asocia a la proteína 3 ind ucida por virus de Epstein Barr (EBI3) , la cual tiene homolog ía con el p40 de la I L-12. También se sabe que la EB I3 se asocia con otra proteína similar a p35 (denominada p28) , para formar la citocina I L-27. La I L-27 se expresa en células mieloides, en particular en monocitos activados por lipopolisacáridos y células dendríticas derivadas de monocito, y promueve la proliferación de células T vírgenes. Se ha sugerido polarizar la respuesta inmunológica hacia el tipo Th 1 . Así, existe una familia de citocinas similares a la I L-1 2 , que tiene efectos pleiotrópicos sobre las células del sistema inmunológico. Hasta la fecha , sin embargo, no ha sido atribuida ninguna función al heterodímero EBI3-p35. La demostración de que la EBI3-p35 se expresa en el sincitiotrofoblasto, combinada con la similitud del heterodímero a la I L-12 , ha cond ucido a la sugerencia de que el heterodímero puede ser inmunosupresor en alg una forma (Devergne et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA94 (1 997) 12041 -1 2046; W097/1 3859). Estos autores propusieron que cualquier actividad como esta podría ser debida más probablemente, a un efecto antagónico en la señalización de la I L-12, pero no proporcionaron datos funcionales en apoyo a esta especulación . Por tanto, hasta ahora, la función de la molécula de EBI3-p35 permanece desconocida. Breve descripción de la invención Los presentes inventores han encontrado que la EBI3-p35 es capaz de promover la proliferación de célu las T reguladoras (células TR O Treg) in vitro. Se sabe q ue las células T reguladoras juegan un papel significativo en la supresión de células T auto reactivas in vivo, y también son capaces de suprimir el rechazo de aloinjertos. De manera consistente con esta función conocida de las célu las Treg, los presentes inventores han demostrado adicionalmente que la EBI3-p35 tiene un efecto terapéutico sustancial en un modelo de artritis reumatoide en ratón . Así, la presente invención proporciona la primera evidencia de cualquier función fisiológica para la citocina EBI3-p35. De acuerdo con esto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para estimular la proliferación de una célula T reg uladora, que comprende poner en contacto a la célula con EBI3-p35. La EBI3-p35 puede contener al menos dos componentes EBI3 y/o al menos dos componentes p35. U na modalidad particularmente preferida es un heterotetrámero q ue tiene dos de cada componente.
En modalidades preferidas, el menos un componente EBI3 y al menos un componente p35 están enlazados covalentemente uno al otro. Preferiblemente, el al menos un componente EBI3 y el al menos un componente p35 forman una proteína de fusión . Preferiblemente cada componente EBI3 o p35 está enlazado covalentemente al menos a otro componente EBI3 o p35. La EBI3-p35 puede contener una, dos o más proteínas de fusión , cada una con al menos dos de los componentes EBI3 y p35. Las proteínas de fusión pueden estar enlazadas covalentemente por sí solas mediante cualquier medio apropiado, incluyendo un enlazante qu ímico no péptido, una unión disulfuro, etc. En modalidades preferidas, todos los componentes EBI3 y p35 están enlazados covalentemente uno al otro. La EB I3-p35 puede contener además u no o más componentes heterologos, preferiblemente polipéptidos heterologos, enlazados covalentemente a uno o más de los componentes EB1 3 o p35. Los polipéptidos heterologos pueden ser parte de una proteína de fusión con uno o más componentes EBI3 o p35. Los componentes heterologos preferiblemente son capaces de asociarse uno con otro y por lo tanto pueden ayudar a la asociación entre los diversos componentes EBI3 y p35. En estos casos, la EBI3-p35 contiene dos o más de estos componentes heterologos; los componentes heterologos pueden ser los mismos o diferentes. Los componentes heterologos pueden proporcionar, de manera adicional o alternativamente, funciones efectoras biológicas adicionales. Los componentes heterologos particularmente preferidos son polipéptidos que contienen secuencias de anticuerpos Fe, las cuales se pueden usar para extender la vida media de la EBI3-p35 in vivo. Preferiblemente, las secuencias bisagra del anticuerpo también están incluidas, dado que estas contienen residuos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro entre cadenas Fe. El método típicamente comprende poner en contacto la célula T reguladora con una sustancia capaz de estimular la señalización a través del complejo receptor de la célula T. Los ejemplos de tales sustancias incluyen anticuerpos anti-CD3 y células que muestran antígenos reconocidos por el receptor de la célula T en el contexto de una molécula de M HC, incluyendo células presentadoras de antígeno (APC) profesionales, tales como células dendríticas, macrófagos, etc. Se puede prevenir la proliferación de las APC por sí solas, por ejemplo, mediante fijación (por ejemplo con formaldehído) , irradiación (por ejemplo, con rayos X o gamma) o tratamiento químico (por ejemplo, con mitomicina C). Adicionalmente o de manera alternativa, se puede emplear señales co-estimuladoras, tales como anticuerpos anti-CD28. Cuando los métodos se llevan a cabo in vitro o ex vivo (por ejemplo, en cultivo celular) , normalmente se proporciona un estímulo con TCR a las células Treg junto con la EBI3-p35. Sin embargo, los métodos de la invención también se pueden realizar in vivo, mediante admin istración de EBI3-p35 a un sujeto como método de reforzar la cantidad de células T reguladoras en ese sujeto. En tales circunstancias, las células Treg dentro del cuerpo normalmente recibirán suficiente estímulo con TCR de su entorno in vivo, y así proliferarán solamente con la administración de EBI3-p35. Cuando se lleva a cabo in vitro o ex vivo, el método puede comprender además el paso de formular una población de células T reguladoras así obtenidas para su administración a un sujeto. Preferiblemente, el receptor es singén ico o histocompatible con las células T. El receptor puede haber sido la fuente orig inal de las células. Así, la invención proporciona un método para proveer una célula T supresora obtenida de un sujeto, pon iendo en contacto la célula in vitro con EBI3-p35 para producir una población de células T reguladoras, y formulando la población de células T reguladoras para administración al sujeto. El método adicionalmente puede comprender los pasos de obtener las células del sujeto y/o administrar las células al sujeto. En un aspecto adicional , la invención proporciona el uso de
EBI3-p35, ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) EBI3-p35, o células que expresan y secretan EBI-p35, en la fabricación de un medicamento para aumentar la actividad reguladora de células T en un sujeto. Por esto se quiere decir aumentar la cantidad de células T reguladoras presentes en el sujeto, y así aumentar la capacidad del sujeto para controlar la actividad de células T efectoras. La invención proporciona además EBI3-p35, ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) EB I3-p35, o células que expresan y secretan EB I-p35 para su uso en un método de tratamiento médico. La invención proporciona además un método para mejorar la actividad reguladora de las células T en un sujeto, el método comprende administrar EBI3-p35, ácido(s) n ucleico(s) que codifica(n) EBI 3-p35, o células q ue expresan y secretan EBI3-p35, a ese sujeto. Estas preparaciones y métodos pueden usarse en el tratamiento de condiciones caracterizadas por activación de células T inapropiada o indeseable, incluyendo enfermedades inflamatorias o autoinmunológicas. También se pueden usar para la prevención de rechazo de aloinjerto o para prolongar la supervivencia del aloinjerto. Las condiciones particulares que pueden ser tratadas por los métodos y composiciones de la invención , incluyen alergia (por ejemplo, asma) , artritis (por ejemplo artritis reumatoide) , gastritis, anemia perniciosa, tiroiditis, insulitis, diabetes, sialoadenitis, adrenalitis, orquitis/ooforitis autoinmunológica, glomerulonefritis, encefalitis autoinmunológica experimental, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal, ateroesclerosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Las características preferidas de la EB I3-p35 para su uso en estas composiciones y métodos están establecidas más arriba en relación con el primer aspecto de la invención , y en cualquier parte en esta especificación . En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de EBI3-p35 que contiene un componente EB I3, un componente p35, y un componente heterólogo, en donde dos o más de los componentes heterólogos son capaces de asociarse uno con otro, de tal forma q ue dos o más de estas moléculas de EBI3-p35 forman un complejo. Preferiblemente, la molécula de EB I3-p35 es una proteína de fusión que contiene EBI3, p35 y componentes heterólogos. En modalidades preferidas, los componentes heterólogos son capaces de asociarse uno con otro mediante formación de uniones disulfu ro. Un ejemplo particularmente preferido de tal componente heterólogo es una secuencia de anticuerpos Fe que incluye la secuencia bisagra. La presente invención proporciona además EB I3-p35 que contiene dos componentes EBI3 y dos componentes p35. Preferiblemente, cada uno de los componentes está unido covalentemente al menos a otro componente del complejo. El complejo puede contener una o más proteínas de fusión , cada una con al menos dos de dichos componentes, preferiblemente al menos un componente EB1 3 y al menos un componente p35. Estas proteínas de fusión pueden comprender además uno o más componentes heterólogos tales como los descritos anteriormente. La invención proporciona además un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como la que se describe en cualquiera de los aspectos de la invención más arriba. También se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido n ucleico de la invención y una célula anfitriona que contiene un vector de expresión de la invención . Breve descripción de los dibujos Fig ura 1 . (A) Análisis de detección Western de EBI3-p35 usando anticuerpo Fe anti-humano. Se detectó una banda clara con PM de 78 kDa. (B) Representación esquemática de la proteína de fusión EBI3-p35-Fc. La proteína probablemente forma un homodímero a través de las uniones disulfuro en la región Fc/bisagra. La figura 2 muestra la tinción con azul Coomassie de EB I-p35-Fc purificada. Se muestra una banda sola a 78 kDa en todas las líneas, (la dilución de proteína de 2 veces comenzó a 1 µg/línea) . Fig ura 3. Efecto de EB I3-p35-Fc sobre la proliferación de células T CD4+ y C D4+CD25+ in vitro. Se purificaron las células de ratones BALB/c y se cultivaron con anticuerpo anti-CD3 unido a placas, y se g raduaron las concentraciones de la proteína de fusión. Se determinó la proliferación celular mediante incorporación de 3H-Timidina a las 72 horas, y se expresó como conteos por minuto. La figura 4 muestra el efecto de EBI3-p35-Fc sobre la proliferación de células Treg CD4+CD25+. Se purificaron las células T CD4+CD25+ de ratones BALB/c y se cultivaron con anti-CD28 y anti-D3 un ido a placas en la presencia de I L-2. Se añadió EBI3-p35-Fc en concentraciones variables y se midió la proliferación mediante incorporación de 3H-timidina. La figura 5 muestra que la EBI3-p35-Fc expandió las función supresora de retención de la células Treg CD4+CD25+ contra las células T CD4+CD25-. Se pu rificaron las células de nodos linfáticos de BALB/c y se cu ltivaron con anticuerpo anti-CD3 unido a placas durante 3 d ías. Las célu las fueron lavadas y luego se cultivaron ya sea solas o en una proporción 1 : 1 du rante 3 días adicionales en la presencia de anticuerpo anti-CD3 soluble y células presentadoras de antígeno tratadas con mitomicina C. Se determinó la proliferación celular mediante incorporación de 3H-timidina y se expresó como cpm, n = 6. La fig u ra 6 muestra el efecto terapéutico de EBI3-p35-Fc en la artritis ind ucida por colágeno en ratones. Se inmun izó a grupos de 1 0 ratones DBA/1 machos (6 a 8 semanas de edad) por vía subcutánea con 200 µg de colágeno bovino de tipo I I (CU) en adyuvante completo de Freund y se sumin istró un refuerzo por vía intraperitoneal (i.p.) 21 d ías después con 200 µg de CU en PBS. Se trató a los ratones i.p. diariamente con 2 µg de EBI3-p35-Fc o con PBS desde el día 24 hasta el día 30. Se vigiló a los ratones diariamente para detectar síntomas de enfermedad . Las barras verticales representan la media ± error estándar medio. La figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos completa (incluyendo el péptido de señal) de la proteína de fusión EBI3-p35-Fc descrita en los ejemplos. La fig ura 8 muestra que la EBI3-p35-Fc es capaz de atenuar la artritis establecida. Se sensibilizó a ratones DBA/1 y se reforzaron con colágeno de tipo I I en FCA tal como se describió en relación con la figura 6 anterior. Luego se trató a los ratones por vía intraperitoneal diariamente con 2 µg de EB I3-p35-Fc, Enbrel, EB I3-p35-Fc mas Enbrelo o sl L-1 5R en los días 27 a 36. A los ratones de control se les suministró solamente PBS. La fig ura 9 muestra el efecto de EBI3-p35-Fc en un modelo murino de asma. Se inyectó intraperitonealmente a ratones BALB/c con 1 00 µg de OVA en 40 µ ? de PBS por vía intratecal (i.t.). Se anestesió de nuevo a los ratones antes de ser expuestos i .t. en cada uno de los d ías 25, 26 y 27 con 1 0 µ9 de OVA en 40 µ?_ de P BS. Para el tratamiento con EBI3-p35, se inyectó 2 µ9 de EBI3-p35 interaperitonealmente a los ratones en tres ocasiones (d ía 25, 26 y 27) 1 hora antes de la exposición a OVA. Se le proporcionó PBS a los ratones de control negativo en lugar de OVA en las etapas de sensibilización y de exposición . Se sacrificó a los ratones el d ía 29 mediante administración de una dosis fatal de avertina. I nmediatamente después de la administración de avertina, se recolectó una muestra de sangre mediante punción cardiaca. Luego se recolectó el lavado bronquio alveolar y se contó usando un hemocitómetro. Los conteos totales de células se muestran en el panel (A). Se usaron ensayos ELISA específicos para determinar la concentración de Ig E específica para ovalbúmina (Panel (B)) , e I L-4 (Penel (C)) en el supernadante BAL. Descripción detallada de la i nvención EB1 3 v p35 El gen de EB I3 (gen 3 ind ucido por el virus de Epstein-Barr) humano, codifica una proteína de aproximadamente 33 kDa con aproximadamente 27% de identidad de secuencia de aminoácidos para la subunidad p40 de la I L-12 humana . Los ejemplos de ácido n ucleico y de secuencias de aminoácidos para el EB 1 3 humano se proporcionan como SEQ I D NO: 1 y 2 respectivamente, de W097/1 3859. Los ejemplos de secuencias para EB 13 murino y humano también se proporcionan en GenBank como números de acceso N M015766 y BC0461 12 , respectivamente.
Las referencias a los componentes EB I3 de la EBI3-p35 se deben tomar como incluyentes de polipéptidos que tienen esas secuencias, o como secuencias codificadas por esas secuencias de ácido n ucleico (con o sin péptido señal) , así como también como polipéptidos EBI3 de tipo natu ral codificados por genes ortólogos de otras especies, y polipéptidos que tienen suficiente identidad de secuencia con respecto a esos polipéptidos para retener la capacidad de estimular la proliferación de las células T reguladoras de las mismas especies cuando se proporcionan en un heterotetrámero con un componente p35 apropiado. Así, las secuencias de polipéptido EB I3 preferidas tienen al menos 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 90% , 91 % , 92% , 93% , 94% , 95% , 96% , 97% , 98% o 99% de identidad de secuencia con respecto a las secuencias de tipo natural a las cuales se hace referencia más arriba (por ejemplo, las de WI97/13859 o las de GenBank, o a los polipéptidos de tipo natural codificados por genes ortólogos de otras especies). La referencia a un ácido nucleico que codifica un polipéptido EBI3 debe ser interpretada de acuerdo con esto. El p35 originalmente fue identificado como un componente de ia citocina I L-2. Los ejemplos de secuencias de ácido n ucleico y de aminoácido para el p35 humano se proporcionan como SEQ I D NO: 3 y 4, respectivamente, de W097/13859. Los ejemplos de secuencias para p35 humano y murino también se encuentran en los n úmeros de acceso a GenBank N M_000882 y M86672, respectivamente. Las referencias a componentes p35 de EBI3-p35 deben ser consideradas como incluyentes de polipéptidos que tienen esas secuencias, o secuencias codificadas por esas secuencias de ácido nucleico (con o sin péptido señal) , así como también polipéptidos p35 de tipo natural codificados por genes ortólogos de otras especies, y polipéptidos que tienen suficiente identidad de secuencia con respecto a esos polipéptidos para mantener la capacidad de estimular la proliferación de células T reguladoras de la misma especie cuando se proporcionan en un heterotetrámero con un componente EBI3 apropiado. Así, las secuencias de polipéptidos p35 preferidas tienen al menos 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 90% , 91 % , 92% , 93% , 94% , 95% , 96%, 97%, 98% , o 99% de identidad de secuencia con respecto a las secuencias a las que se hizo referencia anteriormente (por ejemplo las de W097/13859 o las de Gen Bank, o a polipéptidos de tipo natural codificados por genes ortólogos de otras especies). La referencia a un ácido n ucleico que codifica un polipéptido p35 debe ser interpretada de acuerdo con esto. En particular, las sustituciones conservadoras en EBI3 o en p35 (comparadas con las secuencias de referencia) pueden ser particularmente bien toleradas, sin efecto sustancial en la función de EBI3-p35.
U na sustitución conservadora puede ser definida como una sustitución dentro de una clase de aminoácido y/o una sustitución q ue califique positiva en la matriz BLOSU M62. De acuerdo con una clasificación , las clases de aminoácidos son ácidos, básicos, polares no cargados y no polares, en donde los aminoácidos ácidos son Asp y Glu ; los aminoácidos básicos son Arg , Lys, y His; los aminoácidos polares no cargados son Asn, Gln , Ser, Thr y Tyr; y los aminoácidos no polares son Ala, Gly, Val, Leu , Me, Pro, Phe, Met, Trp y Cys. De acuerdo con otra clasificación , las clases de aminoácidos son hidrofílicos pequeños, ácidos/acidamida/hidrofílicos, básicos, hidrofóbicos pequeños y aromáticos, en donde los aminoácidos hidrofílicos pequeños son Ser, Thr, Pro, Ala y Gly; los aminoácidos ácidos/acidamida/hidrofílicos son Asn , Asp, Glu y Gln; los aminoácidos básicos son His, Arg y Lys; los aminoácidos hidrofóbicos pequeños son Met, lie, Leu y Val; y los aminoácidos aromáticos son Phe, Tyr y Trp. Las sustituciones con puntuación positiva en la matriz BLOSUM62 son como sig ue:
Residuo Original C S T P A G N D E Q H R K M I L V F Y W T S D E E I M M M H
N N Q Y F Sustitución - A s - S - D Q R Q L L I I F E Y K W Y
N H K K R V V V L W El porcentaje (%) de identidad de secuencia del aminoácido con respecto a u na secuencia de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir saltos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar cualesquiera sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Los valores de identidad en % pueden ser determinados mediante WU-BLAST-2 (Altschul et al. , Methods ¡n Enzymology, 266: 460-480 (1 996)) . WU . BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se establece para los valores por defecto. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: amplitud de solapamiento = 1 , fracción de solapamiento = 0.25, umbral de palabra (T) = 1 1 . El valor del % de identidad de secuencia del aminoácido se determina mediante la cantidad de residuos idénticos que coinciden , determinada mediante WU-BLAST-2 , dividida por la cantidad total de residuos de la secuencia de referencia (saltos introducidos por WU-BLAST-2 en la secuencia de referencia para aumentar al máximo la puntuación de alineamiento que está siendo ig norado), multiplicado por 1 00. El porcentaje (%) de similitud está definido en la misma forma que la identidad , con la excepción de q ue se cuentan los residuos que califican con un valor positivo en la matriz BLOSU M62. Así, los residuos que no son idénticos, pero que tienen propiedades similares (por ejemplo, como resultado de sustituciones conservadoras), también se cuentan. De manera similar, el porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico con respecto a un ácido nucleico de referencia está definido como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia candidata, que son idénticos con los residuos de nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico de referencia. Los valores de identidad usados aquí pueden ser generados por el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 establecido en los parámetros por defecto, con amplitud de solapamiento y fracción de solapamiento establecidos en 1 y 0.125, respectivamente. Todos los números de acceso proporcionados en esta especificación se toman del boletín de GenBank número 140.0, del
15 de febrero de 2004. EBI3-P35 Como se usa aquí, el término EBI3-p35 se refiere a cualquier complejo intramolecular o molécula simple que contiene al menos un componente polipéptido EBI3 y al menos un componente polipéptido p35 tal como se describió anteriormente. Se sabe que EBI3 y p35 se asocian uno con el otro in vivo; de acuerdo con Devergne et al. (véase más arriba), esta interacción es no covalente, y no involucra uniones disulfuro. Como se usa en la presente invención, los componentes EBI3 y p35 pueden estar asociados uno con otro ya sea covalentemente o no covalentemente. La asociación covalente puede ser deseable, dado que la molécula de EBI3-p35 así formada puede tener beneficios sobre u n complejo asociado de manera no covalente en términos de estabilidad y posiblemente también de actividad . En modalidades preferidas, los componentes EBI3 y p35 están coexpresados como una proteína de fusión . Para producir una proteína de fusión , se construye un vector de expresión de ácido nucleico que contiene secuencias codificadoras para cada componente en un marco de lectura abierto contin uo, de tal forma que los dos componentes se puedan trasladar como parte de la misma cadena de polipéptidos. Típicamente, se incluye un enlazante péptido flexible entre los dos componentes, para permitir que los dos componentes interactúen libremente uno con otro sin barreras esféricas. El conocedor de la materia es perfectamente capaz de diseñar un enlazante apropiado. Convencionalmente, estos enlazantes tienen entre 1 2 y 20 aminoácidos de longitud , y tienen una alta proporción de residuos aminoácidos pequeños e hidrofílicos (por ejemplo, glicina y serina) para proporcionar la flexibilidad requerida sin comprometer la sol ubilidad acuosa de la molécula. Alternativamente, uno o ambos de los componentes EB I3 y p35 puede ser diseñado para aumentar su afinidad por el otro. Esto puede log rarse de diversas formas. Por ejemplo, se puede introd ucir residuos de cisteína en u no o en ambos componentes para permitir que los dos componentes formen uniones disulfuro uno con el otro.
Como una alternativa ad icional , la interacción entre los componentes EBI3 y p35 pueden ser promovidos enlazado cada componente a un componente heterólogo, en donde los dos componentes heterologos sean capaces de mteractuar uno con el otro. En donde los componentes heterologos son polipéptidos, pueden expresarse como proteínas de fusión con los componentes EB I3 y p35. Los componentes heterologos preferidos son polipéptidos que contiene secuencias de anticuerpos Fe, y preferiblemente uno o más dominios de anticuerpos Fe (por ejemplo, dominios CH2, CH3 y/o CH4 (si es apropiado) o IgG , Ig M , etc.) . Preferiblemente la secuencia bisagra localizada normalmente entre los dominios CH 1 y CH2 está incluida también. La región bisagra contiene residuos de cisteína que forman uniones disulfuro entre las cadenas pesadas del anticuerpo natural intacto. Así, si las regiones bisagra están presentes en las moléculas de EBI3-p35 descritas aquí, se formarán uniones similares para estabilizar las interacciones entre las cadenas. El conocedor de la materia se dará cuenta de componentes heterologos alternativos que se pueden usar para aumentar o estabilizar la interacción entre componentes EBI3 y p35. Estos incluyen polipéptidos con cremallera de leucina, los cuales se dimerizan por medio de interacciones hidrofóbicas. Si bien se prefiere métodos recombinantes, los componentes EBI3 y p35 también pueden ser unidos covalentemente por medios químicos. Las moléculas enlazantes qu ímicas bifuncionales y polifuncionales apropiadas para conjugar o para entrecruzar moléculas de polipéptido una con otra, son familiares para el conocedor de la materia. Los complejos y moléculas de EBI3-p35 que se usan en los métodos y composiciones de la invención , pueden contener dos o más componentes EBI3 y/o dos o más componentes p35. En modalidades particularmente preferidas, EB I3-p35 contiene dos componentes EB I3 y dos componentes p35; es decir, es un heterotetrámero, Preferiblemente, cada componente EBI3 y p35 está unido covalentemente al menos a otro componente EBI3 o p35. Más preferiblemente, todos los componentes EBI3 y p35 en la molécula de EBI3-p35 están u nidos covalentemente uno al otro. Estos enlaces covalentes pueden ser directos (es decir, entre átomos de componentes EBI3 y p35) o indirectos (por ejemplo, por medio de enlazantes químicos, por medio de enlazantes péptidos en proteínas de fusión , o por medio de enlaces disulfuro entre componentes heterólogos que por sí solos están ligados covalentemente a uno o más de los componentes EBI3 o p35). El conocedor de la materia será capaz de concebir n umerosas configuraciones posibles para la moléculas de EBI3-p35. A manera de ejemplo, la molécula de EBl3-p35 puede ser una sola cadena de polipéptidos que contiene (al menos) dos componentes EBI3 y dos componentes p35. Alternativamente, puede contener (al menos), dos proteínas de fusión , cada una con un componente p35 y un componente EBI3, que pueden estar u nidas juntas covalentemente o no covalentemente, por ejemplo, por medio de componentes heterólogos de las proteínas de fusión . La construcción descrita en los ejemplos contiene dos polipéptidos, cada uno elaborado de un componente p35, un componente EBI3 y una secuencia de anticuerpo bisagra/Fc. Las dos cadenas están unidas covalentemente por medio de uniones disulfuro formadas entre las regiones bisag ra del anticuerpo. También se puede usar componentes heterólogos para impartir propiedades adicionales o mejoradas al EBI3-p35. Por ejemplo, las proteínas de fusión que contienen regiones de anticuerpo Fe y bisagra (denominadas comúnmente como inmunoadhesinas) , tienen típicamente una vida media más larga in vivo que las proteínas solas. Así, la construcción descrita en los ejemplos puede tener una vida media mejorada in vivo, comparada con un heterotetrámero EB I3-p35 que carece de la región Fe. Esta construcción de tipo inmunoadhesina puede requerir una administración menos frecuente para un paciente que otras proteínas. Preferiblemente, las regiones Fe y bisagra provienen de una molécula de IgG . Células T reguladoras Las células T reguladoras (células TR o Treg; Sakaguchi, S et al. J Immunol. 1 55: 1 1 51 , 1 995) son un subconjunto de células cuya función principal parece ser para regular hacia abajo la proliferación y la actividad de las células T efectoras auto reactivas. Para revisiones véase Shevach EM Ann . Rev. Immunol. 1 8:423, 2000; Maloy K y F Powrie. Nat. Immunol. 2: 816, 2001 ; Sakaguch i S et al. Immunol. Rev. 1 82 : 1 8, 2001 . Las células TR típicamente son CD4+CD25+, si bien el factor de transcripción FOXP3 (Brunkow, M . E. et al (2001 ). Nat. Genet. 27: 68-73) puede ser un marcador más confiable para las células TR involucradas q ue CD25 (Hori et al. (2003) Science. 299: 1 057-1 061 ; Walker et al. (2003) J . Clin . Invest. 1 1 2: 1437-1443). Así, el término "células T reguladora" puede tomar el significado de una célula T que expresa al menos DC4 y FOXP3, y opcionalmente también CD25. Los seres humanos con mutaciones en FOXP3 y por ello deficientes en células TR, sufren de I PEX (disfunción inmunológica, poliendocrinopatía, enteropatía, síndrome ligado a X) , el cual está acompañado por una enfermedad autoinmunológica tal como diabetes de tipo I , trastorno intestinal inflamatorio, y alergia grave. Si bien no se prevé que la admin istración simple de EBI3-p35 podría tratar el I PEX por si solo, está claro que las condiciones asociadas pueden ser ocasionadas por la actividad inadecuada o por disfunción de las células Treg . Por lo tanto, la EBI3-p35 tiene que ser útil para el tratamiento de las condiciones similares (por ejemplo, diabetes de tipo I , trastorno intestinal inflamatorio y alergia, tal como asma) , en sujetos q ue son capaces de producir células TR funcionales.
Se ha demostrado que el agotamiento de las células TR o el daño de la fu nción de las células TR da como resultado la enfermedad autoinmunológ ica en modelos murinos. La enfermedad ocasionada en los animales de prueba incluye artritis (por ejemplo, artritis reumatoide), enfermedad inflamatoria intestinal, gastritis, anemia perniciosa, tiroiditis, insulitis, diabetes, sialoadenitis, adrenalitis, orquitis/ooforitis autoinmunológica, glomerulonefritis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y encefalitis experimental autoinmunológica y esclerosis múltiple. También se ha demostrado que la ind ucción de una respuesta de tipo 1 de las células T reguladoras reduce el desarrollo de ateroesclerosis en modelos murinos (Mallat Z. et al. Circulation 1 08: 1232-7, 2003). También se ha demostrado que la actividad de TR es significativa en la proporción en la cual se rechazan los aloinjertos. El agotamiento de las células TR o el deterioro de la función, acelera la tasa de rechazos, mientras que se ha demostrado que la infusión de animales de prueba con linfocitos singénicos enriquecidos en las células TR prolonga la supervivencia al injerto. Así, la EBI3-p35 también puede usarse para tratar rechazo de injertos o para prolongar la supervivencia a injertos. Terapia usando EBI3-p35 En vista de lo anterior, se verá q ue la EBI3-p35 representa por lo tanto una terapia realista para el tratamiento de las condiciones mencionadas anteriormente y para prolongar la supervivencia a injertos, por ejemplo en receptores de transplantes, reforzando la cantidad de células T reguladoras en sujetos afectados, y aumentando de esta manera su capacidad para regular hacia abajo la actividad de las células T efectoras (por ejemplo, célula T auxiliar y citotóxica). La proteína EB I3-p35 puede ser administrada directamente a sujetos en composiciones farmacéuticas. Alternativamente, los ácidos nucleidos que codifican las construcciones EB I3-p35 pueden ser administrados a sujetos de tal forma que se exprese EBI3-p35 de las propias células de los sujetos. Típicamente, los ácidos nucleicos serán parte de uno o más vectores de expresión , los cuales pueden ser administrados como ácido nucleico desnudo o en un vehículo de suministro tal como un vector viral. Como alternativa, se puede administrar a un sujeto células que son capaces de manera natu ral de expresar y secretar EBI3-p35, o q ue han sido diseñadas para hacerlo. Preferiblemente las células son singénicas o histocompatibles con el sujeto. Por ejemplo, se puede sacar las células de un sujeto, transfectarse con uno o más vectores apropiados y readministrarse al sujeto. El conocedor de la materia será capaz de diseñar vectores de expresión de ácido nucleico apropiados para usos terapéuticos (así como también para otros usos descritos en esta especificación). Los vectores contendrán típicamente secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias mejoradoras, genes marcadores y otras secuencias, dependiendo de la forma particular de EB I3-p35 que va a ser administrada (véase más arriba) . Los vectores pueden estar dirig idos a integ rarse en un cromosoma celular anfitrión , o pueden existir y reprod ucirse independientemente de los cromosomas anfitriones como un episoma. En donde la EB I3-p35 que va a ser expresada está compuesta de dos cadenas de polipéptidos discretas (es decir, transcritas y traducidas independientemente), estos polipéptidos normalmente estarán codificados por genes discretos o casetes de expresión . Estos genes o casetes de expresión pueden estar ubicados en el mismo vector, es decir, como parte de una sola molécula de ácido nucleico, o en vectores separados. Se puede usar EBI3-p35 in vivo para aumentar la cantidad de células T reguladoras en un sujeto. Sin embargo, la EBI3-p35 también se puede usar in vitro o ex vivo (por ejemplo, en cultivo celular) para expandir las poblaciones de células T reguladoras. Las células T reguladoras pueden ser aisladas de una muestra (por ejemplo, de sangre o de células mononucleares de sangre periférica) , antes del tratamiento con EB I3-p35 (por ejemplo, mediante selección para linfocitos CD4+CD25+, mediante clasificación magnética de células u otros métodos apropiados) , o alternativamente, se puede tratar una población heterogénea de linfocitos con EBI3-p35. La población expandida de células T reguladoras puede ser purificada adicionalmente después de esto si se desea. Así, las poblaciones e linfocitos pueden ser enriquecidas en células T reguladoras, o se puede generar poblaciones más o menos pu ras de células reguladoras en el laboratorio. Las células así obtenidas pueden ser útiles para propósitos de investigación o para su administración a un sujeto. Por lo tanto, las células T reguladoras obtenidas en el laboratorio mediante estos métodos pueden ser formuladas apropiadamente (por ejemplo, en una composición farmacéutica) , para su administración a un sujeto, q ue preferiblemente es singénico o histocompatible con estas células. Preferiblemente, el receptor habrá sido la fuente original de las células. Por consiguiente, se puede obtener una muestra de sangre que contiene células T reguladoras de un sujeto, antes de expandir las células T reguladoras hasta un grado deseado mediante tratamiento con EBI3-p35 y readministrando las células expandidas al sujeto. Esto puede ser útil si por cualquier razón no es factible administrar la proteína EBI3-p35 directamente al sujeto. Los sujetos preferidos para tratamiento mediante los métodos de la invención son mamíferos. Los sujetos preferidos son primates (incluyendo seres humanos) , roedores (incluyendo ratones y ratas) y otros animales comunes de laboratorio, domésticos y agrícolas, incluyendo, sin limitación a ellos, conejos, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, cabras, etc. Formulaciones farmacéuticas Los complejos, polipéptidos, ácidos nucleicos y células de la invención , se pueden formu lar en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden contener, además de una de las sustancias anteriores, un excipiente, portador, reg ulador u otros materiales familiares para los conocedores de la materia aceptables para uso farmacéutico. Estos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador o de otro material puede depender de la vía de administración , por ejemplo, las vías oral , intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal , intramuscular e intraperitoneal. Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede incluir un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un portador líq uido, tal como ag ua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede inclu ir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución sacárida o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio afectado, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa aceptable parenteralmente que es libre de pirógenos y que tiene pH , isotonicidad y estabilidad apropiadas. Los conocedores de la materia son capaces de preparar soluciones apropiadas usando, por ejemplo, vehículos isotón icos tales como inyección en cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer con lactato. Puede incluirse conservadores, estabilizadores, reg uladores de pH , antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Cualquiera que sea la naturaleza del agente activo q ue se va a sumin istrar a un individuo (por ejemplo, una célula, un polipéptido, una molécula de ácido nucleico, otro agente útil farmacéuticamente de acuerdo con la presente invención) , es preferible su administración en una "cantidad efectiva profilácticamente" o en una "cantidad efectiva terapéuticamente" (según el caso, aunque se puede considerar la profilaxis como terapia) , que sea suficiente para mostrar beneficio para el individuo. La cantidad real administrada y la proporción y periodo de administración , dependerán de la natu raleza y de la gravedad de lo que esté siendo tratado. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosis, etc. , está dentro de la responsabilidad de practicantes generales y otros doctores médicos, y típicamente toma en cuenta el trastorno que va a ser tratado, la condición del paciente individual, el sitio de suministro, el método de administración y otros factores conocidos para los practicantes. Los ejemplos de las técnicas y procedimientos mencionados anteriormente pueden encontrase en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a. edición, 2000. pub. Lippincott, Williams & Wilkins. Alternativamente, se puede usar terapias de apuntamiento para suministrar el agente activo más específicamente a ciertos tipos de célula, mediante el uso de sistemas de apuntamiento tales como ligandos específicos para anticuerpos o células. El apuntamiento puede ser deseable por una variedad de razones, por ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico , o si de otra manera requeriría una dosis demasiado alta, o si de otra manera no podría ser capaz de entrar en las célu las objetivo. En lugar de administrar estos agentes directamente, ellos podrían ser producidos en las células objetivo mediante expresión de un gen codificador introd ucido en las células, por ejemplo, en un vector viral (por ejemplo, un vector retroviral, lentiviral o adenoviral) . El vector podría ser apuntado a las células específicas que se desea tratar, o podría contener solamente elementos reguladores que sean activados más o menos selectivamente por las células objetivo. Se puede administrar una composición sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultáneamente o secuencialmente, dependiendo de la condición q ue va a ser tratada. Ejem plos 1 . Construcción de vector enlazante pSec. Se diseñaron dos oligos complementarios y se sintetizaron con fosforilación en el extremo 5' . Directo: 5'-GATCC GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT G ; inverso: 5'-AATTC AGA ACC ACC ACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC G. Los sitios de restricción enzimática BamH I y EcoRI fueron introducidos en los extremos 5' y 3' respectivamente. Se disolvieron los oligos con regulador TE y se ajustaron a 120 pmol/µ?.. Se mezcló 100 µ!_ de cada uno y se incubó en un bloque de calor a 98 "C durante 10 minutos, seguido por enfriamiento natural hasta temperatura ambiente para fijar los dos oligos. Este fragmento de ADNds codifica una secuencia enlazante en un marco de lectura como el que se muestra a continuación.
5'-GATCC GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT G G CCA CCA CCA CCA AGA CCA CCA CCA CCA AGA CCA CCA CCA CCA AGA CTTAA-5' G S G G G G S G G G G S G G G S E K
Se digirió un vector pSecTag2A (Invitrogen) con BamHI y EcoRI antes de ser purificado en gel de agarosa con un equipo para extracción con gel (QIAGEN). Se ligaron los fragmentos enlazantes con vector pSecTag2A digerido, antes de la transformación de células DH5a competentes con 5 µL· de reacción de ligación. Se secuenciaron en ADN dos plásmidos de clones individuales. Ambos contenían una sola copia de secuencia enlazante en la orientación correcta. 2. Construcción del vector pSec-enlazante-hlgGIFc. Se transcribió inversamente un fragmento de hlgG-Fc/bisagra amplificado con PCR, de PBMC humano a ADNc. Los sensibilizadores usados fueron: Directo: 5'GAG CCT CGA GCC GAG CCC AAA TCT TGT GA; Inverso: 5'-AGA AGT CGA CTT ATT TAC CCG GGG ACA GG. Se digirió el producto de la PCR purificado con Xhol y Salí y se purificó adicionalmente en gel de agarosa. Al mismo tiempo, se preparó el vector en lazante pSec para digestión con Xhol y se desfosforiló con AP de camarón antes de purificarse en gel como se describió anteriormente. Se estableció la ligación d urante la noche a 1 5 °C con un fragmento de IgG humana Fe PCR tal como se describió anteriormente: El vector pSec-enlazante-h lgGIFc se purificó en DH5a transformado. 3. Construcción de plásm ido de expresión EBI3-p35-Fc Se amplificaron los fragmentos para marcos de lectura abiertos de EBI3 e I L-12p35 mediante RT-PCR, respectivamente, de ARN total de macrófago de médula ósea murino después de estimulación du rante la noche con LPS e I FNy. Los fragmentos de PCR fueron insertados en el vector TA (I nvitrogen) para secuenciación de ADN . El resultado de la secuenciación coincidió exactamente con las secuencias de Gen Bank para EBI3 and I L-12p35 murinos. Los siguientes sensibilizadores para PCR fueron diseñados para construir el vector de expresión de EBI3-I L-12p35-hFc: EB I3 directo: 5'-CCCCGGATCCCACTGAAACAGCTCTCGTGGCTCT EB I3 inverso: 5'-CGGGATCCCTTATGGGGTGCACTTTCTACTTGCC I L-12p35 directo: 5'-GGCCGAATTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCA I L-12p35 inverso : 5'-GGCGGCGGCCGCATAGCCCATCACCCTGTTGA Los fragmentos de PCR codificados para las proteínas EBI3 e I L-12p35 fueron amplificados con los sensibilizadores anteriores, y ADN polimerasa Pfu de los clones de EBI3 y de p35 del vector TA de ADNc. El fragmento de PCR de EBI3 fue digerido con BamH I e insertado en el vector pSec-en lazante-h lgGIFc del sitio BamH I , tal 7mo se muestra a continuación .
ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT Met Glu Thr Asp Th r Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Secuencia guía de la cadena Ig-K CCA GGT TCC ACT GGT GAC GCG GCC CAG CCG GCC AGG CGC GCC GTA Pro Glv Ser Thr Glv Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val BamH I CGA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CC Arg Ser Leu La orientación de inserción fue verificada por digestión con EcoRV. Este vector fue denominado pEB I3-L-Fc. El pEBI3-L-Fc fue abierto con EcoRI y con Notl antes de la purificación en gel. También se digirió el fragmento de PCR ml L-12p35 con EcoRI y con Notl y se insertó en el vector pEBI3-L-Fc para producir pEB I3-L-p35-Fc (más adelante) . BamH I GGA TCC GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT Glv Ser Glv Glv Glv Glv Ser Glv Glv Glv G lv Ser Glv Glv Enlazante EcoR\ GGT GGT TCT GAA TTC p35 Glv Glv Ser Glu Phe
EcoR\ Pst I ?/otl Xho I GA ATT CTG CAG ATA TCC AGC ACA GTG GCG GCC GCT CGA GCC Arg Ala
GAG CCC AAA TCT TGT.... hlgG-bisagraFc G lu Pro Lys Ser Cys
La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína de fusión EB I3-p35-Fc se muestra en la figura 7. 4. Expresión de EBI3-p35-Fc en cél ulas de mamífero Se transfectaron células Cos-7 con el vector de expresión
EBI3-p35-Fc y se detectó la proteína producida después de 48 h mediante ELI SA de hlgG . Se precipitó la proteína expresada con perlas de agarosa con proteína A antes de la detección Western con anticuerpo lgG 1 antih umano. En la fig ura 1 se muestra una banda de proteína en el peso molecular predicho (78 kDa) , loa cual también muestra una representación diagramática de la proteína de fusión . Se transfectaron células CHO con vector EB I3-p25-Fc y se seleccionaron células resistentes a la Zeocina después de dos semanas. Se seleccionaron veinte colonias para expansión. Se mantuvieron tres colonias que expresaron el nivel más alto de proteína recombinante, para su uso posterior. 5. Purificación de EBI3-p35-Fc mediante colum na de afinidad. Una de las líneas celulares con expresión más alta fue expandida con medio DM EM con 1 0% de suero fetal bovino ultra bajo en IgG (G I BCO). Se recolectó un litro de medio después de 9 días. Se centrifugó el supernadante del cultivo a 5000 rpm d urante 30 minutos para deshacerse de los detritos celulares y luego se cargó en una columna de proteína agarosa a 4 °C durante la noche. Se mantuvo la velocidad de flujo por debajo de 1 mL por minuto para permitir que la proteína de fusión se uniera a las perlas de proteína A. Se lavaron las perlas en la columna a temperatu ra ambiente con PBS hasta que la OD280 del flujo estuvo por debajo de 0.01 . La proteína de unión fue eluida con reg ulador para elución (0.1 M de Glicina, pH 3.0) . Se recolectaron 1 5 fracciones de 1 mL y se neutralizaron inmediatamente con 50 µL· de Tris. HCI 2M , con un pH de 8.0. Se midió la concentración de proteína de cada fracción con un Ensayo de Proteína Coomassie. Se agruparon las fracciones que contenían las concentraciones más altas de proteína. Se verificó la pureza de la proteína con SDS-PAG E (Fig 2).
6. Análisis funcional de EB13-p35-Fc in vitro. Primero investigamos la capacidad de EBI3-p35-Fc para inducir la proliferación de células T in vitro. Se purificaron células T del bazo y nodos linfáticos de ratones BALB/c normales mediante clasificación de células por adherencia magnética (MACS) . Luego se clasificaron adicionalmente en los subconjuntos CD4+, CD8+, CD4+CD25- y CD4+CD25+. La pureza de las células normalmente fue > 95% , demostrada mediante citometría de flujo (no se muestra) . Se cultivaron las células T CD4+ y las células T CD4+CD25- durante 72 horas con anticuerpo anti-CD3 unido a placas (1 µg/mL) en medio de cultivo en la presencia de concentraciones graduadas de EBI3-p35-Fc. Ambos subconjuntos de células T proliferaron sin la adición de EBI3-p35-Fc, la cual indujo la proliferación adicional de estas células en una manera dependiente de la dosis (véase, por ejemplo, la figura 3) . Las célu las T C D4+CD25+ T se conocen como células T reguladoras (Treg) (Sakaguch i S et al. J . Immunol. 1 55: 1 151 , 1 995) . Su función principal es regular hacia abajo la expansión de células efectoras, tales como las células T CD4+CD25 y las células T CD8 + , cuya activación excesiva puede conducir a una gama de enfermedades autoinmunológicas (Shevach EM Ann . Rev. I mmunol. 1 8:423, 2000; Maloy K y F. Powrie F. Nat. Immunol. 2: 816, 2001 ). Las células T CD4+CD25+ son de origen natu ral, y son notablemente difíciles de expander in vitro. La fig ura 4 muestra que las células T CD4+CD25+ proliferaron en la presencia de EBI3-p35-Fc en una forma dependiente de la dosis. Estas células Treg son poderosos reguladores q ue pueden suprimir la proliferación de células T efectoras CD4+CD25-T en una proporción de 1 : 1 0. Por ello, esto nos hace pensar que si una función de EBI3-p35-Fc in vivo es la expansión de las células Treg, por lo tanto previene la sobre expansión de las células T efectoras, tales como las células T CD4+CD25. Se purificaron células CD4+CD25+ y CD4+CD25-T de ratones BALB/c tal como se indicó anteriormente, y luego se cultivaron con anticuerpo anti-CD3 unido a placas en la presencia de f EBI3-p35-Fc durante 3 días. Se recolectaron las células, se lavaron y se cultivaron con anti-CD3 soluble y células presentadoras de antígeno, para someter a prueba la actividad supresora de las células Treg CD4+CD25+. Los dos subconjuntos de células T expandidas fueron cultivados ya sea solos o en combinación (en una proporción 1 : 1 ) . La figura 5 muestra que mientras que las células T CD4+CD25- solas proliferaron significativamente bajo estas condiciones, las células T CD4+CD25+ no lo hicieron . De manera interesante, las células Treg CD4+CD25+ suprimieron la proliferación de células efectoras CD4+CD25-. También se observó supresión similar de la producción de citocina (I L-2 e I FNy) (no se muestran datos). Estos datos sugieren que la EBI3-p35-Fc puede tener potencial terapéutico en el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas expandiendo las células Treg CD4+CD25+ in vivo. 7. Efecto de la EBI3-p35-Fc in vivo Hemos sometido a prueba el efecto de la EBI3-p35-Fc en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones usando un procedimiento establecido (Leu ng BP et al. J . I mmunol. 1 70: 1 524, 2003) . Está aceptado generalmente que la CIA es un sustituto de la artritis reumatoide, una enfermedad que aflige hasta el 1 % de la población h umana alrededor del mu ndo. En este modelo, se inmunizó a ratones DBA/1 subcutáneamente con colágeno bovino de tipo I I (Cl l) (200 µg) en adyuvante de Freu nd completo y se reforzaron intraperitonealmente el día 21 con Cl l (200 µg) en salina regulada fosfatada (PBS) . Se inyectó a los ratones pro vía intraperitoneal diariamente con PBS o con EBI3-p35-Fc (2 µg/ratón) desde el d ía 24 cuando comenzaron los síntomas de artritis. Se vigiló a los ratones diariamente para detectar los síntomas de artritis, para lo cual se asignaron calificaciones de gravedad como sigue: 0 = normal, 1 = eritema, 2 = eritema mas inflamación, 3 =extensión/pérdida de funciones, y puntuación total = suma de los cuatro miembros. El espesor de la pata se midió con un calibre de disco (Kroeplin , M unich , Alemania). La figura 6 muestra q ue los ratones de control tratados con PBS desarrollaron la enfermedad esperada (puntuación incidente y clín ica) , mientras que los tratados con EB I3-p35-Fc mostraron síntomas mínimos de la enfermedad. Mientras que los ratones de control tuvieron malestar y pérdida de peso, los ratones tratados permanecieron saludables y mostraron un aumento de peso normal . Estos resultados por lo tanto, ilustran claramente el potencial terapéutico de la EBI3-p35-Fc en la enfermedad inflamatoria y/o autoinmu nológica. A continuación sometimos a prueba la capacidad de la EBI3-p35-Fc para atenuar una artritis establecida, y comparamos este efecto con el de reactivos que se sabe q ue son beneficiosos para la artritis clín ica (FNT-R alfa recombinante (Enbrel)) y experimental (sI L-1 5Ra). Se sensibilizó a ratones DBA/1 y se reforzaron con colágeno tipo I I en FCA tal como se describió anteriormente. Luego se trató a los ratones i.p. diariamente con 2 µg de EBI3-p35-Fc, Enbrel, u na combinación de los dos reactivos, o slL-15R, desde los días 27 hasta 36. Tal como se muestra en la figura 8, la EBI3-p35-Fc es efectiva en la atenuación de la CIA en progreso, cuando se inyecta intraperitonealmente el día 27 del experimento, cuando la enfermedad ya está establecida. Además, la EBI3-p35-Fc es tan efectiva como el sl L-1 5Ra o Enbrel para el tratamiento de la CIA. 8. Papel terapéutico potencial de la EBI3-p35-Fc en otras enfermedades Las células Treg CD4+CD25+ tienen una amplia gama de actividades supresoras. En modelos murinos experimentales, se ha demostrado que estas células Treg suprimen CIA, asma, gastritis, enfermedad inflamatoria intestinal y rechazos de aloinjerto (Sakag uchi S et al. Immunol . Rev. 1 82: 18,2001 ; Shevach EM Ann . Rev. I mmunol. 1 8: 423,2000) . Basados en nuestro descubrimiento de q ue la EBI3-p35-Fc expandió poderosamente las células Treg CD4+CD25+ in vltro y en su efecto terapéutico demostrado en la CIA, se espera que esta molécula de fusión y otros complejos y construcciones con EBI3-p35 descritos en esta especificación , podrán tener un papel terapéutico contra todas estas condiciones. Para confirmar esto, sometimos a prueba la EBI3-p35-Fc en un modelo murino de asma. Se inyectó a ratones BALB/c por vía ¡ntraperitoneal con 1 00 µ9 de ovalbúmina (OVA) de pollo en una suspensión en alumbre los días 0 y 14. El día 14, se anestesió a los ratones con avertina, y se les administró 1 00 µ9 de OVA en 40 µ?_ de PBS por vía intratecal (i . t.) . Se anestesió nuevamente a los ratones antes de ser expuestos i. t. en cada uno de los días 25, 26, y 27 con 1 0 µ9 de OVA en 40 µ?_ de PBS. Para el tratamiento con EBI3-p35, se inyectó por vía ¡ntraperitoneal a los ratones con 2 µg de EBI3-p35-Fc en tres ocasiones (días 25, 26 y 27) 1 h antes de la exposición a OVA. Se suministró PBS en lugar de OVA a los ratones de control negativo tanto en la etapa de sensibilización como en la etapa de exposición . Se sacrificó a los ratones el d ía 29 mediante administración de u na dosis fatal de avertina. Inmediatamente después de la administración de avertina, se recolectó una muestra de sangre mediante punción cardiaca. Luego se recolectó el lavado bronquio alveolar (BAL) y se contó usando un hemocitómetro. Los conteos de células totales se muestran en la figura 9 (A) . Se elaboraron preparaciones con citospina y se tiñeron con Diff-Quick, en un método de tinción rápida Romanowsky. Se realizó conteo de células diferencial para determinar el nivel de eosinofilia. Las concentraciones de Ig E y de I L-4 específicas para ovalbúmina en el supernadantes de BAL se determinaron mediante ELISA específica. La fig ura 9 muestra q ue los ratones tratados con EBI3-p35-Fc produjeron infiltrados de célu las BAL totales marcadamente reducidos, y redujeron sig nificativamente la eosinofilia (no se muestran datos) , Ig E específica para OVA en suero, e I L-4 total en el fluido BAL. Todas estas son características de hipersensibilidad de las vías respiratorias. Estos resultados demuestran que la EBI3-p35 es efectiva para atenuar u n asma establecido. 9. Producción y caracterización de EBI3-p35 humana La EBI3-p35 humana ha sido clonada ahora también como una proteína de fusión con Fe. Su actividad in vitro ha sido sometida a prueba usando células T h umanas en sangre periférica. La proteína EBI3-p35-Fc humana duplica todas las propiedades de la EBI3-p35-Fc murina descrita en la sección 5 anterior, e ilustrada en las fig uras 2 hasta 5 (no se muestran datos). Si bien la invención ha sido descrita en conjunto con los ejemplos de modalidades descritas anteriormente, muchas modificaciones y variaciones eq uivalentes serán evidentes para los conocedores de la materia, cuando se les proporcione esta descripción . De acuerdo con esto, los ejemplos de modalidades de la invención expuestos, se considera que son ilustrativos y no limitantes. Se puede hacer diversos cambios a las modalidades descritas sin apartarse del espíritu y alcance de la invención . Todas las referencias citadas aquí están incorporadas expresamente mediante referencia.