FI105342B - Menetelmä proteiinin tuottamiseksi, jolla on aivoperäisen neurotrofisen tekijän (BDNF) aktiivisuutta - Google Patents

Description

χ 105342

Menetelmä proteiinin tuottamiseksi, jolla on aivoperäisen neurotrofisen tekijän (BDNF) aktiivisuutta 1. Johdanto

W

5 Tämän keksinnön kohteena ovat nukleiinihapposekvenssit, jot-' ka koodaavat aivoista peräisin, olevaa neurotrofista tekijää (brain derived neurotrophic factor, BDNF), ja menetelmä sen olennaisesti puhtaan proteiinin tai peptidifragmentin valmistamiseksi. Keksintö liittyy lisäksi äskettäin määritel-10 tyyn BDNF/NGF-geeniperheeseen kuuluviin geeneihin sekä niiden geenituotteisiin. Keksintö liittyy myös lääkekoostumuk-siin, jotka sisältävät tehoavan määrän BDNF-geenituotteita tai vaihtoehtoisesti vasta-aineita BDNF-geenituotteille, sekä menetelmiin, joiden avulla diagnosoidaan ja hoidetaan 15 erilaisia neurologisia tauteja ja häiriöitä, esimerkiksi Alzheimerin tautia ja Parkinsonin tautia. Keksinnön mukaiset BDNF-geenituotteet soveltuvat erityisesti diagnosoitaessa ja hoidettaessa dopaminergisten neuronien häiriöitä esimerkiksi Parkinsonin taudin yhteydessä, samoin kuin sensorisiin neu-20 roneihin liittyvissä taudeissa sekä verkkokalvon rappeutuma-sairauksissa.

2-j_Keksinnön taustaa • i « 2.1 Hermosolujen kuolema ja neurotrofisten tekijöiden merki- * · . . tys hermoston kehityksessä « 1 1 • · · I · *:1·: 25 Useissa osissa selkärankaisten hermostoa hermosoluja, 9 neuroneja, on varhaisemmassa kehitysvaiheissa läsnä enemmän kuin täysikasvuisessa eläimessä. Varhaisessa kehitysvaihees- .···. sa ilmenee luonnollista sysäyksit täistä hermosolujen • · · ·· kuolemista (Carr and Simpson, 1978, J. Comp. Neurol., 182:35 30 727-740, Cowan et ai. 1984, Scienee 225:1258-1265). Kehit- • · · : V tyvien neuronien elävänä pysymistä, erilaistumista ja kyp- * · * · • · · ··· • · · « · 105342 2 symistä voidaan säädellä ennemminkin ulkopäin tulevilla, sijainnista johtuvilla "epigeneettisillä" tekijöillä kuin tiukasti sisäisillä geneettisillä ohjelmilla. Esimerkiksi kanan alkioille suoritetuissa kokeissa on tullut esiin, 5 että kun perifeerisiä "kohdealueita" ("target fields"), esimerkiksi raajan silmu tai silmä siirretään tai poistetaan kanan kehityksen alkuvaiheessa, saattaa ilmetä vasta-vaa laajennetun tai pienennetyn kohdealueen lähellä sijaitsevien sensoristen, sympaattisten, parasympaattisten 10 tai motoristen neuronien lukumäärän lisääntymistä tai vähentymistä (Hamburger, 1934, J. Exp. Zool. 68:449? Hollyday and Hamburger, 1976, J. Comp. Neurol., 170:311-321; Land-messer and Pilar, 1976, J, Cell. Biol., 68:357-374). Kohdealue voi ylläpitää vain tietyn määrän hermosoluja, ja 15 ylimääräisten neuronien karsiminen kohdealueen "neurotrofi-sen kyvyn" mukaiseksi saattaa olla normaali osa kehityskulkua. Nykyään hermoston kasvutekijäksi, hermosolujen kasvutekijäksi tai hermokasvutekijäksi (nerve growth factor, NGF) kutsutun proteiinin löytäminen ja eristäminen on joh-20 tanut raolekulaariseen hypoteesiin siitä, kuinka kohdealue voi säädellä tämän kohdealueen kudoksen elävänä pitävien ja hermottavien neuronien lukumäärää (Levi-Montalcini et ai., 1968, Physiol Rev., 48:524-569, Thoenen and Barde, 1980, ] Physiol. Rev., 60:1284-1335).

'25· **” Nykyään pidetään varmana, ainakin ääreishermoston osalta, • ♦ · ·.· : että neuronaaliset kohdekudokset syntetoivat ja vapauttavat rajoitettuja määriä erilaisia neurotrofisiä molekyylejä, ·;··; jotka ovat elintärkeitä tietyntyyppisten neuronien elävänä :3¾ pysymisen kannalta (Korsching and Thoenen, 1983, Proc.

*. Natl. Acad. Sei, U.S.A. 80:3513-3516, Heumann et ai., 1984, • * · « ’···’ EMBO J. 3:3183-3189, Shelton and Reichardt, 1984, Proc.

f«« f * · • · *·;·’ Natl. Acad. Sei U.S.A. 81:7051-7955, Korschig and Thoenen, 1985, Neurosci. Lett. 54:201-205).

-:3¾ 3 105342 2.2 Hermokasvutekijä

Hermokasvutekijä, NGF, on näistä neurotrofisistä molekyyleistä toistaiseksi tarkimmin tunnettu, ja sen on sekä in 5 vitro että in vivo osoitettu olevan olennaisen tärkeä sympaattisten ja hermostopienasta peräisin olevien sensoristen . neuronien elävänä pysymiselle sekä kanan että rotan varhai sessa kehitysvaiheessa (Levi-Montalcini and Angeletti, 1963, Develop. Biol. 7:653-659, Levi-Montalcini et ai., 10 1968, Physiol. Rev. 48:524-569). Puhdistetun NGF:n ruisku tuksen kehittyvään kanan alkioon on havaittu aiheuttavan spinaalisten sensoristen neuronien ja sympaattisten neuronien massiivista solujen lukumäärän ja koon lisääntymistä (Levi-Montalcini and Booker, 1960, Proc.Natl. Acad. Sei 15 U.S.A. 46:373-384, Hamburger et ai., 1981, J. Neurosci.

1:60-71). Käänteisesti taas endogeenisen NGF:n poistaminen tai eristäminen vastasyntyneiltä rotilta käyttämällä päivittäisiä anti-NGF-vasta-aineruiskutuksia on yhdistetty sympaattisen hermoston käytännöllisesti katsoen täydelli-20 seen tuhoutumiseen (Levi-Montalcini and Booker, 1960, Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:384-391, Levi-Montalcini and !! Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18:619-628). Altistuksen • · NGF-vasta-aineille vielä aikaisemmassa kehitysvaiheessa , ] joko vasta-aineruiskutuksin in utero tai passiivista istu-

< I I

'•2*5 kan kautta emon vasta-aineiden kulkeutumista hyväksikäyttä- ' ' en on todettu aiheuttavan huomattavaa spinaalisen ja dorso-• ·· ·' mediaalisen trigeminaalisen sensorineuronien kaltaisten hermostopienasta peräisin olevien sensoristen neuronien . ·:··: vähentymistä (Goedert et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A 81:1580-1584, Gorin and Johnson, 1979, Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A 76:5382-5386). Viime aikoihin asti lähes • · · ;;;* kaikki NGF-tutkimus on keskittynyt sen asemaan ääreisher-• · '·;·’ mostossa, mutta näyttää ilmeiseltä, että NGF vaikuttaa myös :T: tiettyjen neuroniryhmien kehitykseen ja ylläpitoon keskus- ;0£ hermostossa (Thoeneh et ai., 1987, Rev. Physiol. Biochem.

105342 4

Pharmacol. 109:145-178, Whittemore and Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439-464).

Odottamaton arvokas havainto, suurten NGF-proteiinimäärien 5 löytäminen täysikasvuisen uroshiiren leuanalussyIkirauha- » sesta (Cohen, 1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:302-311) sekä aikaisempi havainto suurista NGF-pitoisuuksista käärmeenmyrkyssä (Cohen and Levi-Montalcini, 1956, Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A. 42:571-574), mahdollistivat sattu-10 malta sellaiset NGF-määrät, että pystyttiin suorittamaan kokeita, joiden avulla tutkittiin NGF:ää fysiologian, pro-teiinikemian ja viime aikoina myös molekyylibiologian (NGF:n ja sen reseptorin molekulaarinen kloonaus) kannalta.

Syytä suureen NGF-pitoisuuteen täysikasvuisen uroshiiren 15 sylkirauhasessa ei tunneta, mutta näyttää kuitenkin ilmeiseltä, ettei tällä suurella NGF-määrällä ole mitään osuutta ääreis- tai keskushermoston kehittymisessä tai ylläpidossa. NGF-herkkien neuronien (joiden elävänä pysymisen on osoitettu olevan riippuvainen NGFzstä, joiden NGF-reseptoriaf-20 finiteetti on hyvin voimakas ja jotka voivat ottaa sisäänsä ja takautuvasti kuljettaa tarkan spesifisesti NGF:ää) her-luottamissa kohdekudoksissa vakaassa tilassa mitattavissa '··’ olevien NGF-määrien on havaittu olevan erittäin pieniä, ' ' piko- tai nanogrammoja grammassa kudosta, verrattuna tuhat-'.25 kertaisiin pitoisuuksiin täysikasvuisen uroshiiren sylki-rauhaskudoksessa. NGF:ää ei ole löydetty merkittäviä mää-riä seerumista, eikä se näin ollen ilmeisesti ole kiertävä kasvutekijä tai hormoni (Suda et ai., 1978, Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 75:4042-4046).

9 9 * , .'00 9 9 9 • Mainitun tärkeän havainnon, hiiren leuanalussylkirauhasesta • · · e '···' selvän NGF-proteiinilähteen löytämisen, lisäksi NGF-tunte-• · · '...· musta biologian ja biokemian kannalta ovat edistäneet herk-;’j': kien, luotettavien ja tehokkaiden biologisten kokeiden ke- ..J5 liittäminen. Kehittyvän kanan alkion selkäydinhermon taka-juuren gangliot (dorsal root ganglia, DRG) olivat ensimmäi- 5 105342 siä neuronityyppejä, joiden in vitro osoitettiin reagoivan NGF:ään. Kudosviljelmissä (explant cultures) kanan DRG E8-E12-viljelmät plasmahyytymässä ja uudemmat, erilliset neu-ronirikastetut kanan DRG-viljelmät ovat osoittautuneet 5 erittäin käyttökelpoisiksi NGF:n aktiivisuutta eläimessä tai kudoksessa tutkivissa bioanalyyseissä (esim. puhdistuksen aikana) samoin kuin biologisissa NGF:n in vitro-kokeis-sa (Levi-Montalcini et ai., 1954, Cancer Res. 4:49-57, Le-vi-Montalcini and Angeletti, 1963, Develop. Biol. 1:653-10 659, Greene, 1977, Develop. Biol. 58:96, ibid 58:106).

Yhdestä kanan alkiosta saadaan dissekoitua yli 40 DRG:tä, ja tämä on johtanut siihen, että NGF-bioanalyysejä on ruvettu käyttämään laajalti laboratorioissa.

15 Sen lisäksi, että NGF-proteiinia on alettu saada suuria määriä ja on olemassa tehokkaita NGF-koejärjestelmiä, on kolmaskin tekijä, joka on suuresti lisännyt NGF-tietouttam-me biologian kannalta, nimittäin se, että NGF-vasta-aineita on suhteellisen helppo kasvattaa esimerkiksi marsuissa, 20 kaneissa tai lampaissa; hiiren NGF näyttää olevan erittäin >;< immunogeenistä. Cohen (1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.

46:302-311) kasvatti vasta-aineita NGF:lle, jonka hän oli "·. puhdistamalla saanut hiiren sylkirauhasesta, ja osoitti ' yhdessä Levi-Montalcinin ja Bookerin (Levi-Montalcini and '•25 Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:384-391) kanssa, että nämä vasta-aineet aiheuttivat sympaattisissa • · · V ’ ganglioissa tuhoa, "immunosympatektomiaa", kun niitä annettiin vastasyntyneille rotille päivittäin (Levi-Montalcini ·:··· and Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18:619-628).

.TD * · · - ·. NGF-proteiinin hyvä runsas saatavuus mahdollisti primaa- • · · '·!«’ risekvenssin määrityksen jo melko varhaisessa proteiinike- I · mian vaiheessa (Angeletti and Bradshaw, 1971, Proc. Natl.

«

Acad. Sei. 68: 2417-2420). NGF-geeni on kloonattu jo mo-·;3·5 nesta lajista, hiireltä (Scott et ai., 1983, Nature 302: 583-540), ihmiseltä, (Ullrich et ai., 1983, Nature: 303: 105342 6 821-825), lehmältä ja kanalta (Meier et ai., 1986, EMBO J.

5:1489-1493) sekä rotalta (Whittemore et ai., 1988, J. Neu-rosci. Res., 20: 402-410) käyttämällä olennaisesti perinteistä molekyylibiologiaa, saatavilla olevia hiiren NGF-5 proteiinisekvenssejä sopivien oligonukleotidikoettimien Ψ valmistamiseen. Suurien KGF-määrien saatavuus on edistänyt myös NGF-reseptorien tutkimusta, joiden avulla on lopulta päästy NGF-reseptorien molekulaariseen kloonaukseen ihmiseltä ja rotalta (Johnson et ai., 1986, Cell, 47:545-554.

10 Radeke et ai., 1987, Nature 325:593-597).

Nykyään pidetään selvänä, että NGF ei ole ubikvistinen neu-rotrofinen tekijä. Ääreishermostossa NGF ei näytä olevan elintärkeä tekijä parasympaattisille neuroneille, hermopla-15 kodiperäisille sensorisille neuroneille tai enteerisille neuroneille, se on todettu sekä in vitro- että in vivo-kokein. NGF ei myöskään näytä olevan elintärkeä kehittyville motoneuroneille (Oppenheim, 1982, J. Comp. Neurol. 210:174-189), vaikka näillä neuroneilla onkin osoitettu olevan jon-20 kinasteista NGF-reseptoriaffiniteettia kehityksensä aikana (Raivich et ai., 1985, EMBO J: 4:637-644). Koska NGF:llä ;;; ei näytä olevan vaikutusta näihin neuronityyppeihin, on ruvettu etsimään muita neurotrofisiä tekijöitä, eristyises-ti tekijöitä, jotka edistäisivät selkäytimen motoneuronien •‘.2·$ ja/tai sädeganglion parasyrapaattisten neuronien elävänä “·*: pysymistä.

• · · • « · • · · 2.3 Muita neurotrofisiä tekijöitä • · -* .•?*Q Viimeisten kymmenen vuoden aikana on julkaistu lukuisia • · · neurotrofista aktiivisuutta selventäviä tutkimuksia, joissa . .·. ....

on käytetty uutteita erilaisista kudoksista ja monenlaisia ·*· solutyyppejä käsitellyillä elatusalustoilla. Lähes kaikis-.·;·. sa tapauksissa näiden aktiivisuuksien puhdistuksen ja ka-rakterisoinnin esteenä on ollut niiden äärettömän pieni määrä: vain piko- tai nanogrammoja grammassa kudosta.

7 105342

Lisäksi, vaikka ääreishermoston soluille onkin olemassa riittävän hyviä bioanalyysejä, luotettavien, toistettavien ja spesifisten kokeiden luominen keskushermoston hermosoluja varten on osoittautunut ongelmalliseksi. Yksittäisiä 5 ääreishermoston neuronityyppejä on löydettävissä erillisinä, helposti dissekoitavina ganglioina, kun keskushermoston (central nervous system, CNS) neuronit ovat poikkeuksetta

V

erittäin heterogeenisesti jakautuneita. Tiettyjen CNS-neu-roniluokkien tunnistukseen tai kehittämiseen tarvitaan siis 10 spesifisiä merkkiaineita. Tällaisten merkkiaineiden, esimerkiksi solun pinnan tai tukirangan osiin kohdistuvien vasta-aineiden tai spesifisten histologisten värjäysmenetelmien kehitys on ollut verkkaista. On siis osoittautunut erittäin vaikeaksi karakterisoida neurotrofisiä tekijöitä, 15 joita (i) ei esiinny niin runsaasti kuin NGFrää, (ii) joille on vaikea suorittaa kokeita ja (iii) joita ei ole saatavilla riittäviä määriä vasta-ainetuotannon toteuttamiseen.

2.3.1. Aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän 20 (BDNF) ja hermokasvutekijän (NGF) vertailua

• I I

Neurotrofista aktiivisuutta, joka pystyi pitämään elävänä kanan alkion DRG-hermosoluja in vitro, havaittiin "käsitellystä elatusaineesta", jossa oli kasvatettu rotan C-6 gli-*2S oomasoluja (Barde et ai., 1978, Nature 274:818). Hiiren ’·’*· NGF:n vasta-aineet eivät neutraloineet aktiivisuutta, ja • · · : oli syytä olettaa, että kyseessä oli elatusaineessa oleva jokin muu neurotrofinen tekijä. Samanlaisia aktiivisuuksi··· siä, joita ei pystytty estämään NGF-vasta-aineilla, rapor-.30. toitiin viljelmistä, joissa käytettiin normaalin täysikas-·. vuisen rotan aivojen astrogliasoluja (Lindsay, 1979, Nature 282:80-82, Lindsay et ai., 1982, Brain Res. 243:329-343), uutetta kehittyvän ja täysikasvuisen rotan aivoista (Barde « et ai., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:1199-1203), .S3 sekä kehittyvän ja täysikasvuisen kanan selkäytimestä (Lindsay and Peters, 1984, Neurosci. 12:45-51). Missään 8 105342 näistä tapauksista aktiivista tekijää tai tekijöitä ei eristetty tai tunnistettu, ja on kyseenalaista, olivatko havaitut aktiivisuudet peräisin yhdestä tai useammasta samasta tekijästä vai eri tekijästä.

5 »

Sian aivoja lähtömateriaalina käyttäneet Barde et ai.

(1982, EMBO J. 1:549-553) raportoivat tekijästä, jolle nyt oli annettu nimitys "brain-derived neurotrophic factor", BDNF, aivoista peräisin oleva neurotrofinen tekijä, joka 10 näytti edistävän E10/Ell-kanan alkioiden DRG-solujen elävänä pysymistä. Neurotrofisen aktiivisuuden havaittiin liittyvän erittäin emäksiseen proteiiniin (isoelektrinen piste pl > 10,1), joka liikkui natriumdodekyylisulfaatti- eli SDS-geelielektroforeesissa yhtenäisenä vyöhykkeenä, ja mo-15 lekyylipainon havaittiin olevan 12.3 kD. Puhdistuskertoi-meksi arvioitiin 1,4 x 10 *, mutta saanto oli vähäinen, vain noin 1 μς BDNF:ää saatiin puhdistettua 1,5 kg:sta sian aivoja. Lisäksi, koska puhdistusmenetelmän viimeisenä vaiheena oli preparatiivinen geelielektroforeesi, BDNF:n vai-20 kutusta ei läsnä olevan jäämä-SDS:n vuoksi voitu täysin uudelleennaturoida (Barde and Thoenen, 1985, "Hormones and • · · *;;; Cell Regulation", Voi. 9, Dumont et ai., eds. Elsevier • ·

Science Publishers, pp. 385-390). Havaittiin, että BDNF

» " muistutti korkean emäksisyytensä ja molekyylikokonsa puo- :.*2*5 Iestä hyvin paljon NGF-monoraeeriä. BDNF:llä näytti kuiten- *:**: kin olevan ominaisuuksia, jotka erosivat NGF:n tunnetuista ominaisuuksista siinä, että a) kanan selkäydinganglioko- keissa NGF-vasta-aineilla ei ollut havaittavaa vaikutusta ....: BDNF:n biologiseen aktiivisuuteen, b) BDNF:n ja NGF:n vai- .•;3.0 kutukset näyttivät olevan additiivisia ja c) toisin kuin • · · NGF:llä, BDNF:llä ei havaittu olevan vaikutusta E12-kanan-• * pojan sympaattisiin hermosoluihin. Lisäksi näissä varhai- * « · sissa aivouutekokeissa havaittiin, että näissä lähteissä .·:*. neurotrof inen aktiivisuus näytti kohdistuvan sensorisiin • · · ...?;5 neuroneihin myöhemmässä kehitysvaiheessa kuin NGF:n ollessa • · kyseessä. Erillisissä kanan alkion hermosoluille tehdyissä 9 105342 viljelmissä polykationisella alustalla, esimerkiksi poly-lysiinillä tai polyornitiinillä, BDNF:n havaittiin olevan elävänä pitävä vaikutus yli 30 prosentille E10-11- (alkion 10. tai 11. päivä, embryonic day) DRG-neuroneille, mutta 5 vain vähän vaikutusta samojen hermosolujen elävänä pysymi- * seen vaiheessa E6 (Barde et ai., 1980, Proc. Natl. Acad.

U.S.A. 77:1199-1203 supra). Samanlaisissa olosuhteissa % NGF:n raportoitiin pitävän elävänä 30-40 % E6-DRG-neuro-neista. Mielenkiintoista kyllä, myöhemmin havaittiin, että 10 kun viljely suoritettiin solun ulkopuolisessa soluväliaineen glykoproteiinissa, laminiinissa, sekä NFG että BDNF pitivät elävänä noin 50 % E6-E12-ikäisten kananalkioiden DRG-neuroneista (Lindsay et ai., 1985, Develop. Biol. 112: 319-328). Jälkimmäisessä tutkimuksessa NGF:n ja BDNF:n 15 vaikutusten havaittiin olevan additiivisia kun molempia oli läsnä kyllästettynä pitoisuutena.

Levi-Montalcinin (1966, The Harvey Lectures 60:217-259) varhaisemmissa NGF:n neuronaalista spesifisyyttä koskevissa 20 kokeissa tuotiin esiin, että NGF ei olisi ubikvistinen neu- . rotrofinen tekijä edes sensorisissa hermosoluissa, koska ·;;; NGF: llä ei näyttänyt olevan vaikutusta kanan tiettyihin • · ’···' kallon tuntohermoganglioiden neuroneihin, erityisesti kym- ; : menennen kraniaalisen hermon nodoosiganglion (g. inferius * · •.*2*5 nervi vagi) neuroneihin. Myöhemmät in vivo-tutkimukset m *:**! (Johnson et ai., 1980, Science 210:916-918, Pearson et ai., 1983, Develop. Biol. 96:32-36) ovat osoittaneet, että NGF- deprivointi alkion kehityksen aikana ei vaikuttanut her- ....: mosolujen elossa pysymiseen suurimmassa osassa rotan kallon .*;3.0 sensorisia ganglioita, mutta että samanlainen käsittely • · · voimakkaasti vähensi neuronien määrää hermostopienaperäi-·.:.· sissä sensorisissa hermosolmuissa. Yksityiskohtaisemmissa in vitro-kokeissa (Lindsay and Rohrer, 1985, Develop. Biol.

« .’j’. 112:30-48, Davies and Lindsay, 1985, Develop. Biol. 111:62- ...3:5 72, Lindsay et ai., 1985, J. Cell. Sei. Suppl. 3:115-129) « on osoitettu selvästi, että NGF edistää useimpien hermosto- 105342 10 pienaperäisten sensoristen neuronien elävänä pysymistä, mutta sillä ei ole havaittavaa vaikutusta hermostoplakodi-peräisten kallon sensoristen hermosolujen elävänä pysymiseen.

5

Ensimmäinen osoitus BDNF:n NGF:stä eroavasta neuronaalises-ta spesifisyydestä oli in vitro-koe, joka osoitti puhdistetun BDNF:n pitävän elävänä 40-50 % sensorisista neuroneista, jotka oli erotettu hermostoplakodiperäisistä nodoosi-10 gangliosta kanan alkioista vaiheessa E6, E9 tai E12 (Lindsay et ai., 1985, J. Cell. Sei. Supp. 3:115-129). NGF:llä ei ollut havaittavaa vaikutusta näihin hermosoluihin, yksin tai yhdessä BDNF:n kanssa. Myöhemmin kudosviljelykokeissa osoitettiin, että BDNF näytti ylläpitävän elossa pysymistä 15 ja neuriittien kasvua muissa hermostoplakodiperäisissä sensorisissa ganglioissa, esimerkiksi petrosaaligangliossa, genikulaattigangliossa ja ventrolateraalisessa kolmoishermon gangliossa (g. inferius nervi glossopharyngei, g. geni-culi nervi facialis ja g. trigeminale) (Davies et ai., 20 1986, J. Neurosci. 6:1897-1904), joista yhdenkään ei ole havaittu olevan herkkiä NGF:lie. Missään yllä olevissa ...T kokeissa NGF-vasta-aineilla ei ollut vaikutusta havaittuun BDNF-aktiivisuuteen. Ääreishermoston gangliosta tehdyissä viljelmissä ilmenevän neuroneihin kohdistuvan vaikutuksen :'-^5 lisäksi BDNF:n havaittiin myös edistävän viiriäisen hermos-topienasta peräisin olevien solujen elävänä pysymistä ja neuraalista erilaistumista (Kalcheim and Gendreau, 1988, « ·

Develop. Brain Res. 41:79-86).

« • « ψ ,.ρο Ennen tämän keksinnön syntymistä ei pystytty tuottamaan • « « ’·* * immunisointiin tarvittavia määriä BDNFrää, eikä siis voitu :tuottaa BDNF-vasta-aineita ja verrata anti-NGF-vasta-ainei-• * » den vaikutuksiin eri hermoryhmissä, eikä myöskään suorittaa • · « BDNF/NGF-ristikkäisneutralointikokeita. Kahdessa tuoreessa · * 35 BDNF-tutkimuksessa (Kalcheim et ai., 1987, EMBO J. 6:2871-2873, Hofer and Barde, 1988, Nature 331:261-262) on kuiten- 11 105342 kin tuotu esiin BDNF:n fysiologinen vaikutus linnun ääreishermoston kehityksessä. Jos asetettiin mekaaninen este in ovo E3/E4-DRG:n ja niiden CNS-kohteen välille alkion her-mostoputkeen, useiden DRG-neuronien havaittiin kuolevan 5 (Kalcheim and Le Douarin, 1986, Develop. Biol. 116:451-466). Ajateltiin, että tämän neuronikuoleman syynä voisi olla CNS-peräisen (hermostoputki) neurotrofisen tekijän deprivointi. Myöhemmin havaittiin, että BDNF kiinnitettynä laminiinipäällysteiseen sialastikalvoon pystyi estämään 10 tämän solukuoleman (Kalcheim et ai., 1987, EMBO J. 6:2871-2873). Ruiskuttamalla BDNF:ää kehittyviin viiriäisen muniin havaittiin, että luonnostaan tapahtuva solukuolema nodoosigangliossa väheni; NGF:llä tätä vaikutusta ei ollut (Hofer and Barde, 1988, Nature 331:261-262). Sen lisäksi, 15 että BDNF:n havaittiin vaikuttavan sekä hermostopienasta että hermostoplakodista peräisin oleviin ääreishermoston sensorisiin hermosoluihin, sen huomattiin myös edistävän kehittyvien CNS-neuronien elossapysymistä. Johnson et ai.

(1986, J. Neurosci. 6:3031-3938) toivat esiin tietoa, joka 20 osoittaa BDNF:n edistävän rotan E17-alkioiden viljeltyjen verkkokalvon gangliosolujen elossa pysymistä. Tämä vahvis-···: ti aikaisempia kokeita, joissa oli tullut esiin, että käsi- tellyt elatusaineet ja verkkokalvon gangliosolujen kohde-alueista valmistetut aivouutteet näyttivät edistävän näiden : '2 5 neuronien elossapysymistä (McCaffery et ai., 1982, Ex.

·:·*: Brain Res. 48:37-386, Sarthy et ai., 1983, J. Neurosci.

3:2532-2544, Turner et ai., 1983, Dev. Brain Res. 6:77-83).

Sen lisäksi, että BDNF:n on osoitettu vaikuttavan kehitty- • · .JO viin hermosoluihin viljelmissä, se on osoitettu vaikuttavan · « myös viljeltyihin täysikasvuisten ääreis- ja keskushermos- ▼ · ϊ.·/ ton neuroneihin. BDNF:n, samoin kuin NGF:n, on osoitettu • « · : : stimuloivan aksonien regeneroitumista täysikasvuisen rotan .···, DRG-neuroniviljelmissä (Lindsay, 1988, J. Neurosci. 8:2394- *35 2405), vaikka täysikasvuisten sensoriset hermosolut eivät • näyttäneet vaativan neurotrofisiä tekijöitä in vitro yli 3 105342 12 tai 4 viikkoon. Lisäksi BDNF:n havaittiin täysikasvuisen rotan verkkokalvoviljelmissä edistävän sekä verkkokalvon gangliosolujen elävänä pysymistä että aksonien pituuskasvua (Thanos et al.f 1989, Eur. J. Neurosci. 1:19-26). Taulu-5 kossa I vertaillaan NGF:n ja BDNFrn biologisia vaikutuksia.

» ψ • < · t « · • · * · · · • · • · « « • Il • t • · · • · · • · · « • · « · · i · i • · c • ; > • · · ? • · f • · «

1*1 it < I

• · · « • · · • · · 4 · · • · 13 105342

TAULUKKO I

BDNF:N JA NGF:N BIOLOGISTEN VAIKUTUSTEN VERTAILUA 1 ELOSSA PYS.2

KESKUSHERMOSTO BDNF NGF

* (i) E6 kanan DRG - ++ E10 kanan DRG - ++ E12 kanan sympaatt.neuronit - ++ (ii) E6-E12 kanan DRG ++ ++ E6-E12 kanan nodoosi ++

El2 kanan sympaatt.neuronit - ++ E12 kanan siliaari (g. ciliare) (Lindsay et ai, 1985,supra) (iii) E3-E14 kanan hermot: jugulaari +/++ ++ DM-kolmois +/++ ++ petrosaali +/++ genikulaatti +/++ VM-kolmois ++ vestibulaari mesenkefali ++ (Davies et ai.,1986,supra) (Barde et ai,.1987, Prog.

. Brain Res. 71:185-189)

( I I

II III « <

ÄÄREISHERMOSTO

Il I I

;··: (i) El7 rotan retinaali- ... gangliosolut ++ V · (Johnson et al., 1986, J.Neurosci. 6:3031-3038) • · · * aikajärjestyksessä julkaisupäivämäärän mukaan; · vaikutukset testattuna in vitro 9 f · 2 ei elossapysymistä (-) .··, kohtalainen elossapysyminen ( + ) *...· hyvä elossapysyminen (++) • · · · · · · 105342 14 2.3.2. Aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän neu-ronaaliset kohteet Ääreishermoston ganglioiden sensoristen hermosolujen on 5 havaittu syntyvän kahdesta erillisestä tilapäisestä alkeis-rakenteesta, nimittäin hermostopienasta ja hermostolevyistä 1. -plakodeista. Hermostopienasta näyttävät kehittyvän autonomisten ganglioiden ja spinaalisten tuntohermoganglioi-den (DRG) sekä neuroneita että satelliittisoluja. Hermos-10 topienan ja hermoplakodien osuutta kallohermon tuntohermo-ganglioiden muodostumisessa on tutkittu käyttämällä viiri-äis-kanatransplantaatiosysteemiä, jonka on kehittänyt Le Douarin (Le Douarin, 1973, Develop. Biol. 20:217-222, Noden 1978, Develop. Biol. 67:313-329, Narayanan and Narayanan, 15 1980, Anat. Rec. 196:71-82, Ayer-Le Lievre, and Le Douarin, 1982, Develop. Biol. 94:291-310, D'Amico-Maratel and Nodem, 1983, Am. J. Ant. 166:445-468). Kuten tulee esiin artikkelista Lindsay at ai., 1985, J. Cell. Sei. Supp. 3:115-129, nykyään uskotaan, ainakin linnuilla, että kallon VII, IX ja 20 X kallohermojen distaaliganglioiden (petrosaali-, geniku-laatti- ja nodoosigangliossa) neuronit sekä Vili kallohermon vestibuloakustinen kompleksi kehittyvät yksinomaan her- ·;· moplakodista. V kallohermon kolmoishermoganglio sisältää « · · sekä hermostopienasta että hermostoplakodista peräisin ole- • · · ...25 via hermosoluja (maksillomandibulaarisen lohkon ventrolate-• · .·. : raalisella puoliskolla pääosa plakodiperäisiä neuroneja) • «· ’ kun taas kaikkien kallon ganglioiden satelliittisolujen on • « havaittu olevan peräisin hermostopienasta.

• · · • · « 30 In vitro-kokeissa, joissa on käytetty sekä kudosviljelyä tai soluilla suoritettuja että erillisiä, neuronirikastet- ··» : tuja spinaalisten ja kraniaalisten sensoristen neuronien . .·. viljelyä, on havaittu, että hermostopienaperäiset sensori-• * » ... set hermosolut ovat NGF-herkkiä; sen sijaan hermostoplako- * i ’’$5 diperäiset neuronit (myös kolmoishermoganglion ventrolate- v : raalisen osan neuronit samoin kuin kaikki petrosaali-, ge- _ · • · 105342 15 nikulaatti- ja nodoosiganglioiden hermosolut) eivät näytä reagoivan mitenkään NGF:ään koko alkionkehityksen aikana.

Vaikka sekä plakodista että hermostopienasta peräisin olevat sensoriset neuronit eroavat vaatimuksissaan ja reagoin-5 nissaan NGF:ään, molempien on havaittu (Taulukko I) reagoivan BDNF:n ylläpitävään ja neuriitteja edistävään aktii-v visuuteen (Lindsay et ai., 1985, J. Cell. Sei. Supp. 3:115- 129, Lindsay et ai., 1985, Develop. Biol. 112:319-328, Kal-cheim and Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41:79-86).

10 Tebar ja Barde (1988, J. Neurosci. 8:3337-3342) kokeilivat radioaktiivisesti merkityn BDNF:n sitoutumista kanan alkion DRG-neuroneihin. Tulokset vahvistivat kahden BDNF-resepto-rityypin olemassaolon, joista toisen BDNF-affiniteetti on voimakas, toisen heikko. Sympaattisen hermoston neuroneis-15 sa ei havaittu voimakasta affiniteettiä.

BDNF:n tunnettuja neuronaalisia kohteita tutkittiin edelleen (Barde et ai., 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189).

Ennen tämän keksinnön tekemistä BDNF:ää syntetoivien solu-20 jen tunnistaminen ei ole ollut mahdollista, koska ei ole ollut olemassa BDNF-spesifistä nukleiinihappoa tai vasta-ainekoetinta. Yritykset valmistaa polyklonaalisia tai mo-noklonaalisia BDNF-vasta-aineita ovat epäonnistuneet. Kos-ka vasta-aineita ei ole löydetty, BDNF:ää ei ole voitu • ”2j5 kloonata molekyylitasolla, määritellä BDNF:n kehittyvissä .’.J hermosoluissa ehkäisevää fysiologista vaikutusta in vivo, m · ....: kvantifioida BDNF:ää kudoksissa immunokokein eikä paikal- • · ...p listaa BDNF:ää immunosytokemiaa käyttäen.

• · » • · • · · * · · • · · 9 9 9 9 · • « « • · · · • · · 16 105342

TAULUKKO II

YHTEENVETO BDNF-HERKISTÄ JA EI-HERKISTÄ NEURONEISTA A. BDNF-herkät neuronit I. Kanan sensariset hermostopienaperäiset neuronit: 5 (a) selkäydinhermon takajuuren gangliossa (b) kaulagangliossa (c) dorsomediaalisessa kolmoishermon gangliossa (d) inesenkefalisessa kolmoistumakkeessa ** 10 II. Kanan sensoriset ektodermiplakodiperäiset neuronit: (a) nodoosigangliossa (b) vestibulaarigangliossa (c) petrosaaligangliossa (d) genikulaattigangliossa 15 (e) ventrolateraalisessa kolmoishermon gangliossa III. Rotan verkkokalvon gangliosolut * Barde et ai., 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189 ** Davies et ai., 1986, Nature 319:497-499 .20 · 3. Yhteenveto keksinnöstä • · • · · .;··· Tämän keksinnön kohteena ovat nukleiinihapposekvenssit, .·. ] jotka koodaavat aivoista peräisin olevaa neurotrofista te- • · kijää (brain derived neurotrophic factor, BDNF) ja menetel- • · ...f 25 mä olennaisesti puhtaan proteiinin tai peptidi fragment in a « · * valmistamiseksi. Tämän keksinnön avulla voidaan ensimmäistä kertaa valmistaa niin suuria määriä BDNF:ää, että anti- *#f ' * · *-··’ BDNF-vasta-ainetuotanto ja BDNF:N diagnostinen ja terapeut- I i ·...’ tinen käyttö ovat mahdollisia.

:t,; 30 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa- '··' tenttivaatimuksissa.

» • Il • · · • · 17 105342

Keksinnön eri toteutusmuodoisssa keksinnön mukaisia BDNF-nukleiinihappoja, -proteiineja, -peptidejä, -johdannaisia tai -vasta-aineita voidaan käyttää useiden neurologisten tautien ja häiriöiden hoidossa, erityisesti diagnosoitaessa 5 ja hoidettaessa sensoristen neuronien häiriöitä ja verkkokalvon rappeutumaa. Erityisissä keksinnön mukaisissa toteutusmuodoissa BDNF-nukleiinihappoja ja BDNF-geenituotteita voidaan lisäksi käyttää diagnosoitaessa ja hoidettaessa varhaishermosolukasvaimia, Parkinsonin tautia ja Alzheime-10 rin tautia. Keksinnön mukaisten erityisten toteutusmuotojen mukaan BDNF-geenituotteita voidaan käyttää myös edesauttamaan implantaattien istutusta hermokudokseen tai vaihtoehtoisesti edistämään hermojen reaeneroitumista traumoista, kudoskuoliosta, tulehduksesta johtuvista tai leikkauksen 15 jälkeisistä vammoista.

Keksinnön avulla voidaan saada aikaan lääkekoostumuksia, jotka sisältävät tehoavan määrän BDNF-geenituotteita tai vaihtoehtoisesti vasta-aineita BDNF-geenituotteille, ja joita voidaan käyttää erilaisten neurologisten tautien ja 20 häiriöiden diagnosointiin ja hoitoon.

Koska keksinnön avulla saadaan aikaan täydellinen BDNF- nukleotidijakso, on mahdollista myös vertailla BDNF- ja NGFgeenejä, identifioida homologisia alueita ja määritellä .···. BDNF/NGF-geeniperhe. Tämän keksinnön kohteena on siis myös ”1. 25 menetelmä BDNF/NGF-geeniperheen uusien jäsenien tunnistami- . . seksi. Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää uuden • · · *· 1 BDNF/NGF-geeniperheen ei-NGF ja ei-BDNF-jäsenen tunnistami- . 1 ’ seen. Hakemuksessa on esitetty myös BDNF/NGF-geeniperheen ’ uusia jäseniä, jotka on tunnistettu keksinnön mukaista me- τ 30 netelmää ja geenituotteita käyttäen.

• · · • · • · • · « · • · « • · · · 105342 18 3.1. Lyhenteitä ja määritelmiä

BDNF aivoista peräisin oleva neurotrofinen tekijä hBDNF ihmisen BDNF

5 CAT koliiniasetyylitransferaasi CNS keskushermosto DRG selkäydinhermon takajuuren gangliot (ganglio) EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo NGF hermokasvutekijä 10 PBS fosfaattipuskuroitu suolaliuos PCR polymeraasiketjureaktio PNS ääreishermosto SDS natriumdodesyylisulfaatti

Tris tris(hydroksimetyyli)aminometaani 15 4. Kuvioitten kuvaus

Kuvio 1 : Sian preproBDNF-cDNA nukleotidisekvenssi ja päätelty aminohapposekvenssi. Kuviossa näkyy kahden limittäi-20 sen cDNA-kloonin täydellinen sekvenssi. Mikrosekvensointia (taulukko III) käyttäen saadut peptidijaksot on alleviivattu. Ainoa N-glykosylaatiomyötäsekvenssi (consensus sequen-ce) on alleviivattu kahteen kertaan. Kypsän BDNF-sekvens-sin alku on merkitty sulkumerkein (double carat) .

25 • · .·. : Kuvio 2 : NGF- ja BDNF-sekvenssien vertailua. Alueet, • « ....: joissa on enemmän kuin kaksi aminohappoa samassa kohdassa, • · on merkitty. Jaksot alkavat kypsien proteiinien ensimmäi- • · · sillä aminohapoilla ja päättyvät viimeisiin ennen lopetus- * ^ 30 kodoneja. BDNFrllä ja eri NGF:illä on viisikymmentäyksi ' ’ homologista aminohappoa (Schwarz et ai., 1989, J. Neu- M» w V rochem. 52:1203-1209), 6 kysteiinijäämää mukaanlukien.

* · · • · « ,···, Kuvio 3 : Autoradiografiakuva, southern blotting-menetelmä.

35 EcoRI-leikattu ihmisen, apinan, rotan, hiiren, koiran, leh- • · « « · · • · 19 105342 män, kaniinin, kanan ja hiivan genominen DNA, hybridisoitu-na 32p-leimattuihin NGF- ja BDNF-koettimiin.

Kuvio 4 : Northern Jbiot-analyysikuva. Kaikista kudoksista 5 käytettiin 20 pg kokonais-RNArta raitaa kohden, hybridisaatio 3 2p-leimattuun hiiren cRNA-BDNF-koettimeen. Aivokudoksessa on nähtävissä voimakas signaali noin kohdassa 1,45 kB, muissa seitsemässä analysoidussa kudoksessa ei mitään.

10 Kuvio 5 : Ihmisen BDNF-cDNA -sekvenssi, päätelty aminohap posekvenssi sekä vertailuun käytetyt sian, rotan ja kanan DNA-sekvenssit.

Kuvio 6 : BDNF-ekspressio, plasmidi PCMVl-pBDNF.

15

Kuvio 7 : a) ELISA-määritystä käyttäen suoritettu antiseerumin sitominen B5-peptidiin, antiseerumin sarjalaimennok-set b) kvantitointi sitomalla eri antiseerumien 1:500 laimen-20 nokset 50 ng:aan BDNF:ää.

Kuvio 8 : Immunohistokemiallisen värjäyksen tulokset ty- rosiinihydroksylaasilla BDNF-käsitellyssä (viivoitetut pyl- : väät) ja verrokkikäsitellyssä (yksiväriset pylväät) vent- •: · * |2 5 raalimesenkef alonvil jelmissä.

• · « • ·

Kuvio 9 : Dopamiinioton määrä ventraalimesenkefalonviljel-missä. Viljelmät, joissa on käytetty BDNFrää on merkitty viivoitetulla pylväällä, verrokkiviljelmät yksivärisellä.

' <>>;30

Kuvio 10 : a) BDNF:n vaikutus CAT-positiivisiin soluihin • · · '·[ * alkion etuaivojen kolinergisten hermosolujen viljelmissä : b) etuaivojen kolinergisten hermosolujen viljelmiä, tiheys · * 260 000 solua per kuoppa (yksivärinen pylvät) tai 150 000 .:.35 solua per lähde (viivoitettu pylväs), käsiteltiin 150 • · · ] ng/ml:lla NGF:ää. Verrattiin CAT-immunopositiivisten solu-• « 105342 20 jen määrää NGF-käsitellyissä versus käsittelemättömissä soluissa.

Kuvio 11 ϊ Muutokset CAT-entsyymiaktiivisuuden määrässä 5 pikomooleina katalysoitua substraattia minuutissa, funktiona BDNF-pitoisuudelle etuaivon kolinergisten hermosolujen viljelmissä.

%

Kuvio 12 : Astrogliasoluviljelmiä, konfluenssi noin 60 %, 10 käsiteltiin joko a) epidermikasvutekijällä tai b) BDNF:llä 42 tuntia, ja inkuboitiin sitten [3H]-metyylitymidiinillä.

Sisään kulkeutuneen 3H:n määrä mitattiin suhteessa EGF- ja BDNF-pitoisuuksiin.

15 Kuvio 13 : Southern blot-koe EcoRI-estetyllä kanalla, hiirellä, rotalla, hybridisoituna BDNF/NGF-koettimeen R1B/2C.

NGF:n ja BDNF:n genomisten EcoRI-fragmenttien asemat on merkitty: N ja B.

20 Kuvio 14 : Sekvenssivertailu, NGF, BDNF ja uusi BDNF/NGF- geeniperheen jäsen, joka on tunnistettu käyttämällä PCR:ää, hiiren DNA, Box 3/Box 4 -alukkeet: uusi geeni [tässä mer- .:. kitty M3/4:ksi], jota kutsutaan myös nimikkeellä Neuro- .···. trophin-3 (NT-3), ja josta on näkyvillä vain koodaavan sek- ”25 venssin säie, päätelty aminohapposekvenssi, esitettynä suh-• · . . teessä kypsään hiiren NGFrään ja kypsään sian, rotan, hii-• · * 'ren tai ihmisen BDNF:ään. Katkoviivalla on merkitty kohta, [ ’ jossa yhden NGF-kodonin poistoa käytetän optimoimaan rin-• · « *·* ' nastusta BDNF:ään ja M3/4:ään. Sulkumerkit osoittavat yh- y 30 täläisyyksiä aminohapposkevensseissä ja/tai konservatiivi-sissa aminohapposubstituutioissa.

Iti

Kuvio 15 : Norhern blot-koe: RNA erilaisista ihmisen tuuli; moriperäisistä solulinjoista hybridisoituna ihmisen BDNF- "35 koettimeen.

• · « • · 21 105342

Kuvio 16 : BDNF-mRNA-pitoisuuksien depolarisoiva vaikutus hippokampuksen neuroneihin.

a) BDNF-mRNA -ekspressio ajan suhteen primaarisissa hippo-5 kampuksen neuroneissa, läsnä 50 mM KC1. Solukokona!s-RNA uutettiin 0,5 x 10* -soluista, glykoksyloitiin ja analysoitiin elektroforeesia käyttäen, 1,3-prosenttinen agaroosi-geeli (Biziere, K. and Coyle, T., Neurosci., 1978, Lett.: 8:303, McGeer et ai., 1978, Brain Res. 139:381). Hybond N-10 suodattimiin siirretty RNA hybridisoitiin 32p-leimattuun cRNA-koettimeen (spesifinen aktiivisuus 10’ cpm μg) , joka on spesifinen hiiren BDNF:lie ja jota tuotetaan run-off -transkriptiolla in vitro. Kaksi ylintä vyöhykettä (4 ja 1,5 kB) vastaavat BDNF-mRNA:ta; molemmat BDNF-vyöhykkeet 15 (4kb ja 1,5 kb) ovat RNAse-A-resistenttejä ja edustavat kahta eri transkriptiota (joiden säätely kuitenkin näyttää tapahtuvan samaan tapaan) ja alempi (700 bp) vyöhyke 10 pg lyhyttä BDNF-mRNA talteenottostandardi(ainett)a (recovery standard), jota lisättiin näytteisiin ennen RNA-uuttoa.

20 b) Kalsiumriippuvuus. Neuroneita inkuboitiin 3 tuntia normaalissa viljelyväliaineessa (culture medium, CM), muunnellussa väliaineessa ilman kalsiumia (-Ca) tai väliaineessa, jossa oli 10 μΜ nifedipiiniä (NtF). 50 mM KCl lisäyskoh- ,···. dissa merkintä (+K).

. . Kuvio 17 : NGF-mRNA-pitoisuuksien lisääntyminen hippokam-• · · ' l puksen neuroneissa kaliumia ja kainiinihappoa käytettäessä. Neuroneita inkuboitiin 3 tuntia kontrolliväliaineessa (C), • · · \ f r • f « 50 mM KCl-määrän kanssa (K+) tai 25 μΜ kainiinihappomäärän 30 kanssa (KA). RNA uutettiin ja NGF-mRNA-pitoisuudet määri-*!*" tettiin kvantitatiivisella PCRrllä (11). Arvot ovat kes-: : : kiarvoja ± SEM (n = 6).

Kuvio 18 : Annosvastekäyrä kainiinihappovaikutukselle.

"'35 Hippokampuksen neuroneita inkuboitiin 3 tuntia eri kai-: niinihappopitoisuuksien läsnäollessa. RNA uutettiin ja 105342 22 analysoitiin kuvion 16 tapaan. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta kokeesta.

Kuvio 19 : BDNF- ja NGF-mRNA-pitoisuuksien lisääntyminen 5 ajan suhteen kainiinihappokäsittelyssä. Solukokonais-RNA uutettiin ja analysoitiin kuten kuviossa 16 hippokampukses-ta (A) tai korteksista (B) osoitettuina aikoina (tunteja) intraperitoneaalisen kainiinihapporuiskutuksen (12 mg/kg) jälkeen. Yksi diatsepaamiannos (10 mg/kg) injektoitiin 90 10 minuuttia kainiinihapon jälkeen (molemmat BDNF-vyöhykkeet (4 kb ja 1,5 kb) ovat RNAse A-resistenttejä ja edustavat kahta eri transkriptiota (joiden säätely kuitenkin näyttää tapahtuvan samaan tapaan). Näkyvissä ovat arvot 1,5 Kb BDNF-mRNA (o) ja 1,3 Kb NGF-mRNA (o). Samanlaista lisään-15 tyrnistä oli havaittavissa 4 Kb BDNF-mRNA:ssa. Annetut arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta neljään kokeesta.

Kuvio 20 : Antikonvulsanttien vaikutus kainiinihappoindu- soidussa BDNF-mRNA-ekspressiossa. Rottiin ruiskutettiin 20 intraperitoneaalisesti diatsepaamia (10 mg/kg) (DZ), MK- 801:tä (lmg/kg) (MK) tai ketamiinia (20 mg/kg) (KET) 15 minuuttia ennen kainiinihapporuiskutusta (12 mg/kg) (+KA) · tai suolaliuosta (verrokki). Kolmea tuntia myöhemmin hip- pokampuskudosta käytettiin kokonais-RNA:n valmistamiseen '"25 kuvion 16 tapaan. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta • · kokeesta.

• ·

Kuvio 21 : Septaalisoluviljelmät.

A-F. Faasikontrasti-mikrovalokuva solun kasvusta viljelmäs- ....50 sä ajan kuluessa. Solut levitettiin maljoihin, tiheys 1,3 • · x (10)5 solua/cm*, ja pidettiin 5 HS/NS:ssä kuten teksistä ♦ « · ’ ilmenee. Valitut ajankohdat olivat 1 (A, B), 2 (C, D) ja 4 :.i.: (E, F) päivää. Solutyyppispesifisiä merkkiaineita käytet- tiin tunnistamaan soluryhmiä, AChE-histokemiallisesti vär-.:\35 jättyjä neuroneja (G, H) sekä NGF-reseptori-immunopositii-visia neuroneja (I). Mittapylväs (scale bar) = 25 μπι.

105342 23

Kuvio 22. Vertailu erillisten septaalisolujen vasteesta BDNF- tai NGF-käsittelyyn AChE-solumäärään perusteella.

A. Vertailu vasteesta BDNF:ään (25 ng/ml), NGF:ään (50 ng/ml) tai molempiin ligandeihin eri levitystiheyksillä.

5 B. Vertailu kolinergisten neuronien vasteesta erilaisiin BDNF- tai NGF-pitoisuuksiin (0-50 ng/ml). Tulokset saatiin soluista, joita oli kasvatettu seerumia sisältävässä väliaineessa 11-12 päivää. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM 6-9 määrityksestä.

10

Kuvio 23. Pylvästaulukko vaikutuksesta, joka seuraa BDNF-tai NGF-lisäyksen viivyttämisestä erillisissä septaalivil-jelmissä.

BDNF:ää (50 ng/ml) tai NGF:ää (50 ng/ml) lisättiin erilli-15 siin soluviljelmiin viivytyksen ollessa 5-6 tuntia (+12), 5 päivää (-5/+7) tai 7 päivää (-7/+5). Viljelmiä pidettiin yllä 12 päivää. Solut pisteytettiin AChE-positiivsten his-tokemiallisen värjäyksen avulla. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM 4-5 määrityksestä.

20

Kuvio 24. Pylvästaulukko BDNF:n tai NGF:n kyvystä säädellä NGF-reseptori-immunopositiivisten solujen lukumäärää.

NGF-reseptorin immunokäsittely (immunoslating) suoritettiin ...25 käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta 192-IgG, laimen-• · .·. j nus 1:1000. Erilliset septaalisolut levitettiin maljoihin • · · tiheyteen 1,3 x (10)5 solua cm2, ja niitä käsiteltiin yhtä-... jaksoisesti 12 päivää. Vertailtiin NGF-saturaatioannosta » · i '* * ja erilaisia BDNF-annoksia (0-100 ng/ml). Esitetyt tulok- 30 set ovat keskiarvoja ± SEM, n on 4.

• · * · · · V : Kuvio 25. Septaalisten kolinergisten neuronien annosvaste- . käyrä BDNF:n (A) ja NGF:n (B) indusoimaan CAT-aktiivisuu- .···, teen.

•35 Viljelmät levitettiin polyornitiini- ja laminiinipäällyste-« · · : tyissä kuopissa ja pidettiin 12 päivää 5 HS/N3:ssa. Solut 105342 24 altistettiin BDNF:lie tai NGF:lle 5-6 tuntia levityksen jälkeen. Tekijät uudistettiin joka 3. päivä kun väliaine vaihdettiin. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, n on 5-6 määritystä.

5

Kuvio 26. BDNF:n ja NGF:n annosvastevaikutus AChE-entsyy-miaktiivisuuteen.

Rotan septaalisia kolinergisia neuroneja kasvatettiin seerumia sisältävässä väliaineessa hormonilisäyksin 12 päivää.

10 Soluja käsiteltiin BDNFtllä (avoimet neliöt) ja NGF:llä (täydet neliöt) samaan tapaan kuin kuviossa 25. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja + SEM, n on 6-9. Käsittelemättömien viljelmien AChE-aktiviteetti oli 16,4 ±2 nmol/h/kuop-pa.

15

Kuvio 27. BDNF:n indusoima lisäys CAT-entsyymiaktiivisuu-dessa ajan suhteen verrattuna NGF:ään.

Aikavaatimus (time requirement) CAT-aktiivisuuden stimuloinnissa suoritettiin soluilla, joiden viljelytiheys oli 20 2,3 x (10)5 solua/cm2 ja joita kasvatettiin seerumia sisäl tävässä väliaineessa, jossa oli lisäksi hormonilisäys ja eksogeenisiä tekijöitä, eri pituisia ajanjaksoja. Solut altistettiin alun alkaen BDNF:lie (avoimet neliö) tai NGF:- ,···. Ile (täydet neliöt) 5-6 tuntia maljoihin levityksen jäi-* · ”[25 keen. Tulokset osoittavat aktiivisuusprosentteja määritet-• · . . tynä käsitellyissä viljelmissä versus käsittelemättömissä • · * ’· *5 viljelmissä (n=6, BDNF 12 päivää n=3).

• « t»f * Kuvio 28, Vertailukoe gliasolujen vaikutuksista BDNF:n 30 kykyyn indusoida CAT-aktiviteettia.

”*’! Septaalisoluja viljeltiin levitystiheydellä 2,3 x (10)5so-:T: lua/cm2. 5-6 viljelytunnin jälkeen väliaine vaihdettiin joko seerumittomaan tai seerumia sisältävään väliaineeseen, • · t jotka molemmat lisäksi sisälsivät 1% N3, ks. tarkemmin •;*35 tekstissä. Lisättiin sytosiiniarabinosiiniä (luM) 24 tun-·' niksi astrosyyttien määrän edelleen vähentämiseksi, vil-• 105342 25 jelmiä ylläpidettiin 12 päivää. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM 4 määrityksestä.

Kuvio 29. Pylväsdiagrammi BDNF- tai NGF-käsittelyn vaiku-5 tuksesta affiniteettiherkän koliinin oton tasoon.

Koliininottokokeissa käytettiin soluja, joita pidettiin elossa 11 päivää, viljelytiheys 1,3 x (10)5 solua cm2.

BDNF:ää (50 ng/ml) tai NGF:ää (50 ng/ml) oli läsnä koko viljelyajan. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM 5 määrityk-10 sestä BDNF:lie ja 10 määrityksestä NGF:lle.

Kuvio 30. Ihmisen BDNF:n trypsiinillä ja endoproteinaasi Arg-C:llä entsymaattisesti pilkottujen 35S-leimattujen reaktiotuotteiden erottelu SDS-PAGE-menetelmällä.

15

Kuvio 31. Graafinen esitys DRG-bioanalyysistä, jossa verrataan käsittelemätöntä CHO-hBDNF:ää endoproteinaasipilkot-tuun CHO-hBDNF:ään. Neuriittien kasvu on arvioitu numeroin 0-5, jossa 5 on maksimaalinen bioaktiivisuus.

20

Kuvio 32. Faasikontrasti- (A) ja kirkaskenttämikrovaloku-vat (B, C) erillisistä E14-rotan ventraalisten mesenkefa-..11’ lisolujen viljelmistä värjättynä 9 viljelypäivän jälkeen, monoklonaaliset vasta-aineet tyrosiinihydroksylaasille • 1« -:--:25 (TH).

t · * » » • · t • · A ja B. Faasikontrasti- ja kirkaskenttävalokuvat samasta • · ·.· kohteesta kertovat vähäisestä TtT-neuronien määrästä näissä

• · · T

• m · viljelmissä. Vain yksi TH*-neuroni (nuolet) näkyy kentäs-,30 sä, jossa on useita faasikirkkaita neuroneja, joilla on ] ' pitkät neuriitit. Ei-neuronaalisa soluja on vähän, morfo- ♦ · · V* logisin menetelmin tai GFAP-värjäyksessä (ei esitetty).

« · « • · « · C. Kirkaskenttävalokuva, jossa näkyy kaksi TH*-neuronia • I · 35 (pienet nuolet) kentässä, joka sisältää noin 98 faasikir- • « » « · « 105342 26 kasta solua, jotka ovat muodoltaan neuronaalisia. Mitta-pylväs = 100 IM.

Kuvio 33. Voimakkaasti suurennetut mikrovalokuvat 6 päivää 5 viljellyistä E14-rotan ventraalisten mesenkefalisolujen viljelmistä. Nähtävissä on erimuotoisia TH*-neuroneja, joissakin ekstensiivistä neuriittien kasvua ja erittäin selviä kasvukartioita (A,B). Viljelmät perustettiin ja värjättiin kuten kuviossa 32. Mittapylväs * 25 μιιι.

10

Kuvio 34. BDNF edistää ΤΗ*-, dopaminergisten ja mesekefa-listen neuronien annosriippuvaista elävänä pysymistä ilmenee yli 3 päivää kestävissä viljelyjaksoissa.

15 A. TH*-neuronien määrän vertailua E14-rotan ventraalisten mesenkefalisolujen viljelmissä, joita ylläpidettiin BDNF:n avulla (viivoitettu pylväs) tai ilman BDNF:ää (yksivärinen pylväs). Käsitellyissä viljelmissä BDNF:ää lisättiin (50 ng/ml) kerran 2. viljelypäivänä. Verrokkiviljelmien ja 20 käsiteltyjen viljelmien välillä ei ollut havaittavissa eroa 3. päivänä, mutta 8. päivänä TH*-neuronien lukumäärä oli BDNF-käsitellyissä viljelmissä 1,8-kertainen verrokkivil-jelmiin verrattuna. Arvot ovat keskiarvoja rinnakkaisnäyt-

V

teistä.

• I w « ’"25 «»#·# ] ] B. BDNF:n vaikutus TH’-neuronien elävänä pysymisen lisää-

I I I

*· ·: miseen on annosriippuvaista.

TH*-neuronien lukumäärä määritettiin rinnakkaisviljelmistä • · · ·.· 8 päivän jälkeen viljelmistä, joissa ei ollut BDNF:ää tai 30 joissa oli 2. päivänä lisättyä lisääntyviä BDNF-pitoisuuk-*:*·: siä sisältävää väliainetta.

i»> • · · • · * C. NGF:llä ei ole vaikutusta TH*-neuronien elävänä pysymi- « · · seen.

« · I

*"•35 BDNF-spes if isyyden selvittämiseksi viljelmiä kasvatettiin myös NGF:n läsnäollessa (50 ng/ml) tai ilman sitä 8 päivää « t · 105342 27 ja analysoitiin TH*-solujen osalta. Toisena päivänä lisätty NGF ei lisännyt TH*-neuronien elävänä pysymistä viljelmissä, jotka tutkittiin 6. tai 8. päivänä. Tulokset ovat keskiarvoja rinnakkaismaljoista.

5

Kuvio 35. Toistuvat BDNF-annokset lisäävät edelleen TH*-neuronien elävänä pysymistä verrattuna yhteen ainoaan li-säykseen 2. päivänä.

Viljelmät valmistettiin tekstissä esiin tulevalla tavalla.

10 Ihmisen yhdistelmä-BDNF puhdistettiin C0S-M5 -solujen su-pernatanttiosasta. Viljelmiä käsiteltiin joko käyttämällä yhtä BDNF-lisäystä (SA: single addition; viivoitetut pylväät) (50 ng/ml) 2. päivänä, käyttämällä toistuvia BDNF-lisäyksiä (50 ng/ml) 1., 2., 4., 6. ja 8. päivänä (MA: mul-15 tiple addition; yksiväriset pylväät), tai kasvatusta ilman BDNF:ää (verrokki; avoimet pylväät). Osoitettuina aikoina viljelmät fiksoitiin ja värjättiin TH-immunoreaktivisuuden selvittämiseksi. Täydennys toistuvin BDNF-lisäyksin johti 2,7-kertaiseen TH~-neuronien määrän lisääntymiseen 11. päi-20 vänä verrokkeihin nähden, maksimilisääntyminen yhtä BDNF-lisäystä käyttämällä hieman vajaa 2-kertainen 11 päivän jälkeen. Tulokset, tyypillisesti useimpien kokeiden ta-paan, olivat keskiarvoja rinnakkaisnäytteistä.

««· • « • « f · · ·;···25 Kuvio 36. BDNF:n viivytetty lisääminen ei lisää TH’-neuro-nien lukumäärää yhtä paljon kuin 2. päivänä lisätty BDNF.

• ·

Viljelmät valmistettiin tekstissä esiin tulevaan tapaan, • · poikkeuksena vain eksogeenisen BDNF:n lisäysaika. Kaikissa • · · viljelmissä vaihdettiin seerumittomaan väliaineeseen 2.

.30 päivänä, ja BDNF (50 ng/ml, sian aivon BDNF) lisättiin yh- dellä kertaa 2., 5. tai 7. päivänä (CD2, CD5, CD7). Rin- V* nakkaisviljelmistä määritettiin TH‘-neuronien lukumäärä 6., « : 8., ja 10. päivänä. Tässä kokeessa yhdellä BDNF-lisäyksel-

IM

lä 2. päivänä päästiin 3-kertaiseen TH*-neuronien lukumää- .:.35 rään 10. päivänä. Kun BDNF:ää lisättiin myöhemmin, 5. päi-• * « ’·* [ vänä, TH‘-neuronien lukumäärä 10. päivänä verrokkiin nähden

• I

105342 28 oli suurempi, mutta alle 2-kertainen, eikä tämä ero TH*-neuronien lukumäärässä käsitellyissä ja verrokkiviljelmissä lisääntynyt viljelyäjän pidentymisen myötä. Verrokki: avoin pylväs? BDNF-lisäys 2 päivänä: pilkutettu pylväs? 5 BDNF-lisäys 5. päivänä: täytetty pylväs? BDNF-lisäys 7. päivänä: vinoviivoitettu pylväs.

Kuvio 37. Annosriippuvainen BDNF-vaste affiniteettiherkän GABA-otossa hippokampusviljelmissä.

10 Osittain puhdistettua nBDNF:ää (COS-M5 supernatantista ro-tophor-puhdistettu) lisättiin viljelmiin eri laimennoksina.

BDNF 1 x 10'* -laimennoksen havaittiin saavan aikaan maksimaalisen neuriittien kasvua edistävän vaikutuksen E8-kanan-poikien DRG-ganglioissa. Affiniteettiherkän 3H-GABA:n otto 15 mitattiin 8 päivää BDNF in vitro -käsittelyn jälkeen.

Kuvio 38. BDNF suojaa viljeltyjä nigraalisia dopaminergi-siä neuroneja MPP*:n neurotoksisilta vaikutuksilta.

20 Viljelmissä käytettiin rotan E14-alkioita tapaan, jota kuvataan kuviossa 1. 24 in vitro -tunnin jälkeen viljelyvä- liaine vaihdettiin seerumittomaan. Kolmen viljelypäivän « · jälkeen viljelmät jaettiin neljään ryhmään, jotka muodos- « · · tuivat kuudesta 35 mm:n maljasta. Yhtä ryhmää pidettiin ':"··25 verrokkiryhmänä, muihin lisättiin joko (i) emäksistä fibro- blastikasvutekijää, 10 ng/ml (naudan aivon bFGF, Boehrin- ·;··· ger-Mannheim), (ii) hiiren NGF:ää, 50 ng/ml, tai (iii) BDNF:ää, 50 ng/ml. Viljelmiä pidettiin yllä vielä 24 tun- tia ja sitten 3 maljaa jokaisesta ryhmästä altistettiin 48 ,,,,ρο tunniksi 1 μΜ:11β MPP*:aa (Research Biochemicals, Inc, Na-• * ... tick, MA). Kaikkiaan 6 päivää kestävän kokeen lopuksi kai-• · · \ kista viljelyastioista tutkittiin TH-immunoreaktiivisuus, i M.' ja jokaisesta ryhmästä määritettiin ΤΗ'-solujen lukumäärä.

Tuloksissa näkyvä TH*-solujen lukumäärä MPP*-käsittelyn .•••J35 jälkeen on laskettu prosentteina TH*-neuronien lukumäärästä • · · | vastaavissa viljelmissä, joita ei altistettu MPP*:lle.

« · 105342 29

Kaikki arvot ovat keskiarvoja ± SEH kolmesta rinnakkaisesta viljelmästä.

5. Yksityiskohtainen keksinnön kuvaus 5 Tämän keksinnön kohteena ovat nukleiinihapposekvenssit, jotka koodaavat aivoista peräisin olevaa neurotrofista tekijää (BDNF), sekä BDNF-proteiini, -peptidifragmentit ja -johdannaiset, joita on tuotettu näitä nukleiinihapposek-10 venssejä käyttäen runsaasti. Keksintö koskee myös BDNF-lääkekoostumuksia ja terapeuttista käyttöä, sillä nyt voidaan ensimmäistä kertaa valmistaa tarpeeksi suuria määriä olennaisesti puhdasta BDNF:ää kliinistä käyttöä varten.

Keksinnön kohteena ovat lisäksi vasta-aineet BDNF:lie tai 15 sen fragmenteille, sillä keksinnön avulla on luotu tarpeeksi iramunogeenejä. Koska nyt on mahdollista vertailla BDNF:n ja NGF:n nukleiinihapposekvenssejä, tämän keksinnön tarkoituksena on myös identifioida BDNF:n ja NGF:n homologisia nukleiinihapposekvenssialueita ja sen avulla määri-20 teliä BDNF/NGF-geeniperhe. Tämän keksinnön kohteena on myös menetelmä BDNF/NGF-geeniperheen uusien jäsenien tun-nistamiseksi ja eristämiseksi.

• ·

Kuvauksen selventämiseksi, ei-rajoittavasti , keksintöä ku-:'·.·25 vataan käyttäen seuraavanlaista jaottelua: 9 .·:·. (i) BDNF:n puhdistaminen (ii) BDNF-bioanalyysit . (iii) BDNF-proteiinin mikrosekvensointi ,,.30 (iv) BDNF:ää koodaavan DNA:n kloonaus ’·] ' (v) BDNF-ekspressio (vi) BDNF-geenit ja proteiinit (vii) anti-BDNF-vasta-aineiden luominen • · · (viii) BDNF/NGF-geeniperheen uusien jäsenien tunnistaminen * .35 (ix) keksinnön käyttö (x) lääkekoostumukset 105342 30 5.1 Aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän puhdistaminen BDNFtää koodaavien nukleiinihappojen identifiointiin BDNF-5 proteiinia on saatavilla mikrogrammojen suuruisia määriä kudoksista; saadaan määritettyä aminohapposekvenssit, joita voidaan sitten käyttää oligonukleotidikoettimien muodostamiseen. BDNF:ää on saatavilla niin pieninä määrinä, että se käytännössä rajoittaa määritettävän aminohapposekvenssin 10 määrää. BDNF:ää voidaan valmistaa sian aivoista käyttämällä menetelmää, jota kuvataan esimerkiksi teoksissa Barde et ai., 1982, EMBO J. 1:549-553 ja Hofer and Barde, 1988, Nature 331:261-262.

15 Edullisesti BDNF:ää voidaan valmistaa seuraavan yksityiskohtaisen, esimerkkinä annetun menetelmän mukaisesti, joka ei kuitenkaan ole rajoittava. Alan asiantuntija pystyy johtamaan lukuisia muunnelmia siitä. Koska BDNF on niin harvinaista, puhdistamisessa on edullista käyttää noin kuu-20 si kiloa aivokudosta. Aivokudos voidaan homogenoida nat-riumfosfaattipuskurissa, pitoisuus noin 0,2 M natriumfos-faattia, pH noin 6, mukana noin 1 mM EDTA ja 1 mM juuri *;;; lisättyä fenyylimetaanisulfonyylifluoridia, niin että aivo- '···’ kudoksen suhteeksi nesteeseen tulee noin 1 kg kudosta suh- * ' 25 teessä 2 litraan puskuria. Kloorivetyhappoa voidaan käyt- • · ·.**: tää seoksen pH:n säätämiseksi noin arvoon 4 ja seosta se- koitetaan sitten noin 2 tuntia 4 *C:ssa. Seosta sentrifu- :J : goidaan 25 minuuttia, 20000 x g. Sentrifugoinnin jälkeen

kootaan pinnalle nouseva osa, supernatantti, säädetään pH

....; 30 noin arvoon 6,0 käyttämällä natriumhydroksidia ja sekoite- .·;·. taan sitten noin 1 litran etukäteen turvotetun karboksime- • · * ·. tyyliseiluloosamäärän kanssa (kohti 6 kilogrammaa aivoku- 4 · · *·:·' dosta), tasapainotettuna 0,1 M natriumfosfaatilla, pH 6.

• · ·

Kun on suoritettu useampi puhdistus käyttämällä yhteensä ;*·*: 35 noin 20 litraa 0,1 M natriumfosfaattia, pH 6, liete kaade-taan kolonniin ja pestään samalla puskurilla, joka sisältää 105342 31 0,13 M NaCl, edullisesti yli yön. Aktiiviset jakeet, jotka tunnistetaan BDNF-herkin bioanalyysein (katso kohta 5.2, infra), eluoidaan fosfaattipuskurilla, joka sisältää 0,5 M NaCl ja dialysoidaan vasten useita vaihtoja noin 5 litraa 5 5 mM kaliumfosfaattia, pH 6,8. Dialysoidut jakeet pannaan hydroksiapatiittikolonniin, jossa alustan tilavuus on noin 20 ml käsiteltävää aivokudoskiloa kohden. Hydroksiapatiit-tikolonnin tulee olla tasapainotettu etukäteen 5 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,8. Kolonnia eluoidaan lineaarisella gra-10 dientilla, 500 ml 5 mM kaliumfosfaattia ja 500 ml 700 mM kaliumfosfaattia, molempien noin pH 6,8. Optimaalisesti BDNF-aktiivisuus saadaan eluoimalla noin 500 mM kaliumfosfaatilla. Yhdistetyt aktiiviset jakeet säädetään sitten lopulliseen molaarisuuteen, noin 700 mM kaliumfosfaattia, 15 ja pannaan fenyylisefaroosikolonniin (jonka tilavuus on noin 5 ml kohti jokaista tuotettua 6 kilogrammaa aivokudosta), tasapainotettuna 700 mM kaliumfosfaattiliuoksella, jonka pH on 6,8. Kun on suoritettu pesu noin 40 ml:11a samaa puskuria, BDNF-aktiivisuus eluoidaan 0,1 M kaliumfos-20 faatilla, pH 6,8, dialysoidaan sitten vasten tislattua vettä ja lyofilisoidaan. Lyofilisoitu materiaali otetaan SDS-geelielektroforeesikoepuskuriaineeseen, joka sisältää 0,1 % ·...· natriumdodesyylisulfaattia, mutta mieluiten ei lainkaan ·;··: merkaptoetanolia, ja lisätään SDS-geeliin, joka muodostuu 25 10-25 % akryyliamidia sisältävästä lineaarisesta gradien- ....: tista. Kun elektroforeettinen erottaminen on suoritettu, geeliä värjätään noin 10 minuuttia Coomassie-sinellä ja • · · poistetaan sitten väriä noin 20 minuuttia. Cytochrome c -merkkiaineen kohdalla kulkeva vyöhyke voidaan leikata ja ... 30 eluoida elektroforeettisesti geelistä. SDS voidaan poistaa

| J J

\ * pääosin tapaan jota kuvaavat Weber ja Kuter (1971, J. Biol.

: Chem. 246:4504-4509). Huomattakoon, ettei SDS:ää yleensä :***: saada poistettua täydellisesti. Hofer ja Barde (1988, Na- * · · ture 331:261-262) ovat kehittäneet BDNF:n mikrosekven- • · · * . 35 sointipuhdistusmenetelmän, siinä ei puhdistuksen viimeisessä vaiheessa käytetä geelielektroforeesia.

105342 32 5.2. BDNF-bioanalyysit Tässä keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää, jonka avulla BDNF-aktiivisuus voidaan kvalitatiivisesti tai 5 kvantitatiivisesti osoittaa. Tällaiset bioanalyysit ovat käyttökelpoisia luonnon tai yhdistelmä- 1. rekombinantti-BDND:n identifioinnissa ja/tai mittaamisessa.

Voidaan käyttää mitä tahansa alalla tunnettua BDNF-bio-10 analyysiä. BDNF-kokeessa voidaan käyttää esimerkiksi kanan alkion selkäydinhermon takajuuren ganglioita (DRG) tapaan jota kuvaavat Barde et ai., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 77:1199-1203).

15 Tällöin kootaan 6-14, edullisest 10-12 päivää vanhojen kanan alkioiden DRG:t käyttäen alalla tunnettuja dissekointi-menetelmiä, ja pannaan heti pieneen määrään F14-väliainetta (valmistettu Gibco F-12-jauheesta, lisäksi käsittely kuten artikkelissa Vogel et ai., 1972, Proc. Natl. Acad. Sei.

20 U.S.A. 69:3180-3184), joka tulee korvata dissekoinnin lopuksi Cas*- ja Mg2*-vapaalla fosfaattipuskurisuolaliuoksella (PBS), joka sisältää noin 0,1 % trypsiiniä. Kun ganglioita on inkuboitu noin 20 minuuttia 37 *C:ssa, ne sentrufugoi-daan ja pestään kahteen kertaan F14-väliaineella, joka si- . .25 sältää noin 10 % (til/til) lämpöinaktivoitua hevosen seeru-• * · * mia. Gangliot erotetaan hellävaraista triturointia käyttä- en (noin 10-15 aspiraatiota) pieniläpimittaisella (noin 1 *.* * mm) silikonisoidulla pasteur-pipetillä. Jäljelle jäävät kudosmöykyt poistetaan saattamalla solususpensio nailon-·:··:30 seulan läpi, jonka huokosten läpimitta on noin 40 Mm. So-:T: lusupensiot esilevitetään noin 210 minuutiksi muovisiin kudosviljelmämaljoihin; tänä aikana suurimman osan ei-her-mosoluista pitäisi kiinnittyä muovipintaan, jolloin saadaan neuronirikastettu solupopulaatio suspensiossa. Solut lai-35 mennetaan pitoisuuteen noin 5 x 103 solua millilitrassa elatusväliainetta (edullisesti se saisi olla F14 + 10 % 105342 33 til/til lämpöinaktivoitua hevosen seerumia ja antibiootteja) ja asetetaan polyornitiini- tai, edullisemmin, polyor-nitiini/laminiinipäällysteisiin kudosviljelmämaljoihin (katso infra).

5

Vaihtoehtoisesti, ei rajoittaen, suhteellisen vähän NGF-herkät BDNF-bioanalyysit voivat olla edullisempia kuin edellä kuvatunlaiset DRG-menetelmät, jotka joissain olosuhteissa kohdistuvat sekä BDNF:ään että NGF:ään. Tällaisia 10 suhteellisen BDNF-spesifisiä menetelmiä ovat esimerkiksi verkkokalvon hermosolmujen viljelmät samoin kuin hermosto-plakodeista johdettujen hermosolujen viljelmät.

Perinataalisia verkkokalvosoluja voidaan viljellä menetellä mällä, jota kuvaavat Johnson et ai., 1986, J. Neurosci.

6:3031-3038). Tällöin verkkokalvot poistetaan perinataali-silta eläimiltä (tässä termillä "perinataalinen" tarkoitetaan vaihetta 17. alkionkehityspäivä - juuri syntyneet poikaset 48 tuntia syntymän jälkeen), pestään kalsiumia ja 20 magnesiumia sisältämättömällä fosfaattipuskurisuolaliuok-sella (PBS), ja inkuboidaan sitten 0,05 - 0,1 % trypsiiniä · sisältävässä PBS:ssä noin 15 minuuttia noin 37 *C:ssa.

Proteolyyttisen digestion jälkeen retinat pestään F14-vil-jeyväliaineella, joka sisältää noin 10 % (til/til) läm-: 25 pöinaktivoitua hevosen seerumia (F14-HS , horse serum).

m\m’: Retinat erotetaan hellävaraista pipetointia käytten pienes- • · ... sä määrässä (noin 1-10 ml) tuoretta F14-HS:ää. Hajoamatto- m · · '·’ ’ man kudoksen annetaan laskeutua, jäljelle jäävät solut ja väliaine pipetoidaan pois viljelyä varten.

30 • « · _ : Keksinnössä voidaan vaihtoehtoisesti käyttää myös BDNF-bio- « . .*. analyysejä, joissa käsitellään hermostoplakodi johdettu ja ,··. soluja. Alkioiden kallohermojen kudosviljelmissä voidaan käyttää esimerkiksi kolmoishermoganglion ventrolateraalista ’ 35 osaa, tai ventrikulaari-, genikulaatti-, petrosaali- tai nodoosiganglioita voidaan viljellä kollageenigeelissä, jon- 105342 34 ka päällä on viljelyväliaine tavalla, jota kuvaavat Davies et ai., 1986, J. Neurosci. 6:1897-1904, tai erottelemalla kuten Barde et ai., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. 77:1199-1203.

5

Koska BDNF-herkkyyden on havaittu kymmenkertaistuvan kun kasvatusalusta vaihdetaan polyornitiinistä laminiini/poly-ornitiiniksi (Barde et ai-, 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189) BDNF-kokeet on edullisinta toteuttaa laminiinia sisäl-10 tavilla alustoilla. Viljelypinnat voidaan valmistaa esimerkiksi (i) päällystämällä viljelypinta 8-10 tunniksi steriilillä polyornitiiniliuoksella, (ii) pesemällä useamman kerran steriilillä vedellä ja (iii) peittämällä viljelypinta noin kahdeksi tunniksi laminiinilla, pitoisuus noin 25 15 μg PBS:ssä (Johnson et ai., 1986, J. Neurosci. 6:3031-3038).

Missä tahansa bioanalyysimenetelmässä, jota käytetään keksinnön mukaisesti, BDNF-annosvastekäyrä voidaan saada ai-20 kaan alalla tunnetuin menetelmin. Erillistä kanan tunto-gangliokoetta käytettäessä puolimaksimaalinen eloonjääminen · oli havaittavissa pitoisuuden ollessa noin 5 ng/ml puhdis-tettua BDNF:ää, maksimaalinen eloonjääminen pitoisuuden ollessa noin 10 ja noin 20 ng/ml puhdistettua BDNF:ää (Bar- ·25 de et ai., 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189).

• * · • · « ... 5.3. BDNF-proteiinin mikrosekvensointi • · « • ·

Aivosta valmistettu BDNF-proteiini voidaan sekvensoida; on • * ‘‘**•30 kuitenkin korostettava, että proteiinin lähes olemattoman • · · V : määrän vuoksi on epätodennäköistä, että olennainen BDNF- . .·. proteiinin sekvenssi saataisiin luotettavasti aikaan. Pro-• · · teiini voidaan sekvensoida suoraan tai alkuun lohkaisemalla millä tahansa proteaasilla tai alalla tunnetusti käytettä- < i •V *35 väliä aineella, muun muassa, ei rajoittavasti, käyttäen

Staphylococcus aureus V8:aa, trypsiiniä tai syanogeenibro- 105342 35 midia. Peptidit voidaan sekvensoida automatisoidulla Edma-nin degradaatiomenetelmällä kaasufaasimikrosekventorilla käyttäen menetelmää, jonka ovat kehittäneet Hewick et al.( 1981, J. Biol. Chem. 256:7990-7997) tai Hunkapillar et ai.

5 (1983, Methods Enzymol. 91:227-236). Fenyylitiohydantoini- aminohappojen osoittamiseen voidaan sitten käyttää menetelmää, jota kuvaa Lottspeich (1985, Chromatography 326:321-327). Päällekkäisiä aminohapposekvenssejä voidaan määrittää ja käyttää päättelemään pitempiä jatkuvien sekvenssien 10 pätkiä.

5.4. BDNF:ää koodaavan DNA:n kloonaus BDNF:n harvinaisuuden vuoksi ei BDNF-geenien kloonaukseen 15 voida käyttää tavanomaisia menetelmiä. Jos esimerkiksi käytettäisiin saatavilla olevaa proteiinisekvenssiä luomaan komplementaarisesti leimattu oligonukleotidikoetin, ja tätä koetinta käytettäisiin seulomaan BDNF:ää oletettavasti syn-tetoivien kudosten muodostamia cDNA-kirjastoja, positiivi-20 siä klooneja olisi todennäköisesti häviävän vähän. Tämän keksinnön avulla pystytään kloonaamaan BDNF-geeni käyttä-.··: mällä menetelmäyhdistelmää, jossa puhdistetaan sopiva määrä BDNF-proteiinia, mikrosekvensoidaan BDNF-proteiini, johde-taan oligonukeotidikoetin, luodaan cDNA-kirjasto, suorite-:/.:25 taan vahvistaminen johdettuja BDNF-aminohapposekvenssejä ·:··: käyttäen ja valitaan lopuksi BDNF-geeni. Tässä keksinnön mukaisessa menetelmässä suositeltavin vahvistamismenetelmä • · · on kudosnukleiinihapposekvenssien vahvistaminen polyme- „ raasiketjureaktiota (PCR) käyttäen (Saiki et ai., 1985, • · ...30 Science 230:1350-1354), jolloin saadaan lisättyä BDNF-sek-• · · „ *. venssejä kloonaukseen. Seuraavassa yksityiskohtainen ku- ·,* ‘ vaus suositeltavasta menetelmästä.

Ensin käytetään puhdistetusta BDNF-proteiinista johdettua .35 aminohapposekvenssiä dedusoimaan 1. päättelemään oligonuk-leotidialukkeita polymeraasiketjureaktioon. Koska geneet- 105342 36 tinen koodi, jossa useampi aminohappotripletti voi tarkoittaa samaa aminohappoa, täytyy syntetoida useampia oli-gonuleotidejä tietylle aminohapposekvenssille, jotta saadaan monia mahdollisia nukleotidisekvenssiyhdistelmiä; saa-5 tavia oligonukleotidejä kutsutaan degeneraattialukkeiksi.

Polymeraasiketjureaktioon (PCR) tarvitaan sekä sense- että antisense-säiealukkeita. Näin BDNF-aminohapposekvenssiä vastaavaa degeneraattioligonukleotidialuketta voidaan käytit) tää alukkeena ensimmäisessä DNA-ketjussa ja toista aluket-ta, joka on yleisesti esiintyvän tavallisen DNA-sekvenssin kanssa homologinen, esimerkiksi mRNA:n polyadenosiinihännän käänteistranskriptaasia käyttäen saatua tymidiinijäämäpät-kää, voidaan käyttää alukkeena toisessa DNA-ketjussa. Näi-15 tä alukkeita voidaan sitten käyttää polymeraasiketjureaktiossa nukleiinihappotemplaatin kanssa, jonka oletetaan sisältävän BDNF:ää koodaavia sekvenssejä, esimerkiksi geno-minen DNA tai, edullisemmin, cRNA, joka on valmistettu BDNFrää oletettavasti syntetoivasta kudoksesta kootusta 20 mRNA:sta. DNA-reaktiotuotteet voidaan analysoida elektro-foreesimenetelmällä, jotta nähdään, onko DNA-reaktiotuote molekyylikooltaan odotetun BDNF-geenin kokoinen, tai edul-lisemmin käyttämällä nukelotidisekvenssianalyysiä.

:\:25 Kuitenkin, koska käytettäessä kahta heikennettyä aluketta ·:··· PCR:ssä lisääntyy mahdollisuus vahvistaa nukleiinihapposek-venssejä, jotka eivät koodaa BDNF:ää; suositeltavampi menetelmä on käyttää vain yhtä degeneraattialuketta toisen alukkeen vastatessa täsmällisesti BDNF-sekvenssiä. Täsmäl- , • · ... 30 lisen BDNF-sekvenssin tunnistamiseksi aminohapposekvenssiä, λ m • · « ·. joka on määritetty puhdasta BDND-proteiinia käyttämällä, ::: voidaan käyttää sekä sense- että antisense-säiedegeneraat- tioligonukelotidialukkeen luomisessa. DNA-reaktiotuotteen, .···. joka saadaan käyttämällä näitä alukkeita PCR-reaktiossa .35 käyttämällä BDNF:ää koodaavaa nukleiinihappoa templaattina, tulisi olla nukeliinihappofragmentti, joka koodaa alukkei- 105342 37 den luomiseen käytettyjä aminohappopätkiä, ja se saisi olla kooltaan ennakoitava (esimerkiksi minimissään aminohappotähteiden lukumäärä kerrottuna kolmen tekijällä, emäsparia pituussuunnassa). DNA-reaktiotuotteen sekvenssianalyysin 5 tulosta voidaan verrata varmennettuun aminohapposekvenssiin, jotta saataisiin vahvistettua, koodaako vahvistettu nukleiinihapposekvenssi todella BDNF-peptidifragmenttia.

Vaikka onkin mahdollista käyttää mistä tahansa alalla tunnettua nukleiinihapposekvensointiroenetelmää, suositeltavin 10 on dideoksinukleotidiketjumääritelmämenetelmä (Sanger et ai., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72:3918-3921). Sekvensoinnissa voidaan käyttää lisäksi geelipuhdistettua tai, edullisemmin, kloonattua DNA-reaktiotuotetta. DNA-reaktiotuotteen sekvenssiä voidaan sitten käyttää edelleen 15 luomaan oligonukleotidialuke, joka vastaa täsmälleen BDNF:ää koodavaa sekvenssiä. Tätä aluketta voidaan käyttää yhdessä toisen alukkeen kanssa, joka voi olla degeneraatti, laajentamaan BDNF-sekvenssien määrää suuremmaksi kuin alunperin määritellyn täsmällisen sekvenssin fragmentti. Esi-20 merkiksi, ei rajoittavasti, sense-säiealuke voi vastata täsmällistä BDNF-nukelotidisekvenssiä, kun taas antisense- • ••\ säiealuke voi olla degeneraattialuke, homologinen sekvens- sialueen kanssa, joka todennäköisesti löytyy "alavirrasta” • « · · · . , sekvensoitua fragmenttia, esimerkiksi mRNA:n polyadenosii-* · · '· "25 nihäntä, käänteisesti transkriptoituna cDNA:ssa. Sen jäi-• · · · · * ‘ keen tarvitaan ehkä samanlaista menetelmää, jotta päästäi- : siin sekvensoitua fragmenttia "ylävirtaan", esimerkiksi asntisens-säiealuke voi vastata täsmällistä BDNF-nukeloti-. ·:*·: disekvenssiä ja sense-säiealuke voi olla degeneraattialuke, :*;*30 joka on homologinen ylempänä sekvensoidussa fragmentissa \ sijaitsevan BDNF-sekvenssin kanssa, esim. päätedeoksinukle-otiditransferaasia käyttäen cDNAin 5'-päähän lisätty 5'-';·* polyadenosiinihäntä. Näin saadaan koottua kokonainen BDNF-:T: geeni tai mRNA.

’: · · Ϊ3 5 105342 38 DNA-rektiotuotteita voidaan kloonata käyttämällä mitä tahansa alalla tunnettua menetelmää. On olemassa esimerkiksi useita vektori (1. kuljetin)/isäntämenetelmiä. Sopivia vektoreita, ei rajoitetusti, ovat esimerkiksi kosmidit, 5 plasmidit tai modifioidut virukset. Vektorisysteemin tulee kuitenkin olla yhteensopiva käytettävän isäntäsolun kanssa. Tällaisiin vektoreihin kuuluvat, vaikkeivät rajoitu, esimerkiksi lambda-johdannaisten kaltaiset bakteriofagit, plasmidit kuten pBR322, pUC, tai plasmidijohdannaiset 10 (Bluescript, Stratagene). Rekombinanttimolekyylit voidaan siirtää isäntäsoluihin muun muassa käyttämällä transformaatiota, transfektiota, infektiota tai elektroporaatiota.

BDNF-geeni siirretään kloonausvektoriin, joka voidaan 15 transfromoida, transfektoida tai infektoida sopivaan isän-täsoluun, niin että geenisekvensseistä saadaan luotua useita kopioita. Lisäksi voidaan ligatoida DNA-fragmentti kloonausvektoriin, jossa on komplementaarisia kohesiivisia päätteitä. Jos kloonausvektorissa ei ole DNA:n fragmen-20 tointiin käytettäviä komplementaarisia restriktiokohtia, DNA-molekyylien päät voidaan modifioida entsymaattisesti. Saattaa olla edullista lisätä rajaavia endonukleaasikat-kaisukohtia polymeraasiketjureaktiossa käytettäviin oli-·:··: gonukleotidialukkeisiin helpottamaan liittymistä vektorei- :’·.·25 hin. Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa mikä tahansa haluttu ....: kohta ligatoimalla nukleotidisekvenssejä (linkkereitä, engl. linkers) DNA-päätteisiin; näissä ligatoiduissa link- t t · kereissä voi olla spesifisiä kemiallisesti syntetoituja . oligonukleotidejä koodaavia restriktioendonukleaasitunnis- ... 30 tussekvenssejä. Katkaistu vektori ja BDNF-geeni voidaan » * · *·’ ’ eräässä vaihtoehtoisessa menetelmässä modifioida käyttämäl- : lä homopolymeerihännänmuodostusta.

* · *

» I

ti·

Erityisissä toteutusmuodoissa transformoimalla isäntäsoluun • · · ’ ,35 rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka sisältävät eristetyn BDNF-geenin, cDNA:n tai syntetoidun DNA-sekvenssin, saadaan 105342 39 luotua lukemattomia kopioita geenistä. Geenejä voidaan siis saada suuria määriä kasvattamalla tranformantteja, eristämällä yhdistelmä-DNA-molekyylit tranformanteista, ja tarvittaessa hakemalla insertoitu geeni eristetystä rekom-5 binantti-DNA:sta.

Keksinnön erään suositeltavan toteutusmuodoon mukaan, kun cDNAtsta johdettu BDNF:ää koodaava klooni on luotu, genomi-nen BDNF:ää koodaava klooni voidaan eristää käyttämällä 10 alalla yleisiä tekniikoita. Voidaan esimerkiksi johtaa leimattu nukleiinihappokoetin BDNF-kloonista ja käyttää sitä käymään läpi genomisen DNA:n kirjastoja nukleiinihap-pohybridointimenetelmää käyttäen, esimerkiksi bakteriofagi-kirjastoille tarkoitettua menetelmää (Benton and Davis, 15 1977, Science 196:180) tai plasmidikirjastoille tarkoitet tua menetelmää (Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 72:3961-3965). Haetut kloonit voidaan sitten analysoida alalla hyvin tunnettuja restriktiofrag-menttikartoitusta ja sekvensointimenetelmiä käyttäen.

20

Uusia cDNA-klooneja voidaan lisäksi tunnistaa cDNA-kirjas-[”·' tosta käyttämällä keksinnön mukaisesti saatuja sekvenssejä.

[ ’ 5.5. BDNF-geeniekspressio :·’·^5 * * BDNF-proteiinia tai sen osaa koodaava nukleotidijakso voi- • ·· : daan liittää sopivaan ekspressiovektoriin, eli vektoriin, joka sisältää liitettävän proteiinia koodaavan sekvenssin *:*: transkriptioon tai translaatioon tarvittavat osaset. Tar- :’:*}30 vittavat transkriptio- ja translaatiosignaalit voidaan saa-da myös puhtaasta BDNF-geenistä ja/tai sitä sivuavilta alu-"* eilta. Proteiinia koodaavan sekvenssin ekspressioon voi-daan käyttää monenlaisia isäntä/vektorimenetelmiä. Näistä :voidaan ei rajoittavasti mainita nisäkkäiden solusysteemit, :··$5 jotka ovat virusten (esim. lehmänrokkovirus, adenovirus) infektoimia, hyönteisten solusysteemit, jotka ovat virusten 105342 40 (esim. baculovirus) infektoimia, mikro-organismit kuten hiivavektoreita sisältävä hiiva tai bakteerit, jotka on transformoitu käyttämällä bakteriofagi-DNA:ta, plasmidi-DNA:ta tai kosmidi-DNA:ta. Näiden vektoreiden ekspressio-5 elementtien vahvuudet ja spesifisyydet vaihtelevat. Käy-tettävän isäntä/vektorisysteemin mukaan voidaan käyttää minkälainen määrä tahansa sopivia transkriptio- ja trans-laatioelementtejä.

10 Mitä tahansa edellä mainituista DNA-fragmenttien vektori-insertiomenetelmää voidaan käyttää kokoamaan ekspressiovek-toreita, jotka sisältävät kimeerisen geenin, joka muodostuu sopivista transkriptio/translaatiosäätelysignaaleista ja proteiinia koodaavista jaksoista. Näihin menetelmiin voi-15 daan lukea in vitro-rekombinatti-DNA-menetelmät ja synteettiset menetelmät sekä in vivo-rekombinaatio (geneettinen rekombinaatio). BDNF-proteiinia tai peptidifragmentteja koodaavan nukleiinihapposekvenssin ilmentymää voidaan säädellä toisella nukleiinihapposekvenssillä, niin että BDNF-20 proteiini tai -peptidi ilmentyy isännässä, joka on trans-. formoitu rekombinantti-DNA-molekyylillä. BDNF-ekspressiota ·;;; voidaan säädellä esimerkiksi millä tahansa alan tunnetulla promoottorilla/tehostimella. Promoottoreita, joita voidaan ' ' käyttää BDNF-ekspression säätelyyn ovat, ei-rajoittavasti « Y·; 25 mainittuna, SV40 varhaispromottorialue (Bernoist and Cham-*ί“ί bon, 1981, Nature 290:304-310), Rousin sarkoomaviruksen 3'-:T: pään pitkän päätetoiston sisältämä promoottori (Yamamoto et ai., 1980, Cell 22:787-797), herpestymidiinikinaasiproraoot-tori (Wagner et ai., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.

30 78:144-145), metallotioniinigeenin regulatoriset sekvenssit • · « (Brinster et ai., 1982, Nature 296:39-42), prokaryoottiset ekspressiovektorit kuten B-laktamaasipromoottori (Villa- • « « ·...* Kamaroff et ai., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75: .*:·. 3727-2731) tai tac-promoottori (DeBoer et ai., 1983, Proc.

.,,,:35 Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:21-25), katso myös "Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 105342 41 1980, 242:74-94, kasviekspressiovektorit, esimerkiksi nopa-liinisyntetaasipromoottorialue (Herrera-Estrella et ai.,

Nature 303:209-213, tai kukkakaalimosaiikivirus 35S RNA-promoottori (Gardner et ai., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871) 5 ja promoottori fotosynteesientsyymiribuloosibifosfaattikar-boksylaasille ((Herrera-Estrella et ai., 1984, Nature 310: 115-120, hiivasta tai muista sienistä saatavat promootto-rielementit kuten Gal 4 -promoottori, ADC (alkoholidehydro-genaasi)-promoottori, PGK (fosfoglyserolikinaasi)-promootio tori, alkalifosfataasipromoottori, sekä seuraavat eläimen transkriptiosäätelyalueet, joilla ilmenee kudosspesifisyyttä ja joita on käytetty transgeneettisissä eläimissä: elas-taasi I geenisäätelyalue, joka on aktiivinen haiman asinaa-risoluissa (Swift et ai, 1984, Cell 38:639-646, Ornitz et 15 ai., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399- 409, McDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)? insuliinigeeni-säätelyalue, joka on aktiivinen haiman beetasoluissa (Hanahan, 1985, Nature, 315:115-122, immunoglobuliinigeenisääte-lyalue, joka on aktiivinen lymfoidisoluissa (Grosscheldl et 20 ai., 1984, Cell 38:647-658, Adames et ai., 1985, Nature 318:533-538, Alexander et ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: ...: 1436-1444), hiiren nisätuumorivirussäätelyalue, joka on aktiviinen kives-, rinta-, lymfoidi- ja syöttösoluissa (Le- t der et ai., 1986, Cell 45:485-495), albumiinigeenisäätely- • · :/.:25 alue, joka on aktiivinen maksassa (Pinkert et ai., 1987, ·:··: Genes and Devel. 1:268-276), alfa-fetoproteiinigeenisääte- lyalue, joka on aktiivinen maksassa (Krumlauf et ai., 1985,

Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648, Hammer et ai., 1987, Science „ ....: 235:53-58), alfa-l-antitrypsiinigeenisäätelyalue, joka on * · 30 aktiivinen maksassa ( (Kelsey et ai., 1987, Genes and De- • · · vei. 1:161-171), beeta-globiinigeenisäätelyalue, joka on aktiivinen myeloidisoluissa (Mogram et ai., 1985, Nature :'f”: 315:338-340, Kollias et ai., 1986, Cell 46:89-94, mye- .··.·. liiniemäsproteiinigeenisäätelyalue, joka on aktiivinen ai- I I · jii; 35 von oligodendrosyyttisoluissa (Readhead et ai., 1987, Cell « 48:703-712), myosiini-antisense-säie-2-geenisäätelyalue, 105342 42 joka on aktiivinen luustoon kiinnittyneissä lihaksissa (Sa-ni, 1985, Nature 314:283-286) sekä gonadotropiinia vapauttava hormonigeenisäätelyalue, joka on aktiivinen hypotala-muksessa (Mason et ai., 1986, Science 234:1372-1378).

5

Lisättyjä BDNF-geenejä sisältävät ekspressiovektorit voidaan tunnistaa kolmea yleistä eri lähestymistapaa käyttäen: a) DNA-DNA-hybridisaatio, b) merkkiainegeenifunktioiden läsnäolo tai poissaolo ja c) lisättyjen sekvenssien eks-10 pressio. Ensimmäisessä lähestymistavassa vieras ekspres-siovektoriin liitetty geeni voidaan havaita DNA-DNA-hybri-disaatiolla käyttämällä koettimia, joissa on liitetyn BDNF-geenin kanssa homologisia sekvenssejä. Toisessa lähestymistavassa rekombinantti vektori/isäntä-systeemi voidaan 15 tunnistaa ja valita sen mukaan, ilmeneekö tiettyjä merkkiaineen kaltaisia geenifunktioita vai ei (esimerkiksi tyrai-diinikinaasiaktiivisuutta, antibioottiresistenssiä, trans-formaatiofenotyyppiä tai okkluusiorakennemuodostusta (occlusion body formation) baculoviruksessa, jotka ovat synty-20 neet vieraitten geenien liittämisessä vektoriin. Jos esi-merkiksi BDNF-geeni liitetään vektorin merkkiainegeenisek- .··, venssiin, BDNF-insertin sisältävät rekombinantit voidaan • · tunnistaa merkkiainegeenifunktion poissaolon avulla. Kol- . . mannessa lähestymistavassa rekombinanttiekspressiovektorit • · » "·25 voidaan tunnistaa suorittamalla kokeita rekombinantin il- mentämälle vieraalle geenituotteelle. Kokeet voivat perus-v : tua esimerkiksi BDNF-geenituotteiden fysikaalisiin tai toi minnallisiin ominaisuuksiin bioanalyysikokeissa, esiroerkik-si osassa 5.2, supra, kuvatun kaltaisissa.

• · · : : : 30 j. Kun tietty yhdistelmä-DNA-molekyyli on tunnistettu ja eris- • · m ti; tetty, sen lisäämiseen voidaan käyttää jotain useista alal- la tunnetuista menetelmistä. Kun on saatu aikaan sopiva : isäntäsysteemi ja kasvuolosuhteet, rekombinanttiekspres- *:·; 35 siovektoreita voidaan lisätä ja valmistaa suuria määriä.

Kuten edellä on tuotu esiin, sopivia ekspressiovektoreita 105342 43 ovat muun muassa seuraavat vektorit tai niiden johdannaiset: ihmisen tai eläimen virukset kuten lehmänrokkovirus tai adenovirus, hyönteisten virukset kuten baculovirus, hiivavektorit, bakteriofagivektorit (esim. lambda), sekä 5 plasmidi- ja kosmidi-DNA-vektorit.

Lisäksi voidaan valita sellainen isäntäsolukanta, joka muuntelee liitettyjen sekvenssien ekspressiota tai modifioi ja prosessoi geenituotetta tiettyyn haluttuun tapaan.

10 Tiettyjen promoottorien ekspressiota voidaan lisätä tiettyjen kiihdyttimien avulla; näin geneettisesti valmistettujen BDNF-proteiinien ilmentymää voidaan säädellä. Eri isän-täsoluilla on ominaisuuksia ja spesifisiä mekanismeja proteiinien translaation aikaiseen ja translaation jälkeiseen 15 proteiinien muokkaukseen ja muunteluun (esim. glykosyloin-ti, pilkkominen). On mahdollista valita sopivia solulinjoja tai isäntäsysteemejä varmistamaan haluttu ilmennettyjen vieraiden proteiinien muuntelu ja muokkaus. Esimerkiksi bakteriaalisen systeemin ekspressiota voidaan käyttää tuot-20 tamaan ei-glykosyloitua ydinproteiinituotetta. Ekspres-siota hiivassa voidaan käyttää glykosyloidun tuotteen val- ,···. mistamiseen. Ekspressiota nisäkkään soluissa voidaan käyt-• · tää varmistamaan heterologisen BDNF-proteiinin "puhtaaseen" # « . . glykosylointiin. Lisäksi erilaiset vektori/isäntä-ekspres- I · I · · ' |25 siosysteerait voivat vaikuttaa muokkausreaktioihin kuten ’ ' erilaisten sisältöjen proteolyyttiseen eriasteiseen pilkko-• « « ' miseen.

Erässä erityisessä keksinnön mukaisessa toteutusmuodossa :^:30 prepro-BDNF:ää koodaava DNA voidaan kloonata pCMV-plasmi- "·. diin, vahvistaa ja käyttää sitten COS-solujen transfektoin-« · · Γ.Ι tiin kalsiumfosfaattimenetelmää käyttäen (Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752); BDNF-aktiivisuus voi- M · : daan sitten koota soluvil jelyväliaineesta (katso esimerkki ".":35 10, infra).

105342 44 5.5.1. Ekspressoidun geenituotteen tunnistaminen ja puhdistaminen

Kun BDNF-geeniä ilmentävä rekombinantti on tunnistettu, 5 geenituote pitää analysoida. Tämä voidaan suorittaa käyt-

T

tämällä tuotteen fysikaalisiin tai toiminnallisiin 1. funktionaalisiin ominaisuuksiin perustuvia kokeita.

Kun BDNF-proteiinin on tunnistettu, se voidaan eristää ja 10 puhdistaa standardimenetelmin, esimerkiksi kromatografiaa (esim. ioninvaihto-, afiiniteetti- tai kokoon perustuvaa lajittelupylväskromatografiaa), sentrifugointia, differen-tiaaliliukoisuutta tai mitä tahansa muuta proteiinien puhdistamiseen sopivaa standardimenetelmää käyttäen. Funktio-15 naalisia ominaisuuksia voidaan arvioida käyttämällä mitä tahansa tunnettua BDNF-koetta, esimerkiksi, ei-rajoittavas-ti, kokeita, joissa käytetään kanan selkäydinhermon taka-juuren ganglioita, perinataalisen rotan retinaalisoluja tai hermostoplakodijohdettuja neuroneja.

20

On tärkeää huomata, että menetelmissä, joissa BDNF:ää val-mistetaan aivokudoksesta, käytetään viimeisenä vaiheena preparatiivista geelielektroforeesia, ja tuloksena on BDNF,

« * I

joka ei ole täysin aktiivinen SDS-jäämien vuoksi (Barde and .·. ; 25 Thoenen, 1985, "Hormones and Cell Regulation", Voi. 9, Du-• ·* mont et ai., eds., Elsevier Science Publishers, pp. 385- · ... 390). Sen sijaan tämän keksinnön mukaan saadaan eristettyä • « i *·’ ' BDNF, joka saadaan rekombinanttinukleiinihappomolekyyleis-tä, joka ei sisällä SDS:ää ja joka on siis täysin aktiivi- * * 30 nen. Keksinnön mukaisia anti-BDNF-vasta-aineita (kuten • · · V : vasta-ainetta sian BDNF:n B5-33 aminohappofragraenttia vas- • * . taan, ks. osa 11, infra) voidaan käyttää esimerkiksi, ei « a rajoittavasti, kokoamaan rekombinantti-BDNF käyttämällä I · '·' immunopresipitaatiota tai affiniteettikromatografiaa, ja * · « V ' 35 saada siten pinta-aktiivista ainetta sisältämätön, täysin aktiivinen BDNF.

105342 45

Keksinnön erään toisen toteutusmudon mukaan prepro-BDNF voidaan konvertoida aktiiviseksi kypsäksi BDNF:ksi entsy-maatisesti, käyttämällä esimerkiksi endoproteinaasia Arg-C (ks. osa 17, infra).

5 5.6. BDNF-geenit ja -proteiinit

Seuraavat nukleiinihapposekvenssit määritettiin ja niiden vastaavat aminohapposekvenssit dedusoitiin käyttämällä melo netelmiä, joita on yksityiskohtaisesti kuvattu edellä ja jotka tulevat esiin myöhemmin luvuissa 6 ja 9. Sian cDNA-BDNF-sekvenssi määritettiin, se on esitetty kuviossa 1.

Ihmisen genominen cDNA-BDNF-sekvenssi määritettiin, se on esitetty kuviossa 5, josta ilmenevät myös sian, rotan ja 15 kanan DNA-sekvenssit. Kaikkia näitä sekvenssejä tai niiden toiminnallisia vastaavuuksia voidaan käyttää tämän keksinnön mukaan. Keksintö liittyy lisäksi BDNF-geeneihin ja proteiineihin, jotka on eristetty siasta, naudasta, kissasta, linnusta, hevosesta, koirasta, kädellisistä tai mistä 20 tahansa muusta lajista, jossa BDNF-aktiivisuutta ilmenee. Keksintö kohdistuu myös BDNF-nukleiinihappojen alisekvens-seihin (subsequences), jotka sisältävät vähintään kymmenen nukleotidiä ja joihin kuuluu BDNF-sekvenssien hybridisoita-via osia, joita voidan käyttää esimerkiksi nukleiinihappo-: 25 hybridisaatiokokeissa sekä southern ja northern blot-ko- keissa. Keksintö koskee myös BDNF-proteiinia, -fragmentte- • · ja ja -johdannaisia, jotka ovat kuvioissa 1 ja 5 esitetty- • · · * jen aminohapposekvenssien mukaisia tai niiden toiminnallisia vastaavuuksia. Keksintö koskee myös BDNF-proteiinien * * 30 fragmentteja tai johdannaisia, jotka sisältävät yhden tai ··· V * useamman antigeenideterminantin tai jotka ovat toiminnalli-* · •.*. sesti aktiivisia. Toiminnallisella aktiivisuudella tarkoi- i i * · « tetaan tässä positiivista aktiivisuutta tunnetuissa BDNF-toimintakokeissa, esimerkiksi kanan alkion DRG-kokeissa.

I · · ' I · * 35 · 105342 46

Kuvioissa 1 ja 5 nähtävä nukieiinihapposekvenssit voidaan muuttaa suorittamalla korvauksia, lisäyksiä tai poistoja, joista on tuloksena toiminnallisesti vastaavia molekyylejä. Nukelotidejä koodaavien sekvenssien degeneraatioasteen 5 vuoksi muitakin DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat olennaisesti samaa kuvioiden 1 ja 5 mukaista aminohapposekvenssiä, voidaan käytännössä käyttää tässä keksinnössä. Näihin kuuluvat muun muassa, ei rajoittavasti mainittuna, nukleoti-disekvenssit, jotka sisältävät kaikki tai osan kuvioiden 1 10 ja 5 BDNF-geeneistä, jotka on muunnettu korvaamalla eri kodoneja, jotka koodaavat toiminnallisesti vastaavaa aminohappo jäämää sekvenssissä, ja jotka näin saavat aikaan "hiljaisen" muutoksen (silent change). Keksinnön mukaisiin BDNF-proteiineihinkin tai sen fragmentteihin tai johdannai-15 siin, kuuluvat muun muassa, ei rajoittavasti lueteltuna, ne, jotka sisältävät primaarisena aminohapposekvenssinä kuvioiden 1 ja 5 koko aminohapposekvenssin tai osan siitä, mukaan lukien muunnellut sekvenssit, joissa aminohappojäämien toiminnallisesti vastaavat aminohappojäämät on korvat-20 tu hiljaisesta muutoksesta saatavien sekvenssien jäämillä.

Voidaan esimerkiksi korvata yksi tai useampi aminohappojää-mä sekvenssistä toisella aminohapolla, jolla on vastaava • · polaarisuus, ja joka toimii toiminnallisena vastaavuutena • . . ja on saatu tuloksena hiljaisesta muutoksesta. Sekvenssin • · · • · · * ; 25 aminohapon substituutit voidaan valita muista aminohapon ····· ryhmän jäsenistä. Ei-polaarisiin (hydrofobisiin) aminohap- • « « *·* * poihin kuuluvat esimerkiksi alaniini, leukiini, isoleukii- ni, väliini, proliini, fenyylialaniini, tryptofaani ja me- tioniini. Polaarisia neutraaleja aminohappoja ovat glysii- :T: 30 ni, seriini, treoniini, kysteiini, tyrosiini, asparagiini . !*. ja glutamiini. Positiivisesti varautuneita (emäksisiä) • · · c aminohappoja ovat esim. arginiini, lysiini ja histidiini.

i r

Negatiivisesti varautuneita (happamia) ovat esimerkiksi V ' aspartagiini- ja glutamiinihapot. Keksinnön piiriin kuulu- j *i": 35 vat vielä BDNF-proteiinit, sen fragmentit tai johdannaiset, jotka on differentiaalisesti modifioitu translaation aikana 47 105342 tai sen jälkeen, esim. käyttämällä glykosylaatiota, prote-olyyttistä pilkkomista, liittämistä vasta-ainemolekyyliin tai muuhun soluligandiin.

5 Tietty BDNF voidaan lisäksi mutatoida in vitro tai in vivo ja saada aikaan ja/tai tuhota sekvenssien translaatiota, initiointia ja/tai terminaatiota käyttäen tai luoda muunnelmia koodausalueille ja/tai muodostaa uusia endonukle-aasirestriktiokohtia tai tuhota jo olemassa olevia sellai-10 siä, sekä helpottaa myöhempää in vitro-modifiointia. Voidaan käyttää mitä tahansa alalla käytettävää mutageneesi-menetelmää, muun muassa, ei rajoittavasti, in vitro-alue-suunnattua mutageneesiä (Hutchinson et ai., 1987, J. Biol.

Chem. 253:6551) tai nk. TAB-linkkereitä.

15 5.7. Anti-BDNF-vasta-aineiden luominen

Keksinnön mukaan BDNF-proteiinia, sen fragmentteja tai johdannaisia voidaan käyttää immunogeeneinä luomaan anti-BDNF-20 vasta-aineita. Aikaisemmat yritykset tuottaa anti-BDNF- immuunivastetta eivät ole onnistuneet sen vuoksi, että puh-· dasta BDNF:ää on ollut saatavilla niin vähäisiä määriä.

Riittämättömistä BDNF-määristä johtuvista ongelmista voi- • « « daan päästä käyttämällä suhteellisen suuret BDNF-prote- .'^5 iinimäärät tuottavia proteiinisynteesin rekombinanttitek-• · · niikoita (jotka perustuvat keksinnön mukaisiin BDNF-nukle- • · ... iinihapposekvensseihin).

• * · • · ·

Anti-BDNF-immuunivasteen tuottamisen edelleen parantamisek- '*70 si voidaan analysoida BDNF-aminohapposekvenssi molekyylin • · · , \: · sellaisten kohtien löytämiseksi, jotka ilmeisesti liittyvät , .·, lisääntyneeseen immunogeenisyyteen. Aminohappojakso voi- « I f ,··. daan esimerkiksi analysoida tietokoneella pintaepitooppien ’·' löytämiseksi käyttämällä menetelmää, jonka ovat kehittäneet I I · '.'75 Hopp ja Woods (1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824-3828), ja jota on onnistunnesti käytetty hepatitis B pinta- 105342 48 antigeenin antigeenisten peptidien tunnistamiseen. Vaihtoehtoisesti voitaisiin verrata eri lajeilta johdettuja BDNF-aminohapposekvenssejä ja tunnista suhteellisen epäho-mologiset alueet, jotka todennäköisemmin ovat immunogeeni-5 siä yli eri lajien.

T

BDNFrään suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen voidaan käyttää mitä tahansa tekniikkaa, jonka avulla saadaan tuotettua vasta-ainemolekyylejä jatkuvissa 10 solulinjoissa viljelmässä. Mahdollisia ovat esimerkiksi hybridomatekniikka, jonka alunperin kehittivät Kohler ja Milstein (1975, Nature 256:495-497), trioomatekniikka, ihmisen B-soluhybridomatekniikka (Kozbor et ai., 1983, Immunology Today 4:72), EBV-hybridomatekniikat ihmisen mono-15 klonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen (Cole et ai., 1985, "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R.

Liss, Inc. pp. 77-96) ja vastaavat, jotka soveltuvat tähän keksintöön.

20 Terapeuttisesti käytettävät monoklonaaliset vasta-aineet voivat olla ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita tai ki-meerisiä ihmisen ja hiiren (tai jonkin muun lajin) mono- • · · klonaalisia vasta-aineita. Ihmisen monoklonaalisia vasta-”·"· aineita voidaan valmistaa mitä tahansa lukuisista alalla :^.25 tunnetuista tekniikoista käyttäen (esim. Teng et ai., 1983, ·;··· Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:7308-7312, Kozbor et ai., .'Γ. 1983, Immunology Today 4:72-79 ja Olsson et ai., 1982,

Meth. Enzymol, 92:3-16). Kimeeriset vasta-ainemolekyylit voidaan valmistaa sellaisiksi, että niissä on hiiren anti- • · ...30 geeniä sitova alue ja ihmisen vakio C-osat (Morrison et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:6851, Takeda et ai., 1985, Nature 314:452).

Alalla tunnetaan useita menetelmiä polyklonaalisten vasta-' .35 aineiden tuottamiseen BDNF-epitoopeille. Vasta-ainevalmis-tuksessa voidaan immunisoida useita isäntäeläimiä, esimer- 105342 49 kiksi kaniineja, hiiriä tai rottia, ruiskuttamalla niihin BDNF-proteiinia, sen fragmentteja tai johdannaisia. Immunologisen vasteen lisäämiseksi voidaan isäntälajin mukaan käyttää erilaisia lisäaineita, mm. Freundin adjuvanttia 5 (täydellistä ja epätäydellistä), mineraaligeelejä kuten aluminiumhydroksidia, pinta-aktiivisia aineita kuten lyso-lesitiinia, pluronisia polyoleja, polyanioneja, peptidejä, öljyemulsioita, keyhole limpet -hemosyaniineja, dinitro-fenolia ja potentiaalisesti käyttökelpoisia ihmisen adju-10 vantteja, esim. BCG (Bacille-Calmette-Guerin) ja Corynebac-terium parvum.

BDNF-epitoopin vasta-aineen molekulaarinen klooni voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin. Rekombinantti-DNA-metodo-15 logiaa (katso esim. Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, New York) voidan käyttää rakentamaan nukeliinihapposekvenssejä, jotka koodaavaat monoklonaalista vasta-ainetta tai sen antigeeniä sitovaa aluetta.

20

Vasta-ainemolekyylit voidaan puhdistaa tunnetuin teknii-..li* koin, käyttämällä esimerkiksi immunoabsorptio- tai im-munoaffiniteettikromatografiaa, HPLC- (high performance ·;·: liquid chromatography) kromatografiaa tai niiden yhdistel lä miä.

• ·

Vasta-ainefragmentit, jotka sisältävät molekyylin idiotyy- pin, voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin. Tällaisiin fragmentteihin kuuluvat muun muassa: F (ab') 2-fragmentti, ]5P joka voidaan tuottaa vasta-ainemolekyylin pepsiinidiges-• · » *\ * tiolla, Fab-fragmentit, jotka voidaan luoda pelkistämällä F(ab' )2-fragmentin disulfidisillat, sekä 2 Fab tai Fab-fragmentit, jotka voidaan luoda käsittelemällä vasta-aine- • · · .1. molekyyliä papaiinilla pelkistävällä aineella.

'*35 105342 50

Luvun 11 esimerkki kuvaa BDNF-proteiinin peptidifragmenttia B5-33 vastaan suunnattujen polyklonaalisten antiseerumien valmistusta.

5.8. BDNF/NGF-geeniperheen uusien jäsenien tunnistaminen BDNF:ää koodaavan geenin sekvenssianalyysi ja sen aminhap- f 5 pojaksojen johtaminen ovat paljastaneet, että tämä proteiini muistuttaa rakenteeltaan monin kohdin NGF:ää (kuvio 2).

Kypsän BDNF:n primaarisekvenssi samoin kuin yleinen rakenne ja mahdollisuus prekursorimuokkaukseen viittaavat selvästi siihen että NGF- ja BDNF-geenit ovat ehkä kehittyneet yh-10 teisestä perintögeenistä. Jos kypsien polypeptidien alueella NGF-sekvensseihin luodaan vain kolme aukkoa yhteensopivuuden optimoimiseksi, kaiken kaikkiaan 51 yhteistä amino-happosamaisuutta on löydettävissä aiemmin tunnetuissa monien eri lajien NGFiistä sekä sian ja ihmisen BDNF:stä. Täl-15 laisia yhtäläisyyksiä ovat esimerkiksi kaikki kuusi kyste-iinijäämää. Tämä viittaa siihen, että NGF:t ja BDNF ovat sekundaariselta rakenteeltaan hyvin samankaltaisia. Lisäksi on havaittavissa neljä kuuden tai useamman aminohapon jaksoa, joissa kaikkien mainittujen lajien NGF:t ja sian '•?0 BDNF ovat joko identtisiä tai eroavat korkeintaan yhden ’ ' konservatiivisen aminohapposubstituution osalta, on siis '· " täysi syy olettaa, että NGF ja BDNF ovat läheisiä geeniper- heen jäseniä.

»»· • · · • » * 25 BDNF/NGF-geeniperheen uusien jäsenien tunnistaminen ratio-·:··· naalisesti voidaan toteuttaa käyttämällä lähestymistapaa, jossa käytetään hyväksi odottamattomia voimakkaasti homologisia NGF- ja BDNF-konservaatiojaksoja. BDNF/NGF-geeniper- mmm heen uusia jäseniä voidaan tunnistaa esimerkiksi valitse-"..•30 maila joukosta nukleiinihapposekvenssejä sellaiset sekvenssi': sit, jotka BDNF:llä ja NGF:llä ovat homologisia, ja sen ....: jälkeen tunnistaa valituista sekvensseistä sellaiset, jotka sisältävät myös sekvenssejä, jotka eivät ole NGF- ja BDNF- 105342 51 homologisia. Termillä "ei-homologinen" tarkoitamme aluetta, joka sisältää vähintään noin 6 vierekkäistä nukleotidiä, joista vähintään kaksi on erilaista kuin NGF- ja BDNF-sekvensseissä.

5

Eräs suositeltava keksinnön mukainen menetelmä on seuraavan lainen. Jokaista neljää konservaatiojaksoa ("box”), joita edellä kuvattiin ja jotka on lueteltu edempänä taulukossa III, kohden voidaan syntetoida vähintään 18 nukleotidin 10 degeneraattioligonukleotidin koetinryhmää, jotka vastaavat kaikkia mahdollisia koodaavia sekvenssejä aminohapoissa, joita joko NGF:ssä tai BDNFzssä on yli kuuden vierekkäisen kodonin. Numeroimalla kypsien polypeptidien aminopäätteet (niin että prepro-BDNFzn Hisl34 :ää käsitellään kuten kyp-15 sän proteiinin Hislztä), voidaan määritellä neljä "boksia" seuraavaan tapaan (numeroituna suhteessa kypsiin ihmisen proteiineihin; DNA-sekvenssi kuten kuviossa 1): 20

TAULUKKO III

« · I • · * · « · t *:··: DNA-sekvenssi :\}25 Box 1: NGF GlylO - Serl9 • · BDNF Gly8 - Ser 17 587-616 i ·· » · · • · ·

Box 2: NGF Lys50 - Cys58 . BDNF Lys50 - Cys58 713-739 • · 30 • · · '·] * Box 3: NGF Gly67 - Asp72 BDNF Gly67 - Asp72 764-781 • i · • «

Box 4: NGF Trp99 - Cyslio ’·' 35 BDNF TrplOO - Cyslll 863-898 « · 105342 52

Synteettisiä oligonukleotidejä, jotka on johdettu taulukon III "boksien" sekvenssipareista, voidaan käyttää alukkeina vahvistamaan kiinnostavan lähteen (DNA tai RNA) sekvenssejä PCR-menetelmällä. Tähän sopivat minkä tahansa BDNF:ää tai 5 NGF:ää lähellä olevaa polypeptidiä ilmentävän eukaryootti-sen lajin mRNA, cDNA tai genominen DNA. Suorittamalla vain kuusi PCR-reaktiota (nimittäin: aluke Box l:stä Box 2:n alukkeen kanssa; Box 1 ja Box 3; Box 1 ja Box 4; Box 2 ja Box 3; Box 2 ja Box 4; Box 3 ja Box 4), on mahdollista löy-10 tää geeni tai geenituote, jossa on mitkä tahansa kaksi yllä mainitusta neljästä NGF:n ja BDNF:n konservaattisekvenssin jaksoa. Vaikka haluttaisiin syntetoida useita erilaisia degeneraattialukkeita jokaiseen "boksiin", voi silti olla mahdollista suorittaa täydellinen etsintä kohtuullisen vä-15 täisellä PCR-reaktiomäärällä. On myös mahdollista vaihdella hybridisaatio-olosuhteiden tiukkuutta PCR-reaktioaloit-tamisessa ja antaa tuntemattoman geenin ja NGF:n tai BDNF:n nukleotidisekvenssien muistuttaa toisiaan enemmän tai vähemmän. Jos aikaisemmin tuntemattoman BDNF/NGF-geeniper-20 heen jäsenen jokin jakso saadaan vahvistettua sopivasti, tämä jakso voidaan kloonata molekulaarisesti, sekvensoida '!!! ja käyttää koettimena eristämään täydellinen cDNA tai geno-minen klooni. Tämän jälkeen saadaan määritettyä tuntemat-’ ' toman geenin täydellinen nukleotidisekvenssi, analysoitua I < < ' 2;5 sen ekspressio ja tuottaa sen proteiinituotetta toiminnal- " lisiin analyyseihin.

• · · • · · » · ·

Yllä kuvattua menetelmää on käytetty uuden, sekä BDNF:lie ·;··: että NGF:lie läheisen geenin tunnistamiseen. Sitä kuvataan - ;’;3-0 esimerkkiosassa 13, infra.

m Tämän keksinnön kohteena on lisäksi BDNF/NGF-sekvenssihomo-'·* logien käyttö uusien, BDNF/NGF-geeniperheeseen kuuluvien, muttei luonnossa esiintyvien rekombinanttimolekyylien muo- ;-Sf5 dostamiseen. Keksinnön mukainen yhdistelmämolekyyli voidaan muodostaa esimerkiksi, ei rajoittavasti, sellaiseksi, 105342 53 että se sisältää osia sekä NGF:stä että BDNF:stä. Tällaisella molekyylillä voisi olla sekä BDNF:ään että NGF:ään liittyviä ominaisuuksia sekä uudenlaisia biologisia aktiivisuuksia, niin agonistisia kuin antagonistisia. BDNF- ja 5 NGF-primaarisekvenssejä voidaan käyttää myös ennustamaan molekyylin tertiääristä rakennetta tietokonesimulaation avulla (Hopp ans Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824-3828)? kimeerisiä BDNF/NGF rekombinanttigeenejä voidaan muodostaa tertiaarisen rakenteen ja biologisen vai-10 kutuksen valossa. Samoin on mahdollista muodostaa kimeerisiä geenejä, jotka sisältävät osia yhdestä tai useammasta mistä tahansa BDNF/NGF-geeniperheen jäsenestä, mukaanlukien uusi, osassa 13 kuvattu jäsen.

15 5.9. Keksinnön käyttö Tämä keksintö liittyy BDNF-nukleiinihapposekvenssiin, sen olennaisesti puhtaaseen proteiiniin, peptidifragmentteihin tai johdannaisiin. BDNF:ää voidaan ensimmäistä kertaa 20 tuottaa riittäviä määriä diagnostiseen ja terapeuttiseen käyttöön. Myös anti-BDNF-antigeenejä, joita samoin on en-*::: simmäistä kertaa saatavilla tämän keksinnön ansiosta, sekä BDNF-nukleiinihappokoettimia voidaan käyttää diagnostisesti • · · « « ' ja terapeuttisesti. Useimpiin tarkoituksiin on sopivinta ' '25 käyttää saman lajin BDNF-geenejä tai -geenituotteita diag-nostisissa tai terapeuttisissa sovellutuksissa, vaikka la- • · · : jien välinen BDNF:n käyttö saattaakin olla sopivaa keksin nön joissakin erityisissä toteutusmuodoissa.

;'j’30 5.9.1. Diagnostinen käyttö r » • · · Tätä keksintöä, jonka kohteena ovat BDNF:ää koodaavat nuk-'···’ leiinihapot sekä niistä tuotetut proteiinit, peptidifrag- mentit tai johdannaiset, samoin kuin vasta-aineet BDNF-pro-·:··35 teiinille, -peptideille tai -johdannaisille, voidaan käyt- 105342 54 tää diagnosoitaessa hermoston sairauksia ja häiriöitä, jotka ilmeisesti liittyvät muutoksiin BDNF-ekspressiossa.

Keksinnön eri toteutusmuodoissa BDNF-geenejä ja läheisiä 5 nukleiinihapposekvenssejä ja -alisekvenssejä, myös komple- * mentaarisia sekvenssejä, voidaan käyttää diagnostisissa hybridisaatiokokeissa. BDNF-nukleiinihapposekvenssejä tai alisekvenssejä, jotka sisältävät noin 15 nukleotidiä, voidaan käyttää hybridisaatiokoettimina. Hybridisaatiokokeita 10 voidaan käyttää etsimään, ennustamaan, määrittämään tai seuraamaan olosuhteita, häiriöitä tai tautitiloja, jotka liittyvät muutoksiin BDNF-ekspressiossa, erityisesti tiloissa, jotka ovat seurausta sensoristen neuronien vahingoittumisesta tai verkkokalvon hermosolujen degeneroitumi-15 sesta. Tällaisia tauteja ja tiloja ovat, ei rajoittavasti mainittuna, keskushermoston vammat, infarktit, infektiot, degeneratiiviset hermosairaudet, pahanlaatuiset kasvaimet tai operaation jälkeiset muutokset, mukaan lukien, ei rajoittavasti lueteltuna, Alzheimerin tauti, Parkinsonin tau-20 ti, Huntingtonin tauti ja verkkokalvon rappeutumasairaudet.

Esimerkiksi voidaan tutkia potilaan kudosnäytteen kokonais-RNA ja etsiä BDNF-mRNA, jonka määrän väheneminen osoittaa neuronien degeneroitumista. Suhteellisen korkeita BDNF-·: mRNA-pitoisuuksia on havaittu neuroblastoomakasvainsoluissa :'.2S (yksityiskohtaisemmin osassa 14, infra), ja tämän keksinnön • · erään toteutusmuodon mukaan voidaan BDNF-nukleiinihappo- • · koettimia käyttäen havaittuja lisääntyneitä mRNA-pitoisuuk- • · · siä käyttää varhaishermosolukasvaimen diagnosointiin. Kos-. ka useimmat kudokset syntetoivat äärettömän vähän BDNF:ää, 1^3*0 BDNF-mRNA on huomattavan käyttökelpoinen kasvainten merkit-V : sijä.

Vaihtoehtoisissa keksinnön toteutusmuodoissa BDNF-proteii- • « · nia, -peptidifragmentteja tai -johdannaisia voidaan käyttää I f '35 diagnosoimaan hermoston sairauksia ja häiriöitä, varsinkin tuntohermosolujen häiriöitä ja verkkokalvon degenratiivisia 105342 55 sairauksia samoin kuin aiemmin lueteltuja häiriöitä ja tauteja. Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää esimerkiksi in situ-hybridisaatiotekniikoissa, joissa käytetään tutkittavan potilaan kudosnäytteitä. Edelleen, kek-5 sinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää ELISA-mene-telmissä havaitsemaan ja/tai mittamaan kudos- tai nes-tenäytteissä läsnä oleva BDNF-määrä. Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää samoin western Jblot-ana-lysoinnissa havaitsemaan ja/tai mittamaan kudos- tai nes-10 tenäytteissä läsnä oleva BDNF-määrä. Keksinnön mukaista vasta-ainetta, jota voidaan käyttää BDNF:n sitomiseen ELISA- ja vestern-menetelmissä, kuvataan osassa li, infra.

Eräissä keksinnön toteutusmuodoissa BDNF-proteiinia, -pep-15 tidifragmentteja tai -johdannaisia voidaan käyttää hermoston tautien ja häiriöiden diagnosointiin. Erään erityisen, ei-rajoittavan, toteutusmuodon mukaan voidaan leimattua BDNF-proteiinia tai -peptidifragmenttia käyttää tunnistamaan kudoksia tai soluja, jotka ilmentävät BDNF-reseptoria, 20 tarkoituksena tunnistaa poikkeamat BDNF-reseptoriekspres-. siosta ja sen myötä mahdolliset poikkeavuudet kudoksen tai solujen BDNF-vasteessa.

f ' ' 5.9.2. Terapeuttinen käyttö :.'·25 Tätä keksintöä, joka liittyy BDNFrää koodaaviin nukleiini- :/*: happoihin ja niistä tuotettuihin proteiineihin, peptidi- fragmentteihin tai johdannaisiin, samoin kuin BDNF-prote- ·:··: iinin, -peptidien tai -johdannaisten vasta-aineisiin, voi- ,·:·30 daan käyttää hoidettaessa hermoston sairauksia ja häiriöi- • tä, jotka ilmeisesti liittyvät muutoksiin BDNF-ekspression w * · * kulussa tai joille altistus BDNF- tai anti-BDNF-vasta-ai-neelle ilmeisesti on edullista.

....35 Erilaisissa keksinnön mukaissa toteutusmuodoissa BDNF-proteiinia, -peptidifragmentteja tai -johdannaisia voidaan 105342 56 antaa potilaille, joiden hermosto on vahingoittunut vamman, leikkauksen, iskemian, tulehduksen, aineenvaihduntasairauden, riittämättömän ravinnon, pahanlaatuisen kasvaimen tai myrkyllisten aineiden vuoksi. Keksintöä voidaan erityises- 5 ti käyttää hoitamaan tiloja, joissa vahinko on kohdistunut sensorisiin hermosoluihin tai verkkokalvogangliosoluihin, antamalla terapeuttisesti tehoavia määriä BDNF-proteii-nia, -peptidifragmentteja tai -johdannaisia. Erilaisissa erityisissä keksinnön mukaisissa toteutusmuodoissa BDNF:ää 10 voidaan antaa paikallisesti sensorisiin neuroneihin, jotka ovat vahingoittuneet, muun muassa, ei rajoittavasti lueteltuna, neuroneihin selkäydinhermon takajuuren ganglioissa tai jossain seuraavista kudoksista : genikulaatti-, pet-rosaali- ja nodoosigangliot, Vili kallohermon vestibulo-15 akustinen kompleksi, kolmoishermoganglion maksillomandibu-laarisen lohkon ventrolateraalinen puoli ja mesenkefalinen kolmoishermon tumake. Saattaa olla edullista antaa BDNF-sukuiset peptidit tai BDNF-proteiini imeytettynä kalvolle, esim. sialastikalvolle, joka voidaan implantoida lähelle 20 vahingoittunutta hermoa. Tätä keksintö voidaan käyttää myös esimerkiksi nopeuttamaan sokeritautiin liittyvistä '!!! hermosairauksista, esim. mononeuritis multiplexistä kärsi-• • « vien potilaiden paranemista. Eräissä keksinnön mukaisissa | ’ toteutusmuodoissa BDNF-proteiinia, -peptifragmentteja tai - » f · ’·2¾ johdannaisia voidaan käyttää hoidettaessa synnynnäisiä ti- m *· * loja tai neurodegenratiivisia sairauksia, joista voidaan ei • ·· : rajoittavasti mainita Alzheimerin tauti, Parkinsonin tauti,

Parkinson-plus -oireyhtymät (joissa Parkinsonin taudin oi-*:··: reet johtuvat dopaminergisten hermosolujen degeneroitumi- .

;’;30 sesta), esimerkiksi Steele-Richardson-01szewski-oireyhtymä (progressiivinen supranukleaarinen halvaus), olivoponto- • · · serebellaarinen atrofia (OPCA), Shy-Drager-oireyhtymä (mul- • · ’···’ tippeli elinryhmäatrofia) ja Guamanian-parkinsonismi-demen-tiakompleksi, sekä Huntingtonin tauti. Erityisen hyvin *:-3*5 keksintö soveltuu parantamaan synnynnäisiä tai neurodege-neratiivisia sairauksia, jotka liittyvät sensoristen her- 105342 57 mojen häiriöihin ja verkkokalvon degeneratiivisiin sairauksiin. Keksinnön mukaisia BDNF-proteiinia, -peptidifrag-mentteja tai -johdannaisia voidaan käyttää esimerkiksi hoidettaessa perinnöllistä spastista paraplegiaa, johon 5 liittyy verkkokalvon degeneroitumista (Kjellin and Barnard-Scholz -oireyhtymät), retinitis pigmentosaa, Stargardtin tautia, Usherin oireyhtymää (retinitis pigmentosa ja synnynnäinen kuulonmenetys) ja Refsumin oireyhtymää (retinitis pigmentosa, synnynnäinen kuulonmeneteys ja polyneuropatia), 10 vain muutamia mainitaksemme. On mahdollista, että häiriö BDNF-synteesissä tai -vasteessa voi olla piilevä sairauden syy oireyhtymissä, joille on tunnusomaista verkkokalvon rappeutuminen yhdessä jonkin muun sensorisen häiriön kanssa .

15

Erityisessä keksinnön toteutusmuodossa BDNF-proteiinin, -peptidifragmenttien tai -johdannaisten antaminen voidaan yhdistää kudoksen kirurgiseen implantoimiseen hoidettaessa Alzheimerin tautia ja/tai Parkinsonin tautia. Kuten tulee 20 esiin osissa 12 ja 18, infra, BDNF:ää voidaan käyttää edistämään dopaminergisten substantia nigra -neuronien elossa ·:· pysymistä annosriippuvaiseen tapaan (kuvio 34). Tämä tukee BDNF:n käyttöä keskushermoston dopaminergisten neuronien · · ....: sairauksien hoidossa, mm. Parkinsonin taudin hoidossa (eri- .\2;5 tyisesti osan 21, infra, esiin tuoman tiedon valossa, joka · · ' osoittaa, että BDNF:ää voidaan käyttää estämään neurotoksi-• · ... suutta, jonka aiheuttaa MPP, eräs toksiini, joka liittyy ·* ' Parkinson taudin kaltaisen oireyhtymän syntymiseen).

BDNF:n on lisäksi havaittu edistävän keskushermoston ko- *3*0 linergisten neuronien elävänä pysymistä (osat 12 ja 16, • · · : infra), erityisesti basaalisissa (alkion) etuaivojen ko-

T I

. .·. linergisissä neuroneissa, mikä osoittaa, että BDNF ilmei-• « · .···. sesti on käyttökelpoinen hoidettaessa kolinergisten neuro-• « "·' nien häiriöihin liittyviä sairauksia, muun muassa Alzheime-V3’5 rin tautia. On osoitettu, että noin 35 % Parkinson-poti-laista kärsii Alzheimerin taudin tyyppisestä dementiasta? 105342 58 keksinnön mukaisesti tuotettu BDNF saattaa osoittautua käyttökelpoiseksi yhden aineen hoitomuotona tälle tautikom-pleksille. Keksinnön mukaisesti tuotettua BDNFrää voidaan samaan tapaan käyttää terapeuttisesti hoidettaessa Alzhei-5 merin tautia, johon liittyy Downin oireyhtymä. Keksinnön *· mukaisesti tuotettua BDNFrää voidaan käyttää hoidettaessa monenlaisia dementioita samoin kuin synnynnäisiä oppimishäiriöitä. BDNF:n on havaittu myös vaimentavan astroglia-solujen proliferaatiota, eli BDNFrää voidaan siis käyttää 10 vähentämään arvenmuodostusta keskushermostossa (esimerkiksi leikkauksen, vamman tai kudoskuolion jälkeen), samoin kuin astrogliaperäisiä keskushermoston kasvaimia. Edelleen keksinnön erään toteutusmuodon mukaan BDNFrää voidaan käyttää NGF-reseptorin ekspression säätelyyn ja tällöin sitä on 15 edullista antaa tällaista hoitoa tarvitsevalle potilaalle ennen tai samaan aikaan kuin NGFrää.

Kuten osassa 15, infra, tulee esiin, BDNF-ekspression (ja vähemmässä määrin myös NGF-ekspression) lisäämiseen neuro-20 neissa, niin hippokampuksen (aivoturson) kuin aivokuorenkin hermosoluissa, voidaan käyttää kainiinihappoa. On havait-tu, että (osa 15, infra) ei-NMDA-reseptorien inhibitio lo- • · petti tämän kainiinihapon välittämän lisäyksen BDNF-eks- [ pressiossa. Tämän perusteella keksinnön mukaisen BDNF:n ja • · · ’•2*5 BDNF-sukuisten peptidien ekspressio voidaan indusoida in MM» ' ' vitro tai in vivo antamalla kainiinihappoa, sen sukuisia ·»· V · yhdisteitä, karbakolia, histamiinia, bradykiniiniä tai sen sukuisia yhdisteitä, joilla on havaittu samankaltaisia vai- *:·*: kutuksia in vitro tai in vivo, ei-NMDA-glutamaattiresepto- •*£*9 rien agonisteja tai muita lääkkeitä, jotka lisäävät tai jäljittelevät asetyylikoliinin, histamiinin tai bradykinii-• · · ' *·|·* nin vaikutusta. NGF-ekspressio voidaan indusoida myös an-*·;·’ tamalla kainiinihappoa, sen sukuisia molekyylejä tai ei-NMDA-reseptorien agonisteja.

•:3*$ 105342 59

Keksinnön eräässä toteutusmuodossa BDNF-proteiinia, -fragmentteja tai -johdannaisia voidaan käyttää yhdessä muitten sytokiinien kanssa halutun neurotrofisen vaikutuksen aikaansaamiseksi. Keksinnön mukaan BDNF:ää voidaan muun 5 muassa käyttää yhdessä NGF:n tai luustoon liittyvistä lihaksista saadun uutteen kanssa aikaansaamaan synergistinen stimuloiva vaikutus sensoristen neuronien kasvuun; syner-gistisellä vaikutuksella tarkoitetaan, että BDNF-proteii-nin, -peptidifragmentin ja -johdannaisen sekä toisen aineen 10 yhteisvaikutus on suurempi kuin samalla määrällä jompaa kumpaa ainetta erikseen käytettynä. On ilmeistä, että BDNF vaikuttaa synergisesti muitten keskushermostojohtoisten peptiditekijoiden kanssa, joita ei vielä ole täysin karakterisoitu, sekä hyvin monien hermosolualaryhmien kasvuun, 15 kehitykseen ja elävänä pysymiseen keskushermostossa.

Edelleen on ilmeistä, että BDNF-molekyylin täydellisen karakterisoinnin ansiosta voidaan kehittää uusia BDNF-pepti-difragraentteja, -johdannaisia tai -mutantteja, jotka vai-20 kuttavat antagonistisesti joihinkin tai kaikkiin BDNF:n biologisiin vaikutuksiin. Tällaiset BDNF-antagonistit voi-vat olla hyödyllisiä sensoristen neuronien selektiivisessä : ablaatiossa, esimerkiksi hoidettaessa oireyhtymiä, joihin ·;·; liittyy kroonista kipua.

.·. 25 • · · * · ....: Edelleen keksinnön erään toteutusmuodon mukaan BDNF-prote- • · iineja, -peptidifragmentteja tai -johdannaisia vastaan vai- • · · kuttavia vasta-aineita voidaan antaa potilaille, jotka kärsivät erilaisista neurologisista häiriöistä ja taudeista, ^0 ja jotka tarvitsevat tällaista hoitoa. Esimerkiksi poti- • t · t · · . V ' laat, jotka kärsivät liiallisesta BDNF-tuotannosta, voivat « : tarvita tällaista hoitoa. Anti-BDNF-vasta-aineita voidaan r · · .···. käyttää estämään sensoristen hermosolujen normaalista poik-keavaa regeneroitumista (esim. leikkauksen jälkeen), tai, • · · *1 |35 kuten aiemmin jo tuli esiin, krooniseen kipuun liittyvien 1 oireyhtymien hoitoon. Koska BDNF-mRNA -pitoisuudet ovat 105342 60 huomattavat neuroblastoomakudoksessa, on mahdollista, että BDNF toimii autokriinisenä tuumorikasvutekijänä varhaisher-mosolukasvaimissa. Anti-BDNF-vasta-aineita voidaankin keksinnön erään erityisen toteutusmuodon mukaan antaa tera-5 peuttisesti kasvainregressioon.

5.10. Lääkekoostumukset

Keksinnön mukaisia aktiivisia koostumuksia, jotka voivat 10 sisältää koko BDNF-geenituotteen tai osia siitä, mukaanlukien BDNF-proteiini, -peptidifragmentit tai -johdannaiset, vasta-aineet (tai vasta-ainefragmentit) BDNF-proteiinil-le, -peptidifragmenteille tai -johdannaisille tai BDNF:n ja toisen aineen, esimerkiksi NGF:n tai luustoon kiinnittyvien 15 lihasten uutteen yhdistelmää, voidaan antaa missä tahansa bioyhteensopivassa farmaseuttisessa steriilissä kantoai-neessa, joista voidaan mainita mm. suolaliuos, puskuroitu suolaliuos, dekstroosi ja vesi.

20 BDNF-proteiini- -peptidifragmentti tai -johdannainen voi ... sisältää aminohapposekvenssin tai sen alisekvenssin, joka ’J” on olennaisesti kuviossa 1 tai kuviossa 5 esitetyn kaltai-• * 9 9 nen. On suositeltavaa käyttää BDNF-proteiinia, joka sisäl-j tää kuviossa 1 esiin tulevan koko aminohapposekvenssin noin • 9 '· ”25 aminohaposta 134 aminohappoon 252 tai osan siitä, tai sitä toiminnallisesti vastaavan sekvenssin, sillä tämän alisek- ··♦ v * venssin oletetaan sisältävän BDNF-molekyylin toiminnallisen osan. BDNF voidaan johtaa sekvensseistä, jotka vastaavat ···· minkä tahansa sopivan lajin, esimerkiksi mainittakoon ihmi-30 nen, sika, rotta, kana, lehmä, koira, lammas, vuohi, kissa ·, ja kani, BDNF-geenejä.

t · · ’ 9 9 a a · 9 9 9 • · *···’ Käytettävän BDNF-proteiinin, -peptidifragmentin, -johdan- naisen tai tietyn häiriön tai tilan hoidossa tehoavan vas- a ·;···35 ta-aineen määrä riippuu häiriön tai tilan luonteesta, ja voidaan määrittää kliinisillä standarditekniikoilla. Sil- 105342 61 loin kun on mahdollista, on suositeltavaa määrittää keksinnön raukaiset annosvastekäyrä ja lääkekoostumukset ensin in vitro, esimerkiksi käyttämällä jo kuvattuja BDNF-bioanalyy-sejä, sen jälkeen käyttökelpoisessa eläinmallimenetelmässä 5 ja lopuksi kokeita ihmiselle. In vitro-tietoon pohjautuvan keksinnön mukaisen erään erityisen toteutusmuodon mukaan lääkeainekoostumus, joka edistää sensoristen neuronien elävänä pysymistä, voi aikaansaada paikalliseksi BDNF-prote-iinipitoisuudeksi noin 5-25 ng/ml, edullisesti 10-20 ng/ml.

10 Eräässä toisessa erityisessä keksinnön mukaisessa toisessa toteutusmuodossa lääkekoostumus, joka edistää dopaminergis-ten tai kolinergisten hermosolujen kasvua ja elävänä pysymistä, voi aikaansaada paikalliseksi BDNF-proteiinipitoi-suudeksi noin 10-100 ng/ml.

15

Antotavoista voidaan mainita mm. intradermaalinen, intra-muskulaarinen, intraperitoneaalinen, intravenoosinen, sub-kutaaninen, oraalinen ja intranasaalinen. Lisäksi saattaa olla toivottavaa antaa keksinnön mukaisia lääkekoostumuksia 20 keskushermostoon mitä tahansa sopivaa menetelmää käyttäen, esimerkiksi intraventrikulaarista tai intratekaalista in- • · · ·;;; jektointia. Intraventrikulaarista ruiskuttamista voidaan

I I

'···' helpottaa käyttämällä intraventrikulaarista katetria, joka « on kiinnitetty nestesäiliöön, esimerkiksi Ommaya-nestesäi- t · •.*2*5 liöön.

• ·

Edelleen saattaa olla toivottavaa antaa keksinnön mukaisia lääkekoostumuksia hoitoa tarvitsevalle alueelle paikalli- ....: sesti. Tämä voidaan tehdä käyttämällä esimerkiksi paikal- .--.3.0 lista infusointia leikkauksen aikana, injektoimalla, katet- · · rin avulla tai käyttäen istutetta, joka on huokoista, ei-huokoista tai hyytelömäistä materiaalia, esimerkiksi sia-lastikalvon tapaisia kalvoja tai kuituja.

·♦· * · · • · * ...3;5 Keksintö koskee myös lääkekoostumuksia, jotka sisältävät BDNF-proteiineja, -peptidifragmentteja tai -johdannaisia, 105342 62 annettuna liposomien, mikrohiukkasten tai mikrokapseleiden avulla. Keksinnön monissa toteutusmuodoissa saattaa olla edullista käyttää tällaisia koostumuksia, jotta päästäisiin BDNF:n tai BDNF:n sukuisten tuotteiden jatkuvaan vapautta-5 miseen.

n

On ilmeistä, että BDNF:ää, BDNF:n sukuisia aineita, BDNF— antagonisteja tai anti-BDNF-vasta-aineita aktiivisesti tuottavia soluja pystytään antamaan alueille, joilla tarvi-10 taan suurempia tai pienempiä BDNF-pitoisuuksia.

6. Esimerkki: Sian BDNF-cDNA;n molekulaarinen kloonaus ia karakterisointi 15 Koska BDNF-proteiinia on kudoksissa niin vähäisiä määriä, BDNF-geenin kloonaukseen ei voitu käyttää standardimenetelmiä. Sen sijaan laajennettiin rajallista proteiinisekvens-sitietoutta käyttämällä seuraavanlaista DNA-vahvistustekno-logiaa: 20 (i) Mikrogrammojen suuruisia BDNF-määriä puhdistettiin • Ml kilogrammojen suuruisista määristä sian aivoja.

• I

• · · · · • . . (ii) Puhdistettu BDNF analysoitiin proteiinimikrosekven- · · ' £5 sointimenetelmällä ja saatiin määritettyä 36 aminohappojää- [ * mästä muodostuva aminohapposekvenssin pätkä.

• « ·

• · I

(iii) Kohdassa (ii) määritettyä aminohapposekvenssiä käyt-täen syntetoitiin oligonukleotidejä ja käytettiin sitten :Tso niitä alukkeina polymeraasiketjureaktiossa, sian colliculus . ]·. superiorin cDNA:ita templaattina vahvistamassa määrättyä • · » !’! aminohappofragmenttia koodavaa DNA:ta.

« · · • « · :.ί; (iv) Kohdan (iii) DNA-reaktiotuote sekvensoitiin ja ·:··ί35 105342 63 (v) syntetoitiin vastaavat oligonukelotidialukkeet ja käytettiin polymeraasiketjureaktiossa sian colliculus supe-riorin cDNA:n kanssa luomaan limittäisiä BDNF-mRNA-DNA-fragmentteja sekä "ylävirtaan" että "alavirtaan" alkuperäi-5 siä 36 aminohapposekvenssiä koodaavista sekvensseistä.

Näin täydellinen sian BDNF:ää koodaava alue saatiin moleku-laarisesti kloonattua kahteen limittäiseen fragmenttiin.

Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti näitä vaiheita 10 sekä karakterisoidaan edelleen BDNF-geeniä.

6.1. Materiaalit ja menetelmät 6.1.1. BDNF:n puhdistaminen sian aivoista 15 BDNF:n puhdistaminen sian aivoista toteutettiin käyttämällä menetelmää, jota kuvaavat Hofer ja Barde, 1988, Nature 331: 261-262.

Kuusi kiloa sian aivoja homogenoitiin Ultra-Turrax-homo-

20 genaattorilla, 0,2 M natriumfosfaattipuskuri, pH 6,0, 1 mM

EDTA ja juuri lisättyä fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (1 \!! mM) suhteessa 1 kg aivoja 2 litrassa puskuriainetta. Su-« · *”. pernatantin pH säädettiin arvoon 4,0 1 N HCl:llä ja sekoi- • · t · · [ ] tettiin sitten 2 tuntia 4 *C:ssa. Kun 3 kg aivoja vastaa- • » · *· 'Ϊ25 vaa määrää yhdistettyjä supernatantteja oli sentrifugoitu *·’** 25 minuuttia 20000 x g (pH säädettynä arvoon 6,0 1 N NaOH:- ··· : 11a), niitä sekoitettiin 2 tuntia 1 litran etukäteen turvo tetun karboksimetyyliselluloosamäärän kanssa, joka oli ta-·;·«· sapainotettu 0,1 M natriumfosfaatilla, pH 6,0. Kahden pe-:*;*j}0 sun jälkeen, joissa käytettiin kaikkiaan 20 litraa 0,1 M . *. natriumfosfaattia, pH 6,0, liete kaadettiin kolonniin ja • v ·

pestiin yli yön samalla puskurilla, joka sisälsi 0,13 M

• · ’···' NaCl. Aktiiviset jakeet eluoitiin fosfaattipuskurilla, joka sisälsi 0,5 M NaCl ja dialysoitiin vasten 2x5 litraa ·;···35 5 mM kaliumfosfaattia, pH 6,8. Dialysoidut jakeet, jotka saatiin 2x3 kg:sta lähtömateriaalia, pantiin alustatila- 105342 64 vuudeltaan 130 ml:n hydroksiapatiittikolonniin, joka oli etukäteen tasapainotettu 5 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,8. Kolonnia eluoitiin lineaarisella gradientilla, jossa oli 500 ml 5 mM kaliumfosfaattia ja 500 ml 700 mM kaliumfos-5 faattia, molempien pH 6,8, jolloin BDNF-aktiivisuus eluoitiin keskimäärin 500 mM kaliumfosfaatilla (katso Barde et ai., 1982, EMBO J. 1:549-553). Lisäämällä 0,1 M kaliumfosfaattia yhdistetyt aktiiviset jakeet säädettiin lopulliseen molaarisuuteen, noin 700 mM kaliumfosfaattia, ja pantiin 5 10 ml:n fenyylisefaroosikolonniin, joka oli tasapainotettu 700 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,8. Kun oli suoritettu pesu noin 40 ml:11a samaa puskuria, BDNF-aktiivisuus eluoitiin 0,1 M kaliumfosfaatilla, pH 6,8, dialysoitiin vasten tislattua vettä ja lyofilisoitiin. Lyofilisoitu materiaali otettiin 15 SDS-geelielektroforeesikoepuskuriaineeseen, joka sisältää 0,1 % natriumdodesyylisulfaattia, ei merkaptoetanolia (Barde et ai., 1982, EMBO J, 1:549-553), ja lisättiin SDS-gee-liin, joka muodostui 10-25 % akryyliamidia sisältävästä lineaarisesta (mieluummin kuin eksponentiaalisesta) gra-20 dientista. Kun elektroforeettinen erottaminen oli suoritettu, geeliä värjättiin vähän aikaa (10 minuuttia Coomas- • I · ;;; sie-sinellä, poistettiin väriä noin 20 minuuttia ja sitten • » ’···’ cytochrome c -kohdalla kulkeva vyöhyke voitiin leikata ja ’ · eluoida elektroforeettisesti geelistä. SDS poistettiin * » ’.*·: 25 tapaan, jota kuvaavat Barde et ai., EMBO J. 1:549-553.

·:**: Puhdistusvaihetta, jonka jälkeen päästiin BDNF:n raikrosek- ven^ointiin, muutettiin (Hofer ja Barde, 1988, Nature 331: 261-262), siinä ei puhdistuksen viimeisessä vaiheessa käy- ....: tetty geelielektroforeesia.

30 • · · 6.1.2. Proteiinisekvensointi • · * • · · • · · • · · ·...· BDNF sekvensoitiin joko suoraan (55 pmoolia määritettynä aminohappoanalyysillä, lähtösaanto 40 pmoolia aminopääte-35 histidiinillä) tai pilkottuna seuraavaan tapaan: 5-10 μg BDNF:ää (5 eri valmistuksesta) pilkottiin seuravasti. V8: 105342 65 l^g S. aureus V8:aa (Miles) lisättiin 5 μg:aan BDNF:ää 0,2 M NH4C03, pH 8,0, 10 % asetonitriiliä (kokonaistilavuus 50 μΐ), inkuboitiin huoneen lämmössä yli yön. Trypsiini: 1 pq TPCK-käsiteltyä trypsiiniä (naudan haima, Sigma Type XIII) 5 lisättiin 8 μg:aan BDNF:ää tris-HCl:ssä (0,1 M, pH 8,0), 10 mM CaCl2 (kokonaistilavuus 40 μΐ) ja inkuboitiin yli yön 37 *C:ssa. Syanogeenibromidi (CNBr): 10 μg BDNFrää ja 10 % (w/v) CNBr:ää 70 % (v/v) muurahaishappoa (lopulliset pitoisuudet) inkuboitiin 3 tuntia huoneen lämmössä (kokonaisti-10 lavuus 60 μΐ). Kun oli lisätty 500 μΐ H20 reaktion lopuksi, koe-erä konsentroitiin 50 pl:aan speed-vac-laitteessa.

50 μΐ tris-HCl (1,0 M, pH 8,0) lisättiin yhdessä 5 μ1:η B-merkaptoetanolimäärän kanssa ja koe-erää inkuboitiin yli yön 37 'C:ssa. Kun oli lisätty 5 μΐ jodometaania, koe-erä 15 haihdutettiin kuivaksi speed-vac-laitteessa. BDNF:n reduktio ja alkylointi CNBr-pilkkomisen jälkeen katsottiin tarpeelliseksi: ilman reduktiota ei saatu fragmentteja, kuten paljastaa HPLC- ja Swank-Munkres-SDS-geelielektroforeesi (Swank and Munkres, 1971, Anal. Biochem. 39:462-477). Tämä 20 viittaa siihen, että BDNF:ssä on disulfidisiltoja, sellai-sessa järjestyksessä, ettei mikään pilkkominen tuottanut '.'il vapaita peptidejä. Kaikkien pilkkomisten jälkeen kuivatut • « • · koe-erät suspendoitiin uudestaan 0,1 trifluoroetikkahappoon • * I » · | (TFA) ja pantiin käänteisfaasi-C8-mikrohuokos-HPCL-kolon- » · * *· "25 niin (Applied Biosystems), ja peptidejä eluoitiin 0,1 « ml/min käyttämällä 60 min lineaarista gradienttia, 0-60 % • ·« · asetonitriiliä 0,1 % TFA:ta. Havaitsemisessa käytettiin

Waters 441 UV-detektoria, 214 nm. Peptidit sekvensoitiin . ·;··· käyttämällä automaattista Edmanin degradaatiota kaasufaasi- 30 mikrosekventorissa (malli 470A, Applied Biosystems) (He- . ·. wick, 1981, J. Biol. Chem. 256:7990-7997 ja Hunkapillar, » · · ’···' 1983, Methods Enzymol. 91:227-236). PTH-aminohappojen de- ’···* tektoinnissa käytettiin tapaa, jota kuvaa Lottspeich, 1985, J. Chromatogr. 326:321-327).

·:·: 35 105342 66 6.1.3. DNA-templaattien valmistaminen

Sian genominen DNA eristettiin käyttäen menetelmää, jonka ovat kehittäneet Herrmann and Frischauf, 1987, Methods.

5 Enzyraol. 152:180-183.

▼ cDNArn valmistamiseen tarvittava kokonais-RNA saatiin 6 grammasta sian aivon colliculus superiorin (keskiaivojen yläkukkula) koe-erästä. Kudosnäyte saatiin, dissekoitiin 10 ja jäädytettiin nestemäiseen typpeen paikallisessa teurastamossa. RNA:n uuttamiseen käytettiin standardimenetelmiä (Okayama et ai., 1987, Methods Enzymol. 154:3-28). Kahdeksankymmentä Mg kokonais-RNA:ta siirrettiin käänteistrans-kiptaasia käyttäen Moloney-hiirileukemiaviruksen avulla 15 (BRL, muutoin valmistajan ohjeiden mukaan, vain 1 μ1:η RNa-sin-lisäys ja aktinomysiini-D:n poisjättäminen), alukeseos CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTT, jossa A, C tai G nukleotidin 3'-päänä (oligo3, muodostettuna sopimaan 3' poly-A -pätkään, sisältäen tunnistuskohdat BamHI:lle, EcoRI:lle ja 20 PstI:lie).

6.1.4. Polymeraasiketjureaktio • · ’· ’· 25 Polymeraasiketjureaktio (PCR) toteuttiin käyttämällä mene-telmää, jota kuvaavat Saiki et ai., 1985, Science 230:1350-1354).

·:··· 6.2. Tulokset ja arviointi _ .1.1· 30 6.2.1. Proteiinimikrosekvensoinnin tulokset t · i ? • · m ·.:.1 Tulokset proteiinimikrosekvensoinnista on esitetty taulu- • · ’···’ kossa IV.

« · ψ ·:·· 35

TAULUKKO IV

105342 67

KOKEELLISESTI MÄÄRITETYT BDNF-PEPTIDISEKVENSSIT

5 _

N-pää HSDPARRGELSV

V8 XVTAADKKTAVD

V8 KVPVSKGQLKQYFYE

CNBr XGGTVTVLEKVP(V) (S)

10 CNBr GYTKEGXRGIXRGI

Trypsiini (T)AVDMSGGTVTVLEK

Trypsiini ALTMDSK

Yhdistelmäsekvenssissä VTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGOLKOYFYE 15 alleviivatut aminohapot ovat sekvenssejä, joita PCR:ssä käytetyt oligonukleotidialukkeet koodaavat (ks. osa 6.1.2.) 20 Neljä vierekkäistä aminohapposekvenssijaksoa määritettiin . käyttämällä Edmanin degradaatiota, ja niitä puolestaan voi-;;; tiin käyttää dedusoimaan noin kolmasosaa koko aminohappo- sekvenssistä edustava 36 aminohapon sekvenssi.

V·: 25 6.2.2. Oligonukleotidien syntetointi ja PCR:n käyttö DNA: • « : ta koodaavan aminohappo jakson valmistamiseen ....: Syntetoitiin kemiallisesti kaksi täysin degeneratiivista 17 .·:·. 30 meerin oligonukleotidialuketta käyttämällä osassa 6.2.1., . ·# supra, kuvatun 36 aminohappojäämän fragmentin kuuden amino- • · · '·’··’ hapon lähellä aminopää- ja karboksyylipääloppuja sijaitse-

« « I

·...· via jaksoja koodaavia sekvenssejä. Tarkemmin sanoen synte-:'i'; toitiin kemiallisesti kaksi erillistä 17 meerin oligonukle-35 otidin (kaikki mahdolliset kodonit ja oligol ja oligo2 -merkityt) seosta käyttämällä sekvenssejä AADKKT (sense) ja 105342 68 KQYFYE (antisense) (alleviivattuna taulukossa III), ja 150 pntoolia kumpaakin aluketta lisättiin 1 Mg:aan sian genomis-ta DNA-templaattia. Suoritettiin 35 vahvistussykliä polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla valmistajien ohjeiden 5 mukaisesti (GeneAmp™, Perkin Elmer Cetus). Denaturointi toteutettiin 94 *C:ssa, 1 minuutti, alukkeen jäähdyttäminen, 45 *C, 2 minuuttia ja alukkeen laajentaminen 72 *C, 2 minuuttia. Määrätyn kokoinen (101 bp) DNA-vyöhyke leikattiin 3 % agaroosigeelistä (värjäys etidiumbromidilla) ja 10 vahvistettiin epäsymmetrisesti tavalla, jota kuvaavat Innis et ai., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:9436-9440, käyttämällä 100-kertaista ylimäärää joko oligol:tä tai oli-go2:ta.

15 6.2.3. cDNA-jakson nukleotidisekvenssi

Saatavat sense- ja antisense-säie-DNA-jaksot sekvensoitiin dideoksinukleotidiketjunlopetusmenetelmällä (Sanger et ai., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72:3918-3921) käyttäen 20 alukkeina päistään ”p-leimattuja oligonukleotidiä 1 ja 2. Seuratut nukleotidisekvenssit sisälsivät vain yhden avoimen luku jakson, jota ket junlopetuskodoni ei keskeytä. Tämän avoimen luku jakson dedusoitu aminohapposekvenssi oli täysin yhdenmukainen sian BDNF:n, tämän alueen varsinaisen amino-·. *:25 happosekvenssin kanssa.

• · • · · : 6.2.4. Sian koko BDNF-cDNA:n kloonaaminen ·:··· Täydellinen sian BDNF:ää koodaava alue kloonattiin moleku-,*:*.30 laarisesti kahteen limittäiseen jaksoon. BDNF:n cDNA:n 3'-osan (sense-säikeeseen liittyvä) aikaansaamiseksi syntetoi- • · · tiin 30 meerin oligonukleotidialuke, joka sisälsi täsmälli- • « · ·...’ sen sense-säie-BDNF-sekvenssin 21 emästä yllä kuvatulta * ;’j'; alueelta, "sense-alukkeeksi”. Tämän alukkeen nukleotidi-....:35 sekvenssi oli oligo4, 105342 69 (5'1AAACTAGTCGACGGCAGTGGACATGTCGGGί3/) (alleviivaus tarkoittaa, että sekvenssi vastaa BDNF:n sense-säiettä, kohdasta 643 kohtaan 663 kuviossa 1, joka koodaa aminohapposekvenssiä Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly (Gly-kodonin kaksi 5 ensimmäistä emästä). Tämän alukkeen muut 9 nukleotidiä 5'-päässä lisättiin, jotta saataisiin sopivia restriktioen-donukleaasipilkkomiskohtia Spe I:lle ja Sai I:lle moleku-laarisessa kloonauksessa käytettäväksi. Muodostettiin kolminkertainen 31 meerin degeneraattioligonukleotidialuke, 10 joka oli komplementaarinen poly-A-pätkälle, jota edelsi mikä tahansa cDNA:n sense-säikeen nukleotidi (T, G tai C), ja joka sisälsi tunnistuskohdat restriktioendonukleaaseille BamHI, EcoRI ja Pstl. Tämän "antisense-alukkeen" (oligo3) sekvenssi oli (5')CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTTX(3'), jos-15 sa X = A, C tai G. Synteettisiä oligonukleotidialukkeita käytettiin vahvistamaan sekvenssejä yllä kuvatunlaisessa sian colliculus superiorin cDNA:n PCR-valmistuksessa. Tarkemmin sanoen 3'-vahvistettu DNA saatiin käyttämällä 10 μΐ käänteistranskriptaasia, 150 pmoolia oligo4:ää (sense-alu-20 ke) ja 150 pmoolia oligo3:a antisense-alukkeena PCR-reak-tiossa. Vahvistetuille DNA-tuotteille suoritettiin sout-hern Jblot-analyysi, ja vyöhyke, joka antoi hybridisaa-tiosignaalin 3ip-pääteleimatun oligonukleotidin AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG (oligo5, jota käytettiin • · !.’· 25 antisense-alukkeena jäljempänä kuvatussa 5' reaktiossa ja *:··: joka sisälsi tunnistussekvenssit BamHI:lle ja Pstl:lie) kanssa, leikattiin irti, uutettiin maitolasimenetelmää käyttäen (Gene Clean), hajotettiin FcoRI:llä ja Sällillä, kloonattiin Bluescript SK+-plasmidiin (Stratagene) ja sek- • · ... 30 vensoitiin.

» · « I » t « a BDNF:ää koodaavan sekvenssin loppuosan (ylävirtaan, 5'-osa) • cDNA valmistettiin kuten yllä ja 5'-päihin lisättiin poly- .···. A-hännät terminaalideoksinukleotiditransferaasia käyttäen.

35 Samaa kolmen 31 meerin oligonukleotidin seosta, joista kukin sisälsi yllä kuvatunlaisen 12 peräkkäisen T-jäämän pät- 105342 70 kän, lisättiin tekemään näistä lisätyistä poly-A-hännistä alukekomplementaarisia. Syntetoitiin yksittäinen 30 meerin oligonukleotidialuke, joka sisälsi 17 emästä, jotka vastasivat BDNF:ää koodaavan sekvenssin komplementaarista säiet-5 tä, ja jossa oli tunnistuskohdat restirtiktioendonukle-aaseille BarnHI ja Pstl. Tämän alukkeen sekvenssi oli 15'ΊAAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGGf3M (oligo5, supra) alleviivaus tarkoittaa aluetta, joka on komplementaarinen BDNF:ää koodaavalle sense-säikeelle kohdasta 709 kohtaan 10 693 kuviossa 1; tämä vastaa jaksoa, joka koodaa aminohap posekvenssiä Pro(kodonin kaksi viimeistä emästä)-Val-Ser-Lys-Gly-Gln. Nämä alukkeet lisättiin poly-A-häntäiseen cDNA:han ja vahvistus PCR:llä suoritettiin kuten edellä. Reaktiotuotteet leikattiin PSTIrtä käyttäen ja kloonattiin 15 Bluescript-vektoriin. Nukleotidisekvenssi määritettiin dideoksinukleotidiketjunlopetusmenetelmällä.

6.2.5. Sian BDNF-cDNA nukleotidisekvenssi 20 yhdistetty nukleotidisekvenssi, joka on määritetty lirait-täisistä sian BDNF cDNA -klooneista, näkyy dedusoidun *;;; aminohapposekvenssin kanssa kuviossa 1. Sekvenssissä on *·[ avoin lukujakso 252 aminohapon polypeptidille. Initiaatto-ri Met-kodonin (ATG) tunnistus perustuu läsnä oleviin kah-25 teen vierekkäiseen ketjunlopetuskodoniin (TAG-TGA) samassa lukujaksossa, alkaen 36 emäsparia ylävirtaan. Sian BDNF- • · · : aminopääte, joka on määritetty käyttämällä puhdistetun pro teiinin suoraa sekvenssianalyysiä, vastaa tämän polypepti-·;··· din Hisl34-jäämää. Sekvensoititutkimus osoittaa siis, että 30 kypsä BDNF johdetaan prekursoripolypeptidistä. Juuri ennen 9 \ Hisl34-jäämää on sekvenssi Arg-Val-Arg-Arg. Tällaisten • · » sekvenssien, joissa on yksi emäksinen aminohappo jäämä, sen

• » I

jälkeen neutraali jäämä ja sitten kaksi emäksistä jäämää, on osoitettu olevan kohdealueita prekursoripolypeptidien 35 proteylyyttiselle muokkaukselle. Kypsän BDNF:n dedusoidus-ta aminohapposekvenssistä on odotettavissa 119 aminohapon 105342 71 proteiini (molekyylipaino 13511 daltonia, pl = 9,99); ominaisuudet vastaavat tuloksia aiemmasta BDNF-karakterisoin-nista, joissa käytettiin biologisesti aktiivisen tekijän arviointia kaksiulotteista geelielektroforeesia käyttäen 5 suoritetun fraktioinnin jälkeen. Proteiinimikrosekvensoin-tia käyttäen määritetty BDNF:n osien aminohapposekvenssi (kaikkiaan 64 aminohappojäämää) vastaa täysin aminohappo-

T

sekvenssiä, joka on dedusoitu cDNA-kloonien nukleotidi-sekvenssistä (alleviivattu kuviossa 1). Prekursoripolypep-10 tidin sekvenssi on yhdenmukainen muokattaessa BDNFrää vähintään kahdessa vaiheessa: ensin esimerkiksi 18 jäämän signaalipeptidi voidaan irrottaa aminopäästä, sen jälkeen toteuttaa pilkkominen Argl33:n ja Hisl34:n välillä kypsän polypeptidin vapauttamiseksi. Jos tämä malli on oikea, 15 prekursoria voidaan nimittää prepro-BDNF:ksi.

7. Esimerkki: BDNF-oeeni on erilainen kuin NGF-qeeni eri selkärankaislameilla 7.1. Materiaalit ja menetelmät 7.1.1. NGF- ja BDNF-DNA-koettimien valmistus 5

Hankittiin kypsää ihmisen NGF:ää koodaavan synteettisen geenin sisältävä plasmidi, normaalia ihmisen NGF:ää koodit- tavassa sekvenssissä muutama konservoiva kodonisubstituutti .·. : sopivien endonukleaasikatkaisukohtien lisäämiseksi (valmis- ....:10 taja British Biotechnologies Limited). Syntetoitiin 18 ...t meerin oligonukleotidialukepari vahvistamaan tämän geenin • · · ’ 270 emäsparin jaksoa, koodausaluetta aminohappojäämästä 9 jäämään 111, PCR-reaktio. Leimatun DNA-koettimen aikaansaamiseksi suoritettiin 10 syklin PCR-reaktio käyttämällä * · *.* * 15 32P-dCTP:tä. BDNF-koetin saatiin muutoin samanlaisin mene-* » . telmin, mutta vahvistamisessa käytettiin alkuperäisenä • · templaattina sian genomista DNA:ta ja vahvistettu jakso oli ; kypsän BDNF:n koodausalue aminohaposta 28 aminohappoon 111.

* Syntetoitiin aminohappoalueen 106-111 komplementaarinen 20 (antisense-) säie, sekvenssi (5')ACATACACAGGAAGTGTC(3').

105342 72

Sense-säie valmistettiin alueelle aminohappojäämät 28-33 [ (5')GCAGTGGACATGTCGGGT(3') ]. Suoritettiin southern blot -hybridisaatio (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517) valvotuissa olosuhteissa näillä kahdella koettimella , 2 x 5 SSC, 68 'C.

7.1.2. Eri lajien BDND-geenien sekvensointi

Samoja yllä kuvattuja sian kypsän BDNF:n aminohappoaluetta 10 28-111 koodaavaa kahta 18 meerin oligonukleotidiä käytet tiin alukkeina vahvistamaan standardi-PCR-olosuhteissa sian, rotan, kanan ja ihmisen genomisen DNA:n 252 emäspari-jaksoja ja saadut DNA-reaktiotuotteet sekvensoitiin dideok-sinukleotidiketjunlopetusmenetelmällä (Sanger et ai., 1979, 15 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72:3918-3921). Vahvistetun DNA:n vyöhyke leikattiin joissain tapauksissa irti, ekstra-hoitiin agaroosigeelielektroforeesin jälkeen ja vahvistettiin uudestaan ennen sekvensointia. Muissa tapauksissa uudelleenvahvistus ei ollut tarpeen.

20 7.2 Tuloksia ja pohdintaa

Ennen tämän keksinnön tekemistä BDNF-proteiinia oli puhdis- • · . . tettu vain sialta. Oli siis ensiarvoisen tärkeää osoittaa * * * *· *j 25 yksikäsitteisesti, ettei BDNF ole vain sian beeta-hermokas-• ♦ · · vutekijän aliyksikkö (β-NGF, yksinkertaisemmin pelkkä NGF), * ♦· :.· : jonka puhdistamista ja molekulaarista kloonaamista ei oltu raportoitu. Tämä oli erityisen tärkeää siksi, että aiemmin *:·*: esiin tuodut sian BDNF:n fysikaaliset ominaisuudet ovat :T: 30 käytännöllisesti katsoen samanlaiset monen eri lajin B-NGF- monomeerillä. Koska sian BDNF:ää neutraloivaa vasta-ainet-• · · * • · · I” ta ei ollut, eikä tietoa sian BDNF:n aminohappo- tai nukle- *” otidisekvensseistä, oli mahdotonta selvittää BDNF:n ja • : NGF:n täsmällistä suhdetta. Voitiin ajatella, että havai- *:··:' 35 tut erot BDNF:n ja NGF:n biologisessa aktiivisuudessa johtuisivat esimerkiksi yksinkertaisesti eroista sian ja jon- 105342 73 kin toisen lajin (esim. hiiren) NGF:ssä, ehkä olisivat tulosta NGF-proteiinimolekyylien erilaisesta muokkautuvuudes-ta eri kudoksissa (esim. sian aivot versus hiiren sylkirauhanen), tai tahattomista muutoksista, joita proteiiniin 5 olisi tullut jossain vaiheessa kun sitä puhdistettiin sian aivokudoksesta.

Jos BDNF:n olisi havaittu selvästi eroavan NGF:stä, olisi ollut erittäin kiintoisaa tietää, oliko BDNF-geenejä läsnä 10 muissakin lajeissa, erityisesti ihmisessä. Ennen tämän keksinnön tekemistä ei tästä kysymyksestä ollut saatavilla tietoa, sillä BDKFrää oli puhdistettu vain yhdestä lajista. Ilmeisesti NGF:stä eroavan neurotrofisen aktiivisuuden havaitseminen monissa karkeissa uutoksissa ja käsitellyissä 15 elatusväliaineissa ei vielä osoittanut sian BDNF:n kanssa identtisen tai olennaisesti vastaavan aineen läsnäoloa.

Vertailtaessa sian BDNF:n ennustettuja aminohapposekvenssejä ja useiden eri lajien (ihminen, nauta, marsu, hiiri, 20 kana, käärme) tunnettuja NGF-sekvenssejä ilmeni, että BDNF eroaa selvästi enemmän mistä tahansa selkärankaisen NGFrstä ./ kuin NGF:t keskenään (kuvio 2). Eräs silmiinpistävä piirre ’...· kypsän BDNF:n primaarirakenteessa on sen samanlaisuus NGF:n kanssa; kun NGF-sekvensseihin yhteensopivuuden optimoimi-25 seksi on lisätty vain 3 aukkoa, eri NGF:t (käärmeestä ihrai-....: seen) ja BDNF:t olivat identtisiä 51 kohdassa. On merkit- tävää, että näihin kohtiin kuuluvat kaikki 6 kysteiinijää-mää. Vaikka BDNF:ien disulfidisiltojen täsmällistä järjes-...... tystä ei tunneta, on selvää, että sellaisia siltoja on ... 30 (taulukko III). BDNF:stä löytyvät 3-tryptofaani- ja 2-fe-• · · '·; ’ nyylialaniinijäämät löytyvät identtisistä kohdista NGF:stä.

Tuotakoon esiin myös, että 6 aspartagiinihappojäämää (seit-:***: semästä BDNF:ssä) ja 7 valiinia (yhdeksästä) on läsnä identtisissä kohdissa nisäkkäiden NGF:issä ja BDNF:ssä.

• · · ' .35 Nämä 5 aminohappoa vastaavat noin puolta aminohappovastaa-vuuksista näiden kahden proteiinin välillä. Toisaalta 105342 74 BDNF:n ja kaikkien NGF:ien välillä on muutamia huomattavia eroja: jo mainittujen 3 aukon lisäksi on 21 kohtaa, jotka kaikissa NGF:issä ovat identtiset, mutta BDNF:ssä erilaiset.

5

Suurin osa BDNF-prekursorisekvenssistä eroaa NGF:stä, mutta on kaksi poikkeusta. BDNF:n oletetussa erityssignaalisek-venssissä on 5 aminohappovastaavuutta (18 aminohaposta) ja se on yleisesti ottaen hämmästyttävän samankaltainen hiiren 10 NGF-signaalisekvenssin kanssa, jossa pilkkoutumisen on osoitettu tapahtuvan kun kohdasta 18 löytyy alaniinijäämä initiaatiometioniinitranslaation jälkeen (Edwards et ai., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:2456-2464). Näyttää ilmeiseltä, että alaniini, jota löytyy myös BDNF:n kohdasta 18, on 15 mahdollinen pilkkoutumiskohta BDNF:n signaalisekvenssin irrottamiselle. Toinen samankaltaisuus NGF:n kanssa alkaa ainoasta N-glykosylaatiomyötäsekvenssistä (alleviivattu kahteen kertaa kuviossa 1), asparagiini 126. Asparagiini sijaitsee 8 aminohappoa ennen pilkkoutumiskohtaa, josta 20 syntyy kypsä BDNF. Sama rakenne on löydettävissä useammissa NGF:issä, samoin kuin sekvenssi Arg-X-Basic-Arg prekur-;;; sorin 4 viimeisenä aminohappona (Schwarz et ai., 1989, J.

I

Neurochem 52:1203-1209).

25 Todiste siitä, että eri geenit koodaavat NGF:ää ja BDNF:ää ’5*" useilla eri lajeilla, saatiin valmistamalla DNA-koettimia :T: molekulaarisesti kloonatuista ihmisen NGF:stä ja sian BDNF- :stä, suorittamalla southern jblot-hybridisaatio genomisella ·...: DNA: 11a, hajotus restriktioendonukleaasilla EcoRI. Seuraa- -

3 0 vien lähteiden genomiset DNA:t analysoitiin: ihminen, apina, rotta, hiiri, koira, nauta, kaniini, kana ja hiiva. DNA

• · · ’·!.* hajotettiin EcoRI:llä ja analysoitiin southern blotting-• · · menetelmällä duplikaattisuodattimia käyttäen JiP-leimatun ihmisen NGF-koettimen ja sian BDNF-koettimen avulla. Kai-....:35 kiila testatuilla organismeilla hiivaa lukuunottamatta oli havaittavissa yksittäisiä vyöhykkeitä. Useimmissa tapauk- 105342 75 sissa NGF ja BDNF-koettimiin missä tahansa organismissa hybridisoituvien vyöhykkeiden elektroforeettinen liikkuvuus oli erilainen, vaikka joissain tapauksissa (esim. hiiren DNA) NGF- ja BDNF-koettimiin hybridisoituvat EcoRI-fragmen-5 tit olivat suurin piirtein saman kokoisia, eikä niitä pystytty hajottamaan käytetyissä elektroforeettisissa olosuhteissa (kuvio 3).

Osa kypsää BDNF:ää koodaavasta sekvenssistä vahvistettiin 10 PCR-reaktiolla sian, rotan, kanan ja ihmisen genomisesta DNA:sta, ja määritettiin nukleotidisekvenssit. Sian geno-misen DNA:n vahvistetun alueen DNA-sekvenssianalyysi vahvisti täsmälleen tulokset, jotka oli saatu molekulaarisillä klooneilla sian aivojen cDNA:sta. Määritettiin myös tämän 15 252 emäsparin jakson genomiset rotan, ihmisen ja kanan BDNF-sekvenssit (kuvio 5). Oli merkillepantavaa, että rotalla ja ihmisellä dedusoitu aminohapposekvenssi alueella vähintään aminohaposta 28 aminohappoon 111 oli identtinen sian BDNFrn vastaavan kanssa, vaikka joitain nukleotidiero-20 ja (esim. konservatiiviset muutokset kodonin kolmannessa asemassa) oli havaittavissa eri lajeilla. Kanalla tällä alueella oli havaittavissa vain yksi aminohapposubstituu-

I I I

: : tio; kypsän proteiinin jäämä 61 on kanalla lysiini, nisäk- ·;··· kään BDNF: issä metioniini. Sekvensoinnista saatava tieto 25 yhdessä edellä southern blot-hybridisaatiokeiden tulosten • ....j kanssa osoittivat yksiselitteisesti, että BDNF:ää koodaa .···. erittäin konservoitunut geeni, joka eroaa NGF:ää koodaavas-• · · ta geenistä.

30 8. Esimerkki: BDNF-RNA-eksoressio neuronaalisissa versus • · · » ·’ ’ ei-neuronaalisissä kudoksissa : 8.1. Materiaalit ja menetelmät a a a 8.1.1. RNA:n valmistus a * a a a a *·’ ’ 35 Kokonais-RNA uutettiin täysikasvuisen naarashiiren kudoksista menetelmällä, jonka ovat kehittäneet Okoyama et ai., 76 105342 1987 (Methods Enzymol. 154:3-28). Lyhyesti sanoen, jäädytetty kudos homogenoitiin 5,5 M guanidiumtiosyanaatissa, lysaatti sentrifugoitiin orgaanisten aineiden jätteiden poistamiseksi, ja supernatantti pantiin cesiumtrifluori-5 asetaattikerrokselle, joka oli säädetty tiheyteen 1,51 g/ml. Kun oli lingottu 24 tuntia, noin 125000 x g (SW 27 swinging bucket rotor, Beckmann), RNA uudelleensuspendoi-tiin ja saostettiin etanolilla ja 8 M ammoniumasetaatilla, säilytys - 70 *C:ssa. Elektroforeesi tapaan Lehrach et 10 ai., 1977, Biochemistry 16:4743-4751, 1,3-prosenttisissa agaroosi/formaldehydigeeleissä. RNA siirrettiin nailonkal-voille (Hybond-N, Amersham), ja hybridisoitiin yli yön, 62 °C, 1 ml 2 x SSC, 50 % formamidia, 32P-cRNA hiiren BDNF-koetin (107 cpm, katso edempänä). Pestiin 60 minuuttia, 65 15 'c, 0,1 x SSC. Pesun jälkeen tahraa inkuboitiin 60 minuut tia huoneenlämmössä 0,1 /jg/ml RNAse A:n (Pharmacia) kanssa ja kalvoa pidettiin -70 *C:ssa vahvistuslevyn kanssa 48 tunnin ajan.

20 8.1.2. cRNA-koettimen valmistus

Hiiren aivon cDNA-kirjastoa tutkittiin 2 itsenäisellä BDNF- oligonukleotidillä. Kaksoispositiiviset kloonit eristet- tiin ja alikloonattiin Bluescript SK’-plasmidin (Stratage- .-.:25 ne) FcoRl-kohtaan. Määritettiin nukleotidisekvenssi, joka • · ....: vastaa sian sekvenssin nukleotidejä 350-829 (ks. kuvio 1).

Tästä sekvenssistä löydettiin ainoastaan 4 aminohappoeroa- vuutta hiiren ja sian BDNF:n välillä, eli sian ja hiiren BDNF:n konservaatioaste tässä on huomattava. Valmistettiin · ^ ...30 yksisäikeinen RNA-koetin käyttämällä tätä templaattia ja • · · T3-polymeraasia (Promega). Koettimen spesifinen aktiivi-suus oli 10* cpm/^g.

• · · • · · • * · • « · ’35 « * 105342 77 8.2. Tuloksia ja pohdintaa Käytettiin northern jblot-analyysiä BDNF-mRNA-ekspression arviointiin neuronaalisissa versus ei-neuronaalisissa ku-5 doksissa. Northern jblot-analyyseissä käytettiin hiiren kudoksia, RNA:n uuttaminen oli siten nopeampaa kuin sian kudoksia käytettäessä. ”P-leimattu cRNA-koetin havaitsi ψ signaalin noin 1,45 kb:ssä aivoissa (kuvio 4) ja selkäytimessä (ei kuviota). On merkittävää, ettei signaalia esiin-10 tynyt missään muussa kudoksessa, esimerkiksi munuaisessa, suolessa, keuhkossa, maksassa, pernassa, sydämessä tai lihaksessa (kuvio 4). Oletettaessa sian mRNA:n olevan samankokoinen kuin hiirellä, kuvion 2 cDNA-sekvenssi vastaa yli 80 prosenttia täydellisestä mRNA-sekvenssistä.

15

Eräs merkittävä havainto BDNF:n fysiologian hahmottamisessa on, että tätä proteiinia koodaava mRNA löytyi vain keskushermostosta, ei seitsemästä ei-keskushermostokudoksesta. BDNF-mRNA löytyi löytyi sekä koko aivoista (kuvio 4), että 20 myös selkäytimestä ja colliculus superiorista (kuviossa 1 esitetty sekvenssi on johdettu kokonaisuudessaan colliculus superior in cDNA-templaatista). Nämä tiedot tukevat ajatus- • t • · ta, että BDNF on kohdejohdettu neurotrofinen tekijä, ja | j että BDNF-responsiiviset neuronit joko sisältyvät kes- I I « ' " 25 kushermostoon tai liittyvät suoraan CNS-rakenteisiin. To-siaankin kaikki tähän astiset tunnetusti BDNF:ään reagoivat • · · : neuronit joko heijastuvat keskushermostoon, esimerkiksi selkäydinhermon takajuuren tai kallon sensoriset gangliot . ;··! (Lindsay et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319-328, Davies et 30 ai., 1986, J, Neurosci. 6:1897-1904), tai ovat CNS-neuro- . *. neita kuten verkkokalvon gangliosolut (Johnson et ai., · · '···’ 1986, J. Neurosci 6:3031-3038). On selvää, että tarvitaan III ' ' r r « vielä yksityiskohtaisempia kokeita, joilla tutkitaan BDNF-:*,·*: syntetointialueiden tarkka sijainti keskushermostossa, mut- ....:35 ta on jo selvää, että BDNF-mRNA on jakautunut aivan eri tavoin kuin NGF-mRNA, jota löytyy monista ei-CNS-kudoksista 105342 78 (Heumann et ai., 1984, EMBO J. 3:3183-3189, Shelton et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:7951-7955).

9. Esimerkki: Ihmisen.ia rotan BDNF-geenien molekulaari- 5 nen kloonaaminen ia karakterisointi 9.1.1. Materiaalit menetelmät 9.1.1. Genomisen DNA:n ja cDNA:n kirjastot

Hankittiin täysikasvuisen ihmisen verkkokalvon cDNA-kirjas-10 to, lambda ZapII:ssa, valmistaja Stratagene. Ihmisen istukan genominen DNA-kirjasto EMBL3/SP6/T7:ssä saatiin Clon-techilta. Ihmisen sikiön aivojen cDNA-kirjasto lambda-gtl-l:ssa saatiin Clontechilta. Rotan genominen DNA-kirjasto EMBL3/SP6/T7:ssä saatiin Clontechilta. Molemmat genomiset 15 kirjastot valmistettiin genomisen DNA:n osittaisella hajottamisella Sau3A-restriktioendonukleaasilla ja ligatoimalla vektorin BamHI-kohtaan. Rotan aivon cDNA-kirjasto lambda-ZAPII:ssä saatiin Stratageneltä.

20 9.1.2. BDNF-DNA-koettimien valmistus « .Valmistettiin ”p-leimatut BDNF-DNA-koettimet käyttämällä ί,,,ί samoja oligonukleotidialukkeita kuin osassa 7.1.1., supra, ·:··: PCR-reaktiossa ihmisen genomisen DNA:n kanssa vahvistamaan :'·.;25 jäämien 28-111 koodausaluetta. Samaan tapaan saatiin rotan t · ....: BDNF-spesifinen 32p-leimattu koetin käyttämällä rotan geno- mistä DNA:ta templaattina PCR-reaktioon.

• · · m. 9.1.2. Kirjastojen tutkiminen 30 «M • · · ’·* ’ Tutkittiin lambda-fagikir jasto ja standardimenetelmin (Ben-: ton and Davis, 1977, Science 196:180-182), Maniatis et ai., :***: 1978, Cell. 15:687-701) hybridisoimalla 50-prosenttisessa formaldehydissä dekstraanisulfaatin ja Denhardtin liuoksen « · ·

I « I

‘ 35 kanssa 42 C:ssa. Suodattimet esihybridisoitiin 42 ’C:ssa 50-prosenttisessa formamidissa, 5XSSCPE, 10 % Denhardtin 105342 79 liuosta, 0,5 mg/ml lohen sperman DNA:ta, 0,1 % SDS ja 10 % dekstraanisulfaattia. Hybridisaatio toteutettiin muutoin samanlaisessa puskuriaineessa, mutta Denhardtin liuosta oli 2%, lohen sperman DNA:ta 0,1 mg/ml, eikä käytetty SDSrää 5 eikä dekstraanisulfaattia. Hybridisaation jälkeen suodattimet pestiin 68 °C:ssa. Ihmisen BDNF-koetinta käytettiin tutkimaan ihmisen genomisen DNA:n ja retinaali-cDNA-kirjas- w toja, rotan BDNF-koetinta tutkimaan rotan genomisen DNA:n ja aivojen cDNA-kirjastoja. Kirjastot tutkittiin myös ih-10 misen ja rotan NGF-koettimilla, jotka oli valmistettu tapaan, jotka kuvataan osassa 7.1.1., supra.

9.2. Tulokset ja pohdintaa 15 Jokaisesta kirjastosta käytiin läpi vähintään 670000 plakkia. Positiivisiksi ihmisen klooneiksi katsottiin sellaiset, jotka hybridisoituivat edellä kuvattuihin ihmisen BDNF-koettimiin, mutteivät ihmisen NGF-koettimeen. Genomi-set BDNF-kloonit saatiin sekä ihmisen että rotan kirjas-20 toista tiheydellä, joka vastaa BDNF-geenin esiintymistä . yhtenä kopiona haploidista genomia kohden. Sekä ihmisen * *;;; että rotan genomisista kirjastoista käytiin läpi noin mil- · joona plakkia. Rotan genomisesta kirjastosta saatiin kolme • · ·« · ’ * positiivista tulosta ja ihmisen genomisesta kirjastosta • « 25 yksi. Positiiviset kloonit ihmisen retinaali- ja rotan * aivojen cDNA-kirjastoista saatiin tiheydellä, joka vastaa :J : geeniä, jota ilmenee hyvin pieninä pitoisuuksina; rotan aivojen cDNA-kirjastosta löydettiin kaksi positiivista tu- . ····· losta 670000 :sta, ihmisen retinaali-cDNA-kir jastosta 670000 .·;·. 30 kloonista yksi. Yhtään positiivista kloonia ei löydetty . \ 670000 kloonista, jotka kuuluivat kaupalliseen, ihmisen • · · *·ί·’ fetaalisesta aivon cDNA:sta valmistettuun kirjastoon. Ih-

I I I

misen BDNF-cDNA- ja genoroisten kloonien nukleotidisekven-soinnissa käytettiin synteettisiä oligonukleotidialukkeita, 35 jotka vastaavat täsmällisesti sekvenssejä ihmisen ja rotan BDNF:ää koodaavilta alueilta (osa 7.1.2., supra). Pisim- 105342 80 mässä saadussa ihmisen cDNA-klOonissa oli insertti noin kohdassa 1,6 - 1,8 kbp , ja kuten odotettua, sisälsi täsmälleen sekvenssin siitä ihmisen BDNF-osasta, joka määritettiin suoraan ihmisen genomisen DNA-vahvistamisen jälkeen 5 (osa 7.2., supra). Tämän cDNA-kloonin yksityiskohtainen sekvenssianalyysi (kuvio 5) toi esiin avoimen lukujakson, joka koodasi 247 aminohapon sekvenssiä, joka oli samanlainen, vaikkei identtinen täysimittaisen sian BDNF-prekurso-rin kanssa. Kypsää BDNF-polypetidiä vastaavalla alueella 10 (esim, Hisl34:n kodonista ketjunlopetuskodoniin) ei löydetty eroavuuksia dedusoiduissa aminohapposekvensseissä.

Kaikki nukleotidisubstituutiot sian ja ihmisen välillä olivat konservatiivisia koodausspesifisyyteen nähden. Oletetun BDNF-prekursoripolypeptidin jäämässä oli joitain amino-15 happosekvenssieroja ihmisen ja sian välillä, merkittävimpänä se, että ihmisen BDNF-geenistä puuttuu 5 siassa ilmenevästä 6 peräkkäisestä Ser-kodonista, tuloksena hieman lyhyempi polypeptidi (247 versus 252 aminohappoa).

20 Vektorissa EMBL3 valmistetuissa kirjastoissa insertit olivat välillä 10-23 kbp vierasta DNA:ta. Täsmällistä inser-

t I I

;;; tin kokoa yksityiskohtaisesti analysoidussa ihmisen genomi-* · '···[ sen BDNF-kloonissa ei määritetty. Klooni sisälsi kuitenkin < · » » 4 ' ’ yksittäisen noin 4 kbp:n EcoRI-restriktioendonukleaasifrag-» · :.'':25 mentin, joka hybridisoitui kirjaston tutkimiseen käytetyn leimatun BDNF-koettimen kanssa. Tämä fragmentti on odote-:T: tun kokoinen ja perustuu southern Jblot-hybridisaation tu loksiin aiemmin kuvatuilla ihmisen genomisella DNA:11a ja ····: sian BDNF-koettimella. Ihmisen kloonille suoritettiin sek- • · ^ .*:\30 venssianalyysi käyttämällä synteettisiä oligonukleotidejä, DNA-synteesin aloittavia cDNA-sekvenssejä bakteriofagi-DNA-• · · * *.ί·* templaatista. Sekvenssin oletettavasta ihmisen prekursori-« · BDNF:n koodaussekvenssistä havaittiin olevan identtinen f sellaiseen ihmisen cDNA-kloonissa, lukuunottamatta yhtä i ....:35 ainoaa nukleotidisubstituutiota prepro-alueella, metionii-nin (ATG) korvautumista valiinilla (GTG) nukleotidissä 785, 105342 81 kuvio 5. Muutos saattaa liittyä polymorfismiin ihmisen genomissa. Kuten ihmisen NGF-geenin kohdalla, ihmisen oletettua prepro-BDNF:ää koodaavassa sekvenssissä ei havaittu mitään muutoksia. Myös rotan cDNA-sekvenssitiedot tuodaan 5 esiin kuviossa 5.

10. Esimerkki: Yhdistelmä-BDNF;n ekspressio * 10.1 Materiaalit ja menetelmät 10.1.1. BDNF-ekspressiovektorin valmistaminen 10

Sian prepro-BDNF:ää vastaava sekvenssi saatiin käyttämällä oligonukleotidialukkeita (150 pmoolia kumpaakin) ATAATCTAGATGACCATCCTTTTCCTT (sense) ja ATAATCTAGACTATCTTCCCCTCTTAAT (antisense) 15 PCR-reaktiossa, 1 μg sian genomista templaattia (alukkei-siin oli lisätty WbaI-kohta). Vahvistusreaktio oli muutoin kuvatun kaltainen, vain jäähdytyslämpötila oli 50 °C.

Xbal-hajottamisen jälkeen vahvistettu DNA ligatoitiin pCMV^plasmidin Xbal-kohtaan pCMV1-pBDNF"1 :n valmistamiseksi 20 (-1 tarkoittaa sense-suuntaa kuviossa 6 ja vastaa merkintää , COS* taulukossa V). Plasmidi siirrettiin XL-I-bakteereihin lii ' ;;; elektroporaation avulla.

i

i I

I I I

« ! I I I » 10.1.2. BDNF-ekspressio COS-soluissa :.v: 25 *·**· pCMVl-pBDNF-plasmidi DNA positiivisista klooneista (tarkis-• ·· ϊ tettuna hybridisaatiolla oligo5:n kanssa, kuvio 2) leikattiin käyttäen sekä Xbalrtä että Pstl:tä. Tuloksena saata-_ .··.· vien tuotteiden koon avulla pystyimme päättelemään insert-30 tien suunnan, ja molempia plasmideja käytettiin transfek- , ·, toimaan COS-soluja kalsiumfosfaattimenetelmän avulla (Chen • · · *·|·* et ai., 1987, Mol. Cell Biol. 7:2745-2752), ja kasvatusvä- * · liaine koottiin 24 tunnin jälkeen. BDNF-aktiivisuus tes-tattiin kanan alkion DRG-bioanalyysillä, jota aiemmin on » ....:35 kuvattu yksityiskohtaisesesti.

105342 82 10.2 Tuloksia ja pohdintaa E8-kananpojan spinaalisia sensorisia hermosoluja levitettiin alustoille (6000 per kuoppa), inkuboitiin 24 tuntia ja 5 laskettin 24 tunnin kuluttua (Lindsay et ai., 1985, Develop. Biol. 112:319-328). Arvot ovat keskiarvoja kolminkertaisista määrityksistä ± standardipoikkeama. Käytetyt BDNF- ja NGF-määrät olivat 1 ng/ml: tämän pitoisuuden on todettu kummallakin tekijällä saavan aikaan maksimaalisen 10 elossapysymisvaikutuksen. COS1 tarkoittaa soluja, jotka on transfektoitu plasmideilla, jotka sisältävät BDNF-insertin sense-suunnassa, COS" soluja, jotka on transfektoitu plasmideilla, jotka sisältävät BDNF-insertin vastasuunnassa, COS-transfektoimattomia soluja. Laimennosten ollessa yli 15 1:20 ei ollut havaittavissa verrokkituloksia suurempaa eloon jäämistä COS— tai COS-käsitellyissä väliaineissa. Kaikissa kokeissa, joissa ei käytetty NGF:ää, käytettiin monoklonaalista anti-NGF-vasta-ainetta (Korsching et ai., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:3513-3516) 1 Mg/ml).

20

Kuten taulukosta V tulee esiin, vain väliaineessa, joka oli saatu viljelemällä COS-soluja, joissa oli pCMVl-pBDNF-plas- • · · midi sense-suunnassa, ilmeni kanan sensoristen hermosolujen

elävänä pysymistä vertailuarvoja enemmän. Yhdistelmä-BDNF

""· 25 on siis biologisesti aktiivinen. Lisäksi sian aivosta !.1·· eristetty BDNF ei merkittävästi lisännyt sensoristen neuro- ·:·: nien elävänä pysymistä verrattuna pelkkään yhdistelmä-BDNF- :1·1; :ään, yhdistelmä-BDNF siis ilmeisesti pystyy kyllästämään BDNF-reseptoreita. Yhdistelmä-BDNF:llä havaittiin additii- ....: 30 vinen tai synergistinen vaikutus kanan sensoristen neuro-• · ,·;·, nien elävänä pysymiseen myös käytettynä yhdessä NGF:n kans-• · · ’sa.

< 1 « 35 * f 105342 83

TAULUKKO V

5 Viljeltyjen kanan sensoristen neuronien elävänä pysyminen COS-väliaine 1:20 1:50 1:200 10 (lopull. laimennos) COS+ 2510±263 2833±171 COS- 211116 COS 250187 15 BDNF + COS+ 25161209 NGF + COS+ 5770172

Pelkkä BDNF 27181424 20 11. Esimerkki: BDNF-vasta-aineiden luominen 11.1 Materiaalit ja menetelmät ...25 Valmistettiin BDNF:lie spesifinen polyklonaalinen antisee- .·. : rumi (nimitys: seerumi 4) NZ valkoisessa kaniinissa käyttä- • · mällä immunisointia synteettisellä peptidillä.

♦ · • ·· » · « 11.1.1. Peptidisynteesi ja liittäminen kantajaan 30 * 1 Syntetoitiin perinteisin menetelmin 34 aminohappojäämän • · · ’ v · peptidi (nimitys B5). Sillä on seuraavanlainen aminohap- . posekvenssi, joka vastaa kypsän BDNF:n 33 jäämää (jäämät « · · .···. 153-185 kuviossa 1 näkyvässä täydellisessä sian prepro- • · ’•35 BDNF-sekvenssistä), haluttaessa lisäksi ylimääräinen kyste-• · » ·’ ’ iinijäämä aminopäässä (näkyy sulkeissa) edesauttamassa t 105342 84 liittämistä kantajaproteiiniin, apuna m-maleimidobensoehap-po-N-hydroksisukkiniraidi (MBS):

Cys-Val-Thr-Ala-Ala-Asp-Lys-Lys-Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-5 Gly-Gly-Thr-Val-Thr-Val-Leu-Glu-Lys-Val-Pro-Val-Ser-Lys-Gly-Gln-Leu-Lys-Gln-Tyr.

B5-peptidi liitettiin naudan seerumialbumiiniin (BSA) käyttämällä bis-diatsobentsidiiniä (BDB). Tuore BDB valmistet-10 tiin liuottamalla 46 mg bentsidiini-HCl:ää (p-diaminodi-fenyyli-HCl, Sigma) 9,0 mlrssa 0,2 N HC1. 35 mg NaNO* liuotettiin 1,0 ml:aan H20 ja lisättiin bentsidiiniliuok-seen, sekoitettiin 1 tunti 4 *C:ssa. 21 mg BSA:ta liuotettiin 3,0 ml:aan 0,16 M boraattia, 0,13 M NaCl, pH 9. Noin 15 15 mg B5-peptidiä liuotettiin 1,5 ml:aan boraatti-NaCl-pus- kuriin, pH 0,0. Peptidiliuos lisättiin BSA-liuokseen ja pantiin jäihin. 1,0 ml BDB:tä lisättiin BSA-peptidiliuokseen ja reaktioseosta inkuboitiin sekoittaen samalla 2 tuntia 4 *C:ssa. pH:ta tarkkailtiin ja pidettin noin arvossa 20 9,0 lisäämällä tarpeen mukaan pieniä määriä 0,5 M NaOH.

Reaktio lopetettiin lisäämällä 0,2 ml l-prosenttista feno-lipuskuroitua liuosta. Ylimääräiset reagenssit poistettiin dialysoimalla vasten fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS).

; !25 • · · *· ’· 11.1.2. Immunisointi • m • ·* v : Kaikkiaan kuusia kaniinia immunisoitiin seuraavasti: ‘:**:30 Kaniinit 1 ja 4 : peptidi B5 liitettynä C-päästään BSA:han, BDB, *. Kaniinit 2 ja 3: peptidi B5 liitettynä N-päästään BSA:hän, MBS,

I

Kaniinit 5 ja 6: peptidi B5 sekoitettuna jauhet-: : 35 tuun nitroselluloosaan.

85 105342

Kaikissa tapauksissa ensimäisessä immunisoinnissa käytettiin 1 mg immunogeeniä (100 μg B5/500 μg nitroselluloosaa kaniineille 5 ja 6) 0,5 ml:ssa PBS plus 0,5 ml täydellistä Freundin adjuvanttia. Seos ruiskutettiin subkutaanisesti 5 useampaan kohtaan selkään. Toinen immunisointi suoritettiin kolme viikkoa myöhemmin, ja se oli muutoin samanlainen, paitsi että täydellisen Freundin adjuvantin asemesta käytettiin epätäydellistä Freundin adjuvanttia. Myöhemmät tehostukset suoritettiin 4-6 viikon välein. Kaniineista 10 otettiin verta viikko immunisoinnin jälkeen ja antiseerumi tutkittiin rutiininomaisesti, puhtaan B5-peptidin sitoutumisen suhteen, entsyymin avulla tapahtuvaa valkuaisaineen immunokemiallista määritystä (enzyme-linked immunoabrosbent assay, ELISA) käyttäen.

15 11.1.3. BDNF:ään sitoutuvan vasta-aineen havaitseminen 100 μg antigeeniä (B5-peptidi) H20:ssa lisättiin kuoppiin mikrotiitterilevyillä, annettiin kuivua yli yön ja pestiin 20 sitten nopeasti H20:lla ja sidottiin 100 μg:lla 1-prosent-tista gelatiinia, 30 minuuttia, huoneen lämpö. Kuopat pestiin tislatulla vedellä kolmeen kertaan, lisättiin sitten 100 μg antiseerumia ja annettiin inkuboitua 4 1C:ssa yli ’. ' i yön. Kuopat pestiin kolmeen kertaan PSB/0,05 % triton x-;···25 100:11a, niihin lisättiin 100 μg peroksidaasileimattua an- ti-kaniini-immunomääritysainetta (1/1000) laimennos) ja ....: inkuboitiin huoneen lämmössä kolme tuntia. Kuopat pestiin kahdesti ja lisättiin 100 μg ABTS-liuosta (10 mg ABTS (Sigma) liuotettuna 10 ml:aan 0,1 M natriumsitraattia, pH 4,0 β0 plus 10 μg H202) ja inkuboitiin noin 5 minuuttia, kunnes kehittyi väriä. Reaktio lopetettiin lisäämällä 10 μg NaN3.

* 9 m ’·[ ’ Näytteet laimennettiin 1:5 vedellä ja optinen tiheys mitat- : tiin, 415 nm.

* « « • « · • « • · · .:.35 • · 1 · 105342 86 11.2. Tulokset ja pohdintaa

Kaniinin 4 antiseerumilla (seerumi-4) havaittiin olevan korkeimmat arvot (kuvio 7A) ja sitä käytettiin lisäkokei-5 siin. Seerumi-4:stä saatuja vasta-aineita puhdistettiin osittain seostamalla ammoniumsulfaatin kanssa. Antiseeru-mimäärää vastaava määrä kyllästettyä ammoniumsulfaattia lisättiin hitaasti, samalla sekoittaen, ja liuosta sekoitettiin vielä 15 minuuttia, ja sentrifugoitiin sitten, 2000 x 10 g. Pallukoitua seosta pestiin 50-prosenttisesti tyydyttyneessä ammoniumsulfaatissa kahdesti ja liuotettiin uudestaan PBS:ään alkuperäistä seerumimäärää vastaavana määränä. Ammoniumsulfaatti poistettiin dialysoimalla vasten useita PBS-vaihtoja. Dialysoitu liuos alikvoitiin 1,0 ml:n mää-15 riin ja lyofilisoitiin speed-vac-laitteella. Näyte seeru-mi-4:n vasta-aineesta uudelleensuspendoitiin 0,5 ml:aan H20 ja siitä tutkittiin reaktiivisuus peptidi B5:n kanssa, ELI-SA-analyysi, ja sen havaittiin reagoivan laimennoksena 1:4000.

20

Valmistettiin polyklonaalisia vasta-aineita synteettiselle peptidille (B5), joka vastasi sian BDNF:n 33 aminohappo-fragmenttia, immunisoimalla kaniineja edellä kuvattuun tapaan. Seerumi-4:ssä, jossa ilmeni suurimpia arvoja syn- . 25 teettistä peptidiä vastaan, ilmeni reaktiivisuutta sian • « · *·aivokudoksesta puhdistetun BDNF:n kanssa, ELISA (kuvio 7B).

* ’ Immunoblotting-menetelmällä oli havaittavissa heikkoa « · · ·.· ; reaktiivisuutta (tuloksia ei esitetty kuvioissa). Vasta-aine ei kuitenkaan pystynyt estämään BDNF:n vaikutusta ka-·:**30 nan alkion selkäydinhermon takajuuren ganglion sensorisilla neuroneilla suoritetussa biologisessa kokeessa.

”· 12. Esimerkki: BDNF:n uudet biologiset vaikutukset • · · » :*:*35 Seuraavat havainnot osoittavat BDNF:n pystyvän (i) edistä-·:··· mään keskushermoston dopaminergisten hermosolujen elävänä 87 105342 pysymistä ja indusoimaan niiden täysin erilaistuneen tilan, (ii) edistämään keskushermoston kolinergisten hermosolujen elävänä pysymistä ja (iii) estämään astroglia-solujen pro-liferaatiota. Näitä BDNF:n biologisia vaikutuksia ei ole 5 aiemmin kuvattu. Koska sekä dopaminergiset neuronit, ko-linergiset neuronit että astrogliasolut voivat liittyä neurologisiin sairauksiin tai häiriöihin, BDNF saattaa osoittautua käyttökelpoiseksi hoidettaessa sellaisia hermoston tauteja, jotka liittyvät näihin soluryhmiin.

10 12.1. Materiaalit ja menetelmät 12.1.1. Menetelmät dopaminergisten substantia nigran neuronien kasvattamiseksi 15 Dissekoitiin 13-15 päivää vanhojen rotan alkioiden aivoista ventraalinen keskiaivo. Kokeissa käytettiin tavalliseen tapaan kahta poikuetta. Dissektioliuoksen koostumus oli:

NaCl: 136,8 mM, KC1: 2,7 mM, NaaHP04·HP04· 7HaO: 8,0 mM, KHaP04: 1,5mM, glukoosi: 6 mg/ml, BSA: 0,1 mg/ml; pH 7,4.

20 Liuos valmistettiin ja suodatinsteriloitiin 0,2 μΜ:η suodattimen läpi. Dissekointi suoritettiin epästeriileissä olosuhteissa. Kun kudos oli dissekoitu kaikista aivoista, menetelmän loppuvaihe toteutettiin steriileissä olosuhteis-sa. Kudosfragmentit pantiin 35 mm:n viljelymaljaan ja ] 25 hienonnettiin käyttämällä hienokärkisiä saksia. Kudoksiin • · * *· *· lisättiin kaksi millilitraa 0,125 % trypsiiniä sisältävää 9 ' F-12-elatusväliainetta ja inkuboitiin 37 "c^ssa. Inkuboin- · · ’ tivaiheen lopuksi liuokseen lisättiin DNAselrtä, niin että lopulliseksi pitoisuudeksi saatiin 80 ng/ml. Suoritettiin :*00 samanlainen inkubointi ja kudosliuokseen lisättiin 8,0 ml elatusväliainetta: MEM (Minimal Essential Medium), johon * \ oli lisätty 2 mM glutamiinia, 6 mg/ml glukoosia, 5 yksik- köä/ml penisilliiniä, 5 mg/ml streptomysiiniä ja 7,5 % va- sikanseerumia (fetal calf serum, FCS). Näytettä lingottiin :’:35 5 minuuttia pöytäsentrifugissa huoneenlämmössä, kierrosno- • peus 500 kierrosta minuutissa. Väliaine imettiin pois ja 105342 88 solupallukkaan lisättiin 2 ml kasvatusväliainetta. Solut trituroitiin tulella viimeistellyllä, aukoltaan 1 mm:n pipetillä kahdeksan kertaa. Jäljelle jäävien kudosfragment-tien annettiin laskeutua painovoiman avulla ja vähäinen 5 alikvootti supernatanttia otettiin solumäärän määrittelyyn hemosytometrillä. Kun solutiheys oli määritetty, solut pantiin soluviljelylevyyille tiheyteen 50000/cm2.

Elatusmaljat valmistettiin dissekointia edeltävän päivänä.

10 Kudoslevyt (24 kuoppaa, 2 cm*/kuoppa) päällystettiin etukäteen polyorinitiinilla (molekyylipaino 30000-70000 g/mol), 0,5 mg/ml, 3 tuntia huoneenlämmössä. Maljoja pestiin runsaalla vesimäärällä ja käsiteltiin sitten hiiren laminii-nilla, 5 μg/ml, 3 tuntia huoneenlämmössä. Maljat pestiin 15 vedellä kuten edellä, ja inkuboitiin yli yön 37 *C:ssa, kosteutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5 % C02 ja 95 % ilmaa, elatusväliaineen läsnäollessa. Väliaine levyissä vaihdettiin seuraavana päivänä ja korvattiin tuoreella ela-tusväliaineella.

20

Kun solut oli levitetty elatusalustoille, ne siirrettiin inkubaattoriin, jonka lämpötila oli 37 *C, 5% C02/95 % il- ···, maa, 24 tuntia. Viljelyväliaine vaihdettiin seerumittomaan (serum-free formulation, SFM), jonka koostumus oli: 1:1 , 2$ (tilrtil) seos Basal Eagle Medium -väliainetta (BEM) ja • · · *· *j elatusseosta F-12, glukoosia (33 mM) , glutamiinia (2 mM), ’ ’ NaHC03 (15 mM), HEPES (10 mM), lisänä insuliini (25 μg/ml), • · · V * transferriiniä (100 μg/ml), putreskiiniä (60 μΜ), progesteronia (20 nM), natriumseleniittiä (30 nM), penisilliiniä (5 *”333 U/ml), streptomysiiniä (5 mg/ml) ja T3:a (30 nM). Joissain kokeissa puhdistettu BDNF lisättiin viljelmiin sen jälkeen, \ kun väliaine oli vaihdettu SFM:ksi toisena viljelypäivänä.

• I ( · · «Il

Dopaminergisten hermosolujen viljelmissä käytettävän liuok- • · · :/3S sen vesi otettin Milli-Q reagenssivesisysteemistä. Kudos-*:··: viljelyväliainekoostumukset saatiin Gibco Laboratories - 105342 89 yhtiöltä (Santa Clara, California), samoin kuin vasikansee-rumi (eränumero 43N1086) sekä hiirilaminiini. Kaikki muut väliaineiden aineosat hankittiin Sigma Chemical -yhtiöltä (St. Louis, MO). Myös polyornitiini ja DNAsel saatiin Sig-5 malta. Trypsiini saatiin Worthingtonilta (Freehold, NJ), eränumero 3667. Kaupalliset kemikaalit olivat analyysiin kelpaavan tasoisia ja ne hankittiin Baker Chemical -yhtiöl- * tä (Phillipsburg, NJ). Kokeissa käytetyn BDNF:n puhdisti sian aivoista Dr. Y. -A. Barde käyttämällä menetelmää, jota 10 kuvattiin aiemmin (Barde et ai., 1982, supra), 12.1.2. Menetelmät ventaarimesenkefalonviljelmien im-munosytokemialliseen värjäämiseen 15 Jokaista koetta varten valmistettiin tuore kiinnitysaine-liuos. Tyrosiinihydroksylaasivärjäyksessä (TH) fiksatiivi oli 4,0-prosenttinen Sorensonin fosfaattipuskuri. Sorenso-nin puskuriaine valmistettiin lisäämällä KHaP04:n 0,2 M -liuosta 0,2 M Na2HP04:een kunnes pH-arvoksi saatiin 7,3.

20 Paraformaldehydi lisättiin liuokseen, kuumennettiin nopeasti hetkeksi liukenemisen edistämiseksi ja jäähdytettiin huoneen lämpöön ennen käyttöä.

• · I • · · · • ·

Menetelmän aluksi viljelyväliaine poistettiin viljelyasti-25 öistä varovasti imemällä, ja varsinainen kiinnitysaineliuos m m : '·: lisättiin varovasti astiaan. Inkuboitiin 20 minuuttia huo- • · ·:·*: neenlämmössä. Seuraavaksi suoritettiin kolme pesua Soren- j··’: sonin fosfaattipuskurilla, 5 minuttia jokainen, ja pyöri- teltiin maljoja sitten varovasti. Soluja inkuboitiin sam- ,..,:30 mutusliuoksessa 30 minuuttia huoneenlämmössä varovasti pyö-• · ritellen. TH-värjäykseen käytettävien viljelmien sammutus- • · m liuos oli Sorensonin fosfaattipuskuri, joka sisälsi 2 % :.i.: tavallista hevosen seerumia. Seuraavaksi viljelmiä inku- • · · boitiin permeabilisointipuskurissa, 30 minuuttia huoneen- .·;·,35 lämmössä varovasti pyöritellen. TH:ta varten värjättävien • · viljelmien liuoksena oli Sorensonin puskuri, joka sisälsi 105342 90

0,2 % saponiinia ja 1,5 % tavallista hevosen seerumia. Permeabilisaatiovaiheen jälkeen viljelmiä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen läsnäollessa yli yön 4 *:ssa. Vasta-aine rotan TH:ta vastaan oli hiiren monoklonaalinen vasta-5 aine, isotyyppi IgG2a. Sitä käytettiin 40 μς/ιηΐ liuoksessa, jossa oli 10 mM NaP04, 50 mM NaCl, 0,2 % saponiinia, pH

7,5. Primaarivasta-aineinkuboinnin jälkeen viljelmiä pestiin 5 kertaa 15 minuuttia sopivassa permeabilisaatiopusku-rissa. Seuraavaksi viljelmiä inkuboitiin biotiiniin yhdis-10 tetyn sekundaarisen vasta-aineen kanssa, biotinyloitu hevosen anti-hiiri-IgG. Nyt inkuboitiin kaksi tuntia huoneenlämmössä varovasti pyöritellen. Suoritettin edellä kuvatun kaltaiset pesut ja sen jälkeen viljelmiä inkuboitiin kun läsnä oli etukäteen muodotettua avidiini-biotinyloitua pi-15 parjuuriperoksidaasikompleksia (ABC reagent, Vector Laboratories, Burlingame, CA), joka oli valmistettu valmistajan ohjeiden mukaisesti. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen huoneenlämmössä varovasti pyöritellyt viljelmät pestiin edellä kuvattuun tapaan. Sitten viljelmiä inkuboitiin 55 mM:ssa 20 Tris-Cl;ää, pH 7,3, joka sisälsi 0,5 mg/ml diaminobentsi-diiniä ja 0,01 vetyperoksidia. Reaktiotuotteen annettiin kehittyä 2-5 minuuttia, sen jälkeen liuos poistettiin ja .··'. viljelmiä pestiin useaan kertaan jääkylmällä PBSillä. Tutkittiin positiivisten solujen lukumäärä neliösenttimetriä . .25 kohden.

« * • · * • · m * ' Paraformaldehydi ja glutaraldehydi saatiin Fluka Chemica- • · · V · liitä. Vectastain kit -yhdistelmät, jotka sisälsivät nor- maaliseerumia (käytettiin estoaineena), biotinyloitu, af- _ *:**:30 finitteettipuhdistettu anti-immunoglobuliini, avidiini DH ja biotinyloitu HRP-H hankittiin Vector Laboratories-yh-*. tiöltä. Diaminobentsidiini saatiin BRL-yhtiöltä (Gaithers-berg, MD).

• · 9 · • » · :T:35 9 9 9 105342 91 12.1.3. Menetelmät 3H-dopamiinioton mittaamiseksi ventraa-limesenkefalonviljelmistä.

3H-dopamiiniotto (3H-DA) mitattiin tapaan, jota kuvaavat 5 Dal toso et ai., (1988, J. Neurosci. 8:733-745), vähäisin muutoksin. Ottopuskuriaineen koostumus oli: NaCl: 136,8 mM, KC1: 2,7 mM, NaHP04-7H20: 8,0 mM, KH2P04: 1,5 mM, glukoosi: 5,0 mM, CaCl2: 1,0 mM, MgS04: 1,0 mM, askorbiinihap-po: 0,1 mM, pargyliini; 0,1 mM, pH 7,4. Tarvittaessa otto-10 puskuriin lisättiin 5,0 μΜ benstropiinimesylaattia (BZT).

Solut pestiin esilämmitetyllä (37 *C) ottopuskurilla kerran ja korvattin 0,4 ml:11a ottopuskuria/cm2 kuoppa), viljelmiä inkuboitiin etukäteen 5 minuuttia 37 *C:ssa. Esi-inku-15 boinnin lopulla lisättiin 0,1 ml 3H-DA:ta ottopuskurissa (250 nM, 40 Ci/mMol), niin että lopullinen 3H-DA-pitoisuus puskuriaineessa oli 50 nM. Viljelmiä inkuboitiin 37 °C:ssa 15 minuuttia ja pestiin sen jälkeen neljä kertaa 0,5 milli-litralla ottopuskuria, 4 'C. Pestiin vielä kaksi kertaa 20 jääkylmällä PBS-liuoksella (10 mM NaP04, 150 mM NaCl, pH

7,6). Viimeisen pesun jälkeen soluihin lisättiin vielä 0,2 ml/2 cm2 kuoppa 0,5 N NaOH:ta ja annettiin seistä huoneen ,···. lämmössä kaksi tuntia. NaOH-uute koottiin ja laskettiin • « tuikemittarilla (Packard, LS 500TD) käyttäen 10 ml "ultima- . .25 gold"-tuikeainetta. Spesifinen otto määriteltiin otoksi, • · « '· *; joka poistui kun läsnä oli 5 μΜ BZT:tä. Tämä oli yleensä 70-90 % havaitusta kokonaisotosta.

··· • · · « * · 3H-DA:n alkuperä oli NEN (Boston, MA). Askorbaatti, pargy- ”’"30 liini, BZT ja glukoosi saatiin sigmalta (St. Louis, MO).

:T: Tuikeaine hankittiin Packard-yhtiöltä (Sterling, VA).

* • » · * · · lii 12.1.4. Menetelmät basaalisten etuaivojen kolinergisten • · ’·”* neuronien viljelmien luomiseksi.

35 « • · 105342 92

Primaariset basaalisten etuaivojen kolinergisten hermosolujen viljelmät luotiin käyttämällä E17-rottia.

Tarkemmin sanoen tässä kokeessa käytetyt kolinergiset neu-5 ronit saatiin mediaalisesta septaalinukleuksesta ja Brocan alueen diagonaalisen säikeen nukleuksesta. Nämä hermosolu-ryhmät sijoittuvat lähinnä hippokampuksen alueelle. Eril- liset viljelyseokset (hermosoluja ja gliasoluja) valmistettiin seuraavaan tapaan. Septaalialue leikeltiin irti ympä-10 röivästä kudoksesta ja otettiin alkion aivoista. Kudospa-lat yhdistettiin, hienonnettiin saksilla ja niitä käsiteltiin 20 minuuttia 37 °C:ssa, 12,5 % trypsiiniä. Trypsiini inaktivoitiin laimentamalla levitysväliaineeseen (Dulbec-co's modified Eagle medium, (DMEM), joka sisälsi 1 % pe-15 nisilliiniä ja streptomysiiniä, 5 % hevosen seerumia ja 1 % N3:a, hormonilisäainetta). Yksi solususpensio valmistettiin trituroimalla digestoidut kudosfragmentit tulella käsitellyllä pasteur-pipetillä. Erotellut solut laskettiin hemosytometrillä ja asetettin levyille sopivaan tiheyteen 20 elatusaineeseen. Testiligandit lisättiin viljelmiin 5 -6 tuntia levittämisen jälkeen ja kasvatettiin in vitro kymmenen päivää, väliaineen vaihto joka kolmas päivä.

« f 12.1.5. Koliiniasetyltransferaasimääritykset 1 '.25 • · · ’· *; Käsittelyn aikana soluja käytettiin joko koliiniasetyl- ’ ’ transferaasientsyymimäärityksessä (choline acetyltransfera-• » · V · se (CAT) enzyme assay) tai ne käsiteltiin immuhistokemial- lista värjäystä käyttäen CAT:ia varten seuraavaan tapaan. _ ·:·*:30 Monoklonaalinen vasta-aine CAT:ille hankittiin Boehringer

Mannheim Biochemicals Co. -yhtiöltä ja sitä on kuvattu toi- * saalia. Koejakson lopuksi soluja huuhdeltiin kahdesti • f DMEM:11ä. Viljelmät fiksoitiin kahdessa vaiheessa. 50 μΐ * 4-prosenttista paraformaldehydiä lisättiin 50 μΙ'.ΖΒη DMEM:-.[.’.‘Οδ iä 10 minuutin inkuboinnin ajaksi. Tämä liuos otettiin ····: pois ja korvattiin 100 Mlrlla 4-prosenttista paraformalde- 105342 93 hydiä ja inkubointia jatkettiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Kiinnittämisen jälkeen soluja huuhdeltiin kolmeen kertaan fosfaattipuskuriaineella (PBS) ja permeabilisoitiin inkuboimalla 30 minuuttia saponiinin kanssa (0,5 mg/ml).

5 Pinta-aktiivinen aine poistettiin kolmella PBS-pesulla ja lisättiin 30 minuutiksi estoliuos 5-prosenttista normaalia kaniinin seerumia. Primaarinen vasta-aine annettiin 1:3 laimennoksena 1-prosenttisessa normaalissa kaniinin seerumissa kun estoliuos oli poistettu, ja viljelmiä inkuboitiin 10 yli yön 4 *C:ssa. Primaarisen vasta-aineen sisältävä liuos poistettiin PBS-pesulla. Sitoutunut immunoglobuliini todettiin Vectastain "ABC-menetelmällä. Diaminobentsi-deenitetrahydrokloridia (DAB) käytettiin substraattina pe-roksidaasireaktiossa, joka kesti yleensä yhdestä viiteen 15 minuuttia. Reaktio päätettiin huuhtomalla viljelmiä kahteen kertaan 0,1 M tris-HCl pH 7,2:11a. Viljelmät säilytettiin 50 mM:ssa tris, pH 7,6. joka sisälsi 0,15 M NaCl, 42 % glyserolia ja 0,15 % Zephirania (Pierce Chemical Co., Rockville, IL) 4 °C:ssa.

20 12.1.6. Menetelmä puhdistettujen astrogliasoluviljelmien . aikaansaamiseksi *·. Puhdistetut gliaviljelmät valmistettiin olennaisesti mene- [ j 25 telmällä, jota kuvaavat McCarthy ja DeVellis (McCarthy, K.

:.’*i D., and DeVellis, J. , 1980, J. Cell Biol. 85:890-902), 1-2 « päivän postnataalirotan hippokampuksesta. Hippokampukset

• M

· poistettiin viideltä poikaselta ja hienonnettiin saksilla.

Kudospalaset hajotettiin 2 ml:ssa 0,125-prosenttista tryp-·:··· 30 siiniä, 20 minuuttia 37 *C:ssa. Proteaasi inaktivoitiin laimentamalla levitysväliaineella (10 % fetaalinen naudan ·, seerumi, Gibco), DMEM, 0,5 % penisilliini (5000 mcg/ml) ja 0,5 % glutamiini). Yksittäinen solususpensio valmistettiin saattamalla dhajotetui kudos fragment it kavennetun pasteur-35 pipetin läpi. Solut pallukoitiin sentrifugoimalla, 900 kierrosta minuutissa, 5 minuuttia, uudelleensuspendoitiin 105342 94 levitysväliaineeseen ja laskettiin sitten hemosytometrillä. yksittäinen solusupensio jaettiin kolmeen 75 cma:n kudos-viljelmäpulloon ja soluja kasvatettiin noin 80 % konfluens-silla. Näitä soluja viljeltiin sitten edelleen juuri kuva-5 tun kaltaisen trypsinisaatiomenetelmän avulla. Gliasolut laskettiin ja levitettiin tiheyteen 10000 solua/0,9 cm2.

12.2. Tuloksia 12.2.1. BDNF:n vaikutus ventraalimesenkefalonviljelmissä 10 läsnä olevaan tyrosiinihydroksylaasiin

Osassa 12.1.2, supra, kuvatun kaltaista immunosytokemial-lista värjäystä käytettiin mitattessa BDNF:n vaikutusta tyrosiinihydroksylaasi- (TH-) positiivisten solujen luku-15 määrään (kuvio 8). Maksimaalinen yli 200 prosenttinen lisäys verrokkiin nähden oli huomattavissa BDNF-stimuloiduis-sa ventraalimesenkefalonviljelmissä 8. päivänä. Vähäinen lisäys oli havaittavissa BDNF-stimuloiduissa viljelmissä jo 3. päivänä.

20 12.2.2. BDNFrn vaikutus dopamiiniottoon ventraalimesenke-falonviljelmissä

IMI

.···, 3H-dopamiiniotto (3H-DA) mitattiin tapaan, jota kuvaavat • · ,’”25 Dal Taso et ai., (1988, J. Neurosci. 8:733-745), vähäisin • · . . muutoksin, kuten on kuvattu osassa 12.1.3, supra.

• · · * * Vähäinen lisäys dopamiiniotossa voitiin havaita BDNF-stirou- • · · · · loiduissa ventraalimensenkefalonviljelmissä 8. viljelypäi- • · * ’·* * vänä (kuvio 9).

30 ‘Σ’** 12.2.3. BDNF:n vaikutus koliiniasetyltransferaasiekspres- sT: sioon etuaivojen kolinergisissä neuroneissa t • · « • · ·

Kuviossa 10A esitetään BDNF:n vaikutusta CAT-positiivisten

• I

’.'35 solujen määrään 12 päivän in vitro-kasvatusjakson jälkeen.

• I » ·/· ’ 5,9-kertainen lisäys CAT-solumäärässä on havaittavissa 100 • » * · • · 105342 95 ng/ml:n BDNF-lisäyksellä, laskettu EC50 oli 10 ng/ml. Vertailun vuoksi käsiteltiin 260000 solun (musta pylväs) tai 150000 solun (viivoitettu pylväs) nestekuopassa viljelmiä täysin samaan tapaan NGF:llä (kuvio 10B). 260000 solun 5 tiheys kuopassa vastasi BDNF-kokeen tiheyttä. Tämä lisäys CAT-immunopositiivisten solujen lukumäärässä vastaa aiemmin saavutettuja tuloksia. BDNF:n mahdollista vaikutusta ko- w linergisiin soluihin kokeiltiin myös mittaamalla CAT-ent-syymiaktiivisuus (F. Fonnum, J. Neurochemistry, 1975, 10 24:407-409). Kuvio 11 kuvaa BDNF-käsittelyllä aiheutettuja CAT-muutoksia. Tässä tapoauksessa 1,8-kertaiseen tulokseen päästiin käyttämällä 100 ng/ml BDNF:ää ja EC50:n laskettiin olevan 61 ng/ml.

15 12.2.4. BDNF:n tai EGF:n vaikutukset astrogliasoluviljel- miin

Tyypin II astrosyyteissä on osoitettu olevan affiniteetti-herkkiä reseptoreita monelle neurotransmitterille ja neuro-20 peptidille. Astrosyytit siis pystyvät vastaamaan hermosoluja pitkin johtuviin signaaleihin. Tämän vuoksi ja sik-si, että tyypin II astrosyytit ovat solukomponentteja pri- ,··. maariviljelmissä BDNF:n mahdollista suoraa vaikutusta her-• · moston tukikudokseen liittyviin soluihin tutkittiin. Solu-. .25 ja pidettiin in vitro neljä päivää ennen kasvutekijöiden • t · ’· *j lisäämistä, niin että päästiin noin 60 % konfluenssiin, ja t · · · · * * käsiteltiin niitä sitten 42 tuntia EGF:llä tai BDNFrllä.

• · · V * Viimeisinä 18 inkubointituntina väliaineessa oli läsnä [3H]metyylitymidiiniä. EGF:n vaikutus on esitetty kuviossa ·:··: 30 12A. Kuten aiemmin on raportoitu, EGF:n havaittiin vaikut- tavan mitogeenisesti astrosyytteihin. Maksimaalinen vaste * · havaittiin 10 ng/ml:11a EGF:ää, se sai aikaan 5,2-kertaisen • · · • · ·

//, lisäyksen [3H]metyylityroidiini-inkorporaatiossa. Kuvio 12B

• * *·;·' esittää BDNF:n vaikutusta [3H]metyylitymidiini-inkorporaa- :/:35 tioon. BDNF-vaste näyttää olevan kaksivaiheinen. Hyvin pienet määrät (0,1 ng/ml) saavaat aikaan vähäisen lisäänty- 105342 96 misen tymidiini-inkorporaatiossa, ja yli 1 ng/ml BDNF:ää esti ^Hjmetyylitymidiini-inkorporaation. BDNF-määrän ollessa 24 % inhibitio oli 24 %, ja se viittaa siihen, että hermoston tukikudokseen liittyvien solujen proliferaatio-5 määrä on vähentynyt hoitojakson aikana.

12.3. Pohdintaa Nämä in vitro-kokeet osoittavat selvästi, että BDNF edistää 10 dopaminergisten neuronien elävänä pysymistä ja indusoi niiden täysin erilaistuneen tilan kehittyvän rotan substantia nigrassa, kuten ilmenee tyrosiinihydroksylaasivärjäyksessä ja dopamiininotossa viljelmissä, joissa on käytetty näitä hermosoluja, jotka ovat peräisin rotan alkioiden keskiai-15 voista. Koska juuri nämä neuronit degeneroituvat Parkinsonin taudissa, on erittäin todennäköistä, että BDNF:llä on terapeuttinen vaikutus Parkinsonin taudissa, joko siksi, että se alentaa neuronien vähentymistä, siksi, että se lisää tyrosiinihydroksylaasimääriä (dopamiinisynteesiä ra-20 joittava entsyymi), tai mahdollisesti molemmista syistä.

Lisäksi BDNF:llä näyttää olevan NGF:n tapaan elossapitävä vaikutus kolinergisiin neuroneihin rotan basaalisissa etu-aivoissa, kuten osoittavat lisätty koliiniasetyylitransfe- • · . ?5 raasivärjäys (CAT), lisätty CAT-aktiivisuus ja lisätty ase- * » m ’· *; tylkolinesteraasivärjäys viljelmissä, joissa käytettiin rotan alkion mediaalista septaalinukleusta ja Brocan alueen V ' diagonaalisen säikeen nukleusta. Näin ollen BDNF:ää yksin tai yhdessä NGF:n kanssa voidaan ilmeisesti käyttää hoita- - *”30 maan sairauksia, jotka vaikuttavat basaalisiin etuaivojen :T: kolinergisiin neuroneihin, esimerkiksi Alzheimerin tautia.

• · • · > · · • · * « « · * II· ’ 13. Esimerkki: BDNF/NGF-geeniperheen uuden jäsenen tunnis- ·:*·: taminen 105342 97

Menetelmää, jossa BDNF/NGF-geeniperheen uusia jäseniä etsittiin käyttämällä PCR-reaktiota degeneraatti-oligonukle-otidein, perusteena NGF:n ja BDNF:n aminohappojaksojen sek-venssikonservaatio (Box 1-4, katso osa 5.8), kokeiltiin 5 ensin katsomalla, voitiinko tällaisten alukkeiden pareja käyttää vahvistamaan useiden eri lajien genomisen DNA:n sekä NGF- että BDNF-geenisekvenssejä. Tätä käytettiin sitten tunnistamaan uusi geeni, jolla on homologioita sekä NGF:n ja BDNF:n kanssa kaikissa merkityissä homologia"bok-10 seissa".

13.1. Materiaalit ja menetelmät 13.1.1. Polymeraasiketjureaktio 15 PCR toteutettiin olennaisesti tapaan, jota kuvataan osassa 6, supra.

13.2. Tuloksia 13.2.1 NGF- ja BDNF-sekvenssien vahvistaminen genomisesta 20 DNA:sta ·: Valmistettiin synteettiset degeneraattioligonukleotidialuk-

IMI

keet, jotka vastasivat NGF:n ja BDNF:n Box 1 ja Box 2 • · · aminohappokonservaatio jakso ja (ks osa 5.8) ja käytettiin .·. ; 25 niitä PCR-reaktiossa rotan genominen DNA templaattina.

• · · [ Täsmälliset alukesekvenssit olivat seuraavanlaiset (de- • · ... generaattialueet, kahden tai useamman emäksen seos oli- • m m ’·' ’ gonukleotidisynteesin vaiheessa, merkitty sulkumerkkeihin; alleviivatut osat tarkoittavat häntiä, joissa on useita ·***30 restriktioendonukleaasipilkkoutumiskohtia vektoriin sitou-• » ·

: tumista helpottamassa seuraavassa kloonauksen vaiheessa; A

. .·. = adeniini, G = guaniini, C = sytosiini, T = tyrniini, N = .···, seos A, G, CT): • · • · · *.· ‘35 Box 1 (sense), aluke IB: 5'-GACTCGAGTCGACTCGGTGTGf C.T)GACAGf C.Tl(A,G)T(C,T,A)AG-3' 98 105342

Box 2 (antisense), aluke 2: 5'-CCAAGCTTCTAGAATTCCA f C.T1TT f N1GT f C.T1TC f A. G-)(A,T)A(A,G)AA(A,G)TA(C,T)TG-3' 5 300 ng kumpaakin degeneraattialukeseosta lisättiin 500 ng:aan rotan genomista DNA:ta 100 mikrolitrassa PCR-stan-dardiainereaktioseosta. Toteutettiin 35 sykliä, joista jokaisessa inkuboitiin l minuutti 94 1C:ssa, 2 minuuttia 43 ’c:ssa ja 2 minuuttia 72 1C:ssa. Odotetun NGF- tai BDNF-10 geenille näitä alukkeita käyttäen toteutetun PCR-vahviste-tun tuotteen koko oli 175 eraäsparia, mukaanlukien kaksi 17 meerin häntää (alleviivattu), jotka lisättiin helpottamaan myöhempiä kloonausvaiheita. Reaktioseoksen elektroforeesi 8% polyakryyliamidi/5 % glyseroligeelillä johti odotetun 15 kokoiseen, 175 bp, vahvistettuun DNA-vyöhykkeeseen.

13.2.2. BDNF/NGF-koettimen komplementaaristen sekvenssien etsiminen eri lajien genomisista DNA:ista 20 175 bp:n vyöhyke otettiin akryyliamidigeelistä elektroeluu- tiota käyttäen ja vahvistettiin edelleen toisessa seitsemän syklin PCR-reaktiossa. muutoin samanlaisissa olosuhteissa, il! vain dGTP-, dATP- ja TTP-pitoisuudet laskettiin 50 μΜ:ϋη • 1 ja leimaamattoman dCTP:n asemesta käytettiin alfa-32p-dCTP- *25 ilmaisinta. Radioaktiivisesti leimautunut DNA-tuote ero-• · • · · *·tettiin reaktiokomponenteista kromatografiällä kokojakauma- :\:35 ' kolonnissa. Tätä koetinta, jota nimitetään R1B/2C (rotan ··· ·.· : DNA vahvistettuna alukkeista IB ja 2C), käytettiin etsimään komplementaarisia sekvenssejä eri selkärankaisiajien geno-•;2S0 misista DNArista (tulokset rotalta, hiireltä ja kanalta näkyvät kuviossa 13) sen jälkeen kun oli suoritettu EcoRI-restriktioendonukleaasihajotus ja nitroselluloosablottaus, 2 ;;; southern-hybridisaatiomenetelmä EcoRI-hajotetuille genomi-sille DNArille, kuvio 13.

105342 99 NGF- ja BDNF-sekvenssit sisältävien genomisten deoksiri-bonukleiinihappojen EcoRI-fragmenttien koko määritettiin verrokeista rinnakkaisblottauksessa käyttämällä radioaktii-visesti leimattuja ihmisen NGF- ja BDNF-koettimia, jotka 5 oli valmistettu kloonatuista geeneistä PCR-reaktion avulla.

NGF:n ja BDNF:n genomiset EcoRI-fragmentit näkyvät kuviossa , 13 (N ja B). Tulokset samankaltaisesta analyysistä on esi tetty kuviossa 3, ja ihmisen BDNF-koettimella saavutetut tulokset ovat yhtäpitävät kuviossa 3 näkyvien sian BDNF-10 koettimella saatujen tuloksien kanssa. Kuten edellä mainittiin, NGF- ja BDNF-koettimet hybridisoituivat yksittäisiin EcoRI-fragmentteihin eri selkärankaisiajien genomisis-sa DNA:issa. Esimerkiksi rotan DNA:sta BDNF-koetin havaitsi noin 8,8 kb:n vyöhykkeen, NGF-koetin noin 10,4 kB:n vyö-15 hykkeen.

Kuten kuviosa 13 voidaan nähdä, jokaisessa testatussa lajissa (näkyvissä tiedot kanan, hiiren ja rotan osalta) RlB/2C-koetin hybridisoitui aivan samanlaiseen DNA-vyöhyk-20 keeseen, jonka NGF-koetin tunnisti samoin kuin aivan samanlaiseen DNA-vyöhykkeeseen, jonka BDNF-koetin tunnisti (hii-rellä NGF:n ja BDNF:n genomisten EcoRI-fragmenttien elekt-

III

roforeettinen liikkuvuus on sama, noin 11,5 - 12,0 kb).

Ml

Tämä osoittaa, että degeneraattioligonukleotidialukkeita IB

,·. 25 ja 2C voidaan käyttää vahvistamaan sekvenssejä sekä NGF- ·« I että BDNF-geeneistä. Oli merkillepantavaa, että joissain • · ... tapauksissa genomisessa southern blot-hybridisaatiossa

III

*·* ' RlB/2C-koettimella oli havaittavissa ylimääräisiä vyöhykkeitä. Esimerkiksi EcoRI-hajotetussa hiiren genomisessa *:'*3o DNA:ssa havaittiin vähintään kaksi ylimääräistä vyöhykettä • · · : (nimitykset Xl ja X2: noin 19,0 kb ja 1,5 kb), jotka eivät . liittyneet NGF:ään tai BDNF:ään. Samoin oli havaittavissa .**'·. vähintään kaksi ylimääräistä vyöhykettä hybridisaatiossa rotan DNA:hän (Xl, X2, noin 7,3 ja 1,2 kb), ja vähintään :.:35 yksi kanan DNA:ssa (X, noin 2,6 kb). Ylimääräisiä vyöhyk-keitä, joita ei eksplisiittisesti ole merkitty tähän kuvi- 105342 100 oon, oli myös joissain tapauksissa havaittavissa. Tällaiset vyöhykkeet, jotka eivät liittyneen NGF:ään tai BDNF:ään antoivat odottaa, että oli olemassa muitakin tämän geeni-perheen jäseniä. Samaan tapaan vyöhykkeitä, jotka selvästi 5 erosivat sellaisista, joiden tiedettiin sisältävän BDNF- ja NGF-geenisekvenssejä, löydettiin käyttämällä muita alukepa-reja ja genomisia DNA-templaatteja (tuloksia ei esitetty).

13.2.3. BDNF:n ja NGF:n sukuisen uuden geenin tunnistami-10 nen

Suoritettiin spesifinen koe sen oletuksen perusteella, että uusia BDNF:n ja NGF:n sukuisia geenejä voidaan tunnistaa polymeraasiketjureaktiolla degeneraattioligonukleotidialuk-15 keiden avulla, käyttäen alukkeita Box 3:lie ja Box 4:lie (ks. osa 5.8) ja hiiren genomista DNA:ta templaattina. Degeneraattialukkeet syntetoitiin sekvensseistä:

Box 3 (sense): 20 5'-GGGGATCCGCGGITG(T,C)(C,A)GIGGIAT(T,C,A)GA-3'

Box 4 (anti-sense): *;;; 5'-TCGAATTCTAGATIC(T,G) IÄT(AG) AAIC(T,G)LCCA-3 ’ '25 (G = guaniini, A = adeniini, C = sytosiini, T = tyrniini, I • « ·."·: = inosiini; sulkumerkeissä näkyvillä useamman kuin yhden emäksen seokset yhdessä ainoassa oligonukleotidin asemas-sa). Huomattakoon, että inosiinia käytettiin joissain asemissa vastaamaan kodonin kolmatta (’’wobble") emästä geneet-....30 tisen koodin degeneraation mahdollistamiseksi. On myös .*:·. mahdollista käyttää seoksena neljää perinteistä DNA-emästä inosiinin asemesta, ja olennaisesti samanlaisia tuloksia '···' onkin tällaisia alukkeita käyttäen saatu.

;*|^5 Degeneraatti Box 3/Box 4 -alukeparin PCR-reaktiosta geno-misella NGF- ja BDNF-sekvensseillä hiiren DNA:sta voidaan • · 105342 101 odottaa vahvistavan noin 90 emäsparin (bp) jaksoa. Käyttämällä edellä mainittuja alukkeita suoritettiin PCR neljässä syklissä pienenevällä lämpötilalla 45 °C ja 31 syklissä vähenevässä lämpötilassa 49 'c. Tuotteet analysoitiin gee-5 lielektroforeesilla ja voitiin havaita odotetun kokoinen päävyöhyke. Hiirellä NGF-geeni sisältää Hindll-restriktio-endonukleaasipilkkoutumiskohdan alueella Box 3:n ja Box 4:n välillä, BDNF-geeni pilkkoutumiskohdan Apal-entsyymilie tällä alueella. Polymeraasiketjureaktiossa Hindll- ja 10 Apal-vahvistetun tuotteen hajottamisen voidaan olettaa irrottavan NGF- ja BDNF-sekvenssit tuotteen päävyöhykkeestä. Kuitenkin kun PCR-tuote oli hajotettu näennäisen täydellisesti näiden kahden restriktioentsyymin kanssa, vahvistetusta DNA:sta löytyi hajotusresistentti vyöhyke. Tämä an-15 taa aiheen olettaa, että NGF- ja BDNF-geenien lisäksi oli vahvistettu vähintään yksi uusi geeni.

13.2.4. BDNF/NGF-geeniperheen uuden jäsenen karakterisointi 20

Hajotusresistentti PCR-tuote eluoitiin geelistä ja sitä ·· käytettiin templaattina asymmetrisessä PCR-reaktiossa,

· f I

.···. joissa jompaa kumpaa alkuperäistä degeneraattialuketta oli läsnä 100-kertainen mooliylimäärä toiseen alukkeeseen ver- ...25 rattuna. Tällä asymmetrisellä vahvistamisella saatiin ai-« · · ’ '. kaan yksisäikeisiä DNA-templaatteja, joita voitiin käyttää sekvensointiin ketjunlopetusmenetelmällä. Uuden geenin, • · * ’·' " jota tässä nimitetään M3/4:ksi, mutta myös Neurotrophin- 3:ksi) sekvenssianalyysiä laajennettiin edelleen sekvenssi- '•‘30 en PCR-vahvistuksella, jossa käytettiin täsmällistä aluket-• · · * v : ta Box 3:n ja Box 4:n välillä ja poly-A-sekvenssiä geenin . ,·, transkriptin 3'-päässä, menetelmänä RACE-vahvistaminen (ra- < « t .*··. pid amplification of cDNA ends), jota kuvaavat M. A. Froh- *1* man, M. K. Dush ja G. R. Martin, (Proc. Natl. Acad. Sei, · · *.*3*5 USA, 85:8998-9002, 1988). DNA-sekvensoinnin tulokset pal-jastivat, että uusi geeni oli saatu vahvistettua, ja siinä 105342 102 oli avoin lukujakso, joka pystyi koodaamaan polypeptidiä, joka oli erilainen kuin NGF ja BDNF, mutta aminohapposekvenssiltään muistutti läheisesti niitä molempia (kuvio 14).

5 Alustavat todisteet siitä, että tämä uusi geeni koodaa neu-rotrofista tekijää saatiin määrittämällä sen ekspressiomal-li rotan kudoksissa northern Jblot-hybridisaatiolla. Tämä analyysi osoitti, että uusi geeni ilmenee paljon voimakkaammin aivokudoksessa kuin missään muussa tutkituista kulo doksista.

13.3. Pohdintaa

Kuten edellä tuli esiin (kuvio 13), DNA-koetin, joka saa-15 tiin PCR-vahvistamisella käyttämällä alukkeita Box l:lle ja Box 2:lie rotan genominen DNA templaattina (R1B/2C) hybri-disoitui uusiin vyöhykkeisiin niiden lisäksi, joiden tiedettiin sisältävän NGF- ja BDNF-geenisekvenssejä EcoRI-ha-jotetussa DNArssa kaikilla tutkituilla lajeilla. Samanlai-20 nen analyysi toteutettiin käyttämällä radioaktiivisesti leimattua koetinta uudelle geenille, joka oli vahvistettu käyttämällä Box 3 ja Box 4 -alukkeita hiiren genomisessa _···. DNA:ssa (M3/4). Kaikissa tapauksissa M3/4-koetin hybri-• · disoitui yhteen ainoaan päävyöhykkeeseen EcoRI-hajotettua • · . ,25 genomista DNA:ta, eri vyöhykkeeseen kuin niihin, joiden » · · *· *j tiedettiin sisältävän BDNF- ja NGF-sekvenssejä. Huomattakoon, että hiiren, rotan ja kanan genomisen DNA:n EcoRI- • · · ·.· : fragmentit, joiden hybridisoitumista M3/4-koettimen kanssa tarkkailtiin, ovat kaikissa tapauksissa yhteensattuvia yh- _ :·'30 den uuden vyöhykkeen kanssa, jotka oli saatu hybridisaa- tiolla RlB/2C-koettimella. Nämä ovat 19,0 kb:n EcoRI-frag- • \ mentti hiiren DNA:ssa (Xl kuviossa 13), 7,3 kb:n fragmentti "I rotan DNA:ssa (Xl kuviossa 13) ja 2,6 kb:n vyöhyke kanan DNA:ssa (X kuviossa 13). Tämä viittaa siihen, että osia : : 35 samasta geenistä vahvistui rotan DNA:sta käytettäessä ·:··· lB/2C-alukeparia ja hiiren DNA:sta käytettäessä M3/4-aluke- 105342 103 paria. Näin siis ainakin yksi uusi geeni ilmeisesti on homologialtaan samanlainen NGF- ja BDNF-geenien kanssa kaikissa neljässä mainitussa homologia^boksissa".

5 Puhuttaessa NGF:n, BDNF:n ja geeniperheen uusien jäsenien (esim M3/4, joka tunnetaan myös NT-3:na) ,,boksi,,homolo-giasta, tässä on liikuttu lähinnä primaaristen aminohapposekvenssien tasolla ja geeniperheen uusien jäsenien tunnistusmenetelmissä. On kuitenkin tärkeää huomata, että 10 todennäköisesti on olemassa lisäviitteitä, jotka koskevat näiden neurotrofisten tekijöitten sekundaarista ja tertiääristä rakennetta, vuorovaikutusta spesifisten reseptorien kanssa ja uusien mahdollisesti terapeuttisten molekyylien järkiperäistä luomista 15 NGF:ssä on esimerkiksi 6 kysteiinijäämää, joiden kaikkien on osoitettu liittyvän disulfidiliitoksiin. Numeroimalla ne lähinnä N-terminaalia sijaitsevasta lähinnä C-terminaa-lia sijaitsevaan Cysl - Cys 6, tiedetään, että disulfidi-20 siltoihin kuuluuvat Cysl-Cys6, Cys2-Cys5, Cys3-Cys6. Kaikkien 6 Cys-jäämän asemat säilyvät NGF:n ja BDNF:n välillä, ja M3/4-osan 3 Cys-jäämän asemat sekvensoituvat täsmälli-sesti NGF:n ja BDNF:n jäämiin Cys4, Cys5 ja Cys6. Tämä antaa aiheen olettaa, että geeniperheen kaikkien jäsenien ] ]25 sekundaarinen rakenne on hyvin samankaltainen ja määräytyy • · » ·. ·: suurelta osin konservaattikysteiinijäämien mukaan. Huomat- takoon, että BDNF:n ja NGF:n homologia,,bokseissaM on 5 kuu- ·»· ϊ.ϊ ; desta kysteiini jäämästä (Cysl: Box 1, Cys2: Box 2, Cys3:

Box3, Cys5 ja Cys6: Box 4). Tämä tukee ajatusta, että *:*·:30 näillä kysteiini jäämillä ja niiden välittömässä läheisyy- . .*”· dessä olevilla osilla on tärkeä tehtävä näiden neurotrofis- « · « ♦ ·, ten tekijöiden yleisen rakenteen määrittämisessä. Struk-turaaliset determinantit spesifiseen vuorovaikutukseen af-'···' finiteettiherkkien reseptorien kanssa jokaisessa näissä :':':35 neurotrofisessa tekijässä sijaitsevat todennäköisesti aivan f tietyissä osissa kussakin molekyylissä.

105342 104

Uusia kimeerisiä geenejä voidaan siis valmistaa suorittamalla (esim. in vitro -rekombinaatiota tai suoraa geenisyn-teesiä käyttäen) rekombinaatio geeniperheen jäsenten kesken missä tahansa jo kuvatuista neljässä homologia,,boksisssa", 5 tai muualla molekyylissä. Tällaisten kimeeristen proteii- ·» nien sekundaarinen rakenne tulee todennäköisesti olemaan samankaltainen konservaatti-Cys-jäämien ja muiden aminohappo jäämien vuoksi, mutta niillä voi olla uusia biologisia ominaisuuksia. BDNF/NGF-kimeerinen proteiini voi esimer-10 kiksi olla bifunktionaalinen vuorovaikutuksessaan sekä BDNF- ett- NGF-reseptoreihin. Kimeeriset proteiinit voivat myös erota kantamolekyylistä tai -molekyyleistä, mitä tulee dimerisoitumiseen ja muihin fysikaaliskemiallisiin ominaisuuksiin. Kimeeriset proteiinit saattavat myös pystyä toils mimaan antagonistina jommalle kummalle kantamolekyylille.

Aktiivisia BDNF/NGF-fragmentteja voidaan käyttää luomaan uusia geeniperheen jäseniä käyttämällä hyväksi tietoja tärkeistä "ydin"osista sopivaan laskosteluun sekä tietoa, joka 20 koskee alueita, joita tarvitaan tyyppispesifiseen interaktioon reseptorien kanssa.

Verrattaessa uusia geeniperheen jäseniä (esim. M3/4) jo tunnettuihin jäseniin voidaan löytää uusia homologia"bokse-*:'”25 ja", jotka voivat auttaa etsimään taas uusia BDNF/NGF-gee-niperheen jäseniä. Esimerkiksi M3/4:n ja BDNF:n vertailu ·:··· tuo esiin joitain käyttökelpoisia homologia"bokseja". Eri-tyisen kiinnostaviin kuuluu neljäs konservaatti-Cys-jäämä, mainittu ainoa, jota ei ole aiemmin mainituissa "bokseissa" 1-4. Itse asiassa on löydettävissä yksi melko pitkä ident- • · ... tinen jakso, BDNF:lie ja M3/4:lle yhteinen konservoitunut • · · *. aminohapposubstituutio, johon sisältyy tällainen Cys-jäämä, nimittäin: His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys-(Arg tai Lys)-Thr-(Thr tai Ser)-Gln-(Ser tai Thr)-Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr. Tältä .j.,35 alueelta voidaan valita ainakin kaksi homologia"boksia" ’ . käyttökelpoisten degeneraattioligonukleotidialukkeiden syn- 105342 105 tetointiin (esim. His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys vaatii ainoastaan 96-kertaisen degeneraation 18 xneerin alukkeeseen, tai 48-kertaisen degeneraation 17 meerin alukkeeseen; myös Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr olisi käyttökelpoinen "boksi·'.

5 ΙΔ-ι_Esimerkki; Lisääntynyt BDNF-ekspressio neuroblastoo- masoluissa w 14.1. Materiaalit ja menetelmät 14.1.1. Solulinjat 10 CHP100, CHP126, CHP134, CHP234, LAN1, LAN5, NB9, SY5Y, Y79, FOl,BU2, HOI. HL60 ja COL320 ovat solulinjoja, joita ylläpidetään laboratoriossa (Dr. Fred Alt), josta saatiin myös kuvion 15 northern blot-kokeiden RNA. Kaikki nämä solulin-15 jät olivat ihmisen kasvainsolulinjoja. CHP100 on neuroepi-telioomasolulinja, CHP126, CHP134, CHP234, LAN1, LAN5, NB9 ja SY5Y ovat neuroblastoomasolulinjoja, Y79 on retinoblas-toomasolulinja, FOl, BU2 ja HOI ovat melanoomasolulinjoja, HL60 on promyelolyyttinen leukemiasolulinja ja COL320 on 20 neuroendokriininen paksusuolen karsinoomasolulinja.

14.1.2. RNA:n valmistus • · RNA valmistettiin northern Jblot-menetelmällä, jota kuvataan j 25 osassa 8.1.1., supra, täysimittaisella ihmisen cDNA-koetti-• · · *· *J mella. Kokonais-RNA:ta oli 10 μq kaikilla geeliraidoilla, : joista saatiin kuvion 15 mukainen norther Jblot-kuvio, vain • · · : raita LAN1 ei ollut yhtä kuormitettu ja SY5Y:hyn käytettiin yksi mikrogramma poly(A)*-RNA:ta. ^ ·;·*ί30 14.2. Tulokset « • ·

Kuviossa 15 nähdään tulokset northern blot- analyysistä, '”* joka tehtiin BDNF-koettimelle, joka oli hybridisoitu eri-;’;’S5 laisista ihmisen solulinjoista saatujen RNA-näytteiden joukkoon. Solulin joilla CHP234 ja LAN5 oli huomattavissa 105342 106 runsaasti BDNF-koettimeen hybridisoitunutta RNA:ta, pienempiä määriä solulinjoilla CHP126 ja CHP134. Kaikki positiiviset linjat oli johdettu ihmisen varhaishermosolukasvai-mista.

5 15. Esimerkki:_BDNF- ia NGF-mRNA;iden aktiivisuusriippu- vainen säätely rotan hippokampuksessa välittyy ei-NMDA-glu-tamaattireseptorien avulla 15.1 Materiaalit ja menetelmät 10 15.1.1. Rottien käsitteleminen kainiinihapolla

Rotat saivat yleensä diatsepamia (valiumia) 90 minuuttia intraperitoneaalisen kainiinihapporuiskutuksen (12 mg/kg) jälkeen vaimentamaan ekstensiivistä kouristelua. Kuten 15 kuviosta 19 ilmenee, kainiinihapon jälkeen annettu diatse-paami ei vaikuttanut lisääntyviin BDNF- ja NGF-mRNA-1isä-määriin. Rotilla, jotka eivät saaneet diatsepaamia, ilmeni samanlaista BDNF- ja NGF-mRNA-määrien lisääntymistä hippo-kampuksen alueella 3 tuntia kainiinihapon jälkeen verrattu-20 na eläimiin, jotka saivat kainiihappoa ja sen jälkeen diatsepaamia.

« · · ,··, 15.1.2. Hippokampusviljelmien valmistaminen • i · « « « · · • · , £5 Hippokampukset otettiin alkionkehitykseltään 17 päivää van- t · · ’ *j hoilta (E17) rotanalkioilta, dissekoitiin ja inkuboitiin 20 minuuttia 37 *C:ssa, fosfatoidussa puskurisuolaliuoksessa V : (PBS), ilman kalsium- tai magnesiumioneja, mutta mukana 10 mM glukoosia, 1 mg/ml albumiinia, 6 Mg/ml DNAase ja 1 mg/ml *:**30 papaiinia. Kun liuos oli pesty ilman papaiinia, hippokam-puksen solut irrotettiin varovasti käyttämällä tulella kä-

V

\ siteltyä pasteur-pipettiä. Solut koottiin sentrifugoimalla • · · ;;; pienellä nopeudella, uudelleensuspendoitiin DMEM:iin, li-• · sättiin 10 % vasikanalkion seerumia ja levitettiin muovi-:.:35 siin elatusmaljoihin (0,5 x 10‘ solua per 35 mm), jotka oli ·:·· etukäteen päällystetty poly-DL-ornitiinillä (0,5 mg/ml) ja 105342 107 laminiinilla (5μ9/ιη1). Kolme tuntia levittämisen jälkeen elatusaine vaihdettiin seerumittomaan, joka sisälsi lisäaineita, joita kuvaavat Brewer ja Cotman (Brewer and Cotman, Brain Res. 497:65, 1989), vain ilman glutamaattia. Neu-5 ronit pysyivät viljeltyinä elävinä noin kolme viikkoa, ja kokeisiin niitä käytettiin yleensä 7. päivänä levittämisen jälkeen.

♦ 15.1.3. RNA:n vahvistaminen 10

Solukokonais-RNA uutettiin tavalla, jota kuvaavat Chomcyns-ki ja Sacci (Chomcynski and Sacci, Anal. Biochem., 1987, 162:156-159) 0,5 x 10® soluista sen jälkeen, kun oli lisätty lyhennettyä NGF-cRNA-talteenöttostandardia (30 fg).

15 NGF-mRNA ja -cRNA vahvistettiin samanaikaisesti yhdessä käänteistranskiptaasi/polymeraasiketjureaktioputkessa (RT/PCR), joka sisälsi 1/5 uutetusta RNA:sta, lxRT/PCR-pus-kuria (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 raM KC1, 1,5 mM MgCl,, 0,1 mg/ml gelatiinia, 0,1 % Triton X-100) 0,25 mM dNTP, 0,1 μΗ 20 sekä 5'- että 3'-aluketta, 5 yksikköä RNasin (Promega), 3,2 yksikköä AMV-käänteistranskriptaasia (Life Science) ja 2 yksikköä Taq-polymeraasia (Genofit), kokonaistilavuus 25 * * • · μΐ. Seokseen pantiin mineraaliöljyä, inkuboitiin 41 *C:ssa 30 minuuttia, kuumennettiin 92 *C:een 60 sekunniksi, aluke-25 jäähdytys 55 'C, 60 sekuntia ja aluke-ekstensio 72 *C, 60 sekuntia. Vahvistetut tuotteet (203 emäsparin NGF-mRNA ja ·;··: 153 emäsparin talteenottostandardi) erotettiin käyttämällä 3 % NuSieve/agaroosi 3:1 geeliä (FMC Bioproducts), alkali-blottausta Hybond N plus -kalvoon (Amersham) ja hybridisoi-30 tiin kuvattuun tapaan (Heumann, R. and Thoenen, H., 1986, ... J. Biol. Chem 261:9246, Lindholm et ai., 1988, J. Biol.

• · « *. Chem. 263:16348). Absoluuttiseen kvantitiointiin pääsemi- seksi vahvistettiin yhdessä rinnakkaisreaktiossa tunnetut : määrät in vitro-transkriptoitua NGF-mRNA:ta ja talteenotto- .···. 35 standardia. Äskettäin ovat samanlaista menetelmää kuvan-• · · ’ . neet Wang et ai., PNAS 86:9717-9712, 1989).

v · 105342 108 15.2. Tuloksia ja pohdintaa BDNF ja NGF ovat saman geeniperheen jäseniä, joilla on noin 50 %:n aminohapposamaisuus (Leibrock et ai., 1989, Nature 5 341:149). Molekyyleissä on tarkasti konservoituneita alu- •m eitä. Näihin alueisiin sisältyvät 6 kysteiinijäämää, jotka mitä todennäköisimmin osallistuvat näiden molekyylien kolmiulotteisen rakenteen stabilointiin, mikä on tarpeen niiden biologisen aktiivisuuden kannalta. BDNF:ssä ja NGF:ssä 10 on kuitenkin vaihtelevia osia (variable domains), jotka määräävät niiden erilaisen neuronaalisen spesifisyyden (Lindsay et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319, Johnson et ai., 1986, J. Neurosci. 6:3031, Hofer, M., and Barde, Y., 1988,

Nature 331:261, Rodriguez-Tebar et ai., 1989, Dev. Biol.

15 136:296). Näiden kahden neurotrofisen molekyylin ero tulee esiin myös niiden syntetoitumiskohdan mukaan. NGF ilmentyy sekä perifeerisessä hermostossa (Korsching, S., and Thoe-nen, H., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:3513, Eben-dal et ai., 1983, Exp. Cell. Res. 148:311, Heumann et ai., 20 1984, EMBO J. 3:3183, Dhelton, D.L., and Reichardt, L.F., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:7951) että keskushermostossa (Korsching et ai-, 1985, EMBO J. 4:1389, Shel- • « · *;;; ton, D.L. and Reichardt, L.F., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei.

* » '···' U.S.A. 83:2714, Whittemore et ai., 1986, Proc. Natl. Acad.

'25 Sei. U.S.A. 83:817, Large et ai., 1986, Science 234:352).

• · NGF-herkkien neruonien hermotustiheys kuvastaa NGF-pitoi-

V

suuksia kohdekudoksissa (Korsching, S., and Thoenen, H., ii : 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:3513, Ebendal et ai., 1983, Exp. Cell. Res. 148:311, Heumann et ai., 1984, ....:30 EMBO J. 3:3183, Shelton, D.L., and Reichardt, L.F., 1984,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:7951, Korsching et ai., t · · 1985, EMBO J. 4:1389, Shelton, D.L. and Reichardt, L.F., ‘J·* 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83:2714, Whittemore et

• · V

·...* ai., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83:817, Large et « 35 ai., 1986, Science 234:352). Toisin kuin NGF, BDNF ilmentyy voittopuolisesti keskushermoston neuroneissa, ja BDNF-mRNA- 105342 109 pitoisuudet ovat huomattavasti suuremmat kuin NGF-mRNA-pi-toisuudet, esimerkiksi noin 50-kertaiset hippokampuksessa. Perifeerisessä hermostossa NGF:ää syntetoituu erilaisissa ei-neuronaalisissa solutyypeissä (Bandtlow et ai., 1987, 5 EMBO J. 6:891), aivoissa puolestaan pääasiallisesti neuroneissa, kuten on osoitettu in-situ-hybridisaatiolla (Rennert, P.D., and Heinrich, G., 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 138:813, Ayer-LeLievre et al.# 1988, Science 240: 1339, Whittemore et ai., 1988, J. Neurosci. Res. 20:403).

10 Viljeltyjen tyypin 1 astrosyyttien on kuitenkin osoitettu tuottavan huomattavia määriä NGF:ää (Lindsay, R: M., 1979, Nature 282:80, Furukawa et ai., 1987, Biochem. Biophys.

Res. Commun. 142:395). Neuronien ja astrosyyttien jakoa NGF:n syntetoinnissa aivoissa ei vielä tunneta.

15

Koska sekä BDNF- että NGF-mRNA:t ilmenevät voittopuolisesti keskushermoston hermosoluissa, tutkimme, vaikuttiko neuro-naalinen aktiivisuus näiden kahden mRNA:n määriin, ja jos vaikutti, mikä välittäjäaine tai mitkä välittäjäaineet mah-20 dollisesti osallistuivat säätelyyn. Ensimmäisessä koesarjassa valmistimme hermosoluviljelmiä rotan alkion (E17) hippokampuksesta. Kuten kuviosta 16A näkyy, hippokampuksen . '·' neuronien depolarisoiminen runsaalla (50 mM) kaliumilla * > · : t: johti BDNF-mRNA:n lisääntymiseen. Maksimipitoisuuksiin ·;··:25 päästiin 3-6 tuntia kaliumpitoisuuden lisäämisen jälkeen.

·*·.· Kaliumvälitteinen BDNF-mRNA-lisäys voitiin estää jättämällä • · ....: kalsiumionit pois väliaineesta, ja se väheni myös estämällä kalsiumvirtausta kalsiumkanavan estäjä-nifedipiinillä (cal- • · · sium channel blocker nifedipin) (kuvio 16B).

.30 [,,* Koska hippokampusvil jelmät muodostuivat sekalaisista neu- * · · e * roniryhmistä, joiden välittäjäaine- ja reseptoriekspressiot : vaihtelivat, tutkimme eri fysiologisten ja synteettisten reseptoriagonistien vaikutusta BDNF- ja NGF-mRNA-ekspressi- « · · 35 oon. Taulukkoon VII kootut tulokset osoittavat, että kai- • * · '·* ] kista tutkituista aineista kainiinihappo, glutamaattiresep-• · 105342 110 toriagonisti (Monaghan et ai., 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365) sai aikaan suurimman BDNF-raRNA-lisäyksen hippokampusneuroneissa. Muut molekyylit puolestaan, esimerkiksi karbakoli (muskariinireseptoriagonisti) ja hieman 5 vähemmässä määrin histamiini ja bradykiniini lisäsivät vähän, mutta merkittävästi, BDNF-mRNA:ta (taulukko VI). Koska NGF-mRNA-pitoisuudet hippokampusneuroneissa olivat erittäin pieniä, kehitimme kvantitatiivisen polymeraasiketju-reaktiomenetelmän (PCR), joka sopi NGF-mRNA-pitoisuuksien 10 muutosten märitykseen. Tätä menetelmää käyttämällä saimme selville, että kuten BDNF-mRNA-pitoisuudet, myös NGF-mRNA-pitoisuudet lisääntyivät kaliumin ja kainiinihapon vaikutuksesta hippokampusneuroneissa (kuvio 17).

15 Kuten kuviosta 18 näkyy, maksimaalinen BDNF-mRNA-lisäys hippokampusneuroneissa saavutettiin käytettäessä 25 μΜ kai-niinihappoa. Sitä suuremmat kainiinihappopitoisuudet vähensivät BDNF-mRNA-määriä, mikä erittäin todennäköisesti tarkoittaa, että suurilla kainiinihappopitoisuuksilla on 20 toksinen vaikutus hippokampuksen hermosoluihin (kuvio 18). Aikaisemmin on raportoitu glutamaattireseptorivälitteisestä .f neurotoksisuudesta (Choi et ai., 1987, J. Neurosci. 7:357), Rothman, S.M., and Olney, J.W. , 1987, Trends Neurosci. 10: • « '·'·] 299, Choi, D.W., 1988, Neuron 1:623) erilaisissa keskus- • •II· * 25 hermoston neuroneissa sen jälkeen kun on annettu vastaavia • t *. 1: eksitatorisia aminohappoglutamaatte ja BDNF- ja NGF-mRNA- *·’** ekspression lisäämisen tarvittavat kainiinihappopitoisuudet • « · ί.ί ! eroavat kuitenkin selvästi neurotoksisuuteen johtavista pitoisuuksista.

.«.•30

Kainiinihapon vaikutuksen tarkemmaksi selventämiseksi tut-·, kimme, voitiinko BDNF-mRNA-lisäys estää jollain tunnetulla • · i *«;' glutamaattireseptoriantagonistilla (Monaghan et ai., 1989, • « *...1 Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 29:365). Kynureniinihappoa i ;'·’;35 (laaja-alainen glutamaattireseptoriantagonisti, samoin kuin CNQX, kompetitiivinen ei-NMDA-reseptori-inhibiittori (Mo- 105342 111 naghan et ai., 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 29: 365) estivät täysin kainiinihappovälitteisen BDNF-mRNA-lisäyksen hippokampusneuroneissa (taulukko VII). Toisaalta MK 801, joka spesifisesti estää NMDA-reseptoreita, ei estä-5 nyt BDNF-mRNA:n lisääntymistä näissä neuroneissa. Lisäksi NMDA itse ei muuttanut BDNF-mRNA-määriä (taulukko VI).

Tämä osoittaa, että kainiinihappo vaikuttaa vain resepto-riensa kautta, ja että sen vaikutus ei johdu endogeenisen glutamaatin vapautumisesta (vaikuttaa NMDA-reseptoreihin).

10 Näin voidaan päätellä, että kainiinihappo lisää in vitro BDNF-mRNA-määriä ei-NMDA-glutamaattireseptorien kautta.

« • « · • · · • · · • · • · • · « t « « m • · • · • · • · · » · • · « • f a • • · i i « < • « · II· 1 105342 112

TAULUKKO VI

Eri reseptoriagonistien vaikutus BDNF-mRNA-ekspressioon viljellyissä hermosoluissa LISÄYS verrokki-% ei lisäystä 100 ± 5 karbakoli (50 μΜ) 220 ± 25 karbakoli (50 μΜ) + atropiini (10 μΜ) 85 ± 15 nikotiini (100 μΜ) 110 ± 7 histamiini (50 μΜ) 150 ± 12 serotoniini (100 μΜ) 95 ± 6 dopamiini (100 μΜ) 115 ± 7 norepinefriini (25 μΜ) 75 ± 10 substanssi P (1 μΜ) 85 ± 9 somatostatiini (1 μΜ) 110 ± 8 .*.· bradykiniini (1 μΜ) 115 ± 15 .···. kainiinihappo (25 μΜ) 1365 ± 70 NMDA (25 μΜ) 105 ± 10 ♦ · · -• · · 0 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • • · * • · · 9 *99 *99 105342 113

TAULUKKO VII

Antagonistien vaikutus eri glutamaattireseptoreihin kai-5 niinihappoindusoidussa BDNF-mRNA-ekspressiossa LISÄYS verrokki-% ei lisäystä 100 ± 60 10 kainiinihappo (25 μΜ) 1250 ± 60 kynureniinihappo (1 mM) 70 ± 6 kynureniinihappo (lmM) + kainiinihappo (25μΜ) 84 ± 7 CNQX (10 μΜ) 109 ± 6 CNQX (10 μΜ) + kainiinihappo (25μΜ) 105 ± 7 15 MK-801 (5 μΜ) 96 ± 5 MK-801 + kainiinihappo (25μΜ) 1130 ± 80

Arvioidäksemme in vitro-havaintomme fysiologista merkitystä 20 tutkimme, toimisivatko samanlaiset mekanismit myös in vivo.

Käsittelimme täysikasvuisia 180-200 g painavia sekä uros- että naaraspuolisia Wistar-rottia kainiinihapolla (12 .···. mg/kg). Eri pituisten ajanjaksojen jälkeen määrittelimme • · muutoksen BDNF- ja NGF-mRNA-määrissä hippokampuksessa ja .25 korteksissa käyttämällä northern blot-analyysiä. Kuviosta '· Ί 19 ilmenee, että kainiinihappo sai aikaan BDNF- ja NGF-’ ’ mRNA-määrien lisääntymistä molemmilla aivojen alueilla.

· BDNF-mRNA-lisäys oli selvästi suurempi kuin NGF-mRNA-1 i- säys. Lisäksi mRNA-määrät pysyivät suurina niinkin pitkään *:··:30 kuin 24 tuntia kainiinihappolisäyksen jälkeen. BDNF- ja :Y: NGF-mRNA-määrien muutokset ajan suhteen osoittivat, että *. maksimaalinen lisäys hippokampuksessa saavutettiin noin 3 tuntia kainiihappolisäyksen jälkeen (kuvio 19) . On kiin-’···’ toisaa huomata, että ennen BDNF- ja NGF-mRNA:iden lisäänty-:*:’35 mistä hippokampuksessa oli havaittavissa lisääntymistä c-·:·: fos-mRNA-pitoisuudessa. Ilmiöt saattava olla kausaalisesti 105342 114 sidoksissa toisiinsa, kuten äskettäin on raportoitu asian olevan lonkkahermossa leesion jälkeen (Hengerer et ai., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87:3899). Lisäksi sekä BDNF- että NGF-mRNA-lisäys ilmenee myöhemmin aivokuoressa 5 verrattuna lisäykseen hippokampuksessa. Tämä viittaa siihen, että signaalit, jotka lisäävät BDNF- ja NGF-ekspres-siota, leviävät hippokampuksesta aivojen muihin osiin.

Tämä havainto on yhdenmukainen aikaisemmin raportoitujen kanssa (Morgan et ai., 1987, Science 237:192), jotka osoit-10 tavat, että metratsoli-konvulsantilla esiin tuodut c-fos-lisäykset ilmenivät ensin hippokampuksessa ja sitten kor-teksissa.

Kun aikaisemmissa kokeissa oli todistettu, että NMDA-resep-15 torit osallistuvat hippokampuksen mRNA:iden, esim NGFI-A:n (Cole et ai., 1989, Nature 340:474) säätelyyn, me puolestamme tutkimme, pystyivätkö NMDA-reseptoriantagonistit MK-801 ja ketamiini estämään BDNF- ja NGF-mRNA:iden lisääntymistä in vivo. In vitro-kokeiderame tulosten vahvistukseksi 20 MK-801 ei estänyt kainiinihappovälitteistä BDNF-mRNA-li- säystä hippokampuksessa, vaikka se tehokkaasti esti kohtaukset, jotka olivat tulosta NMDA-reseptoriaktivaatiosta (kuvio 20). Todennäköisimmin tämä NMDA-reseptoriaktivaatio • · · johtuu kainiinihapon vapauttamasta endogeenisesta glutamaatti 25 tista (Biziere, K. and Coyle, T. , Neurosci. 1978, Lett. 8: ;*·.· 303), McGeer et ai., 1978, Brain. Res. 139:381). Samaan • · tapaan NGF-mRNA-lisäystä hippokampuksessa kainiinihappokä-sittelyn jälkeen ei pystytty estämään MK-80:llä tai ketä- • · · miinilla. Aikasemmassa tutkimuksessa (Gall, C. M., and .30 Isackson, P. J., 1989, Science 245:758) on osoitettu, että * · ... limbisiä kouristuksia aiheuttavat elektrolyyttiset leesiot • « i ’·* ’ lisäävät NGF-mRNA:ta rotan hippokampuksessa. Tämänhetkiset : MK-801-:11a ja kainiinihapolla saadut tulokset ovat kuiten- kin selvästi erilaiset mitä tulee kohtausten indusointiin 35 ja BDNF- ja NGF-ekspressiolisäyksiin. Jos rottia käsitel- ’ . tiin diatsepaamilla ennen kainiinihapporuiskutuksia, BDNF-• · 105342 115 ja NGF-nRNA-lisäys estyi täysin rotan hippokampuksessa (kuvio 20). Diatsepaamin BDNF- ja NGF-iuRNA-lisäyksen estävä vaikutus johtuu todennäköisimmin neuronaalisen aktiivisuuden tukahtumisesta inhibitorisen GABAergisen systeemin 5 kautta. Kuitenkin 90 minuuttia kainiinihappolisäyksen jälkeen (eli noin 30 minuuttia kouristuksen alkamisesta) BDNF-ja NGF-mRNA-lisäystä ei enää voitu estää diatsepaamilla.

« Tämä osoitti, että suhteellisen lyhyt lisääntyneen aktiivisuuden jakso saattaa olla riittävä saattamaan alkuun tapah-10 tumajakso, jonka seurauksena näiden kahden neurotofisen tekijän mRNA-ekspressio lisääntyy.

Tätä keksintöä koskevat tutkimukset osoittivat, että ei-NMDA-reseptorit saattavat osallistua BDNF- ja NGF-mRNA-sää-15 telyyn hippokampuksessa, ja näin ollen erottavat tämän säätelymekanismin aiemmin Cole et ai.:in kuvaamasta (Cole et ai., 1989, Nature 340:474), jossa pääteltiin, että hippo-kampuksen varhaisgeenejä koodaavien mRNA:iden säätely näytti tapahtuvan NMDA-alityypin glutamaattireseptorien väli-20 tyksellä. On raportoitu, että muutamat kainiinihapon vaikutukset neuroneihin saattavat olla quisqualate-tyyppisten glutamaattireseptorien välittämiä (Monaghan et ai., 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365).

25 Yhteenvetona voidaan sanoa, että tutkimuksemme osoitti neu-ronaalisen aktiivisuuden säätelevän neurotrofisiä tekijöitä • · BDNF ja NGF koodaavien mRNA:iden määriä rotan hippokampuk-sessa ja korteksissa. Kaikista testatuista aineista kai- • « « niinihappo, joka vaikuttaa ei-NMDA-glutamaattireseptorien 30 välityksellä, lisäsi BDNF- ja NGF-mRNA:itä sekä in vivo , ... että hippokampuksen neuronien viljelmissä. Sen sijaan pe- • · · \ rifeerisen hermoston osalta ei ole todistettavasti havaittu hermottavien (NGF-responsiivisten) neuronien vapauttamien konventionaalisten välittäjäaineiden tai neuropeptidien 35 säätelemää NGF-synteesiä ei-neuronaalisissa soluissa (Barth . et ai., 1984, J. Cell. Biol. 99:839, Hellweg et ai., 1988, 105342 116

Exp. Cell. Res. 179:18). BDNF ilmentyy vallitsevana keskushermostossa, ja ilmenee ainakin osittaista päällekkäisyyttä keskeisissä kulkuväylissä, joissa neurotransmitteri-nä on glutamaatti, ja alueilla, joiden on osoitettu sisäl-5 tävän suhteellisen paljon BDNF- ja NGF-mRNA:ta (Hofer et ai., EMBO J., painossa, Monaghan et ai., 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365). Aivan erityisen huomattavia yhtäläisyyksiä on havaittavissa NGF-mRNA:n jakautumisessa, osoitettuna in situ-hybridisaatiolla (Hofer et ai., EMBO 10 J., painossa), ja kainiinihapporeseptoreilla visualisoituna autoradiografiamenetelmin hippokampuksessa, aivokuoressa ja pikkuaivoissa (Monaghan et ai., 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365). Havainnot ovat yhtäpitäviä sen päätelmän kanssa, että glutamaatti toimii fysiologisena välittäjänä, 15 joka säätelee BDNF- ja NGF-mRNA:ta keskushermostossa.

16. Esimerkki: Aivoperäinen neurotrofinen tekijä edistää viljelmissä rotan septaalisten kolinercisten neuronien elävänä pysymistä ia niiden differentioitunutta solutoimintaa 16.1. Materiaalit ja menetelmät 5 16.1.1 Erillisten solujen valmistus ja soluviljelyolosuh- teet

Alkionkehitykseltään 17 päivää vanhojen rottien (Sprague-’·*” Dawley) septaalialue dissekoitiin ympäröivästä kudoksesta.

:/·· 10 Kudosfragmentit yhdistettiin, pestiin kolmeen kertaan *:··: (Ham's F-10), siirrettiin sitten 35 mm:n kudosviljelymal- :T: joihin ja hienonnettiin. Valmistettiin yksi ainoa solusus- pensio inkuboimalla kudosta 0,25-prosenttisen trypsiinin kanssa 20 minuuttia 37 *C:ssa. Trypsiini inaktivoitiin « · 15 inkuboimalla 5 minuuttia huoneen lämmössä elatusaineessa • · * (infra), joka sisälsi 50 ug/ml deoksiribonukleaasia tyyppiä ·.:.· 1 (Sigma), ja solut eroteltiin saattamalla fragmentit no- peasti läpi kavennetun pasteur-pipetin. Eroteltuja soluja « sentrifugoitiin, 500 x g, 45 sekuntia. Supernatantti pois- /,.,:20 tettiin, sentrifugoitiin uudestaan. Löyhät solupallukat • · 105342 117 uudelleensuspendoitiin, yhdistettiin elatusaineeseen ja solusaanto määritettiin hemosytometrin avulla. Lopuksi solut levitettiin 6 mm:n kuoppiin, jotka oli päällystetty polyornitiinilla (10 Mg/ml) ja laminiinilla (10 Mg/ml).

5 Solujen elinkelpoisuus tarkistettiin 24 viljelytunnin jälkeen solujen kyvystä estää trypaanisineä.

<r

Normaalin neuroneille ja gliasoluille tarkoitetun elatusai-neen 5HS/N3 koostumus oli: 5% (til/til) hevosen seerumia 10 (Gibco), 1 % N3-additiivejä (vol/vol) (Romijn et ai., 1982, Dev. Brain Res. 2:583-589), 0,5 % (til/til) glutamiinia (200 mM, Gibco) ja 0,25 % (til/til) ja penisilliini-streptomysiiniä (10000 yksikköä/ml, 10000 mcg/ml, Gibco) Dulbec-con muunnellussa elatusaineessa (Dulbecco's modified Eag-15 le's medium, DMEM). Neuronirikastettuja viljelmiä valmistettiin korvaamalla väliaine 5-6 tuntia levittämisen jälkeen DMEM:i11ä, joka sisälsi 1 % N3-additiivejä, 0,5 % glutamiinia sekä 0,25 % penisilliiniä ja streptomysiiniä. Molemmissa tapauksissa käytettiin sytosiiniarabinosiinikä-20 sittelyä (1 μΜ, 24 tuntia) rajoittamaan gliasolujen proli-feraatiota.

16.1.2. Koliiniasetyltransferaasiaktivisuuskoe 25 Väliaine poistettiin viljelmistä huuhtomalla soluja kahdes- :\j ti 100 μ1:11& PBS. Solut lysoitiin käyttämällä yhtä jäädy- ....: tys/sulatussykliä ja 15 minuutin inkubointia 37 1C:ssa, 50 .·♦·. mM KHjP04 pH 6,7, joka sisälsi 200 mM NaCl ja 0,25 % (til/ • · · til) Triton X-100. Otettiin kaksi mikrolitraa solulysaat-. 30 tia ja suoritettiin CAT-aktiivisuuskoe mikrofonnum-menetel-mää käyttäen (Fonnum, F, 1975, J. Neurochem. 24:407-409).

• · · *1 Lopullisessa substraattikoostuksessa oli 0,2 mM [l4C] Ace- : tyl-CoA (NEN, 54,4 mCi/mmol), 300 mM NaCl, 8 mM koliinibro- II·

midia, 20 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa ja 0,1 mM

4·· 35 neostigmiiniä 50 mM NaH2P04 (pH 7,4) puskuriaineessa.

• I · f I · · 105342 118 Näillä entsyymi- ja substraattipitoisuuksilla ensymaattinen reaktio oli lineaarinen 90-120 minuuttia. Koliiniasetyl-transferaasi-induktiospesifisyyttä tutkittiin lisäämällä spesifistä CAT-aktiivisuuden inhibiittoria, N-hydroksietyy-5 li-4-(l-naftyylivinyyli)pyridiumia (HNP) määrityksen aikana (White, H.L. and Cavallito, C.J., 1970, J. Neurochem. 17: 1579-1589).

6.1.3. Asetylkolinesteraasi (AChE-) aktiivisuuden määrit-10 täminen

Lysaateissa läsnä olevan AChE:n määrä mitattiin käyttäen menetelmiä, joita ovat kuvanneet Potter (Potter, L.T., 1967, J. Pharmacology and Experimental Therapeutics 156: 15 500-506) sekä Johnson ja Russell (Johnson, C.D., and Rus sell, R.L., 1975, Anal. Biochem. 64:229-238), samoin kuin niiden muunnelmia. Lysaatit, jotka oli valmistettu käyttämällä 200 mM NaCl ja 0,25-prosenttista (til/til) Triton X-100 sisältävää 50 roM:n KH2P04 puskuria, pH 6,7, yhdistet-20 tiin [3H]-asetylkoliinijodiin (NEN, NET-113, 73,3 mCi/mmol) ja etopropatsiinia (0,1 mM) 50 mM:ssa KH2P04 puskuria, pH 7,0. Viidentoista minuutin inkuboinnin jälkeen, 37 *C, ·. reaktio lopetettiin lisäämällä 100 μΐ pysäytyspuskuriliuosta, joka sisälsi: 1 M kloorietikkahappoa, 0,5 M NaOH ja . .25 2,0 M NaCl. Spesifinen AChE-aktiivisuus määritettiin kun « · · läsnä oli 1,0 (10"e) M neostigmiiniä.

• · • · * ·.· * 16.1.4. Af f initeettiherkän koliinin oton mittaaminen ·:··:30 Koliiniottoa af f initeettiherkän, Na*-riippuvaisen mekanis-:T: min avulla tutkittiin olennaisesti Vacan ja Pilarin mene telmän mukaan (Vaca, K. and Pilar, G., 1979, J. Gen. Phy-siol. 73:605-628). Solut pestiin kerran 100 ^l:lla Ham's F-10 ja huuhdottiin 100 μ1:1ΐ3 tyrodesliuosta. 25 mM ka-:35 liumia sisältävällä tyrodesliuoksella suoritetun 10 minuu-·:··: tin depolarisoinnin jälkeen soluja inkuboitiin 20 minuuttia 105342 119 huoneen lämmössä [3H]-koliinin (NEN, NET-109, 0,11 μΜ, 86,7 Ci/mmol) kanssa normaalissa Na1 tai Li1 sisältävässä tyro-desliuoksessa. Ottoreaktio pysäytettiin huuhtomalla soluja kahdesti PBS:llä. Akkumuloitunutta koliinia ekstrahoitiin 5 viljelmistä vähintään 20 minuutin ajan 100 μ1:11& kylmää asetonia, joka sisälsi l N muurahaishappoa. Liukoinen jae otettiin ja laskettiin. Spesifinen koliiniotto on ero ko- «r konaiskoliinioton ja Na1-riippumattoman koliinioton välillä.

10 16.1.5. Asetylkolinesteraasin histokemiallinen värjääminen

Kolinergiset solut tunnistettiin histokemiallisella asetyl-kolinesteraasivärjäyksellä, Geneser-Jensenin ja Blacks-15 tadtin menetelmää (1971), Z. Zellforsch. 114:460-481). Kun viljelmät oli fiksoitu 4-prosenttiseen paraformaldehydiin, soluja inkuboitiin AChE:n läsnäollessa 5-6 päivää seuraavanlaisessa substraattiliuoksessa: 4 mM asetyylitioko-liinijodia, 2 mM kuparisulfaattia, 10 mM glysiiniä ja 10 20 Mg/ml gelatiinia 50 mM:ssa asetaattipuskuria pH 5,0. Reaktiotuotteen visualisointi toteutettiin edellä kuvattuun tapaan (Hartikka, J. and Hefti, F., 1988, J. Neurosci. 8: 2967-2985).

'”.25 16.1.6. NGF-reseptorien immunohistokemiallinen värjäys • · • · • ♦ · ’♦ 1’· Viljelmät pestiin DMEM-illä kahdesti ja fiksoitiin 4-pro- « · 1 senttisellä paraformaldehydillä. Soluja käsiteltiin 3-4 • · m * tuntia natriumfosfaattipuskurilla pH 7,4, joka sisälsi 5 % 30 naudan seerumialbumiinia, 0,02 % triton X-100 ja 5 % suk-·:·1: roosia (Hartikka, J. and Hefti, F., 1988, J. Neurosci. 8: ·1·’? 2967-2985). NGF-R havaittiin käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta 192-IgG (Taniuchi, M. and Johnson, E., 1985, J. Cell. Biol., 101:1100-1106, Chandler et ai., 1984, J.

^35 Biol. Chem. 259:6882-6889) 1:1000 laimennoksena 5 % hevosen seerumia sisältävässä puskurissa. Viljelmiä inkuboitiin 105342 120 laimennetussa vasta-aineessa 15-18 tuntia 4 *C:ssa. Sitoutunut hiiren immunoglobuliini havaittiin käytämällä bio-tinyloitua hevosen anti-hiiri-IgG:tä (1:200 vektori). Im-munoreaktiiviset solut tunnistettiin käyttämällä 3',3'-dia-5 minobentsidiiniä substraattina sidotulle peroksidaasient-syymille.

16.1.7. BDNF:n ja NGF:n puhdistaminen 10 BDNFrn puhdistaminen sian aivosta ja NGF:n puhdistaminen täysikasvuisen hiiren leuanalussylkirauhasesta toteutettiin aiempien julkaisujen menetelmien mukaisesti (Barde et ai., 1982, EMBO J., 1:549-553, Lindsay et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319-328). Yhdistelmä-DNA, jota käytettiin osana näissä 15 tutkimuksissa, on aiemmin karakterisoitu (Maisonpierre et ai., 1990, Science, 247:1446-141).

16.2. Tulokset 20 Septaalisoluilla tehdyissä viljelmissä saatiin aikaan huomattavaa neuriittien kasvua polyoriniitini/laminiinipääl-lysteisissä kuopissa, monissa soluissa luonteenomainen neu-ronaalinen faasikirkas sooma 24 tunnissa (kuviot 21 A ja 21

IMI

,··. B). Jatkettu neuriittien kasvu johti progressiivisesti • · 25 lisääntyvään solu-solu-kontaktiin 2. - 4. in vitro-päivänä • · . . (vrt kuviot 21 c ja D sekä E ja F). Vielä neljän päivän I I | \ jälkeen viljelmissä oli hyvin vähän ei-neuronaalisia solu-ja, joka voidaan huomata litistyneiden faasitummien solujen « · · ·.· * puuttumisesta. BDNF:n vaikutusten arvioimiseen septaalis-30 ten kolinergisten neuronien elossapysymistä viljelmissä t käytettiin histokemiallista AChE-värjäystä ja NGF-resepto-reille immunohistokemiallista värjäystä. Morfologialtaan tyypillisiä AChE-positiivisia neuroneja nähdään kuviossa 21 G ja H. Useampia NGF-reseptoripositiivisia neuroneja näh-35 dään kuviossa 21 I.

« · 105342 121 BDNF sai aikaan 2,4-kertaisen lisäyksen AChE-positiivisissa soluissa matalatiheyksisissä viljelmissä (solutiheys 66700 - 133300 solua/cm2) rotan alkion septaalisoluilla, kuten nähdään kuviossa 22 A. Samalla solutiheydellä NGF:n 5 vaikutus oli hieman pienempi (1,9-kertainen). Havainto, että sekä BDNF että NGF voivat lisätä AChE-positiivisten neuronien määrää septaaliviljelmissä sai meidät tutkimaan, olisiko näiden kahden tekijän vaikutuskohde sama vai eri neuronaalinen soluryhmä. Kuten kuvion 22 A kolmannesta 10 pylväsryhmästä tulee esiin, samanaikainen BDNF:n ja NGF:n saturaatiomäärien käyttö ei lisää AChE-positiivisten neuronien lukumäärää enempää kuin käytettäessä jompaa kumpaa tekijää yksin. Hermosolujen elossa pysymisen kannalta tulokset viittaavat siihen, että rotan septaaliviljelmien 15 kolinergisten neuronien, jotka reagoivat BDNF:ään tai NGF:ään, täytyy olla läheisiä limittäisiä soluryhmiä.

BDNF:n vaikutus AChE-positiivisten neuronien elävänä pysymiseen riippui solujen kasvatustiheydestä (kuvio 22 A).

20 Tiheyden ollessa suuri (200000-260000 solua/cm2) BDNF ei yksin eikä yhdessä NGF:n kanssa lisännyt AChE:tä ilmentävien neuronien lukumäärää. Tämä saattaa johtua lisääntynees- « * » ;·; tä endogeenisestä neurotrofisesta aktiivisuudesta tai, vaihtoehtoisesti, suuremmista solutiheyksistä johtuvien « 25 lisääntyneiden solu-solukosketuksien aiheuttamasta elävänä • · ·.*·: pysymistä edistävästä vaikutuksesta.

• ·

Pienillä solutiheyksillä AChE-positiivisten solujen luku- 9 määrä lisääntyi BDNF-pitoisuuden funktiona, maksimaalinen ....:30 vaste annoksen ollessa 10 mg/ml; se lisäsi AChE-positiivis- · .·;·. ten solujen määrää/kuoppa kontrolliarvoista 169,2 ± 12,9 • » # i arvoihin 388,0 ± 26,2 (2,5-kertainen lisääntyminen) käsi-tellyissä viljelmissä. Vertailun vuoksi mainittakoon, että maksimaalinen NGF-vaste oli havaittavissa määrän ollessa 50 .•:\35 ng/ml, AChE-positiivisten solujen lisääntymisarvot olivat 121,0 ± 7,6 - 231,7 ± 12,9 (1,9-kertainen lisäys). Vaste-

• I

105342 122 käyrän tasannevaihe näytti olevan stabiili sekä BDNFrllä että NGF:llä, AChE-positiivisten hermosolujen määrä ei vähentynyt annosten ollessa jopa 100 ng/ml.

5 On ilmeistä, että matalatiheyksisissä viljelmissä sekä BDNF että NGF pystyvät lisäämään AChE-histokemiallisesti havaittavissa olevien solujen lukumäärää. On mahdollista, että tämä lisääntyminen johtuu viljelmässä kasvutekijän puutteessa kuolevien kolinergisten solujen pelastumisesta, pre-10 kursorisolujen täydennyksestä tai kolinergisen merkkiaineen AChE vaikutuksesta. Näiden mahdollisuuksien erottamiseksi toisistaan suoritettiin viivästetyn annon kokeita (kuvio 23) sarjassa viljelmiä, joita ylläpidettiin kaikkiaan 12 päivää. Yhtä viljelyerää, jota käsiteltiin 5-6 tuntia 15 alustalle levittämisen jälkeen, pidettiin BDNF:n tai NGF:n kanssa koko 12 päivän ajan. Toista viljelyerää pidettiin ilman kasvutekijöitä 5 päivää ja käsiteltiin sitten BDNF:llä tai NGF:llä viimeiset 7 päivää (-5/+7). Kun näitä kahta viljelyerää vertailtiin, solujen vaste BDNF:ään tai 20 NGF:ään viiden päivän jälkeen oli suurin piirtein sama kuin oli havaittavissa molempien kasvutekijoitten jatkuvasti läsnäollessa kasvatetuilla soluilla (vrt. yksiväriset ja ··· viivoitetu pylväät kuviossa 23). Tulos oli kuitenkin hät-• · · · ;***; kähdyttävän erilainen kolmannessa viljelykoe-erässä, joissa • · · ...25 BDNF:ää tai NGF:ää oli läsnä vain viimeisinä 5 päivänä (- : 7/+5). Näissä olosuhteissa ei BDNF sen enempää kuin NGF: « · kään pystynyt lisäämään AChE-positiivisten solujen lukumää- • · ... rää. Toisissa kokeissa on tuotu esiin, että septaalisolu-* · · jen altistaminen NGF:lie tai BDNF:lie niinkin lyhyeksi ai- 30 kaa kuin 3-4 päiväksi riittää lisäämään huomattavasti AChE- ' ’ entsyymiaktiivisuutta ja näin edistämään solujen havaitse-• · · · mistä AChE-värjäyksen avulla. Näin ollen se, ettei AChE-. positiivisten neuronien määrän lisääntymistä ilmennyt "-7/+5,,-viljelmissä, ei johtunut mahdollisuudesta, että al-35 tistusaika kasvutekijälle olisi ollut riittämätön AChE-po- • i * ’·' ' sitiivisten solujen indusoimiseen.

105342 123

On osoitettu sekä in vivo (Montero, C. and Hefti, F., 1988, J. Neurosci 8:2986-2999, Higgins et al., 1989, Neuron. 3:247-256) että in vitro, että NGF voi säädellä oman reseptorinsa määriä mitattuna sekä mRNA- että proteiinimääristä.

5 Koska BDNF:n havaittiin vaikuttavan NGF:n tavoin koliner-gisten fenotyyppien indusoinnissa ja solujen elävänä pitämisessä septaaliviljelmissä, mahdollisuus, että BDNF voi » säädellä NGF-reseptoripitoisuuksia, kvantifioituna IgG-192-immunopositiivisten solujen lukumääränä, testattiin. Pi-10 toisuudella 10 ng/ml BDNF sai aikaan 3-kertaisen lisäyksen NGF- reseptori-immunopositiivisten solujen lukumäärässä, kuten osoittaa kuvio 24. Mielenkiintoista kyllä suuremmilla pitoisuuksilla (25-100 ng/ml) BDNF:n vaikutus oli progressiivisesti vähemmän merkittävä. Annosvaste oli siis 15 selvästi erilainen verrattuna havaittuihin BDNF:n vaikutuksiin viljelmien muihin parametreihin, esimerkiksi AChE-po-sitiivisten solujen lukumäärään. Positiivisena kontrollina soluja käsiteltiin NGF:llä, pitoisuus 50 ng/ml, joka sekin lisäsi positiivisten solujen lukumäärän 3-kertaiseksi.

20 IgG-192-väräjäyksessä BDNF:llä on siis suurin piirtein samanlainen vaikutus kuin NGF:llä NGF-reseptorien ekspression . säätelyssä.

• · · •

• · · I

* ia i a '··' Solujen elävänä pysymisen lisäksi tutkittiin, edistäisikö * * 25 BDNF kolinergisen fenotyypin piirteitä. Lineaarinen CAT- * « aktiviteetin lisääntymistä oli havaittavissa septaalivil- 9 ’5‘,; jelmissä, jotka kasvatettiin 50 ng/ml asti lisääntyvien : BDNF-määrien läsnäollessa, vasteen kyllästymisaste 1,8 - kertainen kontrolliarvoihin verrattuna (kuvio 25). CAT-....:30 aktiivisuuden indusointi NGF-käsitellyissä rinnakkaisvil-jelmissä saavutti tasanteen pitoisuuden ollessa 25 ng/ml, se on 3,4-kertainen lisäys kontrolliarvohin verrattuna. Ei

« · I

BDNF- eikä NGF-vasteessa ollut huomattavissa vähentymistä

Ml pitoisuuksien ollessa kolminkertaiset verrattuna arvoon, % j"|";35 joka sai aikaan kyllästysvasteen. Ei BDNF- eikä NGF-in- dusoitu CAT-aktiivisuus vaikuttanut [N-hydroksietyyli-4-(l- » · 105342 124 naftyylivinyyli)pyridium] HNP-riippumattomaan transfe-raasiaktiivisuuteen.

Kun oli havaittu, että sekä BDNF että NGF saivat aikaan 5 CAT-aktiivisuutta septaaliviljelmissä, tutkittiin vastetta molemmilla tekijöillä samaan aikaan erikseen suoritettuihin käsittelyihin (taulukko Vili). Näissä kokeissa käytettiin kahta BDNF-pitoisuutta, 5 ja 25 ng/ml, jotka lisäsivät CAT-aktiivisuutta 1,4 ja 2,6-kertaisiksi. Kun NGF:ää (50 10 ng/ml), joka yksin lisäsi entsyymiaktiivisuutta 2,8-kertai-seksi, yhdistettiin BDNF:ään, CAT-aktiivisuuden tasossa näkyi vähintään additiivinen vaikutus (taulukko VIII). Käytetyillä BDNF-pitoisuuksilla NGFrän suhteen puhtaasti additiivinen vaikutus olisi johtanut 4,2 - 5,4 -kertaisiin 15 arvoihin kontrolliarvoihin verrattuna. Havaitut arvot olivat itse asiassa hieman additiivista määrää suuremmat.

TAULUKKO VIII

20 BDNF:n ja NGF:n samanaikaisen annon vaikutus CAT-aktiivisuuteen • · * ··* • « • « • ·

• I

....25 CAT-aktiivisuus

Pitoisuus (ng/ml) (pmol/h/kuoppa) Verrokki-% • · ·

• II

Verrokki 561,3 ± 34,8 ---- NGF (50) 1546,3 ± 89,7 280 .*:^0 BDNF (5) 768,0 ± 25,4 140 BDNF (25) 1470,1 ± 66,2 260 NGF(50) + BDNF(5) 2767,6 ± 177,2 490 ..... NGF(50) + BDNF(25) 3742,0 ± 669,3 670 • · r

Septaalisoluja kasvatettiin 12 päivän ajan 5HS/N3:ssa osoitettujen trofisten tekijöiden pitoisuuksien läsnäollessa.

40 CAT-aktiivisuus määritettiin kuvattuun tapaan. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM 4-5 määrityksestä.

105342 125

Mahdollisuus, että BDNF-käsittelyn biologinen vaste johtuisi BDNF-riippuvaisesta endogeenisen NGF:n vapautumisesta, tutkittiin. Tähän käytettiin monoklonaalista vasta-ainetta NGF:lie (vasta-aine 27/21, Korsching and Thoenen, 5 1983) estämään kaikki NGF:ään liittyvä vaste. Kuten taulu kosta IX ilmenee, NGF:n vaikutus CAT-aktiivisuuteen väheni huomattavasti anti-NGF:ää käytettäessä, kun taas BDNF-in-dusoidussa vasteessa ei ilmennyt mitään vaikutuksia. Huomattakoon kuitenkin, että CAT-aktiivisuuden perustaso vähe-10 ni noin 20 % viljelmissä, joita käsiteltiin pelkällä anti-NGF:llä, verrattuna käsittelemättömiin verrokkeihin. Sep-taaliviljelmissä havaittu BDNF:n aikaansaama CAT-aktiivi-suuden lisääntyminen näyttää silti olevan tulosta suorasta vaikutuksesta, eikä endogeenisen NGF:n lisääntymisen väli-15 tyksellä ilmenevä.

TAULUKKO IX

20 Anti-NGF:n vaikutus NGF:n ja BDNF:n kykyyn indusoida CAT-entsyymiaktiivisuutta I I ' CAT-aktiivisuus 25 Pitoisuus (ng/ml) (pmol/h/kuoppa) Verrokki-% . Verrokki 517,5 ± 33,2 ---- V·: BDNF (25) 1021,6 ± 106,1 197 ....Ϊ NGF (50) 1139,0 ± 99,1 220 *,,130 Verrokki + anti-NGF 418,7 ± 27,0 81 li: BDNF + anti-NGF 819,2 ±68,8 158 NGF + anti-NGF 551,0 ± 27,0 107 · 35 ··« • · · w · · · • ·, Kun septaalisoluja oli kasvatettu 12 päivän ajan 5HS/N3:ssa osoitettujen trofisten tekijöiden pitoisuuksien läsnäolles-sa (levitystiheys 2,3 (105) solua/cm2’, ne korjattiin tal-40 teen. CAT-aktiivisuus määritettiin tapaan, jota on kuvattu koeolosuhteita käsittelevässä osassa. Arvot ovat keskiar-V ' voja ± SEM 6 määrityksestä.

105342 126

Tutkittiin myös mahdollisuus, että AChE-aktiivisuus määräytyy yhdessä BDNF:n tai NGF:n indusoiman CAT-aktiivisuuden kanssa (kuvio 26). Päinvastoin kuin CAT-aktiivisuus, AC-hE:n annosvaste BDNF:ään tai NGF:ään näytti olevan melko 5 samanlainen siinä, että entsyymiaktiivisuus lisääntyi lineaarisesti pitoisuuteen 50 ng/ml asti. Tällä pitoisuudella NGF ja BDNF lisäsivät AChE-aktiivisuutta 274 % ja 234 % verrattuna käsittelemättömiin kontrolliarvoihin.

10 BDNF:n tai NGF:n aikaansaamaa CAT-aktiivisuuden lisääntymistä ajan suhteen tutkittiin (kuvio 27). CAT-aktiivisuus lisääntyi 50 ng/ml:n BDNF-määrällä käsitellyissä viljelmissä 170 % kontrolliarvoihin verrattuna kolmessa päivässä. Lisääntyminen jatkui 6. päivään asti, jolloin se tasaantui 15 verrokkeihin nähden 2,5-kertaiseen arvoon koko koeajan loppua jaksi. CAT-vaste NGF:n (50 ng/ml) lisäämiseen oli puolestaan nopeampi, indusoitu arvo kohosi 2,5 kertaiseksi 3. päivänä. CAT-aktiivisuus lisääntyi lineaarisesti jatkuvasti ja saavutti 3,2-kertaisen arvon verrokkeihin nähden 12 20 päivässä.

Tietyn ajan viljeltyjen astrosyyttien on osoitettu synte-toivan monenlaisia neurotrofisiä aktiivisuuksia NGF:n lisäksi (Lindsay, R. M., 1979, Nature, 282:80-82, Lindsay et *. *: 25 ai., 1982, Brain Res. 243:329-343, Alderson et ai., 1989,

Dev. Brain Res. 48:229-241). Vaikka olemme sulkeneet pois • · · : mahdollisuuden, että BDNF:stä tekemämme havainnot olisivat välittyneet lisääntyneiden NGF-määrien vuoksi, on mahdol- ·;··· lista, että BDNF voi vaikuttaa epäsuorasti muuntelemalla 30 muiden neurotrofisten tekijöiden ekspressiota, erityisesti \ gliasoluissa. Tutkiaksemme mahdollisuutta, että ei-neu- • · · ·:·’ Tonaaliset solut vaikuttaisivat BDNF:n aikaansaamaan CAT-• · · • · aktiivisuuteen septaaliviljelmissä, vertailimme kolinergis-ten neuronien BDNF-vastetta sekoitetuissa glia/hermosolu-35 viljelmissä ja neuronirikastetuissa viljelmissä (kuvio 28) . Neuronirikastetuissa viljelmissä CAT-aktiivisuuden BDNF- 105342 127 vaste muodosti kellon muotoisen käyrän, maksimaalinen lisäys saavutettiin annostuksen ollessa 5 ng/ml BDNF:ää, ja pitoisuuden ollessa 25 ng/ml oli havaittavissa huomattava lasku entsymaattisessa aktiivisuudessa (p>0,001, vertailta-5 essa 15-25 ng/ml BDNFrää). Kuten kuviossa 25 näkyvissä tuloksissa, CAT-vaste BDNF:ään konfluentin hermoston tuki-kudoksen kerroksen läsnäollessa oli lineaarinen, tässä ta-pauksessa arvoon 25 ng/ml BDNFrää, joka oli suurin testattu annos. Ei-neuronaalisten solujen läsnäollessa tarvittiin 10 suurempia BDNF-määriä aikaansaamaan vastaava lisäys CAT-aktiivisuudessa verrattuna samanlailla käsitelyihin neu-ronirikastettuihin viljelmiin. BDNF:n kyky maksimaaliseen CAT-aktiivisuuden stimulointiin septaalisissa kolinergisis-sä hermosoluissa oli kuitenkin olennaisesti sama sekä glia-15 solujen läsnäollessa että ilman niitä.

CAT- ja AChE-aktiivisuuksien perusteella näyttää ilmeiseltä, että BDNF voi vaikuttaa NGF:n tavoin ja tehostaa kolin-ergisiä fenotyyppimerkkiaineita. Tämän edelleen tutkimi-20 seksi BDNF:n vaikutusta Na*-riippuvaiseen affiniteettiher-kän koliinin ottoon verrattiin NGF:n vaikutukseen (kuvio [··'' 29). Solut, joita kasvatettiin 12 päivää 50 ng/ml BDNF- • · määrän läsnäollessa lisäsivät koliiniottoa 3,8-kertaiseksi , käsittelemättömiin verrokkeihin nähden. Rinnakkasiviljel- • · * ‘j 25 missä NGF (25 ng/ml) sai aikaan 2,3-kertaisen lisäyksen * * koliinin akkumuloitumisessa.

9 · · • ·

I · I

16.3. Pohdintaa • · 30 Verrattuna julki tuotuihin vaikutuksiin perfeerisissä her-mosoluissa (Barde et ai., 1982, EMBO J. 1:549-553, Lindsay 9 9 9 · et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319-328, Davies et ai., 1986, • · *·;’ J. Neurosci 6:1897-1094, Hofer, M. and Barde, Y., 1988, :T: Nature 331:261-262), BDNF:n neuronaalinen spesifiteetti ;·· 35 keskushermostossa on vähemmän tunnettu. Nykyisin ainoat tunnetut CNS-neuronit ovat pieni aliryhmä Thy-l-positiivi- 105342 128 siä retinaaligangliosoluja, jotka ensimmäisen kerran tunnistettiin E17-rotan verkkokalvoviljelraistä (Johnson et ai., 1986, J. Neurosci. 6:3031-3038). Toisissa tutkimuksissa on tuotu esiin myös BDNF:n vaikutuksia täysikasvuis-5 ten retinaaligangliosoluihin (eksplantti)kudosviljelmissä (Thanos et ai., 1989, Eur. J. Neuro. 1:19-26). Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että BDNF edistää viljeltyjen rotan alkion septumin kolinergisten neuronien elossa ' pysymistä, (histokemiallinen AChE-värjäys) ja lisää eks-10 pressiota erilaisissa kolinergisissä fenotyyppimerkkiai-neissa (AChE- ja CAT-entsyymiaktiivisuus ja affiniteetti-herkän koliinin otto). BDNF:n havaittiin lisäksi lisäävän NGF-reseptoriekspressiota septaaliviljelmissä.

15 Lähtökokeissa havaitsimme, että BDNF lisäsi AChE-positii-visten neuronien määrän E17-septaaliviljelmissä noin kaksinkertaiseksi. Kuten NGF:lläkin (Hartikka, J. and Hefti, F., 1988, J. Neurosci. 8:2967-2985), tämä vaikutus oli selvin solutiheyden ollessa vähäinen. Mielenkiintoista on, 20 että NGF:n ja BDNF:n lisääminen samanaikaisesti ei lisännyt '·· AChE-positiivisten solujen määrää enempää kuin jomman kumman kasvutekijän yksin läsnäollessa. Tämä havainto viittaa vahvasti siihen, että BDNF ja NGF vaikuttavat pitkälti samoihin septaalisten kolinergisten hermosolujen ryhmiin.

25 * · ... Kuten alunperin raportoitiin NGF:stä (Hefti et ai., 1985, »Il

Neuroscience 1:55-68), BDNF ei edistänyt kolinergisten neuronien elossapysymistä viljelmissä, joissa solutiheys oli ’ * suhteellisen suuri. Alustalle levitetyissä soluissa ko- · · · ^ V : 30 linergisten hermosolujen elävänä pysyminen oli parempi so- . lutiheyden ollessa suuri, silloinkin kun läsnä ei ollut • · · .···, ainuttakaan neurotrofista tekijää. Tähän on monta mahdol- • · [·" lista selitystä, mm. lisääntynyt solu/solukontakti, suurem- ’· ' man ei-neuronaalisten solujen määrän edullinen vaikutus tai 35 enemmän kuin suhteellinen lisäys endogeenisessa neurotrofi-sessa aktiivisuudessa. Mitä tulee viimeiseksi mainittuun 105342 129 mahdollisuuteen, emme havainneet merkkejä olennaisesti lisääntyneistä endogeenisen NGF:n määristä, sillä anti-NGF-ylimäärän antaminen käsittelemättömään solutiheydeltään suureen viljelmään vähensi CAT-perusaktiivisuutta vain 20 5 %. Samanlaisissa viljelmissä eksogeeninen NGF sai aikaan jopa 3,4-kertaisen lisääntymisen CAT-aktiivisuudessa.

*

Kuten sekä proteiinien että mRNA:n kohdalla on havaittu, nykyään on paljon julkaistuja tutkimustuloksia, joista il-10 menee, että NGF voi säädellä oman reseptorinsa ekspressiota sekä viljellyissä hermosoluissa että in vivo. Tässä tutkimuksessa käytimme NGF-reseptorin havaitsemiseen monoklonaa-lista vasta-ainetta IgG-192. Tämä monoklonaalinen aine on karakterisoitu sekä rotan sensorisista neuroneista että 15 rotan aivoista (Taniuchi, M. and Johnson, E. 1985, J. Cell Biol. 101:1100-1106). Sen lisäksi, että voimme vahvistaa Hartikan ja Heftin tutkimustulokset NGF:n kyvystä säädellä reseptoriensa määrää septaalisissa viljelmissä, mikä näkyy IgG-192-immunopositiivisten hermosolujen lukumäärän lisään-20 tymisenä, olemme havainneet, että BDNF lisää IgG-192-im-munopositiivisten solujen lukumäärän jopa kolminkertaisek-si. BDNF-vaste oli kaksivaiheinen: suuret pitoisuudet, 25-100 ng/ml, eivät saaneet aikaan niin suurta lisäystä posi-.·. : tiivisten solujen lukumäärässä kuin pitoisuus 10 ng/ml.

I « I

'["I 25 Oli mielenkiintoista, että tämän tyyppinen annosvaste oli • » ... aivan erilainen kuin mitä nähtiin BDNF-indusoidun AChE-po- • · · ' ’ sitiivisten neuronien määrän kohdalla. Jälkimmäisessä BDNF:n maksimaalinen vaikutus ei vähentynyt suurissa pi- . ’ * toisuusmäärissä. Huomattakoon, että ei-affiniteettiherkän • · ♦ V · 30 NGF-reseptorin on äskettäin havaittu sitovan BDNF:ää samal- ...·. la affiniteetilla, mikä viittaa siihen, että ei-affiniteet- • · · • · · .···. tiherkät NGF- ja BDNF-reseptorit saattavat olla identtisiä (Rodriguez-Tebar et ai., 1990, Binding of Brain-Derived *.* * Neurotrophic Factor to the Nerve Growth Factor Receptor, 35 Neuron. 4, 487-492).

105342 130

Mahdolliset samanlaisuudet BDNF:n ja NGF:n vaikutusmekanismissa ilmenivät havainnoista, että BDNF vaikutti yhtä voimakkaasti kuin NGF AChE-aktiivisuuden aikaansaamisessa.

Vaikka BDNF:n havaittiin edistävän myös kolinergisten neu-5 ronien elävänä pysymistä samassa määrin kuin NGF, BDNF:n vaikutus CAT-entsyymiaktiivisuuteen ei ollut yhtä suuri kuin NGF:llä. Useissa kokeissa maksimaalinen CAT-induktio BDNF:ää käytettäessä oli vain 1,8 - 2,6-kertainen, kun NGF:llä arvot olivat yleisesti yli 3-kertaiset. Vaikka 10 siis BDNF:n ja NGF:n vaikutusmekanismeilla on tiettyjä yhtäläisyyksiä, on todennäköistä, että niiden reseptorien ekspressiossa ja säätelyssä ja näiden reseptorien yhdistämisessä toiseen CAT-aktiivisuuden aikaansaamisen kannalta tarpeelliseen viestinviejäreittiin tai -reitteihin on joi-15 tain vaikeasti havaittavia eroja.

Oletus, että BDNF:n tai NGF:n aikaansaaman CAT-aktiivisuu-den määrien erot johtuvat erilaisista säätelyreiteistä vahvistui aikasidonnaisten kokeiden tuloksista. Viljellyt 20 septaalineuronit reagoivat BDNFrään lisääntyneen CAT-aktii-··· visuuden muodossa 6. päivään asti, jolloin vaste tasaantui.

.··. Sen sijaan NGF: llä aikaan saatu CAT-aktii visuus nousi line- aarisesti 3. päivästä 12. päivään asti. CAT-aktii visuuden .·. ; lisääntymisen nousun lakkaaminen BDNF-käsitellyissä viljel- • I | f’ftj 25 missä 6. päivänä saattaa olla osoitus kehitysmuutoksesta • · ... joko BDNF-reseptorin tai vastereittin vaadittavan osateki- • · jän ekspressiossa. Koska kolinergisten neuronien (AChE-positiivisten neuronien) lukumäärä solutiheydeltään suurem-missä viljelmissä 12 päivän jälkeen näyttää olevan riippu-

Ml V : 30 vainen eksogeenisesta BDNF:stä tai NGF:stä, ei näytä toden- 9 . näköiseltä, että differentiaalinen hermosolukuolema olisi • · t - ,···, syynä aikariippuvaisiin eroihin näiden kahden kasvutekijän • · aikaansaamassa CAT-aktiivisuuden lisääntymisessä.

• « I

• · · 35 Ensimmäisissä kokeissa, joissa basaalisia etuaivojen ko-linergisiä soluja käsiteltiin BDNF:llä, ei oletettu, että 105342 131 primaarinen solutyyppi, neuronaalinen tai gliaalinen, reagoisi tähän neurotrofiseen tekijään. Vaikka kokeeet, joissa käytettiin runsaasti rikastettuja perifeeristen neuronien viljelmiä viittasivat selvästi siihen, että BDNF vai-5 kuttaa suoraan neuroneihin (Lindsay et ai., 1985, Dev.

Biol. 112:319-328, Lindsay, 1988, J. Neurosci. 7:2394-2405), on ajateltavissa että tämän kokeen puitteissa nähdyt

V

BDNF:n neuronaaliset vaikutukset ovat voineet välittyä BDNF:n primaarivaikutuksesta astroglia- tai muihin ei-neu-10 Tonaalisiin soluihin. BDNF:n on kuitenkin havaittu olevan yhtä tehokas CAT-aktiivisuuden indusoija kun läsnä on voittopuolisesti astrogliasoluista muodostunut konfluentti yhden solun paksuinen kerros tai viljelmissä, joissa gliaso-lut ovat voimakkaasti vähentyneet mitoottisella inhibiitto-15 rilla, sytosiiniarabinosidilla suoritetun käsittelyn jälkeen. Kiintoisa havainto näistä kokeista oli, että BDNF:n annosvastekäyrät olivat selvästi erilaiset näissä kahdessa tapauksessa. Gliaalisen yhden solun paksuisen kerroksen läsnäollessa BDNF-vaste oli lineaarinen lisääntyvillä BDNF-20 pitoisuuksilla. Neuronirikastetuissa viljelmissä BDNF-an-nosvaste siirtyi vasemmalle. Eräs mahdollinen selitys näi- · * : , : hin tuloksiin on, että gliasolut itsessään voivat ilmentää ·;··: BDNF-reseptoria, ja näin vähentää todellista ligandipitoi- suutta, joka neuroneissa sijaitsevilla reseptoreilla on * ♦ 25 käytettävissään. Vaihtoehtoinen selitys on, että astro- .... syyttien vaimentava vaikutus saattaa olla epäsuora, ei li-• · · gandipitoisuuden tai reseptoriekspression vaikutuksiin . liittyvä, vaan esimerkiksi voimakkaan BDNF-pilkkoutumisen myötä välittyvä. Samanlaisia havaintoja ovat tehneet Har- *·] ’ 30 tikka ja Hefti (Hartikka, J. and Hefti, F., 1988, J. Neu- . rosci. 8:2967-2985) sekä Honegger ja Lenoir (Honegger, P.

:**'· and Lenoir, D., 1982, Dev. Brain Res. 3:229-238). On osoi- • · · tettu, että eri aivojen alueilta peräisin olevat gliasolut • » · ·* ) voivat vaikuttaa suuresti niihin liittyvien neuronien mor-35 fologiaan (Prochiantz et ai., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 76:5387-5391, Prochiantz et ai., 1981, Nature, 293: 105342 132 570-572). Septaalisilla gliasoluilla saattaa siis olla luontaisia solukalvoon tai eritykseen liittyviä ominaisuuksia, jotka voivat vaikuttaa vaimentavasta kolinergisen fenotyypin ekspressioon. Hippokampuksesta peräisin olevien 5 astrosyyttien säätelyominaisuuksia samanlaisissa koeolosuhteissa tutkitaan parhaillaan.

Esitetyn tiedon perusteella on ilmeistä, että sekä BDNF ja NGF pystyvät edistämään septaalista kolinergistä neuronaa-10 lista toimintaa. On mielenkiintoista spekuloida kahden erittäin homologisen ilmeisesti vain yhteen soluryhmään vaikuttavan neurotrofisen tekijän mahdollista fysiologista tärkeyttä. On joitain viitteitä, että BDNF:n ja NGF:n vaikutukset voivat aluksi olla perifeeristen hermosolujen ai-15 kaisessa kehitysvaiheessa limittäisiä, erityisesti sel- käydinhermon ganglion neuroneissa tai niiden prekursoreis-sa, ja että myöhemmin nämä kasvutekijät voivat segregoitua vaikuttamaan itsenäisesti eri ryhmiin (Lindsay et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319-328, Ersberger, U. and Rohrer, H.

20 1988, Dev. Biol. 126:420-432, Barde, Y. A., 1989, Neuron.

2:1525-1534). Tätä ei kuitenkaan ole definitiivisesti osoitettu käyttämällä sopivia merkkiaineita sensoristen neuronien alaryhmien määrittämiseksi. Koska tässä tutki-•: : muksessa keskityttiin alkioiden septaalisisiin neuroneihin 25 viljelmissä kehityksen tiettynä hetkenä, E17, on mahdollis- • · ta, että samankaltainen segregaatioilmiö tapahtuu myöhem-mässä kehitysvaiheessa septumissa. Septaalisten koliner-gisten solujen BDNF- tai NGF-vasteessa saattaa siis olla <<t>. olemassa kiintoisa ajallinen ja avaruudellinen ero.

30 * · · •j * Tulee olemaan mielenkiintoista tutkia BDNF:n vaikutuksia basaalisiin etuaivojen kolinergisiin neuroneihin in vivo, sillä näyttä ilmeiseltä, että hippokampuksesta peräisin • · · oleva NGF saattaa liittyä basaalisten etuaivojen koliner-35 gisten solujen normaaliin kehitykseen ja ylläpitoon in v-ivo. Tulee olemaan kiintoisaa tietää, onko BDNF:llä saman- 105342 133 lainen merkitys in vivo. Äskettäin tehty havainto, että BDNF-mRNA:ta on erityisen runsaasti hippokampuksessa, tukee tätä ajatusta.

5 17. Esimerkki: preoro-BDNFtn entsvmaattinen konvertoitumi nen aktiiviseksi kypsäksi BDNFtksi 17. 1. Materiaalit ja menetelmät * Käytettiin markkinoilta saatavaa endoproteinaasia Arg-C 10 (hiiren leuanalussylkirauhasesta puhdistettua) konvertoimaan entsymaattisesti laaja hBDNF:n prekursorimuoto (prep-ro-BDNF) biologisesti aktiiviseksi kypsäksi proteiiniksi.

Tämä entsymaattinen pilkkominen toteutettiin in vitro-reaktiolla. Entsymaattisen reaktion substraattina oli prepro-15 hBDNF syntetoituna CHO-DG44-soluissa, jota eritettiin solu-viljelyväliaineeseen ja korjattiin talteen. Elatusaine oli Ham's F-12 (nukleosiditon), jossa oli 1 % fetaalista naudan seerumia (FBS) ja 1 % sekä penisilliiniä että streptomysiiniä. Reaktio toeutettiin 37 eC:ssa, 5 minuuttia, 5 yksik-20 köä entsyymiä ja 50 μΐ CH0-DG44-solusupernatanttia, joka ;! sisälsi prepro-hBDNF:n. Prepro-BDNF:n pilkkoutuminen kyp-säksi hBDNF:ksi oli näissä olosuhteissa täydellistä.

# · : 17.2. Tuloksia ja pohdintaa ....: 25

Yhdistelmä-hBDNF:n prepromuoto (noin 31000 daltonia) muo- • · · ’ kattiin täydellisesti kypsäksi bioaktiiviseksi hBDNF:n muo doksi (noin 12000 daltonia) in vitro käyttämällä endopro- , ‘ * teinaasia Arg-C. Yhdistelmä-hBDNF:ää on onnistuneesti tuo- • · ; 30 tettu nisäkkäiden soluissa (CHO-DG44-solut). Ihmisen BDNF- . : geeni on sisällytetty CHO-solugenomiin kestävästi ja hBDNF- ··· geeni vahvistettu käyttämällä metotreksaattivahvistus-f;, menetelmää. Yhdistelmä-BDNF eritettiin väliaineeseen ja sen havaittiin olevan biologisesti aktiivista. Metabolinen · 35 leimaus ja sen jälkeinen SDS-polyakryyliamidielektroforeesi (15 % geeli) osoittaa, että suurin osa syntetoidusta [S5S]- 105342 134 leimatusta väliaineeseen eritetystä hBDNF-tuotteesta migra-toitui prepromuodossa näennäismolekyylipainoon 31000 (kuvio 30, kaista 2). [3*S]-leimatut proteiinit, jotka eritetään viljelemättömän tyyppisistä CHO-DG44-soluista, nähdään ku-5 viossa 30, kaista 1. Luodaksemme vallitsevasti hBDNF:n kypsää muotoa (näennäismolekyylipaino 12000), loimme in vitro -menetelmän hBDNF:n prepro-muodon entsymaattiseen pilkkomiseen.

10 Trypsiinihajotustuotteet näkyvät kuviossa 30, kaistat 3-6.

Naudan haiman trypsiini (Worthington, kymotrypsiinitön) liuotettiin fosfaaattipuskuroituun suolaliuokseen ja lisättiin 50 ul:n alikvootteihin [1S]-leimattujen CHO-solujen hBDNF:ää. Käytettävät trypsiinipitoisuudet olivat 25, 50, 15 75 ja 100 ug/ml. [1S]-leimatut reaktiotuotteet nähdään kaistoilla 3-6. Entsymaattinen pilkkomisreaktio toteutettiin 37 *C:ssa 5 minuutissa. Asteittainen väheneminen 31000 prepro-hBDNF:n leimaamisintensiteetissä havaittiin molekyylipainoltaan 185000 tuotteen lisäyksen myötä.

20 hBDNF:n kypsää muotoa (molekyylipaino 12000) ei syntynyt 4

näissä olosuhteissa. Kuviossa 30, kaista 7, nähdään [1S]-: leimatut reaktiotuotteet sen jälkeen kun CHO-solujen hBDNF

oli hajotettu entsymaattisesti endoproteinaasilla Arg-C, joka oli eristetty hiiren leuanalussylkirauhasesta (Boeh- e < 25 ringer Mannheim Biochemicals, Inc). 100 yksikköä tätä ent-syymiä muodostettiin uudelleen lyofilisointivalmistusta • · · käyttäen 100 ui:n Milli-Q-vesimäärän kanssa, säilytys -20 ’C:ssa. CHO-solujen hBDNF:n hajottamisessa käytimme 5 yk- sikköä (5 ui) entsyymiä ja 50 ui [1S]-leimattua proteiinia • · · * ’* * 30 CHO-solusupernatanteista, jotka sisälsivät prepro-hBDNF:ää : (kuvio 30, kaista 2). Kuten kuviosta 30, kaista 7, ilme- * · · ·*”. nee, 5 yksikköä endoproteinaasia Arg-C riitti konvertoimaan • » · hBDNF:n prepro-muodon (molekyylipaino 31000) kypsän hBDNF:n • « « muotoon (molekyylipaino 12000) 15 minuutissa 37 *C:ssa.

Entsymaattinen käsittely endoproteinaasilla Arg-C hBDNF:ää 35 105342 135 ilmentävien CHO-solujen supernatanteista lisäsi BDNF:n biologisen aktiivisuuden määrää suhteessa käsittelemättömiin supernatantteihin. CHO-DG44-solujen hBDNFrää ilmentäviä supernatantteja käsiteltiin 5 minuuttia endoproteinaasilla 5 Arg-C 37 *C:ssa. 200 ui supernatanttia käsiteltiin 20 yksiköllä entsyymiä ja sekä käsitellyn että käsittelemättömän hBDNF:n biologinen aktiivisuus mitattiin käyttämällä eks- ▼ plantteja kananpojan selkäydinhermon takajuuren ganglioista. Kaksikymmentäneljä tuntia hBDNF-lisäyksen jälkeen neulo riittien kasvu pisteytettiin kvalitatiivisesti. Havaitsimme johdonmukaisesti, että endoproteinaasilla käsitellyt BDNF-koe-erät olivat kauttaaltaan huomattavasti bioaktiivi-sempia kuin kontrollina käytetyt (käsittelemättömät) hBDNF-koe-erät. Pitoisuuskäyrät tästä on esitetty kuviossa 31.

15

Yhteenvetona voidaan sanoa, että puhdistettua endopro- teinaasia Arg-C voidaan käyttää in vitro entsymaattisessa reaktiossa generoimaan kypsää ihmisen yhdistelmä-BDNF-muo- toa epätäydellisesti muokatuista prekursorimolekyleistä 20 (aivoperäisen neurotrofisen tekijän prepro-muoto). Tämän uuden menetelmän avulla päästään tuottamaan tehokkaasti . suuria määriä bioaktiivista ihmisen BDNF:ää käyttämällä • · · *;;j nisäkkäiden solujen viljelysysteemejä. Voi esimerkiksi • · ·...· olla mahdollista immobilisoida endoproteinaasi Arg-C kiin-25 teään matriisiin ja saada aikaan tehokas kolonnikromatogra- • · fiavaihe.

• · 18. Esimerkki; Aivoista peräisin oleva neurotrofinen teki- iä edistää rotan ventraalisen m^senkefalonin dopaminerois- 30 ten hermosolujen elävänä pysymistä ia kypsymistä , 18.1. Materiaalit ja menetelmät · · 18.1.1. Soluviljelmät · · • « « • · «

IM

Luotiin erilliset viljelmät entsymaattista ja mekaanista 1 • · erottamista käyttäen E14-E15-rotan alkioiden ventraalisesta • mesenkefalonista leikellystä kudoksesta. Kahdesta tai koi- 105342 136 mesta poikueesta otettujen rotan (time-mated Sprague-Daw-ley) alkioiden yhdistetyt kudokset trypsinoitiin (0,125 %, Worthington) F12-väliaineessa (Gibco) tavalliseen tapaan 20 minuuttia 37 *C:ssa. Kun kudos oli pesty elatusväliainees-5 sa (MEM, joka sisälsi lisäksi 2 mM glutamiinia, 6 mg/ml * glukoosia, 0,5 U/ml penisilliini-G:tä, 5 Mg/ml streptomysiiniä ja 7,5 % fetaalista vasikanseerumia), sitä sentri-fugoitiin pienellä nopeudella 5 minuuttia ja pallukka erotettiin trituroimalla. Kun dispergoitumattomien solumöyk-10 kyjen oli annettu laskeutua 1-2 minuuttia, koko solususpen-sio levitettiin 35 mm:n maljoihin (etukäteen polyorni-tiinila ja laminiinilla päällystetyille; Linsday et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319), jotka sisälsivät elatusainetta sen verran, että solutiheydeksi tuli 5 x 104 solua per cm2.

15 Kun solujen oli annettu inkuboitua yli yön elatusaineessa solujen kiinnittymisen edistämiseksi, soluja viljeltiin BDNF:n läsnäollessa tai ilman BDNFtää seerumittomassa määrätynlaisessa muutoin samanlaisessa elatusaineessa, jota kuvaavat Bottenstein ja Sato (Bottenstein and Sato, 1979, 20 Proc. Natl, Acad. Sei. U.S.A. 76:514), vain insuliinilisäys muutettiin 20 ng/ml:ksi. Dopaminergisten solujen esille saamiseksi solut fiksoitiin 4-prosenttisella paraformalde-hydillä, pestiin perusteellisesti, permeabilisoitiin 0,02- • · prosenttisella saponiinilla Sorensenin puskuriaineessa 1,5-] 25 prosenttisen hevosenseerumin kanssa ja värjättiin hiiren ♦ « i *· ” rotan TH:n monoklonaalisella vasta-aineella (Boehringer-* *·’*· Mannheim). Primaarinen vasta-ainesitoutuminen visualisoi- • « « V · tiin käyttämällä Vecastain-ABC-kit-menetelmää (Vector

Labs).

·;··: 30 18.1.2. Dopamiinioton mittaaminen m • · ·

Viljelmät valmistettiin tapaan, jota kuvataan osassa • · *···’ 18.1.1., supra, ja kasvatettiin osoitettujen päivien ajan 35 joko sian BDNF:n läsnäollessa, 50 mg/ml, tai ilman sitä.

φ

Dopamiiniotto määritettiin kolmesta rinnakkaisesta viljel- 105342 137 mästä osoitettuina ajankohtina. Solut pestiin etukäteen ottopuskuriaineella, jonka koostumus oli: 136,8 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8 mM Na2HP047H20, 1,5 mM KH2P04, 5 mM glukoosia, 1 mM CaCl2, 1 mM MgS04, 0,1 mM askorbaattia ja 0,1 mM par-5 gyliiniä, pH 7,4. Koe-erissä, joista mitattiin ei-neu-ronaalisen 3H-dopamiinin otto, oli bentstropiinia (BZT) ottopuskurissa, pitoisuus 5 μΜ. Pesun jälkeen solut lämmitettiin etukäteen 37 *C:een viideksi minuutiksi tuoreessa ottopuskurissa, jolloin 3H-dopamiinia (NEN, 40 ci/mmol) 10 lisättiin, lopullinen pitoisuus 50 nM. Viljelmiä inkuboi-tiin 37 *C:ssa 15 minuuttia, ottoliuos poistettiin, solut pantiin jäihin, ja pestiin neljään kertaan jääkylmällä ottopuskuriaineella. Solut korjattiin talteen lisäämällä 0,5 N NaOH viljelyastioihin ja NaOH-uutos laskettiin Beckmanin 15 tuikemittarilla, 15 ml Ultima Gold -tuikenestettä (Packard Instruments). Spesifinen neuronaalinen dopamiiniotto määritellään otoksi (cpm), joka voidaan havaita ilman BZS:ää miinus määrä, joka havaitaan BZS:n läsnäollessa. Yleisesti ottaen BZS ei inhiboinut 70-90 % kokonaisotosta. Toisto-20 viljelmissä määritettiin annettuina aikoina TH*-neuronien määrä immunosytokemiallista värjäystä käyttäen ja saadut . tulokset ovat otto normalisoituna per TH+-perustalla.

iiia • i · « · 18.1.3. BDNF:n transienttiekspressio ί ί 25 *. *: C0S-M5-soluja transfektoitiin vektorilla CDM8, joka sisälsi ihmisen BDNF:ää koodaavan sekvenssin. 72 tuntia transfek- • · · ’ toinnin jälkeen koottiin 50 ml vil jelysupernatanttia ja dialysoitiin vasten 6 M ureaa. Dialysoitu supernatantti 30 yhdistettiin amfoliineihin (pH 3,5 - 10., BioRad) 4 1/2

;·:·. tunniksi. Fraktiot koottiin ja dialysoitiin vasten 25 mM

·. NaP04-puskuria, pH 7,6, dialyysiputkissa, jotka oli pesty • · · ’···* etukäteen BSA:lla (0,5 mg/ml) epäspesifisen absorption es- * · tämiseksi. Fraktioista tutkittiin neuriittien kasvua edis-35 tävää aktiivisuutta viljelmissä, joissa käytettiin eks- plantteja E8-kanan selkäydinhermon taka juuren ganglioista.

105342 138

Aktiiviset fraktiot koottiin. Kootun aktiivisen osan analysoinnissa SDS-PAGE-menetelmällä ja sitä seuraavalla ho-peavärjäyksellä (Wray et ai., 1981, Anal. Biochem. 118:197) 8-18-prosenttisessa geelissä voitiin havaita heikko vyöhyke 5 kohdassa 68 kD, joka vastasi BSA:ta, ja yksittäinen vyöhyke noin kohdassa 12 kD, joka vastasi aiemmin havaittua sian BDNF:n vyöhykettä (Barde et ai., 1982, EMBO J. 1:549) (tuloksia ei esitetty). Vertailevissa bioanalyyseissä, joissa käytettiin eksplantteja kanan selkäyhdihermon takajuuren 10 ganglioista, nodoosiganglioista ja sympaattisen hermoston ganglioista, puhdistetun ihmisen yhdistelmä-BDNF:n neu-ronaalinen spesifisyys oli samanlainen kuin puhdistetun sian BDNF:n.

15 18.1.4. hBDNF:n tuottaminen transfektoiduista CHO-soluista CHO-DG44-solut olivat ystävällinen lahja Dr. L. Chasinilta (Columbia University, NY). Nämä solut ovat dihydrofolaat-tireduktaasivajäitä (dhfr-) (Urlaub and Chasin, 1980, Proc.

20 Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:4216-4220). CHO-DG44-soluja pidettiin Ham's F-12-elatusaineessa, läsnä myös 10 % fetaa- lista naudanseerumia, 1 % penisilliiniä ja streptomysiiniä sekä 2 mM glutamiinia. Solujen elatusaine vaihdettiin kah- "*: desti viikossa ja niistä tarkastettiin rutiininomaisesti :’\.:25 mahdolliset mykoplasmakontaminaatiot. Kaikki plasmidi-DNA • · ....: puhdistettiin kaksinkertaisella kesiumkloridikäsittelyllä (cesium chloride banding) ennen transfektointia. Ihmisen BDNF-geeni alikloonattiin nisäkkään ekspressiovektoriin pCDM8 pC8hB:n aikaansaamiseksi kuten aikaisemmin on kuvattu ... 30 (Maisonpierre et ai., 1990, Science 247:1446-1451). Hei-• · · \ " kennetyn dihydrofolaattireduktaasigeenin p410 lahjoitti ystävällisesti Dr. L. Chasin. Nämä kaksi geenikonstruk-tiota transfektoitiin samanaikaisesti CHO-DG44-soluihin • I > y..' elektroporaation avulla (Shigekawa and Dower, 1988, Bio-.35 Techniques 6:742-751). Noin 1 x 10e solua transfektoitiin 20 ug:ssa pC8hB ja 0,2 ug:ssa p410. 48 tuntia transfek- 105342 139 toinnin jälkeen CHO-DG44-solut pilkottiin selektioelatusai-neeseen, joka sisälsi nukleosiditonta Ham's F-12 (ilman tymidiiniä ja hypoksantiinia; -HT) sekä 10 % dialysoitua fetaalista naudanseerumia ja 1 % penisilliiniä ja strepto-5 mysiiniä. Yksittäiset pesäkkeet eristettiin noin 10 päiväksi sen jälkeen kun solut oli pantu nukleosidittomaan selektioelatusaineeseen. Yksittäisiä valittuja kasvuresis-tenttejä pesäkkeitä nukleosidittomassa Ham's F-12-(-HT)-elatusaineessa käsiteltiin joko 0,02, 0,05 tai 0,1 uM:n melo totreksaattimäärällä (MTX) geeninvahvistuksen aikaansaamiseksi (Alt et ai., 1987, J. Biol. Chem. 253:1357-1370). MTX-resistenttejä pesäkkeitä viljeltiin yhdistettyinä ja ne vahvistettiin edelleen joko 1,5, 2,0 tai 2,5 uM MTX. Yksi 2,5 uM MTX-resistentti pesäke eristettiin ja valittiin 15 mittaviljelmäksi (scale-up culture) ja hBDNF:n tuottamiseen. Tämän kloonin (DGZ1000-B-3-2,5) southern blotting-analyysi osoitti BDNF-geenin vahvistuneen käsittelemättömiin CHO-DG44-soluihin verrattuna noin 50-kertaisesti. Bioanalyyseillä kanan selkäydinhermon takajuuren gangli-20 oilla (DRG) arvioitiin tämän kloonin tuottavan noin 9,5 ug hBDNF/ml (ei esitetty). Yhdistelmä-hBDNF:ää tuotettiin . suuret määrät viljelemällä DGZ-B-3-2,5-soluja 480 cm2:n roller-pulloissa. Elatusaine koottiin noin neljä päivää ’··_’ sen jälkeen kun nämä solut olivat saavuttaneet konfluens-‘25 sin. hBDNF puhdistettiin viljelysupernatantista kuten *. *: aiemmin COS-supernatantista.

· · ’ 18.2. Tuloksia ja pohdintaa ;··· 30 Neuronien elävänä pysymistä ja hermotuskohdespesifisyyttä .··.*. säätelevien molekulaaristen signaalien tunnistaminen on T 11« ^ \ olennaisen tärkeää, ei vain siksi, että sen avulla saadaan selville hermoston muotoja, vaan myös sen vuoksi, että sen • 9 avulla pystytään paremmin ymmärtämään mekanismeja, jotka 35 osallistuvat kypsien hermosolujen ylläpitoon ja korjaami- f ....: seen sopivina synaptisina konfiguraatioina. Vaikka on laa- 105342 140 jalti tunnettua, että neuronien elossa pysyminen ja ylläpito riippuvat spesifisistä kohdesolujohdetuista neurotro-fisistä tekijöistä (Levi-Montalcini and Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Thoenen and Barde, 1980, Physiol, 5 Rev. 60:1284, Purves, D., 1988, Body and Brain, Harvard University Press, Cambridge, MA, Barde, Y.A., 1989, Neuron 2:1525, Lindsay, R.M., 1988, The Making of the Nervous System, Oxford University Press, Oxford, p.148), vain harvoja tällaisia molekyylejä on täydellisesti karakterisoitu.

10 Tähän asti vain kahden neurotrofisen tekijän, hermokasvute-kijän (NGF) ja aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän (BDNF) on osoitettu selektiivisesti edistävän erillisten hermosoluryhmien elävänä pysymistä in vivo ((Levi-Montalcini and Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Barde, 15 Y.A., 1989, Neuron 2:1525, Leibrock et ai., 1989, Nature 341:149).

Neuronaalisia soluviljelmiä on laajalti käytetty bio- analyyseihin neurotrofisen aktiivisuuden tunnistamiseksi 20 solu- ja kudosuutteista (Levi-Montalcini and Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Thoenen and Barde, 1980, Phy- siol, Rev. 60:1284, Lindsay, R.M., 1988, The Making of the

Nervous System, Oxford University Press, Oxford, p.148, ·:·*: Varon and Adler, 1981, Adv. Cell. Neurobiol. 2:118) sekä : -.:25 puhdistettujen neurotrofisten tekijöiden neuronaalisen spe- ....: sifisyyden tai spesifisyyksien määrittämiseen (Ebendal, T. , .·;·. 1989, Nerve Growth Factors, John Wiley, London, p.81, Bar- • · · bin et al., 1984, J. Neurochem. 43:1468, Barde et al., . 1982, EMBO J. 1:549, Davies et al., 1986, J. Neurosci. 6: 30 1897, Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112:319). Tähän • · » ’·* * asti useimmissa tutkimuksissa on keskitytty neurotrof isiin : vaatimuksiin, joita eri hermosoluryhraillä ääreishermostossa on. NGF:n hyvän saatavuuden vuoksi se on toistaiseksi oi-

• I I

.1. lut tarkimmin karakterisoitu neurotrofinen tekijä. NGF:n • « · * , 35 on osoitettu sekä in vivo että in vitro olevan elintärkeä neuronaalisten alaryhmien elävänä pysymiselle ja ylläpidol- 105342 141 le sekä ääreishermostossa (PBN) että keskushermostossa (CNS) (Levi-Montalcini and Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Thoenen and Barde, 1980, Physiol, Rev. 60:1284, Whittemore and Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439, Snider 5 and Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26:489, Hefti et al., 1989, Neurobiology of Aging 10:515, Martinez et al., 1987, Brain Res. 412:295, Takei et al., 1988, J. Neurochem. 51:1118, Hartikka and Hefti, 1988, J. Neurosci. 8:2967). Esteenä spesifisten CNS-neuronien neurotrofisten kasvutekijöiden 10 tunnistamiselle on ollut muiden neurotrofisten tekijöiden kuin NGF:n puhdistettujen valmisteiden huono saatavuus ja vaikeus valmistaa spesifisistä neuroniryhmistä homogeenisia valmisteita. Kaksi äskettäin tehtyä havaintoa saivat meidät tutkimaan BDNF:n vaikutusta keskushermoston (nigraalis-15 ten) dopaminergisten hermosolujen elävänä pysymiseen. Ensinnäkin tällä hetkellä on selvää, että BDNF-geeni ilmentyy keskushermostossa, ja sen pitoisuudet ovat yhtä suuria tai suuremmat kuin NGF-geenin (Leibrock et al., 1989, Nature 341:149). Toiseksi on raportoitu, että proteiini, joka on 20 osittain puhdistettu naudan striatumista (nigraalisten dopaminergisten neuronien kohde) ja joka ominaisuuksiltaan muistuttaa BDNF:ää, pystyy lisäämään mesenkefalonista saa-.···, tujen dopaminergisten neuronien elävänä pysymistä in vitro (Dal Toso et al., 1988, J. Neurosci 8:733).

• · · ’· *j Kuvio 32 A kuvaa tyypillisiä erillisiä ventraalisia mesen-kefalonsoluja yhdeksän päivän viljelyn jälkeen. Käytännöl- M* : lisesti katsoen kaikilla soluilla oli faasikirkas runko-osa ja pitkät ulokkeet. Muutamia morfologialtaan fibroblasti- '"*:30 siä soluja oli nähtävissä, eikä astrogliaalisia soluja ha- t vaittu kun viljelmät värjättiin vasta-aineilla astro- _ \ gliamerkkiaineelle, hermotukitudoksen säikeinen asidinen • · · proteiini (glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Bignami « · *···* et al., 1972, Brain Res. 43:429). Dopaminergisten solujen :35 visualisoimiseksi näissä viljelmissä suoritettiin im-·:··.· munosytokemiallinen värjäys monoklonaalisilla TH:n vasta- 105342 142 aineilla. Kuten oli odotettavissa, TH*-neuronien lukumäärä oli vähäinen (nuolet kuvioissa 32 B ja 32 C) ja vaihteli ajan myötä viljelmissä, 0,1 - 0,5 % levitetyistä soluista. TH*-soluissa havaittiin olevan neuronaaliselta muodoltaan 5 erilaisia soluja (kuvio 33).

Kaikissa viljelmissä TH*-solujen lukumäärässä oli poikkeuksetta vähentymistä (kuviot 34 A ja 35) ensimmäisten 3-4 in vitro-päivän jälkeen. Esimerkiksi 8. viljelypäivänä TH*-10 solujen lukumäärä verrokkiviljelmissä oli vain 25 % verrattuna samojen viljelmien 2. päivään (kuvio 35). Sen sijaan BDNF-käsitellyissä viljelmissä ΤΙΓ-solujen menetys oli verrokkiryhmään nähden huomattavasti vähäisempi. Kahdeksannen in vitro -päivän jälkeen TH*-solujen määrä BDNF-käsitel-15 lyissä viljelmissä oli aina suurempi kuin käsittelemättömissä verrokeissa, esimerkiksi 1,8-kertainen yhden BDNF-lisäyksen jälkeen (kuvio 34 A) ja 5 kertaa suurempi useamman lisäyksen jälkeen (kuvio 35). 8 päivää ylläpidettyihin viljelmiin vain kerran lisätyn BDNF:n vaikutuksen havait-20 tiin olevan annosriippuvainen (kuvio 34 B). Aikaisempien tulosten mukaisesti (Dal Toso et ai., 1988, J. Neurosci. 8:733, Knusel et ai., 1990, J. Neurosci. 10:558) NGF (50 ng/ml) ei vaikuttanut TH*-solujen lukumäärään (kuvio 34 C).

· · * • · · · f '25 Tutkittaessa edelleen BDNF:n vaikutusta dopaminergisiin • · soluihin näissä viljelmissä, selvitettiin TH"-solujen 3H-dopamiiniottokykyä. Kuten taulukosta X voidaan nähdä, do- ·*· !.·* : pamiiniottokyky (normalisoituna per TH*-hermosolu) lisään tyi ensimmäiset 8 päivää huomattavasti, mutta laantui sit- ·:··· 30 ten. Havaittiin kuitenkin, ettei BDNF muuttanut TH*-solu-jen dopamiiniottokykyä, sillä sama aika ja samat arvot saavutettiin sekä BDNF:n läsnäollessa että ilman sitä (tauluk-ko X). Oletimme tämän tuloksen perusteella, että BDNF to-dennäköisesti vaikuttaa suoraan edistäessään dopaminergis-35 ten neuronien elävänä pysymistä mesenkefalonviljelmissä, sen sijaan että se indusoisi dopaminergisen fenotyypin eks- 105342 143 pression neuroneissa, jotka eivät välttämättä tarvitse BDNF:ää elävänä pysyäkseen. Tutkiessamme tätä edelleen suoritimme kokeita, joissa TH*-hermosolujen lukumäärä määriteltiin viljelmissä, joissa BDNF-lisäystä viivytettiin 5 useampia päiviä. Havaitsimme, että kun BDNF-lisäystä viivytettiin 5. päivään asti ja TH*-solujen lukumäärä määritettiin 6., 8. tai 10. viljelypäivänä,·näissä viljelmissä oli vähemmän dopaminergisia soluja verrattuna rinnakkais-viljelmiin, joissa BDND oli ollut läsnä 2. päivästä lähtien 10 (kuvio 36). Vaikka viivytetty BDNF-lisäys selvästi lisäsi TH*-neuronien määrää verrokkiviljelmiin nähden, vastaavina aikoina tutkitun viivytetyn lisäyksen ei kertakaan havaittu säilyttävän yhtä monta ΤΚΓ-neuronia kuin 2. päivän BDNF-lisäyksen yhteydessä.

15

Yhdessä nämä tulokset näyttävät sulkevan pois mahdollisuuden, että BDNF vaikuttaisi vain TH-geeniekspressiota lisäävästi tietyn solumäärän puitteissa, ja näyttää siltä, että BDNF:n vaikutus toteutuu siten, että se edistää sellaisten 20 dopaminergisten solujen neuronien elävänä pysymistä, jotka kuolisivat ellei tätä neurotrofista tekijää lisättäisi vil-jelmiin varhaisessa vaiheessa.

• · • · ;··: On useita tutkimuksia, joissa on raportoitu keskiaivojen 25 dopaminergisten hermosolujen kypsymistä stimuloivista ja • · ....: elävänä pysymistä in vitro edistävistä joko kohdejohdetuis- ta uutteista tai erilaisista kasvutekijöistä (Dal Toso et • · · ai., 1988, J. Neurosci 8:733, Knusel et ai., 1990, J. Neu- . rosci. 10:558, Prochiantz et ai., 1979, Proc. Natl. Acad.

[>t* 30 Sei. U.S.A. 76:5387, DiPorzio et ai., 1980, Nature 288:370, • · · „ '·[ Prochiantz et ai., 1981, Nature 293:570, Denis-Donini et : ai., 1983, J. Neurosci. 3:2292). Toistaiseksi ei kuiten-

«M

kaan ole raportoitu täysin puhdistetusta molekyylistä, joka

• M

suoraan ja selektiivisesti edistäisi TH*-neuronien elävänä • · « ’ 35 pysymistä täysin ilman hermotukikudossoluja tai tehostettua solujakoa (kuten voidaan havaita esimerkiksi IGF-l:n tai 105342 144 FGF:n kohdalla; Dal Toso et ai., 1988, J. Neurosci. 8:733). Aikaisempien tutkimuksien mukaisesti, joissa käytettiin hiiren varhaisalkion kudosta (Dal Toso et ai., 1988, J. Neurosci 8:733), E14-rotan ventraalisen keskiaivon solujen, 5 joita viljeltiin seerumittomassa määrätynlaisessa elatusai-neessa, havaittiin olevan olennaisesti vailla astrosyyttejä tai fibroblasteja. Tässä kokeessa käytetty suhteellisen pieni solujen levitystiheys, 50000 solua/cm2 vähensi mahdollisen endogeenisen neurotrofiaktiivisuuden vaikutuksia, 10 ja päästiin suurempaan solujen laskutarkkuuteen. Esitettyjen tietojen perusteella näyttää siltä, että neurotrofinen tekijä, jonka Dal Toso et ai., osittain puhdistivat naudan striatumista (Dal Toso et ai., 1988, J. Neurosci 8:733) on BDNF. Tämä viittaa siihen, että BDNF:ää syntyy striatumis-15 sa, ja substantia nigrasta projektoituvat dopaminergiset hermosolut ottavat sitä sieltä. Toistaiseksi BDNF-mRNA:ta (tai saman neurotrofisen perheen muiden jäsenien mRNA:ta) ei kuitenkaan ole löydetty runsaasti striatumkudoksesta norther blot-menetelmää käytettäessä.

20

On selvää, ettei BDNF-lisäys, edes useampi lisäys, pidä täysin elossa nigraalisia dopaminergisiä hermosoluja koko tutkitun kasvatus jakson ajan. Tämän ilmiön ovat havainneet hyvin samantapaisissa koeolosuhteissa Dal Toso et ai. (Dal ' 25 Toso et ai., 1988, J. Neurosci 8:733), he osoittivat että • » tämä väheneminen saattaa liittyä käytettävään solutihey-teen. Tiheyden ollessa suurempi (4 kertaa tässä käytettyä :t:*: suurempi) voitiin havaita enemmän katekolamiini-fluoresoi- via soluja, ja näiden solujen spontaani katoaminen oli vä-....|30 häisempää. On mahdollista, että nämä solut vaativat kau-emmin elävänä pysyäkseen solu/solukosketusta.

• · « « • i *

Myöhemmissä tutkimuksissa, erityisesti BDNF:n vaikutuksia ventraalisen keskiaivon dopaminergisten neuronien kehityk- « ;';';35 seen ja ylläpitoon in vivo kohdistuvissa, tulee olemaan tarpeen määrittää tässä kuvattujen BDNF:n vaikutusten fy- • · 145 105342 siologinen tärkeys. Ajateltaessa spesifistä nigraalisten dopaminergisten hermosolujen häviämistä Parkinsonin taudin yhteydessä on erityisen toivottavaa löytää neurotrofinen tekijä, joka selektiivisesti vaikuttaa juuri näihin solui-5 hin. Tämän keksinnön havainto, että BDNF edistää näiden NGF-ärsykkeitä vastaanottamattomien hermosolujen elävänä pysymistä on selvä osoitus siitä, että kannattaa suorittaa eläinkokeita, joilla voidaan määrittää suojaako BDNF dopa-minergisiä hermosoluja 6-hydroksidopamiinin tai MPTP:n (1-10 metyyli-4-fenyyli-l,2,3,6-tetrahydropyridiini) toksisilta vaikutuksilta. Tällaisilla tutkimuksilla voidaan päästä uuteen terapeuttiseen lähestymistapaan parkinsonismin hoidossa .

15

TAULUKKO X

20 BDNF ei suoraan lisää dopamiiniottoa ventraali- mesenkefalonviljelmissä • f t • · « « :.'··25 3H-dopamiiniotto *:**: (cpm/TH/ ( + ) neuronia/15 min) :1·1; Vil jelypäiviä Verrokki BDNF-käsitelty 3 0,51 ± 0,1 0,95 ± 0,2 _ ....: 6 4,5 ± 0,3 3,1 ± 0,6 • · .-:-. 30 8 18,5 + 5,3 27,3 ± 1,2 • · · 10 3,37 ± 0,24 2,21 ± 0,18 • · · • · · · ♦ • · · • · • · · · · 105342 146 19. Esimerkki: BDNF saa aikaan annosriippuvaisen inhibition aantma-aminobutvyrihappo-otossa 19.1. Materiaalit ja menetelmät 19.1.1. Hippokampussoluviljelmät 5

Hippokampukset dissekoitiin E18-19 Sprague-Dawley rottien alkioilta ja koottiin F-10 elatusaineeseen. Kudokset hienonnettiin, huuhdottiin kahdesti F-10-väliaineella (Gibco) ja trypsinoitiin o,25-prosenttisella trypsiinillä (Gibco) 10 20 minuutin ajan 37 *C:ssa. Trypsiini inaktivoitiin lisää mällä seerumia sisältävää väliainetta, joka sisälsi: ela-tusainetta (MEM), jossa oli lisäksi fetaalista vasikansee-rumia (FCS, 10 %), glutamiinia (2 mM), penisilliiniä (25 U/ml) ja streptomysiiniä (25 ug/ml). Varovasti trituroiden 15 erotellut solut koottiin ja sentrifugoitiin pienellä nopeudella (500 rpm) 30 sekunnin ajan. Sentrifugointi toistettiin kahdesti ja solupallukat uudelleensuspendoitiin seerumia sisältävään väliaineeseen. Solut levitettiin 6 mm:n kuoppiin tai 35 mm:n maljoihin, jotka oli peitetty 20 polyornitiinillä (10 ug/ml) ja laminiinilla (10 ug/ml). Useimmissa kokeissa solujen levitystiheys oli vähäinen, noin 71000 solua/cma. Viidestä kuuteen tuntia solujen le- .···. vityksen jälkeen väliaine vaihdettiin seerumittomaan elä- · tusaineeseen joka sisälsi 1 % N3 ja penisilliini/streptro- • · ^ 25 mysiiniä (25 yksikköä/ml ja 25 ug/ml), jolloin BDNF lisät- * tiin viljelmiin. Elatusaine vaihdettiin joka kolmas tai neljäs päivä, jolloin myös neurotrofista tekijää lisättiin « « · *·' ' uudestaan.

'“'SO 19.1.2. Affiniteettiherkän gamma-aminobutyyrihappo-oton : (GABA) mittaaminen • » « !!! Affiniteettiherkän GABA:n otto mitattiin käyttämällä muun- neltua Tomozawan ja Appelin menetelmää (Tomozawa and Appel, * « · V ·35 1986, Brain Res. 399:111-124). Solut pestiin GABA-ottopus- ·:··; kuriaineessa, jonka koostumus oli: 140 mM NaCl, 2,6 mM KC1, 105342 147 1 mM KH2P04, 1 mM Na2HP04, 6 mg/ml glukoosia, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 ja 0,1 % BSA. Pesun jälkeen soluja inkuboitiin GABA-ottopuskurin kanssa 5 minuuttia 37 "C:ssa. 3H-GABA (NEN, NET-191X, 111,4 Ci/mmol) lisättiin, lopullinen pitoi-5 suus 12 nM, ja inkubointi suoritettiin 37 1C:ssa, 10 minuuttia. Soluja pidettiin jäissä ja pestiin sitten kolmeen kertaan ottopuskuriaineella. Soluja inkuboitiin 0,14 N NaOH:n kanssa huoneen lämmössä 2 tuntia ja uutteen 3H-GABA tutkittiin. 3H-GABA-oton havaittiin olevan lineaarinen 10 ainakin 30 minuutin ajan. GABA-otto ei-neuronaalisiin soluihin estettiin lisäämällä 2 mM B-alaniinia: neuronispe-sifinen otto voidaan varmentaa käyttämällä estämiseen 1 mM nipekotiinihappoa.

15 19.2. Tulokset ja pohdintaa

Olemme äskettäin havainneet runsaita viesti-BDNF-määriä neuronirikastetuissa hippokampusviljelmissä, muttei hippo-kampuksen astrosyyteissä. Nämä tiedot viittaavat voimak-20 kaasti siihen, että BDNF lokalisoituu hippokampuksen her-mosoluihin. Tutkittaessa BDNF:n vaikutusta hippokampuksen neuroneihin viljelmissä soluja käsiteltiin eri BDNF-pitoi-suuksilla (rotophor-puhdistetttuna COS-supernatanteista).

• » · : Kahdeksan päivän viljelyjakson lopulla mitattiin neuronien *: 1 1 :2 5 affiniteettiherkän GABArn otto. Kuten kuviosta 37 voidaan :1·.· nähdä, BDNF sai aikaan annosriippuvaisen GABA-ottoinhibiti-• · ....: on. BDNF voi siis vaikuttaa GABAergisten neuronien elävänä pysymiseen ja/tai fenotyyppiekspressioon. BDNF ei vaikut- • · · tanut glutamaattia sisältäviin neuroneihin lainkaan (mikä .30 todettiin glutamaattiottokokein), ei myöskään neurofila-menttiproteiiniin. BDNF: n vaikutus hippokampusvil jelmissä • 9 · ’·) 1 näyttää siis kohdistuvan valikoidusti GABAergisiin neuro- : : neihin.

» t > • «

• « I

35 i i 1 « 105342 148 20^_Esimerkki: BDNF suojaa MPP*:n toksisilta vaikutuksilta 20.1. Materiaalit ja menetelmät 20.1.1. Neurotrofisten tekijöiden MPP+-käsitelyihin SH-SY5Y-soluihin kohdistuvan vaikutuksen mittaaminen 5 SH-SY5Y-solut pantiin 24 kuopan levyihin, tiheys 1 x 105 solua per kuoppa. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen soluja käsiteltiin neurotrofisillä tekijöillä. Kaksikymmentäneljä tuntia neurotrofisella tekijällä suoritetun kä-10 sittelyn jälkeen soluja käsiteltiin MPP+:lla (10 uM). Nel-jäkymmentäkahdeksan tuntia MPP+-lisäyksen jälkeen elinkelpoiset solut kvantifioitiin trypaanisinieksluusiokokeen avulla. Käytetyt neurotrofiset tekijät olivat mNGF-COS (1:5 laimennos), hBDNF-COS (1:5 laimennos), puhdistettu 15 rCNTF E. colista (25 ng/ml), puhdistettu naudan aivojen bFGF (25 ng/ml), rNT3-COS (1:5 laimennos) ja puhdistettu hEGF (25 ng/ml).

20.1.2. Neurotrofisten tekijöiden vaikutuksen mittaaminen 20 MPP*-käsitellyissä ventraalimesenkefalonviljelmissä

Valmistettiin erillisten ventraalimesenkefalonhermosolujen • · · viljelmät E14-rotan alkioista jo esitettyyn tapaan (ks osa :": 18, supra). Neljäkymmentäkahdeksan tuntia viljelyjen pe- :'\fc5 rustamisen jälkeen niitä käsiteltiin neurotrofisilla ai- « 9 neilla. Neurotrof isiä tekijöitä olivat hBDNF (CHO-soluista rotophor-puhdistettu, < 50 ng/ml), puhdistettu mNGF (50 ng/ml), rNT-3 (COS-supernatantit, 1:50 laimennos), puhdis- p . tettu naudan aivon bFGF (10 ng/ml) ja puhdistettu rCNTF (25 ...30 ng/ml) E. colista. Kaksikymmentäneljä tuntia neurotrofisen • · · \ * tekijän lisäyksen jälkeen viljelmiä käsiteltiin MPP*:lla (1 uM). Nel jäkymmentäkahdeksan tuntia MPP*-käsittelyn jälkeen TH-positiiviset solut tunnistettiin immunohistokemiallises-ti ja kvantifioitiin. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta ,35 erillisestä kokeesta, joissa käytettiin kolmea rinnakkaista koe-erää per koe. TH-positiivisten neuronien lukumäärä I < ( 105342 149 MPP*-käsittelyn jälkeen on esitetty viivoitetuin pylväin. Yksiväriset pylväät osoittavat TH-positiivisten hermosolujen määrän ilman MP P+-käsittelyä.

5 20. 2. Tuloksia ja pohdintaa

Kun testattiin erikseen BDNF:n, NGF:n, CNTF:n, NT-3:N, bFGF:n ja EGF:n kykyä suojata SH-SY5Y-soluja l-metyyli-4-fenyylipyridiniumin (MPP) toksisuudelta (trypaanisinieks-10 kluusiokoe), vain BDNF:llä ja NGFillä oli havaittavissa huomattavaa suojausaktiviteettia MPP*-toksisuutta vastaan (taulukot XI ja XII).

15 TAULUKKO XI

BDNF:n ja NGF:n suojauskyky MPP+-toksisuutta vastaan SH-SY5Y-soluissa.

20 '!' Tulokset: • * i ·

Ml Käsittely: Elinkelpoisten solujen määrä ...25 (elinkelpoisuus-%) COS-Mock-transfektio (1:5) 0,4 x 10* (5%) :··: BDNF-COS (1:5) 1,2 X 105 (67%) :**: ngf-cos (1:5) 1,7 x io5 (84%) 30 CNTF 0,6 X 10* (14%) ...... NT-3 0,7 x 10* (20%) • ♦ bFGF 0,4 x 10* (11%) „ '! * EGF 0,1 X 10* (3%) • · ·

* » I

c · :,,35 ___ i i r t I I i f imi • i 105342 150

TAULUKKO XII

BDNF- ja NGF-pitoisuuskäyrät MPP*-toksisuuskokeissa 5 Käsittely Elinkelpoisten solujen määrä (%) COS-MOCK (1:2) 13 10 (1:5) 5 (1:10) 3 (1:20) 6 (1:50) 7 (1:100) 2 15 COS-BDNF (1:2) 73 (1:5) 67 (1:10) 65 (1:20) 42 20 (1:50) 30 (1:100) 25 «

« » i • I I I

:...: COS-NGF (1:2) 88 (1:5) 84 :*\fe5 (1:10) 63 · (1:20) 50 (1:50) 47 (1:100) 34 t ····« ' 1 ' “ ' “ — " 11 v .'..30 < · i

Ventraalimensenkefalonviljelmistä saatava tieto osoittaa, !,·,! että BDNF:llä oli huomattava suojaava vaikutus MPP*-toksi-suutta vastaan, ja bFGF:llä heikompi vaikutus (kuvio 38). MPP*-käsittelyn havaittin vähentävän tyrosiinihydroksy- .35 laasipositiivisten neuronien määrää 85 % verrokkiviljelmis-sä, mutta vain 40 % viljelmissä, jotka oli käsitelty

• · I

105342 151 BDNF:llä ennen altistusta MPP+:lle. MPP1:n oletetaan olevan aktiivinen metaboliitti MPTP-toksiinille, jonka on havaittu aiheuttavan Parkinsonin taudin kaltaisen oireyhtymän in vivo, ja joka on hyväksytty mallisysteemi Parkinsonin 5 taudille. BDNF:n ja NT-3:n suojaava vaikutus viittaa siihen, että nämä yhdisteet saattavat olla käyttökelpoisia Parkinsonin taudin hoidossa tai toksisille aineille altis-tumisesta johtuvan neurologisen vahingoittumisen estämisessä.

10 21. Mikro-organismien talletus

Seuraavat yhdistelmä-bakteriofagit ja yhdistelmä-plasmidi-DNA talletettiin 30. elokuuta 1989 American Type Culture 15 Collection -talletuslaitokseen (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852):

Talletusnumero ATCC

phBDNF-C-1 40648 20 XhBDNF-G-l 40649 ·:· Tämä keksintö ei rajoitu kuvattuihin erityisiin toteutus-muotoihin. Annetusta kuvauksesta ja oheen liitetyistä ku- • · · ....25 vioista alan asiantuntija pystyy luomaan muitakin muunnel-.·. : mia kuin tässä kuvatut. Myös tällaisten muutosten on kat-

• M

sottava kuuluvan patenttivaatimusten piiriin.

• · • ·« • · · 1 1 Kuvauksessa on viitattu useisiin julkaisuihin. Ne on kaik-30 ki oheenliitetty kokonaisuudessaan.

• · > ··· * · · · • · · m • · · « · « • · · * • a • · · * · φ • · « * i · ·

Claims (15)

152 1 0 5 3 4 2

1. Menetelmä proteiinin tai polypeptidin tuottamiseksi, jolla on aivoperäisen neurotrofisen tekijän (BDNF) aktiivi-5 suutta ja seuraavanlainen aminohapposekvenssi: His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Vai Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Vai Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Vai Asp Met Ser Gly Gly Thr Vai Thr

2. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA on kuten on esitetty kuvassa 5 tai on sen ala- - sekvenssi, joka koodaa BDNF-aktiivisuutta omaavaa polypepti- diä. 10

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA on kuten phBDNF-C-1:een sisältyvä, joka on talletettu ATCC:hen talletusnumerolla 40648, tai kuten XBDNF-G-1:een sisältyvä, joka on talletettu ATCC:hen talle- 15 tusnumerolla 40649.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA on säätely-DNA-sekvenssin kontrollin alaisena. 20

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tun-nettu siitä, että DNA-sekvenssi on sisällytetty vektoriin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu sii- : 25 tä, että vektori on phBDNF-C-Ι, joka on talletettu ATCC:hen * · talletusnumerolla 40648, tai XBDNF-G-l, joka on talletettu • « ATCC:hen talletusnumerolla 40649. • · ·

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tun-30 nettu siitä, että isäntäsolu on eukaryoottinen solu tai pro- • · · ' karyoottinen solu. • » • · · • ·

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu sii- I i · ' . tä, että prokaryoottinen solu on bakteeri. I 35

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eukaryoottinen solu on hiiva. 105342 154

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eukaryoottinen solu on kiinanhamsterin munasolu (CHO). 5

10 Vai Leu Glu Lys Vai Pro Vai Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe

15 Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg; tai His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Vai Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Vai Thr Ala Ala Asp

20 Lys Lys Thr Ala Vai Asp Met Ser Gly Gly Thr Vai Thr Vai Leu Glu Lys Vai Pro Vai Ser Lys Gly Gin Leu Lys .:. Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr .···. Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Arg Ala . . 25 Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe '· Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Thr Leu Thr Ile ] * Lys Arg Gly; tai • · · • · « Met His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser : 30 Vai Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Vai Thr Ala Ala Asp :T: Lys Lys Thr Ala Vai Asp Met Ser Gly Gly Thr Vai Thr . Vai Leu Glu Lys Vai Pro Vai Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp

35 Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg, 105342 153 tunnettu siitä, että menetelmässä ilmennetään mainittua proteiinia koodaavaa DNA:ta, tai tälle DNA:lie homologista tai komplementaarista DNA:ta, isäntäsolussa ja eristetään ilmentynyt BDNF-proteiini tai -polypeptidi. 5

11. BDNF-proteiinin tai -polypeptidin, joka on saatu jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukaisella menetelmällä, käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamisessa yhdistämällä BDNF-proteiini tai -polypeptidi farmaseuttisesti hyväksyttä- 10 vän kantajan kanssa.

12. Oleellisesti puhdistetun, eristetyn ja denaturoimattoman proteiinin, jolla on patenttivaatimuksen 1 mukainen aminohapposekvenssi, käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmista- 15 misessa yhdistämällä proteiini farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kantaja on hitaasti vapauttava kantaja. 20

14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että lisäksi yhdistetään proteiini tai polypeptidi ]·”, toisen aineen kanssa. • · · . . 25

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen käyttö, tunnettu siitä, • c · '· '1 että toinen aine on hermokasvutekijä tai toinen jäsen ' 1 BNF/NGF (Brain Derived Neurotrophic Factor / Nerve Growth • · · ·.· · Factor) -perheestä. • · · • · · 1 ·.’ · 30 • · · • · · • · 1 r • · • · · • · C C t I 155 1 0 5 3 4 2