SK279668B6 - Rekombinantná molekula dna s kódovým reťazcom nukl - Google Patents

Description

Vynález sa týka sekvencií nukleových kyselín kódujúcich neurotrofný faktor z mozgu (BDNF), ako aj BDNF, jeho podsekvencií. Vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov s obsahom BDNF proteínu alebo jeho subsekvencií spôsobu diagnózy a liečby celého radu neurologických ochorení a porúch vrátane Alzheimerovej choroby a Parkinsonovej choroby. Proteíny a podsekvenie BDNF podľa vynálezu majú zvlášť veľký význam na diagnózu a liečbu porúch dopaminergných neurónov, ako je Parkinsonova choroba a porúch senzorických neurónov, ako aj degeneratívnych ochorení sietnice.

Doterajší stav techniky

Odumieranie neurónov a úloha neurotrofných faktorov pri vývoji nervového systému

V mnohých častiach nervového systému stavovcov je prítomných v priebehu počiatočného štádia vývoja oveľa viacej neurónov než je tomu u dospelého živočícha. Obdobie počiatočného vývoja je charakterizované vlnami prirodzene sa vyskytujúceho uhynutia neurónov (Carr a Simpson. 1978, J. Comp. Neurol. 727 až 740, Cowan a ďalší, 1984, Science 225: 1258 až 1265). Prežitie, diferenciácia a dozrievanie vyvíjajúcich sa neurónov môže byť riadené skôr vonkajšími alebo epigenetickými faktormi než presným vnútorným genetickým programom. Napríklad pri experimentálnych manipuláciách s kuracím embryom je možné dokázať, že pri transplantácii alebo extirpácii periférnych cieľových oblastí, napríklad oka v počiatočnom štádiu vývoja kurčaťa môže dôjsť k tomu, že zodpovedajúcim spôsobom stúpne alebo poklesne počet senzorických, sympatických, parasympatických alebo motorických neurónov v blízkosti zväčšeného alebo zmenšeného cieľového poľa (Hamburger, 1934, J. Exp. Zocl. 68:449, Hollyday a Hamburger, 1976, J. Celí. Biol. 68:357 až 374). Cieľová oblasť môže podporovať len obmedzený počet neurónov a bežnou časťou procesu je obmedzenie prebytočného počtu neurónov tak, aby zodpovedal neurotrofhej kapacite cieľového tkaniva. Objav a izolácia bielkoviny NGF (nervový rastový faktor) viedol k molekulárnej hypotéze, že cieľové tkanivo môže byť schopné regulovať počet neurónov, ktoré prežijú a inervujú ho (Levi-Montalcini a ďalší, 1968, Physiol. Rev. 48:524 až 569, Thoenen a Barde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284 až 1335).

Teraz je aspoň pre periférny nervový systém zrejmé, že cieľové tkanivo produkuje a uvoľňuje obmedzené množstvo rôznych neurotrofných molekúl, ktoré sú kritické na prežitie špecifických typov neurónov (Korsching a Thoenen, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3513 až 3516, Heumann a ďalší, 1984, EMBO J. 3:3183 až 3189, Shelton a Reichardt, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7051 až 7955, Korsching a Thoenen, 1985, Neurosci Lett. 54:201 až 205).

Nervový rastový faktor (NGF)

Nervový rastový faktor (NGF) je až dosiaľ najúplnejšie charakterizovanou molekulou z uvedenej skupiny a in vivo aj in vitro bolo dokázané, že ide o látku, podstatnú na prežitie sympatických a senzorických neurónov v priebehu počiatočného obdobia vývoja embryí kurčaťa a potkana (Levi-Montalcini a Angeletti, 1963, Develop. Biol. 7:653 až 659, Levi-Montalcini a ďalší, 1968, Physiol. Rev. 48:524 až 569). Injekcie čisteného NGF do vyvíjajúceho sa kuracieho embrya spôsobili masívnu hyperplaziu a hypertrofiu spinálnych senzorických neurónov a sympatických neurónov (Levi-Montalcini a Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sci USA 46:373 až 384, Hamburger a ďalší, 1981, J. Neurosci. 1:60 až 71). Na druhej strane bolo možné odstránením alebo vyčerpaním NGF podávaním protilátok novorodeným potkanom dennými injekciami spôsobiť praktickú deštrukciu sympatického nervového systému (LeviMontalcini a Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:384 až 391, Levi-Montalcini a Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18:619 až 628). Vystavenie účinku protilátok ešte skôr vo vývoji buď podávaním protilátok injekčné in utero alebo pasívnym transplacentámym prenosom materských protilátok malo za následok podstatnú stratu senzorických neurónov, odvodených od nervovej ryhy, ako spinálnych a dorzomediálnych senzorických neurónov trigemínu (Goedert a ďalší, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:1580 až 1584, Gorin a Johnson, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 až 5382 až 5386). Až dosiaľ boli všetky štúdie týkajúce sa NGF zamerané na úlohu tejto látky v periférnom nervovom systéme, ale teraz je zrejmé, že NGF tiež ovplyvňuje udržanie a vývoj špecifických populácií neurónov v centrálnom nervovom systéme (Thoenen a ďalší, 1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109 až 145 až 178, Whittemore a Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439 až 464).

Objav väčšieho množstva NGF v podčeľusťovej žľaze dospelých myšacích samcov (Cohen, 1960, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:302 až 311) a skorší objav vysokého množstva NGF v jede hadov (Cohen a Levi-Montalcini, 1956, Proc. Natl. Acad. Sci USA 42:571 až 574) poskytol dostatočné množstvo NGF pre štúdie fyziológie, chémie a v poslednom období aj molekulárnej biológie NGF, (t. j. molekulárne klonovanie NGF a jeho receptora). Funkcia veľkého množstva NGF v slinnej žľaze myšacích samcov zostáva neznáma. Zdá sa však, že tento bohatý zdroj NGF zrejme nehrá žiadnu úlohu pri vývoji alebo udržiavaní periférneho alebo centrálneho nervového systému. V cieľových tkanivách, inervovaných neurónmi, citlivými na NGF (neuróny, ktoré sú na NGF závislé pokiaľ ide o prežitie a obsahujú receptory s vysokou afinitou k NGF a tiež zaisťujú retrográdny špecifický transport NGF) bolo zistené veľmi nízke stále množstvo NGF, rádu pikogramu alebo nanogramu na gram tkaniva v porovnaní s tisíckrát vyšším množstvom v slinnej žľaze dospelých myšacích samcov. NGF nebol dokázaný vo väčšom množstve v sére a zrejme nie je obehovým rastovým faktorom alebo hormónom (Suda a ďalší, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci USA 75:4042 až 4046).

Okrem dôležitého objavu hlavného zdroja NGF v slinnej žľaze myší mal vývoj citlivej, jednoduchej a účinnej metódy pre biologický výskum NGF veľkú úlohu pri vysvetlení biológie a biochémie tejto látky. Gangliá dorzálnych koreňov (DRG) vyvíjajúceho sa kuracieho embrya boli jedným z neuronálnych tkanív, ktoré zodpovedali in vitro na NGF. Kultúry explantátov E8 až E12 DRG kurčaťa v plazme a neskoršie disociované kultúry DGR kurčaťa, obohatené o neuróny boli veľmi vhodné na biologické skúšky na účinnosť NGF (napr. pri čistení) a pre štúdie biológie NGF in vitro Levi-Montalcini a ďalší, 1954, Cancer Res. 4:49 až 57, Levi-Montalcini a Angeletti, 1963, Develop. Biol. 58:96 a 58 až 106. Skutočnosť, že je dnes možné z jediného kuracieho embrya vybrať viac než 40 DRG viedla k širokému použitiu biologických skúšok pre NGF v mnohých laboratóriách.

Okrem dostupnosti veľkého množstva NGF a systému na dôkaz tejto látky bola tretím hlavným faktorom prispievajúcim k porozumeniu biológie NGF, pomerná ľahkosť, s ktorou je možné získať protilátky proti NGF morčaťa, králika, ovce a podobne. Najmä myš tvorí veľmi ľahko protilátky proti NGF. Cohen (1960, Proc. Natl. Acad. Sci USA 46:302 až 311) získal protilátky proti NGF, čistenému z myší podčeľusťovej žľazy a dokázal spoločne s LeviMontalcinim a Bookerom (1960, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:384 až 391), že tieto protilátky spôsobujú deštrukciu sympatických ganglií, čiže imunologickú sympatektómiu pri dennom podávaní novorodeným potkanom (Levi-Montalcini a Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18:619 až 628).

Dostatočné množstvo NGF umožnilo stanovenie primárneho reťazca pomerne bežným postupom chémie bielkovín (Angeletti a Bradshaw, 1971, Proc. Natl. Acad. Sci USA 68:2417 až 2420). Teraz bol gén pre NGF klonovaný z radu druhov vrátane myši (Scott a ďalší, 1983, Náture 302:538 až 540), človeka (Ullrich a ďalší, 1983, Náture 303:821 až 825), kravy a kurčaťa (Meier a ďalší, 1986, EMBO J., 5:1489 až 1493) a potkana (Whittemore a ďalší, 1988, J. Neurosci. Res. 20:402 až 410) s použitím bežných metód molekulárnej biológie v závislosti od dostupnosti reťazca aminokyselín pre NGF myši, takže bolo možné pripraviť oligonukleotidové sondy. Dostupnosť väčších množstiev NGF tiež podstatne uľahčila štúdie receptorov NGF, čo viedlo k molekulárnemu klonovaniu receptora NGF u človeka a potkana (Johnson a ďalší, 1986, Celí, 47:545 až 554, Radeke a ďalší, 1987, Náture 325:593 až 597).

Teraz už je dokázané, že NGF nie je všadeprítomný neurotrofný faktor. Pokiaľ ide o periférne nervy, nie je NGF zrejme faktorom nevyhnutným na prežitie parasympatických neurónov, senzorických neurónov z prednej časti sústavy a enterických neurónov, ako bolo dokázané in vitro a in vivo. Okrem toho zrejme nie je nutný na prežitie vyvíjajúcich sa motorických neurónov (Oppenheim, 1982, J. Comp. Neurol. 210:174 až 189), napriek tomu pri týchto neurónoch dochádza aspoň k expresii receptora pre NGF s nízkou afinitou v priebehu vývoja (Raivich a ďalší, 1985, EMBO J., 4: 637 až 644). Neprítomnosť účinku NGF na tieto typy neurónov urýchlila hľadanie ďalších neurotrofných faktorov, ktoré by podporovali prežívanie motorických neurónov miechy a/alebo parasympatických neurónov ganglion ciliare.

Ďalšie neurotrofné faktory

V poslednom desaťročí bol podaný celý rad správ o neurotrofnej účinnosti v extraktoch najrôznejších tkanív a v živnom prostredí rôznych typov buniek. Ale takmer vo všetkých prípadoch bol pokrok v čistení a charakterizácii obsiahnutých látok brzdený skutočnosťou, že tieto látky sú prítomné v nesmieme malých množstvách, zvyčajne rádu pikogramu alebo nanogramu na gram tkaniva.

Okrem toho boli síce navrhnuté vhodné biologické skúšky pre periférne neuróny, ale skúšky pre centrálny nervový systém, ktoré by boli špecifické a poskytovali reprodukovateľné výsledky narážajú na celý rad problémov. Jednotlivé typy periférnych neurónov je možné nájsť ako oddelené, ľahko vyberateľné gangliá, ale neuróny CNS sú vo svojej distribúcii vysoko heterogénne. Je nutné použiť špecifické značenie na ich identifikáciu alebo na obohatenie o určité typy neurónov CNS. Pokrok pri tomto značení, napríklad pomocou protilátok proti povrchu buniek alebo zložkám bunky alebo špecifické histologické farbenie je zatiaľ veľmi obmedzený. Súhrne je možné uviesť, že charakterizácia neurotrofných faktorov, ktoré i) sa nevyskytujú a takom množstve ako NGF, ii) ťažko sa dokazujú a iii) nie sú dostupné v dostatočnom množstve na vyvolanie tvorby protilátok, je nesmieme ťažkým postupom.

Porovnanie rastového faktora z mozgu s nervovým rastovým faktorom

Neurotrofná účinnosť schopná udržať pri živote neuróny dorzálnych koreňov ganglií kuracieho embrya in vitro bola identifikovaná v upravenom prostredí, v ktorom boli pestované bunky potkanieho gliómu C-6 (Barde a ďalší, 1978, Náture 274:818). Táto účinnosť nebola neutralizovaná protilátkami proti myšaciemu NGF, čo znamená pravdepodobnú prítomnosť iného neurotroíhého faktora v tomto prostredí. Podobný účinok, ktorý nebolo možné blokovať protilátkami proti NGF bol dokázaný aj v kultúrach astrogliálnych buniek normálneho mozgu dospelých potkanov (Lindsay 1979, Náture 282:80 až 82, Lindsay a ďalší, 1982, Brain Res. 243:329 až 343) a v extraktoch vyvíjajúceho sa a dospelého mozgu potkanov (Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1199 až 1203) a vyvíjajúcej sa a dospelej kuracej miechy (Lindsay a Peters

1984, Neurosci. 12:45 až 51). Ale v žiadnom prípade neboli účinné faktory izolované ani identifikované a zostáva pochybné, či pozorovaná účinnosť bola dôsledkom prítomnosti jedného alebo väčšieho počtu rôznych faktorov.

Pri použití mozgu prasaťa ako východiskového materiálu podali Barde a ďalší (1982, EMBO J., 1:549 až 553) správu o faktore, ktorý sa teraz nazýva mozgovým neurotrofným faktorom (BDNF) a ktorý podporuje prežitie neurónov dorzálnych koreňov ganglií kuracích embryí E10/E11. Neurotrofná účinnosť bola dokázaná pre vysoko bázickú bielkovinu (izoelektrický bod, pi 10,1), ktorá migrovala pri elektroforéze na géli s dodecylsíranom sodným (SDS) ako jednotný pás s molekulovou hmotnosťou 12,3 kjednotky. Purifikačný faktor bol 1,4 x liÄ ale výťažok bol veľmi nízky, približne Jen 1 pg BDNF z 1,5 kg mozgu prasaťa. Okrem toho vzhľadom na to, že posledným stupňom pri čistení tejto látky bola preparatívna elektroforéza na géli, nebolo možné účinnosť BDNF celkom renaturovať vzhľadom na prítomnosť zvyškov SDS (Barde a Thoenen,

1985, Hormones and Celí Regulation, zv. 9, Dumont a ďalší, Elsevier Science Publishers, str. 385 až 390). Bolo uvedené, že vysoko bázická povaha a molekulová hmotnosť BDNF boli veľmi blízke monoméru NGF. Ale BDNF má vlastnosti, ktoré sú odlišné od známych vlastností NGF v tom zmysle, že

a) pri biologickom pokuse s dorzálnymi koreňmi kuracích ganglií nie je možné pozorovať zjavný účinok protilátok proti NGF na účinnosť BDNF,

b) v tom istom pokuse bol účinok BDNF a NGF aditívny a

c) na rozdiel od NGF nemá BDNF žiadny účinok na prežitie sympatických neurónov kurčiat E12.

Okrem toho v priebehu štúdií s extraktmi z mozgu bolo pozorované, že neurotrofná účinnosť z týchto zdrojov zrejme pôsobí na senzorické neuróny v neskoršom štádiu vývoja než v prípade NGF. Pri použití disociovaných kultúr neurónov kuracieho embrya pestovaných na polykatió3

SK 279668 Β6 novom substráte, ako polylyzíne alebo polyomitíne bolo dokázané, že BDNF umožnil prežitie viacej než 30 % E ΙΟΙ 1 (embryonálny deň 10 alebo 11) neurónov dorzálnych koreňových ganglií, ale pravdepodobne mal len malý vplyv na prežitie tých istých neurónov v E6 (Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1199 až 1203). Za podobných podmienok podporuje NGF prežitie 30 až 40 % E6 neurónov DRG. Je zaujímavé, že neskoršie bolo zistené, že pri pestovaní substrátu, potiahnutého extracelulámou matricou glykoproteínu laminínu podporoval tak NGF, ako aj BDNF prežitie približne 50 % neurónov DRG kuracích embryí vo veku E6 až E12 (Lindsay a ďalší, 1985, Develop. Biol. 112, 319 až 328). V tejto publikácii sa uvádza, že účinok NGF a BDNF je aditívny v prípade, že obe tieto látky sú prítomné v sýtiacich koncentráciách.

Skoršie štúdie podľa publikácie Levi-Montalcini, 1966, The Harvey Lectures 60, 217 až 259, týkajúce sa špecifickosti NGF a účinkov tejto látky na neuróny uvádzajú, že NGF zrejme nie je všadeprítomným neurotrofným faktorom, ani pre senzorické neuróny vzhľadom na to, že táto látka nemá žiadny účinok na neuróny v niektorých senzorických hlavových gangliách kuraťa, najmä v ganglion nodosum desiateho hlavového nervu. Pri neskorších štúdiách in vivo (Johnson a ďalší, 1980, Science 210, 916 až 918; Pearson a ďalší, 1983, Develop. Biol. 96, 32 až 36) bolo dokázané, že deprivácia NGF v priebehu embryogenézy nemala žiadny vplyv na prežitie neurónov vo väčšine kraniálnych senzorických gangliách potkana, zatiaľ čo to isté opatrenie viedlo k veľkej deplecii počtu neurónov v senzorických gangliách, odvodených od neurálnej ryhy. Pri podrobnejších štúdiách in vitro (Lindsay a Rohrer, 1985, Develop. Biol. 112, 30 až 48, Davies a Linsay, 1985, Develop. Biol. 111, 62 až 72 a Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí Sci. Suppl. 3, 115 až 129) sa jasne ukázalo, že NGF podporuje prežitie väčšiny senzorických neurónov, odvodených od neurálnej ryhy, ale nemá žiadny zjavný účinok na prežitie kraniálnych senzorických neurónov, odvodených od hlavovej časti zárodkového listu.

Prvým dôkazom špecifickosti BDNF pre neuróny, odlišnej od NGF bola skutočnosť, že in vitro bolo možné dokázať, že čistený BDNF podporuje prežitie 40 až 50 % senzorických neurónov, disociovaných od ganglion nodosum, odvodeného u kuracieho embry a od hlavovej časti zárodkového listu v štádiu E6, E9 alebo E12 (Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí Sci. Supp. 3, 115 až 129). NGF nemal na tieto neuróny žiadny zjavný účinok ani sám o sebe, ani v spojení s BDNF. Ako bolo ďalej dokázané pri použití kultúr explantátov, BDNF zrejme podporuje prežitie a rast neuritov z ostatných senzorických ganglií vrátane ganglion petrosum, geniculatum a ventrolaterale trigeminu (Davies a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6, 1897 až 1904) žiadne z uvedených ganglií nebolo citlivé na NGF. Vo všetkých uvedených štúdiách nemali neutralizačné protilátky proti NGF žiadny vplyv na pozorovaný účinok BDNF. Okrem pozorovaných účinkov na neuróny z periťémych ganglií v kultúre bolo dokázané, že BDNF tiež stimuluje prežitie a diferenciáciu neurónových buniek z neurálnej ryhy prepelice (Kalcheim a Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41, 79 až 86.

Až dosiaľ brzdila nemožnosť získať dostatočné množstvo BDNF na imunizáciu produkcie protilátok proti BDNF na porovnanie s protilátkami proti NGF v ich účinku na neuróny a tiež nebolo možné vykonať pokusy so skríženou neutralizáciou NGF a BDNF. Teraz však opisujú dve publikácie a to Kalcheim a ďalší, 1987, Embo J., 6, 2871 až 2873 a Hofer a Barde, 1988, Náture 331, 261 až 262) fyziologickú úlohu BDNF vtákov. V prípade, že sa uloží vo vajci mechanická prekážka medzi dorzálne koreňové gangliá v dňoch E3/E4 a ich cieľ v CNS v nervovej trubici, je možné pozorovať, že celý rad neurónov týchto ganglií zahynie (Kalcheim a Le Douarin, 1986, Develop. Biol. 116, 451 až 466. Predpokladá sa, že toto uhynutie neurónov by mohlo byť spôsobené nedostatkom neurotrofného faktora z CNS (nervová trubica). Bolo ďalej pozorované, že BDNF v spojení s membránou opatrenou povlakom laminínu môže zabrániť tomuto uhynutiu buniek (Kalcheim a ďalší, Embo J., 6, 2871 až 2873). Po vstreknutí BDNF do vyvíjaj ícich sa prepeličích vajec potláča prirodzené uhynutie v ganglion nodosum, čo nie je možné dokázať pre NGF (Hofer a Barde, 1988, Náture 331, 261 až 262).

Okrem účinku na periférne senzorické neuróny v nervovej ryhe aj v hlavovej časti podporuje BDNF prežívanie vyvíjajúcich sa neurónov CNS. Johnson a ďalší (1986, J. Neurosci. 6, 3031 až 3938) uverejnili údaje, ktoré dokazujú, že BDNF podporuje prežitie retinálnych gangiiových buniek z potkaních embryí E17. Tým sú rozšírené skoršie poznatky, ktoré dokázali, že niektoré upravené prostredia a extrakty z mozgu, pripravené z cieľových oblasti retinálnych gangiiových buniek podporovali prežívanie týchto neurónov (McCaffery a ďalší, 1982, Ex. Brain. Res. 48, 37 až 386, Sarthy a ďalší, 1983, J. Neurosci. 3, 2532 až 2544, Tumer a ďalší, 1983, Dev. Brain Res. 6, 77 až 83).

Okrem účinkov na prežitie vyvíjajúcich sa neurónov v kultúre má BDNF tiež zrelé neuróny periférneho aj centrálneho nervového systému v kultúre. Bolo dokázané, že BDNF, rovnako ako NGF, stimuluje regeneráciu axónov z neurónov DRG dospelých potkanov v kultúre (Lindsay, 1988, J. Neurosci. 8, 2394 až 2405), napriek tomu, že zrelé senzorické neuróny zrejme nevyžadujú na svoje prežitie v kultúre in vitro na 3 alebo 4 týždne neurotrofné faktory. Okrem toho v kultúre retinálnych buniek dospelých potkanoch bolo pozorované, že BDNF podporuje tak prežitie, ako aj predĺženie axónov z gangiiových buniek sietnice (Thanos a ďalší, 1989, Eur. J. Neurosci. 1, 19 až 26). Porovnanie biologických účinkov NGF a BDNF je zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 1.

Tabuľka I

Porovnanie biologickej účinnosti BDNF a NGF^X

Prežitie Periférny nervový systém BDNF NGF

i) E6 DRG kurčaťa -++

E10 DRG kurčaťa++

E12 symp. kurčaťa (Barde a ďalíí, 1980, vyššie) -++ ii) E6-E12 DRG kurčaťa ++++

E8-E12 nodosum kurčaťa*+

E12 symp. kurčaťa -++

E12 dliámy g. kurčaťa (Lindsay a další, 1985, vyššie) iii) E3-E14 kurčaťa:

SK 279668 Β6

jugulare	+/++ ++
DM-trigemini	+/++ ++
petrosum	+/++
geniculatum	+/++
VL-trigemini	++
vestibulare	-
mesencephalicum	++
(Davies a ďalší, 1986, vyššie,
Barde a ďalší, 1987, Prog.,
Brain Res., 71:185 až 198)
Centrálny nervový systém
i) E177 gangliové bunky sietnice
potkana	++
(Johnson a ďalší, 1986,
J. Neurosci. 6:3031 až 3038)

Poznámky k tabuľke:

^x v chronologickom poradí podľa dátumu zverejnenia, účinky boli skúmané in vitro ^xx žiadne prežitie (-), malý počet prežití (+), dobré prežitie (++)

Cieľové neuróny pre neurotrofné faktory odvodené od mozgu

Senzorické neuróny periférnych nervových ganglií pochádzajú z niektorej z dvoch od seba odlišných prechodných embryonálnych štruktúr, z ktorých jedna je nervová ryha a druhá z týchto štruktúr je zväčšená kraniálna časť tejto ryhy vo forme doštičiek. Nervová ryha dáva vznik tak neurónom, ako aj satelitným bunkám autonómnych ganglií a spinálnym senzorickým gangliám, t. j. DRG. Príspevok oboch uvedených štruktúr na tvorbu senzorických ganglií kraniálnych nervov bol študovaný s použitím transplantačného chimémeho systému prepelica/kurča, podľa publikácie Le Douarin, 1973, Develop. Biol. 20:217 až 222, Noden, 1978, Develop. Biol. 67:313 až 329, Narayan a Narayan, 1980, Anat. Rec. 196:71 až 82, Ayer-Le Lievre a Le Douarin, 1982, Develop. Biol. 94: 291 až 310, D'AmicoMartel a Noden, 1983, Am. J. Anat. Rec. 196:445 až 468). V zhrňujúcej publikácii Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí Sci. Supp. 3:115 až 129 sa uvádza, že aspoň pri vtákoch pochádzajú neuróny distálnych ganglií kraniálnych nervov VII, IX a X (ganglion geniculatum, petrosum a nodosum) a neuróny vestibuláme-akustického komplexu VIII kraniálneho nervu výlučne z hlavovej časti. Trigeminálny ganglion V. kraniálneho nervu obsahuje neuróny z oboch uvedených štruktúr, pričom neuróny z hlavovej časti je možné nájsť prevažne vo ventrolaterálnej časti maxillomandibulámeho laloku, zatiaľ čo satelitné bunky všetkých kraniálnych ganglií majú svoj pôvod zrejme výlučne v nervovej ryhe.

Z pokusov in vitro, pri ktorých boli použité tak explantáty, ako aj disociované neuróny obohatenej kultúry senzorických neurónov miechy a mozgu je zrejmé, že senzorické neuróny z nervovej ryhy odpovedajú na pôsobenie NGF. Na rozdiel od toho, odpovedajú neuróny, ktorých pôvod je v hlavovej časti vrátane neurónov ventrolaterálnej časti ganglia trigeminu a celé populácie neurónov z ganglion vestibulare, geniculatum, petrosum a nodosum v podstate neodpovedajú na pôsobenie NGF v priebehu svojho emryonálneho vývoja. Napriek rozdielom v požiadavkách a v odpovedi na NGF, ako je zrejmé z tabuľky 1, sú oba tieto typy neurónov citlivé na účinky BDNF, a to tak pokiaľ ide o prežitie, ako aj pokiaľ ide o vplyv na tvorbu neuritov (Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí. Sci. Supp. 3:115 až 129, Lindsay a ďalší, 1985, Develop. Biol. 112:319 až 328, Kalcheim a Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41:79 až 86). Tebar a Barde (1988, J: Neurosci. 8:3337 až 3342) študovali väzbové parametre rádioaktívne značeného BDNF na neurónoch ganglií dorzálnych koreňov kurčaťa. Ich výsledky sú v súlade s výsledkami, ktoré dokazujú existenciu dvoch skupín receptorov BDNF, z ktorých jedna má vysokú afinitu pre BDNF a druhá afinitu nízku. V prípade sympatických nervov neboli pozorované žiadne receptory s vysokou afinitou.

Známe neurónové ciele pre BDNF boli zhrnuté v publikácii Barde a ďalší, 1987, Prog. Brain Res. 71:185 až 189. Pred existenciou tohto vynálezu nebolo možné vykonávať identifikáciu buniek, syntetizujúcich BDNF vzhľadom na to, že neboli k dispozícii sondy typu nukleových kyselín alebo protilátok, špecifických proti BDNF. Pokusy pripraviť polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok proti BDNF boli neúspešné. Tento neúspech zabrzdil molekulárne klonovanie BDNF, stanovenie fyziologického účinku nedostatku BDNF in vivo na vyvíjajúce sa neuróny, kvantitatívne stanovenie BDNF v tkanivách pomocou imunologických skúšok a lokalizáciu BDNF pri použití imunocytochémie.

V nasledujúcej tabuľke II sú uvedené neuróny podľa svojej odpovede na BDNF.

Tabuľka II

Neuróny, odpovedajúce a neodpovedajúce na BDNF^X

A. Odpovedajúce neuróny

I. Senzorické neuróny kurčaťa z nervovej ryhy v

a) gangliách dorzálnych koreňov

b) ganglion jugulare

c) dorzomediálnom gangliu trigeminu

d) mesencefalickom jadre trigeminu^xx

II. Senzorické neuróny kurčaťa z ektodermálnej doštičky

a) ganglion nodosum

b) ganglion vestibulare

c) ganglion petrosum

d) ganglion geniculatum

e) ventrolaterálny ganglion trigeminu

III. Gangliové bunky sietnice potkanov

IV. Gangliové bunky sietnice kurčaťa^xxx

B. Neodpovedajúce neuróny

I. Neuróny sympatiku kurčaťa a potkana

II. Parasympatické ciliáme neuróny kurčaťa ^x Barde a ďalší, 1987, Prog. Brain Res. 71:185 až 189 ^xx Davies a ďalší, 1986, Náture 319:497 až 499 ^xxx Rodriguez-Tebar a ďalší, 1989, Dev. Biol. 136:296 až 303

Klonovanie génu pre neurotrofný faktor z mozgu

Kolonovanie génu pre BDNF bolo prvýkrát vykonané postupom, opísaným v US patentovej prihláške č. 07/400,591, podanej 30. augusta 1989. Najskôr boli čistené malé množstvá BDNF z mozgu prasaťa, čím bolo možné stanoviť fragmenty reťazcov aminokyselín, ktoré potom bolo možné použiť na stanovenie zodpovedajúcich reťazcov oligonukleotidov. Tieto syntetické oligonukleotidy boli potom použité ako priméry pri reakciách, založených na polymeráze (PCR) s použitím cDNA templátu, pripraveného z buniek, produkujúcich BDNF. Produkty, získané

PCR boli použité ako sondy, umožňujúce klonovanie úplnej cDNA a/alebo génov pre BDNF genómu z rôznych druhov živočíchov vrátane človeka, prasaťa, potkana, myši, reťazce týchto génov boli taktiež stanovené. Expresia rekombinantného BDNF bola dosiahnutá v bunkách COS.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú sekvencie nukleových kyselín kódujúcich neurotrofný faktor, odvodený od mozgu (BDNF), ako aj proteíny BDNF, jeho podsekvencie , ktoré majú BDNF aktivitu. Vynález prvýkrát umožňuje získanie dostatočného množstva BDNF na výrobu protilátok proti BDNF a na diagnostické a liečebné použitie tejto látky.

V rôznych uskutočneniach vynálezu je možné využiť nukleové kyseliny pre BDNF, samotný BDNF, jeho podsekvencie na diagnózu a liečenie rôznych neurologických ochorení a porúch, najmä na diagnózu a liečenie porúch senzorických neurónov a pri degenerácii sietnice. Okrem toho je v špecifických uskutočneniach možné využiť nukleové kyseliny alebo proteíny a podsekvencie podľa vynálezu na diagnostikovanie a liečenie neuroblastomu, Parkinsonovej choroby a Alzheimerovej choroby. BDNF proteíny alebo podsekvencie je tiež možné využiť na uľahčenie príjmu implantátov do nervového tkaniva alebo na vyvolanie regenerácie nervov po poranení, infarkte, infekcii alebo po operáciách.

Podstatu vynálezu tvoria aj farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú BDNF proteíny alebo podsekvencie podľa vynálezu, ktoré je možné využiť na diagnostikovanie alebo na liečenie rôznych neurologických ochorení a porúch.

Okrem toho je možné objasnením celého nukleotidového reťazca pre BDNF uskutočniť porovnanie génov pre BDNF a NGF, identifikovať homológne oblasti a definovať skupinu génov BDNF/NGF.

Skratky a definície pojmov

BDNF neurotrofný faktor odvodený od mozgového tkaniva hBDNF ľudský BDNF

CAT cholínacetyltransferáza

CNS centrálny nervový systém

DRG gangliá dorzálnych koreňov (ganglion)

EDTA kyselina etyléndiamíntetraoctová

NGF nervový rastový faktor

PBS fyziologický roztok NaCl s fosfátovým pufrom

PCR väzba reťazcov vyvolaná pomocou polymerázy

PNS periférny nervový systém

SDS dodecylsíran sodný tris tris(hydroxymetyl)aminometán

Ďalšou podstatou vynálezu sú reťazce nukleových kyselín, ktoré sú kódom pre neurotrofný faktor, odvodený od mozgu (BDNF) a tiež BDNF a ich podsekvencií s BDNF aktivitou, ktoré môžu byť získané vo väčšom množstve s použitím podsekvencií nukleových kyselín podľa vynálezu. Okrem toho sa vynález týka farmaceutických prostriedkov a liečebného použitia BDNF a prýkrát poskytuje prostriedky na získanie dostatočného množstva v podstate čistého BDNF na klinické použitie.

Na objasnenie opisu vynálezu, ale nie na jeho obmedzenie, bude teraz vynález opísaný v nasledujúcich odstavcoch:

i) čistenie BDNF ii) biologické skúšky na prítomnosť BDNF iii) stanovenie reťazca BDNF mikrometódami iv) kolonovanie kódovej DNA pre BDNF

v) expresia BDNF vi) gény pre BDNF a vlastný BDNF vii) tvorba protilátok proti BDNF viii) identifikácia ďalších členov skupiny génov BDNF/NGF ix) využitie vynálezu

x) farmaceutické prostriedky

Čistenie faktora odvodeného od mozgového tkaniva (BDNF)

Aby bolo možné identifikovať nukleovú kyselinu, ktorá je kódom pre BDNF, je možné získať z tkaniva mikrogramové množstvo tejto látky, aby bolo možné stanoviť reťazec aminokyselín, ktorý je potom možné použiť na konštrukciu oligonukleotidových sond. Výnimočná vzácnosť bielkoviny BDNF obmedzuje množstvo reťazcov aminokyselín, ktoré môže byť stanovené. BDNF je možné získať z mozgu prasaťa postupmi, ktoré boli opísané v publikácii Barde a ďalší, 1982, EMBO J., 1:549 až 553 alebo v publikácii Hofer a Barde, 1988, Náture 331:261 až 262.

Výhodne je možné BDNF pripraviť nasledujúcim spôsobom, ktorý bude opísaný ako príklad, ale nie na obmedzenie rôznych modifikácií, ktoré môže vykonať každý odborník v danej oblasti techniky. Vzhľadom na malé množstvo prirodzene sa vyskytujúceho BDNF je nutné použiť výhodne približne 6 kg mozgového tkaniva na čistiaci postup. Mozgové tkanivo môže byť homogenizované v pufri s fosforečnanom sodným v koncentrácii približne 0,2 M fosforečnanu sodného s pH približne 6 s obsahom 1 mM EDTA a 1 mM čerstvo pridaného fenylmetánsulfonylchloridu tak, aby pomer mozgového tkaniva a kvapaliny bol približne 1 kg tkaniva na 2 litre pufru. Potom je možné použiť kyselinu chlorovodíkovú na úpravu pH zmesi na hodnotu približne 4 a zmes sa potom mieša 2 hodiny pri teplote 4 °C. Potom je možné zmes odstrediť 25 minút pri 20 000 g. Po odstredení sa supematant oddelí, jeho pH sa upraví na hodnotu približne 6,0 s použitím hydroxidu sodného, potom sa supematant mieša s 1 litrom vopred nabobtnanej karboxymetylcelulózy (na 6 kg mozgového tkaniva) v rovnovážnom stave s 0,1 M fosforečnanom sodným s pH 6. Po niekoľkonásobnom premytí celkovým množstvom 20 litrov 0,1 M fosforečnanu sodného s pH 6 je možné suspenziu naliať do stĺpca a stĺpec premyť tým istým pufrom s obsahom 0,13 M chloridu sodného, najlepšie cez noc. Účinné frakcie, identifikované biologickou skúškou na BDNF (je uvedená ďalej) je potom možné vymyť fosfátovým pufrom s obsahom 0,5 M chloridu sodného a potom dialyzovať proti niekoľkokrát vymeneným približne 5 litrom 5 mM fosforečnanu draselného s pH 6,8. Dialyzované frakcie sa potom nanesú na stĺpec s obsahom hydroxyapatitu s objemom vrstvy 20 ml na každý kg spracovaného mozgového tkaniva. Hydroxyapatitový stĺpce má byť vopred uvedený do rovnovážneho stavu v 5 mM fosforečnanu draselného pri pH 6,8 pred nanesením vzorky. Potom sa stĺpec vymýva použitím lineárneho gradientu, ktorý je tvorený 500 ml 5 mM fosforečnanu draselného a 500 ml 700 mM fosforečnanu draselného, vždy s pH 6,8. BDNF sa vymýva pri koncentrácii fosforečnanu draselného 500 mM. Účinné frakcie sa spoja, ich molarita sa upraví na 700 mM fosforečnanu draselného a potom sa materiál nanesie na stĺpec s obsahom fenyl-sepharózy s objemom približne 5 ml na každých 6 kg spracovaného mozgového tkaniva, stĺpec je v rovnovážnom stave v 700 mM roztoku fosforečnanu draselného s pH 6,8. Po premytí približne 40 ml toho istého pufra je možné BDNF vymývať 0,1 M fosforečnanom draselným s pH 6,8 a potom je možné materiál dialyzovať proti destilovanej vode a potom lyofilizovať. Lyofilizovaný materiál sa potom rozpustí v pufri na vykonávanie elektroforézy na SDS-géli s obsahom 0,1 % SDS, ale výhodne bez obsahu merkaptoctanolu a potom sa vzorka nanesie na SDS-gél s lineárnym gradientom 10 až 25 % akrylamidu. Po skončenom elektroforetickom delení je možné gél farbiť približne 10 minút Coomassieovou modrou a potom 20 minút odfarbovať. Pás, ktorý migruje na úrovni značenia, vykonaného cytochrómom C je možné vystrihnúť a vymyť z gélu elektroforeticky. SDS je možné do značnej mieiy odstrániť podľa Webera a Kutera (1971, J. Biol. Chem. 246:4504 až 4509). Je nutné uviesť, že odstránenie SDS zvyčajne nie je úplné. Čistiaci postup na stanovenie reťazca BDNF bol modifikovaný podľa Hofera a Bardeho (1988, Náture 331:261 až 262) a nepoužíva sa pri ňom v poslednom stupni čistenia elektroforéza na géli.

Biologické skúšky na BDNF

Podľa vynálezu je možné na skúšky použiť akýkoľvek systém, ktorým je možné kvantitatívne alebo kvalitatívne dokázať účinnosť BDNF. Týmto spôsobom je možné identifikovať BDNF a/alebo merať účinnosť prírodného alebo rekombinantného BDNF.

Je možné použiť akékoľvek známe biologické skúšky na BDNF. Je napríklad možné použiť neuróny ganglií dorzálnych koreňov kuracích embryí (DRG), ako bolo opísané v publikácii Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1199 až 1203.

Pri tejto skúške sa napríklad gangliá dorzálnych koreňov 6 až 14 dní starých kuracích embryí, výhodne vo veku 10 až 12 dní odoberú známym spôsobom a okamžite sa uložia do malého objemu prostredia F14 (vyrobeného z práškového materiálu GIBCO F-12 podľa Vogel a ďalší, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3180 až 3184), toto prostredie sa potom nahradí PBS, t. j. fyziologickým roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom, zbaveným vápenatých a horečnatých iónov, s obsahom 0,1 % trypsínu. Po približne 20 minútach inkubácie pri teplote 37 °C sa gangliá odstredia a dvakrát sa premyjú prostredím F14 s obsahom približne 10 % objemových konského séra, inaktivovaného teplom. Potom je možné gangliá od seba oddeliť jemným rozotretím (približne 10 až 15 zdvihov) s použitím silikanizovanej Pasterovej pipety s priemerom približne 1 mm. Zvyšné zhluky tkaniva je potom možné odstrániť výhodne prechodom tkaniva cez silikónovú sieť s otvormi približne s priemerom 40 pm. Potom je možné suspenziu buniek predbežne pestovať 210 minút v tkanivovej miske z plastickej hmoty, v priebehu tohto času priľnú bunky odlišné od neurónov k povrchu plastickej hmoty a v suspenzii zostanú bunky, obohatené o neuróny. Potom je možné bunky zriediť na koncentráciu približne 5 x 10^ buniek v 1 ml prostredia, výhodne prostredia F14, doplneného 10 % objemovými konského séra, inaktivovaného teplom a doplneného antibiotikami, potom sa materiál uloží do misiek na tkanivové kultúry, potiahnutých polyomitínom alebo výhodne polyomitínom a laminínom.

V niektorých prípadoch môže byť výhodnejšie použiť systémy, ktoré sú citlivé na BDNF, ale relatívne necitlivé na NGF (uvedený systém DRG môže byť za určitých podmienok citlivý tak na BDNF, ako aj na NGF). Týmito pomerne špecifickými systémami pre BDNF sú retinálne gangliá a kultúry neurónov, odvodených od prednej časti nervového systému.

Perinatálne retinálne bunky je možné pestovať spôsobom opísaným v publikácii Johnson a ďalší 1986, J. Neurosci. 6: 3031 až 3038). Je napríklad možné vybrať sietnice z perinatálnych živočíchov (u potkana sa pod pojmom perinatálne'¹ rozumejú embryá po embryonálnom dni 17 až potkana do 48 hodín po vrhu), sietnice sa premyjú vo fyziologickom roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrom (PBS), zbavenom vápenatých a horečnatých iónov a potom sa inkubujú v PBS s obsahom približne 0,05 až 0,1 % trypsínu približne 15 minút pri teplote 37 °C. Po proteolytickom štiepení je možné sietnice premyť v živnom prostredí F14 s obsahom približne 10 % objemových konského séra, inaktivovaného teplom (F14-HS). Potom sa sietnice opatrne rozrušia pipetou v malom objeme (približne 1 až 10 ml) čerstvého F14-HS. Nedisociované tkanivo sa nechá usadiť a zvyšné bunky a živné prostredie sa odpipetuje na ďalšie pestovanie.

Na biologické skúšky je možné použiť aj bunky z prednej časti nervového systému. Je napríklad možné pestovať explantáty embryonálnych kraniálnych nervov, napríklad ventrolaterálnej časti ganglia trojklanného nervu alebo ganglión vestibulare, geniculatum, petrosum alebo nodosum na kolagénovom géli, prevrstvenom živným prostredím podľa publikácie (Davies a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6:1897 až 1904 alebo v disociovanom stave podľa publikácie Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:1199 až 1203).

Vzhľadom na to, že bolo pozorované, že odpoveď na BDNF je možné desaťkrát zvýšiť výmenou rastového substrátu z polyomitínu na zmes laminínu a polyomitínu (Barde a ďalší, 1987, Prog. Brain Res. 71:185 až 189), vykonávajú sa skúšky na BDNF výhodne na substrátoch obsahujúcich laminín. Povrchy na pestovanie je možné pripraviť napríklad tak, že sa

i) prekiyje povrch prostredia 8 až 10 hodín sterilným roztokom polyomitínu, ii) prostredie sa niekoľkokrát premyje sterilnou vodou, potom sa iii) povrch prostredia na dve hodiny prevrství laminínom v koncentrácii 25 pg/ml v PBS (Johnson a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6:3031 až 3038).

V akomkoľvek biologickom systéme podľa vynálezu je možné známym spôsobom získať krivky závislosti účinku BDNF od jeho dávky. Použitím skúšok na disociovanom senzorickom gangliu kurčaťa bolo možné pozorovať hodnotu, rovnajúcu polovici maximálneho prežitia pri koncentrácii približne 5 ng/ml čisteného BDNF a maximálne prežitie bolo možné pozorovať pri koncentrácii 10 až 20 ng/ml čisteného BDNF (Barde a ďalší, 1987, Prog. Brain Res. 71:185 až 189).

Stanovenie reťazca BDNF vo forme bielkoviny

Reťazec bielkoviny BDNF pripravenej z mozgového tkaniva je možné analyzovať, je však nutné zdôrazniť, že výnimočná vzácnosť tejto bielkoviny spôsobuje, že je veľmi ťažké skutočne zistiť zloženie podstatnej časti reťazca tejto bielkoviny. Reťazec je možné analyzovať priamo alebo je možné ho na začiatku rozštiepiť akoukoľvek známou proteázou vrátane trypsínu zo Staphylococcus aureus a bromkyánu. Reťazec peptidov je možné analyzovať automaticky Edmanovou degradáciou v plynnej fázy spôsobom podľa publikácie Hewick a ďalší, 1981, J. Biol. Chem. 256:7990 až 7997 a Hunkapillar a ďalší, 1983, Methods Enzymol. 91:227 až 236. Detekciu aminokyselín s použitím fenyltiohydantoínu je potom možné vykonať spôsobom podľa publikácie Lottspeich, 1985, Chromatography 236:321 až 327. Je možné dokázať prekrývajúce sa reťazce aminokyselín a použiť na dedukciu dlhšie reťazce.

Klonovanie kódovej DNA pre BDNF

Vzhľadom na vzácnosť výskytu BDNF nie je možné použiť na klonovanie génu pre túto látku štandardné postupy. Napríklad v prípade, že sa použije dostupný reťazec bielkoviny na konštrukciu komplementárnej značenej oligonukleotidovej sondy a táto sonda sa použije na vyšetrenie zostáv cDNA z tkanív, o ktorých sa predpokladá, že v nich dochádza k syntéze BDNF, bude počet pozitívnych klonov zrejme veľmi malý. Vynález však umožňuje klonovanie génu pre BDNF kombináciou postupov, ktoré zahrnujú čistenie vhodných množstiev BDNF, stanovenie reťazca tejto látky, konštrukciu oligonukleotidovej sondy, konštrukciu zostavy cDNA, amplifikáciu na báze odvodeného reťazca aminokyselín BDNF a konečne selekciu génu BDNF. Pri vykonávaní tohoto postupu sa ako výhodný postup na amplifikáciu používa amplifikácia nukleových kyselín z tkanív pomocou PCR (Saiki a ďalší, 1985, Science 230:1350 až 1354, aby bolo možné získať dostatočné množstvo molekúl BDNF na klonovanie.

Najskôr je možné použiť reťazec aminokyselín odvodený od čistenej bielkoviny na odvodenie oligonukleotidových primérov na použitie pri PCR. Vzhľadom na degeneráciu genetického kódu, pri ktorej môžu rôzne triplety nukleových kyselín byť kódom pre tú istú aminokyselinu, je nutné syntetizovať celý rad oligonukleotidov pre daný reťazec aminokyselín, aby bolo možné získať rad potenciálnych kombinácií oligonukleotidových reťazcov. Výsledné oligonukleotidy sa označujú ako degenerované priméry.

Pri vykonávaní PCR je nutné použiť tak mediátorové, ako aj nemediátorové priméry. Degenerovaný oligonukleotidový primér zodpovedajúci reťazcu aminokyselín BDNF je možné použiť ako primér pre jeden reťazec DNA a druhý primér, homológny s bežne sa vyskytujúcim reťazcom DNA, napríklad vznikajúci pri reverznej transkripcii polyadenozínového zakončenia mRNA je možné použiť ako primér pre druhý reťazec DNA. Tieto priméry sa potom použijú pre PCR spolu s templátom nukleovej kyseliny, o ktorom sa predpokladá, že obsahuje kódový reťazec pre BDNF, napríklad DNA genómu alebo výhodne cDNA, pripravenú z mRNA z tkaniva, pravdepodobne syntetizujúcu BDNF. Produkty tejto reakcie sa potom analyzujú elektroforézou, aby bolo možné stanoviť, či reakčný produkt má rozmer zodpovedajúci predpokladanému rozmeru génu pre BDNF a výhodne sa vykonáva analýza reťazca.

Vzhľadom na použitie dvoch degenerovaných primérov sa však pri vykonávaní PCR zvyšuje pravdepodobnosť amplifikácie reťazcov nukleových kyselín, ktoré nie sú kódom pre BDNF, takže výhodný je postup, pri ktorom sa používa len jeden degenerovaný primér a druhý primér zodpovedá presne reťazcu BDNF. Aby bolo možné presne identifikovať reťazec BDNF, je možné použiť reťazec aminokyselín, ktorý bol zistený pri použití čisteného BDNF na konštrukciu degenerovaného mediátorového aj nemediáto rového priméru. Produkt reakcie s použitím týchto primérov pri PCR a s použitím nukleovej kyseliny, ktorá je kódom pre BDNF ako templátu by mal byť fragment nukleovej kyseliny, ktorý je kódom pre aminokyseliny, použité pri konštrukcii primérov a mal by mať predpokladaný rozmer v pároch báz. Analýzou reťazca tohto reakčného produktu a porovnaním zisteného reťazca aminokyselín je možné potvrdiť, že amplifikovaný reťazec nukleovej kyseliny je v skutočnosti kódom pre peptidový fragment BDNF. Napriek tomu, že je možné na analýzu reťazca nukleových kyselín použiť akýkoľvek známy postup, je výhodné použiť postup s využitím terminačného postupu dideoxynukleotidového reťazca (Sanger a ďalší, 1979, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 72:3918 až 3921). Analýzu reťazca je možné vykonať s použitím reakčného produktu, čisteného na géli alebo výhodne klonovaného reakčného produktu. Reťazec reakčného produktu je potom možné použiť na konštrukciu oligonukleotidového priméru, ktorý zodpovedá presnému reťazcu, ktorý je kódom pre BDNF. Tento primér je potom možné použiť spolu s druhým primérom, ktorý môže byť degenerovaný, aby bolo možné zvýšiť množstvo nukleotidov v reťazci pre BDNF nad nukleotidy, reprezentované fragmentom reťazca, ktorý bol presne stanovený na začiatku postupu. Mediátorový primér môže napríklad presne zodpovedať nukleotidovému reťazcu pre BDNF, zatiaľ čo nemediátorovým reťazcom môže byť degenerovaný primér, homológny k oblasti reťazca, ktorá pravdepodobne je uložená smerom k polyadenozínovému zakončeniu mRNA, k reverznej transkripcii, ktorej dochádza do cDNA. Potom môže byť nutné použiť podobný postup na zistenie reťazca na druhej strane od dokázaného fragmentu. Napríklad môže nemediátorový primér presne zodpovedať nukleotidovému reťazcu pre BDNF a mediátorový primér môže byť degenerovaný primér, homológny k oblasti reťazca BDNF smerom k 5'-polyadenozínovému zakončeniu, pridanému na 5'-zakončenie cDNA s použitím terminálnej deoxynukleotidtransferázy. Podobným spôsobom je možné zostaviť celý reťazec génu alebo mRNA pre BDNF.

Reakčné produkty je možné klonovať akýmkoľvek známym spôsobom. Je možné použiť celý rad systémov vektor-hostiteľ. Vhodnými vektormi sú napríklad kozmidy, plazmidy alebo modifikované vírusy, ale je potrebné, aby vektorový systém bol kompatibilný s použitou hostiteľskou bunkou. Tieto vektory zahrnujú napríklad bakteriofágy ako deriváty bakteriofágu lambda alebo plazmidy ako pBR322, pUC alebo plazmid Bluescript (Stratagene). Rekombinantné molekuly je možné do hostiteľskej bunky uložiť transformáciou, transfekciou, infekciou, otvorením pórov pôsobením elektrického prúdu a podobne.

Gén pre BDNF sa uloží do vektora na klonovanie, ktorý je možné použiť na transformáciu, transfekciu alebo infekciu príslušných hostiteľských buniek tak, aby vzniklo veľké množstvo kópií reťazca génu. Toto je možné dosiahnuť tak, že sa fragment DNA uloží do vektora na klonovanie s komplementárnymi kohezívnymi zakončeniami. Ale v prípade, že nie sú k dispozícii komplementárne štiepne miesta pre reštrikčné enzýmy použité na fragmentáciu DNA vo vektore na klonovanie, je možné zakončenie DNA chemicky modifikovať. Môže byť výhodné uložiť miesta pôsobenia reštrikčných enzýmov do oligonukleotidových primérov, použitých pri reakcii PCR na uľahčenie uloženia do vektora. Je takto možné skonštruovať na zakončeniach akékoľvek štiepne miesto naviazaním väzbových nukleotiSK 279668 B6 dových reťazcov. Tieto reťazce môžu byť tvorené špecifickými chemicky syntetizovanými oligonukleotidmi, ktoré sú kódom pre reťazce s obsahom štiepnych miest, rozpoznávaných určitými endonukleázami. Rozštiepený vektor a gén pre BDNF je tiež možné modifikovať konštrukciou homopolymémych zakončení.

V špecifických uskutočneniach môže umožniť transformácia hostiteľských buniek rekombinantnou molekulou DNA, s obsahom izolovaného génu pre BDNF, cDNA alebo syntetizovaný reťazec DNA tvorbu mnohopočetných kópií tohto génu. V tomto prípade je potom možné získať gén vo veľkom množstve pestovaním transformátov s následnou izoláciou rekombinantných molekúl DNA z týchto transformátov, potom je prípadne opäť možné vybrať uložený gén z izolovanej rekombinantnej DNA.

Podľa výhodného uskutočnenia vynálezu je možné postupovať tak, že hneď ako dôjde k získaniu klonu, odvodeného od cDNA a kódujúceho BDNF, je možné izolovať kloň genómu, ktorý je kódom pre BDNF s použitím štandardných postupov, ktoré sú v danej oblasti techniky známe. Je napríklad možné odvodiť od BDNF značenú sondu nukleovej kyseliny a túto, od uvedeného klonu odvodenú nukleovú kyselinu použiť na vyšetrenie zostáv DNA genómu hybridizáciou nukleových kyselín napríklad spôsobom, opísaným v publikácii Benton a Davies, 1977, Science 196:180 pre prípad zostáv bakteriofágu a podľa publikácie Grunstein a Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci USA 72:3961 až 3965 pre zostavy plazmidov. Izolované klony je potom možné analyzovať zistením štiepnych miest pre reštrikčné enzýmy a analýzou reťazca. Tieto analýzy je možné vykonať štandardnými postupmi.

Okrem toho je tiež možné zo zostavy cDNA identifikovať ďalšie klony s použitím reťazcov, získaných spôsobom podľa vynálezu.

Expresia génu, ktorý je kódom pre neurotrofný faktor, odvodený od mozgového tkaniva

Reťazec nukleotidov, ktorý je kódom pre BDNF alebo jeho časť, je možné uložiť do vhodného vektora na expresiu, t. j. pre tymidínkinázu vírusu herpesu (Wagner a ďalší, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:1444 až 1445), riadiaci reťazec metalotionínového génu (Brinster a ďalší, 1982, Náture 296: 39 až 42), prokaryotické vektory na expresiu, napríklad promótor beta-laktamázy (Villa-Komaroff a ďalší, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727 až 3731) alebo tac-promótor (DeBoer a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21 až 25), súhrn je možné nájsť napríklad v publikácii Useful proteins from rekombinant bacteria, Scientific Američan, 1980:242:74 až 94. Ďalej je možné použiť vektory na expresiu v rastlinách s obsahom promótora pre nopalínsyntetázu (Herrera-Estrella a ďalší, Náture 303:209 až 231) alebo promótor RNA 35S vírusu mozaiky karfiolu (Gardner a ďalší, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871) a promótor pre fotosyntetický enzým ribulozobifosfátkarboxylázu (Herrerra-Estrella a ďalší, 1984, Náture 310:115 až 120), promótorove prvky z kvasiniek alebo iných húb ako promótor Gal 4, ADC promótor (pre alkoholdehydrogenázu), promótor pre alkalickú fosfatázu a nasledujúce živočíšne oblasti na riadenie transkripcie, ktoré sú špecifické pre určité tkanivá a boli použité v prípade transgénnych živočíchov: riadiaca oblasť génu pre elastázu I, ktoráje účinná v pankreatických bunkách (Swift a ďalší, 1984, Celí 38:639 až 646, Omitz a ďalší, 1986, Cold Spring Haabor Symp. Quant. Biol. 50:399 až 409, MacDonald, 1987, He patology 7:425 až 515), ďalej riadiaca oblasť génu pre inzulín, ktorá je účinná v pankreatických beta-bunkách (Hanahan, 1985, Náture 315:115 až 122), riadiaca oblasť génu pre imunoglobulín, ktoráje účinná v lymfoidných bunkách (Grosschedl a ďalší, 1984, Celí 38:647 až 658, Adames a ďalší, 1985, Náture 318:533 až 538, Alexander a ďalší, 1987, Mol. Celí. Biol. 7:1436 až 1444), riadiaca oblasť vírusu nádoru mliečnej žľazy myší, ktorá je účinná pri bunkách samčích pohlavných žliaz, mliečnej žľazy, lymfoidných a tukových bunkách (Leder a ďalší, 1986, Celí 45:485 až 495), riadiaca oblasť génu pre albumín, ktoráje účinná v pečeňových bunkách (Pinkert a ďalší, 1987, Genes and Devel. 1:268 až 276), riadiaca oblasť génu pre alfafetoproteín, ktorý je účinný v pečeni (Krumlauf a ďalší, 1985, Mol. Celí. Biol. 5:1639 až 1648), Hammer a ďalší, 1987, Science 235:53 až 58), riadiaca oblasť génu pre 1-antitrypsín, ktorá je účinná v pečeni (Kelsey a ďalší, 1987, Genes and Devel. 1:161 až 171), riadiaca oblasť génu pre beta-globín, ktoráje účinná v myeloidných bunkách (Mogram a ďalší, 1985, Náture 315:338 až 340, Kollias a ďalší, 1986, Celí 46:89 až 94), riadiaca oblasť pre gén základnej bielkoviny myoglobínu, ktorá je účinná v oligodendrocytoch (Readhead a ďalší, 1987, Celí 48:703 až 712), riadiaca oblasť pre ľahký reťazec 2 myozínu, ktoráje účinná v kostrovom svale (Saní, 1985, Náture 314:283 až 286) a riadiaca oblasť génu na uvoľňovanie gonadotropínu, ktoráje účinná v hypotalame (Mason a ďalší, 1986, Science 234:1372 až 1378).

Vektory na expresiu, ktoré obsahujú včlenený gén pre NT-3 je možné identifikovať troma zásadnými postupmi:

a) hybridizáciou DNA-DNA,

b) prítomnosťou alebo neprítomnosťou značiaceho génu a

c) podľa expresie včlenených funkcií.

Pri prvom z týchto postupov je možné zistiť prítomnosť cudzorodého génu včleneného do vektora na expresiu hybridizáciou DNA-DNA s použitím sond, ktoré obsahujú reťazce, homológne s včleneným génom NT-3. Pri druhom z týchto postupov sa identifikuje a podrobí selekcii systém rekombinantného vektora a hostiteľa na základe prítomnosti alebo neprítomnosti určitého značiaceho génu a jeho funkcií (napríklad môže ísť o účinnosť tymidínkinázy, odolnosť proti antibiotikám, transformáciu fenotypu, tvorbu oklúznych teliesok pri baculovíruse a podobne). Tieto funkcie sú spôsobené včlenením cudzorodého génu do vektora. Napríklad v prípade, že sa gén pre BDNF uloží do značiaceho génu vo vektore, je možné rekombinanty, ktoré ho obsahujú identifikovať podľa straty funkcie, zodpovedajúcej funkcii značiaceho génu. Pri treťom postupe je možné identifikovať rekombinantná vektory na expresiu podľa expresie cudzorodého génu v rekombinantnej bunke. Tieto postupy môžu byť založené napríklad na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach produktu génu BDNF v systéme na biologické skúšky.

Hneď ako je určitá rekombinantná molekula DNA identifikovaná a izolovaná, je možné na jej propagáciu použiť niekoľko postupov. Hneď ako dôjde k stabilizácii systému hostiteľa a rastových podmienok, je možné pripraviť rekombinantná vektory vo väčšom množstve. Ako už bolo vysvetlené, je možné ako vektory použiť napríklad nasledujúce vektory alebo ich deriváty: ľudské alebo iné živočíšne vírusy, ako je vírus vaccinia alebo adenovírus, vírus hmyzu, napríklad baculovírus, vektory z kvasiniek, z bak

SK 279668 Β6 teriofágov (napríklad lambda) a DNA plazmidov a kozmidov a podobne.

Okrem toho je možné voliť kmeň hostiteľských buniek, ktorý· mení expresiu uloženého reťazca alebo modifikuje a spracováva produkt génu špecifickým spôsobom. Expresiu niektorých promótorov je možné zvýšiť za prítomnosti niektorých induktorov. Týmto spôsobom je možné riadiť expresiu geneticky pozmeneného NT-3. Okrem toho boli charakterizované rôzne hostiteľské bunky a špecifické mechanizmy na translačné a posttranslačné spracovanie a modifikáciu, napríklad ako sú glykozylácia a odštiepenie bielkovín. Je možné voliť príslušné bunkové línie alebo systémy hostiteľov na zaistenie požadovanej modifikácie a spracovanie cudzorodej bielkoviny. Je napríklad možné použiť expresiu v bakteriálnom systéme na získanie neglykozylovaného bielkovinového produktu. Expresia v kvasinkách poskytne glykozylovaný produkt. Expresiu v bunkách cicavcov je možné využiť na zaistenie natívnej glykozylácie heterológneho BDNF. Okrem toho je možné zaistiť vhodnou voľbou rôznych vektorov a hostiteľov na expresiu spracovanie výsledného produktu, napríklad proteolytické štiepenie v rôznom rozsahu.

V špecifickom uskutočnení je možné klonovať DNA, ktorá je kódom pre prepro BDNF v plazmide pCMV, amplifikovať a potom použiť na transfekciu buniek COS s použitím fosforečnanu vápenatého (Chen a Okayama 1987, Mol. Celí. Biol. 7:2745 až 2752), BDNF je potom možné izolovať zo živného prostredia, ako je opísané v príslušných odstavcoch príkladu 5.

Identifikácia a čistenie produktu génu po expresii

Hneď ako dôjde u rekombinanty k identifikácii expresie génu pre BDNF, je možné produkt analyzovať. Toto je možné dosiahnuť skúškami, založenými na fyzikálnych alebo na funkčných vlastnostiach produktu.

Hneď ako bola identifikovaná bielkovina BDNF, je možné ju izolovať a čistiť zvyčajnými postupmi vrátane chromatografie, napríklad je možné použiť chromatografiu na ionomeniči, afmitnú chromatografiu a chromatografiu, pri ktorej je možné oddeliť látky od určitej molekulovej hmotnosti, ďalej je možné použiť odstredenie, rozdiely v rozpustnosti alebo akýkoľvek iný zvyčajný postup na čistenie bielkovín. Funkčné vlastnosti je možné hodnotiť akoukoľvek známou skúškou na BDNF vrátane použitia ganglií dorzálnych koreňov kuracieho embrya, retinálnych buniek potkana v perinatálnom období alebo neurónov, odvodených od prednej časti nervovej sústavy.

Postupy použité na získanie BDNF z mozgového tkaniva, zahrnujú ako konečný stupeň preparatívnu chromatografiu na géli a z tohto dôvodu poskytujú BDNF, ktorý nie je celkom účinný vzhľadom na to, že obsahuje reziduálny SDS (Barde a Thoenen, 1985, Hormones and Celí Regulation, zv. 9, Dumont a ďalší, Elsevier Science Publishers, str. 385 až 390). Naopak, vynález dovoľuje izoláciu BDNF, ktorý je získaný z rekombinantných molekúl nukleových kyselín, je zbavený SDS a je preto plne účinný. Je napríklad možné použiť protilátky podľa vynálezu proti BDNF (napríklad protilátky proti fragmentu aminokyselín B5-33 z BDNF prasaťa tak, ako sú opísané v príklade 6) na izoláciu BDNF pomocou imunoprecipitácie alebo pomocou afinitnej chromatografie za získania plne účinného BDNF, zbaveného zmáčadla.

V ďalšom uskutočnení vynálezu je možné premeniť prepro BDNF enzymaticky na účinný úplný BDNF, napríklad s použitím endoproteinázy Arg-C (príklad 12).

Rovnako vynález poskytuje izolovanú molekulu DNA, ktorá obsahuje sekvenciu kódujúcu proteín neurotrofného faktora zo zrelého ľudského mozgu (BDNF) s nasledujúcou sekvenciou amino kyselín:

His Ser Aep Pro Äla Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser íle Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Aap Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lya Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Pha Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly íle Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg íle Gly Trp Arg Phe íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr íle Lys Arg Gly Arg alebo podsekvencia uvedenej molekuly DNA kódujúca polypeptid s BDNF aktivitou.

Napríklad, molekula DNA, ktorá je znázornená na obr. 1 alebo obr. 5, alebo jej podsekvencia, ktorá kóduje polypeptid s BDNF aktivitou.

Vynález poskytuje molekulu izolovanej nukleovej kyseliny homológnej alebo komplementárnej k opísaným molekulám DNA alebo jej časti, kódujúcej polypeptid s BDNF aktivitou.

Napríklad molekula DNA môže obsahovať sekvencie vybrané z:

a) nukleotid 167 až do nukleotidu 927 z obr. 1

b) nukleotid 566 až do nukleotidu 927 z obr. 1

c) nukleotid 974 až do nukleotidu 1330 z obr. 5 pre BDNF a

d) nukleotid 590 až do nukleotidu 1330 z obr. 5 pre potkaní BDNF.

Alternatívne molekula DNA môže byť obsiahnutá v plazmide phBDNF-C-1 deponovanom v ATCC pod prístupovým číslom 40648, alebo obsiahnutá v bakteriofágu /.BDNF-G-l deponovanom v ATCC s prístupovým číslom 40649.

Výhodne je molekula DNA schopná expresie BDNF alebo jeho peptidového fragmentu v hostiteľskej bunke, kde molekula DNA je riadená regulačnou sekvenciou DNA.

Vynález tiež poskytuje vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa vynálezu. Výhodné vektory zahrnujú: vektor phBDNF-C-1 uložený v ATCC a pod registračným číslom 40648 a bakteriofág XDNF-G-l uložený v ATCC a pod registračným číslom 40649.

Vynález ďalej poskytuje bunku obsahujúcu molekulu DNA podľa vynálezu. Výhodne je táto bunka rekombinantným mikroorganizmom napríklad baktériou alebo kvasinkou.

Podstatu vynálezu tvorí aj podstatne purifikovaný, izolovaný a nedenaturovaný proteín BDNF s neurotrofnou aktivitou a nasledovnou sekvenciou aminokyselín:

kxe Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

Val

Cys

Asp

Ser

íle

Ser

Glu

Trp

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Lys

Lys

Thr

Ala

Val

Asp

Met

Ser

Gly

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Leu

Glu

Lys

Val

Pro

Val

ser

Lys

Gly

Gin

Leu

Lys

Gin

Tyr

Pha

Tyr

Glu

Thr

Lys

Cys

Asn

Pro

Mat

Gly

Tyr

Thr

Lys

Glu

Gly

Cys

Arg

Gly

íle

Asp

Lys

Arg

His

Trp

Asn

Ser

Gin

Cys

Arg

Thr

Thr

Gin

Ser

Tyr

Val

Arg

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Ser

Lys

Lys

Arg

íle

Gly

Trp

Arg

Phe

íle

Arg

íle

Asp

Thr

Ser

Cys

Val

Cys

Thr

Leu

Thr

íle

Lys

Arg

Gly

Arg

alebo jeho podsekvencia s aktivitou BDNF.

Vynález tiež poskytuje podstatne vyčistený, izolovaný a nedenaturovaný protein BDNF s neurotrofnou aktivitou a s nasledovnou sekvenciou aminokyselín:

Hla Ser Aap Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

Val

Cya

Asp

Ser

íle

Ser

Glu

Trp

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Lys

Ly·

Thr

Ale

Val

Asp

Met

Ser

Gly

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Leu

Glu

Lye

Val

Pro

Val

Ser

Lys

Gly

Gin

Leu

Lye

Val

Leu

Glu

Lys

Val

Pro

Val

Ser

Lys

Gly

Gin

Leu

Lys

Gin

Tyr

Phe

Tyr

Glu

Thr

Lys

Cys

Asn

Pro

Met

Gly

Tyr

Thr

Lys

Glu

Gly

Cys

Arg

Gly

íle

Asp

Lys

Arg

Hls

Trp

Asn

Ser

Gin

Cys

Arg

Thr

Thr

Gin

Ser

Tyr

val

Arg

Ala

Leu

Thr

Met

Asp

Ser

Lys

Lys

Arg

íle

Gly

Trp

Arg

Phe

11«

Arg

íle

Asp

Thr

Ser

Cys

Val

Cys

Thr

Leu

Thr

íle

Lye

Arg

Gly

alebo jeho podsekvencia s aktivitou BDNF.

Vynález ďalej poskytuje podstatne vyčistený, izolovaný a nedenaturovaný protein BDNF s neurotrofnou aktivitou a s nasledovnou sekvenciou aminokyselín:

Met Hla Ser Aap Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cya Aep Ser íle Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp

Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr

Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr

Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly íle Asp Lys Arg Hls Trp

Asn ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala

Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg íle Gly Trp Arg Phe íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr íle

Lys Arg Gly Arg alebo jeho podsekvencia s aktivitou BDNF.

Využitie vynálezu

Vynález sa týka sekvence nukleových kyselín pre BDNF a čistého BDNF proteínu a jeho podsekvencií s BDNF aktivitou. BDNF je možné získať v množstvách, dostatočných na diagnostické a liečebné použitie. Na väčšinu účelov je výhodné použiť gény pre BDNF alebo produkty génov toho istého druhu tak na diagnostické, ako aj na liečebné účely, hoci v špecifických uskutočneniach môže byť vhodné aj použitie BDNF z iného druhu.

Diagnostické aplikácie

Vynález, ktorý sa týka nukleových kyselín, ktoré sú kódom pre BDNF, čistého BDNF proteínu a ich podsekvencií, ktoré je možné využiť na diagnózu ochorení a porúch nervového systému, ktoré môžu byť spojené s poruchami expresie tejto látky.

V rôznych uskutočneniach vynálezu je možné použiť BDNF, gény pre BDNF a príbuzné reťazce nukleových kyselín aj časti týchto reťazcov a príbuzné reťazce vrátane reťazcov komplementárnych na diagnostické hybridizačné skúšky. Sekvencie nukleových kyselín pre BDNF podľa vynálezu je možné použiť ako hybridizačné sondy. Hybridizačné skúšky je možné použiť na zistenie, prognózu, diagnózu, zistenie stavu, poruchy alebo pokročilosti ochorenia, spojeného so zmenami v expresii BDNF vrátane napríklad stavov, ktoré sú výsledkom poškodenia senzorických neurónov. Tieto choroby a stavy zahrnujú napríklad poškodenie CNS, infarkt, infekcie, degeneratívne nervové ochorenia, zhubné ochorenia, postoperačné zmeny, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu alebo Huntingtonovu chorobu. Je napríklad možné skúmať vzorku úplnej RNA vo vzorke tkaniva chorého na prítomnosť mRNA pre BDNF, pričom zistená zmena v množstve mRNA pre BDNF je ukazovateľom degenerácie neurónov.

V ďalších uskutočneniach vynálezu je možné použiť BDNF, jeho peptidové fragmenty alebo deriváty na diagnózu ochorení a porúch nervového systému. Vo zvláštnom uskutočnení je možné použiť BDNF alebo jeho peptidové fragmenty na identifikáciu tkaniva alebo buniek, pri ktorých dochádza k expresii receptora BDNF, aby bolo možné identifikovať aberancie v expresii tohto receptora a v dôsledku toho aj potenciálne abnormality tkanivovej alebo bunkovej odpovede na BDNF.

Liečebné použitie

Vynález je možné využiť na liečbu ochorení a porúch nervového systému, spojených s poruchami expresie BDNF alebo ktoré by bolo možné priaznivo ovplyvniť prívodom BDNF alebo protilátok proti BDNF.

Podľa rôznych uskutočnení vynálezu je možné podávať BDNF protein alebo podsekvencie podľa vynálezu chorým, ktorých nervový systém bol porušený úrazom, chirurgickým zákrokom, ischémiou, metabolickou chorobou, nedostatkami vo výžive, zhubným ochorením alebo toxickými látkami. V rôznych špecifických uskutočneniach je možné BDNF podávať miestne na senzorické neuróny, ktoré sú porušené, ide napríklad o neuróny dorzálnych ganglií miechových koreňov alebo o akékoľvek z nasledujúcich tkanív: ganglion geniculatum, petrosum alebo nodosum, vestibuloakustický komplex VIII hlavového nervu, ventrolaterálny pól maxillo-mandibulámeho laloku ganglia trojklanného nervu, mesencefalické jadro pre trigeminus a gangliá sympatiku. Môže byť žiaduce podať proteíny alebo podsekvencie podľa vynálezu, vstrebaním z membrány, na ktorej sú adsorbované, môže ísť napríklad o silastickú membránu, ktorú je možné implantovať do blízkosti poškodeného nervu. Vynález je možné použiť aj na urýchlenie rekonvalescencie chorých s diabetickými neuropatiami, ako je mononeuropatia multiplex a diabetická periférna neuropatia. V ďalšom uskutočnení vynálezu je možné použiť BDNF proteíny alebo podsekvencie podľa vynálezu na liečenie kongenitálnych stavov alebo neurodegeneratívnych porúch vrátane napríklad Azheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby, syndrómu Parkinson-Plus, pri ktorom symptómy Parkinsonovej choroby sú vyvolané degeneráciou dopaminergných neurónov, ako je progresívny supranukleámy syndróm (syndróm Steele-Richardson-Olszewski), olivopontocerebrálna atrófia (OPCA), Shy-Dragerov syndróm (mnohopočetná systémová atrófia) a komplex demencie Guamanian-Parkinson a Huntingtonova chorea. Najmä je vynález možno použiť na liečbu kongenitálnych alebo neurodegeneratívnych porúch spojených s dysfunkciou senzorických neurónov a degeneratívnym ochorením sietnice. Napríklad je možné použiť BDNF proteíny alebo podsekvencie podľa vynálezu na liečenie hereditámej spastickcj paraplégie s retinálnou degeneráciou (syndróm Kjellinov a Bamard-Scholz), ďalej pri retinitis pigmentosa, Stargardtovom ochorení, Usherovom syndróme (retinitis pigmentosa s kongenitálnou stratou sluchu) a tiež pri Refsumovom syndróme (retinitis pigmentosa, hereditáma strata sluchu a polyneuropatia. Ide však len o niektoré syndrómy, pri ktorých je možné BDNF použiť. Je možné, že poruchy pri syntéze BDNF alebo poruchy v odpovedi na BDNF môžu byť pôvodnou príčinou radu syndrómov, ktoré sú charakterizované kombináciou degenerácie sietnice a ďalšej senzorickej dysfunkcie.

V špecifickom uskutočnení vynálezu je možné podávať

BDNF protein alebo podsekvenciu podľa vynálezu v spo11 jení s chirurgickou implantáciou tkaniva pri liečbe Alzheimerovej choroby a/alebo Parkinsonovej choroby. Ako bude ďalej uvedené v príkladoch 7 a 13, je možné BDNF použiť aj na podporu prežitia neurónov dopaminergnou substantia nigra, ktoré je závislé od dávky, ako je zrejmé z obr. 34 a tiež na liečbu porúch dopaminergných neurónov CNS, vrátane Parkinsonovej choroby v zásade vo svetle údajov, ktoré budú ďalej uvedené v odstavci Uloženie mikroorganizmov, kde sa dokazuje, BDNF je možné použiť na prevenciu neurotoxicity, spôsobenej MPP, čo je toxín, spojený s indukciou ochorenia, podobného Parkinsonovej chorobe. Okrem toho bolo pozorované, že BDNF podporuje prežitie cholinergných neurónov CNS, ako bude ďalej opísané v príkladoch 7 a 11, najmä cholinergných neurónov bazálnej časti predného mozgu, čo ukazuje na to, že BDNF by bolo zrejme možné použiť na liečbu porúch, zahrnujúcich cholinergné neuróny vrátane napríklad Alzheimerovej choroby. Bolo dokázané, že približne 35 % chorých s Parkinsonovým ochorením trpí tiež demenciou Alzheimerovho typu. V týchto prípadoch by mohlo podávanie BDNF byť užitočné ako komplexná liečba tohto syndrómu. Podobne je možné použiť BDNF, získaný spôsobom podľa vynálezu na liečbu Alzheimerovho ochorenia spojeného s Downovým syndrómom. BDNF, získaný spôsobom podľa vynálezu je možné použiť pri liečbe celého radu demencií a tiež pri kongenitálnych poruchách poznávania. Bolo tiež zistené, že BDNF zrejme potláča proliferáciu astrogliálnych buniek, čo podporuje používanie BDNF pri zaistení tvorby čo najmenších jaziev v CNS (napríklad po chirurgických zákrokoch, po úrazoch alebo po krvácaní alebo trombóze mozgu) a tiež na liečbu nádorov odvodených od astrogliálnych buniek. V ďalšom uskutočnení vynálezu je možné použiť BDNF na reguláciu expresie receptora NGF. Je teda možné podať túto látku výhodne pred podaním NGF alebo súčasne s podaním NGF chorým.

Ako bude ďalej uvedené v príklade 10, môže sa podať kyselina kaínová na indukciu zvýšenia expresie BDNF (a v menšom rozsahu tiež na indukciu expresie NGF) v neurónoch vrátane hippocampových neurónov a neurónov v mozgovej kôre. Bolo pozorované (ako bude ďalej uvedené v príklade 10), že inhibícia non-NMDA-receptorov blokuje toto zvýšenie expresie BDNF, vyvolané podaním kyseliny kaínovej. Je tiež zrejmé, že je možné indukovať expresiu podsekvencií podľa vynálezu in vitro alebo in vivo podaním kyseliny kaínovej alebo príbuzných látok alebo podaním karbacholu, histamínu alebo bradykinínu a príbuzných látok, ktoré majú in vitro alebo in vivo podobný účinok alebo antagonistov ne-NMDA glutamátových receptorov alebo iných látok, ktoré zvyšujú alebo napodobňujú pôsobenie acetylcholínu, histamínu alebo bradykinínu. Indukciu expresie je taktiež možné dosiahnuť podaním kyseliny kainovej alebo príbuzných molekúl alebo agonistov neNMDA receptorov.

V ďalšom uskutočnení vynálezu je možné použiť BDNF alebo podsekvenciu podľa vynálezu v spojení s ďalšími cytokínmi na dosiahnutie požadovaného neurotrofného účinku. Napríklad je podľa vynálezu možné BDNF použiť spolu s NGF alebo spolu s extraktom z kostrového svalu na dosiahnutie synergného stimulačného účinku na rast senzorických, čo znamená, že synergným účinkom je účinok kombinácie BDNF ako bielkoviny, peptidu alebo derivátu a druhého prostriedku, čo vedie k dosiahnutiu väčšieho účinku, než by bolo možné dosiahnuť s použitím akejkoľvek z použitých látok samostatne. Je zrejmé možno predpokladať synergný účinok BDNF s ďalšími peptidovými faktormi, odvodenými od CNS, ktoré ešte nie sú celkom charakterizované a to tak na rast, ako aj na vývoj a prežívanie širokej škály subpopulácií neurónov v centrálnom nervovom systéme.

Vynález poskytuje použitie proteínu BDNF alebo polypeptidu s aktivitou BDNF podľa vynálezu alebo prípravok podľa vynálezu pri príprave liečiva na liečenie ľudského alebo živočíšneho tela s chorobou alebo poruchou nervovej sústavy alebo v diagnóze takej choroby alebo poruchy.

Chorobou alebo poruchou môže byť choroba alebo porucha senzorických neurónov, ako je diabetická neuropatia alebo porucha nervovej sústavy je choroba alebo porucha cholinergných neurónov, kde cholinergné neuróny môžu byť bazálne cholinergné neuróny predného mozgu alebo septálne cholinergné neuróny.

Chorobou alebo poruchou môže byť choroba alebo porucha, akou je Alzheimerova choroba, Huntingtonova chorea, retinálna choroba, Parkinsonova choroba, Parkinsonov plus syndróm alebo diabetická neuropatia.

Chorobou alebo poruchou nervovej sústavy môže byť choroba alebo porucha dopaminergných neurónov, ako je napríklad Parkinsonova choroba.

Chorobou alebo poruchou nervovej sústavy môže byť choroba alebo porucha nervovej sústavy obsahuje poškodenie nervovej sústavy a príčinou poškodenia je trauma, chirurgický zákrok, infarkt, infekcia, malígny nádor, vystavenie účinkom toxického činidla, nutričná nedostatočnosť alebo diabetická neuropatia.

Farmaceutické prostriedky

Vynález poskytuje aj farmaceutický prípravok, ktorý zahrnuje izolovaný a nedenaturovaný protein BDNF alebo polypeptid s aktivitou BDNF podľa vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič.

Nosičom môže byť pomaly uvoľňujúci nosič. Prípravok môže tiež obsahovať ďalšiu aktívnu látku. Výhodne, druhou aktívnou látkou môže byť nervový rastový faktor (NGF) alebo iný člen skupiny BDNF/NGF.

Prostriedky podľa vynálezu je možné podávať v akomkoľvek sterilnom biologicky kompatibilnom nosiči vrátane fyziologického roztoku chloridu sodného, prípadne s obsahom pufru, dextrózy alebo vo vode.

Množstvo BDNF vo forme bielkoviny alebo podsekvencie podľa vynálezu, účinné v prípade určitej poruchy alebo určitého stavu bude závisieť od povahy tejto poruchy alebo tohto stavu a je možné ho stanoviť bežnými klinickými postupmi. Tam, kde je to možné, je žiadúce stanoviť krivku závislosti účinku od dávky a vhodné zloženie farmaceutického prostriedku najskôr in vitro, napríklad na uvedenom systéme na dôkaz biologickej účinnosti BDNF a potom na vhodnom živočíšnom systéme pred klinickými testami. Na základe údajov, získaných in vitro je možné v špecifickom uskutočnení získať farmaceutický prostriedok, ktorý môže pri podpore prežívania senzorických neurónov zaistiť miestnu koncentráciu BDNF v rozmedzí 5 až 25 ng/ml a výhodne 10 až 20 ng/ml. V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je pri podaní farmaceutického prostriedku na vyvolanie rastu a na prežitie dopaminergných alebo cholinergných neurónov možné dosiahnuť miestnu koncentráciu BDNF v rozmedzí 10 až 100 ng/ml.

Spôsoby podávania zahrnujú podanie intradermálne, intramuskuláme, intraperitoneálne, vnútrožilové, podkož12 né, perorálne a intranazálne. Okrem toho môže byť žiaduce podať farmaceutický prostriedok podľa vynálezu priamo do centrálneho nervového systému akoukoľvek vhodnou cestou vrátane intraventrikulámej a intratekálnej injekcie. Intraventrikulámu injekciu je možné uľahčiť použitím intraventrikulámcho katétra, napríklad pripojeného na zásobník, ako Ommayov zásobník.

Okrem toho môže byť vhodné podávať farmaceutický prostriedok podľa vynálezu miestne do oblasti, kde je potrebné dosiahnuť požadovaný účinok. Toto je možné dosiahnuť napríklad miestnou infúziou v priebehu chirurgického zákroku, injekciou, napríklad pomocou katétra alebo pomocou implantátu, ktorým môže byť porézny, neporézny alebo želatínový materiál vrátane membrán, napríklad sialastickej membrány alebo môže ísť o vlákna.

Podstatu vynálezu tvoria taktiež farmaceutické prostriedky s obsahom bielkoviny BDNF, jej peptidového fragmentu alebo derivátu, podávaného pomocou lipozómov, mikročastíc alebo mikrokapsúl. V rôznych uskutočneniach vynálezu môže byť vhodné použiť takéto prostriedky, ktoré môžu zaistiť spomalené uvoľňovanie BDNF alebo príbuzných produktov.

Je pravdepodobné, že v budúcnosti bude možné privádzať do oblastí, do ktorých to bude treba bunky aktívne produkujúce BDNF proteín alebo podsekvenciu podľa vynálezu tam, kde bude potrebné zvýšiť koncentráciu tejto látky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je znázornený nukleotidový reťazec a odvodený reťazec aminokyselín pre cDNA prepro BDNF prasaťa. Je znázornený úplný reťazec dvoch prekrývajúcich sa klonov cDNA. Peptidový reťazec zistený analýzou mikrovzorky (tabuľka III) je podčiarknutý. Jediný spoločný reťazec pre N-glykozyláciu je podčiarknutý dvakrát. Začiatok úplného reťazca BDNF je označený tým, že okrem nukleotidového reťazca je uvedený aj zodpovedajúci reťazec aminokyselín.

Na obr. 2 je znázornené porovnanie reťazcov NGF a BDNF. Sú označené oblasti s viacerými než dvoma zvyškami aminokyselín na identických miestach. Reťazce začínajú prvými aminokyselinami úplných bielkovín a končia poslednými pred stop-kodónmi. BDNF a rôznym NGF je spoločných 51 aminokyselín (Schwarz a ďalší, 1989, J. Ncurochem. 52:1203 až 1209) vrátane šiestich cysteínových zvyškov.

Na obr. 3 je znázornený autorádiogram skúšky Southem blot pre DNA genómu človeka, opice, potkana, myši, psa, kravy, králika a kurčaťa a kvasiniek po rozštiepení enzýmom EcoRI a po hybridizácii na 32p._znaý_enej sondy NGF a BDNF.

Na obr. 4 je znázornená analýza Northem blot. Z každého tkaniva bolo do dráhy nanesených 20 pg celkovej RNA a potom bola vykonaná hybridizácia na ³²P-značenou myšacou cRNA ako sondou pre BDNF. Je možné pozorovať silný signál pri 1,45 kb v prítomnosti mozgového tkaniva, ale potom už v prípade žiadneho zo siedmich ďalších analyzovaných tkanív.

Na obr. 5 je znázornený reťazec cDNA pre BDNF človeka a odvodený reťazec aminokyselín a tiež porovnanie reťazcov DNA prasaťa, potkana a človeka.

Na obr. 6 je znázornený plazmid PCMVl-pBDNF na expresiu BDNF.

Na obr. 7a) je znázornený výsledok stanovenia ELISA na väzbu antiséra na peptid B5 s použitím sériového riedenia antiséra. Na obr. 7b) je znázornené kvantitatívne stanovenie väzby rôznych antisér v riedení 1:500 na 10 ng BDNF.

Na obr. 8 sú znázornené výsledky imunohistochemického farbenia pre tyrozínhydroxylázu v kultúrach ventrálneho mesencephala po pôsobení BDNF (šrafované stĺpce) a pri kontrolách (prázdne stĺpce).

Na obr. 9 je znázornený príjem dopamínu kultúrami ventrálneho mesencephala. Kultúry, doplnené BDNF sú označené šrafovanými stĺpcami, kontrolné kultúry prázdnymi stĺpcami.

Na obr. 10a) je znázornený účinok BDNF na počet pozitívnych buniek v kultúrach cholinergných neurónov predného mozgu. Na obr. 10b) je znázornená kultúra cholinergných neurónov predného mozgu pri hustote 260 000 buniek na jedno vyhĺbenie (šrafovaný stĺpec) po pôsobení 150 ng/ml NGF. Počet CTA-imunopozitívnych buniek v bunkách po pôsobení NGF a bez tohto pôsobenia je navzájom porovnaný.

Na obr. 11 sú znázornené zmeny v účinnosti enzýmu CAT v pikomóloch v katalyzovanom substráte za minútu ako funkcia koncentrácie BDNF v kultúrach cholinergných neurónov predného mozgu.

Na obr. 12 je znázornený prípad, keď boli kultúry astrogliálnych buniek v štádiu, v ktorom na 60 % súvisle pokrývali dno nádoby, spracovávané pôsobením buď a) epidermálneho rastového faktora alebo b) BDNF počas 42 hodín, potom boli inkubované s | ²H | -metyltymidínom. Množstvo inkorporovaného bolo merané relatívne ku koncentrácii EGF a BDNF.

Na obr. 13 je znázornený Southem blot pre sondu R1B/2C kurčaťa po štiepení EcoRI, hybridizovanú na BDNF/NGF. Polohy fragmentov genómu pre BDNF a NGF po štiepení enzýmom EcoRI sú znázornené písmenami B a N.

Na obr. 14 je znázornené porovnanie NGF a BDNF s novým členom skupiny BDNF/NGF, ktorý bol identifikovaný pomocou PCR z DNA myši s použitím primérov zostavy 3/zostavy 4. Nový gén, označený ako M3/4 a známy taktiež ako Neurotrofín-3 alebo NT-3 je znázornený len svojím kódovým reťazcom a odvodeným reťazcom aminokyselín v porovnaní s úplným NGF myši a úplným BDNF prasaťa, potkana, myši alebo človeka. Pomlčky znázorňujú polohy, v ktorých je vynechaný v NGF kodón, aby bolo možné reťazec lepšie porovnať s reťazcom BDNF a M3/4. Kurzívou sú označené miesta so zodpovedajúcimi kyselinami a/alebo konzervatívne substitúcie aminokyselín.

Na obr. 15 je znázornený Northem blot RNA z rôznych ľudských bunkových línií, odvodených od nádorových tkanív hybridizovaných na ľudský BDNF, použitý ako sonda.

Na obr. 16 je znázornený vplyv depolarizácie na úroveň mRNA pre BDNF v neurónoch hippocampu.

a) Priebeh expresie mRNA pre BDNF v čase v primárnej kultúre hippocampových neurónov za prítomnosti 50 mM

KC1. Celková bunková RNA bola extrahovaná z 0,5 x 10^ buniek, glyoxylovaná a analyzovaná elektroforézou na

1,3% agarózovom géli (Biziere K. a Coyle T., Neurosci.,

1978, Lett. 8:303; McGeer a ďalší, 1978, Brain Res. 139 až

381). RNA bola prenesená na filtre Hybond N a hybridizo13

SK 279668 Β6 vaná s 32p._zna£_erlou cRNA-sondou (špecifická účinnosť 1()9 impulzov za minútu/pg, špecifickou pre myšací BDNF a získanú transkripciou in vitro. Dva horné pásy (4 a 1,5 kb) zodpovedajú mRNA BDNF. Dva pásy BDNF (4 kb a

1,5 kb) sú odolné proti RNáze A a reprezentujú dva rôzne transkripty, ktoré sú však zrejme riadené podobným spôsobom, spodný pás (700 bp) zodpovedá 10 pg krátkeho štandardu mRNA BDNF, ktorý bol k vzorkám pridaný pred extrakciou RNA.

b) Závislosť od vápnika. Neuróny boli inkubované 3 hodiny v normálnom živnom prostredí (CM), v modifikovanom prostredí bez vápnika (-Ca) alebo v živnom prostredí s 10 μΜ nifedipínu (NIF). Tam, kde je to označené, bolo pridaných 50 mM KC1 (+K).

Na obr. 17 je znázornený vzostup mRNA pre NGF v neurónoch hippocampu pôsobením draslíka a kyseliny kaínovej. Neuróny boli inkubované 3 hodiny v kontrolnom prostredí (C) alebo v prítomnosti 50 mM KC1 (K+) alebo v prítomnosti 25 μΜ kyseliny kaínovej (KA). RNA bola extrahovaná a hladina mRNA pre NGF bola stanovená kvantitatívnou PCR (11). Hodnoty sú priemerom (n = 6) ± štandardná odchýlka.

Na obr. 18 je znázornený vzťah medzi dávkou a účinkom na pôsobenie kyseliny kaínovej. RNA bola extrahovaná a analyzovaná spôsobom, opísaným na obr. 16. Hodnoty sú priemerom z troch pokusov □ smerodajná odchýlka. Hippocampové neuróny boli inkubované 3 hodiny pri rôznych koncentráciách kyseliny kaínovej.

Na obr. 19 je znázornený časový priebeh vzostupu mRNA pre NGF a pre BDNF pôsobením kyseliny kaínovej. Bola extrahovaná celková bunková RNA a analyzovaná spôsobom, opísaným na obr. 16 z hippocampu (a) alebo z mozgovej kôry (b) v označenom čase (v hodinách) po intraperitoneálnej injekcii kyseliny kaínovej v množstve 12 mg/kg. 90 minút po kyseline kaínovej bola podaná jediná dávka diazepamu (10 mg/kg) (dva pásy pre BDNF, 4 a

1,5 kb sú odolné proti pôsobeniu RNázy A a znamenajú dva odlišné transkripty, ktoré sú však pravdepodobne riadené podobným spôsobom). Hodnoty, zodpovedajúce

1,5 kb mRNA-BDNF (o) a 1,3 kb mRNA-NGF (o) sú taktiež znázornené. Podobný vzostup bol pozorovaný pre 4 kb mRNA-BDNF. Uvedené hodnoty sú priemerom z troch až štyroch stanovení ± smerodajnej odchýlky (SEM).

Na obr. 20 je znázornený vplyv protikŕčových látok na expresiu mRNA-BDNF, vyvolanú kyselinou kainovou. Potkanom bol podaný intraperitoneálne diazepam (10 mg/kg) (DZ); MK-801 (1 mg/kg) (MK) alebo ketamín (20 mg/kg) (KET) 15 minút pred injekciou kyseliny kaínovej (12 mg/kg) (+KA) alebo fyziologického roztoku chloridu sodného (kontrola). Po troch hodinách bolo tkanivo hippocampu pripravené na prípravu celkovej RNA spôsobom, ktorý bol opísaný na obr. 16. Hodnoty znamenajú priemer z troch pokusov ± SEM.

Na obr. 21 sú znázornené bunkové kultúry septa A až F. Ide o mikrofotografie vo fázovom kontraste, zaznamenaný je priebeh bunkového rastu kultúry v čase. Bunky boli nanesené v hustote 1,3 x 10^ buniek/cm³ a udržiavané v 5 HS/NS tak, ako je opísané v texte. Záznam bol vykonávaný v časových intervaloch 1 (A, B), 2 (C, D) a 4 (E, F) dňoch. Boli použité špecifické značiace prostriedky na identifikáciu populácie buniek, neurónov, histochemicky sfarbených AChE (G, H) a neurónov, imunopozitívnych na receptor NGF (I). Ciachovacia tyčinka = 25 pm.

Na obr. 22 je uvedené porovnanie odpovedi disociovaných buniek septa na pôsobenie BDNF alebo NGF na báze počtu AChE buniek.

A) Porovnanie odpovede na BDNF (25 ng/ml), NGF (20 ng/ml) alebo kombinácie oboch týchto látok pri rôznej hustote buniek.

B) Porovnanie odpovede cholinergných neurónov na rôzne koncentrácie BDNF alebo NGF (0 až 50 ng/ml). Pre oba typy pokusov boli bunky pestované 11 až 12 dní v prostredí s obsahom séra. Údaje sú priemerom zo 6 až 9 stanovení ± SEM.

Na obr. 23 je znázornený graf, ktorý uvádza vplyv oneskoreného pridania BDNF alebo NGF na disociované kultúry septa. BDNF (50 ng/ml) alebo NGF (50 ng/ml) boli pridané k disociovaným bunkovým kultúram s oneskorením 5 až 6 hodín (+12), 5 dní (-5/+7) alebo 7 (-7/+5) dní. Kultúry boli pestované 12 dní. Potom boli bunky vyhodnotené na báze pozitívneho histochemického sfarbenia AChE. Výsledky sú priemerom zo 4 až 5 stanovaní + SEM.

Na obr. 24 je znázornený graf na schopnosť BDNF a NGF riadiť počet receptorov pre NGF v imunopozitívnych bunkách.

Skúška na počet receptorov pre NGF bola vykonávaná s použitím monoklonálnej protilátky 192-IgG v riedení 1 : : 1000. Disociované bunky septa boli nanesené na platne s hustotou 1,3 x ÍO³ buniek/cm a bunky boli spracovávané kontinuálne počas 12 dní. Bolo vykonané porovnanie medzi nasýtenou dávkou NGF a celým radom dávok BDNF v rozmedzí 0 až 100 ng/ml. Znázornené výsledky sú priemerom zo štyroch stanovení ± SEM.

Na obr. 25 je znázornená krivka závislosti účinku od dávky na indukciu účinnosti CAT pre BDNF (A) a NGF (B). Kultúry boli nanesené do vyhlbenín s priemerom 6 mm, potiahnutých polyomitínom a laminínom a boli udržiavané 12 dní v prostredí 5 HS/N3. Bunky boli vystavené pôsobeniu BDNF alebo NGF počas 5 až 6 hodín pred nanesením na platne. Faktory boli menené každé 3 dni súčasne s výmenou živného prostredia. Získané výsledky sú priemerom z 5 až 6 stanovení ± SEM.

Na obr. 26 je znázornená závislosť dávky a účinku v prípade enzymatickej účinnosti AChE pre BDNF a NGF. Cholinergné neuróny potkanieho septa boli pestované 12 dní v živnom prostredí s obsahom séra s doplnkom hormónov. Potom boli bunky podrobené pôsobeniu BDNF (prázdne štvorčeky) a NGF (plné štvorčeky) tak, ako bolo opísané na výkrese 25. Výsledky sú priemerom zo 6 až 9 stanovení ± SEM. Účinnosť AChE v neošetrených kultúrach bola 16,4 ± 2 nmol/h/vyhĺbenie.

Na obr. 27 je znázornený časový priebeh účinnosti enzýmu CAT, indukovanej BDNF v porovnaní s NGF. Časové požiadavky na stimuláciu účinnosti CAT boli sledované na bunkách s hustotu 2,3 x KÚ buniek/cm³, pestovaných po rôznu dobu v prostredí s obsahom séra s doplnkom hormónov a exogénnych faktorov. Bunky boli zo začiatku vystavené pôsobeniu BDNF (prázdne štvorčeky) alebo NGF (plné štvorčeky) 5 až 6 hodín po nanesení na platne. Výsledky sú uvedené v % účinnosti stanovenej na ošetrených kultúrach v porovnaní s kultúrami neošetrenými (n = 6, BDNF 12 dní n = 3).

Na obr. 28 jc znázornené porovnanie účinku gliálnych buniek na schopnosť BDNF indukovať enzymatickú účinnosť CAT. Septálne bunky boli pestované na platniach pri hustote 2, 3 x 1()5 buniek/cm³. Počas 5 až 6 hodín bolo prostredie nahradené buď prostredím zbaveným séra alebo prostredím s obsahom séra, obe prostredia boli doplnené 1 % N3, ako je podrobne vysvetlené v texte. Na 24 hodín bol pridaný cytozínarabinozid (1 μΜ) na ďalšie zníženie počtu astrocytov. Potom boli kultúry pestované 12 dní. Výsledky predstavujú priemer zo 4 stanovení + SEM.

Na obr. 29 je znázornený graf, ktorý uvádza vplyv BDNF alebo NGF na úroveň príjmu cholínu. Príjem cholínu bol sledovaný na bunkách, pestovaných 11 dní pri hustote 1,3 x 1 <)5 buniek/cm^. Po celý čas pestovania boli bunky vystavené účinku BDNF (50 ng/ml) alebo NGF (50 ng/ml). Údaje sú priemerom z 5 stanovení ± SEM pre BDNF a z 10 stanovení ± SEM pre NGF.

Na obr. 30 je znázornené delenie 35S-značených reakčných produktov enzymatického štiepenia ľudského BDNF trypsínom a endoproteinázou Arg-C na SDS-Page.

Na obr. 31 je znázornená biologická skúška na DRG, porovnávajúca nespracovaný CHO-hBDNF s CHO-hBDNF, rozštiepeným endoproteinázou. Rast neurónov sa hodnotí stupnicou 0 až 5, pričom hodnotenie 5 znamená maximálnu biologickú účinnosť.

Na obr. 32 sú znázornené vo fázovom kontraste (A) a v osvetlenom poli (B, C) mikrofotografie disociovaných kultúr E14 buniek ventrálneho potkanieho mesencephala, farbené po 9 dňoch pestovania v kultúre pomocou monoklonálnych protilátok proti tyrozínhydroxyxyláze (TH). A a B. Fázový kontrast a mikrofotografie toho istého poľa v plnom osvetlení ukazujú malé množstvo TH-neurónov v týchto kultúrach. Je možné pozorovať len jediný TH+ - neurón (šípky), ktoré obsahuje celý rad jasných neurónov s dlhými vláknami. Je možné pozorovať tiež niekoľko buniek, odlišných od neurónov a to pomocou morfologickej analýzy alebo farbením na GFAP (neznázomené).

C. Fotografia v osvetlenom poli znázorňuje dva TH+ - neuróny (malé šípky) v poli, obsahujúcom približne 98 jasných buniek s morfologickými znakmi neurónov. Ciachovacia tyčinka -100 IM.

Na obr. 33 je vo veľkom zväčšení uvedená mikrofotografia 6 dní starých kultúr E14 buniek ventrálnych mesencefalických buniek potkana so zmenenou morfológiou TH+ - neurónov, niektoré z nich majú veľký rast vláken a veľmi vyjadrené rastové kónusy (A, B). Kultúry boli založené a sfarbené rovnakým spôsobom ako v prípade výkresu 32. Veľkosť ciachovacej tyčinky = 25 μΜ.

Na obr. 34 je znázornený pozitívny účinok BDNF na prežitie TH+ - neurónov, dopaminergných neurónov mesencephala v kultúre pri závislosti účinku od veľkosti dávky, účinok je možné pozorovať po dobe dlhšej než 3 dni.

A) Porovnanie počtu TH+ - neurónov v kultúrach E14 ventrálnych mesencefalických buniek potkana, ktoré boli udržiavané bez prítomnosti BDNF (prázdne stípčeky) alebo v prítomnosti BDNF (plné stlpčeky) V ošetrených kultúrach bol BDNF pridaný raz denne v dávke 50 ng/ml v druhom dni pestovania kultúry. Na 3. deň nebolo možné pozorovať žiadny rozdiel medzi kontrolnými a ošetrenými kultúrami, ale počet TH+ - neurónov v kultúrach, ku ktorým bol pridaný BDNF, bol 1, 8-krát vyšší než v kontrolných kultúrach v 8. dni. Hodnoty sú vyjadrené priemerom z dvoch stanovení.

B) Účinok BDNF na vyššie prežívanie TH+ - neurónov je závislý od jeho dávky.

Počet TH+ - neurónov bol stanovený v dvojitom opakovaní po 8 dňoch pestovania v kultúre v neprítomnosti BDNF alebo v prostredí, obsahujúcom zvyšujúce sa koncentrácie BDNF, ktorý bol pridaný vždy v 2. dni.

C) NGF nemá žiadny účinok na prežitie TH+ - neurónov. Aby bolo možné dokázať špecifickosť pôsobenia BDNF, boli kultúry pestované tiež za prítomnosti alebo v neprítomnosti NGF v dávke 50 ng/ml počas 8 dní a potom boli analyzované na prítomnosť TH+ - neurónov. NGF, pridaný v 2. dni nezvýšil prežívanie TH+ - neurónov v kultúrach, ktoré boli skúmané v dňoch 6 alebo 8. Výsledky sú priemerom z dvojitého opakovania.

Na obr. 35 je znázornený vplyv BDNF na ďalšie zvýšenie prežívania TH+ - neurónov, porovnanie bolo vykonané s opakovanými dávkami BDNF a jedinou dávkou v 2. dni. Kultúry boli pripravené rovnako, ako je opísané v texte. Rekombinantný ľudský BDNF bol čistený zo supernatantu buniek COS M5. Kultúry boli ošetrené jediným pridaním (SA, bodkované stĺpce) BDNF (50 ng/ml) v 2. deň alebo opakovanými dávkami BDNF (50 ng/ml) v dňoch 1, 2, 4, 6 a 8 (MA - mnohopočetné pridanie, plné stĺpce). V uvedenom čase boli kultúry fixované a farbené na TH-imunoreakti-vitu. Doplňovaním BDNF jeho opakovaným pridávaním bolo možné dosiahnuť 2,7-krát vyšší počet TH+ - neurónov v 11. dni v porovnaní s kontrolnými kultúrami, zatiaľ čo pri jedinom podaní BDNF bol maximálny vzostup počtu po 11 dňoch o málo vyšší než dvojnásobný. Výsledky sú uvedené pre dvojité opakovanie skúšok ako ich priemer.

Na obr. 36 je graficky znázornená skutočnosť, že pri oneskorenom pridaní BDNF nedochádza k takému veľkému zvýšeniu počtu TH+ - neurónov ako pri jeho pridaní v 2. dni. Kultúry boli pripravené spôsobom, uvedeným v texte až na čas pridania exogénneho BDNF. Všetky kultúry' boli pestované odo dňa 2 v prostredí, zbavenom séra a BDNF bol pridaný v jedinej dávke 50 ng/ml (BDNF z mozgu prasaťa) v dni 2, 5 alebo 7 (CD2, CD5, CD7). V dňoch 6, 8 a 10 bol stanovený počet TH+ - neurónov v dvojitom opakovaní. Pri tomto pokuse došlo po pridaní BDNF v 2. dni k trojnásobnému zvýšeniu počtu TH+ - neurónov v 10. dni. V prípade, že bol BDNF pridaný neskoršie, v dni 5, bolo možné tiež pozorovať zvýšenie počtu TH+ - neurónov v porovnaní s kontrolami v 10. dni, ale toto zvýšenie bolo menej než dvojnásobné a rozdiel medzi počtom TH+ - neurónov medzi ošetrenou kultúrou a kultúrou kontrolnou sa už v priebehu času nezvyšoval. Výsledky kontrolných pokusov sú vyjadrené prázdnymi stĺpcami. Pridanie BDNF v 2. dni - bodkované stĺpce. Pridanie BDNF v 7. dni - plné stĺpce. Pridávanie BDNF v 77. dni je vyjadrené diagonálne šrafovanými stĺpcami.

Na obr. 37 je znázornená závislosť odpovede od dávky BDNF na príjem GABA v kultúre hippocampových neurónov. BDNF, čiastočne čistený zo supernatantu buniek COS M5 bol pridaný ku kultúram v rôznom riedení. Bolo dokázané, že BDNF v riedení 1 x 10'2 mal maximálny účinok na vývoj neuritov u E8 kuracieho ganglia dorzálnych koreňov. Príjem 3 H-GABA bol meraný 8 nasledujúcich dní po podaní BDNF in vitro.

Na obr. 38 je znázornená skutočnosť, že BDNF je schopný chrániť dopaminergné neuróny substantia nigra pred neurotoxickými účinkami MPP+. Kultúry boli získané z potkaních embryí spôsobom podľa obr. 1. Po 24 hodinách in vitro bolo živné prostredie nahradené prostredím zbaveným séra. Po troch dňoch boli kultúry rozdelené na štyri časti a uložené do šiestich misiek s priemerom 35 mm. Jedna skupina buniek bola kontrolná, k ďalším skupinám bol pridaný i) rastový faktor z bázických fibroblastov, 10 ng/ml, (bFGF z hovädzieho mozgu, Boehringer15

Mannheim) alebo ii) myšací NGF, 50 ng/ml alebo iii) BDNF, 50 ng/ml. Kultúry boli udržiavané ďalších 24 hodín a potom boli 3 misky z každej skupiny vystavené pôsobeniu 1 μΜ MPP+ (Research Biochemicals, Inc., Natick, MA) na dobu 48 hodín. Na konci pokusu, ktorý trval celkom 6 dní boli všetky vzorky skúmané na ΊΉ-imunoreaktivitu a v každej skupine buniek bol stanovený počet TH+ - buniek. Udané údaje sú počet buniek TH+ -neurónov po pôsobení MPP+, vyjadrený v percentách počtu TH+ - neurónov v podobných kultúrach, nevystavených pôsobeniu MPP+. Všetky hodnoty sú priemer ± SEM na trojité opakovanie.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Molekulárne klonovanie a charakterizácia cDNA pre neurotrofný faktor, odvodenej z mozgu prasaťa

Nesmieme malé množstvo BDNF v tkanivách vylučovalo použitie bežných spôsobov klonovania pre gén tejto látky. Postupovalo sa tak, že obmedzené údaje o reťazci bielkoviny boli postupne doplňované použitím amplifikácie DNA nasledujúcim spôsobom:

(i) Z kilogramového množstva mozgu prasaťa boli vyčistené mikrogramové množstvá BDNF (ii) Čistený BDNF bol analyzovaný s použitím malého množstva materiálu a bol stanovený súvislý reťazec s obsahom 36 aminokyselín.

(iii) Na základe takto zisteného reťazca aminokyselín boli syntetizované oligonukleotidy, ktoré potom boli použité ako priméry na PCR-reakciu s použitím cDNA z colliculus superior prasaťa ako templátu na amplifikáciu kódovej DNA pre definovaný fragment reťazca aminokyselín.

(iv) Reťazec reakčného produktu zo stupňa iii) bol ďalej analyzovaný.

(v) Boli syntetizované zodpovedajúce oligonukleotidové priméry za využité pri PCR-reakcii s cDNA colliculus superior prasaťa za vzniku prekrývajúcich sa fragmentov DNA, predstavujúcich mRNA pre BDNF oboma smermi od pôvodného fragmentu s obsahom 36 aminokyselín. Týmto spôsobom bola molekulárne klonovaná kódová oblasť preBDNF prasaťa vo forme dvoch prekrývajúcich sa fragmentov.

Ďalej budú uvedené podrobnosti jednotlivých uvedených stupňov a tiež ďalšie charakterizácie génu pre BDNF.

Materiál a metódy

Čistenie BDNF z mozgu prasaťa

Čistenie BDNF z mozgu prasaťa bolo vykonávané v podstate spôsobom podľa publikácie Hofer a Barde, 1988, Náture, 331:261 až 262.

kg mozgu prasaťa bolo homogenizovaných v homogenizačnom zariadení Ultra-Turrax v 0,2 M fosforečnanu sodného ako pufri s pH 6,0 s obsahom 1 mM EDTA a 1 mM čerstvo pridaného fenylmetánsulfonylfluoridu. Bol použitý pomer 1 kg mozgu na 2 litre pufru. Potom bolo upravené pH supematantu na hodnotu 4,0 pridaním 1 M HC1 a zmes bola miešaná 2 hodiny pri teplote 4 °C. Po odstredení 25 minút pri 20 000 g boli supematanty (upravené na pH 6,0 pridaním 1 M NaOH) zodpovedajúce množstvu 3 kg mozgového tkaniva spojené, miešané 2 hodiny s 1 litrom vopred nabobtnanej karboxymetylcelulózy, uvedenej do rovnovážneho stavu v 0,1 M fosforečnanu sodného s pH

6,0. Po dvojitom premytí celkovým množstvom 20 litrov 0,1 M fosforečnanu sodného s pH 6,0 bola suspenzia vliata do stĺpca a premývaná cez noc tým istým pufrom s obsahom 0,13 M chloridu sodného. Aktívne frakcie potom boli vymyté fosfátovým pufrom s obsahom 0,5 M chloridu sodného a potom dialyzované proti 1 x 5 litrom 5 mM fosforečnanu sodného s pH 6, 8. Dialyzované frakcie, ktoré boli získané spracovaním 2 x 3 kg východiskového materiálu boli nanesené na stĺpec s obsahom 130 ml hydroxyapatitu, vopred uvedený do rovnovážneho stavu s 5 mM fosforečnanu draselného s pH 6,8. Potom bol stĺpec vymývaný s použitím lineárneho gradientu 500 ml 5 mM a 500 ml 700 mM fosforečnanu draselného vždy s pH 6,8. Určité množstvo BDNF bolo vymyté s použitím 500 mM fosforečnanu draselného, ako bolo tiež uvedené v publikácii Barde a ďalší, EMBO J., 1982, 1:549 až 553. Pridaním 1,0 M fosforečnanu draselného boli spojené aktívne frakcie upravené na konečnú molámu koncentráciu 700 mM fosforečnanu draselného a materiál bol nanesený na stĺpec s obsahom 5 ml fenylsepharózy v rovnovážnom stave so 700 mM fosforečnanom draselným s pH 6,8. Po premytí stĺpca 40 ml toho istého pufra bol BDNF vymývaný 0,1 M fosforečnanom draselným s pH 6,8, dialyzovaný proti destilovanej vode a potom lyofilizovaný. Lyofilizovaný materiál bol rozpustený v pufri na nanášanie vzorky na SDS-gél na elektroforézu s obsahom 0,1 SDS bez merkaptoetanolu, pufer bol opísaný v publikácii Barde a ďalší, EMBO J., 1:549 až 553 a potom bola vzorka nanesená na SDS-gél s lineárnym (nie exponenciálnym) gradientom 10 až 25 % akrylamidu. Po skončení elektroforetického delenia bol gél krátko farbený (10 minút) Coomassieovou modrou, potom bol odfarbovaný 20 minút a bol vystrihnutý pás putujúci na úrovni cytochrómu c, tento pás bol potom z gélu elektroforeticky vymytý. SDS bol odstránený spôsobom podľa publikácie Barde a ďalší, EMBO J., 1:549 až 553. Ďalšie čistenie, ktoré potom viedlo k stanoveniu reťazca BDNF bolo modifikované podľa publikácie Hofer a Barde, 1988, Náture 331:261 až 262, takže v poslednom stupni čistenia nebola použitá elektroforéza na géli.

Stanovenie reťazca bielkoviny

Reťazec BDNF bol stanovený jednak priamo (55 pmólu podľa stanovenia analýzou aminokyselín, s počiatočným výťažkom 40 pmolu pre aminoterminálny histidín), jednak bol rozštiepený nasledujúcim spôsobom: 5 až 10 mikrogramov BDNF (z 5 rôznych prípravkov) sa rozštiepi nasledujúcim spôsobom: 1 mikrogram Staphylococcus aureus V8 (Miles) sa pridá k 5 pg BDNF v 0,2 M uhličitane amónnom s pH 8 s obsahom 10 % acetonitrilu (celkový objem 50 mikrolitrov) a materiál sa inkubuje cez noc pri teplote miestnosti. Trypsín: 1 pg trypsínu, spracovaného TPCK (pankreas hovädzieho dobytka, Sigma Typ XIII) sa pridá k 8 pg BDNF v tris-HCl (0,1 M, pH 8,0) s obsahom 10 mM chloridu vápenatého (celkový objem 40 pl) a zmes sa inkubuje cez noc pri teplote 37 °C. Bromkyán (CNBr): 10 pg BDNF sa inkubuje 3 hodiny pri teplote miestnosti (celkový objem 60 pl) s 10% CnBr v 70% kyseline mravčej (konečná koncentrácia). Po pridaní 500 pl vody na konci reakcie sa vzorka zahustí na objem 50 pl v odpaľovacom zariadení. Potom sa pridá 50 pl tris-HCl (1,0 M, pH 8,0) spolu s 5 pl D-merkaptoetanolu a vzorka sa inkubuje cez noc pri teplote 37 °C. Pridá sa ešte 5 pl jódmetánu a vzorka sa odparí do sucha na odpaľovacom zariadení. Bolo zistené, že po rozštiepení pôsobením CNBr jc nutné vyko nať redukciu a alkyláciu BDNF. Bez redukcie nebolo možné získať žiadne fragmenty, ako bolo možné dokázať HPLC a Swank-Munkresovou elektroforézou na SDS-géli podľa publikácie Swank a Mukres, 1971 Anál. Biochem. 39:462 až 477. To dokazuje, že v BDNF sú obsiahnuté disulfidové mostíky a sú usporiadané takým spôsobom, že žiadnym štiepením nie je možné získať voľné peptidy. Po všetkých štiepeniach boli vysušené vzorky znova uvedené do suspenzie v 0,1% kyseline trifluóroctovej TFA a nanesené na stĺpec C8 microbore HPLC v reverznej fáze (Applied Biosystems) a potom boli peptidy vymývané rýchlosťou 0,1 ml/min. s použitím 60 minút lineárneho gradientu 0 až 60 % acetonitrilu v 0,1% TFA. Detekcia bola vykonávaná pri 214 nm s použitím UV detektora Waters 441. Reťazec peptidu bol analyzovaný s použitím Edmanovej automatickej degradácie v plynnej fáze (model 470 A, Applied Biosystems). Analýza bola vykonávaná spôsobom podľa publikácie Hewick, 1981, J. Biol. Chem. 256:7990 až 7997 a Hunkapillar, 1983, Methods Enzymol. 91:227 až 236. Detekcia PTH aminokyselín bola opísaná v publikácii Lottspeich, 1985, J. Chromatograph. 326: 321 až 327.

Príprava DNA templátov

DNA genóm prasaťa bola izolovaná spôsobom podľa publikácie Herrmann a Frischauf, 1987, Methods Enzymol. 152:180 až 183.

Na prípravu cDNA bola získaná celková RNA zo vzorky s hmotnosťou 6 g z colliculus superior mozgu prasaťa. Bola odobraná vzorka tkaniva, ktorá bola zmrazená v kvapalnom dusíku na miestnych jatkách. Na extrakciu RNA boli použité zvyčajné postupy, napríklad podľa publikácie Okayama a ďalší, 1987, Methods Enzymol. 154:3 až 28. 80 mikrogramov celkovej DNA bolo použitých na transkripciu pomocou reverznej transkriptázy s použitím vírusu myšacej leukémie Moloney (BRL, podľa údajov výrobcu až na to, že bol pridaný 1 μΐ RNázy a bol vynechaný actinomycin D), bola použitá zmes priméru CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTT s A, C alebo G ako terminálnym 3'-nukleotidom (oligo3, konštruovaný tak, aby zodpovedal 3'-poly-A-predíženiu a aby obsahoval miesto štiepenia enzýmami BamHl, EcoRI a PstI).

PCR-reakcie

Polymerázová reakcia (PCR) bola vykonaná spôsobom, opísaným v publikácii Saiki a ďalší, 1985, Science 230:1350 až 1354.

Výsledky a diskusie

Výsledky stanovenia reťazca bielkoviny

Výsledky, získané stanovením reťazca bielkoviny s použitím malých množstiev tejto bielkoviny sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke IV.

Tabuľka IV

Experimentálne stanovený reťazec peptidu BDNF

N-terminálna časť	HSDPARRGELSV
V8	XVTAADKKTAVD
V8	KVPVSKGQLKQYFYE
CNBr	XGGTVTVLEKVP (V) (S)
CNBr	GYTKEGXRGIXRGI
Trypsín	(T) AVDMSGGTVTVLEK
Trypsln	ALTMDSK

V kombinovanom reťazci VTAADKK.TAVDMSGGTVTVLEKVPVSKG QLKQYFYE znamenajú podčiarknuté aminokyseliny reťazce, pre ktoré sú kódom oligonukleotidové priméry, použité pri PCR, ako bolo uvedené v odstavci Stanovenie reťazca bielkoviny.

Použitím Edmanovej degradácie boli zistené štyri reťazce aminokyselín, ktoré potom bolo možné použiť na dedukciu reťazca 36 aminokyselín, ktoré predstavujú približne tretinu celého reťazca aminokyselín.

Syntéza oligonukleotidov a použitie PCR na získanie kódovej DNA pre fragment aminokyselín

Dva plne degenerované oligonukleotidové priméry (17-méry) boli chemicky syntetizované na základe kódového reťazca pre úseky šiestich aminokyselín v blízkosti aminoterminálneho a karboxyterminálneho zakončenia fragmentu s obsahom 36 aminokyselín tak, ako bol opísaný v odstavci Výsledky stanovenia reťazca bielkoviny. Najmä potom boli syntetizované dve oddelené zmesi oligonukleotidov (17-mérov) zodpovedajúcich všetkým kodónom a označenej oligol a oligo2, na základe reťazca AADKKT (antikódujúci reťazec) a KQYFYE (kódujúci reťazec). Potom bolo 150 pmólov každého priméru pridaných k 1 pg DNA genómu prasaťa ako templátu. Potom bolo vykonaných 35 amplifikačných cyklov s použitím PCR-reakcie podľa inštrukcií výrobcu (GeneAmpTM Perkin-Elmer Cetus). Denaturácia bola vykonávaná jednu minútu pri teplote 94, väzba priméru 2 minúty pri teplote 45 °C a extenzia priméru 2 minúty pri teplote 72 °C. Pás DNA s predpokladanou dĺžkou 101 bp bol vystrihnutý z 3 % agarózového gélu (sfarbeného etidiumbromidom) a asymetricky amplifikovaný spôsobom podľa publikácie Innis a ďalší, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436 až 9440 s použitím 100násobného prebytku buď oligol alebo oligo2.

Oligonukleotidový reťazec fragmentu cDNA

Výsledné antikódujúce a kódujúce fragmenty DNA boli analyzované metódou s použitím dideoxynukleotidov podľa publikácie Sanger a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3918 až 3921, ako priméry boli použité oligonukleotidy 1 a 2, značené na koncoch pomocou 32p Získaný reťazec nukleotidov obsahuje len jeden otvorený čítací rámec, neprerušený terminačným kodónom. Odvodený reťazec aminokyselín pre tento otvorený čítací reťazec bol celkom v súlade so skutočným reťazcom aminokyselín, ktorý bol pre túto oblasť stanovený v BDNF prasaťa.

Klonovanic celej cDNA pre BDNF prasaťa

Úplná kódová oblasť pre BDNF prasaťa bola molekulárne klonovaná vo forme dvoch prekrývajúcich sa segmentov. Aby bolo možné získať 3'-oblasť (relatívne k antikódujúcemu reťazcu) pre cDNA pre BDNF, bol syntetizovaný oligonukleotidový primér (30-mér), obsahujúci 21 báz predného antikódujúceho reťazca BDNF z vyššie opísanej oblasti, tento reťazec slúžil ako antikódujúci primér. Nukleotidový reťazec tohto priméru bol oligo 4, (5')AAACTAGTCGACGGCAGTGGACATGTCGGG(3') (podčiarknuté bázy zodpovedajú reťazcu, ktorý je antikódujúcim reťazcom pre BDNF od polohy 643 do 663 na obr. 1 a je kódom pre reťazec aminokyselín Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly (prvé dve bázy pre kodón Gly). Ďalších 9 nukleotidov na 5-zakončeni tohtopriméru bolo zahrnutých preto, aby bolo ľahké vykonať reštrikciu pomocou endonukleáz Spel a Sali pri molekulárnom klonovaní. Bol tiež zostavený degenerovaný oligonukleotidový primér (31-mér) tak, aby bol komplementárny k reťazcu, predĺženému pomocou Poly-A a predchádzanému akýmkoľvek nukleotidom (T, G alebo C) antikódujúceho reťazca cDNA, súčasne tento reťazec obsahoval miesta štiepenia reštrikčných endonukleáz BamHl, EcoRI a PstI. Reťazec tohto antikódujúceho priméru (oligo3) bol (5')CGGATGGCAATTGTGCAGTTTTTTTTTTTTX(3’), kde X = A, C alebo G. Syntetické oligonukleotidové priméry boli použité na amplifikáciu reťazcov z colliculus superior prasaťa, a to z cDNA pomocou PCR. Špecificky bol získaný reťazec 3'-amplifikovanej cDNA s použitím 10 μΐ prostriedku s obsahom reverznej transkriptázy, 150 pmólov antikódujúceho priméru (oligo4) a 150 pmólov oligo3 ako kódujúceho priméru pri reakcii PCR. Analýza Southern blot bola vykonaná na amplifikovaných produktoch DNA a pás, poskytujúci hybridizačný signál s oligonukleotidom AAGGATCCTGCAG TTGGCC TTTCGAGACGG (oligo5, použitý ako kódujúci primér pri 5'-reakcii, opísanej a obsahujúci miesta štiepenia enzýmov BamHl a PstI) bol vystrihnutý, extrahovaný s použitím postupu glassmilk (gencleanTM, rozštiepený EcoRI a Sali, klonovaný v plazmide Bluescript SK⁺ (Stratagene) a následným klonovaním).

Aby bolo možné získať zvyšok reťazca pre BDNF (smerom hore od 5'-oblasti), bola pripravená cDNA podobným spôsobom a na 5'-zakončení boli naviazané PolyA-zakončenia s použitím terminálnej deoxynukleotidtransferázy. Tá istá zmes troch oligonukleotidov (31-mérov), z ktorých každý obsahoval 12 po sebe nasledujúcich zvyškov T, opísaných, bola použitá na konštrukciu priméru, komplementárneho k naviazaným poly-A-reťa-zcom. Bol syntetizovaný aj oligonukleotidový primér (30-mér), obsahujúci 17 báz, zodpovedajúcich komplementárnemu reťazcu kódového reťazca pre BDNF a obsahujúci miesta štiepenia reštrikčnými endonukleázami BamHl a PstI. Tento primér je možné vyjadriť nasledujúcim reťazcom: (5')AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG(3'). Ide o uvedený oligo5, podčiarknuté bázy označujú oblasť, komplementárnu k anikódujúcemu reťazcu pre BDNF od polohy 709 do polohy 693 na obr. 1. Reťazec zodpovedá reťazcu, ktorý je kódom pre reťazec aminokyselín Pro (posledné dve bázy kodónu)-Val-Ser-Lys-Gly-Gln. Priméry boli pridané k cDNA s naviazanými poly-A-reťazcami a potom bola vykonaná amplifikácia uvedeným spôsobom. Reakčné produkty boli rozštiepené PstI a klonované vo vektore Bluescript, nukleotidový reťazec bol stanovený terminačnou metódou s použitím dideoxynukleotidov.

Nukleotidový reťazec cDNA pre BDNF prasaťa

Na obr. 1 jc uvedený nukleotidový reťazec pre prekrývajúce sa časti klonov cDNA pre BDNF prasaťa. Reťazec obsahuje otvorený čítací rámec pre polypeptid s 252 aminokyselinami. Identifikácia iniciačného kodónu Met (ATG) je založená na prítomnosti dvoch kodónov na ukončenie reťazca (TAG-TGA) v tom istom čítacom rámci po 36 pároch báz v smere odčítania. Aminoterminálne zakončenie BDNF prasaťa, stanovené priamou analýzou reťazca na čistenej bielkovine zodpovedá zvyšku His 134 tohto polypeptidu. Zvyšku His 134 bezprostredne predchádza reťazec Arg-Val-Arg-Arg. Takéto reťazce, v ktorých je jeden zvyšok bázickej aminokyseliny nasledovaný neutrálnou aminokyselinou a potom nasledujú ešte dva zvyšky bázickej kyseliny sa považujú za cieľové miesta na proteolytické spracovanie prekurzorových polypeptidov. Odvodený reťazec aminokyselín pre úplný BDNF predpokladá bielkovinu s obsahom 119 aminokyselín (molekulová hmotnosť 13 511 s bázickým nábojom (pi = 9,99) a s vlastnosťami, ktoré sú v súlade s predchádzajúcou charakterizáciou BDNF a jeho vyhodnotením ako biologicky účinného faktora na frakcionalizáciu dvojrozmernou elektroforézou na géli. Reťazec aminokyselín pre časti BDNF, stanovený analýzou reťazca nikrovzoriek (celkom 64 zvyškov aminokyselín) je v úplnom súlade s reťazcom aminokyselín, odvodeným od nukleotidového reťazca klonov cDNA tak, ako je podčiarknutý na obr. 1. Reťazec prekurzorového polypeptidu je v súlade so spracovaním BDNF aspoň v dvoch stupňoch: najskôr dochádza k odštiepeniu približne 18 zvyškov signálneho peptidu na aminoterminálnom zakončení a potom dôjde k štiepeniu medzi Arg 133 a His 134 na uvoľnenie úplného polypeptidu. V prípade, že tento model je správny, mal by byť prekurzor označovaný napríklad názvom preproBDNF.

Príklad 2

Gén pre BDNF je odlišný od génu pre NGF u rôznych druhov stavovcov

Materiál a metódy Príprava sond DNA pre NGF a BDNF

Od British Biotechnologies Limited bol získaný plazmid, obsahujúci syntetický gén, ktorý je kódom pre úplný ľudský NGF a obsahuje normálny kód pre ľudský NGF s niekoľkými málo konzervačnými substitúciami kodónov tak, aby boli zavedené vhodné miesta štiepenia reštrikčnými endonukleázami. Bol taktiež syntetizovaný pár oligonukleotidových primérov (18-mérov) na umožnenie amplifikácie segmentu tohto génu s 270 pármi báz, zodpovedajúceho kódovej oblasti pre zvyšky amynokyselin 9 až 111, pomocou PCR. Aby bolo možné získať značenú sondu DNA, bolo vykonaných 10 cyklov reakcie PCR s použitím 32p-dCTP. Sonda pre BDNF bola získaná podobným spôsobom s tým rozdielom, že amplifikácia bola vykonávaná s použitím DNA genómu prasaťa ako originálneho templátu a amplifikovaný úsek zodpovedal kódovej oblasti pre aminokyseliny 28 až 111 úplného reťazca BDNF. Bol tiež syntetizovaný komplementárny (t. j. kódujúci) primér, zodpovedajúci oblasti aminokyselín 106 až 111, s reťazcom báz (5')ACATACACAGGAAG TGTC(3). Antikódujúci oligonukleotidový primér bol pripravený pre oblasť zvyškov aminokyselín 28 až 33 a je možné ho vyjadriť reťazcom (5')GCAGTGGACACATGTCGGGT(3'). Hybridizácia Southem blot (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503 až 516) s použitím týchto dvoch sond bola vykonávaná za obmedzujúcich podmienok v 2 x SSC pri teplote 68 °C.

Stanovenie reťazca génov pre BDNF z rôznych druhov

Tie isté dva oligonukleotidy (18-méry), vymedzujúce kódovú oblasť pre aminokyseliny 28 až 111 úplného BDNF prasaťa tak, ako boli opísané, boli použité ako priméry na amplifikáciu (za štandardných podmienok pre PCR) segmentu s 252 pármi báz genómu DNA prasaťa, potkana, kurčaťa a človeka a výsledné produkty PCR-reakcie boli analyzované terminačnou metódou s použitím dideoxynukleotidov podľa publikácie Sanger a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3918 až 3921. V niektorých prípadoch bol pás pre amplifikovanú DNA vystrihnutý a extrahovaný po elektroforéze na agarózovom géli a potom reamplifikovaný pred analýzou reťazca. V iných prípadoch nebola reamplifikácia podstatná.

Výsledky a diskusia

Pred navrhnutím spôsobu podľa vynálezu bol čistený BDNF vo forme bielkoviny len z prasaťa. Bolo veľmi dôležité jednoznačne dokázať, že BDNF nie je len podjednotkou faktora, podporujúceho rast nervového tkaniva prasaťa (podjednotka beta alebo beta-NGF ale tiež len NGF) a to podjednotkou, ktorá až dosiaľ nebola čistená a podrobená molekulárnemu klonovaniu. Táto situácia bola zvlášť kritická z toho dôvodu, že predtým uvádzané fyzikálne vlastnosti BDNF prasaťa boli v podstate zhodné s vlastnosťami D-NGF-monoméru rôznych druhov živočíchov.

Skutočnosť, že neboli k dispozícii neutralizačné protilátky proti BDNF a súčasne neboli k dispozícii informácie o reťazci aminokyselín alebo nukleotidov v BDNF prasaťa, robila nemožným aj stanovenie skutočného vzťahu medzi BDNF a NGF. Zdalo sa prijateľné, že by pozorované rozdiely v biologickej účinnosti medzi BDNF a NGF mohli proste odrážať rozdiely medzi NGF prasaťa a niektorých ďalších živočíšnych druhov (napríklad myší) alebo by mohli byť dôsledkom rôznej modifikácie molekuly NGF v rôznych tkanivách (napríklad by mohlo ísť o rozdiel medzi modifikáciou v mozgu prasaťa a v slinnej žľaze myši) alebo dôsledkom modifikácie spôsobenej v bielkovine nechtiac v niektorom zo stupňov čistenia z mozgu prasaťa.

V prípade, že by bolo zistené, že BDNF je zreteľne odlišný od NGF, bolo by veľmi dôležité zistiť, či je gén pre BDNF prítomný aj v ďalších živočíšnych druhoch, najmä u človeka. Pred navrhnutím spôsobu podľa vynálezu nebola o tomto probléme k dispozícii žiadna informácia vzhľadom na to, že BDNF bol vyčistený len z jediného živočíšneho druhu. Prítomnosť neurotrofnej účinnosti, zreteľne odlišnej od účinnosti NGF v celom rade surových extraktov a prostredí nebola ešte dôkazom existencie látky, totožnej alebo ekvivalentnej BDNF prasaťa.

Porovnanie predpokladaného reťazca aminokyselín BDNF prasaťa so známym reťazcom aminokyselín NGF z celého radu druhov (človek, hovädzí dobytok, morča, myš, kurča a had) ukázalo, že BDNF je štatisticky významne menej príbuzný akémukoľvek NGF stavovcov než jednotlivé typy NGF medzi sebou, ako je zrejmé z obr. 2. Významným znakom primárnej štruktúry úplného BDNF je skutočnosť, že táto štruktúra je veľmi podobná štruktúre NGF. V prípade, že sa vypustia tri úseky reťazca NGF na lepšie porovnanie, je možné dokázať 51 totožných aminokyselín pre rôzne typy NGF (od človeka až po hady) a pre BDNF, ako je znázornené na obr. 2. Je dôležité, že identické úseky zahrnujú všetkých 6 cysteínových zvyškov. Aj napriek presnému usporiadaniu disulfídových mostíkov v BDNF nie je dosiaľ známe, je zrejmé, že BDNF tieto mostíky obsahuje (legenda k tabuľke III). Tri tryptofanové a 2 fenylalanínové zvyšky, ktoré sa nachádzajú v BDNF je možné v identických polohách nájsť aj v NGF. Je tiež nutné uviesť, že 6 zvyškov kyseliny asparagovej (zo 7 prítomných v BDNF) a 7 valínových zvyškov (z 9 prítomných) sa nachádza na identických miestach v NGF a BDNF cicavcov. Týchto päť aminokyselín tvorí približne polovicu totožných aminokyselín medzi oboma uvedenými bielkovinami. Na druhej strane existujú nápadné rozdiely medzi štruktúrou NGF a BDNF. Okrem troch už uvedených chýbajúcich úsekov reťazca existuje aj 21 polôh, v ktorých sú zvyšky aminokyselín totožné pre všetky typy NGF, ale sú rôzne v BDNF.

Väčšina reťazca prekurzora BDNF je nepríbuzná reťazcu prekurzora pre NGF s dvoma výnimkami: sekretorický signálny reťazec BDNF má 5 totožných aminokyselín (z 18 obsiahnutých) a celkovú nápadnú podobnosť so signálnym reťazcom NGF myši, čo bolo dokázané štiepením za alanínovým zvyškom v polohe 18 po metionínovom zvyšku na začiatok translácie (Edwards a ďalší, 1988, Mol. Celí Biol. 8:2456 až 2464). Je pravdepodobné, že alanín, ktorý sa v BDNF taktiež nachádza v polohe 18 je potenciálnym miestom štiepenia na odstránenie signálneho reťazca BDNF. Ďalšia podobnosť s reťazcom pre NGF začína na jedinom zhodnom N-glykozylačnom mieste (na obr. 1 je dvojito podčiarknuté), ktoré zodpovedá asparagínovému zvyšku v polohe 126. Tento asparagínový zvyšok je uložený 8 zvyškov aminokyselín pred miestom štiepenia na odštiepenie úplného BDNF. To isté usporiadanie je možné nájsť pri niekoľkých typoch NGF, rovnako ako reťazec Arg-X-bázická aminokyselina-Arg ako reťazec posledných 4 aminokyselín prekurzora (Schwarz a ďalší, 1989, J. Neurochem. 52:1203 až 1209.

Dôkaz, že kódmi pre NGF a BDNF sú odlišné gény u rôznych druhov stavovcov bol získaný tak, že boli pripravené sondy DNA z molekulárne klonovaného ľudského NGF a z BDNF prasaťa a potom bola vykonaná hybridizácia Southern blot s použitím DNA genómu, rozštiepeného reštrikčnou endonukleázou EcoRI. DNA genómu bola analyzovaná z nasledujúcich zdrojov: človek, opica, potkan, myš, pes, hovädzí dobytok, králik, kurča a kvasinky. DNA bola rozštiepená pôsobením enzýmu EcoRI a analyzovaná hybridizáciou Southern blot v dvojitom uskutočnení s použitím 32p._znaj_enej ľudskej sondy pre NGF a sondy pre BDNF prasaťa. Pre každú sondu bolo možné pozorovať vo všetkých testovaných organizmoch jeden pás, s výnimkou kvasiniek. Vo väčšine prípadov mali pásy, hybridizujúce so sondami pre NGF a BDNF v ktoromkoľvek organizme rôznu elektroforetickú pohyblivosť, aj napriek tomu, že v niektorých prípadoch, napríklad u myšacej DNA mali fragmenty po štiepení enzýmom EcoRI, hybriduzujúce so sondami pre NGF a BDNF približne rovnaký rozmer a nebolo možné ich od seba oddeliť s použitými podmienkami pre elektroforézu (obr. 1).

Časť kódového reťazca pre úplný BDNF bola amplifikovaná pomocou PCR z DNA genómu morčaťa, potkana, kurčaťa a človeka a boli stanovené nukleotidové reťazce. Analýza reťazca DNA z amplifikovanej oblasti DNA genómu prasaťa presne potvrdila výsledky analýzy' reťazca, ktoré boli získané s použitím molekulárnych klonov z mozgu prasaťa. Boli tiež stanovené reťazce genómu potkana, kurčaťa a človeka pre segment BDNF s 252 pármi báz (obr. 5). Je pozoruhodné, že u potkana a u človeka bol odvodený reťazec aminokyselín pre oblasť aspoň aminokyselín 28 až 111 totožný s reťazcom pre BDNF prasaťa, aj napriek tomu, že bolo možné pozorovať u rôznych druhov celý rad rozdielov v nukleotidoch (napríklad konzervatívne zmeny v tretej polohe kodónu). U kurčaťa bolo možné pozorovať v tejto oblasti jedinú substitúciu aminokyseliny. U kurčaťa je zvyškom 61 v úplnej bielkovine lyzín, zatiaľ čo u cicavcov sa v tejto polohe BDNF nachádza zvyšok metionínu. Údaje získané pri analýze reťazca spolu s výsledkami hybridizácie Southern blot, tak ako boli opísané, poskytujú jednoznačný dôkaz skutočnosti, že kódom pre

BDNF je vysoko konzervovaný gén, ktorý je odlišný od génu, ktorý je kódom pre NGF.

Príklad 3

Expresia RNA pre BDNF v neurónových a neneurónových tkanivách

Materiál a metódy Príprava RNA

Celková DNA bola extrahovaná z tkanív dospelých myšacích samíc spôsobom podľa publikácie Okayama a ďalší, 1987, Methods Enzymol, 154:3 až 28. Zmrazené tkanivo bolo odstredené na odstránenie bunkovej drviny a supematant bol navrstvený na vrstvu trifluóracetátu cézneho, upraveného na hustotu 0,51 g/ml. Po odstredení 24 hodín pri 125 000 x g v rotore SW 27 (Beckman) a RNA bola znova uvedená do suspenzie, potom zrážaná etanolom a 8 M acetátom amónnym a potom skladovaná pri teplote -70 °C. Elektroforéza bola vykonávaná podľa publikácie Lehrach a ďalší, 1977, Biochemistry 16:4743 až 4751) na 1,3% agarózovoformaldehydovom géli. RNA bola prenesená na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham) a hybridizovaná cez noc pri teplote 62 °C v 1 ml 2 x SSC s obsahom 50 % formamidu s 32p._cRtyA ako sondy pre BDNF myši (10 impulzov za minútu, ako bude ďalej uvedené). Premývanie bolo vykonávané 60 minút pri teplote 65 °C v 0,1 x SSC. Po premytí bol materiál inkubovaný 60 minút pri teplote miestnosti s 0,1 pg/ml RNázy A (Pharmacia) a film bol exponovaný pri teplote -70 °C s použitím zosilňujúcej clony počas 48 hodín.

Príprava sondy cRNA

Banka cDNA z mozgu myši bola vyšetrená pomocou dvoch nezávislých oligonukleotidov BDNF. Boli izolované dvojité pozitívne klony, ktoré boli subklonované v mieste štiepenia enzýmu EcoRI plazmidu Bluescript SK⁺ (Stratagene). Bol stanovený nukleotidový reťazec zodpovedajúci nukleotidom 350 až 829 reťazca prasaťa (obr. 1). V tomto reťazci bolo možné dokázať len 4 odlišné aminokyseliny pre reťazec BDNF myši a prasaťa, čo znamená veľký stupeň konzervácie v tejto oblasti medzi BDNF myši a prasaťa. Bola pripravená sonda RNA s jednoduchým reťazcom s použitím tohto templátu a T3-polymerázy (Promega). Špecifická účinnosť tejto sondy bola 10⁸ impulzov za minútu/pg.

Výsledky a diskusia

Analýza Northem blot bola použitá na vyhodnotenie expresie mRNA pre BDNF v neurónovom aj neneurónovom tkanive. Analýza Northem blot bola vykonaná s použitím myšacích tkanív, ktoré dovoľujú rýchlejšie spracovanie na získanie RNA než tkanivá prasaťa. Sonda 32p. cRNA dokázala signál s veľkosťou približne 1,45 kb v mozgu (obr. 4) a v mieche (údaje nie sú znázornené). Je významné, že nebolo možné zistiť žiadny signál pre iné tkanivá vrátane obličiek, čreva, pľúc, pečene, sleziny, srdca a svalu (obr. 4). Vzhľadom na to, že veľkosť mRNA prasaťa je podobná veľkosti tej istej látky u myší je zrejmé, že reťazec DNA, znázornený na obr. 2 predstavuje viac než 80 % úplného reťazca mRNA.

Významným pozorovaním pri výskume fyziológie BDNF bola skutočnosť, že mRNA, ktorá je kódom pre túto látku, je možné nájsť len v centrálnom nervovom systéme a nie v siedmich tkanivách odlišných od centrálneho nervového systému. Kódovú mRNA pre BDNF bolo možné ná jsť nielen v celom mozgu (obr. 4), ale aj v mieche a v colliculus superior (reťazec, znázornený na obr. 1 je celkom odvodený od cDNA colliculus superior ako templátu). Tieto údaje podporujú myšlienku, že BDNF je neurotrofhý faktor, odvodený od cieľového tkaniva a že neuróny, odpovedajúce na BDNF sú buď vnútorné neuróny CNS alebo ide o neuróny, ktoré sú so štruktúrami CNS priamo spojené. Skutočne tiež všetky neuróny, o ktorých je známe, že odpovedajú na BDNF buď vybiehajú do CNS, ako napríklad dorzálne korene kraniálnych senzorických ganglií (Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 328, Davies a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6:1897 až 1904) alebo ide o neuróny CNS, napríklad gangliové bunky sietnice (Johnson a ďalší, J. Neurosci. 6:3031 až 3038). Je zrejmé, že je potrebné vykonať podrobné štúdie na preskúmanie presnej distribúcie miest syntézy BDNF v CNS, je však už zrejmé, že distribúcia mRNA pre BDNF je veľmi odlišná od distribúcie mRNA pre NGF, ktorú je možné nájsť v celom rade neneurónových tkanív (Heumann a ďalší, 1984, EMBO J., 3:3183 až 3189, Shelton a ďalší, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:795 i až 7955).

Príklad 4

Molekulárne klonovanie a charakterizácia génov pre BDNF človeka a potkana

Materiály a metódy

DNA genómu a banky cDNA

Bola získaná banka cDNA ľudskej sietnice v lambdaZAPII (Stratagene). Ďalej bola získaná banka DNA genómu ľudskej placenty v EMBL3/SP6/76 (Clontech). Potom boli získané banky cDNAQ ľudského fetálneho mozgu v lambdagtll (Clontech a banka DNA genómu potkana v EMBL3/SP6/T7 (Clontech). Obe banky genómu boli pripravené parciálnym štiepením DNA genómu reštrikčnou endonukleázou Sau 3A s následnou väzbou do miesta štiepenia BamHI vektora. Potom bola získaná ešte banka cDNA potkanieho mozgu v lambda-ZAPII (Stratagene).

Príprava sond DNA

32p.značené DNA-sondy pre BDNF boli pripravené s použitím tých istých oligonukleotidových primérov, ktoré boli opísané v príklade 2 pri opise PCR-reakcie s DNA ľudského genómu tak, aby bolo možné dosiahnuť amplifikáciu kódovej oblasti pre zvyšky 28 až 111 ľudského BDNF. Súbežne bola získaná 32p._Značená sonda, špecifická pre potkaní BDNF s použitím DNA genómu potkana ako templátu pre PCR.

Analýza knižníc

Knižnice fágu lambda boli analyzované podľa štandardných postupov (Benton and Davies, 1977, Science 196:180 až 182, Manniatis a ďalší, 1978, Celí 15:687 až 701), hybridizáciou v 50% formaldehyde za prítomnosti dextránsulfátu a Denhartovho roztoku pri teplote 42 °C. Filtre boli vopred hybridizované pri teplote 42 °C v 50 % formamide, 5 x SSCPE, 10% Denhardtov roztok, 0,5 mg/ml DNA zo spermy lososa, 0,1% SDS a 10% dextránsulfát. Hybridizácia bola vykonávaná v tom istom pufti s tým rozdielom, že Denhardtov roztok bol 2%, bola použitá DNA zo spermy lososa v množstve 0,1 mg/ml a SDS a dextránsulfát boli vynechané. Po hybridizácii boli filtre premyté pri teplote 68 °C. Na analýzu DNA ľudského genómu a knižnice cDNA zo sietnice bola použitá sonda pre ľudský BDNF. Potkania sonda pre BDNF bola použitá na analýzu DNA potkanieho genómu a knižnice cDNA z mozgu. Knižnice boli takisto analyzované s použitím ľudských a potkaních sond pre NGF, pripravených podľa príkladu 2.

Výsledky a diskusia

Bolo analyzovaných aspoň 670 000 plakov z každej knižnice. Z ľudských klonov boli považované za pozitívne také klony, ktoré hybridizovali s ľudskou sondou pre BDNF, ale nie s ľudskou sondou pre NGF, tak ako bolo opísané. Klony genómu pre BDNF boli získané z ľudských a potkaních knižníc s častosťou výskytu, ktorá zodpovedá častosti výskytu génu pre BDNF v jednej kópii na haploidný genóm. Tak v prípade potkaních, ako aj v prípade ľudských knižníc bol analyzovaný približne jeden milión plakov. Tri pozitívne klony boli získané z knižnice potkanieho genómu a jeden z knižnice ľudského genómu. Pozitívne klony z knižnice ľudskej sietnice a z cDNA mozgu potkana boli takisto získané s častosťou výskytu, ktorá zodpovedala génu, k expresii dochádza na veľmi nízkej úrovni. V cDNA potkanieho mozgu boli identifikované dva pozitívne klony zo 670 000, v knižnici ľudskej sietnice bol identifikovaný kloň z množstva 670 000 vyšetrovaných klonov. Ani jeden pozitívny kloň nebol identifikovaný zo 670 000 klonov z bežne dodávanej knižnice cDNA, pripravenej z ľudského fetálneho mozgu. Stanovenie reťazca bolo vykonané na cDNA pre BDNF ľudského pôvodu a na klonoch genómu s použitím syntetických oligonukleotidových primérov, reprezentujúcich presný reťazec, zodpovedajúci kódovému reťazcu pre BDNF človeka a potkana, ako bolo opísané v príklade 2. Najdlhší ľudský kloň cDNA, získaný týmto spôsobom, mal vloženú časť s veľkosťou 1,6 až 1,8 kpba, ako bolo možné očakávať, obsahoval presný reťazec pre časť ľudského BDNF, ako bolo stanovené po priamej amplifikácii z DNA ľudského genómu, ako bolo opísané v príklade 2. Podrobná analýza reťazca tejto cDNA (obr. 5) klonu dokázala otvorený čítací rámec, ktorý je kódom pre polypeptid s 247 aminokyselinami, podobný, ale nie totožný s plnou dĺžkou prekurzora pre BDNF prasaťa. V oblasti zodpovedajúcej úplnému polypeptidu BDNF (napríklad od kodónu pre His 134 do terminačného kodónu) nebolo možné dokázať žiadne rozdiely v odvodenom reťazci aminokyselín. Všetky rozdiely v nukleotidoch medzi reťazcom človeka a prasaťa boli konzervatívne, pokiaľ ide o špecifickosť kódu. Vo zvyšku polypeptidu, ktorý je prekurzorom pre BDNF bolo možné pozorovať malé rozdiely v reťazci aminokyselín človeka a prasaťa, ide najmä o dva po sebe nasledujúce kodóny pre Ser 5 a 6 u prasaťa, ktoré nie sú prítomné u človeka, čo má za následok o niečo kratší polypeptid (247 namiesto 252 aminokyselín).

Knižnice pripravené vo vektore EMBL3 obsahovali vložené časti cudzorodej DNA s veľkosťou 10 až 23 kbp. Presná veľkosť vloženej časti pre kloň BDNF ľudského genómu nebola presne stanovená. Kloň však obsahoval jediné miesto štiepenia pre EcoRI s dĺžkou približne 4 kbp, ktoré hybridizovalo so značenou sondou pre BDNF, ktorá bola použitá na analýzu knižnice. Tento fragment má očakávanú dĺžku podľa výsledkov hybridizácie Southem blot DNA ľudského genómu so sondou pre BDNF prasaťa, ako bolo opísané. Analýza reťazca bola vykonávaná na ľudskom klone s použitím syntetických oligonukleotidov, reprezentujúcich reťazce cDNA, ktoré boli použité ako priméry pri syntéze DNA z DNA bakteriofágu ako templátu. Bolo dokázané, že kódový reťazec pre prekurzor BDNF ľudského pôvodu je totožný s reťazcom v klone ľudskej cDNA s tým rozdielom, že obsahuje jednu substitúciu nukleotidu v prepro oblasti, čo zodpovedá náhrade valínu (GTG) metioninom (ATG), na nukleotide 785 na obr. 5. Táto zmena môže odrážať polymorfiu v ľudskom genóme. Rovnako ako v prípade ľudského genómu pre NGF nebolo možné zistiť reťazce intervenujúce s kódovým reťazcom pre ľudský preproBDNF. Údaje o reťazci cDNA potkana sú taktiež znázornené na obr. 5.

Príklad 5

Expresia rekombinantného BDNF Materiály a metódy

Príprava vektora na expresiu BDNF

Bol získaný reťazec, zodpovedajúci reťazcu pre preproBDNF prasaťa s použitím vždy 150 pmólov oligonukleotidových primérov

ATAATCTAGATGACCATCCTTTTCCTT (medi átorový) ATAATCTAGACTATCTTCCCCTCTTAAT (antimediátorový) pri PCR reakcii s použitím 1 pg templátu genómu prasaťa (každý primér obsahuje miesto štiepenia Xbal). Amplifikačná reakcia bola vykonávaná uvedeným spôsobom až na to, že teplota pri spojení bola 50 °C. Po rozštiepení Xbal bola amplifikovaná DNA naviazaná v mieste štiepenia Xbal do plazmidu pCMVl _za vzniku pCMV'-pBDNF’i (-1 znamená orientáciu na obr. 6 a zodpovedá COS+ v tabuľke V) a plazmid bol použitý na transformáciu baktérií XL-1 otvorením pórov pomocou elektrického prúdu.

Expresia BDNF v bunkách COS

DNA plazmidu pCMVl-pBDNF z pozitívnych klonov (podľa kontroly hybridizáciou s použitím oligoS z obr. 2) bola rozštiepená enzýmami Xbal a Pstl. Veľkosť získaných produktov umožnila stanoviť orientáciu vložených reťazcov a oba plazmidy boli použité na transfekciu buniek COS s použitím fosforečnanu vápenatého (Chen a ďalší, 1987, Mol. Celí Biol. 7:2745 až 2752) a živné prostredie bolo po 24 hodinách oddelené. Účinnosť BDNF bola skúšaná na kuracom embryu (gangliá dorzálnych koreňov) tak, ako bolo podobne uvedené.

Výsledky a diskusia

E8 spinálne senzorické neuróny kurčaťa boli nanesené na platne (6 000 na vyhĺbenie), inkubované 24 hodín a potom počítané po 24 hodinách (Lindsay a ďalší, 1985, Develop. Biol. 112:319 až 328). Uvedené hodnoty sú priemerom z troch stanovení + štandardná odchýlka. BDNF a NGF boli použité v množstve 1 ng/ml, čo je maximálna koncentrácia, pri ktorej je možné pozorovať maximálne prežívanie neurónov. Bunky COS+ sú bunky po transfekcii plazmidom s obsahom vloženého kódu pre BDNF v správnej orientácii, COS- sú bunky po transfekcii plazmidom s obsahom vloženého kódu pre BDNF v obrátenej orientácii. COS sú bunky, pri ktorých nebola transfekcia vykonaná. Pri riedení vyššom než 1:20 nebolo možné pozorovať vyššie prežívanie v porovnaní s kontrolami v prostredí s obsahom buniek COS alebo COS-. Vo všetkých pokusoch bez NGF bola použitá monoklonálna protilátka proti NGF (Korsching a ďalší, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3513 až 3516) v množstve 1 pg/ml.

Ako je zrejmé z tabuľky V, len v prostredí, ktoré obsahovalo bunky COS, nesúce plazmid pCMVl-pBDNF v správnej orientácii bolo možné pozorovať vyššie preživa21 nie senzorických neurónov kurčaťa oproti kontrolám. Je teda zrejmé, že rekombinantný BDNF má biologickú účinnosť. Okrem toho pri pridaní BDNF izolovaného z mozgu prasaťa nebolo možné ďalej zvýšiť štatisticky významné prežívanie senzorických neurónov nad úroveň, ktorú bolo možné dosiahnuť s použitím samotného rekombinantného BDNF, čo znamená, že rekombinantný BDNF je schopný nasýtiť receptory pre BDNF. Bolo tiež možné pozorovať, že rekombinantný BDNF má aditívny alebo synergný účinok na prežívanie senzorických neurónov kurčaťa pri súčasnom použití s NGF.

Tabuľka V

Prežívanie senzorických neurónov kurčaťa v kultúre

Prostredie COS (konečné
riedenie)	1 :20	1 :50	1 :20D
COS*		2510 1 263	2833 ±171
COS-	211118
COS	250 ±87
BDNF* COS		25161209
NGF + COS		5770 ±72
samotný BDNF		2718 ±424

Príklad 6

Produkcia protilátok proti BDNF Materiály a metódy

Polyklonálne antisérum, špecifické pre BDNF označené ako sérum 4 bolo získané u bielych králikov NZ imunizáciou pomocou syntetického peptidu.

Syntéza peptidov a väzba na nosič

Peptid tvorený 34 zvyškami aminokyselín a označený B5 bol syntetizovaný zvyčajným spôsobom. Obsahoval nasledujúci reťazec zvyškov aminokyselín, ktorý zodpovedá 33 zvyškom úplného BDNF (zvyšky 153 až 185 úplného reťazca preproBDNF, ako je znázornené na obr. 1) a ďalší cysteínový zvyšok aminoterminálnom zakončení na umožnenie väzby na nosnú bielkovinu s použitím N-hydroxysukcínimidu kyseliny m-maleínimidobenzoovej (MBS) v prípade potreby: Cys-Val-Thr-Ala-Ala-Asp-Lys-Lys-Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly-Gly-Thr-Val-Thr-Val-Leu-Glu-Lys-Val-Pro-Val-Ser-Lys-Gly-Gln-Leu-Lys-Gln-Tyr

Peptid B5 bol naviazaný na sérový albumín hovädzieho dobytka (BSA) s použitím bis-diazobenzidínu (BDB). Čerstvý BDB bol pripravený rozpustením 46 mg hydrochloridu benzidínu (p-diaminofenylhydrochlorid, Sigma), v 9,0 ml 0,2 N kyseliny chlorovodíkovej. 35 mg NaNO2 bolo rozpustených v 1,0 ml vody a pridaných k roztoku benzidínu a zmes bola hodinu miešaná pri 4 °C. 21 mg BSA bolo rozpustených v 3,0 ml 0,16 M boritanu, 0,13 M NaCl s pH 9,0. Približne 15 mg peptidu bolo rozpustených v 1,5 ml pufru s boritanom a NaCl s pH 9,0. Peptidový roztok bol pridaný k roztoku BSA a uložený do ľadu. 1,0 ml BDB bolo pridaných k roztoku BSA-peptidu a reakčná zmes bola inkubovaná za miešania 2 hodiny pri 4 °C, potom bolo pH upravené na 9,0 pridávaním malých množstiev 0,5 M NaOH v prípade potreby. Reakcia bola skončená pridaním 0,2 ml 1% roztoku fenolu s obsahom pufru. Prebytočné reakčné činidlá boli odstránené dialýzou proti fyziologickému roztoku chloridu sodného s obsahom fosfátového pufra (PBS).

Imunizácia

Celkom šesť králikov bolo imunizovaných podľa nasledujúcej schémy:

Králiky 1 a 4 - peptid B5, viazaný na svojom C-terminálnom zakončení na BSA s použitím BDB.

Králiky 2 a 3 - peptid B5, viazaný na svojom N-terminálnom zakončení ba BSA s použitím MBS.

Králiky 5 a 6 - peptid B5, zmiešaný s práškovou nitrocelulózou.

Vo všetkých prípadoch bol na prvú imunizáciu použitý 1 mg imunogénu (100 pg B5/5OO pg nitrocelulózy pre králiky 5 a 6) v 0,5 ml PBS plus 0,5 ml úplného Freundovho pomocného činidla. Táto zmes bola podaná podkožné na rad miest na chrbte. Druhá imunizácia bola vykonaná po troch týždňoch a bola totožná s prvou imunizáciou až na to, že bol použitý neúplný Freundov pomocný prostriedok. Ďalšie imunizácie boli vykonávané v intervaloch 4 až 6 týždňov. Králikom bola odobratá krv 1 týždeň po imunizácii a antiséra boli zvyčajným spôsobom skúšané na väzbu čistého peptidu B5 skúškou ELISA s použitím imunoadsorpcic s viazaným enzýmom.

Detekcia väzby protilátky na BDNF

100 pg antigénu (peptid B5) vo vode bolo pridaných do vyhĺbení mikrotitračnej platne a po vysušení cez noc bol materiál krátko premytý vodou a blokovaný 100 pg 1% želatíny počas 30 minút pri teplote miestnosti. Potom boli vyhĺbenia trikrát premyté destilovanou vodou, bolo pridaných 100 pg antiséra a zmes bola inkubovaná cez noc pri teplote 4 °C. Potom boli vyhĺbeniny trikrát premyté PBS/0,05% Triton-X-100 a potom bolo pridaných 100 pg peroxidázou značeného antiséra proti králikom (riedenie 1/1000) a zmes bola inkubovaná tri hodiny pri teplote miestnosti. Potom boli vyhĺbeniny dvakrát premyté, bolo pridaných 100 pg roztoku ABTS (10 mg ABTS (Sigma), rozpusteného v 10 ml 0,1 M citrátu sodného s pH 4,0 s 10 pg H2O2) a zmes bola inkubovaná 5 minút (do vzniku zafarbenia). Reakcia bola zastavená pridaním 10 pg 1 % NaN3. Vzorky boli zriedené 1:5 vodou, optická hustota bola meraná pri 415 nm.

Výsledky a diskusia

Antisérum z králika (sérum 4) malo najvyšší titer (obr. 7a) a bolo použité v nasledujúcich pokusoch. Protilátky proti séru 4 boli čiastočne čistené zrážaním síranom amónnym. K podielu antiséra bol pridaný rovnaký podiel nasýteného vodného roztoku síranu amónneho, pomaly a za stáleho miešania a roztok bol potom ďalej miešaný ešte 15 minút, potom bol odstredený pri 2000 x g. Usadenina bola dvakrát premytá 50% nasýteným roztokom síranu amónneho, potom bola znova rozpustená v PBS v objeme, ktorý zodpovedal pôvodnému objemu séra. Potom bol síran amónny odstránený dialýzou proti PBS, ktorý bol niekoľkokrát vymenený. Dialyzovaný roztok bol rozdelený na podiely po 1,0 ml a potom bol lyofilizovaný (speed-vac). Vzorka protilátky proti séru 4 bola znova uvedená do suspenzie v 0,5 ml vody a skúšaná na reaktivitu s peptidom B5 skúškou ELISA, bolo dokázané, že reaguje do zriedenia 1 :4000.

Polyklonálne protilátky proti syntetickému peptidu B5, zodpovedajúcemu fragmentu 33 zvyškov aminokyselín

BDNF prasaťa boli získané imunizáciou králikov uvedeným spôsobom. Sérum 4, ktoré malo najvyšší titer proti syntetickému peptidu bolo reaktívne s čisteným BDNF z mozgu prasaťa pri skúške ELISA (obr. 7). Slabú reaktivitu bolo možné dokázať aj pri imunoblotovej skúške (údaje nie sú uvedené). Antisérum však nebolo schopné blokovať účinnosť BDNF pri biologickej skúške na senzorických neurónoch dorzálnych ganglií kuracieho embrya.

Príklad 7

Nové biologické účinky BDNF

Nasledujúce pozorovania dokazujú, že BDNF je zrejme schopný nasledujúcich funkcií:

i) udržovať prežívanie a indukovať plne diferencovaný stav dopaminergných neurónov v CNS, ii) udržovať prežívanie cholinergných neurónov CNS a iii) potlačovať proliferáciu astrogliálnych buniek.

Uvedené biologické funkcie BDNF neboli opísané. Vzhľadom na to, že dopaminergné neuróny, cholinergné neuróny a astrogliálne bunky môžu byť spojené so vznikom neurologických ochorení alebo porúch, mohol by BDNF zrejme byť použitý na liečbu neuropatických stavov, spojených s týmito populáciami buniek.

Materiály a metódy

Metódy na pestovanie dopaminergných neurónov zo substantia nigra

Z mozgu potkaních embryí vo veku emryonálneho dfta 13 až 15 bol odobratý ventrálny mesencephalon. V typických prípadoch boli použité dva litre tohto materiálu v každom pokuse. Roztok, použitý pri vyberaní mal nasledujúce zloženie: 136, 8 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8,0 mM Na2HPC>4 . 7H2O, 1,5 mM KH2PO4, 6 mg/ml glukózy a 0,1 mg/ml BSA, pH 7,4. Tento roztok bol pripravený a potom sterilizovaný filtráciou cez filter s veľkosťou pórov 0,2 pm. Vyberanie bolo vykonávané za nesterilných podmienok. Hneď ako bolo tkanivo vybraté zo všetkých mozgov, boli všetky ďalšie pokusy vykonávané za sterilných podmienok. Fragmenty tkaniva boli uložené do kultivačných misiek s priemerom 35 mm a rozdelené na malé častice jemnými nožnicami. Potom boli pridané 2 ml živného prostredia F-12 s obsahom 0,125 % trypsínu a materiál bol inkubovaný pri teplote 37 °C. Na konci inkubácie bola k suspenzii pridaná DNAáza I do konečnej koncentrácie 80 ng/ml. Potom bol vykonaný ešte jeden identický postup na získanie toho istého materiálu a tkanivová suspenzia bola potom pridaná k 8,0 ml živného prostredia, ktoré bolo tvorené minimálnym základným prostredím (MEM), doplneným 2 mM glutamínu, 6 mg/ml glukózy, 5 jednotkami/ml penicilínu, 5 mg/ml streptomycínu a 7,5 % fetálneho teľacieho séra (FCS). Vzorka bola odstredená na stolovej odstredivke pri teplote miestnosti a 500 otáčkach/min. počas 5 minút. Prostredie bolo odsaté a k usadenine buniek boli pridané 2 ml živného prostredia. Potom boli bunky rozotreté celkom osemkrát s použitím vyžíhanej pipety s otvorom 1 mm. Zvyšné tkanivové fragmenty boli usadené pomocou gravitácie a bol odobratý malý podiel supematantu na odčítanie počtu buniek pomocou hemocytometra. Po stanovení hustoty buniek boli bunky nanesené na kultivačné platne s použitím 50 000 buniek/ml.

Kultivačné platne boli pripravené deň pred vybratím tkaniva. Tkanivové platne (24 vyhĺbenín, 2 ml/vyhĺbenie) boli vopred vybavené povlakom polyomitínu (molekulová hmotnosť 30 000 až 70 000 g/mol) v množstve 0,5 mg/ml pri teplote miestnosti počas tri hodiny. Platne boli dôkladne premyté vodou a potom bolo na ne nanesených 5 pg/ml myšacieho laminínu pri teplote miestnosti na tri hodiny. Potom boli platne premyté vodou, rovnako ako je uvedené a inkubované cez noc pri teplote 37 °C vo vlhkej atmosfére s obsahom 5% oxidu uhličitého, 95 % vzduchu za prítomnosti živného prostredia. Nasledujúceho dňa bolo živné prostredie nahradené čerstvým živným prostredím.

Hneď ako boli bunky nanesené na kultivačné platne, boli bunky uložené do inkubátora, ktorého teplota bola nastavená na 37 °C s použitím atmosféry s obsahom 5 % CO2 a 95 % vzduchu na 24 hodín. Rastové prostredie bolo nahradené prostredím, zbaveným séra (SFM) nasledujúceho zloženia: zmes 1: 1 bazálneho Eaglovho prostredia (BEM) a živného prostredia F-12 s glukózou (33 mM), glutamínom (2 mM), NaHCO₃ (15 mM), HEPES (10 mM), prostredie bolo doplnené inzulínom (15 pg/ml), transferínom (100 pg/ml). putrescínom (60 μΜ), progesteronom (20 nM), selenitom sodným (30 nM), penicilínom (5 jednotiek/ml), streptomycínom (5 mg/ml) a T3 (30 nM). V niektorých pokusoch bol čistený BDNF pridaný ku kultúre po výmene prostredia na prostredie SFM druhý deň kultivácie.

Roztok použitý' na kultiváciu dopaminergných neurónov bol pripravený s použitím vody zo systému Milli-Q. Živné prostredia boli získané z Gibco Laboratories (Šanta Čiara, Ca), rovnako ako fetálne teľacie sérum (šarža 43N1086) a myšací laminín. Všetky ďalšie zložky prostredia boli získané od Sigma Chemical (St. Louis, MO) s čistotou, vhodnou na kultiváciu kultúr. Polyomitin a DNAáza boli taktiež získané od Sigma. Trypsin bol získaný od fy Worthíngton (Freehold, NJ), šarža 3667. Obchodne dodávané chemické látky boli analyticky čisté a boli získané od Baker Chemicals (Phillipsburg, NJ). BDNF, použitý pri týchto pokusoch bol čistený z mozgu prasaťa podľa publikácie Barde a ďalší, 1982, uvedenej.

Spôsoby imunocytochemického farbenia kultúr ventrálneho mesencephala

Na každý pokus boli použité čerstvé fixačné roztoky. Na farbenie tyrozínhydroxylázy (TH) bol fixačným prostriedkom 4,0 % paraformaldehyd v Sorensenovom fosfátovom pufri. Tento pufer bol pripravený pridaním 0,2 M roztoku dihydrogénfosforečnanu draselného k zásobnému roztoku 0,2 M hydrogénfosforečnanu sodného až do dosiahnutia pH 7,3. Paraformaldehyd bol potom k roztoku pridaný a roztok bol trochu zohriaty, aby sa rozpustil a potom ochladený na teplotu miestnosti pred použitím.

Na začatie postupu bolo prostredie z kultivačných misiek odstránené opatrným odsatím a do misky bol pridaný príslušný fixačný roztok. Potom bol materiál 20 minút inkubovaný pri teplote miestnosti. Potom boli misky trikrát premyté Sorensenovým fosfátovým pufrom, vždy po piatich minútach za opatrného otáčania miskou. Potom boli bunky inkubované s roztokom na zastavenie reakcie 30 minút pri teplote miestnosti, opäť za opatrného otáčania. Roztok na zastavenie reakcie pre materiály, ktoré mali byť farbené na TH, obsahoval Sorensenov fosfátový pufer s obsahom 2 % normálneho konského séra. Potom boli kultúry inkubované v permeabilizačnom pufri 30 minút pri teplote miestnosti, opäť za opatrného miešania otáčaním. Tento roztok obsahoval 0,2 % saponínu a 1,5 % normálneho konského séra pre kultúry, ktoré mali byť farbené na TH. Po permeabilizačnom stupni boli kultúry inkubované za prítomnosti protilátky cez noc pri teplote 4 °C. Protilátkou proti potkaniemu TH bola myšacia monoklonálna protilátka izotypu lgG2a. Bola použitá v koncentrácii 40 pg/ml v roztoku 10 mM fosforečnanu sodného, 50 mM NaCl, 0,2% saponíne pri pH 7,5. Po primárnej inkubácii protilátky boli kultúry 5 x 15 minút premývané príslušným permeabilizačným pufrom. Potom boli kultúry inkubované so sekundárnou protilátkou viazanou na biotín, t. j. na biotinylovanú konskú protilátku, proti myšaciemu IgG. Táto inkubácia bola vykonávaná pri teplote miestnosti dve hodiny za opatrného miešania rotáciou. Potom bola kultúra opäť premývaná rovnako ako je uvedené a potom bola inkubovaná za prítomnosti vopred vytvoreného komplexu avidínbiotinylovanej peroxidázy z chrenu (reakčné činidlo ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA) podľa návodu výrobcu. Po inkubácii 30 minút za opatrného miešania otáčaním boli kultúry opäť premyté rovnako ako vyššie. Potom boli kultúry inkubované s 55 mM tris-HCl s pH 7,3 s obsahom 0,5 mg/ml diaminobenzidínu a 0,01 % peroxidu vodíka. Reakčný produkt vznikal 2 až 5 minút, potom bol roztok opäť odstránený a kultúry boli niekoľkokrát premyté ľadovo chladným PBS. Potom bol stanovený počet pozitívnych buniek v 1 ml.

Paraformaldehyd a glutaraldehydy boli získané od Fluka Chemical. Balíčky Vectastain, ktoré obsahujú normálne sérum (použité ako blokujúce činidlo), biotinylovaný antiimunoglobulín, čistený afinitnou chromatografiou, avidín DH a biotinylovaný HPR-H boli získané od Vector Laboratories. Diaminobenzidín bol získaný od BRL (Gaithesberg, MD).

Metódy, použité pri meraní príjmu ^H-dopamínu v kultúrach ventrálneho mesencephala

Príjem ^H-dopamínu (²H-DA) bol sledovaný spôsobom podľa publikácie Dal Toso a ďalší, 1988, J. Neurosci. 8:733 až 745 s malými modifikáciami. Pufer na túto skúšku mal nasledujúce zloženie: NaCl 136,8 mM, KC1 2,7 mM, Na2HPO4 · ⁷ H2O 8,0 mM, KH₂PO4 1,5 mM, glukóza 5,0 mM, chlorid vápenatý 1,0 mM, síran horečnatý 1,0 mM, kyselina askorbová 0,1 mM, pargylín 0,1 mM, pH 7,4. V prípade potreby bol k tomuto prostrediu pridaný benztropínmesylát v množstve 5,0 μΜ (BZT).

Bunky boli raz premyté uvedeným pufrom, predohriatym na 37 °C, potom bolo do každého vyhĺbenia pridaných 0,4 ml tohto pufra na 2 ml vyhĺbenie. Potom boli kultúry predbežne inkubované 5 minút pri teplote 37 °C. Na konci tejto predbežnej inkubácie bolo pridaných 0,1 ml 3H-DA v pufri na zavedenie skúšky (250 nM, 40 Ci/mM) tak, aby konečná koncentrácia 3H-DA v pufri bola 50 nM. Kultúry boli inkubované 15 minút pri teplote 37 °C, potom boli kultúry štyrikrát premyté pri teplote 4 °C, vždy s použitím pufra na vykonanie skúšky. Potom boli bunky premyté ešte dvakrát ľadovo chladným PBS (10 mM NaPC>4, 150 mM NaCl, pH 7,6). Po poslednom premytí bolo k bunkám pridaných 0,2 ml 0,5 N NaOH do 2 ml vyhĺbenia a bunky boli ponechané dve hodiny pri teplote miestnosti. Potom bol extrakt v NaOH odobratý a rádioaktivita bola meraná na scintilačnom počítači (Packard, LS 500TD) s použitím 10 ml scintilačnej kvapaliny (Ultimagold). Špecifický príjem bol definovaný ako príjem, ktorý vymizol za prítomnosti 5 μΜ BZT. Typicky tento podiel predstavoval 70 až 90 % celkového pozorovaného príjmu.

²H-DA bol získaný od NEN (Boston, MA). Askorbát, pargylín, BZT a glukóza boli získané od Sigma (St. Luis, MO). Scintilačná kvapalina Ultimagold bola získaná od fy Packard (Šterling, VA).

Metódy na získanie kultúr cholinergných neurónov bazálnej časti predného mozgu

Primáme kultúry cholinergných buniek bazálnej časti predného mozgu boli získané z potkanov 17. embryonálneho dňa. Cholinergné neuróny použité pri týchto skúškach boli špecificky získané zo stredného septálneho jadra a z jadra pre diagonálny Brocov pás. Táto populácia neurónov primáme zodpovedá hippocampu. Disociované zmiešané kultúry neuróny a glie boli získané nasledujúcim spôsobom:

Septálna oblasť bola zbavená okolitého tkaniva a vybratá z fetálneho mozgu. Úseky tkaniva boli rozrušené nožnicami a potom uložené do 12,5% trypsínu na 20 minút pri 37 °C. Trypsín bol inaktivovaný zriedením v živnom prostredí (Dublaccova modifikácia Eaglovho prostredia DMEM) s obsahom 1 % penicilínu a streptomycínu, 5 % konského séra a 1 % N3 ako hormonálny doplnok). Suspenzia jednotlivých buniek bola získaná rozotretím tkanivových fragmentov pomocou vyžíhanej pasterovej pipety. Disociované bunky boli počítané v hemocytometri a potom boli nanesené na platne pri zvolenej hustote v živnom prostredí na kultiváciu. Päť až šesť hodín po nanesení na platne boli k bunkám pridané väzbové látky a potom boli bunky pestované desať dní in vitro pri výmene prostredia každé tri dni.

Skúšky na cholínacetyltransferázu

Po uvedenom spracovaní boli bunky buď použité na skúšky na enzým cholínacetyltransferázu (CAT), alebo boli ďalej spracované pre imunohistochemické farbenie na CAT nasledujúcim spôsobom: Monoklonálna protilátka proti CAT bola získaná od Boehringer Mannheim Biochemical Co. Na konci pokusného obdobia boli bunky dvakrát prepláchnuté DMEM. Potom boli bunky fixované v priebehu dvojstupňového postupu: 50 μΐ 4% paraformaldehydu bolo pridaných k 50 μΐ DMEM na 10 minút. Potom bol tento roztok odstránený a nahradený 100 μΐ 4% paraformaldehydu a inkubácia bola vykonávaná ešte 30 minút pri teplote miestnosti. Po fixácii boli bunky trikrát prepláchnuté roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom (PBS) a potom permeabilizované inkubáciou 30 minút so saponínom (0,5 mg/ml). Zmáčadlo bolo odstránené trojitým premytím PBS a potom bol pridaný na 30 minút blokujúci roztok s obsahom 5 % normálneho králičieho séra. Primárna protilátka bola pridaná v riedení 1:3 v 1% normálnom králičom sére po odstránení blokujúceho roztoku a potom boli kultúry inkubované cez noc pri teplote 4 °C. Roztok s obsahom primárnej protilátky bol odstránený vymytím pomocou PBS. Viazaný imunoglobulín bol dokázaný s použitím Vectastainu metódou ABC. Ako substrát na peroxidázovú reakciu bol použitý diaminobenzidéntetrahydrochlorid (DAB), reakcia bola vykonávaná zvyčajne 1 až 5 minút. Potom bola reakcia zastavená tak, že kultúry boli dvakrát premyté 0,1 M tris-HCl s pH 7,2. Kultúry boli skladované v 50 mM tris s pH 7,6 s obsahom 0,15 M NaCl, 42 % glycerolu a 0,15 % Zephiranu (Pierce Chemical Co., Rockville, IL) pri teplote 4 °C.

Spôsob získavania čistých kultúr astrogliálnych buniek

Čistené gliálne kultúry boli pripravené v podstate spôsobom podľa publikácie McCarthy K.D. a DeVellis J.,

1980, J. Celí Biol. 85:890 až 902 z hippocampu potkanov postnatálneho dňa 1 až 2. Hippocampy boli odobraté od piatich mláďať a boli rozrušené nožnicami. Častice tkaniva boli otrávené 2 ml 0,125% trypsínu 20 minút pri teplote 37 °C. Proteáza bola inaktivovaná zriedením pomocou kultivačného prostredia (10% fetálne sérum hovädzieho dobytka Gibco, DMEM, 0,5 % penicilínu (5000 pg/ml) a 0,5 % glutamínu). Potom bola pripravená suspenzia jednotlivých buniek prechodom tkanivových fragmentov zúženou pasteurovou pipetou. Bunky boli potom odstredené päť minút pri 900 otáčkach za minútu, potom boli znova uvedené do suspenzie v kultivačnom prostredí a potom počítané v hemocytometrí. Suspenzia jednotlivých buniek bola rozdelená do troch fliaš na pestovanie tkanivových kultúr s obsahom 75 ml a bunky boli pestované tak dlho, až vytvorili vrstvu spojitú na 80 %. Potom boli bunky opäť podrobené pôsobeniu trypsínu a znova kultivované v podstate uvedeným spôsobom. Gliálne bunky boli počítané a potom nanesené na platne s hustotou 10 000 buniek/0,9 ml.

Výsledky

Vplyv BDNF na hydroxylázu prítomnú v kultúrach buniek ventrálneho mesencephala

Imunochemické farbenie vykonané podľa príkladu 7 bolo použité na meranie účinku BDNF na celý rad buniek, pozitívnych na hydroxylázu (TH, obr. 8). Maximálny vzostup o viac než 200 % v porovnaní s kontrolou bolo možné pozorovať v 8. dni u kultúr buniek ventrálneho mesencephala po stimulácii BDNF. Veľmi malý vzostup bolo možné pozorovať u kultúr, stimulovaných BDNF už tretí deň.

Účinok BDNF na príjem dopamínu kultúrami buniek ventrálneho mesencephala

Príjem 3H-dopamínu Í^H-DA) bol meraný spôsobom podľa publikácie Dal Toso a ďalší, 1988, J. Neurosci. 8:733 až 745 s malými modifikáciami tak, ako bolo opísané v príklade 7. Malý vzostup príjmu dopamínu bolo možné pozorovať u BDNF-stimulovaných kultúr ventrálneho mesencephala už v ôsmom dni pestovania kultúry (obr. 9).

Účinok BDNF na expresiu cholínacetyltransferázy v cholinergných neurónoch predného mozgu

Na obr. 10a je znázornený účinok BDNF na počet CAT-pozitívnych buniek po rastovom období 12 dní in vitro. 5,9-násobný vzostup počtu CAT-buniek bolo možné pozorovať po pridaní 100 ng/ml BDNF, EC5Q bola v tomto prípade 10 ng/ml. Ako pozitívna kontrola boli použité kultúry s hustotou buniek 260 000 (čierny stĺpec) alebo 150 000 (šrafovaný stĺpec) buniek na jedno vyhĺbenie, bunky boli podobným spôsobom spracované pôsobením NGF (obr. 10b). Hustota buniek 260 000/vyhíbenie zodpovedá hustote, použitej pri sledovaní účinku BDNF. Tento vzostup počtu CAT-imunopozitívnych buniek je podobný skôr uvádzanému vzostupu. Potenciál BDNF pri účinku na cholinergné neuróny bol taktiež sledovaný meraním CAT-enzymatickej účinnosti podľa publikácie F. Fonnum, J. Neurochemistry 1975, 24:407 až 409. Na obr. 11 sú znázornené zmeny CAT vyvolané pôsobením BDNF. V tomto prípade bolo dosiahnuté 1,8-násobné zvýšenie s použitím BDNF v množstve 100 ng/ml, hodnota EC50 bola 61 ng/ml.

Účinky BDNF alebo EGF na kultúry astrogliálnych buniek

Bolo dokázané, že astrocyty majú receptory s vysokou afinitou pre celý rad nervových prenášačov a neuropeptidov. Z toho dôvodu sú astrocyty schopné odpovedať na signály, odvodené od neurónov. Z tohto dôvodu a tiež preto, že astrocyty typu II predstavujú jednu z bunkových zložiek v primárnych kultúrach bol sledovaný prípadný priamy účinok BDNF na gliálne bunky. Bunky boli pestované in vitro štyri dni pred pridaním rastových faktorov tak, aby bola vytvorená vrstva, súvislá približne na 60 %, potom boli bunky podrobené na 42 hodín pôsobeniu EGF alebo BDNF. V priebehu posledných 18 hodín inkubácie bol v živnom prostredí prítomný (3H)-metyltymidín. Účinok EGF je znázornený na obr. 12a. Ako už bolo uvedené, bolo dokázané, že EGF má na astrocyty mitogénny účinok. Maximálnu odpoveď bolo možné pozorovať po pridaní EGF v množstve 10 ng/ml, čím bol dosiahnutý 5,2-násobný vzostup príjmu (^H)-metyltymidínu. Odpoveď na pôsobenie BDNF je dvojfázová:veľmi nízke dávky (0,1 ng/ml) vyvolávajú malý vzostup príjmu derivátu tymidínu. Dávky vyššie bež 1 ng/ml BDNF spôsobujú inhibíciu príjmu uvedenej zlúčeniny. BDNF v dávke 5 ng/ml spôsobil 24 % inhibíciu príjmu, čo zrejme vedie k zníženiu rýchlosti proliferácie gliálnych buniek v priebehu pôsobenia tejto látky.

Diskusia

Tieto pokusy in vitro jasne ukazujú, že BDNF podporuje prežívanie alebo indukuje plne diferencovaný stav dopaminergných neurónov vo vyvíjajúcej sa substantia nigra potkana, ako bolo dokázané farbením na tyrozínhydroxylázu a tiež príjmom dopamínu v kultúrach týchto neurónov, odvodených od mesencephala embryonálneho potkana. Vzhľadom na to, že ide o neuróny, ku ktorých degenerácii dochádza pri Parkinsonovom ochorení, je veľmi pravdepodobné, že by bolo možné BDNF použiť na liečebné účely pri tejto chorobe, čím by bolo možné buď znížiť straty neurónov alebo zvýšiť hladinu tyrozínhydroxylázy (enzým, obmedzujúci syntézu dopamínu) alebo oboje.

Okrem toho, rovnako ako NGF, má BDNF účinok na prežívanie cholinergných neurónov bazálnej časti predného mozgu potkana, ako je možné dokázať zvýšeným ťarbením na cholínacetyltransferázu (CAT), zvýšenou aktivitou CAT a zvýšeným farbením na acetylcholínesterázu v kultúrach mediálneho septálneho jadra potkanieho embrya a jadra diagonálneho zväzku (Broca). Je teda zrejmé, že BDNF sám osebe alebo v spojení s NGF mohol byť vhodnou látkou na liečenie ochorenia alebo porúch, ktoré ovplyvňujú cholinergné neuróny bazálnej časti predného mozgu, napríklad vrátane Alzheimerovho ochorenia.

Príklad 8

Identifikácia nového génu zo skupiny génov BDNF/NGF identifikácia nových génov zo skupiny génov NGF/BDNF využitím PCR s použitím degenerovaných 0ligonukleotidov, na základe konzervácie úsekov aminokyselín medzi NGF a BDNF (boxy 1 až 4, odstavec Identifikácia ďalších členov skupiny génov BDNF/NGF) bola prvýkrát skúšaná pri stanovení, či páry takýchto primérov by bolo možné využiť na amplifikáciu reťazcov pre NGF a BDNF z DNA genómu niekoľkých živočíšnych druhov. Táto metóda potom bola použitá na identifikáciu nového génu, ktorý má homológiu, spoločnú pre NGF a BDNF vo všetkých štyroch boxoch, v ktorých bola homológia dokázaná.

Materiály a metódy PCR-reakcie

PCR bola vykonávaná v podstate spôsobom podľa uvedeného príkladu 1.

Výsledky Amplifikácia reťazcov pre NGF a BDNF z DNA genómu

Degenerované syntetické oligonukleotidy boli ako priméry syntetizované tak, aby zodpovedali častiam boxu 1 a boxu 2 konzervácie reťazcov aminokyselín medzi NGF a BDNF (odstavec 5.8.) a potom boli využité pre PCR-reakciu s použitím DNA potkanieho genómu ako templátu. Presné reťazce primérov sú ďalej uvedené (miesto degenerácie so zmesou dvoch alebo väčšieho počtu báz pri syntéze oligonukleotidu je uvedené v zátvorke, podčiarknuté sú konečné úseky s obsahom väčšieho počtu miest pôsobenia reštrikčných endonukleáz na uľahčenie väzby na vektor pri nasledujúcom klonovaní. A = adenín, G = guanín, C = cytozín, T = tymín, N = zmes A, G, C a T): Box 1 (antikódujúci) primér IB: 5'-GACTCGATCGACTCGGTGTG(C,T)GACAG(C,T)(A,G)T(C,T,A)AG-3^r Box 2 (kódujúci), primér 2C: 5'-CCAAGCTTCTAGAATCCA(C,T)TT(N)GT(C,T)TC(A,G)(A,T)A(A,G)AA (A,G)TA(C,T)TG-3'

300 ng každej zmesi degenerovaných primérov bolo pridaných k 500 ng DNA genómu potkana v 100 mikrolitroch štandardnej reakčnej zmesi na vykonávanie PCR. Bolo vykonaných 35 cyklov, z ktorých každý spočíval v inkubácii 1 minútu pri 94 °C, 2 minúty pri 43 °C a 2 minúty pri 72 °C. Predpokladaná veľkosť produktu amplifikácie PCR v prípade génu pre NGF alebo BDNF s použitím uvedených primérov by bola 175 báz vrátane zakončenia s dĺžkou 17 báz (v priméroch sú podčiarknuté), ktorá by bola do primérov zaradená na uľahčenie následného klonovania. Elektroforézou reakčnej zmesi na 8% polyakrylamidovom géli s 5 % glycerolu bolo možné pozorovať hlavný pás amplifíkovanej DNA s predpokladanou veľkosťou 175 bp.

Detekcia reťazcov komplementárnych k sondám BDNF/NGF v DNA genómu rôznych živočíšnych druhov

Pás s materiálom so 175 bp bol z akrylamidového gélu odstránený elektrolúciou a potom amplifikovaný v druhej PCR-reakcii s použitím siedmich cyklov za totožných reakčných podmienok až na to, že koncentrácia dGTP, dATP a TTP bola znížená vo všetkých prípadoch na 50 μΜ a že bol použitý alfa-32p-dCTP na označenie namiesto neznačeného dCPT. Rádioaktívne značená DNA ako produkt bola od ostatných reakčných zložiek oddelená chromatografiou na stĺpci, deliacom zlúčeniny podľa molekulovej hmotnosti. Táto sonda, označená R1B/2C (pre DNA potkana amplifikovaná z primérov IB a 2C) potom bola použitá na detekciu komplementárnych reťazcov v DNA rôznych druhov stavovcov (potkan, myš, kurča sú znázornené na obr. 13) po rozštiepení enzýmom EcoRl a blotovej reakcii s nitrocelulózovou hybridizáciou Southem blot pre DNA genómu, rozštiepenej pomocou EcoRl (obr. 13).

Veľkosť fragmentov DNA genómu po rozštiepení enzýmom EcoRl (išlo o DNA s obsahom kódových reťazcov pre NGF a BDNF) bola stanovená v kontrolných a paralelných blotových reakciách s použitím rádioaktívne značených sond pre ľudský NGF a BDNF, pripravených pomo cou PCR z klonovaných génov. Polohy fragmentov NGF a BDNF genómu po rozštiepení EcoRl sú na obr. 13 označené N a B. Výsledky podobnej analýzy už boli znázornené na obr. 3 a ekvivalentné výsledky boli získané s použitím sondy pre ľudský BDNF so sondou, pripravenou z BDNF prasaťa (obr. 3). Ako už bolo uvedené, sondy pre NGF a BDNF hybridizujú na určite fragmenty EcoRl v rôznych DNA genómu stavovcov. Napríklad v prípade DNA potkana dokázala sonda pre BDNF pás s veľkosťou približne 8,8 kg, zatiaľ čo sonda pre NGF dokázala pás s veľkosťou približne 10,4 kb.

Ako je zrejmé z obr. 13, u každého skúmaného druhu (údaje sú uvedené pre kurča, myš a potkana) sonda R1B/2C hybridizuje na pás DNA, ktorý je neodštiepiteľný od pásu, identifikovaného sondou pre NGF a tiež na pás, ktorý je neoštiepiteľný od pásu, identifikovaného sondou pre BDNF (u myši majú fragmenty genómu po štiepení enzýmom EcoRl tú istú elektroforetickú motolitu, zodpovedajúcu veľkosti približne 11,5 až 12,0 kb). To dokazuje, že degenerované oligonukleotidové priméry IB a 2C je možné využiť na amplifikáciu reťazcov génov pre NGF aj pre BDNF. V niektorých prípadoch boli pozorované prídavné pásy, ktoré pri hybridizácii Southem blot z genómu taktiež hybridizovali na sondu R1B/2C. Napríklad v DNA genómu myši po rozštiepení enzýmom EcoRl bolo možné zistiť aspoň dva ďalšie pásy (označené XI a X2 o približne 19,0 kb a i ,5 kb), ktoré nezodpovedali ani NGF ani BDNF. Podobne bolo možné pozorovať pri hybridizácii na DNA potkana aspoň dva ďalšie pásy (XI a X2 s veľkosťou 7,3 a 1,2 kb) a aspoň jeden takýto pás bolo možné dokázať aj u kurčaťa (x, približne 2,6 kb). Ďalšie pásy, ktoré nie sú výslovne označené na tomto obrázku, boli v niektorých prípadoch taktiež pozorované. Prítomnosť pásov, ktoré nezodpovedajú ani NGF ani BDNF predpokladajú možnosť existencie ďalších génov z tejto skupiny génov. Podobne boli aj s použitím iných zostáv párov primérov a templátov DNA genómu nájdené pásy, ktoré celkom zrejme nezodpovedajú pásom, ktoré sú známe pre gény BDNF a NGF (údaje nie sú uvedené).

Identifikácia nového génu príbuzného pre BDNF a NGF

Špecifický test na podporu hypotézy, že by bolo možné identifikovať nové gény, príbuzné génom pre NGF a BDNF pomocou PCR s použitím degenerovaných oligonukleotidových primérov bol vykonaný s použitím primérov pre box 3 a box 4 (odstavec Identifikácia ďalších členov skupiny génov BDNF/NGF) a s použitím DNA genómu myši ako templátu. Boli syntetizované degenerované priméry s nasledujúcimi reťazcami:

Box 3 (antikódujúci): 5'-GGGGATCCGCGGITG(T,C)(C,A)GIGGIAT(T,C,A)GA-3'

Box 4 (kódujúci) 5'-TCGAATTCTAGATIC(T,G)IAT(AG)AAIC(T,G)ICCA-3' (G = guanín, A = adenín, C = cytozín, T = tymidín, I = inozín; zmesi viac než jednej bázy v jednej polohe sú v zátvorkách). Inozín bol využitý v niektorých polohách, ktoré zodpovedajú tretej báze kodónu tak, aby došlo k degenerácii genetického kódu. Je tiež možné využiť zmes štyroch zvyčajných báz DNA namiesto inozínu, s takými primérmi boli dosiahnuté približne rovnaké výsledky.

Pri použití degenerovaného páru báz primérov Box

3/box 4 je možné predpokladať, že PCR reťazcov pre NGF

SK 279668 Β6 a BDNF z DNA genómu myši poskytne amplifikovaný reťazce s približne 90 bp. Pri použití uvedených primérov bola PCR vykonávaná v štyroch cykloch pri teplote zohrievania pri väzbe 45 °C, potom nasledovalo 31 cyklov pri teplote 49 °C. Produkty boli analyzované elektroforézou na géli a bolo možné dokázať hlavný pás s očakávaným rozmerom. U myši obsahuje gén pre NGF miesto pôsobenia reštrikčnej endonukleázy HindlIT v oblasti medzi boxom 3 a boxom 4. zatiaľ čo gén pre BDNF obsahuje v tejto oblasti miesto štiepenia enzýmom Apai. Z tohto dôvodu bolo možné očakávať, že pri štiepení produktu amplifíkácie PCR enzýmami Apai a HindlII dôjde k odstráneniu reťazcov pre BDNF a NGF z produktu v hlavnom páse. Ale v prípade, že bol produkt PCR rozštiepený týmito dvoma enzýmami zrejme úplne, bolo možné dokázať pás, ktorý bol proti štiepenia týmito enzýmami odolný a ktorý bol tvorený amplifikovanou DNA. Je teda možné predpokladať, že okrem NGF a BDNF došlo ešte k amplifikácii aspoň jedného nového génu.

Charakterizácia nového génu zo skupiny BDNF/NGF

Produkt PCR, ktorý bol odolný proti štiepeniu bol z gélu vymytý a bol použitý ako templát pri asymetrických PCR-reakciách, v ktorých bol jeden z pôvodných degenerovaných primérov použitý v stonásobnom molámom prebytku vzhľadom na množstvo druhého priméru. Táto asymetrická amplifikácia dovoľuje tvorbu templátov DNA s jednoduchým reťazcom, ktoré sú vhodné na analýzu reťazca metódou s ukončením reťazca. Analýza reťazca nového génu (označeného ako M3/4, ale uvádzaného tiež ako neurotrofm-3) bola ďalej upresnená PCR-amplifikáciou reťazcov medzi primérom, uloženým medzi boxami 3 a 4 a polyA-reťazcom, nachádzajúcom sa na 3’-zakončení transkriptu génu s použitím metódy rýchlej amplifikácie zakončenia cDNA (RAGE) podľa publikácie M. A. Frohman, M. K. Dush a G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998 až 9002 (1988). Výsledky analýzy reťazca DNA potvrdili, že nový gén bol skutočne amplifikovaný a že obsahuje otvorený čítací rámec, ktorý je kódom pre polypeptid, odlišný tak od NGF, ako aj od BDNF, ale blízko príbuzný obom týmto látkam svojím reťazcom aminokyselín (obr. 14).

Predbežný dôkaz skutočnosti, že nový gén je kódom pre neurotrofný faktor bol získaný stanovením expresie tohto génu v rôznych tkanivách potkana pomocou hybridizácie Northem blot. Táto analýza dokázala, že k expresii nového génu dochádza najviac v mozgovom tkanive v porovnaní so všetkými ostatnými sledovanými tkanivami.

Diskusia

Ako bolo znázornené na obr. 3, hybridizovala sonda DNA, získaná amplifikáciou PCR s použitím primérov pre boxy 1 a 2 s DNA potkanieho genómu ako templátu (R1B/2C) na nové pásy okrem známych pásov, ktoré obsahovali gény pre NGF a BDNF v DNA, rozštiepenej enzýmom EcoRI pri rôznych sledovaných druhoch. Podobná analýza bola vykonaná s použitím rádioaktívne značenej sondy pre nový gén, ktorý bol amplifikovaný s použitím primérov 3 a 4 a DNA myšacieho genómu (M3/4). V každom prípade hybridizovala sonda M3/4 na jediný hlavný pás DNA genómu, rozštiepenej enzýmom EcoRI, ktorý bol odlišný od pásov, o ktorých bolo známe, že obsahujú reťazce NGF a BDNF. Ie nutné uviesť, že fragmenty genómu myši, potkana a kurčaťa po rozštiepení EcoRI pri hybridi zácii so sondou M3/M4 sú v každom prípade v súlade s jedným z nových pásov, ktoré boli získané hybridizáciou so sondou R1B/2C. Ide o fragment DNA myši s 19,0 kb po štiepení

EcoRI (XI na obr. 14), fragment potkanej DNA so 7,3 kb (XI na obr. 14), a fragment DNA kurčaťa s 2,6 kb (C na obr. 14). Je možné sa domnievať, že časti toho istého génu boli amplifikované z DNA potkana s použitím párov primérov 1B/2C a z DNA myši s použitím páru primérov 3/4. Je teda zrejmé, že aspoň jeden gén má spoločnú homológiu s génmi NGF a BDNF vo všetkých štyroch boxoch homológie tak, ako boli uvedené.

Koncepcia homológie boxov medzi NGF, BDNF a ďalšími členmi tejto skupiny génov (napríklad M3/4, známy tiež ako NT-3) bola primáme vyjadrená vo forme primárneho reťazca aminokyselín, pričom bola použitá metóda identifíkácie nových génov z určitej skupiny. Je však dôležité uviesť, že zrejme existujú sekundárne a terciáme štruktúry týchto neurotrofných faktorov, ich interakcia so špecifickými receptormi a tým aj pravdepodobnosť konštrukcie nových molekúl, ktoré by bolo možné využiť na liečebné účely.

Napríklad v NGF existuje 6 zvyškov Cys, z ktorých sa všetky zúčastňujú disulfídových väzieb. Pri číslovaní týchto zvyškov od C-terminálneho zakončenia ako Cysl až Cys6 je známe, že disulfldové väzby sú tvorené Cysl až Cys4, Cys2 až Cys5 a Cys3 až Cys6. Poloha všetkých šiestich zvyškov Cys je v NGF a BDNF konzervovaná a polohy 3 zvyškov Cys v časti génu M3/4 presne zodpovedajú zvyškom Cys4, Cys5 a Cys6 v NGF a BDNF. To predpokladá, že sekundárna štruktúra všetkých členov tejto skupiny génov je zrejme blízko príbuzná a do značnej miery je určovaná konzervovanými zvyškami Cys. Je nutné uviesť, že boxy homológie tak, ako boli uvedené pre BDNF a NGF zahrnujú 5 zo 6 zvyškov Cys (Cysl v boxe 1, Cys2 v boxe 2, Cys3 v boxe 3 a Cys5 a Cys6 v boxe 4). Toto usporiadanie podporuje názor, že tieto zvyšky Cys a ich bezprostredne susediace zvyšky hrajú dôležitú úlohu v určovaní všeobecnej štruktúry týchto neurotrofných faktorov. Štruktúrne determinanty pre špecifické interakcie s receptormi s vysokou afinitou pre každý z neurotrofných faktorov sú zrejmé uložené vo vopred určenej časti každej molekuly.

Je teda zrejmé, že je možné konštruovať nové chiméme gény rekombináciou medzi členmi uvedenej skupiny génov (napríklad rekombináciou in vitro alebo priamou syntézou génu) v mieste ktoréhokoľvek boxu homológie tak, ako boli opísané alebo aj inde v molekule. Takéto chiméme bielkoviny budú pravdepodobne mať podobnú sekundárnu štruktúru vzhľadom na konzerváciu zvyškov Cys a zvyškov iných aminokyselín, môžu však mať nové biologické vlastnosti. Napríklad chiméma bielkovina NGF/BD-NF môže byť bifunkčná, pokiaľ ide o interakciu s receptormi tak pre NGF, ako aj pre BDNF. Chiméme bielkoviny sa tiež môžu líšiť od východiskových molekúl napríklad dimerizáciou a inými fyzikálno-chemickými vlastnosťami. Chiméma bielkovina môže tiež pôsobiť ako antagonista vzhľadom na účinok východiskovej molekuly.

Aktívne fragmenty BDNF/NGF je možné použiť na konštrukciu ďalších členov uvedenej skupiny génov v závislosti od poznania kritických oblastí a tiež od základu informácií, ktoré oblasti sú nevyhnutné pre špecifickú reakciu s príslušnými receptormi.

Porovnanie nových členov skupiny génov (napríklad

M3/4) so známymi členmi je možné použiť na dôkaz no27 vých boxov homológie, čo môže pomôcť vyhľadávaniu nových členov uvedenej skupiny génov. Napríklad pri porovnaní M3/4 a BDNF budú objavené určité boxy homológie. Zvláštny záujem vzbudzuje napríklad štvrtý konzervovaný zvyšok Cys, jediný, ktorý nie je zahrnutý do uvedených boxov 1 až 4. Medzi BDNF a M3/4 však existuje pomerne dlhý segment totožných alebo konzervovaných zvyškov aminokyselín, v ktorom je uvedený zvyšok Cys zahrnutý. Ide o nasledujúci reťazec: His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys-(Arg alebo Lys)-Thr-(Thr alebo Ser)-Gln-(Ser alebo Thr) -Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr.

V tejto oblasti by malo byť možné nájsť aspoň dva boxy homológie na syntézu použiteľných degenerovaných oligonukleotidových primérov (napríklad His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys vyžaduje len 96-násobnú degeneráciu pre primér s 18 bázami alebo 48-násobnú degeneráciu pre primér so 17 bázami; Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr by taktiež mohol byť použiteľný box).

Príklad 9

Zvýšená expresia BDNF v bunkách neuroblastómu Materiály a metódy

Bunkové línie

CHP100, CHP126, CHP134, CHP234, LANI, LAN5, NB9, SY5Y, Y79, FO1, BU2, HO1, HL60 a COL320 sú bunkové línie, ktoré sú udržované v laboratóriách Dr. Fred Alt, ktorý dodal taktiež RNA pre analýzu Northem blot, použitú na obr. 15. Všetky bunkové línie sú bunkové línie, odvodené od ľudských nádorových buniek. CHP1000 je línia neuroepiteliómových buniek, CHP126, CHP134, CHP234, Lani, Lan5, NB9 a SY5Y sú bunkové línie neuroblastomových buniek, Y79 je línia buniek retinoblastómu, FO1, BU2, HO1, sú bunkové línie malanómobvých buniek, HL60 je línia buniek promyelocytických a COL320 je bunková línia neuroendokrinného karcinómu hrubého čreva.

Príprava RNA

RNA bola pripravená a analýza Northem blot bola vykonávaná v podstate podľa príkladu 3 s použitím ľudskej cDNA s plnou dĺžkou ako sondy. 10 pg celkovej RNA bolo použitých v každej dráhe gélu na analýzu Northem blot podľa obr. 15 až na to, že RNA v dráhe 1 bola použitá v nižšom množstve a pre bunky SY5Y bol použitý lpg poly(A)⁺RNA.

Výsledky

Na obr. 15 sú znázornené výsledky analýzy Northem blot s použitím sondy BDNF, hybridizovaná na celý rad vzoriek RNA z rôznych druhov ľudských bunkových línií. Veľký podiel RNA hybridizujúci na sondu BDNF bol dokázaný v bunkových líniách CHP234 a LAN5, nižšie množstvo bolo dokázané v CHP1 a CHP134. Všetky pozitívne línie boli odvodené od buniek ľudského neuroblastómu.

Príklad 10

Riadenie mRNA pre BDNF a NGF, závislej od účinnosti, v hippocampu potkana, sprostredkovanej ne-NMDA-glutamátovými receptormi Materiály a metódy

Pôsobenie kyseliny kaínovej na potkany

Potkanom bol podaný diazepam (Valium) 90 minút pred intraperitoneálnou injekciou kyseliny kaínovej v dáv ke 12 mg/kg na potlačenie príliš vysokej inhibičnej účinnosti. Ako je zrejmé z obr. 19, neinterferuje Valium, podané po kyseline kaínovej s ďalším vzostupom úrovne mRNA pre BDNF a NGF. Potkany, ktorým nebolo podané Valium mali podobný vzostup úrovne mRNA pre NGF a BDNF v hippocampu 3 hodiny po podaní kyseliny kaínovej v porovnaní so zvieratami, ktorým bola podaná kyselina kaínová a potom bolo podané Valium.

Príprava hippocampových kultúr

Hippocampy boli pripravené z potkaních embryí vo veku E17, materiál bol vybratý a inkubovaný 20 minút pri teplote 37 °C vo fyziologickom roztoku chloridu sodného s obsahom fosfátového pufra (PBS) bez vápenatých alebo horečnatých iónov, ale s obsahom 10 mM glukózy, 1 mg/ml albumínu, 6pg/ml DNAázy a 1 mg/ml papaínu, hippocampové bunky boli starostlivo od seba oddelené pomocou vyžíhanej pipety. Potom boli bunky oddelené odstredením pri malej rýchlosti, znovu uvedené do suspenzie v DMEM, doplnené 10% fetálnym teľacím sérom a nanesené na kultivačné platne z plastickej hmoty (0,5 x 10θ buniek na platňu s priemerom 35 mm), platne boli vopred opatrené povlakom poly-DL-omitínu (0,5 mg/ml) a laminínu (5 pg/ml). Po troch hodinách od nanesenia na platne bolo prostredie nahradené prostredím, zbaveným séra, ktoré obsahovalo doplnky podľa publikácie Brewer a Cotman, Brain Res 497:65, 1989, ale bez glutamátu. Životnosť neurónov pretrvávala až tri týždne v tejto kultúre a neuróny boli zvyčajne použité na pokusy 7 dní po nanesení na platne.

Amplifikácia RNA

Celková bunková RNA bola extrahovaná spôsobom podľa publikácie Chomcynski a Sacci, Anál. Biochem 1987, 162:156 až 159 z 0,5 x 10^ buniek po pridaní skrátenej mRNA ako štandardu pre NGF (30 fg). mRNA a cRNA pre NGF boli spoločne amplifikované v tej istej skúmavke v reakčnej zmesi na súčasné vykonanie reverznej transkripcie a PCR-reakcie (RT/PCR) s obsahom: 1/5 extrahovanej RNA, 1 x RT/PCR pufer (10 mM tris-HCl s pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCÍ2, 0,1 mg/ml želatíny a 0,1 % Tritónu X-100), 0,25 mM dNTP, 0,1 μΜ primérov 5' a 3', 5 jednotiek RNázy (Promega), 3,2 jednotiek AMV-reverznej transkriptázy (Life Science) a 2 jednotky Taq polymerázy (Genofit) v celkovom objeme 25 μΙ. Zmes bola prevrstvená minerálnym olejom, inkubovaná 30 minút pri teplote 41 °C, zohriata na 92 °C na čas 60 sekúnd, potom bol naviazaný primér 60 sekúnd pri teplote 55 °C a extenzia priméru bola vykonávaná 60 sekúnd pri teplote 72 °C. Produkty amplifikácie (203 bp pre mRNA NGF a 153 bp pre štandard) boli oddelené na 3% NuSieve/agarózový gél (3:1) (FMC Bioproducts), potom bola vykonaná blotová reakcia pôsobením bázy na Hybond N - membránu (Amersham) a bola vykonaná hybridizácia spôsobom podľa publikácie Heumann R. A Thoenen H., 1986, J. Biol. Chem. 261, 9246, Lindhold a ďalší, 1988, J. Biol. Chem. 263: 16348. Na absolútnu kvantifikáciu bola vykonaná súčasná amplifikácia mRNA pre NGF po transkripcii in vitro a štandardu v paralelnej reakcii. V súčasnosti bola opísaná podobná metóda Wangem a ďalší (PNAS 86:9717 až 9721, 1989).

Výsledky a diskusia

BDNF a NGF sú členy skupiny génov, ktoré obsahujú približne 50 % totožných zvyškov aminokyselín (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149). Molekuly obsahujú prísne konzervované oblasti. V týchto oblastiach je obsiahnutých 6 cysteínových zvyškov, ktoré sa pravdepodobne zúčastňujú stabilizácie trojrozmernej štruktúry týchto molekúl, ktorá je nutná pre ich biologickú účinnosť. Ale NGF a BDNF obsahujú tiež variabilné oblasti, ktoré určujú ich špecifickosť pre rôzne druhy neurónov (Lindsay a ďalší,

1985, Dev. Biol. 112: 319, Johnson a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6:3031, Hofer M. a Barde Y. 1988. Náture 331:261, Rodriquez-Tebar a ďalší, 1989, Dev. Biol. 136:296). okrem toho je rozdiel medzi týmito dvoma neurotrofhými molekulami preukazovaný tiež miestom ich syntézy. K expresii NGF dochádza tak na periférii (Korsching S. a Thoenen H. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3513, Ebendal a ďalší, 1983 Exp. Celí Res. 148:311. Heumann a ďalší, 1984, EMBO J. 3:3183, Dhelton D. L. a Reichardt L. F. 1984, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 81:7951), ako aj v centrálnom nervovom systéme (Korsching a ďalší, 1985, EMBO J. 4:1489, Shelton D. L. a Reichardt L. F. 1986, Proc. Natl. Acd. Sci. USA 83:2714, Whittemore a ďalší, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:817, Large a ďalší, 1986, Science 234:352). Hustota inervácie neurónov, ktoré odpovedajú na NGF odráža úroveň NGF v zodpovedajúcom cieľovom tkanive (Korsching S. a Thoenen H., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3513, Ebendal a ďalší, 1983, Exp. Celí Res. 148: 311, Heumann a ďalší, 1984, EMBO J., 3:3183, Dhelton D. L. a Reichardt L. F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7951, Korsching a ďalší, 1985, EMBO J., 4:1389, Shelton D. L. a Reichardt L. F. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2714, Whittemore a ďalší, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:817, Large a ďalší, 1986, Science 234:352). Na rozdiel od NGF dochádza k expresii BDNF prevážne v neurónoch CNS a úroveň mRNA pre BDNF je podstatne vyššia než mRNA pre NGF, napríklad 50-krát v hippocampe. V periférnom nervovom systéme je NGF syntetizovaný rôznymi bunkovými typmi, odlišnými od neurónov (Bandtlow a ďalší, 1987, EMBO J. 6:891), zatiaľ čo v mozgu je syntéza lokalizovaná prevážne v neurónoch, ako je možné dokázať hybridizáciou in situ (Rennert P. D. a Heinrich G.,

1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 138:813, AyerLeLievre a ďalší, 1988, Science 240:1339, Whittemore a ďalší, 1988, J. Neurosci. Res. 20:403). Bolo však dokázané, že v kultúre tiež astrocyty typu 1 produkujú značné množstvá NGF (Lindsay R. M., 1979, Náture 282:80, Forokawa a ďalší, 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 142:395). Relatívny príspevok neurónov a astrocytov k množstvu NGF, ktoré je syntetizované v mozgu nie je dosiaľ známe.

S ohľadom na prevážnu expresiu mRNA pre BDNF a NGF v neurónoch centrálneho nervového systému bol sústredený výskum na zistenie, či úroveň týchto dvoch typov RNA ovplyvnená aktivitou neurónov a v prípade, že tomu tak je, ktorý prenášač by sa mohol zúčastniť na riadení. V prvej sérii pokusov boli pripravené kultúry neurónov z hippocampu embryonálnych potkanov (E 17). Ako je zrejmé z obr. 16a, depolarizácia hippocampových neurónov veľkým množstvom (50 mM) draslíka mala za následok zvýšenie mRNA pre BDNF. Maximálne hodnoty boli dosiahnuté medzi 3 až 6 hodinami po zvýšení koncentrácie draslíka. Zvýšenie mRNA pre BDNF, vyvolané draslíkom bolo možné obmedziť vylúčením iónov vápnika z prostre dia a tiež inhibíciou vstupu vápnika použitím blokátorov vápnika nifedipínu (obr. 16b).

Vzhľadom na to, že použité hippocampové kultúry boli tvorené zmiešanou populáciou neurónov s rôznou úrovňou expresie prenášača a receptoru, bolo ďalej dokázané, aký účinok majú rôzne fyziologické a syntetické látky, pôsobiace antagonistický s receptorom na expresiu mRNA pre BDNF a NGF. Výsledky, ktoré sú zhrnuté v tabuľke VI ukazujú, že zo všetkých skúmaných látok kyselina kaínová, antagonisia glutamátových receptorov (Monaghan a ďalší, 1988, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365) vyvoláva oveľa vyšší vzostup mRNA pre BDNF v hippocampových neurónoch . Na druhej strane inej molekuly, napríklad karbachol (antagonista muskarínových receptorov) a do menšej miery histamín a bradykinín spôsobujú slabé zvýšenie, ale štatisticky významné zvýšenie mRNA pre BDNF (Tabuľka VI). Vzhľadom na to, že úroveň mRNA pre NGF v hippocampových neurónoch bola veľmi nízka, bola použitá kvantitatívna PCR, vhodná na stanovenie zmien v množstve mRNA pre NGF. Pri použití tejto metódy bolo dokázané, že rovnako ako v prípade mRNA pre BDNF, aj úroveň mRNA pre NGF sa zvyšuje pôsobením draslíka a kyseliny kaínovej v hippocampových neurónoch (obr. 17).

Ako je znázornené na obr. 18, maximálny vzostup mRNA pre BDNF v hippocampových neurónoch bol vyvolaný s použitím približne 25 μΜ kyseliny kaínovej. Ďalšie zvýšenie koncentrácie kyseliny kaínovej malo za následok zníženie úrovne mRNA pre BDNF, čo zrejme odráža toxické pôsobenie vysokej koncentrácie kyseliny kaínovej na hippocampové neuróny (obr. 18). Neurotoxicita, sprostredkovaná glutamátovými receptormi už bola opísaná (Choi a ďalší, 1987, J. Neurosci. 7:357, Rothman S. M. a Olney J. W., 1987, Trends Neurosci. 10:299, Choi D. W., 1988, Neurón 1:623) pre rôzne centrálne neuróny po aplikácii analógov aminokyseliny glutamátu, ktorá má excitačný účinok. Je však možné zreteľne od seba odlíšiť koncentrácie kyseliny kaínovej, potrebné na podporu expresie mRNA pre BDNF a NGF v neurónoch hippocampu a koncentrácie, ktoré vedú k neurotoxicite.

Aby bolo možné skúmať účinky kyseliny kaínovej podrobnejšie, bolo sledované, či je možné zvýšenie mRNA pre BDNF blokovať ktorýmkoľvek zo známych antagonistov glutamátových receptorov (Monaghan a ďalší, Ann, Rev. Pharmacol Toxicol. 29:365). Kynurenová kyselina, antagonista glutamátových receptorov so širokým spektrom, rovnako ako CNQX, kompetitívny inhibítor neNMDA-receptorov (Monaghan a ďalší, 1989, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365) úplne blokujú vzostup mRNA v neurónoch hippocampu, ktorý bol vyvolaný pôsobením kyseliny kaínovej tak, ako je znázornené v tabuľke VII. Na druhej strane MK 801, ktorý špecificky blokuje receptory NMDA bol neúčinný pri pokuse blokovať zvýšenie úrovne mRNA pre BDNF v týchto neurónoch. Navyše NMDA sama osebe nemení nijako úroveň mRNA pre BDNF, ako je zrejmé z tabuľky VI. To dokazuje, že kyselina kaínová pôsobí priamo cez svoje receptory a že jej účinok nie je spôsobený uvoľnením endogénneho glutamátu, (ktorý tiež pôsobí na receptory NMDA). Je teda možné uzavrieť, že kyselina kaínová in vitro zvyšuje úroveň mRNA pre BDNF cez ne-NMDA-glutamátové receptory.

Tabuľka VI

Účinok rôznych agonistov receptorov na expresiu mRNA pre BDNF v kultúrach neurónov

Prídavná látka (μΜ)	% kontroly
O	10015
karbachol (50)	220 ±25
karbachol (50) * atropín (10)	85115
nikotín (100)	11017
histamín (50)	150112
serotonín (100)	9516
dopamln (100}	11517
norepinefrín (25)	75110
látka P (1)	B519
somatostatin (1)	11018
bradykinln (1)	155115
kyselina kaínová (25)	1365170
NMDA (25)	105110

Tabuľka VII

Účinok agonistov rôznych glutamátových receptorov na expresiu mRNA pre BDNF, indukovanú kyselinou kaínovou

Prídavná látka (μΜ)	% kontroly
O	100160
kyselina kaínová (25)	1250160
kyselina kynurenová (1)	7016
kyselina kynuranová (1) * kyselina
kaínová (25)	8417
CNQX(10)	10916
CNQX (10) * kyselina kaínová (25)	10517
MK-801 (5)	9615
MK-801 (5) + kyselina kaínová (25)	1130180

Aby bolo možné vyhodnotiť fyziologický význam pozorovaní vykonaných in vitro, boli vykonané ďalšie štúdie so snahou zistiť, či uvedené mechanizmy sú v činnosti tiež in vivo. Dospelým potkanom kmeňa Wistar oboch pohlaví s hmotnosťou 180 až 300 g bolo podanie 12 mg/kg kyseliny kaínovej. Po rôznom čase boli stanovené zmeny mRNA pre BDNF a NGF v hippocampe a v mozgovej kôre analýzou Northem blot. Na obr. 19 je znázornené, že kyselina kaínová vyvolala v oboch oblastiach mozgu vzostup úrovne mRNA pre BDNF aj pre NGF. Vzostup mRNA pre BDNF bol podstatne vyšší než vzostup mRNA pre NGF. Okrem toho zostala úroveň mRNA vyššia 24 hodín po podaní kyseliny kaínovej. Časový priebeh zmien mRNA pre BDNF a pre NGF ukázal, že maximálny vzostup v hippocampe bol dosiahnutý približne 3 hodiny po podaní kyseliny kaínovej (obr. 19). Je zaujímavé, že vzostup mRNA pre NGF a pre BDNF v hippocampe predchádzalo zvýšenie cfos-mRNA. Oba fenomény môžu byť teda spolu príčinné spojené, ako bolo v poslednom čase dokázané pre n. ischiadicus po jeho poškodení (Hengere a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3899). Okrem toho dochádza k vzostupu mRNA pre BDNF aj pre NGF v mozgovej kôre neskoršie než k vzostupu tých istých látok v hippocampe, čo ukazuje na skutočnosť, že signály, ktoré vedú k zvýšeniu expresie NGF a BDNF sa rozširujú z hippocampu do ďalších oblastí mozgu. Toto pozorovanie je v súlade so skoršími správami (Morgan a ďalší, 1987, Science 237:192), ktoré uvádzali, že vzostup c)fos, vyvolaný metrazolom, spôsobujúcim kŕče sa prejavil najskôr v hippocampe a až potom v mozgovej kôre.

Predchádzajúce štúdie potvrdili, že receptory NMDA sa zúčastňujú riadenia mRNA v hippocampe, napríklad NGFI-A (Cóle a ďalší, 1989, Náture 340:474), boli preto vykonané ďalšie štúdie s cieľom dokázať, či antagonisty receptorov NMDA, MK 801 a ketamín blokujú vzostup mRNA pre BDNF a NGF in vivo. Ale pri pokusoch in vitro nespôsobil MK 801 inhibíciu vzostupu mRNA pre BDNF v hippocampe, vyvolaný kyselinou kaínovou, ja napriek tomu, že spoľahlivo spôsobil inhibíciu javov, vyvolaných aktiváciou receptorov NMDA (obr. 20). Pravdepodobne má táto aktivácia receptorov NMDA príčinu v endogénnom glutamáte, ktorý je uvoľnený kyselinou kaínovou (Biziere K. a Coyle T. Neurosci. 1978, Lett. 8:303, McGeer a ďalší, 1978, Brain Res. 139:381). Na druhej strane nebol vzostup mRNA pre NGF v hippocampe po podaní kyseliny kaínovej brzdený ani MK 801 ani ketamínom. V skorších štúdiách (Gali C. M. a Isackson P. J. 1989, Science 245:758) bolo dokázané, že elektrolytické poškodenie limbu má taktiež za následok zvýšenie úrovne mRNA pre NGF v hippocampu. Súčasne výsledky, získané pri podaní MK 801 a kyseliny kaínovej však dokazujú jasný rozdiel medzi uvedeným javom a zvýšením expresie BDNF a NGF. V prípade, že bol podaný diazepam (Valium) potkanom pred injekciou kyseliny kaínovej, došlo k úplnému blokovaniu vzostupu mRNA pre BDNF a NGF v hippocampe (obr. 20). Blokujúci účinok diazepamu na zvýšenie úrovne mRNA pre BDNF a NGF je zrejme výsledkom potlačenia aktivity neurónov cez inhibičný GABA-ergný systém. Ale 90 minút po podaní kyseliny kaínovej, (t. j. približne 30 minút po začiatku kŕčov) nebolo už možné diazepamom blokovať vzostup mRNA pre BDNF a NGF, čo znamená, že pomerne krátke obdobie zvýšenej aktivity môže byť dostatočné na to, aby bol spustený mechanizmus, ktorý vedie k zvýšeniu expresie mRNA pre oba uvedené neurotrofné faktory.

Súčasné sledovania dokázali, že ne-NMDA-receptoiy sa môžu zúčastniť riadenia mRNA pre BDNF a NGF v hippocampe, čím je možné tento mechanizmus odlíšiť od mechanizmu, ktorý bol už skôr opísaný v publikácii Cóle a ďalší, 1989, Náture 340:474, kde sa uvádza, že rôzne typy mRNA v hippocampe, ktoré sú kódom pre skoro sa vyskytujúce gény sú zrejme riadené cez NMDA-podtypy glutamátových receptorov. Bolo uvádzané, že niektoré účinky kyseliny kaínovej na neuróny môžu taktiež byť sprostredkované quisqualátovým typom glutamátových receptorov (Monaghan a ďalší, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365).

Je teda možné uzavrieť, že súčasné štúdie dokázali, že aktivita neurónov riadi úroveň mRNA, ktorá je kódom pre neurotrofné faktory BDNF a NGF v hippocampe a mozgovej kôre potkana. Zo všetkých skúmaných látok zvyšovala kyselina kaínová, pôsobiaca cez ne-NMDA-glutamátové receptory, úroveň mRNA pre BDNF a NGF tak in vitro, v kultúrach hippocampových neurónov, ako aj in vivo. Na rozdiel od toho na periférii, nie je možné dokázať, že syntéza NGF v neneurónových bunkách je riadená bežnými prenášačmi alebo neuropeptidmi, uvoľnenými inervujúcimi (na NGF citlivými) neurónmi (Barth a ďalší, 1984, J. Celí Biol. 99:839, Hellweg a ďalší, 1988, Exp. Celí. Res. 179:18). K expresii BDNF dochádza prevážne v CNS, kde sa aspoň čiastočne prekrývajú centrálne dráhy, používajúce glutamát ako nervový prenášač a v oblasti, pomerne bohatej na mRNA pre BDNF a NGF (Hofer a ďalší, EMBO J., v tlači, Monaghan a ďalší, 1989, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:265). Najmä je možné pozorovať prekvapujúcu podobnosť medzi distribúciou mRNA pre NGF tak, ako bola dokázaná hybridizáciou in situ (Hofer a ďalší, EMBO J., v tlači) a receptory kyseliny kaínovej tak, ako boli dokázané autorádiograficky v hippocampe, mozgovej kôre a v mozočku (Monaghan a ďalší, 1989, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365). Pozorovania sú kompatibilné s interpretáciou, podľa ktorej glutamát predstavuje fyziologický prenášač, ktorý riadi mRNA pre BDNF a NGF v CNS.

Príklad 11

Neurotrofný faktor, odvodený od mozgového tkaniva (BDNF) zvyšuje prežívanie a diferenciáciu kultúr cholinergných neurónov potkanieho septa v kultúre

Materiály a metódy

Príprava disociovaných buniek a podmienky pri pestovaní kultúr

Z potkanov kmeňa Sprague-Dawley po 17 dni gcstácie bola vybraná septálna oblasť a bola zbavená okolitého tkaniva. Fragmenty tkaniva boli trikrát premyté prostredím F-10 (Ham) a potom prenesené do kultivačnej misky s priemerom 35 mm a rozdrvené. Suspenzia jednotlivých buniek bola pripravená inkubáciou tkaniva s 0,25% trypsínom 20 minút pri 37 °C. Po inaktivácii trypsinu päťminútovou inkubáciou pri teplote miestnosti v rastovom prostredí s obsahom 50 pg/ml deoxyribonukleázy typu 1 (Sigma), bunky boli od seba oddelené tak, že fragmenty boli opakovane pretlačené zúženým koncom Pasterovej pipety. Potom boli oddelené bunky odstredené pri 500 x g celkom 45 sekúnd. Supematant bol oddelený a znova odstredený. Usadenina voľných buniek bola znova uvedená do suspenzie a bolo pridané rastové prostredie a hustota buniek bola stanovená hemocytometrom. Nakoniec boli bunky nanesené na vyhĺbenia s priemerom 6 mm, vopred potiahnuté polyomitínom (10 pg/ml) a laminínom (10 pg/ml). Bola overená životnosť buniek po 24 hodinách v kultúre na základe schopnosti buniek vylučovať trypanovú modrú.

Zvyčajné živné prostredie 5HS/N3 pre kultúry, tvorené neurónmi a bunkami glie obsahovalo: 5 % objemových konského séra (Gibco), 1 % objemových prísady N3 (Romijn a ďalší, 1982, Dev. Brain Res. 2:583 až 589), 0,5 % objemových glutamínu (200 mM, Gibco) a 0,25 % objemových zmesi penicilínu a streptomycínu (10 000 jednotiek/ml a 10 000 mikrogramov/ml, Gibco) v Dulbeccovej modifikácii Eaglovho prostredia (DMEM). Kultúry, obohatené neurónmi boli pripravené tak, že živné prostredie bolo päť až šesť hodín po kultivácii nahradené prostredím DMEM s obsahom 1 % prísady N3, 0,5 % glutamínu a 0,25 % zmesi penicilínu a streptomycínu. V oboch prípadoch bol použitý cytozínarabinozid (1 pM na 24 hodín) ako látka, obmedzujúca proliferáciu gliálnych buniek.

Skúška na účinnosť cholínacetyltransferázy

Z kultúr bolo odstránené rastové prostredie dvojitým premytím buniek vždy 100 pi PBS. Potom boli bunky rozrušené zmrazením a opätovným rozmrazením a 15 minútovou inkubáciou pri teplote 37 °C v 50 mM KH2PO4 s pH 6,77 a obsahom 200 mM NaCl a 0,25 % objemových Tritonu X-100. Potom boli 2 mikrolitre materiálu analyzované na účinnosť CAT podľa publikácie Fonnum F., 1975, J.

Neurochem. 24:407 až 409. Zloženie konečného substrátu: 0,2 mM j4C-acetyl-CoA (NEN, 54,4 mCi/mmol), 300 mM NaCl, 8 mM cholínbromidu, 20 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej a 0,1 mM neostigmínu v 50 mM NaH2PO4 s pH 7,4 ako pufra Pri tejto koncentrácii enzýmu a substrátu bola enzymatická reakcia lineárna 90 až 120 minút. Špecifickosť indukcie cholínacetyltransferázy bola skúšaná pridaním špecifického inhibítora účinnosti CAT, ktorým je N-hydroxyetyl-4-(l-naftylvinyl)pyridium (HNP v priebehu pokusu (White H. L. a Cavallito C. J., 1970, J. Neurochem. 17:1579 až 1989).

Skúška na účinnosť acetylcholínesterázy (AChE)

Množstvo AChE v rozrušených bunkách bolo merané podľa publikácie Potter L. T., 1967, J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 156:500 až 506 a Johnson C. D. a Russell R. L., 1975, Anál. Biochem. 64:229 až 238 s niekoľkými modifikáciami. Lyzáty, pripravené v 50 mM KH2PO4 s pH 6,7 ako pufra s obsahom 200 mM NaCl a 0,25 % objemových Tritonu X-100 boli zmiešané s 3H-acetylcholinjodidom (NEN, NET-113, 73,7 mCi/mmol), etopropazínom (0,1 mM) v 50 mM KH2PO4 s pH 7,0. Po 15 minútach inkubácie pri teplote 37 °C bola reakcia skončená P5ID8N9M 100 pl pufra na zastavenie reakcie, ktorý obsahoval 1 M kyselinu chlóroctovú, 0,5 M hydroxid sodný a 2,0 M chlorid sodný. Špecifická účinnosť AChE bola meraná za prítomnosti 1,0 (10‘6) neostigmínu).

Meranie príjmu cholínu mechanizmom s vysokou afinitou

Príjem cholínu vysoko afinitným, od Na⁺ závislým mechanizmom bol meraný spôsobom podľa publikácie Vaca K. a Pilar G., 1979, J. Gen. Physiol. 73:605 až 628). Bunky boli raz premyté 100 pl prostredia F-10 (Ham) a potom 100 pl Tyrodovho roztoku. Po 10 minútovej depolarizácii, indukovanej Tyrodovým roztokom s obsahom 25 mM draslíka, boli bunky inkubované 20 minút pri teplote miestnosti s 3H-cholínom (NEN, NET-109, 0,11 pM, 86,7 Ci/mmol) v normálnom Tyrodovom roztoku s obsahom Na⁺ alebo Li⁺. Príjem bol zastavený dvojitým premytím buniek pomocou PBS. Nahromadený cholín bol extrahovaný tak, že kultúra bola aspoň 20 minút inkubovaná so 100 pl chladného 1 N acetónového roztoku kyseliny mravčej. Rozpustná frakcia potom bola oddelená a výsledok bol zmeraný. Špecifický príjem cholínu je rozdiel medzi celkovým a od Na⁺ nezávislým príjmom cholínu.

Histochemické farbenie na acetylcholínesterázu

Cholinergné bunky boli identifikované histochemickým farbením na acetylcholínesterázu s použitím modifikácie farbenia podľa publikácie Geneser-Jensen a Blackstadt, 1971, Z. Zellforsch. 114:460 až 481. Po fixácii kultúry v 4% paraformaldehyde boli bunky inkubované 5 až 6 dní pri 4 °C za prítomnosti roztoku s obsahom substrátu pre AChE s následným zložením: 4 mM acetyltiocholínjodidu, 2 mM síranu meďnatého, 10 mM glycínu a 10 pg/ml želatíny v 50 mM acetátového pufra s pH 5,0. Vizualizácia produktu bola skončená podľa publikácie Hartikka J. a Hefti F., 1988, J. Neurosci. 8:2967 až 2985.

Histochemické farbenie receptorov NGF

Kultúry boli dvakrát premyté DMEM a potom boli fixované 4% paraformaldehydom. Potom boli bunky spracované 3 až 4 hodiny pufrom s fosforečnanom sodným s pH

7,4 s obsahom 5 % sérového albumínu hovädzieho dobyt31 ka, 0,02 % Tritonu X-100 a 5 % sacharózy (Hartikka J. a Hefti F., 1988, J. Neurosci. 8:2967 až 2985). Receptory NGF boli dokázané s použitím monoklonálnej protilátky 192-IgG (Taniuchi M. a Johnson E.,1985, J. Celí Biol. 101:1100 až 1106, Chandler a ďalší, 1984, J. Biol. Chem. 259:6882 až 6889) a v riedení 1:1000 v pufri s obsahom 5 % konského séra. Kultúry boli inkubované so zriedenou protilátkou 15 až 18 hodín pri teplote 4 °C. Viazaný imunoglobulín myši bol detekovaný s použitím biotinylovaného konského IgG proti myšiam (1:200 Vector). Imunoreaktívne bunky boli identifikované s použitím 3',3'-diaminobenzidínu ako substrátu pre viazaný enzým peroxydázu.

Čistenie BDNF a NGF

Čistenie BDNF bolo vykonávané z mozgu prasaťa, čistenie NGF zo submaxilámej žľazy myšacích samcov spôsobom podľa publikácie Barde a ďalší, 1982, EMBO J., 1:549 až 553, Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 328. Rekombinantný BDNF použitý pre časť týchto štúdií už bol skôr charakterizovaný (Mainsonpierre a ďalší, 1990, Science 247: 1446 až 141).

Výsledky

Kultúry septálnych buniek boli pestované vo vyhĺbeninách opatrených povlakom polyomitín-laminínu. Bolo možné pozorovať rast neuritov, po 24 hodinách vytvárali bunky útvary, charakteristické pre neuróny, ktoré bolo možné pozorovať vo fázovom kontraste (obr. 21A a 21B). Pri ďalšom raste neuritov postupne dochádzalo k častejšiemu vzájomnému styku medzi jednotlivými bunkami v dňoch 2 až 4 in vitro, ako je zrejmé z obr. 21 C, D, E a F. Aj po 4 dňoch bolo možné v kultúrach pozorovať veľmi malé množstvo buniek, odlišných od neurónov, čo sa prejavuje neprítomnosťou plochých buniek, ktoré sú vo fázovom kontraste tmavé. Aby bolo možné zistiť účinok BDNF na prežívanie cholinergných neurónov septa v kultúre, bolo použité histochemické farbivo pre AChE a pre receptor NGF. Typickú morfológiu neurónov pozitívnych na AChE je možné pozorovať na obr. 21 G a H. Niekoľko neurónov s pozitívnou reakciou na receptory NGF je možné vidieť na obr. 21 I.

BDNF vyvolal 2,4-násobný vzostup počtu buniek, pozitívnych na AChE v kultúrach s nízkou hustotou (hustota buniek v rozmedzí 66,700 až 133 300/cm³) v kultúrach septálnych buniek potkanieho embrya, ako je zrejmé z obr. 22A. Pri tej istej hustote buniek bol účinok NGF o niečo slabší (1,9-násobok). Zistenie, že BDNF a NGF môžu zvýšiť počet neurónov, pozitívnych na AChE v kultúre septálnych buniek uiýchlilo rozhodnutie zistiť, či oba tieto faktory pôsobia na podobné alebo odlišné populácie neurónov. Ako je zrejme z tretieho poľa na obr. 22A, súčasné pridanie BDNF a NGF až do nasýtenia neviedlo k väčšiemu zvýšeniu počtu neurónov, pozitívnych na AChE v porovnaní s jednotlivými pôsobeniami oboch faktorov. Pokiaľ ide o prežívanie neurónov, tieto výsledky ukazujú, že v prípade cholinergných neurónov potkanieho septa v kultúre musí ísť v prípade pozitívnej odpovede na NGF alebo na BDNF o prekrývajúce sa populácie.

Účinok BDNF na prežívanie neurónov, pozitívnych na AChE, bol závislý od hustoty, pri ktorej boli bunky pestované, ako je zrejmé z obr. 22A. Pri vysokej hustote buniek (200 000 až 266 000 buniek/cm³) už ani samotný BDNF ani v kombinácii s NGF už nespôsobil zvýšenie počtu neurónov, pri ktorých dochádza k expresii AChE. Tento jav môže byť spôsobený endogénnou hladinou neurotrofného účinku alebo tiež tým, že zvýšené prežívanie je podporované tiež zvýšeným stykom medzi bunkami.

Pri nízkej hustote buniek sa zvyšuje počet AChE-pozitívnych buniek ako funkcie koncentrácie BDNF, maximálnu odpoveď je možné pozorovať v dávke 10 ng/ml, pri ktorej dochádza k zvýšeniu počtu AChE-pozitívnych buniek/vyhĺbenie z kontrolných hodnôt 169 + 12,9 na 388 + 26,2 (2,5-násobný vzostup) v kultúrach, ku ktorým bol BDNF pridaný. Na porovnanie je možné uviesť, že maximálnu odpoveď na NGF bolo možné pozorovať pri koncentrácii tejto látky 50 ng/ml, táto koncentrácia vyvolala zvýšenie počtu AChE-pozitívnych buniek/vyhĺbenie z pôvodnej hodnoty 121 ± 7,6 na 231 + 12,9, to znamená 1,9-násobné zvýšenie. Fáza, pri ktorej krivka po určitý čas nestúpa (plateau) je stála na krivkách pre BDNF aj pre NGF v tom zmysle, že nedošlo k zníženiu AChE-pozitívnych neurónov až do dávok 100 ng/ml.

Je zrejmé, že v prípade kultúr s nízkou hustotou buniek môžu BDNF aj NGF zvýšiť počet buniek, ktoré je možné dokázať histochemicky pomocou AChE. Je možné, že tento vzostup môže byť spôsobený záchranou cholinergných buniek, ktoré by v kultúre zahynuli bez rastového faktora alebo môže ísť o zvýšenie počtu prekurzorových buniek alebo o indukciu cholinergného značenia, AChE. Aby bolo možné tieto možnosti od seba odlíšiť, boli vykonané ďalšie pokusy, pri ktorých boli uvedené látky pridané neskoršie (obr. 23) v sériách kultúr, ktoré boli pestované celkom 12 dni. K jednej skupine kultúr boli látky pridané 5 až 6 hodín po nanesení na platne a kultúra potom bola pestovaná až do 12. dňa v prítomnosti BDNF alebo NGF. Druhá skupina kultúr bola pestovaná bez rastového faktora 5 dní a potom bol na ďalších sedem dní pridaný NGF alebo BDNF (-5/+7). Pri porovnaní týchto dvoch skupín kultúr bola odpoveď na BDNF alebo NGF, prípadne až po piatich dňoch pestovania v podstate rovnaká ako v prípade, že boli bunky kontinuálne pestované v prítomnosti týchto faktorov (ako je zrejmé z porovnania plných a šrafovaných stĺpcov na obr. 23). Ale výsledky boli celkom rozdielne v tretej skupine kultúr, v ktorej bol NGF alebo BDNF prítomný len posledných päť dní (-7/+5). Za týchto podmienok už nedošlo v prítomnosti BDNF ani v prítomnosti NGF k zvýšeniu počtu buniek, pozitívnych na AChE. V ďalších pokusoch bolo dokázané, že vystavenie septálnych neurónov len na 3 až 4 dni vplyvu NGF alebo BDNF je dostatočné na veľké zvýšenie počtu buniek s aktivitou AChE, ktorú je možné dokázať príslušným farbením. To znamená, že skutočnosť, že u kultúr -7/+5 nedošlo k zvýšeniu počtu AChEpozitívnych neurónov nebola spôsobená tým, že by rastový faktor nebol v čase expozície schopný vyvolať zvýšenie počtu týchto buniek.

In vivo bolo dokázané (Montero C. a Hefti F., 1988, J. Neurosci. 8:2986 až 2999, Higgins a ďalší, 1989, Neurón. 3: 247 až 256), že NGF je schopný riadiť úroveň svojich vlastných receptorov, ako je možné dokázať meraním úrovne mRNA. Rovnakú schopnosť bolo možné dokázať aj in vitro. Vzhľadom na to, že BDNF má podobné účinky ako NGF pri indukcii cholinergného fenotypu a pri prežívaní septálnych buniek v kultúre, bola skúmaná možnosť, či BDNF neriadi úroveň receptora pre NGF. Na tento účel bol zistený počet IgG-pozitívnych buniek. Pri koncentrácii BDNF 10 ng/ml došlo k trojnásobnému zvýšeniu počtu imunopozitívnych buniek s receptormi pre NGF, ako je zrejmé z obr. 24. Je zaujímavé, že pri vyšších koncentrá ciách (25 až 100 ng/ml) bol účinok BDNF postupne stále menej významný. Z krivky závislosti účinku od dávky bol teda zrejmý veľký rozdiel v porovnaní s účinkom BDNF na iné parametre týchto kultúr, napríklad na počet AChE-pozitívnych buniek. Ako pozitívna kontrola boli použité bunky pestované v prítomnosti NGF v koncentrácii 50 ng/ml, táto koncentrácia vyvolávala trojnásobný vzostup počtu pozitívnych buniek. Na báze farbenia IgG-192 bolo teda možné dokázať, že BDNF má približne rovnaký účinok ako NGF pri riadení expresie receptora pre NGF.

Okrem účinkov na prežívanie buniek bola skúmaná možnosť, že by BDNF mohol vyvolať vznik cholinergného fenotypu. U kultúr septálnych buniek pestovaných za prítomnosti zvyšujúcej sa koncentrácie BDNF až do 50 ng/ml bolo možné pozorovať lineárny vzostup aktivity CAT, najvyššia odpoveď bola 1,8-násobné zvýšenie oproti kontrole, ako je zrejmé z obr. 25. Pri indukcii účinnosti CAT v paralelných kultúrach s pridaním NGF bolo dosiahnuté plateau pri koncentrácii 25 ng/ml, čo znamená zvýšenie 3,4-krát v porovnaní s kontrolnými hodnotami. Odpoveď na BDNF ani NGF nevykazovala podstatné zníženie pri koncentrácii trikrát vyššej než zodpovedá nasýteniu. Indukcia aktivity CAT v prítomnosti NGF ani BDNF neovplyvnila hladinu transferázy, nezávislej od [N-hydroxy-ety 1-4-(1 -naftylvinyl)pyridium]HNP.

Vzhľadom na zistenie, že BDNF a NGF vyvoláva zvýšenie účinnosti CAT v bunkách septa, bola študovaná odpoveď na súčasné pôsobenie oboch týchto faktorov, výsledky sú uvedené v tabuľke VIII. V týchto pokusoch boli použité dve koncentrácie BDNF, 5 a 25 ng/ml, došlo k zvýšeniu účinnosti CAT 1,4 a 2,6-krát. V prípade, že bol účinok NGF v dávke 50 ng/ml, ktorá sama zvyšuje účinnosť enzýmu 2,8-krát kombinovaný s účinkom BDNF. Bol účinok na aktivitu CAT aspoň aditívny, ako je zrejmé z tabuľky VII taktiež zrejmé. V použitej koncentrácii BDNF by čisto aditívny účinok viedol spolu s použitím NGF k zvýšeniu 4,2 a 5,4-krát v porovnaní s kontrolnou hodnotou. Pozorované hodnoty teda boli o niečo vyššie než aditívne.

Tabuľka VIII

Vplyv súčasného pridania NGF a BDNF na aktivitu CAT

Koncentrácia ng/ml	účinnosť CAT pmol/h/v*	% kontroly
Kontrola	561,3134,8
NGF (50)	1546,3188.7	280
BDNF (5)	768,0125,5	140
BDNF (25)	1470,1166,2	260
NGF (50) + BDNF (5)	2767,61177,2	490
NGF (50) + BDNF (25)	3742,0 1 668,3	670

_vx = vyhĺbenie

Bunky septa boli pestované počas 12 dní v prostredí 5HS/N3 za prítomnosti uvedených koncentrácií trofických faktorov. Aktivita CAT bola zmeraná a opísaná. Uvedené hodnoty sú priemer + priemerná štandardná odchýlka zo 4 až 5 stanovení.

Bola skúmaná aj možnosť, že biologická odpoveď, pozorovaná pri podaní BDNF by mohla byť dôsledkom uvoľňovania endogénneho NGF v závislosti od BDNF. Aby bolo možné tento vzťah študovať, bola použitá monoklonálna protilátka proti NGF (protilátka 27/21, Korsching a Thoenen, 1983) na blokovanie akejkoľvek odpovede, spojenej s NGF. Ako je znázornené v tabuľke IX, bol účinok

NGF na účinnosť CAT podstatne znížený protilátkou proti NGF, zatiaľ čo odpoveď, vyvolaná podaním BDNF bola v podstate nezmenená. Je však nutné uviesť, že bazálna úroveň účinnosti CAT bola približne o 20 % znížená u kultúr, ktorým bola podávaná len protilátka proti NGF, v porovnaní s kontrolnými kultúrami bez ošetrenia. Ale pozorovaný vzostup účinnosti CAT u kultúr septálnych buniek po podaní BDNF je zrejme priamym účinkom a nie účinkom, ktorý by bol sprostredkovaný zvýšením koncentrácie endogénneho NGF.

Tabuľka IX

Účinok protilátok proti NGF na schopnosť NGF a BDNF indukovať aktivitu enzýmu CAT

Účinnosť enzýmu CAT

koncentrácia ng/ml	(pmol/h/vyhlbenie)	% kontroly
kontrola	517,5313,2	-
BDNF (25)	1021,6 ±106,1	187
NGF (50)	1138,0 ±98,1	220
kontrola + protilátka
proti NGF	418,7 ±27,0	61
BDNF + protilátka
proti NGF	819,2 ±88.8	15B
NGF + protilátka
proti NGF	551,0 ±27,0	107

Po dvanásťhodinovom raste v prostredí 5HS/N3 za prítomnosti uvedených koncentrácií trofických faktorov boli septálne bunky (nanesené v hustote 2,3 (10^) buniek/ctrú) oddelené. Účinnosť CAT bola stanovená spôsobom opísaným v metodickej časti. Hodnoty sú uvedené ako priemer ± stredná odchýlka od priemeru zo 6 stanovení.

Bola taktiež sledovaná možnosť, že AChE je koordinovane riadená spolu s účinnosťou CAT pôsobením BDNF alebo NGF (obr. 26). Na rozdiel od účinnosti CAT nebola závislosť účinku od dávky pre AChE pri pôsobení BDNF alebo NGF, bola pri porovnaní oboch trofických faktorov podobná v tom zmysle, že účinnosť enzýmu sa zvyšovala lineárne až do koncentrácie 50 ng/ml. Pri tejto koncentrácii zvyšovali NGF a BDNF účinnosť CAT o 274 a 234 % v porovnaní s kontrolnými hodnotami, získanými v neprítomnosti týchto faktorov.

Bola skúmaný aj čas, po ktorý dochádza k indukcii zvýšenia účinnosti CAT (obr. 27). Účinnosť CAT v kultúrach, ku ktorým bolo pridaných 50 ng/ml BDNF sa zvýšila na 170 % kontrolná hodnota v priebehu 3 dní. Tento vzostup pokračoval až do 6. dňa, keď sa začalo vytvárať plateau na hodnote, rovnajúcej sa 2,5-násobku kontrolnej hodnoty a hodnota sa už v priebehu pokusu nezvyšovala. Oproti tomu pri sledovaní odpovede CAT na NGF v koncentrácii 50 ng/ml bolo zistené, že tretí deň už bol dosiahnutý 2,5 násobok kontrolnej hodnoty. Potom vzostup pokračoval lineárne, až po 12 dňoch dosiahol 3,2-násobok kontrolných hodnôt.

Bolo dokázané, že astrocyty pestované v kultúre po určitý čas syntetizujú celý rad neurotrofných látok okrem NGF (Lindsay R. N., 1979, Náture 282:80 až 82, Lindsay a ďalší, 1982, Brain Res. 243:329 až 343, Alderson a ďalší, 1989, Dev. Brain Res. 48:229 až 241). Aj napriek tomu, že bola pripustená možnosť, že súčasné pozorovania účinku BDNF sú sprostredkované cez vzostup koncentrácie NGF je možné, že BDNF môže pôsobiť nepriamo tak, že mení expresiu iných neurotrofných faktorov, najmä v bunkách glie. Aby bolo možné odhadnúť možnosť, že bunky, odliš33 né od neurónov by mohli ovplyvniť vplyv BDNF na účinnosť CAT v septálnych kultúrach, bola porovnávaná odpoveď cholinergných neurónov na BDNF v kultúrach zmesi gliálnych buniek a neurónov a v kultúrach, obohatených neurónmi (obr. 28). V kultúrach obohatených neurónmi mala krivka závislosti účinku CAT od BDNF tvar zvona, maximálny vzostup bol dosiahnutý pri dávke 5 ng (ml BDNF a pri koncentrácii 25 ng/ml už bolo možné pozorovať podstatný pokles enzymatickej účinnosti (p < 0,001, v porovnaní s 15 až 25 ng/ml BDNF). Podobne, ako je tomu pri výsledkoch, znázornených na obr. 25, odpoveď CAT na BDNF za prítomnosti súvislej vrstvy gliálnych buniek bola lineárna, v tomto prípade až do 25 ng/ml BDNF, čo bola najvyššia skúmaná dávka. Za prítomnosti buniek odlišných od neurónov je teda potrebná vyššia koncentrácia BDNF na vyvolanie ekvivalentného vzostupu účinnosti CAT, aký je možné dosiahnuť v kultúrach obohatených neurónmi. Nezávisle od tejto skutočnosti bola schopnosť maximálne stimulovať aktivitu CAT pri cholinergných neurónoch septa v podstate za prítomnosti aj neprítomnosti gliálnych buniek.

Na báze účinnosti CAT a AChE je zrejmé, že BDNF môže mať v podstate rovnaký účinok, pokiaľ ide o podporu fenotypového značenia cholinergných buniek. Aby bolo možné túto skutočnosť podrobnejšie študovať, bol porovnaný účinok BDNF na príjem cholinu, závislý od sodíkových iónoch, s účinkom NGF (obr. 29). Bunky, ktoré boli 12 dní pestované za prítomnosti 50 ng/ml BDNF akumulovali cholín, 3,8-násobne v porovnaní s neošetrenými kontrolami. V paralelných kultúrach bol NGF v dávke 25 ng/ml schopný vyvolať 2,3-násobný vzostup akumulácie cholinu.

Diskusia

V porovnaní s dokázanými účinkami na periférne neuróny (Barde a ďalší, 1980, EMBO J., 1:549 až 553, Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 328, Davies a ďalší 1986, J. Neurosci. 6:1897 až 1904, Hofer M. a Barde Y., 1988, Náture 331:262 až 262) je špecifickosť pôsobenia BDNF v oblasti centrálneho nervového systému menej dobre charakterizovaná. Až dosiaľ je možné považovať za jediné bunky CNS, ktoré na tento odpovedajú, malou subpopuláciou Thy-1-pozitívnych buniek sietnicových ganglií, ktoré boli prvýkrát identifikované v sietniciach potkaních embryí E17 (Johnson a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6:3031 až 3038). Ďalšie sledovanie dokázalo taktiež účinok BDNF na sietnicové gangliá dospelých potkanov v explantátoch (Thanos a ďalší, 1989, Eur. J. Neuro. 1:19 až 26. V súčasných pokusoch bolo dokázané, že BDNF zvyšuje prežívanie cholinergných neurónov z embryonálneho septa potkanov v kultúre, ako bolo dokázané histochemickým farbením AChE a zvyšuje expresiu rôznych fenotypických cholinergných značení, t. j. enzymatickú účinnosť AChE a CAT a vysoký príjem cholinu. Okrem toho bolo dokázané, že BDNF zvyšuje expresiu receptora pre NGF v kultúre septálnych buniek.

V počiatočných pokusoch bolo dokázané, že BDNF zvyšuje počet neurónov, pozitívnych na acetylcholínesterázu AChE v kultúrach septálnych buniek embryí E17 približne na dvojnásobok. Rovnako, ako je tomu v prípade NGF (Hartikka J. a Hefti F., 1988, J. Neurosci. 8:2967 až 2985) bol tento účinok najzrejmejší pri nízkych hustotách buniek. Je zaujímavé, že súčasné pridanie NGF a BDNF nemalo žiadny účinok, pokiaľ ide o ďalší vzostup AChE-pozitívnych buniek nad úroveň, pozorovanú v prítomnosti ktoréhokoľvek z rastových faktorov jednotlivo. Toto pozorovanie podporuje teóriu, že BDNF a NGF zrejme pôsobia na tú istú populáciu cholinergných neurónov septa.

Ako už bolo uvádzané pre NGF (Hefti a ďalší, 1985, Neuroscience 1:55 až 68), BDNF nepodporuje prežívanie cholinergných v kultúrach pri pomerne vysokej hustote buniek. V pomere k pestovaným bunkám bolo prežívanie cholinergných neurónov vyššie pri vyššej než pri nižšej hustote buniek a v neprítomnosti akéhokoľvek neurotrofného faktora. Je niekoľko možných vysvetlení pôsobenia tohto bunkového vzájomného styku, možnosť priaznivého účinku väčšieho počtu buniek, odlišných od neurónov alebo vyšší než proporcionálny vzostup endogénneho neurotrofného účinku. Pokiaľ ide o poslednú možnosť, nebolo možné dokázať žiadnu známku toho, že by bolo podstatne zvýšené množstvo endogénneho NGF vzhľadom na to, že pridanie prebytku protilátky proti NGF pri neošetrených bunkách s vyššou hustotou znížilo bazálnu aktivitu CAT len o 20 %. V týchto kultúrach zvyšoval exogénny NGF účinnosť CAT až 3,4-krát.

Ako bolo možné pozorovať, tak na úrovni bielkovín, ako aj na úrovni mRNA, existuje teraz mnoho správ, ktoré sa týkajú možnosti, že NGF môže sám spätne riadiť expresiu svojho vlastného receptora na pestovaných neurónoch aj in νίνο. V súčasných pokusoch bola použitá monoklonálna protilátka lgG-192 na detekciu receptora pre NGF. Táto monoklonálna protilátka bola charakterizovaná tak na senzorických neurónoch potkana, ako aj na potkanovom mozgu (Taniuchi M. a Johnson E., 1985, J. Celí. Biol. 101:1100 až 1106). Bolo potvrdené zistenie Hartikky a Heftiho, že NGF môže regulovať množstvo svojho receptora v kultúrach septa, ako bolo možné zvýšením počtu IgG192-imu-nopozitívnych neurónov a okrem toho bolo dokázané, že BDNF zvyšuje počet IgG-192-imunopozitívnych buniek až trikrát. Odpoveď na BDNF je dvojfázová v tom zmysle, že vysoké koncentrácie v rozmedzí 25 až 100 ng/ml už nevyvolávajú taký vysoký vzostup pozitívnych buniek, aký je možné pozorovať pri koncentrácii 10 ng/ml. Je zaujímavé, že tento typ závislosti odpovede od dávky je celkom rozdielny od typu odpovede, ktorú je možné pozorovať pre vzostup počtu AChE-pozitívnych neurónov po podaní BDNF. Pri tomto type odpovede nebolo možné pozorovať zníženie maximálneho účinku BDNF pri vyšších koncentráciách. Je nutné uviesť, že receptor pre NGF s nízkou afinitou je taktiež schopný viazať BDNF s podobnou afinitou, ako bolo v poslednom čase dokázané, čo vedie k domnienke, že by receptory s nízkou afinitou mohli byť identické pre BDNF aj NGF (Rodriguez-Tebat a ďalší 1990, Binding of Barin-derived Neurotrophic Factor to the Nerve Growth Factor Receptor Neurón. 4, 487 až 492).

Na možnú podobnosť mechanizmu účinku BDNF a NGF bolo usudzované na základe zistenia, že BDNF je v prípade indukcie aktivity AChE rovnako účinný ako NGF. Aj napriek tomu bolo dokázané, že BDNF podporuje prežívanie cholinergných neurónov v podobnej miere ako NGF, účinok BDNF na enzymatickú účinnosť CAT nebol taký vysoký ako účinok NGF. Pri vykonávaní celého radu pokusov bola dosiahnutá maximálna indukcia CAT 1,8 až 2,6-krát vyššia, zatiaľ čo v prípadoch NGF je možné bežne dosiahnuť trojnásobné zvýšenie. Je teda zrejmé, že aj napriek tomu, že existuje určitá podobnosť medzi mechanizmom účinku BDNF a NGF, je aj tak pravdepodobné, že existujú tiež určité rozdiely v expresii a riadení zodpoveda34

SK 279668 Β6 júcich receptorov a väzby týchto receptorov na cesty, ktorými dochádza k indukcii účinnosti CAT.

Predpoklad, že rozdiel v úrovni indukcie účinnosti CAT, vyvolaný BDNF alebo NGF by mohol byť dôsledkom rôznych ciest riadenia bol ďalej podporovaný výsledkami pokusov, sledujúcich účinky týchto látok v priebehu času. Septálne neuróny pestované v kultúre odpovedali na prítomnosť BDNF vzostupom účinnosti až do 6. dňa, keď sa odpoveď zastavila na určitej úrovni. Na rozdiel od tohto pozorovania v prítomnosti NGF dochádza k indukcii účinnosti CAT pomalšie v rozmedzí 3 až 12 dní. Zastavenie vzostupu indukcie účinnosti CAT v 6. dni za prítomnosti BDNF môže byť ukazovateľom vývojovej zmeny v expresii receptorov pre BDNF alebo zložky, nevyhnutnej pri vyvolávaní odpovede. S ohľadom na to, že počet cholinergných neurónov (AChE-pozitívnych neurónov) v kultúrach s vysokou hustotou buniek po 12-tich dňoch je zrejme nezávislý od exogéneho prívodu BDNF alebo NGF, je nepravdepodobné, že by diferencované uhynutie neurónov mohlo byť príčinou časových rozdielov, pozorovaných pri indukcii účinnosti CAT pri týchto dvoch rastových faktoroch.

V počiatočných pokusoch, pri ktorých bolo sledované pôsobenie BDNF na cholinergné bunky bazálnej časti predného mozgu, nebol vykonaný žiadny predpoklad, pokiaľ ide o primárny typ buniek, neurónový alebo gliálny, ktorý by mohol odpovedať na tento neurotrofný faktor. Hoci pokusy vykonané na vysoko obohatených kultúrach periférnych neurónov veľmi naznačovali, že BDNF pôsobí priamo na neuróny (Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 328, Lindsay, 1988, J. Neurosci. 7:2394 až 2405), je tiež možné pripustiť, že účinok BDNF na neuróny, pozorovaný pri súčasných pokusoch by mohol byť spôsobený cez primárny účinok BDNF na astrogliu alebo inú bunku neneurónovej povahy. Bolo však tiež dokázané, že BDNF je rovnako účinný pri vyvolávaní indukcie účinnosti CAT za prítomnosti súvislej vrstvy prevažne astrogliálnych buniek alebo v kultúrach, ktoré boli do značnej miery zbavené gliálnych buniek pôsobením inhibítorov mitózy, cytozínarabinozidu. Zaujímavým pozorovaním pri týchto pokusoch bola skutočnosť, že tvar krivky závislosti odpovede od dávky pre BDNF mal v oboch prípadoch zjavnú odlišnosť. V prítomnosti súvislej vrstvy gliálnych buniek bola odpoveď na BDNF lineárna pri zvyšujúcej sa koncentrácii BDNF. V kultúrach obohatených neurónmi bolo možné pozorovať posun krivky závislosti odpovede od dávky doľava. Možným vysvetlením pre tieto výsledky je, že aj u gliálnych buniek samých osebe môže dochádzať k expresii receptora pre BDNF, čím sa súčasne zníži účinná koncentrácia ligandu, dostupná pre receptor, uložený na neuróne. Je tiež možné, že supresívny účinok astrocytov je nepriamy a nie je spojený s účinkom na koncentráciu ligandu alebo na expresiu receptora a je sprostredkovaný napríklad vysoko zvýšenou regradáciou BDNF. Podobné pozorovania uviedli tiež Hartikka a Hefti, 1988, J. Neurosci: 8: 2967 až 2985 a Honegger a Lenoir, 1982, Dev. Brain Res., 3: 229 až 238. Bolo dokázané, že gliálne bunky z rôznych oblastí mozgu môžu do značnej miery ovplyvniť morfológiu neurónov, ktoré sú s nimi spojené (Prochiantz a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5387 až 5391, Prochiantz a ďalší, 1981, Náture 293:570 až 572). Septálna glia teda môže mať vnútorné pôsobenie buď na membrány alebo na sekrečné štruktúry a týmto spôsobom potlačiť expresiu cholinergného fenotypu. V poslednom čase sú skúmané riadiace vlastnosti astrocytov, odvodených od hippocampu za podobných podmienok.

Na základe zistených skutočností je zrejmé, že tak BDNF ako aj NGF môžu zvýšiť cholinergnú funkciu neurónov septa. Je zaujímavé pokúsiť sa o zhodnotenie fyziologického pôsobenia týchto dvoch vysoko homológnych neurotrofných faktorov, ktoré zrejme pôsobia na tú istú populáciu neurónov. Je pravdepodobné, že pôsobenie BDNF a NGF sa môže na začiatku prekrývať v priebehu včasného vývoja periférnych neurónov, zvlášť pri subpopulácií ganglií dorzálnych koreňov alebo pri prekurzoroch týchto neurónov a potom neskoršie môže dôjsť k rozlíšeniu tak, že oba faktory pôsobia na odlišné populácie (Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 328, Ersberger U. a Rohrer H, 1988, Dev. Biol. 126:420 až 432, Barde Y. A., 1989, Neurón. 2:1525 až 1534). Tieto skutočnosti však zatiaľ neboli dokázané s použitím príslušného značenia tak, aby bolo možné definovať subpopulácie senzorických neurónov. Vzhľadom na to, že súčasné štúdie boli zamerané na embryonálne septálne neuróny v kultúre v určitom časovom období E17 je možné, že v septe môže dochádzať aj v iných časových obdobiach, najmä v neskorších vývojových štádiách k podobným segregatívnym fenoménom. Môže sa ukázať, že existujú zaujímavé časové a priestorové rozdiely v odpovedi septálnych cholinergných neurónov na NGF a BDNF.

Bude tiež zaujímavé preskúmať účinky BDNF na cholinergné neuróny bazálnej časti predného mozgu in vivo, v tejto časti mozgu bolo zatiaľ dokázané, že NGF, odvodený od hippocampu sa zrejme zúčastňuje normálneho vývoja a udržiavania cholinergných neurónov bazálnej časti predného mozgu in vivo. Bude zaujímavé zistiť, či BDNF má alebo nemá podobnú úlohu in vivo. Súčasné zistenie, žc mRNA pre BDNF sa nachádza v hippocampe vo zvlášť vysokom množstve podporuje túto možnosť.

Príklad 12

Enzymatická premena prepro BDNF na účinný, úplný BDNF

Materiály a metódy

Bežne dodávaná endoproteináza Arg-C (čistená zo submaximálnych žliaz myši) bola použitá na enzymatickú premenu veľkej prekurzorovej formy hBDNF (preproBDNF) na biologicky účinnú bielkovinu. Toto enzymatické štiepenie bolo vykonané in vitro. Substrátom pre enzymatickú reakciu bol preproBDNF, syntetizovaný v bunkách CHO-DG44, látka bola vylučovaná do živného prostredia, odkiaľ bola izolovaná. Ako živné prostredie bolo použité prostredie Hamovo, F12 (zbavené nukleozidov) s prídavkom 1% fetálneho séra hovädzieho dobytka (FBS) a 1 % penicilínu a streptomycínu, reakcia bola vykonávaná minút pri teplote 37 °C s použitím 5 jednotiek enzýmu a 50 pl supematantu buniek CHO-DG44 s obsahom preprohBDNF. Za týchto podmienok prebehlo úplne rozštiepenie preprohBDNF na hBDNF.

Výsledky a diskusia

Prepro-forma rekombinantného hBDNF s molekulovou hmotnosťou približne 31 000 bola úplne spracovaná na biologicky účinnú formu hBDNF s molekulovou hmotnosťou približne 12 000 in vitro s použitím endoproteinázy

Arg-C. Rekombinantný hBDNF bol úspešne získaný produkciou v cicavčích bunkách CHO-DG44. Gén pre hBDNF

SK 279668 Β6 bol stabilne integrovaný do genómu buniek CHO a bol amplifikovaný s použitím metotrexátu. Rekombinantný hBDNF bol vylučovaný do živného prostredia a bolo dokázané, že je biologicky účinný. Metabolické značenie s následnou elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovom géli dokázalo, že väčšina syntetizovaného 35sznačeného hBDNF, vylúčeného do živného prostredia migrovala v prepro-forme so zjavnou molekulovou hmotnosťou 31 000, ako je zrejmé z dráhy 2 na obr. 30. 35s_ značené bielkoviny, produkované divokým typom buniek CHO-DG44 sú znázornené v dráhe lna obr. 30. Aby bolo možné získať prevažne zrelú formu hBDNF so zjavnou molekulovou hmotnosťou 12 000, bol použitý postup in vitro na enzymatické rozštiepenie prepro-formy BDNF.

Produkty štiepenia trypsínom sú znázornené v dráhach 3 až 6 na obr. 30. Trypsin zo slinivky hovädzieho dobytka vo fyziologickom roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrom a enzým bol pridaný k jednotlivým podielom 50 μΐ 2-S-označeného hBDNF z buniek CHO. Bola použitá koncentrácia trypsínu 25, 50, 75 a 100 pg/ml. 35S-značené reakčné produkty sú znázornené v dráhach 3 až 6. Enzymatické štiepenie bolo vykonávané pri teplote 37 °C celkom 5 minút. Bolo možné pozorovať postupný pokles intenzity značenia prepro-formy s molekulovou hmotnosťou 31 000 a zodpovedajúci vzostup značenia produktu s molekulovou hmotnosťou 18 500. Za týchto podmienok nebolo možné dosiahnuť vznik zrelej účinnej formy s molekulovou hmotnosťou 12 000. V dráhe 7 na obr. 30 sú znázornené reakčné produkty, značené 35g p₀ vykonaní enzymatického štiepenia hBDNF z buniek CHO pôsobením endoproteinázy ArgC, izolovanej zo submaxilámej žľazy myši (Boehringer Mannheim Biochemicals. Inc.). 100 jednotiek tohto enzýmu bolo rekonštituovaných z lyofilizovaného prostriedku s použitím 100 μΐ vody Milli-Q a roztok bol skladovaný pri teplote -20 °C. Pre enzymatické rozštiepenie hBDNF z buniek CHO bolo použitých 5 jednotiek (5 μΐ) enzýmu a 50 μΐ 35s-značenej bielkoviny zo supematantu buniek CHO s obsahom preprohBDNF (dráha 2 na obr. 30). Ako je z obr. 30 zrejmé, 5 jednotiek endoproteinázy Arg-C bolo schopných previesť prepro-formu hBDNF s molekulovou hmotnosťou 31 000 na zrelú formu hBDNF s molekulovou hmotnosťou 12 000 v priebehu 5 minút pri teplote 37 °C.

Enzymatické spracovanie supematantov buniek CHO, pri ktorých dochádza k expresii hBDNF endoproteinázou Arg-C vedie k zvýšeniu úrovne biologickej účinnosti BDNF v porovnaní so supematantmi, ktoré týmto spôsobom spracované neboli. Supematanty buniek CHO-DG44, pri ktorých dochádza k expresii hBDNF boli 5 minút spracované endoproteinázou Arg-C pri teplote 37 °C. K 200 μΐ supematantu bolo pridaných 20 jednotiek enzýmu a tak spracovaný, ako aj nespracovaný hBDNF bol skúmaný na biologickú účinnosť s použitím explantátov E8 kuracích ganglií z dorzálnych koreňov. 24 hodín po pridaní hBDNF bol kvantitatívne hodnotený rast neuritov. Vždy bolo možné pozorovať, že vzorky spracované endoproteinázou boli výskumné biologicky aktívnejšie než kontrolné nespracované vzorky. Krivka závislosti od koncentrácie pre tieto hodnoty je uvedená na obr. 31.

Je teda možné uzavrieť, že čistenou endoproteinázu Arg-C je možné použiť pri enzymatickej reakcii in vitro na získanie zrelej, biologicky účinnej formy rekombinantného hBDNF z neúplne spracovaných prekurzorov BDNF. Tento nový postup umožní získavať vo veľkom množstve biologicky aktívny hBDNF z kultúr cicavčích buniek.

Malo by napríklad byť možné mobilizovať endoproteinázu Arg-C na tuhú matricu a týmto spôsobom získať možnosť účinného chromatografického spracovania.

Príklad 13

BDNF podporuje prežívanie a dozrievanie dopaminergných neurónov ventrálneho mesencephala potkana Materiály a metódy

Bunkové kultúry

Disociované kultúry boli pripravené enzymatickým a mechanickým delením tkaniva ventrálneho mesencephala, ktoré bolo vybraté z E14 až E15 potkaních embryí. Postup bol zvyčajne vykonávaný tak, že dva až tri litre zmesi uvedeného tkaniva z potkaních embryí, narodených z potkanov, ktorých párenie bolo načasované, boli spracované pôsobením trypsínu (0,125 %, Worthington) v prostredí F12 (Gibco) 20 minút pri teplote 37 °C. Po premytí rastovým prostredím (MEM s nasledujúcimi doplnkami: glutamín 2 mM, glukóza 6 mg/ml, penicilín G 0,5 jednotiek/ml, streptomycín 5 pg/ml, ťetálne teľacie sérum 7,5 %) bolo tkanivo krátko odstredené nízkou rýchlosťou celkom 5 minút a peleta bola rozotretá. Po usadení zhlukov v časee 1 až 2 minúty bola suspenzia jednotlivých buniek nanesená na platoe s priemerom 35 mm (vopred opatrené povlakom polyomitínu a laminínu podľa publikácie Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319) s obsahom rastového prostredia, bola použitá hustota 5 x 104 buniek na cm2. Po inkubácii cez noc v rastovom prostredí na dosiahnutie spojenia buniek boli bunky pestované za prítomnosti alebo v neprítomnosti BDNF v definovanom prostredí, zbavenom séra (Bottenstein a Sato, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: : 514) s tým rozdielom, že bol pridaný inzulín v dávke 20 ng/ml. Aby bolo možné zviditeľniť dopaminergné bunky, boli kultúry fixované 4% paraformaldehydom, dôkladne premyté, spracované 0,02% Saponínom v Sorensenovom pufri s 1,5 % konského séra a potom farbené myšacou monoklonálnou protilátkou proti TH potkana (Boehringer Mannheim). Primárna väzba bola vizualizovaná s použitím skúšobného balíčka Vectastain ABC kit (Vector Labs).

Meranie príjmu dopamínu

Kultúry boli pripravené spôsobom opísaným v príklade 13 a boli pestované po uvedený počet dní buď za prítomnosti alebo za neprítomnosti BDNF prasaťa v množstve 50 ng/ml. Príjem dopamínu bol meraný vždy v trojitom opakovaní v uvedených časových bodoch. Bunky boli predbežne premyté puťrom na sledovanie príjmu s nasledujúcim zložením: 136,8 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8 mM Na2HPO4 . 7 H2O, 1,5 mM KH2PO4, 5 mM glukózy, 1 mM CaC12, 1 mM MgSC>4, 0,1 mM askorbátu a 0,1 mM pargylínu pri pH 7,4. Vzorky, na ktorých mal byť meraný príjem ^H-dopamínu neneuronálnymi bunkami obsahovali benzotropín v koncentrácii 5 μΜ. Po premytí boli bunky predohriate na teplotu 37 °C počas 5 minút v čerstvom pufri na sledovanie príjmu a potom bol pridaný ^H-dopamín (NEN, 40 Ci/mmol) do konečnej koncentrácie 50 nM. Kultúry boli inkubované 15 minút pri 37 °C, potom bol roztok odstránený a bunky boli uložené do ľadu a štyrikrát premyté ľadovo chladným pufrom pre príjem. Potom boli bunky oddelené pridaním 0,5 M NaOH do platní a v NaOH extrakte bola stanovená rádioaktivita s použitím scintilačného počítača (Beckman) so scintilačnou kvapalinou v množstve 15 ml (Ultima Gold, Packard Instruments). Špecifický príjem dopamínu neurónmi je definovaný ako množstvo (v impulzoch za minútu), ktoré je možné pozorovať v prítomnosti BZT mínus množstvo, pozorované za prítomnosti BZT. Zvyčajne bolo možné dosiahnuť inhibíciu 70 až 90 % celkového príjmu pôsobením BZT. V opakovaných skúškach bolo v kultúrach v každom časovom období stanovené množstvo neurónov TH⁺ imunocytochemickým farbením a výsledky reprezentujú príjem, normalizovaný na báze TH⁺.

Prechodná expesia BDNF

Bunky COS M5 boli podrobené transfekcii vektorom CDM8, obsahujúcim kódový reťazec pre ľudský BDNF. 72 hodín po transfekcii bolo odobratých 50 ml supematantu kultúry a dialyzovaných proti močovine. Dialyzovaný supematant potom bol zmiešaný na 4,5 hodín s amfolínmi (pH 3,5 až 10, BioRad). Boli odobraté frakcie, ktoré boli dialyzované proti 5M Na₂PO4 s pH 7,6 s použitím dialyzačnej trubice, ktorá bola vopred premytá BSA (0,5 mg/ml), aby nedošlo k nešpecifickej absorpcii. Frakcie boli skúšané na schopnosť podporovať rast neuritov v kultúrach explantátov ganglií dorzálnych koreňov kurčaťa. Účinné frakcie boli spojené a analyzované na SDS PAGE s následným farbením striebrom (Wray a ďalší, 1981, Anál. Biochem. 118:197), na 8,18% géli bolo možné pozorovať slabý pás s molekulovou hmotnosťou 68 000, zodpovedajúcou BSA a pás pri približne molekulovej hmotnosti 12 000, zodpovedajúci skôr pozorovanému pásu pre BDNF prasaťa (Barde a ďalší, 1982, EMBO J., 1:549). V porovnateľných štúdiách, ktoré boli vykonané na explantátoch ganglií dorzálnych koreňov, ganglión nodosum a na sympatických gangliách kurčaťa bola špecifická účinnosť a špecifickosť pre neuróny v prípade rekombinantného ľudského BDNF podobná vlastnostiam čisteného BDNF prasaťa.

Príprava hBDNF z buniek CHO po transfekcii

Bunky CHO-DG44 boli získané ako dar od Dr. L. Chasina (Columbia University, NY). Týmto bunkám chýba dihydrofolátreduktáza (dhfŕ-) (Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acd. Sci. USA 77:4216 až 4220). Bunky CHO-DG44 boli udržované na Hamovom prostredí F12 s 10 % fetálneho séra hovädzieho dobytka, 1 % penicilínu a streptomycínu a 2 mM glutamínu. Bunky boli preočkovávané dvakrát týždenne a boli známym spôsobom skúmané na kontamináciu mycoplazmy. Všetka plazmidová DNA bola čistená pred transfekciou s použitím chloridu cézneho. Gén pre hBDNF bol subklonovaný vo vektore na expresiu cicavčieho pôvodcu pCDM8 za vzniku plazmidu pC8hB, ako už bolo opísané (Maisonpierre a ďalší, 1990, Science 247: 1446 až 1451). Zoslabený gén pre dihydrofolátrcduktázu, p410, bol získaný ako dar od Dr. L. Chasina. Tieto dve konštrukcie boli spoločne použité na transfekciu buniek CHO-DG44 otvorením pórov pôsobením elektrického prúdu (súhrny článok Shikegawa a Dower, 1988, BioTechniques 6:742 až 751). Transfekcii bolo podrobených približne 1 x 1θ6 buniek s použitím 20 pg pC8hB a 0,2 pg p410. 48 hodín po transfekcii boli bunky CHO-DG44 rozdelené do selekčných prostredí, boli použité nukleozidy zbavené Hamovho prostredia F12 (bez tymidínu a hypoxantinu; -HT) s 10 % dialyzovaného fetálneho séra hovädzieho dobytka a 1 % penicilínu a streptomycínu. Jednotlivé kolónie boli izolované približne 10 dní po uložení buniek do selekčného prostredia, zbaveného nukleozidov. Jednotlivé kolónie, odolné proti Hamovmu prostrediu F12 bez nukleozidov (-HT) potom boli podrobené pôsobeniu

0,02, 0,05 alebo 0,1 pM metotrexatu (MTX) na indukciu amplifikácie génu (Alt a ďalší, 1978, J. Biol. Chem. 253:1357 až 1370). MTX-rezistentné kolónie boli pestované v zmesi a boli ďalej amplifikované s použitím 1,5, 2, 0 alebo 2,5 pM MTX. Boli izolované jednotlivé kolónie, odolné proti 2,5 pM MTX a tieto kolónie boli podrobené selekcii na produkciu hBDNF a účinnosť v kultúre. Pri analýze Southem blot tohto klonu (DGZ1000-B-3-2,5) bolo možné dokázať amplifikáciu génu pre BDNF v porovnaní s divokým typom buniek CHO-DG44 približne 50x. Pri biologických skúškach na explantátoch embryonálnych (E8) kuracích gangliách dorzálnych koreňov (DRG) bolo možné dokázať, že tento kloň produkoval približne 9,5 pg hBDNF/ml. Rekombinantný hBDNF bol produkovaný vo veľkom meradle pestovaním buniek DGZ1000-B-3-2,5 vo fľašiach s objemom 480 ml. Prostredie bolo izolované približne štyri dni potom, keď bunky vytvorili súvislú vrstvu. Čistenie hBDNF zo supematantu kultúry bolo vykonané rovnakým spôsobom ako vyššie čistenie supematantu buniek COS.

Výsledky a diskusia

Charakterizácia molekulárnych signálov, ktoré riadia prežívanie neurónov a špecifickosť cieľovej inervácie má základnú dôležitosť nielen vzhľadom na to, že môže vysvetliť stavbu nervového systému, ale tiež preto, že môže viesť k lepšiemu pochopeniu mechanizmu, ktorý sa zúčastňuje udržovania a regenerácie zrelých neurónov v príslušných synaptických konfiguráciách. Aj keď je v súčasnosti široko uznávané, že prežitie a regenerácia neurónov závisí na špecifických, od cieľových buniek odvodených neurotrofných faktoroch, (Levi-Montalcini a Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48: 534, Thoenen a Barde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284, Purves D., 1988, in Body and Brain, Harvard University Press, Cambridge, MA, Barde Y. A., 1989, Neurón 2:1525, Lindsay R. M., 1988, The Making of the Nervous Systém, Oxford University Press, Oxford, str. 148) až dosiaľ bolo len veľmi málo takýchto molekúl plne charakterizovaných. Až dosiaľ bolo dokázané len pre dva neurotrofné faktory a to pre rastový faktor nervov (NGF) a mozgový neurotrofný faktor (BDNF), že tieto faktory selektívne podporujú prežitie určitých populácií neurónov in vivo (Levi-Montalcini a Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Barde Y. A., 1989, Neurón 2:1525, Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149).

Bunkové kultúry neurónov sú široko používané na biologické skúšky na identifikáciu neurotroíhej účinnosti v extraktoch tkanív a buniek (Levi-Montalcini a Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Thoenen a Baide, 1980, Physiol. Rev. 60:1284, Lindsay R. M., 1988, The Making of the Nervous Systém, Oxford University Press, Oxford, str. 148, Varon and Adler, 1981, Adv. Celí. Neurobiol. 2:118) a na stanovenie špecifickosti čistených neurotrofných faktorov pre neuróny (Ebendal T., 1989, Nerve Growth Factors, John Wiley, London, str. 81, Barbin a ďalší, 1984, J. Neurochem. 43:1468, Barde a ďalší, 1982, EMBO J., 1:549, Davies a ďalší, 1986, J. Neurosci, 6:1897, Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112: 319). Až dosiaľ sa väčšina výskumov sústredila na neurotrofoé požiadavky rôznych skupín neurónov periférneho nervového systému (ONS). Dostupnosť NGF bola príčinou skutočnosti, že táto látka je až dosiaľ najlepšie charakterizovaným neurotrofným faktorom. Ako bolo dokázané in vitro a in vivo, je NGF podstatný na prežitie a udržovanie subpopulácií neurónov tak v

PNS, ako aj v CNS (Levi-Montalcini a Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Thoenen a Barde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284, Whittemore a Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439, Snider and Johnson, 1988, Ann. Neurol. 26:489, Hefti a ďalší, 1989, Neurobiology of Aging 10:515, Martinez a ďalší, 1987, Brain Res. 412:295, Takei a ďalší, 1988, J. Neurochem. 51:1118, Hartikka a Hefti, 1988, J. Neurosci. 8:2967). Brzdiacim faktorom na identifikáciu neurotrofných rastových faktorov pre špecifické neuróny CNS bola obmedzená dostupnosť čistených preparátov neurotrofných faktorov s výnimkou NGF a ťažké pripravovanie homogénnych preparátov špecifických populácií neurónov. Dve súčasné sledovania urýchlili štúdium účinkov BDNF na prežitie dopaminergných neurónov v substantia nigra. Predovšetkým je zrejmé, že k expresii génu pre BDNF dochádza v CNS a to v porovnateľných alebo vyšších množstvách než pri expresii génu pre NGF (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149). Za druhé sa dokázalo, že bielkovina, čiastočne čistená z corpus striatum hovädzieho dobytka (cieľové tkanivo dopaminergných neurónov substantia nigra) s vlastnosťami, zjavne podobnými vlastnostiam BDNF môže zvýšiť in vitro prežívanie dopaminergných neurónov, pripravených z mesencephala (Dal Toso a ďalší, 1988, J. Neurosci 8:733).

Na obr. 32A je znázornený vzhľad disociovaných ventrálnych mesencephalických buniek po deviatich dňoch v tkanivovej kultúre. V takmer všetkých bunkách je možné pozorovať jasnú perikaryotickú oblasť a dlhé výbežky. Je obsiahnutých tiež niekoľko buniek s morfológiou fibroblastov, ale žiadne astrogliálne bunky v prípade, že kultúry boli farbené pomocou protilátok na označenie astroglie, t. j. bielkoviny kyslej povahy z fibrilglie (GFAP; Bignami a ďalší, 1972, Brain Res. 43:429). Aby bolo možné vizualizovať dopaminergné neuróny v tejto kultúre, bolo uvedené imunocytochemické farbenie s použitím monoklonálnych protilátok proti TH. Ako bolo možné očakávať, počet TH+ neurónov bol malý (šípky na obr. 32B a 32C) a menil sa v závislosti od doby pestovania kultúry v rozmedzí 0,1 až 0,5 % z pestovaných buniek. Medzi bunkami TH+ bolo možné pozorovať rôznu morfológiu neurónov, ako je zrejmé z obr. 33.

Vo všetkých kultúrach bez rozdielu bolo možné pozorovať postupný pokles počtu TH+ buniek, ako je zrejmé z obr. 34A a 36, po prvých 3 až 4 dňoch in vitro. Po 8 dňoch kultúry tvorili napríklad počet TH+ buniek v kontrolných kultúrach len 25 % počtu týchto buniek v podobných kultúrach v 2. dni, ako je zrejmé z obr. 35. Ale v kultúrach, ošetrených BDNF bola strata buniek TH+ podstatne nižšia než v kontrolných kultúrach. Vo všetkých časových intervaloch po 8. dni in vitro bol počet buniek TH+ v kultúrach, ošetrených pridaním BDNF in vitro vyšší než v neošetrených kontrolách, napríklad 1,8-krát vyšší po jedinom pridaní BDNF (obr. 34A) a 5-krát vyšší po opakovanom podaní (obr. 35). Aj keď bol BDNF pridaný len jedenkrát do kultúr, udržovaných počas 8 dní, bolo možné dokázať, že účinok BDNF je závislý od dávky (obr. 34A). V súlade s predchádzajúcimi správami (Dal Toso a ďalší, 1990, J. Neurosci. 10:558) nemal NGF v dávke 50 ng/ml žiadny vplyv na počet buniek TH+ (obr. 34C).

Ako ďalší spôsob na zistenie účinku BDNF na dopaminergné neuróny v týchto kultúrach bola študovaná schopnosť buniek TH+ prijímať 3H-dopamín. Ako je zrejmé z tabuľky X, schopnosť prijímať dopamín (prepočítaná na jeden neurón TII+) sa význačne zvyšovala v priebehu prvých 8 dní pestovania v kultúre, ale potom klesala. Bolo však dokázané, že BDNF nijako nemení schopnosť buniek TH+ prijímať dopamín vzhľadom na to, že v priebehu toho istého časového obdobia bolo možné pozorovať podobné hodnoty v prítomnosti aj v neprítomnosti BDNF (tabuľka X). Z tohto výsledku je možné usúdiť, že BDNF pravdepodobne pôsobí priamo na prežívanie dopaminergných neurónov v kultúre mesencephalického tkaniva na rozdiel od indukcie expresie dopaminergného fenotypu v neurónoch, ktoré nevyžadujú nevyhnutne k svojmu prežitiu BDNF. Aby bolo možné tento jav ďalej sledovať, boli vykonané pokusy, v ktorých bol v kultúre stanovený počet neurónov TH+ a súčasne bolo pridanie BDNF odložené o niekoľko dní. Bolo dokázané, že v prípade, že bolo pridanie BDNF odložené až do piateho dňa a počet buniek TH+ bol stanovený v dňoch 6, 8 alebo 10, bolo možné pozorovať v týchto kultúrach menší počet dopaminergných buniek v porovnaní s paralelnými kultúrami, v ktorých bol BDNF prítomný od druhého dňa (obr. 36). Hoci oneskorené pridanie BDNF zrejme zvýšilo počet neurónov TH+ v porovnaní s kontrolnými kultúrami pri odčítaní výsledkov v ekvivalentných časových obdobiach, pri oneskorenom pridaní tejto látky už nedochádza k prežitiu toľkých neurónov TH+ ako v prípade, že sa BDNF ku kultúre pridá už v 2. dni.

Je teda zrejmé, že uvedené výsledky svedčia proti možnosti, že by BDNF pôsobil len zvýšením expresie génu pre TH pri fixovanom počte buniek, je naopak pravdepodobné, že BDNF účinkuje zvýšením prežívania dopaminergných neurónov, ktoré by inak boli stratené v prípade, že by tento neurotrofný faktor nebol ku kultúre pridaný v počiatočnom štádiu.

Niekoľko správ dokumentuje stimuláciu dozrievania a zlepšené prežívanie dopaminergných mesencephalických neurónov in vitro po pridaní extraktu z cieľového tkaniva rôznych rastových faktorov (Dal Toso a ďalší, 1988, J. Neurosci. 8:733, Knusel a ďalší, 1990. J. Neurosci 10:558, Prochiantz a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5387, DiPorzio a ďalší, 1980, Náture 288:370, Prochiantz a ďalší, 1981, Náture 293:570, Denis-Donini a ďalší, 1983, J. Neurosci. 3:2292). Až dosiaľ však nebola podaná správa o žiadnej plne čistenej molekule, ktorá by priamo a selektívne podporovala prežívanie neurónov TH+ v úplnej neprítomnosti gliálnych buniek alebo by podporovala delenie buniek (ako bolo pozorované napríklad v prípade IGF-1 alebo FGF, Dal Toso a ďalší, 1988, J. Neurosci 8:733). V súlade s predchádzajúcimi správami s použitím, počiatočného embryonálneho tkaniva myší (Dal Toso a ďalší, 1988, J. Neurosci 8:733) bolo dokázané, že bunky ventrálneho mesencephala potkana E14, pestované v definovanom prostredí, zbavenom séra boli v podstate zbavené astrocytov alebo fibroblastov. Pomerne malá hustota buniek 50 000 buniek/cm2 pri týchto pokusoch znižovala účinok akéhokoľvek endogénneho neurotrofného faktora a dovoľovala presnejšie počítanie buniek. Vzhľadom na uvádzané výsledky je zrejmé, že neurotrofný faktor, čiastočne čistený z corpus striatum hovädzieho dobytka (Dal Toso a ďalší, 1988, J. Neurosci 8:733) je zrejme BDNF. Je pravdepodobné, že BDNF je produkovaný v corpus striatum a prijímaný zakončeniami dopaminergných neurónov, vychádzajúcimi zo substantia nigra. Až dosiaľ však nebolo možné dokázať mRNA pre BDNF (alebo mRNA pre akýkoľvek iný faktor zo skupiny neurotrofných faktorov) vo väčšom množstve v tkanive corpus striatum pomocou analýzy Northem blot.

Je zrejmé, že pridávanie BDNF aj v prípade opakovaného pridania, nemá za následok prežitie všetkých dopaminergných neurónov substantia nigra v priebehu analyzovaných období pestovania v kultúre. Tento fenomén už bol pozorovaný za pokusných podmienok, veľmi podobných súčasne použitým podmienkam (Dal Toso a ďalší, 1988, J. Neurosci 8:733), pri ktorých sa ukázalo, že táto strata buniek môže byť v súvislosti s použitou hustotou buniek. Pri vyšších hustotách (až 4-krát vyšších než boli použité v súčasnosti) je možné pozorovať vyšší počet katecholamínfluorescenčných buniek a spontánne vymiznutie týchto buniek bolo znížené. Je možné, že na dlhodobé prežitie týchto buniek je potrebný styk medzi bunkami. Bude ešte potrebné vykonať ďalšie štúdie, zvlášť zamerané na zistenie účinkov BDNF na vývoj a udržovanie dopaminergných neurónov ventrálneho mesencephala in vivo tak, aby bolo možné stanoviť fyziologicky význam účinkov BDNF, ktorý bol teraz opísaný. Vzhľadom na špecifické straty dopaminergných neurónov v substantia nigra pri Parkinsonovej chorobe je zvlášť žiaduce nájsť neurotrofný faktor, ktorý by tieto bunky selektívne ovplyvňoval. Súčasné zistenia, že BDNF podporuje prežívanie týchto neurónov, to znamená buniek, ktoré sú refraktéme vzhľadom na pôsobenie NGF opodstatňujú vykonanie pokusov na zvieratách s cieľom zistiť, či BDNF môže chrániť dopaminergné neuróny pred neurotoxickými účinkami 6-hydroxydopamínu alebo MPTP (l-metyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridínu). Tieto výsku-my by mohli viesť k novému terapeutickému prístupu k Parkinsonovej chorobe.

Tabuľka X

BDNF priamo nezvyšuje príjem dopamínu v bunkách ventrálneho mesencephala

dni v kultúre	príjem 3H - dopamínu (impulzy za minútu/TH/(+)neur6n/15 min)
kontroly	po podaní BDNF
3	0.51 ± 0,1	D.S5 ± 0,2
6	4,5 ± 0,3	3,1 ±0,6
8	18,5 ±5.3	27,3 ±1,2
10	3,37 ± 0,24	2,21 ±0.18

Príklad 14

BDNF vyvoláva v závislosti od dávky inhibiciu príjmu kyseliny gama-aminomaslovej

Materiál a metódy

Kultúry hippocampových buniek

Hippocampy boli vybraté z potkaních embryí E18-19 kmeňa Sprague-Dawley a boli uložené do prostredia F10. Tkanivo bolo rozdrvené, dvakrát prepláchnuté prostredím F10 (Gibco) a potom bolo spracovávané pôsobením 0,25 % trypsínu (Gibco) počas 20 minút pri teplote 37. Trypsín bol inaktivovaný pridaním prostredia s obsahom séra, ktoré bolo tvorené minimálnym základným prostredím (MEM), doplneným 10 % fetálneho teľacieho séra (FSC), 2 mM glutamínu, 25 jednotiek/ml penicilínu a 25 pg na 1 ml streptomycínu. Disociované bunky získané opatrným rozotrenim boli oddelené a odstredené pri nízkej rýchlosti 500 otáčok za minútu počas 30 sekúnd. Odstredenie bolo dvakrát opakované a pelety buniek boli uvedené do suspenzie v prostredí s obsahom séra. Potom boli bunky nanesené na platne s vyhĺbeniami s priemerom 6 mm alebo na platne s priemerom 35 mm, potiahnuté polyomitínom (10 pg/ml) a laminínom (10 pg/ml). Vo väčšine pokusov boli bunky nanesené na platne s nízkou hustotou približne 71 000 buniek/cmT 5 až 6 hodín po nanesení buniek na platne bolo prostredie vymenené za prostredie, zbavené séra, obsahujúce 1 % N3 a 25 jednotiek penicilínu v ml a 25 pg streptomycínu v 1 ml, v tomto čase bol pridaný BDNF. Prostredie bolo menené každé 3 alebo 4 dni a súčasne bol vždy pridaný aj neurotrofný faktor.

Meranie príjmu kyseliny gama-aminomaslovej (GABA) s vysokou afinitou

Meranie bolo vykonané s použitím modifikovaného postupu podľa publikácie Tomozawa a Appel, 1986, Brain Res. 399: 111 až 124. Bunky boli premyté pufrom na príjem GABA s obsahom 140 mM NaCl, 2,6 mM KC1, 1 mM KH2PO4, 1 mM Na2HPC>4, 6 mg/ml glukózy, 1 mM MgCfy, 1 mM CaCfy, 0,1 % BSA. Po premytí boli bunky inkubované v pufri na príjem GABA 5 minút pri teplote 37 °C. Potom bola pridaná ^H-GABA (NEN, NET-191X, 111,4 Ci/mmol) do konečnej koncentrácie 12 nM a inkubácia bola ďalej vykonávaná 10 minút pri teplote 37 °C. Potom boli bunky inkubované 2 hodiny s 0,14 M NaOH pri teplote miestnosti, potom bolo odpočítané množstvo GABA v extrakte. Bolo dokázané, že príjem ^H-GABA je lineárny počas aspoň 30 minút. Príjem GABA do neneuronálnych buniek bol brzdený pridaním 2 mM B-alanínu, zatiaľ čo príjem, špecifický pre neuróny bol overený inhibíciou kyselinou nipekotovou v koncentrácii 1 mM.

Výsledky a diskusia

V poslednom čase bolo dokázané výnimočné veľké množstvo mRNA pre BDNF v kultúrach buniek hippocampu, obohatených o neuróny, ale nie v astrocytoch hippocampu. Tieto údaje veľmi naznačujú, že BDNF je lokalizovaný v neurónoch hippocampu. Aby bolo možné sledovať účinok BDNF na hippocampové neuróny v kultúre, boli bunky podrobené pôsobeniu rôznych koncentrácií BDNF (čisteného zo supernatantu buniek COS). Na konci osemdenného obdobia pôsobenia bol meraný príjem GABA neurónmi s vysokou afinitou. Ako je zrejmé z obr. 37, BDNF spôsobuje v závislosti od dávky inhibiciu príjmu GABA. BDNF teda môže ovplyvniť prežívanie a/alebo expresiu fenotypu GABAergných neurónov. BDNF však nemal žiadny vplyv na neuróny, obsahujúce glutamát, (ako bolo merané príjmom glutamínu) ani na množstvo bielkovín v nervových vláknach. Účinok BDNF na kultúry hippocampových buniek je teda zrejme špecifický účinok na GABAergné neuróny.

Príklad 15

BDNF má ochranný účinok proti toxickému účinku MPP+ Materiály a metódy

Meranie účinkov neurotrofných faktorov na bunky SH-SY5Y pri pôsobení MPP+

Bunky SH-SY5Y boli nanesené na platne s 24 vyhĺbeninami v hustote 1 x KÚ buniek na jedno vyhĺbenie. Po 24 hodinách bol pridaný neurotrofný faktor. Po 24 hodinách po pridaní neurotrofhého faktora bolo k bunkám pridaných 10 μΜ MPP+. Po 48 hodinách po pridaní MPP+ boli spočítané životaschopné bunky po farbení trypanovou modrou. Použitým neurotrofným faktorom bol mNGF-COD v riedení 1:5, hBDNF-COS (riedenie 1:5), čistený rCNTF z E. coli (25 ng/ml), čistený bFGF z mozgu hovädzieho dobytka (25 ng/ml), rNT3-COS (riedenie 1:5) a čistený hEGF (25 ng/ml).

Meranie účinku neurotroíhých faktorov na kultúry buniek ventrálneho mesencephala po pôsobení MPP+

Kultúry disociovaných neurónov ventrálneho mesencephala boli získané z potkaních embryí E14, ako bolo opísané v príklade 13. Po 48 hodinách po založení kultúr bol pridaný príslušný neurotrofný faktor a to hBDNF (čistený s buniek COS v množstve = 50 ng/ml), čistený mNGF (50 ng/ml), rNT-3 (Supematant buniek COS v riedení 1:50), čistený bFGF z mozgu hovädzieho dobytka (10 ng/ml) alebo čistený rCNTF (25 ng/ml z E. coli). Po 24 hodinách po pridaní neurotrofného faktora bol ku kultúram pridaný 1 μΜ MPP+. Po 48 hodinách po pridaní tejto látky boli identifikované TH+-neuróny imunohistochemicky a boli stanovené kvantitatívne. Údaje znamenajú priemer z troch nezávislých pokusov, pričom v každom pokuse boli použité tri vzorky. Počet TH+ neurónov po pôsobení MPP+ je vyznačený šrafovanými stĺpcami. Prázdne stĺpce znamenajú počet TH-pozitívnych neurónov bez pôsobenia MPP+.

Výsledky a diskusia

V prípade, že boli faktory BDNF, NGF, NT-3, bFGF a EGF schopné chrániť bunky SH-SY5Y pred toxickým pôsobením l-metyl-4-fenylpyridiniového iónu (MPP+), ako bolo merané pomocou farbenia trypanovou modrou, len BDNF a NGF mali štatisticky významný ochranný účinok proti tomuto toxickému pôsobeniu, ako jc zrejmé z nasledujúcich tabuliek XI a XII.

Tabuľka XI

Ochrana buniek SH-SY5Y proti toxicite MPP+ pôsobením BDNFaNGF

Otetreni· kultúr Počet životaschopných buniek (%)

simulovaná transakcia COS (1:5)	0,4x10*	(5%)
BDNF-COS (1:5)	1,2x105	(67 %)
NGF-COS (1:5)	1,7x10®	(84%)
CNTF	0,8 x 10*	(14%)
NT-3	0.7 x 10*	(20%)
bFGF	0,4 x 10*	(11%)
EGF	0,1 x 104	(3%)

Tabuľka XII

Závislosť koncentrácie BDNF a NGF od ich účinku pri pokusoch na inhibíciu toxicity MPP+

Otetrenia % tNctuchopných buniek

COS-MOCK'(1:2)	13
(1:5)	5
(1:10)	3
(12D)	8
(1:50)	ľ
(1:100)	2
COS-BDNF (12)	73
(1:B)	87
(1:10)	85
(1:20)	42
(1:50)	30
(1:100)	25
COS-NGF (12)	88
(1:5)	84
(1:10)	83
(1:20)	50
(1:M)	47
(1:100)	34

*MOCK = simulovaná transfekcia

V kultúrach buniek ventrálneho mesencephala údaje dokazujú, že BDNF má štatisticky významný ochranný účinok proti toxicite MPP+, zatiaľ čo bFGF má menší účinok, ako je zrejmé z obr. 38. Bolo dokázané, že pôsobením MPP+ dôjde k zníženiu počtu neurónov, pozitívnych na tyrozínhydroxylázu o 85 % v kontrolných kultúrach, zatiaľ čo v kultúrach, ktoré boli spracované pôsobením BDNF pred pôsobením MPP+ došlo k zníženiu len o 40 %. MPP+ je predpokladaný účinný matabolit toxínu MPTP, pri ktorom bolo dokázané, že in vivo môže spôsobiť vznik syndrómu, podobného prejavom Parkinsonovej choroby, takže ide o uznávaný modelový systém pre Parkinsonovu chorobu. Ochranný účinok BDNF a NGF teda ukazuje, že by tieto zlúčeniny mohli byť účinné pri liečení Parkinsonovej choroby alebo pri prevencii neurologického poškodenia po vystavení účinku toxických látok.

Uloženie mikroorganizmov

Dfta 30. augusta 1989 boli vo verejnej zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 uložené: rekombinantný bakteriofág a rekombinantná plazmidová DNA pod nasledujúcimi číslami:

Označen ie ATCC čí sto phBDNF-C-1 40648

XhBDNF-G-1 40649

Vynález bol opísaný v súvislosti s niekoľkými špecifickými uskutočneniami, je však zrejmé, že existuje ešte celý rad modifikácií, taktiež patriacich do oblasti vynálezu.

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná molekula DNA, ktorá obsahuje sekvenciu kódujúcu zrelý proteín ľudského neurotrofného faktora izolovaného z mozgu (BDNF) s nasledovnou sekvenciou aminokyselín:

   Hie Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

   Val cys Asp Ser íle Ser Glu Trp val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly íle Asp Lys Arg Hla Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg íle Gly Trp Arg Phe íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr íle Lys Arg Gly Arg

   alebo podsekvencia tejto molekuly DNA kódujúca polypeptid s aktivitou BDNF.
2. 2. Molekula DNA podľa nároku 1, ako je znázornená na ktoromkoľvek z obrázkov 1 alebo 5, alebo jej podsekvencia, ktorá kóduje polypeptid s aktivitou BDNF.
3. 3. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny homologická alebo komplementárna s molekulou DNA podľa nároku 1 alebo 2, alebo jej časť kódujúca polypeptid s aktivitou BDNF.
4. 4. Molekula DNA podľa nároku 2 so sekvenciou vybranou (a) od nukleotidu 167 až po nukleotid 927 na obrázku 1;

   (b) od nukleotidu 566 až po nukleotid 927 na obrázku 1;

   (c) od nukleotidu 974 až po nukleotid 1330 na obrázku 5 pre BDNF;

   (d) od nukleotidu 590 až po nukleotid 1330 na obrázku 5 pre potkaní BDNF.
5. 5. Molekula DNA podľa nároku 2 obsiahnutá v plazmide phBDNF-C-1, uloženom v ATCC a pod registračným číslom 40648, alebo obsiahnutá v bakteriofágu XBDNF-G-1 uloženom v ATCC a pod registračným číslom 40649.
6. 6. Molekula DNA podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, schopná exprimovať BDNF alebo jeho peptidový fragment v hostiteľskej bunke, kde molekula DNA je pod kontrolou regulačnej sekvencie DNA.
7. 7. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.
8. 8. Vektor podľa nároku 7 zodpovedajúci plazmidu phBDNF-C-1 uloženom v ATCC pod registračným číslom 40648 a bakteriálna lambdaBDNF-G-1 uloženého v ATCC pod registračným číslom 40649.
9. 9. Bunka obsahujúca molekulu DNA podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.
10. 10. Bunka podľa nároku 9, ktorá je rekombinantným mikroorganizmom.
11. 11. Rekombinantný mikroorganizmus podľa nároku 10, ktorým je baktéria alebo kvasinka.
12. 12. Purifíkovaný, izolovaný a nedenaturovaný proteín BDNF s neurotrofnou aktivitou a nasledovnou sekvenciou aminokyselín:

    Hla Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

    Val Cys Asp Ser íle Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lye Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly íle Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp ser Lys Lys Arg íle Gly Trp Arg Phe íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr íle Lya Arg Gly Arg

    alebo jeho podsekvencia s aktivitou BDNF.
13. 13. Purifíkovaný, izolovaný a nedenaturovaný proteín BDNF s neurotrofnou aktivitou a s nasledovnou sekvenciou aminokyselín:

    His Ser Aap Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

    Val Cys Asp Ser íle Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Aap Lys Lys Thr Ala Val Aap Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lya Val Pro Val Ser Lya Gly Gin Leu Lya Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly íle Aap Lya Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Mat Asp Ser Lys Lys Arg íle Gly Trp Arg Phe íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr íle Lys Arg Gly

    alebo jeho podsekvencia s aktivitou BDNF.
14. 14. Purifíkovaný, izolovaný a nedenaturovaný proteín BDNF s neurotrofnou aktivitou a s nasledovnou sekvenciou aminokyselín:

    Met His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Oly Glu Leu Ser val Cys Asp Ser íle Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu bys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly íle Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg íle Gly Trp Arg Phe íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr íle Lys Arg Gly Arg alebo jeho podsekvencia s aktivitou BDNF.
15. 15. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa izolovaný a nedenaturovaný proteín BDNF alebo polypeptid s aktivitou BDNF podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 18 a farmaceutický prijateľný nosič.
16. 16. Farmaceutický prípravok podľa nároku 15, vyzná č u j ú c i sa tým, že nosičom je pomaly uvoľňujúci nosič.
17. 17. Farmaceutický prípravok podľa nároku 15 alebo 16, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ďalšiu účinnú látku.
18. 18. Prípravok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m , že kde ďalšou účinnou látkou je nervový rastový faktor (NGF) alebo iný člen skupiny BDNF/NGF.
19. 19. Použitie proteínu BDNF alebo polypeptidu s aktivitou BDNF podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 14 alebo prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 18 na prípravu liečiva na liečenie ľudského alebo živočíšneho tela s chorobou alebo poruchou nervovej sústavy alebo v diagnóze takej choroby alebo poruchy.
20. 20. Použitie podľa nároku 19, kde choroba alebo porucha je chorobou alebo poruchou senzorických neurónov.
21. 21. Použitie podľa nároku 20, kde choroba alebo porucha senzorických neurónov je diabetická neuropatia.
22. 22. Použitie podľa nároku 19, kde choroba alebo porucha nervovej sústavy je choroba alebo porucha cholinergných neurónov.
23. 23. Použitie podľa nároku 22, kde cholinergné neuróny sú bazálne cholinergné neuróny predného mozgu alebo septálne cholinergné neuróny.
24. 24. Použitie podľa nároku 20, kde chorobou alebo poruchou je Alzheimerova choroba, Huntingtonova chorea, retinálna choroba, Parkinsonova choroba, Parkinsonov plus syndróm alebo diabetická neuropatia.
25. 25. Použitie podľa nároku 19, kde chorobou alebo poruchou nervovej sústavy je choroba alebo porucha dopaminergných neurónov.
26. 26. Použitie podľa nároku 25, kde chorobou alebo poruchou je Parkinsonova choroba.
27. 27. Použitie podľa nároku 19, kde choroba alebo porucha nervovej sústavy obsahuje poškodenie nervovej sústavy.
28. 28. Použitie podľa nároku 27, kde príčinou poškodenia je trauma, chirurgický zákrok, infarkt, infekcia, malígny nádor, vystavenie účinkom toxického činidla, nutričná nedostatočnosť alebo diabetická neuropatia.