PL197150B1

PL197150B1 - Izolowany i rekombinowany polinukleotyd, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu antygenowego, sposób wykrywania polinukleotydu, zestawy do wykrywania polinukleotydu, związek wiążący i sposób jego zastosowania, zasadniczo czysty albo izolowany polipeptyd antygenowy, sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo komórek hodowli tkankowej, rekombinowane przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen oraz sterylna kompozycja

Info

Publication number: PL197150B1
Application number: PL338262A
Authority: PL
Inventors: J.Fernando Bazan
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-24
Publication date: 2008-03-31
Also published as: IL134068A0; IL205765A0; JP2010011863A; PL338262A1; ES2610483T3; JP2001511347A; CA2296272C; CO4810232A1; AR017510A1; NO20000343L; IL134068A; CN1271387A; ES2331762T3; NO329329B1; EP2100959B1; ATE443142T1; HUP0004019A3; JP4316133B2; AU8589498A; WO1999005280A1

Abstract

1. Izolowany i rekombinowany polinukleotyd koduj acy antygenowy polipeptyd obejmuj acy: a) przynajmniej 17 s asiaduj acych aminokwasów dojrza lej cz esci kodowanej o Id. Sekw. nr 2; b) przynajmniej 17 s asiaduj acych aminokwasów dojrza lej cz esci kodowanej o Id. Sekw. nr 4; albo c) przynajmniej 17 s asiaduj acych aminokwasów dojrza lej cz esci kodowanej o Id. Sekw. nr 5. 8. Sposób wykrywania polinukleotydu okre slonego w zastrz. 1, znamienny tym, ze obejmuje kontaktowanie polinukleotydu z sond a, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z przynajmniej 25 s asiaduj acymi nukleotydami: a) cz esci koduj acej z Id. Sekw. nr 1; albo b) cz esci koduj acej z Id. Sekw. nr 3; z wytworzeniem dupleksu, przy czym wykrycie dupleksu wskazuje na obecno sc polinukleotydu. 13. Sposób zastosowania zwi azku wiazacego okre slonego w zastrz. 11, znamienny tym, ze obejmuje kontaktowanie zwi azku wiaz acego z próbk a biologiczn a zawieraj ac a antygen, przy czym kontaktowanie powoduje wytworzenie kompleksu zwi azku wiaz acego i antygenu. PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197150 B1 (21) Numer zgłoszenia: 338262 ⁽¹³⁾ (22) Data zgłoszenia: 24.07.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

24.07.1998, PCT/US98/15423 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

04.02.1999, WO99/05280 PCT Gazette nr 05/99 (51) Int.Cl.

C12N 15/24 (2006.01) C07K 14/54 (2006.01) C07K 16/24 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)

Izolowany i rekombinowany polinukleotyd, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu antygenowego, sposób wykrywania polinukleotydu, zestawy do wykrywania polinukleotydu, związek wiążący i sposób jego zastosowania, zasadniczo czysty albo izolowany polipeptyd antygenowy, sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo komórek hodowli tkankowej, rekombinowane przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen oraz sterylna kompozycja

(30) Pierwszeństwo: 25.07.1997,US,08/900,905	(73) Uprawniony z patentu: SCHERING CORPORATION,Kenilworth,US
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 09.10.2000 BUP 21/00	(72) Twórca(y) wynalazku: J.Fernando Bazan,Menlo Park,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.03.2008 WUP 03/08	(74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o.

(57) 1. izolowany i rekombinowany polinukleotyd kodujący antygenowy polipeptyd obejmujący:

a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 2;

b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 4; albo

c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 5.

8. Sposób wykrywania polinukleotydu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie polinukleotydu z sondą, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z przynajmniej 25 sąsiadującymi nukleotydami:

a) części kodującej z Id. Sekw. nr 1; albo

b) części kodującej z Id. Sekw. nr 3;

z wytworzeniem dupleksu, przy czym wykrycie dupleksu wskazuje na obecność polinukleotydu. 13. Sposób zastosowania związku wiążącego określonego w zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie związku wiążącego z próbką biologiczną zawierającą antygen, przy czym kontaktowanie powoduje wytworzenie kompleksu związku wiążącego i antygenu.

PL 197 150 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany i rekombinowany polinukleotyd, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu antygenowego, sposób wykrywania polinukleotydu, zestawy do wykrywania polinukleotydu, związek wiążący i sposób jego zastosowania, zasadniczo czysty albo izolowany polipeptyd antygenowy, sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo komórek hodowli tkankowej, rekombinowane przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen oraz sterylna kompozycja.

Wynalazek dotyczy w ogólności rozwiązań związanych z białkami, które działają kontrolując biologię i fizjologię komórek ssaków, np. komórek układu odpornościowego ssaków. W szczególności niniejszym ujawnione zostały geny, białka, przeciwciała i pokrewne antygeny przydatnych, np. w regulowaniu aktywacji, rozwoju, różnicowania i działania różnych rodzajów komórek, w tym komórek krwiotwórczych.

Technologia rekombinowanego DNA dotyczy zasadniczo techniki integracji informacji genetycznej ze źródła donorowego do wektorów, w celu dalszego przetwarzania, na przykład przez wprowadzanie do organizmu gospodarza, przy czym przenoszona informacja genetyczna jest kopiowana i/lub wyrażana w nowym środowisku. Zwykle, informacja genetyczna występuje w postaci komplementarnego DNA (cDNA) pochodzącego z matrycowego RNA (mRNA) kodującego pożądany produkt białkowy. Nośnikiem często jest plazmid o zdolności włączania cDNA do dalszej replikacji w organizmie gospodarza, zaś w niektórych przypadkach, zasadniczo do kontrolowania ekspresji cDNA i kierowania syntezą kodowanego produktu w organizmie gospodarza.

Od pewnego czasu wiadomo, że reakcja odpornościowa ssaków oparta jest na szeregu złożonych oddziaływań komórkowych, określanych jako „sieć odpornościowa”. Ostatnie badania dostarczyły nowych informacji dotyczących wewnętrznego działania tej sieci. O ile pozostaje oczywiste, że większość tej reakcji toczy się wokół oddziaływań limfocytów, makrofagów, granulocytów i innych komórek, immunolodzy współcześnie twierdzą, że białka rozpuszczalne, znane jako limfokiny, cytokiny albo monokiny, odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu tych oddziaływań komórkowych. Tak więc, istnieje istotne zainteresowanie izolacją, charakteryzacją i mechanizmami działania czynników modulujących komórki, których poznanie powinno doprowadzić do znacznego postępu w diagnostyce i terapii licznych zaburzeń, np. chorób układu odpornościowego. Niektóre z tych czynników są krwiotwórczymi czynnikami wzrostowymi, np. czynnik pobudzający kolonie granulocytów (G-CSF). Patrz, Thompson (1994; red.) The Cytokine Handbook (wyd. 2) Academic Press, San Diego; Metcalf i Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, Cambridge University Press; i Aggarwal i Gutterman (1991) Human cytokines; Blackwell Publ.

Limfokiny pośredniczą w aktywności komórek w różny sposób. Wykazano, że podtrzymują proliferację, wzrost i różnicowanie pluripotencjalnych krwiotwórczych komórek macierzystych w kierunku wielu linii progenitorowych obejmujących różnorodne linie komórkowe, tworzących złożony układ odpornościowy. Właściwe i zrównoważone oddziaływanie pomiędzy składnikami komórkowymi są konieczne do prawidłowej reakcji odpornościowej. Różne linie komórkowe często reagują w różny sposób gdy limfokiny podawane są w połączeniu z innymi czynnikami.

Linie komórkowe szczególnie istotne dla odpowiedzi odpornościowej obejmują dwie klasy limfocytów: limfocyty B, które wytwarzają i wydzielają immunoglobuliny (białka posiadające zdolność rozpoznawania i wiązania ciał obcych w celu ich usunięcia) oraz limfocyty T różnych podtypów, które wydzielają limfokiny i indukują albo hamują limfocyty B i inne komórki (w tym inne limfocyty T) tworzące sieć odpornościową. Limfocyty te oddziałują z wieloma innymi rodzajami komórek.

Inną istotną linią komórek są komórki tuczne (których nie zidentyfikowano u wszystkich gatunków ssaków), które są komórkami tkanki łącznej, zawierającymi ziarnistości, umiejscowionymi proksymalnie do naczyń włosowatych w organizmie człowieka. Stwierdzono, że komórki te występują ze szczególną gęstością w płucach, skórze i przewodzie pokarmowym oraz moczowo-płciowym. Komórki tuczne odgrywają kluczową w zaburzeniach o typie alergicznym, szczególnie w anafilaksji w następujący sposób: gdy wybrane antygeny usieciują jedną z klas immunoglobulin związanych z receptorami na powierzchni komórek tucznych, komórka tuczna ulega degranulacji i uwalnia mediatory, np. histaminę, serotoninę, heparynę i prostaglandyny, które wywołują reakcję alergiczną, np. anafilaksję.

Badania nad lepszym zrozumieniem i leczeniem różnych zaburzeń immunologicznych są hamowane przez generalną niemożliwość utrzymania komórek układu odpornościowego in vitro. ImmuPL 197 150 B1 nolodzy ujawnili, że hodowanie tych komórek można uzyskać przez zastosowanie nadsączy limfocytów T i innych komórek, które zawierają różne czynniki wzrostowe, w tym wiele limfokin.

Z powyższego wynika, że ujawnienie i opracowanie nowych limfokin np. pokrewnych z G-CSF i/lub IL-6 może przyczynić się do powstania nowych terapii wielu stanów degeneracyjnych albo nieprawidłowych, które bezpośrednio albo pośrednio dotyczą układu odpornościowego i/lub komórek krwiotwórczych. W szczególności, ujawnienie i opracowanie limfokin, które zwiększają albo nasilają korzystną aktywność znanych limfokin, powinno być szczególnie korzystne. Niniejszym opisane zostały nowe kompozycje interleukin i substancji pokrewnych oraz sposoby ich zastosowania.

Wynalazek dotyczy interleukiny-B30 (IL-B30) ssaków, np. gryzoni, psów, kotów, naczelnych i jej aktywności biologicznej. Niniejszym ujawnione zostały kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy i sposoby ich wytwarzania i zastosowania. Opisane poniżej kwasy nukleinowe są scharakteryzowane częściowo przez homologię z załączonymi tu klonowanymi sekwencjami komplementarnego DNA (cDNA) i/lub testy funkcjonalne aktywności wobec czynnika wzrostowego albo cytokiny, np. G-CSF (patrz, Nogata (1994), Thompson (red.) The Cytokine Handbook, wyd. 2, Academic Press, San Diego) i/lub IL-6 (patrz Hirano (1994), tamże), które są zastosowane wobec polipeptydów kodowanych zazwyczaj przez te kwasy nukleinowe. Ujawnione zostały również sposoby modulowania albo włączania się w zależną od czynników wzrostowych kontrolę fizjologii albo reakcji odpornościowej.

Wynalazek jest oparty, częściowo, na ujawnieniu nowej sekwencji cytokiny wykazującej istotne podobieństwo sekwencji i budowy z G-CSF i IL-6. W szczególności, przedstawiony został gen naczelnych, np. człowieka, kodujący białko, którego wielkość postaci dojrzałej wynosi około 168 aminokwasów, oraz sekwencje świni i gryzoni, np. myszy. Funkcjonalne odpowiedniki wykazujące istotną homologię sekwencji dostępne są z innych gatunków ssaków, np. bydła, koni i szczurów, oraz gatunków innych niż ssaki.

Opisano niniejszym zasadniczo czyste albo rekombinowane białko IL-B30 wykazujące przynajmniej około 85% identyczności sekwencji na długości przynajmniej 12 aminokwasów o Id. Sekw. nr 2; naturalną sekwencję IL-B30 o Id. Sekw. nr 2; oraz białko fuzyjne obejmujące sekwencję IL-B30. Homologia opisanego tu białka może wynosić przynajmniej około 90% identyczności na odcinku o długości przynajmniej około 9 aminokwasów; przynajmniej około 80% identyczności na odcinku o długości przynajmniej około 17 aminokwasów; przynajmniej około 70% identyczności na odcinku o długości przynajmniej około 25 aminokwasów.

IL-B30 obejmuje dojrzałą sekwencję przedstawioną w Tabeli 1 albo może wykazywać wzorzec modyfikacji potranslacyjnej różny od naturalnej IL-B30. Opisane tu białko albo peptyd pochodzi od zwierzęcia stałocieplnego, wybranego z grupy obejmującej ssaki, w tym naczelne; obejmuje przynajmniej jeden segment polipeptydowy o Id. Sekw. nr 2; wykazuje wiele części wykazujących wyżej wskazany procent identyczności do wyżej wskazanej sekwencji; jest naturalną odmianą alleliczną IL-B30; ma długość przynajmniej około 30 aminokwasów; wykazuje przynajmniej dwa nienakładające się epitopy, które są swoiste dla IL-B30 ssaków; wykazuje identyczność sekwencji wynoszącą przynajmniej około 90% na długości przynajmniej około 20 aminokwasów z IL-B30 ssaków; jest glikozylowane; ma ciężar cząsteczkowy wynoszący przynajmniej 10 kDa z naturalną glikozylacją; jest polipeptydem syntetycznym; jest przyłączone do podłoża stałego; jest sprzęgnięte z inną cząsteczką chemiczną; jest podstawione w 5 albo w mniejszej liczbie miejsc; albo jest odmianą delecyjną albo insercyjną sekwencji naturalnej.

Opisano niniejszym kompozycję obejmującą: sterylne białko albo peptyd IL-B30; albo białko albo peptyd IL-B30 i nośnik, przy czym nośnikiem jest woda lub roztwór wodny obejmujący roztwór soli i/lub bufor; kompozycja jest sformułowana do podawania doustnego, doodbytniczego, donosowego, miejscowego albo pozajelitowego. Opisane tu białko fuzyjne może wykazywać: sekwencję dojrzałego białka przedstawioną w Tabeli 1; znacznik umożliwiający wykrywanie albo oczyszczanie, w tym FLAG, His6 albo segment Ig; i/lub sekwencję innej cytokiny albo chemokiny.

Opisano niniejszym również zestawy obejmujące białko albo polipeptyd IL-B30, przy czym obejmują one przedział z białkiem albo polipeptydem; i/lub instrukcję stosowania albo wykorzystania reagentów w zestawie.

Opisany tu związek wiążący może mieć miejsce wiązania z przeciwciała, które swoiście wiąże się z naturalnym białkiem IL-B30, przy czym IL-B30 jest białkiem ssaka; związek wiążący jest fragmentem Fv, Fab albo Fab2; związek wiążący jest sprzęgnięty z inną resztą chemiczną; a przeciwciało: jest wytworzone przeciwko sekwencji peptydowej dojrzałego polipeptydu przedstawionej w Tabeli 1; jest wytworzone przeciwko dojrzałej IL-B30; jest wytworzone przeciwko oczyszczonej IL-B30 gryzoni;

PL 197 150 B1 jest selekcjonowane immunologicznie; jest przeciwciałem poliklonalnym; wiąże się z denaturowaną IL-B30; wykazuje Kd o wartości przynajmniej 30 μΜ; jest połączone z substratem stałym, w tym perełką albo membraną z tworzywa sztucznego; jest w sterylnej kompozycji; albo jest znakowane w wykrywalny sposób, w tym znacznikiem radioaktywnym albo fluorescencyjnym. Zestawy zawierające związki wiążące obejmują przedział zawierający związek wiążący; i/lub instrukcję stosowania albo wykorzystania reagentów w zestawie. Często zestawem można przeprowadzić analizę jakościową albo ilościową. Kompozycje będą obejmowały: sterylny związek wiążący; albo związek wiążący i nośnik, przy czym nośnikiem jest woda lub roztwór wodny obejmujący roztwór soli i/lub bufor, kompozycja jest sformułowana do podawania doustnego, doodbytniczego, donosowego, miejscowego albo pozajelitowego.

Opisane poniżej kwasy nukleinowe obejmują izolowany albo rekombinowany kwas nukleinowy kodujący białko IL-B30 albo peptyd albo białko fuzyjne, przy czym: białko IL-B30 pochodzi od ssaka; i/lub kwas nukleinowy: koduje sekwencję peptydu antygenowego przedstawioną w Tabeli 1; koduje wiele sekwencji peptydu antygenowego przedstawionych w Tabeli 1; wykazuje przynajmniej około 80% identyczność z naturalnym cDNA kodującym segment; jest wektorem ekspresyjnym; dalej obejmuje początek replikacji; pochodzi ze źródła naturalnego; obejmuje wykrywalny znacznik; obejmuje syntetyczną sekwencję nukleotydową; jest mniejszy niż 6 kb; korzystnie mniejszy niż 3 kb; pochodzi od ssaka, w tym od naczelnego; obejmuje naturalną sekwencję kodującą pełnej długości; jest sondą hybrydyzacyjną dla genu kodującego IL-B30; albo jest starterem PCR, produktem PCR albo starterem mutagennym. Możliwe jest również otrzymanie komórki, tkanki albo narządu obejmującego taki kwas nukleinowy; korzystnie komórka jest: komórką prokariotyczną; komórką eukariotyczną; komórką bakteryjną; komórką drożdżową; komórką owada; komórką ssaka; komórką myszy; komórką naczelnego albo komórką ludzką.

Opisano niniejszym również zestawy, które zawierają taki kwas nukleinowy, przy czym obejmują one przedział zawierający kwas nukleinowy; przedział ponadto zawierający białko IL-B30 albo polipeptyd; i/lub instrukcje zastosowania albo wykorzystania reagentów w zestawie. Zwykle, zestaw umożliwia przeprowadzenie analizy jakościowej albo ilościowej.

Kwas nukleinowy: hybrydyzuje w warunkach płukania 30°C i mniej niż 2 M sól, albo 45°C i/lub 500 mM sól, albo 55°C i/lub 150 mM sól z Id. Sekw. nr 1; albo wykazuje przynajmniej około 85% identyczności i/lub ciąg wynosi przynajmniej około 30 nukleotydów albo wykazuje przynajmniej około 90% identyczność i/lub ciąg wynosi przynajmniej około 55 nukleotydów; albo wykazuje przynajmniej 95% i/lub ciąg wynosi przynajmniej 75 nukleotydów z IL-B30 naczelnych.

Przedstawiony został również sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo hodowli tkankowej obejmujący kontaktowanie komórki z agonistą albo antagonistą IL-B30 ssaka. Sposób może polegać na: kontaktowaniu w kombinacji z agonistą albo antagonistą G-CSF i/lub IL-6; albo kontaktowaniu z antagonistą, w tym kompozycją wiążącą obejmującą miejsce wiążące przeciwciała, które swoiście wiąże się z IL-B30.

W szczególności przedmiotem wynalazku jest izolowany i rekombinowany polinukleotyd kodujący antygenowy polipeptyd obejmujący:

Korzystnie polinukleotyd według wynalazku koduje dojrzały polipeptyd o:

a) Id. Sekw. nr 2; albo

b) Id. Sekw. nr 4.

Również korzystnie polinukleotyd według wynalazku hybrydyzuje w 55°C, mniej niż 500 mM soli i 50% formamidzie z:

a) częścią kodującą o Id. Sekw. nr 1; albo

b) częścią kodującą o Id. Sekw. nr 3.

Korzystniej polinukleotyd według wynalazku obejmuje:

a) przynajmniej 35 sąsiadujących nukleotydów części kodującej o Id. Sekw. nr 1; albo

b) przynajmniej 35 sąsiadujących nukleotydów części kodującej o Id. Sekw. nr 3.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny obejmujący polinukleotyd według wynalazku oraz komórka gospodarza zawierająca ten wektor ekspresyjny, w tym komórka eukariotyczna.

Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania polipeptydu antygenowego obejmującego ekspresję rekombinowanego polinukleotydu według wynalazku.

PL 197 150 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania polinukleotydu według wynalazku obejmujący kontaktowanie polinukleotydu z sondą, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z przynajmniej 25 sąsiadującymi nukleotydami:

a) części kodującej z Id. Sekw. nr 1; albo

b) części kodującej z Id. Sekw. nr 3;

z wytworzeniem dupleksu, przy czym wykrycie dupleksu wskazuje na obecność polinukleotydu.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw do wykrywania polinukleotydu według wynalazku obejmujący przedział zawierający sondę, która hybrydyzuje w ostrych warunkach tworząc dupleks z przynajmniej 17 sąsiadującymi nukleotydami polinukleotydu według wynalazku. Korzystnie, sonda jest znakowana w sposób wykrywalny.

Następnie przedmiotem wynalazku jest związek wiążący, który obejmuje miejsce wiążące przeciwciała, które swoiście wiąże się z:

a) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 2;

b) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 4; albo

c) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 5.

Korzystnie miejsce wiążące przeciwciała jest:

i) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. nr 2;

ii) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. nr 4;

iii) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. Nr 5;

iv) wywołane przeciwko oczyszczonemu albo wytworzonemu rekombinacyjne białku ludzkiej IL-B30;

v) wywołane przeciwko oczyszczonemu albo wytworzonemu rekombinacyjne białku mysiej IL-B30;

vi) w przeciwciele monoklonalnym, Fab albo F(ab)2; lub związek wiążący jest:

i) cząsteczką przeciwciała;

ii) poliklonalną surowicą odpornościową;

iii) znakowany w sposób wykrywalny;

iv) sterylny; lub

v) w kompozycji buforowanej.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób zastosowania związku wiążącego według wynalazku, który obejmuje kontaktowanie związku wiążącego z próbką biologiczną zawierającą antygen, przy czym kontaktowanie powoduje wytworzenie kompleksu związku wiążącego i antygenu. Korzystnie próbka biologiczna pochodzi od człowieka, a związek wiążący jest przeciwciałem.

Wynalazek dotyczy też zestawu do wykrywania, który obejmuje związek wiążący według, oraz:

a) materiały instruujące o stosowaniu związku wiążącego w celu wykrywania; lub

b) przedział zapewniający oddzielenie związku wiążącego.

Przedmiotem wynalazku jest także zasadniczo czysty albo izolowany polipeptyd antygenowy, który wiąże się z kompozycją wiążącą według wynalazku i ponadto obejmuje:

a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 2;

b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 4; albo

c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 5.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku

a) obejmuje przynajmniej fragment o co najmniej 25 sąsiadujących resztach aminokwasowych z białka IL-B30 naczelnych;

b) obejmuje przynajmniej fragment o co najmniej 25 sąsiadujących resztach aminokwasowych z białka IL-B30 gryzoni;

c) jest rozpuszczalnym polipeptydem;

d) jest znakowany w sposób wykrywalny;

e) jest w sterylnej kompozycji;

f) jest w buforowanej kompozycji;

g) wiąże się z receptorem powierzchniowym komórki;

h) jest wytworzony rekombinacyjnie; lub

i) ma sekwencję polipeptydu występującego naturalnie.

Korzystniej polipeptyd według wynalazku obejmuje:

a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 2;

b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 4; lub

c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 5.

PL 197 150 B1

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polipeptyd, obejmujący reszty 1-168 z Id. Sekw. nr 2 oraz izolowany polipeptyd obejmujący reszty 1-175 z Id. Sekw. nr 4.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo komórek hodowli tkankowej obejmujący kontaktowanie komórki z agonistą albo antagonistą IL-B30 ssaków.

Korzystnie w sposobie tym:

a) kontaktowanie przebiega w kombinacji z agonistą albo antagonistą G-CSF i/lub IL-6; albo

b) kontaktowanie następuje z antagonistą, w tym z kompozycją wiążącą obejmującą miejsce wiążące przeciwciała, które swoiście wiąże się z IL-B30.

Również korzystnie sposób według wynalazku obejmuje kontaktowanie komórki z antagonistą IL-B30 albo kontaktowanie komórki z agonistą IL-B30.

Wynalazek dotyczy również rekombinowanego przeciwciała albo jego fragmentu wiążącego antygen, które wiążą się z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2.

Korzystnie fragment wiążący antygen według wynalazku jest wybrany spośród fragmentu Fab i fragmentu Fab2.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto rekombinowane przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen wiążące się z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 4.

Ponadto wynalazek dotyczy sterylnej kompozycji obejmującej rekombinowane przeciwciało albo fragment wiążący antygen według wynalazku.

Szczegółowy opis korzystnych postaci wykonania

I. Ogólnie

Opisane zostały niniejszym sekwencje aminokwasowe i sekwencje DNA kodujące różne białka ssaków, które są cytokinami, np. które są cząsteczkami wydzielniczymi, które pośredniczą w przekazaniu sygnału pomiędzy komórkami odpornościowymi albo innymi komórkami. Patrz, Paul (1994) Fundamental Immunology (wyd. 3) Raven Press, NY. Cytokiny pełnej długości i fragmenty albo antagoniści przydatni są w fizjologicznym modulowaniu komórek wyrażających receptor. Możliwe jest, że IL-B30 wywiera efekt hamujący albo pobudzający na komórki krwiotwórcze, w tym, np. komórki limfoidalne, takie jak limfocyty T, limfocyty B, naturalne komórki niszczące (NK), makrofagi, komórki dendrytyczne, progenitorowe komórki krwiotworzenia itp. Białka będą również przydatne jako antygeny, np. immunogeny, do wywoływania przeciwciał przeciwko różnym epitopom na białku, zarówno epitopom liniowym jak i konformacyjnym.

cDNA kodujący IL-B30 zidentyfikowano w ludzkiej linii komórkowej. Cząsteczkę oznaczono huIL-B30. Zidentyfikowano również pokrewny gen kodujący sekwencję świńską. Opisano również sekwencję, np. mysią.

Ludzki gen koduje niewielką, rozpuszczalną cząsteczkę białka przypominającego cytokinę, wielkości około 168 aminokwasów. Sekwencja sygnałowa wynosi prawdopodobnie 21 reszt i zaczyna się od Met do około Ala. Patrz, Tabela 1 i Id. Sekw. nr 1 i 2. IL-B30 wykazuje motywy strukturalne charakterystyczne dla członków rodziny cytokin o długim łańcuchu. Patrz, np. IL-B30, G-CSF i IL-6, sekwencje dostępne z GenBank. Patrz, Tabela 2.

PL 197 150 Β1

Tabela 1:

Kwas nukleinowy (Id. Sekw. Nr 1) kodujący IL-B30 naczelnych, np. człowieka. Sekwencja aminokwasowa po translacji Id. Sekw. Nr 2.

ATG 48

CTG

GGG

AGC

AGA

GCT

GTA

ATG

CTG

TTG

CTG

CCC

TGG

ACA

Met -21

Leu -20

Gly

Ser

Arg

Ala

Val -15

Met

Leu

Leu -10

Leu

Pro

Trp

Thr

GCT 96

CAG

GGC

AGA

GCT

GTG

CCT

GGG

GGC

AGC

CCT

GCC

TGG

ACT

CAG

Ala -5

Gin

Gly

Arg

Ala

Val 1

Pro

Gly

Ser 5

Ser

Pro

Ala

Trp

Thr 10

Gin

TGC 144

CAG

CTT

TCA

CAG

AAG

CTC

TGC

ACA

CTG

GCC

TGG

AGT

GCA

CAT

Cys

Gin

Leu 15

Ser

Gin

Lys

Leu

Cys 20

Thr

Leu

Ala

Trp

Ser 25

Ala

His

CCA 192

CTA

GTG

GGA

CAC

ATG

GAT

CTA

AGA

GAA

GAG

GGA

GAT

GAA

GAG

ACT

Pro

Leu

Val 30

Gly

His

Met

Asp

li cju 35

Arg

Glu

Gly

Asp 40

Glu

Thr

ACA 240

AAT

GAT

GTT

CCC

CAT

ATC

CAG

TGT

GGA

GAT

GGC

TGT

GAC

CCC

CAA

Thr

Asn 45

Asp

Val

Pro

His

Ile 50

Gin

Cys

Gly

Asp

Gly 55

Cys

Asp

Pro

Gin

GGA 288

CTC

AGG

GAC

AAC

AGT

CAG

TTC

TGC

TTG

CAA

AGG

ATC

CAC

CAG

GGT

Giy 60

Leu

Arg

Asp

Asn

Ser 65

Gin

Phe

Cys

Leu

Gin 70

Arg

Ile

111»

Gin

Gly 75

CTG ATT 33 6

TTT TAT

GAG Glu 80

AAG CTG CTA GGA TCG GAT ATT TTC

ACA GGG

GAG Glu

Phe

Tyr

Thr

Gly 90

Leu

Ile

Lys

Leu

Gly

Ser Asp 85

Ile

Phe

CCT

TCT

CTG

CTC

CCT

GAT

AGC

CCT

GTG

GCG CAG

CTT

CAT

GCC

TCC

CTA

384

Pro

Ser

Leu

Pro

Asp

Ser

Pro

Val

Ala Gin

Leu

His

Ala

Ser

Leu

95

100

105

CTG

GGC

CTC

AGC

CAA

CTC

CTG

CAG

CCT

GAG GGT

CAC

TGG

GAG

ACT

432

Leu

Gly

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Pro

Glu Gly

His

Trp

Glu

Thr

110

115

120

CAG

ATT

CCA

AGC

CTC

AGT

CCC

AGC

CAG CCA

TGG

CAG

CGT

CTC

CTT

480

Gin

Ile

Pro

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Gin Pro

Trp

Gin

Arg

Leu

125

130

135

CTC

CGC

TTC

AAA

ATC

CTT

CGC

AGC

CTC

CAG GCC

TTT

GTG

GCT

GTA

GCC

528

Leu

Arg

Phe

Lys

Ue

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin Ala

Phe

Val

Ala

Val

Ala

140

145

150

155

GCC

CGG

GTC

TTT

GCC

CAT

GGA

GCA

ACC CTG

AGT

CCC

TAA

570

Ala

Arg

Val

Phe

Ala

His

Gly

Ala

Thr Leu

Ser

Pro

160

165

δ

PL 197 150 Β1 sekwencja kodująca:

ATGCTGGGGA

TCAGGGCAGA

AGCAGCTTTC

GTGGGACACA

TGTTCCCCAT

ACAACAGTCA

GAGAAGCTGC

TGATAGCCCT

TCCTGCAGCC

AGTCCCAGCC

CAGCCTCCAG

CAGCAACCCT

GCAGAGCTGT

GCTGTGCCTG

ACAGAAGCTC

TGGATCTAAG

ATCCAGTGTG

GTTCTGCTTG

TAGGATCGGA

GTGGCGCAGC

TGAGGGTCAC

AGCCATGGCA

GCCTTTGTGG

GAGTCCCTAA

AATGCTGCTG

GGGGCAGCAG

TGCACACTGG

AGAAGAGGGA

GAGATGGCTG

CAAAGGATCC

TATTTTCACA

TTCATGCCTC

CACTGGGAGA

GCGTCTCCTT

CTGTAGCCGC

TTGCTGCTGC

CCCTGCCTGG

CCTGGAGTGC

GATGAAGAGA

TGACCCCCAA

ACCAGGGTCT

GGGGAGCCTT

CCTACTGGGC

CTCAGCAGAT

CTCCGCTTCA

CCGGGTCTTT

CCTGGACAGC

ACTCAGTGCC

ACATCCACTA

CTACAAATGA

GGACTCAGGG

GATTTTTTAT

CTCTGCTCCC

CTCAGCCAAC

TCCAAGCCTC

AAATCCTTCG

GCCCATGGAG

IL-B30 gryzonia, np. myszy (Id. Sekw. nr 3 i 4):

CGCTTAGAAG TCGGACTACA GAGTTAGACT CAGAACCAAA GGAGGTGGAT AGGGGGTCCA

CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAA GCAGGGAAĆA AG ATG Met -21

115

CTG

GAT

TGC

AGA

GCA

GTA

ATA

ATG

CTA

TCG

CTG

TTG

CCC

TGG

GTC

ACT

163

Leu -20

Asp

Cys

Arg

Ala

Val -15

Ile

wet

Leu

Trp

Leu -10

Leu

Pro

Trp

Val

Thr -5

CAG

GGC

CTG

GCT

GTG

CCT

AGG

AGT

AGC

AGT

CCT

GAC

TGG

GCT

CAG

TGC

211

Gin

Gly

Leu

Ala

Val 1

Pro

Arg

Ser

Ser 5

Ser

Pro

Asp

Trp

Ala 10

Gin

Cys

CAG

CTC

TCT

CGG

AAT

CTC

TGC

ATG

CTA

GCC

TGG

AAC

GCA

CAT

GCA

259

Gin

Leu 15

Ser

Arg

Asn

Leu

Cys 20

Met

Leu

Ala

Trp

Asn 25

Ala

His

Ala

CCA

GCG

GGA

CAT

ATG

AAT

CTĄ

CTA

AGA

GAA

GAG

GAT

GAA

GAG

ACT

307

Pro

Ala 30

Gly

His

Met

Asn

Leu 35

Leu

Arg

Glu

Glu 40

Asp

Glu

Thr

AAA

AAT

GTG

ccc

CGT

ATC

CAG

TGT

GAA

GAT

GGT

TGT

GAC

CCA

CAA

355

Lys 45

Asn

Val

Pro

Arg 50

Ile

Gin

Cys

Glu

Asp 55

dy

cys

Asp

Pro

Gin 60

GGA

CTC

AAG

GAC

AAC

AGC

CAG

TTC

TGC

TTC

CAA

AGG

ATC

CGC

CAA

GGT

403

Gly

Leu

Lys

Aap

Asn 65

Ser

Gin

Phe

Cys

Leu 70

Gin

Arg

Ile

Arg

Gin 75

Gly

CTG

GCT

TTT

TAT

AAG

CAC

CTG

CTT

GAC

TCT

GAC

ATC

TTC

AAA

GGG

GAG

451

Leu

Ala

Phe

Tyr 80

Lys

His

Leu

Asp 85

Ser

Asp

Ile

Phe

Lys 90

Gly

Glu

CCT

GCT

CTA

CTC

CCT

GAT

AGC

CCC

ATG

GAG

CAA

CTT

CAC

ACC

TCC

CTA

499

Pro

Ala

Leu 95

Leu

Pro

Asp

Ser

Pro 100

Met

Glu

Gin

Leu

His 105

Thr

Ser

Leu

CTA

GGA

CTC

AGC

CAA

CTC

CAG

CCA

GAG

GAT

CAC

CCC

CGG

GAG

ACC

547

Leu

Gly 110

Leu

Eer

Gin

Leu

Leu 115

Gin

Pro

Glu

Asp

His 120

Pro

Arg

Glu

Thr

CAA

CAG

ATG

CCC

AGC

CTG

AGT

TCT

AGT

CAG

TGG

CAG

CGC

CCC

CTT

595

Gin 125

Gin

Met

Pro

Ser

Leu 130

Ser

Gin

Gin 135

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu 140

CTC

CGT

TCC

AAG

ATC

CTT

CGA

AGC

CTC

CAG

GCC

TTT

TTG

GCC

ATA

GCT

643

Leu

Arg

Ser

Lys

Ile 145

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin 150

Ala

Phe

Leu

Ala

Ile 155

Ala

GCC

CGG

GTC

TTT

GCC

CAC

GGA

GCA

ACT

CTG

ACT

GAG

CCC

TTA

GTG

691

Ala

Arg

Val

Phe

Ala

His

Gly

Ala

Thr

Leu

Thr

Glu

Pro

Leu

Val

160 165 170

CCA ACA GCT TAAGGATGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA 740

Pro Thr Ala

175

ATCTATCAGC	CCAGACATCT	ACCAGTTAAT	TAACCCATTA	GGACTTGTGC	TGTTCTTGTT	800
TCOTTTGTTT	TGCGTGAAGG	GCAAGGACAC	CATTATTAAA	GAGAAAAGAA	ACAAACCCCA	860
GAGCAGGCAG	CTGGCTAGAG	AAAGGAGCTG	GAGAAGAAGA	ATAAAGTCTC	GAGCCCTTGG	92 0
CCTTGGAAGC	GGGCAAGCAG	CTGCGTGGCC	TGAGGGGAAG	GGGGCGGTCG	CATCGAGAAA	9B0
CTCTGAGAAA	ACCCAGAGCA	TCAOAAAAAG	TGAGCCCAGG	CTTTGGCCAT	TATCTGTAAG	1040
AAAAACAAGA	AAAGGGGAAC	ATTATACTTT	CCTGGGTC-GC	TCAGGGAAAT	GTGCAGATGC	1100
ACAGTACTCC	AGACAGCAGC	TCTGTACCTG	CCTGCTCTGT	CCCTCAGTTC	TAACAGAATC	1160

TAGTCACTAA GAACTAACAG GACTACCAAT ACGAACTGAC AAA

1203

PL 197 150 B1

T a b e l a 2:

Porównanie różnych postaci wykonania IL-6 i G-CSF względem IL-B30. Ludzką IL-B30 jest Id. Sekw. nr 2; mysią IL-B30 jest Id. Sekw. nr 4; świńską IL-B30 jest Id. Sekw. nr 5; bydlęcym G-CSF jest Id. Sekw. nr 6; kocim G-CSF jest Id. Sekw. nr 7; ludzkim G-CSF jest Id. Sekw. nr 8; mysim G-CSF jest Id. Sekw. nr 9; IL-6 wydry jest Id. Sekw. nr 10; kocią IL-6 jest Id. Sekw. nr 11; ludzką IL-6 jest Id. Sekw. nr 12; IL-6 owcy jest Id. Sekw. nr 13; mysią IL-6 jest Id. Sekw. nr 14; kurzym MGF jest Id. Sekw. nr 15; i wirusową IL-6 KSHV, wirusa herpes mięsaka Kaposiego jest Id. Sekw. nr 16.

il30 ludzka			...VPGG
il30 mysia			...VPRS
il30 świńska
gcsf bydlęcy	......TPLG	P.	......AR
gcsf koci	......TPLGł	P.	......TS
gcsf ludzki	......TPIG	P.	......AS
gcsf mysi	VPLVTVSALP	P.	......SL
il6 wydry	.AFPTPGPLG	GDSKDDATSN
il6 kocia	.AFPTPGPLG	G.	...DATSN
il6 ludzka	.AFPAPVPPG	EDSKDVAAPH
il6 owcy	.AFPTPGPLG	EDFKNDTTPS
il6 mysia	.AFPTSQVRR	GDFTEDTTPN
mgf kurzy		.APLAELSGD
il6 khsv			.....TRG

SSPVWTQCQQ LSCKLCT.LA WSAHPLVG.. SSPDWAQCQQ LSRNLCM.LA WNAHAPAG..

SLPQSFLLKC LEQVRKIQAD GABLQERL., SLPQSFLLKC LEQVRKVQAD GTALQERL.. SŁPQSFLLKC LEQVRKIQGD GAALQEKLVS PLPRSFLLKS LEQVRKIQAS GSVLLEQL.. RPPLTSADKM EDFIKFILGK ISALENEM.. RLPLTPADKM EELIKYILGK ISALKKEM.. ROPLTSSERI DKQIRYILDG ISALRKET.. RLLLTTPEKT EALIKHIVDK ISAIRKEI.. R. PVYTTSQV GGLITHVLWE IVEMRKEL. . HDFQLFLHKN LEFTRKIRGD VAALQRAV.. KLPDAPEFEK DLLIQRLNWM LWIIDECFRD il3 0_ludzka il3 0_mysia il30_świńska gcsf.bydlęcy gcsf.koci gcsf.ludzki gcsf_mysi il6_wydry il6_kocia il6_ludzka il6_owcy il6_mysia mgf_kurzy i!6 khsv

HMD.LREEG

HMNLLREEE

DEETTNDVPH

DEETIONWPR

DPQGLRDNSQ

DPQGLKDNSQ .CAA.HKLCH .CAA.HKLCH ECAT.YKLCH .CAT.YKLCH .CDK.YNKCE .CDN.YNKCE .CNK.SNMCE .CEK.NDECE JCNG.USDCM .CDT.FQLCT LCYR.TGICK

PEELMLLRHS

PEELVLLGHA

PEELVLLGHS

DSKEVLAENN

DSKEALAEMN

SSKEALAENN

NSKETLAENK

NNDDALAENN

EEELQLVQPD

GILEPAAIFH

LGIP.QAPLS

LGIP.WAPLS

LGIP.KASLS

LNLPKLAEKD

LNLPKMABKD

LKLPKMEEKD

LKLPEIQRND

PHLV.QAPLD

LKLPAINDTD

SCSSQSLQLR

SCSSQALQLT

SCPSQALQLA

GCSSQALQQT

RCFQSRFNQE

GCFQSGFNQE

GCFQSGFNEE

GCFQSGFNQA

GCYQTGYNQE

QCHKRGFQAE

HCGLIGFNBT

FCLQRIHQGL

FCLQRIRQGL

SCLQRIHQGL

GCLNQLHGGL

GCLRQLHSGL

GCLSQLHSGL

QCLSQLHSGL

TCLTRITTGL

TCLVKIITGL

ICLIKTTAGL

ICLLKISSGL

VCFTQIRAGL

SCLKKLADGF il30_ludzka il30_mysia il30_świńska gcsf_bydlęcy gcsf_koci gcsf.ludzki gcsf_mysi il6_wydry il6_kocia il6_ludzka il6_owcy il6_mysia mgf_kurzy i!6 khsv

IFYEKLLGSD

AFYKHLLDSD

VFYEKLLGSD

FLYQGLLQAL

CLYQGLLQAL

QEFQIHLKYL

QEFQIYLKFL

LEFEVYLEYL

LEYQIYLDFL

LEYHSYLEYM

HAYHDSLGAV

FEFEYLFKFL

IFTGE______

IFKGE.....

IFTGE.....

AGIS......

EGIS......

SGIS......

ESNYEG...N ODKYEG...D QNRFES...S QNEFEG...N KNNLKDN..K LRLLP..... TTEFGKSVIN .PSLLPDSPV .PALLPDSPM .PSLHPDGSV .PELAPTLDT ,PELAPTLDM .pelgptldt .PALAPTLDL KDNAHSVYIS KENAKSVYTS EEQARAVQMS QETVMELQSS KDKARVLQRD ..NHTTLVET VDVMELLTKT

AQLHASLLGL

EQLHTSLLGL

GQLHASLLGL lqldvtdfat

LGLDITDFAI

LQLDVADFAT

LQLDVANFAT

TKHLLQTLRP

TNVLLQMLKR

TKVLIQFLQK

IRTLIQILKE

TETLIHIFNQ

LQLDAANLSS

LGWDIGEELN

SQLLQPE..G SQLLQPE..D RQLLQPE..G NIWLQMEDLG NIWQQMEDVG TIWQQMEELG TIWG2MENLG M. ,NQIEVTT KGKNQDEVTI KAKNLDAITT KIAGL....I EVKDLHKIVL NIQQQMEDLG KLTKTHY. . S

PL 197 150 B1

Tabela 2 cd.

il30_ludzka il30_mysia il30_świńska gcsf_bydlęcy gcsf_koci gcsf_ludzki gcsf_mysi il6_wydry il6_kocia il6_ludzka il__owcy il__r ysia mgf_kurzy il . khsv

HHWETQQIP. .SLSPSQ,.P WQRLLLRFKI LRSLQAFVAV AARVFAHGAA HPRETQQMP. .SLSSSQ..Q WQRPLLRSKI LRSLQAFLAI AARVFAHGAA HHWETEQTP. .SPSPSQ..P WQRLLLRLKI LRSLQAFVAV AARVFAHGAA AAPAVQPTQ. .GAMPTFTSA FQRRAGGVLV ASQLHRFLEL AYRGLRYLAE MAPAVPPTQ. „GTMPTFTSA FQRRAGGTLV ASNLQSFLEV AYRALEHFTK MAPALQPTQ. .GAMPAFASA FQRRA<GGVLV ASHLQSFLEV SYRVLRHLAQ VAPTVQPTQ. „SAMPAFTSA FQRRAGGVLA ISYLOGFLET ARLALHHLA. PDPTTDASL. ,QALFKSQDK WLKKTTIHLI LRRLEDFLQF SLRAIRIM.. PVPTVEVGL. .QLSCSHR.R VAEAHNNHLT LRRLEDFLGL RLRAVRIM.. PDPTTNASL. ,LTKLQAQNQ WLQDMTTRLI LRSFKEFLQS SLRALRQM.. TTPATHTDM. . LEKMQSSNE WVKNAKVIII LRSLENFLGF SLRAIRMK.. PTPISNALL. .TDKLESQKE WLRTKTIQFI LKSLEEFLKV TLRSTRQT.. LDTVTLPAEQ RSPPPTFSGP FQQQVGGFFI LANFQRFLET AYRALRHLAR P.PKFDRG.. LLGRLQGLKY WVRHFASFYV LSAMEKFAGG AVRVLDSIPD il30_ludzka il30_mysia H 30_świńska gcsf_bydlęcy gcsf_koci gcsf_ludzki gcsf_mysi il6_wydry il6_kocia ilG—uudzka il6_owcy il6_mysia mgf_kurzy il . . khsv

TLSP. ... TLTEPLVPTA

TLSQ. ...

P.......

P, ......

L. ..... . VTPDVHDK

Homologia strukturalna IL-B13 z pokrewnymi białkami cytokin sugeruje pokrewne funkcje tej cząsteczki. IL-B13 jest cytokiną o długim łańcuchu wykazująca podobieństwo sekwencji z IL-6 i G-CSF.

Agonista IL-B13, albo antagonista, może również działać jako antagonista funkcjonalny albo antagonista receptora, który np. blokuje wiązanie IL-6 albo G-SCF z ich receptorami albo pośredniczy w odwrotnym działaniu. Tak więc, IL-B13 albo jej antagoniści może być przydatna w leczeniu nieprawidłowych stanów, w tym zaburzeń odporności, np. niedoborów limfocytów T, przewlekłych stanów zapalnych albo odrzucania tkanek, albo w chorobach kardiologicznych i neurofizjologicznych.

Naturalne antygeny są zdolne do pośredniczenia w różnych reakcjach biochemicznych, które prowadzą do reakcji biologicznych albo fizjologicznych komórek docelowych. Niniejszym scharakteryzowano rozwiązania w odniesieniu do człowieka, ale w naturze istnieją odpowiedniki u innych naczelnych albo innych gatunków.

Dodatkowe sekwencje białek innych gatunków ssaków powinny być również dostępne, np. naczelnych, psowatych, kotowatych i gryzoni. Patrz niżej. Poniższy opis dotyczy ludzkiej IL-B13, ale może być zastosowany w pokrewnych postaciach wykonania dla innych gatunków.

II. Oczyszczona IL-B13

Sekwencja aminokwasowa ludzkiej IL-B13 jest przedstawiona jako Id. Sekw. nr 2. Naturalnie występujące kwasy nukleinowe, które kodują białko można izolować standardowymi procedurami stosując dostarczone sekwencje, np. techniką PCR albo przez hybrydyzację. Te sekwencje aminokwasowe, od końca aminowego do karboksylowego, są istotne w dostarczaniu informacji o sekwencji dla cytokin umożliwiając rozróżnienie antygenu białkowego od innych białek oraz egzemplifikując liczne warianty. Ponadto, sekwencje peptydowe umożliwiają wytworzenie peptydów w celu wytworzenia przeciwciał, które rozpoznają takie segmenty, zaś sekwencje nukleotydowe umożliwiają wytworzenie sond oligonukleotydowych, co stanowi strategie wykrywania albo izolacji, np. klonowania genów kodujących takie sekwencje.

W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „ludzka rozpuszczalna IL-B13”, kiedy stosowana w kontekście białek, powinna obejmować białko o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej rozpuszczalnemu polipeptydowi o Id. Sekw. nr 2, albo jego istotnym fragmentom. Korzystne wykonania obejmują wiele różnych, np. nie nakładających się, segmentów o konkretnej długości. Zwykle, wiele oznacza przynajmniej dwa, częściej przynajmniej trzy, zaś najczęściej 5, 7 albo jeszcze więcej. PodPL 197 150 B1 czas gdy podana jest minimalna długość, odpowiedniejsza może być sekwencja dłuższa, różnej długości np. jedna długości 7, zaś druga długości 12.

Składniki wiążące, np. przeciwciała, zwykle wiążą IL-B30 z wysokim powinowactwem, np. przynajmniej około 100 nM, zwykle lepszym niż około 30 nM, korzystnie lepszym niż około 10 nM, zaś najkorzystniej lepszym niż około 3 nM. Białkowe odpowiedniki spotykane są u gatunków ssaków innych niż człowiek, np. innych naczelnych, kopytnych albo gryzoni. Gatunki inne niż ssaki powinny również posiadać geny i białka pokrewne strukturalnie albo funkcjonalnie, np. ptaki albo płazy.

Określenie „polipeptyd” w znaczeniu tu zastosowanym obejmuje istotny fragment albo segment, i obejmuje ciąg reszt aminokwasowych długości przynajmniej 8 aminokwasów, zasadniczo przynajmniej około 12 aminokwasów, zwykle przynajmniej około 16 aminokwasów, korzystnie przynajmniej około 20 aminokwasów, zaś w szczególnie korzystnych wykonaniach przynajmniej około 30 aminokwasów albo więcej, np. 35, 40, 45, 50, itp. Fragmenty takie mogą mieć końce w zasadniczo każdej pozycji, np. mogą rozpoczynać się resztą 1,2, 3 itp. i kończyć się np. w pozycji 150, 149, 148 itp., we wszystkich praktycznie kombinacjach. Szczególnie interesujące są polipeptydy, których końce odpowiadają granicom domen strukturalnych, np. helis A, B, C i/lub D. Patrz, Tabela 1.

Określenie „kompozycja wiążąca” w znaczeniu tu zastosowanym dotyczy cząsteczek, które wiążą swoiście IL-B30, np. w oddziaływaniu typu antygen-przeciwciało. Swoistość może być mniej lub bardziej specyficzna, np. swoista dla konkretnego wykonania albo do grupy pokrewnych wykonań np. naczelnych, gryzoni itp. Obejmuje również związki, np. białka, które swoiście wiążą się z IL-B30, w tym przez naturalnie istotne fizjologicznie oddziaływania białko-białko, kowalencyjne i niekowalencyjne. Cząsteczką może być polimer, albo reagent chemiczny. Analog funkcjonalny może być białkiem z modyfikacjami strukturalnymi albo może być cząsteczką, które posiada kształt molekularny oddziałujący z odpowiednimi determinantami wiązania. Związki mogą służyć jako agoniści albo antagoniści wiązania receptora, patrz, np. Goodman i in., (red.) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (wyd. współczesne), Pergamon Press.

„Zasadniczo czyste”, np. w kontekście białek, oznacza zwykle, że białko jest wolne od innych zanieczyszczających białek, kwasów nukleinowych albo innych składników biologicznych pochodzących z organizmu będącego źródłem. Czystość można ocenić standardowymi sposobami, zwykle ciężarem, i zazwyczaj powinna ona wynosić przynajmniej około 40%, ogólnie przynajmniej około 50%, często przynajmniej około 60%, zwykle przynajmniej około 80%, korzystnie przynajmniej około 90%, zaś w najkorzystniejszych wykonaniach przynajmniej około 95%. Zwykle dodaje się również nośniki albo zaróbki.

Rozpuszczalność polipeptydu albo fragmentu zależy od środowiska i polipeptydu. Wiele parametrów wpływa na rozpuszczalność białek, w tym temperatura, środowisko elektrolitowe, wielkość i charakterystyka molekularna polipeptydu oraz rodzaj rozpuszczalnika. Zwykle, temperatury przy których stosuje się polipeptyd zawierają się w zakresie od około 4°C do około 65°C. Zwykle temperatura stosowania jest wyższa niż około 18°C. Dla celów diagnostycznych, temperatura będzie wynosić około temperatury pokojowej albo cieplejsza, ale niższa niż temperatura denaturacji składników testu. Dla celów terapeutycznych temperatura będzie zwykle temperaturą ciała, zwykle około 37°C dla ludzi i myszy, jednakże w pewnych konkretnych sytuacjach temperatura może być podwyższona albo obniżona in situ albo in vitro.

Wielkość i struktura polipeptydu powinna zasadniczo być w stanie stabilnym i zwykle nie w stanie denaturacji. Polipeptyd może być połączony z innymi polipeptydami w struktury czwartorzędowe, np. w celu zapewnienia rozpuszczalności albo połączony z lipidami albo detergentami.

Rozpuszczalnik i elektrolity zwykle będą w buforze zgodnym biologicznie, i zbliżać się będą do wodnego środowiska fizjologicznego. Zwykle, rozpuszczalnik będzie miał pH obojętne, zwykle od około 5 do 10, zaś korzystnie około 7,5. W niektórych przypadkach można dodać jeden albo wiele detergentów, zwykle łagodnie denaturujących, np. CHS (hemibursztynian cholesterylu) albo CHAPS (sulfonian (3-[3-cholamidopropylo]-dimetyloamonio)-1-propanu) albo w stężeniu na tyle niskim, że unika się istotnego zniszczenia właściwości strukturalnych albo fizjologicznych białka. W innych warunkach, można zastosować silny detergent w celu wywołania istotnej denaturacji.

III. Warianty fizyczne

Wynalazek obejmuje również białka albo peptydy o zasadniczej identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową antygenu IL-B30. Odmiany obejmują odmiany gatunkowe, polimorficzne i alleliczne.

PL 197 150 B1

Homologia sekwencji aminokwasowej albo identyczność sekwencji określa się przez optymalizację przyporządkowania reszt, jeżeli to konieczne wprowadzając przerwy. Patrz, również Needlham i in., (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff i in., (1983) Rozdział Pierwszy w „Time Warps, String Edits and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison”, Addison-Wesley, Reading, MA; i pakiety oprogramowania z IntelliGenetics, Mountain View, CA; i University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madisom, WI. Identyczność sekwencji ulega zmianie przy uwzględnieniu zastąpień konserwatywnych jako dopasowań. Zastąpienia konserwatywne zwykle obejmują zastąpienia w następujących grupach: glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; oraz fenyloalanina, tyrozyna. Zakonserwowanie może dotyczyć cech biologicznych, funkcjonalnych albo strukturalnych. Homologiczne sekwencje aminokwasowe zwykle obejmują naturalne odmiany polimorficzne albo alleliczne oraz międzygatunkowe odmiany sekwencji białka. Typowe homologiczne białka albo peptydy mają od 25-100% identyczności (jeżeli wprowadzone są przerwy) do 50-100% identyczności (jeżeli włączone są zastąpienia konserwatywne) z sekwencją aminokwasową IL-B30. Identyczność wynosić powinna przynajmniej około 35%, ogólnie przynajmniej około 40%, często przynajmniej około 50%, zwykle przynajmniej około 60%, zazwyczaj przynajmniej około 70%; korzystnie przynajmniej około 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej około 90%.

Izolowany DNA IL-B30 można łatwo modyfikować przez zastępowanie nukleotydów, delecje nukleotydów, insercje i inwersje krótkich ciągów nukleotydowych. Modyfikacje te powinny spowodować powstanie nowych sekwencji DNA, które kodują te antygeny, ich pochodne albo białka o podobnej aktywności fizjologicznej, immunogennej, antygenowej albo innej aktywności funkcjonalnej. Modyfikowane sekwencje można zastosować do wytworzenia zmutowanych antygenów albo w celu zwiększenia ekspresji. Zwiększona ekspresja może obejmować amplifikację genu, wzrost transkrypcji, zwiększoną translację albo inne mechanizmy. Określenie „zmutowana IL-B30” obejmuje polipeptyd podpadający pod definicję identyczności sekwencji IL-B30 jak podana wyżej, ale posiadający sekwencję aminokwasową, która się różni od IL-B30 normalnie spotykanej w naturze, czy to z powodu delecji, zastąpienia albo insercji. Obejmuje to ogólnie białka o istotnej identyczności z białkiem o Id. Sekw. nr 2, i posiadające wspólne z nim różne aktywności biologiczne, np. antygenowość albo immunogennosc, zaś w korzystnych wykonaniach zawiera większość ujawnionej naturalnej sekwencji pełnej długości. Sekwencje pełnej długości są zwykle korzystne, jakkolwiek wersje okrojone są również przydatne, podobnie, najbardziej pożądane są geny i białka spotykane w naturze. Podobne pojęcie dotyczy różnych białek IL-B30, szczególnie tych spotykanych u różnych zwierząt ciepłokrwistych, np. ssaków albo ptaków. Opisy te generalnie dotyczą wszystkich białek IL-B30 i nie ograniczają się do omówionego tu konkretnego przykładu naczelnych.

Mutagenezę IL-B30 można również przeprowadzić przez wytworzenie insercji albo delecji aminokwasowej. W celu osiągnięcia końcowego konstruktu można przeprowadzić zastąpienia, delecje, insercje albo dowolną ich kombinację. Insercje obejmują fuzje na końcu aminowym albo karboksylowym. W docelowym kodonie można przeprowadzić losową mutagenezę, zaś wyrażonego mutanta można badać przesiewowe w kierunku pożądanej aktywności. Sposoby wytwarzania mutacji zastąpieniem w określonym miejscu DNA o znanej sekwencji są dobrze znane w stanie techniki, np. mutageneza starterem M13 albo technika mutagenezy reakcją łańcuchową polimerazy (PCR). Patrz, Sambrook i in., (1989); Ausubel i in., (1987 i suplementy); oraz Kunkel i in., (1987) Met. Enzymol. 154: 367-382. Korzystne wykonania obejmują np. pojedyncze, podwójne, trzykrotne, pięciokrotne, siedmiokrotne itp., korzystnie konserwatywne zastąpienie na poziomie nukleotydowym albo aminokwasowym. Korzystnie, zastąpienia będą omijały konserwowane cysteiny i często będą w miejscach odległych od strukturalnych domen helikalnych. Odmiany takie mogą być przydatne do wytworzenia swoistych przeciwciał i często będą miały wspólnych wiele albo wszystkie właściwości biologiczne.

Niniejszym opisane zostały również białka rekombinowane, np. heterologiczne białka fuzyjne, wykorzystujące segmenty tych białek. Heterologiczne białko fuzyjne jest fuzją białek albo segmentów, które w naturze nie są połączone w ten sposób. Podobna koncepcja dotyczy sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego.

Oprócz tego, nowe konstrukty można wytworzyć przez połączenia podobnych funkcjonalnie domen z innych białek. Przykładowo, segmenty wiążące cel albo inne można „wymienić” pomiędzy różnymi nowymi polipeptami albo fragmentami fuzyjnymi. Patrz, Cunningham i in., (1989) Science 243: 1330-1336; O'Dowd i in., (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992.

PL 197 150 B1

Metoda amidynofosforanowa, opisana przez Beaucage i Carruthers (1981) Tetra. Lett. 22: 1859-1862, powinna wytworzyć odpowiednie syntetyczne fragmenty DNA. Dwuniciowy fragment można często otrzymać przez syntezę komplementarnej nici i połączenie ich ze sobą w odpowiednich warunkach albo przez dodanie komplementarnej nici przy użyciu polimerazy DNA z odpowiednią sekwencją startera, np. techniką PCR.

Analizę strukturalną można zastosować wobec genu, porównując z rodziną cytokin IL-6. Rodzina ta obejmuje, np. IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF, LIF, OSM, CNTF i Ob. Przyrównanie sekwencji IL-B30 człowieka, świni i myszy z innymi członkami rodziny IL-6 powinno umożliwić określenie cech strukturalnych. W szczególności, arkusza-β i helisy-α można określić stosując np. program RASMOL, patrz, Bazan i in., (1996) Nature 379: 591; Lodi i in., (1994) Science 263: 1762-1766; Sayle i Milner-White (1995) TIBS 20: 374-376 i Gronenberg i in., (1991) Protein Engineering 4: 263-269. Korzystne reszty dla zastąpień obejmują reszty eksponowane na powierzchnię, które powinny oddziaływać z receptorem. Inne reszty, które powinny zachowywać funkcję powinny być zastąpieniami konserwatywnymi, szczególnie w położeniu odległym od reszt eksponowanych na powierzchnię.

IV. Odmiany funkcjonalne

Blokowanie reakcji fizjologicznej IL-B30 może wyniknąć z kompetycyjnego zahamowania wiązania liganda z receptorem.

Testy in vitro według wynalazku powinny wykorzystywać izolowane białko, rozpuszczalne fragmenty obejmujące segmenty wiążące receptor tych białek albo fragmenty przyłączone do podłoża stałego. Testy te powinny również umożliwić diagnozowanie wpływu mutacji oraz modyfikacji w segmencie wiążącym, albo mutacji i modyfikacji cytokiny np. analogów IL-B30.

Wynalazek uwzględnia również zastosowanie kompetycyjnych testów w badaniu przesiewowym leków, np. gdzie przeciwciała neutralizujące przeciwko cytokinie albo fragmenty wiążące receptor współzawodniczą z badanym związkiem.

„Pochodne” antygenów IL-B30 obejmują mutanty sekwencji aminokwasowej postaci występujących w naturze, odmiany glikozylacji i kowalencyjne albo agregacyjne koniugaty z innymi resztami chemicznymi. Pochodne kowalencyjne można wytworzyć przez połączenie grup funkcyjnych z grupami spotykanymi w łańcuchach bocznych aminokwasów IL-B30 albo na końcu C albo N, np. standardowymi metodami. Patrz, Lundblad i Noyes (1988) Chemical Reagents for Protein Modyfication, tom 1-2, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Hugli (wyd. 1989), San Diego, CA; i Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Boca Raton, FL.

W szczególności, dotyczy to zmian glikozylacji, np. wytworzonych przez modyfikowanie wzorca glikozylacji polipeptydu podczas syntezy i przetwarzania, albo dalszych etapów przetwarzania. Patrz, np. Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: 497-534. Objęte są również odmiany peptydów, o tej samej sekwencji pierwszorzędowej, które mają niewielkie modyfikacje, w tym fosforylowane reszty aminokwasowe, np. fosfotyrozyna, fosfoseryna albo fosfotreonina.

Dostarczone są również polipeptydy fuzyjne pomiędzy IL-B30 i innymi białkami homologicznymi i heterologicznymi. Wiele receptorów cytokin albo innych białek powierzchniowych stanowią białka multimeryczne, np. jednostki homodimeryczne, stąd wielokrotne konstrukty mogą posiadać szereg zalet, w tym mniejszą podatność na cięcie proteolityczne. Typowymi przykładami są fuzje polipeptydów reporterowych, np. lucyferazy, z segmentem albo domeną białka, np. segmentem wiążącym receptor, tak że obecność albo położenie ligandu fuzyjnego można łatwo określić. Patrz, np. Dull i in., patent USA 4,859,609. Inne składniki fuzji genów obejmują bakteryjną β-galaktozydazę, trpE, białko A, β-laktamazę, alfa-amylazę, dehydrogenazę alkoholową, czynnik alfa drożdży i znaczniki wykrywania i oczyszczania takie jak sekwencja FLAG sekwencji His6. Patrz, np. Godowski i in., (1988) Science 241: 812-816.

Peptydy fuzyjne zwykle wytwarza się metodami rekombinacji kwasu nukleinowego albo metodami syntezy polipeptydów. Techniki manipulacji kwasem nukleinowym i ekspresji opisano ogólnie np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 i Ausubel i in., (wyd. 1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Willey, NY. Techniki syntezy peptydów opisane są np. Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; Atherton i in., (1989), IRL Press, Oxford; oraz Grant (1992) Synthetic Peptides: A User Guide, Freeman, NY. Metody fałdowania można zastosować wobec białek syntetycznych. Wynalazek uwzględnia również zastosowanie pochodnych białek IL-B30 innych niż odmiany sekwencji aminokwasowej czy glikozylacji. Pochodne takie mogą obejmować kowalencyjne albo agregacyjne połączenie z resztami chemicznymi albo nośnikami białkowymi. Pochodne kowalencyjne

PL 197 150 B1 albo agregacyjne mogą być przydatne jako immunogeny, jako reagenty do testów immunologicznych, w metodach oczyszczania takich jako oczyszczanie przez powinowactwo ze składnikiem wiązania np. innym antygenem. IL-B30 można unieruchamiać przez kowalencyjne związanie z podłożem stałym, takim jak Sepharose aktywowana bromkiem cyjanu, które to sposoby są dobrze znane w dziedzinie, albo przez adsorpcję na powierzchniach poliolefinowych, z sieciowaniem glutaraldehydem albo bez, do zastosowania w teście albo w oczyszczaniu przeciwciał anty-IL-B30 albo w alternatywnych kompozycjach wiążących. Białka IL-B30 można również znakować w sposób wykrywalny, np. do zastosowania w testach diagnostycznych. Oczyszczanie IL-B30 można przeprowadzić przy użyciu unieruchomionych przeciwciał albo komplementarnych składników wiązania, np. części wiążącej receptora.

Rozpuszczalną IL-B30 albo fragment według wynalazku można zastosować jako immunogen do wytwarzania surowic odpornościowych albo swoistych przeciwciał. Oczyszczony antygen można zastosować do przesiewania przeciwciał albo fragmentów wiążących antygen, w tym fragmentów wiążących antygen przeciwciał naturalnych, np. Fab, Fab', F(ab')2, itp. Oczyszczone antygeny można również zastosować jako reagent do wykrywania przeciwciał wytworzonych w reakcji na obecność podwyższonych poziomów cytokin, co może być diagnostyczne dla nieprawidłowych albo specyficznych stanów fizjologicznych albo chorobowych. Wynalazek uwzględnia przeciwciała wytworzone przeciwko sekwencjom aminokwasowym kodowanym przez sekwencję nukleotydową pokazaną jako Id. Sekw. nr 1, albo białkom zawierającym ich fragmenty. W szczególności, wynalazek uwzględnia przeciwciała o powinowactwie wiązania z albo wywołane przeciwko konkretnym domenom, np. helisom A, B, C albo D.

Wynalazek uwzględnia izolowanie dodatkowych odmian z gatunków blisko spokrewnionych. Analizę Southern'a i Northern umożliwi ustalenie, czy istnieją podobne jednostki genetyczne u innych ssaków. Prawdopodobnie, IL-B30 jest szeroko rozpowszechniona jako odmiany gatunkowe, np. gryzoni, lagomorpha, carnivora, artiodactyla, perissodactyla i naczelnych.

Wynalazek dostarcza również sposobów izolowania grupy pokrewnych antygenów wykazujących różnice i podobieństwa struktury, ekspresji i funkcji. Wyjaśnienie wielu działań fizjologicznych cząsteczek byłoby znacznie przyspieszone przez wyizolowanie i charakteryzację dodatkowych odmian gatunkowych albo polimorficznych. W szczególności, wynalazek dostarcza przydatnych sond do identyfikacji dodatkowych homologicznych jednostek genetycznych u różnych gatunków.

Izolowane geny umożliwiają transformację komórek pozbawionych ekspresji IL-B30, np. rodzajów komórek albo komórek, które nie posiadają odpowiednich białek i wykazują negatywną aktywność spoczynkową. Powinno to umożliwić analizę funkcji IL-B30 w porównaniu z nietransformowanymi komórkami kontrolnymi.

Określenie kluczowych elementów strukturalnych, które wywołują różne funkcje fizjologiczne za pośrednictwem tych antygenów możliwe jest przy użyciu standardowych technik nowoczesnej biologii molekularnej opisanych w Cunningham i in., (1989) Science, 243: 1339-1336; oraz podejścia zastosowane w O'Dowd i in., (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992 i Lechleiter i in., (1990) EMBO J. 9: 4381-4390.

Międzykomórkowa sygnalizacja obejmuje prawdopodobnie sygnalizację przez receptor. Jednakże, w pewnych warunkach może następować internalizacja białek i oddziaływanie pomiędzy składnikami wewnątrzkomórkowymi i cytokiną. Swoiste segmenty oddziaływania IL-B30 ze składnikami oddziaływania można zidentyfikować przez mutagenezę albo bezpośrednio metodami biochemicznymi, np. przez sieciowanie albo powinowactwo. Analiza strukturalna metodami krystalograficznymi albo innymi metodami fizycznymi powinna być również możliwa do zastosowania. Dalsze badania mechanizmu przekazywania sygnału powinny obejmować badanie towarzyszących składników, które można wyizolować metodami powinowactwa albo metodami genetycznymi, np. metodą komplementacji mutantów.

Przewiduje się dalsze badania ekspresji i kontroli IL-B30. Elementy kontrolujące związane z antygenami powinny wykazywać różnicowy wzorzec fizjologiczny, rozwojowy, tkankowo-specyficzny albo ekspresyjny. Interesujące są elementy kontrolne powyżej i poniżej genu.

Badania strukturalne antygenów IL-B30 powinny dostarczyć nowych antygenów, szczególnie analogów wykazujących właściwości agonistyczne albo antagonistyczne wobec cząsteczki. Można to połączyć z uprzednio opisanymi metodami izolowania antygenów wykazujących pożądane spektra aktywności.

PL 197 150 B1

V. Przeciwciała

Przeciwciała można wytworzyć przeciwko różnym epitopom białek IL-B30, w tym odmianom gatunkowym, polimorficznym albo allelicznym oraz ich fragmentom, w ich postaci naturalnej, jak i rekombinowanej. Oprócz tego, przeciwciała można wywołać przeciwko IL-B30 w postaci aktywnej albo postaci nieaktywnej, w tym natywnej albo denaturowanej. Uwzględniane są również przeciwciała antyidiotypowe.

Przeciwciała, w tym fragmenty wiążące i jednołańcuchowe, przeciwko określonym fragmentom antygenów można wytworzyć przez immunizowanie zwierząt koniugatami fragmentów z białkami immunogennymi. Przeciwciała monoklonalne izoluje się z komórek wytwarzających pożądane przeciwciała. Przeciwciała te można badać przesiewowo w kierunku wiązania z normalnymi albo defektywnymi IL-B30, albo badać przesiewowo w kierunku aktywności agonistycznej albo antagonistycznej, np. za pośrednictwem receptora. Przeciwciała mogą być agonistyczne albo antagonistyczne, np. przez steryczne blokowanie wiązania z receptorem. Takie przeciwciała monoklonalne wiążą się zwykle z Kd równą przynajmniej około 1 mM, zwykle przynajmniej około 30 μΜ, korzystnie przynajmniej około 10 μM, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej około 3 μM albo lepiej. Przeciwciała według wynalazku mogą być również przydatne w zastosowaniach diagnostycznych. Jako przeciwciała wychwytujące albo nie neutralizujące, można je badać przesiewowo w kierunku zdolności do wiązania z antygenami bez hamowania wiązania z receptorem. Jako przeciwciała neutralizujące, mogą być przydatne w kompetycyjnych testach wiązania. Będą również przydatne w wykrywaniu albo ocenie ilościowej białka IL-B30 albo jej receptora. Patrz, np. Chan (wyd. 1987) Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price i Newman (wyd. 1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, NY; i Ngo (wyd. 1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, NY. Absorpcja krzyżowa i inne testy powinny zidentyfikować przeciwciała, które wykazują różne spektra swoistości, np. unikalne albo wspólne swoistości gatunkowe.

Dalej, przeciwciała, w tym fragmenty wiążące antygen według wynalazku mogą być silnymi antagonistami, którzy wiążą antygen i hamują wiązanie funkcjonalne, np. z receptorem, który może wywoływać reakcję biologiczną. Mogą być również przydatne jako przeciwciała nie neutralizujące i można je sprzęgać z toksynami albo izotopami radioaktywnymi w taki sposób, że po związaniu się z antygenem komórka, która go wyraża, np. na powierzchni, ulega zniszczeniu. Dalej, przeciwciała te można sprzęgać z lekami albo innymi środkami terapeutycznymi bezpośrednio albo pośrednio przy użyciu łącznika i można uzyskać w ten sposób kierowanie leku.

Fragmenty antygenu można łączyć z innymi substancjami, szczególnie polipeptydami, jako polipeptydy fuzyjne albo połączone kowalencyjne do stosowania jako immunogeny. Antygen i jego fragmenty można poddać fuzji albo połączyć kowalencyjnie z różnymi immunogenami, jak np. hemocyjanina skałoczepa, albumina surowicy bydlęcej, anatoksyna tężcowa itp. Patrz, Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, NY; Williams i in., (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, tom 1, Academic Press, NY; Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press, NY, zawierające opis sposobów wytwarzania surowic poliklonalnych.

W niektórych przypadkach, pożądane jest wytworzenie przeciwciał monoklonalnych z różnych gatunków ssaków, takich jak myszy, gryzonie, naczelne, ludzie itp. Opis technik wytwarzania takich przeciwciał można znaleźć w np. Stites i in., (wyd.) Basic and Clinical Immunology (wyd. 4), Lange Medical Publications, Los Altos, CA i cytowane tam odnośniki; Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press, NY; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (wyd. 2), Academic Press, NY; zaś w szczególności Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495-497, gdzie znajduje się opis jednego ze sposobów wytwarzania przeciwciał monoklonalnych.

Inne odpowiednie techniki obejmują ekspozycję limfocytów in vitro na polipeptydy antygenowe albo alternatywnie, wybór biblioteki przeciwciał w fagu albo podobnym wektorze. Patrz, Huse i in., (1989) Science 246: 1275-1281; i Ward i in., (1989) Nature 341: 544-546. Polipeptydy i przeciwciała według wynalazku można zastosować z modyfikacjami albo bez, w tym przeciwciała chimeryczne albo humanizowane. Często, polipeptydy i przeciwciała będą znakowane przez przyłączenie, kowalencyjne albo nie kowalencyjne, substratu, który zapewnia wykrywalny sygnał. Różne znaczniki i techniki koniugacji są znane i opisywane w literaturze naukowej i patentowej. Odpowiednie znaczniki obejmują izotopy promieniotwórcze, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, reszty fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne itp. Patenty opisujące takie znaczniki obejmują patenty USA 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241. Można również wy16

PL 197 150 B1 tworzyć rekombinowane immunoglobuliny, patrz, Cabilly, patent USA 4,816,567; Moore i in., patent USA 4,642,334; Queen i in., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033.

Przeciwciała według wynalazku można również zastosować w celu chromatografii powinowactwa w izolowaniu białka. Można wytworzyć kolumny, w których przeciwciała połączone są z podłożem stałym. Patrz, Wilchek i in., (1984) Meth. Enzymol. 104: 3-55.

Przeciwciała wywołane przeciwko IL-B30 powinny być również przydatne do wywołania przeciwciał antyidiotypowych. Będą one przydatne do wykrywania i diagnozowania różnych stanów immunologicznych związanych z ekspresją odpowiednich antygenów.

VI. Kwasy nukleinowe

Opisane sekwencje peptydowe i pokrewne reagenty są przydatne do wykrywania, izolowania albo identyfikowania klonu DNA kodującego IL-B30, np. ze źródła naturalnego. Zwykle, powinno być to przydatne przy izolowaniu genu od ssaka, zaś podobne procedury stosuje się do izolowania genów z innych gatunków, np. zwierząt ciepłokrwistych, takich jak ptaki i ssaki. Hybrydyzacja krzyżowa powinna umożliwić izolowanie IL-B30 z tego samego gatunku, np. odmian polimorficznych, albo z innych gatunków. W celu pomyślnego wyizolowania odpowiedniego klonu kwasu nukleinowego dostępnych jest wiele podejść.

Oczyszczone białko albo określone peptydy są przydatne do wytwarzania przeciwciał standardowymi sposobami, jak to opisano wyżej. Syntetyczne peptydy albo oczyszczone białka mogą być prezentowane układowi odpornościowemu w celu wywołania przeciwciał poliklonalnych albo monoklonalnych. Patrz, Coligan i in., (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; oraz Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press.

Przykładowo, swoiście wiążące kompozycje można zastosować do badania przesiewowego biblioteki ekspresyjnej wytworzonej z linii komórkowej, która wyraża IL-B30. Badanie przesiewowe ekspresji wewnątrzkomórkowej można przeprowadzić wieloma sposobami barwienia albo immunofluorescencji. Kompozycje wiążące można zastosować w celu oczyszczania przez powinowactwo albo sortowania komórek wyrażających fuzyjne białko powierzchniowe.

Segmenty peptydowe można również zastosować w celu przewidywania odpowiednich oligonukleotydów do przesiewania biblioteki. Kod genetyczny można zastosować do selekcji odpowiednich oligonukleotydów przydatnych jako sondy do przesiewania. Patrz, np. Id. Sekw. nr 1. W kombinacji z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR), syntetyczne oligonukleotydy powinny być przydatne do selekcji prawidłowych klonów z biblioteki. Sekwencje komplementarne można również zastosować jako sondy, startery albo nici antysensowne. Różne fragmenty powinny być szczególnie przydatne, np. sprzęgnięte z wektorami kotwiczącymi albo techniki PCR z komplementarnymi poli-A albo z komplementarnymi DNA dla innych peptydów.

Wynalazek uwzględnia zastosowanie izolowanego DNA albo fragmentów do kodowania biologicznie czynnych polipeptydów odpowiadających IL-B30, szczególnie pozbawionych części kodujących nie ulegające translacji końce 5' opisanej sekwencji. Oprócz tego, wynalazek obejmuje izolowane i rekombinowane DNA, które kodują biologicznie czynne białko albo polipeptyd i które są zdolne do hybrydyzacji w odpowiednich warunkach z opisanymi tu sekwencjami DNA. Takim biologicznie czynnym białkiem albo polipeptydem może być cały antygen, albo fragment, i może mieć sekwencję pokazaną jako np. Id. Sekw. nr 2, szczególnie dojrzały, wydzielany polipeptyd. Dalej, wynalazek obejmuje zastosowanie izolowanego albo rekombinowanego DNA, albo jego fragmentu, które kodują białka wykazujące silną identyczność z wydzielniczą IL-B30. Izolowany DNA może zawierać odpowiednie sekwencje regulatorowe na końcach 5' i 3', np. promotory, wzmacniacze, sygnały poliadenylacji i inne. Alternatywnie, ekspresję można przeprowadzić przez połączenie funkcjonalne segmentu kodującego z promotorem heterologicznym, np. przez wprowadzenie promotora powyżej endogennego genu.

„Izolowany kwas nukleinowy” oznacza kwas nukleinowy, np. RNA, DNA albo mieszany polimer, który jest zasadniczo oddzielony od innych składników, które naturalnie towarzyszą natywnej sekwencji, np. rybosomy, polimerazy i/lub flankujące sekwencje genomowe z gatunków pochodzenia. Określenie obejmuje sekwencje kwasu nukleinowego, które pobrano ze środowiska naturalnego i obejmują rekombinowane albo klonowane izolaty DNA oraz chemicznie syntetyzowane analogi albo analogi syntetyzowane biologicznie przez układy heterologiczne. Zasadniczo czysta cząsteczka obejmuje izolowane postaci cząsteczki. Ogólnie, kwas nukleinowy będzie w wektorze albo fragmencie wielkości mniejszej niż około 50 kb, zwykle mniej niż około 30 kb, zwykle mniej niż około 10 kb, zaś korzystnie mniej niż około 6 kb.

PL 197 150 B1

Izolowany kwas nukleinowy będzie ogólnie homogenną kompozycją cząsteczek, ale w niektórych wykonaniach, zawierać może pewną heterogenność. Tą heterogenność spotyka się na końcach polimerów albo częściach, które nie są kluczowe dla pożądanego działania biologicznego albo aktywności.

„Rekombinowany” kwas nukleinowy określony jest sposobem wytwarzania albo jego budową. W odniesieniu do sposobu wytwarzania, np. produkt wytworzony sposobem stosuje się sposoby rekombinacji kwasu nukleinowego, np. obejmujące interwencję człowieka w sekwencję nukleotydową, zwykle selekcję albo wytwarzanie. Alternatywnie, może to być kwas nukleinowy wytworzony z sekwencji obejmującej fuzję dwóch fragmentów, które nie są naturalnie styczne do siebie, ale z wyłączeniem produktów naturalnych, np. mutantów występujących naturalnie. Tak więc, np. dotyczy to produktów wytworzonych przez transformowanie komórek nienaturalnie występującym wektorem, podobnie jak kwasy nukleinowe obejmujące sekwencję otrzymaną przy użyciu dowolnego procesu z udziałem syntetycznego oligonukleotydu. Często przeprowadza się to przez zastąpienie kodonu nadmiarowym kodonem kodującym ten sam albo konserwatywny aminokwas, przy wprowadzeniu albo usunięciu sekwencji rozpoznającej.

Alternatywnie, przeprowadza się to w celu połączenia ze sobą segmentów kwasu nukleinowego o pożądanej funkcji w celu wytworzenia pojedynczej jednostki genetycznej obejmującej pożądaną kombinację funkcji, nie spotykaną w dostępnej postaci naturalnej. Celem takich manipulacji są często miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne, ale inne miejsca np. promotory, miejsca replikacji DNA, sekwencje regulatorowe, kontrolne i inne mogą być również włączone. Podobny koncept dotyczy rekombinowanych, np. polipeptydów fuzyjnych. Konkretnie dotyczy to syntetycznych kwasów nukleinowych, które z powodu nadmiarowości kodu genetycznego, kodują polipeptydy podobne do fragmentów tych antygenów i fuzji tych sekwencji z różnych gatunków albo odmian polimorficznych.

Istotny „fragment” w kontekście kwasu nukleinowego oznacza ciągły segment długości przynajmniej około 17 nukleotydów, ogólnie przynajmniej około 22 nukleotydów, zwykle przynajmniej około 29 nukleotydów, częściej przynajmniej około 35 nukleotydów, zwykle przynajmniej około 41 nukleotydów, zwykle przynajmniej około 47 nukleotydów, korzystnie przynajmniej około 55 nukleotydów, zaś w szczególnie korzystnych wykonaniach przynajmniej około 60 nukleotydów albo więcej, np. 67, 73, 81,89, 95 itp.

DNA który koduje białko IL-B30 powinien być szczególnie użyteczny do identyfikacji genów, mRNA i cDNA, które kodują pokrewne albo podobne białko, jak również DNA, które kodują białka homologiczne z innych gatunków. Będą to homologi innych gatunków, w tym naczelnych, gryzoni, psów, kotów i ptaków. Różne białka IL-B30 powinny być homologiczne z innymi gatunkami. Jednakże, nawet białka, które mają odleglejsze zależności ewolucyjne z antygenem można łatwo wyizolować w odpowiednich warunkach, stosując sekwencje jeżeli nie są odpowiednio homologiczne. Szczególnie interesujące są białka IL-B30 innych naczelnych.

Rekombinowane klony z sekwencji genomowych, np. zawierające introny, powinny być przydatne do badań transgenicznych, w tym np. komórek transgenicznych i organizmów oraz do terapii genowej. Patrz, np. Goodnow (1992) Transgenic Animals, Roitt (wyd.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, str. 1502-1504; Travis (1992) Science 256: 1392-1394; Kuhn i in., (1991) Science 254: 707-710; Capecchi 91989) Science 244: 1288; Robertson (1987) (wyd.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cels: A practical Approach, IRL Press, Oxford; oraz Rosenberg (1992) J. Clin. Oncol. 10: 180-199.

Zasadnicza homologia, np. identyczność, w kontekście porównania sekwencji kwasu nukleinowego oznacza, że segmenty albo ich komplementarne nici, przy porównaniu są identyczne przy optymalnym przyrównaniu, z odpowiednimi insercjami albo delecjami oligonukleotydów, w przynajmniej 50%, ogólnie przynajmniej około 58%, zwykle przynajmniej około 65%, często przynajmniej około 85%, korzystnie przynajmniej około 95 do 98% albo więcej. Alternatywnie, zasadnicza homologia występuje, gdy segmenty hybrydyzują w wybiórczych warunkach hybrydyzacji z nicią albo jej sekwencją komplementarną, z zastosowaniem sekwencji IL-B30, np. w Id. Sekw. nr 1. Zwykle, swoista hybrydyzacja powinna zajść gdy występuje przynajmniej około 55% identyczności na przestrzeni przynajmniej około 30 nukleotydów, korzystnie przynajmniej około 75% na przestrzeni około 25 nukleotydów, zaś najkorzystniej przynajmniej około 90% na przestrzeni około 20 nukleotydów. Patrz, Kanehisa (1984) Nucl. Acids Res. 12: 203-213. Długość porównania identyczności jak opisano może być na przestrzeni dłuższego ciągu, zaś szczególne wykonania powinny obejmować ciąg przynajmniej około 17 nukle18

PL 197 150 B1 otydów, zwykle przynajmniej około 28 nukleotydów, zwykle przynajmniej około 40 nukleotydów, zaś korzystnie przynajmniej około 75 do 100 albo więcej nukleotydów.

Surowe warunki, w odniesieniu do homologii w kontekście hybrydyzacji, powinny być surowymi złożonymi warunkami stężenia soli, temperatury i rozpuszczalników organicznych oraz innych parametrów, zwykle kontrolowanych w reakcjach hybrydyzacji. Surowe warunki temperatury obejmują zwykle temperatury ponad 30°C, zwykle ponad około 37°C, zwykle ponad około 55°C, korzystnie ponad około 70°C. Surowe warunki stężenia soli zwykle będą niższe niż około 1000 mM, zwykle mniej niż około 400 mM, zwykle mniej niż około 250 mM, korzystnie mniej niż około 150 mM, w tym mniej niż około 100, 50 albo nawet 20 mM. Jednakże, złożone parametry są bardziej istotne niż wielkość konkretnego parametru. Patrz, np. Wetmur i Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370. Hybrydyzacja w surowych warunkach powinna dawać tło wynoszące przynajmniej 2-krotność tła, korzystnie przynajmniej 3-5 albo więcej.

Do porównania sekwencji, zwykle jedna sekwencja działa jako sekwencja odniesienia, do której porównywana jest badana sekwencja. Przy zastosowaniu algorytmu porównania sekwencji, sekwencję badaną i odniesienia wprowadza się do komputera, oznacza się współrzędne sekwencji, jeżeli to konieczne, i zaznacza się parametry algorytmu. Algorytm porównania sekwencji obliczany jako procent identyczności dla sekwencji badanej względem sekwencji odniesienia oparty jest na określonych parametrach programu.

Można przeprowadzić optyczne przyrównanie sekwencji w celu porównania, np. algorytmem miejscowej homologii Smith i Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, algorytmem przyrównania homologii Needleman i Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, metodą poszukiwania podobieństwa Pearson i Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, komputerowymi implementacjami tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w pakiecie Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI) albo wizualnie (patrz, Ausubel i in., wyżej).

Jednym z przykładów przydatnego algorytmu jest PILEUP. PILEUP tworzy liczne przyrównania sekwencji z grupy porównywanych sekwencji stosując progresywne, sparowane porównania wykazujące pokrewieństwo i procent identyczności sekwencji. Kreśli również drzewo albo dendrogram pokazujący skupienia pokrewieństwa zastosowane do wytworzenia przyrównania. PILEUP wykorzystuje uproszczoną metodę progresywnego przyrównywania Feng i Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351360. Zastosowany sposób jest podobny do metody opisanej przez Higgins i Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153. Program może przyrównać do 300 sekwencji, o długości do 5000 nukleotydów albo aminokwasów. Procedura wielokrotnego przyrównywania rozpoczyna się przyrównywaniem parami dwóch najbardziej podobnych sekwencji, dając przedział dwóch przyrównanych sekwencji. Następnie, przedział ten jest przyrównywany do następnej, najbliżej spokrewnionej sekwencji albo przedziału przyrównanych sekwencji. Dwa przedziały sekwencji są przyrównywane przez proste rozszerzenie przyrównania parami dwóch poszczególnych sekwencji. Końcowe przyrównanie otrzymuje się przez szereg progresywnych przyrównań parami. Program uruchamia się przez określenie konkretnych sekwencji i ich współrzędnych aminokwasów albo nukleotydów dla regionów porównania sekwencji i przez określenie parametrów programu. Przykładowo, sekwencję odniesienia można porównać z inną sekwencją badaną w celu określenia procentu identyczności stosując następujące parametry: domyślna przerwa (3,00), długość domyślnej przerwy (0,10) i ważone końce przerw.

Innym przykładem algorytmu przydatnego do określania procentu identyczności sekwencji i podobieństwa sekwencji jest algorytm BLAST, który został opisany przez Altshul i in., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Oprogramowanie do przeprowadzania analizy BLAST jest dostępne publicznie przez serwer National Center for Biotechnology Information.

Oprócz obliczania procentu identyczności sekwencji, algorytm BLAST przeprowadza również analizę statystyczną podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami (patrz, np. Karlin i Altshul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787)

Dalszą wskazówką, że dwie sekwencje kwasu nukleinowego są podobne zasadniczo identyczne jest to, że polipeptyd kodowany przez pierwszy kwas nukleinowy reaguje immunologicznie krzyżowo z polipeptydem kodowanym przez drugi kwas nukleinowy, jak to opisano niżej. Tak więc, polipeptyd jest zwykle zasadniczo identyczny z drugim polipeptydem, przykładowo, gdy oba peptydy różnią się jedynie konserwatywnymi zastąpieniami. Inną wskazówką, że dwie sekwencje kwasu nukleinowego są podobne zasadniczo identyczne jest to, że obie cząsteczki hybrydyzują ze sobą w surowych warunkach, jak to opisano niżej.

PL 197 150 B1

IL-B30 od jednego gatunku ssaka można klonować i izolować przez hybrydyzację międzygatunkową blisko spokrewnionego gatunku. Homologia może być względnie niska pomiędzy odległymi gatunkami, stąd zalecana jest hybrydyzacja względnie blisko spokrewnionych gatunków. Alternatywnie, preparat przeciwciał, które wykazują mniejszą swoistość gatunkową może być przydatny w podejściu polegającym na klonowaniu ekspresyjnym.

VII. Wytwarzanie IL-B30; Mimetyki

DNA, który koduje IL-B30 albo jego fragmenty można otrzymać drogą syntezy chemicznej, badania przesiewowego bibliotek cDNA albo badania przesiewowego bibliotek genomowych wytworzonych z różnych linii komórkowych albo próbek tkanek. Patrz, np. Okayama i Berg (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 161-170; Gubler i Hoffman (1983) Gene 25: 263-269; i Glover (wyd. 1984) DNA Cloning: A practical Approach, IRL Press, Oxford. Alternatywnie, dostarczone tu sekwencje zapewnią przydatne startery do PCR albo syntetyczne albo inne preparaty odpowiednich genów kodujących IL-B30; w tym naturalnie występujące wykonania.

DNA ten można poddać ekspresji w różnych komórkach gospodarza w celu syntezy IL-B30 pełnej długości albo fragmentów, które z kolei można użyć do wytworzenia przeciwciał poliklonalnych albo monoklonalnych; do badań wiązania; do konstruowania i ekspresji modyfikowanych cząsteczek oraz do badań nad strukturą/funkcją.

Wektory w znaczeniu tu zastosowanym, obejmują plazmidy, wirusy, bakteriofagi, fragmenty DNA zdolne do integracji i inne nośniki, które umożliwiają integrację fragmentów DNA z genomem gospodarza. Patrz, np. Pouwels i in., (1985 i suplementy) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY. i Rodriguez i in., (1988, wyd.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Dla celów wynalazku, sekwencje DNA są pokrewne funkcjonalnie ze sobą. Przykładowo, DNA dla pre-sekwencji albo fragmentu wydzielniczego jest połączony z polipeptydem jeżeli ulega on ekspresji jako pre-białko albo uczestniczy w kierowaniu polipeptydu do błony komórkowej albo w wydzieleniu polipeptydu. Promotor jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą jeżeli kontroluje ona transkrypcję polipeptydu; miejsce wiązania rybosomu jest połączone funkcjonalnie z sekwencją kodującą, jeżeli jest w położeniu umożliwiającym translację. Zwykle, połączenie funkcjonalne oznacza połączenie ciągłe i w tej samej ramce odczytu, jednakże niektóre elementy genetyczne, takie jak geny represorowe, nie są połączone w ciągu, ale wiążą sekwencję operatora co z kolei kontroluje ekspresję. Patrz, np. Rodriguez i in., rozdz. 10, str. 205-236; Balbas i Bolivar (1990) Met. Enzymol. 185: 14-37; Ausubel i in., wyżej.

Reprezentatywne przykłady odpowiednich wektorów ekspresyjnych obejmują pCDNA1; pCD, Okayama i in., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1136-1142; pMC1neo Poly-A, Thomas i in., (1987) Cell 51: 503-512; oraz wektor bakulowirusowy taki jak pAC 373 albo pAC 610. Patrz, Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42: 177-199.

Często będzie pożądane wyrażenie polipeptydu IL-B30 w układzie, który zapewnia swoisty i określony wzorzec glikozylacji. Patrz, Luckow i Summers (1988) Bio/Technology 6: 47-55; Kaufman (1990) Meth. Enzymol. 185: 487-511.

IL-B30 albo jej fragment można przekonstruować w taki sposób, aby była połączona z błoną komórkową przez fosfatydylo-inozytol (PI), ale można ją było usunąć z błony przez traktowanie enzymem tnącym fosfatydylo-inozytol, np. fosfolipazą C. Uwalnia to antygen w postaci biologicznie czynnej, i umożliwia oczyszczanie standardowymi procedurami chemii białek. Patrz, np. Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988: 427-454; Tse i in., (1985) Science 230: 1003-1008; Brunner i in., (1991) J. Cell Biol. 114: 1275-1283.

Obecnie, ponieważ IL-B30 została scharakteryzowana, jej fragmenty albo pochodne można wytworzyć konwencjonalnymi sposobami syntezy peptydów. Obejmują one procesy takie jak opisane w Stewart i Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bondaszky i Bondaszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, NY, Bondaszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, NY; i Villafranca (wyd. 1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, CA.

VIII. Zastosowania

Wynalazek dostarcza reagentów, które znajdą zastosowanie w diagnostyce, jak to opisano, np. w stanach w których pośredniczy IL-B30 albo poniżej, w opisie zestawów diagnostycznych. Gen może być przydatny dla celów kryminalistyki, np. w celu odróżnienia gryzonia od człowieka, albo jako

PL 197 150 B1 znacznik w celu rozróżnienia pomiędzy różnymi komórkami wykazującymi różnicową ekspresję albo wzorzec modyfikacji.

Wynalazek dostarcza również reagentów o istotnych możliwościach komercyjnych i/lub terapeutycznych. IL-B30 (występująca naturalnie albo rekombinowana), jej fragmenty i przeciwciała przeciwko niej, wraz ze związkami o powinowactwie wiązania z IL-B30, powinny być przydatne jako reagenty do nauki technik biologii molekularnej, immunologii albo fizjologii. Przy użyciu reagentów można wytworzyć odpowiednie zestawy, np. do praktycznych zajęć laboratoryjnych wytwarzania albo zastosowania białek, przeciwciał, metod klonowania, histologii itp.

Reagenty będą również przydatne do leczenia stanów związanych z nieprawidłową fizjologią albo rozwojem, w tym stanów zapalnych. Mogą być przydatne w testach in vitro na obecność składników oddziałujących, które mogą korelować z powodzeniem konkretnych strategii leczenia. W szczególności, przez odpowiednie sposoby leczenia przy użyciu dostarczonych to kompozycji można osiągnąć modulowanie fizjologii np. komórek krwiotwórczych albo limfoidalnych. Patrz, Thompson (1994; wyd.) The Cytokine Handbook (wyd. 2) Academic Press, San Diego; Metcalf i Nicola (1995) The Hematopoietic Golony Stimulating Factors, Cambridge University Press; i Aggarwal i Gutterman (1991) Human cytokines; Blackwell Publ.

Przykładowo, choroba albo zaburzenie związane z nieprawidłową ekspresją albo nieprawidłową sygnalizacją przez IL-B30 powinno być celem dla agonisty albo antagonisty. Nowa cytokina powinna odgrywać rolę w regulowaniu albo rozwoju komórek krwiotwórczych, np. komórek limfoidalnych, które wpływają na reakcje odpornościowe, np. reakcję zapalną i/lub choroby autoagresyjne. Alternatywnie, może wpływać na fizjologię naczyniową albo rozwój albo objawy neuronalne.

W szczególności, cytokina powinna pośredniczyć w różnych kontekstach, syntezie cytokin przez komórki, proliferacji itp. Antagoniści IL-B30, tacy jak odmiany muteinowe naturalnie występujących postaci IL-B30 albo przeciwciała blokujące, mogą zapewnić wybiórczy i silny sposób blokowania reakcji odpornościowej, np. w sytuacjach reakcji zapalnej albo autoagresyjnej. Patrz, również Samter i in., (wyd.) Immunological Diseases tom 1 i 2, Little, Brown and Co.

Oprócz tego, powinny być przydatne pewne kompozycje skojarzone, np. z innymi modulatorami stanu zapalnego. Takie cząsteczki mogą obejmować steroidy, inne wersje G-CSF i/lub IL-6, w tym odmiany gatunkowe, albo homologi wirusowe oraz innych antagonistów.

Wiadomo, że różne nieprawidłowe stany powodują wytwarzanie w różnych rodzajach komórek mRNA dla IL-B30 co stwierdzono analizą Northern. Patrz, Berkow (wyd.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co. Rahway, NJ; Thorn i in., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY; Weatherall i in., (wyd.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Wiele innych stanów i chorób obejmuje aktywację przez makrofagi albo monocyty, i wiele z nich reaguje na leczenie dostarczonymi tu agonistami albo antagonistami. Patrz, Stites i Terr (wyd. 1991) Basic and Clinical Immunology, Appleton & Lange, Norwalk, CT; Samter i in., (wyd.) Immunological Diseases, Little, Brown and Co., Problemy te są podatne na zapobieganie albo leczenia dostarczonymi tu kompozycjami. Lokalizacja w wysepkach trzustkowych wskazuje ewentualny związek z cukrzycą.

IL-B30, antagoniści, przeciwciała itp. można oczyszczać a następnie podawać pacjentowi, weterynaryjnemu albo człowiekowi. Wszystkie reagenty można łączyć w celach terapeutycznych, z dodatkowymi albo obojętnymi składnikami, np. z konwencjonalnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami albo rozcieńczalnikami, np. adiutantami immunologicznymi, wraz z fizjologicznie nieszkodliwymi stabilizatorami, zaróbkami albo konserwantami. Kombinacje te można sterylizować przez filtrowanie i umieszczać w postaciach dawkowania, jak np. przez liofilizowanie w fiolkach albo przechowywać w stabilizowanych roztworach wodnych. Wynalazek uwzględnia również zastosowanie przeciwciał albo ich fragmentów wiążących, w tym postaci, które nie wiążą dopełniacza.

Badanie przesiewowe leków przy użyciu IL-B30 albo jej fragmentów można przeprowadzić w celu zidentyfikowania związków o powinowactwie wiązania albo o innych biologicznych działaniach na funkcjonowanie IL-B30, w tym izolowanie składników towarzyszących. Kolejne testy biologiczne można wykorzystać w celu stwierdzenia, czy związek ma wewnątrzpochodną aktywność pobudzającą, a stąd czy jest blokerem albo antagonistą ponieważ blokuje aktywność cytokiny. Podobnie, związek o wewnątrzpochodnej aktywności pobudzającej może aktywować szlak sygnalizacjj, a stąd jest agonistą pobudzającym aktywność IL-B30. Wynalazek dalej uwzględnia zastosowanie terapeutyczne przeciwciał blokujących przeciwko IL-B30, jako antagonistów, i przeciwciał pobudzających, jako agonistów. Podejście to powinno być szczególnie przydatne w przypadku odmian gatunkowych IL-B30.

PL 197 150 B1

Ilości reagentów koniecznych do skutecznej terapii zależą, od wielu różnych czynników, w tym drogi podania, miejsca docelowego, stanu fizjologicznego pacjenta, i innych podawanych leków. Stąd, dawki lecznicze powinny być dobrane w celu optymalizacji bezpieczeństwa i skuteczności. Zwykle, dawki stosowane in vitro mogą zapewnić przydatne wytyczne co do ilości przydatnych in situ stosowanych reagentów. Badania skutecznych dawek na zwierzętach powinny dalej przepowiadać dawkowanie u ludzi. Opisano różne metody określania dawek, np. Goodman i in., (wyd.) Goodman i Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (wyd. współczesne), Pergamon Press; i Remington^ Pharmaceutical Sciences, wyd. 17 (1990) Mack Publishing Co, Easton, Penn. Sposoby podawania są dyskutowane niżej, np. dotyczące podawania doustnego, dożylnego, dootrzewnowego albo domięśniowego, dyfuzji przezskórnej itp. Nośniki dopuszczalne farmaceutycznie obejmują wodę, sól, bufory i inne substancje opisane np. w Merck Index, Merck & Co, Rahway, NJ. Oczekuje się, że zwykłe zakresy dawek powinny wynosić od stężenia około 1 mM, zwykle mniej niż około 10 μΜ, zwykle mniej niż 100 nM, korzystnie mniej niż około 10 pM (pikomolarne), zaś najkorzystniej mniej niż 1 fM (femtomolarne), w odpowiednim nośniku. Formulacje do powolnego uwalniania albo urządzenia do powolnego uwalniania mogą być zastosowane do ciągłego albo przedłużonego podawania. Patrz, Langer (1990) Science 249: 1527-1533.

ILB30, jej fragmenty przeciwciała przeciwko niej albo ich fragmenty, antagoniści i agoniści, mogą być podawani bezpośrednio leczonemu biorcy, albo, zależnie od wielkości związku, może być pożądane sprzęgnięcie ich z białkiem nośnikowym takim jak owalbumina albo albumina surowicy przed podaniem. Formulacje terapeutyczne można podawać w różnej postaci dawkowania. O ile możliwe jest podawanie samego składnika czynnego, korzystne jest podanie w postaci formulacji farmaceutycznej. Formulacje zwykle obejmują przynajmniej jeden składnik czynny, jak określony wyżej, wraz z jednym albo wieloma nośnikami. Każdy nośnik powinien być dopuszczalny farmaceutycznie i fizjologicznie, w taki sposób, że jest zgodny z innymi składnikami, oraz nieszkodliwy dla pacjenta. Formulacje obejmują takie, które są przydatne do podawania doustnego, doodbytniczego, nosowego, miejscowego albo pozajelitowego (w tym podskórnego, domięśniowego, dożylnego i śródskórnego). Formulacje mogą być w postaci dawek jednostkowych i można je wytwarzać sposobami dobrze znanymi w dziedzinie farmacji. Patrz, Goodman i in., (wyd.) Goodman i Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (wyd. współczesne), Pergamon Press i Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 17 (1990) Mack Publishing Co, Easton, Penn.; Avis i in., (wyd. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, NY; Lieberman i in., (wyd. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY; i Lieberman i in., (wyd. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. Leczenie według wynalazku można połączyć z albo zastosować wraz z innymi czynnikami, np. innymi cytokinami, w tym IL-6 albo G-CSF albo ich odpowiednimi agonistami.

Naturalnie występujące i rekombinowane postaci IL-B30 według wynalazku są szczególnie przydatne w zestawach i sposobach testów, które umożliwiają badanie przesiewowe w kierunku aktywności wiązania białek. Opracowano szereg sposobów automatyzacji testów, w sposób umożliwiający badanie przesiewowe dziesiątków tysięcy związków w krótkim czasie. Patrz, np. Fodor i in., (1991) Science 251: 767-773, którzy opisują sposoby testowania powinowactwa wiązania z wieloma określonymi polimerami syntetyzowanymi na podłożu stałym. Opracowanie odpowiednich testów może być znacznie ułatwione przez dostępność znacznych ilości oczyszczonej, rozpuszczalnej IL-B30 dostarczonej według wynalazku.

Inne sposoby można zastosować w celu określenia kluczowych reszt w oddziaływaniu IL-B30 z receptorem IL-B30. Można przeprowadzić analizę mutacyjną, np. patrz, Somoza i in., (1993) J. Exp. Med. 178: 549-558), w celu stwierdzenia swoistych reszt kluczowych dla oddziaływania i/lub sygnalizacji. PHD (Rost i Sander (1994) Proteins 19: 55-72) i DSC (King i Sternberg (1996) Protein Sci. 5: 2298-2310) może dostarczyć informacji o strukturze drugorzędowej helis α (H), płacht β (E) oraz pętli (L). Helisy A i D są najistotniejsze w oddziaływaniu z receptorem, przy czym helisa D jest bardziej istotnym regionem. Helisa A u człowieka biegnie od około pro(7) do his(27), podczas gdy helisa D od około trp(135) do gly(162). Reszty eksponowane na powierzchnię powinny wpływać na wiązanie z receptorem, podczas gdy ukryte reszty powinny wpływać na ogólną strukturę. Przewidywane reszty o szczególnej roli odpowiadają prawdopodobnie arg(146), ser(147), gln(149), ala(150), ala(153), val(154), ala(156), arg(157), ala(160) i his(161).

Przykładowo, antagonistów można znaleźć po określeniu struktury antygenu, np. przez badanie danych struktury trzeciorzędowej. Badanie możliwości oddziaływania analogów jest obecnie możliwe przez opracowanie wysoko zautomatyzowanych testów wykorzystujących IL-B30. W szczególności,

PL 197 150 B1 nowych agonistów i antagonistów można określić przez zastosowanie opisanych tu technik badania przesiewowego. Szczególnie istotne są związki, które mają powinowactwo wiązania ze spektrum IL-B30, np. związki, które mogą służyć jako antagoniści odmian gatunkowych IL-B30.

Jeden ze sposobów badania przesiewowego wykorzystuje eukariotyczne albo prokariotyczne komórki gospodarza stabilnie transformowane rekombinowaną cząsteczką DNA wyrażającą IL-B30. Komórki które wyrażają IL-B30 można izolować od innych cząsteczek. Takie komórki, żywe albo utrwalone, można stosować jako standardowy składnik wiązania w testach. Patrz, Parce i in., (1989) Science 246: 243-247; Owicki i in., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4007-4011.

Inna technika badania przesiewowego leków obejmuje podejście zapewniające przesiewanie wielkoprzepustowe w kierunku substancji o odpowiednim powinowactwie wiązania IL-B30, jak to opisano w Geysen, zgłoszenie europejskie 84/03564, opublikowane 13 września, 1984. Po pierwsze, znaczną liczbę różnych małych peptydów badanej substancji syntetyzuje się na podłożu stałym, np. plastikowych szpilkach albo innej odpowiedniej powierzchni, patrz, Fodor i in., (1991). Następnie, wszystkie szpilki poddaje się reakcji z rozpuszczoną, nieoczyszczoną albo rozpuszczoną, oczyszczoną IL-B30, a następnie płucze. Następny etap obejmuje wykrywanie związanej IL-B30.

Racjonalne projektowanie leków może również opierać się na badaniach strukturalnych kształtu cząsteczkowego IL-B30 i innych efektorów albo analogów. Efektory mogą być innymi białkami, które pośredniczą w innych funkcjach w reakcji na wiązanie, albo innymi białkami, które normalnie oddziałują z IL-B30 np. receptory. Jednym ze sposobów określania, które miejsca oddziałują z innym białkiem jest fizyczne określenie struktury np. techniką krystalografii rentgenowskiej albo 2-wymiarowego NMR. Powinno to zapewnić wskazówki, co do reszt aminokwasowych z modelowanych regionów kontaktu molekularnego, np. w stosunku do innych modeli receptor-cytokina. Szczegółowy opis określenia strukturalnego, patrz, np. Blundell i Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, NY.

IX. Zestawy

Wynalazek uwzględnia również zastosowanie białek IL-B30, ich fragmentów, peptydów, i ich produktów fuzyjnych w różnych zestawach i sposobach diagnostycznych, w celu wykrywania obecności innej IL-B30 albo składnika wiązania. Zwykle zestaw powinien zawierać przedział zawierający określony peptyd IL-B30 albo segment genu albo reagent, który rozpoznaje np. IL-B30 albo przeciwciała.

Zestaw do określania powinowactwa wiązania badanego związku z IL-B30 powinien zwykle obejmować badany związek; znakowany związek, przykładowo składnik wiązania albo przeciwciało o znanym powinowactwie wiązania z IL-B30; źródło IL-B30 (występującej naturalnie albo rekombinowanej); oraz środki do oddzielenia związanego związku od wolnego znakowanego, takie jak faza stała do unieruchamiania cząsteczki. Po badaniu przesiewowym związków, związki o odpowiednim powinowactwie wiązania z antygenem można badać w odpowiednich testach biologicznych, które są dobrze znane, w celu określenia czy działają jako agoniści albo antagoniści w szlaku sygnalizacji IL-B30. Dostępność rekombinowanych polipeptydów IL-B30 również zapewnia dobrze określonego wzorca do kalibracji takich testów.

Korzystne zestawy do określania stężenia, np. IL-B30 w próbce, powinny obejmować znakowany związek, np. składnik wiązania albo przeciwciało, o znanym powinowactwie wiązania z antygenem, źródło cytokiny (występującej naturalnie albo rekombinowanej) oraz środki do oddzielenia związanego związku od wolnego znakowanego, takie jak faza stała do unieruchamiania cząsteczki. Powinien być zapewniony przedział zawierający reagenty oraz instrukcję.

Przeciwciała, w tym fragmenty wiążące antygen, swoiste wobec IL-B30 albo fragmenty, są przydatne w zastosowaniach diagnostycznych w celu wykrywania obecności podwyższonych poziomów IL-B30 i/lub jej fragmentów. Takie testy mogą wykorzystywać lizaty, żywe komórki, utrwalone komórki, immunofluorescencję, hodowle komórkowe, płyny ustrojowe i dalej mogą obejmować wykrywanie antygenów pokrewnych z antygenem w surowicy itp. Testy diagnostyczne mogą być homogenne (bez etapu oddzielania wolnego reagenta od kompleksu antygenu-składnika wiązania) albo heterogenne (z etapem oddzielania). Istnieją różne testy dostępne w handlu, takie jak testy immunologiczne (RIA), enzymatyczne testy immunosorpcyjne (ELISA), enzymatyczne testy immunologiczne (EIA), technika wzmacniania testu immunologicznego enzymem (EMIT), test immunologiczny z substratem znakowanym fluorescencyjnie (SLFIA) itp. Patrz, np. Van Vunakis i in., (1980) Meth. Enzymol. 70: 1-525; Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press, NY i Coligan i in., (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene.

Przeciwciała antyidiotypowe mogą mieć podobne zastosowanie w celu diagnozowania obecności przeciwciał przeciwko IL-B30. Przykładowo, nadprodukcja IL-B30 może spowodować różne reakPL 197 150 B1 cje odpornościowe, które mogą być diagnostyczne dla wielu nieprawidłowych stanów fizjologicznych, szczególnie stanów proliferacji komórek, jak nowotwór albo nieprawidłowej aktywacji albo różnicowania. Ponadto, wzorzec rozmieszczenia dostarcza informacji, że cytokina ulega ekspresji w wysepkach trzustkowych, co wskazuje na możliwość, że cytokina może być związana z działaniem tego narządu, np. w stanach związanych z cukrzycą.

Często, reagenty do testów diagnostycznych są dostarczane w zestawach, w celu optymalizacji czułości testu. W przypadku niniejszego wynalazku, zależnie od natury testu dostarcza się protokół, znacznik, przeciwciało albo składnik wiązania znakowany albo nie albo znakowaną IL-B30. Zwykle również dostarcza się je z takimi dodatkami jak bufory, stabilizatory, materiały konieczne do wytworzenia sygnału, jak substraty enzymów itp. Korzystnie, zestaw zawiera również instrukcje prawidłowego zastosowania i usunięcia zawartości po użyciu. Zwykle zestaw ma przedziały na każdy z reagentów. Pożądane jest, aby reagenty były dostarczone jako liofilizowany proszek, przy czym reagenty odtwarza się w ośrodku wodnym zapewniając odpowiednie stężenie reagentów do przeprowadzenia testu.

Wiele z wymienionych wcześniej składników do badania przesiewowego leków i testów diagnostycznych można zastosować bez modyfikacji albo można zastosować w różnoraki sposób. Przykładowo, znakowanie można osiągnąć przez kowalencyjne albo nie kowalencyjne połączenie domeny, która bezpośrednio albo pośrednio zapewnia wykrywalny sygnał. W wielu testach, składnik wiązania, badany związek, IL-B30, albo przeciwciała przeciwko nie można znakować bezpośrednio albo pośrednio. Możliwości bezpośredniego znakowania obejmują następujące znaczniki: znaczniki radioaktywne, jak ¹²⁵I, enzymy (patent USA 3,645,090), jak peroksydaza i fosfataza alkaliczna oraz znaczniki fluorescencyjne (patent USA 3,940,475) zdolne do śledzenia zmian natężenia fluorescencji, przesunięcia długości fali, albo polaryzacji fluorescencji. Możliwości pośredniego znakowania obejmują biotynowanie jednego ze składników, a następnie wiązanie z awidyną sprzęgniętą z jednym z powyższych znaczników.

Istnieją liczne sposoby oddzielenia postaci związanej IL-B30 od postaci wolnej, albo alternatywnie, oddzielenia związku badanego związanego od nie związanego. IL-B30 można unieruchamiać na różnych matrycach, a następnie płukać. Odpowiednie matryce obejmują plastik, jak płytka do ELISA, filtry albo perełki. Patrz Coligan i in., (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene;. Inne odpowiednie techniki oddzielania obejmują, bez ograniczania, metoda z użyciem magnetyzowanych cząstek z przeciwciałami i fluoresceiną opisane w Rattle i in., (1984) Clin. Chem. 30: 1457-1461 i rozdział cząstek magnetycznych z podwójnym przeciwciałem jak opisany w patencie USA 4,659,678.

Sposoby wiązania białek albo ich fragmentów z różnymi znacznikami opisywano szczegółowo w literaturze i nie ma konieczności dyskutowania ich tu. Wiele z tych technik obejmuje zastosowanie aktywowanych grup karboksylowych przez zastosowanie karbodiimidu albo aktywnych estrów w celu wytworzenia wiązania peptydowego, tworzenie tioestrów przez reakcję grupy merkaptowej z aktywnych chlorowcem, takim jak chloroacetyl albo aktywowaną olefiną, jak maleimid itp. Białka fuzyjne mogą również znaleźć zastosowanie.

Inny aspekt diagnostyczny wynalazku obejmuje zastosowanie sekwencji oligonukleotydowych albo polinukleotydowych wziętych z sekwencji IL-B30. Sekwencje te można zastosować jako sondy w celu wykrywania ilości transkryptu IL-B30 w próbkach od pacjenta podejrzewanego o nieprawidłowy stan, np. stan zapalny albo autoagresję. Ponieważ cytokina może być znacznikiem albo mediatorem aktywacji, przydatne może być określenie liczby aktywowanych komórek w celu stwierdzenia, czy konieczna jest dalsza terapia, w celu zapobiegawczym przed pojawieniem się objawów albo przez ich zaawansowaniem. Wytwarzanie sekwencji RNA i DNA, znakowanie sekwencji, oraz korzystna wielkość sekwencji została opisana w literaturze . Patrz, np. Langer-Safer i in., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4381-4385; Caskey (1987) Science 236: 962-967 i Wilchek i in., (1988) Anal. Biochem. 171:1-32.

Zestawy diagnostyczne które również badają jakościowo i ilościowo ekspresję innych cząsteczek są również uwzględniane. Diagnoza i rokowanie może zależeć od kombinacji wielu wskaźników, zastosowanych jako znaczniki. Tak więc, Zestawy mogą badać kombinację znaczników. Patrz, np. Viallet i in., (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89-97. Inne zestawy można zastosować do badania innych podtypów komórek.

X. Izolowanie receptora IL-B30

Po wyizolowaniu liganda swoistego oddziaływania ligand-receptor, istnieją sposoby na wyizolowanie receptora. Patrz, Gearing i in., (1989) EMBO J. 8: 3667-3676. Przykładowo, można określić sposoby znakowania cytokiny IL-B30 bez zakłócania wiązania jej z receptorem. Przykładowo, znacz24

PL 197 150 B1 nik powinowactwa można poddać fuzji z końcem aminowym albo karboksylowym liganda. Znacznikiem takim może być znacznik epitopowy FLAG, albo np. domena Ig albo Fc. Bibliotekę ekspresyjną można badać przesiewowo w kierunku swoistego wiązania cytokiny, np. przez sortowanie komórek albo inne metody badań przesiewowych w kierunku populacji wyrażających składnik wiązania. Patrz, np. Ho i in., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11267-11271; Liu i in., (1994) J. Immunol. 152: 1821-1829. Alternatywnie, można zastosować metodę odpłukiwania. Patrz, np. Seed i Aruffo (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365-3369.

Techniki sieciowania białek ze znacznikiem można zastosować w celu wyizolowania składników wiązania cytokiny IL-B30. Powinno to umożliwić identyfikację białek, które swoiście oddziałują z cytokiną, np. w sposób typu receptor-ligand.

Wczesne doświadczenia przeprowadza się w celu określenia, czy znane składniki receptorów IL-6 albo G-CSF są związane z reakcją na IL-B30. Możliwe jest również, że te funkcjonalne kompleksy receptorów mogą posiadać wspólne elementy z receptorem IL-B30, np. swoistą podjednostkę receptora albo dodatkową podjednostkę receptora.

Można przeprowadzić wiele modyfikacji i odmian niniejszego wynalazku bez oddalania się od jego ducha i zakresu, co jest oczywiste dla specjalisty. Opisane tu konkretne wykonania przedstawiono jedynie przykładowo, zaś wynalazek ograniczony jest jedynie zakresem dołączonych zastrzeżeń patentowych wraz z pełnym zakresem zamienników, do których takie zastrzeżenia są upoważnione.

P r z y k ł a d y

I. Ogólne metody

Wiele ze standardowych metod zostało opisanych albo powołanych w, np. Maniatis i in., (1982) Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Ausubel i in., (wyd. 1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Willey, NY.; Ausubel i in., (1987 i suplementy); Innis i in., (wyd. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY. Sposoby oczyszczania białek obejmują takie metody jak precypitacja siarczanem amonu, chromatografia kolumnowa, elektroforeza, wirowanie, krystalizacja itp. Patrz, Ausubel i in., (1987 i suplementy); Deutscher (1990) Meth. Enzymol. tom 182 i inne tomy tej serii; Coligan i in., (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; oraz Matsudaira (wyd. 1993) A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Academic Press, San Diego, CA; oraz literatura wytwórców dotycząca zastosowania produktów służących oczyszczaniu białek, np. Pharmacia, Piscataway, NJ czy Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinacje z technikami rekombinacji umożliwiają fuzję odpowiednich segmentów (znaczników epitopowych) np. z sekwencją FLAG albo zamiennikiem, np. przez sekwencję możliwą do usunięcia przy użyciu proteazy. Patrz, np. Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) w Setlow (wyd.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98 Plenum Press, NY; Crowe i in., (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System, QIAGEN Inc., Chatsworth, CA.

Standardowe techniki immunologiczne opisano w, np. Hertzenberg i in., (wyd. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, tom 1-4, Blackwell Science; Coligan i in., (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; oraz Met. Enzymol, tomy 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 i 163. Testy na cytokiny opisano np. w Thompson (1994; wyd.) The Cytokine Handbook (wyd. 2) Academic Press, San Diego; Metcalf i Nicola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, Cambridge University Press; i Aggarwal i Gutterman (1991) Human cytokines; Blackwell Publ.

Testy naczyniowej aktywności biologicznej są dobrze znane. Obejmują one aktywność angiogenną i angiostatyczną w nowotworach albo innych tkankach, np. proliferację mięśniówki gładkiej tętnic (patrz, Koyoma i in., (1996) Cell 87: 1069-1078), adhezję monocytów do śródbłonka naczyń (patrz, McEvoy i in., (1997) J. Exp. Med. 185: 2069-2077) itp. Patrz również Ross (1993) Nature 362: 801-809; Rekhter i Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147: 668-677; Thyberg i in., (1990) Atherosclerosis 10: 966-990; i Gumbiner (1996) Cell 84: 345-357.

Testy neuronalnej aktywności biologicznej opisano np. Wouterlood (wyd. 1995) Neuroscience Protocols, modył 10, Elsevier; Methods in Neurosciences, Academic Press; i Neuromethods, Humana Press, Totowa, NJ. Metodologię dotyczącą układów rozwojowych opisano np. Meisami (wyd.) Handbook of Human Gro-wth and Developmental Biology CRC Press; oraz Chrispeels (wyd.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology, Interscience.

PL 197 150 B1

Analizy FACS opisano w Melamed i in., (1990) Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc.,

NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry, Liss NY, i Robinson i in., (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, NY.

II. Klonowanie ludzkiej IL-B30

Sekwencję genu podano na Tablicy 1. Sekwencję otrzymano z biblioteki cDNA wytworzonej z melanocytów, serca płodowego i ciężarnej macicy. Spotyka się ją również w bibliotece cDNA pochodzącego z wysepek trzustkowych. Sekwencje umożliwiają wytworzenie starterów PCR albo sond w celu określenia rozmieszczenia komórkowego genu. Sekwencje umożliwiają wyizolowanie genomowego DNA, kodującego transkrypt.

Stosując sondę albo startery PCR, badano różne tkanki albo rodzaje komórek w celu określenia rozmieszczenia komórkowego. Produkty PCR klonowano przy użyciu, np. zestawu do klonowania TA (Invitrogen). Powstałe plazmidowe cDNA sekwencjonowano z obu końców na automatycznym sekwenatorze (Applied Biosystems).

III. Ekspresja komórkowa IL-B30

Wytworzono odpowiednią sondę albo startery swoiste wobec cDNA kodującego IL-B30 naczelnych. Zwykle, sondę znakuje się, np. losowymi starterami. Ekspresja zachodzi prawdopodobnie w opisanych rodzajach komórek oraz również prawdopodobnie w wysepkach trzustkowych. Analiza metodą Southern'a: DNA (5 μο) z jednokrotnie amplifikowanej biblioteki cDNA trawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi w celu uwolnienia wstawek, puszczono na 1% żelu agarozowym i przeniesiono na membranę nylonową (Schleicher&Schuell, Keene, NH).

Próbki ludzkiego mRNA obejmowały: jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (monocyty, limfocyty T, komórki NK, granulocyty, limfocyty B), spoczynkowe (T100); jednojądrzaste komórki krwi obwodowej aktywowane anty-CD3 przez 2, 6, 12 godzin, pulowane (T101); limfocyty T, klon Mot 72 TH0, spoczynkowe (T102); limfocyty T, klon Mot 72 TH0, aktywowane anty-CD28 i anty-CD3 przez 3, 6, 12 godzin, pulowane (T103); limfocyty T, klon Mot 74 TH0, anergiczne, traktowane swoistym peptydem przez 2, 7, 12 godzin, pulowane (T104); limfocyty T, klon HY06 TH1, spoczynkowe (T107); limfocyty T, klon HY06 TH1, aktywowane anty-CD28 i anty-CD3 przez 3, 6, 12 godzin, pulowane (T108); limfocyty T, klon HY06 TH1, anergiczne, traktowane swoistym peptydem przez 2, 6, 12 godzin, pulowane (T109); limfocyty T, klon HY935 TH2, spoczynkowe (T110); limfocyty T, klon HY935 TH2, aktywowane anty-CD28 i anty-CD3 przez 3, 7, 12 godzin, pulowane (T111); Limfocyty T linii nowotworowych Jurkat i Hut78, spoczynkowe (T117); klony limfocytów T, pulowane AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, spoczynkowe (T118); limfocyty T klony losowych γδ, spoczynkowe (T119); klon limfocytów T CD28; splenocyty, spoczynkowe (B100); splenocyty, aktywowane anty-CD40 i IL-4 (B101); linie limfocytów T EBV, pulowane WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, spoczynkowe (B102); linia JY limfocytów B, aktywowana PMA i jonomycyną przez 1, 6 godzin, pulowane (B103); 20 klonów NK pulowane, spoczynkowe (K100); 20 klonów NK pulowane, aktywowane PMA i jonomycyną przez 6 godzin (K101); klon NK, pochodzący z krwi obwodowej pacjenta z białaczką LGL, traktowany IL-2 (K106); krwiotwórcz linia prekursorowa TF1, aktywowana PMA i jonomycyną przez 1, 6 godzin, pulowane (C100); linia premonocytarna U937, spoczynkowa (M100); linia premonocytarna U937, aktywowana PMA i jonomycyną przez 1,6 godzin, pulowane (M101); eluowane monocyty, aktywowane LPS, IFNy, anty-IL-10 przez 1, 2, 6, 12, 24 godziny pulowane (M102); eluowane monocyty, aktywowane LPS, IFNy, IL-10 przez 1, 2, 6, 12, 24 godziny pulowane (M106); eluowane monocyty, aktywowane LPS, IFNy, anty-IL-10 przez 4, 16 godzin pulowane (M107); eluowane monocyty, aktywowane LPS 1 godzinę (M108); eluowane monocyty, aktywowane LPS 6 godzin (M109); DC 70% CD1a+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dni, spoczynkowe (D101); DC 70% CD1a+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dni, aktywowane PMA i jonomycyną przez 1 godzinę (D102); DC 70% CD1a+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dni, aktywowane PMA i jonomycyną przez 6 godzin (D103); DC 95% CD1a+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dni, sortowane na FACS, aktywowane PMA i jonomycyną przez 1, 6 godzin pulowane (D104); DC 95% CD14+ , z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dni, sortowane na FACS, aktywowane PMA i jonomycyną przez 1, 6 godzin pulowane (D105); DC CDla+, CD86+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dni, sortowane na FACS, aktywowane PMA i jonomycyną przez 1,6 godzin pulowane (D106); DC z monocytów GM-CSF, IL-4 5 dni, spoczynkowe (D107); DC z monocytów GM-CSF, IL-4 5 dni, spoczynkowe (D108); DC z monocytów GM-CSF, IL-4 5 dni, aktywowane LPS 4, 16 godzin pulowane (D109); DC z monocytów GM-CSF, IL-4 5 dni, aktywowane TNFa, nadsącz z monocytów 4, 16 godzin pulowane (D110); Komórki nabłonkowe, niepobudzone, komórki nabłonkowe, aktywowane IL-1 β; linia mięsaka z fibroblastów płuc MRC5, aktywowana PMA i jonomycyną przez 1, 6 godzin pulowana

PL 197 150 B1 (C101); linia raka nerki CHA, aktywowana PMA i jonomycyną przez 1, 6 godzin pulowana (C102). Ekspresja transkryptu IL-B30 była bardzo wysoka w eluowanych monocytach aktywowanych LPS, IFNy, anty-IL-10 przez 4, 16 godzin pulowane (M106); eluowanych monocytach, aktywowane LPS, IFNy, anty-IL-10 przez 1, 2, 6, 12, 24 godziny pulowane (M102); eluowane monocyty, aktywowane LPS 1 godzinę (M108); eluowane monocyty, aktywowane LPS 6 godzin (M109). Ekspresja była również wysoka w (D104) i (K101). Mniejszą ekspresję wykryto w (D103), (D102), (T109), (T101), (T103), (B101), (T104), (B100), (T108), (M107) i (B103). Wykrywalną ekspresję stwierdzono w (D109), (T102), (T100), (T116), (T118), (M100), (C100), (T111), (D106), (M103), (D110), (D108), (M101), (T119), i (T108). Nie obserwowano sygnału w pozostałych próbkach.

Podsumowując, rozmieszczenie wykazuje podwyższony poziom IL-B30 w aktywowanych makrofagach, co wskazuje na udział w stanie zapalnym; aktywowanych limfocytach Th1, co wskazuje na udział w regulacji albo działaniu efektorowym w tym podtypie limfocytów pomocniczych T, szczególnie reakcji odpornościowej Th1; i aktywowanych komórkach dendrytycznych, co wskazuje na udział w prezentacji antygenu albo oddziaływaniu w centrum namnażania limfocytów T albo B z komórkami dendrytycznymi.

Próbki mysiego mRNA obejmowały: spoczynkową linię mysich fibroblastów L (C200); komórki transfekowane Braf:ER (fuzja Braf z receptorem estrogenu), kontrola (C201); naiwne limfocyty T ze śledziony, Mel114+, spoczynkowe (T209); naiwne limfocyty T ze śledziony, Mel114+, pobudzone IFNy, IL-12 i anty-IL-4, w celu spolaryzowania w kierunku Th1, eksponowane na IFNy i IL-4 przez 6, 12, 24 godziny, pulowane (T210); naiwne limfocyty T ze śledziony, Mel114+, pobudzone IL-4 i antyIFNy w celu spolaryzowania w kierunku Th2, eksponowane na IL-4 i anty-IFNy przez 6, 13, 24 godziny, pulowane (T211); limfocyty T, TH1 (Mel114, jasne, komórki CD4+ ze śledziony, polaryzowane przez 7 dni IFNy i anty-IL-4; T200); limfocyty T, TH1 (Mel114, jasne, komórki CD4+ ze śledziony, polaryzowane przez 7 dni anty-IFNy i IL-4; T201); limfocyty T 3x silnie spolaryzowane TH1, od transgenicznych Balb/C (patrz, Openshaw i in., (1995) J. Exp. Med. 182: 1357-1367) aktywowane anty-CD3 przez 2, 6, 24 godziny, pulowane, T202); limfocyty T 3x silnie spolaryzowane TH2, od transgenicznych Balb/C, aktywowane anty-CD3 przez 2, 6, 24 godziny, pulowane, T203); limfocyty T 3x silnie spolaryzowane TH1, od transgenicznych C57Bl/6, aktywowane anty-CD3 przez 2, 6, 24 godziny, pulowane, T212); limfocyty T 3x silnie spolaryzowane TH2, od transgenicznych C57Bl/6, aktywowane anty-CD3 przez 2, 6, 24 godziny, pulowane, T213); limfocyty T silnie spolaryzowane TH1 (naiwne limfocyty T CD4+ od transgenicznych Balb/c 3x polaryzowane IFNy, IL-12 i anty-IL-4; pobudzane IGIF, IL-12 i anty-IL-4 przez 6, 12, 24 godziny, pulowane); CD44- CD25+ pre-limfocyty T, sortowane z grasicy (T2004); Klon limfocytów TH1, D1.1, spoczynkowy, przez 3 tygodnie po ostatnie stymulacji antygenem (T205); klon limfocytów TH1, D1.1, pobudzany przez 15 godzin 10 ug/ml ConA (T206); klon limfocytów TH2, CDC35, spoczynkowy, przez 3 tygodnie po ostatnie stymulacji antygenem (T207); klon limfocytów TH2, CDC35, pobudzany przez 15 godzin 10 ug/ml ConA (T208); linia nie pobudzonych limfocytów B, CH12 (B201); dojrzałe limfocyty B białaczkowej linii komórkowej A20 (B200); nie pobudzone, wielkie limfocyty B ze śledziony (B202); limfocyty B z całej śledziony, aktywowane LPS (B203); komórki dendrytyczne ze śledziony, wzbogacone metrizamidem, spoczynkowe (D200); komórki dendrytyczne ze szpiku, spoczynkowe (D201); nie pobudzone komórki dendrytyczne ze szpiku, zubożone przez traktowanie, anty-B220, anty-CD3 i anty-klasa II, hodowane w GM-CSF i IL-4 (D202); komórki dendrytyczne ze szpiku, zubożone przez traktowanie, anty-B220, anty-CD3 i anty-klasa II, hodowane w GM-CSF i IL-4, pobudzane anty-CD40 przez 1, 5 dni, pulowane (D203); linia komórkowa monocytów RAW 264.7, aktywowanych LPS 4 godziny (M200); makrofagi otrzymane ze szpiku przy użyciu GM-CSF i M-CSF (M201); makrofagi otrzymane ze szpiku przy użyciu GM-CSF, pobudzane LPS, IFNy i IL-10 przez 24 godziny (M205); makrofagi otrzymane ze szpiku przy użyciu GM-CSF, pobudzane LPS, IFNy i anty-IL-10 przez 24 godziny (M206); makrofagi otrzewnowe (M207); linia komórkowa makrofagów J774, spoczynkowa (M202); linia komórkowa makrofagów J774, + LPS + anty-IL-10 0,5, 1,3, 6, 12 godzin, pulowane (M203); linia komórkowa makrofagów J774, + LPS + IL-10 0,5, 1,3, 6, 12 godzin, pulowane (M204); nie pobudzona linia komórkowa komórek tucznych MC-9 i MCP-12 (M208); linia komórkowa unieśmiertelnionych komórek śródbłonka pochodząca z komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu, nie pobudzona (E200); linia komórkowa unieśmiertelnionych komórek śródbłonka pochodząca z komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu, pobudzona przez noc TNFa (E201); linia komórkowa unieśmiertelnionych komórek śródbłonka pochodząca z komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu, pobudzona przez noc TNFa (E202); linia komórkowa unieśmiertelnionych komórek śródbłonka pochodząca z komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu, pobudzona przez noc TNFa i IL-10

PL 197 150 B1 (E203); cała aorta od myszy C57BI/6 typu dzikiego; cała aorta od 5-miesięcznych myszy ApoE KO (X207); cała aorta od 12-miesięcznych myszy ApoE KO (X207) grasica typu dzikiego (O214); cała grasica, rag-1 (O208); cała nerka, rag-1 (O209); cała nerka, mysz NZ B/W i całe serce, rag-1 (O202). Silny sygnał wykryto w monocytach (M200), limfocytach T (T212) i limfocytach T silnie spolaryzowanych TH1 (naiwne limfocyty T CD4+ od transgenicznych Balb/c 3x polaryzowane IFNy, IL-12 i anty-IL-4; pobudzane IGIF, IL-12 i anty-IL-4 przez 6, 12, 24 godziny, pulowane). Wykrywalny sygnał stwierdzono w limfocytach T (T202), (T201), (T200), makrofagach (M203), (M202), (M204), komórkach śródbłonka (E201) i makrofagach (M206). Nie stwierdzono sygnału w innych próbkach. Ekspresja w mysich monocytach linii RAW 264.7 sugeruje naturalne źródło białka.

IV. Mapowanie chromosomalne IL-B30.

Zastosowano izolowany cDNA kodujący IL-B30. Mapowanie chromosomalne przeprowadzono standardową metodą. Patrz, np. BIOS Laboratories (New Haven, CT) i sposoby stosowania panelu hybryd mysich komórek somatycznych z PCR. Pewne dowody sugerują, że mysi gen IL-B30 mapuje się na chromosomie 10.

V. Oczyszczanie białka IL-B30

Liczne transfekowane linie komórkowe badano przesiewowo w kierunku silnej ekspresji cytokiny w porównaniu z innymi komórkami. Badano różne linie komórkowe i selekcjonowano pod względem korzystnych właściwości. Naturalną IL-B30 można izolować z różnych źródeł naturalnych albo pozyskiwać przez ekspresję z transformowanych komórek stosując odpowiedni wektor ekspresyjny. Oczyszczanie wyrażonego białka otrzymano standardowymi procedurami, albo polepszyć oczyszczanie z dużą skutecznością z lizatów i nadsączy komórkowych przy zastosowaniu metod inżynierii. W takich procedurach można wykorzystać segmenty FLAG i His6. Alternatywnie, można zastosować chromatografię powinowactwa ze swoistymi przeciwciałami, patrz, niżej.

Białko wytwarza się, zależnie od potrzeb w E. coli, komórkach owadów, albo układach ekspresyjnych ssaków.

VI. Izolowanie homologicznych genów IL-B30 cDNA IL-B30 albo odpowiednie sekwencje z innych gatunków, można zastosować jako sondę hybrydyzacyjną do badania przesiewowego biblioteki z pożądanego źródła, np. bibliotekę cDNA komórek naczelnych. Stosując sondę, można zbadać wiele różnych gatunków zarówno pod względem surowości koniecznej do hybrydyzacji, jak i obecności. Odpowiednie warunki hybrydyzacji stosuje się w celu selekcji klonów wykazujących hybrydyzację krzyżową.

Badanie przesiewowe przy użyciu zdegenerowanych sond opartych na sekwencjach peptydowych, powinno również umożliwić izolowanie odpowiednich klonów. Alternatywnie, zastosowanie odpowiednich starterów do badania przesiewowego przez PCR powinno wzbogacić odpowiednie klony kwasu nukleinowego.

Podobne metody stosuje się w celu wyizolowania odmian gatunkowych, polimorficznych albo allelicznych. Odmiany gatunkowe izoluje się stosując hybrydyzację krzyżową opartą na izolowaniu izolatów pełnej długości albo fragmentów z jednego gatunku jako sondy.

Alternatywnie, można zastosować przeciwciała wywołane przeciwko ludzkiej IL-B30 do badania przesiewowego w kierunku komórek, które wyrażają białko reagujące krzyżowo z odpowiedniej np. biblioteki cDNA. Oczyszczone białko albo określone peptydy są przydatne do wytworzenia przeciwciał metodami standardowymi, jak opisano wyżej. Syntetyczne peptydy albo oczyszczone białka prezentuje się układowi odpornościowemu w celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych albo poliklonalnych. Patrz, Coligan i in., (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; oraz Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press. Powstałe przeciwciała stosuje się do badania przesiewowego, oczyszczania albo diagnostyki, jak opisano.

VII. Wytwarzanie przeciwciał swoistych wobec IL-B30

Peptydy syntetyczne albo oczyszczone białka prezentuje się układowi odpornościowemu w celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych albo poliklonalnych. Patrz, Coligan i in., (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; oraz Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, SCH Press. Można wytworzyć surowice poliklonalne albo hybrydoma. W odpowiednich sytuacjach reagent wiążący jest znakowany jak opisano wyżej, np. fluorescencyjnie albo w inny sposób albo unieruchomiony na substracie w celu odpłukiwania. W celu wytworzenia wybiórczych reagentów dostępne są techniki immunoselekcji i pokrewne.

PL 197 150 B1

VIII. Badanie zasięgu aktywności biologicznej

Aktywności biologiczne IL-B30 badano w oparciu o homologię sekwencji i struktury pomiędzy IL-B30 i IL-6 i G-CSF. Wstępne testy wykazały działanie biologiczne IL-6 i G-CSF.

A. Wpływ na proliferację komórek

Wpływ na proliferację różnych komórek badano stosując różne rozcieńczenia cytokiny. Przeprowadzono analizę reakcji na dawkę, w kombinacji z pokrewnymi cytokinami IL-6 i G-CSF itp.

B. Wpływ na ekspresję powierzchniową cząsteczek u ludzkich monocytów

Monocyty oczyszczono przez selekcję negatywną z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej normalnych zdrowych dawców. Pokrótce, 3X10⁸ komórek jednojądrzastych wirowanych na Ficoll inkubowano na lodzie z mieszaniną przeciwciał monoklonalnych (Becton Dickinson, Mountain View, CA) obejmującą, np. 200 μΙ a CD2 (Leu-5A), 200 μΙ a CD3 (Leu-4), 100 μΙ a CD8 (Leu 2a), 100 μΙ a CD19 (Leu-12), 100 μΙ a CD20 (Leu-16), 100 μΙ a CD56 (Leu-19), 100 μΙ a CD67 (IOM 67; Immunotech, Westbrook, ME) i przeciwciało przeciwko glikoforynie (10F7MN, ATCC, Rockville, MD). Komórki związane z przeciwciałami płucze się i inkubuje z IgG owcy przeciwko mysim przeciwciałom, sprzęgniętym z perełkami magnetycznymi (Dynal, Oslo, Norwegia) w stosunku perełek do komórek równym 20:1. Komórki związane z przeciwciałami oddziela się od monocytów przez przyłożenie pola magnetycznego. Następnie monocyty hoduje się w pożywce Yssel (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) zawierającej 1% ludzką surowicę AB w obecności albo pod nieobecność IL-B30, IL-6, G-CSF albo ich kombinacji.

Analizę ekspresji cząsteczek powierzchniowych można przeprowadzić przez bezpośrednią immunofluorescencję. Przykładowo, 2X10⁵ oczyszczonych ludzkich monocytów inkubuje się w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) zawierającym 1% surowicę ludzką na lodzie przez 20 minut. Komórki wiruje się przy 200 xg. Komórki zawiesza się w 20 ml mAb znakowanych FITC albo PE. Po następnych 20 minutach inkubacji na lodzie, komórki przepłukano PBS zawierającym 1% surowice ludzką, a następnie dwukrotnie samym PBS. Komórki utrwalono w PBS zawierającym 1% paraformaldehyd i analizowano na cytometrze przepływowym FACScan (Becton Dickinson; Mountain View, CA). Przykładowo zastosowano mAb: CD11b (anty-mac1), CD11c (anty-gp150/95), CD14 (Leu-M3), CD54 (Leu 54), CD80 (anty-BB1/B7), HLA-DR (L243) z becton Dickinson i CD86 (FUN 1; Pharmingen), CD64 (32.2 Medarex), Cd40 (mAb89, Schering-Plough Francja).

C. Wpływ IL-B30 na wytwarzanie cytokin przez ludzkie monocyty

Ludzkie monocyty izolowano jak to opisano, i hodowano w pożywce Yssel (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) zawierającej 1% ludzką surowicę AB w obecności albo pod nieobecność IL-B30 (rozcieńczenie 1/100 materiału wyrażanego przez bakulowirus). Oprócz tego, monocyty pobudza się LPS (E. coli 0127:B8, Difco) w obecności albo pod nieobecność IL-B30 i oznaczano stężenie cytokin w nadsączu przez ELISA (IL-1 β, IL-6, TNFa, GM-CSF i IL-10).

W celu wewnątrzplazmatycznego znakowania na cytokiny, monocyty hodowano (1 milion/ml) w pożywce Yssel w obecności albo pod nieobecność IL-B30 i LPS (E. coli 0127:B8 Difco) i 10 mg/ml Brefeldin A (Epicentre Technologies, Madison, WI) przez 12 godzin. Komórki płukano w PBS i inkubowano z 2% formaldehydem/PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki płukano, zawieszano w buforze do permeabilzacji (0,5% saponina (Sigma) w PBS/BSA (0,5%)/azydek (1 mM)) i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Komórki (2x10⁵) wirowano i zawieszano w 20 ml mAb przeciwko cytokinie sprzęgniętych bezpośrednio, rozcieńczonych w buforze do permeabilizacji 1:10, przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zastosowano następujące przeciwciała: IL-1a-PE (364-3B3-14); IL-6-PE (MQ2-13A5); TNFa-PE (mAb11); GM-CSF-PE (BVD2-21C11) i IL-12-PE (C11.5.14; Pharmingen, San Diego, CA). Następnie, komórki płukano dwukrotnie w buforze do permeabilizacji i raz w PBS/BSA/Azydku i analizowano na cytometrze przepływowym (Becton Dickinson).

D. Wpływ IL-B30 na proliferację jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC)

Całkowite PBMC izolowano z kożuszków leukocytarnych zdrowych dawców przez wirowanie na

Ficoll-Paque, jak opisano (Boyum i in.). PBMC hodowano w 200 μΙ pożywki Yssel, zawierającej 1% ludzką surowicę AB w płytce 96-studzienkowej (Falcon, Becton Dickinson, NJ) w obecności albo pod nieobecność IL-B30. Komórki hodowano same albo w kombinacji z 100 U/ml IL-2 (RD Systems) przez 120 godzin. ³H-tymidynę dodano (0,1 mCi) na ostatnie 6 godzin hodowli i oznaczano jej włączanie przez zliczanie scyntylacyjne.

Białka natywne, rekombinowane i fuzyjne bada się w kierunku aktywności agonistycznej i antagonistycznej w różnych układach testów biologicznych, np. na limfocytach T, limfocytach B, komórPL 197 150 B1 kach NK, makrofagach, komórkach dendrytycznych, progenitorach krwiotwórczych itp. Z powodu pokrewieństwa strukturalnego IL-6 i G-CSF należy analizować te aktywności.

IL-B30 analizowano pod względem aktywności agonistycznej i antagonistycznej na transfekowanych komórkach wyrażających receptory IL-6 i G-CSF oraz kontrolnych (patrz, np. Ho i in., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11267-11271; HO i in., (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 5043-5053; i Liu i in., (1994) J. Immunol. 152: 1821-1829.

IL-B30 badano pod względem wpływu na aktywację makrofagów/komórek dendrytycznych i prezentację antygenu, wytwarzanie cytokin przez limfocyty T i proliferację w reakcji na antygen albo bodziec allogeniczny. Patrz, np. de Waal Malefyt i in., (1991) J. Exp. Med. 174: 1209-1220; de Waal Malefyt i in., (1991) J. Exp. Med. 174: 915-924; Fiorentino i in., (1991) J. Immunol. 147: 3815-3822; Fiorentino i in., (1991) J. Immunol. 146: 3444-3451 i Groux i in., (1996) J. Exp. Med. 184: 19-29.

IL-B30 powinno się również zbadać pod względem wpływu na pobudzenie komórek NK. Testy mogą być oparte na np. Hsu i in., (1992) Internat. Immunol. 4: 536-569 i Schwartz i in., (1994) J. Immunother. 16: 95-104.

Wpływ na wzrost i różnicowanie limfocytów B można analizować np. metodyką opisaną np. w Defrance i in., (1992) J. Exp. Med. 175: 671-682; Rousset i in., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 1890-1893; w tym testy przełączania IgG2 i IgA2. Należy zaznaczyć, że w przeciwieństwie do nadsączy COS7, nadsącze NIH3T3 i COP nie zakłócają testów limfocytów B.

IX. Wytwarzanie i analiza zwierząt zmienionych genetycznie

Myszy transgeniczne można wytworzyć standardową metodą. Zwierzęta takie są przydatne do określania efektów delecji genu w konkretnych tkankach albo w całym organizmie. Może to dostarczyć informacji o rozwoju zwierzęcia albo konkretnych tkanek na różnych etapach. Ponadto, można badać wpływ na różne reakcje bodźców biologicznych. Patrz, Hogan i in., (1995) Manipulating the mouse Embryo: A Laboratory Manual (wyd. 2) CSH Laboratory Press.

Myszy transgeniczne wytworzono i o ile przeżywały poród, zwykle ginęły w ciągu kilku tygodni. Konstrukt oparty jest na promotorze aktynowym ze wzmacniaczem CMV, co powinno doprowadzić do rozległej i silnej ekspresji. Myszy, podobnie jak transgeniczne myszy IL-6 były karłowate. Ponadto miały wzdęte powłoki brzuszne, zapalenie żołądka i jelit, naciek komórkowy w wątrobie i zwykle padały przed 50 dniem życia. Myszy nie były płodne. Drugi podtyp myszy transgenicznych wykazywał lżejszy fenotyp i obecnie trwają próby ich rozmnożenia.

Określono strukturę genomową mysiej IL-B30. Opracowano strategię wytworzenia myszy ze znokautowanym genem IL-B30 i rozpoczęto tworzenie konstruktu.

Wszystkie cytowane tu odnośniki włączone są jako odnośniki w całości.

Id. Sekw. nr 1 jest sekwencją nukleotydową IL-B30 naczelnych;

Id. Sekw. nr 2 jest sekwencją aminokwasową IL-B30 naczelnych;

Id. Sekw. nr 3 jest sekwencją nukleotydową IL-B30 gryzoni;

Id. Sekw. nr 4 jest sekwencją aminokwasową IL-B30 gryzoni;

Id. Sekw. nr 5 jest świńską IL-B30;

Id. Sekw. nr 6 jest bydlęcym G-CSF;

Id. Sekw. nr 7 jest kocim G-CSF;

Id. Sekw. nr 8 jest ludzkim G-CSF;

Id. Sekw. nr 9 jest mysim G-CSF;

Id. Sekw. nr 10 jest IL-6 wydry;

Id. Sekw. nr 11 jest kocią IL-6;

Id. Sekw. nr 12 jest ludzką IL-6;

Id. Sekw. nr 13 jest IL-6 owcy;

Id. Sekw. nr 14 jest mysią IL-6;

Id. Sekw. nr 15 jest kurzym MGF;

Id. Sekw. nr 16 jest wirusową IL-6 KSHV wirusa herpes mięsaka Kaposiego.

PL 197 150 B1

LISTA SEKWENCJI (1) INFOMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Schering Corporation (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Cytokina ssaków, pokrewne reagenty (iii) LICZBA SEKWENCJI: 16 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Schering Corporation (B) ULICA: 2000 Galloping Hill Road (C) MIASTO: Kenilworth (D) STAN: New Jersey (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki Północnej (F) KOD: 07033-0530 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: Power Macintosh 7600/120 (C) SYSTEM OPERACYJNY: Windows (D) OPROGRAMOWANIE: MS Word (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA: 24 czerwca 1998 (C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/900,905 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 25 lipca 1997 (C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJE O RZECZNIKU:

(A) NAZWA: Thampoe, Immac J.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 36,322 (C) NUMER SPRAWY: DX0758K1 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: (908) 298-5061 (B) TELEFAX: (908) 298-5388 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI Nr: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 570 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 1..567 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mat_peptide (B) LOKALIZACJA: 64..567

PL197 150 Β1

(xi)

OPIS

SEKWENCJI:

IDENTYFIKATOR SEKW.

NR:

1:

ATG

CTG

GGG

AGC

AGA

GCT

GTA

ATG

CTG

TTG

CTG

CCC

TGG

ACA

48

Met

Leu

Gly

Ser

Arg

Ala

Val

Met

Leu

Pro

Trp

Thr

_ 1 '

-20

-15

-10

GCT

CAG

GGC

AGA

GCT

GTG

CCT

GGG

GGC

AGC

CCT

GCC

TGG

ACT

CAG

96

Ala

Gin

Gly

Arg

Ala

Val

Pro

Giy

Gly

Ser

Pro

Ala

Trp

Thr

Gin

-5

1

5

10

TGC

CAG

CTT

TCA

CAG

AAG

CTC

TGC

ACA

CTG

GCC

TGG

AGT

GCA

CAT

144

Cys

Gin

Leu

Ser

Gin

Lys

Leu

Cys

Thr

Leu

Ala

Trp

Ser

Ala

His

15

20

25

CCA

CTA

GTG

GGA

CAC

ATG

GAT

CTA

AGA

GAA

GAG

GGA

GAT

GAA

GAG

ACT

192

Pro

Leu

Val

Gly

His

Met

Asp

Leu

Arg

Glu

Gly

Asp

Glu

Thr

30

35

40

AZA

AAT

GAT

CTT

CCC

CAT

ATC

CaG

TGT

GGA

GAT

GGC

TGT

GAC

CCC

CAA

240

7hi

Asn

Asp

Val

Pro

His

Ile

Gir,

Lys

Gly

Asp

Gly

Cys

Asp

Pro

Gin

45

Γ *' 0

55

GGA

AGG

GAC

AAC

ACT

CAG

Tl 7

- J _

TTC^:

CAA.

AGG

ATC

CAC

CAG

GGT

28?

Gly

Leu

Arg

Asp

Asn

Ser

Gir.

Pne-

Cys

Leu

Gin

Arg

Ile

His

Gin

Gly

60

€5

70

75

CTG

ATT

TTT

TAT

GAG

AAG

*_ A

CTA

GGA

TCG

GAT

ATT

TTC

ACA

GGG

GAG

336

Leu

Ile

Phe

Tyr

Glu

Lys

Leu

Giy

Ser

Asp

Ile

Phe

Thr

Gly

Glu

ec

85

90

i- 4

CTG

CTC

CCT

GAT

AGC

CCT

GTG

GCG

CAG

CTT

CAT

GCC

TCC

CTA

384

Pro

Ser

Leu

Pro

Asp

Ser

Prc

Val

Ala

Gin

Leu

His

Ala

Ser

Leu

95

100

105

CTG

GGC

CTC

AGC

CAA

CT¹

CTG

CAG

GAG

GGT

CAC

TGG

GAG

ACT

432

Leu

Gly

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Pro

Glu

Gly

His

Trp

Glu

Thr

110

115

120

CAG

ATT

CCA

AGC

CTC

AGT

CCC

AGC

CAG

CCA

TGG

CAG

CGT

CTC

CTT

480

Gir.

Gin

Ile

Pro

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Gir.

Pro

Trp

Gin

Arg

Leu

12 5

130

135

PL 197 150 Β1

528

CTC CGC Leu Arg

TTC Phe GTC Val

AAA Lys TTT Phe

ATC Ile GCC Ala 160

CTT CGC Leu Arg 145

AGC Ser GCA Ala

CTC Leu GCA Ala

CAG GCC Gin Ala 150

TTT GTG GCT GTA

GCC Ala 155

Phe AGT Ser

Val CCC Pro

Ala Val TAA

140 GCC Ala

CGG Arg

CAT His

GGA Gly

ACC Thr 165

CTG Leu

(2)

INFORMACJA DLA

IDENTYFIKATORA SEKWENCJI

NR:

2:

(i)

i CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

(A)

DŁUGOŚĆ

: 189 aminokwasów

(B)

TYP

: aminokwas

(C)

TOPOLOGIA:

liniowa

(ii]

1 RODZAJ

CZĄSTECZKI:

białko

<xi]

I OPIS SEKWENCJI

: IDENTYFIKATOR

SEKW

. NR

: 2:

Met

Leu

Gly

Ser

Arg

Ala

Val

Met

Leu

Pro

Trp

Thr

-21

-20

-15

-10

Ala

Gin

Gly

Arg

Ala

Val

Pro

Gly

Ser

Pro

Ala

Trp

Thr

Gin

-5

1

5

10

Cys

Gin

Leu

Ser

Gin

Lys

Leu

Cys

Thr

Leu

Ala

Trp

Ser

Ala

His

15

20

25

Pro

Leu

Val

Gly

His

Met

Asp

Leu

Arg

Glu

Gly

Asp

Glu

Thr

30

35

40

Thr

Asn

Asp

Val

Pro

His

Ile

Gin

Cys

Gly

Asp

Gly

Cys

Asp

Pro

Gin

45

50

55

Gly

Leu

Arg

Asp

Asn

Ser

Gin

Phe

Cys

Leu

Gin

Arg

Ile

His

Gin

Gly

60

€5

70

75

Leu

Ile

Phe

Tyr

Glu

Lys

Leu

Gly

Ser

Asp

Ile

Phe

Thr

Gly

Glu

80

85

90

Pro

Ser

Leu

Pro

Asp

Ser

Pro

Val

Ala

Gin

Leu

His

Ala

Ser

Leu

95

100

105

Leu

Gly

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Pro

Glu

Gly

His

Trp

Glu

Thr

110

115

120

C-ln

Gir.

Ile

Pro

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Gin

Pro

Trp

Gin

Arg

Leu

125

130

135

Leu

Arg

Phe

Lys

Ile

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Ala

Phe

Val

Ala

Val

Ala

140

145

150

155

Aid

Arg

Val

Phe

Ala

His

Gly

Aia

Aid

Thr

Leu

Ser

Pro

160

165

2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3

570 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(Ał DŁUGOŚĆ: 1203 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 197 150 B1 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWiAKLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 113..700 (iX; CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mat_peptide (B) LOKALIZACJA: 17 6 . .700 (xi) OPIS SEKWNCJI: IDECTYFIIATOR SEKW. NR: 3:

CGCTTAGAAG TCGGACTACA GAGTTAGACT CAGAACCAAA GGAGGTGGAT AGGGGGTCCA 60

CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAA GCAGGGAACA AG ATG 115

Met -21

CTG Leu -20

GAT Asp

TGC Cys

AGA Arg

GCA Ala

GTA Val -15

ATA Ile

ATG Mec

CTA Leu

TGG Trp

CTG Leu -10

TTG Leu

CCC Pro

TGG Trp

GTC Val

ACT Thr -1

163

CAG

GGC

CTG

GCT

GTG

CCT

AGG

AGT

AGC

AGT

CCT

GAC

TGG

GCT

CAG

TGC

211

Gin

Gly

Leu

Ala

Vai

Pro

Arg

Ser

Pro

Asp

Trp

Ala

Gin

Cys

1

10

CAG

JAG

CTC

TCT

CGG

AAT

CTC

TGC

ATG

CTA

GCC

TGG

AAC

GCA

CAT

GCA

219

Gin

Leu

Ser

Arg

As n

Leu

Cys

Met

Leu

Ala

Trp

Asn

Ala

His

Ala

11

20

21

CCA

GCG

GGA

CAT

ATG

AAT

CTA

AGA

GAA

GAG

GAT

GAA

GAG

ACT

307

Pro

Ala

Gly

His

Met

Asn

Leu

Arg

Glu

Asp

Glu

Thr

30

31

40

AAA

AAT

GTG

CCC

CGT

ATC

CAG

TGT

GAA

GAT

GGT

TGT

GAC

CCA

CAA

311

Lyi

Asn

Asn.

Val

Pro

Ar?

Ile

Gin

Cys

Glu

Asp

Gly

Cys

Asp

Pro

Gin

41

SC

60

GgA

CTC

AAG

GAC

AAC

CAG

TTC

TGC

TTG

CAA

AGG

ATC

CGC

CAA

GGT

403

Cly

Leu

Lys

Asp

Asn

Ser

Gin

Phe

Cys

Leu

Gin

Arg

Ile

Arg

Gin

Gly

61

70

71

CTG

GCT

TTT

TAT

AAG

CAC

CTG

CT?

GAC

TCT

GAC

ATC

ttc

AAA

GGG

GAG

411

Leu

Ala

Phe

Tyr

Lys

His

Leu

Asp

Ser

Asp

Ile

Phe

Lys

Gly

Glu

80

es

90

CCT

GCT

CTA

JTJ

CCT

GAT

AGC

CCC

ATG

GAG

CAA

CTT

CAC

ACC

TCC

CTA

499

Pro

Ala

Leu

Pro

Asp

Ser

Pro

Met

Glu

Gin

Leu

His

Thr

Ser

Leu

91

IGO

101

s_. · M

GGA

CTC

AGC

CAA

CTC

CAG

CCA

GAG

GAT

CAC

CCC

CGG

GAG

ACC

14

Leu

Gly

Leu

Ser

Gin.

Leu

Gm

Pro

Glu

Asp

His

Pro

Arg

Glu

Thr

110

111

120

CAA

CAG

ATG

CCC

AGC

CTG

AG .

TC.

AGT

CAG

TGG

CAG

CGC

CCC

CTT

193

Gin

Gir*.

Met

Pro

Ser

Leu

Ser

Gin

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

121

130

131

140

CTC

CGT

TCC

AAG

A TC

CTT

CGA

AGC

CTC

CAG

GCC

TTT

TTG

GCC

ATA

GCT

64 3

Leu

Ara

Ser

Lys

Ilf

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Ala

Phe

Leu

Ala

Ile

Ala

141

110

111

PL 197 150 B1

GCC CGG GTC TTT GCC CAC GGA GCA GCA ACT CTG ACT GAG CCC TTA GTG 691

Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val

160 165 170

CCA ACA GCT TAAGGATGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA 740

Pro Thr Ala

175

ATCTATCAGC CCAGACATCT ACCAGTGJTT TTACCCCTTT GGACTTGTGC TG TTC TTG TT 800

TCGTTTGTTT TGCGTGAAGG GC^C^^C^CA CTTTATTTTA GAG^^GA^ 860

GTGCAGGCTG CTGGCTTGCG AJACTGGTTT GGCATCATTA ATA^GTCTC GAGCCCTTCG 920

CCTTGG^GC GGGCTTGCTG CTGCGT<TGG T^J^^^^AAA (CCCGCGGTGG CATCGAGWA 980

CTGTGTGATT ACCCTGTGCA TCAGCGATTC GCGCCTTTTG CTTTGGCCAT TATCTOTiAG 1040

ATATACTAGT TCTGGGGTTC A^,:TTTCCTTTC CCGGGGTGG TCTGGCyTACT GTGCAGTTGC 1100

TCTGTTCTCC TGTCTGCCGC TCTCTACATCeCCGOTCTTG CCCTCAGTTC TCATCGTTTT 1160

TTGTCCCTTA GAATCATTCG GTTTTTCTTC TTGATTCGTT TAT 1203 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWETCJI NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 196 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) TOPOLOGIA: liniowa ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SE^WNCCI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4:

Met

Leu -2C

Asp

Cys

Arg

da

Val _15

He

Met

Leu

Trp

Leu -10

Leu

Pro

Trp

Val

Thr

Gin

Gly

Leu

A ιά

tal

Pro

Arg

Ser

Pro

Asp

Trp

Ala

Gin

-5

¹

5

10

Cys

Gin

Leu

Se:

Arg

Ar n

Le u

J

Met

Leu

A..a

Trp

Asn

Ala

His

15

:c

25

Ala

Pro

d a

Gly

His

Met

Asr.

Leu

Arg

Glu

Asp

Glu

30

35

40

Thr

Lys

As:'.

Asn

Va*

Pro

Arg

Ile

Gin

Cys

Glu

Asp

Gly

Cys

Asp

Pro

45

50

55

Cln

Gly

Leu

Lys

Asp

Asn

Ser

Gir.

Phe

Cys

Leu

Gin

Arg

Ile

Arg

Gin

6 0

£5

70

75

dy

Leu

da

Phe

Tyr

L*ys

His

Leu

Asp

Ser

Asp

Ile

Phe

Lys

Gly

8 0

65

90

Glu

Pro

Ala

Leu

Prc

Asp

Ser

Pro

Met

Glu

Gin

Leu

His

Thr

Ser

95

100

105

Leu

Gly

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

His

Pro

Arg

Glu

110

115

120

PL 197 150 B1

Thr

Gin 125

Gin

Met

Pro

Ser

Leu 130

Ser

Gin

Gin 135

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

Arg

Ser

Lys

Ile

Leu

Arg

Ser

Leu

Gin

Ala

Phe

Leu

Ala

Ile

140

145

150

155

Ala

Arg

Val

Phe

Ala

His

Gly

Ala

Thr

Leu

Thr

Glu

Pro

Leu

160

165

170

Val Pro Thr Ala 175 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 102 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: ]^:^niowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWNCCJ: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5:

Ser 1

Cys

Leu

Gin

Arg 5

Ile

His

Gin

Gly

Leu 10

Val

Phe

Tyr

Glu

Lys 15

Leu

Gly

Ser

Asp 20

He

Phe

Thr

Gly

Glu 25

Pro

Ser

Leu

His

Pro 30

Asp

Gly

Ser

Va]

Gly 35

Gin

Leu

His

Ala

Ser 40

Leu

Gly

Leu

Arg 45

Gin

Leu

Gin

Pro 50

Glu

Gly

Kis

Trp 55

Glu

Thr

Giu

Gin

Thr 60

Pro

Ser

Pro

Ser

Pro 65

Ser

Gin

Pro

Trp

Gin 70

Arg

Leu

Arg 75

Leu

Lys

He

Leu

Arg 80

Ser

Leu

Gin

Ala

Phe E5

Val

A iń

Val

Ala

Ala 9C

Arg

Va]

Phe

Ala

His 95

Gly

Ala

Thr

Leu 100

Ser

Gin

12) INFORMACJA, DLA IDENTYFIIATORA SEKWENCJI NR: 6 :

|i) CHARAKTERYSTYKA SE-KWJNCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 4 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)) RODZAJ peptyd (xi) OPIS SERWE^J!: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6

PL197 150 Β1

Thr 1

Pro

Leu

Gly

Pro 5

Ala

Arg

Ser

Leu

Pro 10

Gin

Ser

Phe

Leu

Leu 15

Lys

Cys

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

Ile

Gin

Ala

Asp

Gly

Ala

Glu

Leu

Gin

20

25

30

Glu

Arg

Leu

Cys

Ala

His

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Leu

Met

35

40

45

Leu

Arg

His

Ser

Leu

Gly

Ile

Pro

Gin

Ala

Pro

Leu

Ser

Cys

50

55

60

Ser

Gin

Ser

Leu

Gin

Leu

Arg

Gly

Cys

Leu

Asn

Gin

Leu

His

Gly

65

70

75

80

Gly

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Ala

Gly

Ile

Ser

85

90

95

Pro

Glu

Leu

Ala

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Thr

Asp

100

105

110

Phe

Ala

Thr

Asr.

Ile

Trp

Leu

Gin

Met

Glu

Asp

Leu

Gly

Ala

Pro

115

120

125

Ala

Val

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Thr

Phe

Thr

Ser

Ala

Phe

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Ser

Gin

Leu

His

Arg

Phe

145

150

155

160

Leu

Glu

Leu

Ala

Tyr

Arg

Gly

Leu

Arg

Tyr

Leu

Ala

Glu

Pro

165

170

INFORMACJA DLA ;

IDENTYFIKATORA SEKWENCJI

NR: '

7 :

ii)

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

(A)

DŁUGOŚĆ:

: 174 aminokwasy

(B)

TYP:

: aminokwas

(C)

NICIOWOŚĆ: nie istotna

(D)

TOPOLOGIA: liniowa

RODZAJ

CZĄSTECZKI i

peptyd

OPIS SEKWENCJI:

: IDENTYFIKATOR SEKW.

, NR:

7:

Thr 1

Pro

Leu

Gly

Prc Thr Ser c.

Ser

Leu

Pro 10

Gin

Ser

Phe

Leu

Leu 15

Lys

Cys

Leu

Glu

Gir. 20

Val Arę Lys

Va 1

Gin 25

Ala

Asp

Gly

Thr

Ala 30

Leu

Gin

Glu

Arg

Leu 35

Cys

Ala Ala His

Lys 40

Leu

Cys

His

Pro

Glu 45

Glu

Leu

Val

Leu

Leu 50

Gly

His

A. i a Leu Gly 55

Ile

Pro

Gin

Ala

Pro 60

Leu

Ser

Cys

PL 197 150 B1

Ser 65

Ser

Gin

Ala

Leu

Gin 70

Leu

Thr

Gly

Cys

Leu 75

Arg

Gin

Leu

His

Ser 80

Gly

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Ala

Gly

Ile

Ser

85

90

95

Pro

Glu

Leu

Ala

Pro

Thr

Leu

Asp

Met

Leu

Gin

Leu

Asp

Ile

Thr

Asp

100

105

110

Phe

Ala

Ile

Asn

Ile

Trp

Gin

Met

Glu

Asp

Val

GLy

Met

Ala

Pro

115

120

125

Ala

Val

Pro

Thr

Gin

Gly

Thr

Met

Pro

Thr

Phe

Thr

Ser

Ala

Phe

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Gly

Thr

Leu

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Ser

Phe

145

150

155

160

Leu

Glu

Val

Ala

Tyr

Arg

Ala

Leu

Arg

His

Phe

Thr

Lys

Pro

165

170

INFORMACJA	DLA	IDENTYFIKATORA	SEKWENCJI CR: 8:
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI : (A) DŁUGOŚĆ: 177 aminokwasów (B) TYP: aminokwas <C) NICIOWOSC: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:
Thr Pro Leu 1	Gly	Pro Ala Ser Ser 5	Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys 10 15
Cys Leu Glu	Gin 20	Val Arg Lys Ile	Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin 25 30
Glu Lys Leu 35	Va 1	Ser Glu Cys Ala 40	Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu 45
Glu Leu Val 50	Leu	Leu Gly His Ser 55	Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu 60
Ser Ser Cys 65	Pro	Ser Gin Ala Leu 70	Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin 75 80
Leu His Ser	Gly	Leu Met Ala Pro 85	Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala 90 95
Met Pro Ala	Phe 100	Ala Ser Ala Phe	Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu 105 110
Val Ala Ser 115	His	Leu Gin Ser Phe 120	Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu 125
Arg His Leu 130	Ala	Gin Phe Leu Tyr 135	Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu 140

PL 197 150 Β1

Gly 145

Ile

Ser

Pro

Glu

Leu Gly 150

Pro

Thr

Leu

Asp 155

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp 160

Val

Ala

Asp

Phe

Ala

Thr Thr

Ile

Trp

Gin

Met

Glu

Leu

Gly

165 170 175

Pro (2) INFORMACJA ELA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI i (A) DŁUGOŚĆ: 178 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

(xi) OPIS	SEKWENCJI:	IDENTYFIKATOR SEKW.	NR:	9:
Val 1	Pro Leu Val	Thr Val Ser Ala Leu 5	Pro 10	Pro Ser Leu Pro Leu Pro 15
Arg	Ser Phe Leu 20	Leu Lys Ser Leu Glu 25	Gin	Val Arg Lys Ile Gin Ala 30
Ser	Gly Ser Val 35	Leu Leu Glu Gin Leu 40	Cys	Ala Thr Tyr Lys Leu Cys 45
His	Pro Glu Glu 50	Leu fal Leu Leu Gly 55	His	Ser Leu Gly Ile Pro Lys 60
Ala 65	Ser Leu Ser	Gly Cys Ser Ser Gin 70	Ala	Leu Gin Gin Thr Gin Cys 75 Θ0
Leu	Ser Gin Leu	His Ser Gly Leu Cys 85	Leu 90	Tyr Gin Gly Leu Leu Gin 95
Ala	Leu Ser Gly 100	Ile Ser Pro Ala Leu 105	Ala	Pro Thr Leu Asp Leu Leu 110
Gin	Leu Asp Val 115	Aia Asn Phe Ala Thr 120	Thr	Ile Trp Gin Gin Mer. Glu 125
Asn	Leu Gly Ual 130	Ala Pro Thr Val Gin 135	Pro	Thr Gin Ser Ala Mer Pro 140
Ala 145	Phe Thr Ser	Ala Phe Gin Arg Arg 150	Ala	Gly Gly Val Leu Ala Ile 155 160
Ser	Tyr Leu Gin	Gly Phe Leu Glu Thr 165	Ala 170	Arg Leu Ala Leu His His 175

Leu Ala

PL 197 150 B1 {2} INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW3NCJI NR: 10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWEOJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 18 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna <D) TOPOLOGIA: linoowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENC!: IDENTYFIKATOR SEKW. CR: 10:

Ala 1

Phe

Pro

Thr

Pro 5

Gly

Pro

Leu

Gly

Gly 10

Asp

Ser

Lys

Asp

Asp 15

Ala

Thr

Ser

Asn

Arg

Pro

Leu

Thr

Ser

Ala

Asp

Lys

Met

Glu

Asp

Phe

2C

25

30

Ile

Lys

Phe

Ile

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Ala

Leu

Arg

Asn

Glu

Met

Cys

35

40

45

Asp

Lys

Tyr

Asn

Lys

Cys

Glu

Asp

Ser

Lys

Glu

Val

Leu

Ala

Glu

Asn

50

55

60

Asn

Leu

Asn

Leu

Pro

Lys

Leu

Ala

Glu

Lys

Asp

Arg

Cys

Phe

Gin

Ser

65

70

75

80

Arg

Phe

Asn

Gin

Glu

Thr

Cys

Leu

Thr

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

Gin

85

90

95

Glu

Phe

Gin

Ile

His

Leu

Lys

Tyr

Leu

Glu

Ser

Asn

Tyr

Glu

Gly

Asn

100

105

110

Lys

Asp

Asn

Ala

His

Ser

Val

Tyr

Ile

Ser

Thr

Lys

His

Leu

Gin

115

120

125

Thr

Leu

Arg

Pro

Ket

Asn

Gin

He

Glu

Val

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

130

135

140

Thr

Asp

Ala

Ser

Leu

Cln

Ala

Leu

Phe

Lys

Ser

Gin

Asp

Lys

Trp

Leu

145

150

155

160

Lys

His

Thr

Ile

His

Leu

I ie

Leu

Arg

Leu

Glu

Asp

Phe

Leu

165

170

175

Gin

Phe

Ser

Leu

Arg

Ala

I ie

Arg

Ile

Ket

180 185 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 183 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (Ć) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11:

PL 197 150 Β1

Ala 1

Phe

Pro

Thr

Pro 5

Gly

Pro

Leu

Gly

Gly 10

Asp

Ala

Thr

Ser

Asn 15

Arg

Leu

Pro

Leu

Thr

Pro

Ala

Asp

Lys

Met

Glu

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

20

25

30

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Ala

Leu

Lys

Glu

Met

Cys

Asp

Asn

Tyr

Asn

35

40

45

Lys

Cys

Glu

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Asn

Leu

Asn

Leu

50

55

60

Pro

Lys

Leu

Ala

Glu

Lys

Asp

Gly

Cys

Phe

Gin

Ser

Gly

Phe

Asn

Gin

65

70

75

80

Glu

Thr

Cys

Leu

Thr

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

Gin

Glu

Phe

Gin

Ile

85

90

95

Tyr

Leu

Lys

Phe

Leu

Gin

Asp

Lys

Tyr

Glu

Gly

Asp

Lys

Glu

Asn

Ala

100

105

110

Lys

Ser

Val

Tyr

Thr

Ser

Thr

Asn

Val

Leu

Gin

Met

Leu

Lys

Arg

115

120

125

Lys

Gly

Lys

Asn

Gin

Asp

Glu

Val

Thr

Ile

Pro

Val

Pro

Thr

Val

Glu

130

135

140

Val

Gly

Leu

Gin

Leu

Ser

Cys

Ser

His

Arg

Val

Ala

Glu

Ala

His

145

150

155

160

Asn

His

Leu

Thr

Leu

Arg

Leu

Glu

Asp

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

165

170

175

Leu

Arg

Ala

Val

Arg

Ile

Met

180

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

{A} DŁUGOŚĆ: 188 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ; nie istotna <D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

OPIS	SEKWENCJI:	IDENTYFIKATOR SEKW.	NR:	12:
Ala 1	Phe Pro Ala	Pro Val Pro Pro Gly	Glu 10	Asp Ser Lys Asp Val Ala 15
Ala	Pro His Arg 20	Gin Pro Leu Thr Ser 25	Ser	Glu Arg Ile Asp Lys Gin 30
Ile	Arg Tyr Ile 35	Leu Asp Gly Ile Ser 40	Ala	Leu Arg Lys Glu Thr Cys 45

PL 197 150 B1

Asn

Lys

Ser

Asn

Met Cys

Glu Ser

Ser

Lys

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Asn

50

55

60

Asn

Leu

Asn

Leu

Pro Lys

Met Ala

Glu

Lys

Asp

Gly

Cys

Phe

Gin

Ser

65

70

75

80

Gly

Phe

Asn

Glu

Glu Thr

Cys Leu

Val

Lys

Ile

Thr

Gly

Leu

85

90

95

Glu

Phe

Glu

Val

Tyr Leu

Glu Tyr

Leu

Gin

Asn

Arg

Phe

Glu

Ser

100

105

110

Glu

Gin

Ala

Arg Ala

Val Gin

Met

Ser

Thr

Lys

Val

Leu

Ile

Gin

115

120

125

Phe

Leu

Gin

Lys

Lys Ala

Lys Asn

Leu

Asp

Ala

Ile

Thr

Pro

Asp

130

135

140

Pro

Thr

Asn

Ala Ser

Leu Leu

Thr

Lys

Leu

Gin

Ala

Gin

Asn

Gin

145

150

155

160

Trp

Leu

Gin

Asp

Mec Thr

Thr His

Leu

Ile

Leu

Arg

Ser

Phe

Lys

Glu

165

170

175

Phe

Leu

Gin

Ser

Ser Leu

Arg Ala

Leu

Arg

Gin

Mec

180

185

(2)

INFORMACJA

DLA

IDENTYFIKATORA SEKWENCJI

CR:

13:

(i)

CHARAKTERYSTYKA

SEKWENCJI :

(A)

DŁUGOŚĆ: 184 aminokwasy

(B)

TYP

: aminokwas

(C)

cic;^<^wość:

nie istotna

(D)

TOPOLOGIA:

liniowa

(ii-.

) RODZAJ

CZĄSTECZKI: peptyd

(xi) OPIS SEKWNCJI

: IDENTYFIKATOR

SEKW

. CR

: 13

Ala i A

Phe

Pro

Thr

Pro 5

Gly

Pro

Leu

Gly

Glu 10

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp 15

Thr

Pro

Ser

Arg 20

Leu

Thr

Thr 25

Pro

Glu

Lys

Thr

Glu 30

Ala

Leu

Ile

Lys

His 35

Ile

Va!

Asp

Lys

Ile 40

Ser

Ala

Ile

Arg

Lys 45

Glu

Ile

Cys

Glu

Lys 50

Asn

Asp

Glu

Cys

Glu c c.

Asn

Ser

Lys

Glu

Thr 60

Leu

Ala

Glu

Asn

Lys €5

Leu

Lys

Leu

Prc

Lys 7 0

Met

Glu

Lys

Asp 75

Gly

Cys

Phe

Gin

Ser eo

Gly

Phe

Asn

Gin

Aia 85

Ile

Cys

Leu

Ile

Lys 90

Thr

Ala

Gly

Leu 95

Leu

Glu

Tyr

Gin

He 100

<w * J “

Leu

Asp

Phe

Leu 105

Gin

Asn

Glu

Phe

Glu 110

Gly

Asn

PL 197 150 Β1

Gin

Glu

Thr 115

Val

Met

Glu

Leu

Gin 120

Ser

Ile

Arg

Thr 125

Leu

Ile

Gin

Ile

Leu

Lys

Glu

Lys

Ile

Ala

Gly

Leu

Ile

Thr

Pro

Ala

Thr

His

130

135

140

Thr

Asp

Met

Leu

Glu

Lys

Met

Gin

Ser

Asn

Glu

Trp

Val

Lys

Asn

145

ISO

155

160

Ala

Lys

Val

Ile

Leu

Arg

Ser

Leu

Glu

Asn

Phe

Leu

Gin

Phe

165

170

175

Ser

Leu

Arg

Ala

Ile

Arg

Met

Lys

180

(2)

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI

NR:14:

(i)

CHARAKTERYSTYKA

SEKWENCJI :

(A)

DŁUGOŚĆ:

188

aminokwasów

(B)

TYP:

aminokwas

(C)

NICIOWOŚĆ: nie istotna

(D)

TOPOLOGIA: liniowa

(ii)

1 RODZAJ

CZĄSTECZKI:

peptyd

(xi) OPIS SEKWENCJI

r IDENTYFIKATOR

SEKW. NR: 14:

Ala

Phe

Pro

Thr

Ser

Gin

Val

Arg

Gly

Asp

Phe

Thr

Glu

Asp

Thr

1

5

10

15

Thr

Pro

Asn

Arę

Pro

Val

Tyr

Thr

Ser

Gin

Val

Gly

Leu

Ile

20

25

30

Thr

His

Val

Leu

Trp

Glu

Ile

Val

Glu

Met

Arg

Lys

Glu

Leu

Cys

Asn

35

40

45

Gly

Asn

Ser

Asp

Cys

Me:

Asn

Asp

Ala

Leu

Ala

Glu

Asn

50

55

60

Leu

Lys

Leu

Pro

Glu

Ile

Gin

Arg

Asn

Asp

Gly

Cys

Tyr

Gin

Thr

Gly

65

70

75

80

Tyr

Asn

Gin

G.u

Ile

Cys

Leu

Lec

Lys

Ile

Ser

Gly

Leu

Glu

ES

90

95

Tyr

His

Ser

Tyr

Leu

Glu

'łS-,• j «

Met

Lys

Asn

Leu

Lys

Asp

Asn

Lys

100

105

110

Lys

Asp

Lys

Ala

Arg

Va 1

Leu

Gin

Arg

Asp

Thr

Glu

Thr

Leu

Ile

His

115

120

125

Ile

Phe

Asn

Gir.

Glu

'.'a

Lys

Asp

Leu

His

Lys

Ile

Val

Leu

Pro

Thr

130

13 5

140

Pro

Ile

Ser

Asn

Aia

Leu

Thr

Asp

Lys

Leu

Glu

Ser

Gin

Lys

Glu

145

is;

155

160

Trp

Leu

Arg

Thr

Lys

Thr

Iie

Gin

Phe

Ile

Leu

Lys

Ser

Leu

Glu

165

170

175

Phe Leu Lys Val 18Ć

Leu Arg Ser Thr Arg Gin Thr 185

PL 197 150 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWNCJI NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A)	DŁUGOŚĆ:	178 amLnokwasć)w
(BJ	TYP: aminokwas
(C)	NICIOWOŚĆ	: nie istotna
(D)	TOPOLOGIA	: liniowa

(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

OPIS SEKWENCJ :	IDENTYFIKATOR S	IEKW.	NR:	15:
Ala Pro Leu Ala 1	Glu Leu Ser Gly 5	Asp	His 1C	Asp Phe Gin Leu Phe Leu 15
His Lys Asn Leu 20	Glu Phe Thr Arg	Lys 25	Ile	Arg Gly Asp Val Ala Ala 30
Leu Gin Arg Ala 35	Val Cys Asp Thr 40	Phe	Gin	Leu Cys Thr Glu Glu Glu 45
Leu Gin Leu Val 50	Gin Pro Asp Pro 55	His	Leu	Val Gin Ala Pro Leu Asp 60
Gin Cys His Lys 65	Arg Gly Phe Gin 70	Ala	Glu	Val Cys Phe Thr Gin Ile 75 80
Arg Ala Gly Leu	His Ala Tyr His 85	Asp	Ser 90	Leu Gly Ala Val Leu Arg 95
Leu Leu Pro Asn 100	His Thr Thr Leu	Val 105	Glu	Thr Leu Gin Leu Asp Ala 110
Ala Asn Leu Ser 115	Ser Asn He Gin 120	Gin	Gin	Met Glu Asp Leu Gly Leu 125
Asp Thr Val Thr 130	Leu Pro Ala Glu 135	Gin	Arg	Ser Pro Pro Pro Thr Phe 140
Ser Gly Pro Phe 145	Gin Gin Gin Val 150	Gly	Gly	Phe Phe Ile Leu Ala Asn 155 160
Phe Gin Arg Phe	Leu Glu Thr Ala 165	Tyr	Arg 170	Ala Leu Arg His Leu Ala 175

Arg Leu (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWEJGJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 185 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKW^^NJ^: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16:

PL 197 150 B1

Thr Arg Gly Lys 1

Leu 5

Pro Asp

Ala

Pro

Glu 10

Phe

Glu

Lys

Asp

Leu 15

Leu

Ile

Gin

Arg

Leu

Asn

Trp

Met

Leu

Trp

Val

Ile

Asp

Glu

Cys

Phe

Arg

20

25

30

Asp

Leu

Cys

Tyr

Arg

Thr

Gly

Ile

Cys

Lys

Gly

Ile

Leu

Glu

Pro

Ala

35

40

45

Ala

Ile

Phe

His

Leu

Lys

Leu

Pro

Ala

Ile

Asn

Asp

Thr

Asp

His

Cys

50

55

60

Gly

Leu

Ile

Gly

Phe

Asn

Glu

Thr

Ser

Cys

Leu

Lys

Leu

Ala

Asp

65

70

75

80

Gly

Phe

Glu

Phe

Glu

Val

Leu

Phe

Lys

Phe

Leu

Thr

Glu

Phe

85

90

95

Gly

Lys

Ser

Val

Ile

Asn

Val

Asp

Val

Met

Glu

Leu

Thr

Lys

Thr

100

105

110

Leu

Gly

Trp

Asp

Ile

Gin

Glu

Leu

Asn

Lys

Leu

Thr

Lys

Thr

His

115

120

125

Tyr

Ser

Pro

Lys

Phe

Asp

Arg

Gly

Leu

Gly

Arg

Leu

Gin

Gly

130

135

140

Leu

Lys

Tyr

Trp

Val

Arg

His

Phe

Ala

Ser

Phe

Tyr

Val

Leu

Ser

Ala

145

150

155

160

Met

Glu

Lys

Phe

Ala

Gly

Gin

Ala

Val

Arg

Val

Leu

Asp

Ser

Ile

Pro

165

170

175

Asp

Val

Thr

Pro

Asp

Val

His

Asp

Lys

180 185

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowany i rekombinowany polinukleotyd kodujący antygenowy polipeptyd obejmujący:

a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 2;

b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 4; albo

c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów dojrzałej części kodowanej o Id. Sekw. nr 5.
2. Polinukleotyd według zastrz. 1 kodujący dojrzały 15 polipeptyd o:

a) Id. Sekw. nr 2; albo

b) Id. Sekw. nr 4.
3. Polinnuieetydwedłuu zastrz.1, zznmieenntym. żehhbiydyzujew 55°C,mniejniż 550 mM soli i 50% formamidzie z:

a) częścią kodującą o Id. Sekw. nr 1; albo

b) częścią kodującą o Id. Sekw. nr 3.
4. Polinukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje:

a) przynajmniej 35 sąsiadujących nukleotydów części kodującej o Id. Sekw. nr 1; albo

b) przynajmniej 35 sąsiadujących nukleotydów części kodującej o Id. Sekw. nr 3.
5. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje polinukleotyd określony w zastrz. 1.
6. Komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony w zastrz. 5, w tym komórka eukariotyczna.
7. Sposóówetweszasiap olipeetydd a stydgdewedgιZzamieenytym. żeo bejmnjeedspredjęrekombinowanego polinukleotydu określonego w zastrz. 1.
8. Sposóóweyrywesia polinnUleetydy okredlonedg w zastrz. J zzamieenytym. że ο!θ^^θ kontaktowanie polinukleotydu z sondą, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z przynajmniej 25 sąsiadującymi nukleotydami:

PL 197 150 B1

a) części kodującej z Id. Sekw. nr 1; albo

b) części kodującej z Id. Sekw. nr 3;

z wytworzeniem dupleksu, przy czym wykrycie dupleksu wskazuje na obecność polinukleotydu.
9. Zestaw do wykrywania polinukleotydu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje przedział zawierający sondę, która hybrydyzuje w ostrych warunkach tworząc dupleks z przynajmniej 17 sąsiadującymi nukleotydami polinukleotydu określonego w zastrz. 1.
10. Zestaw według zastrz. 9, znamienny tym, że sonda jest znakowana w sposób wykrywalny.
11. Związek wiążący, znamienny tym, że obejmuje miejsce wiążące przeciwciała, które swoiście wiąże się z:

a) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 2;

b) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 4; albo

c) przynajmniej 17 sąsiadującymi aminokwasami z Id. Sekw. nr 5.
12. Związek wiążący według zastrz. 11, znamienny tym, że:

a) miejsce wiążące przeciwciała jest:

i) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. nr 2;

ii) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. nr 4;

iii) swoiście immunoreaktywne z polipeptydem o Id. Sekw. nr 5;

iv) wywołane przeciwko oczyszczonemu albo wytworzonemu rekombinacyjne białku ludzkiej IL-B30;

v) wywołane przeciwko oczyszczonemu albo wytworzonemu rekombinacyjne białku mysiej IL-B30;

vi) w przeciwciele monoklonalnym, Fab albo F(ab)2; lub

b) związek wiążący jest:

i) cząsteczką przeciwciała;

ii) poliklonalną surowicą odpornościową;

iii) znakowany w sposób wykrywalny;

iv) sterylny; lub

v) w kompozycji buforowanej.
13. Sppsóó zzstosowania związku wiążącceo określoneeo w zzstrz. 11, zzamieeny tym, żż obejmuje kontaktowanie związku wiążącego z próbką biologiczną zawierającą antygen, przy czym kontaktowanie powoduje wytworzenie kompleksu związku wiążącego i antygenu.
14. Sppsóówaeług zzaS-Zz 13, znnmieenatym. żż próókk Οΐο^^^ ppohoodi oo ccłowieśu, a związek wiążący jest przeciwciałem.
15. Zestaw do wykrywania, znamienny tym, że obejmuje związek wiążący określony w zastrz. 12, oraz:

a) materiały instruujące o stosowaniu związku wiążącego w celu wykrywania; lub

b) przedział zapewniający oddzielenie związku wiążącego.
16. Zasadniczo czysty albo izolowany polipeptyd antygenowy, znamienny tym, że wiąże się z kompozycją wiążącą określoną zastrz. 11 i ponadto obejmuje:

a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 2;

b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 4; albo

c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 5.
17. Polipeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że:

a) obejmuje przynajmniej fragment o co najmniej 25 sąsiadujących resztach aminokwasowych z białka IL-B30 naczelnych;

b) obejmuje przynajmniej fragment o co najmniej 25 sąsiadujących resztach aminokwasowych z białka IL-B30 gryzoni;

c) jest rozpuszczalnym polipeptydem;

d) jest znakowany w sposób wykrywalny;

e) jest w sterylnej kompozycji;

f) jest w buforowanej kompozycji;

g) wiąże się z receptorem powierzchniowym komórki;

h) jest wytworzony rekombinacyjnie; lub

i) ma sekwencję polipeptydu występującego naturalnie.
18. Polipeptyd według zastrz. 17, znamienny tym, że obejmuje:

a) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów z Id. Sekw. nr 2;

b) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 4; lub

c) przynajmniej 17 sąsiadujących aminokwasów Id. Sekw. nr 5.

PL 197 150 B1
19. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje reszty 1-168 z Id. Sekw. nr 2.
20. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje reszty 1-175 z Id. Sekw. nr 4.
21. Sposób modulowania fizjologii albo rozwoju komórki albo komórek hodowli tkankowej, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie komórki z agonistą albo antagonistą IL-B30 ssaków.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że:

a) kontaktowanie przebiega w kombinacji z agonistą albo antagonistą G-CSF i/lub IL-6; albo

b) kontaktowanie następuje z antagonistą, w tym z kompozycją wiążącą obejmującą miejsce wiążące przeciwciała, które swoiście wiąże się z IL-B30.
23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie komórki z antagonistą IL-B30.
24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie komórki z agonistą IL-B30.
25. Rekombinowane przzeiwciało albo jeeo ffaament wiążącc antyygn, zr^nr^ier^r^n tym, żż wiążą się z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2.
26. Ργζ|ο^^ wu^żżcc antyygn waeług zzatrz. 25, zzamieeny tt^m, żż jjet wat^ozno sppśróó fragmentu Fab i fragmentu Fab2.
27. Renomeinowano przzeiwaiało albcs jjeg ffzament w^^z^ć^c^cy η^οοπ, zmamiem tym, żż wiążą się z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 4.
28. SS}k/y^okoś^eośycj^j|Zzamieena tym, żż oOejmejekenomeinowanoprzzeiwaiałoalbbśraament wiążący antygen określone w zastrz. 25.