CN104208721B - 一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和视网膜损伤技术领域，具体涉及一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用。本发明构建的一种携带Neuritin基因的慢病毒，用于视网膜色素上皮细胞变性动物模型，进行相关指标的检测，证实Neuritin慢病毒载体能成功转染大鼠RPE并高表达，进而保护视网膜的RPE、视细胞等并改善功能恢复。

Description

一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮 变性药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和视网膜损伤技术领域，具体涉及一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用。

背景技术

视网膜色素上皮细胞（RPE）位于视网膜和脉络膜之间，具有吞噬、屏障及离子转运等多种功能。RPE变性是一组以视网膜光感受器细胞和RPE的渐进性凋亡以及死亡为结局，引起视力下降和视野缺损等为共同表现的疾病，具有遗传倾向性，现已经有100多个的相关基因被发现。该病发病率较高，约1/4000，是致盲性疾病的关键环节。（参考文献[1]SungCH,Chuang JZ.The cell biology of vision.J Cell Biol2010;190:953-63）。而且目前对这些疾病还没有有效的治疗措施，几乎不可避免的致盲，引起人们的广泛关注和研究。另外，年龄相关性黄斑变性，也称老年黄斑变性（AMD），是当前中老年人致盲的主要原因，至今仍未找到一种能阻止本病病程进展的确切有效的治疗方法。黄斑区RPE细胞损伤往往被认为是其始动环节，受损RPE对视细胞外界盘膜吞噬消化功能下降，最终导致黄斑变性发生。越来越多的眼底病与RPE细胞凋亡有关，如遗传性外层视网膜营养不良以及视网膜移植术后等。因此，抑制RPE细胞凋亡就成为治疗上述疾病的关键。

视网膜色素上皮变性（Retinitis pigmentosa,RP）的治疗，目前已出现针对致病基因的基因治疗、针对RP发生机制的药物治疗(如干预视蛋白循环通路以减少代谢产物的堆积，阻滞Ca2+通道等)、神经保护治疗(如神经营养因子，抗凋亡因子等)以及旨在恢复视功能的细胞、组织移植或人工视觉等多种方法，但尚无一种方法能够完全阻止RP发展或恢复受损视功能。（参考文献[2]Hamel C．Retinitis pigmentosa．Orphanet J Rare Dis，2006，1：40．）。由于RP具有显著的遗传异质性，从病因学角度治疗RP难度较大，但神经营养因子治疗RP的疗效受致病基因差异的影响较小，因而其对RP变性视网膜组织的神经保护效应一直成为研究热点。（参考文献[1]张湘，李根林.神经营养因子治疗视网膜色素变性的研究进展.中华眼科杂志2009年9月第45卷第9期:855-859.）

神经营养因子可直接作用于RPE、光感受器细胞或间接作用于视网膜其他细胞进而促光感受器细胞存活。神经营养因子中，神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor，bFGF)、色素上皮源性生长因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）、表皮细胞生长因子及肝细胞生长因子等，均显示可增强RPE增殖、减少RPE凋亡，增加光感受器细胞存活，缓解视功能减退，部分神经营养因子联合使用还具有协同作用。但神经营养因子的应用受到一定限制，主要原因是：(1)具有生物活性的生长因子半衰期短，而且局部使用时易被稀释，难以保持有效的浓度，需反复多次给药或增加使用剂量；(2)提取或基因重组的生长因子价格昂贵；(3)已经证明内源性合成的蛋白与外源重组蛋白相比，生物活性更高。因此，目前人们主要致力于神经营养因子的基因转移治疗RP。（参考文献[3]Brian Rossmiller,Haoyu Mao,Alfred S.Lewin.Review:Gene therapy in animalmodels of autosomal dominant retinitis pigmentosa.Molecular Vision2012;18:2479-2496.）

如NGF能拮抗神经细胞谷氨酸毒性、缺氧损伤，能抑制视网膜RPE细胞凋亡的发生。它还通过刺激BDNF、bFGF、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子等因子的分泌而对遗传性视网膜色素变性动物模型的光感受器起保护作用。（参考文献[4]Lenzi L,Coassin M,Lambiase A,Bonini S,Amendola T,Aloe L.Effect of exogenous administration ofnerve growth factor in the retina of rats with inherited retinitispigmentosa.Vision Res.2005Jun;45(12):1491-500.）神经生长因子腺病毒载体注射入视网膜下腔，能转染所有RPE，使遗传性视网膜色素变性RCS大鼠视细胞得以营救，使其凋亡的发生推迟。（参考文献[5]刘世全,张薇,贾东辉,等.腺病毒介导神经生长因子对遗传性视网膜变性RCS大鼠视细胞的营救.北京医科大学学报,2000,32(5):403-407.）

BDNF对视网膜色素变性疾病的有效性己得到了证实。在体电穿孔辅助BDNF基因转染至RPE和神经节细胞层，能减少RCS大鼠RPE凋亡，延缓其视网膜色素变性的病程。（参考文献[6]Zhang M,Mo X,Fang Y,Guo W,Wu J,Zhang S,Huang Q.Rescue of photoreceptorsby BDNF gene transfer using in vivo electroporation in the RCS rat ofretinitis pigmentosa.Curr Eye Res.2009Sep;34(9):791-9.）

GDNF治疗RP动物模型可维持光感受器细胞存活，并保存视功能。Ohnaka等用GDNF腺相关病毒载体能转染视网膜退行性变小鼠rd10的RPE和视细胞并高表达，能有效减缓视细胞变性的程度。（参考文献[7]Ohnaka M,Miki K,Gong YY,Stevens R,Iwase T,HackettSF,Campochiaro PA.Long-term expression of glial cell line-derivedneurotrophic factor slows,but does not stop retinal degeneration in a modelof retinitis pigmentosa.J Neurochem.2012Sep;122(5):1047-53.）

bFGF是公认的光感受器存活因子，能够挽救光感受器的变性，恢复RPE细胞吞噬功能，治疗RP。RCS(royal college of surgeons)鼠是公认的遗传性视网膜病变动物模型。RCS鼠的RPE细胞对于光感受器外节盘膜的吞噬功能缺陷，bFGF在7～10d的RCS鼠RPE细胞的表达减少。对RCS鼠原代培养的RPE，加入bFGF后能恢复细胞的吞噬功能。（参考文献[8]McLaren MJ,Inana G．Inherited retinal degeneration：basic FGF inducesphagocytic competence in cultured RPE cells from RCS rats.FEBS Lett,1997,412:21-29.）将牛bFGF重组腺相关病毒载体注射到视网膜变性转基因鼠的视网膜下腔，提高了眼大量光感受器细胞存活，降低了光感受器的变性机率，并且没有观察到显著的炎症反应和新生血管化。（参考文献[9]Lau D,McGee LH,Zhou S,Rendahl KG,Manning WC,EscobedoJA,Flannery JG.Retinal degeneration is slowed in transgenic rats by AAV-mediated delivery of FGF-2.Invest Ophthalmol Vis Sci.2000Oct;41(11):3622-33.）

猿猴慢病毒为载体介导PEDF转基因治疗RCS大鼠，能转染RPE并高表达PEDF，减少光感受器细胞凋亡，并可维持视功能。（参考文献[10]Miyazaki M,Ikeda Y,Yonemitsu Y,Goto Y,Sakamoto T,Tabata T,Ueda Y,Hasegawa M,Tobimatsu S,Ishibashi T,SueishiK.Simian lentiviral vector-mediated retinal gene transfer of pigmentepithelium-derived factor protects retinal degeneration and electrical defectin Royal College of Surgeons rats.Gene Ther.2003Aug;10(17):1503-11.）

目前，以腺相关病毒为载体的转基因和细胞包囊技术作为神经营养因子的给药途径在多种RP动物模型上取得较好疗效，神经营养因子与针对致病基因的病因学治疗和(或)细胞移植技术联合应用可能获得优劣互补、相得益彰的效果。基因治疗的出现，给我们的研究带来了新的曙光，但基因治疗存在病毒载体潜在安全性等问题。慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组能长期表达、免疫反应小，适于体内基因治疗，已批准进行临床研究。慢病毒载体较其他病毒载体，特别易于转染RPE和细胞。（参考文献[11]Kostic C,Chiodini F,Salmon P,Wiznerowicz M,Deglon N,et al.Activityanalysis of housekeeping promoters using self-inactivating lentiviral vectordelivery into the mouse retina.Gene Ther,2003,10:818–821.参考文献[12]Mats and Alan R.Harvey.Retinal Ganglion Cell Gene Therapy and VisualSystem Repair.Current Gene Therapy,2011,11,116-131.）

Neuritin（又名CPG15）是Nedivi等1993年通过构建海人藻酸激活型大鼠海马齿状回cDNA文库得到的一个基因。人类的Neuritin基因位于染色体6P2513，全长2072bp，开放读码框为426bp，表达的蛋白含有142个氨基酸，其中第l～27个氨基酸为信号肽，第116～142个氨基酸为糖基磷脂酰肌醇（glycolsylphosphatidlinositol，GPI）锚定位点。人类与鼠类、爪蟾的Neuritin基因经同源性比较分析分别为98％、88％，具有高度的保守性，提示Neuritin在不同物种胚胎发育过程中发挥着重要的作用。成熟的Neuritin蛋白是小分子量的糖蛋白，以可溶性和膜蛋白两种形式存在，膜蛋白以GPI锚定位点锚定在细胞膜上。（参考文献[13]Loebrich S,Nedivi E.The function of activity-regulated genes in thenervous system.Physiol Rev.2009,89(4):1079-103.参考文献[14]Leslie JH,NediviE.Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.ProgNeurobiol,2011,94:223–237.）

Neuritin在神经系统的表达、调节及作用。Neuritin高表达于神经系统，发育时主要在新大脑皮质、海马、嗅球，成年后仅表达在发生结构改变并与神经活动密切相关的组织，如海马、嗅球、小脑蒲肯野细胞。Neuritin是活动依赖性表达的神经营养因子（NTF）。神经活动可诱导Neuritin蛋白的表达。生理性刺激如光刺激、触觉刺激以及电刺激可诱导Neuritin的表达，促进树突和轴突的生长和突触成熟，调节突触回路的形成。而众多NTF如NGF（参考文献[15]Karamoysoyli E,Burnand RC,Tomlinson DR,et al.Neuritinmediates nerve growth factor-induced axonal regeneration and is deficient inexperimental diabetic neuropathy.Diabetes,2008,57(1):181-189.）、BDNF（参考文献[16]Naeve GS,Ramakrishnan M,Kramer R,et al.Neuritin:a gene induced by neuralactivity and neurotrophins that promotes neuritogenesis.Proc Natl Acad Sci US A,1997,94(6):2648-2653.）、神经营养素-3（NT-3）、神经胶质源性神经营养因子（GDNF）（参考文献[17]Pahnke J,Mix E,Knoblich R,et al.Overexpression of glial cellline-derived neurotrophic factor induces genes regulating migration anddifferentiation of neuronal progenitor cells.Exp Cell Res,2004,297(2):484-494.）等均能单独诱导Neuritin蛋白的表达，Neuritin还是介导这些NTF发挥神经营养作用（促进神经元存活和突起生长）的关键下游因子。Neuritin定位于神经元胞体和轴突，在轴突呈点状分布，以细胞内囊泡形式分泌至细胞表面经GPI锚定在细胞膜上，通过募集AMPA受体到突触来促进突触成熟，促进突触后树突树的发育。在发育期间，Neuritin还可阻止神经祖细胞caspase3的激活而免于凋亡，能维持神经元的存活（参考文献[18]Putz U,HarwellC,Nodivi E.Soluble CPG15expressed during early development rescues corticaIprogenitors from apoptosis.Nat Neurosci,2005,8(3):322-331.）。在体外培养神经元，Neuritin富集于轴突伸出突起处和生长锥处，旁分泌促进邻近神经元突起的生长（参考文献[19]Cantallops I,Cline HT.Rapid activity-dependent delivery of theneurotrophic protein CPG15 to the axon surface of neurons in intact XenopusTadpoles.Dev Neurobiol,2008,68:744–759.）。

Neuritin在视觉系统中主要分布在视网膜、视神经、外侧膝状体、视皮层及视上丘。在视网膜，Neuritin mRNA仅表达于RGC中。Nedivi等发现Neuritin在大鼠视觉系统发育过程中呈动态变化，先后高表达于外侧膝状体和视皮层，并与眼优势柱的形成有关。通过光刺激可以诱导Neuritin在成年大鼠视皮层的表达。提示Neuritin在视觉系统发育和功能调节中发挥重要作用。

Neuritin在神经系统伤后表达的变化。大鼠脑弥漫性轴索损伤（参考文献[20]贺亚龙，贺晓生，章翔，等.候选可塑性相关基因15在大鼠脑弥漫性轴索损伤中的表达.中华神经外科杂志,2010,26(2)：186-188.）、小鼠局部脑缺血（[21]Han Y,Chen X,Shi F,eta1.CPG15，a new factor upregulated after ischemic brain iniury contributes toneuronal network reestablishiment after glutamate-induced injury.JNeurotrauma,2007,24:722-731.）、大鼠脊髓损伤（参考文献[22]Di Giovanni S,FadenAI,Yakovlev A,et al.Neuronal plasticity after spinal cord injury:identification of a gene cluster driving neurite outgrowth.FASEB J,2005.19,153-154.）后，脑或脊髓内Neuritin表达增强。席绍松、黎兴毅等蛛网膜下腔导管注入外源性Neuritin，能促进大鼠急性脊髓损伤（改良Allen打击法）后伤区轴突再生相关蛋白神经丝蛋白200及生长相关蛋白43(growth associated protein 43，GAP-43)的表达，并能促进大鼠后肢运动功能的恢复（参考文献[23]席绍松,刘维钢,张红,等.Neuritin蛋白对大鼠急性脊髓损伤后神经元轴突再生的作用.中国修复重建外科杂志,2009,23(10):1219-1223.）。而Sharma等在大鼠面神经损伤后的面神经核神经元中，观察到Neuritin表达略低于正常。雄激素、电刺激促进面神经再生必须通过Neuritin才能发挥作用（参考文献[24]Sharma N,Marzo SJ,Jones KJ,et al.Electrical stimulation and testosteronedifferentially enhance expression of regeneration-associated genes.ExpNeurol,2010,223:183–191.）。提示Neuritin在神经系统的创伤修复和治疗中具有重要作用，极富应用前景。

由上可见，Neuritin锚在轴突生长活跃区的细胞膜外或分泌至细胞外，与其他NTF一样具有促进神经元存活及其突起生长和突触成熟的神经营养作用，特别是为众多NTF发挥神经营养作用的关键的、共同的下游分子，在神经系统包括视觉系统的发育和功能调节中至关重要，脊髓和视神经损伤后早期的表达量显著下调Neuritin，而同时轴突再生夭折，推测Neuritin为影响神经轴突内在再生能力的关键和重要分子。

本申请人长期以来致力于Neuritin的相关研究，已于2013年1月30日申请了中国专利CN201310043613.9，发明名称为“一种携带Neuritin基因的慢病毒及其在修复视神经损伤中的应用”，并于2013年5月17日申请了中国专利CN201310182950.6，发明名称为“一种携带Neuritin基因的Ⅱ型腺相关病毒及其在修复视神经损伤中的应用”。

目前，尚未见Neuritin在RP后表达变化及作用的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物（或称治疗RP药物）中的应用。

本申请人认为，虽然RPE细胞不是神经细胞，但它是从神经外胚层分化而来的，受到众多神经营养因子的作用。Neuritin具有独特的神经营养作用，且为其他神经营养因子发挥作用的关键分子和共同下游分子，有可能也能作用于RPE。

基于RPE变性和凋亡是RP发生的始动和关键因素；神经营养因子治疗RP为当今研究热点和有效方法之一；Neuritin为其他神经营养因子发挥作用的关键分子和共同下游分子。我们推测以Neuritin为靶点治疗RP，较单一神经营养因子为靶点治疗RP，可更强地保护RPE，获得更好的功能恢复。由于外源性Neuritin如同其他NTF一样，在体内半衰期较短，玻璃体注射Neuritin基因重组慢病毒以转染RPE，可使之持续高表达Neuritin，并可观察Neuritin长期作用的效果。

本发明的技术方案，主要是构建Neuritin的慢病毒载体，并在RP动物模型中和体外培养的RPE受损细胞模型上，利用Neuritin的慢病毒载体感染RPE，观察并探讨Neuritin基因治疗RP的作用及机制，为临床治疗RP提供新的有力手段和理论基础。

Neuritin基因，以下也称NRN1基因或Nrn1基因。

本发明的第一方面，是提供一种携带Neuritin基因的慢病毒载体，该慢病毒载体是携带如SEQ ID NO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。

所述的慢病毒载体选用Tronolab系统为四质粒系统，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的穿梭质粒。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包装所必须的元件，目的穿梭质粒含有目的基因（Nrn1）以及标记基因红色荧光蛋白（RFP）。较优的，目的穿梭质粒的多克隆位点插入如SEQ ID NO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。

本发明的第二方面，提供了一种携带Neuritin基因的慢病毒载体的构建方法，具体步骤如下：

1.Neuritin基因慢病毒表达载体的构建

根据Neuritin（NRN1）基因（GenBank:BC002683.2）设计并合成如下PCR引物：

NRN1-正向引物：5’-CGACGCGTATGGGACTTAAGTTGAAC-3’（SEQ ID NO:2）；

NRN1-反向引物：5’-TTTGCGGCCGCTCAGAAGGAAAGCCA-3’（SEQ ID NO:3）；

使用PCR方法从含有NRN1基因cDNA（1551bp，如SEQ ID NO:1所示）克隆模板中扩增NRN1基因CDS区；将慢病毒载体和目的基因分别双酶切，纯化酶切产物后与NRN1基因PCR产物进行定向连接或重组，其产物转化感受态细菌，对生长出的克隆进行Nrn1基因PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提，钙转法将质粒转入293T细胞，36-48小时后通过荧光显微镜观察融合蛋白RFP。

2.Neuritin基因慢病毒包装

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8小时更换为完全培养基，培养48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，感染Hela细胞后采用倍比稀释法检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度的要求不同，生产过程中可过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。

本发明的第三方面，提供了一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物（或称治疗RP药物）中的应用。

所述的一种携带Neuritin基因的慢病毒，其Neuritin基因如SEQ ID NO:1所示。

所述的慢病毒载体选用Tronolab系统为四质粒系统，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的穿梭质粒。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包装所必须的元件，目的穿梭质粒含有目的基因（Nrn1）以及标记基因红色荧光蛋白（RFP）。较优的，目的穿梭质粒的多克隆位点插入如SEQ ID NO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。

携带Neuritin基因的慢病毒载体在制备治疗RP药物中的应用，临床上，具体可采用玻璃体注射该药物进行RP的基因治疗。

本发明所述的一种携带Neuritin基因的慢病毒，用于视网膜色素上皮细胞变性动物模型，进行相关指标的检测，证实Neuritin慢病毒载体能成功转染大鼠RPE并高表达，进而保护视网膜的RPE、视细胞等并改善功能恢复。

本发明基于Neuritin独特的神经营养作用及其在神经创伤、疾病中的表达变化和作用，以Neuritin为靶标对RP进行基因治疗，以增强RP的内在再生能力，改善其存活。并推测其对RPE和视细胞这两RP的关键细胞具有明显的作用，从而达到甚至超过给予多种NTF、或多种治疗方法保护RPE的疗效，为临床治疗RP提供有力的手段和理论依据。

附图说明

图1是Neuritin慢病毒表达质粒载体构建图；

图2是Neuritin慢病毒转染大鼠视网膜，视网膜切片显示慢病毒转染色素上皮层(A、B、C)，其中（A）为DAPI染核，核为蓝色；（B）箭头示Neuritin慢病毒转染色素上皮细胞，呈红色荧光；（C）A与B合并的照片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

实施例1：

1.Neuritin基因慢病毒表达载体构建

（1）慢病毒表达载体及目的基因的酶切

采用pLenO-RIP（购自Addgene公司）载体使用Not I、Mlu I进行酶切，酶切后的载体准备载体构建时使用（图1）。以NRN1基因CDS区的cDNA克隆为模板采用PCR扩增NRN1基因片段，产物使用Not I、Mlu I进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收载体及目的基因DNA。

（2）连接反应

将酶切后的慢病毒载体和NRN1基因的PCR产物按照表1中的反应体系进行连接反应。

表1：连接反应体系

以上试剂混合后于4℃，12小时连接反应制备克隆连接液，准备转化。

（3）转化，挑克隆鉴定

采用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，具体抽提步骤如下：过夜培养的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分两次于一个1.5ml离心管中12,000×g离心1分钟，彻底去除上清；加入250μl细菌悬浮液，振荡器充分重悬细菌；加入250μl细菌裂解液，颠倒混匀4－6次；注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染；加入250μl细菌裂解液五分钟内加入350μl中和液，轻轻颠倒混匀6－8次；12,000×g，离心10分钟；将上清转移到小量纯化柱中，小量纯化柱插于废液收集管中，12,000×g离心1分钟；不要吸到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染；弃收集管中的废液，将小量纯化柱插于收集管中，加700μl细菌裂解液到小量纯化柱中，12,000×g离心1分钟；重复该步骤一遍；弃收集管中的废液，将小量纯化柱放入同一支收集管中，12,000×g离心1分钟彻底去除细菌裂解液；将小量纯化柱放入新的干净的1.5ml离心管中，加50μl2.5mMTris-HCl洗脱液，室温放置1分钟后，12,000×g离心1分钟；离心管中的溶液即为所抽提的质粒；所得质粒采用PCR鉴定以及Not I和Mlu I双酶切鉴定，酶切产物挑选阳性克隆送测序。

委托南京金斯瑞生物测序公司测序，1551bp，如SEQ ID NO:1所示，测序结果表明NRN1基因号1克隆为鉴定正确的阳性克隆，可进入慢病毒包装的实验流程。

2.Neuritin基因慢病毒包装

（1）慢病毒载体系统质粒基本信息

该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G，目的穿梭质粒（所有质粒均购自Addgene公司）。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件；目的穿梭质粒含有目的基因以及能表达红色荧光蛋白（RFP）的基因。分别包装含目的基因Nrn1的慢病毒，以及不含目的基因Nrn1的慢病毒以作为对照。

（2）质粒转染

慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞（购自中科院上海细胞所），重新接种于10cm细胞培养皿（每个平皿接种细胞约为2-2.5×10⁶），37℃，50ml/L CO₂培养箱内培养；制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液；加入无菌水定容至1800μl，再加入CaCl₂(2.5mol/L)溶液200μl，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000μl，室温放置20-25min。

当细胞密度达60%～70%时转染，将各质粒和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养6-8小时后后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15ml，轻摇后弃去，重复该步骤3次；每瓶细胞中加入含10%胎牛血清的细胞培养液6ml，继续培养48小时；收集转染72小时的293T细胞上清液；将收集的上清液于4℃，4000g离心10min，收集离心后的上清液；将上清液以0.45μm滤器过滤；于40ml超速离心管中，4℃，25000rpm/min离心2hrs；而后以冰PBS液或者500μlDMEM培养基重悬病毒沉淀于4℃溶解过夜。

（3）慢病毒滴度测定

采用逐孔稀释滴度测定法:测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，每个96孔中加1×10⁵个细胞，体积为100μl。根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的新鲜培养基。取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。24小时后，加入新鲜培养基100μl。4天后，观察细胞生长状况，并收取细胞进行流式细胞术测定滴度。

最后根据流式细胞仪检测结果计算滴度公式：

滴度（TU/ml）=100000（上样细胞数）×RFP阳性细胞的百分数/病毒上清液的体积（ml）。

实施例2：

1.慢病毒体外转染视网膜色素上皮细胞以及Neuritin的过表达

无菌条件下将孕19d胚胎大鼠眼切开弃除角膜、晶状体、玻璃体和视网膜神经层。用PBS磷酸缓冲液洗后，加入0．25％胰蛋白酶和0．02乙二胺四乙酸(EDTA)，37℃消化收集细胞，弃上清液后加入内含胎牛血清的DMEM培养基在C0₂培养箱中培养，细胞传代后选用鼠抗人细胞角蛋白(cytokeratin)单克隆抗体和荧光素标记进行鉴定。建立吲哚美辛(Indomethacin，IN)诱导RPE细胞凋亡模型，加入终浓度为10、30、50、100、200、300ng/ml的重组Neuritin，以及LV-RFP、LV-Neuritin，后二者慢病毒组于损伤前2天转染RPE细胞并验证其表达，分别用MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium)法和核酸蛋白分析仪测定Neuritin对细胞增殖及DNA合成的影响；用透射电镜和吖啶橙(Acridine orange)荧光染色检测凋亡细胞。在体外证实Neuritin慢病毒载体能成功转染大鼠RPE并高表达，减少受损RPE凋亡。

2.慢病毒体内转染视网膜色素上皮细胞以及Neuritin的过表达

动物实验分组如下：（1）Neuritin慢病毒组，即LV-Neuritin组；（2）慢病毒空载体组，即LV-RFP组；（3）生理盐水对照组。实验各组大鼠眼球玻璃体注射1μl LV-Neuritin-RFP/Lv-RFP/注射用生理盐水后（滴度为5.3×10⁹TU/ml），术后存活3周常规经心灌注取材观察，取材前2d玻璃体注射FITC标记的霍乱毒素B亚单位（CTB-FITC）标记RGCs及其轴突。

玻璃体注射慢病毒载体或CTB-FITC的方法：腹腔注射10%水合氯醛麻醉SD大鼠。75%的酒精棉球擦拭眼周，注射器吸取无菌生理盐水冲洗眼睛。用5μl Hamliton微量注射器吸取1μl CTB-FITC水溶液（10μg/μl）。左手食指从颞侧轻推眼球以达到固定眼球的效果，右手持注射器从内眦的角膜巩膜缘后1mm先平进针，有落空感后缓慢斜向进针直到针尖达眼球中央（通过瞳孔可见），实验助手旋转注射器针柄缓慢将慢病毒载体或CTB-FITC溶液注射到玻璃体内，留针30s。再次用无菌生理盐水冲洗眼睛，并腹腔注射青霉素。放回动物房饲养。用4%多聚甲醛经心灌注后取眼球和视神经，于-25℃恒冷切片机中行眼球经视神经平面的冰冻连续切片，厚度为10μm。37℃烤片机上烘干1h后，PBS洗5min×3次，碳酸甘油抗荧光萃灭封片剂封片。在荧光显微镜下观察RFP标记的视网膜色素上皮细胞和CTB-FITC标记的视网膜节细胞及其轴突。

Neuritin慢病毒转染大鼠视网膜，眼球经视神经平面的视网膜冰冻切片显示，慢病毒绝大部分主要转染色素上皮层细胞（图2），表达RFP的红色荧光，转染效率约为90%以上。

3.视网膜色素上皮细胞变性动物模型的建立及相关指标的检测

参照孟晶等方法（孟晶，张翼飞，陈剑，等.N-甲基-N-亚硝脲诱导的视网膜变性大鼠模型的形态学和功能改变.暨南大学学报(医学版),2006,27(4):557-563），按体质量一次性腹腔注射40mg/kg N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)损伤出生后50dSD大鼠视网膜光感受器细胞，制备大鼠RP动物模型。SD大鼠随机分为正常对照组、MNU损伤组、Neuritin组、对照病毒载体组（LV-RFP组）、Neuritin慢病毒载体组（LV-Neuritin组）。Neuritin组于给予MNU损伤时玻璃体内注射重组Neuritin；LV-RFP组、LV-Neuritin组分别于给予MNU损伤前1周时玻璃体内注射相应病毒载体。于造模后1d、2d、3d、5d，行眼闪光视网膜电图检查(ERG)a波、b波消失时间；处死动物取眼球做组织学检查，HE染色并测量大鼠中心和外周视网膜的厚度；取视网膜常规冰冻切片，TUNEL染色检测细胞凋亡；免疫组织化学法检测谷氨酰胺合成酶、增殖性细胞核抗原的表达；Western blot检测视网膜Neuritin、caspase-3的表达；用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Cyclin D1mRNA、Neuritin mRNA的表达。通过以上检测，结果显示Neuritin慢病毒载体能成功转染大鼠RPE并高表达，通过下调caspase-3的表达，减轻RPE凋亡程度并促进其增殖，进而保护视网膜的RPE和视细胞等，并改善视功能恢复。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (2)

1.一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用，所携带的Neuritin基因如SEQ ID NO:1所示；

所述的慢病毒载体选用Tronolab系统，为四质粒系统pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的穿梭质粒；其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包装所必须的元件，目的穿梭质粒含有目的基因以及标记基因红色荧光蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用，其特征在于，目的穿梭质粒的多克隆位点插入如SEQ ID NO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。