PT101297B - Polipeptideos que sao factores de crescimento mitogenicos para celulas da glia, sequencias de dna que os codificam e aplicacao terapeutica destes polipeptideos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Referência a Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente é uma continuação em parte do N° de Série 07/965,173 entregue em 23 de Outubro, 1992, N° de Série 07/940,389, entregue em 3 de Setembro, 1992, N° de Série 07/907,138, entregue em 30 de Junho, 1992 e N° de Série 07/863,703, entregue em 3 de Abril , 1992.

Fundamento do Invento

Este invento está relacionado com polipeptídeos encontrados em espécies de vertebrados, polipeptídeos esses que são factores de crescimento mitogénicos para células da glia, incluindo células de Schwann. O invento diz também respeito aos processos capazes de produzir tais factores e à aplicação terapêutica de tais factores.

As células da glia dos vertebrados constituem o tecido conjuntivo especializado dos sistemas nervosos central e periférico. Células da glia importantes incluem as células de Schwann que proporcionam o suporte metabólico aos neurónios e que proporcionam a bainha de mielina à volta dos axónios de certos neurónios periféricos, formando assim fibras nervosas individuais. As células de Schwann sustentam os neurónios e proporcionam um efeito de bainha formando camadas concêntricas de membrana à volta de axónios neuronais adjacentes, enrolando-se à medida que se desenvolvem à volta dos axónios. Estas bainhas de mielina são \ 2

um elemento susceptível de mutias fibras nervosas e a danificação das células de Schwann, ou a ausência de crescimento e desenvolvimento, pode estar associado a uma desmielinação significativa ou degeneração dos nervos característica de uma série de doenças e perturbações do sistema nervoso periférico. No desenvolvimento do sistema nervoso tornou-se aparente que as células necessitam de vários factores para regularem a sua divisão e crescimento e vários desses factores foram identificados nos últimos anos, incluindo alguns que possuem efeito sobre a divisão ou desenvolvimento das células de Shwann.

Assim, Brockes et al., inter alia, em J. Neuroscience, 4 (1984) 75-83 descrevem um factor de crescimento proteico

presente em extratos de cérebro bovino e tecido de pituitária, o qual foi designado Factor de Crescimento da Glia (GGF) . Este factor estimulou a divisão de células de Schwann de rato em cultura contra um meio de fundo contendo dez por cento de soro fetal de vitela. O factor foi também descrito como tendo um peso molecular de 31000 Daltons e sendo de fácil dimerização. Em Meth. Enz., 147 (1987), 217-225, Brockes descreve um ensaio para GGF baseado nas células de Schwann.

Brockes et al., supra. também descreve um método para a purificação do GGF até uma homogeneidade aparente. Resumidamente, um método de purificação em larga escala descrito envolve a extracção de lóbulos anteriores bovinos liofilizados e cromato-grafia do material obtido a partir de CM-celulose. A filtração em gel é então realizada com uma coluna de Ultrogel, seguido de eluição de uma coluna de fosfocelulose e finalmente, electrofore-se em gel com SDS em pequena escala. Como alternativa, o material derivado da CM-celulose foi aplicado directamente numa coluna de fosfocelulose, as fracções da coluna foram reunidas e 3

purificadas por electroforese em gel nativo preparativo, seguido de uma electroforese final em gel de SDS.

Brockes et al. observaram que em experiências de filtração em gel anteriormente referidas (brockes et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 8374-8377), o pico principal de actividade do factor de crescimento migra com um peso molecular de 56000 Daltons, enquanto que no primeiro dos processos atrás descritos a actividade foi predominantemente observada com um peso molecular de 31000. Foi descrito que o dímero de GGF é largamente removido como resultado da eluição com gradiente da CM-celulose neste processo.

Benveniste et al. (PNAS, 82. (1985), 3930-3934) descreve um factor de promoção do crescimento da glia derivado de linfóci-tos T. Este factor, em condições redutoras, apresenta uma alteração no peso molecular aparente em géis de SDS.

Kimura et al. (Nature, 348 (1990), 257-260) descreve um factor que designaram por factor de crescimento derivado de Schwannoma (SDGF) que se obtem a partir de um tumor da bainha do nervo ciático. Os autores estabeleceram que SDGF não estimula a incorporação de TdR marcado com tricio em células de Schwann em cultura em condições em que pelo contrário a fracção derivada de pituitária parcialmente purificada contendo GGF é activa. SDGF tem um peso molecular aparente entre 31000 e 35000.

Davies e Stroobant (J. Cell. Biol., 110 (1990), 1353--1360) descrevem o despiste de uma série de candidatos a mitogé-nios Usaram-se células de Schwann de rato, as substâncias candidatas escolhidas sendo examinadas quanto à sua capacidade para estimular a síntese de DNA nas células de Schwann na presença de 10% FCS (soro fetal de vitela), com e sem Forskolin. Um dos 4 4

factores testados foi a fracção de GGF-carboximetilcelulose (GGF-CM), a qual se mostrou roitogénica na presença de FCS, com e sem Forskolin. O trabalho revelou que na presença de Forskolin, inter alia, o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) é um mitogénio potente para as células de Schwann, PDGF tendo sido anteriormente pensado como não tendo efeito nas células de Schwann.

Holmes et al. Science (1992) 256; 1205 e Wen et al., Cell (1992) £9:559 demonstra que as sequências de DNA que codificam proteínas que se ligam a um receptor (pl85erbB2) estão associadas a vários tumores humanos. A proteína pl85erbB2 é uma proteína de membrana de 185 KD com actividade de cinase de tirosina. A proteína é codificada pelo proto-oncogene erbB2 (Yarden e Ulrich Ann. Rev. Biochem. 57: 443 (1988)). 0 gene erbB2, também referido como HER-2 (em células humanas) e neu (em células de rato), está estreitaroente relacionado com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF). Evidência recente indica que proteínas que interactuam com (e activam a cinase de) pl85erbB2 induzem a proliferação em células portadoras de pl85erbB2 (Holmes et al., Science 256: 1205 (1992); Dobashi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 8582 (1991); Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 89: 2287 (1992)). Ainda, é evidente que o gene codificador das proteínas que se ligam a pl85erbB2 produz uma série de transcritos de RNA cortados e ligados de forma diferencial, de tamanhos variáveis dando origem a um série de proteínas, as quais são de diferentes comprimentos e contêm algumas sequências peptídicas comuns e algumas sequências peptí-dicas únicas. Isto é apoiado pelos transcritos de RNA diferencialmente cortados e religados recuperados de cancro da mama humano (MDA-MB-231) (Holes et al., Science 256: 1205 (1992)). Outro apoio deriva da larga gama de tamanhos das proteínas que actuam 5 5

como ligandos (conforme descrito aqui) para o receptor pl85Cr^B2 (ver abaixo).

Sumário do Invento

De um modo geral o invento proporciona métodos para a estimulação da mitogénese de células da glia (em particular, glia e células de Schwann do sistema nervoso central), assim como novas proteínas que apresentem tal actividade mitogénica para células da glia. Ainda, são proporcionados DNA codificador destas proteínas e anticorpos que se ligam a elas e proteínas relacionadas .

As novas proteínas do invento incluem produtos alternativos de corte e ligação das sequências codificadoras de polipep-tídeos. De um modo geral, estas proteínas conhecidas são membros da família de proteínas GGF/pl85erbB2.

Especificamente, o invento proporciona polipeptídeos de uma fórmula especificada e as sequências de DNA codificadoras daqueles polipeptídeos. Os polipeptídeos possuem a fórmula

WYBAZCX em que WYBAZCX é composto pelas sequências de aminoácidos mostra-

. OS das na Figura 31 (SEQ ID N 136-139, 141-147, 160, 161); em que W compreende o segmento polipeptídico F ou está ausente; em que Y compreende o segmento polipeptídico E ou está ausente; em que Z compreende o segmento polipeptídico G ou está ausente; e em que X compreende os segmentos polipeptídicos C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' HL, i i

I 6

C/D D'HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HKL; desde que a) pelo menos um de F, Y, B, A, Z, C ou X é de origem bovina; ou b) Y compreende o segmento polipeptidico E; ou c) X compreende os segmentos polipeptídicos C/D HKL, C/D D, C/D' HKL, C/D C/D' HKL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL, C/D C/D' D' HKL, C/D'H, C/D C/D'H, ou C/D C/D' HL.

Em adição, o invento inclui a sequência de DNA compre- 5' 3 ' endendo os segmentos codificadores FBA assim como os segmentos polipeptídicos correspondentes tendo as sequências de amino-ácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136, 138, 139); a sequência de DNA compreendendo os segmentos codifica-5' 3 ' dores FBA assim como os segmentos polipeptídicos correspondentes tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136, 138, 140); a sequência de DNA compreendendo os segmentos codifica-5' 3 ' dores FEBA assim como os segmentos polipeptídicos correspon dentes tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139); a sequência de DNA compreendendo os segmentos codifica- /· 5' 3' . . . dores FEBA assim como os segmentos polipeptídicos correspon dentes tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-133, 140); e 7 a seqiuência de DNA compreendendo os segmentos codificadores de polipeptídeos do clone de cDNA GGF2HBS5 (Depóstio ATCC No. 75298, depositado em 2 de Setembro, 1992). 0 invento inclui ainda peptídeos da fórmula FBA, FEBA, FBA', FEBA' e sequências de DNA codificadoras destes peptídeos em que os segmentos de polipeptídeos correspondem às sequências de aminoácidos apresentadas na Figura 31, SEQ ID Nos. (136, 138 e 139), (136-139) e (136, 138 e 140) respectivamente. O polipeptí-deo purificado GGF-II (SEQ ID NO. 167) também está incluído como parte do invento.

Ainda um outro aspecto do invento são peptídeos e DNA codificador dos mesmos que são úteis no tratamento da glia e em particular de oligodendrócitos, microglia e astrócitos, do sistema nervoso central e métodos para a administração destes peptídeos. O invento ainda inclui vectores incluindo sequências de DNA que codificam as sequências de aminoácidos, conforme definidas atrás. Também estão incluídos uma célula hospedeira contendo o DNA isolado codificador das sequências de aminoácidos conforme definido atrás. O invento inclui ainda os compostos que se ligam ao receptor de pl35RerbB2 . . . .. , , ,, , e estimulam a mitogenese de células da glia in vivo e/ou in vitro.

Uma parte do invento diz também respeito a anticorpos contra os novos peptídeos aqui descritos. Ainda, anticorpos contra qualquer um dos peptídeos aqui descritos podem ser usados para a purificação dos mesmos polipeptídeos. Os anticorpos contra os polipeptídeos podem ser também usados para a inibição terapêutica da mitogénese das células da glia. 8 8

O invento proporciona ainda um método para a estimulação da mitogénese de células da glia caracterizado pelo contacto das células da glia com um polipeptídeo definido pela fórmula

WYBAZCX em que WYBAZCX é composto pelos segmentos de polpeptí-deos mostrados na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-147, 160, 161) em que W compreende o segmento de polipeptídeo F ou está ausente, em que Y compreende o segmento de polipeptídeo E, ou está ausente; em que Z compreende o segmento de polipeptídeo G ou está ausente; e em que X compreende o segmento de polipeptídeo C/D HKL, C/D H, C/D H, C/D HL, C/C D, C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' Dr, HL qu C/D C/D' D' HKL. O invento também inclui um método para a preparação de um factor mitogénico para as células da glia que consiste na cultura de células hospedeiras modificadas conforme definido atrás em condições que permitam a expressão das sequências de DNA do invento.

Os peptídeos do invento podem ser usados para fazer uma formulação farmacêutica ou veterinária para uso farmacêutico ou veterinário. Facultativamente, a formulação pode ser usada juntamente com um diluente, veículo ou excipiente aceitável e/ou na forma de dosagem unitária.

Um outro aspecto do invento consiste num método para a estimulação da mitogénese de células da glia por contacto das células da glia com um polipeptídeo definido atrás como um mitogénio das células da glia in vivo ou in vitro. Constitui 9

igualmente parte do invento um método para a produção de um efeito mitogénico sobre células da glia num vertebrado (de preferência um mamífero, mais preferencialmente um ser humano) através da administração de uma quantidade eficaz de um polipep-tídeo como definido. São também parte do invento métodos para o tratamento de doenças e perturbações usando os polipeptídeos descritos. Por exemplo, descreve-se um método para o tratamento ou profiláxia de uma doença ou perturbação nervosa em que podem ser usados os polipeptídeos descritos. Estão também incluídos um método para a profiláxia ou tratamento de um estado patofisiológico do sistema nervoso no qual está envolvido um tipo celular que é sensível ou que responde a um polipeptídeo como definido.

Estão igualmente incluídos no invento métodos para o tratamento quando a condição envolve danificação dos nervos periféricos; danificação dos nervos no sistema nervoso central; perturbações neurodegenerativas; desmielinação no sistema nervoso central ou periférico; ou danificação ou perda das células de Schwann, oligodendrócitos, microglia ou astrócitos. Por exemplo, estão incluídos uma neuropatia das fibras nervosas sensoriais ou motoras ou de uma perturbação neurodegenerativa. Em qualquer um destes casos, o tratamento consiste na administração de uma quantidade eficaz do polipeptídeo. O invento também inclui um método para a indução de regeneração e/ou reparação neuronal por administração de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo como definido atrás. Tal medicamento consiste no polipeptídeo juntamente com um veículo farmaceuticamente eficaz. 10 10

O invento inclui a utilização de um polipeptídeo como definido atrás na produção de um medicamento. O invento inclui ainda a utilização de um polipeptídeo como definido atrás - para imunizar um mamífero para a produção de anticorpos, os quais podem facultativamente ser usados com fins de diagnóstico ou terapêuticos - num ensaio competitivo para identificar ou quantificar moléculas tendo características de ligação ao receptor correspondendo às do polipeptídeo; e/ou - para contacto de uma amostra com um polipeptídeo, conforme referido atrás, juntamente com um receptor capaz de se ligar especificamente ao polipeptídeo com o fim de detectar inibição competitiva da ligação ao polipeptídeo. - num processo de isolamento por afinidade, facultativamente cromatografia de afinidade, para a separação de um receptor correspondente. O invento também inclui um método para a profiláxia ou tratamento de um tumor da glia. Este método consiste na administração de uma quantidade eficaz de uma substância que inibe a ligação de um factor como definido pelos peptídeos atrás. ........Ainda, o invento inclui-um método para a estimulação da actividade mitogénica de células da glia através da aplicação às células da glia de um 11 11

- factor polipeptídico de 30 KD isolado a partir da linha celular humana da mama MDA-MB 231; ou - factor polipeptídico isolado a partir da linha celular fibroblástica de rato transformada I-EJ ou - factor polipeptídico de 75 KD isolado a partir da linha celular humana da mama SKBR-3; ou - factor polipeptídico de 44 KD isolado a partir da linha celular fibroblástica de rato transformada I-EJ; ou - factor polipeptídico de 25 KD isolado a partir de macrófagos peritoneais de murganho; ou - factor polipeptídico de 45 KD isolado a partir de células humanas da mama MDA-MB 231; ou - factor polipeptídico de 7 a 14 KD isolado a partir da linha de células T humana ATL-2; ou - factor polipeptídico de 25 KD isolado a partir de células de rim bovino; ou - factor polipeptídico de 42 KD (ARIA) isolado a partir de cérebros. O invento inclui ainda um método para a utilização dos polipept ídeos EGFL1, "EGFL2, EGFL3 , EGFL4EGFL5 e EGFL6, Figura 38 a 43 e SEQ ID Nos. 154 a 159, respectivamente, para a estimulação de mitogénese das células da glia in vivo e in vitro. 12

Também está incluida no invento a administração do polipeptídeo GGF-II cuja sequência está apresentada na Figura 45 para a estimulação da mitogénese das células da glia.

Um aspecto adicional do invento inclui a utilização dos peptídeos acima referenciados com a finalidade de estimular as células de Schwann para produzir factores de crescimento os quais podem por sua vez ser colhidos para uso ciêntifico ou terapêutico.

Ainda, os peptídeos aqui descritos podem ser usados para induzir proliferação da glia e remielinação para o tratamento de doenças, e.g., MS, onde se pretenda remielinação.

Num outro aspecto do invento os novos polipeptídeos aqui descritos podem ser usados para estimular a síntese de receptores de acetilcolina.

Conforme referido acima, o invento proporciona novos factores de crescimento de células da glia derivados de mamíferos, incluindo factores bovinos e humanos distintos de factores conhecidos. Estes factores são mitogénicos para as células de Scwann contra um fundo de plasma fetal de vitela (FCP). O invento também proporciona processos para a preparação destes factores e um método melhorado para a definição de actividade destes e doutros factores. A aplicação terapêutica dos factores é ainda um outro as pecto importante do invento. .....- Assim, são aspectos importantes do invento: (a) um factor polipeptídico básico tendo actividade mitogénica sobre as células da glia, mais especificamente, actividade mitogénica sobre as células de Schwann na presença de 13 plasma fetal de vitela, com um peso molecular entre aproximada-mente 30 e 36 KD e incluindo na sua sequência de aminoácidos qualquer uma das sequências peptídicas que se seguem:

FKGDAHTE

ASLADEYEYMXK

TETSSSGLXLK

ASLADEYEYMRK

AGYFAEXAR

TTEMASEQGA

AKEALAALK

FVLQAKK ETQPDPGQILKKVPMVIGAYT EYLCLKFKWFKKATVM EXKFYVP KLEFLXAK; e (b) um factor polipeptídico básico que estimula a mitogénese das células da glia, particularmente a divisão das células de Schwann, na presença de plasma fetal de vitela, tendo um peso molecular entre cerca de 55 KD e cerca de 63 KD, e incluindo dentro da sua sequência de aminoácidos qualquer uma das seguintes sequências peptídicas:

VHQVWAAK

YIFFMEPEAXSSG

LGAWGPPAFPVXY

WFWIEGK -ASPVSVGSVQELQR -

VCLLTVAALPPT

KVHQVWAAK

KASLADSGEYMXK

DLLLXV 14

EGKVHPQRRGALDRK

PSCGRLKEDSRYIFFME

ELNRKNKPQNIKIQKK

As novas sequências peptídicas estabelecidas atrás, derivadas do factor polipeptídico de peso molecular mais baixo e do factor polipeptídico de peso molecular mais alto, são também aspectos destes invento. Estas sequências são úteis como fonte de sondas para factores polipeptídicos do invento, para investigação, isolamento ou preparação de tais factores (ou correspondentes sequências de genes) a partir de uma gama de espécies diferentes ou preparação de tais factores por tecnologia de DNA recombinante e na geração dos anticorpos correspondentes, por tecnologias convencionais, de preferência anticorpos monoclonais, os quais são eles próprios ferramentas de investigação úteis e possíveis agentes terapêuticos. O invento também inclui uma sequência de um gene codificador da actividade mitogénica sobre células da glia ou seu fragmento obtido pelos métodos descritos atrás para as novas sequências peptídicas do invento. A disponibilidade de peptídeos pequenos derivados de factores altamente purificados do invento permitiu a determinação de sequências adicionais (ver Exemplo que se segue).

Assim, o invento engloba ainda um factor polipeptídico tendo actividade mitogénica sobre células da glia e incluindo uma sequência de aminoácidos codificada por: ( (a) - uma'sequência de DNA apresentada em qualquer uma das Figuras 28a, 28b ou 28c, SEQ ID Nos 133-135, respectivamente;

(b) uma sequência de DNA apresentada na Figura 22, SEQ ID No. 89; 15

(c) a sequência de DNA representada pelos nucleôtidos 281-557 da sequência apresentada na Figura 28a, SEQ ID No. 133; ou (d) uma sequência de DNA que hibride com qualquer uma das sequências de acordo com (a), (b) ou (c) . O invento inclui ainda sequências que possuem mais de 60%, de preferência 80%, de identidade de homologia com as sequências indicadas atrás.

Se bem que o presente invento não esteja limitado a uma série particular de condições de hibridação, o protocolo que se segue dá uma orientação geral que pode, caso se pretenda, ser seguida:

As sondas de DNA podem ser marcadas com uma actividade 8 9 3 2 específica elevada (aproximadamente 10 a 10 P dpm//ig) por translação de corte ou por reacções de PCR de acordo com

Schowalter e Sommer (Anal. Biochem., 177:90-94, 1989) e purificadas removendo o sal em colunas de Sephadex G-150. As sondas podem ser desnaturadas (10 minutos em água fervente seguido de imersão em água gelada), depois adicionadas às soluções de hibridação de 80% do tampão B (2g de polivinilpirrolidona, 2 g de Ficoll-400, 2 g de albumina sérica bovina, 50 ml de 1M Tris-HCl (pH 7,5), 58g de NaCl, 1 g de pirofosfato de sódio, lOg de dodecilsulfato de sódio, 950 ml de HO) contendo 10% de sulfato de dextrano a 106 32 . . . dpm P por ml e incubadas durante a noite (aproximadamente 16 horas) a 60°. Os filtros podem ser então lavados a 60°C, primeiro em tampão B durante 15 minutos seguido de três lavagens de 20 minutos em 2xSSC, 0,1% SDS depois uma vez durante 20 minutos em lx SSC, 0,1% SDS. 16

Noutros aspectos, o invento proporciona: (a) um factor polipeptídico básico que tem, se obtido a partir de material de pituitária bovina, com um peso molecular, tanto em condições redutoras como não redutoras, entre cerca de 30 e 36 KD por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida usando os seguintes padrões de pesos moleculares: lisozima (clara do ovo) 14 400 inibidor da tripsina da soja 21 500 anidrase carbónica (bovina) 31 000 ovalbumina (clara do ovo) 45 000 albumina sérica bovina 66 200 fosforilase B (músculo de coelho) 97 400; factor esse que tem actividade mitogénica sobre as células da glia incluindo a estimulação da divisão das células de Schwann de rato na presença de plasma de vitela fetal e quando isolado usando HPLC de fase reversa mantém pelo menos 50% da referida actividade após 10 semanas de incubação em ácido trifluo-roacético a 0,1% a 4°C; e (b) um factor polipeptídico básico que tem, se obtido a partir de material da pituitária bovina, um peso molecular, em condições não redutoras, entre cerca de 55 KD e cerca de 63 KD por electroforese em gel de poliacrilamida usando os padrões de peso molecular que se seguem: lisozima (clara do ovo) 14 400 ' _ inibidor da tripsina da soja 21 500 anidrase carbónica (bovina) 31 000 ovalbumina (clara do ovo) 45 000 albumina sérica bovina 66 200 fosforilase B (músculo de coelho) 97 400; 17 factor esse cujo equivalente humano é codificado pelo clone de DNA GGF2HBS5 descrito aqui e factor esse que tem activi-dade mitogénica sobre as células da glia incluindo a estimulação da divisão das células de Schwann de rato na presença de plasma de vitela fetal e quando isolado usando HPLC de fase reversa mantém pelo menos 50% da referida actividade após 4 dias de incubação em ácido trifluoroacético a 0,l%a 4°C; e

Apenas por conveniência de descrição os factores de peso molecular mais baixo e de peso molecular mais alto deste invento são referidos daqui em diante como "GGF-I" e "GGF-II", respectivamen-te. A designação "GGF2" é usada para todos os clones isolados com os dados da sequência peptídica derivados da proteína GGF-II (i.e., GGF2HBS5, GGF2BPP3).

Como se poderá avaliar os limites da gama de pesos moleculares apresentados não são exactos, mas antes estão sujeitos a ligeiras variações dependendo da fonte do factor polipeptí-dico particular. Não será portanto impossível encontrar uma variação digamos de 10%, por exemplo, para material derivado de outra fonte.

Um outro aspecto importante do invento é uma sequência de DNA codificadora de um polipeptídeo tendo actividade mitogénica sobre as células da glia e compreendendo: (a) uma sequência de DNA apresentada em qualquer uma das Figuras 28a, 28b ou 28c, SEQ ID Nos. 133-135:

' (b) uma sequência de DNA mostrada na Figura 22, SEQ ID NO. 89; (c) a sequência de DNA representada pelos nucleótidos 281-557 da sequência apresentada na Figura 28a, SEQ ID No. 133; ou 18 (d) uma sequência de DNA hibridável com qualquer uma das sequências de DNA de acordo com (a), (b) ou (c).

Um outro aspecto do presente invento usa o facto de os factores de crescimento das células da glia e as proteínas Q J· 2 2 ligandos de pl85 serem codificadas pelo mesmo gene. Uma série de variantes de corte e religação do RNA mensageiro (e suas proteínas resultantes) derivam deste gene e muitos destes produtos apresentam ligação e activação de pl85c . Vários destes produtos de genes (GGF-II) foram usados para mostrar actividade mitogénica sobre células de Schwann. Este invento proporciona uma utilização para todos os produtos conhecidos do C Γ hR 2 gene do ligando de GGF/pl85 (descrito nas referências apresentadas atrás) como mitogénios das células de Shwann.

Este invento também está relacionado com outros variantes de corte e religação não isolados ainda do gene do Factor de Crescimento de Células da Glia. A Figura 30 mostra os padrões conhecidos de corte e religação derivados de experiências de reacção em cadeia com polimerase (sobre RNA produzido com trans-criptase reversa) e análise dos clones de cDNA (conforme apresentado) e derivados do que foi publicado como sequências codifica-doras dos ligandos de pl85 (Peles et al., Cell .69.:205 (1992) e Wen et al., Cell 6^.:559 (1992)). Estes padrões, assim como outros aqui descritos representam provavelmente variantes de corte e religação existentes. Assim um outro aspecto do presente invento está relacionado com sequências de nucleótidos codificadoras de novos factores proteicos derivados deste gene. O invento também proporciona processos para a preparação destes factores. A aplicação terapêutica destes novos factores é ainda um outro aspecto do presente invento.

Assim outros aspectos importantes do invento são: 19

(a) Uma série de factores polipeptídicos humanos e bovinos tendo actividade mitogénica de células da glia incluindo a estimulação da divisão das células de Schwann. Estas sequências peptídicas estão apresentadas nas Figuras 31, 32, 33 e 34, SEQ ID Nos. 136-137 respectivamente. (b) uma série de factores polipeptídicos tendo actividade mitogénica sobre células da glia incluindo a estimulação da divisão das células de Schwann e purificados e caracterizados de acordo com processos descritos por Lupu et al., Science 249: 1552 (1990); Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA JL9: 2287 (1992); Holmes et al., Science 256: 1205 (1992); Peles et al., 69: 205 (1992) ; Yarden e Peles Biochemistry 3J3: 3543 (1991) ; Dobashi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 88 8582 (1991); Davis et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 1536 (1991); Beaumont et al., pedido de patente PCT/US91/03443 (1990); Greene et al., pedido de patente PCT/US91/02331 (1990); Usdin e Fischbach, J. Cell. Biol. 103:493-507 (1986); Falis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. .55:397-406 (1990); Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 7664-7668 (1991); e Falis et al., Cell 72: 801-815 (1993) . (c) Um factor polipeptídico (GGFBPP5) tendo actividade mitogénica sobre células da glia incluindo estimulação da divisão das células de Schwann. A sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 32, SEQ ID No. 148 e é codificada pela sequência de DNA bovina apresntada na Figura 32, SEQ ID No. 148. /

As novas sequências peptídicas humanas descritas atrás e apresentadas nas Figuras 31, 32, 33 e 34, SEQ ID Nos. 136-150, respectivamente, representam uma série de variantes de corte e religação que podem ser isoladas como DNAs complementares de tamanho completo (cDNAs) a partir de fontes naturais (bibliotecas 20

de cDNA preparadas a partir dos tecidos adequados) ou podem ser montadas como construções de DNA com exões individuais (e.g., derivadas como exões separados) por alguém familiarizado com a técnica.

Outros compostos, em particular, peptídeos, que se ligam especificamente ao receptor pl85er^B2 podem também ser usados de acordo com o invento como um mitogénio das células da glia. Um composto candidato pode ser despistado por rotina quanto à ligação a pl85er^B2 e caso se ligue, pode então ser despistado quanto à actividade mitogénica de células da glia usando os métodos descritos aqui. O invento inclui quaisquer modificações ou equivalentes dos factores polipeptídicos acima descritos os quais não apresentam uma actividade significativamente reduzida. Por exemplo, as modificações em que o conteúdo ou sequência de aminoácidos foi alterado sem afectar adversamente a actividade estão também incluídos. Como exemplo, na EP-A 109748 são descritas mutações das proteínas nativas em que a possibilidade de ligação dissulfu-reto indesejada é evitada substituindo qualquer uma das císteinas na sequência nativa, que não sejam necessárias para a actividade biológica, por um aminoácido neutro. O que aqui foi estabelecido sobre efeito e utilização devem ser pensados em conformidade, tais utilizações e efeitos empregando factores modificados ou equivalentes fazendo parte do invento.

As novas sequências do invento tiram proveito dos benefícios da tecnologia de DNA recombinante. Portanto o invento também inclui os seguintes aspectos: (a) construções de DNA compreendendo sequências de DNA como definidas atrás numa posição que dê uma grelha de leitura 21 operacional dentro dos vectores (posicionadas relativamente às sequências de controle de forma a permitir a expressão das sequências) nas células hospedeiras escolhidas após transformação com as construções (de preferência as sequências de controle incluem promotores reguláveis, e.g. Trp). Será apreciado que a selecção de um promotor e de sequências reguladoras (se existirem) são matérias sujeitas a escolha pelos familiarizados com a matéria; (b) células hospedeiras modificadas por incorporação de construções como definido em (a) imediatamente atrás de forma a que as referidas sequências de DNA possam ser expressas nas referidas células hospedeiras - a escolha do hospedeiro não é crítica e e as células escolhidas podem ser procarióticas ou eucarióticas e podem ser geneticamente modificadas para incorporar as referidas construções através de métodos conhecidos; e (c) um processo para a preparação de factores como definidos atrás caracterizado pela cultura das células hospedeiras modificadas em condições que permitam a expressão das sequências de DNA. Estas condições podem ser facilmente determinadas, para qualquer realização particular, pelos familiarizados com a tecnologia de DNA recombinante. Os mitogénios das células da glia preparados por estes métodos estão incluídos no presente invento.

Nenhum dos factores descritos tem a combinação das características dos novos factores polipeptldicos aqui tratados.

Conforme indicado, o ensaio das células de Schwannusado para caracterizar os presentes factores emprega um fundo de plasma fetal de vitela. Em todos os outros aspectos, o ensaio pode ser o mesmo descrito por Brockes et al., em Meth. Enz., supra, mas com 10% FCP substituindo 10% FCS. Esta diferença nas 22 técnicas de ensaio é significativa, uma vez que a ausência dos factores derivados de plaquetas no plasma fetal de vitela (em oposição ao soro) permite uma definição mais rigorosa da activi-dade sobre as células de Schwann ao eliminar potencialmente efeitos devidos a outros factores. O invento também inclui um processo para a preparação de um polipeptídeo como definido atrás, extracção de material a partir de cérebro de vertebrado para se obter proteína, sujeição do extracto resultante a purificação cromatográfica por HPLC em hidroxilapatite e depois sujeição destas fracções a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Colhe-se a fracção que tem um peso molecular de aproximadamente 30 KD a 36 KD e/ou a fracção que tem um peso molecular entre cerca de 55 KD e 63 KD. Em qualquer um dos casos a fracção é sujeita a electroforese em gel de.SDS-poli-acrilamida usando os seguintes padrões de pesos moleculares: lisozima (clara do ovo) 14 400 inibidor da tripsina da soja 21 500 anidrase carbónica (bovina) 31 000 ovalbumina (clara do ovo) 45 000 albumina sérica bovina 66 200 fosforilase B (músculo de coelho) 97 400;

No caso da fracção de peso molecular mais baixo, o gel de SDS-poliacrilamida corre em condições não redutoras ou condições redutoras e no caso da fracção de peso molecular mais alto o /v gel corre em condições não redutoras. As fracções são então testadas quanto à actividade de estimulação da divisão de células de Schwann de rato contra um fundo de plasma fetal de vitela.

Preferencialmente, o processo acima começa pelo isolamento de uma fracção importante obtida por cromatografia em 23

carboximetilcelulose, e.g. a partir de material de pituitária bovina. Prefere-se também que HPLC em hidroxilapatite, cromato-grafia de permuta catiónica, filtração em gel e/ou HPLC em fase reversa sejam empregues antes da electroforese em gel de SDS-po-liacrilamida. Em cada uma das fases do processo a actividade pode ser determinada usando incorporação de iododesoxiuridina pelas células de Schwann como medida de um ensaio de um modo geral como descrito por Brockes em Meth. En., supra, mas modificado por substituição de 10% FCS por 10% FCP. Como já anteriormente foi notado, tal ensaio é um aspecto do invento para efeitos mitogéni-cos sobre células CNS ou PNS, e.g. células de Schwann.

Assim o invento também inclui um ensaio para a actividade mitogénica de células da glia em que um fundo de plasma fetal de vitela é empregue contra o qual se determina a síntese de DNA em células da glia estimuladas ou não pela substância a ensaiar.

Um outro aspecto do invento é uma formulação farmacêutica ou veterinária compreendendo qualquer factor conforme definido atrás para utilização farmacêutica ou veterinária, respectivamente, facultativamente em conjunto com um diluente, veículo ou excipiente e/ou numa forma de dosagem unitária. Ao usar-se os factores do invento, podem ser empregues métodos farmacêuticos ou veterinários convencionais para proporcionar formulações ou composições adequadas.

Assim, as formulações deste invento podem ser aplicadas à administração parenteral, por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intra-cranial, intracapsular, intraspinal, intracisternal, intraperito-neal, tópica, intranasal, aerossol, escarificação e também à administração oral, bucal, rectal ou vaginal. 24

As formulações deste invento podem também ser administradas pelo transplante para o paciente das células hospedeiras que expressam o DNA do presente invento ou usando os implantes cirúrgicos que libertam as formulações do invento.

As formulações parenterais podem ser na forma de soluções líquidas ou suspensões; para administração oral, as formulações podem ser na forma de comprimidos ou cápsulas; e para formulações intranasais, na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis. Métodos bem conhecidos nesta área para fazer formulações podem ser encontrados por exemplo em "Remington' Pharmaceu-tical Sciences". As formulações para administração parenteral podem por exemplo conter excipientes tais como água ou soro fisiológico estéreis, polialquilenoglicóis tais como polietile-noglicol, óleos de origem vegetal ou podem ser usados naftalenos hidrogenados, polímeros láctidos biocompatíveis e biodegradáveis • ou copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno para controlar a libertação dos presentes factores. Outros sistemas de libertação parenteral potencialmente úteis para os factores incluem partículas de copolímeros de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis e lipossomas. As formulações para implantação podem conter como excipientes, por exemplo, lactose ou podem ser soluções aquosas contendo, por exemplo éter de polioxietileno-9-laurilo, glicocolato e desoxico-lato ou podem ser soluções oleosas para administração na forma de ( gotas nasais ou como um gel a ser aplicado intranasalmente. As formulções para administração parenteral podem também incluir glicocolato para administração bucal, metoxisalicilato pata administração rectal ou ácido cítrico para administração vaginal. 25

Os presentes factores podem ser usados como agentes activos isolados ou podem ser usados em combinação com outros ingredientes activos, e.g. outros factores de crescimento que possam facilitar a sobrevivência neuronal em doenças neurológicas ou inibidores de peptidases ou proteases. A concentração dos presentes factores nas formulações do invento variarão dependendo de uma série de tecidos, incluindo a dosagem a ser administrada e a via de administração.

Em termos gerais, os factores deste invento pode ser proporcionados numa solução aquosa fisiológica tamponada contendo entre aproximadamente 0,1 e 10% p/v do composto para administração parenteral. Em geral as gamas de dosagem são entre cerca de 1 mg/Kg e cerca de lg/Kg de peso do corpo por dia; uma gama de dosagem preferida é entre cerca de 0,1 mg/Kg e 100 mg/Kg de peso de corpo por dia. A dosagem preferida a ser administrada provavelmente depende do tipo e grau de progressão do estado patofi-siológico a ser tratado, do estado geral do doente, da formulação e da via de administração.

Conforme indicado atrás, as células de Schwann (as células da glia do sistema nervoso periférico) são estimuladas para se dividirem na presença dos factores do invento. As células de Schwann do sistema nervoso periférico estão envolvidas no suporte dos neurónios e na criação da bainha de mielina à volta de fibras nervosas individuais. Esta bainha é importante para a condução correcta de impulsos eléctricos para os músculos e dos receptores sensoriais.

Existe uma variedade de neuropatias periféricas nas quais as células de Schwann e as fibras nervosas estão danificadas, quer primária quer secundariamente. Existem muitas 26

neuropatias das fibras sensoriais e motoras (Adams e Victor, Principies of Neurology). As mais importantes daquelas neuropatias são provavelmente as neuropatias associadas aos diabetes, esclerose múltipla, sindroma de Landry-Guillain-Barr, neuropatias causadas por carcinomas e neuropatias causadas por agentes tóxicos (alguns dos quais são usados para tratar carcinomas).

No entanto, o invento, destina-se ao tratamento ou profiláxia de condições em que a destruição do sistema nervoso foi efectuada por qualquer causa básica, e.g. infecção ou danificação. Assim, para além da utilização dos presentes factores no tratamento de perturbações ou doenças do sistema nervoso onde a desmielinação ou perda das células de Schwann ocorreu, tais factores de crescimento das células da glia podem ser importantes no tratamento de perturbações do sistema nervoso que tenham sido causadas aos nervos periféricos. Após danificação dos nervos periféricos, o processo de regeneração é conduzido pelo crescimento ou pelo restabelecimento das células de Schwann, seguido pelo avanço da fibra nervosa novamente para o seu alvo. Ao acelerar-se a divisão das células de Schwann pode-se promover o processo regenerativo após danificação.

Abordagens semelhantes podem ser usadas para tratar danificações ou doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (cérebro e corda espinal).

Ainda, existe uma variedade de tumores das células da glia, o mais comum dos quais é provavelmente neurofibromatose, o qual é um pequeno tumor em placa criado pelo sobrecrescimento das células da glia. Também, encontrou-se que uma actividade muito semelhante ã do GGF pode ser encontrada nalguns tumores de células de Schwann e portanto inibidores da acção dos presentes factores sobre os seus receptores proporciona uma terapia de um 27

tumor da glia, a qual compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma substância que inibe a ligação de um factor, como definido atrás, a um receptor.

Em geral o invento inclui a utilização dos presentes factores polipeptídicos na profiláxia ou tratamento de qualquer estado patofisiológico do sistema nervoso no qual está envolvido um tipo de célula sensível ao factor ou que lhe responde.

Os factores polipeptídicos do invento podem ser também usados como imunogénicos para produzir anticorpos, como sejam anticorpos monoclonais, de acordo com técnicas convencionais. Tais anticorpos estão incluídos no presente invento. Estes anticorpos podem por sua vez ser usados para fins terapêuticos ou de diagnóstico. Assim, condições associadas a níveis anormais do factor poderão ser controladas usando tais anticorpos. Podem ser usadas técnicas in vitro empregando ensaios sobre amostras isoladas usando m+etodos conhecidos. Podem ser também empregues os métodos de criação de imagens em que os anticorpos são por exemplo marcados com isótopos radioactivos os quais podem ser visualizados fora do corpo usando técnicas utilizadas na visualização de tumores. O invento também incluia utilização geral dos presentes factores como mitogénios de células da glia in vivo ou in vitro e os factores usados. Uma realização específica é pois um método para a produção de um efeito mitogénico sobre as células da glia num vertebrado através da administração de uma quantidade eficaz "de um factor dó invento. Umã" realização "preferida é um desses métodos para o tratamento ou profiláxia de uma doença ou perturbação do sistema nervoso. 28

Um outro aspecto geral do invento é a utilização de um factor do invento na produção de um medicamento, de preferência para o tratamento de uma doença ou perturbação nervosa ou para a regeneração ou reparação neuronal.

Também está incluído no invento a utilização dos factores do invento em ensaios competitivos para identificar ou quantificar moléculas tendo características de ligação a recepto-res correspondendo às dos referidos polipeptídeos. Os polipeptí-deos podem ser marcados facultativamente com um radioisótopo. Um ensaio competitivo pode identificar antagonistas e agonistas do receptor importante.

Num outro aspecto, o invento proporciona a utilização de cada um dos factores do invento num processo de isolamento por afinidade, facultativamente cromatografia de afinidade, para a separação de um receptor correspondente. Tais processos para o isolamento de receptores correspondendo a proteínas particulares são conhecidos e uma série de técnicas estão disponíveis e podem ser aplicadas aos factores do presente invento. Por exemplo, em relação a IL-6 e IFNgama pode-se consultar Novick, D. et al., J. Chromatogr. (1990) 510:331-7. Relativamente à hormona de libertação da gonodotropina deve-se consultar Hazum, E. , J. (1990) Chromatogr. 510:233-8. Em relação G-CSF aponta-se como referência Fukunaga, R., et al., J. Biol. Chem., 256:13386-90♦ Em relação ã IL-2 a referência será Smart, J.E. et al., (1990) J. Invest. Dermatol., 94:158S-163S e em relação ao IFN-gama faz-se referência a Stefanos, S., et al.. (1989) J. Interferon Res., £:719-30.

Breve Descricão dos Desenhos

Serão primeiro descritos os desenhos.

Desenhos

As Figuras l a 8 estão relacionadas com o Exemplo 1 e estão resumidamente descritas abaixo:

Fig. 1 é o prefil para o produto da cromatografia de carboximetilcelulose;

Fig.. 2 é o perfil para o produto de HPLC em hidroxila- patite;

Fig. 3 é o perfil para o produto de Mono S FPLC;

Fig. 4 é o perfil para o produto de FPLC de filtração em gel:

Figs. 5 e 6 descrevem os perfis para os dosi produtos polipeptídicos parcialmente purificados derivados de HPLCem fase reversa; e

Figs. 7 e 8 descrevem as curvas de dose resposta para as fracções de GGF-I e GGF-II derivados de HPLC em fase reversa usando um fundo de soro fetal de vitela ou de plasma fetal de vitela;

Figs. 9 a 12 descrevem as sequências peptídicas derivadas de GGF-I e de GGF-II, SEQ ID Nos. 1-20, 22-29, 32-53 e 169, (ver Exemplo 2 à frente), Figuras 10 e 12 descrevem especifica-mente novas sequências; 30

Na Fig. 10, Painel A, estão apresentadas as sequências dos peptideos GGF-I usados para projectar sondas oligoncleotídi-cas degeneradas e iniciadores de PCR degenerados (SEQ ID NOs. 20, 1, 22-29 e 17). Algumas da sequências no painel A foram também usadas para projectar peptideos sintéticos. 0 painel B é uma lista das sequências dos novos polipeptídeos que eram demasiado pequenos (menos de 6 aminoácidos) para projectar sondas degeneradas ou iniciadores de PCR degenerados (SEQ ID Nos. 17 e 52);

Na Fig. 12, Painel A, está uma lista das sequências dos peptideos GGF-II usados para projectar sondas oligonucleotídicas degeneradas e iniciadores de PCR degenerados (SEQ ID Nos. 45-52) . Algumas das sequências no Painel A foram usadas para projectar peptideos sintéticos. O painel B é uma lista de novos peptideos que eram demasiado pequenos (menos de 6 aminoácidos) para projectar sondas degeneradas ou iniciadores de PCR degenerados (SEQ ID No. 53);

As Figuras 13 a 20 estão relacionadas com o Exemplo 3 a abaixo e descrevem a actividade mitogénica dos factores do invento;

As Figuras 21 a 28 (a,b e c) estão relacionadas com o Exemplo 4 abaixo e descrevem-se brevemente a seguir:

Fig. 21 é uma lista das sondas oligonucleotídicas degeneradas (SEQ ID Nos. 54-88) projectadas a partir das novas sequências peptídicas na Figura 10, Painel A e Figura 12, Painel

Fig. 22 (SEQ ID N0. 89) descreve um segmento da sequência putativa do gene de GGF-II bovino derivada do fago recombi-nante de genoma bovino GGF2BG1, contendo o sítio de ligação das 31 31

sondas oligonucleotídicas degeneradas 609 e 650(ver Figura 21, SEQ ID Nos. 69 e 72 respectivamente). A figura é a cadeia codificadora da sequência de DNA e a sequência de aminoácidos deduzida na terceira grelha de leitura. A sequência do peptídeo 12 derivada do factor 2 (carregado) é parte de uma grelha de leitura de 66 aminoácidos (nucleótidos 75272);

Fig. 23 é os niciadores degenerados de PCR (Painel A, SEQ ID Nos. 90-108) os iniciadores de PCR únicos (Painel B, SEQ ID Nos. 109-119) usados nas experiências para isolar os segmentos das sequências codificadoras de GGF-II bovino presentes em RNA de pituitária posterior;

Fig. 24 descreve as nove estruturas contíguas distintas de GGF-II bovino que foram obtidas em experiências de amplificação por PCR usando a lista de iniciadores na Figura 7, Painéis A e B e RNAderivado de pituitária posterior. A linha de cima da Figura é um esquema das sequências codificadoras que contribuem para as estruturas de cDNA que foram caracterizadas;

Fig. 25 é um mapa físico do fago recombinante bovino de GGF2BG1. O fragmento bovino tem cerca de 20 Kb de comprimento e contem dois exões (carregado) do gene GGF-II bovino. Os sítios de restrição para as enzimas Xbal, Spel, Ndel, EcoRI, Kpnl, SstI foram colocados neste mapa físico. As fracções sombreadas correspondem a fragmentos que foram subclonados para sequenciação;

Fig. 26 é um esquema da estrutura dos três produtos alternativos do gene' putativo de GGF-II bovino. Os exões “estão apresentados em A a E pela ordem da sua descoberta. Os padrões de corte e religação alternativos 1, 2 e 3 geram três estruturas de proteína deduzidas sobreponíveis(GGF2BP1, 2 e 3) as quais estão apresentadas nas várias Figuras 28a, b, c (descritas abaixo); 32 32

Fig. 27 (SEQ ID Nos. 120-132) é uma comparação das sequências apresentadas nas Figuras 28a, 28b e 28c (descrito abaixo) com as novas sequências peptídicas apresentadas nas Figuras 10 e 12. A Figura mostra que seis das nove sequências peptídicas de CGF-II correspondem a estas sequências de proteína deduzidas. Também se observam duas sequências peptídicas semelhantes às sequências de GGF-I;

Fig. 28a (SEQ ID No. 133) é uma lista da sequência de DNA da cadeia codificadora e sequência de aminoácidos deduzida do cDNAobtido a partir do padrão de corte e religação número 1 na Figura 26. Este cDNA parcial do gene putativo de CGF-II bovino codifica uma proteína de 206 aminoácidos de comprimento. Os peptídeos a carregado foram os identificados a partir das listas apresentadas nas Figuras 10 e 12. Estão sublinhados os potenciais locais de glicosilação (juntamente com o sinal de poliadenilação AATAAA);

Fig. 28b (SEQ ID No. 134) é uma lista da sequência de DNA da cadeia codificadora e sequência de aminoácidos deduzida do cDNA obtido a partir do padrão de corte e religação número 2 na Figura 26. Este cDNA parcial do gene putativo de CGF-II bovino codifica uma proteína de 281 aminoácidos de comprimento. Os peptídeos a carregado são os identificados a partir das listas apresentadas nas Figuras 10 e 12. Estão sublinhados os potenciais locais de glicosilação (juntamente com o sinal de poliadenilação AATAAA); - Fig. 28c- (SEQ-ID No. 134)-.....é-uma lista da sequência de DNA da cadeia codificadora e sequência de aminoácidos deduzida do cDNA obtido a partir do padrão de corte e religação número 3 na Figura 26. Este cDNA parcial do gene putativo de GGF-II bovino codifica uma proteína de 281 aminoácidos de comprimento. Os 33

peptídeos a carregado são os identificados a partir das listas apresentadas nas Figuras 10 e 12. Estão sublinhados os potenciais locais de glicosilação (juntamente com o sinal de poliadenilação AATAAA);

Fig. 29, a qual está relacionada com o Exemplo 6 à frente, é um autorradiograma de uma análise de hibridação cruzada das sequências putativas do gene de GGF-II bovino com uma variedade de DNAs de mamíferos numa transferência Southern. O filtro contem as faixas de DNA digerido com EcoRI (5 jig por faixa) das espécies referidas da Figura. A sonda detecta uma única banda forte em cada amostra de DNA, incluindo um fragmento de quatro quilobases no DNA bovino conforme antecipado pelo mapa físico na Figura 25. Também se observam outras bandas com uma intensidade relativamente menor. A banda de hibridação forte de cada uma das outras amostras de DNA de mamífero presumivelmente representa o homólogo de GGF-I daquelas espécies.

Fig. 30 é um diagrama de variantes de corte e religação representativos. Os segmentos codificadores estão representados por F, E, B, A, G, C, C/D, C/D', D, D', Η, K e L. A localização das sequências peptídicas derivadas da proteína purificada estão indicadas por "o".

Fig. 31 (SEQ ID Nos. 136-147, 160, 161) é uma lista das sequências de DNA e sequências peptídicas previstas dos segmentos codificadores de GGF. A linha 1 é uma lista das sequências de aminoácidos previstas de GGF bovino, a linha 2 é uma lista das sequências de-nucleótidos de -GGF bovino, a linha--3—é uma- lista das sequências de nucleótidos de GGF humano (heregulina) (as bases homólogas estão indicadas com uma linha vertical) e a linha 4 é uma lista das sequências de aminoácidos previstas de GGF humano/heregulina onde difere da sequência bovina prevista. Os 34

segmentos codificadores Ξ, A' e K representa apenas as sequências bovinas. 0 segmento codificador D' representa apenas a sequência humana (heregulina).

Fig. 32 (SEQ ID No. 148) é a sequência de aminoácidos prevista de GGF2 e a sequência de nucleótidos de BPP5. A linha superior é a sequência de nucleótidos e alinha inferior é a sequência de aminoácidos prevista.

Fig. 33 (SEQ ID No. 149) é a sequência de aminoácidos prevista e a sequência de nucleótidos de GGF2BPP2. A linha superior é a sequência de nucleótidos e a linha inferior é a sequência de aminoácidos prevista.

Fig. 34 (SEQ ID No. 150) é a sequência de aminoácidos prevista e a sequência de nucleótidos de GGF2BPP4. A linha superior é a sequência de nucleótidos e a linha inferior é a sequência de aminoácidos prevista.

Fig. 35 (SEQ ID Nos. 151-152) descreve o alinhamento das duas sequências peptídicas de GGF (GGF2bpp4 e GGF2bpp5) com EGF humano (hEGF). Os asteriscos indicam posições das císteinas conservadas.

Fig. 36 descreve o nível da actividade de GGF (ensaio mitogénico das células de Schwann) e de fosforilação da tirosina de uma proteína de aproximadamente 200 KD (intensidade de uma banda de 200 KD num autorradiograma de uma transferência Western ...........—........revelado com um - -anticorpo polic-lonal - antifosfotirosina) na resposta a quantidades crescentes de GGF.

Fig. 37 é uma lista de variantes de corte e religação derivadas das sequências mostradas na Fig. 31. baixo, e No.154) .

Fig. 38 é a sequência de aminoácidos prevista, em sequência de nucleótidos, em cima, de EGFL1 (SEQ ID

Fig. 39 é a sequência de aminoácidos prevista, em baixo, e sequência de nucleótidos, em cima, de EGFL2 (Seq ID No. 155) . Fig. 40 é a sequência de aminoácidos prevista, em baixo, e sequência de nucleótidos, em cima, de EGFL3 (SEQ ID No. 156) . Fig. 41 é a sequência de aminoácidos prevista, em baixo, e sequência de i nucleótidos, em cima, de EGFL4 (SEQ ID No.157) . Fig. 42 é a sequência de aminoácidos prevista, em baixo, e sequência de nucleótidos, em cima, de EGFL5 (Seq ID No. 158) . Fig. 43 é a sequência de aminoácidos prevista, em baixo, e sequência de nucleótidos, em cima, de EGFL6 (SEQ ID No. 159) . Fig. 44 é um i mapa à escala do clone do segmento codifi- cador. T3 refere-se ao promotor do bacteriófago usado para produzir mRNA a partir do clone. R= sítios flanquantes para a enzima de restrição EcoRI. 5' UT ‘ refere-se ã região 5' não traduzida. E, -B, -A,-.--0, C/D' e D refere-se aos segmentos codificadores. O = local de iniciação da tradução. /\ = o limite 5' da região homóloga do segmento E bovino (ver Exemplo 6) e 3' UT refere-se à região 3' não traduzida. 36

Fig. 45 é a sequência de aminoácidos prevista (meio) e sequência de nucleótidos (em cima) de GGF2HBS5 (SEQ ID No. 167) . A sequência de baixo (intermitente) representa as sequências de peptídeos derivadas das preparações de GGF-II (ver Figuras 11, 12) .

Fig. 46 é um gráfico que descreve a actividade mitogé-nica das células de Schwann de factores de crescimento de células da glia recombinantes de origem humana e bovina.

Fig. 47 é uma curva de dose resposta descrevendo os dados de actividade de proliferação de células de Schwann resultante da administração de diferentes quantidades de meio condicionado de células CHO.

Fig. 48 é uma curva de dose resposta descrevendo a actividade mitogénica sobre células de Schwann secretada para o meio extracelular pelas células de insecto SF9 infectadas com baculovírus contendo o clone.de cDNA GGF2HBS5.

Fig. 49 é uma transferência Western de meio condicionado de células CHO rcombinantes usando o anticorpo anti peptídeo GGF.

Fig. 50 (A) é um gráfico de actividade de proliferação sobre células de Schwann do pico de GGF-II humano recombinante (rhGGF-II) (produzido em células COS) eluido de uma coluna de permuta catiónica; (B) é uma imunotransferência do pico GGFIII recombinante usando o anticorpo policlonal- feito contra o peptídeo específico de rhGGFII;

Fig. 51 (A) é um gráfico mostrando a purificação de rhGGF-II (produzido em células CHO) numa coluna de permuta 37

catiónica por fracção; (B) é uma fotografia de uma transferência Western usando fracções como descrito em (A) e um anticorpo específico de rhGGF-II.

Fig. 52 é uma fotografia de um gel que descreve a fosforilação de tirosina em células de Schwann tratadas com factores de crescimento de células da glia recombinantes.

Fig. 53 é as sequências dos polipeptídeos GGFHBS5, GGFHFB1 e GGBPP5 (SEQ ID Nos. 170, 171 e 172).

Fig. 54 é um mapa do vector de expressão de células CHO pcDHFRpo1iA.

Descrição Detalhada 0 invento diz respeito ao isolamento e purificação de novos factores de crescimento de células da glia e à clonagem de sequências de DNA codificadoras destes factores. outros componentes do invento são várias variantes de corte e religação do gene que potencialmente codificam una série de factores de crescimento de células da glia, em particular o GGF2HBS5 em particular uma variante que codifica o equivalente humano de GGF-II bovino. É evidente que o gene codificador de GGF e das proteínas de ligação a pl85 produz uma série de diferentes transcritos de RNA de tamanho variável e cortados e ligados de forma diferente que dão origem a uma série de proteínas, as quais são de diferentes comprimentos e contêm algumas sequências peptídicas comuns e algumas sequências peptídicas -únicas------Isto é apoiado pelas sequências diferencialmente cortadas e religadas que são recuperáveis a partir de RNA de pituitária posterior bovina (conforme aqui apresentado), cancro da mama humano (MDA-MB-231) (Holmes et al., D«Science 256: 1205 (1992) e RNA de cérebro de galinha 38 (Falis et al., Cell 72.:1-20 (1993)). Outros apoios derivam da gama larga de tamanhos das proteínas que actuam como mitogénios das células de Schwann (conforme aqui descrito) e como ligandos erbB2 , , . para o receptor pl85 (ver abaixo).

Outra evidência a suportar o facto de os genes codificadores de GGF e de pl85e serem homólogos vem da comparação da sequência de nucleótidos. Science 256 (1992), 1205-1210)

Holmes et al. demonstram a purificação de uma proteína humana de 45 quilodaltons (Heregulina-α) que interactua especificamente com a proteína do receptor pl85e , que está associada a várias doenças humanas. Foram isolados vários clones de cDNA complementares codificadores de Heregulina-α. Peles et al. (Cell 69:205 (1992)) e Wen et al., (Cell 69.:559 (1992)) descreve um DNA complementar isolado a partir de células de rato codificadores de uma proteína chamada factor de diferenciação neu" (NDF). O produto de tradução do cDNA de NDF tem actividade de ligação a pl85erbB2. Usdin e Fischbach, J. Cell Biol. 103:493-507 (1986);

Falis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 55:397-406 (1990) ; Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7664-7668 (1991) ; e Falis et al., Cell 22.:801-815 (1993) demonstram a purificação de uma glicoproteína de 42 KD que interactua com uma p 2 proteína receptor pl85e e vários clones de cDNA complementa res foram isolados (Falis et al., Cell 72.:801-815 (1993). Vários outros grupos descreveram a purificação de proteínas de vários pesos moleculares com actividade de ligação a pl85e . Estes grupos incluem Lupu et al., (1992) Proc. Natl Acad. Sei. USA 89.:2287,- Yarden e Peles (1991) Biochemistry 22:3543; Lupu et al., (1990) Science 2 4 9:1552) ; Dobashi et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1536; e Huang et al., (1992) J. Biol. Chem. 257: 11508-11512.

Outras Realizações

O invento inclui qualquer proteína que seja substancial-mente homóloga dos segmentos codificadores na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-147, 160 e 161) assim como outros polipeptídeos GGF naturais. Também estão incluídos: variações alélicas; mutantes naturais; mutantes induzidos; proteínas codificadas pelo DNA que hibrida em condições de restringência elevada ou baixa com um ácido nucleico natural (para definições de alta e baixa restringência consultar Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1-6.3.6, aqui incluído como referência); e polipeptídeos ou proteínas especificamente ligadas por anti-soros contra o polipeptídeo GGF. O termo também inclui polipeptídeos quiméricos que incluem os polipeptídeos GGF compreendendo sequências da Figura 31.

Os exemplos que se seguem não se destinam a limitar o invento, mas antes são apresntados para ilustrar o mesmo, e proporcionam uma orientação específica para técnicas preparativas eficazes.

Como se verá no Exemplo 3, abaixo, os presentes facto-res apresentam actividade mitogénica numa gama de tipos celulares. A actividade em relação a fibroblastos indica uma capacidade para sarar uma ferida e o invento engloba esta utilização. O estabelecido pelo invento atrás em relação às formulações e/ou medicamentos e sua produção deverá ser claramente pensado como incluindo os produtos e utilizações adequados. Isto é claramente uma espect-ativa razoável para o presente invento face às descrições de actividades semelhantes para factores de crescimento de fibroblastos (FGFs). Pode-se fazer referência por exemplo a Sporn et al.. "Peptide Growth Factors and their Receptors I", página 40

396 (Baird e Bohlen) na secção com o título "FGFs in Wound Healing and Tissue Repair". EXEMPLO 1

Purificação de GGF-I e GGF-II a partir de pituitárias bovinas I. Preparação da fraccão CM do factor

Deixou-se a descongelar durante a noite 4000 pituitárias bovinas completas, lavaram-se brevemente com água e depois homogenizaram-se num volume igual de sulfato de amónio 0,15M em lotes num Misturador Waring. O homogenato foi ajustado a pH 4,5 com HC1 1,0 M e centrifugado a 4900 g durante 80 minutos. O material membranar no sobrenadante foi removido passando-o através de lã de vidro. Após ajuste do pH do sobrenadante a 6,5 usando NaOH 1,0 M, adicionou-se sulfato de amónio para dar uma solução saturada a 36%. Após várias horas de agitação, a suspensão foi centrifugada a 4900 g durante 80 minutos e rejeitado o precipitado. Após filtração através de lã de vidro, adicionou-se mais sulfato de amónio ao sobrenadante para dar uma solução saturada a 75% a qual foi novamente centrifugada a 4900 g durante 80 minutos após várias horas de agitação. O sedimento foi ressus- penso em aproximadamente 21 de fosfato de sódio 0,1M pH 6,0 e dialisado contra 3 x 40 1 do mesmo. Após confirmação de que a condutividade do dialisato estava abaixo de 20,0 /^Siemens, aplicou-se numa coluna Bioprocess (120 x 113 mm, Pharmacia), contendo carboximetilcelulose (CM-52, Whatman) a um fluxo de 2 ml min-1. A coluna foi lavada com 2 volumes de fosfato de sódio 0,1M pH 6,0, seguido de 2 volumes de 50 mM NaCl e finalmente 2 volumes de 0,2 M NaCl ambos no mesmo tampão. Durante o passo final, colheram-se fracções de 10 ml (5 minutos). As fracções 73 a 118 inclusive foram reunidas , dialisadas contra 10 volumes de 41

fosfato de sódio 10 mM pH 6,0 duas vezes e clarificado por centrifugação a 100000 g durante 60 minutos. II. HPLC em hidroxilapatite HPLC em hidroxilapatite não é uma técnica até agora usada no isolamento de factores de crescimento de células da glia, mas neste invento provou ser particularmente eficaz. O material obtido a partir de cromatografia em CM-celulose atrás foi filtrado através de um filtro de 0,22 μτη (Nalgene) aplicado à temperatura ambiente numa coluna de hidroxilapatite de alta reslução (50 x 50 mm, Biorad) e equilibrada com fosfato de potássio 10 mM pH 6,0. A eluição à temperatura ambiente foi realizada a um fluxode 2 ml. minuto 1 usando o seguinte gradiente linear programado: tempo (min) %B Solvente A: fosfato de potássio 10 mM pH 6,0 0,0 0 Solvente B: fosfato de potásio 1,0 M pH 6,0 5,0 0 7,0 20 70,0 20 150,0 100 180,0 100 185,0 0

Colheram-se fracções de 6,0 ml (3 minutos) durante a eluição com gradiente. As fracções 39-45 foram reunidas e diali-sadas contra 10 volumes de fosfato de~ sódio-50 mM pH-6 ,O . -...... — III. FPLC Mono S _ FPLC Mono S permitiu obter um material mais concentrado

para a filtração em gel subsequente.

Qualquer material insolúvel no material reunido da coluna d ehidroxilapatite foi removido por uma centrifugação de clarificação a 100000 g durante 60 minutos antes de aplicação numa coluna de permuta catiónica HR10/10 Mono S (100 x 10 mm, Pharmacia) a qual foi então reequilibrada para fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 à temperatura ambiente com um fluxo de 1,0 ml/minu-to. Nestas condições a proteína ligada foi eluida usando o gradiente linear programado que se segue: tempo (min) %B Solvente A: fosfato de potássio 50 mM pH 6,0 fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 0,0 0 70.0 30 240.0 100 250.0 100 260.0 0

Colheram-se fracções de lml (1 minuto) através deste programa de gradiente. As fracções 99 a 115 inclusive foram reunidas. IV. FPLC de filtração em ael

Este passo iniciou a separação dos dois factores do invento antes da purificação final, produzindo fracções enriquecidas.

Para os objectivos deste passo preparou-se uma coluna de FPLC preparativa Superose 12 (510 x 20 mm, Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante. Para normalizar esta coluna, uma medição teórica de placas foi feita de acordo com as instrucções do fabricante, dando um valor teórico de 9700 placas. 43

O conjunto de material eluido de Mono S foi aplicado à temperatura ambiente em quantidades de 2,5 ml a esta coluna em fosfato de sódio 50 mM, MaCl 0,75 pH 6,0 (anteriormente passado através de uma coluna de fase reversa C18 (Sep-pak Millipore) a um fluxo de 1,0 ml/minuto. Colheram-se fracções de lml (0,5 minutos) apartir dos 35 minutos após cada uma das amostras ter sido aplicada na coluna. Reuniram-se fracções 27 a 41 (GGF-II) e 42 a 57 (GGF-I) inclusive de cada migração. V. HPLC em fase reversa

Os conjuntos de fracções de GGF-I e GGF-II de cada uma das migrações em Superose 12 foram divididos em três quantidades iguais . Cada uma delas foi aplicada numa coluna de fase reversa C8 (Aquapore RP-300 7μ C8 220 x 4,6 mm, Applied Biosystems) protegidopor uma cassete de protecção (RP-8; 15 x 3,2 mm, Applied Biosystems) e equilibrado a 40°C a o,5 ml minuto 1. A proteína foi eluida nestas condições usando o seguinte programa de gradiente linear: tempo (min) 0 60 62,0 72.0 75.0

%B Solvente A: ácido trifluoroacético (TFA) Solvente B: 90% acetonitrilo, 0,1% TFA 66,6 100 100 0

Colheram-se fracções de 200 μΐ (0,4 minuto) em tubos siliconados (tubos Multilube, Bioquotej—dos 15,2 minutos após o começo do gradiente programado. VI. Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida

Neste passo, usaram-se padrões de peso molecular para proteínas, gama baixa, ns de catálogo 161-0304, da Bio-Rad Laboratories Limited, Watford, England. As proteínas usadas e os seus padrões de peso molecular foram aqui descritos anteriormen-te.

As fracções 47 a 53 (GGF-I) e as fracções 61 a 67 (GGF-II) inclusive das migrações em fase reversa foram reunidas individualmnete. 7 μΐ do material reunido foi fervido num volume igual de 0,0125 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glicerol e 10% β-mercap-toetanol para GGF-I durante 5 minutos e aplicado num gel Laemmli de 11% de acrilamida com um gel de concentração de 4% e mieprado a uma voltagem constante de 50 V durante 16 horas. Este gel foi então fixado e corado usando um kit de coloração com prata (Amersham). Nestas condições, os factores apresentam-se como uma banda difusa com pesos moleculares relativos de 30000 a 36000 Daltons (GGF-I) e 550000 a 63000 Daltons (GGFIII) conforme definido pelos marcadores de peso molecular. A partir da coloração do gel é aparente que existe um pequeno número de outras proteínas presentes em níveis equivalentes aos GGF-I e GGF-II no material reunido das migrações em fase reversa. VII. Estabilidade em ácido trifluoroacético

Os dados de estabilidade foram obtidos para os presentes factores na presença de ácido trifluoroacético como segue: GGF-I: Material de HPLC em fase reversa, na presença de 0,1% TFA e acetonitrilo, foi testado dentro de 12 horas após o final da migração na coluna e depois após cerca de 10 semanas de 45

incubação a 40°C. Após incubação, o GGF-I tinha pelo menos 50% da actividade do material testado logo após a saída da coluna. GGF-II: 0 material de HPLC em fase reversa, na presença de 0,1% TFA e acetonitrilo e guardado a -20°C foi testado após descongelação e depois após 4 dias de incubação a 40°C. Após incubação, o GGF-II tinha pelo menos 50% da actividade do material descongelado de fresco.

Será apreciado que a concentração do ácido trifluoro-acético usada nos estudos acima é a mais vulgarmente usada para cromatografia em fase reversa. VIII. Condições do ensaio de actividade A menos que de outra forma seja indicado, todas as operações foram realizadas a 37°C e com referência às Figuras 1 a 6, a actividade em cada fase foi determinada usando as t'écnicas de Brockes (Meth. Enz., supra) com as modificações que se seguem. Assim, na preparação das células de Schwann, adicionou-se Forskolin 5 μΜ para além de DMEM (meo de Eagle modificação de Dulbecco), FCS e GGF. As células usadas no ensaio foram células de Schwann sem fibroblastos numa passagem inferior a 10 e estas células foram removidas dos frascos com tripsina e semeadas em placas de 96 cavidades de fundo plano a 3,3 milhares de células por micocavidade. . . 125

Adicionou-se [ IJIUDdR nas últimas 24 horas após a adição da solução a testar.- A-incorporação de f undo (não estimulado) de cada ensaio foi inferior a 100 cpm e a incorporação máxima foi 20 a 200 vezes superior ao fundo dependendo do lote de células de Schwann e do número da passagem. 46

No caso das fracções GGF-I e GGF-II de HPLC em fase reversa como descrito atrás, foram também produzidas duas curvas de dose resposta para cada factor, usando exactamente o método acima para uma das curvas de cada factor e o método acima modificado no processo de ensaio apenas substituindo o soro fetal de vitela por plasma fetal de vitela para se obter a outra curva para factor. Os resultados estão nas Figuras 7 e 8. EXEMPLO 2

Sequências de aminoácidos de GGF-I e GGF-II purificados

Os estudos de análise da sequência de aminoácidos foram realizados usando GGF-I e GGF-II de pituitária bovina altamente purificada. O código convencional de uma só letra foi usado para descrever as sequências, os peptídeos foram obtidos por digestões com endopeptidase de lisilo e protease V8, realizado em amostras reduzidas e carboximetiladas, com a digestão por endopeptidase de lisilo de GGF-II realizada em material eluido a partir da região de 55-65 RD de uma SDS-PAGE de 11% (PM relativo aos marcadores usados).

Obtive-se um total de 21 sequências peptídicas (ver Figura 9, SEQ ID Nos. 1-20, 169) para GGF-I, dos quais 12 peptídeos (ver Figura 10, SEQ ID Nos. 1, 22-29, 17, 19 e 32) não estão presentes nos dados de bases de proteínas normais e portanto representam proteínas únicas. Um total de 12 sequências peptídicas (ver Figura 11, SEQ ID Nos. 33-44) foram obtidas para GGF-II, dos quais 10 peptídeos (ver Figura- 12, SEQ ID” Nos. 45-53) nâo estão presentes nos bancos de dados normais e portanto representam sequências únicas (uma excepção é o peptídeo GGF-II 06 que apresenta sequências idênticas a muitas proteínas que são provavelmente sem significado dado o pequeno número de resíduos). 47

Estas novas sequências provavelmente correspondem a fracções das verdadeiras sequências de aminoácidos dos GGFs I e II.

Deve-se dar particular atenção às sequências de GGF-I e de GGF-II 12, as quais estão claramente altamente relacionadas. As semelhanças indicam que as sequências destes peptideos são quase certamente as das espécies referidas de GGF e é pouco provável que derivem de proteínas contaminantes.

Em adição, no peptídeo GGF-II 02, a sequência X S S é consistente com a presença de uma fracção de açúcar ligada em N numa asparagina na posição assinalada por X.

Em geral, nas Figuras 9 e 11, X representa um resíduo desconhecido denotando um ciclo da sequenciação onde um posição não pode ser atribuída com certeza por haver mais de um sinal de igual tamanho no ciclo ou pela ausência de sinal. O asterisco significa peptideos onde o último aminoácido chamado corresponde ao último aminoácido presente naquele peptídeo. Nos restantes peptideos a força do sinal após o último aminoácido chamado ser insuficiente para continuar a chamada da sequência até ao fim daquele petídeo. A coluna do lado direito indica os resultados de uma pesquisa numa base de dados de um computador usando os programas de pacote GCG FASTA e TFASTApara analisar as bases de dados de sequências NBRF e EMBL. O nome de uma proteína nesta coluna significa identidade de uma fracção da sua sequência coma sequência de aminoácidos do peptídeo chamado permitindo um máximo de duas diferenças. Uma interrogação significa que foram permitidas três diferenças. As abreviaturas usadas-foram as seguintes: HMG-l Proteína 1 do grupo de alta mobilidade HMG-2 Proteína 2 do grupo de alta mobilidade LH-alfa Subunidade alfa da hormona luteinizante LH-beta Subunidade beta da hormona luteinizante EXEMPLO 3

Actividade mitogénica de GGF-I e GGF-II purificados A actividade mitogénica d euma amostra altamente purificada contendo GGFs I e Ilfoi estudada usando um método quantitativo, o qual permite que uma só microcultura seja examinada quanto ã síntese de DNA, morfologia celular, número de células e expressão de antigénios celulares. Esta técnica foi modificada de um método anteriormente descritopor Muir et al., Analytical Biochemistry 185, 377-382, 1990. As principais modificações foram: 1) a utilização de placas de microtitulação não revestidas, 2) o número de células por cavidade, 3) a utilização de plasma fetal bovino a 5% (FBP) em vez de 10% de soro fetal bovino (FCS) e 4) o tempo de incubação na presença de mitogénios e de bromodesoxiuridina (BrdU), adicionado simultaneamente ãs culturas. Ainda a monocamada celular não foi lavada antes da fixação para evitar a perda de células e o tempo de incubação anticorpo monoclonal de murganho anti-BrdU e o conjugado de anticorpo de cabra anti-imunoglobulina (IgG) de murganho com peroxidasé foram duplicados para aumentar a sensibilidade do ensaio. 0 ensaio, optimizado para as células de Schwann do nervo ciático de rato, também foi usado para várias linhas celulares, após modificações adequadas às condições de cultura de tecidos. I. Métodos para testar mitogénese

No dia 1, células de Schwann purificadas foram semeadas em placas de 96 cavidades, não revestidas, na presença de meio de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM) mais 5% FBP (5000 células por cavidade). No dia 2, adicionou-se às culturas GGFs ou outros 49

factores a testar, assim como BrdU numa concentração final de 10 μιη. Após 48 horas (dia 4) a incorporação de BrdU foi parada por aspiração do meio e as células foram fixadas com 200 μΐ/cavidade de etanol a 70% durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida as células foram lavadas com água e o DNA desnaturado por incubação com 100 μΐ de HCl 2N durante 10 minutos a 37°C. Após aspiração o ácido residual foi neutralizado enchendo as cavidades com tampão borato 0,1M, pH 9,0 e as células foram lavadas com tampão de fosfatos salino (PBS). As células foram então tratadas com 50 μΐ de tampão de bloqueio (PBS contendo 0,1% de Triton X100 e 2% de soro normal de cabra) durante 15 minutos a 37°C. Após aspiração, o anticorpo monoclonal de murganho anti-BrdU (Dako Corp., Santa Barbara, CA) (50 μΐ/cavidade, 1,4 μg/ml diluido em tampão de bloqueio) foi adicionado e incubado durante duas horas a 37°C. Os anticorpos não ligados foram removidos por três lavagens em PBS contendo 0,1% de Triton X-100 e anticorpo de cabra anti-IgG de murganho conjugado com peroxidase (Dako Corp., Santa Barbara, CA) (50 μΐ/cavidade, 2 μg/ml diluido em tampão de bloqueio) foi adicionado e incubado durante uma hora a 37°C. Após três lavagens em PBS/Triton e uma lavagem final em PBS, as cavidades receberam 100 μΐ/cavidade de tampão 50 mM fosfato/ci-trato, pH 5,0, contendo 0,05% do cromogénio solúvel o-fenilenodi-amina (OPD) e 0,02% H202. A reacção foi parada após 5-20 minutos à temperatura ambiente pipetando 80 μΐ de cada cavidade para uma placa limpa contendo 40 μΐ/cavidade de ácido sulfúrico 2N. A absorvância foi registada a 490 nm usando um leitor d eplacas (Dynatech Labs). As placas de ensaio contendo as monocamadas celulares foram lavadas duas vezes com PBS e coradas imunocito-quimicamente coradas para BrdU-DNA adicionando 100 μΐ/cavidade do substrato diaminobenzidina (DAB) e 0,02% de H2°2 para 9erar um produto insolúvel. Após 10-20 minutos a reacção corada foi parada por lavagem com água e observados e contados os núcleos positivos para BrdU usando um microscópio invertido. 50

Ocasionalmente os núcleos negativos foram contrastados com 0,001% de azul de Toluidina e contados como anteriormente. II. Linhas celulares usadas em ensaios de mitoqénese)

Fibroblastos suiços 3T3: Células, da Flow Labs, foram mantidas em DMEM suplementado com 10% FCS, penicilina e estrepto-micina a 37°C numa atmosfera humidificada de 10% de CC>2 em ar. As células foram alimentadas ou subcultivadas de dois em dois dias. Para o ensaio mitogénico, as células foram semeadas a uma densidade de 5000 células/cavidade em meio completo e incubadas durante uma semana até as células estarem confluentes e terem parado de crescer. O meio contendo soro foi removido e a monoca-mada celular lavada duas vezes com meio sem soro. Adicionou-se então a cada cavidade 100 μΐ de meio sem soro contendo mitogénios e 10μΜ de BrdU e incubou-se durante 48 horas. Realizaram-se doses-respostas a GGFs e soro ou PDGF (como controlo positivo).

Fibroblastos BHK (rim de hamster bébé) 21C13: Células da Colecção Europeia de Culturas de Células Animais (ECACC) , foram mantidas em Meio de Eagle Modificação de Glasgow (GMEM) suplementado com caldo de fosfato de triptose a 5%, 5% FCS, penicilina e estreptomicina a 37°C numa atmosfera húmida de 5% de CO^ em ar. As células foram alimentadas ou subcultivadas de dois em dois ou de três em três dias. Para o ensaio mitogénico, as células foram semeadas a uma densidade de 2000 células/cavidade em meio completo durante 24 horas. 0 meio contendo soro foi então removido e após lavagem com meio sem soro, substituido por 100 μΐ de meio GMEM contendo 0,1% FCS ou GMEM sozinho. GGFs e FCS ou bGFF foram adicionadas como testemunhas positivas, coincidente com BrdU 10 μΜ e incubado durante 48 horas. As culturas celulares foram então processadas como descrito para as células de Schwann. 51 51

Linha celular de glioma de rato C6: As células obtidas na passagem 39, foram mantidas em DMEM contendo 5% FCs, 5% de soro de cavalo (HS), penicilina e estreptomicina a 37°C numa atmosfera húmida de 10% de COem ar. As células foram alimentadas ou subcultivadas de três em três dias. Para o ensaio mitogé-nico as células foram semeadas a uma densidade de 2000 célu-las/cavidade em meio completo e incubadas durante 24 horas. Em seguida o meio foi susbtituido com uma mistura de 1:1 de DMEM e meio F12 contendo 0,1% FCS, após lavagem em meio sem soro. Realizaram-se então as curvas de dose resposta a GGFs, FCS e aFGF e as células foram processadas por ELISA como anteriormente descrito para outros tipos celulares. PC12 (Células de feocromocitoma adrenal de rato): Células de ECACC, foram mantidas em RPMI 1460 suplementado com 10% HS, 5% FCS, penicilina e estreptomicina, em frascos revestidos com colagéneo a 37°C numa atmosfera húmida de 5% C02 em ar. As células foram alimentadas de três em três dias substituindo 80% do meio. Para o ensaio mitogénico, as células foram semeadas a uma densidade de 3000 células/cavidade em meio completo, em placas revestidas com colagéneo (50 μΐ/cavidade de colagéneo, Vitrogen Collagen Córp., diluido a 1:50, 30 min a 37°C) e incubadas durante 24 horas. O meio foi então colocado com RPMI fresco sozinho ou contendo insulina 1 mM ou 1% FCS. Realizaram-se como anteriormente as curvas de dose-resposta para FCS/HS (1:2) como controle positivo e para GGFs. Após 48 horas as células foram fixadas e realizada ELISA como anteriormente descrito. III. Resultados dos ensaios de mitoaéneserTodas as" experiências apresentadas neste Exemplo foram realizadas usando uma amostra altamente purificada dé um passo de purificação por cromatografia em Sepharose 12 (ver Exemplo 1, secção D) contendo uma mistura de GGF-I e de GGF-II (GGFs). 52

Em primeiro lugar os resultados obtidos com os ensaios de incorporação de BrdU foram comparados com o ensaio mitogénico clássico para as células de Schwann baseado na incorporação de [125]I-UdR no DNA das células em divisão, descrito por J.P. Brockes (Methods Enzymol. 147:217, 1987). A Figura 13 mostra a comparação dos resultados obtidos com os dois ensaios, realizados nas mesmas condições de cultura de tecidos (5000 células/cavidade, em 5% FBP/DMEM, incubadas na presença de GGFs durante 48 horas). Conforme claramente mostrado, os resultados são comparáveis, mas o ensaio de incorporação de BrdU parece ser ligeiramente mais sensível, conforme sugerido pelo desvio da curva para a esquerda do gráfico, i.e. para concentrações mais baixas de GGFs.

Conforme descrito na secção "Métodos de testes de mitogénese", após ter sido quantificado o BrdU-DNA imuno-reactivo por leitura da intensidade do produto solúvel da reacção de OPD peroxidase, as placas de ensaio originais contendo monocamadas celulares podem sofrer a segunda reacção resultando no produto DAB insolúvel, o qual cora os núcleois positivos para BrdU. As microculturas puderam ser então examinadas com um microscópio invertido e observados a morfologia ’ celular e os números de núcleos positivos e negativos relativamente a BrdU.

Na Figura 14a e na Figura 14b a imuno-reactividade de BrdU-DNA, avaliada pela leitura da absorvância a 490 nm, foi comparado com o número de núcleos positivos para BrdU e com a percentagem de núcleos positivos para BrdU no número total de células por cavidade, contadas nas mesmas culturas. Os desvios padrões foram inferiores a 10%. Os dois métodos de avaliação mostram uma correlação muito boa e a discrepância entre os valores na dose mais alta de GGFs pode ser explicada pelo 53 53

diferente grau de síntese de DNA nas células detectadas como positivas para BrdU. 0 ensaio de incorporação de BrdU pode portanto fornecer informação adicional útil acerca da actividade biológica dos polipeptídeos sobre as células de Schwann quando comparado com o ensaio de incorporação de [125] I-UdR. Por exemplo os resultados descritos na Figura 15 mostram que GGFs podem actuar sobre as células de Schwann para induzir a síntese de DNA, mas em doses mais baixas aumentam o número de células negativas presentes na microcultura após 48 horas. O ensaio foi usado em várias linhas celulares de origem diferente. Na Figura 16 estão comparadas as respostas mitogénicas das células de Schwann e de fibroblastos 3T3 Suiços a GGFs; apesar da resposta fraca btida nos fibroblastos 3T3, alguns núcleos claramente positivos para BrdU foram detectados nestas culturas. As culturas testemunha foram processadas em paralelo na presença de várias doses de FCSou de PDGF recombinante humano, mostrando que as células podiam responder aos estímulos adequados (não apresentado). A capacidade dos fibroblastos para responder a GGFs foi ainda estudada usando a linha celular BHK 21 C13. Estes fibroblastos, derivados de rim, não apresentaminibição de contacto nem apresentam quiescência quando confluentes. Assim as condições experimentais foram projectadas de forma a haver uma proliferação de fundo muito baixa sem comprometer a viabilidade celular. GGFs possuem uma actividade mitogénica significativa sobre células BHK21 C13 como se mostra na Figura 17 e na Figura 18. A Figura 17 mostra a incorporação de BrdU no DNA pelas células BHK 21 C13 estimuladas por GGFs na presença de 0,1% FCS. A resposta mitogénica boa a FCS indica que as condições de cultura de tecidos não 54 54

são limitantes. Na Figura 18 o efeito mitogénico de GGFs é expresso como o número de células positivas para BrdU e negativas para BrdU e como o número total de células contadas por cavidade. Os resultados são representativos de duas experiências processadas em duplicado; foram contados pelo menos três campos por cavidade. Conforme observado para as células de Schwann para além do efeito proliferativo em doses baixas, GGFs também aumentam os números de células sobreviventes que não respondem. A percentagem de células positivas para BrdU é proporcional às quantidades crescentes de GGFs adicionadas às culturas. O número total de células após 48 horas na presença de doses mais altas de GGFs é pelo menos o dobro., confirmando que GGFs induzem a síntese de DNA e a proliferação de céluylas BHK21 C13. Nas mesmas condições as células mantidas durante 48 horas na presença de 2% FCS mostraram um aumento de cerca de seis vezes (não apresentado).

As células de glioma C6 proporcionaram um modelo útil para estudar as propriedades das células da glia. 0 fenótipo expresso parece parece estar dependente da passagem celular, as células assemelhando-se mais a um fenótipo de astrócito numa fase inicial e um fenótipo oligodendrócito nas fases mais tardias (passagem superior a 70). As células C6 são uma população altamente proliferativa, portanto as condições experimentais foram optimizadas de forma a terem um fundo muito baixpo de incorporação BrdU. A presença de 0,1% de soro foi necessária para manter a viabilidade celular sem afectar significativamente as respostas mitogénicas, como se mostra pelas curvas de dose resposta a FCS (Figura 19).

Na Figura 20 as respostas mitogénicas a aFGF (factor de crescimento de fibroblastos ácido) e a GGFs são expressas como percentagens de incorporação máxima de BrdU obtida na presença de FCS (8%). Os valores são médias de duas experiências corridas em 55 duplicado. 0 efeito de GGFs foi comparável ao da preparação de aFGF puro. aFGF foi descrito como um factor de crescimento específico das células C6 (Lim R. et al., Cell Regulation 1: 741-746, 1990) e por essa razão foi usado como testemunha positiva. A contagem directa de células positivas e negativas para BrdU não foi possível devido à densidade celular elevada em microcul-turas. Ao contrário das linhas celulares até agora descritas, as células PC12 não apresentam qualquer resposta evidente a GGFs, quando tratado em condições de cultura em que PC12 responde a soros (a mistura de FCS e de HS conforme usado de rotina na manutençaõ celular). No entanto o número de células semeadas por cavidade parece afectar o comportamento das células PC12 e portanto são necessárias outras experiências. EXEMPLO 4

Isolamento e clonagem das sequências de nucleõtidos codificadoras de proteínas contendo oeptideos GGF-I e GGF-II O isolamento e clonagem das sequências de nucleõtidos de GGF-II foram efectuados como descrito aqui usando a informação de sequências peptídicas e o despiste de bibliotecas e efectuado como descrito abaixo. Como se pode ver os peptídeos das Figuras 4 e 5 podem ser usados como ponto de partida para o isolamento e clonagem das sequências de GGF-I seguindo as técnicas aqui descritas. De facto, a Figura 21, SEQ ID Nos. 54-88 mostra possíveis sondas de oligonucleótideos degeneradas para este fim e a Figura 23, SEQ ID Nos. 90-119, apresenta possíveis iniciadores de PCR. A sequência de DNA e a sequência de polipeptídeos deverá ser obtida por este meio tal como com GGF-II e também construções de DNA e vectores de expressão tendo inserida tal sequência de DNA, as células hospedeiras geneticamente alteradas por inclusão 56

de tais construções/vectores e proteínas obtidas por cultura de tais células hospedeiras. 0 invento inclui estas matérias. I. Proieccão e síntese de sondas e iniciadores oliqonucleotldicos

As sondas degeneradas de oligómeros de DNA foram projectadas a partir das sequências de axninoácidos. Os oligómeros representam a sequência da cadeia codificadora ou da cadeia não codificadora. Quando serina, arginina ou leucina foram incluídas na projecção de oligómeros, então foram preparadas duas sínteses separadas para evitar ambiguidades. Por exemplo, a serina foi codificada por TCN ou AGY como em 537 e 538 ou 609 e 610. Tal degeneração de codões foi feita ara arginina ou leucina (e.g. 544, 545). Os oligómeros de DNA foram sintetizados num sintetiza-dor de DNA de 4 colunas Biosearch 8750 usando química de B-ciano-etilo operada numa escala de síntese de 0,2 micromoles. Os oligómeros foram separados da coluna (resinas CpG de 500 angstrons) e desprotegidos em hidróxido de amónia concentrada durante 6-24 horas a 55-60°C. Os oligómeros desprotegidos foram secos sob vácuo (Speedvac) e purificados por electroforese em géis de 15% de acrilamida (20 mono : 1 bis), tampão 50 mM Tris--borato-EDTA contendo ureia 7M. Os oligómeros de tamanho completo foram detectados nos géis por iluminação com UV, em seguida as bandas foram retiradas e os oligómeros de DNA eluidos em 1,5 ml de H2OI durante 4-16 horas com agitação. 0 eluato foi seco, redissolvido em 0,1 ml de H20 e as medições de absorvância feitas a 260 nm. . _______As concentrações foram determinadas de acordo com a seguinte fórmula: (A 260 x unidades/ml) (6 0,6/comprimento - x μΜ) 57

Todos os oligómeros foram ajustados a uma concentração de 50 μΜ pela adição de H^O.

Sondas degeneradas projectadas como descrito atrás estão apresentadas na Figura 21, SEQ ID Nos. 54-88.

Os iniciadores de PCR foram preparados essencialmente pelos mesmos processos usados para sondas com as modificações gue se seguem. Adaptadores de treze nucleótidos contendo sítios de restrição foram incluídos nos extremos 5' dos oligómeros degenerados para usar em clonagem nos vectores. A síntese de DNA foi realizada à escala de 1 micromole usando resinas CpG de 1000 angstrons e usou-se inosina nas posições onde foram incorporados os quatro nucleótidos normamente em sondas degeneradas. As purificações dos iniciadores de PCR incluíram uma precipitação com etanol após purificação por electroforese em gel. II. Construção e despiste de uma biblioteca

Comprou-se à Stratagene uma biblioteca de DNA genómico bovino (Número de Catálogo: 945701). A biblioteca continha 2 x 10° fragmentos de DNA bovino de 15-20 Kb obtido por digestão parcial com Sau3Al clonados no vector lambda Dashll. Comprou-se à Clonetech uma uma biblioteca de cDNAtotal de cérebro bovino (Número de Catálogo: BL 10139). Construiram-se bibliotecas de DNA complementar (In Vitrogen; Stratagene) a partir de mRNA preparado a partir de cérebro total bovino, a partir de pituitária bovina e a partir de oituitária posterior bovina. In Vitrogene preparou duás bibliotecas dé cDNA: uma biblioteca foi no vector lambda glO, a outra no vector pcDNAI (uma biblioteca em plasmídeo). As bibliotecas da Stratagene foram preparadas no vector lambda unizap. Colectivamente, as bibliotecas de cDNA continham 14 milhões de fagos primários recombinantes. 58

A biblioteca genómica bovina foi plaqueada em E. coli K12 estirpe LE392 em placas de 23 x 23 cm (Nunc) entre 150000 e 200000 placas fágicas por placa. Cada uma das placas representou aproximadamente umequivalente de genoma bovino. Após uma incubação durante a noite a 37 °C, as placas foram arrefecidas e preparadas réplicas em filtros de acordo com os processos de Maniatis et al., (2:60-81). Prepararam-se quatro réplicas de cada placa com membranas de nylon sem carga (Pall Biodyne A ou MSI Nitropu-re). O DNA foi imobilizado nas membranas por ligação com luz UV durante 5 minutos ou cozendo a 80°C sob vácuo durante duas horas. As sondas de DNA foram marcadas usando cinase de polinucleótidos de T4 (New England Biolabs) com gama 32P ATP (New England Nuclear; 6500 Ci/mmole) de acordo com as especificações dos forne-· cedores. Resumidamente, 50 pmoles de oligómero de DNA degenerado foram incubados na presença de 600 pCi de gama 32P-ATP e 5 unidades de cinase de polinucleótidos de T4 durante 30 minutos a 37°C. As reacções foram paradas, adicionou-se tampão de aplicação para electroforese em gel e depois as sondas marcadas radioacti-vamente foram purificadas por electroforese. As sondas marcadas cpm 32P foram removidas das fatias de gel e eluidas para água. Como alternativa, as sondas de DNA foram marcadas via amplificação por PCR por incorporação de cr-32P-dATP pu a-32P-dCTP de acordo com o protocolo de Schowalter e Sommer, Anal. Biochem 177:90-94 (1989). As sondas marcadas em reacções de PCR foram purificadas por remoção do sal em colunas de Sephadex G-150. A pré-hibridação e hibridação foram realizadas em tampão GMC (0,52 M NaPi, 7% SDS, 1% BSA, 1,5 mH EDTA, 0,1M NaCl, 10 mg/ml- tRNA) .· A lavagem foi realizada em oligolavagem (160 ml de Na2HP04 1 M, .200 ml de. DSD a 20%, 8,0 ml de 0,5M EDTA, 100 ml de NaCl 5M, 3632 ml de H2<0). Tipicamente 20 filtros (400 centímetros quadrados cada) representando cópias de réplicas de dez equivalentes de genoma bovino foram incubados em 200 ml de 59

solução de hibridação com 100 pmoles de sonda oligonucleótidica degenerada (128-512 vezes degenerada). A hibridação correu durante a noite a 5°C abaixo da temperatura de fusão mínima calculada para a sonda degenerada. 0 cálculo da temperatura de fusão mínima assume 2°C para um par AT e 4°C para um par GC.

Os filtros foram lavados em mudas repetidas de oligola-vagem às temperaturas de hibridação quatro a cinco horas e finalmente em cloreto de tetrametilamónio 3,2 M, 1% SDS duas vezes durante 30 minutos a uma temperatura dependente do comprimento da sonda de DNA. Para 20 meros, a temperatura da lavagem final foi de 60°C. Os filtros foram montados, depois expostos a filme de raios X (Kodak XAR5) usando écrans intensificadores (Dupont Cronex Lightening Plus). Geralmente, uma exposição do filme de três a cinco dias a -80°C foi suficiente para detectar sinais em duplicado nestes despistes de bibliotecas. Após análise dos resultados, os filtres foram desibridados por dois ciclos sucessivos de quinze minutos num forno de micro-ondas na potência máxima numa solução de 1% SDS contendo 10 mM EDTA pH8. Os filtros foram usados pelo menos três a quatro ciclos de desibridação e hibridação com várias sondas.

III. Isolamento de f acros recombinantes, crescimento e preparação de DNA

Estes processos seguiram o protocolo convencional conforme descrito em Recombinant DNA Maniatis et al. , 2:60-2:81). IV. Análise de clones isolados usando digestão de DNA e transferências Southern

Amostras de DNA fágico recombinante (2 microgramas) 60 foram digeridas de acordo com as condições recomendadas pelo fornecedor da endonuclease de restrição (Nev£ England Biolabs). Após uma incubação de quatro horas a 37°C, os produtos de reacção foram precipitados na presença de acetato de sódio 0,1M e três volumes de etanol. O DNA precipitado foi colhido por centrifugação, lavado em etanol a 75% e seco. Todas as mostras ressuspensas foram aplicadas em géis de agarose (tipicamente 1% em tampão TAE; 0,04M Tris-acetato, 0,002M EDTA). Os géis correram a 1 volt por centímetro entre 4 e 20 horas. Os marcadores incluíram fragmentos de DNA de lambda clivado com Hind III e/ou fragmentos HaelII de 0X174 (New England Biolabs). Os géis foram corados coro 0,5 microgramas/ml de brometo de etídio e fotografados. Para as transferências Southern, o DNA foi primeiro despurinizado no gel por tratamento com 0,125N HCl, desnaturado em 0,5N NaOH e transferido em 20X SSC (cloreto de sódio 3M, citrato de sódio 0,03M) para membranas de nylon não carregadas. A transferência foi feita durante 6 horas até 24 horas, em seguida os filtros foram neutralizados em 0,5M Tris HCl pH 7,5, cloreto de sódio 0,15M, em seguida lavado brevemente em 50 mM Tris-borato EDTA.

Para a ligação, os filtros foram primeiro envolvidos em película de plástico, transparente, em seguida o lado do DNAexpos-to durante cinco minutos a uma luz de ultravioleta. A hibridação e a lavagem foram realizadas como descrito para o despiste de bibliotecas (ver secção 2 deste Exemplo). Para análise de hibridação de forma a determinar se existem genes semelhantes noutras espécies foram feitas ligeiras modificações. 0 filtro com DNA foi adquirido à Clonetech (Número de Catálogo 7753-1) e contem 5 microgramas por faixa de DNA digerido com EcoRI derivado de várias espécies. A sonda foi marcada por reacções de amplificação por PCR como descrito na secção 2 atrás e as hibridações foram feitas em 80% de tampão B (2g de polivinilpirrolidona, 2 g de Ficoll-400, 2 g de albumina sérica bovina, 50 ml de 1M Tris-HCl 61 (ρΗ 7,5) 58 g de NaCl, lg de pirofosfato de sódio, 10 g de dodecilsulfato de sódio, 950 ml de Η2<0) contendo 10% de dextran-sulfato. As sondas foram desnaturadas por fervura durante dez minutos e depois rapidamente arrefecidas em água gelada. A sonda foi adicionada ao tampão de hibridação a 106 dpm 32P por ml e incubado durante a noite a 60°C. Os filtros foram lavados a 60°C primeiro em tampão B seguido de 2xSSC, 0,1% SDS depois em lx SSC, 0,1% SDS. Para experiências com restringência elevada as lavagens finais foram feitas em 0,1 x SSC, 1% SDS e a temperatura aumentada para 65°C.

Os dados de transferência Southern foram usados para preparar um mapa de restrição do clone genómico e para indicar quais os fragmentos que hibridam com as sondas de GGF (candidatos a subclonagem). V. Subclonaaem de segmentos de DNA homólogos das sondas de hibridação

As digestões de DNA (e.g. 5 microgramas) foram aplicadas em géis de 1% de agarose, depois os fragmentos removidos dos géis após coloração. O DNA foi purificado por adsorção a esferas de vidro seguido de eluição usando o protoclo descrito pelo fornecedor (Bio 101). Os fragmentos de DNA recuperados (100-200 ng) foram ligados a vectores linearizados desfosforilados, e.g. pT3T7 (Ambion), o qual é um derivado de pUC18, usando ligase de T4 (New England Biolabs). Este vector é portador do gene da β-lactamase de E. coli. portanto, os transformantes pode ser seleccionado em placas - contendo - ampicilina. O vector também fornece complementação de β-galactosidase à célula hospedeira, assimas placas não recombinantes (azuis) podem se rdetectadas usando isopropiltiogalactosido e Bluogal (Bethesda Research Labs). Uma fracção dasreacções de ligação foi usada para 62

transformar células competentes azuis E. coli K12 XL1 (Stratagene Na de Catálogo: 200236) e em seguida os transformantes foram seleccionados em placas LBcontendo 50 microgramas por ml de ampicilina. As colónias brancas foram seleccionadas e feitas minipreparações de plasmídeos para digestão do DNA e para análise da sequência. Os clones seleccionados foram novamnete testados para determinar se a sua inserção híbrida com as sondas de GGF.

VI. Sequenciacão de DNA

Preparam-se moldes de DNA de plasmídeo de cadeia dupla a partir de culturas de 5 ml de acordo com protocolos convencionais. A sequenciação foi feita pelo método de terminação de cadeias didesoxi usando Sequenase 2.0 e um kit de sequenciação de desoxinucleõtidos (US Biochemical) de acordo com o protocolo dos fabricantes (uma modificação de Sanger et al. PNAS; USA 74:5463 (1977)]. Como alternativa, a sequenciação foi feita num cicliza-dor térmico de DNA (Perkin Elmer, modelo 4800) usando um kit de sequenciação por ciclos (New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories) e foi realizado de acordo com as instruções do fabricante usando um iniciador marcado no extremo 5'. Os iniciadores de sequenciação foram os fornecidos com os kits de sequenciação ou foram sintetizados de acordo com a sequência determinada a partir dos clones. As reacções de sequenciação foram aplicadas e resolvidas em géis de sequenciação de 0,4 mm de espessura de 6% de poliacrilamida. Os géis foram secos e expostos a filme de raios X. Tipicamente, 35S foi incorporado quando foram usados kits de sequenciação convencionais e iniciador marcado no extremo 5'—com 32P foi usado nas reacções de sequenciação por ciclos. As sequências foram lidas num editor de sequências de DNA a partir do fundo do gel para o topo (direcção 5' para 3') e os resultados foram analisados usando programas fornecidos por Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin). \ 63

VII. Preparacao de RNA e amplificacao por PCR

Grelhas de leitura abertas detectadas no DNA genómico e que continham sequências codificadoras de peptídeos GGF foram prolongadas via amplificação por PCR de RNA de pituitária. O RNA foi preparado a partir de tecido bovino congelado (Pelfreeze) segundo o método de guanidina-CsCl (hirgwin et al., Biochemistry 18:5294 (1979). Seleccionou-se RNA poliadenilado por cromatogra-fia em coluna de oligo-dT celulose (Aviv e Leder PNAS (USA) 69:1408 (1972)).

Sequências de DNA alvo específicas foram amplificadas começando com amostras de RNA total ou de RNA poliadenilado que foram convertidas em cDNA usando o kit de PCR/RNA Perkin Elmer Número: N808-0017. As reacções de transcriptase reversa para obtenção da primeira cadeia usaram 1 μg de RNA molde e iniciadores de oligo dT com elementos de ligação contendo locais de reconhecimento de enzimas de restrição. Para produzir a segunda cadeia os iniciadores foram sequências únicas de cadeia mais conforme usado nas reacções RACE 3' (Frohman et . al., PNAS (USA) 85: 8998 (1988) ou foram iniciadores de oligo dT com sítios de restrição ligados se o segundo sítio alvo foi adicionado por formação de caudas com transferase terminal nos produtos de reacção da primeira cadeia usando dATP (e.g. reacções RACE, Frohman et al., ibid). Como alternativa, tal como nas reacções de PCR ancoradas os iniciadores da segunda cadeia foram degenerados, portanto representando sequências peptídicas particulares. ...................Os perfis de amplificação seguiram o seguinte esquema geral: 1) cinco minutos a 95°C; 2) ciclo térmico de 1 minuto, 95°C; 1 minuto de rampa até uma temperatura de emparelhamento de 45°C, 50°C ou 55°C; manutenção da temperatura de emparelhamento durante 1 minuto; rampa até 72°C durante 1 minuto; 72°C durante 1 \ 64 minuto ou durante 1 minuto mais uma auto-extensão,de 10 segundos; 3) ciclo de extensão a 72°C, cinco minutos e; 4)tempo infinito a 4°C. Normalmente fizeram-se 3 0 ciclos (#2) . Uma amostra de dezasseis μΐ dos 100 μΐ de reacção de amplificação foi analisado por electroforese em géis de 1% de agarose Nusieve em tampão TAE a 4 volts por centímetro durante três horas. Os géis foram corados, depois transferidos para membranas de nylon que foram despistadas com sondas de DNA marcado que eram internas relativamente aos iniciadores. Séries específicas de produtos de amplificação de DNA puderam ser identificadas nas experiências de transferência e as suas posições usadas como guia da purificação e reamplificação. Quando adequado o restante das reacções de amostras seleccionadas foi aplicado em géis preparativos, depois da electroforese quatro a cinco fatias de 0,5 mm de espessura (englobando a posição esperada do produto específico) foram retiradas do gel. A agarose foi esmagada, depois embebida em 0,5 ml de tampão de electroforese 2-16 horas a 40°C. A agarose esmagada foi centrifugada durante dois minutos e a fase aquosa foi transferida para novos tubos.

Fez-se reamplificação em cinco microlitros (aproximada-mente 1% do produto) do material eluido usando as mesmas séries de iniciadores e os perfis de reacção como nas reacções originais. Quando as reacções de reamplificação estavam completas as amostras foram extraídas com clorofórmio e transferidas para tubos novos. Os tampões concentrados de enzimas de restrição e as enzimas foram adicionadas às reacções de forma a clivar nos sítios de restrição presentes nos adaptadores. Os produtos de PCR digeridos foram purificados por electroforese em gel, depois subclonados nos vectores como descrito na secção de subclonagem acima. A sequenciação de DNA foi feita como descrito acima. 65

VIII. Análise da sequência de DNA

As sequências de DNA foram montadas usando um programa de montagem de fragmentos e as sequências de aminoácidos deduzidas pelo pelos programas GCG GelAssemble, Map and Translate. As sequências proteicas deduzidas foram usadas como sequências de partida na pesquisa das bases de dados de sequências proteicas usando WordSearch. A análise foi. feita numa estação de trabalho VAX Station 3100 operando com VMS 5.1. A pesquisa da base de dados foi feita num terminal SwissProt número 21 usando a GCG Versão 7.0.

IX. Resultados de clonaqem e seguenciacão de genes codificadores de GGF-I e GGF-II

Conforme indicado atrás, para identificar a sequência de DNA codificadora de GGF-II bovino projectaram-se sondas oligonucleotídicas degeneradas a partir das sequências peptídicas GGF-II. GGF-II 12 (SEQ ID N2 44), um peptídeo gerado via digestão com lisil-endopeptidase de uma preparação de GGF-II purificada (ver Figuras 11 e 12) mostrou uma forte homologia da sequência de aminoácidos com GGF-I 07 (SEQ ID N2 39) um peptídeo tríptico gerado a partir da preparação de GGF-I purificado. GGF-II 12 foi assim usado para criar dez sondas de oligonucleótidos degeneradas (ver oligos 609, 610 e 649 a 656 na Figura 21, SEQ ID Nos. 69, 70, 71 e 79, respectivamente). Uma série em duplicado de filtros foi despistada com duas séries (série 1=609, 610; série 2=649--5656) das sondas codificadoras de duas fracções sobreponíveis de GGF-II 12. Observaram-se sinais - de hibridação, mas apenas um clone hibridou com ambas as séries de sondas. O clone (designado GGF2BG1) foi purificado. 66

A análise de transferência Southern do DNA do clone fágico GGF2BG1 confirmou que ambas as séries das sondas hibrida-ram com a sequência de DNA bovino e mostrou "ainda que ambas as sondas reagiam com a mesma série de fragmentos de DNA dentro do clone. Com base naquelas experiências um subfragmento EcoRI de 4 Kb do clone original foi identificado, subclonado e parcialmente sequenciado. A Figura 22 mostra a sequência de -nucleótidos, SEQ ID Na 89) e a sequência de aminoácidos deduzida das leituras iniciais da sequência de DNA que incluíram os sítios de hibrida-ção das sondas 609 e 650, e confirmou que uma racção deste DNA genómico bovino codifica o peptídeo 12 (KASLADSGEYM).

Posterior análise de sequências demonstrou que GGF-II 12 está situado numa grelha de leitura aberta de 66 aminoácidos (ver abaixo) que se tornou o ponto de partida para o isolamento de sequências sobreponíveis representando um gene putativo de GGF-II bovino e um cDNA.

Usou-se vários processos de PCR para se obter sequências codificadoras adicionais para o gene putativo bovino de GGF-II. Amostras de RNA total e de RNA seleccionado em oligo-dT (contendo poli A) foram preparadas a partir de pituitária total bovina, pituitária anterior, pituitária posterior e hipotálamo. Usando iniciadores da lista mostrada na Figura 23, SEQ ID Nos. 109-119, reacções de PCR unilaterais (RACE) foram usadas para amplificar extremos de cDNA em ambas as direcções 3' e 5' e reacções de PCR ancoradas foram realizadas com oligonucleótidos iniciadores degenerados representando outros peptídeos de GGF-II. A Figura 24 resume as estruturas- de DNA contíguas e as sequências obtidas naquelas experiências. A partir das reacções RACE 3' foram produzidas três sequências de cDNA de corte e religação alternativo, as quais foram clonadas e sequenciadas. Uma reacção RACE 5' conduziu à descoberta de mais um exão contendo uma 67 sequência codificadora de pelo menos 52 aminoácidos. A análise daquela sequência de aminoácidos deduzida revelou peptídeos GGF-II-6 e uma sequência semelhante a GGF-I-18 (ver abaixo). As reacções de PCR ancoradas conduziram ã identificação de sequências codificadoras (cDNA) dos peptídeos GGF-II-1, 2, 3 e 190 contidas dentro de um segmento de cDNA adicional de 300 pb. O limite 5' deste segmento(i.e. segmento E, ver Fig. 31) é definido pelo endonucleótido que codifica o peptídeo GGF-II-1 e que foi usado na reacção de PCR (existem outros dados da sequência 5' tal como descrito para o clone humano no Exemplo 6). Assim este clone contem sequências de nucleótidos codificadoras de seis das nove sequências novas de GGF-II. 0 gene clonado foi caracterizado primeiro construindo um mapa físico de GGF2BG1 que nos permitiu posicionar as sequências codificadoras à medida que foram encontradas (ver abaixo, Figura 25). As sondas de DNA derivadas das sequências codificadoras descritas atrás foram usadas para identificar outros fragmentos de DNA contendo os exões neste clone fágico e para identificar clones sobreponíveis em ambas as direcções. O gene putativo bovino de GGF-II está dividido em pelo menos 5 segmentos codificadores. Os segmentos codificadores são definidos como comprimentos discretos da sequência de DNA que podem ser traduzidos em sequências polipeptídicas usando o código genético universal. Os segmentos codificadores descritos na Figura 31 e referidos no presente pedido são: 1) exões particulares presentes dentro do gene GGF (e.g. segmento codificador a) ou 2) derivados de séries de dois ou mais exões que surgem em subgrupos específicos de mRNAs, onde cada série pode ser traduzida nos segmentos polipep-tídicos específicos tal como nos produtos dos genes mostrados. Os segmentos polipeptídicos referidos nas reivindicações são os produtos de tradução de segmentos de DNA codificadores análogos. Apenas os segmentos codificadores A e B foram definidos como 63 63

exões e sequenciados e mapeados. 0 sumário das sequências codificadoras contíguas identificadas está apresentado na Figura 26. Os exões estão apresentados (por ordem alfabética) pela ordem da sua descoberta. É aparente a partir das fronteiras intrão/exão que o exão B pode estar incluido em cDNAs que liguem o segmento codificador E e o segmento codificador A. Ou seja o exão B não pode ser cortado e religado sem comprometer a grelha de leitura. Assim, sugerimos que três padrões alternativos de corte e religação podem produzir sequências putativas 1, 2 e 3 de cDNA de GGF-II bovino. As sequências codificadoras destas, designadas GGF2BPP1.CDS, GGF2BPP2.CDS e GGF2BPP3.CDS, respectivamente estão apresentadas nas Figuras 28a (SEQ ID N2 133}, 28b (SEQ ID Νδ 134) e 28c (SEQ ID N2 135), respectivamente. A sequência de aminoáci-dos deduzida dos três cDNAs está também apresentada nas Figuras 28a, (SEQ ID Νδ 133), 28b (SEQ ID Νδ 134) e 28c (SEQ ID NS 135).

As três estruturas deduzidas codificam proteínas de comprimentos 206, 281 e 257 aminoácidos. Os primeiros 183 rsíduos da sequência proteica deduzida são idênticos nos três produtos dos genes. Na posição 184 os clones diferem significativamente.

Um codão para glicina GGT em GGF2BPP1 também serve com um sítio dador de "splicing" para GGF2BPP2 e GGF2BPP3, que alternativamente origina os exões C, C/D, C/D' e D ou C, C/D e D, respectivamente e apresentado na Figura 33, SEQ ID Ns 149). GGFIIBPP1 é um produto truncado gerado lendo para além da junção de splicing do segmento A codificador no sentido da sequência interviniente (intrão) seguinte. Isto representa o segmento codificador A' na figura 31 (SEQ ID Νδ 140). Os transcritos terminam adjacentes a uma sequência canónica de poliadenilação AATAAA e sugerimos que este produto truncado represente um transcrito maduro. Os outros dois produtos mais longos partilham a mesma sequência 3' não traduzida e o sítio de poliadenilação. 69 -

Estas três moléculas contêm seis das nove sequências peptídicas novas de GGF-II (ver Figura 12) e Um outro peptídeo é altamente homólogo de GGF-I-18 (ver Figura 27)”. Este resultado dá uma alta probabilidade de que esta molécula recombinante codifique pelo menos uma fracção de GGF-II bovino. Ainda, os pontos isoeléctricos calculados para os três peptídeos são consistentes com as propriedades físicas de GGF-I e II. Uma vez que o tamanho molecular de GGF-II é aproximadamente 60 KD, o maior dos três cDNAs deverá codificar uma proteína com aproximadamente metade do número de aminoãcidos previsto.

Uma sonda englobando os exões B e A foi marcada via amplificação por PCR e usado no despiste de uma biblioteca de cDNAfeita a partir de RNA isolado a partir de pituitária posterior bovina. Um clone (GGF2BPP5) apresentou o padrão indicado na Figura 30 e continha um segmento de DNA codificador adicional (G) entre os segmentos codificadores A e C. A sequência de ácido nucleico na sua totalidade está apresentada na Figura 32 (SEQ ID Ns 148). 0 produto de tradução previsto a partir da maior grelha de leitura aberta é de 241 aminoácidos. Uma fracção de um segundo cDNA (GGF2BPP4) foi também isolado a partir de uma biblioteca de pituitária posterior bovina usando a sonda descrita atrás. Estes 'clorie mostrou o padrão indicado na figura 30. Este clone está incompleto no extremo 5', mas é uma variante de corte e religação no sentido de não possuir os segmentos G e D. BPP4 também apresenta um novo extremo 3' com as regiões Η, K e L para lá da região C/D. A sequência de BPP4 está apresentada na Figura 34 (SEQ ID N2 150) .

Exemplo 5

Sequências GGF em várias espécies A pesquisa de bases de dados não revelou quaisquer 70

semelhanças significativas entre os produtos de tradução previstos para GGF e sequências proteicas conhecidas. Isto sugere que GGF-II é o primeiro membro de uma nova família ou superfamília de proteínas. Em estudos de hibridação cruzada de alta restringência (experiências de transferência de DNA) com outros DNA de mamíferos mostraram claramente que as sondas de DNA desta molécula recombinante bovina pode facilmente detectar sequências específicas numa variedade de amostras testadas. Uma sequência altamente homóloga foi também detectada em DNA genómico humano. O autorra-diograma está apresentado na figura 29. Os sinais nas faixas xontendo DNA de rato e humano representam os equivalentes de rato ehumano do gene GGF, as sequências de vários cDNAs codificados por este gene foram recentemente descritas por Holmes et al. (Scinece 256: 1205 (1992)) e Wen et al. (Cell 69.: 559 (1992)).

Exemplo 6

Isolamento de uma sequência codificadora de GGF2 humano Vários clones humanos contendo sequências derivadas do segmento E codificador de GGF-II bovino foram isolados por despiste de uma biblioteca de cDNA humano preparada a partir de cérebro (Stratagne N2 de catálogo #935206). Esta estratégia foi continuada com base na forte ligação entre a maior parte dos peptídeos GGF2 (específico de GGF2) e a sequência prevista a partir de clones contendo o segmento E bovino. Esta biblioteca foi despistasda como descrito no Exemplo 4, Secção II usando as sondas de oligonucleótidos 914-919 apresentadas abaixo.

914 TCGGGCTCCATGAAGAAGATGTA

915 TCCATGAAGAAGATGTACCTGCT

916 ATGTACCTGCTGTCCTCCTTGA

917 TTGAAGAAGGACTCGCTGCTCA 71

918 AAAGCCGGGGGCTTGAAGAA

Os clones detectados com estas sondas foram ainda analisados por hibridação. Uma sonda derivada do segmento codificador A (ver Figura 21), o qual foi produzido por marcação de um produto de reacção em cadeia com polimerase (PCR) do segmento A, foi também usado para fazer o despiste de uma biblioteca primária. Vários clones que hibridaram com sondas derivadas de A e de E foram seleccionados e um clone particular, GGF2HBS5, foi selec-cionado para posterior análise. Este clone é representado pelo padrão de segmentos codificadores (EBACC/D'D como se mostra na Figura 31). 0 segmento E neste clone é o equivalente humano da versão bovina truncada de E mostrado na Figura 37. GGF2HBS5 é o candidato mais provável como codificador de GGF-II de todos os candidatos putativos a GGF-II descritos. O comprimento da sequência codificadora do segmento E é de 786 nucleótidos mais 264 bases de sequência não traduzida. 0 tamanho previsto da proteína codificada por GGF2HBS5 é de aproximadamente 423 aminoácidos (aproximadamente 45 kilodaltons, ver Figura 45, SEQ ID N2 167) que é semelhante ao tamanho da forma desglicosilada de GGF-II (ver Exemplo 16). Em adição, sete dos peptídeos apresentados na Figura 27 possuem sequências equivalentes que caem dentro da sequência proteica prevista a partir da região E. Os peptídeos II-6 e 11-12 são excepções, as quais caem dentro do segmento codificador B e do segmento codificador A, respectivamente. RNA codificador da proteína GGF2HBS5 foi produzido num sistema de transcrição in vitro conduzido pelo promotor do bacteriofago T7 residente no vector [Stratagene Inc.] ver Figura 44) contendo a inserção GGF2HBS5. Este RNA foi traduzido num sistema acelular (reticulócitos de coelho) de tradução in vitro e o tamanho da proteína foi de 45 Kd. Ainda, o produto obtido num sistema acelular foi testado num ensaio mitogénico para células de Schwann para confirmar a actividade biológica. As células de 72

Schwann tratadas com meio condicionado apresentam um aumento de 125 proliferação medido pela incorporação de I-Undina e fosfori-lação da tirosina de uma proteína na gama de 185 quilodaltons. Assim, o tamanho do produtocodifiçado por GGF2HBS5 e a presença de sequências de DNA que codificam peptídeos humanos altamente homólogos dos peptídeos bovinos apresentados na Figura 12 confirmam que GGFHBS5 codificam o equivalente humano de GGF2 bovino. 0 facto de o meio condicionado preparado a partir de células transformadas com este clone induzir actividade mitogénica das células de Schwann confirma que o produto do gene GGFIIHBS5 (ao contrário do produto do gene BPP5) é secretado. Adicionalmente o produto do gene GGFIIBPP5 parece mediar a resposta proliferativa das células de Schwann via um receptor cinase de tirosina como seja pl85 ou um receptor estreitamente relacionado (ver

Exemplo 14).

Exemplo 7

Expressão de GGF2 humano recombinante em células de mamífero e de insecto 0 clone de cDNA GGF2HBS5 codificador de GGF2 humano (como descrito no Exempplo 6 e também referido aqui como HBS5) foi clonado no vector pcDL-SRa296 (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8.:466-472 (1988) e células COS-7 foram transfectadas em placas de 100 mm pelo método de DEAE-dextrano (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2â ed. CSH Laboratory NY (1989). Os lisados celulares ou meios condicionados de células COS com expressão transitória foram colhidos aos 3 ou 4 dias após trans-fecção. Para preparar lisados, monocamadas celulares foram lavadas com PBS, raspadas das placas lisadas por três ciclos de congelação/descongelação em 150 μΐ de 0,25M Tris-HCl, pH 8. Os detritos celulares foram sedimentados e recuperado o 73

sobrenadante. Colheram-se amostras de meio condicionado (7 ml), depois concentraram-se e mudou-se o tampão com Tris 10 mM pH 7,4 usando unidades Centiprep-10 e Centricon-10 como descrito pelo fabricante (Amicon, Beverly, MA). As células de Schwann do nervo de rato foram testadas relativamente à incorporação de precursores da síntese de DNA, como descrito (ver Exemplo 3). Os meios condicionados ou amostras de lisado celular foram testadas no ensaio de proliferação das células de Schwann como descrito no Exemplo 3. Os resultados da actividade mitogénica estão apresentados na Fig. 46. O cDNA, GGF2HBS5, codificador de GGF2 dirigiu a secreção do produto proteico para o meio. Uma pequena proporção da actividade total foi detectada dentro das células conforme determinado pelos ensaios usando lisados celulares. cDNAs de GGF2HBF1 e GGFBPP5 não deram origem a secreção do produto para o meio extracelular. A actividade GGF destes clones foi detectável apenas nos lisados celulares (Fig. 46). GGF2 recombinante foi também expresso nas células CHO. O cDNA de GGF2HBS5 codificador de GGF2 foi clonado no local EcoRI do vector pcdhfrpolyA (Fig. 54) e usado para transfectar a linha celular CHO negativa relativamente a DHFR (DG44) pelo método de coprecipitação com fosfato de cálcio (Graham e Van Der Eb, Virology 52:456-467 (1973). Os clones foram seleccionados em meio α sem nucleósidos e sem nucleótidos (Gibco) em placas de 96 cavidades. Após 3 semanas, amostras de meio condicionado de clones individuais foram despistadas relativamente à expressão de GGF pelo ensaio de proliferação das células de Schwann como descrito no Exemplo 3. Clones estáveis que secretavam níveis significativos de actividade GGF para o meio foram identificados. Os resultados da actividade proliferativa das células de Schwann de diferentes quantidades de meio condicionado de células CHO foram usados para produzir a curva de dose resposta mostrada na Fig. 47 (Graham e Van der Eb, Virology 52.:456, 1973). Este 74

material foi analisado numa transferência Western despistado com anti-soro policlonal induzido contra um peptideo específico de GGF2. Uma banda larga de aproximadamente 69-90 Kd (o tamanho esperado de GGF2 extraído de pituitária e de glicoformes de alto peso molecular) foi marcada especificamente (Fig. 49, faixa 12)· GGF2 recombinante foi também expresso em células de insecto usando a expressão em Baculovirus. Células de insecto Sf9

foram infectadas com baculovirus contendo o clone de cDNA GGF2HBS5 numa multiplicidade de 3-5 (106 células/ml) cultivadas em meio Sf900-II (Gibco). A actividade mitgénica de células de

Schwann foi secretada para o meio extracelular (Fig. 48). Volumes diferentes de meio condicionado de células de insecto foram testados no ensaio de proliferação de células de Schwann na ausência de„... .. . . . .

Forskolm e os resultados usados para produzir a curva de dose-resposta mostrada na Fig. 48.

Este material foi também analisado numa transferência Western (Fig. 47) despistado com o anticorpo específico de GGFII descrito atrás. Observou-se uma banda de 45 Kd, o tamanho de GGF-II desglicosilado (ver Exemplo 16).

Os métodos usados neste exemplo foram os seguintes: A actividade mitogénica em células de Schwann dos factores de crescimento das células da glia bovinos foi determinada como se segue: As respostas mitogénicas das células de Schwann em cultura foram medidas na presença de 5μΜ Forskolin usando as preparações brutas de GGF recombinante obtidas a partir de experiências de expressão transitória em células de mamífero. 125 . A incorporação de [ I]-Undina foi determinada após uma exposição de 18-24 horas a materiais obtidos a partir de células COS transfectadas ou não como descrito nos Métodos. São mostradas as 75

médias e desvios padrões das quatro séries de resultados. A resposta xnitogénica a GGF de pituitária bovina nativa parcialmente purificado (fracção de carboximetilcelulose; Goodearl et al., submetido a publicação) é está apresentado (GGF) como um padrão de cem por cento de actividade.

Clonaram-se cDNAs (Fig. 53) em pcDL-SRa296 (Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8:466-472 (1988)) e células COS-7 foram transfectadas em placas de 100 mm pelo método de DEAE-dextrano (Sambrook et al., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2â ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989)). Os lisados celulares ou meios condicionados foram colhidos aos 3 ou 4 dias pós-infecção. Para preparar lisados as monocamadas celulares foram lavadas com PBS, raspadas · das placas e lisadas por três ciclos de congelação/descongelação em 150 μ1ά& 0,25M Tris-HCl, pH 8. Os detritos celulares foram sedimentadas e recuperado o sobrenadnte. As amostras de meio condicionado (7 ml) foram colhidas, depois concentradas e mudado o tampão com 10 mM Tris, pH 7,4 usando unidades Centriprep-10 e Centricon-10 como descrito pelo fabricante (Amicon, Beverly, MA). Células de Schwann do nervo ciático de rato foram testadas quanto à incorporação de precursores da síntese de DNA, como descrito (Davis e Stroobant, J. Cell Biol. 110:1353-1360 (1990); Brockes et al., Brain Res. 165:105-118 (1979)) .

Transferências Western de meio condicionado de células CHO recombinante foram realizadas como se segue: Um clone de CHO recombinante foi cultivado em 7 ml de meio sem proteínas MCDB302 durante 3 dias; 2 -ml de meio condicionado foi concentrado, trocado o tampão para 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 e liofilizado até secagem. O sedimento foi ressuspenso em tampão de amostra de SDS-PAGE, sujeito a electroforese em gel de SDS redutor e analisado por transferência Western com um anticorpo contra um 76

peptldeo GGF. Fez-se uma testemunha CHO usando meio condicionado de hospedeiros CHO-DG44 não transfectados e os níveis de CHO HBS5 foram testados usando meio condicionado a partir de um clone recombinante. EXEMPLO 8

Isolamento de outras sequências humanas relacionadas com GGF bovino O resultado nos Exemplos 5 e 6 indicam que sequências relacionadas com GGF derivado de fontes humanas podem também ser facilmente isolados usando sondas de DNA derivadas de sequências GGF bovinas. Como alternativa pode ser usado o processo descrito por Holmes et al. (Science 256: 1205 (1992)). Neste exemplo uma proteína humana (heregulina a), que se liga ao receptor pl85crbB2

e o activa ( e está relacionado com GGF), foi purificada a partir de uma linha celular tumoral e a sequência peptídica derivada foi usada para produzir sondas oligonucleotídicas que foram usadas para clonar os cDNAs codificadores de heregulina. O Λγ· bR p ensaio bioquímico para a activação do receptor pl85 é diferente do ensaio de proliferação das células de Schwann. Esta é uma abordagem semelhante à usada no Exemplo 1-4 para a clonagem de sequências de GGF derivadas de cDNAs de pituitária. A proteína heregulina e os DNAs complementares foram isolados a partir de linhas de células tumorais de acordo com os processos que se seguem. A heregulina foi purificadaa partir de meio condicionado por células de cancro da mama MDA-MB-231 (ATCC #HTB 26) cultivadas em esferas microveículos Percell Biolytica (Hyclone Labs). O meio foi concentrado (10 litros) foi concentrado 25 vezes por filtração através de uma membrana (10 KD de exclusão) (Millipore) e clarificado por centrifugação e filtração através de um filtro (0,22 ^m). O material filtrado foi aplicado numa coluna de 77

heparina-Sepharose (Pharmacia) e as proteínas foram eluidas por passos com 0,3, 0,6 eO,9M NaCl em tampão de fosfatos salino. Mediu-se a actividade nas várias fracções cromatográficas por quantificação do aumento de fosforilação da tirosina de pl85erbB2 em células de tumor da mama MCF-7 (ATCC # HTB 22). As células MCF-7 foram semeadas em placas Costar de 24 cavidades em F12 (50%) meio mínimo essencial de Dulbecco (50%) contendo soro 5 ... (10%) (10 células por cavidade) e deixadas aderir durante pelo menos 24 horas. Antes do ensaio, as células foram transferidas para meio sem soro durante um mínimo de 1 hora. As fracções da coluna (10 a 100 μΐ) foram incubadas durante 30 minutos a 37°C. Os sobrenadantes foram então aspirados e a reacção parada pela adição de tampão de amostra de SDS-PAGE (100 μΐ). As amostras foram aquecidas durante 5 minutos a 100°C e fracções de 10 a 15 μΐ foram aplicadas num gel de tris-glicina (4 a 20%) (Novex). Após electroforese, as proteínas foram electrotransferidas para uma membrana de polivinilidenodifluoreto (PVDF) que depois foi bloqueada albumina sérica bovina (5%) em tampão tris salino contendo Tween 20 (0,05%) (TBST). As transferências foram despistadas com um anticorpo monoclonal (diluição 1:1000) contra a fosfotirosina (Upstate Biotechnology) durante um mínimo de 1 hora à temperatura ambiente. As transferências foram lavadas com TBST, despistadas com um anticorpo contra a imunoglobulina G de murganho conjugado com fosfatase alcalina (Promega) (diluido a 1:7500) durante um mínimo de 30 minutos à temperatura ambiente. As bandas deram reacção positiva foram visualizadas com 5-bromo-4-cloro-3--indolil-l-fosfato e nitro-azul de tetrazólio. As imunotransfe-rências foram varridas com um densitómetro Scan Jet Plus (Hewlwtt-Packard). As intensidades do sinal para as células MCF-7 não estimuladas foram 20 a 30 unidades. pl85crbB2 totalmente estimulado deu· sinais de 180 a 200 unidades. O conjunto de fracções eluidas com 0,6 M NaCl, que continha a maior parte da actividade, foi aplicado a uma coluna de ácido poliaspártico 78

(PolyLC) equilibrada com fosfato de sódio 17 mM (pH 6,8) contendo etanol (30%). Para eluir as proteínas ligadas usou-se um gradiente linear de 0,3 M a 0,6 M NaCl em tampão de equilíbrio. Um pico de actividade (a ~ 0,45M) foi ainda fraccionadonuma coluna de fase reversa C4 (SynChropak RP-4) equilibrada em tampão contendo TFA (0,1%) e acetonitrilo (15%). As proteínas foram eluidas desta colna com um gradiente de acetonitrilo entre 25 e 40% durante 60 minutos. As fracções (1 ml) foram colhidas, testadas relativamente à sua actividade e analisadas por SDS-PAGE em géis de Trsi-glicina (4-20%, Novex). HRG-α purificado por HPLC foi digerido com lisina C em SDS (0,1%), ditiotreitol 10 mM, 0,1M NH4HC03 (ph 8,0) durante 20 horas a 37°C e os fragmentos resultantes foram resolvidos numa coluna Synchrom C4 (4000A, 0,2 por 10 cm). A coluna foi equilibrada em 0,1% TFA e eluida com um gradiente de 1-propanol em 0,1% TFA (W. J. Henzel, J.T. Stults, C. Hsu, D.W. Aswad, J. Biol. Chem. 264: 15905 (1989)). Os picos da cromatografia foram secos sob vácuo e sequenciados. Um dos peptídeos (eluindo a ~24% 1-propanol) deu a sequência [A] AEKEKTF[C] VNGGEXFMVKDLXNP (SEQ ID NS 162) . Os resíduos entre parêntesis são incertos e um X representa um ciclo em que não foi possível identificar o aminoácido. 0 rendimento inicial foi de 8,5 pmoles e a sequência não correspondeu a qualquer proteína conhecida. Os resíduos 1, 9, 15 e 22 foram mas tarde identificados na sequência de cDNA como císteina. A sequenciação directa da banda de 45 KD de um gel a que se aplicou demasiado material e que foi transferido para uma membrana PVDF revelou uma sequência pouco abundante XEXKE[G][R]GK[G]K[G]KKKEXGX[K] (SEQ ID N2 163) ( com um rendimento inicial muito baixo (0,2 pmoles). Isto corres pondeu aos resíduos de aminoácidos 2 a 22 de heregulina-α (Fig. 31), sugerindo que a serina 2 é o extremo NH^ de proHGR-α. Se bem que o extremo NH2 estivesse bloqueado, observou-se que ocasionalmente uma pequena quantidade de uma proteína normalmente bloqueada pode não ser modificada após a tradução. A terminação NH2 foi

confirmada por espectrometria de massa da proteína após digestão com brometo de cianogénio. O extremo COOH da proteína isolada não foi definitivamente identificado; no entanto, por sequenciação mista dos produtos de digestão proteolítica, a sequência madura não parece prolongar-se para além do resíduo 241. As abreviaturas para os resíduos de aminoácidos são: A, Ala; C, Cis; D, Asp; E, Glu; F, Fen; G, Gli; H, His; I, Ile; K, Lis; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T, Tre; V, Vai; W, Trp; e Y, Tir. Como fonte de clones de cDNA, construiu-se uma biblioteca de cDNA em lambda gtlO por iniciação com oligo(dT) (T. V. Huynn, R.A. Young, R.W. Davis, lambda gtlO and lambda gtll DNA Cloning Techniques: A Praticai Approach, D. Glover, Ed. (IRC Press, Oxford, (1984)) (U. Gubler and J. Hoffman, Gene 25, 263 (1983)) com mRNA purificado (J. M. Chirwin, A.E. Przbyla, R.J. MacDonald, W. J. Rutter, Biochemistry 1J3, 5294 (1979)) a parrir de células MDA-MB-231. Projectaram-se os desoxioligonucleótidos anticodão degenearados oito vezes codificadores da sequência de 13 aminoácidos AEKEKTFCVNGGE (SEQ ID Ns 164) (13) que se seguem com base na frequência humana de utilização de codões (R. Lathe, J. Mol. Biol. 183. 1 (1985)) e sintetizaram-se quimicamente: 5' -CTCGCC (G OU T) CC (A OU G) CAGAAGGTCTTCTCCTTCTCAGC-3' (SEQ ID N2 165). Para a projecção de sondas uma císteina foi atribuída a um resíduo desconhecido na sequência de aminoácidos. A sonda foi marcada por fosforilação e hibridada em condições de baixa restringência com a biblioteca de cDNA. A proteína proHGR-α foi identificada nesta biblioteca. cDNA de HRB-Bl foi identificado por despiste com uma segunda biblioteca em lambda gtlO iniciada com oligo(dT) feita a partir de mRNA de células MDA-MB-231 com as sequências derivadas dos extremos 5' e 3' de proHGR-α. O clone 13 (Figura 2A) foi um produto do despiste de uma biblioteca de MDA-MB-231 em lambda gtlO feita com um iniciador (5' —CCTCGCTCCTTCTTCTTGCCCTTC-3' (SEQ ID N2 166); nucleótidos anticodão 33 a 56 de proHRG) usando a sequência 5' de HRG-α. Uma

sequência correspondendo ao extremo 5' do clone 13 como sonda foi usada para identificar proHRGB2 e proHRGE3 numa terceira biblioteca em lambda gtlO iniciada com oligo(dT) derivada de mRNA de células MDA-MB-231. Sequenciaram-se dois clones de cDNA codificadores cada um de quatro HRGs (F. Sanger, S. Milken, A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad- Sei. U.S.A. 74., 5463 1977]). Um outro clone de cDNA designado clone 84 tem uma sequência de aminoácidos idêntica a proHRGB2 até ao aminoácido 420. Um codão de paragem na posição 421 é seguido de uma sequência diferente 3' não traduzida. EXEMPLO 9

Isolamento de uma outra variante de corte e reliqacão

Os métodos usados 1 no Exemplo 6 deram origem a quatro sequências estreitamente relacionadas (heregulina a, fil, R2, B3) as quais surgem como resultado de variação de corte e religação. Peles et al., (Cell 69, 205 (1992)) e Wen et al. (Cell 69, 559 (1992)) isolaram uma outra variante de corte e religação (derivada de rato) usando uma abordagem de purificação e clonagem semelhante à descrita nos Exemplos 1-4 e 6 envolvendo uma proteína que se liga a pl85er . O clone de cDNA foi obtido como se segue (via purificação e sequenciação de uma proteína de ligação a pl85 a partir de uma linha celular de fibroblastos de rato não transformada).

Uma proteína de ligação a pl85er^B2 foi purificada a partir de meio condicionado como se segue. O meio condicionado reunido derivado de três colheitas de 500 frascos rolantes de cultura (120 litros total) foi clarificado por filtração através de filtros de 0,2 μτα e concentrado 31 vezes com um sistema de ultrafiltração Pelicon usando membranas com um peso molecular de exclusão de 20 KD: Todos os passos de purificação foram 81

realizados usando um sistema de cromatografia líquida de proteínas Pharmacia. O material concentrado foi aplicado directamente numa coluna de heparina-Sepharose (150 ml, pré-equilibrada com tampão de fosfatos salino (PBS)) . A coluna foi lavada com PBS contendo 0,2M NaCl até não se detectar absorvância a 280 nm. As proteínas ligadas foram então eluidas com um gradiente contínuo. As proteínas ligadas foram então eluidas com um gradiente contínuo (250 ml) de NaCl (de 0,2M a 1,0 M) e colheram-se fracções de 5 ml. Amostras (0,01 ml das fracções colhidas foram usadas para o ensaio quantitativo da actividade estimuladora de cinase. As fracções activas de três colunas (volume total = 360 ml) foram reunidas , concentradas para 25 ml usando uma membrana de ultra-filtração YM10 (Amicon, Danvers, MA) e adicionou-se sulfato de amónio para atingir uma concentração de l,7M. Após clarificação por centrifugação (10000 xg, 15 minutos), o material reunido foi aplicado numa coluna de fenil-Superose (HR10/10, Pharmacia). Na coluna foi aplicado um gradiente de 45 ml de (NH^^SO^ (de 1,7M até ausência de sal) em Na_P0. ,, _ ' 2 4r (pH 7,4) e colheram-se fracções de 2 ml e testaram-se (0,002 ml por amostra) quanto à estimulação de cinase (como descrito no Exemplo 6). O principal pico de actividade foi reunido e dialisado contra tampão fosfato de s+odio 50 mM (pH 7,3). Uma coluna de permuta catiónica Mono-S (HR5/5, Pharmacia) foi pré-equilibrada com fosfato de sódio 50 mM. Após aplicação do material activo (0,884 mg de proteína; 35 ml) a coluna foi lavada com o tampão de partira e depois eluida a uma velocidade de 1 ml/min. com um gradiente de NaCl. A actividade estimuladora de cinase foi recuperada na concentração salina de 0,45-0,55M distribuida por quatro fracções de 2 ml cada.

Estas foram reunidas e aplicadas directamente em colunas de - 2 + quelataçao de Cu (1,6 ml, Superose de quelatação HR2/5, Pharmacia). A maior parte das proteínas adsorveu à resina, mas gradualmente eluiram com um gradiente linear de 30 ml de cloreto de amónio (0-1 M) . A actividade eluiu num único pico de proteína na gama de 0,05 a 0,2 M NH4Cl. Amostras de vários passos de purificação foram analisadas por electroforese em gel seguido de coloração com prata usando um kit da ICN (Costa Mesa, CA) e determinada a sua composição proteica por um ensaio de ligação do corante azul de Coomassie usando um kit da Bio-Rad (Richmond, CA) . A proteína p44 (10 μg) foi reconstituída em 200 μΐ de tampão bicarbonato de amónio 0,1M (pH 7,8). A digestão foi conduzida com tripsina tratada com L-l-tosilamida 2-feniletilclo-rometilcetona (Serva) a 37°C durante 18 horas numa proporção de enzima:substrato de 1:10. A mistura de peptídeos resultante foi separada por HPLC de fase reversa e controlado a 215 nm usando uma coluna Vydac C4 micro (2,1 mm d.i. x 15 cm, 300A) e um sistema de cromatografia líquida HP 1090 equipado com detector de arranjo de díodos e uma estação de trabalho. A coluna foi equilibrada com ácido trifluoroacético a 0,1% (fase móvel A) e a eluição efectuada com um gradiente linear de 0%-55% da fase móvel B(90% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%) durante 70 minutos. O fluxo foi de 0,2 ml/minuto e a temperatura da coluna foi controlada a 25°C. Amostras de um terço dos picos peptídicos colhidos manualmente do sistema de HPLC foram caracte-rizadas por análise da sequência N-terminal por degradação de Edman. A fracção eluida após 27,7 min. (T27.7) continha uma mistura de sequências de aminoácidos e foi novamente cromatogra-fada após redução como se segue: Uma amostra de 70% da fracção peptídica foi seca sob vácuo e reconstituída em 100 μΐ de tampão bicarbonato de amónio 0,2M (pH 7,8). Adicionou-se à solução DTT (concentração final de 2 mM) a qual foi então incubada a 37°C durante 30 minutos. A mistura de peptídeos reduzida foi então separada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Vydac (2,1 mm d.i. x 15 cm). As condições de eluição e os fluxos foramidênticos aos descritos atrás. A análise da sequência de aminoácidos do 83 83

peptídeo foi realizada com um sequenciador de proteínas Modelo 477 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) equipado com um analisador de aminoácidos feniltio-hidantoina (PTH) e um sistema de análise de dados Modelo 900 (Hunkapiller et al., (1986) em Methods od Protein Microcharacterization. J.E. Shively ed. (Clifton, New Jersey: Humana Press p. 223-247) . A proteína foi aplicada em discos de fibra de vidro tratados com ácido trifluo-roacético preciclados com polibreno e NaCl. A análise de PTH-ami-noácidos foi realizada com um micro-sistema de cromatografia líquida (Modelo 120) usando bombas de duas seringas e colunas de calibre estreito de fase reversa (C-18) (Applied Bisoystems, 2,1 mm x 250 mm).

Isolou-se RNA de células Rati-EJ segundo processos convencionais (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York (1982) e poli(A+) foram seleccionados usando um kit de separação de mRNA (Clontech Lab, Inc., Paio Alto, CA). O cDNA foi sintetizado com o kit Superscript (da BRL Life Technologies, Inc., Bethesda, MD). cDNA de cadeia dupla fraccionado em coluna foi ligado ao plasmídeo pJT-2, um derivado do vector pCD-X, digerido com Sall e Notl (Okayama e Berg, Mol. Cell Biol. 3.:280 (1983)) e usado para transformar células E. coli DH10B por electroporação (Dower et 5 al., Nucl. Acids Res. 3J>: 6127 (1988)). Aproximadamente 5 x 10 transformantes primários foram despistados com duas sondas oligonucleotídicas derivadas das sequências proteicas do extremo N de NDF (resíduos 5-24) e do peptídeo tríptico T40.4 (resíduos 7-12). As respectivas sequências foram as seguintes (N indica todos os 4 nucleótidos):

(1) 5'-ATA GGG AAG GGC GGG GGA AGG GTC NCC CTC NGC

A T AGG GCC GGG CTT GCC TCT GGA GCC TCT-3' 84

(2) 5'-TTT ACA CAT ATA TTC NCC-3'

C G G C (1: SEQ ID Na 167; 2: SEQ ID NB 168)

Os oligonucleótidos sintéticos foram marcados nos 32 extremos com [gama- P]ATP com cmase de polinucleótidos de T4 e

usados para o despiste de réplicas em filtros de nitrocelulose. A

solução de hibridação continha 6 x SSC, fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, solução de Denhardt 2x, 50 μg/ml de DNA de esperma de salmão e 20% de formamida (para a sonda 1) ou sem formamida (para a sonda 2). Os filtros foram lavados a 50°C com SSC 0,5X, 0,2% SDS, EDTA 2 mM (para a sonda 2) . A autorradiografia dos filtros deu dez clones que hibridaram com ambas as sondas. Estes clones foram purificados fazendo nova sementeira e hibridando com a sonda como descrito atrás. Os

clones de cDNA foram sequenciados usando um sequenciador de DNA automático Applied Biosystems 373A os kits de sequenciação por

TM ciclos Applied Biosystems Taq DyeDeoxy Terminator seguindo as instruções do fabricante. Nalguns casos as sequências foram obtidas usando [35S]dATP (Amersham) e kits Sequenase™ da U.S. Biochemicals seguindo as instruções do fabricante. Ambas as cadeias do clone de cDNA 44 foram sequenciadas usando oligonucleótidos sintéticos como iniciadores. A sequência dos 350 nucleótidos do extremo 5' foi determinada em sete clones de cDNA independentes. O clone resultante apresentou o padrão mostrado na Figura 30 (NDF). EXEMPLO 10

Estratégias para a deteccão de outras possíveis variantes de corte e reliaacão O alinhamento das sequências de aminoácidos deduzidas 85

dos clones de cDNA e dos produtos bovinos de PCR e das sequências humanas (Fig. 31) e de rato apresenta um nível elevado de semelhança, indicando que estas sequências são derivadas dos genes homólogos dentro das três espécies. 0 número variável de transcritos de RNA mensageiro detectável ao nível do produto cDNA/PCR é provavelmente devido a corte e religação extensivo específico de tecido. Os padrões obtidos e apresentados na Figura 30 sugerem que existam outras variantes de corte e religação. Na Figura 37 está indicada uma lista de prováveis variantes de corte e religação. Muitas destas variantes podem ser obtidas usando no despiste de bibliotecas de cDNA sondas específicas do segmento codificador derivadas de tecidos diferentes e por experiências de PCR usando pares de iniciadores específicos de segmentos codificadores particulares. Como alternativa as variantes podem ser montadas a partir de clones de cDNA específicos, produtos de PCR ou regiões de DNA genómico usando técnicas de corte e ligação bem conhecidas. Por exemplo um local de corte por uma enzima de restrição rara num segmento codificador comum (e.g. A) pode ser usado para ligar o extremo amina FBA de GGFBPP1, GGFBPP2, GGFBPP3 ou GGFBPP4. Se a presença ou ausência do segmento codificador E e/ou G oferecem benefício então estes segmentos codificadores podem ser incluidos em construções de expressão. Estas sequências variantes podem ser expressas em sistemas recombinantes e os produtos recombinantes podem ser testados para determinar o seu nível de actividade mitogénica sobre as células de Schwann assim como a sua capacidade para se ligar e activar o receptor pl85e . EXEMPLO 11

Identificação de elementos funcionais de GGF

As estruturas deduzidas da família de sequências de GGF \ 86

indicam que as formas mais longas (conforme representado por GGF2BPP4) codificam proteínas transmembranares onde a parte extracelular contem um domínio que se assemelha ao factor de crescimento epidérmico (ver Carpenter e Wahl em Peptide Growth Factors and Their Receptors I pp. 69-133, Springer-Verlag, NY 1991) . As posições dos resíduos de císteina nos segmentos codificadores das sequências peptídicas C e C/D ou C/D' são conservadas relativamente aos resíduos análogos no peptídeo do factor de crescimento epidérmico (EGF) (ver Figura 35, SEQ ID Nos. 151-153). Isto sugere que o domínio extracelular funcione como sítios de reconhecimento de receptores e de activação biológica. Várias das formas variantes não possuem os segmentos codificadores de Η, K e L e portanto podem ser expressos como proteínas difusíveis, secretadas e biologicamente activas. As sequências de DNA de GGF codificadoras dos polipeptídeos que incluem o domínio tipo EGF (EGFL) podem ter total actividade biológica na estimulação da actividade mitogénica das células da glia.

As versões desta proteína ligadas a membrana podem induzir a proliferação das células de Schwann se expressas na superfície de neurónios durante a embriogénese ou durante a regeneração de nervos (onde as superfícies dos neurónios estão intimamente associadas às superfícies das células de Schwann em proliferação). GGFs secretados (não ligados a membranas) podem actura como factores classicamente difusíveis que podem interactuar com as células de Schwanna alguma distância do seu ponto de secreção. Outras formas podem ser libertadas pelas células através de danificação de tecidos e rebentamento de células. Um exemplo de GGF secretada é a proteína codificada or GGF2HBS5 (ver Exemplo 6); esta é a única GGF que se conhece dirigida para o exterior da célula (exemplo 7). A secreção é provavelmente mediada via uma 87

sequência hidrofóbica N-terminal encontrada apenas na região E, a qual é o domínio N-terminal contido dentro de GGF-II recombi-nante codificado por GGF2HBS5.

Outros GGFs parecem não ser secretados (ver Exemplo 6). Estes GGFs podem ser uma forma de resposta à danificação de tecidos sendo libertados como consequência desta.

Outras regiões da estrutura proteica prevista de GGF-II (codificadas por GGF2HBS5) e outras proteínas contendo regiões B e A apresentam semelhanças com a proteína do núcleo heparano-sul-fato proteoglicano da membrana basal humana (ref.). O peptídeo ADSGEY, o qual está situado a seguir à segunda císteina da dobra de imunoglobulina C2 nestes GGFs ocorre em nove das vinte e duas repetições C-2 encontradas na proteína da lâmina basal. Esta evidência sugere fortemente que estas proteínas podem associar-se às proteínas da matrix tais como as associadas aos neurónios e células da glia e pode sugerir um método para o sequestro de factores de crescimento de células da glia em sítios alvo. EXEMPLO 12

Purificação de GGFs a partir de células recombinantes

Para se obter GGFs de tamanho completo ou fracções para testar relativamente à actividade biológica, as proteínas podem ser sobreproduzidas usando DNA clonado. Podem ser usadas várias abordagens. Pode-se construir uma célula E. coli recombinante contendo as sequências descritas atrás. Sistemas de expressão tais como pNHBa ou pHH16a (Stratagene, Inc.) podem ser usados para este fim seguindo os processos dos fabricantes. Como alternativa estas sequências podem ser inseridas num vector de expressão de mamíferos e pode-se construir uma linha celular fortemente 88

produtora. Como exemplo, para este fim DNA codiifcador de um GGF, clone GGF2BPP5 foi expresso em células COS e em células de ovário de hamster (ver Exemplo 7) (J. Biol. Chem. 263. 3521-3527, (1981)). Este vector contendo sequências de DNA de GGF pode ser transfectado para células hospedeiras usando processos estabelecidos . A expressão transitória pode ser examinada ou os clones resistentes a G418 podem ser cultivados na presença de metotrexa-to para seleccionar as células que amplificam o gene dhfr (contido no vector pMSXND) e no processo, co-amplificação da sequência adjacente codificadora de GGF. Devido às células CHO poderem ser mantidas num meio totalmente sem soro, o meio sem proteína (Hamilton e Ham, In Vitro 13., 537-547 (1977)), a proteína pretendida pode ser purificada a partir do meio. A análise de Western usando o anti-soro produzido no Exemplo 9 pode ser usado para detectar a presença da proteína pretendida no meio condicionado de células fortemente produtoras. A proteína pretendida (rGGF-II) foi purificada a partir de meio condicionado pelas células COS com expressão transitória como se segue. rGGF-II foi colhido do meio condicionado e parcialmente purificaod usando Cromatografia de Permuta Catiónica (POROS-HS). A coluna foi equilibrada com 33,3 mM MES pH 6,0. 0 meio condicionado foi aplicado com um fluxo de 10 ml/min. O pico contendo a actividade de proliferação das células de Schwann e imuno-reactivo (usando o anti-soro policlonal contra um peptídeo GGFII descrito atrás) foi eluido com 50 mM Tris, 1M NaCl pH 8,0. (Figura 50A e 50B respectivamente). rGGF-II é também expresso usando uma linha celular estável de ovário de hamster chinês. rGGF-II do meio condicionado colhido foi parcialmente purificado usando cromatografia de 89

*—\

permuta catiónica (POROS-HS). A coluna foi equilibrada com PBS pH 7,4. O meio condicionado foi aplicado a 10 ml/min. 0 pico contendo a actividade proliferadora de células de Schwann e imuno-reac-tividade (usando anti-soro policlonal contra GGFII) foi eluido com 50 mM Hepes, 500 mM NaCl pH 8,0. Observou-se um outro pico a 50 mM Hepes, 1M NaCl pH 8,0 com actividade proliferadora e imuno-reactividade (Fig. 51) . rGGF-II pode ser ainda purificado usando cromatografia de interacção hidrofóbica como passo de alta resolução; cromato-grafia de permuta catiónica/fase reversa (se necessário como segundo passo de alta resolução); um passo de inactivação virai e um passo de remoção de DNA como seja cromatografia de permuta aniónica.

Segue-se a descrição detalhada dos processos usados: A actividade proliferadora das células de Schwann do pico de GGF-II recombinante eluido a aprtir da coluna de permuta catiónica foi determinado como se segue: respostas mitogénicas

das células de Schwann em cultura foram medidas na presença de 5M

Forskolin usando o pico eluido por 50 mM Tris 1M NaCl pH 8,0. 0

pico foi adicionado a 20 1, 10 1 (1:10) 10 1 e (1:100) 10 1. A . 125 incorporação de I-Undina foi determinada e expressa em cpra após 18-24 horas de exposição.

Uma imunotransferência usando o anticorpo policlonal induzido contra um peptldeo de GGF-II foi efectuado como se segue: 10 μΐ de fracções diferentes foram aplicadas em géis de gradiente 4-12%. Os géis foram transferidos para membrana de nitrocelulose e esta loqueada com 5% BSA e despistada com anti- 125 corpo especifico de GGF-II (diluição 1:250). I proteína A (diluição 1:500, acitvidade especifica = 9,0/ci/g) foi usada como 90

anticorpo secundário- As imunotransferências foram expostas a filmes de raios X Kodax durante 6 horas. As fracções do pico eluidas com 1M NaCl apresentaram uma banda imuno-reactiva larga a 65-90 Kd a qual está na gama de peso molecular esperado para GGFII e glicoformas de pesos moleculares mais elevados. A purificação de GGF-II em colunas de permuta catiónica foi realizada como se segue: meio condicionado de células CHO expressando rGGF-II foi aplicado na coluna de permuta catiónica a 10 ml/min. A coluna foi equilibrada com PBS pH 7,4. A eluiçãp foi conseguida com 50 mM Hepes 500 mM NaCl pH 8,0 e 50 mM Hepes 1M NaCl pH 8,0, respectivamente. Todas as fracções foram analisadas usando o ensaio de proliferação de células de Schwann (CPM) aqui descrito. A concentração proteica (mg/ml) foi determinada pelo ensaio de Bradford usando BSA como padrão.

Fez-se uma transferência Western usando 10 μΐ de cada uma das fracções. Conforme indicado na Figura 51A e 51B, a imuno-reactividade e a actividade proliferadora das células de Schwann migram na mesma posição. O ensaio mitogénico das células de Schwann aqui descrito pode ser usado para testar o produto expresso do clone de tamanho completo ou quaisquer fracções suas biologicamente activas. 0 clone de tamanho completo GGF2BPP5 foi expresso transitoriamente em células COS. Os extractos intracelulares das células COS transfectadas apresentam actividade biológica quando testados no ensaio de proliferação de células de Schwann descrito no Exemplo 1. Em adição, o clone de tamanho completo codificador de GGF2HBS5 foi expresso transitoriamente em células CHO e de insecto (Exemplo 7). Neste caso tanto o extracto celular como o meio condicionado apresentam actividade biológica no ensaio de proliferação de células de Schwann descrito no Exemplo 1, 91

Qualquer membro da família de DNAs complementares variantes de corte e religação derivadas do gene GGF (incluindo as heregulinas) pode ser expresso desta forma e testado no ensaio de proliferação de células de Schwann por alguém experimentado.

Como alternativa, o material recombinante pode ser isolado a partir de outras variantes de acordo com Wen et al. (Cell 69., 559 (1992)) que expressaram a variante de corte e religação do factor de diferenciação Neu (NDF) em células COS-7. Os clones de cDNA inseridos no vector plasmídeo eucariótico pJT-2 estão sob o controle do promotor precoce do SV40 e estão flanqueados no extremo 3' pelos sinais de terminação e de poliadenilação do SV4 0. As células COS-/ foram transfectadas com o DNA de plasmídeo pJT-2 por electroporação como se segue: 6 x 10^ células (em 0,8 ml de DMEM e 10% FEBS) foram transferidas para uma cuvete de 0,4 cm e misturadas com 20 /ig de DNA de plasmídeo em 10 μΐ de solução TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA). A electroporação foi realizada à temperatura ambiente a 1600 V e 25 μ¥ usando um aparelho Bio-Rad Gene Pulser com a unidade de controlo do pulso regulada para 200 ohms. As células foram então diluidas em 20 ml de DMEM, 10% FBS e transferidas para um frasco T75 (Falcon). Após 14 horas de incubação a 37°C o meio foi substituído por DMEM, 1% FBS e a incubação continuou durante mais 48 horas. O meio condicionado contendo a proteína recombinante que foi colhido das células demonstrou actividade biológica numa linha celular expressando o receptor desta proteína. Esta linha celular (linha celular humana de carcinoma da mama em cultura AU 565) foi tratada com material recombinante. As células tratadas apresentaram uma alteração da morfologia que é característica da activação do receptor erbB2. O meio condicionado deste tipo pode também ser testado no ensaio de proliferação das células de Schwann. EXEMPLO 13

Purificação e ensaio de outras proteínas que se ligam ao receptor m85erbB2 I. Purificação de gp30 e de p70

Lupu et al., (Science 249, 1552 (1990)) e Lippman e Lupu (pedido de patente número PCT/US91/03443 (1990)), aqui incluído como referência, purificaram uma proteína derivada de meio condicionado de uma linha celular humana de cancro da mama MDA-MB-231, como se segue.

As colheitas de meios condicionados foram realizadas usando processos bem conhecidos. O meio foi concentrado 100 vezes numa célula de ultrafiltração Amicon (membrana YM5) (Amicon, Danvers, MA). Uma vez clarificado e concentrado, os meios foram guardados a -20°C enquanto que colheitas sucessivas foram feitas durante os dias seguintes. Os meios concentrados foram dialisados usando Spectra/por (Spectrum Medicai Industries, Los Angeles, CA) contra 100 volumes de ácido acético 0,1M durante um período de dois dias a 4°C. 0 material que precipitou durante a diálise foi removido por centrifugação a 4000 rpm durante 30 minutos a 4°C; adicionaram-se inibidores de proteases. A amostra clarificada foi então liofilizada. O meio condicionado liofilizado foi dissolvido em ácido acético 1M para uma concnetração final de cerca de 25 mg/ml de proteína total. O material insolúvel foi removido por centrifugação a 10000 rpm durante 15 minutos. A amostra foi então aplicada numa coluna de Sephadex G-100 (XK 16, Pharmacia, Piscataway, NJ), equilibrada e eluida com ácido acético 1M a 4°C com um fluxo de 30 ml/h. 100 ng de proteína foi processado a partir de 4 ml de meio concentrado 100 vezes. As fracções contendo 3 ml de eluato foram liofilizadas e ressuspensas em 300 μΐ de PBS para ensaio e serviram como fonte para posterior purificação. O material purificado em Sephadex G-100 foi sujeito a cromatografia liquida de alta pressão em fase reversa (HPLC). 0 primeiro passo envolveu um gradiente de passos descontínuos com acetonitrilo. O gradiente de acetonitrilo descontínuo e todos os outros passos de HPLC foram realizados à temperatura ambiente após equílibrio da coluna de fase reversa C3 com 0,05% TFA (ácido trifluoroacético) em água (grau de pureza HPLC). As amostras foram aplicadas e as fracções eluidas com um gradiente linear (0-45% de acetonitrilo em 0,05% TFA) com um fluxo de 1 ml/min. durante um período de 30 minutos. A absorvância foi controlada a 280 nm. Fracções de um ml foram colhidas e liofilizadas antes de análise relativamente à actividade de competição com o receptor de EGF.

Um segundo passo de HPLC envolveu um gradiente concavo de acetonitrilo. O conjunto de fracções activas do passo anterior de HPLC foi recromatografado na mesma coluna. A eluição foi realizada com um gradiente de 0-18% de acetonitrilo em 0,05% TFA durante um período de 5 minutos seguido de um gradiente linear de acetonitrilo de 18-45% em 0,05% de TFA durante um período de 30 minutos. O fluxo foi de 1,0 ml/min. e colheram-se fracções de 1 ml. O factor tipo TGFa humano foi eluido na concentração de 30-32% de acetonitrilo como um único pico detectável por RRA.

Lupu et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. 2287 (1992)) purificou uma outra proteína que se liga ao receptor pl85cr^®^. Esta proteína particular, p75, foi purificada a partir de meio condicionado usado para o crescimento de SKBr-3 (uma linha celular humana de cancro da mama) propagada em meio de Eagle melhorado (IMEM: GIBCO) suplementado com 10% de soro fatal bovino 94

(GIBCO). A proteína p75 foi purificada a partir de meio condicionado concentrado (lOOx) usando uma coluna de afinidade pl85cr^B2. O domínio extracelular de 94 quilodaltons de pl85c (que se liga a p75) foi produzido via expressão recombinante e foi acoplado a uma matrix de croroatografia de afinidade de poliacril-amida hidrazido-Sepharose. Após acoplagem a matrix foi lavada extensivamente com HC1 1,0 M arrefecido em gelo e as esferas foram activadas com 0,5M NaNO^. A temperatura foi mantida a 0°C durante 20 minutos e isto foi seguido de filtração e lavagem com HCl 0,1 M arrefecido em gelo. 500 ml de meio condicionado concentrado foi passado através das esferas por gravidade. A coluna foi lavada e eluida por passos com ácido cítrico 1,0 M a valores de pH entre 4,0 e 2,0 (para permitir a dissociação do erbB2 e p75). Retirou-se o sal a todas as fracções em colunas Pharmacia PD10. A purificação deu um polipeptídeo homogéneo de 74 KDa pH de eluição de 3,0-3,5 (confirmado por análise em SDS/PAGE por cooração com prata). _ „ L_ rj II. Lioacão de gp30 a p!85_ A proteína gp30 purificada foi testada num ensaio para determinar se se liga a pl85e . Um ensaio de competição com um anticorpo monoclonal contra pl85e . A proteína gp30 deslocou a ligação do anticorpo para pl85erl:>B2 em células SK-BR-3 e MDA-MB--453 (linhas celulares humanas de carcinoma da mama expressando o receptor pl85e ). A actividade de proliferação das células de Schwann de gp30 pode também ser demonstrada por tratamento de culturas de células de Schwann com gp30 purificado usando o processo do ensaio descrito nos Exemplos 1-3. III. Liqacao de p75 a P185_

Para avaliar se o polipeptídeo de 75 KDa (p75) obtido a 95 partir de meio condicionado SKBr-3 era de facto o ligando para a oncoproteína erbB2 em células SKBr-3, usou-se um ensaio de competição como descrito atrás para gp30. Encontrou-se que p75 apresenta actividade de ligação, enquanto que o material de outras fracções da cromatografia não mostraram tal actividade (resultados não apresentados). O material não retido mostrou alguma actividade de ligação. Isto deverá ser devido à presença de erbB2 ECD desprendido. IV. Outros liqandos de p!85erbB2

Peles et al. (Cell 69, 205 (1992)) também purificaram um ligando estimulador de 185e a partir de células de rato, (NDF, ver Exemplo 8 para o método). Holmes et al. (Science 256. 1205 (1992)) purificaram heregulina a a partir de células humanas que se liga e estimula 185erbB2 (ver Exemplo 6). Tarakovsky et al. Oncogene 6:218 (1991) demonstraram ligação de um polipeptídeo de 25 KD isolado a partir de macrófagos activados ao receptor Neu, homólogo de pl85erbB2, aqui incluído como referência.

VI. Isolamento de NDF

Yarden e Peles (Biochemistry 3.0, 3543 (1991)) identifi caram uma glicoproteína de 35 quilodaltons que estimula o receptor 185erbB2. A proteína foi identificada em meio condicionado de acordo com o processo que se segue. Células I-EJ de rato foram . 2 cultivadas até à confluência em frascos de 175 cm (Falcon).

Lavaram-se as monocamadas com PBS e deixaram-se em meio sem soro durante 10-16 horas. O meio foi rejeitado e susbstituido por meio fresco sem soro que foi colhido após 3 dias de cultura. O meio condicionado foi clarificado por centrifugação a baixa velocidade e concentrado 100 vezes numa célula de utrafiltração Amicon com uma membrana YM2 (peso molecular de exclusão de 2000). As 96 96

análises bioquímicas da actividade estimuladora neu em meio condicionado indicam que o ligando é uma glicoproteína de 35 KDa que é estável ao calor mas sensível à reduçã. O factor é precipitado por concentrações de sal altas ou álcoolacídico. A purificação parcial da molécula por precipitação selectiva, cromatogra-fia em heparina-agarose e filtração em gel em ácido diluído resultou num ligando activo, o qual é capaz de estimular o receptor proto-oncogénico mas é ineficaz sobre a proteína oncogé-nica neu, a qual é constituivamente activa. No entanto, a fracção purificada manteve a capacidade para estimular também o receptor relacionado para EGF, sugerindo que estes dois recepto-res estão funcionalmente acoplados através de um mecanismo bidirecional. Como alternativa, o presumível ligando interactua simultaneamente com ambos os receptores. A característica bioquímica apresentada do factor pode ser usada para permitir obter um factor completamente purificado com o qual explorar estas possibilidades .

Noutras publicações, Davis et al. (Biochem. Biophys. Res. Cmmun. 179, 1536 (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 8582 (1991) e Greene et al., pedido de patente PCT/US91/02331 (1990)) descrevem a purificação de uma proteína a partir de meio condicionado de uma linha celular de células T humanas (ATL-2). A linha celular ATL-2 é uma linha de células T HTLV-1 (+) independente de IL-2. As células ATL-2 sem micoplasmas foram mantidas em meio RPMI contendo 10% FCS-RPMI 1640) a 37°C numa atmosfera húmida com 5% de CC>2.

Para a purificação do material proteico as células 5

ATL-2 foram lavadas duas vezes em PBS IX e cultivadas a 3 x 10 células/ml em meio RPMI 1640 sem soro/L-glutamina 2 mM durante setente e duas horas seguido de sedimentação das células. O 97

sobrenadante da cultura assim produzida foi designado ",meio condicionado" (C.M.). C.M. foi concentrado 100 vezes, a partir de 1 litro para 10 ml, usando uma membrana Diaflo YM-2 (Amicon, Boston, MA) com uma exclusão de lOOOd. Para usar nalguns ensaios, C.M. concentrado contendo componentes de PM superior a 1000 foi rediluido para o volume original com meio RPMI. A electroforese em gel usando gel de gradiente de poliacrilamida (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MD ou Phorecast System da Amersham, Arlington Heights, IL) seguido de coloração com prata de algum deste material purificado em duas colunas a partir de um litro de preparação revelou pelo menos quatro a cinco bandas das quais as bandas de 10 KD e de 20 KD foram exclusivas deste material. C.M. contendo componentes inferiores a 1000 NW foram usados sem diluição. O meio condicionado concentrado foi esterilizado por filtração com um filtro uniflo de 0,45 μ (Schleicher e Schuell, Keene, NH) e depois ainda purificado por aplicação numa coluna de permuta aniónica DEAE-SW (Waters, Inc., Milford, MA) que foi pré-equilibrada com 10 mM Tris-HCl, pH 8,1. As proteínas de C.M. concentrado representando um litro de meio condicionado ATL-2 original por HPLC foram absorvidas à coluna e depois eluidas com um gradiente linear de 0 mM a 40 mM NaCl a um fluxo de 4 ml/min. As fracções foram testadas usando um ensaio in vitro de complexo imune com cinase com 10% da fracção adequada de DEAE (material purificado de 1 coluna) ou 1% das fracções C18 adequadas (material purificado em duas colunas). A actividade que aumentou a actividade de cinase de tirosina de pl85c-neu numa forma dependente de dose usando o ensaio in vitro de complexos imunes com cinase foi eluida como um pico dominante em 4 a 5 fracções (36-40) à volta de 220-240 mM NaCl. Após purificação por 98

HPLC-DEAE, as proteínas nas fracções activas foram concentradas e sujeitas a cromatografia de fase reversa em C18 (matrix nilhão) (Waters, Inc., Milford, MA) (referido como passo C18+1 ou material purificado por duas colunas). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 2-propanol contra 0,1% TFA. Todas as fracções foram dialisadas contra meio RPMI 1640 para remover o 2-propanol e testadas usando o ensaio in vitro de formação de complexos imunes com cinase, descrito abaixo e uam concentração de 1% da fracção adequada· A actividade aumentando a actividade de cinase de tirosina de pl85c-neu foi eluida em dois picos. Um eluiu na fracção 11-13, enquanto que um segundo pico de actividade ligeiramente menos activo eluiu nas fracções 20-23. Estes dois picos correspondem a cerca de 5 a 7% de isopropanol e 11 a 14% de isopropanol respectivamente. As fracçõs 11-13 geradas em C18#l foram usadas em estudos de caracterização. As fracções activas obtidas a partir do segundo passo cromatográfico foram reunidas e designadas como amostra de material proteico.

Uma preparação de 20 litros empregou a mesma estratégia de purificação. As fracções activas de DEAE 35-41 foram reunidas e sujeitas a cromatografia em C18 como discutido atrás. As fracções de C18#l 11-13 e 21-24 ambas apresentam actividade dependente de dose. 0 conjunto das fracções 11-13 foi sujeito a mais um passo cromatográfico em C18 (referido como C18#2 ou material purificado por três colunas). Novamente, as fracções 11-13 e 21-24 apresentaram actividade. A resposta à dose da fracção 23 conforme determinado por ensaio in vitro de formação de complexos imunes com cinase conforme descrito no Exemplo 8 pode ser obtida pela adição de 0,005% por volume da fracção 23 e 0,05% por volume da fracção 23. Isto representa a maior pureza conseguida. 99

As gamas de pesos moleculares foram determinadas com base em cromatografia de filtração em gel e análise com membrana de ultrafiltração. Quantidades quase equivalentes de actividade de cinase de tirosina foram retidas e passadas por um filtro de exclusão de peso molecular 30000. As gamas de pesos moleculares para as fracções cromatográficas activas foram determinadas comparando fracções contendo actividade de activação de neu dependente de dose com os perfis de eluição de uma série de padrões de pesos moleculares de proteínas (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gerados usando as mesmas condições. Uma região de actividade de baixo peso molecular foi identificada entre 7000 e 14000 daltons. Uma segunda gama de actividade variou entre cerca de 14000 e cerca de 24000 daltons.

Após electroforese em gel usando um gel de gradiente de poliacrilamida (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MD ou

Phorecase System da Amersham, Arlington Heights, IL), coloração com prata do material purificado por três colunas (cl8#2) foi feita com um kit de coloração com prata comercial (BioRad,

Rockville Centre, NY). As fracções 21, 22, 23 e 24 da purificação cl8#2 da preparação de vinte litros foram processadas como marcadores. As fracções 22 e 23 apresentaram a resposta à dose £X*1dB 2

mais forte no ensaio de cinase com 185 (neu) (ver abaixo). O facto de as fracções de pesos moleculares seleccionados inter-actuarem com 185e^r®^ foi demonstrado com um ensaio de formação de complexos imunes com cinase.

Huang et al., (1992, J. Biol. Chem. 257:11508-11512), aqui incluido como referência, isolaram mais um factor de crescimento ligando de neu/erb a partir de rim bovino. 0 factor poli-peptldico de 25 KD foi isolado por um processo de fraccionamento em coluna, seguido de cromatografia sequenciada em DEAE/celulose (DE52), Sulfadex (Sephadex G-50 sulfatada), heparina-Sepharose 4B 100 e Superdex 75 (cromatografia líquida de proteínas). O factor, NEL-GF, estimula a autofosforilação específica de tirosina do produto do gene neu/erb. VII. Ensaio de formação de complexos imunes NDF para a ligação do ligando a p!85er^B2: Este ensaio reflete as diferenças na activi-dade de autofosforilação de pl85 imunoprecipitado devidas ã pré-incubação do lisado de células PN-NR6 com quantidades variáveis de meio condicionado de ATL-2 (C.H.) ou material proteico e é referido daqui em diante como actividade de activação de neu.

As linhas celulares usadas no ensaio de formação de complexos imunes com cinase foram obtidas, preparadas e cultivadas de acordo com métodos descritos em Kokai et al., Cell 55, 287-292 (28 de Julho, 1989) as divulgações dos quais são aqui incluídas como referência como se aqui totalmente estabelecido e pedido de patente U.S número de série 386820 entregue em 27 de Julho de 1989 no nome de Mark I. Green entitulado "Methods of Treating Cancerous Cells with Anti-Receptor Antibodies", as divulgações dos quais são aqui incluídas como referência como se fossem totalmente estabelecidas aqui.

As linhas celulares foram todas mantidas em meio DMEM contendo 5% FCS como meio de cultura (5% FCS-DMEM) a 37°C numa atmosfera húmida com 5% C02.

Culturas densas de células em placas de 150 mm foram lavadas duas vezes com PBS frio, raspadas para 10 ml de tampão de congelação e descongelação (150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 20 mM Hepes, pH 7,2, 10% glicerol, 1 mM EDTA, 1% de aprotinina) e centrifuga-das (600 xg, 10 minutos). Os sedimentos de células foram ressus-pensos em 1 ml de tampão de lise (50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 3% Brij 35, 1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, 1% de aprotinina, 1 mM 101

EGTA, 20 μΜ Na^VC^, 10% glicerol) e rodado trinta minutos a 4°C. Todos os reagentes foram da Sigma Chemical Co. , St. Louis, Mo, a menos gue de outra forma indicado. Os materiais insolúveis foram removidos por centrifugação a 40000 xg durante trinta minutos. 0 sobrenadante clarificado que foi subsequentemente usado foi designado como lisado celular.

Os lisados celulares foram incubados durante quinze minutos com 50 μΐ de 50% (volume/volume) Proteína A-Sepharose (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), e centrifugados durante dois minutos para clarificar os lisados. Amostras de 50 μΐ de lisado celular previamente clarificado foram incubadas em gelo durante quinze minutos com meio condicionado, material proteico ou outros factores conforme especificado, num volume final de 1 ml com tampão de lise. A amostra foi então incubada com 5μg do anticorpo monoclonal 7.16.4, o qual reconhece o domínio extracelular de pl85neu e de pl85c-neu, ou outros anticorpos adequados, durante vinte minutos em gelo, seguido de vinte minutos de incubação em gelo, seguido de uma incubação de vinte minutos com 50 μΐ de 50% (vol/vol) de proteína A-Sepharose com rotação a 4°C. Os complexos imunes foram colhidos por centrifugação, lavados quatro vezes com 500 μΐ de tampão de lavagem (50 mM Hepes, pH 7,5, 0,1% Brij 35, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% de aprotinina, 30 μπι Na3C04) depois duas vezes com tampão de reacção (20 mM Hepes (pH 7,4), 3 mM MnCl2 e 0,1% Brij 35, 30 μιη Na3V04) .

Os sedimentos foram ressuspensos em 50 μΐ de tampão de reacção e 32 [gama- P]-ATP (Amersham, Arlmgton Heights, IL) adicionado dando uma concentração final de 0,2 μπι. As amostras foram incubadas a 27 °C durante vinte minutos ou a 4°C durante 25 minutos com amostras mais puras. As reacções foram paradas pela adição de tampão de amostra com SDS 3x contendo 2 mM ATP e 2 mM EDTA e depois incubação a 100°C durante cinco minutos. As amostras foram então sujeitas a análise por SDS-PAGE em géis de 10% de acrilamida. Os géis foram corado, secos e expostos a filme Kodak XAR ou XRP com écrans intensificadores. VIII. Purificação de actividade ndutora do receptor de acetilco-lina (ARIA) ARIA, uma proteína de 42 KD que estimula a síntese do receptor de acetilcolina, foi isolada no laboratório de Gerald Fischbach (Falis et al., Cell 72: 801-815 (1993)). ARIA induz a fosforilação de tirosina de uma proteína transmembranar do músculo de 185 KD que se assemelha a pl85e e estimula a síntese do receptor de acetilcolina em miotubos embrionários em cultura. A análise da sequência dos clones de cDNA que codificam ARIA mostra que ARIA é um membro das proteínas do grupo de ligandos GGF/erbB2 e isto é potencialmente útil na estimulação da mitogénese das céluls da glia e outras aplicações de, e.g., GGF2 aqui descrito. EXEMPLO 14

Fosforilação de tirosina de proteínas mediada por GGF em células de Schwann Células de Schwann de rato, após tratamento com níveis suficientes de Factor de Crescimento de Células da Glia para indução da proliferação, mostra a estimulação da fosforilação de tirosina de proteínas (figura 36). Quantidades variáveis de GGF parcialmente purificado foram aplicadas sobre uma cultura primária de células de Schwann de rato de acordo com o processo descrito no Exemplo 3. As células de Schwann foram cultivadas em DMEM/10% de soro fetal de vitela/5 μΜ Forskolin/0,5 Mg por ml de GGF-CM (o,5 ml por cavidade) em placas de 24 cavidades revestidas com poli D-lisina. Quando confluentes as células fora, 103 alimentadas com DMEM/10% de soro fetal de vitela a 0,5 ml por cavidade e deixadas na estufa durante a noite. No dia seguinte, as células foram alimentadas com 0,2 ml de DMEM/10% soro fetal de vitela e deixadas na estufa durante 1 hora. As amostras a testar foram então adicionadas directamente ao meio em diferentes concentrações e durante períodos variáveis. As células foram então lisadas em tampão de lise fervente (fosfato de sódio, 5 mM, pH 6,8; 2% de SDS, 5% de β-mercaptoetanol; ditiotreitol 0,1 M; 10% de glicerol; 0,4% de azul de bromofenol; vanadato de sódio 10 mM), incubadas durante 10 minutos num banho a ferver e depois analisadas directamente ou congeladas a -70°C. As amostras foram analisadas por separação em géis de SDS-PAGE de 7,5% de acrilami-da e depois transferidas para nitrocelulose usando processos convencionais como descrito por Towbin et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 4350-4354. A nitrocelulose com as proteínas transferidas foi despistada com anticorpos antxfosfotirosina usando métodos convencionais como descrito em Kamps e Selton (1988)Oncogene 2:305-315. As transferências despistadas foram expostas a filme de autorradiografia durante a noite e revelados usando um processador convencional de laboratório. As medições densitométricas foram realizadas usando um densitómetro de laser Ultrascan XL (LKB). As estimativas dos pesos moleculares foram feitas relativamente a padrões de alto peso molecular (Sigma). As curvas de dose resposta da fosforilação de proteínas e de proliferação de células de Schwann são muito semelhantes (figura 36). O peso molecular da banda fosforilada é muito perto do peso molecular de pl85erbB2. Resultados semelhantes foram obtidos quando células de Schwann foram tratadas com meio condicionado preparado a partir de céluls COS transfectadas com o clone GGF2HBS5. Estes resultados estão de acordo com a interaeção e activação esperada dos GGFs com pl85erbB2. 104

Esta experiência foi repetida com GGF-II recombinante. Meio condicionado derivado de uma linha celular CHO estavelmente transformada com o clone GGF-I (GGF2HBS5) estimula a fosforilação da tirosina d eproteina usando o ensaio descrito atrás. As células CHO sujeitas a transfecção simulada não estimularam esta actividade (Fig. 52). EXEMPLO 15

Ensaio para a proliferação das células de Schwann pelo factor proteico derivado da linha celular MDA-MB-231 A proliferação das células de Schwann é mediada por meio condicionado derivado da linha celular humana de cancro da 4 mama MDA-MB-231. No dia 1 do ensaio 10 células primárias de Schwann de rato foram semeadas em 100 μΐ de meio de Eagle Modificação de Dulbecco suplementado com 5% de plasma fetal bovino por cavidade numa placa de microtitulação de 96 cavidades. No dia 2 do ensaio, 10 μΐ de meio condicionado (derivado da lina celular humana de cancro da mama MDA-MB-231, cultivado como descrito no Exemplo 6) foi adicionado a cada uma das cavidades da placa de microtitulação. No dia 6 determinou-se o número de células de Schwann por placa usando um ensaio de fosfatase ácida (de acordo com o processo de Connoly et al. Anal. Biochem. 152:136 (1986). A placa foi lavada com 100 μΐ de tampão de fosfatos salino (PBS) e 100 μΐ de tampão de reacção (acetato de sódio 0,1M, pH 5,5)), 0,1% Triton X-100 e adicionado a cada cavidade p-nitrofenilfosfa-to 10 mM). A placa foi incubada a 37°C durante duas horas e a reacção foi parada pela adição de 10 μΐ de NaOH 1M. A densidade óptica de cada uma das amostras foi lida num espectrofotómetro a 410 nm. Observou-se uma estimulação de 38% do número de células relativamente às células de Schwann tratadas com meio condicionado de uma linha celular testemunha (HS-294T, uma linha não 105

produtora do ligando erbB-2) . Este resultado mostra que lima proteína secretada pela linha celular MDA-MB-231 (a qual secreta uma actividade de ligação a pl85er^*B2) estimula a proliferação das células de Schwann. EXEMPLO 16

N-qlicosilacão de GGF A sequência proteica prevista a partir da sequência de cDNA dos clones de GGF-II candidatos GGF2BPP1, 2 e 3 contem uma série de motivos consensus de N-glicosilação. Um intervalo na sequência peptídica de GGFOII02 coincide com o resíduo asparagina num destes motivos, indicando que o açúcar está provavelmente ligado neste sítio. A N-glicosilação dos GGFs foi estudada por observação das alterações da mobilidade em SDS-PAGE após incubação com N-glicanase, uma enzima que cliva as ligações covalentes entre o açúcar e os resíduos de asparagina nas proteínas. O tratamento com N-glicanase de GGF-II deu uma banda principal de PM 40-42 KD e uma banda menor a 45-48 KD. As experiências de eluição de ctividade em condições não redutoras mostrou uma única espécie desglicosilada activa a ca. de 45-50 KDa.

( As experiências de eluição de actividade com GGF-I também demonstrou um aumento da mobilidade electroforética quando tratado com N-glicanase, dando uma espécie activa de PM 26-28 KD. A coloração com prata confirmou que existe uma alteração da mobilidade, se bem que não se pudesse observar qualquer banda N-desglicosilada devido à coloração de fundo na amostra usada. 106

Depôsito O ácido nucleico codificador da proteína GGF-II (cDNA, GGF2HBS5) (Exemplo 6) num plasmídeo pBluescript 5K, sob o controle do promotor T7, foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, em 2 de Setembro, 1992 e dado o número de acesso ATCC 75298. 0 requerente reconhece a sua responsabilidade em susbstituir este plasmídeo caso se torne não viável antes do fim desta patente e a sua responsabilidade em notificar a ATCC da emissão de tal patente, ficando nessa altura o depósito disponível ao público. Antes dessa altura o depósito ficará disponível ao Comissário de Patentes nos termos de 37 CFR §1.14 e 35 USC §112.

Lisboa, 30 de Junho de 1993

JUNTO UA-Wv —

J. PEREIRA DA CRUZ

Agenje Oficia! da Praprindad? Industrial RUA VICTOFt CORDON. 10 -A 3.®

1200 LISBOA

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES Ia. - Sequência de DNA, caracterizada por ser codificadora de um polipeptídeo da fórmula YVYBAZCX em que VVYBAZCX é composto pelos segmentos de polipeptídeo mostrados na Figura 31 (SEQ 1D Nos. 136-139, 141-147, 160, 161, e 163); em que W compreende o segmento de polipeptídeo F ou está ausente; em que Y compreende o segmento de polipeptídeo E ou está ausente; em que Z compreende o segmento de polipeptídeo G ou está ausente; e em que X compreende os segmentos de polipeptídeo C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D’ HKL, C/D1 H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D’ D, C/D D' H, C/D D’ HL, C/D D’ HKL, C/D' D' H, C/D' D’ HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D’ D’ HL, C/D C/D’ D' HKL, ou C/D’ D' HL; desde que: a) pelo menos um de F, Y, B, A, Z, C, ou X, seja de origem bovina; ou b) Y compreenda o segmento de polipeptídeo E; ou c) X compreenda segmentos de polipeptídeo C/D HKL, C/D D, C/D' HKL, C/D C/D' HKL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HKL, C/D C/D’ D' H, C/D C/D' D' HL, C/D C/D' D' HKL, C/D' H, C/D C/D' H ou C/D' D' HL. 2'. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, *t·

   caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-142, 146, 147, 160, 161). 3a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D’ H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 143, 146, 160). 4a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D D tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 142, 144, 160). 5a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D' HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 143, 146, 147, 160, 161). 6a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 146, 147, 160, 161). 7a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 146, 160).

   8a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' HL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 146, 147, 160). 9a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' D tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-144, 160). 10a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D D' H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-142, 145, 146, 160). 1 Ia. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D D' HL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141- 142, 145, 146, 147, 160). 12a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D D' HK.L tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-142, 145-147, 160, 161). 13a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D' D' H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 143, 145, 146, 160). -4- \

   / 14a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D' D* HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 143, 145-147, 160, 161). 15a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D’ D’ H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 3 1 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 145, 146, 160). 16a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D’ D’ FIL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 145-147, 160). 17a. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D’ D1 HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 145-147, 160, 161). 18a. - Sequência de DNA, caracterizada por compreender segmentos codificadores 3FBA'\ que codificam segmentos de polipeptídeo tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136, 138, 139). 19a. - Sequência de DNA, caracterizada por compreender segmentos codificadores SFBA''\ que codificam segmentos de polipeptídeo tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136, 138, 140).

   20a. - Sequência de DNA, caracterizada por compreender segmentos codificadores ^FEBA'1, que codificam segmentos de polipeptídeo tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 163). 21“. - Sequência de DNA, caracterizada por compreender segmentos codificadores 5FEBA''\ que codificam segmentos de polipeptídeo tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-138, 140, 163). 22:i. - DNA purificado, caracterizado por ser codificador de GGF2HBF5. 23a. - Polipeptídeo, caracterizado por apresentar a fórmula WYBAZCX em que WYBAZCX é composto pelos segmentos de polipeptídeo mostrados na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-147, 160, 161, e 163); em que W compreende o segmento de polipeptídeo F ou está ausente; em que Y compreende o segmento de polipeptídeo E ou está ausente; em que Z compreende o segmento de polipeptídeo G ou está ausente; e em que X compreende os segmentos peptídicos C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D’ H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D’ HL, C/D C/D’ D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D’ H, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D’ D' HL, C/D C/D' D' HKL, ou C/D' D' HL; desde que:

   a) pelo menos um de F, Y, B, A, Z, C, ou X, seja de origem bovina; ou b) Y compreenda o segmento de polipeptídeo E; ou c) X compreenda segmentos de polipeptídeo C/D HKL, C/D D, C/D' HKL, C/D C/D' HKL, C/D C/D' D, C/D D’ H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HKL, C/D C/D’ D' H, C/D C/D' D' HL, C/D C/D' D' HKL, C/D' H, C/D C/D' H ou C/D’ D' HL. 24a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-142, 146, 147, 160, 161). 25a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D D tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 142, 144, 160). 26a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D1 H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 3 1 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 143, 146, 160). 27a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D' HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 143, 146, 147, 160, 161). 28a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado I

   por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 146, 147, 160, 161). 29a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 146, 160). 30a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' HL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 146, 147, 160). 31a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' D tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-144, 160). 32a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D D’ H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 3 I (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 142, 145, 146, 160). 33a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D D' HL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 3 1 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 142, 145-147, 160). 34a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado

   por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D D' HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 142, 145-147, 160, 161). 35a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D' D' H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 143, 145, 146, 160). 36a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D' D' HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141, 143, 145-147, 160, 161). 37a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' D' H tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 145, 146, 160). 38a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' D' HL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 145-147, 160)..............-- --------- · - - 39a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por X compreender segmentos de polipeptídeo C/D C/D' D' HKL tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-143, 145-147, 160, 161). -9- -9-

   <L 40a. - Polipeptídeo, caracterizado por compreender segmentos de polipeptídeo FBA tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQIDNos. 136, 138, 139). 41a. - Polipeptídeo, caracterizado por compreender segmentos de polipeptídeo FEBA tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQIDNos. 136-139, 163). 42a. - Polipeptídeo, caracterizado por compreender segmentos de polipeptídeo FBA’ tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136, 139, 140). 43a. - Polipeptídeo, caracterizado por compreender segmentos de polipeptídeo FEBA' tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQIDNos. 136-139, 140, 163). 44a. - Polipeptídeo purificado, caracterizado por ser GGF2HBF5. 45a. - Polipeptídeo da fórmula VVYBAZCX em que VVYBAZCX é composto pelos segmentos de polipeptídeo mostrados na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 141-147, 160, 161, e 163); em que W compreende o segmento de polipeptídeo F ou está ausente; em que Y compreende o segmento de polipeptídeo E ou está ausente; em que Z compreende o segmento de polipeptídeo G ou está ausente; e em que X compreende oo segmentos de polipeptídeo C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D’ H, C/D’ D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, - 10- C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D’ H, C/D' D' HL, C/D' D’ HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D1 D' HL, ou C/D C/D' D' HKL; caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 46a. - Polipeptídeo compreendendo segmentos de polipeptídeo FBA tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136, 138, 139), caracterizado porser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 47a. - Polipeptídeo compreendendo segmentos de polipeptídeo FBA' tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136, 138, 140), caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 48a. - Polipeptídeo compreendendo segmentos de polipeptídeo FEBA tendo as sequências de aminoácidos mostradas na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-139, 163), caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 49a. - Polipeptídeo compreendendo segmentos de polipeptídeo FEBA' tendo as sequências de aminoácidos correspondentes aos segmentos de polipeptídeo mostrados na Figura 31 (SEQ ID Nos. 136-138, 140, 163), caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 50a. - Polipeptídeo GGF2HBS5, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia.

   51a. - Composto que se liga especificamente ao receptor p 185 erbB2 de células da glia, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogé-nese de uma célula da glia. 52a. - Polipeptídeo, compreendendo EGFL1, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 38, SEQ ID No. 154, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 53a. - Polipeptídeo, compreendendo EGFL2, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 39, SEQ 1D No. 155, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 54a. - Polipeptídeo, compreendendo EGFL3, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 40, SEQ ID No. 156, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 55a. - Polipeptídeo, compreendendo EGFL4, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 41, SEQ ID No. 157, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 56a. - Polipeptídeo, compreendendo EGFL5, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 42, SEQ ID No. 158, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 57a. - Polipeptídeo, compreendendo EGFL6, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 43, SEQ ID No. 159, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 58a. - Polipeptídeo da reivindicação 1, 18, 19, 20, 21 ou 22,

   caracterizado por ser empregue na profilaxia ou tratamento de um estado patofi-siológico do sistema nervoso num mamífero, estado esse que envolve um tipo de célula que é sensível ou que reage ao referido polipeptídeo. 59;1. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por o referido estado envolver lesões nos nervos periféricos. 60:|. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por o referido estado envolver a glia do sistema nervoso central. 6 Ia. - Factor polipeptídico de 35 kD isolado a partir da linha celular fibroblástica transformada 1-EJ de ratazana, caracterizado por ser empregue para estimular a actividade mitogénica numa célula da glia. 62a. - Factor polipeptídico de 75 kD isolado a partir da linha celular de mama humana SKBR-3. caracterizado por ser empregue para estimular a actividade mitogénica numa célula da glia. 63a. - Factor polipeptídico de 44 kD isolado a partir da linha celular fibroblástica transformada 1-EJ de ratazana, caracterizado por ser empregue para estimular a actividade mitogénica numa célula da glia. 64a. - Factor polipeptídico de 45 kD isolado a partir da linha celular de mama humana MDA-MB 23 1, caracterizado por ser empregue para estimular a actividade mitogénica numa célula da glia. 65a. - Factor polipeptídico de 7 a 14 kD isolado a partir da linha celular T humana ATL-2, caracterizado por ser empregue para estimular a actividade mitogénica numa célula da glia.

   66a. - Factor polipeptídico de 25 kD isolado a partir de macrófagos peritoneais de ratinho activados, caracterizado por ser empregue para estimular a actividade mitogénica numa célula da glia. 67a. - Factor polipeptídico de 25 kD isolado a partir de rim bovino, caracterizado por ser empregue para estimular a actividade mitogénica numa célula da glia. 68a. - Polipeptídeo ARIA, caracterizado por ser empregue para estimular a actividade mitogénica numa célula da glia. 69a. - Polipeptídeo tendo actividade mitogénica sobre células da glia, caracterizado por o referido polipeptídeo ser codificado pela sequência de DNA da reivindicação 1, sendo o referido polipeptídeo obtido por um método que compreende a cultura de células hospedeiras modificadas sob condições que permitem a expressão da referida sequência de DNA. 70a. - Polipeptídeo tendo actividade mitogénica sobre células da glia, caracterizado por o referido polipeptídeo ser codificado pela sequência de DNA da reivindicação 18, 19, 20, 21 ou 22, sendo o referido polipeptídeo obtido por um método que compreende a cultura de células hospedeiras modificadas sob condições que permitem a expressão da referida sequência de DNA. 71a. - Processo para identificar a presença de um receptor do polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69 numa amostra, caracterizado por compreender o contacto da referida amostra com o referido polipeptídeo e a determinação da ligação entre eles, em que a referida ligação é indicativa da presença do referido receptor. - 14-

   / / .f /

   / 72a. - Substância que inibe a ligação de um polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69 a um receptor para esse fim, caracterizada por ser empregue na profilaxia ou tratamento de um tumor da glia num paciente. 73a. - Formulação farmacêutica ou veterinária, caracterizada por compreender um polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69 formulado para utilização farmacêutica ou veterinária, respectivamente, juntamente com um diluente, veículo ou excipiente aceitável e/ou por se apresentar em forma de dosagem unitária. 74a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia. 75a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue para estimular a mitogénese de uma célula da glia num vertebrado. 76a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue na profilaxia ou tratamento de um estado patofisiológico do sistema nervoso num mamífero, estado esse que envolve um tipo de célula que é sensível ou que reage ao referido polipeptídeo. 77a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue no tratamento de um estado que envolve lesões nos nervos periféricos num mamífero.

   78a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue na profilaxia ou tratamento de um estado num mamífero, estado esse que envolve a desmielinação ou lesão ou perda de células de Schwann, por exemplo a neuropatia de fibras nervosas sensórias ou motoras. 79;|. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue na profilaxia ou tratamento de uma perturbação neurodegenerativa num mamífero. 80a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue para induzir regeneração ou reparação neural num mamífero. 81a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue para induzir proliferação de fibroblastos. 82a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue para reparar feridas em mamíferos. 83a. - Processo para o fabrico de um medicamento, caracterizado por compreender a mistura de um polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69 com um veículo farmaceuticamente aceitável. 84a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue na produção de um anticorpo, através da imunização de um mamífero com o referido polipeptídeo. 85a. - Processo para a detecção de um receptor que é capaz de se ligar a um polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, - 16- caracterizado por se levar a cabo isolamento por afinidade na referida amostra, utilizando um dos referidos peptídeos como ligando de afinidade. 86a. - Substância que inibe a ligação de um polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69 a um receptor para esse fim, caracterizada por ser empregue na profilaxia ou tratamento de um tumor da glia num paciente. 87a. - Processo para a investigação, isolamento e preparação de um mitogénio de células da glia ou sequência genética codificadora do referido mitogénio de células da glia, caracterizado por compreender o contacto de preparações ou amostras de tecidos com um anticorpo, sendo o referido anticorpo preparado como definido na reivindicação 84. 88a. - Processo para o isolamento de uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma molécula tendo actividade mitogénica de células da glia, caracterizado por compreender o contacto de uma amostra contendo células com um anticorpo específico de mitogénio de células da glia para determinar a expressão do referido mitogénio na referida amostra e o isolamento da referida sequência de ácido nucleico a partir das células que exibem a referida expressão. 89a. - Polipeptídeo GGF2 purificado, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 45 (SEQ ID No. 167). 90a. - DNA GGF2 purificado, caracterizado por ser codificador do polipeptídeo GGF2, cujas sequência é mostrada na Figura 45 (SEQ ID No. 167). 91a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, - 17 - / - 17 - / / / caracterizado por ser empregue para induzir a mielinação de uma célula neural por uma célula de Schwann. 92a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44 ou 69, caracterizado por ser empregue para induzir a síntese do receptor de acetilcolina numa célula. 93a. - Anticorpo, caracterizado por ser um anticorpo contra um polipeptídeo como definido na reivindicação 23. 94a. - Anticorpo, caracterizado por ser um anticoipo contra um polipeptídeo como definido na reivindicação 40. 95a. - Anticorpo, caracterizado por ser um anticorpo contra um polipeptídeo como definido na reivindicação 41. 96a. - Anticoipo, caracterizado por ser um anticoipo contra um polipeptídeo como definido na reivindicação 42. 97a. - Anticoipo, caracterizado por ser um anticoipo contra um polipeptídeo como definido na reivindicação 43. 98a. - Anticoipo, caracterizado por ser um anticoipo contra um polipeptídeo como definido na reivindicação 44. 99a. - Anticoipo, caracterizado por ser uin anticorpo contra um polipeptídeo como definido na reivindicação 69. 100a. - Processo para a purificação de uma proteína com actividade - 18 -

   mitogénica de células da glia, caracterizado por compreender o contacto de um extracto celular com um anticorpo da reivindicação 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99. 101a. - Processo para a purificação de uma proteína com actividade mitogénica de células da glia, caracterizado por compreender o contacto de um extracto celular com um anticorpo contra um factor polipeptídico básico tendo actividade mitogénica, a estimulação da divisão das células de Schwann na presença de plasma de vitela fetal, tendo o referido polipeptídeo um peso molecular de desde cerca de 30 kD até cerca de 36 kD, incluindo o referido polipeptídeo, dentro da sua sequência de aminoácidos, pelo menos uma das seguintes sequências polipeptídicas: F K G D A H T E A s L A D E Y Ξ Y M X K T E T S S S G L X L K A S L A D E Y E Y M R K A G Y F A E X A R T rp 1 E M A S E Q G A A K E A L A A L K F V L Q A K K E T Q P D P G Q I L K K V P M V E Y K C L K F K w F K K A T V M E X K F Y V D - K L E F L X A K em que as letras representam segmentos de polipeptídeo mostrados na Figura 31. 102a. - Processo para a purificação de uma proteína com actividade - 19 - i

   mitogénica de células da glia, caracterizado por compreender o contacto de um extracto celular com um anticorpo contra um factor polipeptídico básico tendo actividade mitogénica, a estimulação da divisão das células de Schwann na presença de plasma de vitela fetal, tendo o referido polipeptídeo um peso molecular de desde cerca de 55 kD até cerca de 63 kD, incluindo o referido polipeptídeo, dentro da sua sequência de aminoácidos, pelo menos uma das seguintes sequências polipeptídicas: V H Q V W A A K Y I F F M E P E A X S S G L G A W G P P A F P V X Y W F V V I £ G K A S P V s V G s V Q E L V Q R V c L L T V A A L P P T K V H Q V w A A K K A S L A D S G E Y M X K D L L L X V E G K V H P Q R R G A L D R K P S C G R L K D S R V A. I F Γ M E L N R K N K P Q N I K I Q K K em que as letras representam segmentos de polipeptídeo mostrados na Figura 31. 103:'. - Processo para a purificação de uma proteína com actividade mitogénica de células da glia, caracterizado por compreender o contacto de um extracto celular com um anticorpo contra um factor polipeptídico tendo actividade mitogénica de células da glia e incluindo uma sequência de aminoácidos codificada por: -20- \

   (a) uma sequência de DNA mostrada nas Figuras 28a, 28b, 28c (SEQ ID Nos. 133-135, respectivamente). (b) uma sequência de DNA mostrada na Figuras 22 (SEQ ID No. 89). (c) a sequência de DNA representada pelos nucleotídeos 281-557 da sequência mostrada na Figura 28a. (d) uma sequência de DNA que hibrida com a sequência de DNA de (a), (b) ou (c). 104a. - Processo para a purificação de uma proteína com actividade mitogénica de células da glia, caracterizado por compreender o contacto de um extracto celular com um anticorpo contra um factor polipeptídico básico, tendo um peso molecular, sob condições quer redutoras quer não redutoras, de desde cerca de 30 kD até cerca de 36 kD com base em electioforese de gel de SDS-poliacrilainida, tendo o referido polipeptídeo actividade mitogénica que estimula a divisão das células de Schwann de ratazana na presença de plasma de vitela fetal, e retendo, quando isolado utilizando HPLC de fase reversa, pelo menos 50% da referida actividade depois de 10 semanas de incubação em ácido trifluoroacético a 0,1%, a 4°C. 105a. - Processo para a purificação de uma proteína com actividade mitogénica de células da glia, caracterizado por compreendei o contacto de um extracto celular com um anticorpo contra um factor polipeptídico básico, tendo um peso molecular, sob condições não redutoras, de desde cerca de 55 kD até cerca de 63 kD com base em electioforese de gel de SDS-poliacrilamida, tendo o referido polipeptídeo actividade mitogénica que estimula a divisão das células de

   Schwann de ratazana na presença de plasma de vitela fetal, e retendo, quando isolado utilizando HPLC de fase reversa, pelo menos 50% da referida actividade depois de 4 dias de incubação em ácido trifluoroacético a 0,1%, a 4°C. 106''. - Anticorpo da reivindicação 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99, caracterizado por ser empregue no tratamento de um mamífero que sofre de uma doença de proliferação de células da glia. 107'. - Anticorpo contra um factor polipeptídico básico tendo actividade mitogénica estimuladora da divisão das células de Schwann na presença de plasma de vitela fetal, tendo o referido polipeptídeo um peso molecular de desde cerca de 30 kD até cerca de 36 kD, incluindo o referido polipeptídeo, dentro da sua sequência de aminoácidos, pelo menos uma das seguintes sequências polipeptícas: F K G D A H T E A s L A D E Y E Y M X K T E T S S S G L X L K A s L A D E Y E Y M R K A G Y F A E X A R T T E M A S E Q G A A K E A L A A L K F V L Q A K K E T Q P D P G Q T L K K V p M V E Y K c L K F K W F K K A T V M E X K F Y V P K L E F L X A K em que as letras representam segmentos de polipeptídeo mostrados na -22-

   Figura 31, caracterizado por ser empregue no tratamento de um mamífero que sofre de uma doença de proliferação de células da glia. 1081'. - Anticorpo contra um factor polipeptídico básico tendo actividade mitogénica estimuladora da divisão das células de Schwann na presença de plasma de vitela fetal, tendo o referido polipeptídeo um peso molecular de desde cerca de 55 kD até cerca de 63 kD, incluindo o referido polipeptídeo, dentro da sua sequência de aminoácidos, pelo menos uma das seguintes sequências polipeptícas: V H Q V W A A K Y I F F M E p E A X S S G L G A W G D P A F P V X Y w F V V I E G K A S P V S V G s V Q E L V Q R V C L L T V A A L P P T K V H Q V W A A K K A S L A D S G E Y M X K D L Li L X V E G K V H P Q R R G A L D R K P S O G R L K E D S R Y I F F M E L N R K N K P Q N I K I Q K K em que as letras representam segmentos de polipeptídeo mostrados na Figura 31, caracterizado por ser empregue no tratamento de um mamífero que sofre de uma doença de proliferação de células da glia. 109“. - Anticorpo contra um factor polipeptídico tendo actividade mitogénica de células da glia e incluindo uma sequência de aminoácidos _ ?

   codificada por: (a) uma sequência de DNA mostrada nas Figuras 28a, 28b, 28c (SEQ ID Nos. 133-135, respectivamente); (b) uma sequência de DNA mostrada na Figuras 22 (SEQ ID No. 89); (c) a sequência de DNA representada pelos nucleotídeos 281-557 da sequência mostrada na Figura 28a; (d) uma sequência de DNA que híbrida com a sequência de DNA de (a), (b) ou (c); caracterizado por ser empregue no tratamento de um mamífero que sofre de uma doença de proliferação de células da glia. 110a. - Anticorpo contra um factor polipeptídico básico, tendo um peso molecular, sob condições quer redutoras quer não redutoras, de desde cerca de 30 kD até cerca de 36 kD com base em electroforese de gel de SDS-poliacrilamida, tendo o referido polipeptídeo actividade mitogénica que estimula a divisão das células de Schwann de ratazana na presença de plasma de vitela fetal, e retendo, quando isolado utilizando HPLC de fase reversa, pelo menos 50% da referida actividade depois de 10 semanas de incubação em ácido trifluoroacético a 0,1%, a 4°C, caracterizado por ser empregue no tratamento de um mamífero que sofre de uma doença de proliferação de células da glia. 11 Γ. - Anticorpo contra um factor polipeptídico básico, tendo um peso molecular, sob condições não redutoras, de desde cerca de 55 kD até cerca de 63 kD com base em electroforese de gel de SDS-poliacrilamida, tendo o referido polipeptídeo actividade mitogénica que estimula a divisão das células de Schwann de ratazana na presença de plasma de vitela fetal, e retendo, quando isolado utilizando HPLC de fase reversa, pelo menos 50% da referida actividade depois de 4 dias de incubação em ácido trifluoroacético a 0,1%, a 4°C, caracterizado por ser empregue no tratamento de um mamífero que sofre de uma doença de proliferação de células da glia. 112a. - Vector, caracterizado por compreender uma sequência de DNA da reivindicação 1, IS, 19, 20, 21 ou 22. 113a. - Polipeptídeo da reivindicação 23, 40, 41, 42, 43, 44, ou 69, caracterizado por se destinar a utilização como mitogénio de células da glia. 114a. - Polipeptídeo que compreende um domínio do tipo do factor de crescimento epidérmico, cuja sequência de aminoácidos é idêntica a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene do ligando de GGF/pl84 erb B2, caracterizado por se destinar à profilaxia ou tratamento de um estado patofisiológico do sistema nervoso num mamífero, ou à profilaxia ou tratamento da esclerose múltipla, ou a estimular a mitogénese de um célula da glia, ou a induzir a rnielinação de uma célula neural por meio de uma célula da glia, ou a induzir a síntese de um receptor de acetilcolina numa célula. 115a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 114, caracterizado por o referido estado patofisiológico incluir o sistema nervoso. 116a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado por o referido estado patofisiológico incluir o sistema nervoso periférico.

   117a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado por o referido estado patofisiológico incluir o sistema nervoso central. 118a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado por o referido estado patofisiológico ser escolhido entre o grupo que consiste em: (1) desmielinação das células nervosas; (2) danos nas células de Schwann; (3) perda das células de Schwann; e (4) uma perturbação neurodegenerativa. 119a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 116, caracterizado por o referido estado ser uma neuropatia periférica. 120a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 119, caracterizado por a referida neuropatia ser uma neuropatia das fibras dos nervos sensoriais. 121a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 119, caracterizado por a referida neuropatia ser uma neuropatia das fibras motoras. 122a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado por o referido estado requerer a regeneração neural ou reparação neural. 123a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ 1D NO: 177.

   124:1. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 178. 125:i. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 42. 126a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender ainda a sequência SEQ ID NO: 178, em que a SEQ ID NO: 178 é C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 177 . 127a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender ainda a sequência SEQ ID NO: 179, em que a SEQ ÍD NO: 42 é C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 177. 128a, - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada entre o grupo constituído por SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158 e SEQ ID NO: 159. 129a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 114, caracterizado por o referido estado patofisiológico incluir a esclerose múltipla. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 114, 130a. - ι -27-

   caracterizado por estimular a mitogénese de uma célula da glia. 13 Γ'. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 130, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ 1D NO: 177. 132a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 130, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ 1D NO: 178. 133a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 130, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ 1D NO: 42. 134'. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 131, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender ainda a sequência SEQ 1D NO: 178, em que a SEQ ID NO: 178 é C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 177. 135a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 131, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender ainda a sequência SEQ ID NO: 179, em que a SEQ ID NO: 42 é C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 177. 136a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 130, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada entre o grupo constituído por SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158 e SEQ ID NO: 159.

   137'. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 114, caracterizado por induzir a mielinação de uma célula neural por meio de uma célula da glia 138a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 137, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 177. 139:1. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 137, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ 1D NO: 178. 140°. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 137, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 42. 141a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 138, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender ainda a sequência SEQ ID NO: 178, em que a SEQ ID NO: 178 é C-terminal relativamente à SEQ ÍD NO: 177. 142:I. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 138, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender ainda a sequência SEQ ID NO: 179, em que a SEQ ID NO: 42 é C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 177. 143a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 137, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico

   compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada entre o grupo constituído por SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158 e SEQ ID NO: 159. 144a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 114, caracterizado por induzir a síntese do receptor de acetilcolina numa célula. 145a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 144, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 177. 146a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 144, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 178. 147a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 144, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 42. 148a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 145, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender ainda a sequência SEQ ID NO: 178, em que a SEQ ID NO: 178 é C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 177. 149 a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 145, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender ainda a sequência SEQ ID NO: 179, em que a SEQ ID NO: 42 é C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 177.

   150'1. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 144, caracterizado por o domínio do tipo do referido factor de crescimento epidérmico compreender lima sequência de aminoácidos seleccionada entre o grupo constituído por SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158 e SEQ ID NO: 159. 15Γ. - Polipeptídeo que se liga ao receptor p 185 erb B2, caracterizado por se destinar à profilaxia ou tratamento de um estado patofisioiógico do sistema nervoso num mamífero, ou à profilaxia ou tratamento da esclerose múltipla, ou a estimular a mitogénese de uma célula da glia, ou a induzir a mielinaçào de uma célula neural por meio de uma célula da glia, ou a induzir a síntese do receptor da acetilcolina numa célula. I52:|. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 151, caracterizado por o referido estado patofisioiógico incluir o sistema nervoso. 153;|. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 152, caracterizado por o referido estado patofisioiógico incluir o sistema nervoso periférico. 154a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 152, caracterizado por o referido estado patofisioiógico incluir o sistema nervoso central. 155a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 152, caracterizado por o referido estado patofisioiógico ser escolhido entre o grupo que consiste em: (1) desmielinação das células nervosas; (2) danos nas células de Schwann; (3) perda das células de Schwann; e (4) uina perturbação neurodegenerativa. 156a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 153, caracterizado por o referido estado ser uma neuropatia periférica. 157a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 156, caracterizado por a referida neuropatia ser uma neuropatia das fibras dos nervos sensoriais. 158a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 156, caracterizado por a referida neuropatia ser uma neuropatia das fibras motoras. 159a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 152, caracterizado por o referido estado requerer a regeneração neural ou reparação neural. 160a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 151, caracterizado por o referido estado patofisiológico incluir a esclerose múltipla. 161a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 151, caracterizado por estimular a mitogénese de uma célula da glia. 162a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 151, caracterizado por induzir a mielinação de uma célula neural por uma célula da glia. 163a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 151, caracterizado por induzir a síntese do receptor de acetilcolina numa célula. 32 - *

   / 164:ι. - Polipeptídeo recombinante com actividade mitogénica da célula da glia, caracterizado por se destinar à profilaxia ou tratamento de um estado patofisiológico do sistema nervoso num mamífero, ou à profilaxia ou tratamento da esclerose múltipla, ou a estimular a mitogénese de uma célula da glia, ou a induzir a mielinaçào de uma célula neural por meio de uma célula da glia, ou a induzir a síntese do receptor da acetilcolina numa célula. 165;1. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 164, caracterizado por o referido estado patofisiológico incluir o sistema nervoso. 166'. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 165, caracterizado por o referido estado patofisiológico incluir o sistema nervoso periférico. 167a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 165, caracterizado por o referido estado patofisiológico incluir o sistema nervoso central. 168a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 165, caracterizado por o referido estado ser escolhido entre o grupo que consiste em: (1) desinielinação das células nervosas; (2) danos nas células de Sclnvann; (3) perda das células de Schwann; e (4) uma perturbação neurodegenerativa. 169a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 167, caracterizado por o referido estado patofisiológico ser uma esclerose múltipla.

   170a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 166, caracterizado por o referido estado ser uma neuropatia periférica. 171a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 170, caracterizado por a referida neuropatia ser uma neuropatia das fibras dos nervos sensoriais. 172a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 170, caracterizado por a referida neuropatia ser uma neuropatia das fibras motoras. 173a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 165, caracterizado por o referido estado patofisiológico requerer a regeneração neural ou reparação neural. 174a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 164, caracterizado por o referido estado incluir a esclerose múltipla. 175a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 164, caracterizado por estimular a mitogénese de uma célula da glia. 176a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 164, caracterizado por induzir a mielinação de uma célula neural por uma célula da glia. 177a. - Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 164, caracterizado por induzir a síntese do receptor de acetilcolina numa célula. 178a. - Formulação farmacêutica ou veterinária, caracterizada por compreender um polipeptídeo compreendendo um domínio do tipo do factor de -34- crescimento epidénnico, cuja sequência de aminoácidos é idêntica a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene do ligando de GGF/pl85 erb B2, que é formulada para utilização farmacêutica ou veterinária, respectivamente, juntamente com um diluente aceitável, um veículo ou um excipiente e/ou sob a forma de unidades de dosagem. 179;i. - Processo para preparar um medicamento, caracterizado por compreender a mistura de um polipeptídeo compreendendo um domínio do tipo do factor de crescimento epidénnico, cuja sequência de aminoácidos é idêntica a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene do ligando de GGF/pl85 erb B2, com um veículo fannaceuticamente aceitável. 180'*. - Fonnulação fannacêutica ou veterinária, caracterizada por compreender um polipeptídeo que se liga ao receptor GGF/pl85 erb B2, que é fonnulada para utilização fannacêutica ou veterinária, respectivamente, juntamente com um diluente aceitável, um veículo ou um excipiente e/ou sob a fonna de unidades de dosagem. 181;I. - Processo para preparar um medicamento, caracterizado por compreender a mistura de um polipeptídeo que se liga ao receptor erb B2 com um veículo fannaceuticamente aceitável. I82:|. - Fonnulação fannacêutica ou veterinária, caracterizada por compreender um polipeptídeo recombinante com actividade mitogénica das células da glia, que é fonnulada para utilização fannacêutica ou veterinária, respectivamente, juntamente com um diluente aceitável, um veículo ou um excipiente e/ou sob a fonna de unidades de dosagem. 183;1. - Processo para preparar um medicamento, caracterizado por -35 - compreender a mistura de um polipeptídeo recombinante com actividade mitogénica das células da glia, com um veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 30 de Junho de 1993

   ROSÁRIO-CRUZ GARCIA Agente Ofictáí da Propriedade Industrial RUA yfcTOR CORDON, 14 1200 LISBOA / /"