KR100453499B1 - 신경영양성 인자 ｎｎｔ-1 - Google Patents

신경영양성 인자 ｎｎｔ-1 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NNT-1 이라 명명한 신규한 신경영양성 인자를 코드하는 핵산에 관한 것이다. 또한 본 발명은 NNT-1 폴리펩티드의 아미노산 서열, NNT-1 폴리펩티드의 제조방법 및 그외의 관련 양상에 관한 것으로, 이러한 폴리펩티드는 염증 반응을 감소시킬 뿐 아니라 B-세포 및/또는 T-세포 생산 자극에 대해 활성적이다.

Description

신경영양성 인자 ＮＮＴ-1{THE NEUROTROPHIC FACTOR NNT-1}
본 출원은 1997년 2월 3일자로 제출된 제 08/792,019 호의 부분 계속 출원으로서, 상기 출원은 본원에서 참고문헌으로 인용된다.
발명의 배경
다수의 신경 장애와 신경 질환은 적어도 부분적으로는 특정 신경원 군의 변성이나 사멸에서 기인한다. 예를들어, 파킨슨병은 수의적 근육 운동, 근경직 및 진전이 서서히 진행됨을 특징으로 한다. 이러한 증상은 흑색질이라 불리는 뇌의 특정 부위에 위치하는 도파민-생산 신경원의 진행성 변성에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받는다.이들 신경원("도파민작용성 신경원")의 변성으로 인해 선조체라 불리는 뇌의 인접 부위에서 도파민 수준이 감소한다. 선조체는 도파민 수용체를 발현하는 신경원을 함유하는데, 이들 신경원은 운동 활성 조절과 관계가 있다. 도파민작용성 신경원의 변성 원인은 알려져 있지 않지만, 자유 라디칼, 과량의 철 함량, 주변 독소, 흥분성 아미노산 신경독성 및 특정 신경영양 인자의 결핍 등에 의한 것으로 추측된다[Jenner, Neurology, Suppl. 3 : S6 - S12 (1995) ; Adams 및 Victor, eds. Principles of Neurology, Chapter 42 : Degenerative Disease of the Nervous System, McGraw Hill, NY (1993) 참조].
근위축성측삭경화증(ALS ; 루 게리병으로도 알려져 있음), 진행성 근위축증 및 유전 운동 신경병증과 감각 신경병증(샤르코-마리-투드병)과 같은 모든 질환은 척수의 복측각(ventral horn)에 위치하는 운동성 신경원 쇠퇴가 적어도 부분적으로 그것의 원인이 된다.
뇌의 대뇌피질 부분 중 뚜렷한 부분인 해마는 장기기억 형성에 중요하다. 예를들어 국소빈혈에 의한 해마의 파괴로 새로운 기억 형성이 되지 않는 결과가 초래될 수 있다. 해마의 CA1 부위에 존재하는 CA1 추체세포 신경원의 변성은 알쯔하이머병의 특징 중 하나이다. 이러한 신경원은 선택적으로 발작과 두부 외상 같은 증상에서 발생하는허혈성 손상과 저산소증 손상에 약하다. 또한, 해마의 CA3 부위에 존재하는 추체세포 신경원 뿐만 아니라 CA1 해마 추체세포 신경원은 간질에 의해 선택적으로 손상된다.
선조체는 흑색질의 도파민작용성-함유 신경원 중 신경 말단의 신경 지배 부위이다. 선조체의 신경원 대부분은 신경전달물질로 GABA(4-아미노부티르산)를 사용한다. 선조체는 헌팅톤병에서 발생하는 진행성 신경변성의 주요 표적이 되는데, 손실되는 신경원의 대부분은 GABA를 이용하는 선조체 신경원이다.
세로토닌-함유 신경원은 후뇌의 정중선 주변에 밀집되어 있는 군에 위치한다. 이러한 신경원은 체온, 기분과 수면 조절에 관계한다. 세로토닌-함유 신경원계의 장애는 예를들어 우울증, 그외의 기분 장애 및 수면 장애를 포함한다.
광수용체 세포는 분화된 망막 신경원 집단으로서 시각을 담당한다. 광수용체 세포의 손상 및/또는 사멸로 시력을 잃을 수도 있다. 색소성망막염, 연령과 관련된 황반변성, 정체성 야맹증 등에 의한 망막 변성은 빛의 자극을 전기적 활성으로 전환시키는 시각 색소를 함유하는 전문 구조인 광수용체 외구역의 기능 상실 및 진행성 위축증을 수반함을특징으로 한다.
이러한 질병을 완화시키고 증상을 치료하는 데 사용하는 일부 치료제(예를들어, 파킨슨병을 치료하는 L-도파)가 존재하는 반면, 최근에도 상기 언급한 신경원의 손상 대부분을 막거나 감소시킬 수 있는 치료제 또는 이들의 수복을 촉진시킬 수 있는 치료제가 존재하지 않는다.
최근에는, 여러 신경원의 영양 활성을 기초로 수 개의 자연발생적인 단백질성 분자를 확인해 왔다. 이러한 분자를 "신경영양성 인자"라 한다. 신경영양성 인자는 생존, 성장 및/또는 신경원의 형태학적 가성형을 자극하거나 조절할 수 있는 내인성의 수용성 단백질이다[Fallon 및 Laughlin, Neurotrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA (1993) 참조].
공지된 신경영양성 인자에는, 그것의 아미노산 서열 상동성 및/또는 3 차 구조 등을 근거로 분류한 폴리펩티드 성장 인자의 수 개의 다른 단백질 상과가 속한다[MacDonald 및 Hendrikson, Cell, 73 : 421 - 424 (1993) 참조]. 신경영양성 인자 중 한 과는 뉴로트로핀과이다. 이 과는 일반적으로 NGF(신경 성장 인자), BDNF(뇌 유래 신경영양성 인자), NT-3(뉴로트로핀-3), NT-4(뉴로트로핀-4) 및 NT -6(뉴로트로핀-6)으로구성된다.
CNTF(모양체 신경영양성 인자) 및 LIF(백혈병 저해 인자)는 신경영양 활성을 갖는 시토킨 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 그것의 구조적 특징과 수용체 성분으로 인해 조혈 시토킨 과에 포함되는데, 이러한 조혈 시토킨은 IL-6(인터루킨-6), IL-11(인터루킨-11), G-CSF(과립구-군체 자극 인자) 및 옹코스타틴-M 을 포함한다. 본 발명의 NNT-1 은 이러한 신경영양성 인자과의 여러 멤버와 상당한 유사성을 보인다. 도 6 을 참조하라.
GDNF(신경교 유래 신경영양성 인자)는 TGF-베타(형질전환 성장 인자 베타) 상과에 속하는 신경영양성 인자이다. GDNF 는 강력한 생존력을 보이며 도파민작용성 신경원과 운동 신경원에 대하여 분화-촉진 작용을 한다[Lin 등의 Science, 260 : 1130 - 1132 (1993) ; Yan 등의 Nature, 373 : 341 - 344 (1995) 참조].
이러한 신경영양성 인자가 신경원의 성장 및/또는 생존을 증가시키는 것으로 공지된 반면, 이러한 인자와 함께 작용하는 분자에 관하여는 거의 알려져 있지 않다. 부가적인 뉴로트로핀과 관련 분자를 확인하는 방법 중 하나는 신경계에 영향을 미치는 것으로 알려진 하나 또는 그이상의 화합물을 동물에게 투여한 후 화합물에 대한 신경 반응과 관련된 유전자의 유도 여부를 조직에서 분석하는 것이다. 예를들어, 뇌의 해마 부위와 같은 신경계의 특정 조직에서 유도되는 유전자를 스크린할 수 있다. 카이네이트(카인산)라 불리는 글루타메이트의 신경전달물질 유사체 투여에 대해 해마의 치상회 부위에서 유도되는 신규한 유전자를 확인하기 위해 이 기술을 이용하였다[Nedivi 등의 Nature, 363 : 718 - 722 (1993) ; Nedivi 등의 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93 : 2048 - 2053 (1996) 참조].
NGF, BDNF, NT3, GDNF, bFGF, IGF-1 및 TGF-베타와 같은 다수의 신경영양성 인자의 발현은 구심성 신경 활성 및/또는 신경원 손상에 의해 조절된다. 해마 치상회에 글루타메이트 유사체 카이네이트를 투여하였을 때에 이러한 유전자의 일부가 강하게 유도됨을 관찰할 수 있었다 [Isackson, Current Opinions in Neurobiology 5 : 50 - 357 (1995) 참조]. 카이네이트로 처리하면 민첩한 랫의 해마에서 신규한 화합물 방출이 증가하는 것으로 나타났으며 이러한 활성도는 공지된 신경영양성 인자 작용과 다를 것이다[Humpel 등의 Science, 269 : 552 - 554 (1995) 참조].
다수의 신경 장애와 신경 질환에 대한 치료방법이 알려져 있지 않기 때문에, 본 분야에서는 파킨슨병, 근위축성측삭경화증(ALS), 알쯔하이머병, 발작 및 시작에 영향을 미치는 다수의 변성 장애 등과 같은 신경학적 증상과 질병 치료용 신규 화합물을 확인할 필요가 있다.
NNT-1 화합물이 특히 B-세포와 T-세포 생산을 증가시킴으로써 면역계의 생물학적 활성을 조절함을 시사하는 다른 증거가 본원에 나타나 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 신경원 재생을 촉진시키고 신경 기능을 회복시키는 데 유용한 신규한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본원에 기술한 신경학적 질환 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본원에 기술한 면역 질환 치료방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적 이외에 다른 목적은 본 명세서로부터 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.
발명의 요약
한 실시형태에 있어서, 본 발명은 다음 중에서 선택한 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를 제공한다 :
(a) 서열 번호 : 1 의 핵산 분자 ;
(b) 서열 번호 : 3 의 핵산 분자 ;
(c) 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편을 코드하는 핵산 분자 ;
(d) 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드와 적어도 70 % 상동인 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 ;
(e) 엄격한 조건하에서 상기 (a) - (d) 중 하나와 혼성시킨 핵산 분자 ; 및
(f) 상기 (a) - (e) 중 하나의 상보물인 핵산 분자.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 다음 중에서 선택한 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를 제공한다 :
(a') 서열 번호 : 4 의 핵산 분자 ;
(b') 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편을 코드하는 핵산 분자 ;
(c') 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드와 적어도 70 % 상동인 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 ;
(d') 엄격한 조건하에서 상기 (a') - (c') 중 하나와 혼성시킨 핵산 분자 ; 및
(e') 상기 (a') - (d') 중 하나의 상보물인 핵산 분자.
또다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 이 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 다음 중에서 선택한 NNT-1 폴리펩티드를 제공한다 :
(a) 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드 ;
(b) 서열 번호 : 2 의 아미노산 1 - 198 로 이루어진 폴리펩티드 ;
(c) (a) 또는 (b) 의 폴리펩티드와 적어도 70 % 상동인 폴리펩티드 ; 및
(d) (a) - (c) 중 하나의 생물학적으로 활성인 단편.
본 발명은 또한 다음 중에서 선택한 NNT-1 폴리펩티드를 제공한다 :
(a') 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드 ;
(b') 서열 번호 : 5 의 아미노산 1- 198 로 이루어진 폴리펩티드 ;
(c') (a') 또는 (b') 의 폴리펩티드와 적어도 70 % 상동인 폴리펩티드 ; 및
(d') (a') - (c') 중 하나의 생물학적으로 활성인 단편.
선택적으로, NNT-1 폴리펩티드는 아미노 말단 메티오닌을 수반하거나 그렇지 않을 수 있다.
또다른 실시형태에 있어서 본 발명은 NNT-1 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 5, 서열 번호 : 2 의 아미노산 1 - 198, 서열 번호 : 5 의 아미노산 1 - 198 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편일 수 있으며, 이 방법은 다음을 포함한다 :
(a) NNT-1 핵산 분자에 의해 코드되는 폴리펩티드를 적당한 숙주에서 발현시키고 ;
(b) 폴리펩티드를 분리한다.
본 발명은 또한 항-NNT-1 항체도 제공한다.
본 발명은 신경영양 활성을 갖는, NNT-1 이라 명명된 신규한 폴리펩티드와 관련 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 코드하는 신규한 핵산 분자 및 그외의 관련 양상들에 관한 것이다.
도 1 은 인체 NNT-1을 코드하는 cDNA 의 핵산 서열(서열 번호 : 1)을 나타낸 것이다.
도 2 는 NNT-1 에 대한 인체 게놈 DNA 의 핵산 서열(서열 번호 : 3)을 나타낸 것이다.
도 3 은 cDNA(서열 번호 : 1)에서 번역된, 인체 NNT-1 에 대한 아미노산 서열(서열 번호 : 2)을 나타낸 것이다. 초기 27 개 아미노산은 시그널 펩티드 서열을 나타내는 것으로, NNT-1 의 성숙형은 번호 1 로 표시한 로이신에서 시작한다. ★ 표는 종결 코돈을 나타낸다.
도 4 는 마우스의 NNT-1을 코드하는 cDNA 의 핵산 서열(서열 번호 : 4)을 나타낸 것이다.
도 5 는 cDNA(서열 번호 : 4)에서 번역된, 마우스 NNT-1 의 아미노산 서열(서열 번호 : 5)을 나타낸 것이다. 초기 27 개 아미노산은 시그널 펩티드 서열을 나타내는 것으로, 마우스 NNT-1 의 성숙형은 번호 1 로 표시한 로이신에서 시작한다. ★ 표는 종결 코돈을 나타낸다.
도 6 은 NNT-1, IL-11(서열 번호 : 8), IL-6(서열 번호 : 9), G-CSF(서열 번호 : 10), 카디오트로핀(서열 번호 : 11), CNTF(서열 번호 : 12), 옹코스타틴(서열 번호 : 13) 및 LIF(서열 번호 : 14)의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 각 경우에서, 인체 분자를 비교한다.
도 7 은 인체 NNT-1 과 인체 CNTF 의 병아리 운동 신경원 활성도를 비교 분석한 결과 그래프이다.
도 8 은 인체 NNT-1 과 인체 CNTF 의 병아리 교감 신경원 활성도를 비교 분석한 결과 그래프이다.
도 9 는 음성 대조 마우스(#22)의 정상 비장을 H & E 염료로 염색하여 20 × 대물렌즈로 관찰한 것이다.
도 10 은 림프구 과형성(화살표)을 수반하는 NNT-1 형질전환 마우스(#62)의 비장을 나타낸 것이다.
도 11 은 대조 마우스의 정상 간을 H & E 염료로 염색하여 10 × 대물렌즈로 관찰한 것이다.
도 12 는 동양혈관(화살표)과 그 주변 혈관에 림프구 응집물을 수반하는 NNT-1 형질전환 마우스(#60)의 간을 H & E 로 염색하여 나타낸 것이다.
도 13 은 NNT-1 이 혈청 SAA 를 유도함을 나타내는 데이터이다(p < 0.001). 1 군 당 마우스 수는 5 마리이다.
도 14 는 NNT-1 이 혈청내 코르티코스테론의 IL-1 에 의한 유도를 증가시키며(p < 0.01), IL-1 단독으로도 코르티코스테론의 혈청 수준을 증가시킴을(p < 0.001) 나타내는 데이터이다. 1 군당 마우스 수는 5 마리이다.
도 15 는 NNT-1 이 혈청내 IL-6 중 IL-1 에 의한 유도를 증가시킴을 나타내는 데이터이다(p < 0.001). 1 군 당 마우스의 수는 5 마리이다.
도 16 은 NNT-1 이 LPS 에 의한 혈청 TNF 수준 증가를 차단함을 나타내는 데이터이다(p < 0.001). LPS - 치료군에는 10 마리, 다른 군에는 5 마리의 마우스가 속하였다.
도 17 은 NNT-1 이 마우스의 말초림프절 내 세포 총수(p < 0.04)와 CD45-양성 세포수(p < 0.001)를 증가시킴을 나타내는 데이터이다.
서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드와 같은 NNT-1 폴리펩티드 및 그와 관련된 생물학적 활성 폴리펩티드 단편과 그것의 유도체가 본 발명의 범주에 속한다. 또한 이들 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자와 이 폴리펩티드의 제조방법도 본 발명의 범주에 포함된다.
Ⅰ.NNT-1 단백질/폴리펩티드, 그것의 단편 및 유도체
본원에 사용된 용어 "NNT-1 단백질" 또는 "NNT-1 폴리펩티드" 는 NNT-1 에 대하여 본원에 기술한 성질을 갖는 모든 단백질이나 폴리펩티드를 의미한다. NNT-1 폴리펩티드는 예를들어 그것의 제조방법에 따라 아미노 말단 메티오닌을 갖거나 갖지 않을 수 있다. NNT-1 단백질이나 NNT-1 폴리펩티드를 설명하기 위해서 다음과 같이 기술한다 :
(1) 다음 각 항목 중 하나에서 규정한 NNT-1 핵산 분자에 의해 코드되는 아미노산 서열 :
(a) 서열 번호 : 1 의 핵산 분자 ;
(b) 서열 번호 : 3 의 핵산 분자 ;
(c) 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편을 코드하는 핵산 분자 ;
(d) 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드와 적어도 70 % 상동인 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 ;
(e) 엄격한 조건하에서 상기 (a) - (d) 중 어느 하나와 혼성시킨 핵산 분자 ; 및
(f) 상기 (a) - (e) 중 하나의 상보물인 핵산 분자 ; 및
(a') 서열 번호 : 4 의 핵산 분자 ;
(b') 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편을 코드하는 핵산 분자 ;
(c') 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드와 적어도 70 % 상동인 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 ;
(d') 엄격한 조건하에서 상기 (a') - (c') 중 하나와 혼성시킨 핵산 분자 ; 및
(e') 상기 (a') - (d') 중 하나의 상보물인 핵산 분자 ; 및
(2) 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 5 의 NNT-1 폴리펩티드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상이 치환, 결실 및/또는 삽입되어 생성된 NNT-1 유전자의 자연발생적인 대립형질 변이체, 및/또는
(3) 본원에서 제공하는 핵산 및/또는 그것의 아미노산 서열 변이체 뿐만 아니라 화학적으로 변이된 유도체.
본 발명을 실시하는 데 사용하는 NNT-1 폴리펩티드는 자연발생적인 온길이의 폴리펩티드 또는 절두된 폴리펩티드나 펩티드(즉 "단편") 일 수 있다.
폴리펩티드는 성숙형으로 존재하거나 천연 시그널 펩티드 또는 불균질 시그널 펩티드에 결합될 수 있다. 예를들어, 인체 NNT-1 과 마우스 NNT-1 은 각각 서열 번호 : 2 및 5 의 아미노산 -27 내지 -1 로 이루어진 시그널 펩티드를 갖는다.
하기한 바와 같이, 폴리펩티드나 단편은 글리코실화, 인산화 및/또는 중합체에 결합시키는 등 화학적으로 변이시킬 수 있으며, 그것의 제조방법에 따라 아미노 말단 메티오닌을 가질 수 있다. 또한, 폴리펩티드나 단편은 자연발생적인 NNT-1 폴리펩티드 변이체일 수 있다(즉, 자연발생적인 NNT-1 의 아미노산 중 하나 또는 그 이상의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다).
본원에서 기술한 바와 같이, 용어 "NNT-1 단편" 은 온길이의 자연발생적인 NNT-1 단백질보다 짧은 펩티드 또는 폴리펩티드를 말하지만, 상기한 NNT-1 폴리펩티드 또는 NNT-1 단백질과 질적으로 상당히 유사한 생물학적 형태를 갖는다. 이러한 단편은 아미노 말단, 카르복시 말단또는 둘 다에서 절두될 수 있으며 화학적으로 변이될 수 있다. 이러한 NNT-1 단편은 아미노 말단 메티오닌을 수반하거나 수반하지 않도록 제조될 것이다. 단편의 활성도는 온길이의(성숙한) NNT-1 폴리펩티드보다 크거나 같거나 작을 수 있다. 단편의 활성도는 온길이의 폴리펩티드 활성도의 ≥ 50 % 이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 ≥ 65 %, 가장 바람직하게는 ≥ 80 % 이고, 이 활성도는 본원의 실시예 부분에 기술한 표준 활성도 검정에 의해 측정한다. 본 발명의 예시적인 일부 단편은 NNT-1 폴리펩티드의 C-말단이나 N-말단 중 하나 또는 두 말단에서 1 내지 20 의 아미노산을 제거한 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "NNT-1 유도체" 또는 "NNT-1 변이체" 는 1) 예를들어 폴리에틸렌 글리콜 분자, 당, 인산 또는 야생형 NNT-1 폴리펩티드에 자연적으로 결합하지 않는 그외의 분자 중 하나 또는 그 이상을 부가함으로써 화학적으로 변이시키고/변이시키거나 2) 도 3(인체) 또는 도 5(마우스)에 기술한 NNT-1 아미노산 서열에 대해 핵산이나 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상이 치환, 결실 및/또는 삽입된 NNT-1 폴리펩티드, 단백질 또는 단편을 말한다.
본원에 사용된 용어 "생물학적으로 활성인 폴리펩티드" 및 "생물학적으로 활성인 단편" 은 NNT-1 에 대해 상기한 폴리펩티드 또는 펩티드를말하는데, 여기에서 NNT-1 은 (a) 신경원(예를들어, 운동 신경원 및/또는 교감 신경원) 또는 (b) B 세포와 T 세포 같은 면역 세포에 대하여 성장 인자로 작용한다.
활성 분석시에 활성적이지는 않은 NNT-1 의 단편 및/또는 유도체는 시험관내 또는 생체내에서 NNT-1 수용체의 조절자(예를들어, 저해제나 자극제)로 유용할 수 있거나 NNT-1 폴리펩티드에 대한 항체 제조에 유용할 것이다.
본 발명의 NNT-1 아미노산 변이체는 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 5 중 하나와 적어도 70 % 상동인 것이 바람직하고, 적어도 약 80 % 상동인 것이 더욱 바람직하며, 적어도 약 90 % 상동인 것이 훨씬 더 바람직하다.
서열 상동성 백분율은 두 폴리펩티드의 아미노산 위치에서 유사성을 비교하기 위해 일반적으로 사용하는 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. 예로써 BLAST 또는 FASTA 와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 서열 상동성 백분율을 결정할 두 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 가장 잘 부합되도록 정렬시킨다("부합 구간" 은 하나 또는 두 서열의 온길이를 포함하거나 하나 또는 두 서열의 선결 부분을 포함한다). 각 컴퓨터프로그램은 오프닝 패널티 "디폴트값"과 갭 패널티 "디폴트값" 및 PAM 250 과 같은 스코어링 매트릭스를 제공한다. 표준 스코어링 매트릭스[Dayhoff 등의 in : Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978) 참조]는 컴퓨터 프로그램과 함께 사용할 수 있다. 상동성 백분율은 다음과 같은 FASTA 프로그램을 갖는 알고리즘을 이용하여 계산할 수 있다 :
적어도 70 % 상동인 폴리펩티드는 일반적으로 야생형 NNT-1 의 아미노산 중 하나 또는 그 이상이 치환, 결실 및/또는 삽입된 것이다. 일반적으로, 치환은 단백질의 전체적인 순하전, 극성 또는 소수성에 전혀 또는 거의 영향을 미치지 않도록 보존적일 것이나 선택적으로 NNT-1 의 활성도를 증가시킬 것이다. 보존적인 치환은 하기 표 I 에 기술되어 있다.
본 발명은 NNT-1 유사체 종도 포함한다. 예를들어, 인체 이외에도 개, 고양이, 마우스, 랫, 원숭이, 말, 돼지, 염소, 토끼, 양 등의 포유동물 종의 NNT-1 유사체가 포함된다. 마우스 cDNA 와 단백질 서열은 서열 번호 : 4 및 5 에 나타나 있다.
또한 본 발명은 NNT-1 을 다른 폴리펩티드의 일부 또는 전부와 결합시키는 등의 키메라 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 키메라 폴리펩티드는 BDNF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5, NT-6 등과 같은 다른 신경영양성 인자의 일부 또는 전부와 결합시킨 NNT-1 을 포함한다. 폴리펩티드는 N 말단과 C 말단, C 말단과 C 말단 또는 N 말단과 N 말단끼리 결합시킬 수 있다.
Ⅱ.핵산
본원에서 핵산 분자를 언급할 때 사용된 용어 "NNT-1" 은 상기한 핵산 분자 또는 그의 단편을 말한다.
용어 "엄격한 조건" 이란 올리고누클레오티드 또는 cDNA 분자 프로브와 같은 핵산 분자가 높은 상동성을 갖는 서열에만 결합하도록 하는 조건하에서 혼성시키고 세척함을 의미한다. 엄격한 세척 용액 중 하나는 0.015 M NaCl, 0.005 M 시트르산나트륨 및 0.1 % SDS 로서 온도 55 ℃ - 65 ℃ 에서 사용한다. 그외의 엄격한 세척 용액으로는 0.2 × SSC 및 0.1 % SDS 가 있으며 온도 50 ℃ - 65 ℃ 에서 사용한다. 올리고누클레오티드 프로브를 cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝에 사용할 경우, 다음과 같은 엄격한 세척 조건을 사용할 수 있다. 프로토콜 중 하나는 올리고누클레오티드 프로브의 길이에 따라 35 ℃ - 62 ℃ 의 온도에서 0.05 % 피로인산나트륨을 함유하는 6× SSC 를 사용한다. 예를들어, 14 개 염기쌍으로 된 프로브는 35 - 40 ℃ 에서 세척하고, 17 개 염기쌍 프로브는 45 - 50 ℃ 에서 세척하며, 20 개 염기쌍 프로브는 52 - 57 ℃ 에서 세척하고 23 개 염기쌍으로 된 프로브는 57 - 63 ℃ 에서 세척한다. 비-특이 결합의 백그라운드가 높을 경우에는 온도를 2 - 3 ℃ 높일 수 있다. 두 번째 프로토콜은 올리고누클레오티드 프로브를 세척하기 위해 염화 테트라메틸암모늄(TMAC)을 사용하는 것이다. 엄격한 세척 용액 중 하나는 3 M TMAC, 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0 및 0.2 % SDS 이다. 이 용액을 사용하는 세척 온도는 프로브의 길이와 관계가 있다. 예를들어, 17 개의 염기쌍으로 된 프로브는 약 45 - 50 ℃ 에서 세척한다.
활성 분석시 활성인 폴리펩티드 자체를 코드하지는 않는 NNT-1 핵산 분자, 단편 및/또는 유도체는 포유동물 조직이나 체액 시료내 NNT-1 DNA 또는 RNA 존재 여부에 대하여 양적으로나 질적으로 실험하기 위한 진단 분석시 혼성 프로브로 유용할 것이다.
상기한 바와 같은 천연 또는 이종 시그널 펩티드 및/또는 키메라폴리펩티드에 결합시킨 NNT-1 폴리펩티드를 코드하는 NNT-1 핵산 분자도 본 발명의 범주내에 속한다.
Ⅲ.NNT-1 폴리펩티드의 제조방법
A.재조합 방법
온길이의 NNT-1 폴리펩티드 또는 그 단편은 Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) 및/또는 Ausubel 등의 eds, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. 및 Wiley 와 Sons, NY (1994) 문헌에 기술된 바와 같은 널리 공지된 재조합 DNA 기술 방법을 이용하여 제조할 수 있다. NNT-1 단백질이나 그 단편을 코드하는 유전자 또는 cDNA 는 예를들어 게놈 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 스크리닝하거나 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 대안으로서, NNT-1 폴리펩티드 또는 그 단편을 코드하는 유전자는 Engels 등의 Angew. Chem. Intl. Ed., 28 : 716 - 734 (1989) 문헌에 기술된 바와 같이 숙련자들에게 널리 알려진 방법을 이용한 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 방법들은 무엇보다도 핵산 합성을 위한 포스포트리에스테르, 포스포라미디트 및 H-포스포네이트 방법을 포함한다. 바람직한 화학적 합성 방법으로는 표준 포스포라미디트 화학을 이용하는 플리머-지지 합성이 있다. 일반적으로, NNT-1 폴리펩티드를 코드하는 DNA 는 그 길이가 수 백개의 누클레오티드로 이루어질 것이다. 약 100 개 보다 많은 누클레오티드로 이루어진 핵산은 이러한 방법을 이용하여 수 개의 단편으로 합성할 수 있다. 그런 다음 온길이의 NNT-1 폴리펩티드를 형성하기 위해 단편을 결합시킬 수 있다. 폴리펩티드의 아미노 말단을 코드하는 DNA 단편은 보통 메티오닌 잔기를 코드하는 ATG 를 가질 것이다. 이 메티오닌은 숙주 세포에서 생산되는 폴리펩티드가 세포에서 분비되는 지의 여부에 따라 성숙형의 NNT-1 폴리펩티드에 존재하거나 그렇지 않을 수 있다.
일부 경우에 있어서, 자연발생적인 NNT-1 의 핵산 및/또는 아미노산 변이체를 제조하는 것이 바람직하다. 프라이머가 바람직한 점돌연변이를 가질 경우, 핵산 변이체(여기에서는 하나 또는 그 이상의 누클레오티드가 야생형 또는 자연발생적인 NNT-1 과 다르도록 제조한다)는 부위 특이 돌연변이유발 또는 PCR 증폭을 이용하여 생산할 수 있다[돌연변이유발 기술에 대해 기재되어 있는 Sambrook 등의 상기문헌 및 Ausubel 등의 상기문헌 참조]. Engels 등의 상기문헌에 기재되어 있는 방법을 이용한 화학합성을 이러한 변이체 제조에 이용할 수 있다. 숙련자들에게 널리 알려져 있는 그외의 방법도 사용할 수 있다. 바람직한 핵산 변이체는 NNT-1 생산에 사용되는 숙주 세포에서의 선호 코돈에 관계된 누클레오티드가 치환된 것이다. 그외의 바람직한 변이체는 야생형에 대해 상기한 보존적 아미노산 치환체(예를들어, 자연발생적인 아미노산 곁사슬의 전하나 극성은 다른 아미노산에 의해 치환으로 그다지 변하지 않는다)를 코드하는 핵산이고/이거나 NNT-1 상에 새로운 글리코실화 및/또는 인산화 부위가 생성되도록 제조한 것이거나 NNT-1 상에 존재하는 글리코실화 및/또는 인산화 부위가 결실되도록 제조한 것이다.
NNT-1 유전자 또는 cDNA를 숙주 세포에서 발현시키기 위해 적당한 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 벡터는 사용된 특정 숙주 세포에서 기능성인 것으로 선택한다(즉, 벡터는 NNT-1 유전자가 증폭되고/되거나 유전자가 발현될 수 있도록 숙주 세포계와 양립되어야 한다). NNT-1 폴리펩티드 또는 그 단편은 원핵, 효모, 곤충(바쿨로바이러스계) 및/또는 진핵 숙주 세포에서 증폭/발현될 것이다. 숙주 세포를 선택하는 데 있어서 NNT-1 폴리펩티드나 그 단편이 글리코실화되었는 지에 따라 최소한 부분적으로나마 영향을 받는다. 따라서 효모, 곤충 또는 포유동물 숙주 세포가 바람직하다면 ; 효모 세포는 폴리펩티드를 글리코실화할 것이며 곤충 세포와 포유동물 세포는 그것이 NNT-1 폴리펩티드 상에서 자연발생하기 때문에(즉, "천연" 글리코실화 및/또는 인산화) 폴리펩티드를 글리코실화하고/하거나 인산화할 수 있다.
일반적으로, 특정 숙주 세포에 사용하는 벡터는 5' 측면 서열("프로모터" 라고도 함) 뿐만 아니라 그외의 조절 성분도 포함하는데, 이 조절 성분에는 인핸서, 복제 기원 성분, 전사 종결 성분, 공여체와 수용체의접합 부위를 포함하는 완전 인트론 서열, 시그널 펩티드 서열, 리보솜 결합 부위 성분, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 부위 및 선별가능한 표식(marker) 성분이 포함된다. 이들 각 성분은 아래에도 기술되어 있다. 선택적으로, 벡터는 "표지(tag)" 서열 즉, 폴리His(예를들어 헥사His) 또는 다른 짧은 면역원 서열을 코드하는 NNT-1 코딩 서열의 5' 말단이나 3' 말단에 위치한 올리고누클레오티드 서열을 포함할 것이다. 이 표지는 단백질과 함께 발현될 것이며, 숙주 세포로부터 NNT-1 폴리펩티드를 정제하기 위해 친화 표지로 작용할 수 있다. 선택적으로, 표지는 예를들어 선택된 단백질 가수분해 효소를 사용하여 여러 방법에 의해 정제된 NNT-1 폴리펩티드로부터 연속적으로 제거할 수 있다.
5' 측면 서열은 상동적(즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주), 이형적(즉, 숙주 세포 종이나 균주와는 다른 종), 혼성(하나 이상의 종과 5' 측면 서열의 복합체), 합성적일 것이며, 천연 NNT-1 5' 측면 서열일 것이다. 5' 측면 서열이 숙주 세포계에서 기능성이고 숙주 세포에 의해 활성화될 수 있다는 조건하에, 그 자체로서의 5' 측면 서열 원은 단세포성 원핵 또는 진핵 유기체, 모든 척추, 무척추 유기체 또는 모든 식물일 수 있다.
본 발명의 벡터에 유용한 5' 측면 서열은 본 분야에 잘 알려진여러 방법으로 수득할 수 있다. 통상적으로, NNT-1 5' 측면 서열과는 달리 본원에 유용한 5' 측면 서열은 지도화 및/또는 제한 엔도누클레아제 절단에 의해 미리 확인될 것이며, 따라서 적당한 제한 엔도누클레아제를 이용하여 적당한 조직원으로부터 분리할 수 있다. 어떤 경우에는 5' 측면 서열의 전체 누클레오티드 서열이 알려져 있다. 이런 경우 핵산 합성이나 클로닝에 대하여 상기한 방법을 이용하여 5' 측면 서열을 합성할 수 있다.
5' 측면 서열의 전부 또는 일부만이 알려져 있는 경우, PCR을 이용하고/하거나 동일한 종이나 다른 종의 5' 측면 서열 단편 및/또는 적당한 올리고누클레오티드와 함께 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 5' 측면 서열을 수득할 수 있다.
5' 측면 서열이 알려져 있지 않은 경우, 예를들어 코딩 서열이나 다른 유전자(들) 까지도 함유하는 DNA 대단편으로부터 5' 측면 서열을 함유하는 DNA 단편을 분리할 수 있다. 신중히 선택한 하나 또는 그 이상의 효소를 제한 엔도누클레아제 절단에 이용하여 적절한 DNA 단편을 분리할 수 있다. 절단 후에, 아가로스 겔 정제, Qiagen컬럼 또는 숙련자들에게 공지된 그외의 방법으로 원하는 단편을 분리할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 본 목적을 달성하기에 적당한 효소를용이하게 선택할 수 있을 것이다.
복제 기원 성분은 보통 상업적으로 구입하는 원핵 발현 벡터의 일부이며 숙주 세포에서의 벡터 증폭을 돕는다. 어떤 경우에는 일정한 복제수에 대한 벡터 증폭이 NNT-1 폴리펩티드의 최적 발현에 중요할 수도 있다. 복제 기원 부위를 함유하지 않는 벡터를 선택하였다면, 공지 서열을 기초로 화학적으로 합성하여 벡터 내로 결합시킬 수 있다.
전사 종결 성분은 보통 NNT-1 폴리펩티드 코딩 서열의 3' 말단에 위치하며, NNT-1 폴리펩티드의 전사를 종결시킨다. 일반적으로 원핵 세포내의 전사 종결 성분은 G-C 가 풍부한 단편 다음의 폴리 T 서열이다. 이 성분은 라이브러리로부터 쉽게 클로닝하거나 상업적으로 구입할 수 있기도 하나, 상기한 방법과 같은 핵산 합성 방법을 이용하여 쉽게 합성할 수도 있다.
선별가능한 표식 유전자 성분은 선택적인 배양 배지에서 성장하는 숙주 세포의 생존과 성장에 필요한 단백질을 코드한다. 전형적인 선별 표식 유전자는 (a) 암피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신 등의 항생물질이나 그외의 독소에 대한 내성을 원핵 숙주 세포에 부여하는 단백질 ; (b) 세포의 영양요구변이 결핍을 보충하는 단백질 ; 또는 (c) 복합 배지에서 이용할 수 없는 임계 영양을 공급하는 단백질을 코드한다. 선별할 수 있는 표식 중 바람직한 것은 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자이다.
일반적으로 샤인-달가노 서열(원핵 세포) 또는 코자크 서열(진핵 세포)이라 불리는 리보솜 결합 성분은 mRNA 의 번역 개시에 필수적이다. 이 성분은 합성될 NNT-1 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 및 프로모터의 3' 에 위치하는 것이 보통이다. 샤인-달가노 서열은 다양하지만 일반적으로 폴리푸린(즉, A-G 함량이 높은)이다. 여러 샤인-달가노 서열이 확인되었으며, 이들 각각은 상기 방법을 이용하여 용이하게 합성할 수 있으며 원핵 벡터에서 사용할 수 있다.
숙주 세포로부터 NNT-1 이 분비되는 것이 바람직한 경우에, 시그널 서열은 NNT-1 폴리펩티드가 합성되는 숙주 세포 안에서 밖으로 그것을 유도하기 위해 사용되며, 단백질의 카르복시-말단 부분은 막에 부착되는 것을 막기 위해 결실시킬 것이다. 일반적으로, 시그널 서열은 NNT-1 핵산 서열의 코딩 부위에 위치하거나 NNT-1 코딩 부위의 5' 말단에 일직선으로 위치한다. 다수의 시그널 서열이 확인되었으며, 선택된 숙주 세포에서 기능성인 그들 중 어떤 것은 NNT-1 유전자와 함께 사용될 것이다. 따라서 시그널 서열은 NNT-1 폴리펩티드에 대해 상동이거나 이종일 수 있다. 또한, 상기한 방법을 사용하여 시그널 서열을 화학적으로 합성할 수 있다. 대부분의 경우에 있어서, 시그널 펩티드 존재하에 숙주 세포에서 폴리펩티드가 분비됨으로써 폴리펩티드에서 아미노 말단 메티오닌이 제거될 것이다. NNT-1 폴리펩티드를 발현시키고 분비시키기에 유용한 분비 서열의 예는 tPA 리더 서열[예를들어, Rickles 등의 J. Biol. Chem. 263 : 1563 - 1560 (1988) 및 Feng 등의 J. Biol. Chem. 265 : 2022 - 2027 (1990) 참조], EPO 리더 서열 및 카디오트로핀 리더 서열 중에서 선택된다.
여러 경우에 있어서, NNT-1 폴리펩티드의 전사는 벡터 상에 하나 또는 그 이상의 인트론이 존재함으로써 증가된다 ; 이것은 NNT-1 이 진핵 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서 생산될 때 더욱 확실하다. 사용하는 NNT-1 서열이 특히 온길이의 게놈 서열 또는 그것의 단편일 경우에, 사용한 인트론은 NNT-1 핵산 서열 내에 자연발생적으로 존재할 것이다. 인트론이 NNT-1 DNA 서열(대부분의 cDNA 에 대하여) 내에서 자연발생적으로 존재하지 않을 경우에, 인트론은 다른 원에서 수득할 수 있다. 인트론이 효율적으로 전사되어야 하므로 5' 측면 서열과 NNT-1 코딩 서열에 대한 인트론의 위치는 중요하다. NNT-1 핵산 서열이 그 자체로서 cDNA 서열일 경우에, 인트론의 바람직한 위치는 전사 개시 부위의 3' 및 폴리A 전사 종결 서열의 5' 이다. NNT-1 cDNA 에 있어서 인트론은 그것이 코딩 서열을 방해하지 않도록 NNT-1 코딩 서열의 한 면이나 다른 면(즉, 5' 또는 3')에 위치하는 것이 바람직할 것이다. 인트론이 삽입되는 숙주 세포와 양립된다는 조건하에, 특정 바이러스, 원핵 및 진핵(식물 또는 동물) 유기체를 포함한 모든 원에서 수득한 인트론을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 또한 본원에는 합성 인트론도 포함된다. 선택적으로, 하나 이상의 인트론을 벡터에 사용할 수 있다.
상기 성분 중 하나 또는 그 이상이 사용할 벡터에 존재하지 않을 경우에는 개별적으로 수득하여 벡터에 결합시킬 수 있다. 각 성분을 수득하는 데 사용하는 방법은 숙련자들에게 잘 알려져 있으며 상기한 방법(즉, DNA 합성, 라이브러리 스크리닝 등)에 필적한다.
본 발명을 실시하는 데에 사용하는 최종 벡터는 보통 통상적으로 입수가능한 벡터와 같은 출발 벡터로부터 구성된다. 이러한 벡터는 모든 것을 갖춘 벡터에 함유되는 성분 중 일부를 포함하거나 그렇지 않을 수 있다. 원하는 성분 중 어느것도 출발 벡터에 존재하지 않는다면, 벡터 말단과 결합하려는 성분의 말단을 결합시킬 수 있도록 적당한 제한 엔도누클레아제로 벡터를 절단함으로써 개별적으로 벡터에 결합시킬 수 있다. 어떤 경우에는, 서로 맞붙는 두 말단이 제대로 결합되도록 "평활 말단화" 할 필요가 있다. 평활 말단화는 우선 네 개의 모든 누클레오티드 존재하에 클레노우 DNA 폴리메라제 또는 T4 DNA 폴리메라제를 이용하여 "접착 말단" 을 채움으로써 실시된다. 이 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며 예를들어 Sambrook 등의 상기문헌에 기술되어 있다.
선택적으로, 우선 벡터에 삽입되는 성분 중 둘 또는 그 이상을 서로 결합시킨 후(그 성분들이 서로 인접해 있다면) 벡터 내로 결합시킨다.
벡터를 구성하는 방법 중 하나는 반응 혼합물 내에서 여러 가지 모든 성분을 동시에 결합시키는 것이다. 성분의 부적절한 결합이나 삽입으로 인해 다수의 넌센스 또는 비기능성 벡터가 생성될 수 있지만, 기능성 벡터를 제한 엔도누클레아제 절단으로 확인하여 선택할 수 있다.
본 발명의 실시에 바람직한 벡터는 박테리아, 곤충 및/또는 포유동물 숙주 세포에 적합한 것이다. 이러한 벡터는 그중에서도 pCRⅡ (미국 캘리포니아 샌디에고 소재 인비트로겐 컴파니에서 구입), pBSⅡ(미국 캘리포니아 라졸라 스트라타진 컴파니에서 구입) 및 pETL(BlueBacⅡ ; 인비트로겐에서 구입)이 포함된다.
벡터를 구성하고 NNT-1 핵산을 적당한 벡터 내로 삽입시킨 후에, 모든 것을 갖춘 벡터가 NNT-1 폴리펩티드를 증폭 및/또는 발현시킬 수 있도록 적당한 숙주 세포 내로 삽입할 것이다.
숙주 세포는 원핵 숙주 세포(예, E. coli) 또는 진핵 숙주 세포(예, 효모 세포, 곤충 세포 또는 척추동물 세포)일 수 있다. 숙주 세포를 적당한 조건하에서 배양하였을 때, 숙주 세포가 NNT-1 단백질을 합성한 후에 이 단백질을 배양 배지로부터 수확하거나(숙주 세포가 단백질을 배지로 분비할 경우), 단백질을 생산하는 숙주 세포로부터 직접 수확할 수 있다(분비하지 않을 경우). 수확 후, 분자체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 NNT-1 단백질을 정제할 수 있다.
숙주 세포는 NNT-1 단백질이 글리코실화되는지 인산화되는지에 따라 (이 경우에는 진핵 숙주 세포가 바람직하다) 선택할 수 있으며, 숙주 세포에서 생물학적으로 활성인 단백질이 제조될 수 있도록 단백질을 천연 3 차 구조(예를들어, 이황화물 다리의 적당한 배치)로 "접을" 수 있는 숙주 세포를 선택할 것이다. 그러나, 숙주 세포가 생물학적으로 활성인 NNT-1 을 합성하지 않을 경우에 NNT-1 은 하기한 바와 같은 적당한 화학적 조건을 이용하여 합성한 후에 "접힐" 것이다.
적당한 세포 또는 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 3T3 세포와 같은 포유동물 세포일 것이다. 적당한 포유동물 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 산물 생산과 정제 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 그외의 적당한 포유동물 세포주에는 원숭이 COS-1 과 COS-7 세포주 및 CV-1 세포주가 있다. 포유동물 숙주 세포의 다른 예로는 형질전환 세포주를 포함하여 영장류 세포주와 설치류 세포주가 있다. 일차 이식편 뿐만 아니라 일차 조직의 시험관내 배양액에서 유도한 세포종인 정상 이배체 세포도 적당하다. 후보 세포는 선택 유전자가 유전자적으로 결핍되거나, 우세하게 작용하는 선택 유전자를 함유할 것이다. 다른 적당한 포유동물 세포주는 HeLa, 마우스 L-929 세포, 스위스(Swiss), Balb-c 또는 NIH 마우스에서 유도한 3T3 세포주, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하지만, 이것으로 한정되지는 않는다.
본 발명에 적합한 숙주 세포로 유용한 것에는 박테리아 세포도 있다. 예를들어, 다양한 E. coli 종(예를들어, HB101, DH5α, DH10 및 MC1061)은 생명공학 분야에서 숙주 세포로 널리 알려져 있다. 여러 종의 고초균(B. subtilis), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 그외의 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이시즈 종(Streptomyces spp.) 등도 본 방법에 사용할 수 있다.
본 분야의 숙련자들에게 공지된 다수의 효모 세포종 또한 본 발명의 폴리펩티드 발현 숙주 세포로 이용할 수 있다. 또한, 경우에 따라서는 곤충 세포도 본 발명의 방법에서 숙주 세포로 이용할 수 있다[Miller 등의 Genetic Engineering 8 : 277 - 298 (1986) 참조].
선택한 숙주 세포 내로 벡터를 삽입("형질전환" 이나 "형질감염" 이라고도 함)하는 것은 염화칼슘, 일렉트로포레이션, 현미주사, 리포펙션 또는 DEAE-덱스트란 방법 등을 이용하여 실시할 수 있다. 이러한 방법과 그외의 적당한 방법은 숙련자들에게 잘 알려져 있을 뿐더러 Sambrook 등의 상기문헌 등에 기술되어 있다.
벡터를 함유하는(즉, 벡터로 형질전환되거나 형질감염된) 숙주 세포는 숙련자들에게 널리 알려져 있는 표준 배지를 이용하여 배양할 수 있다. 배지는 보통 세포의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 함유할 것이다. E. coli 세포를 배양하기에 적당한 배지는 예를들어 루리아 육즙(LB) 및/또는 테리픽 육즙(TB)이다. 진핵 세포 배양에 적당한배지는 RPMI 1640, MEM, DMEM 이며, 이들 모두는 배양될 특정 세포주의 요구에 따라 혈청 및/또는 성장 인자를 보충할 것이다. 적당한 곤충 배양 배지는 필요에 따라 이스톨레이트(yeastolate), 락트알부민 가수분해물 및/또는 우태아혈청을 보충한 그레이스 배지이다.
일반적으로 형질감염 세포만을 선택적으로 성장시키는 데 유용한 항생물질이나 그외의 화합물은 배지 보충물로 첨가된다. 사용되는 화합물은 숙주 세포를 형질전환시키는 플라스미드 상에 존재하는 선별가능한 표식 성분에 의해 결정된다. 예를들어 선별가능한 표식 성분이 카나마이신 내성일 경우에, 배양 배지에 가하는 화합물은 카나마이신일 것이다.
숙주 세포에서 생산되는 NNT-1 폴리펩티드의 양은 본 분야에 공지된 표준 방법에 의해 측정할 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯 분석, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법, 비-변성 겔 전기영동법, HPLC 분리, 면역침전법 및/또는 DNA 결합 겔 이동 검정 등의 활성 검정을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.NNT-1 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되도록 구성되었다면, 폴리펩티드의 대부분은 세포 배양 배지 내에서 수득할 수 있을 것이다. 이런 식으로 제조한 폴리펩티드는 일반적으로 아미노 말단 메티오닌을 갖지 않는데, 그 이유는 세포에서 분비될 때 아미노 말단 메티오닌이 제거되기 때문이다. 그러나 NNT-1 폴리펩티드가 숙주 세포에서 분비되지 않는다면, 세포질(원핵 세포, 그람 양성 박테리아 및 곤충 숙주 세포)이나 주변세포질(그람 음성 박테리아 숙주 세포)에 존재할 것이며 아미노 말단 메티오닌을 가질 것이다.
세포내 NNT-1 단백질의 경우에는, 일반적으로 세포질 성분을 완충 식염수로 방출할 수 있도록 기계적으로 또는 삼투적으로 숙주 세포를 먼저 파쇄한다. 그런 다음 이 용액으로부터 NNT-1 폴리펩티드를 분리할 수 있다.
여러 기술을 이용하여 용액으로부터 NNT-1 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 폴리펩티드의 카르복시 말단이나 아미노 말단에 헥사히스티딘 (NNT-1/헥사His)이나 그외의 작은 펩티드와 같은 표지를 함유하도록 폴리펩티드를 합성하였다면, 컬럼 매트릭스가 표지나 폴리펩티드에 대해 직접적으로(즉, NNT-1 을 특이하게 인식하는 모노클로날 항체) 높은 친화성을 갖는 친화성 컬럼에 용액을 통과시키는 1 단계 과정을 통해 폴리펩티드를 정제할 수 있을 것이다. 예를들어, 폴리히스티딘은 니켈에 대해 고도의 친화성과 특이성을 가지므로, 니켈 친화성 컬럼(예, 퀴아젠 니켈 컬럼)을 NNT-1/폴리His 정제에 이용할 수 있다. 예를들어 Ausubel 등의 eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993) 문헌을 참조하라.
NNT-1 폴리펩티드가 표지를 가지지 않고 이용할 수 있는 항체도 없을 경우에는 공지된 다른 정제방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, HPLC, 겔 용리와 연합한 천연 겔 전기영동법 및 조제적 등전점 전기영동(호퍼 사이언티픽에서 입수한 "이소프림" 기구/기술)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 어떤 경우에는 상기 기술 중 둘 또는 그 이상의 기술을 연합하여 순도를 높일 수도 있다. 바람직한 정제방법은 예비 등전점 전기영동과 연합한 폴리히스티딘 표지 부가 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
NNT-1 폴리펩티드가 진핵 세포의 세포질이나 박테리아의 주변세포질에서 일차적으로 발견될 것으로 생각된다면, 세포 봉입체(예를들어, 그람 음성 박테리아)를 포함한 주변세포질이나 세포질에 함유되어 있는 단백질을 숙련자들에게 공지되어 있는 표준 기술로 세포에서 추출할 수 있다(단, 프로세싱된 폴리펩티드가 이러한 복합체를 형성할 경우에 한함). 예를들어, 주변세포질 성분을 방출시키기 위해 프렌치 프레스, 균질화 및/또는 초음파처리로 숙주 세포를 용균시킬 수 있다. 그런 다음 균질화물을 원심분리한다.
NNT-1 폴리펩티드가 주변세포질 내에서 세포 봉입체를 형성하였다면, 이 세포 봉입체는 때때로 세포내 막 및/또는 세포외 막에 결합하므로 원심분리 후 펠릿 물질에서 일차적으로 발견될 것이다. 그런 다음에는 세포 봉입체를 방출시켜서 파괴한 후 용해시키기 위해 구아니딘이나 요소와 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)로 펠릿 물질을 처리할 수 있다. 그런 다음 용해된 형태의 NNT-1 폴리펩티드는 겔 전기영동법이나 면역침전법 등을 이용하여 분석할 수 있다. NNT-1 폴리펩티드를 분리하고자 한다면, 하기한 방법과 Marston 등의 Meth. Enz., 182 : 264 - 275 (1990) 문헌에 기술되어 있는 방법을 이용하여 분리할 수 있다.
NNT-1 폴리펩티드 세포 봉입체가 숙주 세포의 주변세포질에서 상당량 형성되지 않는다면 세포 균질화물을 원심분리한 후의 상청액에서 NNT-1 폴리펩티드가 일차적으로 발견될 것이며, 하기한 방법을 이용하여 상청액으로부터 NNT-1 폴리펩티드를 분리할 수 있다.
NNT-1 폴리펩티드를 부분적으로 또는 완전히 분리하는 것이 바람직할 경우에는 숙련자들에게 널리 알려진 표준 방법을 이용하여 NNT-1 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 이러한 방법은 전기용리법, 여러 형태의 크로마토그래피(면역친화성, 분자체 및/또는 이온 교환) 및/또는 고성능액체 크로마토그래피 후에 전기영동을 통해 분리하는 방법을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 어떤 경우에는 이러한 방법 중 하나 이상을 이용하여 완전 정제하는 것도 바람직할 것이다.
B.화학 합성 방법
재조합 DNA 기술을 이용하여 NNT-1 폴리펩티드를 제조하고 정제하는 것 이외에도, 다음 문헌에 기술된 방법처럼 본 분야에 공지된 방법을 이용하여 NNT-1 폴리펩티드, 그것의 단편 및/또는 유도체를 화학 합성 방법(이를테면, 고체상 펩티드 합성과 같은 방법)으로 제조할 수 있다[Merrifield 등의 J. Am. Chem. Soc., 85 : 2149 (1964) ; Houghten 등의 Proc Natl Acad. Sci. USA, 82 : 5132 (1985) ; 및 Stewart 와 Young 의 Solid Phase Peptide Syunthesis, Pierce Chem Co, Rockford, IL (1984) 문헌 참조]. 이러한 폴리펩티드는 아미노 말단에 메티오닌을 갖거나 그렇지 않도록 합성할 것이다. 이들 문헌에 기술된 방법을 이용하여 화학적으로 합성한 NNT-1 폴리펩티드나 단편을 산화시켜 이황화물 다리를 형성시켰다. NNT-1 폴리펩티드나 단편은 치료방법 및 면역학적 방법에 있어서 천연의 정제된 NNT-1 폴리펩티드에 대한, 생물학적으로 활성이거나 면역학적 대용품으로 사용될 것이다.
Ⅳ.화학적으로 변이시킨 NNT-1 유도체
NNT-1 폴리펩티드를 중합체와 결합시킴으로써("NNT-1-중합체") 화학적으로 변이시킨 NNT-1 조성물(즉, "유도체")이 본 발명의 범주에 속한다. 선택한 중합체는 그것이 결합하는 단백질이 생리학적 환경인 수성 환경에서 침전되지 않도록 하기 위해 보통 수용성이다. 선택한 중합체는 일반적으로 아실화 반응에서의 활성 에스테르나 알킬화 반응의 알데히드와 같은 단일 반응기를 갖도록 변이시켜, 본 방법에서 제공하는 바와 같이 중합체화 반응 정도를 조절할 것이다. 중합체는 모든 분자량일 수 있으며 가지난 것이거나 그렇지 않을 수 있다. NNT-1-중합체의 범주에 속하는 것은 중합체 혼합물이다. 최종-산물의 치료학적 용도에 대하여 중합체는 제약학적으로 용인가능한 것이 바람직하다.
수용성 중합체나 그것의 혼합물은 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스 또는 그외의 탄수화물 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 산화 폴리프로필렌/산화 에틸렌 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜 중에서 선택될 것이다.아실화 반응의 경우, 선택한 중합체는 단일 반응성 에스테르기를 가져야 한다. 환원성 알킬화 반응의 경우, 선택한 중합체는 단일 반응성 알데히드기를 가져야 한다. 바람직한 반응성 알데히드는 수용성 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드이거나 그것의 모노 C1 - C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체이다(미국 특허 번호 제 5,252,714 호 참조).
예를들어 다음 문헌에 기술한 바와 같이, 본 분야에서 공지된 모든 폴리에틸렌 글리콜화 반응에 의해 NNT-1 의 폴리에틸렌 글리콜화를 실시하였다 : Focus on Growth Factors 3 : 4 - 10 (1992) ; EP 0 154 316 ; 및 EP 0 401 384 . 폴리에틸렌 글리콜화는 하기한 바와 같이 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응이나 알킬화 반응을 통해 실시하는 것이 바람직하다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화 반응은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 활성 에스테르 유도체와 NNT-1 단백질을 반응시키는 것이다. 모든 공지된 반응성 PEG 분자나 이후에 밝혀지는 반응성 PEG 분자를 NNT-1 의 폴리에틸렌 글리콜화에 사용할 것이다. 바람직하게, 활성화된 PEG 에스테르는 N-히드록시숙신이미드("NHS")로 에스테르화된 PEG 이다. 본원에 사용한 "아실화" 는 PEG 와 같은 수용성 중합체와 NNT-1 간의 아미드 결합, 카르바메이트 결합, 우레탄 결합 등을 의미하지만 이에 한정되지는 않는다[Bioconjugate Chem. 5 : 133 - 140 (1994) 참조]. 반응 조건은 폴리에틸렌 글리콜화 분야에 공지된 모든 방법이나 이후에 개발된 것들 중에서 선택할 수 있으나, 변이되는 NNT-1 종의 활성도를 없애는 온도, 용매 및 pH 조건은 피해야 한다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 보통 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 NNT-1 을 생성시키는데, 여기에서 리신 ε-아미노기는 아실 결합기를 통해 폴리에틸렌 글리콜화된다. 결합 고리는 아미드가 바람직할 것이다. 또한 결과적으로 생성된 산물의 적어도 약 95 % 는 모노, 디- 또는 트리- 폴리에틸렌 글리콜화되어야 바람직하다. 그러나, 보다 고도로 폴리에틸렌 글리콜화된 일부 종(NNT-1 의 리신 ε-아미노기 + NNT-1 의 아미노 말단의 α-아미노기의 최대 수에 달함)은 사용하는 특정 반응 조건에 따라 정상적으로 통틀어 형성될 것이다. 필요하다면, 보다 정제된 폴리에틸렌 글리콜화 종을 혼합물, 특히 비반응 종으로부터 다음과 같은 표준 정제 방법을 이용하여 분리할 수 있다 : 투석, 염석, 한외여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동법.
알킬화 반응에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 환원제의 존재하에 NNT-1 과 같은 단백질과 PEG 의 말단 알데히드 유도체를 반응시키는 것이다. 폴리에틸렌 글리콜화 정도에 관계 없이, PEG 기는 -CH2-NH- 기를 통해 단백질에 결합하는 것이 바람직하다. -CH2- 기에 관여하는, 이러한 형태의 결합을 "알킬" 결합이라 언급한다.
모노폴리에틸렌 글리콜화된 산물을 생산하는 환원성 알킬화를 통한 유도체화는 NNT-1 유도체화에 이용할 수 있는 일차 아미노기(리신 대 N-말단)의 다른 형태의 차등 반응성을 이용한다. 일반적으로, 반응은 리신 잔기의 ε-아미노기와 단백질 N-말단의 α-아미노기 간의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH(하기 참조)에서 실시한다. 이러한 선택적 유도체화에 의해, 알데히드와 같은 반응기를 함유하는 수용성 중합체의 단백질 결합이 조절된다 : 중합체와의 결합은 주로 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기를 그다지 변형시키지 않은 채로 단백질의 N-말단에서 일어난다. 본 발명은 NNT-1 단백질 상의 한 위치에서만(즉, 적어도 약 95 %) 중합체 분자가 실질적으로 결합하는 NNT-1 단백질을 의미하는, 실질적으로 균질한 NNT-1-모노중합체 단백질 복합체 분자를 제공한다. 본 발명이 폴리에틸렌 글리콜을 이용할 경우에는 더욱 특별하게, 항원성 결합기가 결핍되어 있고 NNT-1 단백질에 직접 결합하는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 갖는 폴리에틸렌 글리콜화된 NNT-1 단백질을 제공한다.
본원에서 사용하기에 바람직한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 약자로 PEG 이다. 본원에 사용한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 모노-(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜과 같은 다른 단백질을 유도하는 데 사용하는 모든 형태의 PEG 를 포함함을 의미한다.
일반적으로, 화학적 유도체화는 활성화된 중합체 분자와 생물학적으로 활성인 물질을 반응시키는 데 사용하는 모든 적당한 조건하에서 실시할 것이다. 폴리에틸렌 글리콜화된 NNT-1 을 제조하는 방법은 일반적으로 (a) NNT-1 이 하나 또는 그 이상의 PEG 기에 결합되는 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜(예, PEG 의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 NNT-1 폴리펩티드를 반응시키는 단계 ; 및 (b) 반응 산물을 수득하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 아실화 반응에 대한 최적 반응 조건은 공지된 파라미터와 원하는 결과를 기초로 결정할 것이다. 예를들어, PEG : 단백질의 비가 클수록, 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 산물의 백분율은 커진다.
실질적으로 균질한 모노-중합체/NNT-1 단백질 복합체 분자를 생산하기 위한 환원성 알킬화는 일반적으로 (a) 환원성 알킬화 조건하에서 NNT-1 단백질의 아미노 말단 α-아미노기를 선택적으로 변이시키기에 적당한 pH에서 반응성 PEG 분자와 NNT-1 단백질을 반응시키는 단계 ; (b) 반응 산물을 수득하는 단계를 포함한다.
모노-중합체/NNT-1 단백질 복합체 분자의 실질적으로 균질한 집단을 위하여, 환원성 알킬화 반응 조건은 NNT-1 의 N-말단에 수용성 중합체 부분에 선택적으로 결합할 수 있게 한다. 이러한 반응 조건들은 일반적으로 N-말단에서 리신 아미노기와 α-아미노기 사이에서 pKa 차이를 나타낸다(아미노기 중 50 % 는 양성자를 수여하고 나머지 50 % 는 그렇지 않은 pH 값인 pKa). pH 는 또한 사용할 단백질에 대한 중합체의 비율에 영향을 미친다. 일반적으로, 만일 pH 가 낮다면 단백질에 대하여 과량의 중합체가 바람직할 것이다(즉, N-말단 α-아미노기의 반응성이 적으면 적을수록, 최상의 조건을 수득하기 위해 더 많은 중합체를 필요로 할 것이다). 만일 pH 가 높다면, 중합체 : 단백질 비율은 높을 필요가 없다(즉, 반응성 기가 유용하면 할수록 중합체 분자는 적은 양을 필요로 한다). 본 발명의 목적에서, pH 는 일반적으로 3 - 5 범위, 바람직하게는 4 - 5 범위 이내이다.
또다른 중요한 고려 대상은 중합체의 분자량이다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 크면 클수록 단백질에 붙을 수 있는 중합체 분자의 갯수는 점점 적어진다. 유사하게, 중합체의 분지는 이러한 파라미터가 최적일때 고려되어야 한다. 일반적으로, 분자량(또는 더 많은 분지)이 크면 클수록 중합체 : 단백질 비율도 커진다. 일반적으로, 본원에서 실시하는 폴리에틸렌 글리콜화 반응에 대한 바람직한 평균 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 이다("약" 이란 용어는 ± 1 kDa 을 나타낸다). 바람직한 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 이며, 특히 바람직하게는 약 12 kDa 내지 약 25 kDa 이다. NNT-1 단백질에 대한 물 - 가용성 중합체의 비율은 일반적으로 1 : 1 내지 100 : 1 범위이고, 바람직하게는(폴리 폴리에틸렌 글리콜화에 대하여) 1 : 1 내지 20 : 1 및 (모노 폴리에틸렌 글리콜화에 대하여) 1 : 1 내지 5 : 1 이다.
상기 서술한 조건을 사용하는 환원성 알킬화 반응은 아미노 말단에 α-아미노기를 갖는 NNT-1 단백질에 중합체를 선택적으로 부착시키고, 모노 중합체/NNT-1 단백질 접합체의 실질적으로 균질한 제제를 제공할 것이다. "모노중합체/NNT-1 단백질 접합체" 라는 용어는 본원에서 NNT-1 단백질 분자에 부착된 단일 중합체 분자로 구성되는 조성물을 의미한다. 모노 중합체/NNT-1 단백질 접합체는 N-말단에 위치한 중합체 분자(리신 아미노 곁기상에 위치하지는 않음)를 갖는 것이 바람직할 것이다. 제제는 바람직하게 90 % 모노중합체/NNT-1 단백질 접합체보다 더 크며, 더 바람직하게는 반응하지 않은 것으로 관찰되는 분자(즉, 중합체 성분이 부족한 단백질)의 잔여물을 지니는 95 % 모노중합체/NNT-1 단백질 접합체보다 더 클 것이다. 하기 실시예는, 적어도 약 90 % 모노중합체/단백질 접합체와 약 10 % 반응하지 않은 단백질로 구성되는 제제를 제공한다. 모노중합체/단백질 접합체는 생물학적 활성을 갖는다.
본 환원성 알킬화 반응에 대해, 환원제는 수용액에서 안정하고, 환원성 알킬화 초기 과정에 형성된 쉬프 염기만을 환원시킬 수 있는 것이 바람직하다. 바람직한 환원제는 소듐 보로하이드라이드, 소듐 시아노보로하이드라이드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란 중에서 선택할 수 있다. 특히 바람직한 환원제는 소듐 시아노보로하이드라이드이다.다른 반응 파라미터(예를들어 용매, 반응시간, 온도 등.) 및 산물의 정제 수단은 수용성 중합체를 지닌 단백질의 유도체화에 관한 공개된 정보에 기초를 두어 결정될 수 있다.
중합체/NNT-1 단백질 접합체 분자의 혼합물은 상기에 기술한 바와 같이 아실화 반응 및/또는 알킬화 반응 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이중 하나는 혼합물내 포함하는 모노중합체/단백질 접합체 비율을 선택할 것이다. 따라서, 바람직한 위치에, 다양한 수의 중합체 분자가 부착된(즉, 디-, 트리-, 테트라 -, 등등) 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있고, 본 방법을 사용하여 제조한 모노중합체/NNT-1 단백질 접합체와 결합할 수 있다.일반적으로, 본 발명의 중합체/NNT-1 을 투여함으로써 경감 또는 조절가능한 증상은 일반적으로 NNT-1 분자에 대해 본원에서 상술한 것을 포함한다. 그러나, 본원에서 상술한 중합체/NNT-1 분자는 비-유도화된 분자와 비교하여 부가적인 활성을 갖고, 활성을 증가 또는 감소시키거나, 또는 다른 특성을 갖는다.
Ⅴ.조합
화학적으로 변형이 되었든 안되었든, NNT-1 폴리펩티드 및 그것의 단편은 단독으로 사용하거나, 예를들어 신경계 또는 면역계 질환의 치료시 신경영양성 인자, 시토킨, 인터페론, 인터루킨, 성장 인자, 항생물질, 항-염증성 물질, 신경전달물질 수용체 작동물질이나 길항물질 및/또는 항체와 같은 다른 제약학적 조성물과 결합하여 사용할 수 있다.
Ⅵ.항체
NNT-1 폴리펩티드, 그것의 단편 및/또는 유도체는 표준 방법으로 생성된 항체를 제조하는데 사용될 것이다. 따라서, NNT-1 폴리펩티드와 반응하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 반응 단편들도 또한 본 발명의 범위 내에서 고찰된다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 키메라, 단일-사슬 및/또는 이중 특이성이 있다. 전형적으로, 항체 또는 그것의 단편은 인체에서 만들어진 것과 같은 성질로 만들어야 한다("humanized"). 즉, 환자에게 투여했을때 항체에 대한 면역 반응을 예방하거나 최소화하도록 제조한다. 항체 단편은 Fab, Fab' 등과 같은, 본 발명의 NNT-1 과 반응하는 단편일 것이다. 또한 본 발명은 선택된 포유동물에 대한 항체로서 NNT-1 이나 그것의 단편을 사용한 다음, 공지된 기술에 의해 불멸 세포주를 형성하는 특정 암세포와 포유동물 세포(예, 비장 세포)를 융합함으로써 생성된 하이브리도마를 제시한다. 본 발명의 인체 NNT-1 폴리펩티드의 전체 또는 일부분에 대한 세포주 및 항체를 생성하기 위해 사용된 방법도 또한 본 발명에 포함된다.
항체는 그것의 수용체와 NNT-1 의 결합을 저해하는 정도로, 치료학적으로 사용될 수 있다. 항체는 체액내 NNT-1 의 존재를 탐지하도록 표지된 형태로 생체내 및 시험관내 진단학적 과정에 더 사용될 수 있다.
Ⅶ.치료학적 조성물 및 그것의 투여
본원에서 사용한, "유효량" 및 "치료학적 유효량" 이란 용어는 상기에서 진술한 대로 하나 또는 그 이상의 NNT-1 의 생물학적 활성을 유지하기 위해 필수적인 NNT-1 의 양을 뜻한다.
다양한 신경학적 장애 또는 질병을 치료하는 치료학적 조성물은 본 발명의 범위내에 포함된다. 그러한 조성물은 제약학적으로 용인가능한 담체를 함유한 혼합물내에 NNT-1 폴리펩티드 또는 그것의 단편(둘 중 하나는 화학적으로 변이가능함)의 치료학적 유효량을 포함한다. 담체 물질은 주사용 물일 수 있고, 바람직하게는 포유동물에 투여하는 용액에 다른 일반적 물질을 보충한 것일 수 있다. 전형적으로, NNT-1 치료학적 화합물은 하나 또는 그 이상의 생리학적으로 용인가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 결합한 형태의 정제된 NNT-1 폴리펩티드 또는 단편(화학적으로 변이가능함)을 포함하는 조성물의 형태로 투여될 것이다. 중성의 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 전형적인 적절한 담체이다. 바람직하게, 적절한 부형제(예, 수크로스)를 사용한 동결건조법으로 산물을 제형화한다. 다른 표준 담체, 희석제 및 부형제는 필요에 따라 포함될 수 있다. 전형적인 조성물은 NaCl 을 더 함유할 수 있는, 약 pH 4.0 - 4.5 인 시트르산염 완충용액을 포함한다.
NNT-1 조성물은 신체에 비경구적으로 투여할 수 있다. 대안적으로, 정맥내 또는 피하내로 조성물을 투여할 수 있다. 신체에 투여했을때, 본 발명에서 사용한 치료학적 조성물은 발열 물질이 없는, 비경구적으로 용인가능한 수용액 형태이다. pH, 등장성, 안정성 등을 고려하여, 이러한 제약학적으로 용인가능한 단백질 용액의 제제는 본 기술분야에 속한다.
본 발명을 실시하기에 유용한 NNT-1 조성물의 치료학적 제제형은 동결 건조시킨 케익 또는 수용액 형태로 임의의 생리학적으로 용인가능한 담체, 부형제 또는 안정화제[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990)]를 함유한 바람직한 정도의 순도를 갖는, 선택한 조성물을 혼합함으로써 저장할 수 있도록 제조하였다. 용인가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 수용자에게 비독성이며, 사용되는 농도 및 투약량에서 불활성인 것이 바람직하며, 다음과 같은 완충용액을 포함한다 ; 인산염, 시트르산염 또는 다른 유기산 ; 아스코르브산과 같은 산화방지제 ; 저분자량 폴리펩티드 ; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질 ; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체 ; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산 ; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물 ; EDTA 같은 킬레이트제 ; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜 ; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온 ; 및/또는 트윈(Tween), 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제.
생체내 투여에 쓰이는 NNT-1 조성물은 멸균해야 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과함으로써 쉽게 수행된다. NNT-1 조성물이 동결건조된 곳에서, 동결건조 및 재구성 전이나 후에 이러한 방법을 사용한 멸균을 실시하였다. 비경구적 투여용 조성물은 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장될 것이다.
치료학적 조성물은 일반적으로 정맥주사 용액 백(bag) 또는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 가진 유리병 등의 멸균된 접촉 포트를 갖는 용기에 저장한다.조성물의 투여 경로는 예를들어, 경구 ; 정맥내, 복강내, 대뇌내(실질내), 흉실내, 근육내, 안(眼)내, 동맥내, 병소내의 경로를 통하거나 서방성 시스템(sustained - release system)에 의한 주사 또는 주입 ; 또는 선택적으로 카테터 사용을 포함하는 이식기구를 통한 공지된 방법과 일치한다. 필요한 곳에, 주입, 환괴 주사 또는 이식기구에 의해 조성물을 계속해서 투여할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, NNT-1 은 NNT-1 폴리펩티드를 세포막, 스폰지 또는 다른 적절한 물질에 흡수시켜 손상된 부위로의 이식을 통해 국부적으로 투여할 수 있다.
이식기구가 사용되는 곳에, 그 기구는 예를들어 대뇌실 또는 뇌실질 같은 적절한 조직 또는 기관내로 이식될 수 있으며, NNT-1 수송은 환괴 투여 또는 계속적인 투여, 또는 연속적 주입을 이용하는 카테터를 통해 직접 이루어진다.
NNT-1 폴리펩티드는 서방성 제제형 또는 제제로 투여될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 일정한 형태를 갖춘, 예를들어 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스에는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드(미국 특허 제 3,773,919 호, 제 EP 58,481 호 참조), L-글루타민산 및 감마 에틸-L-글루타민의 공중합체[Sidman 등의, Biopolymers, 22 : 547 - 556 (1983) 참조], 폴리(2-히드록시에틸-메타아크릴레이트)[Langer 등의, J. Biomed. Mater. Res., 15 : 167 - 277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12 : 98 - 105 (1982) 참조], 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer 등의, 상기문헌 참조) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산(제 EP 133,988 호 참조)이 있다. 서방성 조성물에는 또한 리포솜이 포함되는데, 리보솜은 본 분야에 공지된 몇 가지 방법을 통해 제조된다[예를들어, 제 DE 3,218,121 호 ; Epstein 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688 - 3692 (1985) ; Hwang 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4030 - 4034 (1980) ; 제 EP 52,322 호 ; 제 EP 36,676 호 ; 제 EP 88,046 호 ; 제 EP 143,949 호 참조].
몇몇 경우에서, 생체외 방법으로 NNT-1 조성물을 사용하는 것, 즉 환자로부터 분리한 세포 또는 조직을 치료한 다음 다시 환자에게 이식하는 것이 바람직하다.
다른 경우에서, NNT-1 은 NNT-1 폴리펩티드를 발현 및 분비하도록 유전공학적으로 처리한 환자의 특정 세포에 이식함으로써 수송된다. 그러나 세포는 동물 세포 또는 인체 세포일 수 있으며, 환자 자신의 조직에서 유도되거나, 인체 또는 비-인체의 다른 원(source)에서 유도될 수 있다. 임의로 그 세포를 불멸화(immortalized)할 수 있다. 그러한 세포는 뇌, 부신 또는 다른 적절한 신체 조직 또는 환자의 기관에 이식할 수 있다.
특정 상황에서, 신경학적 또는 면역학적 질환으로 고생하는 환자에게 NNT-1 을 투여하기 위해 유전자 치료방법을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 상황에서, NNT-1 을 코드하는 게놈 DNA, cDNA, 및/또는 합성 DNA 또는 그것의 단편이나 변이체는 조성물이 주사될 조직에서 활성을 나타내는 본질적 또는 유도성 프로모터에 사용가능하게 결합될 것이다. 이러한 NNT-1 DNA 구성물을(벡터에 삽입된 구성물 또는 벡터없이 구성물 단독) 뇌 또는 다른 조직(신경원성 또는 비-신경원성)으로 직접 주사할 수 있다.
대안적으로, NNT-1 DNA 가 시토메가로바이러스(CMV) 프로모터, 로우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터 또는 근육 크레아틴 키나아제 프로모터와 같은 근육 조직내에서 활성적인 프로모터와 사용가능하게 결합되면, NNT-1 DNA 구성물은 그것이 세포내로 흡수되어 세포내에서 발현될 수 있는 근육 조직에 직접 주사될 수 있다. 전형적으로, DNA 구성물은(NNT-1 DNA 와 프로모터 이외에) 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및/또는 허피스 바이러스 벡터와 같은 벡터에서 수득한 벡터 서열을 포함할 것이다. 벡터/DNA 구성물을 주사하기 위해 제약학적으로 용인가능한 담체와 혼합할 수 있다.
치료학적으로 사용하는 NNT-1 조성물의 유효량은, 예를들어, NNT-1 의 사용경과, 투여 경로 및 환자의 상태 같은 치료학적 징후에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료사에게 있어서 투약량을 적정하고 최적의 치료학적 효과를 얻기위해 필요한 투여 경로를 수정하는 것은 필수적일 것이다. 전형적인 하루 투약량은 약 0.1 ㎍/kg 내지 10 mg/kg 또는 그 이상의 범위이며, 투약량은 상기에서 언급한 요소에 따라 달라진다. 전형적으로, 임상가는 원하는 효과를 얻을 수 있는 투약량까지 NNT-1 조성물을 투여할 것이다. 따라서 NNT-1 조성물은 1 회분 투약량 또는 일정 시간동안 2 회분이나 그 이상의 투약량(NNT-1 의 동일량을 포함하거나 포함하지 않음), 또는 이식기구나 카테터를 통한 연속적인 주입으로 투여할 수 있다.
부가적 연구를 실시함으로써 다양한 환자에서 다양한 상태를 치료하기 위한 적절한 투약량 수치에 관한 정보를 얻을 것이며, 본 분야의 숙련자는, 치료학적 정황, 치료시의 질환 형태, 수용자의 연령 및 일반적 건강을 고려하여 적절한 투약량을 결정할 수 있을 것이다.
Ⅷ.NNT-1 으로 치료되는 증상
NNT-1 발현 패턴의 변형과 관련되며 NNT-1 이나 항-NNT-1 항체에 노출되어 효험있는 중추 또는 말초 신경계의 질병 및 장애를 치료하기 위해 NNT-1 단백질, 그것의 단편 및/또는 유도체가 사용된다.
NNT-1 단백질 및/또는 그것의 단편이나 유도체는 중추, 자율 또는 말초 신경계가 퇴화되었거나 및/또는 선천성 질병, 외상, 물리적 손상, 수술, 발작, 국소빈혈, 감염, 대사성 질환, 영양결핍, 악성 종양 및/또는 독성 시약으로 손상입은 환자를 치료하기 위해 사용한다. 좀더 특이적으로, NNT-1 단백질 수치는 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 샤르코-마리-투드 증후군, 헌팅톤병, 당뇨병이나 다른 대사성 질환에 의한 말초 신경병 및/또는 색소성 망막염, 약물-유도 망막증, 정지형의 야맹증, 진행성 콘-로드 변성 등과 같은 신경 망막 변성 또는 영양실조와 같은 증후에 대해 조절(높게 또는 낮게 조절됨)될 것이다. 또한 NNT-1 이 면역계 세포에서 발현되기 때문에(하기 실시예 Ⅴ 참조), 면역질환에 의해 야기되는 질병을 치료하는데 유용하다. NNT-1 이 또한 조혈세포에서 발현되기 때문에(하기 실시예 Ⅴ 참조), 조혈계의 질환에 의해 야기되는 질병을 치료하는데도 유용하다.
게다가 NNT-1 단백질, 그것의 단편 및/또는 유도체는 B-세포 및/또는 T-세포, 바람직하게는 B-세포를 포함한 면역계의 질병 및 장애를 치료하는데 사용될 것이다. 본원의 실시예 Ⅸ - XI 에서 볼 수 있듯이, NNT-1 은 B-세포 자극 활성을 갖고 있으며 B-세포보다는 적은 정도의 T-세포 생산 자극 활성을 갖고 있다.
몇몇 주요한 체액성 면역결핍은 이러한 요소에 대하여 표적이 될 가능성이 있다. 다소 희귀할지라도, 이러한 질병은 모두 만성이며 장기간의 치료를 필요로 한다. 첫번째로 고려되는 것은, 다소의 혈행성 B-세포의 정상 수치로 특정화되지만 면역글로불린을 생산하는 세포로 적절하게 분화되는 능력이 미흡한, 보통의 다양한 면역결핍 또는 CVID 이다. CVID 를 갖고 있는 사람은 회귀성 박테리아에 감염되기 쉽다.
다른 NNT-1 표적 질환은 회귀성 감염을 야기하는 선택적 IgA 결핍이며, 보통 폐, 위장 및 생식기관에 제한된다. 선택적 IgA 결핍은 집단의 0.03 % - 0.97 % 사이의 이환율을 갖는 이러한 질병들 중 하나이다.
다른 NNT-1 표적 질환은 저 감마글로불린혈증의 다양한 형태, X-결합된 감마글로불린혈증 및/또는 회귀성 감염, 신장 결핍 또는 지아르디아증 같은 이러한 질환 중의 하나와 연관된 상태를 포함한다. Clin. Immunol. and Immunopath., 40(1) : 13 - 24 (1986) 참조.
특정 백신에 대한 체액성 면역 반응을 증강시키는 것은 NNT-1 폴리펩티드의 또다른 용도이다. 예를들어, 경구적 백신 투여로 인한 항체 생산은 흔히 불충분하며, 따라서 제한된 시간을 엄수해야 한다. 접종시 항체의 생산을 증진시키기 위해 보조제로서의 NNT-1 용도가 기대된다.그것의 LPS-유도 TNF-α 생산을 저해하는 능력 때문에, NNT-1 은 패혈증 치료에 사용할 수 있다. 이러한 매우 중요한 임상적 문제 해결에 대한 많은 생물학적 반응 변경사항에 기초를 둔 연구는 정확한 유효성이 입증되지 않았으며, 실패한 다른 치료학적 대상에서 NNT-1 이 성공할 가능성을 함유한다. 야리쉬-슈바르쯔만 반응은 패혈증과 유사한 임상적 증상이며, 엄밀하게는 TNF 독성 작용의 결과이다. 항-TNF 항체를 사용하는 것은 이런 증상을 치료하는데 임상적으로 결과가 좋은 방법임이 입증되었다. 이는 NNT-1 이 그것의 항-TNF 및 항-염증 성질면에서 임상적 가치를 나타내는 증상이다.
Ⅸ.NNT-1 저해제에 대한 스크린 분석
일부 상황에서는, NNT-1 활성 수치를 저해하고, 현저하게 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. NNT-1 활성을 저해하는 화합물은 생체외 방법, 또는 국부적 또는 정맥주사에 의하거나, 경구 투여, 이식기구 등에 의한 생체내 방법으로 투여 가능하다. 하기에 기술된 분석은 NNT-1 활성을 저해하는 화합물을 입증하는데 유용한 방법의 실시예를 제공한다.
쉽게 판독하기 위해, 다음의 정의는 분석을 기술하기 위해 본원에서 사용된다 ; "실험 분자들" 은 NNT-1 과 그것의 수용체와의 상호작용을 저지하는 잠재적 능력에 의해 전형적인 NNT-1 저해제로 평가되는 분자이다.
NNT-1 수용체는 예를들어 표지된(예를들어, 요오드화된) NNT-1 을 사용하는 발현 클로닝에 의해 분리될 수 있다.
정제된 단백질을 사용하여 시험관내 분석의 여러 형태는 NNT-1 활성을 방해하는 화합물을 입증하기 위해 실시하였다. 이러한 방해는 NNT-1 과 그것의 수용체와의 상호작용을 전형적으로 저해하는 화합물에 의해 일어날 것이다.
한 분석에 있어서, 정제된 NNT-1 단백질 또는 그것의 단편(예를들어, 상기 기술된 방법을 사용하여 제조함)은 미량역가 평판의 웰(well) 바닥에 부착하여 고정시킬 수 있다. 실험분자 뿐만 아니라 방사선 표지된 수용체도 웰에 한번에 또는 동시에 첨가한다. 배양 후에, 웰을 세척하고, 실험분자 존재하에 NNT-1/수용체 결합 정도를 결정하기 위해 방사능을 섬광계수기를 사용하여 측정하였다. 전형적으로, 분자는 여러 범위의 농도에 걸쳐 실험하고, 하나 또는 그 이상의 실험 분석 요소를 제거한 일련의 대조 "웰" 을 실험을 측정하는 정확도를 위해 사용할 수 있다. 본 분석의 변형은 웰에 수용체를 부착하고, 실험분자와 함께 방사선 표지된 NNT-1 을 웰에 첨가함을 포함한다. 배양 및 세척 후에 웰의 방사능을 측정하였다.
방사능 표지를 포함하는 몇몇 방법은 NNT-1 을 "마크" 하는데 유용하다. 예를들어, NNT-1 의 단백질은 125-I 또는 35-S 를 이용하여 방사선 표지할 수 있다. 대안적으로, NNT-1 을 코드하는 DNA 가 c-myc 에피토프 같은 펩티드를 코드하는 서열에 융합하는 NNT-1 융합 단백질이 있다. NNT-1-myc 융합 단백질은 myc 에 대하여 상업적으로 유용한 항체로 쉽게 탐지할 수 있다.결합 분석의 미량역가 평판 형태에 대한 대안으로는 아가로스 비드, 아크릴 비드 또는 다른 형태의 불활성 기질에 NNT-1 또는 그것의 수용체를 고정함을 포함한다. NNT-1 또는 그것의 수용체를 함유하는 불활성 기질을 방사선 표지 또는 형광 표지된 상보적 성분(수용체 또는 NNT-1 단백질)과 함께 실험 분자를 함유한 용액내에 두었다. 배양 후에, 불활성 기질은 원심분리하여 침전시키고, NNT-1 과 수용체 사이의 결합량은 상기에 기술한 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 대안적으로, 불활성 기질 복합체는 컬럼상에 고정시키고 실험분자 및 상보적 성분은 컬럼위로 통과시킨다. 그런 다음, NNT-1/수용체 복합체의 형성을 상기에서 기술한 방사선 표지, 항체 결합 등과 같은 기술을 이용하여 측정할 수 있다.
NNT-1 활성을 저해하는 분자를 확인하는데 유용한 시험관내 분석의 다른 형태는 표면 플라스몬 공명 검출기기를 제조업자의 프로토콜을 따라 사용한 비아코르 분석계(Biacore assay system ; 미국 뉴저지 피스카타웨이 소재의 파마시아에서 입수)이다. 이러한 분석은 본질적으로 검출기에 내장되어 있는 덱스트란-피복된 센서 칩에 NNT-1 또는 그것의 수용체가 공유결합함을 포함한다. 실험 분자 및 상보적 성분을 동시에 또는 순차적으로 센서 칩을 함유한 챔버에 주입한 다음, NNT-1/수용체의 결합량을 센서 칩의 덱스트란-피복된 면과 물리적으로 관련된 분자량 변화를 토대로 평가할 수 있다 ; 분자량의 변화는 검출기기로 측정가능하다.
몇몇 경우에 있어서, NNT-1 활성을 감소시키거나 또는 저해하는데 사용하는 둘 또는 그 이상의 실험분자를 함께 평가하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 경우에, 상기 기술한 분석은 첫번째 실험분자에 동시에 또는 순차적으로 부가적인 실험 분자를 첨가함으로써 쉽게 변형될 수 있다. 분석시 나머지 과정은 상기에 기술된 바와 같이 실시될 수 있다.
Ⅹ.형질전환 포유동물
해당 유전자의 발현 수치를 현저하게 감소시키거나 완전히 없애기 위해서 인체의 NNT-1 에 상당한 유전자(들)를 넉아웃("knocked out")시킨 마우스, 랫, 토끼, 염소 또는 양과 같은 인간을 제외한 포유동물들은 본 발명의 범주에 포함된다. 그러한 포유동물은 미국 특허 번호 제 5,557,032 호에 기술된 기술 및 방법을 사용하여 제조되었다. 또한 본 발명은 NNT-1(포유동물 NNT-1 의 천연형 또는 이형의 NNT-1 유전자)을 코드하는 유전자가 포유동물에 의해 과발현됨으로써 "형질전환" 포유동물을 만드는 마우스, 랫, 토끼, 염소 또는 양과 같은 인간을 제외한 포유동물을 더 포함한다. 이러한 형질전환 포유동물은 미국 특허 번호 제 5,489,743 호 및 1994년 12월 8일자 PCT 특허 출원 번호 제 WO 94/28122 호에 기술된 바와 같이 공지된 방법을 사용하여 제조되었다.
하기의 실시예들은 단지 설명을 위한 것이지 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다.
라이브러리 제조, DNA 클로닝 및 단백질 발현에 대한 표준 방법은 Sambrook 등의, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989] 및 Ausubel 등의, eds. Current Protocols in Molecular Biology Wiley, New York, NY [1995] 문헌에 기술되어 있다.
실시예 Ⅰ : NNT-1 에 대한 cDNA 클로닝 및 게놈 클론
A. cDNA 라이브러리의 구성
인체 T-세포 림프종 세포, 쥬라캣 세포를 10 % 우태아 혈청이 함유된 RPMI 400 배지에서 5 % CO2하에 37 ℃ 에서 배양하였다. 그 배지를 pH 7.5 의 10 mM HEPES 로 완충하였다. 8 번 계대배양 후에 그 세포를 2 개의 군으로 나누었다. 한쪽 군은 전면 생장(2 × 107세포/플라스크)시키고, RNA 는 "드라이버" RNA 역할을 하는 세포에서 수확하였다. 나머지 군은 "테스터" 군이며, 다음과 같이 처리하여 활성화 시켰다.
세포를 슈퍼항원 연쇄상구균 엔테로톡신 B 및 F(TSST) 80 ng/ml ; PKC 활성제, PMA 50 ng/ml ; 칼슘 이오노포어 A 21832 125 ng/ml 을 첨가하여 8 시간 동안 활성화 시켰다. 단백질 번역 저해제 시클로헥시미드도 1 mg/ml 농도로 첨가하였다. 다른 시간대에서 다른 군의 세포로부터 RNA 를 수확하였다.
1. 총 RNA 제제 :
세포를 300 ×g 에서 5 분 동안 원심분리하여 침전시키고 PBS(인산염 완충 식염수)로 세척하고 울트라스펙 Ⅱ(Ultraspec Ⅱ ; 미국 텍사스 소재의 바이오테크 인코포레이티드에서 입수)에 5 × 106세포/ml 의 농도로 재현탁시켰다. 그리고 나서 세포를 21-계기 주사기를 통해 4 번 통과시켜 용해시켰다. 균질화한 조제물을 15 분 동안 얼음에서 배양한 다음, 0.2 부피의 클로로포름을 첨가하여 잘 혼합하고, 추가 10 분 동안 얼음에서 재배양하고 30 ml 코렉스 튜브에서 30 분 동안 12000 ×g 로 원심분리하였다. 원심분리 후 상청액은 저장하고 잔여물은 버렸다. 0.5 부피의 이소프로판올을 첨가한 후에 분리 키트의 일부로 바이오테크에서 판매한 레진 고형물과 결합한 RNA 의 0.05 부피를 첨가하였다. 원심분리(5 분 동안 300 ×g )하여 레진을 펠릿화한 후에, 레진을 75 % 무-RN아제 에탄올로 2 번 세척하고 10 분 동안 50 ℃ 에서 공기를 쐬어 건조시켰다. 그런 다음 1 부피의 무-RN아제 물에 레진을 재현탁시키고, 1 분 동안 강하게 볼텍싱한 다음, 1 분 동안 13000 ×g 로 원심분리함으로써 레진에서 총 RNA 를 용리시켰다. 그런 다음 총 RNA 를 새로운 에펜도르프 튜브에 옮기고 레진 펠릿을 버렸다.
2. 폴리(A)+RNA 분리 :
퀴아젠의 올리고테크 mRNA 분리기기는 당업자가 기술한 바대로 사용한다 : 순수한 폴리(A)+RNA 를 수득하기 위해 실험과정을 2 번 반복하였다. 이것은 cDNA 내에 있는 리보솜 RNA 의 복제수를 최소화하기 위해 임의의 슈퍼항원자극을 받은 라이브러리에 있어 특히 중요하다. mRNA 통합은 분광학 및 포름아미드 변성 겔 전기영동으로 결정하였다.
BRL cDNA 합성 프로토콜을 따라 cDNA 제 1 가닥을 합성하였다. 표적 cDNA 로부터 잔여 mRNA 를 제거하기 위해, 제 1 가닥 cDNA 반응을 페놀/클로로포름 추출하여 2 M 아세트산 암모늄 및 3 부피의 에탄올로 침전시켰다. cDNA/mRNA 하이브리드를 2 mM EDTA 존재하에 0.3 M NaOH 에 재현탁시키고, 15 분 동안 68 ℃ 에서 배양하였다. 약 1.5 M 순수한 트리스 HCl 의 과량으로 가수분해 반응을 중화시켰다. 그런 다음 cDNA 를 페놀/클로로포름 추출하고 2 M 아세트산 암모늄 및 3 부피의 에탄올로 재침전시키고, 75 % 에탄올로 세척하고, 7 ml 의 살균한 물에 재현탁하였다. cDNA 의 단일 가닥을 뵈링거 맨하임 테일링 키트의 프로토콜에 따라 테일링하였다.
3. 드라이버 mRNA 제조 및 광비오틴화 :
폴리(A) RNA 를 상기 기술한 바와 같이 분리하였다. 약 20 mg 아세트산 광비오틴(시그마에서 입수)으로 두 번 광비오틴화 하고 무-RN아제 용액에 1 mg/ml 농도로 재구성 하였다. 과량의 광비오틴을 포화된 이소부탄올 용액으로 제거하고, 에탄올 침전시키고 30 ml 의 DEPC-처리 용액에 재현탁하였다.
4. 공제된 혼성화 반응 :
광비오틴화된 드라이버 mRNA 를 테스터 cDNA 로 공침전시키고 2 ml 의 무-RN아제 용액에 재현탁시켰다. 핵산을 용액에 첨가하기 위해, 제제를 간헐적으로 부드럽게 교반하여 몇 시간 동안 실온에 둔 다음, 68 ℃ 에서 20 시간 동안 더 배양하였다. 광비오틴화된 드라이버를 2 mg/ml 의 최종 농도로 용해하였다. 일반적으로, 드라이버 RNA 의 농도는 적어도 1 mg/ml 로 사용해야 한다.
5. 혼성화 후 하이브리드 제거 :
혼성화 후, 스트렙타비딘을 0.2 mg/ml 의 최종 농도에 첨가하고, 10 분 동안 실온에서 배양하였다. 스트렙타비딘을 페놀/클로로포름 추출로 제거하였다. 추출 후에, cDNA 를 에탄올로 침전시켰다.
한쌍의 프라이머 : AGCGCTACGGTCGACCCG GCG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT (ACG)X (서열 번호 : 15)(SalI T21 고정된 프라이머) 및 GGA AGG AAA AAA GCG GCC GCT ACA (서열 번호 : 16)(NotI-N9 프라이머)를 cDNA 를 증폭시키기 위해 PCR 에 사용하였다. 익스펜드 PCR 키트를 사용하였다. 라이브러리내에서 동일한 크기를 나타내도록 하는 겔 분획화 방법에 필요한 충분한 물질을 만들기 위해 15 주기를 실행하였다. 제 1 프라이머의 어닐링을 위해, PCR 의 초기 5 주기의 어닐링 온도를 35 ℃ 로 1 분 동안 수행하였다. 다른 크기의 분획을 나타내는 cDNA 를 겔상에서 분획화하였다. SalI 어댑터를 이중나선 cDNA 에 첨가하고, 이것을 NotI 로 절단하여 pSport 벡터에 클로닝하였다.
B. cDNA 클론의 분리
라이브러리는 발현된 서열 표지 분석으로 스크린하였다. 이런 라이브러리로부터 각각의 클론을 임의로 선택하고, 벡터 프라이머 및 태크 다이-터미네이터 리액션즈(Taq dye-terminator reactions ; 어플라이드 바이오시스템즈에서 입수)를 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 373A 오토메이티드 DNA 시퀀서(Applied Biosystems 373A automated DNA sequencer) 상에서 서열결정하였다. 임의로 선택한 클론 NNT-1 에서 수득한 결과적인 누클레오티드를 번역한 다음, FASTA 프로그램의 수정된 버젼을 사용하여 공지된 단백질 서열의 현존하는 데이타베이스와 비교하였다.
하나의 클론(khjl-00008-f2)은 번역된 아미노산 서열 수준에서 CNTF 와 약 21 % 의 상동성을 갖는다. cDNA 클론의 전체 삽입물 서열을 결정하여 전장 클론을 코드하는 것임이 밝혀졌는데, 즉, 전장 클론은 5' 말단에 Met 을 포함하고, Met 의 상류부분에 정지 코돈 및 3' 말단에 다른 정지 코돈을 포함한다.
이러한 전장 cDNA 의 서열은 도 1 에 나타나 있다. 단백질의 예상되는 아미노산 서열은 도 3 에 나타나 있다. 추정되는 시그널 펩티드는 아미노산 -27 번(Met) 내지 -1 번(Ala)에 걸쳐 존재한다.
C. 게놈 클론의 분리
NNT-1 의 게놈 DNA 는 인체 게놈 P1 라이브러리(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 게놈 시스템즈 인코포레이티드에서 입수 ; 카탈로그 번호 제 P1-2535 호)에서 수득하였다. 프로브로 NNT-1 cDNA 를 사용하여 라이브러리를 스크린하였다. 애머샴 레디프라임 키트(Amersham Rediprime kit ; 미국 일리노이 알링턴 하이츠 소재의 애머샴에서 입수 ; 카탈로그 번호 제 RPN-1633 호) 및 혼성화 용액 및 예비 혼성화 용액(50 % 포름아미드, 5× SSC, 5× 덴하르트(Denhardt), 0.05 % 피로인산 나트륨, 0.1 % SDS 및 100 mg/ml 연어 정자 DNA 를 함유함)을 사용하여 cDNA 를 방사선 표지하였다. 약 1 시간 동안 예비 혼성화를 실시하고, 42 ℃ 에서 약 16 시간 동안 혼성화를 실시하였다.
혼성화 후에, 여과기를 0.2× SSC 및 0.1 % SDS 로 42 ℃ 에서 약 30 분 동안 세척한 다음, 필름에 노출시켰다. 두 개의 양성 클론이 확인되었으며, 이러한 클론을 함유한 플라스미드는 게놈 시스템즈 인코포레이티드 프로토콜을 따라 정제되었다. 그리고나서 바로 플라스미드 DNA 를 서열결정하였다.
NNT-1 을 코드하는 게놈 서열은 도 2(서열 번호 : 3)에 나타나 있다. 그 유전자는 3 개의 엑손과 2 개의 인트론으로 구성되어 있다. 코드 부위는 대문자로 표기하고, 5' 비번역된 부위를 포함하는 비코드 부위, 인트론 및 3' 비번역된 부위는 소문자로 표기되어 있다.
실시예 Ⅱ : NNT-1 의 재조합 포유류 단백질의 제조
인체 NNT-1 cDNA 및 플래그-표지 펩티드를 포함한 발현 벡터는 융합 유전자의 PCR 증폭으로 구성되었다. 융합 유전자를 증폭하기 위한 PCR 에 다음과 같은 센스 및 안티-센스 프라이머를 사용하였다 : 5' 말단에 HindIII 부위를 갖는 센스 프라이머는 다음과 같고, 이는 아미노산 -27 번(Met) 내지 아미노산 -21 번(Asp)을 코드한다 :
5' 말단에 NotI 부위를 갖는 안티-센스 프라이머는 다음과 같고, 이는 플래그-표지 펩티드 및 3' 말단의 마지막 8 개 아미노산을 코드한다 :
융합 유전자를 P CEP4 벡터(미국 캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐 인코포레이티드에서 입수)내로 결합하였다. 리포펙틴(미국 메릴랜드 가이데스버그 소재의 BRL 에서 입수)으로 발현 벡터를 EBNA-1 293 세포내로 형질감염 시켰다. 형질감염 48 시간 후에, 293 세포 및 조정 배지 둘 다를 수확하고 항-플래그-표지 항체(미국 코네티컷 뉴 하벤 소재의 이스트만 코닥 컴파니에서 입수)를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 재조합 단백질의 대부분은 293 세포 용균액에서 발견되었다. 따라서, 항-플래그 항체 겔(미국 코네티컷 뉴 하벤 소재의 이스트만 코닥 컴파니에서 입수)을 293 세포 용균액으로부터 단백질을 정제하는데 사용하였다. 28 - 30 kd 단백질은 당업자 프로토콜을 따라 정제하였다. 이러한 재조합 단백질은 생물학적 기능 분석(운동 신경원 및 교감 신경원 생존 분석에 대한)에 사용된다. 단백질의 N-말단 아미노산은 시그널 펩티드로 예상되는 아미노산(아미노산 -27 번 내지 -1 번)이 잘려진 것을 나타내는 Leu (아미노산 1 번)으로 결정되었다.실시예 Ⅲ : 재조합 E. coli NNT-1 단백질의 제조
서열번호 : 2 의 아미노산 Leu(1) 내지 Phe(198) 을 코드하는 NNT-1 의 cDNA 클론을 pCFM 1656(ATCC 기탁번호 69576)의 유도체인 벡터 pAMG21 [1ux PR 프로모터(1ux 발현계의 설명에 대해 미국 특허 번호 제 5,169,318 호 참조) 하부에 유전자 삽입을 위한 적절한 제한 부위를 포함함]에 삽입하였다. 사용하는 숙주 세포는 E. coli K12, 균주 CGSC 6159(미국 코네티켓 뉴 하벤 소재의 예일 대학 유전 저장소에서 입수)이다. 숙주 세포를 표준 형질전환 과정을 사용하여 벡터로 형질전환 시킨 다음, 30 ℃ 에서 약 50 ul/ml 카나마이신을 함유한 2XYT 배지에서 배양하였다. 약 30 ng/ml 의 최종 농도로 배양 배지에 자가유도체 N-(3-옥소헥사노일)-DL-호모세린 락톤을 첨가함으로써 NNT-1 유전자 산물의 유도가 개시되며, 세포 봉입체를 현미경으로 관찰한 후에 약 6 시간 동안 30 ℃ 또는 37 ℃ 에서 배양액을 배양시켰다.
NNT-1 단백질 대다수가 세포 봉입체내에 위치하는 것으로 발견되었다. 그러므로, 세포를 펠릿화하여 세포 페이스트를 제조하였다. 세포 봉입체는 낮은 pH 로 용해시키고, 단백질은 연속적 침전으로 정제하였다. 순도를 측정하기 위해 SDS-PAGE 에 시료를 적하하기 전에 단백질을 투석하였다. 겔의 쿠마지에 염색은 적어도 95 % 순도의 단백질을 나타낸다.
실시예 Ⅳ : NNT-1 의 신경 생물학적 기능
A. 병아리 운동 신경원 분석
배발생일이 5.5 일된 병아리의 요추 척수로부터 운동 신경원(MN)이 풍부한 배양액을 제조하였다. 6.8 % 메트리자미드 농도구배를 사용하여 운동 신경원을 농후하게 하였다. 간단히, 요추 척수를 해부하고 수막 및 DRG 를 제거하였다. 척수를 L15 배지(미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재의 깁코/BRL 에서 입수)를 함유한 파파인에서 20 분 동안 37 ℃ 에서 배양하였다(미국 뉴저지 프리홀드 소재의 워싱톤 바이오케미컬 코포레이션에서 입수). 효소학적으로 저항력이 약한 척수 단편을 피펫팅하여 단일 세포로 해리시켰다. 세포 현탁액을 6.8 % 메트리자미드(독일 페인바이오케미카라 세르바에서 입수) 완충물 위에 적층하고, 튜브를 20 분 동안 500×g 로 원심분리하였다. 메트리자미드 완충물과 세포 현탁액 사이의 접촉면을 수집하고 배양 배지에 희석하였다. 그런 다음, 분획을 4 % BSA 완충물 위에 서서히 적층하고 10 분 동안 280×g 로 원심분리하였다. 3.6 mg/ml 글루코스, 5 ng/ml 셀렌산 나트륨, 6.25 ng/ml 프로게스테론, 0.1 mg/ml 콘알부민, 16 mg/ml 푸트레신 및 5 mg/ml 인슐린으로 보충한 10 % 우태아 혈청을 함유한 L15 배양 배지에 펠릿을 재현탁시켰다. 웰 당 10,000 세포로 96 웰 조직 배양 플레이트에 접종하였다. 신경영양성 인자(NNT-1 또는 CNTF)를 계열 희석하여 배양액에 첨가하고 3 일 동안 배양하였다. 3 일 후에, MTT 를 4.5 시간 동안 배양액에 첨가하였다. 포르마잔 산물을 용해시키고, 플레이트를 가시성 간섭으로 인하여 650 nm 를 공제하여 570 파장에서 판독하였다. 흡광도(OD) 판독은 배양액에서 생존하는 신경원 수에 대해 비례한다. 삼중의 웰의 570 nm(신경원 생존이 증가함)에서의 흡광도는 NNT-1 또는 CNTF 의 최종 농도의 함수로 플로팅된다.
분석의 결과는 도 7 에 나타나 있다. 570 nm 에서의 흡광도는 실제 판독의 1000 배를 나타낸다. 결과는 NNT-1 이 병아리 운동신경원 성장을 원조할 수 있음을 보여준다. 그것의 최대 활성은 CNTF 활성의 약 90 % 에 달한다.
B. 병아리 교감 신경원 분석
1 차 병아리 배 교감신경원 연결 신경절의 배양액을 제조하였다. 간단하게, 교감신경원 신경절을 병원체가 없는 수정된 달걀에서 제거하는데, 이 달걀은 습한 공기에서 37.6 ℃ 로 9 일간 배양되었다. 신경절을 37 ℃ 에서 10 분 동안 pH 7.2 인 10 mM HEPES 완충액을 포함한 2 가의 양이온이 없는 행크스 밸런스드 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution)에 먼저 노출시킨 다음 37 ℃ 에서 12 분 동안 상기의 변형된 행크스 밸런스드 염 용액에서 0.125 % 박토트립신 1 : 250 (미국 미시간 디트로이트 소재의 디프코에서 입수) 용액에 노출시켜 화학적으로 해리시켰다. 10 % 최종 농도에 우태아 혈청을 첨가하여 트립신화 반응을 정지시켰다.
이러한 처리 후에, 신경절을 10 % 우태아 혈청과 pH 7.2 인 10 mM HEPES 를 함유한 중탄산염을 갖는 글루코스 함량이 높은 둘베코의 변형 이글 배지(Dulbecco's high glucose Modified Eagle's Medium)로 구성된 용액에 옮기고 20-게이지, 1" 더블-허브드 스테인레스 강철 바늘로 대략 14 번 분쇄하여 기계적으로 해리시켰다.
그런 다음 해리된 신경절을 직경이 100 mm 인 조직 배양 접시(접시 당 대략 40 개의 해리된 신경절)에서 2 내지 3 시간 동안 배양 배지(10 % 우태아 혈청, 4 mM 글루타민, 60 mg/L 페니실린-G, 25 mM HEPES, pH 7.2 로 보충한 둘베코의 변형 이글 배지)에 플레이트 하였다. 이런 예비 플레이팅은(preplating) 비신경원 세포를 분리하기 위함이며, 비신경원 세포는 접시에 부착되고 신경원 세포는 부착되지 않는다. 예비 플레이팅 후에, 부착되지 않은 신경 세포를 원심분리하여 수득하고 배양 배지에 재현탁시켰으며, 웰 당 2500 신경 세포의 밀도로 96-웰 미량역가 조직 배양 플레이트 1/2 에 해당하는 부분에 웰 당 50 ml 로 플레이트 하였다. 미량역가 웰을 미리 pH 8.4 인 10 mM 붕산나트륨에 용해된 1 mg/㎖ 의 폴리-L-오르니틴 용액에 4 ℃ 에서 밤새 노출시키고, 살균 정제된 물에 세척하고 공기 건조시켰다.
노출시킨 세포에 대한 신경영양성 인자의 최종 농도는 다음과 같다 : 1) CNTF 표준에서, 9 개 점의 계열 희석 곡선은 100 ng/ml 에서 6 pg/ml 범위이고 ; 2) NNT-1 단백질에서, 9 개 점의 계열 희석 곡선은 100 ng/ml 에서 0.12 pg/ml 범위이다. 신경영양성 활성을 분석한 시료를 계열 희석한 25 ml 를 각각의 웰에 첨가하고 접시를 7.5 % CO2를 함유한 습한 공기중에서 37 ℃ 로 38 - 46 시간 동안 배양하였다. 그리고나서 pH 7.2 인 10 mM HEPES 를 함유한 중탄산염을 갖는 글루코스 함량이 높은 둘베코의 변형 이글 배지에 테트라졸리움 염색 MTT 의 1.5 mg/ml 용액을 웰 당 18 ml 로 첨가하였으며 배양액을 4.5 시간 동안 37 ℃ 배양기에 두었다. 그리고나서 pH 4.7 인 20 % 도데실 황산 나트륨을 함유한 50 % N,N-디메틸포름아미드 용액 75 ml 를 결정형 포르마잔 산물을 용해시키기 위해 첨가하고 플레이트를 최소 12 시간 동안 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 579 nm 에서의 흡광도는 자동 미량역가 플레이트 판독기를 사용하여 각각의 웰에 대한 650 nm 기준에 비례하여 결정하였다. 결과적으로 생성된 흡광도는 각각의 웰에 생존하는 세포 수에 대한 비율이며, 신경 세포는 색소를 감소시킬 수 있는 것으로 정의된다.
분석의 결과는 도 8 에 나타나 있다. 결과는 NNT-1 이병아리 교감 신경원 성장에 관여함을 나타내 준다.
실시예 Ⅴ : 조직 분배에 관한 노던 블롯 분석
인체 조직의 노던 블롯은 클론테크(미국 캘리포니아 팔로 알토 소재)에서 구입하였다. 노던 블롯은 인체 NNT-1 cDNA 프로브로 시험하였다. NNT-1 의 5' 및 3' 코드 부위를 스패닝한 2 개의 cDNA 단편을 표지하여 NNT-1 유전자의 조직 발현을 분석하기 위한 프로브로 사용하였다. 그 결과는 NNT-1 이 비장, 림프절 및 말초 혈액 림프구, 골수 및 태아간, 신장, 폐, 결장직장의 선암세포 SW480, HeLa 세포 S3, 폐 악성종양 A 549, 만성 골수성 백혈병 K-562 세포, 부르키드 임파종 라지 세포(Burkitt's lymphoma Raji cells)의 조직에서 2.2 kb 의 전사된 유전정보로 발현됨을 보여준다. 그 유전자의 조직 분화가 유전자가 면역계 또는 조혈 세포의 발생에 관여함을 시사한다.
실시예 Ⅵ : NNT-1 유전자의 염색체 위치
유전자의 염색체 위치는 FISH 로 측정하였다. 14 kb 의 게놈 단편을 BRL 바이오닉 라벨링 키트(BRL BioNick labeling kit)를 사용하여 dATP 로 비오틴화 하였다(15 ℃ 에서 1 시간). FISH 과정은 Heng 등의, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89 : 9509 - 9513, 1992 문헌에 따라 실시되었다. 그 결과는 유전자가 인체 CNTF 유전자 위치(염색체 11 q12)에 근접한 염색체 11 q13 에 위치함을 보여준다.
실시예 Ⅶ : 마우스 cDNA 클론의 분리
마우스의 일부 cDNA 클론을 인체 특이적 프라이머를 사용하여 배발생 11 일된 마우스 cDNA(미국 캘리포니아 팔로 알토 소재의 클론테크에서 입수)로부터 PCR 증폭하여 분리하였다. 전장 cDNA 클론을 5' RACE 및 3' RACE 로 수득하였다. 마우스 cDNA 누클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 도 4 및 5 에 각각 나타나 있다. 마우스의 단백질은 진화를 통해 고도로 보존된 단백질을 나타내는 인간의 단백질과 96 % 동일성을 공유한다. 인간의 단백질과 같이, 마우스의 단백질 또한 아미노산 2(Asn) 위치에 잠재적인 N-결합된 글리코실화 부위를 갖고 있다.
실시예 Ⅷ : 다른 군의 멤버와 NNT-1 의 비교
NNT-1 의 아미노산 서열은 단백질이 CNTF 군(서열 번호 : 12)에 속하는 것임을 시사하며, CNTF 군은 IL-11(서열 번호 : 8), IL-6(서열 번호 : 9), 카디오트로핀(cardiotrophin)(서열 번호 : 11), 온코스타틴 (oncostatin)(서열 번호 : 13) 및 과립구 군체-자극인자(G-CSF) (서열 번호 : 10)를 포함한다. NNT-1 과 다른 군 멤버 모두와의 아미노산 서열을 컴퓨터 프로그램 PILEUP 로 비교하고 그 결과는 도 6 에 나타나 있다. 이러한 군의 다른 모든 멤버와 같이, NNT-1 단백질의 2 차 구조는 4 개의 역-평행 알파-헬릭스를 갖고 있을 것으로 예상된다.
실시예 Ⅸ : NNT-1 형질전환 마우스의 표현형
A. NNT-1 형질전환 마우스의 표현형
NNT-1 유전자로 코드된 단백질은 CNTF 와 약간의 상동성을 가지며, 골수 및 신경 세포 분석에서 시험관내 활성을 나타낸다. NNT-1 으로 형질 감염된 골수를 이식한 마우스의 연구는 위장 - 관련 임파 조직내 가벼운(mild) 림프세포증식을 설명하지만 다른 명백한 표현형 변화를 설명하는 것은 아니다.
재료 및 방법
종: 마우스계통: BDF1연령: 17 주(120 일)
성별: 수컷/암컷실험물질: NNT-1 (WX240)
치료그룹
두 그룹에서 명백한 이상은 발견되지 않았다.
조직병리학 검사를 위해 완충된 아연 포르말린에 고정된 조직을 선택하여 총체적인 부검을 실시하였다(뇌, 심장, 신장, 부신, 십이지장, 췌장, 방광, 간, 폐, 비장, 전체적인 병변). 일상적인 조직학적 프로세싱 전에 조직을 밤새 고정시켰다. 데이타는 JMP(미국 노스 캐롤라이나 캐리 소재의 SAS 인스티튜트에서 입수) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석하였다.
실험 : 기관 무게, 체중, 조직병리학, 면역조직학, 노던 블롯.다음의 치료와 관련된 변화는 NNT-1-형질감염 마우스에 나타난다 :
형질전환 마우스에서 여포(B 세포) 부위 및 소동맥(T 세포) 부위와 관련된 현저하게 반응성인 림프구 과형성(도 10)을 비장이 조절한다. 림프구 과형성은 높은 발현자 마우스 # 62 에서 가장 현저하게 나타나며 (도 10), 부검시 나타난 거비증과 매우 관련되어 있다. 다른 높은 발현자 마우스 # 60 은 3 대 혈통 모두에서 대량 발산한 수질외 조혈을 동반하는 림프 부위의 약간의 과형성만을 나타낸다. 이러한 두 마리의 높은 발현자 마우스를 기초하여 NNT-1 의 비장성 효과에 대한 일반적 결론을 내리는 것은 어렵지만, 마우스 # 62 에서 나타나는 림프세포증식은 주입한 단백질을 이용한 연구 결과와 일치한다(하기의 실시예 X A 참조). 반면에 마우스 # 60 에서 발견된 EMH 는 먼저 실험한 시험관내 골수 배양 연구의 생체내 관련물을 나타낸다.
마우스 # 60 의 간은 림프구의 다병소성의 집합체, 및 혈관 주위의 공간을 침윤하고 간내의 "림프구형성도(islands of lymphopoiesis)"(도 12)와 닮은 독특한 형태로 근접한 동양혈관으로 확장하는 혈장 세포를 함유한다. 면역조직화학에 따라서, 림프구의 집합체는 B220+ 세포 및 CD3+ 세포로 구성되어 있다. 유사하지만 더 경증이며 전형적인 혈관주위의 림프구 침윤물도 마우스 # 62 에서 발견되었다. 간에서 발견된 다른 변화는 대조군 및/또는 형질전환 그룹내 각각의 마우스에서 산발적으로 발생한다.
위장관은 파이어판(Peyer's patches)(장-관련 림프 조직)의 활성 림프구 과형성을 최소로 조절한다. 유사하게, 이런 변화가 NNT-1 단백질을 주입한 본 연구의 현저한 특징이 아니더라도(하기의 실시예 X A 참조)경부 및 장간막의 림프절은 대조군에서보다 형질전환 마우스에서 더 활성적이다.
형질전환 마우스의 골수, 중추 및 말초 신경계는 정상으로 나타났다. 일반적으로, 다른 조직에서의 변화는 음성 대조군 및/또는 형질전환 그룹내 하나 또는 그 이상의 동물에서 산발적으로 발견되며, 형질전환 유전자(transgene)와 관련된 것으로 해석하지는 않는다.
본 연구의 데이타는 NNT-1 형질전환 마우스가 비장, 림프절, 장-관련 림프 조직, 신장 및 간을 포함한 다발성 말초 조직내에 있는 T 및 B 림프구 및 혈장 세포의 증식으로 특징되는 중요한 표현형을 갖는다는 것을 나타낸다. NNT-1 은 또한 말초 혈액 또는 골수에서 심각한 변화가 없을경우, 비장 및 췌장과 같은 몇몇의 말초 조직에서 수질외 조혈을 유도할 것이다. 따라서, NNT-1 형질전환 마우스의 데이터는 일반적으로 NNT-1 단백질로 주사한 7 일 간의 마우스 연구(하기의 실시예 X A 참조)에서의 발견을 뒷받침하는데, NNT-1 단백질 주사 연구는 골수 또는 중추 신경계에서 검출되는 효과없이 림프 조직의 증식을 유도한다.흥미롭게, 두 마리의 높은 발현자 NNT-1 형질전환 암컷 마우스에서 검출되는 사구체신염은 MRL/1pr(Fas-결핍) 마우스에서 나타나는 자연적인 사구체신염과 매우 유사하게 나타나는데, 이는 폴리클로날 B-세포 활성, 다발성 자가항체, 순환 면역 복합체 및 일반적으로 B-세포의 마커인 B220+ 으로 명명되는 CD45R 이소폼(isoform)을 발현하는 이중 음성(CD4- CD8- TCRab+ CD3+) T 세포의 비정상적 집단의 축적과 관련된 초기-시발 SLE-유사 자가면역 증후군을 발달시킨다(Singer 등의, Curr. Opin. Immunol., 6 : 913 -920, 1994 참조). 더욱이, NNT-1 의 생물학적 효과의 일부는 인터루킨-6 의 효과와 유사하며, 인터루킨-6(유사 CNTF, LIF 및 IL-11)은 gp 130 시그널링 트랜스듀서(signaling transducer)를 사용하고 간, 신장, 뇌, 피부, 면역계 및 조혈계에 다면 효과(pleiotropic effect)를 지닌다(Ryffel 등의, Int. Rev. Exp. Pathol., 34 A : 79 - 89, 1993 참조). 따라서, 말초 혈액 또는 조직에서 발견된 림프구가 유동 세포계수성 분석(flow cytometric analysis)에 의해 T 및 B 세포 마커의 이중 발현을 갖는 비정상적 표현형을 나타내는지를 결정하는 것이 중요할 것이다.
B. NNT-1 형질전환 시조(founder)의 FACS 면역표현형
분석된 조직
말초 혈액 샘플은 안와의 후방에서 채취하여 수득하였다. 시조 한배새끼 대조군(founder littermate control) 및 NNT-1 양성(PCR 에 의한) 마우스 각각의 그룹에서 9 개의 샘플을 얻었다 ; 이들을 응고시키지 않았다. 대략 샘플 당 20 - 40 ul 을 Fc 블록 항체와 함께 먼저 배양한 다음, 다양한 세포 표면 항원에 대한 형광성 항체로 배양하였다.
순환 말초 혈액에서 대부분 조혈 세포 집단을 분화하는 마커로 항체를 선택하였다. 또한, B 및 T-세포 활성/분화 마커는 발현된 서열 표지에 대한 라이브러리는 기원을 토대로 선택하였다. 라이브러리는 독성 쇽 증후군 독소(TSST)로 활성화된 쥬라캣 세포(T-세포주)로부터 형성하였다.
항체
Fc 블록(CD32/16) - 비특이적 결합을 억제하기 위한 예비-배양의 일부로, 총 21 개의 항체를 사용하였다. 단색 히스토그램으로 데이터를 분석하였다.
랫 IgG 형광체 이소티오시안산염 (FITC) + 랫 IgG 피코에리트린 (PE)
햄 IgG FITC + 햄 IgG PE
CD45 FITC + GR-1 (CD97) PE ----- 팬 백혈구 대 과립구
CD4 FITC + CD8 PE ------- T-세포 아형 헬퍼 대 킬러
Th1.2 FITC + B220 PE ----- T-세포 대 팬 B-세포 마커
CD69 FITC + CD28 PE ----- T 및 B 세포에 대한 활성 마커 또는 T 세포에만 해당하는 활성 마커
CD3 FITC + CTLA4 PE ------ 팬 T-세포 대 T-세포 활성
ckit FITC + Sca-1 PE------ 골수 및 선조 세포 대 선조 및 말초 림프구
CD40 FITC + CD40L PE ----- B-세포 다른 항원 대 동일한 t-세포 리간드
CD62L FITC + CD54 PE ----- B 및 T-세포상의 부착 분자 활성화
CD34 FITC(데이터가 분석되지 않았다)
결과
B220+, CD40+, CD62L+ 및 CD54+ 세포에 대하여 NNT-1 양성을 나타내는 동물 4 마리의 절대적 세포수에 있어 현저한 증가가 관찰되었다. 이러한 4 마리 동물은(# 24, 35, 60, 62) 노던 블롯에 의하여 발현자로 나중에 확정된다. B220+ 및 CD40+ 세포에서의 증가량은 상기 대조군의 2 - 4 배 사이의 범위이다. CD62L+(LECAM) 및 CD54+(ICAM)은 상기 대조군의 1. 5 - 3 배 사이의 범위이다. 4 개의 발현자 중 3 개에서 증가를 보이는 마커는 Sca-1(대조군의 2 - 6 배) 및 ckit(대조군의 2 - 3 배)를 포함한다. CD3, CD4, CD8, Thy1.2 를 포함하는 다른 마커는 4 개의 발현자 중 2 개에서 적당한 증가를 보이지만 지속적이지는 않다(이들이 모두 T-세포 마커라도, 그들 모두가 동일한 발현자에서 모두 양성을 나타내지는 않는다). GR1 은 발현자 중 하나에서 증가를 보이지만, 대조군 동물 중 하나에서 GR1+ 세포수가 훨씬 높게 나타나므로 이것은 중요하지 않을 것이다. 나머지 항체는 양성도 아니고, 현저하게 다르지도 않으며, 또는 CD34 경우에는 분석하기가 불가능하다.
요약
이러한 마우스에서는 순환 림프구 세포의 절대적 수에 있어 뚜렷한 증가가 관찰된다. T-세포수에서의 약간의 증가도 나타나지만, 림프구 집단에서의 이러한 증가는 근본적으로 B 세포로 구성된 것처럼 보인다. 림프구 집단은 활성화된 세포 형태에서 증가를 나타내지 않는다. 순환 골수종 세포 집단에서는 효과가 거의 없거나 아무런 효과도 나타나지 않는다. ckit 및 Sca-1 에서의 증가는 이러한 마커가 성숙한 순환 세포에서도 발견되므로 선조 세포에서의 증가와 반드시 연관되는 것은 아니다.
이러한 세포수 전체가 발현과 매우 관련되므로 데이터는 B-세포 유도 증식을 시사한다. 몇몇 동물의 T-세포 증가는 아마도 증가된 B-세포에 의해 생성된 다른 요소의 2 차적 효과일 것이다. B-세포에 대한 한 가지 흥미로운 관찰은 B220+ 세포와 CD40+ 세포간의 차이가 경미하지만 매우 일관되게 나타난다는 점이다. 이들 둘 모두가 B-세포 마커라 하더라도, CD40 도 또한 수상돌기 세포에서 발견된다.
실시예 Ⅹ : NNT-1 으로 주사한 마우스의 림프구 과형성
A. NNT-1 을 정맥내/피하로 주입하여 BDF1 암컷 마우스를 처리한 7 일 동안의 검사 연구
NNT-1 으로 코드된 단백질은 CNTF 와 약간의 상동성을 가지며 골수 및 신경 세포 분석에서 시험관내 활성을 갖고 있다. 본 연구의 목적은 7 일 동안 마우스에게 매일 투여할때 NNT-1 단백질이 전신에 미치는 효과와 잠재적 독성을 결정하는 것이다.
재료 및 방법
6 주된 암컷 BDF1 마우스 20 마리를 연구에 사용하였다. 마우스를 다음과 같은 치료 군으로 무작위로 나누었다(n = 5/군) :
1. PBS 완충 대조군 (7 일 동안 매일 1 회 정맥내 투약)
2. 1.5 ㎎/㎏ 의 NNT-1 (정맥내)
3. 0.15 ㎎/㎏ 의 NNT-1 (정맥내)
4. 1.5 ㎎/㎏ 의 NNT-1 (피하내)
전체적인 부검 전에 마우스를 단식시키지 않는다. 부검 한 시간 전에(마지막 투약 후 24 시간), BrdU(세포 증식 연구를 위해 50 ㎎/㎏ 첨가)를 마우스에게 복강내 주사하였다. 혈액학(헤모글로빈, 헤마토크리트, 적혈구 세포수, 혈소판 수, 평균 혈소판 부피, 총 백혈구 수 및 감별 백혈구 수) 및 임상 화학적 파라미터(알라닌, 아미노전이효소, 아스파르트산 아미노전이효소, 알칼린 포스파타제, 락트산 탈수소효소, 글루코스, 요소 질소, 크레아티닌, 총 단백질, 알부민, 글로불린, 칼슘, 인, 총 빌리루빈, 요산, 콜레스테롤 및 트리글리세리드)의 측정을 위해 심장을 천자하여 혈액을 수득하였다.
조직병리학 검사를 위해 완충된 아연 포르말린에 고정된 조직을 선택하여 총체적인 부검을 실시하였다[부신, 골수, 뼈(대퇴골), 뇌, 맹장, 기부 및 말단의 결장, 십이지장, 식도, 심장, 회장, 공장, 신장, 간, 폐, 유선, 난소, 췌장, 골격근, 피부, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 호흡관, 방광, 자궁, 질, 백색 및 갈색 지방 조직, 전체적인 병변]. 일상적인 조직학적 프로세싱 전에 조직을 밤새 고정시켰다. 비장, 간, 위, 신장 및 흉선에서 기관의 무게를 측정하였다.
결과
비장.NNT-1-처리 군에서 동맥주위 림프구 초(T-세포 부위) 및 여포(B-세포 부위)가 확장된 비장의 백색 수에서 현저한 림프구 과형성이 나타났다. 그러나, 수질외의 조혈 범위는 이러한 군에서 뚜렷이 증가하지는 않는데, 이는 이런 단백질이 생체내 조혈세포에서보다는 오히려 림프구에서 자극 효과 또는 성장 요소-유사 효과를 가짐을 시사한다.
림프절.NNT-1 으로 처리한 마우스는 림프절 피질의 여포(B-세포) 및 방피질(T-세포)의 현저한 반응성 림프구 과형성이 경증으로 나타난다. 이런 변화가 재조합 단백질에 대한 초기 면역 반응을 반영하더라도, 비장, 림프절, 파이어판 및 골수에서 나타난 일반화된 반응성 림프구 과형성의 정도는 NNT-1 의 특정한 치료와 관련된 효과를 나타냄을 시사한다.
요약 및 결과
본 연구에서 도출해 낸 결과 중 가장 중요한 발견은 NNT-1 으로 7 일간 치료한 마우스에서 림프 조직, 특히 비장 및 림프절의 증식이 유도된다는 것이다. 그러나, 이 단백질은 본 연구 조건하에서는 조혈 신경계나 중추 신경계에 검출가능한 정도의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
B. NNT-1 을 주사한 마우스의 FACS 분석
시약 및 마우스.재조합 인체 NNT-1 과 rhIL-1 은 미국 캘리포니아 사우전드 오크스 소재의 암젠 인코포레이티드에서 입수하였다. LPS (E. coli 0111 : B4)는 미국 캘리포니아 캠프벨 소재의 엘아이에스티 바이올로직 라보라토리스에서 입수하였다. 체중이 약 20 g 인 암컷 Balb/c 마우스는 미국 메사츄세츠 윌밍턴 소재의 찰스 리버 라보라토리스에서 입수하였다. 마우스는 일정한 온도와 습도를 유지하는 방에서 사육하였고, 12 시간 주기로 밝게/어둡게를 반복하였다. 마우스에게 표준 실험실 식이와 임의량의 물을 주었다. 동물과 그 사육에 관련된 과정은 국가법과 국제법 및 그 방침에 따른 공공 지침을 준수하였다(미국 국제 리서치 협의회의 실험실 동물 사육과 이용에 관한 지침, 1996 참조).
림프절 무게 및 세포의 수.7 일 동안 매일 5 ㎎/㎏ 의 NNT-1 또는 완충액을 마우스에게 복강내 주사하였다. 7 번째 주사 후 24 시간이 경과한 후에 마우스를 안락사시켜 말초(경관 및 액실러리) 림프절을 수집하였다. 림프절을 풀링하여 무게를 잰 다음 세포 현탁액을 제조하기 위해 균질화하였다. 시스멕스 셀 카운터(Sismex cell counter : 일본 고베 소재의 토아 메디칼 코포레이션에서 입수)로 세포의 수를 계수하고, 랫의 항-마우스 항-CD45R (항-B220) MAb(미국 캘리포니아 샌 디에고 소재의 파밍엔에서 입수)를 이용하여 직접적인 IF 로 염색하여 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest software : 미국 캘리포니아 산 조스 소재의 벡톤 앤드 디킨슨에서 입수)를 이용하여 FACSCAN 으로 분석하였다.
통계학적 분석.결과는 평균 ± 표준 오차로 나타낸다. TNF 값은 그것의 비스듬한 분포를 줄여 정상치가 되도록 로그-변환하였다. 분포의 정상치를 분석하기 위해 형질전환 전후에 샤피로-윌크스 실험 (Shapiro - Wilks test)을 실시하였다. 각 군간의 차이는 스튜던츠 t 실험(Student's t test)으로 분석하였다. 각 개체에 대하여 반복적으로 BW 를 측정하였으므로, 각 그룹간의 BW 차이와 동일한 군 내에서의 BW 차이는 반복 측정에 대한 분산을 분석함으로써 실험하였다(ANOVA).
림프절 무게 및 세포의 수.NNT-1 처리는 말초 림프절에서의 총 세포와 CD45-양성 세포의 수를 증가시켰다(도 17 참조).
실시예 XI : NNT-1 은 IL-6 군 중 시토킨의 생체내 활성도 특징을 나타낸다
시약, 마우스 및 통계학적 분석은 상기 실시예 X 의 B 에 기술한 바와 같다.
IL-1 에 의한 혈청 아밀로이드 A(SAA) 유도, 코르티코스테론의 강화 및 IL-6 유도, 및 LPS-유도 TNF 의 저해.5 ㎎/㎏ 의 NNT-1 을 단독으로 또는 IL-1(100 ng/마우스)이나 LPS(100 ng/마우스)와 함께 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에게는 NNT-1 대신에 용매(10 mM 아세트산염이 용해되어 있는 식염수)를 주사하였다. SAA 를 측정하기 위해서 NNT-1 이나 식염수를 투여한 지 8 시간 만에 후방의 안와총으로부터 혈액을 채취하고, 코르티코스테론과 IL-6 의 경우에는 투여 후 2 시간, TNF 의 경우에는 투여 후 1.5 시간 만에 혈액을 채취하였다. 5 또는 10 마리의 마우스로 이루어진 그룹에서 실험을 실시하였다.
통상적으로 입수가능한 키트(미국 캘리포니아 카마릴로 소재의 바이오겐에서 입수)를 이용한 ELISA 에 의해 혈청내에서 SAA, IL-6 및 TNF 를 측정하였고 ; 결과는 각각 ㎍, ng 및 pg/㎖ 로 나타내었다. 통상적으로 입수가능한 키트(미국 캘리포니아 코스타 메사 소재의 아이씨비 바이오메디칼에서 입수)를 이용한 RIA 에 의해 코르티코스테론을 측정하였고 ; 결과는 ng/㎖ 로 나타내었다.
IL-1 에 의한 SAA 유도, 코르티코스테론의 강화 및 IL-6 유도, 및 LPS-유도 TNF 의 저해.NNT-1 은 순환 SAA 를 유도하였다(도 13 참조). NNT-1 은 적은 투여량의 IL-1 에 의해, 혈청 코르티코스테론 또는 IL-6 의 유도를 강화시켰다(도 14 및 15 참조). NNT-1 은 그것을 단독으로 주사하였을 때에도 혈행내 코르티코스테론 양을 증가시키는 능력을 보였다. NNT-1 은 혈청 TNF 의 LPS 에 의한 유도를 저해하였다(도 16 참조).
결과 요약
염증이 진행되면, 염증-관련 병리학으로 구별되는 조직 손상과 기능 장애의 주요 원인이 되는 시토킨인 TNF 의 생산이 수반된다. 때때로 IL-1 은 TNF 와 함께 생산되며 염증 도중에 병인 조정자로 작용할 것으로도 생각된다. 코르티코스테로이드는 효율적인 음성 피드백 회로 (negative feed-back circuit)를 통해 IL-1 에 의해 유도되는, 매우 강력하고 광범위한 스펙트럼의 항-염증제이다. 코르티코스테로이드는 TNF 와 IL-1 둘 다의 생산을 저해한다. TNF 와 IL-1 둘 다에 의해 유도되는 IL-6 은 또한 또다른 음성 피드백 회로를 통해 TNF 와 IL-1 의 생산을 저해할 수도 있다.
적어도 IL-1 의 존재하에, NNT-1 이 코르티코스테로이드와 IL-6 을 유도할 수 있음은, 이 분자가 두 개의 생리학적 항-염증 회로를 강화시키는 능력이 있음을 시사하는 것이다. 이로써 TNF 와 IL-1 의 생산의 저해가 촉진되고 따라서 염증 진행의 완화를 촉진시킬 것이다. 코르티코스테로이드와 IL-6 생산을 각각 저해하는 것 이외에도, NNT-1 은 TNF 생산을 직접 차단할 수 있다. 흥미롭게도 NNT-1 의 이러한 성질이 위에서 대략적으로 설명한 항-염증 특성을 증가시킨다.
DNA 의 기탁
NNT-1 에 대한 인체 게놈 DNA 를 코드하는 벡터 P1 을 함유하는 E. coli 세포 DH10B(NNT-g-PI) 및 NNT-1 에 대한 인체 cDNA 를 코드하는 벡터 PSPORT 를 함유하는 E. coli 세포 DH10B 는 1997년 1월 17일자로 ATCC(미국 매릴랜드 록크빌 파크로운 드라이브 12301 에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)에 기탁하였으며(생존 실험 일자는 1997년 1월 21일임), 기탁 번호는 각각 98294 및 98295 였다.
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170 Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 175 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 212 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Protein (B) LOCATION: 1..182 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Region (B) LOCATION: -30..0 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu -30 -25 -20 -15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro -10 -5 1 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 5 10 15 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 20 25 30 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 35 40 45 50 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 55 60 65 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 70 75 80 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 85 90 95 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 100 105 110 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 115 120 125 130 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 135 140 145 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 150 155 160 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 165 170 175 Leu Arg Gln Met 180 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 204 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Protein (B) LOCATION: 1..174 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Region (B) LOCATION: -30..0 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln -30 -25 -20 -15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro -10 -5 1 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 5 10 15 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu 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  24. 다음 중에서 선택한, 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 NNT-1 폴리펩티드
    (a) 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드 ; 및
    (b) 서열 번호 : 2 의 아미노산 1 - 198 로 이루어진 폴리펩티드.
  25. 다음 중에서 선택한, 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 NNT-1 폴리펩티드
    (a') 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드 ; 및
    (b') 서열 번호 : 5 의 아미노산 1 - 198 로 이루어진 폴리펩티드.
  26. 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드로 이루어진, 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 NNT-1 폴리펩티드.
  27. 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드로 이루어진, 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 NNT-1 폴리펩티드.
  28. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 폴리펩티드가 아미노 말단 메티오닌을 갖지 않음을 특징으로 하는 NNT-1 폴리펩티드.
  29. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 폴리펩티드가 아미노 말단 메티오닌을 부가적으로 가짐을 특징으로 하는 NNT-1 폴리펩티드.
  30. 다음 중에서 선택한, 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 분리된 핵산 분자
    (a) 서열 번호 : 1 의 핵산 분자 ;
    (b) 서열 번호 : 3 의 핵산 분자 ; 및
    (c) 서열 번호 : 2 의 아미노산 -27 내지 198 또는 1 내지 198 로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
  31. 다음 중에서 선택한, 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 분리된 핵산 분자
    (a') 서열 번호 : 4 의 핵산 분자 ; 및
    (b') 서열 번호 : 5 의 아미노산 -27 내지 198 또는 1 내지 198 로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
  32. 서열 번호 : 1 의 분리된 핵산 분자.
  33. 서열 번호 : 3 의 분리된 핵산 분자.
  34. 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드를 코드하는 분리된 핵산 분자.
  35. 서열 번호 : 2 의 아미노산 1 - 198 을 코드하는 분리된 핵산 분자.
  36. 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 함유하는 벡터.
  37. 제 36 항의 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  38. 다음 단계를 포함하는, 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법
    (a) 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항의 핵산에 의해 코드되는 폴리펩티드를 숙주에서 발현시키는 단계 ; 및
    (b) 폴리펩티드를 분리하는 단계.
  39. 다음 중에서 선택한 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 분리되고 정제된 항체 또는 이의 단편
    (a) 서열 번호 : 2 의 폴리펩티드 ; 및
    (b) 서열 번호 : 2 의 아미노산 1 - 198 로 이루어진 폴리펩티드.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 분리되거나 정제된 항체 또는 이의 단편.
  41. 다음 중에서 선택한 운동 신경원 또는 교감 신경원의 성장을 촉진시키는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 분리되고 정제된 항체 또는 이의 단편
    (a) 서열 번호 : 5 의 폴리펩티드 ; 및
    (b) 서열 번호 : 5 의 아미노산 1 - 198 로 이루어진 폴리펩티드.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 분리되거나 정제된 항체 또는 이의 단편.
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