CZ300958B6 - Izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující antigenní polypeptid, expresní vektor, hostitelská bunka, protilátka a zpusob prípravy polypeptidu - Google Patents

Izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující antigenní polypeptid, expresní vektor, hostitelská bunka, protilátka a zpusob prípravy polypeptidu Download PDF

Info

Publication number
CZ300958B6
CZ300958B6 CZ20000263A CZ2000263A CZ300958B6 CZ 300958 B6 CZ300958 B6 CZ 300958B6 CZ 20000263 A CZ20000263 A CZ 20000263A CZ 2000263 A CZ2000263 A CZ 2000263A CZ 300958 B6 CZ300958 B6 CZ 300958B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
leu
gin
seq
ala
ser
Prior art date
Application number
CZ20000263A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2000263A3 (cs
Inventor
J. Bazan@Fernando
Original Assignee
Schering Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25413278&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ300958(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Schering Corporation filed Critical Schering Corporation
Publication of CZ2000263A3 publication Critical patent/CZ2000263A3/cs
Publication of CZ300958B6 publication Critical patent/CZ300958B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Rešení popisuje precištené geny kódující cytokiny u savcu, látky v tomto procesu zahrnuté vcetne precištených proteinu, specifických protilátek a nukleových kyselin kódujících tyto molekuly. Konkrétne je predmetem vynálezu izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující polypeptid vybraný ze skupiny sestávající ze SEQ.ID.NO:2, 4 a 5. Uvedený polynukleotid výhodne obsahuje kódující oblasti SEQ.ID.NO:1 nebo 3. Dalším predmetem vynálezu je izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující maturovaný polypeptid ze SEQ.ID.NO:2 nebo 4. Ve výhodném provedení tento polynukleotid obsahuje nukleotidy 64 až 567 ze SEQ.ID.NO:1 nebo nukleotidy 176 až 700 ze SEQ.ID.NO:3. Dalšími predmety vynálezu jsou expresní vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy polypeptidu, protilátka nebo její fragment vázající antigen a zpusob detekce prítomnosti antigenu v biologickém vzorku.

Description

Oblast techniky
Navrhovaný vynález popisuje proteinové přípravky které slouží ke kontrole biologie a fyziologie savčích buněk, konkrétně pak buněk savčího imunitního systému. Jedná se o přečištěné geny, bílkoviny, protilátky a podobné reagencie, sloužící k regulaci aktivace, vývoje, diferenciace a ío funkčnosti různých buněčných typů, včetně hematopoietických buněk.
Dosavadní stav techniky is Technologie rekombinantní DNA je v podstatě technika umožňující integrovat genetickou informaci z dárcovského zdroje do vektoru pro následné zpracování, jako je přenos do hostitelské buňky, přičemž přenesená genetická informace je kopírována a/nebo exprimována v novém prostředí. Genetická informace obvykle existuje ve formě komplementární DNA (cDNA) odvozené od mediátorová RNA (mRNA) kódující požadovaný bílkovinný produkt. Nosičem je obvykle plazmid s kapacitou dostatečnou pro inkorporací cDNA pro další replikaci v hostitelské buňce, a v některých případech, pro aktuální kontrolní expresi cDNA a tedy přímou syntézu kódovaného produktu v hostiteli.
V některých případech je známo, že imunitní reakce savců je založena na sérii komplexních buněčných interakcí, obecně nazývaných „imunitní síť“. Poslední výzkum přináší nový náhled na vnitřní mechanismy tohoto systému. Zatímco je jasné že většina reakce je závislá na křížové interakci lymfocytů, makrofágů, granulocytů a ostatních buněk, imunologové nyní přesto věří, že rozpustné proteiny, známé jako lymfokiny, cytokiny a monokiny hrají klíčovou roli v kontrole těchto buněčných interakcí. Existuje tedy obecný zájem je izolovat, charakterizovat a určit jejich mechanismus účinku na buněčné populace, porozumění čehož povede k značnému zlepšení v diagnostice a terapii celé řady medicínských abnormalit nebo poruch imunitního systému. Některé z těchto faktorů jsou hematopoietické růstové faktory, např. granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). Viz např. Thomson (1994, ed.) The Cytokine Handbook (2. vydání) Academie Press, San Diego, Metcalfand Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating
Factors Cambridge University Press a Aggaewal and Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub,
Lymfokiny zřetelně ovlivňují buněčnou aktivitu v celé řadě případů. Bylo prokázáno, že ovlivňují buněčnou proliferaci, růst a diferenciaci pluripotentních hematopoietických kmenových buněk na obrovské množství progenitorů různých buněčných linií, které dohromady tvoří komplexní imunitní systém. Poslušné a vyvážené interakce mezi buněčnými komponentami jsou nezbytné pro řádnou imunitní odpověď. Různé buněčné linie obvykle odpovídají odlišným způsobem, přičemž lymfokiny jsou sekretovány zároveň s dalšími aktivními látkami. Buněčné linie, obzvláště důležité pro imunitní reakci jsou dvě třídy lymfocytů: B-buňky, které produkují imunogíobuliny (proteiny schopné rozeznat a navázat se na cizorodý objekt a tak usnadnit jeho odstranění) a T-buňky různých podtříd, které sekretují lymfokiny a indukují nebo suprimují B- buňky a řadu dalších buněčných druhů (včetně dalších T-buněk), což je podstatou spolupráce imunitního systému. Tyto lymfocyty interahují s celou radou dalších buněčných populací.
Dalším důležitým buněčným typem jsou mastocyty (které nebyly dosud identifikovány ve všech savčích druzích), což jsou epitelíální buňky obsahující granule lokalizované proximálně ve vlásečnicích v celém těle. Tyto buňky se nacházejí ve vysokých koncentracích zejména v plicích, pokožce a gastrointestínálnim a genitourinámím traktu. Mastocyty hrají klíčovou roli v poruchách alergického charakteru, zejména pak při anafylaktickém šoku, a to následujícím způsobem
- když patřičný antigen propojí jednu třídu imunoglobulinu navázaných na receptory přítomné na povrchu mastocytu, mastocyt degranuluje a uvolní mediátory, tzn. histamin, serotonin, heparin a prostaglandiny, které způsobují alergickou reakci až anafylaktický šok.
Lepšímu pochopení a možnosti zlepšení terapie brání obecně problém s udržováním buněk imunitního systému in vitro. Imunologové objevili, že udržení těchto buněk v kultuře může být dosaženo za použití T- buněčného nebo jiného supematantu, který obsahuje řadu růstových faktorů, včetně celé řady lymfokinů.
Z výše uvedeného je patrné, že objev a vývoj nových lymfokinů, např. podobných G-CSF a/nebo lo IL-6, může přispět k rozvoji nových terapií pro široké spektrum degenerativních a abnormálních poruch, které přímo nebo nepřímo souvisí s imunitním systémem a/nebo hematopoietickými buňkami. Konkrétně objev a vývoj lymfokinů, které zlepšují nebo potencují přínosné aktivity známých lymfokinů je vysoce žádoucí. Navrhovaný vynález popisuje nové přípravky podobné interleukinům a podobným látkám, a způsoby jejich použití.
Podstata vynálezu
Navrhovaný vynález je zaměřen na savčí, např. psí, kočičí, myší nebo primáti interleukin -B30 (IL-B30) ajeho biologické aktivity. To znamená kódování nukleových kyselin pro polypeptidy a způsoby jeho produkce a použití, Nukleové kyseliny podle navrhovaného vynálezu jsou charakteristické, částečně, jejich homologii ke klonované komplementární DNA (cDNA) sekvenci, zde uvedené, a/nebo funkční souvislostí s růstovými faktory nebo cytokiny, např. G- CSF (Viz Nagata, 1994 v Thomsonově The Cytokine Handbook druhé vydání, Academie Press, San Diego) a/nebo IL—6 (Viz Hirano, 1994 v Thomsonově The Cytokine Handbook druhé vydání, Academie Press, San Diego) aplikované na polypeptidy, které jsou těmito nukleovými kyselinami kódovány. Způsob modulace nebo ovlivnění kontroly růstových faktorů je závislý na fyziologii a nebo probíhající imunitní reakci.
.10 Konkrétně je předmětem vynálezu izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující polypeptid vybraný ze skupiny sestávající ze SEQ.ID.NO:2, 4 a 5. Uvedený polynukleotid výhodně obsahuje kódující oblasti SEQ.ID.NO:1 nebo 3.
Dalším předmětem vynálezu je izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující maturo35 váný polypeptid ze SEQ.ID.NO:2 a 4. Ve výhodném provedení tento polynukleotid obsahuje nukleotidy 64 až 567 ze SEQ.ID.NOH nebo nukleotidy 176 až 700 ze SEQ.ID.NO:3.
Dalšími předměty vynálezu jsou expresní vektor obsahující izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující maturovaný polypeptid ze SEQ.ID.NO:2 a 4 a dále hostitelská buňka obsahu40 jící tento expresní vektor. Ve výhodném provedení je uvedenou hostitelskou buňkou eukaryotická buňka.
Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy polypeptidu majícího SEQ.ID.NO:2 a 4, při kterém se exprimuje rekombinantní polynukleotid kódující maturovaný polypeptid ze SEQ.ID.NO:2 a 4,
Dalším předmětem vynálezu je protilátka nebo její fragment vázající antigen, která se specificky váže k polypeptidu $e sekvencí aminokyseliny SEQ.ID.NO:2, 4 nebo 5. Ve výhodném provedení je protilátkou nebo její vazebnou složkou antigenů monoklonální protilátka, Fab nebo F(ab)2. V dalším výhodném provedení je protilátka nebo její fragment vázající antigen detekovatelně značena.
Předmětem vynálezu je také způsob detekce přítomnosti antigenů v biologickém vzorku, kde antigen je maturovaný polypeptid ze SEQ.ID,NO:2 a 4, při kterém se kontaktuje protilátka nebo její fragment vázající antigen, která se specificky váže k polypeptidu se sekvencí aminokyseliny SEQ.ID.NO:2, 4, nebo 5, s biologickým vzorkem obsahujícím uvedený antigen za vzniku komplexu protilátka: antigen nebo komplexu fragment protilátky vázající antigen: antigen. Tento biologický vzorek pochází ve výhodném provedení z člověka.
Předmětem vynálezu je také izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinu SEQ.ID.NO:2, 4 nebo 5. Ve výhodné provedení je tento polypeptid detekovatelně značen. Dále je předmětem vynálezu izolovaný polypeptid obsahující maturovaný polypeptid ze SEQ.ID.NO:2 nebo 4.
Předmětem vynálezu je také protilátka nebo její fragment vázající antigen, která se specificky váže k aminokyselinové sekvenci maturovaného polypeptidu ze SEQ.ID.NO.2 nebo 4.
io
Navrhovaný vynález je založen, částečně na objevu nové sekvence kódující cytokin, vykazující značnou sekvenční a strukturální podobnost s G-CSF a IL-6. Konkrétně, jedná se o primáti, např. lidský, gen kódující protein jehož konečná velikost je asi 168 aminokyselin, a prasečí a myší sekvence. Funkční ekvivalent vykazující značnou sekvenční homologii, bude znám i z jiných savců, např. kráva, kůň a krysa a z řady dalších druhů nepatřících do řádu savců.
Z řady konkrétních variant proteinu, vynález popisuje : v podstatě čistý rekombínantní protein IL-B30 nebo peptid vykazující alespoň 85 % sekvenční identity, v délce alespoň 12 aminokyselin k SEQ ID NO: 2, přirozenou sekvenci IL-B30 SEQ ID NO: 2, a fúzní protein obsahující
2o sekvenci IL-B30. V některých konkrétních variantách je homologie alespoň 90 % identická a velikost je alespoň 9 aminokyselin, homologie je asi 80 % a velikost je alespoň 17 aminokyselin neboje homologie 70 % a velikost je alespoň 25 aminokyselin. V jiné variantě obsahuje IL-B30 sekvenci podle tabulky 1, nebo vykazuje posttranskripční modifikační vzorec odlišný od přirozeného IL-B30, nebo protein nebo peptid pocházející z teplokrevných živočichů, zejména savců, včetně primátů, obsahuje alespoň jeden segment polypeptidu podle SEQ.ID.NO:2, vykazuje pluralitu partií s jistou identitou, je bud’ přirozenou alelickou variantou IL-B30 o délce alespoň 30 aminokyselin, obsahuje alespoň dva nepřekrývající se epitopy, které jsou specifické pro savčí IL-B30, má tedy sekvenční identitu alespoň 90 % v délce alespoň 20 aminokyselin vzhledem k savčímu IL-B30, je glykosylován, má molekulovou hmotnost alespoň 10 kD s přirozenou glyko30 sylací, je to syntetický polypeptid, je navázán na pevný substrát, je konjugován s jinou chemickou skupinou, je pětinásobně nebo méně substituován vzhledem k přirozené sekvenci, nebo je deleění či inzerční variantou přirozené sekvence. Preferované varianty popisují přípravek obsahující: sterilní IL-B30 protein či peptid, nebo IL-B30 protein či peptid a nosič, kterým může být: kapalina, jako je voda, fyziologický roztok, a/nebo pufr přizpůsobený pro orální, rektální, nasální, parenterální nebo povrchové použití. Ve variantě s fúzním proteinem, který může obsahovat: sekvenci podle tabulky 1, detekční nebo purifikační tag, jako je např. FLAG, Hís6 nebo Ig sekvenci a/nebo sekvenci jiného cytokinu nebo chemokinů.
Varianty kitu obsahují IL-B30 protein nebo polypeptid a: složku obsahující protein nebo poly40 peptid, a/nebo instrukce pro použití nebo popis jednotlivých složek kitu.
Varianty vazebné složky mohou být část protilátky vážící antigen, a to konkrétně přirozenou variantu proteinu IL-B30, přičemž ÍL-B30 je savčí protein a vazebná složka je Fv, Fab nebo Fab2 fragment, vazebná složka je konjugována s jinou chemickou složkou nebo protilátkou, která je zaměřena proti peptidové sekvenci polypeptidu podle tabulky 1, nebo proti konečnému IL-B30, nebo proti přečištěnému 1L-B pocházejícímu z hlodavců, je imunoselektivní, je to polyklonální protilátka, váže se na denaturovaný IL-B30, vykazuje Kd alespoň 30 μΜ, je připojena na pevný substrát, kterým mohou být kuličky nebo plastické membrány, je to sterilní přípravek, je detekovatelně označena to buď fluorescenční nebo radioaktivní značkou. Kity obsahující vazebnou složku obsahují: složku obsahující vazebnou složku nebo polypeptid, a/nebo instrukce pro použití nebo popis jednotlivých složek kitu. Kit je zpravidla použitelný jak pro kvalitativní, tak pro kvantitativní analýzu. Preferovaná varianta bude obsahovat: sterilní vazebnou složku, nebo vazebnou složku a nosič, přičemž nosič může být: kapalina, jako je voda, fyziologický roztok, a/nebo pufr přizpůsobený pro orální, rektální, nasální, parenterální nebo povrchové použití.
-3CZ 300958 B6
Varianty nukleových kyselin popisují izolované nebo rekombinované nukleové kyseliny kódující protein IL-B30, nebo peptid nebo fúzní protein, přičemž: IL-B30 pochází ze savců, a/nebo nukleové kyseliny kódující antigenní peptidové sekvence podle tabulky 1, nebo kódující radu antigenních peptidových sekvencí podle tabulky 1, vykazujících alespoň asi 80 % identitu k při? rozené cDNA kódující patřičný segment, který je expresní vektor, obsahuje počátek replikace, je z přirozeného zdroje, obsahuje detekovatelnou značku, obsahuje syntetickou nukleotidovou sekvenci, je menší než 6 kb, lépe pak menší než 3 kb, je ze savců, včetně primátů, obsahuje přirozenou kódující sekvenci v plné délce, je hybridizační próbou pro geny kódující IL- B30, je to PCR primer, PCR produkt nebo mutagenezní primer.
io
Vynález také popisuje buňky, tkáně nebo orgány obsahující tyto rekombinantní nukleové kyseliny, jedná se o: prokaryotní buňky, eukaryotní buňky, bakteriální buňky, kvasinkové buňky, hmyzí buňky a savčí buňky, myší, lidské nebo z primátů.
i? Varianty kitu obsahující tyto nukleové kyseliny obsahují: složku obsahující nukleovou kyselinu, složku obsahující IL-B30 protein nebo polypeptid a/nebo instrukce pro použití nebo popis jednotlivých složek kitu. Kit je zpravidla použitelný jak pro kvalitativní tak pro kvantitativní analýzu.
V někteiých konkrétních variantách nukleové kyseliny: hybridizují za promývacích podmínek při 30 °C a méně než 2 M soli, nebo při 45 °C a/nebo 500 mM soli, nebo 55 °C a/nebo 150 mM soli se SEQ.ID.NO:!, nebo vykazují alespoň 85 % identity a/nebo sekvence má délku alespoň 30 nukleotidů, nebo vykazují alespoň 90 % identity a/nebo sekvence má délku alespoň 55 nukleotidů, nebo vykazují alespoň 95 % identity a/nebo sekvence má délku alespoň 75 nukleotidů vzhledem k IL-B30 pocházejícímu z primátů.
Vynález také popisuje způsob ovlivnění fyziologie nebo vývoje buněk či buněčných tkáňových linií představující kontakt těchto buněk s agonisty nebo antagonisty IL-B30. Způsob může být: kontakt s kombinací agonistů nebo antagonistů G-CSF a/nebo IL—6, nebo kontakt s antagonisty, to včetně vazby přípravku pomocí vazebného místa protilátky která specificky váže IL-B30.
Všechny dále uvedené reference jsou zde uvedeny jako citace, stejně jako každá publikace nebo patentová přihláška je specificky označena a uvedena jako citace.
Obecně
Navrhovaný vynález popisuje aminokyselinové sekvence a sekvence DNA kódující různé savčí proteiny typu cytokinů, tzn. sekretovaných molekul které mají schopnost mediovat přenos signálu mezi buňkami imunitního systému i jinými buňkami. Viz Paul (1994) Fundamentals Immunology (3 vydání) Raven Press, NY. Cytokiny o plné délce a jejich fragmenty nebo antagonisti jsou použitelné pro fyziologické ovlivnění buněk exprimujících patřičný receptor. Je pravděpodobné že IL-B30 má inhibiční nebo stimulační efekt na hematopo i etické buňky, včetně lymfoidních buněk, jako jsou T-buňky, B-buňky, přirození zabíječí (NK buňky), makrofágy, dendritické buňky, hematopoietické prekurzory atd. Proteiny jsou také použitelné jako antigeny, tzn. imunogeny, pro indukci produkce protilátek zaměřených proti řadě epitopů na proteinu, a to jak lineárních, tak konformačních.
Molekula cDNA kódující IL-B30 byla objevena u lidských buněk. Byla označena jako huIL-B30. Odpovídající gen byl objeven a popsán už i u prasat a myší.
Lidský gen kóduje malý rozpustný protein podobný cytokinů o délce asi 168 aminokyselin. Signální sekvence má délku asi 21 jednotek a probíhá od Met do Ala. Viz tabulka 1, a SEQ.ID.NO: 1 a 2.1L-B30 vykazuje strukturální motiv charakteristický pro členy rodiny dlouhořetězcových cytokinů. Pro srovnání např. IL-B30, G-CSF a IL-6, sekvence dostupné v GeneBank. Viz také tabulka 2.
_ .1 _
CZ «WUV33 ΒΟ
Tabulka 1: Nukleová kyselina (SEQ.ID.NO:1) kódující 1L-B30 z primátů, konkrétně člověka. Sekvence po translaci je SEQ.ID.NO:2.
ATG CTG GGG AGC Ser AGA GCT GTA ATG CTG CTG TTG CTG CTG CCC TGG ACA
48 Met Leu Gly
Arg Ala Val -15 Met Leu Leu Leu Leu -10 Leu Pro Trp Thr
-21 -20
GCT CAG GGC AGA GCT GTG CCT ggg GGC AGC AGC CCT GCC TGG ACT CAG
96
Ala Gin Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gin
-5 i 5 10
TGC CAG CAG CTT TCA CAG AAG CTC TGC ACA CTG GCC TGG AGT GCA CAT
144
Cys Gin Gin Leu Ser Gin Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
15 20 25
CCA CTA GTG GGA CAC ATG GAT CTA AGA GAA GAG GGA GAT GAA GAG ACT
192
Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
30 35 40
ACA AAT GAT GTT CCC CAT ATC CAG TGT GGA GAT GGC TGT GAC CCC CAA
240
Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gin Cys Cly Asp Gly Cys ASp Pro Gin
45 50 55
GGA CTC AGG GAC AAC AGT CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CAC CAG GGT
288
Gly Leu Arg A$p Asn Ser Gin Phe Cve Leu Gin Arg Ile His Gin Gly
60 65 70 75
CTG ATT TTT TAT GAG AAG CTG CTA GGA TCG GAT ATT TTC ACA GGG GAG
336
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Cly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
80 65 90
CCT TCT CTG CTC CCT GAT AGC CCT GTG GCG CAG CTT CAT GCC TCC CTA
384
Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ai Λ Gin Leu His Ala Ser Leu
95 100 105
CTG GGC CTC AGC CAA CTC CTG CAG CCT GAG GGT CAC CAC TGG GAG ACT
432
Leu Gly Leu Ser Gin Leu Leu Gin Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr
110 115 120
CAG CAG ATT CCA AGC CTC AGT CCC AGC CAG CCA TGG CAG CGT CTC CTT
480
Gin Gin Ile Pro Ser Leu Ser Pro Sér Gin Pro Trp Gin Arg Leu Leu
125 130 135
CTC CGC TTC AAA ATC CTT CGC AGC CTC CAG GCC TTT GTG ! GCT GTA , GCC
528
Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gin Ala Phe Val Ala Val Ala
140 145 150 155
GCC CGG GTC TTT GCC CAT GGA GCA GCA ACC CTG AGT CCC TAA
570
Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
160 165
-5CZ 300958 B6 kódující sekvence:
ATGCTGGGGA GCAGAGCTGT AATGCTGCTG TTGCTGCTGC CCTGGACAGC TCAGGGCAGA GCTGTGCCTG GGGGCAGCAG CCCTGCCTGG ACTCAGTGCC AGCAGCTTTC ACAGAAGCTC TGCACACTGG CCTGGAGTGC ACATCCACTA GTGGGACACA TGGATCTAAG AGAAGAGGGA GATGAAGAGA CTACAAATGA TGTTCCCCAT ATCCAGTGTG GAGATGGCTG TGACCCCCAA GGACTCAGGG ACAACAGTCA GTTCTGCTTG CAAAGGATCC ACCAGGGTCT GATTTTTTAT GAGAAGCTGC TAGGATCGGA TATTTTCACA GGGGAGCCTT CTCTGCTCCC TGATAGCCCT GTGGCGCAGC TTCATGCCTC CCTACTGGGC CTCAGCCAAC TCCTGCAGCC TGAGGGTCAC CACTGGGAGA CTCAGCAGAT TCCAAGCCTC AGTCCCAGCC AGCCATGGCA GCGTCTCCTT CTCCGCTTCA AAATCCTTCG CAGCCTCCAG GCCTTTGTGG CTGTAGCCGC CCGGGTCTTT GCCCATGGAG CAGCAACCCT GAGTCCCTAA
1L-B3O pocházející z hlodavců, např. myší (SEQ.ID.NO:3 a 4)
CGCTTAGAAG tcggactaca gagttagact cagaaccaaa ggaggtggat agggggtcca
CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAA GCAGGGAACA AG ATG Met -21
CTG GAT TGC AGA GCA GTA ATA ATG CTA TGG CTG TTG CCC TGG GTC ACT
Leu -20 Asp Cys Arg Ala Val -15 Ile Met Leu Trp Leu -10 Leu Pro Trp Val Thr -5
CAG GGC CTG GCT GTG CCT AGG AGT AGC AGT CCT GAC TGG GCT CAG TGC
Gin Gly Leu Ala Val X Pro Arg Ser Ser 5 Ser Pro Asp Trp Ala 10 Gin Cys
CAG CAG CTC TCT CGG AAT CTC TGC ATG CTA GCC TGG AAC GCA CAT GCA
Gin Gin Leu 15 Ser Arg Asn Leu Cys 20 Met Leu Ala Trp Asn 25 Ala His Ala
CCA GCG GGA CAT ATG AAT CTA CTA AGA GAA GAA GAG GAT GAA GAG ACT
Pro Ala 30 Gly His Met Asn Leu 35 Leu Arg Glu Glu Glu 40 Asp Glu Glu Thr
AAA AAT AAT GTG CCC CGT ATC CAG TGT GAA GAT GGT TGT GAC CCA CAA
Lys 45 Asn Asn Val Pro Arg 50 Ile Gin Cys Glu Asp 55 Gly Cys Asp Pro Gin 60
GGA CTC AAG GAC AAC AGC CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CGC CAA GGT
Gly Leu Lys Asp Asn 65 Ser Gin Phe cys Leu 70 Gin Arg Ile Arg Gin 75 Gly
CTG GCT TTT TAT AAG CAC CTG CTT GAC TCT GAC ATC TTC AAA GGG GAG
Leu Ala Phe Tyr 80 Lys His Leu Leu Asp 85 Ser Asp Ile Phe Lys 90 Gly Glu
cz juuraf ho
CCT GCT CTA CTC CCT GAT AGC CCC ATG GAG CAA CTT CAC ACC TCC CTA
Pro Ala Leu 95 Leu Pro Asp Ser Pro 100 Met GlU Gin Leu His 10S Thr Ser Leu
CTA GGA CTC AGC CAA CTC CTC CAG CCA GAG GAT CAC CCC CGG GAG ACC
Leu Gly 110 Leu Ser Gin Leu Leu 115 Gin Pro Glu Asp His 120 Pro Arg Glu Thr
CAA CAG ATG CCC AGC CTG AGT TCT AGT CAG CAG TGG CAG CGC CCC CTT
Gin 125 Gin Met Pro Ser Leu 130 Ser Ser Ser Gin Gin 135 Trp Gin Arg Pro Leu 140
CTC CGT TCC AAG ATC CTT CGA AGC CTC CAG GCC TTT TTG GCC ATA GCT
Leu Arg Ser Lys Ile 145 Leu Arg Ser Leu Gin 150 Ala Phe Leu Ala Ile 155 Ala
GCC CGG GTC TTT GCC CAC GGA GCA GCA ACT CTG ACT GAG CCC TTA GTG
Ala Arg Val Phe 160 Ala His Gly Ala Ala 165 Thr Leu Thr Glu Pro 170 Leu Val
CCA ACA GCT TAAGGATGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA Pro Thr Ala
175
ATCTATCAGC CCAGACATCT ACCAGTTAAT TAACCCATTA GGACTTGTGC TGTTCTTGTT
TCGTTTGTTT TGCGTGAAGG GCAAGGACAC CATTATTAAA GAGAAAAGAA ACAAACCCCA
GAGCAGGCAG CTGGCTAGAG AAAGGAGCTG GAGAAGAAGA ATAAAGTCTC GAGCCCTTGG
CCTTGGAAGC GGGCAAGCAG CTGCCTGGCC TGAGGGGAAG GGGGCGGTGG CATCGAGAAA
CTGTGAGAAA ACCCAGAGCA TCAGAAAAAG TGAGCCCAGG CTTTGGCCAT TATCTGTAAG
AAAAACAAGA AAAGGGGAAC ATTATACTTT CCTGGGTGGC TCAGGGAAAT GTGCAGATGC
ACAGTACTCC AGACAGCAGC TCTGTACCTG cctgctctgt CCCTCAGTTC TAACAGAATC
TAGTCACTAA GAACTAACAG GACTACCAAT ACGAACTGAC AAA
Tabulka 2: Porovnání různých IL-6 a G-CSP vzhledem kIL-B30. Lidský IL-B30 je SEQ.ÍD.NO;2, myší IL-B30 je SEQ.ID.NO:4, prasecí IL-B30 je SEQ.ID.NO:5, bovinní IL-B30 je SEQ.ID.NO:6, kočičí IL-B30 je SEQ.ID.NO:11, lidský G-CSF je SEQ.ID.NO:8 myší G-CSF je SEQ.ID.NO:9. vydří IL-ó je SEQ.ID.NOHO, kočičí 11^6 je SEQ.ID.NO:11, lidský IL-Ó je SEQ.ID.NO:12, ovčí IL-6 je SEQ.ID.NO:13, myší IL-Ó je SEQ.ID.NO:14, kuřecí MGF je SEQ.ID.NO:15 a KSHV, herpes virus Kaposiho sarkomu, virová IL-ó SEQ.ID.NO:16.
-7CZ 300958 B6 iDOlidský ................VPGG SSPWTQCQQ LSQKLCT.LA WSAHPLVG. .
iDOmyší ................VPRS SSPDWAQCQQ LSRNLCM.LA WNAHAPAG- .
iDO prasečí .................... , -............................
gcsf hovězí ......TPLG P.......AR SLPQSFLLKC LEQVRKIQAD GAÉLQERL..
gcsf kočičí ......tplg P.......TS SLPQSFLLKC LEQVRKVQAD GTALQERL..
gcsf lidský ......TPLG P.......AS SLPQSFLLKC LBQVRKIQGD GAALQEKLVS gcsf myší VPLVTVSALP P.......SL PLPRSFLLKS LEQVRKIQAS GSVLLEQL..
H6vydří .AFPTPGPLG GDSKDDATSN RPPLTSADKM EDFIKFILGK ISALRNEM. .
Í16 kočičí .AFPTPGPLG G. . . .DATSN RLPLTPADKM EELIKYILGK ISALKKEM..
iló lidský .AFPAPVPPG EDSKDVAAPH RQPLTSSERI DKQIRYILDG ISALRKET. .
ilóovčí AFPTPGPLG EDFKNDTTPS RLLLTTPEKT EALIKHIVDK ISAIRKEI..
ilómyší .AFPTSQVRR GDFTEDTTPN R.PVYTT5QV GGLITHVLWE IVEMRKEL..
mgfkuřecí ...........APLAELSGD HDFQLFLHKN LEFTRKIRGD VAALQRAV..
il6khsv .................TRG KLPDAPEFEK DLLIQRLNWM LWVIDECFRD iDOlidský . HMD.LREEG DEETTNDVPH I...0CGDGC DPQGLRDNSQ FCLQRIHQGL 1130myší -HMNLLREEE DEETKNNVPR I...QCEDGC DPQGLKDNSQ FCLQRIRQGL
ÍI30 prasečí .....* - - * - ...............·..............SCLQRIHQGL gcsf hovězí -CAA.HKLCH PEELMLLRHS LGIP.QAPLS SCSSQSLQLF GCLNQLHGGL gcsf kočičí .CAA.HKLCH PEELVLLGHA LGIP.QAPLS SCSSQALQLT GCLRQLHSGL gcsflidský ECAT.YXLCH PEELVLLGHS LGIP.WAPLS SCPSQALQLA GCLSQLHSGL gcsf myší .CAT.YKLCH PEELVLLGHS LGIP.KASLS GCSSQALQQT QCLSQLHSGL iló vydří -CDK.YNKCE DSKEVLAENN LNLPKLAEKD RCFQSRFNQE TCLTRITTGL Í16 kočičí .CDN.YNKCE DSKEALAENN LNLPKLAEKD GCFQSGFNQE TCLTRITTGL ilólidský -CNK.SNMCE SSKEALAENN LNLPKMAEKD GCFQSGFNEE TCLVKIITGL Í16ovčí .CEK.NDECE NSKETLAENK LKLPKMEEKD GCFQSGFNQA ICLIKTTAGL ilómyší .CNG.NSDCM NNDDALAENN LKLPEIQRND GCYQTGYNQE ICLLKISSGL mgfkuřecí -CDT.FQLCT EEELQLVQPD PHLV.QAPLD QCHKRGFQAE VCFTQIRAGL ilókhsv LCYR.TGICK GILEPAAXFH LKLPAINDTD HCGLIGFNET SCLKKLADGF iDOlidský IFYEKLLGSD IFTGE......PSLLPDSPV AQLHASLLGL SQLLQPE..G iDOmyší AFYKHLLDSD IFKCE......PALLPD5PM EQLHTSLLGL SQLLQPE. .D iDO prasečí VFYEKLLGSD IFTGE......PSLHPDGSV GQLHASLLGL RQLLQPE.-G gcsf hovězí FLYQGLLOAL AGIS.......PELAPTLDT LQLDVTDFAT NIWL0MEDLG gcsf kočičí FLYQGLLQAL AGIS.......PELAPTLDM LQLDITDFAI NIWQQMEDVG gcsflidský FLYQGLLQAL EGIS.......PELGPTLDT LQLDVADFAT TIWQQMEELG gcsf myší CLYQGLLQAL SGIS.......PALAPTLDL LQLDVANFAT TIWQQMENLG iló vydří QEFQIHLKYL ESNYEG...N KDNAHSVYIS TKHLLQTLRP M. .NQIEVTT iló kočičí QEFQIYLKFL QDKYEG. . . D KENAKSVYTS TNVLLQMLKR KGKNQDEVTI iló lidský LEFEVYLEYL QNRFES...S EEQARAVQMS TKVLIQFLQK KAKNLDAITT iló ovčí LEYQIYLDFL QNEFEG. . .K QETVMELQSS IRTLIQILKE KIAGL. .. .1 ilómyší LEYHSYLEYM KNNLKDH..K KDKARVLQRD TETLIHIFNQ EVKDLHKIVL mgf kuřecí HAYHDSLGAV LRLLP.......NHTTLVET LQLDAANLSS NIQQQMEDLG ilókhsv FEFEVLFKFL TTEFGKSVIN VDVMELLTKT LGWDIQEELN KLTKTHY..S
Strukturní homologie IL-B30 k podobným cytokinům naznačuje Í podobnou funkci této molekuly. IL-B30 je cytokin s dlouhým řetězcem se značnou sekvenční podobností s IL—6 a G-CSF.
Agonisti nebo antagonisti IL-B30, mohou také obojí fungovat jako funkční Či receptoroví antagonisté, tím že blokují vazbu IL-ó nebo G-CSF kjejich patřičným receptorům, nebo tím, že způsobují opačnou reakci. IL-B30 nebo jeho antagonisté mohou tedy sloužit k léčbě abnormálio nich zdravotních potíží, včetně imunitních nedostatečností, tzn. T-bunččných nedostatečností, chronických zánětů, odvržení tkáně nebo kardiovaskulárních nebo neurofyzio logických poruch.
β.
Přirozené antigeny jsou schopné indukovat řadu biochemických reakcí vedoucích k biologické nebo fyziologické odpovědi cílových buněk. Preferované varianty zde charakterizované se týkají pouze lidí, nicméně platí i pro ostatní primáty nebo jiné živočišné druhy vyskytující se v přírodě. Jsou známé i další sekvence pro jiné druhy savců např.: primáty, psi, kočky a hlodavce. Viz dále.
Následující popisy jsou, pouze pro příklad, popisem lidského IL-B30, ale jsou pravděpodobně aplikovatelné i najiné druhy.
Přečištěný IL-B30
Aminokyselinová sekvence lidského IL-B30, je jako jedna konkrétní varianta popsána jako
SEQ.ID.NO:2, Další přirozeně se vyskytující nukleové kyseliny, které kódují protein, mohou být izolovány standartními technikami, za použití patřičné sekvence, např. PCR technikou nebo hybridizací. Tyto aminokyselinové sekvence, popisované směrem od amino ke karboxy konci, jsou důležité pro přenos sekvenční informace pro cytokin, umožňující rozlišení proteinového antigenu od ostatních proteinů a definování celé řady variant. Navíc tato peptidová sekvence umožňuje přípravu řady peptidů pro indukci protilátek rozeznávajících tyto segmenty a nukleotidová sekvence umožňuje přípravu oligonukleotidových prób, což obojí jsou strategie pro detekci nebo izolaci, např. pro klonování, genů kódujících tyto sekvence.
Jak je zde používán, termín „lidský rozpustný IL-B30“ popisuje, pokud je použit v souvislosti s proteinem, protein s aminokyselinovou sekvencí odpovídající rozpustnému polypeptidu popsanému v SEQ.ID.NO:2, nebo jeho podstatné části. Preferovaná varianta popisuje řadu nezávislých, tzn. nepřekrývajících se, segmentů o specifické délce. Obvykle se jedná alespoň o dva, lépe pak tri a nejlépe 5, 7 a více. Zatímco minimální délka je v podstatě jasná, je možné použít delší varianty o různé délce, např. jedna o délce 7 a dva o délce 12.
Vazebná složka, např. protilátka, se vážena IL-B30 s vysokou afinitou, tzn. alespoň 100 nM, obvykle však alespoň 30 nM, lépe pak alespoň 10 nM a nejlépe pak asi 3 nM. Příslušné proteiny byly nalezeny i v jiných savčích druzích než je člověk, např. jiní primáti, kopytnatci nebo hlodavci. Strukturně a funkčně podobné proteiny byly identifikovány i u jiných živočišných druhů než u savců, jako jsou obojživelníci a ptáci.
Termín „polypeptid“ tak jak je zde používán popisuje podstatný fragment nebo segment, o alespoň 8 aminokyselinách, spíše však o 12 aminokyselinách, obvykle o 16 aminokyselinách, lépe pak o 20 aminokyselinách, ještě lépe o 30 aminokyselinách a více, např. o 35, 40, 45, 50, atd. Tyto fragmenty mohou mít konce které budou začínat a/nebo končit v libovolné pozici, např. začínat na 1, 2, 3, atd. a končit na např. 150, 149, 148 atd., v libovolných kombinacích. Nejzajímavější peptidy mají konce připomínající strukturální domény rozhraní, např. spirály A.B.C, a/nebo D. Viz tabulka l.
Termín vazebná složka popisuje molekulu která specificky váže IL-B30, např. prostřednictvím interakce protilátka-antigen, Specifická může být více či méně inkluzivní, tzn. je specifická pro každou konkrétní variantu, nebo skupinu podobných variant. Popisuje také látky, např. proteiny, které specificky asociují s IL-B30, včetně přirozených fyziologických interakcí mezi proteiny a to jak kovalentních tak nekovalentních. Touto molekulou může být také polymer, nebo chemická látka. Funkční analog může být protein se strukturální modifikací, nebo to může být molekula s takovou molekulární strukturou která reaguje s patřičnou vazebnou determinantou. Tato látka může sloužit jako agonista nebo antagonista interakce receptem s ligandem. Viz Goodman et al. (eds) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (poslední vydání) Pergamen Press.
„V podstatě čisté“, např. v souvislosti s proteinem znamená, že protein neobsahuje žádné jiné kontaminující proteiny, nukleové kyseliny nebo jiné biologické látky pocházející z původního organismu. Čistota může být stanovena standartními technikami, obvykle hmotnostními, a měla
-9CZ 300958 B6 by být okolo 40 %, spíše však alespoň 50 %, obvykle okolo 60 %, lépe pak okolo 80 %, ještě lépe pak okolo 90 % a nejlépe pak alespoň 95 %. Často mohou být přidány nosiče nebo excipienty.
Rozpustnost peptidu nebo jeho fragmentu je závislá na prostředí a na polypeptidů. Ovlivňuje jí řada parametrů, jako je teplota, prostředí elektrolytu, velikost a molekulární vlastnosti polypeptidu a povaha rozpouštědla. Obvyklá teplota při níž je polypeptid používán jev rozsahu od 4 do asi 65 °C. Teplota použití však nebývá vyšší než 18 °C. Pro diagnostické účely bude teplota obvykle pokojová nebo vyšší, ale ne natolik vysoká aby došlo k denaturaci jednotlivých komponent kitu. Pro terapeutické účely bude teplota obvykle okolo 37 °C, pro lidi a myši, ačkoliv io v některých případech může být teplota in šitu nebo in vitro zvýšena nebo snížena. Velikost a struktura polypeptidů jsou v podstatě stabilní veličiny, a protein není obvykle denaturován. Polypeptid může být asociován s jinými polypeptidy v kvartemí struktuře, tzn. zachovává si rozpustnost, neboje asociován s lipidy nebo detergenty.
Rozpouštědlo a elektrolyt jsou obvykle biologicky kompatibilní pufry, takového typu, který zachovává biologickou aktivitu a obvykle odpovídá fyziologickému vodnému roztoku. Rozpouštědlo má obvykle neutrální pH, obvykle mezi 5 a 10, a lépe pak okolo 7,5. V některých případech může být přidán jeden či více detergentů, většinou slabé a nedenaturující, např. CHS (cholesteryl hemisukcinát) nebo CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylamonio)-l-propan
2o sulfonát), neboje použita tak nízká koncentrace silného detergentů, která podstatně nepozmění strukturální nebo fyziologické vlastnosti proteinu. Na druhou stranu použití silného detergentů způsobí denaturaci.
Fyzické varianty
Navrhovaný vynález popisuje proteiny nebo peptidy s podstatnou aminokyselinovou sekvenční identitou s aminokyselinovou sekvencí IL-B30 antigenu. Různými variantami jsou varianty druhové, polymorfní nebo alelícké. Aminokyselinová sekvenční homologie, nebo sekvenční identita je dána shodou reziduí, v případě potřeby po zavedení přerušení.Viz také Needelham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, SankofT, et al. (1983) kapitola jedna v Time Warps, String
Edits, and Macromolecules: The theory and Practice of Sequence comparsio, Addison-Wesley, Reading, MA, a softwarové balíky od Intel liGenetics, MountainView, CA, a University of Wisconsin Genetic Computer Group, Madison, WI. Sekvenční identita se mění pokud jsou konzervativní mutace hodnoceny jako shody. Konzervativní mutace obvykle představuje substituce následujících skupin: glycin, alanin; valin, izoleucin, leucin; kyselina asparová, kyselina glutamo35 vá; serin, thereonin; lysin, arginin; fenylalanin tyrosin. Konzervativnost je aplikována na biologické, funkční a strukturní vlastnosti. Homologní aminokyselinové sekvence obvykle představují přirozené polymorfní nebo alelícké mezidruhové varianty proteinové sekvence. Typické homologní proteiny nebo peptidy budou mít 25 až 100% identitu (pokud mohou být zavedena přerušení) až 50 až 100% identitu (pokud jsou zahrnuty konzervativní mutace) s aminokyselinovou sekvencí 1L-B30. Měřená identita by měla být alespoň asi 35, obecně asi 40, spíše však asi 50, lépe pak asi 60, ještě lépe asi 70, ještě lépe asi 80 a nejlépe alespoň 90 %.
Izolovaná DNA kódující IL-B30 může být modifikovaná nukleotidovou substitucí, nukleotidovou delecí, nukleotidovou inzercí a inverzí krátkých nukleotidových sekvencí. Tyto modifikace vedou k nové sekvenci DNA kódující antigeny, jejich deriváty nebo proteiny s podobnou fyziologickou, imunogenní, antigenní nebo jinou funkční aktivitou. Tyto modifikované sekvence mohou být použity pro produkci mutantních antigenu nebo pro zvýšení exprese. Zvýšená exprese může být dána amplifikací genu, zesílenou transkripcí, zesílenou translací nebo jiným mechanismem. „Mutantní IL-B30“ popisuje polypeptid spadající do sekvenční identity s IL-B30 jak byla definována výše, ale mající odlišnou aminokyselinovou sekvenci od IL-B30 běžně se v přírodě vyskytující, což je dáno delecí substituci nebo inzercí. Tomu odpovídá jakýkoliv protein mající podstatnou sekvenční identitu s proteinem uvedeným v SEQ.ID.NO:2, a sdílející řadu biologických aktivit, např. antigenních nebo imunogenních, s touto sekvencí a v preferované variantě obsahující většinu přirozené sekvence v plné délce. Sekvence s plnou délkou je obvykle prefero1 Λ cz bó vána, ačkoliv zkrácené verze jsou také použitelné, a podobně, nejvhodnější jsou geny nebo proteiny získané z přirozených zdrojů. Podobný koncept je aplikovatelný na odlišné ÍL- B30 proteiny, konkrétně na ty nacházející se v teplokrevných zvířatech, např. savcích a ptácích. Tento popis obecně zahrnuje všechny IL-B30 proteiny, bez limitace na ty o kterých se hovoří v konkrétních variantách.
Mutageneze IL-B30 je možné také dosáhnout aminokyselinovou inzercí nebo delecí. Substituce, inzerce, inzerce nebo jejich kombinace mohou být připraveny tak aby daly vzniknout finálnímu konstruktu. Inzerce zahrnují i amino- či karboxy- terminální fůzi. Náhodná mutageneze může být zaměřena na cílový kodón a exprimována mutantní varianta může být testována na požadovanou aktivitu. Způsoby přípravy substitučních mutací v předem stanovených místech DNA o známé sekvenci jsou dobře známé v současném stavu techniky, např. M 13 primer mutagenezí nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), Viz také Sambrook et al. (1989), Ausubel et al. (1987 a Supplements) a Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382. Preferované varianty obsahují jednonásobek, dvojnásobek, trojnásobek, pětinásobek, sedminásobek atd., především konzervativních substitucí na nukleotidové nebo aminokyselinové úrovni. Je žádoucí aby substituce nezasáhly konzervované cysteiny a aby se vyskytovaly v oblastech mimo helikální strukturní domény. Tyto varianty budou použitelné pro produkci specifických protilátek a často budou sdílet řadu biologických funkcí.
Navrhovaný vynález také popisuje rekombinantní proteiny, např. heterologní fiúzní proteiny, za použití segmentů těchto proteinů. Heterologní fúzní proteiny jsou fiúzní proteiny jejichž segmenty za normálních podmínek nefúzují stejným způsobem. Obdobný koncept platí Í pro heterologní sekvence nukleových kyselin.
Navíc nový konstrukt může být připraven z kombinací domén s podobnou funkcí z různých proteinů. Například specifická vazebná doména nebo jiný segment může být přehozen mezi dvěma novými fúzními polypeptidy nebo fragmenty. Viz Cunningham et al. (1989) Science 243:1330-1336 a 0'Dowd et al., (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992.
Technika využívající fosforamiditu popisovaná v Beacage and Carruthers (1981) Tetre. Letts. 22:1859-1862, produkuje vhodné syntetické fragmenty DNA. Dvojřetězcové fragmenty mohou být získávány buď dosyntetizováním komplementárního řetězce a denaturací řetězců za vhodných podmínek, nebo doplněním komplementárního řetězce pomocí DNA polymerázy a vhodné35 ho primeru, např. PCR technikou.
Tento gen může být podroben strukturní analýze v porovnání s ostatními členy rodiny cytokinů IL-6. Do této rodiny patří IL-6, 1L-11, IL-12, G-CSF, LIF, OSM, CNTF a Ob. Porovnání sekvence lidského prasečího a myšího IL-B30 s ostatními členy IL-6 rodiny umožní definici strukturních vlastností. Konkrétně β-pás a α-helix mohou být rozlišeny pomoct např. programu RASMOL, Viz Bazan et al. (1996) Nátuře 379:591, Lodi et al. (1994) Science 263:1762-1766, Sayle and Milner-White (1995) TIBS 20:374-376, a Gronenberg, et al. (1991) Protein Engeneering 4:263-269. Preferované skupiny pro substituci jsou ty skupiny které jsou na povrchu a je možné předpokládat jejich interakci s receptorem. Ostatní skupiny, které zachová45 vají funkci budou schopny konzervativní substituce, konkrétně na pozicích daleko od skupin vystavených na povrchu.
Funkční varianty
Blokování fyziologické odpovědi ÍL-B30 může být dáno kompetitivní inhibici vazby ligandu na receptor.
In vitro techniky navrhovaného vynálezu většinou využívají izolovaný protein, rozpustné fragmenty obsahující segment tohoto proteinu rozeznávaný receptorem, nebo fragmenty navázané na
-11 CZ 300958 B6 pevný substrát. Tyto techniky také umožní diagnostické stanovení efektu buď vazby mutovaného či modifikovaného segmentu, nebo mutace čí modifikace cytokinů, např. analogu IL -B30.
Navrhovaný vynález také popisuje použití technik kompetitivní vazby, např. použití neutralizační protilátky proti cytokinů nebo kompeticí fragmentu vážícího se na receptor.
„Deriváty“ IL-B30 antigenů zahrnují aminokyselinové sekvenční mutanty přirozených forem, glykosylační varianty a kovalentní nebo agregované konjugáty sjinými chemickými komponentami. Kovalentní deriváty mohou být připraveny pomocí připojení funkčních skupin na skupiny m nacházející se na postranních aminokyselinových řetězcích 1L-B30, nebo na N- či C-terminálním konci. Viz např. Lundblad and Noyes (1988) Chemical Reagents for Protein Modification, vol. 1-2, CRC Press, lne., Boča Raton, FL, Hugli (ed. 1989) Techniques in Protein Chemistry,
Academie Press, San Diego, CA, a Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boča Raton, FL.
Je počítáno i s variantami glykosylace, např. připravené modifikací glykosylace na polypeptidu během jeho syntézy a následujících úprav. Viz, např. Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:497- 534. Použitelné jsou i varianty peptidů se stejnou primární aminokyselinovou sekvencí, které mají jiné minoritní modifikace, včetně fosforylace aminokyselinových zbytků, např. fosfo20 tyrosin, fosfoserin nebo fosfothreonin.
Navrhovaný vynález popisuje také fúzní polypeptidy variant IL-B30 a jiných homologních nebo heterologních proteinů. Řada receptorů cytokinů nebo jiných povrchových proteinů jsou multimemí, např. homodimemí entity a repetitivní konstrukty mají řadu výhod, včetně snížené citli25 vosti k proteolytickému štěpení. Typickým příkladem je fúze reportérových polypeptidů, např. luciferáza, se segmentem nebo doménou proteinu, např. segmentem vázaným receptorem, což umožňuje snadnou detekci přítomnosti nebo lokalizace fúzního ligandu. Viz Duli et al., patent US 4 859 609. Ostatní fuzní partneři genu mohou být β-galaktosidáza, trpE, Protein A, β-laktamáza, α-amyláza, alkohol dehydrogenáza, kvasinkový mating faktor a a detekční nebo purifikační tágy jako je FLAG sekvence nebo sekvence His6. Viz např. Godovski, et al., (1988) Science 241:812-816.
Fúzní peptidy jsou obvykle připraveny buď technikami rekombinantní DNA, nebo pomocí technik syntetických polypeptidů. Techniky exprese a manipulace s nukleovými kyselinami jsou popsány v např. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 vydání) vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory a Ausubel et al., (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY. Techniky syntézy polypeptidů jsou popsány v Merrifíeld (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156, Merrifíeld (1986) Sciene 232:341-347, Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, a Grant (1992)
Synthetic Peptides: A Users Guide, W.H. Freeman, NY. Na syntetické proteiny může být aplikována technika refoldingu.
Navrhovaný vynález také popisuje použití jiných derivátů proteinu IL-B30 než jsou varianty aminokyselinové sekvence nebo glykosylace. Tyto deriváty představují kovalentní nebo agre45 gované konjugáty s chemickými látkami nebo proteinovými nosiči. Kovalentní nebo agregované deriváty jsou použitelné jako imunogeny, jako reagencie imunotechník, nebo purifikační techniky jako jsou afinitní pročišťování vazebných partnerů, nebo jiných antigenů. IL-B30 může být imobilizován kovalentní vazbou na pevný nosič jako je kyanogen bromidem aktivovaná SEPHAROSA, technikami jaké jsou dobře známé v současném stavu techniky, nebo adsorbován na polyolefinový povrch, s a nebo bez prokřižování glutaraldehydem, pro použití v purifikační technice anti-IL-B30 protilátek nebo alternativních vazebných složek. Protein IL-B30 může být označen detekovatelnou skupinou např. pro použití v diagnostických technikách. Purifikace IL-B30 může být prováděna zmobilizovanou protilátkou nebo odpovídajícím vazebným partnerem, např. vazebnou částí receptorů.
CZ 3UU9í>8 tfO
Rozpustný IL-B30 nebo jeho fragment podle navrhovaného vynálezu může být použit jako imunogen pro produkci antiséra nebo protilátek specifických pro vazbu. Přečištěný antigen může být použit pro testování monoklonálních protilátek nebo antigen vázajících fragmentů, včetně antigen vázajícího fragmentu přirozených protilátek, např. Fab, Fab', F(ab)2, atd. Přečištěný antigen IL-B30 může být také použit jako reagens detekující generované protilátky, jako reakci na zvyšující se hladinu cytokinů, které jsou zjišťovány v případě abnormálních nebo specifických fyziologických podmínek nebo poruch. Navrhovaný vynález popisuje protilátky namířené proti aminokyselinové sekvenci kódované nukleotidovou sekvencí uvedenou zde jako SEQ.ID.NO:1, nebo fragmenty proteinů jí obsahující. Konkrétně navrhovaný vynález popisuje protilátky io s vazebnou afinitou proti, nebo vytvořené proti specifickým doménám, např. Spirála A, B, C, nebo D.
Navrhovaný vynález popisuje izolaci dalších druhově blízkých variant. Analýza pomocí Southern a Northern blotu prokazuje že podobné genetické entity se vyskytují i v jiných savcích. Je tedy pravděpodobné, že 1L-B30 se vyskytuje v celé řadě druhů, např. u hlodavců, zajíců, šelem, sudokopytníků, lichokopytníků a primátů.
Navrhovaný vynález také popisuje způsob izolace skupiny podobných antigenu vykazujících jak odlišnosti, tak podobné znaky ve struktuře, expresi a funkci. Vysvětlení řady fyziologických efektů těchto molekul bude značně urychleno izolací a charakterizací jejich dalších odlišných druhů nebo polymorfních variant. Navrhovaný vynález popisuje konkrétně použitelné próby pro identifikaci dalších homologních genetických entit v jiných živočišných druzích.
Izolované geny umožňují transformaci buněk postrádajících expresi IL-B30, a to i buněčných typů takového druhu, které zcela postrádají expresi odpovídajících proteinů a vykazují negativní aktivitu. To by umožnilo analyzovat funkci IL-B30 v porovnání s netransformovanými kontrolními buňkami.
Rozbor kritických strukturních elementů, které ovlivňují různé fyziologické funkce způsobené těmito antigeny, je možný za použití standartních technik moderní molekulární biologie, konkrétně pak pomocí porovnání s členy podobných skupin. Víz např. technika skenování homologních mutací popsaná v Cunningham et al. (1989) Science 243:1339-1336 a 0'Dowd et al., (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992 a Lechleiter etal., (1990) EMBO J. 9.438M390.
Intracelulámí funkce budou pravděpodobně zahrnovat receptorovou signalizaci. Intemalizace proteinu může tedy probíhal za konkrétní situace, a může dojít i k interakci mezi intracelulámími komponentami a cytokiny. Specifické segmenty intemalizace IL-B30 interahující příslušnou komponentou mohou být identifikovány buď mutagenezí, nebo přímou biochemickou cestou, např. technikou provázání nebo afinitní reakcí. Pro stanovení struktury je použitelná strukturální analýza kiystalografií nebo jinou fyzikální metodou. Další testování mechanismu přenosu signálu představuje studii asociovaných komponent které mohou být izolované afinitní technikou, nebo pomocí genetických technik, např. komplementační analýzou mutant.
Další studium exprese a kontroly IL-B30 je žádoucí. Kontrolní elementy asociované s antigenem mohou vykazovat odlišné fyziologické, vývojové, tkáňově specifické nebo jiné expresní charakteristiky. Je třeba prozkoumat i posměmé nebo protisměrné oblasti genetického kódu, tzn. kontrolní sekvence.
Strukturní studie antigenu IL- B30 vedou k přípravě nových antigenu, konkrétně analogů vykazu50 jících agonistické nebo antagonistické vlastnosti vzhledem k původní molekule. To může být kombinováno s výše uvedenými skenovacími technikami pro izolaci antigenu vykazujících požadované spektrum aktivit.
-13CZ 300958 B6
Protilátky
Protilátky mohou být namířené proti celé řadě epitopů proteinu IL-B30, včetně druhových polymorfhích nebo alelických variant a jejich fragmentů, jak v jejich přirozeně se vyskytující tak v rekombinantní formě. Navíc protilátky mohou být namířeny proti IL-B30 jak v aktivní, tak v inaktivní formě, včetně nativních a denaturovaných stavů. Je možné použít i anti idiotypové protilátky.
Protilátky, včetně vazebných fragmentů a jednořetězcových forem, proti předem určeným fragmentům antigenu mohou být indukovány imunizací zvířat konjugáty těchto fragmentů s imunogeními proteiny. Monoklonální protilátky jsou připraveny z buněk sekretujících požadované protilátky. Tyto protilátky mohou být testovány na vazbu na normální nebo defektní IL-B30, nebo na jejich agonistickou nebo antagonistickou aktivitu, např. danou interakcí s receptorem. Protilátky mohou fungovat jak jako agonisti, tak jako antagonisti, např. sférickým blokováním vazby na receptor. Tyto monoklonální protilátky se obvykle vážou s KD asi 1 mM, lépe pak asi 300 μΜ, obvykle pak 100 μΜ, spíše však asi 30 μΜ, lépe pak alespoň 10 μΜ a nejlépe alespoň 3 μΜ a lépe.
Protilátky podle navrhovaného vynálezu jsou také použitelné pro diagnostické aplikace, Jako vazebné nebo neneutralizující protilátky, mohou být testovány na svoji schopnost vázat antigen bez ovlivnění vazby na receptor. Jako neutralizační protilátky mohou být použitelné v kompetitivních technikách. Jsou také použitelné pro detekci a kvantifikaci proteinu IL-B30 nebo jeho receptem. Viz např. Chán (1987) Imunology: A Practical Guide, Academie Press, Orlando, FL, Price and Newman (1981) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press NY, a Ngo (1988) Nonisotropic Immunoassay, Plenům Press, NY. Křížové reakce nebo jiné testy budou identifikovat protilátky které vykazují různá spektra specifit, např., jedinečné druhové spektrum.
Protilátky včetně vazebných fragmentů mohou být silnými antagonisty vázajícími antigen a inhibujícími funkční vazbu, např. k receptoru způsobujícímu jeho biologickou odpověď. Jsou také použitelné jako neneutralizující protilátky a mohou být konjugovány s toxiny nebo radionuklidy což způsobí smrt buňky, která specificky danou protilátku váže. Tyto protilátky mohou být také konjugovány s léčivy nebo jinými terapeutickými agens, a to buď přímo, nebo nepřímo pomocí linkeru, což umožňuje nasměrování léčiva.
Antigenní fragmenty mohou být připojeny na jiné materiály, konkrétně např. polypeptidy, jako fúzní nebo kovalentně navázané proteiny a pak mohou být využity jako imunogeny. Antigen a jeho fragmenty mohou být fúzovány nebo kovalentně navázané na různé imunogeny, jako je např. hemocyanin z přílipky příbojové, hovězí sérový albumin, toxoíd tetanu atd. Viz Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969, Landsteiner (1962) Specificity of
Serological Reactions, Dover Publications, New York, a Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CHS Press, NY, pro popis způsobů přípravy polyklonálních antisér. V některých případech je žádoucí připravit monoklonální protilátky z různých savčích organismů, jako jsou myši, hlodavci, primáti, člověk atd. Popis technik přípravy monoklonálních protilátek je obsažen v např. Stites et al., Basic and Clinical Immunology (4 vydání), Lange Medical
Publications, Los Altos, CA, a tam uvedené reference Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CHS Press, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2 vydání). Academie Press, New York, a zejména Kohíer and Milstein (1975) Nátuře 256:495497, který popisuje způsoby přípravy monoklonálních protilátek.
Další vhodné techniky jsou in vitro inkubace lymfocytů s antigenním polypeptidem nebo alternativně výběr z knihovny protilátek ve fagové nebo podobné knihovně. Viz Huse et al., (1989) Generation of Large Combinatorial Library of the Imunoglobulin Repertoir i Phage Lambda, Science 246:1275-1281 a Ward et al., (1989) Nátuře 341:544-546. Polypeptidy a protilátky podle navrhovaného vynálezu mohou být použity bez modifikace, včetně chimerních nebo huma55 nizovaných protilátek. Velmi často jsou polypeptidy a protilátky naznačeny pomocí kovalentně .1
CZ 3U0958 B6 nebo nekovalentně připojené substance, která je schopna zajistit detekovatelný signál Je známé velké množství technik značení a konjugace a je dobře popsáno ve vědecké i patentové literatuře. Vhodnými značkami jsou radionuklidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční skupiny, chemiluminiscenční látky, magnetické částice a podobně. Patenty popisující použití těchto značek jsou patent US 3 817 837, US 3 850 752, US 3 939 350, US 3 996 345, US 4 277 437, US 4 275 149 a US 4 366 241. Je také možné použít rekombinantní imunoglobuliny. Viz Cabílly, patent US 4 816 567, Moore et al, patent US 4 642 334 a Queen et al, (1989) Proč. Nati Acad. Sci. USA 86:10029-10033.
io Protilátky podle navrhovaného vynálezu mohou být také použity pro afinitní chromatografii při izolaci proteinu. Kolona je připravena po navázání protilátek na pevný nosič. Viz Wilchek et al, (1984) Meth. Enzymol. 104:3-55.
Protilátky specifické pro IL-B30 jsou také použitelné pro přípravu antiidiotypových protilátek.
Ty jsou pak použitelné pro detekci nebo diagnostiku různých imunologických situací doprovázejících expresi daného antigenu.
Nukleové kyseliny
Popsaná peptidová sekvence a příbuzné reagencíe jsou použitelné pro detekci, izolaci nebo identifikaci klonů DNA kódujících IL-B30, např. z přirozených zdrojů. Obvykle je použitelná pro izolaci genu ze savců, ale podobné techniky mohou být použity pro izolaci genů i z jiných živočišných druhů, např. teplokrevných zvířat, jako jsou ptáci nebo savci. Křížová hybridizace umožňuje izolaci IL-B30 ze stejných, nebo polymorfhích variant nebo jiných druhů. Řada různých postupů pro úspěšnou izolaci vhodných klonů nukleových kyselin. Přečištěný protein nebo definovaný peptid je použitelný pro přípravu protilátek standardní metodou, jak je popsáno výše. Syntetické peptidy nebo přečištěný protein mohou být přítomné v imunitním systému a generují vznik monoklonálních či polyklonálních protilátek. Viz Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Green, a Harlow and Lané (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.
Specifická vazebná složka může být použita například ke zjištění exprese knihovny připravené z buněčné linie exprimující IL-B30. Zjištění intracelulámí exprese může být provedeno řadou běžných značících imunofluorescenčních technik. Vazebná složka může být použita pro afinitní přečištění nebo sortování buněk exprimuj ících povrchový fúzní protein. Peptidový segment může být také použit pro predikci odpovídající oligonukleotidové sekvence pro prohledávání knihovny. Genetický kód může být použit pro volbu vhodných oligonukleotidů použitelných jako próby pro testování. Viz např. SEQJD.NO:1. V kombinaci s PCR, jsou syntetické oligonukleotidy použitelné pro výběr správných klonů z knihovny. Komplementární sekvence může být také jako próba, primer nebo antisérum. Různé fragmenty mohou být použity např. spojené s ukotveným vektorem nebo poly-A komplementární PCR technikou nebo s komplementární DNA nebo jiným peptidem.
Navrhovaný vynález také popisuje použití izolované DNA nebo jejích fragmentů pro kódování biologicky aktivních polypeptidů odpovídajících IL-B30, popřípadě postrádajících část kódují45 cích nepřekládanou 5'terminální část popisované sekvence. Navíc navrhovaný vynález popisuje izolaci rekombinantní DNA kódující biologicky aktivní protein nebo polypeptid a která je schopna hybridizace za vhodných podmínek s výše popisovanou DNA.Tento biologicky aktivní protein nebo polypeptid může být intaktní antigen nebo fragment a jeho aminokyselinová sekvence bude odpovídat sekvenci SEQ.ID.NO:2, a to zejména kompletní sekretovaný polypeptid. Dále navrhovaný vynález popisuje použití izolované rekombinantní DNA, nebo jejích fragmentů, které kódují protein vykazující vysokou identitu vzhledem k sekretovanému IL-B30. Izolovaná DNA může obsahovat regulační sekvence na 5' či 3' koncích, např. promotory, enhancery, polyadenylační signální sekvence a další. Exprese může být také ovlivněna operativním připojením
- 15CZ 300958 B6 kódujícího segmentu a heterologního promotoru, např. vložením promotoru proti směru sekvence od endogenního genu.
Termín „izolovaná“ nukleová kyselina je taková nukleová kyselina, např. DNA, RNA nebo směsný polymer, která je v podstatě zbavena ostatních složek obvykle navázaných na přirozenou sekvenci, např. ribozómy, polymerázy a/nebo sousední genomové sekvence, které pochází z původního organismu. Tento termín zahrnuje i sekvence nukleových kyselin, které byly vyjmuty ze svého přirozeného prostředí a zahrnuje také rekombinantní nebo klonovanou izolovanou DNA a chemicky syntetizované analogy nebo analogy syntetizované biologicky v heterologních io systémech. V podstatě čisté molekuly jsou také izolované formy molekul. Obecně, nukleové kyseliny budou ve vektoru nebo fragmentu menším než 50 kb, obvykle menším než asi 30 kb, lépe pak menším než asi 10 kb a nejlépe menším než asi 6 kb.
Izolované nukleové kyseliny budou většinou homogenní směsí molekul, ale v některých konkrét15 nich variantách mohou obsahovat malou míru heterogenity. Tato heterogenita je obvyklá pro konce polymerů nebo pro části, které neovlivňují požadovanou biologickou aktivitu.
Termín „rekombinovaná“ nukleová kyselina je definován buď způsobem její produkce, nebo její strukturou. V referencích týkajících se způsobů její produkce, je uvedeno že produkt je připraven procesem použití rekombinačních technik na sekvenci nukleové kyseliny, tzn. je připravena zásahem člověka do nukleotidové sekvence. Může se však také jednat o nukleovou kyselinu připravenou generováním sekvence fúzí dvou fragmentů, které nejsou přirozenými partnery, ale dají vzniknou produktu, který se podobá přirozené variantě, nebo přirozenou cestou vzniklé mutaci. Tedy produkt připravený transformací buněk nepřirozeným vektorem dává vzniknout nukleové kyselině obsahující sekvenci jaká vznikla syntetickým procesem. Tak je možné nahradit jeden kodón kodónem s náhradní sekvencí kódující stejnou, nebo konzervativní aminokyselinu, což je běžné při vkládání nebo odstraňování rozpoznávaného místa.
Je také možné spojit dohromady segmenty nukleových kyselin o požadované funkci tak, aby ao vznikla jedna genetická entita, obsahující požadovanou kombinaci fiinkčních podjednotek, která se však v přírodě běžně nevyskytuje. Místa rozeznávaná restrikčními enzymy jsou většinou cílem takovýchto umělých modifikací, ale je tak možné ovlivnit jiné specificky rozeznávané sekvence např. promotory DNA replikační počátky, regulační sekvence, kontrolní sekvence nebo jiné použitelné prvky. Podobný postup je možný i pro rekombinantní či fúzní polypeptidy. Specifické jsou syntetické nukleové kyseliny, kódující polypeptidy podobné fragmentům těchto antigenů a fúzní sekvence z různých druhů nebo polymorfních variant.
Podstatný „fragment“ v kontextu s nukleovou kyselinou je nepřetržitý segment alespoň o 17 nukleotidech, spíše však o alespoň 22 nukleotidech, ještě spíše o asi 22 nukleotidech, obvykle pak o alespoň 29 nukleotidech, častěji pak o 35 nukleotidech, lépe pak o 41 nukleotidech, ještě lépe o 47 nukleotidech, ještě lépe o 55 nukleotidech a nejlépe o alespoň 60 a více, např. 67, 73, 81, 89, 95 atd., nukleotidech. DNA kódující IL B30 protein je použitelná pro identifikaci genů mRNA a cDNA kódujících odpovídající nebo podobné proteiny, stejně jako DNA kódující homologní proteiny od různých druhů. Jedná se o homology u jiných druhů, jako jsou primáti, hlodavci, psi, kočky a ptáci. Různé IL B30 proteiny mohou být homologní a jsou zde zahrnuty. Dokonce i proteiny se značnou evoluční vzdáleností od popisovaného antigenu mohou být za patřičných podmínek izolovány za použití této sekvence, pokud jsou dostatečně homologní. Nejzajímavější jsou proteiny IL-B30 pocházející z primátů.
Rekombinantní klony odvozené z genomových sekvencí např. obsahující introny, jsou použitelné pro transgenní studie, včetně transgenních buněk a organismů, a pro genovou therapii. Viz Goodnow (1992) „Transgenc Animals“ v Roitt Encydopedia of Immunology, Academie Press, San Diego, 1502-1504, Travis (1992) Science 256:1392-1394, Kuhn et al., (1991) Science 254:707-710, Capecchi (1989) Science 244:1288, Robertson (1987) Tetracarcinomas and
L
CZ 3UW3» Bó
Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford a Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10:180-199.
Podstatná homologie, nebo identita v kontextu s porovnáváním sekvencí nukleových kyselin znamená, že segment nebo jeho komplementární řetězec, je při porovnání identická, pokud je ideálně srovnána, s odpovídajícími nukleotidovými inzercemi nebo delecemi, v alespoň 50 % nukleotidů, obvykle alespoň 58 %, spíše však 65 %, ještě spíše 71 %, častěji 77 %, lépe pak 85 % a nejlépe alespoň 95 až 98 % a více, a v jedné konkrétní variantě dokonce 99 % více nukleotidů. Podobně, podstatná homologie existuje pokud segmenty hybridizují za selektivních hybridizačio nich podmínek s řetězci nebo komplementárními řetězci obvykle použité sekvence SEQ.ID.NO:
I. Selektivní hybridizace probíhá pokud existuje alespoň 55 % identita v sekvenci o délce alespoň 30 nukleotidů, lépe pak alespoň 75 % identita v sekvenci o délce alespoň 25 nukleotidů a nejlépe pokud je 90 % identita v sekvenci o délce alespoň 20 nukleotidů. Viz Kanehisa (1984) Nuc. Acid. Res. 12:203-213. Délka porovnávané sekvence, jak je popisována, může být i delší, a v některých variantách dosahuje délky 17 nukleotidů, obvykle alespoň 28 nukleotidů, lépe pak asi 40 nukleotidů a nejlépe od 75 do 100 nebo více nukleotidů.
Přísné podmínky, týkající se homologie při hybridizaci, se týkají přesně kombinovaných podmínek jako je koncentrace soli, teplota, organická rozpouštědla a další parametry které rozhoduji o průběhu hybridizační reakce. Přísné teplotní podmínky obvykle znamenají teplotu vyšší než 30 °C, lépe pak vyšší než asi 37 °C, ještě lépe pak vyšší než 55 °C a nejlépe vyšší než asi 70 °C. Přísné podmínky charakteristik soli znamenají že její koncentrace je obvykle nižší než 1000 mM, lépe nižší než asi 400 mM, ještě lépe nižší než 250 mM a nejlépe nižší než asi 150 mM, včetně asi 100, 50, nebo dokonce 20 mM. Kombinace těchto parametrů je daleko důležitější než kon25 krétní hodnota každého jednotlivého parametru. Viz např. Wetmur and Davidson, (1968)
J. Mol.Biol. 31:349-370, Hybridizace za přísných podmínek může dosáhnout dvojnásobku pozadí, lépe pak troj až pětinásobku.
Pri porovnání sekvencí, jedna sekvence slouží jako referenční sekvence s kterou je testovaná sekvence srovnávaná. Když je použit sekvenční srovnávací algoritmus, je referenční a testovaná sekvence vložena do počítače, jsou označeny srovnávací koordináty, pokud je to nezbytné a jsou označeny parametry sekvenčního srovnávacího algoritmu. Sekvenční srovnávací algoritmus poté spočítá procenta sekvenční identity pro testovanou sekvenci vzhledem k referenční sekvenci, na základě označených programových parametrů.
Optické nastavení sekvence pro srovnání může být provedeno např. lokálním hornologním algoritmem podle Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, pomocí homologního řadicího algoritmu podle Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pomocí techniky vyhledávání podobnosti podle Pearson and Lipman (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, a to počítačovou implementací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA v Wisconsin Genetic Software Package, Genetic Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI), nebo vizuálním porovnáním (viz obecně Ausubel et al.).
Příkladem použitelných algoritmů je PILEUP. PILEUP používá mnohonásobné sekvenční porovnání se skupinou podobných sekvencí za použití progresivní, podvojného srovnávání, tak aby byla určena procentuální sekvenční identita. Vykreslí také větvené grafy nebo dendrogramy ukazující nahromadění podobnosti použité pro vytvoření sestavení. PILEUP používá zjednodušení progresivních stanovovacích metod podle Feng and Dolittle (1987) J, Mol. Evol. 35:351-360. Použitá technika je podobná technice popsané Higginsem a Sharpem (1989)
CABIOS 5:151-153. Program může najednou porovnávat až 300 sekvencí, každou o maximální délce 5000 nukleotidů nebo aminokyselin. Mnohočetné srovnávání začíná jako párové srovnání dvou nej podobnějších sekvencí, což ukáže klastr dvou srovnaných sekvencí. Tento klastr je poté srovnán s další podobnou sekvencí nebo klastrem porovnaných sekvencí. Dva klastry sekvencí jsou srovnány jednoduchým rozšířením párového porovnání dvou nezávislých sekvencí. Výsledné srovnání je pak získáno jako série progresivních párových porovnání. Program běží po označení
- 17CZ 300958 B6 specifické sekvence a jejích aminokyselinových nebo nukleotidových koordinát pro oblasti sekvenčního porovnání a po zadání programových parametrů. Referenční sekvence může být například srovnána s jinou testovanou sekvencí aby byla zjištěna sekvenční identita za použití daných parametrů: definovaná váha mezer (3,00), definovaná váha délky mezer (0,10) a zatížené konce mezer.
Jiným příkladem tohoto algoritmu vhodného pro určení procentuální sekvenční identity a sekvenční podobnosti je algoritmus BLAST, popsaný v Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Software využívající BLAST analyzuje dostupný prostřednictvím National Center io for Biotechnology Information (http: www.ncbi.nih.gov/). Tento algoritmus používá první identifikovaný vysoce podobný sekvenční pár (HSPs) identifikací krátkých slov délky W v dotazované sekvenci, který buď naplňuje, nebo souhlasí některá pozitivně hodnocená vysoká skóre T, pokud je srovnán se slovem o té samé délce nalezené v databázové sekvenci. T je definováno jako maximum shody sousedních slov (Altschul et al.). Toto iniciační příbuzné slovo slouží jako jádro pro inicializaci vyhledávání delších HSPs, které ho obsahují. Shodná slova jsou pak rozšířena v obou směrech podél každé sekvence tak daleko, dokud kumulativní skóre narůstá. Rozšiřování shody slov v každém směru je zastaveno když: kumulativní nárůst skóre klesne o hodnotu X z maximální dosažené hodnoty, kumulativní skóre dosáhne nuly nebo klesne pod ní díky akumulaci jednoho nebo více negativně hodnocených srovnání, nebo pokud je dosažen konec jedné nebo druhé sekvence. Parametry algoritmu BLAST W, T a X určují citlivost a rychlost porovnávání. Program BLAST používá jako předvolené hodnoty délky slova (W) 11, BLOSUM62 skórovací matrix (viz Henikoff and Henikoff (1989) Proč. Nati. Acad, Sci. USA 89:10915) srovnání (B) 50, pravděpodobnost (E) 10, M=5, N=4 a srovnávají se oba řetězce.
Navíc k vypočítané sekvenční identitě, BLAST také provádí statistickou analýzu podobnosti mezi dvěmi sekvencemi (Viz např. Karlin and Altschul (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Jedno stanovování podobností prováděné pomocí algoritmu BLAST stanoví také nejmenší sumu pravděpodobnosti (P(N)) která udává hodnotu pravděpodobnosti podle níž shoda mezi dvěma nukleotidovými sekvencemi je dána náhodou. Například nukleová kyselina je rozeznána jako podobná referenční sekvenci, pokud nejmenší suma pravděpodobnosti porovnání testované nukleové kyseliny s referenční nukleovou kyselinou je nižší než asi 0,1, lépe pak nižší než 0,001 a nejlépe pokud je nižší než asi 0,001.
Další faktor ukazující, že sekvence nukleových kyselin jsou v podstatě identické je, pokud kódované polypeptidy jsou navzájem křížově reaktivní. Z toho vyplývá, že polypeptid je v podstatě identický s druhým polypeptidem, například pokud se dva peptidy odlišují pouze konzervativní substitucí. Dalším důkazem identity dvou nukleových kyselin je vzájemná hybridizace za přísných podmínek, jak byla popsána výše.
IL-B30 z jiných savčích druhů může být klonováno a izolováno mezidruhovou hybridízací blízce příbuzných druhů. Homologie může být relativně nízká mezi vzdálenějšími druhy a díky tomu je hybridizace mezi bližšími druhy pravděpodobnější.
Příprava protilátek vykazujících nižší druhovou specifítu může být výhodná pro expresivní klonování.
Příprava IL-B30
DNA kódující IL-B30 nebo jeho fragmenty, může být získána chemickou syntézou, otestováním cDNA knihoven nebo prohledáním genetických knihoven připravených ze širokého spektra so buněčných linií nebo tkáňových vzorků. Viz např. Okayama and Berg (1982) Mol. Cell. Biol.
2:161-170, Gubler and Hoffman (1983) Gene 25:263-269, a Glover (1984) DNA Cloning:
A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Sekvence zde uvedená zahrnuje použitelné PCR primery nebo umožňuje syntetickou nebo jinou přípravu vhodných genů, kódujících IL-B30, včetně přirozeně se vyskytujících variant.
rt
CZ 3UU958 B6
Tato DNA může být exprimována v širokém spektru hostitelských buněk, tak aby vznikl IL-B30 s plnou délkou, nebojeho fragmenty, které mohou být použité pro přípravu monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, pro vazebné studie, pro konstrukci a expresi modifikovaných molekul a pro strukturní nebo funkční studie.
Vektory tak, jak jsou zde použity, včetně plazmidů, virů, bakteriofágů, inegrovatelných fragmentů DNA a jiných transportních zařízení, umožňujících integraci fragmentů DNA do genomu hostitele. Viz Pouwels et al., (1985) Cloning vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY, a ío Rodriguez et al., 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vector and Their Uses,
Buttersworth, Boston, MA.
Pro účely tohoto vynálezu jsou sekvence DNA operativně připojeny, pokud si funkčně odpovídají, dohromady. Například DNA kódující presekvenci sekretomí domény je operativně připojena k polypeptidu, pokud je exprimován jako preprotein nebo se podílí na nasměrování polypeptidu na buněčnou membránu nebo na jeho sekreci. Promotor je operativně připojen ke kódující sekvenci, pokud kontroluje transkripci polypeptidu, místo vázající ribozómy je operativně připojeno ke kódující sekvenci pouze pokud je umístěno tak, aby umožňovalo translaci. Operativně připojeno obvykle znamená, že spadá do čtecího rámce, ačkoliv některé elementy jako jsou např. represorové geny nepokračují kontinuálně, ale přesto jsou stále vázány na operátorové sekvence řídicí jejich expresi. Viz např. Rodriguez et al., kapitola 10, str. 205-236, Balbas and Bolivar (1990) Methods in Enzymology 185:14-37, a Ausubel et al., (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY.
Reprezentativními příklady vhodných expresních vektorů jsou pCDNAl, pCD, Viz Okayama, et al., (1985) Mol. Cel. Biol. 5:1136-1142, pMClneo Poly-A, viz Thomas et al., (1987) Cell 51:503-512, a baculovirový vektor jako je pAC373 nebo pACólO, viz Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177-199.
Často je nezbytné exprimovat polypeptid IL-B30 v systému, který zajišťuje specifickou nebo definovanou glykosylaci. Viz Luckow and Summers (1988) Bio/Technology 6:47-55, a Kaufman (1990) Meth. Enzymol. 185:487-511.
Protein IL-B30 nebo jeho fragment může být připraven tak, že fosfatidyl inositoi (Pl) je navázán na membránu, ale může zní být odstřižen enzymy Štěpícími fosfatydilinositol, např. fosfolipázou-42. To umožní uvolnit antigen v biologicky aktivní formě a umožňuje další purifikaci standartními postupy proteinové chemie. Viz např. Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988:427-454, Tse et al., (1985) Science 230:1003-1008 a Brunner et al., (1991) J. Cell. Biol. 114:1275-1283.
IL-B30 je charakterizován a jeho fragmenty nebo deriváty mohou být připraveny konvenčními procesy pro syntézu peptidů. Jedná se o postupy popsané v Steward and Young (1984) Solid Phase Peptid Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, Bodanszky (1984) The
Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York a Villafranca (1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academie Press, San Diego, CA.
Použití
Navrhovaný vynález popisuje látku, která najde uplatnění v diagnostice, jak je zde popsáno, např. pro poruchy způsobené IL-B30, nebo výše popsané v popisu kitů pro diagnostiku. Gen může být využitelný v právnických vědách, např. pro rozlišení hlodavců od lidí, nebo jako znak pro rozlišení mezi různými buněčnými typy vykazujícími rozdílnou expresi a modifikaci.
- IQ CZ 300958 B6
Navrhovaný vynález také popisuje látky s důležitým komerčním a/nebo terapeutickým potenciálem. 1L-B30 (buď přirozené, nebo rekombinantní) nebo jeho fragmenty či protilátky proti němu, zároveň s látkami u kterých byla zjištěna vazebná afinita k IL-B30, mohou být použitelné jako složky výukových technik molekulární biologie, imunologie nebo fyziologie. Patřičné kity mohou být připraveny ze složek využitelných v laboratoři používající proteiny, protilátky, klonovací techniky, histologii atd.
Tyto látky mohou být také použity pro léčbu poruch spojených s abnormálními fyziologickými projevy nebo vývojem, včetně zánětlivých poruch. Mohou být také využity v testech na prítom10 nost nebo absenci reagujících komponent, které mohou být důvodem úspěchu léčebné strategie. Konkrétně, modulace fyziologie různých, např. hematopoietických nebo lymfoidních buněk, může být dosaženo odpovídajícím způsobem léčby za použití přípravku zde popisovaného. Viz Thomson (1994) The Cytokine Handbook (2. vydání) Academie Press, San Diego, Metcalf and Nicola (1995) The hematopoietic Colony Stimulating Factors, Cambridge University Press a (5 Aggarwal and Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.
Například choroba nebo porucha spojená s abnormální expresí nebo abnormální signalizací IL-B30 může být vhodným uplatněním pro agonistů nebo antagonistu. Nové cytokiny mohou hrát v regulaci nebo vývoji hematopoietických buněk, např. lymfoidních buněk ovlivňujících imunitní reakci, např. zánět nebo autoimunitní poruchu. Může také ovlivnit vaskulámí fyziologii nebo vývoj, či neurologické reakce.
Cytokiny mohou tedy způsobovat, v různém kontextu, syntézu cytokinů buňkami, proliferaci atd. Antagonisti IL-B30, jako jsou mutantní varianty přirozeně se vyskytujících forem IL-B30, nebo blokující protilátky, mohou zajistit selektivní a účinnou cestu jak blokovat imunitní reakci, např. v situaci jakou je zánět nebo autoimunitní reakce. Viz Samter et al., Immunological Diseases díl 1 a 2, Little Brown and Co.
Navíc některé kombinace přípravků mohou být využity s dalšími modulátory zánětu. Těmito molekulami mohou být např. steroidy, jiné varianty IL-6 a/nebo G-CSF, včetně specifických variant nebo virových homologů a jejich odpovídajících antagonistů.
Různé abnormální situace jsou známé ve všech buněčných typech produkujících IL-B30 mRNA což prokázal Northern blot. Viz Berkow The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J., Thom, et al., Harrisona Principles of Intemal Medicine, McGraw-Hill,
N.Y. a Weatherhall et al., Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Celá řada medicínských poruch nebo chorob zahrnuje aktivaci makrofágů nebo monocytů a řada z nich bude citlivá k léčbě agonisty nebo antagonisty popisovanými v navrhovaném vynálezu. Viz Stites and Jerr (1991) Basic and Clinical Imunology Appleton and Lange, Norwalk,
Conecticut a Stamter et al., Immunological Diseases Little Brown and Co. Tyto problémy mohou být citlivé k prevenci nebo léčbě za použití přípravků zde popisovaných. Lokalizace pankreatických ostrůvků naznačuje možnou souvislost s diabetem.
IL-B30, antagonisti protilátky, atd. mohou být přečištěny a poté podávány pacientům, a to buď zvířatům, nebo lidem. Tyto látky mohou být z terapeutických důvodů kombinované s dalšími aktivními nebo inertními složkami, např. v konvenčním farmaceutickém nosiči nebo rozpouštědle, např. imunogenním adjuvans, zároveň s fyziologicky neškodným stabilizátorem, excipientem nebo ochrannou složkou. Tyto kombinace mohou být sterilní nebo filtrované a umístěné v dávkách jako lyofilizované dávky nebo stabilizované vodné roztoky. Navrhovaný vynález také so popisuje použití protilátek nebo jejich vazebných fragmentů, včetně forem, které se nevážou na komplement.
Testování léčiv za použití ÍL-B30 nebo jeho fragmentů může být použito pro identifikaci látek s vazebnou aktivitou k této molekule, nebo jiným podstatným biologickým efektem na funkce
IL-B30, včetně izolace asociovaných komponent. Následné biologické techniky mohou být
CL JW5O3 »0 použity ke stanovení podstatné stimulační aktivity, a je tedy bloker nebo antagonista v tom, že blokuje jeho biologickou aktivitu. Podobně látky s podstatným stimulačním efektem mohou aktivovat signální dráhu, a být tedy agonisty do té míry, že stimulují aktivitu IL-B30. Navrhovaný vynález také popisuje therapeutické použití blokujících protilátek proti IL-B30 jako antagonistů a stimulačních protilátek jako agonistů. Tento aspekt by mohl být využitelný s jinými druhovými variantami IL-B30.
Kvantifikace látek nezbytných pro efektivní therapii závisí na celé radě různých faktorů, včetně způsobu podání, cílového místa, fyziologického stavu pacienta a dalších podaných léčiv. Léčebná io dávka musí být tedy pečlivě stanovena aby se dosáhlo ideálního efektu a bezpečnosti. Obvyklá dávka použitá in vitro může dát dobré vodítko pro stanovení dávky in šitu. Testování efektivní dávky na zvířatech v případě některých konkrétních poruch je důležitou prediktivní informací pro stanovení dávkování pro člověka. Je popsána řada domněnek, např. Gilman et ai., (1990)
Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, (8 vydání), Pergamen
Press a Remingtone Pharmaceutical Sciences, (17 vydání) (1990), Mack Publishing Co., Easton Penn. Způsoby podání jsou uvedeny dále, je možné aplikovat např. orálně, nitrožilně, intraperitoneálně, nebo pomocí intramuskulámí aplikace, transdermální difúze a dalších. Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou např. voda, fyziologický roztok a další látky popsané v Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Rozmezí dávek je možné očekávat v koncentraci menší než
1 mM, obvykle nižší než 10 μΜ, většinou pak nižší než asi 100 nM, lépe pak nižší než asi 10 pM (pikomolámí) a nejlépe nižší než asi 1 fM (femtomolámí) s odpovídajícím nosičem. Formy s pomalým uvolňováním, nebo aparáty pomalu uvolňující léčivo mohou být využity pro kontinuální dlouhodobou aplikaci. Viz Langer (1990) Science 249:1527-1533. IL-B30, jeho fragmenty a protilátky proti němu nebo jeho fragmentům, antagonisti nebo agonisti mohou být podány přímo pacientovi, nebo v závislosti na velikosti léčiva, může být žádoucí konjugovat je na proteinový nosič, jako je ovalbumin nebo sérový albumin před jejich aplikací. Therapeutické formulace mohou být podány v řadě konvenčních forem. Ačkoliv je možné podávat aktivní složku samotnou, je lepší použít pro aplikaci některou farmaceutickou formulaci. Tato forma obvykle obsahuje alespoň jednu aktivní složku, jak byla definována výše, zároveň s jedním nebo více přijatelnými nosiči. Každý nosič musí být jak farmaceuticky, tak fyziologicky přijatelný, v tom smyslu, že musí být kompatibilní s ostatními složkami a nesmí být škodlivý pro pacienta. Tyto formy jsou určeny pro orální, nasální, rektální povrchové nebo parenterální (Včetně subkutánní, intramuskulámí, intravenózní a intradermální aplikace) podání. Tyto formulace mohou být konvenčně rozděleny na jednotlivé dávky a připravené způsoby známými v současném stavu techniky. Viz. Gilman et al., (1990) Goodman And Gilmans: The Pharmacological Bases of Therapeutics, (8 vydání). Pergamen Press a Remingtone Pharmaceutical Sciences, (17 vydání) (1990), Mack Publishing Co., Easton Penn., Avis et al., (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, New York a Liebermann et al., (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekke, New York. Terapie podle navrhovaného vynálezu může být kombinována a nebo použita zároveň s jinými agens, např. jinými cytokiny včetně IL-6 nebo G-CSF nebo jejich antagonisty.
Jak přirozené, tak rekombínantní formy IL-B30 podle navrhovaného vynálezu jsou použitelné pro kity a techniky testující vazebnou aktivitu těchto látek k proteinům. Některá techniky byly vyvinuty před pár lety a umožňují otestování desítek tisíc látek za krátkou dobu. Viz Fodor et al., (1991) Science 251:767-773, popisující techniky testování vazebné afinity množstvím definovaných polymerů syntetizovaných na pevném substrátu. Vývoj použitelných technik může být značně usnadněn dostupností velkého množství přečištěných rozpustných IL-B30 popisovaných navrhovaným vynálezem. Jiné techniky mohou být použity pro stanovení kritického množství interakce IL-B30 - IL-B30 receptor. Může být použita například mutační analýza. Viz Somoza et al, (1993) J. Exptl. Med. 178:549-558, pro stanovení specifických residuí kritických pro interakci a/nebo pro přenos signálu. PHD (Rošt and Sander (1994) Proteins 19:55-72) a DSC (King and Stemberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310) mohou určit sekundární strukturu predikcí α-helixů (H) a β-pásů (E) nebo smyček (L). Nejdůležitější jsou A a D hetixy pro interakci s receptorem, D helix je nejdůležitější oblast. Helix A u člověka probíhá od asi pro(7) do his(27),
-21 CZ 300958 B6 zatímco helix D probíhá od trp( 135) do gly( 162), Struktury vystavené na povrchu ovlivňují vazbu na receptor, zatímco zanořená residua ovlivňují celkovou strukturu. Residua s predikovanou důležitostí jsou arg( 146), ser( 147), gln(149), ala(150, ala(153), val( 154), ala(156), arg(157), ala(160) a his(161). Antagonisté mohou být nalezeni normálně pokud je antigen strukturálně definován, např. je známá jeho terciální struktura. Testování potenciálních interakčních analogů je nyní možné díky vývoji vysoce automatizované techniky využívající přečištěný IL-B30. Konkrétně, noví agonisté nebo antagonisté budou objeveni za použití technik zde popsaných. Poměrně důležité jsou složky s kombinovanou vazebnou afinitou pro celé spektrum IL-B30 molekul, např., látek sloužících jako antagonisti druhových variant IL-B30.
io
Jedna technika testování využívá eukaryotních nebo prokaryotních buněk, které jsou stabilně transformovány rekombinantní molekulou DNA kódující IL-B30. Mohou být izolované buňky exprimující IL-B30 v izolaci od ostatních proteinů.Tyto buňky potom v nativní nebo fixované formě mohou být použity jako standartní vazebný partner. Viz Parce et al., (1990) Proč, Nati.
is Acad. Sci. USA 87:4007-4011, popisující citlivou techniku detekci buněčné odpovědi.
Další techniky testování léčiv zahrnují způsoby zajišťující vysoce výkonné testování látek s patřičnou vazebnou afinitou klL-B30 a jsou detailně popsány v Geysen European Patent Application 84/03564, podaném 13. září, 1984. První velké množství odlišných malých testova2o ných peptidů bylo syntetizováno na pevném substrátu, např. plastikovém hrotu nebo jiném vhodném povrchu. Viz Fodor et al. (1991). Poté jsou všechny hroty ponechány reagovat s rozpuštěným a nepřečištěným, nebo rozpuštěným a přečištěným IL-B30 a promyty. Dalším krokem je detekce navázaného IL-B30.
Rozumné přizpůsobování léčiv může být založeno také na strukturálních studiích molekulární struktury IL-B30 a jiných efektem nebo analogů. Efektory mohou být i jiné proteiny které mají jiné funkce v reakci na vazbu, nebo jiné proteiny normálně reagující sIL-B30, např. receptor. Jedním způsobem určení místa specificky reagujícího s jiným proteinem je určení fyzické struktury, např. rentgenovou krystalografií nebo dvojdimenzionální NMR technikou. Tyto techni3ϋ ky podají informace o tom, které aminokyseliny ze zkoumané kontaktní oblasti molekuly reagují, např. vzhledem k jinému modelu receptor-cytokin. Pro detailní popis stanovování proteinové struktury Viz Blundel and Johnson (1976) Protein Crystalography, Academie Press, New York. Kity
Navrhovaný vynález také popisuje použití IL-B30 proteinů, jejich fragmentů, peptidů a jejich fůzních produktů v celé řadě diagnostických kitů a technik určených pro detekci přítomnosti jiného IL-B30 nebo vazebného partnera. Kit obvykle obsahuje složku obsahující buď definovaný IL-B30 peptid, nebo genový segment, nebo látku rozeznávající jedno z toho, např. IL-B30 fragment nebo protilátka.
Kit určený pro stanovování vazebné afinity testovaných látek k IL-B30 obvykle obsahuje testovanou složku, značenou látku, např, vazebného partnera nebo protilátku se známou vazebnou afinitou pro IL-B30, zdroj IL-B30 (přirozený nebo rekombinantní) a způsob separace vazby z volné značené molekuly, jako je pevná fáze nebo imobilizace molekuly. Jakmile je o látce zjištěno, že má dostatečnou vazebnou afinitu k antigenu, může být testována pomocí patřičných biologických technik, dobře známých v současném stavu techniky, aby bylo zjištěno jestli působí jako agonista nebo antagonista signalizační dráhy IL-B30. Dostupnost rekombinantního 1L-B30 polypeptidu také umožňuje použít ho jako velmi dobře definovaný standart pro kalibraci těchto technik.
Nej vhodnějším kitem pro stanovování koncentrace, např. IL-B30, ve vzorku je značená látka, např. vazebný partner nebo protilátka, se známou vazebnou afinitou k antigenu, zdroj cytokinů (přirozených i rekombinantních) a způsob pro separaci navázané a volné složky, např. pevná fáze pro imobilizaci IL-B30. Jsou obsaženy složky obsahující chemikálie a také instrukce.
CL JUUV35 BO
Protilátky, včetně vazebných fragmentů, specifické proti IL-B30 nebo fragmentům jsou použivatelné v diagnostice pro detekci přítomnosti zvýšené hladiny IL-B30 a/nebo jeho fragmentů. Tyto diagnostické techniky využívají lyzáty, živé buňky, fixované buňky, imunofluorescenci, buněčné kultury a také mohou využívat detekci antigenu podobných sérovým antigenům a podobně. Diagnostické techniky mohou být homogenní (bez separačního kroku mezí volnou látkou a komplexem antigen - vazebný partner) nebo heterogenní (se separačním krokem). Existuje řada komerčních technik jako je RIA (radioimunoassay), ELISA (enzyme-línked imunosorbent assay), EIA (enzyme imunoassay), EM1T (enzyme-multiplied immunoassay technique), SLFIA (substrate-labeled fluorescent immunoassay a podobně. Viz Van Vunakis, et io al., (1980) Meth. Enzymol. 70:1-525, Harlow and Lané (1980) Antibodies: A Laboratory Manual, CHS Press, a Colingan et al., (1993) Current Protocols in Immunology, Greene and
Wiley, NY.
Antiidiotypové protilátky mohou být podobně použity pro diagnostiku přítomnosti protilátek is proti IL-B30, což může být diagnostickým parametrem při řadě abnormálních stavů. Například nadprodukce IL-B30 může vést ke vzniku řady imunologických reakcí, které mohou způsobit řadu abnormálních fyziologických stavů, konkrétně při proliferativních poruchách jako je rakovina nebo abnormální aktivace a diferenciace. Navíc dostupné rozložení exprese ukazuje, že cytokiny jsou exprimovány v pankreatických ostrůvcích, což naznačuje možnost, že by se mohly podílet na funkci těchto orgánů, např. ve zdravotních projevech doprovázejících diabetes.
Většina chemických látek potřebných pro reakce je obvykle obsažena v kitu, tak, aby byla optimalizována citlivost techniky. Pro předmět navrhovaného vynálezu, v závislosti na povaze techniky, protokolu, a značce je použita buď značená nebo neznačená protilátka nebo vazebný partner, nebo značený IL-B30, Obvykle jsou v kombinaci s dalšími aditivy, jako jsou pufry, stabilizátory, látky nezbytné pro vznik signálu, jako jsou substráty enzymů a podobně. Je vhodné, aby kit také obsahoval instrukce pro správné použití a popis likvidace odpadu. Kit má obvykle oddělenou složku pro každou chemikálii. Je vhodné, aby byly chemikálie použity ve formě suchého lyofilizovaného prášku, neboť mohou být rekonstruovány ve vodném médiu za použití patřičných koncentrací látek nezbytných pro test. Řada výše uvedených součástí testovacích a diagnostických technik může být použita bez modifikace, nebo může být modifikována celou řadou způsobů. Například, vazba značící molekuly může být jak kovalentní, tak nekovalentní a může se jednat o látku přímo či nepřímo vytvářející detekovatelný signál. V jakékoliv z těchto technik, vazebný partner, testovaná látka, IL-B30 nebo protilátka proti němu může b^t značena přímo nebo nepřímo. Možnosti pro přímé značení jsou: radiové značky, jako je |25I, enzymy (patent US 3 645 090) jako je peroxidáza a alkalická fosfatáza a fluorescenční značky (patent US 3 940 475) schopné monitorování změn intenzity fluorescence, posunu vlnové délky nebo fluorescenční polarizace. Možnosti nepřímého značení jsou biotinylace jedné složky následované vazbou avidinu konjugovaného s některou z výše uvedených molekul.
Existuje také celá řada technik separace vazbou na volný IL-B30, nebo alternativně vazbou z testované složky. 1L-B30 může být imobilizováno pomocí řady způsobů což umožňuje následné promytí. Vhodným materiálem pro imobilizaci může být například plast, jako jsou ELISA destičky, filtry nebo partikule. VizColigan et al., (1993) Current Proticols in Immunology, vol. 1,
Greene and Wiley, NY. Jiné vhodné separační techniky jsou, bez limitace, fluorescenční protilátky s magnetickými kuličkami. Viz Rattle et al., (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461 a separace pomocí dvou protilátek s magnetickými kuličkami, jak popisuje patent US 4 659 678.
Techniky připojení proteinů nebo jejich fragmentů k různým značícím komponentám, je rozsáhle podána v literatuře, a není proto nutněji zde podrobněji probírat.
Řada technik využívá pro vazbu použití aktivovaných karboxylových skupin tak, aby pomocí karbodiimidu nebo aktivního esteru vznikla peptidová vazba, vytváření thioesterů reakcí merkapto skupiny s aktivovaným halogenem jako je chloroacetyl, nebo s aktivovaným olefinem jako je maleimid, a podobně. V těchto aplikacích jsou využitelné i fúzní proteiny.
-23CZ 300958 B6
Další diagnostický aspekt navrhovaného vynálezu představuje použití oligonukleotidové nebo polynukleotidové sekvence vyňaté ze sekvence IL-B30. Tyto sekvence mohou být využity jako próby pro detekci přepisu IL-B30 ve vzorcích pacientů postižených abnormálními poruchami, jako je zánět nebo autoimunita. Jelikož cytokiny mohou být značkou nebo původcem aktivace, dají se využít pro stanovení množství aktivovaných buněk což napoví jestli má být nasazena další terapie, před tím než efekt dosáhne progresivní důležitosti. Příprava jak RNA tak DNA sekvencí, značení sekvencí a preferovaná velikost sekvencí je více než dostatečně diskutována v literatuře. Viz např. Langer-Safer et al., (1982 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:438 W385, Caskey (1987) io Science 236:962-967 a Wilchek etal., (1988) Anal. Biochem. 171:1-32.
Diagnostické kity používané pro testování kvalitativní nebo kvantitativní exprese jiných molekul jsou rovněž zahrnuty. Diagnóza nebo prognóza mohou záviset na kombinaci celé řady indikací použitých jako znaky. Kity mohou tedy testovat kombinace znaků. Viz Viallet et al., (1989)
Progress in Growth Factor res. 1:89-97. Různé kity mohou být využity pro testování různých buněčných populací.
Izolace receptoru IL-B30
Pokud je izolován ligand ze specifické interakce ligand - receptor, existuje rada technik sloužících k izolaci receptoru. Viz Gearing et al., (1998) EMBO J. 8:3667-3676. Například, je možné stanovit míru vazby 1L-B30 cytokinů značeného bez ovlivnění jeho vazby na receptor. Například, afinitní značka může být fázována na buď amino-, nebo karboxy- konec ligandu. Touto značkou může být například tag typu FLAG, nebo Fc doména imunoglobulínu. Expresní knihovna může být testována na specifickou vazbu k cytokinů, např. buněčným sortingem, nebo jinou technikou tak, aby byla nalezena subpopulace exprimující patřičný vazebný komponent. Viz např. Ho et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:11267-11271, a Liu et al., (1994) J.Imunol. 152:1821-29.
Může být také využita technika panningu. Viz Seed and Aruffo (1987 Proč. Nati. Acad. Sci. USA
84:3365-3365.
Pro izolaci vazebného partnera IL-B30 je také možné využít techniku křížového provázání proteinů se značkou. To umožní identifikaci proteinů specificky interaguj ících s cytokinem např. způsobem ligand - receptor,
Proběhly také ranné experimenty snažící se stanovit zda receptory IL-6 a G-CSF jsou zapojeny v odpovědi na IL-B30. Je také možné, že tyto funkční receptorové komplexy sdílejí řadu nebo dokonce všechny komponenty s IL-B30 receptorem, buď jako specifickou receptorovou podjednotku, nebo připojenou receptorovou jednotku.
Je možné vytvořit řadu modifikací a variant tohoto vynálezu aniž by byl překročen rámec a myšlenka vynálezu, což je každému odborníkovi v oboru jasné. Konkrétní varianty zde popsané jsou uváděny pouze jako příklady a vynález může být limitován pouze závěry uvedených nároků v plné míře a rozsahu těchto nároků.
Příklady provedení vynálezu
Přikladl Obecná technika
Řada standartních technik je popsáno nebo uvedeno v Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, Sambrook et ak, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 vydání) vol. 1-3, CSH Press, NY,
CL BO
Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn NY, Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Greene NY, Innis et al., (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications Academie Press NY. Purifikace proteinu může být provedena pomocí precipitace síranem amonným, chromatografícky, elektroforeticky, centri5 fugací, krystalizaci atd. Viz Ausubel et al., (1987), Deutscher (1990) Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology vol. 182, Coligan et al., (1995) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, New York, NY, P. Matsudaira (1993) A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microseqencing, Academie Press, San Diego, CA a literatura vydávaná výrobci purifikačních produktů, např. Pharmacia, Piscataway, NJ nebo Bio-Rad, io Richmond, CA. Kombinace s rekombinantními technikami umožňuje fúzi patřičných segmentů (tágy epitopů) např. FLAG sekvence, nebo nějakého fúzního ekvivalentu prostřednictvím sekvence odstranitelné proteázou. Viz Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70, Hochuli (1990) Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent v Setlow Genetic engeneering, Principle and Methods 12:87-98, Plenům Press, NY a Crowe et al., (1992)
OIAexpress: The High Level of Expression & Protein Purification System QUIAGEN, lne., Chatsworth, CA.
Standartní imunologické techniky jsou popsány v Hertzenberg et al., (1996) Wer's Handbook of Experimental Immunology, vol. 1^1, Blackwell Science, Coligan (1991) Current Protocols in
Immunology, Wilwey and Greene, NY a Methods in Enzymology vol. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 a 163. Techniky detekce cytokinu jsou popsány v Thomson (1994) The Cytokine Handbook, Academie Press, San Diego, Metcalf and Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press, a Aggarwal and Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.
Techniky testující vaskulámí biologické aktivity jsou dobře známé v současném stavu techniky. Jedná se o angiogenní a angiostatickou aktivitu v nádoru nebo v jiných tkáních, např. proliferace arteriálního hladkého svalstva (Koyoma et al. (1996) Cell 87:1069-1078) adheze monocytů na vaskulámí epithelium ( McEvoy et al., (1997) J. Exp. Med. 185:2069-2077). Dále Viz Ross (1993) Nátuře 362:801-809, Rekhter and Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147:668-677, Thyberg et al., (1990) Artheroscierosis 10:966-990 a Gumbiner (1996) Cell 84:345-357.
Techniky testující aktivitu buněk nervového systému jsou popsány v Wouterlood (1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier, Methods in Neurosciences Academie Press a
Neuromethods Humana Press, Totowa, NY. Metodologie vývojového systému je popsána v Meisami Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press a Chrispeels Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology, Interscience.
FACS analýza je popsána v Melamed et al., (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, lne.
New York, NY and Robinson et al., (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York,NY.
Příklad 2 Klonování lidského IL-B30 45
Genová sekvence je uvedena v tabulce 1. Tato sekvence je získána z knihovny cDNA připravené z melanocytů, fetálního srdce a pregnantního uteru. Nachází se také v knihovně cDNA získané z pankreatických ostrůvků. Tyto sekvence umožňují přípravu PCR primerů nebo prób ke zjištění buněčné distribuce genu. Tato sekvence umožňuje izolaci kódující genomové DNA.
Použitím próby nebo PCR primerů, byla testována řada tkání aby byla zjištěna buněčná distribuce. PCR produkty byly klonovány pomocí např. TA klonovacího kitu (Invitrogen). Výsledné plasmidy cDNA byly osekvenovány
-25CZ 300958 B6
Příklad 3 Buněčná exprese IL-B30
Byl připraven vhodný primer nebo próba specifická pro cDNA kódující IL-B30 u primátů. Tato próba je obvykle značena. Exprese probíhá pravděpodobně v popsaných tkáních a navíc ještě v pankreatických ostrůvcích. Southern blot: DNA (5 pg) z primární amplifikované knihovny cDNA bylo naštípáno vhodnými restrikčními enzymy aby se uvolnily inzerty, rozděleno na 1% agarózovém gelu a převedeno na nylonovou membránu (Schleicher and Schuell, Keene, NH).
Vzorky pro izolaci lidské mRNA obsahují: periferní mononukleáry (monocyty, T-buňky, NK io buňky, granulocyty, B-buňky), klidové (T100), periferní mononukleáry aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 12 h, smíchané (T101), T-buňky THO klon Mot 72, klidové (TI02), T-buňky THO klon Mot 72 aktivované anti-CD3 po dobu 3, 6, 12 h, smíchané (TI03), T-buňky THO klon Mot anergicky inkubované se specifickým peptidem po dobu 2, 7, 12 h, smíchané (T104), T-buňky TH1 klon HY06, klidové (T107), T-buňky TH1 klon HY06 aktivované anti-CD28 a anti-CD3 po dobu 3, 6, 12 h, smíchané (TI08), T-buňky TH1 klon HY06 anergicky inkubované se specifickým peptidem po dobu 2, 6, 12 h, smíchané (TI09), T-buňky TH2 klon HY935, klidové (TI 10), T-buňky TH2 klon HY935 aktivované anti-CD28 a anti-CD3 po dobu 2, 7, 12 h, smíchané (Tlil), T-buněčné nádorové buňky Jurkat a Hut78, klidové (TI 17), T-buněěné klony, smíchané AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, klidové (TI 18), náhodné
T-buněěné γδ klony klidové (TI 19), CD-28 T-buněěné klony, splenocyty, klidové (B100), splenocyty aktivované anti-CD40 a IL-4 (B101), B-buněčné EBV linie smíchané, WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, klidové (B102) B-buněčná linie JY, aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h, smíchané (B103), NK20 klony, smíchané. Klidové (K101), NK20 klony aktivované PMA a ionomycinem po dobu 6 h (K101), NKL klon odvozený z periferní krve
LGL leukemického pacienta, aktivovaný IL-2 (K106), hematopoietický prekurzor linie TF1, aktivovaný PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h, smíchané (Cl00), U973 premonocytická linie, klidová (M100), U973 premonocytická linie, aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h, smíchaná (Ml01), proprané monocyty, aktivované LPS, IFNy a anti 1L10 po dobu 1, 2, 6, 12, 24 h, smíchané (Ml02), proprané monocyty, aktivované LPS, IFNy a anti IL10 po dobu 1, 2, 6,
12, 24 h, smíchané (Ml03), proprané monocyty, aktivované LPS, IFNy a anti IL10 po dobu 4, h, smíchané (Ml06), proprané monocyty, aktivované LPS, IFNy a anti IL 10 po dobu 4, 16 h, smíchané (Ml07), proprané monocyty, aktivované LPS po dobu 1 h (Ml08), proprané monocyty, aktivované LPS po dobu 1 h (M109), DC 70 % CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1 h (Dl02), DC 70 % CDla+, z CD34+ GM-CSF,
TNFa 12 dní, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 6 h (Dl03), DC 95 % CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, sortované FACSem, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h smíchané (D104), DC 95 %CD14+, ex CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, sortované FACSem, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h smíchané (Dl05), DC CDla+, CD86+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, sortované FACSem, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h smíchané (Dl06), DC z monocytů GM-CSF, IL-4 5 dní, klidové (Dl07), DC z monocytů GMCSF, IL-4 5 dní, klidové (Dl08), DC z monocytů GM-CSF, IL-4 5 dní, aktivované LPS po dobu 4, 16 h, smíchané (Dl09), DC z monocytů GM-CSF, IL4 5 dní, aktivované TNFa, monocyt supe po dobu 4, 16 h, smíchané (DUO), epiteliální buňky, nestimulované, epiteliální buňky aktivované IL—1 p, fibroblasty plicního sarkomu linie MRC5 aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h smíchané (C101), buněčná linie epiteliálního karcinomu ledviny CHA, aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h smíchané (Cl02). Exprese IL-B30 transkriptů je velmi vysoká v těchto vzorcích: proprané monocyty aktivované LPS, IFNy, anti IL-10 po dobu 4, 16 h smíchané (Ml06), proprané monocyty, aktivované LPS, IFNy a anti IL10 po dobu 1, 2, 6, 12, 24 h, smíchané (Ml02), proprané monocyty, aktivované LPS po dobu 1 h (Ml08), proprané monocyty, aktivované LPS po dobu 1 h (M 109).
Exprese byla vysoká v DC 95 % CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, sortované FACSem, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1,6 h smíchané (Dl04), NK20 klony aktivované PMA a ionomycinem po dobu 6 h (K101). Nižší exprese byla detekována v DC 70 % CDla+, z CD34+
GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 6 h (Dl03), DC 70 % CDla+,
CZ JWIVS» Bb zCD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní aktivované PMA a ionomycinem po dobu l h (D102), T-buňky TH1 klon HY06 anergicky inkubované se specifickým peptidem po dobu 2, 6, 12 h, smíchané (TI09), periferní mononukleáry aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 12 h, smíchané (TI 01), T-buňky THO klon Mot 72 aktivované anti-CD3 po dobu 3, 6, 12 h, smíchané (T103), spleno5 cyty aktivované anti-CD40 a IL-4 (B101), T-buňky THO klon Mot 72 anergicky inkubované se specifickým peptidem po dobu 2, 7, 12 h, smíchané (TI 04), CD-28 T-buněčné klony, splenocyty, klidové (B100), T-buňky TH1 klon HY06 aktivované anti-CD28 a anti-CD3 po dobu 3, 6, 12 h, smíchané (TI08), proprané monocyty, aktivované LPS, IFNy a anti IL10 po dobu 4, 16 h, smíchané (Ml07), B-buněčná linie JY, aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h, ío smíchané (B103).
Detekovatelná exprese byla pozorována v DC z monocytů GM-CSF, IL-4 5 dní, aktivované LPS po dobu 4, 16 h, smíchané (Dl09), T-buňky THO klon Mot 72, klidové (TI02), periferní mononukleáry (monocyty, T-buňky, NK buňky, granulocyty, B-buňky), klidové (TI 00), T-buňky
CD4+ CD45RO- T-buňky polarizované, aktivované anti-CD3 a anti-CD28 4h (TI 16), T-buněčné klony, smíchané AD 130.2, Tc783.12, Tc783.l3, Tc783.58, Tc782.69, klidové (TI 18), U973 premonocytická linie, klidová (Ml00), hematopoietický prekurzor linie TF1, aktivovaný PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h, smíchané (Cl00), T-buňky TH2 klon HY935 aktivované antLCD28 a anti-CD3 po dobu 2, 7, 12 h, smíchané (Tlil), DC CDla+, CD86+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, sortované FACSem, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h smíchané (Dl06), proprané monocyty, aktivované LPS, IFNy a anti IL10 po dobu 1, 2, 6, 12, 24 h, smíchané (M103), DC z monocytů GM-CSF, IL-4 5 dní, aktivované TNFa, monocyt supe po dobu 4, 16 h, smíchané (Dl 10), DC z monocytů GM-CSF, IL—4 5 dní, klidové (Dl08), U973 premonocytická linie, aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 h, smíchaná (M101), náhodné T-buněčné γδ klony klidové (TI 19), T-buňky TH1 klon HY06 aktivované anti-CD28 a anti-CD3 po dobu 3, 6, 12 h, smíchané (TI 08). V ostatních vzorcích nebyl detekován žádný signál.
Obecně byla prokázána zvýšená distribuce IL-B30 v aktivovaných makrofázích, což naznačuje spojitost se zánětlivými procesy, aktivovaných Thl buňkách což souvisí s regulační nebo efekto30 rovou úlohou této subpopulace Th buněk, konkrétné při Thl imunitní reakci, a aktivovaných dendritických buňkách, což souvisí s jejich úlohou při prezentaci antigenu, nebo interakci s T nebo B buňkami v germinálních centrech.
Vzorky pro izolaci myší mRNA jsou myší buněčná linie fibroblastu L (C200), Braf:ER (Braf fúze s receptorem estrogenu) transfekované buňky, kontrola (C201). Mel 14+ naivní T-buňky ze sleziny, klidové (T209), Mel 14+ naivní T-buňky ze sleziny, stimulované IFNy, IL12 a anti-íL-^t aby se polarizovaly TH1 buňky, inkubace s IFNy a anti-IL-4 po dobu 6, 12, 24 h, smíchané (T210), Mel 14+ naivní T-buňky ze sleziny, stimulované IL-4 a anti-IFNy, aby se polarizovaly TH2 buňky, inkubace s IL-4 a anti-ÍFNy po dobu 6, 13, 24 h, smíchané (T211), T-buňky, TH1 polarizované (Mel 14, splenocyty CD4+, polarizované po dobu 7 dní IFNy a anti—IL-4, T200), T-buňky, TH2 polarizované (Mel 14, splenocyty CD4+, polarizované po dobu 7 dní IL-4 a anti- IFNy, T201), T-buňky, silně TH1 polarizované 3x z transgenních myší Balb/C (Viz Openshaw et al., (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367) aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 24 h, smíchané (T202), T-buňky, silně TH2 polarizované 3x z transgenních myši Balb/C aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 24 h, smíchané (T203), T-buňky, silné TH1 polarizované 3x z transgenních myší C57 bl/6 aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 24 h, smíchané (T212), T-buňky, silně TH2 polarizované 3x z transgenních myši C57 bl/6 aktivované anti-CD3 po dobu 2,6, 24 h, smíchané (T213), T-buňky, silně TH1 polarizované, naivní CD4+ T-buňky z transgenních myší Balb/C, polarizované 3x IFNy, IL12 a anti-IL-4, stimulované IGIF, IL-Í2 aanti-lL-4 po dobu
6, 12, 24 h smíchané, CD44- CD25+ pře T-buňky, sortované z thymu (T204), TH1 T-buňky klon Dl.l, klidové po tri týdny po stimulaci antigenem (T205), TH1 T-buňky klon Dl.l, stimulované 15 h 10 pg/ml ConA (T206), TH2 T-buňky klon CDC35, klidové po tři týdny po stimulaci antigenem (T207), TH2 T-buňky klon CDC35, stimulované 15 h 10 pg/ml ConA (T208), nestimulované B- buňky linie CH12 (B201), nestimulované maturované buňky
-27CZ 300958 B6
B-buněčné leukemie A20 (B200), nestimulované velké B-buňky ze sleziny (B202), B-buňky ze sleziny aktivované LPS (B203), dendritické buňky ze sleziny obohacené metrizamidem, klidové (D200), dendritické buňky z kostní dřeně, klidové (D201), nestimulované dendritické buňky z kostní dřené vyseparované anti B220, anti CD3 a anti MHC třídy II, kultivované v CM-CSF a
IL-4 (D202), dendritické buňky z kostní dřené vyseparované anti B220, anti CD3 a anti MHC třídy II, kultivované v CM-CSF a IL^4 stimulované anti-CD40 po dobu 1, 5 dní, smíchané (D203), monocytámí buněčná linie RAW 264.7 aktivovaná LPS 4 h (M200), makrofágy získané z kostní dřeně pomocí GM a M-CSF (M201), makrofágy získané z kostní dřeně pomocí GMCSF stimulované LPS, IFNy a anti—IL—ÍO po dobu 24 h, (M206), peritoneální makrofágy ίο (M207), makrofágová buněčná linie J774, klidová (M202), makrofágová buněčná linie J774, stimulovaná LPS anti—ÍL—10 po dobu 0,5, 1, 3, 6, 12 h, smíchaná (M203), makrofágová buněčná linie J774, stimulovaná LPS anti—IL—10 po dobu 0,5, 1, 3, 6, 12 h, smíchaná (M204), nestimulové mastocyty linie MC-9 a MC-12 (M208), imortalizované endotheliální buňky, nestimulované (E200), imortalizované endotheliální buňky získané z mozkových mikrovaskulámích endothelií, stimulované přes noc TNFa (E201), imortalizované endotheliální buňky získané z mozkových mikrovaskulámích endothelií, stimulované přes noc TNFa (E202), imortalizované endotheliální buňky získané z mozkových mikrovaskulámích endothelií, stimulované přes noc TNFa a IL—10 (E203), celá aorta z myši kmene wt C57 bl/6, celá aorta z 5 měsíční ApoE KO myší (X207), celá aorta z 12 měsíční ApoE KO myši (X207), wt thymus (0214), celý thymus, rag-1 (0208), celá ledvina, rag-1 (0209), celá ledvina, NZ B/W myš, celé srdce, rag-1 (0202).
Silný signál byl zjištěn v těchto případech: monocytámí buněčná linie RAW 264.7 aktivovaná LPS 4 h (M200), T-buňky, silně TH1 polarizované 3x z transgenních myší C57 bl/6 aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 24 h, smíchané (T212), T-buňky, silně TH1 polarizované, naivní CD4+
T-buňky z transgenních myší Balb/C, polarizované 3x IFNy, IL12 a anti-IL-4, stimulované IGIF, IL-12 a anti—IL—4 po dobu 6, 12, 24 h, smíchané.
Detekovatelný signál byl získán v těchto případech: T-buňky, silně TH1 polarizované 3x z transgenních myší Balb/C (Viz Openshaw et al., (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367) aktivované anti~CD3 po dobu 2, 6, 24 h, smíchané (T202), T-buňky, TH2 polarizované (Mel 14, splenocyty CD4+, polarizované po dobu 7 dní IL^4 a anti-IFNy, T201), T-buňky, THl polarizované (Mel 14, splenocyty CD4+, polarizované po dobu 7 dní IFNy a anti-IL-4, T200), makrofágová buněčná linie J774, stimulovaná LPS anti—IL—10 po dobu 0,5, 1, 3, 6, 12 h, smíchaná (M203), makrofágová buněčná linie J774, klidová (M202), makrofágová buněčná linie J774, stimulovaná
LPS anti—IL—10 po dobu 0,5, 1,3,6,12 h, smíchaná (M204), imortalizované endotheliální buňky získané z mozkových mikrovaskulámích endothelií, stimulované přes noc TNFa (E201), makrofágy získané z kostní dřeně pomocí GM-CSF stimulované LPS, IFNy a anti-IL-10 po dobu 24 h, (M206). Ostatní vzorky nevykazovaly žádný signál. Exprese v RAW 264.7 myší monocytové linii naznačuje možnost přirozeného zdroje proteinu,
Příklad 4 Chromozómové mapování IL-B30
Byly použity izolované cDNA kódující IL-B30. Chromozómové mapování je standartní tech45 nika. Viz BIOS Laboratories (New Haven, CT) a techniky používající hybridizačního panelu myších somatických buněk pomocí PCR. Nepřímé důkazy ukazují, že myší IL-B30 gen leží na chromozómu 10.
so Příklad 5 Přečištění proteinu IL-B30
Řada transfekovaných buněčných linií byla testována aby bylo zjištěno která linie má nejvyšší expresi. Přirozené IL-B30 může být izolováno z přirozených zdrojů, nebo exprimované v transformovaných buňkách pomocí patřičného vektoru. Přečištění exprimovaného proteinu probíhá podle standartních technik, nebo může být kombinováno s technickými postupy tak aby byla
CZ JUU95B Βϋ zvýšena efektivita purifikace z buněčného lyzátu nebo supematantu. Pro tyto purifikační účely může být použit segment FLAG nebo His6. Další možností je použití afinitní chromatografie za použití specifických protilátek, viz dále.
Protein je produkován v bakteriálním, hmyzím nebo savčím expresním systému, jak je třeba.
Příklad 6 Izolace homologního IL-B30 genu ío IL-B30 cDNA, nebo odpovídající sekvence z jiných druhů, může být použita jako hybridizační próba pro testování knihovny z požadovaného zdroje, např. knihovny cDNA z primátů. Řada různých druhů může být testována jak na podmínky nezbytné pro snadnou hybridizaci a na přítomnost pomocí próby. Vhodné hybridizační podmínky budou použity pro selekci klonů vykazujících specifickou křížovou hybridizaci.
Testování pomocí hybridízace za použití degenerovaných prób založených na sekvenci peptidů umožní také izolaci patřičných klonů. Použití vhodných primerů pro PCR dá vzniknout celé řadě vhodných nukleových kyselin a klonů.
Podobné techniky jsou použitelné pro izolaci buď druhových, polymorfních nebo alelických variant. Druhové varianty jsou izolované za použití mezidruhové křížově specifické hybridízace, založené na izolací plné délky genu nebo jeho fragmentu z jednoho druhu a použitého jako próby.
Protilátky proti lidskému IL-B30 mohou být použity pro testování buněčných linií exprimujících křížově reaktivní proteiny z příslušných, např. cDNA knihoven. Přečištěný protein nebo definované peptidy mohou být použity pro přípravu protilátek standartní technikou, jak byla popsána výše. Syntetické peptidy nebo přečištěné proteiny jsou přítomné v lidském imunitním systému pro přípravu monoklonálních nebo polyklonálních protilátek. Viz Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley / Greene a Harlow and Lané (1998) Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press. Vzniklé protilátky mohou být použity pro testování, pročišťování nebo diagnostiku, jak bylo popsáno.
Příklad 7 Příprava protilátek specifických proti IL-B30
Syntetické peptidy nebo přečištěné proteiny jsou předkládány imunitnímu systému tak, aby vznikly monoklonální nebo polyklonální protilátky. Viz Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley / Greene a Harlow and Lané (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Může tak být připraveno polyklonální sérum nebo hybridomy. V některých případech je vazebná složka také naznačena, jak bylo uvedeno výše, např. fluorescenční značkou, nebo je imobilizována na substrátu pro techniku panningu. Imunoselekce a podobné techniky jsou dostupné pro přípravu selektivních reagens jak je třeba.
Příklad 8 Stanovování šíře biologických funkcí
Biologické aktivity IL-B30 byty testovány v souvislosti se strukturní a sekvenční homologii mezi IL-B30 a IL-6 a G-CSF. Zpočátku byly použity techniky testující biologické aktivity IL-6 nebo G-CSF.
A. Vliv na proliferaci buněk
Vliv na proliferační aktivitu různých buněčných typů byl testován v závislosti na koncentraci cytokinů. Byla provedena analýza dávkové reakce v porovnání s ostatními cytokiny IL-6 a G-CSF atd.
-29CZ 300958 B6
B. Vliv na expresi povrchových molekul na lidských monocytech
Monocyty byly přečištěny negativní selekcí z mononukleámích buněk periferní krve normálních zdravých dárců. Přibližně 3x108 mononukleámích buněk oddělených na ficollu a inkubovaných na ledu s koktejlem monoklonálních protilátek (Becton Dickinson, Mountain
View, CA) obsahujícím 200 μΙ anti-CD2 (Leu-5a), 200 μΐ anti-CD3 (Leu~4), 100 μ 1 anti— CD8 (Leu 2a), 100 μΐ anti-CD19 (Leu-12), 100 μΙ anti-CD20 (Leu-16), 100 μΐ anti-CD56 (Leu-19), 100μΙ antM3D67 (IOM 67, Immunotech, Westbrook, ME) a protilátka proti glykophorinu (10F7MN, ATCC, Rockville MD). Buňky s navázanými protilátkami byly io promyty a poté inkubovány s ovčí anti-myší IgG s konjugovanými magnetickými kuličkami (Dynal, Oslo, Norway) v poměru 20:1. Buňky s navázanými protilátkami jsou poté separovány od monocytů použitím magnetického pole. Získané lidské monocyty jsou inkubovány v Ysselově médiu (Gemini Bíoproducts, Caiabasas, CA) obsahujícím 1 % lidského AB séra v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1L-B30, ÍL-6 a G-CSF nebo jejich kombinací.
Analýza exprese povrchových molekul může být provedena přímou imunofluorescencí. Např. 2x103 přečištěných lidských monocytů je inkubováno na ledu v PBS obsahujícím 1 % lidské sérum po dobu 20 minut. Buňky jsou centrifugovány při 200 g. Poté jsou resuspendovány s 20 ml monoklonálních protilátek naznačených PE nebo FITC. Následuje dalších 20 minut inkubace na ledu, buňky jsou poté promyty v PBS s 1% lidským sérem a dvakrát v čistém PBS. Poté jsou buňky fixovány v PBS obsahujícím 1% paraformaldehyd a analyzovány průtokovou cytometrií (FACScan) (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Příkladem použitých protilátek může být např. CDIlb (anti-macl), CDlIc (a gpl50/95), CD14 (Leu-M3), CD54 (Leu 54), CD80 (anti-BB 1/B7), HLA-DR (L243) od Becton Dickinson a
CD86 (FUNÍ, Pharmingen), CD64 (32,2 Medarex) CD40 (mAb89, Schoering-Plough
France).
C. Efekt IL-B30 na produkci cytokinů lidskými monocyty
Lidské monocyty byly izolovány jak bylo popsáno a kultivovány v Ysselově médiu (Gemini
Bíoproducts, Caiabasas, CA) obsahujícím 1 % lidského AB séra, v absenci nebo v přítomnosti IL-B30 (1/100 ředěný expresní vzorek baculoviru). Navíc byly monocyty stimulovány LPS (E. Coli 0127:B8 Difco) v absenci nebo v přítomnosti IL-B30, a koncentrace cytokinů (IL-Ιβ, IL—6, GM-CSF a IL·—10) bylo v buněčném supematantu stanoveno ELISA technikou.
Pro cytoplasmatické značení cytokinů, byly monocyty (1 milion/ml) kultivovány v Ysselově médiu) v absenci nebo v přítomnosti IL-B30 a LPS (E. Coli 0127:B8 Difco) a 10 mg/ml Brefeldinu A (Epicentre Technologies Madison WI) po dobu 12 hodin. Buňky byly promyty v PBS a inkubovány ve 2% roztoku paraformaldehydu v PBS po dobu 20 minut a při poko40 jové teplotě. Poté byly buňky promyty v permeabilizačním pufru (0,5 % saponinu (Sigma) v
PBS/BSA (0,5 %) a Azid (1 mM)) a inkubovány PBS po dobu 20 minut a při pokojové teplotě. Buňky (2x105) byly centrifugovány a resuspendovány ve 20 ml konjugátů anti— cytokin protilátek naředěných 1 : v permeabilizační pufru PBS po dobu 20 minut a při pokojové teplotě. Byly použity tyto protilátky: IL-Ια-ΡΕ (364-3B3-14), IL-6-PE (MQ2-13A5), TNFa-PE (Mabll), GM-CSF-PE (BVD2-21C11) a IL-12-PE (Cl 1.5.14,
Pharmingen San Diego, CA). Buňky jsou poté dvakrát promyty v permeabilizačním pufru a jednou v PBS/BSA/Azidu a analyzovány průtokovou cytometrií (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
D. Vliv IL-B30 na proliferaci lidských mononukleárů z periferní krve (PBMC)
Celkové PBMC byly izolovány z normálních zdravých dárců centrifugací na ficoll-hypaque jak popisuje (Boyum et al.). Buňky byly poté kultivovány v 200 μΙ Ysselova média (Gemini Bíoproducts, Caiabasas, CA) obsahující 1 % lidského AB séra v 96 jamkových destičkách
CZ 3WI95» Bb (Falcon, Becton Dickinson, NJ) v absenci nebo v přítomnosti IL-B30. Buňky byly kultivovány v čistém médiu nebo v médiu obsahujícím 100 U/ml IL—2 (R&D Systems) po dobu 12 hodin. Během posledních 6 hodin byl přidán 3H-Thymidin a míra jeho inkorporace byla stanovena pomocí počítání v kapalném scintilátoru.
Nativní, rekombinantní a fuzní proteiny byly testovány pro svou agonistickou nebo antagonistickou aktivitu v řadě dalších biologických systémů, např. na T-buňkách, B-buňkách, makrofázích, dendritických buňkách, hematopoietických progenitorech atd. Díky strukturní podobnosti s IL-6 a G-CSF je vhodné používat podobné nebo odvozené techniky.
1L-B30 byl testován na svou agonistickou nebo antagonistickou aktivitu na transfekovaných buňkách exprimujících IL—6 a G-CSF receptory. Viz Ho et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 11267-11271, Ho et al., (1995) Mol. Cell. Biol. 15:5043-5053 a Liu et al., (1994) J. Immunol. 152:1821-1829.
IL-B30 bylo testováno na svůj efekt na aktivaci a zpracování antigenu v makrofázích a dendritických buňkách, produkci cytokinů a proliferativní reakci na antigen nebo allogenní stimul u T-buněk. Viz např. de Waal Malefyt et al., (1991) J. Exp. Med. 174:1209-1220, de Waal Maleťyt et al., (1991) J. Exp. Med. 174:915-924, Fiorentino et al., (1991) J. Immunol.
147:3815-3822, Fiorentino et al., (1991) J. Immunol. 146:3444-3451 a Groux et al., (1996)
J. Exp. Med. 184:19-29.
Byl testován i vliv IL-B30 na stimulaci NK buněk. Tyto techniky mohou být založeny na např. Hsu et al., (1992) Internát. Immunol. 4:563-569 a Schwarz et al., (1994) J. Immunother.
1 6:95-104.
Růst a diferenciace B-buněk byla testována např. technikami popsanými v Defrance et al., (1992) J. Exp. Med. 175:671-682, Rousset et al., (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:1890-1893, včetně analýzy přeskupujícího faktoru IgG2 a IgA2. Je třeba uvést, že narozdíl od COS7 super30 natantů, NIH3T3 a COP supematanty zřetelně neinterferovaly s reakcemi B-buněk.
Příklad 9 Příprava a analýza geneticky pozměněných zvířat
Transgenní myši mohou být připraveny standartními postupy. Tato zvířata jsou použitelná pro stanovení efektu delece genu v konkrétní tkání nebo kompletně v celém organismu. To může odkrýt zajímavý pohled na vývoj zvířete nebo některého konkrétního orgánu v různých stádiích. Navíc bude zřetelný vliv na řadu stresujících faktorů imunitního systému. Viz Hogan et al., (1995) Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratoiy Manual (2 vydání) Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
Byla připravena transgenní zvířata, která přežila porod, špatné však prospívala a během několika týdnů umírala. Konstrukt byl založen na aktinovém promotoru s CMV enhancerem, který zajistí Širokou a vysokou expresi. Myši, stejně jako IL—6 transgeny, byly zakrslé. Navíc na nich byl patrný otok břicha, zánět žaludku a střev, infiltrace buněk do jater a smrt nastávala obvykle do 50 dní. Tyto myši nemohly otěhotnět. Druhá třída transgenních myší vykazovala nižší fenotyp a mohly se množit.
Byla stanovena genová struktura myšího IL-B30. Byla vyvinuta strategie pro produkci knockoutovaných myší a začala práce na přípravě konstruktu.
Všechny reference zde uvedené jsou připojeny jako citace, stejnou měrou jako každá uvedená patentová přihláška.
-31 CZ 300958 B6
Řada modifikaci a variant navrhovaného vynálezu může být uskutečněna bez překročení rámce a myšlenky navrhovaného vynálezu, jak je patrné všem odborníkům v oboru. Konkrétní varianty, zde popsané, jsou uvedeny pouze z ilustračních důvodů a nemohou být brány jako limitace myšlenky navrhovaného vynálezu, který je limitován pouze celou šíří patentových nároků.
Seznam sekvencí
SEQ.ID.NO: 1 je přirozená sekvence nukleové kyseliny kódující IL-B30 u primátů io SEQ.ID.NO:2 je přirozená sekvence aminokyselin v IL-B30 u primátů
SEQ.ID.NO',3 je přirozená sekvence nukleové kyseliny kódující IL-B30 u hlodavců SEQ.ID.NO:4 je přirozená sekvence aminokyselin v IL-B30 u hlodavců SEQ.ID.NO:5 je prasečí IL-B30
SEQ.ID.NO:6 je hovězí G-CSF
SEQ.ID.NO:7 je kočičí G-CSF SEQ.ID.NO:8 je lidské G-CSF SEQ.ID.NO:9 je myší G-CSF SEQ.ID.NO: 10 je vydří IL-6 SEQ.ID.NO: 11 je kočičí IL-6
SEQ.ID.NO: 12 je lidské IL-6
SEQ.ID.NO: 13 je ovčí IL-6 SEQ.ID.NO:14 je myší IL-6 SEQ.ID.NO: 15 je kuřecí MGF
SEQ.ID.NO: 16 je KSHV (herpes virus Kaposiho sarkomu) virový IL-6 (1) OBECNÉ INFORMACE (i) APLIKANT: Schering Corporation (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: IZOLOVANÝ NEBO REKOMBÍNANTNÍ POLYNUKLEO TID KÓDUJÍCÍ CYTOKIN IL-B30, ZPŮSOB JEHO PŘÍPRAVY A EXPRESE (iii) POČET SEKVENCÍ:16 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA:
(A) ADRESA: Schering Corporation (B) ULICE: 2000 Galloping Hill Road (C) STÁT: New Jersey (E) ZEMĚ: USA (F)ZIP:07033-0530 (v) POČÍTAČOVÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: floppy disk (B) POČÍTAČ: Power Macintosh 7600/120 (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: Windows (E) SOFTWARE: MS Woid
CZ JWW38 U6 (vi) APLIKAČNÍ DATA:
(A) ČÍSLO APLIKACE (B) DATUM PODÁNÍ: 24. červen 1998 (C) KLASIFIKACE (vii) PŘEDCHOZÍ APLIKAČNÍ DATA:
(A) ČÍSLO APLIKACE: US 08/900,905 (B) DATUM PODÁNÍ: 25-JUL-1997 (viii) INFORMACE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: Thampoe Immac J.
(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 36,322 (C) REFERENCE: DX0758K1 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON: (908) 298-5061 (B) TELEFAX: (908) 298-5388 (2) INFORMACE O SEQ.ID.NO: 1 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 570 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) RYSY (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) LOKALIZACE: L.567 (iii) RYSY (A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptide (B) LOKALIZACE: 64 ..567
-33CZ 300958 B6 (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:!
ATG Met _ Ί * W -x· CTG GGG AGC AGA GCT GTA ATG CTG CTG TTG CTG CTG CCC TGG ACA
Leu -20 Gly Ser Arg Ala Val -15 Met Leu Leu Leu Leu -10 Leu pro Trp Thr
GCT CAG GGC AGA GCT GTG CCT GGG GGC AGC AGC CCT GCC TGG ACT CAG
Ala -5 Gin Gly Arg Ala Val Pro 1 Gly Gly Ser Ser 5 Pro Ala Trp Thr Gin 10
TGC CAG CAG CTT TCA CAG AAG CTC TGC ACA CTG GCC TGG AGT GCA CAT
Cys Gin Gin Leu Ser 15 Gin Lys Leu Cys 20 Thr Leu Ala Trp Ser Ala His 25
CCA CTA GTG GGA CAC ATG GAT CTA AGA GAA GAG GGA GAT GAA GAG ACT
Pro Leu Val 30 Gly His Met Asp Leu 35 Arg Glu Glu Gly Asp 40 Glu Glu Thr
ACA AAT GAT GTT CCC CAT ATC CAG TGT GGA GAT GGC TGT GAC CCC CAA
Thr Asn 45 Asp Val Pro His Ile 53 Glr. Cys Gly Asp Gly 55 Cys Asp Pro Gin
GGA CTC AGG GAC AAC ACT CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CAC CAG GGT
Gly 60 Leu Arg Asp Asn Ser Gin 65 Pne cys Leu Gin 70 Arg Ile His Gin Gly 75
CTG ATT TTT TAT GAG AAG CTG CTA GGA TCG GAT ATT TTC ACA GGG GAG
Leu Ile Phe Tyr Glu 80 Lys Leu Leu Gly Ser Asp 85 Ile Phe Thr Gly Glu 90
CCT TCT CTG CTC CCT GAT AGC CCT GTG GCG CAG CTT CAT GCC TCC CTA
Pro Ser Leu Leu Pro 95 Asp Ser Pro Val 100 Ala Gin Leu His Ala Ser Leu 105
CTG GGC CTC AGC CAA CTC CTG CAG CCT GAG GGT CAC CAC TGG GAG ACT
Leu Cly Leu 110 Ser Gin Leu Leu Gin 115 Pro Glu Cly His His 120 Trp Glu Thr
CAG CAG ATT CCA AGC CTC AGT CCC AGC CAG CCA TGG CAG CGT CTC CTT
Gin Gin 125 Ile Pro Ser Leu Ser 130 Pro Ser Gin Pro Trp 135 Gin Arg Leu Leu
CTC CGC TTC AAA ATC CTT CGC AGC CTC CAG GCC TTT GTG GCT GTA GCC
Leu 140 Arg Phe Lys Ile Leu Arg 145 Ser Leu Gin Ala 150 Phe i Val . Ala Val Ala 155
GCC Ala CGG Arg GTC Val TTT GCC Phe Ala CAT GGA GCA His Gly Ala GCA Ala ACC CTG Thr Leu AGT Ser CCC Pro ‘ TAA •
160 165 (3) INFORMACE O SEQ.ID.NO:2 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 189 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina io (C) TOPOLOGIE: lineární
CZ .ÍUWOB BO (ii) TYP MOLEKULY-protein (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:2
Met Leu -21 -20 Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr
-15 -10
Ala Gin Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gin
-5 1 5 10
Cys Gin Gin Leu Ser Gin Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
15 20 25
Pro Leu Val Gly His Met ASP Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
30 35 40
Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gin Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro-Sin
45 50 55
Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gin Phe Cys Leu Gin Arg Ile His Gin Gly
60 65 70 75
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
80 85 90
Pro Sex Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gin Leu His Ala Ser Leu
95 100 105
Leu Gly Leu Ser Gin Leu Leu Gin Pro Giu Gly His His Trp Glu Thr
110 115 120
GJn Gin Tle Pro Ser Leu Sex Pro Ser Gin Pro Trp Gin Arg Leu Leu
125 130 135
Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gin Ala Phe Val Ala Val Ala
140 145 150 155
Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
160 165
(4) INFORMACE O SEQ.ID.NO:3 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 1203 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineami (ii) TYP MOLEKULY: cDNA 15 (iii) RYSY (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) LOKALIZACE: 113..700 (iii) RYSY t (A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptide (B) LOKALIZACE: 176 .,700
-35CZ 300958 B6 (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:3
CGCTTAGAAG TCGGACTACA GAGTTAGACT CAGAACCAAA GGAGGTGGAT AGGGGGTCCA
CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAA GCAGGGAACA AG ATG Met -21
CTG GAT TGC AGA GCA GTA ATA ATG CTA TGG CTG TTG CCC TGG GTC ACT
Leu -20 Asp Cys Arg Ala Val -15 Ile Met Leu Trp Leu -10 Leu Pro Trp Val Thr -5
CAG GGC CTG GCT GTG CCT AGG AGT AGC AGT CCT GAC TGG GCT CAG TGC
Gin Gly Leu Ala Val 1 Pro Arg Ser Ser S Ser Pro Asp Trp Ala 10 Gin Cys
CAG CAG CTC TCT CGG AAT CTC TGC ATG CTA GCC TGG AAC GCA CAT GCA
Gin Gin Leu 15 Ser Arg Asn Leu Cys 20 Met Leu Ala Trp Asn 25 Ala His Ala
CCA GCG GGA CAT ATG AAT CTA CTA AGA GAA GAA GAG GAT GAA GAG* ACT
Pro Ala 30 Gly His Met ASn Leu 35 Leu Arg Glu Glu Glu 40 Asp Glu Glu Thr
AAA AAT AAT GTG ccc CGT ATC CAG TGT GAA GAT GGT TGT GAC CCA CAA
Lys 45 Asn Asn Val Pro Arg 5C Ile Gin Cys Glu Asp 55 Gly Cys Asp Pro Gin 60
GGA CTC AAG GAC AAC AGC CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CGC CAA GGT
Gly Leu Lýs Asp Asn 65 ser Gin Phe Cys Leu 70 Gin Arg Ile Arg Gin 75 Gly
CTG GCT TTT TAT AAG CAC CTC CTT GAC TCT GAC ATC TTC AAA GGG GAG Leu Ale Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly Glu
B5 90
CCT GCT CTA CTC CCT GAT AGC CCC ATG GAG CAA CTT CAC ACC TCC CTA
Pro Ala Leu Leu pro Asp Ser Pro Met Glu Gin Leu His Thr Ser Leu
100 105
CTA GGA CTC AGC CAA CTC CTC CAC CCA GAG GAT CAC CCC CGG GAG ACC
Leu Gly Leu Ser Gin Leu Leu Glr. Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr
110 115 120
CAA CAG ATG CCC AGC CTG AGT TCT AGT CAG CAG TGG CAG CGC CCC CTT
Gin Gin Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gin Gin Trp Gin Arg Pro Leu *25 130 135 140
CTC CGT TCC AAG ATC CTT CGA AGC CTC CAG GCC TTT TTG GCC ATA GCT
Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gin Ala Phe Leu Ala Ile Ala
145 150 155
GCC CGG GTC TTT GCC CAC GGA GCA GCA ACT CTG ACT GAG CCC TTA GTG Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val
160 165 170
CCA ACA GCT TAAGGATGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA Pro Thr Ala
175
CZ 3U0958 Bb
ATCTATCAGC CCAGACATCT ACCAGTTAAT TAACCCATTA GGACTTGTGC TGTTCTTGTT
TCGTTTGTTT TOCGTGAAGG GCAAGGACAC CATTATTAAA GAGAAAAGAA ACAAACCCCA
GAGCAGGCAG CTGGCTAGAG AAAGGAGCTG GAGAAGAAGA ATAAAGTCTC GAGCCCTTGG
CCTTGGAAGC GGGCAAGCAG CTGCGTGGCC TGAGGGGAAG GGGGCGGTGG CATCGAGAAA
CTGTGAGAAA ACCCAGAGCA ŤCAGAAAAAG TGAGCCCAGG CTTTGGCCAT TATCTGTAAG
AAAAACAAGA AAAGGGGAAC ATTATACTTT CCTGGGTGGC TCAGGGAAAT GTGCAGATGC
ACAGTACTCC AGACAGCAGC TCTGTACCTG CCTGCTCTGT CCCTCAGTTC TAACAGAATC
TAGTCACTAA GAACTAACAG GACTACCAA7 ACGAACTGAC AAA (5) INFORMACE O SEQ.ID.N0:4 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 196 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE:lineámí ío (ii) TYP MOLEKULY.protein (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:4
Met -21 Leu -2C Asp Cys Arg Ala Val -15 11« Met Leu Trp Leu *10 Leu Pro Trp Val
Thr Gin Gly Leu Ais Val 1 Pro Arg Ser Ser 5 Ser Pro Asp Trp Ala 10 Gin
Cys Gin Gin Leu 15 Ser Arg Asn Leu Cys 20 Met Leu Ala Trp Asn 25 Ala His
Ala Pro Ala 30 Gly HIS Met Asn Leu 35 Leu Arg Glu Glu Glu 40 Asp Glu Glu
Thr Lys 45 Asn Asn Val Pro Arg 50 Ile Gin Cys Glu Asp 55 Gly cys Asp Pro
Gin 63 Gly Leu tys Asp Asn 65 Ser Gin Phe Cys Leu 70 Gin Arg Ile Arg Gin 75
Gly Leu Ala Phe Tyr 60 Lys His Leu Leu Asp 85 Ser ASp Ile Phe Lys 90 Gly
Glu Pro Ala Leu 95 Leu Pro Asp Ser Pro 100 Met Glu Gin Leu His 105 Thr Ser
Leu Leu Gly 110 Leu Ser Gin Leu Leu 115 Gin Pro Glu Asp His 120 Pro Arg Glu
Thr Gin 125 Gin Met Pro Ser Leu 130 Ser Ser Ser Gin Gin 135 Trp Gin Arg Pro
Leu 140 Leu Arg Ser Lys Zle 145 Leu Arg Ser Leu Gin 150 Ala Phe Leu Ala Ile 155
Ala Ala Are Val Phe 160 Ala Bia Gly Ale Ala 165 Thr Leu Thr Glu Pro 170 Leu
Val Pro Thr Ala 175
-37CZ 300958 B6 (6) INFORMACE O SEQ.ID.NO:5 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 102 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE:lineární (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:5
Ser 1 cys Leu Gin Arg 5 Ile His Gin Gly Leu 10 Val Phe Tyr Glu Lys 15 Leu
Leu Gly Ser Asp 20 Ile Phe Thr Gly Glu 25 Pro ser Leu His Pro 30 Asp Gly
Ser Val Gly Gin 35 Leu His Ala Ser 40 Leu Leu Gly Leu Arg 45 Gin Leu Leu
Gin Pro 50 Glu Gly His His Trp 55 Glu Thr Glu Gin Thr 60 Pro Ser Pro Ser
Pro 65 Ser Gin Pro Trp Gin 70 Arg Leu Leu Leu Arg 75 Leu Lys Ile Leu Arg 80
Ser Leu Gin Ala Phe es Val Ala Val Ala Al a 90 Arg Val Phe Ala His 95 Gly
Ala Ala Thr Leu Ser Gin 100 (7) INFORMACE O SEQTD.NO:6 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 174 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE:lineámí (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:6
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Ala ASP Gly Ala Glu Leu Gin
20 25 30
Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Met
35 40 45
IQ _ cz ouir^o do
Leu Leu 50 Arg His Ser Leu Gly 55 Ile Pro Gin Ala Pro 60 Leu Ser Ser Cys
Ser 65 Ser Gin Ser Leu Gin 70 Leu Arg Gly Cys Leu 75 Asn Gin Leu His Gly 80
Gly Leu Phe Leu Tyr 85 Gin Gly Leu Leu Gin 90 Ala Leu Ala Gly Ile 95 Ser
Pro Glu Leu Ala 100 Pro Thr Leu Asp Thr 105 Leu Gin Leu Asp Val 110 Thr Asp
Phe Ala Thr 115 Asn lle Trp Leu Gin 120 Met Glu Asp Leu Gly Ala 125 Ala Pro
Ala Val 130 Gin Pro Thr Gin Gly 135 Ala Met Pro Thr Phe 140 Thr Ser Ala Phe
Gin 145 Arg Arg Ala Gly Gly 150 Val Leu Val Ala Ser 155 Gin Leu His Arg Phe 160
Leu Glu Leu Ala Tyr 165 Arg Gly Leu Arg Tyr 170 Leu Ala Glu Pro
(8) INFORMACE O SEQ.UXNO:7 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 174 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIErlineámí io (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:7
Thr Pro Leu Gly Pro Thr ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys
1 S 10 15
Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys Val Gin Ala Asp Gly Thr Ala Leu Gin
20 25 30
Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ala Leu Gly lle Pro Gin Ala Pro Leu Ser Ser Cys
50 55 60
-39CZ 300958 B6
Ser 65 Ser Gin Ala Leu Gin Leu Thr Gly Cys Leu Arg Gin Leu His Ser 80
70 75
Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Ala Gly Zle Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Met Leu Gin Leu Asp Ile Thr Asp
100 105 110
Phe Ala Ile Asn Ile Trp Gin Gin Met Glu Asp Val Gly Met Ala Pro
115 120 125
Ala Val Pro Pro Thr Gin Gly Thr Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe
130 135 140
Gin Arg Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Ala Ser Asn Leu Gin Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Phe Thr Lys Pro
165 170
(9) INFORMACE O SEQ.ID.NO:8 s (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 177 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE:lineámí io (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:8
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Giu Gin Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin
2C 25 30
Glu Lys Leu Val ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu
50 55 60
Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin
€5 70 75 80
Leu His Ser Cly Leu Het Ale Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala 85 90 95
CZ 30U958 Bb
Met Pro Ala Phe 100 Ala Ser Ala Phe Gin 105 Arg Arg Ala Gly Gly 110 Val Leu
Val Ala Ser 115 His Leu Gin Ser Phe 120 Leu Glu Val Ser Tyr 125 Arg Val Leu
Arg His 130 Leu Ala Gin Phe Leu 135 Tyr Gin Gly Leu Leu 140 Gin Ala Leu Glu
Gly 145 Ile Ser Pro Glu Leu 150 Gly Pro Thr Leu ASp 155 Thr Leu Gin Leu ASp 160
Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly
165 170 175
Pro (10) INFORMACE O SEQ.ID,NO:9
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: (A) DÉLKA: 178 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIEJineámí
(ii) (ix) TYP MOLEKULY;peptid í POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:9
Val 1 Pro Leu Val Thr Val Ser Ala Leu Pro Pro Ser Leu Pro Leu Pro 5 10 15
Arg Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Ala 20 25 30
Ser Gly Ser Val Leu Leu Glu Gin Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys 35 40 45
His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Lys 50 55 60
Ala 65 Ser Leu Ser Gly Cys Ser Ser Gin Ala Leu Gin Gin Thr Gin Cys 70 75 80
Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Cys Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin 85 90 95
Ala Leu Ser Gly Ile Ser Pro Ala Leu Ala Pro Thr Leu Asp Leu Leu 100 105 110
Gin Leu Asp Val Ala Asn Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu 115 120 125
Asn Leu Gly Val Ala Pro Thr Val Gin Pro Thr Gin Ser Ala Met Pro 130 135 140
Ala 145 Phe Thr Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala Ile 150 155 160
Ser Tyr Leu Gin Gly Phe Leu Glu Thr Ala Arg Leu Ala Leu His His 165 170 175
Leu Ala
-41 CZ 300958 Bó (11) INFORMACE O SEQJD.NO: 10 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 186 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGlEJineámí (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQJD.NOHO
Ala Phe Pro Thr Pro Cly Pro Leu Cly Gly Asp Ser Lys Asp Asp Ala
1 5 10 15
Thr Ser Asn Arg Pro Pro Leu Thr Ser Ala Asp Lys Met Glu Asp Phe
20 25 30
Ile Lys Phe Ile Leu Gly Lys Ile Ser Ala Leu Arg Asn Glu Met Cys
35 40 45
Asp Lys Tyr Asn Lys Cys Glu Asp Ser Lys Glu Val Leu Ala Glu Asn
50 55 60
Asn Leu Asn Leu Pro Lys Leu Ala Glu Lys Asp Arg Cys Phe Gin Ser
65 70 75 80
Arg Phe Asn Gin Glu Thr Cys Leu Thr Arg Ile Thr Thr Gly Leu Gin
85 90 95
Glu Phe Gin He His Leu Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Tyr Glu Gly Asn
100 105 110
Lys Asp Asn Ala His Ser Val Tyr Ile Ser Thr Lys His Leu Leu Gin
115 120 125
Thr Leu Arg Pro Kec Asn Gin Ile Glu Val Thr Thr Pro Asp Pro Thr
130 135 140
Thr Asp Ala Ser Leu Gin Ala Leu Phe Lys Ser Gin Asp Lys Trp Leu
145 150 155 160
Lys His Thr Thr Ile His Leu Iie Leu Arg Arg Leu Glu Asp Phe Leu
165 170 175
Gin Phe Ser Leu Arg Ala Ile Arg Ile Met
1B0 185
(12) INFORMACE O SEQJD.NO: 11 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 183 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGlEJineámí (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO: 11
Ala 1 Phe Pro Thr Pro Gly Fro Leu Gly Gly Asp Ala Thr Ser Asn Arg
5 10 15
Leu Pro Leu Thr 20 Pro Ala Asp Lys Met Glu Glu 25 Leu Ile Lys Tyr Ile 30
Leu Gly Lys 11« 35 Ser Ala Leu Lys Lys Glu Met 40 Cys Asp Asn Tyr Asn 45
Lys Cys Glu Asp 50 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu 55 Asn Asn Leu Asn Leu 60
Pro 65 Lys Leu Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin 70 75 Ser Gly Phe Asn Gin 80
Glu Thr Cys Leu Thr 65 Arg Ile Thr Thr Gly Leu 90 Gin Glu Phe Gin Ile 95
Tyr Leu Lys Phe Leu Gin Asp Lys Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Asn Ala 100 105 110
Lys Ser Val 115 Tyr Thr Ser Thr Asn 120 Val Leu Leu Gin Met 125 Leu Lys Arg
Lys Gly 130 Lys Asn Gin Asp Glu 135 Val Thr Ile Pro Val 140 Pro Thr Val Glu
Val 145 Gly Leu Gin Leu Ser 150 cys Ser His Arg Arg 155 Val Ala Glu Ala His 160
Asn Asn His Leu Thr 165 Leu Arg Arg Leu Glu Asp 170 Phe Leu Gin Leu 175 Arg
Leu Arg Ala Val 180 Arg Ile Met
(13) INFORMACE O SEQ.ID.NO:12 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: (A) DÉLKA: 188 aminokyselin ίο (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO: 12
CZ 300958 Bó
Ala Phe pro Ala Pro val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala
1 5 10 15
Ala Pro His Arg Gin Pro 20 Leu Thr Ser Ser Glu 25 Arg Ile Asp Lys Gin 30
Ile Arg Tyr Ile Leu Asp 35 Gly Ile Ser Ala Leu 40 Arg Lys Glu Thr Cys 45
Asn Lys Ser Asn Met Cys 50 Glu Ser Ser Lys Glu 55 Ala Leu Ala Glu Asn 60
Asn 65 Leu Asn Leu Pro Lys 70 Het Ala Glu Lys Asp 75 Gly Cys Phe Gin Ser 80
Gly Phe Asn Glu Glu Thr 85 Cys Leu Val Lys Xle 90 11· Thr Gly Leu Leu 95
Glu Phe Glu Val Tyr Leu 100 Glu Tyr Leu Gin Asn 105 Arg Phe Glu Ser Ser 110
Glu Glu Gin Ala Arg Ala 115 Val Gin Hec Ser Thr 120 Lys Val Leu Ile Gin 125
Phe Leu Gin Lys Lys Ala 130 Lys Asn Leu Asp Ala 135 Zle Thr Thr Pro Asp 140
Pro 145 Thr Thr Asn Ala Ser 150 Leu Leu Thr Lys Leu 155 Gin Ala Gin Asn Gin 160
Trp Leu Gin Asp Hec Thr Thr His Leu Ile Leu 165 170 Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gin 180 185 (14) INFORMACE 0 SEQ.ID.NO: 13 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: (A) DÉLKA: 184 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIEdineámí Arg ser Phe Lys Glu 175 Met
(ii) TYP MOLEKULY .-peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO: 13
Ala Phe Pro Thr Pro Gly Pro Leu Gly Glu Asp Phe Lys Asn Asp Thr
1 5 10 15
Thr Pro Ser Arg Leu Leu Leu Thr Thr Pro Glu Lys Thr Glu Ala Leu
20 25 30
Zle Lys Bis lle Val Asp Lys He Ser Ala lle Arg Lys Glu Xle cys
35 40 45
Glu tys Asn Asp Glu Cys Glu Asn Ser Lys Glu Thr Leu Ala Glu Asn
50 55 60
Lys Leu Lys Leu Pru Lys Met Glu Glu Lys Asp Gly cys Phe Gin Ser
es 70 75 80
Gly Phe Asn Gin Ala lle Cys Leu lle Lys Thr Thr Ala Gly Leu Leu
es 90 95
Glu Tyr Gin Zle Tyr Leu Asp Phe Leu Gin Asn Glu Phe Glu Gly Asn
100 105 110
Gin Glu Thr Val Met Glu Leu Gin Ser Ser Xle Arg Thr Leu Xle Gin
115 120 125
lle Leu Lys Glu Lys Zle Ala Gly Leu Xle Thr Thr Pro Ala Thr His
130 135 140
Thr Asp Met Leu Glu Lys Met Gin Ser Ser Asn Glu Trp Val Lys Asn
145 150 155 160
Ala Lys Val 11« lle lle Leu Arg Ser Leu Glu Asn Phe Leu Gin Phe
165 170 175
Ser Leu Arg Al* Xle Arg Met Lys
180 (15) INFORMACE O SEQ.ID.NO: 14 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 188 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE:lineámí (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO: 14
-45 CZ 300958 B6
Ala Phe Pro Thr Ser Gin Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr
1 5 10 15
Thr Pro Asn Arg Pro Val Tyr Thr Thr Ser Gin Val Gly Gly Leu Ile
20 25 30
Thr His Val Leu Trp Glu Ile Val Glu Het Arg Lys Glu Leu Cys Asn
35 40 45
Gly Asn Ser Asp Cys Het Asn Asn Asp Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn
50 55 60
Leu Lys Leu Pro Glu Ile Gin Arg Asn Asp Gly Cys Tyr Gin Thr Gly
65 70 75 80
tyf Asn Gin GlU II· Cys Leu Leu Lys Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu
8$ 90 95
Tyr His Ser Tyr Leu Glu Tyr Met Lys Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys
100 105 110
Lys Asp Lys Ala Arg Val Leu Gin Arg Asp Thr Glu Thr Leu Ile His
11S 120 125
Ile Phe Asn Gin Glu Val Lys Asp Leu His Lys Ile Val Leu Pro Thr
130 135 140
Pro Ile Ser Asn Ala Leu Leu Thr Asp Lys Leu Glu Ser Gin Lys Glu
145 150 155 160
Trp Leu Arg Thr Lys Thr Ile Gin Phe Ile Leu Lys ser Leu Glu Glu
165 170 175
Phe Leu Lys Val Thr Leu Arg Ser Thr Arg Gin Thr
180 185 (16) INFORMACE O SEQ.ID.NO:15 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 178 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO:15 s
CZ JUU75S B6
Ala 1 Pro Leu Ala Glu 5 Leu Ser Gly Asp His Asp Phe Gin Leu Phe Leu
10 15
His Lys Asn Leu 20 Glu Phe Thr Arg Lys 25 Ile Arg Gly Asp Val Ala Ala 30
Leu Gin Arg 35 Ala Val Cys Asp Thr 40 Phe Gin Leu Cys Thr Glu Glu Glu 45
Leu Gin Leu 50 Val Gin Pro Asp 55 Pro His Leu Val Gin Ala Pro Leu Asp 60
Gin 65 Cys His Lys Arg Gly 70 Phe Gin Ala Glu Val Cys Phe Thr Gin Ile 75 80
Arg Ala Gly Leu His 85 Ala Tyr His Asp Ser 90 Leu Gly Ala Val Leu Arg 95
Leu Leu Pro Asn 100 His Thr Thr Leu Val 105 Glu Thr Leu Gin Leu Asp Ala 110
Ala Asn Leu 115 Ser Ser Asn Ile Gin 120 Gin Gin Met Glu Asp Leu Gly Leu 125
Asp Thr Val 130 Thr Leu Pro Ala 135 Glu Gin Arg Ser Pro pro Pro Thr Phe 140
Ser 145 Gly Pro Phe Gin Gin 150 Gin Val Gly Gly Phe Phe Ile Leu Ala Asn 155 160
Phe Gin Arg Phe Leu Glu Thr Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Leu Ala
165 170 175
Arg L«u (6) INFORMACE O SEQ.ID.NO: 16 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 185 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIEJineámí (ii) TYP MOLEKULY:peptid (ix) POPIS SEKVENCE: SEQ.ID.NO: 16
-47Cl 300958 B6
Thr Arg Gly Ly» Leu Pro Asp Ala Pro Glu Phe Glu Lys Asp Leu Leu
1 5 10 15
XI· Gin Arg Lgu Asn Trp Mat Leu Trp Val Ile Asp Glu Cya Phe Arg
20 25 30
Asp L«U Cys Tyr Arg Thr Gly Ile Cys Lys Gly Ile Leu Glu Pro Ala
35 40 45
Ala Ile Phe His Leu Lys Leu Pro Ala Ile Asn Asp Thr Asp His Cys
50 55 60
Gly Leu Tle Gly Phe Asn Glu Thr Ser Cys Leu Lys Lys Leu Ala Asp
65 70 75 80
Gly Phe Phe Glu Phe Glu Vel Leu Phe Lys Phe Leu- Thr Thr Glu Phe
85 90 95
Oly Lys Ser Val Ile Asn Val ASp Val Met Glu Leu Leu Thr Lys Thr
100 105 110
Leu Gly Trp Asp Ile Gin Glu Glu Leu Asn Lys Leu Thr Lys Thr His
115 120 125
Tyr Ser Pro Pro Lys Phe Asp Arg Gly Leu Leu Gly Arg Leu Gin Gly
130 135 140
Leu Lys Tyr Trp Val Arg His Phe Ala Ser Phe Tyr Val Leu Ser Ala
145 150 155 160
Met Glu Lys Phe Ala Gly Gin Ala Val Arg Val Leu Asp Ser Ile Pro
165 170 175
Asp Val Thr Pro Asp Val His Asp Lys
180 185

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaný nebo rekombinantní poiynukleotid kódující polypeptid vybraný ze skupiny sestálo vající ze SEQJD.NO:2, 4 a 5,
  2. 2. Izolovaný nebo rekombinantní poiynukleotid kódující maturovaný polypeptid ze SEQ.ID.NO:2 nebo 4.
    15
  3. 3, Poiynukleotid podle nároku 1, obsahující kódující oblasti SEQ.ED.NO:1 nebo 3.
  4. 4. Poiynukleotid podle nároku 2 obsahující nukleotidy 64 až 567 ze SEQ.ID.NO:! nebo nukleotidy 176 až 700 ze SEQ.ID.NO:3.
    20
  5. 5. Expresní vektor obsahující poiynukleotid podle nároku 2.
  6. 6. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 5.
    4 0
    CZ 3UU958 B6
  7. 7. Hostitelská buňka podle nároku 6, kterou je eukaryotická buňka.
  8. 8. Způsob přípravy polypeptidu majícího SEQ.ID.NO:2 nebo 4, vyznačující se tím, 5 že se exprimuje rekombinantní polynukleotid podle nároku 2.
  9. 9. Protilátka nebo její fragment vázající antigen, která se specificky váže k polypeptidu s aminokyselinovou sekvencí SEQ.ED.NO:2,4 nebo 5.
    ío
  10. 10. Protilátka nebo její fragment vázající antigen podle nároku 9, kde protilátka nebo její fragment vázající antigen je monoklonální protilátka, Fab nebo F(ab)2.
  11. 11. Protilátka nebo její fragment vázající antigen podle nároku 9, která je detekovatelně značená.
  12. 12. Způsob detekce přítomnosti antigenu, kterým je maturovaný polypeptid ze SEQ.ID.NO:2 nebo 4, v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že se kontaktuje protilátka nebo její fragment vázající antigen podle nároku 9 s biologickým vzorkem obsahujícím uvedený antigen za vzniku komplexu protilátka: antigen, nebo komplexu fragment protilátky vázající antigen:
    20 antigen.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že tento biologický vzorek pochází z člověka.
    25
  14. 14. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID.NO: 2, 4 nebo 5.
  15. 15. Polypeptid podle nároku 14, který je detekovatelně značen.
  16. 16. Izolovaný polypeptid obsahující maturovaný polypeptid ze SEQ.1D.NO:2 nebo 4.
  17. 17. Protilátka nebo její fragment vázající antigen, která se specificky váže k aminokyselinové sekvenci maturovaného polypeptidu ze SEQ.ID.NO:2 nebo 4.
    Konec dokumentu
CZ20000263A 1997-07-25 1998-07-24 Izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující antigenní polypeptid, expresní vektor, hostitelská bunka, protilátka a zpusob prípravy polypeptidu CZ300958B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90090597A 1997-07-25 1997-07-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2000263A3 CZ2000263A3 (cs) 2000-06-14
CZ300958B6 true CZ300958B6 (cs) 2009-09-23

Family

ID=25413278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20000263A CZ300958B6 (cs) 1997-07-25 1998-07-24 Izolovaný nebo rekombinantní polynukleotid kódující antigenní polypeptid, expresní vektor, hostitelská bunka, protilátka a zpusob prípravy polypeptidu

Country Status (29)

Country Link
EP (3) EP2233574A1 (cs)
JP (5) JP4316133B2 (cs)
KR (1) KR100666835B1 (cs)
CN (2) CN101851286A (cs)
AR (2) AR017510A1 (cs)
AT (1) ATE443142T1 (cs)
AU (1) AU741046B2 (cs)
BR (1) BR9811039A (cs)
CA (1) CA2296272C (cs)
CO (1) CO4810232A1 (cs)
CZ (1) CZ300958B6 (cs)
DE (1) DE69841161D1 (cs)
DK (2) DK1002084T3 (cs)
ES (2) ES2331762T3 (cs)
HK (1) HK1024932A1 (cs)
HU (1) HU230629B1 (cs)
ID (1) ID28114A (cs)
IL (3) IL134068A0 (cs)
LT (1) LT2100959T (cs)
MY (1) MY157028A (cs)
NO (1) NO329329B1 (cs)
NZ (1) NZ502391A (cs)
PE (1) PE20000183A1 (cs)
PL (1) PL197150B1 (cs)
PT (2) PT2100959T (cs)
SK (1) SK287198B6 (cs)
TW (1) TWI237057B (cs)
WO (1) WO1999005280A1 (cs)
ZA (1) ZA986596B (cs)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6060284A (en) 1997-07-25 2000-05-09 Schering Corporation DNA encoding interleukin-B30
US6610515B1 (en) * 1997-10-23 2003-08-26 Nippon Institute For Biological Science Feline granulocyte colony-stimulating factor
AU2661199A (en) * 1998-02-06 1999-08-23 Schering Corporation Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
WO1999054357A1 (fr) * 1998-04-14 1999-10-28 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Nouvelle proteine du type cytokine
US7090847B1 (en) 1999-09-09 2006-08-15 Schering Corporation Mammalian cytokines; related reagents and methods
AU2005202420B2 (en) * 1999-09-09 2008-08-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Mammalian cytokines; related reagents and methods
HU230679B1 (en) * 1999-09-09 2017-08-28 Merck Sharp & Dohme Mammalian interleukin-12 p40 and interleukin b30, combinations thereof, antibodies, uses in pharmaceutical compositions
EP3184637A1 (en) 1999-09-09 2017-06-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Mammalian interleukin-12 p40 and interleukin b30 complexes, antibodies, uses in pharmaceutical compositions
KR101053412B1 (ko) 2002-10-30 2011-08-01 제넨테크, 인크. Ｉｌ―１７ 생성의 억제
CN101052726A (zh) 2003-05-09 2007-10-10 森托科尔公司 IL－23p40特异性免疫球蛋白衍生蛋白、组合物、方法和用途
WO2005108425A1 (en) * 2004-05-10 2005-11-17 Cytos Biotechnology Ag Il-23 p19 antigen array and uses thereof
AR051444A1 (es) 2004-09-24 2007-01-17 Centocor Inc Proteinas derivadas de inmunoglobulina especifica de il-23p40, composiciones, epitopos, metodos y usos
WO2007005955A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Centocor, Inc. Anti-il-23 antibodies, compositions, methods and uses
EA035459B1 (ru) 2005-12-29 2020-06-19 Сентокор, Инк. Антитело против il-23p19
US7910703B2 (en) 2006-03-10 2011-03-22 Zymogenetics, Inc. Antagonists to IL-17A, IL-17F, and IL-23P19 and methods of use
EP2044118A2 (en) 2006-06-13 2009-04-08 Zymogenetics, Inc. Il-17 and il-23 antagonists and methods of using the same
TWI426918B (zh) 2007-02-12 2014-02-21 Merck Sharp & Dohme Ｉｌ-２３拮抗劑於治療感染之用途
US20110189203A1 (en) 2007-11-27 2011-08-04 Ablynx N.V. Immunoglobulin constructs
NZ623706A (en) 2008-05-05 2015-12-24 Novimmune Sa Anti-il-17a/il-17f cross-reactive antibodies and methods of use thereof
MX348013B (es) 2009-05-05 2017-05-23 Novimmune Sa Anticuerpos anti il-17f y metodos de uso de los mismos.
JO3244B1 (ar) 2009-10-26 2018-03-08 Amgen Inc بروتينات ربط مستضادات il – 23 البشرية
BR112013011065B1 (pt) 2010-11-04 2022-03-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticorpo anti-il-23p19 humanizado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, seu uso e composição farmacêutica
CA2871985C (en) 2012-05-03 2023-10-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-il-23p19 antibodies
NZ712294A (en) 2013-03-15 2020-04-24 Amgen Inc Methods for treating crohn’s disease using an anti-il23 antibody
WO2014149425A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Methods for treating psoriasis using an anti-il-23 antibody
WO2016014775A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases
MY192824A (en) 2014-09-03 2022-09-12 Boehringer Ingelheim Int Compound targeting il-23a and tnf-alpha and uses thereof
WO2017049035A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Amgen Inc. Prediction of clinical response to il23-antagonists using il23 pathway biomarkers
AU2016379157A1 (en) 2015-12-22 2018-06-21 Amgen Inc. CCL20 as a predictor of clinical response to IL23-antagonists
US20210277105A1 (en) 2018-07-13 2021-09-09 Astrazeneca Collaboration Ventures, Llc Treating ulcerative colitis with brazikumab
AU2019383017A1 (en) 2018-11-20 2021-06-03 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating psoriasis with anti-IL-23 specific antibody
BR112021023295A2 (pt) 2019-05-23 2022-02-08 Janssen Biotech Inc Método de tratamento de doença inflamatória intestinal com uma terapia de combinação de anticorpos para il-23 e tnf-alfa
JP2023509373A (ja) 2019-12-20 2023-03-08 ノヴァロック バイオセラピューティクス， リミテッド 抗インターロイキン－２３ ｐ１９抗体およびそれの使用方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3645090A (en) 1969-06-19 1972-02-29 Citizen Watch Co Ltd Day-date quick-adjuster for calender timepiece
US3940475A (en) 1970-06-11 1976-02-24 Biological Developments, Inc. Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
EP0088994B1 (en) 1982-03-15 1991-06-19 Schering Corporation Hybrid dna, binding composition prepared thereby and processes therefor
US4659678A (en) 1982-09-29 1987-04-21 Serono Diagnostics Limited Immunoassay of antigens
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4859609A (en) 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
WO1999054357A1 (fr) * 1998-04-14 1999-10-28 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Nouvelle proteine du type cytokine

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hillier a kol. (1997) databaze EMBL zaznam id. c. HS1214377 *
Ito a kol. (1997) databaze EMBL zaznam id. c. SSAB4061 *
Oppmann a kol. (2000) Immunity 13, 715-725 *
Takeda a kol. (1996) databaze EMBL zaznam id. c. HSC3686 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1271387A (zh) 2000-10-25
ES2331762T3 (es) 2010-01-14
PE20000183A1 (es) 2000-03-11
HK1024932A1 (en) 2000-10-27
NO20000343D0 (no) 2000-01-24
ES2610483T3 (es) 2017-04-27
JP2015037405A (ja) 2015-02-26
KR100666835B1 (ko) 2007-01-11
NZ502391A (en) 2002-12-20
EP2100959A2 (en) 2009-09-16
EP1002084B1 (en) 2009-09-16
EP2233574A1 (en) 2010-09-29
IL134068A0 (en) 2001-04-30
KR20010022214A (ko) 2001-03-15
PT1002084E (pt) 2009-12-16
DK2100959T3 (en) 2017-01-30
WO1999005280A1 (en) 1999-02-04
LT2100959T (lt) 2017-01-10
PT2100959T (pt) 2017-01-09
PL197150B1 (pl) 2008-03-31
NO20000343L (no) 2000-03-24
CA2296272C (en) 2012-03-13
NO329329B1 (no) 2010-09-27
HU230629B1 (hu) 2017-04-28
JP2010011863A (ja) 2010-01-21
DE69841161D1 (de) 2009-10-29
JP4316133B2 (ja) 2009-08-19
AR086483A2 (es) 2013-12-18
CO4810232A1 (es) 1999-06-30
SK912000A3 (en) 2000-09-12
AR017510A1 (es) 2001-09-12
IL205765A0 (en) 2011-07-31
EP2100959A3 (en) 2009-10-14
TWI237057B (en) 2005-08-01
ID28114A (id) 2001-05-03
HUP0004019A3 (en) 2003-08-28
ZA986596B (en) 1999-02-08
CA2296272A1 (en) 1999-02-04
DK1002084T3 (da) 2010-01-04
BR9811039A (pt) 2000-08-08
IL205765A (en) 2015-07-30
HUP0004019A2 (en) 2001-03-28
JP2013034480A (ja) 2013-02-21
AU741046B2 (en) 2001-11-22
CZ2000263A3 (cs) 2000-06-14
MY157028A (en) 2016-04-15
SK287198B6 (sk) 2010-03-08
EP1002084A1 (en) 2000-05-24
ATE443142T1 (de) 2009-10-15
EP2100959B1 (en) 2016-12-07
AU8589498A (en) 1999-02-16
JP2001511347A (ja) 2001-08-14
PL338262A1 (en) 2000-10-09
IL134068A (en) 2010-11-30
JP2005323610A (ja) 2005-11-24
CN101851286A (zh) 2010-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8765914B2 (en) Interleukin-B30 proteins
AU741046B2 (en) Mammalian cytokine: interleukin-B30 and related reagents
CA2343979C (en) Human interleukin-b50, therapeutic uses
EP1159299B1 (en) Mammalian cytokines; related reagents and methods
US6800460B1 (en) Mammalian cytokine complexes
CA2379963C (en) Mammalian cytokines; related reagents
AU773669B2 (en) Mammalian cytokine: interleukin-B30 and related reagents
MXPA01009178A (en) Mammalian cytokines;related reagents and methods
MXPA00000928A (en) Mammalian cytokine:interleukin-b30 and related reagents

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20180724