JPH05161493A

JPH05161493A - ニューロトロフィン―３

Info

Publication number: JPH05161493A
Application number: JP2229505A
Authority: JP
Inventors: Andreas Hohn; アンドレアス・ホーン; Joachim Leibrock; ヨアヒム・ライブロック; Karen Bailey; カレン・バイレイ; Yves-Alain Barde; イフェス―アライン・バルデ; Hans Friedrich Erwin Thoenen; ハンス・フリードリッヒ・エルヴィン・テーネン; Peter C Maisonpierre; ペーター・シー・マイソンピール; Mark E Furth; マーク・イー・フース; Ronald M Lindsay; ロナルド・エム・リンドセイ; George Yancopoulos; ジョージ・ヤンコプロス
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-08-30
Filing date: 1990-08-30
Publication date: 1993-06-29

Abstract

(57)【要約】電子出願以前の出願であるので要約・選択図及び出願人の識別番号は存在しない。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、BDNF/NGF遺伝子ファミリーのメンバーである新しく発見された神経栄養因子ニューロトロフィン−３(NT-3)に関する。NT-3をコードする遺伝子がクローンおよび配列され、そして組換えNT-3が哺乳動物細胞中で発現されている。組換えNT-3は、BDNFおよびNGFのそれとは異なる生物活性スペクトルを有することが示されている。

本発明は、NT-3をコードする核酸配列、このものから多量に産生される実質的に純粋なNT-3タンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導体、並びにNT-3タンパク質、またはそのペプチドに対する抗体に関する。本発明のNT-3遺伝子産物は、とりわけ末梢神経障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む種々の神経学的疾患の診断および治療に使用できる。

発明の背景 (1) 神経系における神経栄養因子の役割神経系の発達および維持は神経栄養因子として知られるタンパク質に依存する。広範なニューロン細胞の死は中枢および末梢神経系の正常な発達に伴って起こり、そして所定の標的領域に突き出るニューロンの数を調節するのに決定的な役割を明らかに果している(Berg,D.K.,1982,Neuronal Development 297-331;Cowanら、1984,225:1258 -65)。発達期中の末梢標的組織の切除および移植研究により、ニューロン細胞の死は、ニューロンの突き出た領域中に生成された限定量の生存因子（「神経栄養因子」）に対するニューロン間の競争から生ずることが示されている。これらの観察は、断然最もよく特性決定された神経栄養分子となっている神経成長因子(NGF)の同定につながった(Levi-MontalciniおよびAngeletti,P.U.,19 68,Physiol.Rev.48:534-69;Thoenen,H.およびBarde,Y.-A.,1980,Rev.60:1284-335)。NGF の役割および作用メカニズムの理解は、運よく雄マウス顎下線においてこのタンパク質が豊富に発見されたことにより、中和抗体の生産のみならず NGFの精製およびクローニングが可能になって大きく促進された(Ullrichら，1983,Nature 303: 821-5;Scottら，1983,Nature 302:538-40)。

NGFは限定されたニューロン集団セットをするだけなので、他の神経栄養因子の存在が長い間予測されていた。(Varon,S. およびAdler,R.1981, Adv.Cellular Neurobiol.2:115-63;Bardeら、 1987,Prog Brain Res 71:185-9;Snider,W.D. およびJohnson,E.M.,1989,Ann.Neurol.26: 489-506)。かかる因子が確かに存在することは現在明らかであるが、それらの量が非常に少ないので、それらの分子の特性決定が妨げられている。

それにもかかわらず、２種のかかるタンパク質、すなわち脳由来神経栄養因子(BDNF)および毛様体神経栄養因子(CNTF)の少量が精製されたことにより、それらの部分的な核酸配列が最近可能となった(Leibrockら，1989,Nature 341:149-52; Stockliら，1989,Nature 342:21-28およびLin ら，1989,Science 246:1023-25)。別個のニューロン集団特異性を有するにもかかわらず、BDNFおよびNGF（しかしCNTFではない）はひとつの遺伝子ファミリーのメンバーとみなされるに十分な構造的相同性を示す(Leibrockら，1989,Nature 341: 149-52)。

(2) その他の神経栄養因子ここ10年来、多種多様の組織の抽出物におけるおよび多くの異なる種類の細胞の馴化培地における神経栄養活性物の報告が多数存在する。しかしながらほとんど全ての場合において、これら活性物が極めて少量、すなわち組織１ｇ当たりピコグラムないしナノグラムの範囲でしか存在しないという事実によりかかる活性物の精製および特性決定の進歩が妨げられている。

更に、適当なバイオアッセイが末梢ニューロンについては確立されているが、中枢神経系ニューロンに関する意図する信頼でき、再現性がありかつ特異的なアッセイは問題があることが判明している。個々の種類の末梢神経はばらばらの、容易に切開可能な神経節として見出されているが、中枢神経系(CNS)ニューロンはそれらの分布において不変に高い異質性を有する。従って、特異的マーカーが特定のクラスのCNSニューロンの同定または富化のいずれかに必要とされる。かかるマーカー、例えば細胞表面または細胞骨格成分に対する抗体生成の進展、または特異的な組織学的染色は非常に制限されている。従って、(i)NGF程豊富でなく、(ii)アッセイが困難であり、そして(iii) 抗体産生を引き出すに十分な量で入手できない、神経栄養因子の特性決定が甚だ困難な方法であることは判っている。

(2.1) 脳由来成長因子と神経成長因子の比較インビトロにおいて胚のニワトリ背根神経節ニューロンの生存を維持できる神経栄養活性物は、ラットC-6神経膠腫細胞を培養した「馴化培地」中で確認された(Bardeら，1978,Nature 274:818)。

この活性物はマウスNGFに対する抗体によって中和されず、馴化培地における他の神経栄養因子の存在が示唆される。次いで、NGF抗体によって遮断され得なかった同様の活性物が正常成体ラット脳大グリア細胞の培養物中で(Lindsay,1979, Nature 282:80-82;Lindsayら，1982,BrainRes. 243:329-343)、および発達中並びに成体ラット脳 (Bardeら，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 77:1199-1203)および発達中および成熟ニワトリ脊髄(LindsayおよびPeters,1984,Neurosci,12: 45-51)の抽出物中で報告された。しかしながら、全ての場合において活性因子は単離も同定もされておらず、そして観察された活性が同一因子によるものかまたは異なる因子によるものかの疑問が残っている。

ブタ脳を出発物質として使用して、Barde等 (1982,EMBO J.1:549-553)は、今や脳由来神経栄養因子(BDNF)と命名され、そしてE10/E11ニワトリ胚からの背根神経節ニューロンの生存を促進するらしい因子を報告した。神経栄養活性は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル電気泳動において12.3kD分子量のシングルバンドとして移動する高い塩基性タンパク質（等電点，pI>10.1）にあることが見出された。精製ファクターは、1.4×10^６であると概算されたが、収量が非常に低く、1. 5kgのブタ脳から約１μｇのBDNFしか精製されなかった。更に、精製工程の最終段階が調製的ゲル電気泳動であるので、BDNFの活性は残留SDSの存在に派生して完全には復元できなかった(BardeおよびThoenen,1985,"Hormones and Cell Regula tion",Vol.9,Dumontら編、Elsevier Science Publishers,pp.385-390)。BDNFの高度の塩基性および分子サイズは、NGFモノマーに非常に類似することが注目された。しかしながら、BDNFは、 (a)ニワトリ背根神経節バイオアッセイにおいて、 NGFに対する抗体がBDNFの生物学的活性に対して何ら明らかな作用を及ぼさず、(b)同じアッセイにおいてBDNFおよびNGFの効果が付加的でると思われ、そして(c)NGFとは異なり、BDNFがE12ニワトリ胚交感神経ニューロンの生存に対してなんらの作用も有していないことが判明したという点で、 NGFの既知の性質とは異なる性質を有していることが明らかとなった。加えて、脳抽出物を用いる早期の研究の際、これらの供給源からの神経栄養活性がNGFに関連するよりも発達のより後期段階で知覚ニューロンに対して作用するらしいことが観察された。ポリカチオン性基質、例えばポリリシンまたはポリオルチニン上で培養されたニワトリ胚ニューロンの解離培養物を用いると、BDNFは、 E10-11（胚日数10または11）背根神経節ニューロンの30パーセント以上の生存を持続させることが見出されているが、E6における同一ニューロンの生存に対する影響はほとんどないと思われた (Bardeら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． 77:1199-1203,前出）。同様の条件下に、NGFは、 E6 DRGニューロンの30〜40パーセントの生存を支えた。興味深いことに、細胞外マトリックス糖タンパクラミニンで被覆した基質上で培養した場合に、NGFとBDNFの両方がE6-E12令のニワトリ胚からのDRGニューロンの約50パーセントの生存を持続させることが後に見出された(Lindsayら，1985, Develop.Biol.112:319-328)。後者の研究において、NGFおよびBDNFの効果が、両者が飽和濃度で存在する場合に付加的であることが見出された。

NGFのニューロン特異性に関するLevi-Montalc ini(1966,The Harvey Lectures 60:217-259)による初期の研究では、NGFがニワトリのある種の脳感覚性神経節のニューロン、特に第10脳神経の節状神経節に対してなんら作用を有していないことが明らかになったので、NGFが感覚性ニューロンに関しても遍在性神経栄養因子ではないことが示唆された。後のインビボ研究(Johnsonら，1980, Science 210:916-918;Pearsonら，1983 Develop. Biol.96:32-36)では、胚形成の際のNGF不在がラットの大部分の脳感覚性神経節におけるニューロンの生存に何らの作用も及ぼさず、一方同様な処理が神経稜由来の感覚性神経節におけるニューロン総数を著しく涸渇させることが示された。より詳細なインビトロ研究（LindsayおよびRohrer, 1985,Develop.Biol.112:30-48;Daviesおよび Lindsay,1985,Develop.Biol.111:62-72;Lin dsayら，1985,J.Cell.Sci.Suppl.3:115-129) では、NGFが大部分の神経稜由来感覚性ニューロンの生存を持続させるが、神経プラコードから由来の脳感覚性ニューロンの生存に対して何ら明らかな作用を有しないことが明示されている。

NGFのそれとは異なるＢＤＮＦのニューロン特異性の第１の証拠は、精製BDNFがE6、E9またはE12でのニワトリ胚の神経プラコード由来節状神経節から解離された知覚ニューロンの40〜50％の生存を持続させるというインビトロ例証である(Lindsay ら，1985,J.Cell.Sci.Supp.3:115-129)。

NGFは、それ自身によってもあるいはBDNFと一緒でもこれらのニューロンに対する明らかな効果を有していない。後に、外植培養研究において、BD NFが錐体、膝状および腹側外側三叉神経神経節を含む他の神経プラコード由来感覚性神経節の生存および軸索が伸び出るのを支持すると思われることが示されたが(Daviesら，1986,J.Neurosci. 6:1987-1904)、これらのいずれもNGFに対して感受性であるとは判明していない。上記の研究の全てにおいて、NGFに対する中和抗体は、BDNFの観察された活性に何らの作用も及ぼさなかった。末梢神経節からの培養ニューロンに及ぼすその作用に加えて、BDNFは、ウズラ神経稜から培養された細胞の生存およびニユーロン分化を刺激することが見出された(KalcheimおよびGendreau,1988, Develop.Brain Res.41:79-86)。

本発明以前には、免疫化にとって十分な量のBD NFを生産できないことが、ニュローン集団に及ぼすこれらの作用を抗−NGF抗体と比較するための抗−BDNF抗体の生産を妨げており、そしてBDNF/N GF交差−中和実験を妨げていた。しかしながら、 BDNFを用いる二つの最近の研究では(Kalcheimら， 1987,EMBO J.6:2871-2873;HoferおよびBarde, 1988,Nature 331:261-262)、鳥類PNS発達におけるBDNFの生理学的役割が示されている。機械的バリアを卵子内でE3/E4 DRG（胚日数３〜４の背根神経節）と神経管中のそれらのCNS標的との間に置いた場合、多くのDRGニューロンが死ぬことが観察された(KalcheimおよびLe Douarin,1986, Develop.Biol.116:451-466)。このニューロン死がCNS（神経管）由来神経栄養因子不在によるものであるかも知れないと仮定された。続いて、ラミニン被覆シアラスティック(sialastic)膜に結合したBDNFがこの細胞死を防止できることが観察された(Kalcheimら，1987,EMBO J.6:2871-28 73)。BDNFの発達中のウズラ卵への注射は、節状神経節における自然に生じる細胞死を減少させることが見出され、この効果はNGFでは見られないものであった(HoflおよびBarde,1988,Nature 331:261-262)。神経稜および神経プラコード両起源の末梢知覚ニューロンに対するその作用に加えて、BDNFは、発達中のCNSニューロンの生存を持続させることが見出された。Johnson等は(1986, J.Neurosci.6:3031-3938)、BDNFがE17ラット胚から培養された網膜神経節細胞の生存を持続させることを示すデータを提示している。これは、馴化培地および網膜神経節細胞の標的領域から調製された脳抽出物がこれらのニューロンの生存を支えると思われることを示した先の研究の範囲を拡大させた(McCafferyら，1982,Ex.Brain Res. 48:37-386;Sarthyら，1983,J.Neurosci.3: 2532-2544;Turnerら，1983,Dev.Brain Res. 6:77-83)。

培養物中における発達中のニューロンの生存に及ぼすその作用に加えて、BDNFは培養された成体末梢および中枢神経系ニューロンに作用を及ぼすことが示されている。成体感覚性ニューロンは３または４週間にわたるインビトロ維持に神経栄養因子を必要としないと思われたが、BDNF並びにNG Fは、培養中の成体ラットDRGニューロンからの軸索再生を刺激することが示されている(Lindsay, 1988,J.Neurosci.8:2394-2405)。更に、成体ラット網膜の培養物において、BDNFは網膜神経節細胞の生存およびそこからの軸索伸長の両方を促進することが観察された(Thanosら，1989,Eur. J.Neurosci.1:19-26)。NGFとBDNFの生物学的作用の比較を第Ｉ表に示す。

(2.2) 脳由来神経栄養因子のニューロン標的末梢神経神経節の感覚性ニューロンが、二つの異なった過度的な発生学的構造すなわち神経稜および神経プラコードのいずれかからも生ずることが見出されている。神経稜から自律神経節および脊髄神経感覚性神経節、すなわちDRGのニューロンおよび付随細胞が生じると思われる。神経稜および神経プラコードの脳神経感覚性神経節形成への寄与がLe Douarinにより考案されたウズラ／ニワトリキメラ移植系を用いて研究された(Le Douarin,1973,Develop.Biol.20:217-222; Noden,1978,Develop.Biol.67:313-329;Nara yananおよびNarayanan,1980,Anat.Rec.196: 71-82;Ayer-Le LievreおよびLe Douarin,1982, Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．９４：２９１−３１０；
Ｄ′Ａｍｉｃｏ−ＭａｒｔｅｌおよびNodem,1983,Am.J.Anat.166:445-468)。

Lindsayらの総説(1985,J.Cell.Sci.Supp.3: 115-129)におけるように、現在では少なくとも鳥類に関しては、第VII、第IX、および第X脳神経の末端の神経節（それぞれ膝状神経節、錐体神経節および節状神経節）のニューロンおよび第VIII脳神経の前庭聴神経複合体のニューロンがもっぱら神経プラコード起源であると考えられている。第V 脳神経の三叉神経節は神経稜および神経プラコードの両方の起源のニューロンを含有する（上下顎葉の腹側外側極では神経プラコード由来ニューロンが主である）が、一方すべての脳神経節の付随細胞は、完全に神経稜起源であることが判明している。

脊髄および脳神経感覚性ニューロンの外植片および解離された、ニューロンの濃厚な培養物の両者を用いたインビトロ実験から、神経稜起源の感覚性ニューロンはNGFに対して応答性であり、他方、神経プラコード由来のニューロン（三叉神経節の腹側外側部分のニューロンおよび聴神経節、膝状神経節、錐体神経節および節状神経節の全ニューロン集団を包含する）の大部分は胚発生期間全体を通じてNGFに対して応答性でないことが観察された。このようなNGFに対する要求性および応答性の相違とは対照的に、神経プラコードおよび神経稜由来感覚性ニューロンは両方ともBDNFの生存および神経突起−促進活性に対して応答性であることが見いだされている（第Ｉ表）(Lindsayら，1985,J.Cell.Sci.Supp.3:115-129;Linds ayら，1985,Develop.Biol.112:319-328;Kalche imおよびGendreau,1988,Develop.Brain Res.41 :79-86)。TebarおよびBarde(1988,J.Neurosc i.8:3337-3342)は、放射性標識したBDNFのニワトリ胚背根神経節ニューロンに対する結合パラメーターを研究した。その結果は、一方はBDNFに対して高い親和性を有し、他方は低い親和性を有する二クラスのBDNFレセプターの存在と一致する。高親和性レセプターは交感神経ニューロンにはみられなかった。

BDNFの既知のニューロン標的がさらにBardeら (1987,Prog.Brain Res.71:185-189)によって総説された。本発明以前には、BDNFに特異的な核酸または抗体プローブがないため、BDNFを合成する細胞を同定することは不可能であった。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製する試みはいずれも成功していない。このような抗体生産の失敗は、BDNFの分子クローニング、発達中のニューロンからインビボでBDNFを除去することの生理学的作用の測定、イムノアッセイを用いた組織中のBDNFの定量および免疫細胞化学を用いたBD NFの位置決定を妨げてきた。

(2.3) 脳由来神経栄養因子遺伝子のクローニング BDNF遺伝子のクローニングは、最初に米国特許出願第07/400,591号、1989年８月30日出願、に記載のように行われ、参照としてその全文がここにとりこまれる。簡単に説明すると、微量のBDNFタンパク質がブタ脳から精製され、それによってアミノ酸配列のフラグメントの決定が可能になった。

これをさらに利用して、対応するオリゴヌクレオチドを設計することができた。次に、BDNF生産細胞から調製したcDNA鋳型を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、これらの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。PCR生成物をプローブとして使用し、ヒト、ブタ、ラット、およびマウスを包含する様々な種の完全なcDNAおよび／またはゲノムBDNF遺伝子のクローニングを行い、そしてこれらの遺伝子の配列を決定した。

組換えBDNFの発現はCOS細胞に於て達成された。

本発明は、BDNF遺伝子ファミリーの新たに発見されたメンバーであるニューロトロフィン−３ (NT-3)に関する。本発明は、部分的には、BDNFおよびNGFに共通の核酸配列相同性領域の同定に基づいている（米国特許出願第07/400,591号、1989 年８月30日出願、参照としてここにとり込まれる。）。本発明によれば、このような相同性を有する領域を用いて、BDNF/NGF遺伝子ファミリーの新たなメンバーを同定できる；かかる方法を用いてNT-3を同定した。本発明は、これらの方法によって同定された新規BDNF/NGF関連神経栄養因子の遺伝子および遺伝子産物を提供する。

本発明の一部は、NT-3をコードする組換えDNA 分子に関する。本発明の詳細な実施態様に於ては、 NT-3をコードするDNA、はヒトDNAマウスDNAまたはラットDNAに由来する。本発明はまた、実質的に第２図（マウスNT-3）、第７図（ラットNT-3）、または第11図（ヒトNT-3）に示される核酸配列の少なくとも一部を含んでなる組換えDNA分子を提供する。また本発明は、組換えNT-3タンパク質および関連ペプチド生産に使用しうる組換えDNA発現ベクターも提供する。

別の実施態様に於ては、本発明はNT-3タンパク質および関連ペプチドを提供し、さらにかかるペプチドおよびタンパク質を生産、調製するための方法を提供する。また、本発明はNT-3タンパク質およびペプチドに対する抗体にも関する。

本発明によれば、神経学的障害の診断および／または治療にNT-3を使用することができる。このような障害は、糖尿病性神経疾患、中毒性および栄養性神経障害、遺伝性神経障害およびAIDS関連神経障害のような末梢神経障害、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病のような変性疾患を包含するがそれらに限定されない。NT-3はドーパキン作動性ニューロンの生存を支持することが示されたので、本発明の好ましい実施態様において、NT-3をパーキンソン病の治療に用いることができる。NT-3はBDNFまたはNGFの特異性とは異なる活性スペクトルを示すことが観察されたので、 NT-3は中枢神経系において再生および修復を誘導するための新しく、価値のある選択枝を与える。

本明細書に添付した図面について以下に説明する。

第１図．種々の種に由来するBDNFおよびNGFの配列の比較。BDNFをコードする遺伝子の配列分析およびそのアミノ酸配列の推定によって、このタンパク質がNGFと構造的類似性を多数有することが明らかになった。成熟BDNFの一次構造、並びに全体構造および前駆体タンパク質からの考えられるプロセシング様式は、NGFとBDNF遺伝子が共通の祖先の遺伝子から進化してきた可能性があることを強く示唆している。成熟ポリペプチドの領域内で、最もよく適合させるためにNGFにわずかに３個のギャップを導入すると、全部で51のアミノ酸同一性が多くの種に由来する既知のNGFに共通し、そしてブタおよびヒトBDNFに共通する。このような同一性には、６個のシステイン残基のすべてが包含されており、このことはNGFとBDNFが非常によく似た二次構造を有することを示唆している。さらに、上記の種すべてに由来するNGFおよびブタ由来BDNFが同一であるような、またはわずかにおよそ１個の保存されたアミノ酸置換によってのみ異なるような、６またはそれ以上のアミノ酸からなる４セグメントを観察することができる。

従って、当然、NGFとBDNFは一遺伝子ファミリーの密接に関連したメンバーであると結論付けることができる。

第２図．マウスNT-3のゲノム配列および推定アミノ酸配列。アミノ酸配列は、同一読み枠の３個の終止コドンの後に見いだされる最初のATGコドンから始まる。下線を付した配列はPCRの第一巡に使用したプライマーの位置を示す。N-グリコシル化コンセンサス配列にのみ二重下線を付し、また矢印はプロセシングを受けた成熟NT-3の推定開始箇所を示す。

第３図．成熟マウスNT-3、NGF(Scottら、1983, Nature 302:538-540)、およびBDNF(Leibrockら、 1989,Nature 341:149-152)のアミノ酸配列の比較。ここに示す成熟マウスBDNFの配列はブラBDNF と100％同一である。太字および影付きは３種のタンパク質すべてに同一の位置で見いだされたアミノ酸を示し、矢印はすべてのシステイン残基を指示する。星印は、適合を最適にするために導入されたギャップを示す。V1-V4は３個以上の連続したアミノ酸からなる４個の可変ドメインを示す。

第４図．マウスに於けるNT-3mRNAの組織分布。

全RNAのうち20μｇを各レーンに供し、^３２P-標識二本鎖DNAプローブとハイブリッド形成させた。

(A)約1.4キロベースに当たる単一バンドをすべての組織でみることができるが、肺では最も弱いシグナルが観察され、心臓では最も強い。骨格筋は大腿部から取った。(B)脳では、海馬および小脳で最大のシグナルが得られる。

第５図．胚齢８日のニワトリから得た節状神経節から単離された感覚性ニューロンの生存。5,000 細胞をポリオルニチン−ラミニン基質上に塗布し、生存するニューロンを24時間後に計数した。ここで用いたBDNF濃度は最大生存を得るのに必要な最低濃度の３倍である。無添加では、または1:50 希釈で用いられたトランスフェクションされない COSを有する馴化培地、または対照DNAでトランスフェクションされた細胞を有する馴化培地では、ニューロンの生存はまったく見いだされなかった。

第６図．(A)縮重した１Ｂ及び２Ｃプライマー（RIB/2Cと称する）を用いて誘導されたPCR産物はラットゲノムDNAのNGF及びBDNF遺伝子のみならず新規遺伝子NT-3も検出する。(B)ラットNT-3 ゲノムクローンの制限地図。RIB/2Cと特異的にハイブリッド形成する２種の独立のバクテオリファージクローンをラットゲノムライブラリーから単離した。19.5kb挿入物を含有するこれらのクローンのうちの一つの制限地図の模式図的表示を示す。

太い線はNT-3の読み取り枠(ORF)を示す（第７Ａ図参照）。RIB/2Cプローブの位置を示す。

第７図．ラットNT-3の配列、およびラットNGF およびラットBDNFに対するその相同性。(A)NT-3 のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。NT-3遺伝子をコードするORFを含むDNA配列、DNA配列の上にアミノ酸翻訳を示す。星印は読み取り枠の開始および終了を示す。成熟NT-3(119アミノ酸）の最初の残基を＋１の位置としてアミノ酸に番号を付す。成熟NT-3を放出するために用いられる切断部位を四角で囲む。この切断部位のすぐ上流に保存されたグリコシル化部位も四角で囲む。他の考えられる切断部位は、NGFにおける推定中間体プロセシング部位と同様に存在するが(Darlingら、19 87,Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1:427-34) （しかしBDNFでは保存されていない）、これを四角で囲み、「？CLEAVE」を付す。成熟NT-3に於ける６個のシステインに下線を付す。NT-3の短い前駆体型のメチオニン開始コドン（-139の位置）にも下線を付してあるが、これは本分中で論じられる開始部位「Ｂ」を示す。「Ｂ」開始部位の上流の推定スプライス受容部位／イントロン境界を図に示す。(B)ラットNGFおよびラットBDNFと並べて整列させたラットNT-3の配列。MacVector配列分折ソフトウェア(International Biotechnologies, Inc.より購入）を用いて、ラットNT-3 ORGとNGF およびBDNF遺伝子のORFとのマトリックス配置図を作成した（ウィンドウサイズ20および最小一致 20％を用いた）。このマトリックスの対角線に沿って見られる有意な一致を、NT-3タンパク質産物の模式的表示の下に示す；成熟NT-3の上流の二つの相同性領域をＩおよびIIと命名し、NGFおよび BDNFと比較して示した。図に示すように、領域Ｉは、短鎖前駆体NT-3を生じるために用いられる「Ｂ」開始部位の上流に延びており、より長い前駆体が存在するとの主張を裏書きする。(C)相同領域ＩおよびIIに於けるNT-3，NGFおよびBDNFの配列比較。これらの領域の配列を、相同性を最大にするように一列に重ねてならべ、列に挿入されたギャップを「−」で示す。BDNFまたはNGFのいずれかとNT-3配列との一致を「★」で示し、一方 NGFとBDNFとの一致をNGF配列に於いて「・」で示す。配列上部の「＋」は、ラットNT-3と、調べたすべての種に由来するNGFおよびBDNF配列との間で、完全に保存されている残基を示す。NGFについて定義され、BDNFについては既に予想され、 NT-3について本文で提出される以下の部位を示す：「Ｂ」開始部位メチオニン開始コドン；シグナル配列切断部位(Edwardsら、1988,Mol.Cell. Biol.8:2456-64);BDNFには存在しないがNT-3には存在する推定NGF中間体切断部位；グリコシル化受容部位；成熟因子を放出するタンパク質加水分解切断部位。(D)NT-3、BDNFおよびNGFの成熟型の配列比較。保存されたシステインをボールドフェースのひし形で下線を付す。「★」、「・」および「−」図はＣと同様。NGF配列にのみ存在するC-末端切断部位を示す。

第８図．外植したニワトリ胚（８日）神経節でアッセイしたNGF、BDNF、およびNT-3活性の比較。

背根神経節(DRG)(図Ａ−Ｄ)、節状神経節(NG)(図Ｅ−Ｈ)、および交感神経系神経節(SG)(図Ｉ−Ｌ) の顕微鏡写真。これらの神経節は、まったく神経栄養因子の存在しない条件（対照；Ａ，Ｅ，Ｉ）、またはNGF（Ｂ，Ｆ，Ｊ）またはBDNF（Ｃ，Ｇ，Ｋ）またはNT-3（Ｄ，Ｈ，Ｌ）を含有するCOS細胞上清の存在する条件のいずれかのもとで、24時間 (DRGおよびNG)または48時間(SG)培養した。対照培養に於いては神経突起の成長はほとんど見られない(偽似トランスフェクション細胞から得た500 μｌのCOS細胞上清)。NGF(10μｌのCOS細胞上清)はDRGとSGからは大量の線維の成長を生じたがNGからは生じなかった。NGF COS細胞上清を20 μｌから500μｌまで増加させたが、NGには作用をおよぼさなかった。BDNF(10μｌCOS細胞上清) はDRGとNGからの線維の成長を生じたが、SGからは生じず、大量にしても(20から500μｌ)SGには作用をおよぼさなかった。NT-3(DRGおよびNGについては20μｌCOS細胞上清、SGについては200 μｌ)は、SGからの成長は開始が遅く、また量も少なかったが、三種類すべての神経節から線維の成長を生じた。神経節は外植片として、前記 Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319-28)のように５％ウマ血清を添加したF14培地中のコラーゲンゲル(Lindsay R.M.およびRohrer,H.,1985, Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１２：３０−４８)中で培養し
た。目盛り＝ 200μｍ。

第９図．NT-3は高度に富化された培養物中におけるDRGニューロンの生存および神経突起成長を促進する。以下のいずれかと48時間処理した、解離されたニワトリ胚（８日）DRGのニューロン− 富化（＞95％ニューロン）培養物の顕微鏡写真：（Ａ）偽似トランスフェクションCOS細胞から得られた上清（500μｌ）または（Ｂ，Ｃ）NT-3トランスフェクション細胞からの上清（50μｌ）。ＡおよびＢは暗視野顕微鏡写真である。Ａ（対照培養物）に於いては、塗布したニューロンの５％以下が生存した。Ｂにおいては、処置に耐えたニューロンの数は塗布したニューロンの約60％であった。用量応答曲線から、これがニワトリE8 DRGニューロンに及ぼすNT-3の最大の作用であることが判明した。（Ｃ）Ｂに示したのと同様の培養物の高倍率位相差顕微鏡写真。多数の位相の鮮明なニューロン細胞の像、およびニューロンでない細胞が事実上まったく存在しないことに注目すべきである。培養は前記(Lindsayら、1985,Dev.Biol .112:319-28)のように行われた。目盛り＝150 μｌ（Ｃ）。

第10図．齧歯類組織に於けるNT-3、NGF、およびBDNF発現のノーザンブロットの比較。ラット（左図）またはマウス（右図）の指示された組織からRNAを調製した(Auffray,C.およびRougeon, Ｆ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０
７：３０３−１４)。つぎに、指示された起源に由来する１０μｇのRNAを１％ホルムアルデヒド−アガロ−スゲル上で分画し、 10×SSC中でナイロン膜に移した。三通りのノーザンブロットを、68℃で、^３２P-標識(Feinberg,A. P.およびVogelstein,B.,1984,Anal.Biochem. 137:266-7)ラットNT-3、ラットBDNF、およびラットNGFDNAフラグメントとハイブリッド形成させ (Mahmoudi,M.およびLin,V.K.1989,Bio techiques 7:331-3)、次に68℃で２×SSC，０．１％ SDS中で洗浄した。NT-3、NGFおよびBDNFに関するDNAフラグメントは、pCDM8にこれらの遺伝子を含有する発現構築物に由来する。これらの構築物中の約７７５ｂｐＸｈｏＩ挿入物を、放射性標識に
先立ちゲルで精製した。臭化エチジウム染色ゲルの写真を包含しており、それにより試料当りのRNA総量を比較することができる。

第11図．整列させたラットおよびヒトNT-3遺伝のDNA配列。予想翻訳開始部位を「プレプロ >>」で示し、成熟NT-3の予想開始位置を「成熟 >>」で示す。成熟ラットおよびヒトNT-3タンパク質は同一のアミノ酸配列を有するが、プレプロ領域は下線を付した11箇所で異なる。

第12図．代謝標識によって検出されたヒトNT-3 ポリペプチドの発現。ペトリ皿１個当り５×10⁶ のCOS-M5細胞を60mmペトリ皿に接種し、10％ウシ全血清(FBS)を含有する完全DMEM培地中で37℃で一夜増殖させた。サイトメガロウイルスプロモーターの調節のもとで、ヒトNT-3遺伝子を含有する 20μｇのプラスミドpC8-hN3(P1)を用いて、その細胞をトランスフェクションし(Chenおよび Okayama,1987,Mol.Cell.Biol.7:2745-52に記載されたCaPO₄法を使用）、または（プラスミドDNA無しで）同様のトランスフェクション操作だけを行った。48時間後、細胞を洗浄し、メチオニンおよびシステインを含まない１％FBS含有DM EM 1ml中で１時間インキュベートした。[³⁵S]メチオニンおよび[³⁵S]システインの混合物（各100 μCi、New England Nuclearから購入）を各培養物に加え、細胞をさらに４時間37℃でインキュベートし、培地を集めた。50μｌの試料を25μｌのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)含有２倍濃度試料バッファーと混合し、５分間沸騰させ、そして SDS存在下15％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動にかけたLaemmli,1970,Nature 227:680- 685)。Towbinらにより1979,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.76:4350-4354に記載の緩衝液を用いて、電気泳動（３時間，100mA)により、ナイロン膜(Immobion,Milliporeより購入）にこのタンパク質を移した。このフィルターを風乾し標識れたタンパク質をオートラジオグラフィーによって検出した（室温で16時間、増感スクリーン− Cronex,DupontとともにKodak X-ARフィルムを使用）。

第１３図．NT-3上精の無い場合（０）、および、 NT-3含有上精の1:300,1:100,1:50および1:25希釈の場合の培養物あたりの生存チロシンヒドロキシラーゼ細胞数を示す棒グラフ。

第１４図、１皿あたり900,000細胞密度であることを除き第１３図の説明に記載したのと同じ棒グラフ、第１５図．Ａ．NT-3、BDNFおよびNGF合成転写物を比較した図。全ての３転写物の５’末端での共有する配列と相同の放射性標識オリゴヌクレオチドを用いたドットブロットハイブリダイゼーションは、予め分光光度計により定量した合成NT-3、 BDNFおよびNGF転写物の等量（２ng）を規定の標準として使用したと示としている。Ｂ．規定の合成RNA標準物と比較した、成体ラット脳から調製した全RNA中のNT-3、BDNFおよびNGF mRNAレベルの決定。成体脳から単離された全RNA 10μｇおよびその各ニューロトロフィンに対応する合成転写物の4,10および20pgをノーザンブロットし、そして、各ニューロトロフィンに特異的な放射性標識がなされたプローブとハイフレダイズした。

第１６図．ラット胚(A)、発達中のラット脳(B) および選択された分娩時の生体組織(C)から調製された全RNA（10μｇ／レーン）中で発現された NT-3、BDNF、NGFおよびNRNA遺伝子。組織：A. BR:第１Ｂ図で標準化された成体脳検体；PLAC: 胎盤；EMB:胚全体；SP.C:脊髄；THY:胸線；LIV: 肝臓；HRT:心臓；BR:脳。転写の大きさは右端に示す（キロ塩基対（ｋｂ））。

第１７図．新生(A)および成体(B)神経系の別個の領域から調製した全RNA（10μｇ／レーン）中でのNT-3、BDNF、NGFおよびNRNA遺伝子発現。

領域：A.BR:第１Ｂ図で標準化した成体脳検体； CBL：小脳；HBR:後脳；MBR:中脳；DIEN:間脳； STR:線条体；HIP:海馬；CTX:新皮質；OLF:臭神経球；BR:小脳無しの全脳；ADR:副腎；RET:網膜； SC.N.:座骨神経；SP.C.:脊髄。

第１８図．新生および成体CNS領域および末梢組織におけるNT-3、BDNF、およびNGF転写レベルの定量。データは、第１６、１７、１９図および Maisonpierreら（1990,Science 247:1446-1451) に示されたものを含むノーザンブロットの複数回照射物のデンシトメトリック走査を用いて得られた。全てのレベルを成体脳におけるニューロトロフィンレベルとの相関で標準化される。成体脳におけるニューロトロフィンレベルは、３つのニューロトロフィンに関して類似しており（本文参照）、各ニューロトロフィンについて１と定められる。

スケールを越えた量については破断し棒線の上部にその値が示される。神経および非−神経検体が図に示されている。検体：BRN:小脳を含まない脳；CBL：小脳；HBR:後脳；MBR:中脳；DIE:間脳； STR:線条体；HIP:海馬；CTX:新皮質；OLF:臭神経球；SP.C.:脊髄;SC.N.:座骨神経；RET:網膜；AD R:副腎；HRT:心臓；LIV:肝臓；THY:胸線；SKN:皮膚；MUS:骨格筋；LNG:肺；INT:腸；KID:腎臓；SP L:脾臓。

第１９図．脊髄(A,B)、小脳(B,F)および海馬 (C.G)の発達中のNT-3、BDNF、NGFおよびNGFR遺伝子発現。表示した発達時点から調製した全RNA 10μｇを種々の転写物のそれの発現について比較した。ニューロトロフィン転写レベルのデンシトメトリック定量をE,F,Gに示した。

発明の詳細な説明本発明は、神経栄養分子のBDNF/NGFファミリーの新たなメンバーであるニューロトロフィン−３、並びに同様の方法を用いて同定することのできる BDNF/NGFファミリーの他のメンバーに関する。限定するためでなく、明細書を明白に説明するために、本発明の詳細な説明を以下の小項目に分けることとする。

(i) BDNF/NGFファミリーの他のメンバーの同定； (ii) ニューロトロフィン−３のクローニング； (iii) ニューロトロフィン−３の発現； (iv) ニューロトロフィン−３の生物学的活性のアッセイ； (v) ニューロトロフィン−３遺伝子およびタンパク質； (vi) 抗−ニューロトロフィイン−３抗体の生産；および (vii) 本発明の利用。

(1)BDNF/NGFファミリーの他のメンバー NGFおよびBDNFは、約50％のアミノ酸同一性を共有するおよそ120アミノ酸からなる塩基性タンパク質で、活性型NGFに於いて３個のジスルフィド橋を形成することが示されている６個のシステイン残基の完全な保存を包含する(Bradshow,A., 1978,Ann.Rev.Biochem.47:191-216;Leibrock ら、1989,Nature 341:149-52)。進化的に分枝した種に由来するNGFの配列を比較することによって、これらのシステイン残基の側面にあるアミノ酸は分子の中で最もよく保存された領域を含有することが明らかになった(Meierら、1986,EMBO J .5:1489-93;Selbyら、1987,J.Neurosci.Res .18:293-8)。顕著なことは、これが、BDNFとNG Fとの間で最も類似した領域であることである (Leibrockら、1989,Nature 341:149-52)。

NGFとBDNFの間に強い相同性を有する保存されたセグメントが存在することを利用した方法を用いて、BDNF/NGF遺伝子ファミリーのさらに他のメンバーに関する合理的な探査を行うことができる。

例えば、多様な核酸配列の中からBDNFおよびNGF に相同な配列を選択し、さらに選択した配列の中からNGFおよびBDNFと相同でない核酸配列も含有する配列を同定することによって、BDNF遺伝子ファミリーの他のメンバーを同定することができる。

「相同できない」という用語は、NGFおよびBDNF配列とは異なる少なくとも２個のヌクレオチドをその中に含有する少なくとも６個の連続したヌクレオチドを含有する領域を意味すると解することができる。

本発明はまた、BDNFおよびNT-3に対して、あるいはまたNGFおよびNT-3に対して相同であるが、それぞれBDNFおよびNT-3に対して、またはNGFおよびNT-3に対して非相同な領域も含有する組換え DNA分子にも関する。このようなBDNF/NGF/NT-3 遺伝子ファミリーの他のメンバーを、相同性を有する領域に対応する分子プローブを用いて同定することができる。さらに分析することによって、これらのBDNF/NGF/NT-3遺伝子ファミリーのメンバーが、BDNF/NGF/NT-3遺伝子ファミリーの既知のメンバーの配列とは異なる配列を有することが見いだされる。

例えば、本発明の好ましい詳細な実施態様では以下の方法が提供される。下記第III表に示される４個の保存されたセグメント（「ボックス」）のそれぞれに対応して、約10-20ヌクレオチドからなる一揃いの縮重したオリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。これらは、NGFまたはBDNFのいずれかに見いだされる約３から７個の連続したコドンに対するアミノ酸にありうるすべてのコード配列に相当する。成熟ポリペプチドのアミノ末端について番号をつけ（その結果プレプロBDNFのHis134が成熟タンパク質のHis1となる）、４枠を以下のように特徴付けることができる（ヒと成熟タンパク質との関連に於て番号付けされる）。

第III表に示されるボックスからの各組の配列に由来する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして利用し、潜在的に興味のある起源（RNAまたは DNA）の配列をPCRによって増幅することができる。

これには、BDNFまたはNGFに密接に関連のあるポリペプチドを発現することのできる、あらゆる真核生物種に由来するmRNAまたはcDNAまたはゲノム DNAを包含することができる。６回という少数回のPCR反応（すなわちボックス１からのプライマーとボックス２からのプライマー；ボックス１とボックス３；ボックス１とボックス４；ボックス２とボックス３；ボックス２とボックス４；ボックス３とボックス４）を行うことによって、NGF とBDNFの間で保存されている配列である上記４セグメントのうち任意の２個を共有する遺伝子、または遺伝子産物を検出することができよう。もしそれぞれのボックスについて、いくつかのそれぞれ異なった縮重プライマーを合成することを選択する場合には、合理的な少数回のPCR反応で完全に探索することが可能であろう。PCR反応の開始に際して用いられるハイブリッド形成条件の厳密さを変動させて、未知遺伝子とNGFまたはBDNFとの間のヌクレオチド配列の相似度に大小の度合いがあるようにすることもできる。予め知られていないBDNF/NGF遺伝子ファミリーのメンバーのセグメントがうまく増幅されれば、そのセグメントを分子的にクローン化して配列決定し、完全なcDNA またはゲノムDNAを単離するためのプローブとして利用することができる。次にこれにより未知の遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および機能分析のためのタンパク質産物を生産できよう。

さらに本発明は、BDNF/NGF配列の相同性を、BD NF/NGF遺伝子ファミリーのメンバーであるが天然には存在し得ない新規組換え分子の設計に利用することに関する。制限するためではなく例を挙げると、NGFとBDNFの両方の部分を有してなる組換え分子を本発明にしたがって構築することができる。かかる分子はBDNFとNGFの両方に関連した性質を示し、アゴニスト並びにアンタゴニストを包含する生物活性の新たな側面を示しうるであろう。

BDNFおよびNGFの一次配列を、コンピューターシミュレーションを用いて分子の四次構造を予測するために利用することもできる(HoppおよびWoods, 1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824 -3828)。BDNF/NGFキメラ組換え遺伝子を、四次構造と生物学的機能との相互関係の観点で設計することができる。同様に、BDNF/NGF遺伝子ファミリーの任意の一つまたはそれ以上のメンバーの一部分を含有するキメラ遺伝子を構築することができる。

(2)ニューロトロフィン−３のクローニング BDNFとNGFに共通の相同性領域を利用し、上記の方法を用いてあらゆる生物に由来するNT-3を同定することができる。本発明の二つの好ましい詳細な実施態様に於ては、遺伝子を同定し以下のようにクローン化することができる。

好ましい−実施態様に於ては、（IUPAC分類を用いた）ヌクレオチド配列GGGGATCCGC GGI TGY MGI GGI ATH GAを有するセンス（または5'）プライマー（プライマー１、これはBamHIおよびSacIIエンドヌクレアーゼ切断部位を包含する）、およびヌクレオチド配列TCGAATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCAを有するアンチセンス（または3'）プライマー（プライマー２、これはEcoRIおよびXbaI 部位を包含する）を、市販のサーマルサイクラー（例、Perkin-Elmer Cetusサーマルサイクラー）およびThermus aquaticus由来の耐熱性DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応(Saikiら、1985,Science 230:1350- 1354)に利用できる。アニーリング温度45℃で約４回行った後、49℃のアニーリングで残りの36回を行うことができる。増幅の結果生じたDNA産物を、つぎにポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離することができる。予想サイズ（約137塩基対）に相当する産物を溶離し、再度増幅し、次に二つの制限エンドヌクレアーゼで消化することができる。これらのエンドヌクレアーゼのうちの一つは、生物のNGF遺伝子配列を増幅されたセグメント内で切断し、他の一つは生物のBDNF遺伝子配列を増幅されたセグメント内で切断する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、切断されたDNAから（おそらくNGFとBDNFのどちらもコードしていない、エンドヌクレアーゼ切断を受けなかった）切断されないDNAを分離し、溶出し、そして例えばプライマー１および２を用いて非対称に増幅し (Innisら、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:9436-9440)、配列決定することができる (Sangerら、1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S. A.72:3918-3921)。それによって得られた配列に基づいて、新規遺伝子の配列をより正確に反映したさらにほかのセンスおよびアンチセンスプライマーを設計することができる。例えば、GGGAT TGATGAC AAA（プライマー３）およびACTCTCAGTGCA AAACTTCGC（プライマー４）のようなセンスプライマー、およびアンチセンス（5'）プライマーCGGATC CGAATTCTGCAG(T)₁₂V（プライマー５）を使用することができる。脳のような神経栄養活性を生じる可能性のある組織から(Okayamaら、1987,Meth, Enzymol.154:3-28に記載されるような任意の標準的な方法を用いて）調製されたRNAは、例えばプライマー５を用いて逆転写でき、このものは3'ポリ(A)末端に適合するよう設計され、BamHI、 EcoRI、およびPstIに関する制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する(Leibrockら、１９８９， Nature 341:149-152)。次にその結果生じたcDNA を、プライマー３および５を用いてPCR増幅することができ、さらに次にプライマー４および５を用いて再増幅することができる。次にサザンブロットを、最終反応の産物を用いて行い、プライマー３および４配列の下流の配列に相当する^３２P-末端標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させることができる。こうして同定された DNAフラグメントを、次に好適なベクターにクローン化することができる。得られた最長の挿入物を関心のある生物から作成されたゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。このようにして同定された陽性クローンを次に標準的な制限地図作成およびヌクレオチド配列決定技法によって分析することができる。

本発明の別の好ましい実施態様に於ては、NGF とBDNFの間で高度に保存された４個のタンパク質配列のセグメントに相当する縮重オリゴヌクレオチドを合成することができる。たとえば、これらのアミノ酸配列（第７Ｄ図に示す）は、(1)Gly- Glu-(Tyr/Phe)-Ser-Val-Cys-Asp-Ser;(2)Lys- Gen-Tyr-Phe-(Thr/Phe)-Glu-Thr-Lys-Cys;(3) Gly-Cys-Arg-Ile-Asp;and(4)Trp-Arg-Phe-Ile -Arg-Ile-Asp-Thr-(Ser/Ala)-Cys-Val-Cysであることができる。一連の縮重センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド）センスまたはアンチセンス方向のいずれかの上記タンパク質配列の５− ９アミノ酸に相当する15−26ヌクレオチドの長さの縮重部分、ならびに制限酵素認識部位をコードする非縮重尾部を含有）をPCR反応に使用することができる。対をなす上流センスプライマーと下流アンチセンスプライマーの間の増幅反応を標準条件下で行うことができ、あるいは好ましくは、それぞれのプライマーの組合せの最適の条件を実験的に決定することができる。例えば、センスプライマー（上記アミノ酸配列(1)に相当する）5' GACTCGAGTCGACATCG-GTN-TGY-GAY-WSN-RTN-WS-3' およびアンチセンスプライマー（上記アミノ酸配列(2)に相当する）5'-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT -NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YTG-3'を、鋳型として好適な起源に由来するゲノムDNAまたはcDNAを用いた増幅反応に使用することができる。対をなす上流センスプライマーおよび下流アンチセンスプライマーを用いた増幅反応の産物を、ハイブリッド形成プローブとしてゲノムDNAのサザンブロットに用いることができ、そのプローブと非相同な領域（例えば、非NGF、非BDNF配列）のみならず相同な領域も含有するゲノムDNA配列とハイブリッド形成するPCR産物を同定することができる。新規ゲノムDNA配列を同定するPCR産物を用いて、ゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングすることができ、それによってBDNF/NGF遺伝子ファミリーの新規メンバーをコードするクローンを選択することができる。

(3)ニューロトロフィン−３の発現 NT-3タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその一部分を適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクター、に挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは天然型のNT-3遺伝子および／またはその側面領域によって供給されることもできる。種々の宿主−ベクター系を利用してタンパク質コード配列を発現させることができる。これらの系には、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）感染を受けた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）感染を受けた昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母のような微生物、またはバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換された細菌が包含されるがそれらに限定されない。

本発明の好ましい実施態様に於ては、発現ベクターCMCプロモーター(StephensおよびCochett, 1989,Nucl.Acids.Res.17:7110)およびSV40複製開始点を含有しうる。これらのベクターの発現エレメントはその強さと特異性がそれぞれ異なる。

利用する宿主−ベクター系に応じて、多くの適当な転写および翻訳エレメントの任意の一つを用いることができる。

DNAフラグメントのベクターへの挿入に関して既に記載された任意の方法を用いて、適当な転写／翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法にはインビトロ組換えDNAおよび合成法、およびインビボ組換え（遺伝子組換え）が包含されうる。NT-3タンパク質またはペプチドが組換えDNA分子で形質転換された宿主内で発現されるように、NT-3タンパク質またはペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列の発現を第二のヌクレオチド配列によって制御することができる。例えば、NT-3の発現を当業上知られた任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御することができる。

NT-3発現を制御するのに使用できるプロモーターには、以下のものが包含されるがそれらに限定さえない。SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1981,Nature 290:304-310)、ウラス肉腫ウイルスの3'長い末端重複に含まれるプロモーターYamamotoら、1980,Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner ら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78: 144-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列 (Brinsterら、1982,Nature 296:39-42)；β− ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroffら、 1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727 -3731)、またはtacプロモーター(Deboerら、1983, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８０：２１−２５）のような原核生物発現ベクター、また Scientific American,1980,242:74-94の「組み換え細菌からの有用タンパク質」も参照されたい；ノパリンシンセターゼプロモーター領域(Herrera-Estrella ら、Nature 303:209-213)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら、 1981,Nucl.Acids Res.9:2871)、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのためのプロモーター(Herrera-Estrellaら、1984, Nature310:115-120)を含んでなる植物発現ベクター；Gal4プロモーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプリモーターのような酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、および組織特異性を示しそしてトランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域すなわち膵臓腺房細胞に於て活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swiftら、1984,Cell.38:639-646;Ornitzら、 1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 50:399-409;Macdonald,1987,Hepetology 7:42 5-515)；膵脾臓ベータ細胞に於て活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan,1985,Nature 315:115 -122)、リンパ系細胞に於て活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら、1984.Cell 38: 647-658;Adamsら、1985,Nature 318:533-538; Alexanderら、1987,Mol.Cell.Biol.7:1436- 1444)、精巣、乳房、リンパ系およびマスト細胞に於て活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域 (Lederら、1986,Cell 45:485-495)、肝臓に於て活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら、19 87,Genes and Devel.1:268-276)、肝臓に於て活性なアルファーフェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら、1985,Mol.Cell.Biol.5:1639 -1648;Hammerら、1987,Science 235:53-58)、肝臓に於て活性なアルファ１−アンチトリピシン遺伝子制御領域(Kelseyら、1987,Genes and Devel.1:161-171)、骨髄細胞に於て活性なベーターグロビン遺伝子制御領域(Mogramら、1985,Nature 315:338-340;Kolliasら、1986,Cell 46:89-94)、脳の寡突起神経膠細胞に於て活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら、1987, Cell 48:703-712)；骨格筋に於て活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域(Sani,1985,Nature 31 4:283-286)、および視床下部に於て活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら、 1986,Science 234:1372-1378)。

NT-3遺伝子挿入物を含有する発現ベクターを三つの一般的な方法により同定することができる： (a)DNA-DNAハイブリッド形成、(b)「マーカー」遺伝子機能の有無、および(c)挿入配列の発現。第一の方法に於ては、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたNT-3遺伝子に相同な配列を含有するプローブを用いるDNA-DNAハイブリッド形成によって検出することができる。第二の方法に於ては、外来遺伝子のベクターへの挿入によって引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスによる封入体形成、など）の有無に基づいて、組換えベクター／宿主系を同定し、選択することができる。たとえば、もしNT-3遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されるならば、NT-3挿入物を含有する組換え体はマーカー遺伝子機能の欠如によって同定できる。第三の方法に於ては、組換え体によって発現される外来遺伝子産物をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することができる。かかるアッセイは、例えばバイオアッセイ系に於けるNT-3遺伝子産物の物理的または機能的性能に基づくことができる。

一たび特定の組換えDNA分子が同定および単離されると、当業上知られたいくつかの方法によりそれを増殖させることができる。好適な宿主系および増殖条件が確立されると、組換えベクターを増殖させそして大量に調製することができる。既に説明したように、使用可能な発現ベクターには以下のベクターまたはその誘導体が包含されるがそれに限定されない。少数例をあげればワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えばラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドDNAベクターなど。

さらに、挿入された配列の発現を調節し、または特定の所望する様式で遺伝子産物を修飾しプロセシングするような宿主細胞株を選択することができる。ある種のプロモーターからの発現を、ある種のインデューサーの存在によって高めることができ、このようにして遺伝子工学的に作成されたNT-3タンパク質の発現を制御することができる。

さらに、それぞれ異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳時および翻訳後のプロセシングおよび修飾のための特徴的で特異的なメカニズム（例えばグリコシル化、切断）を有する。発現される外来タンパク質の所望される修飾およびプロセシングを確実にするために、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、細菌系に於ける発現をグリコシル化されないコアタンパク質産物の生産に用いることができる。酵母での発現はグリコシル化された産物を生じる。非相同NT-3タンパク質の天然型のグリコシ化を保証するために、哺乳動物細胞に於ける発現を用いることができる。

さらに、様々なベクター／宿主発現系はタンパク質加水分解的切断のようなプロセシング反応を種々の程度に行うことができる。

本発明の詳細な実施態様に於いては、プレプロ NT-3をコードするDNAをpCMVプラスミドにクローン化し、増幅し、次いでリン酸カルシウム法によるCOS細胞のトランスフェクションに使用することができる(ChenおよびOkayama,1987,Mol. Cell.Biol.7:2745-2752)。次にNT-3活性を細胞培養培地から収集することができる（下記実施例１および２参照）。

NGFは二つの異なった前駆体形、すなわち長鎖形および短鎖形、から合成されると理解されている(Darlingら、1983,Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.48:427-483)。短鎖形はBDNFおよび NT-3のプレプロ型と実質的に類似している。本発明によれば、BDNFまたはNT-3の同様の長鎖形をコードするDNAを含有する発現系を利用することが望ましい。このような長い前駆体形をコードする DNAは、成熟BDNFまたはNT-3ペプチドコード領域の上流のcDNAまたはゲノムDNA領域を配列決定しそして翻訳読みとり枠の位置決定することにより同定できる。NGFおよびBDNFの配列とNT-3の配列を重ねてならべてみると、NT-3タンパク質の長鎖および短鎖前駆体を予測することができる（第７Ｂ図）。長鎖または短鎖前駆体からの成熟BDNFまたはNT-3発現の有効性は、使用した発現系の如何によるものであって、細胞系統の種類に応じて変化することがある。

(3.1)発現した遺伝子産物の同定および精製 NT-3遺伝子を発現する組換え体が同定されると、その遺伝子産物を分析することができる。これは産物の物理的または機能的性質に基づくアッセイによって行うことができ、産物の放射性標識化およびそれに続くゲル電気泳動での分析が包含される。

NT-3タンパク質が同定されると、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差を包含する標準的な方法によって、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技法によって、それを単離し、精製することができる。ニワトリ背根神経節、神経プラコード由来または交感神経節ニューロンを包含するがそれらに限定されない任意の適当なアッセイを用いて機能的性質を評価することができる。

(4)ニューロトロフィン−３の生物活性のアッセイ定性的または定量的にNT-3活性を示す任意の系を本発明にしたがって用いることができる。NT-3 はBDNFやNGFとは対照的に、神経プラコード由来節状神経節および交感神経節の両方からの神経突起の成長を促進するので、背根神経節(DRG)培養系に加えて、これらの両方をNT-3バイオアッセイとして用いることができる。DRGアッセイは、 Bardeら(1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 77:1199-1203)の記載のように行うころができる。

節状神経節アッセイ系は、Lindsayら(1985,Dev. Biol.112:319-328)の記載のように行うことができる。交感神経節アッセイ系はBardeら(1982, EMBO J.,1:549-553)の記載のように行うことができる。

(5)ニューロトロフィン−３遺伝子およびタンパ質上記、および下記実施例１および２に詳述した方法を用いて、以下の核酸配列を決定し、それに対応するアミノ酸配列を推定した。マウスゲノム NT-3配列を決定し、第２図に示す。ラットNT-3の配列を第７図に示す。ヒトゲノムDNA NT-3配列を決定し、第11図に示す。ここにはラット由来の DNA配列も示す。これらの各々の配列、またはそれと機能的に同等なものを、本発明は従って用いることができる。さらに本発明は、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマまたはイヌ、並びに霊長目の動物起源、およびNT-3活性が存在する他のすべての種から単離されたNT-3遺伝子およびタンパク質に関する。本発明はさらに、少なくとも10個のヌクレオチドを含有するNT-3核酸サブ配列にも関する。

かかるサブ配列は、例えば核酸ハイブリッド形成アッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析などに使用できるNT-3配列のハイブリッド形成可能な部分を含有する。本発明はまた、第２、７、および11図に示すアミノ酸配列またはそれらと機能的に同等な配列に従って、NT-3タンパク質、およびそのフラグメントや誘導体を提供する。本発明はまた、抗原決定基を含有するか、または機能的に活性な、NT-3タンパク質のフラグメントまたは誘導体を提供する。ここで用いられる「機能的に活性な」とは既知のNT-3の機能に関するアッセイ例えば、ニワトリ胚DRG、節状神経節および交感神経節アッセイに於いて陽性の活性を有することを意味するものとする。

例えば、第２、７、および11図に示す核酸配列を、機能的に同等な分子を生じる置換、付加、または欠失によって変化させることができる。ヌクレオチドコード配列の縮重によって、第２、７、および11図に示すアミノ酸配列と事実上同一のアミノ酸配列をコードする別のヌクレオチド配列を、本発明の実施に際し用いることができる。これらは、機能的に等しいアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換による変化をその配列内に有し、従ってサイレントな変化を生じた第２、７、および11図に示すNT-3遺伝子配列の全体または部分を含んでなるヌクレオチド配列を包含するがそれに限定されない。同様に、本発明のNT-3タンパク質またはそのフラグメントまたは誘導体は、配列内の残基が機能的に同等なアミノ酸残基で置換され、サイレントな変化を生じるような配列の変化を包含する実質的に第２、７、および11図に示すようなアミノ酸配列の全体または部分を、一次アミノ酸配列として含有するタンパク質を包含するがそれに限定されない。例えば、配列内の一またはそれ以上のアミノ酸残基を、機能的に同等に作用する同様の極性を有する別のアミノ酸で置換することができ、結果的にサイレントな変化を生じる。

配列内でのアミノ酸の代替物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸から選ばれる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが包含される。極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが包含される。正に荷電した（塩基性）にアミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが包含される。負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含される。また、本発明の範囲内には、例えばグリコシル化、タンパク質加水分解的切断、抗体分子や他の細胞性リガンドとの結合などによって、翻訳中または翻訳後に種々に修飾されたNT-3タンパク質またはそのフラグメントまたは誘導体も含まれる。

さらに、特定のNT-3のインビトロまたはインビボで突然変異させて、翻訳、開始、および／または終止配列を作成および／または破壊するか、またはコード領域に変異を生じさせそして／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成させるか、あるいは既にあるかかる部位を破壊することができ、こうしてインビトロ修飾をさらに促進することができる。当業上知られた任意の突然変異誘発法を使用することができ、それにはインビトロ特定部位の突然変異誘発(Hutchinsonら、1987, J.Biol.Chem.253:6551)、TAB(商標)リンカー (Pharmacia)の使用などが包含されるがそれらに限定されない。

(6)抗−ニューロトロフィン−３抗体の生成本発明によれば、NT-3タンパク質またはそのフラグメントまたは誘導体を、抗-NT-3抗体生成のための免疫原として使用できる。

抗-NT-3免疫応答を生じる可能性をさらに向上させるために、免疫原性の増大と関連する可能性のある分子の部分を同定することを目的として、 NT-3のアミノ酸配列を分析することができる。例えば、アミノ酸配列をコンピューター分析にかけて、HoppおよびWoods(1981,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.78:3824-3828)の方法（この方法を利用して、すでにＢ型肝炎表面抗原の抗原性ペプチドが成功裡に同定されている）にしたがって、表面エピトープを同定することができる。あるいはまた、種々の種に由来するNT-3の推定アミノ酸配列を比較し、これらの非相同領域を同定することができよう。これらの非相同領域は種々の種にわたって免疫原性である可能性がより高いと思われる。

NT-3に対するモノクローナル抗体を調製するためには、培養中の連続細胞系統により、抗体分子を生成させる任意の技法を使用することができる。

例えば、KohlerおよびMilstein(1975,Nature 256:495-497)によって開発されたハイブリドーマ法、ならびにトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozborら、1983,Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を生産するEBV-ハイブリドーマ法(Coleら、1985,in "Monoclonal Antibodies and Cancer The rapy"， Alan R.Liss,Inc.pp77-96)などが本発明の範囲に含まれる。

治療用のモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス（または他種）モノクローナル抗体であることができる。当業上知られた多数の技法のいずれによっても、ヒトモノクローナル抗体を作成することができる（例えば、Tengら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.80:7308-7312;Kozborら、1983,Imm umo logy Today 4:72-79;Olssonら、1982,Met h. Enzymol.92:3-16)。マウス抗原−結合ドメインとヒト定常領域を含有するキメラ抗体分子を調製できる(Morrisonら、1984,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.81:6581,Takedaら、1985,Nat ure 314:452)。

NT-3のエピトープに対するポリクローナル抗体を生成させるには、当業上知られた種々の方法を用いることができる。抗体を生成させるには、NT -3タンパク質またはそのフラグメントまたは誘導体を注射することによって、種々の宿主動物を免疫することができる。これらの動物には、ウサギ、マウス、ラットなどが包含されるがそれらに限定されない。免疫応答を増加させるために、宿主の種に応じて、種々きアジュバントを使用することができる。このようなアジュバントには、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、界面活性剤例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、カサガイヘモシアニン、ジチオスレイトール、およびBCG(Bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium Parvum)のような有用である可能性のあるヒトアジュバントが包含されるがそれらに限定されない。

NT-3エピトープに対する抗体の分子クローンは既知の技法によつて調製できる。組換えDNA技法（例えばManiatis,T.ら、1982,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spri ng Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, New York参照）を用いて、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を作製することができる。

抗体分子は、知られた技法、例えば免疫吸着クロマトグラフィーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィー、HPLC（高性能液体クロマトグラフィー）の様なクロマトグラフィー法、またはそれらの組合せなどによって精製することができる。

分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントを既知技法により生成させることができる。

例えば、かかるフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって生成させうるＦ（ａｂ′）_２フラグメント、Ｆ（ａｂ′）_２フラグメントのジスルフィド橋の還元によって生成されうるＦａｂ′フラグメント、および抗体分子をパパイン還元剤で処理することによって生成されうる2FabまたはFabフラグメントが包含されるが、それらに限定されない。

(7)発明の有用性本発明は、NT-3核酸配列、およびそれから産生される実質的に純粋なタンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導体に関する。NT-3は診断および治療用途に十分な量で生産され得る。同様に抗−BDNF抗体、およびNT-3核酸プローブを診断および治療に使用することができる。本発明の詳細な実施態様ではNT-3の交雑種利用も有用であるが、大部分の目的には同一の種からのNT-3遺伝子または遺伝子産物を診断および治療の目的に使用することが好ましい。

(7.1)診断用途 NT-3をコードする核酸および、それから産生されたタンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導体、並びにNT-3タンパク質、ペプチドまたは誘導体に対する抗体に関する本発明は、NT-3発現パターンの変更に関連し得る神経系の疾患および障害の診断に利用できる。

本発明の種々の実施態様においては、NT-3遺伝子および関連核酸配列並びにサブ配列、例えば相補性配列は、診断用ハイブリダイゼーションアッセイに使用できる。NT-3核酸配列または約15個のヌクレオチドを含有するそのサブ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイを用いて、特に感覚性ニューロン損傷をもたらす状態を含む、NT-3 発現の変化に関連する状態、障害または疾患状態を検出し、予知し、診断しあるいは監視し得る。

かかる疾患および状態には、これに限定されないがアルツハイマー病、ハンチントン舞踏病およびパーキンソン病を含むCNS外傷、梗塞、感染、変性性神経疾患、悪性腫瘍または手術後変化が包含される。例えば、患者からの組織サンプル中の総 RNAを、NT-3 mRNAの量の変化がニューロン変性の指標であるNT-3 mRNAの存在に関してアッセイできる。

本発明の別の実施態様においては、NT-3タンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体に対する抗体を使用して神経系の疾患および障害、特に感覚性障害および網膜の変性性疾患並びに上記した障害および疾患を診断することができる。本発明の抗体は、例えばかかる評価を必要とする患者から得られた組織サンプルを用いる原位置ハイブリダイゼーション法に使用することができる。更に別の例においては、本発明の抗体は組織または液体サンプルに依存するNT-3の量を検出および／または測定するためのELISA法に使用できる。同様に、本発明の抗体は組織または液体サンプルに存在するNT-3を検出および／または測定するためのウエスタンブロット分析に使用できる。

本発明の更に別の実施態様においては、NT-3タンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体を神経系の疾患および障害の診断に使用できる。これに限定されるつもりはないが特定の実施態様においては、標識化NT-3タンパク質またはペプチドフラグメントは、NT-3レセプター発現の変種および従ってNT-3に対する組織または細胞性応答におけるありうる異常を確認するために、NT-3レセプターを発現する組織または細胞の同定に使用できる。

(7.2)治療用途 NT-3をコードする核酸および、このものから産生されるタンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導体、並びにNT-3タンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体に対する抗体に関する本発明は、NT-3発現パターンの変更に関連し得るかあるいはNT-3または抗-NT-3抗体への曝露によって利益を得ることができる神経系の疾患および障害の治療に用いることができる。

本発明の種々の実施態様においては、NT-3タンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体は、神経系が外傷、外科手術、虚血、感染、代謝疾患、栄養不全、悪性腫瘍または有毒薬剤によって損傷された患者に投与することができる。本発明の種々の詳細な実施態様においては、NT-3は、これに限定されないが背根神経節または以下の組織；すなわち、膝状、錐体および節状神経節；第VIII脳神経の前庭聴覚複合体；三叉神経神経節の上下顎骨葉の腹側外側極、中脳三叉神経核および交感神経神経節のいずれかにおけるニューロンを含む切断された感覚性ニューロンに局所投与することができる。NT-3−関連ペプチドまたはNT-3タンパク質を、切断神経の近傍に移植することができる膜、例えばシラスティック膜に吸着させることにより投与するのが望ましい。本発明はまた、例えば糖尿病性神経障害および糖尿病末梢神経障害、例えば多重単発神経障害に罹患している患者の回復を早めるのにも使用できる。

糖尿病性神経障害に加えて、NT-3またはNT-3関連ペプチドは下記を包含するがそれらに限定されない他の末梢神経障害を治療するのにも使用できる。すなわち後天性免疫不全症候群関連の神経障害、多発性神経炎を有する伝染性単核症、多発性神経炎を有するウイルス肝炎を含むウイルス関連神経障害；ギラン−バレ症候群；ボツリヌス中毒関連神経障害；鉛およびアルコール関連神経障害を含む中毒性多発性神経障害；亜急性連合性変性症を含む栄養性神経障害；全身性紅斑性狼瘡に関連する神経障害を含む脈管障害性神経障害；類肉腫関連神経障害；癌腫様の神経障害；圧迫性神経障害（例えば手根骨トンネル症候群）および遺伝性神経障害。NT-3またはNT-3関連タンパク質を使用して治療できる遺伝性神経障害には腓骨筋萎縮、家族性自律神経異常症および進行性肥大性神経障害が包含される。

本発明の更に別の実施態様においては、NT-3タンパク質、またはこのものから誘導されるペプチドフラグメントあるいは誘導体は先天的状態または神経変性性障害、例えばこれに限定されないがアルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、多発性硬化症および筋萎縮性側嚢硬化症の治療に使用できる。

本発明の詳細な実施態様においては、NT-3タンパク質またはこれから誘導されるペプチドフラグメントあるいは誘導体の投与は、アルツハイマー病および／またはパーキンソン病の治療において組織の外科的移植と組み合わせて用いることができる。後記の第１１節に示すように、NT-3はドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する。ドーパミン作動性ニューロンがパーキンソン病において破壊されることから、NT-3はかかる治療が必要な患者に有効量のNT-3を投与することからなるパーキンソン病の治療方法に使用することができる。

パーキンソン病を有する患者の約35パーセントがアルツハイマー型痴呆にかかっていることが示されている。本発明に従って生産されるNT-3は、この複合疾患に有効な単一剤療法であることが判明しよう。同様に、本発明により生産されるNT-3は、ダウン症候群と合併したアルツハイマー病の治療に使用できる。加えて、後記の第１２節に示すように、NT-3は神経系の発達および分化の過程において高レベルで発現される。従って、NT-3はダウン症候群のような発達中の神経系障害の治療に、そして悪性腫瘍のような細胞の脱分化による疾患の治療も、あるいは神経系にから利益を得るであろう障害の治療に用いることができる。本発明に従って生産されるNT-3は、１種々の痴呆並びに先天性学習障害の治療に使用できる。

本発明の更に別の実施態様においては、NT-3タンパク質、フラグメントまたは誘導体は、所望の神経栄養効果を達成するのに他のサイトカインと一緒に使用できる。例えば、限定するつもりはないが、本発明によればニューロンの成長および／または生存の維持および／または機能の復活または増強におよぼす相乗的刺激作用を達成するために、NT-3を第２の作用物質たとえばNGFまたはBD NFと一緒に使用することができる。ここで相乗効果とはNT-3タンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体と第２薬剤との組合せ物の作用が個々に使用される同量の各物質より高い効果を達成することを意味すると解釈される。NT-3が中枢神経系における広い系列のニューロンサブ集団の成長、発達、分化した機能の維持および生存においてまだ十分に特徴付けられていない他のCNS-由来ペプチド因子と相乗的に作用しうることが想像される。

あるいはまた、NT-3および第２の神経栄養因子作用物質の作用は相加的であることもできる。

更に、NT-3分子の十分な特徴付けに基づいて、 NT-3のいくつかまたは全ての生物学的機能の拮抗体として作用しうるNT-3の新規ペプチドフラグメント、誘導体または突然変異体が開発され得ると想定される。かかるNT-3拮抗体は、感覚性ニューロンの選択的除去、例えば慢性痛み症候群の治療に有効であり得る。

本発明の更に別の実施態様においては、NT-3タンパク質、またはそのペプチドフラグメントあるいは誘導体に対する抗体は、種々の神経学的障害および疾患にかかっている患者およびかかる治療を必要とする患者に投与できる。例えば、NT-3の過剰産生に悩む患者は、かかる治療を必要としよう。抗-NT-3抗体は、感覚性ニューロンの異常再生（例えば手術後）の防止に、あるいは上述の通り慢性痛み症候群の治療に使用できる。

下記実施例１および２で記載されるように、NT -3の組織分布では、NT-3 mRNAは他の組織に比べ脳、腎臓、心臓および膵臓組織中で高レベルに発現されることが示される。非神経組織中で生成されるNT-3は脳中に発現されるNT-3と同一であるかも知れないしまたはないかもしれない。NT-3の１種類が神経および非神経組織の両方で機能するかも知れない。NT-3発現における障害が他の器官系のみならず神経系に影響する疾患の原因をなすかもしれない。またNT-3分子と密接に関連するファミリーは、神経および非神経組織における異なるサブ機能に役だつかもしれない。したがって本発明のNT-3分子は、とりわけ心臓、造血、腎臓および細網内皮系を含む非神経組織のみならず神経組織の神経調節にも影響する疾患の治療に有用であろう。

さらに下記実施例１に例示するように、NT-3発現は成体動物に比較して未成熟動物で高い。本発明によればNT-3は発育期の障害、あるいはまた CNS傷害の後の神経系の再生の誘導にとりわけ有用であ
る。

(8)医薬組成物 NT-3タンパク質、このものから誘導されるペプチドフラグメントまたは誘導体、あるいはNT-3タンパク質、そのペプチドフラグメントもしくは誘導体に対する抗体（または抗体フラグメント）、あるいはNT-3とNGFまたはBDNFのような他の薬剤の少なくとも１種との組合せを含むNT-3遺伝子産物の全部または一部分を含有しうる本発明の活性組成物は、任意の滅菌生体適合性製剤担体、例えばこれに限定されないが食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水中で投与され得る。

NT-3タンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体は、第２，７または11図に実質的に示されるアミノ酸配列またはそのサブ配列を含んでなることができる。すなわち特に第２図に示されるアミノ酸約140から約258まで、第７図のアミノ酸約１から約119までまたは第11図の「成熟」と標識した第１アミノ酸からその図に示されるペプチド配列の終りまでのアミノ酸配列の全部または一部分または機能的に等しい配列を含有するNT-3タンパク質を使用するのが、これらサブ配列がNT-3 分子の機能的部分を含有すると信じられているので好ましい。NT-3は、限定するものではないがヒト、ブタ、ラット、ニワトリ、ウシ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ等を含む任意の適当な種のNT -3遺伝子に相当する配列から誘導できる。

特定の疾患または状態の治療に有効であろうNT -3タンパク質、ペプチドフラグメント、誘導体または抗体の量は、障害または状態の性質の如何に依り、そして標準的臨床技術によって決定することができる。可能な場合、用量−応答曲線および本発明の医薬組成物を先ずインビトロで、例えば上述のNT-3バイオアッセイ系で測定し、次いでヒトにおいて試験するに先立ち有効な動物モデル系で測定するのが望ましい。インビトロデータに基づいて、本発明の詳細な実施態様においては、感覚性ニューロンの生存を促進するのに有効な医薬組成物は、約0.1〜１０μｇ／ｍｌの局所的NT-3タンパク質濃度を提供できる。

導入方法には、これに限定されないが皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口および鼻腔内が挙げられる。加えて、本発明の医薬組成物を心室内および鞘内注射を含む任意の好適な経路により中枢神経系に導入するのが望ましく、心室内注射は、心室内カテーテル、例えばOmmaya貯留器のような貯留器に結合されたカテーテルによって促進され得る。

更に、本発明の医薬組成物を治療の必要な領域に局所的に投与するのが望ましい。これは、例えばこれに限定されないが外科手術中の局所的注入によるか、注射によるか、カテーテルによるかあるいはインプラントにより達成でき、該インプラントはシアラスティック膜または繊維のような膜を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン状物質である。

本発明はまた、リポソーム、微粒子またはマイクロカプセルを介して投与されるNT-3タンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体を含有する医薬組成物も提供する。本発明の種々の実施態様においては、かかる組成物を使用してNT-3およびNT -3関連産物の持続的放出を達成するのが有用でありうる。

NT-3、NT-3関連物質、NT-3拮抗体または抗-NT -3抗体を活性に産生する細胞を、高められたかまたは低減された濃度のNT-3を必要とする領域に導入することができると想定される。

実施例１：クローニングおよびマウスニューロトロフィン−３遺伝子の特性決定 (1)材料および方法 (1.1)ポリメラーザ連鎖反応２本のオリゴヌクレオチドプライマーをBDNFおよび全ての知られたNGFに保存されている２個のアミノ酸配列に基づいて合成した(Leibrockら、 1989,Nature 341:149-152)。センス（または５′ 側）プライマーの配列は、GGGGATCCGC GGI TGY MGI GGI ATH GA（プライマー１，IUPAC命名，Ｉ＝イノシン）でありそしてBamHIおよびSaCII部位を含有する。アンチセンス（または３′側）プライマーの配列は、TCGAATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCAでありそしてEcoRIおよびXbaI部位を含有する（プライマー２）。Perkin-Elmer Cetus サーマルサイクラーおよびTaqポリメラーゼ(Gene Amp^ＴＭ）を使用し、１μgのマウスゲノムDNAを用いてPCR(Saikiら、1985,Science 230:1350-13 54)を行った。アニーリング温度45℃で４サイクルした後、残りの36サイクルは49℃でアニーリングを行った。予想したサイズ(137塩基対）に相当する増幅したDNA産物をアクリルアミドゲルから溶出させ、再び増幅し、そしてHindIIおよびApaI で消化した。前者はマウスNGFを、後者はマウス BDNFを切断した。切断されなかったDNAを溶出し、非対照的に増幅(Innisら、1988,Proc.Natl. Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：９４３６−９４
４０）させ、そしてプライマー１および２を使用して配列(Sangerら、 1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3918 -3921)した。このようにして得られた配列に基づいて、ヌクレオチド８０８−８２２（プライマー３）お
よび824-844（プライマー４）に相当し、SaIIおよび PstI部位が加えてある２本のセンスプライマーをさらに合成した。成人マウスの脳，肝臓および筋肉からRNAを抽出し(Okayamaら、1987,Meth. Enzymology 154:3-28)そしてアンチセンス（５′）プライマーを使用して逆転写した。このアンチセンスプライマーはCGGATCCGAATTCTGCAG(T)_１２V（プライマー５）であって３′側ポリ(A)尾部に適合するうに設計してあり、そしてBamHI，EcoRIおよび PatIのクローニング部位を含有する(Leibrockら、 1989,Nature 341:149-152)。これらcDNAは、はじめプライマー３および５を使用してPCRで増幅し、次にプライマー４および５を使用して再び増幅した。この最後の反応から得られる生成物を用いてサザンブロットを行い、そしてヌクレオチド 879-893に相当する^３２Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させた。このようにしてベクター(Stratagene)中にクローンしそして得られた最長の挿入物(460塩基対）をEMBL3マウスゲノムライブラリー(Clontech)を選抜するのに使用した。２個の陽性クローンが見出され、そして１個のクローンのDNAを種々の制限酵素で消化した。

制限フラグメントを460塩基対挿入物で探査した。

770塩基対HindIIIおよび4,000塩基対PstIフラグ PstIフラグメントを使用して３′および５′に伸ばした完全なHindIII配列を示す。

(1.2)ノーザンブロッティング全RNAを成人女性の組織から抽出し(Okayamaら、1987,Meth.Enzym.154:3-28)、そして1.3 ％ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで電気泳動した(Hehrachら、1977,Biochem.16:4743-4 7 51)。RANをナイロン膜(Hybond-N,Amersham)に移し、そして40％ホルムアミド、５×デンハード液(Denhardt's solution)および200μg.ml^−１変性サケ精子DNAを含有する200mMリン酸ナトリウム(pH7.2)1ml中42℃にて一夜ハイブリツッド形成させた。使用したプローブは、ヌクレオチド319- 1093 （第２図）に相当するランダムプライマーのついた二本鎖プローブ（Feinbergら、1979,Anal. Biochem.137:266-267を^３２Ｐ標識したものである。比活性は1.3 ×10⁸cpm×μｇ^−１でありそして 10^７をハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。

0.5％SDSを含有する0.1×SSC中60℃で60分間洗浄した。増感スクリーンを用い−70℃にて５日間フィルターを露出させた。

(1.3)ニューロトロフィン−３の発現第２図に示される読み取り枠の初めの19ヌクレオチド（およびEcoRI部位）および最後の19ヌクレオチド（およびBamHI部位）に相当するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。第２図に示されるPstIゲノムフラグメントを鋳型として使用しPCR増幅した後、生ずる産物を発現ベクターpCMV （Andersonら、1989,J,Biol.Chem.246:8222- 8229）のEcoRI-BamHI部位にクローンした。pCMV 中のNT-3挿入物のヌクレオチド配列を決定した。

リン酸カルシウム法（ChenおよびOkayama,1987, Mol.Cell.Biol.7:2745-2752）を使用し、COS- １細胞をトランスフェクションし、そして培地は以前に記載（Leibrockら、1989,Nature 341:149 -152）されたようにして集収した。使用した対照、培地はリン酸カルシウムを用いてまたはNT-3の終止コドンが欠失したpCMV/NT-3構築物を用いてCOS -1細胞を処理した後得た。両培地は希釈度1:50で生物的活性を失った。節状神経節を解離し、そしてニューロンを24−ウェルプレート中で培養し (Lidsayら、1985,Dev,Biol.112:319-328）、そしてBDNFをブタの脳から精製した(Hoferおよび Barde,1988,Nature 331:261-262) 。

(2)結果および論考神経栄養因子を特性決定するうえでの大きな問題は非常にそれらの量が少ないということである。

NGFおよびBDNFはそれらの活性を監視するために、生物学的アッセイに基づいたタンパク質精製技術を使用して特性決定した(Cohenら、1960,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.46:302-311;Bardeら、 1982,EMBO J.1:549-553)。成体雄マウスの顎下腺中にはこのタンパク質が非常に豊富なので、 NGFではこの方法が可能であり、そして豚の脳組織は事実上無限に取得可能なのでBDNFについてはこの方法が最高に可能である。NGFおよびBDNF中に検出される配列の同一性により、遺伝子ファミリーであると決定された他のメンバーを特性決定するのに異なる方法が使えることを示唆している (Leibrockら、1989,Nature 341:149-152）。マウスNGFおよびBDNFアミノ酸(a.a.)配列の詳細な比較から、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法に特に好適と思われる６個のアミノ酸からなる２本（第２図において下線部）の存在が明らかとなった(Saikiら、1985,Science 230:1350-1354)。

NGFおよびBDNF遺伝子においては生物学的に活性なタンパク質をコードするエクソンを何らイントロンが中断しないので、マウスゲノム鋳型を使用した。この方法によりNGFおよびBDNF配列の予想された増幅が生じ、そして次にその配列は適切な制限酵素を使用して消化した。完全のまま残った DNAフラグメントを配列し、そしてその配列がBD NFにもNGFにも一致しないことが判明した。マウスの脳、筋肉、および肝臓から抽出したRNAの逆転写によって調製した相補的DNAを鋳型として使用して２本の特異的センス（または5'）プライマーおよびポリＡ配列（第２図）に適合するよう設計した１本の3'プライマーを、さらにPCRに用いるために合成した。これら三組織から同様のサイズの増幅産物が得られ、それらをクローンしそしてマウスゲノムライブラリーを選抜するのに使用した。このようにして見出されたゲノムクローンのひとつを配列した（第２図）。読み取り枠から 258アミノ酸からなるタンパク質が予測され（読み取り枠３個の終止コドンの後に見出される第１番目のメチオニンで始まる）、このものをニューロトロフィン−３(NT-3)と命名した。あらゆる点で、予測されたタンパク質の全体的構造はNGFおよびBDNFに確立されたそれと似ている。すなわち 18アミノ酸の推定シグナル配列（BDNFおよびNGF とそれぞれ５アミノ酸および９アミノ酸が同一であることを示す）のあとに121アミノ酸のプロ配列が続いている。かかるプロ配列は恐らくはこれらタンパク質の折り重なりおよびジスルフィド橋の正しい形成にかかわっており(Edwardsら、J. Biol.Chem.263:6810-6815)、マウスNGF（103アミノ酸）そしてマウスBDNF(112アミノ酸）中にも見出されている。１個のありうるＮ−グリコシル化部位は我々が切断部位であると提案する部位の９アミノ酸前（BDNFおよびNGFの８アミノ酸と比較して）に位置しており、塩基性残基のクラスターにより特色づけられ、成熟NT-3（第２図、矢印）を生じる。成熟NT-3は119アミノ酸（相対的分子量13625およびpI9.3）からなると予測される。

成熟マウスNGF，BDNFおよびNT-3の比較により、 54アミノ酸が同一であることが示される。NGFおよびBDNF中でジスルフィド橋の形成にかかわっていると知られる(Leibrockら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ
３４１：１４９−１５２；Ａｒｇｅｌｅｔｔｉ，１９７３，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２：１００ -115）６個のシステイン残基全てが保存残基内にある（第３図、矢印）。注目すべきことに、NGF およびBDNFの配列にNT-3配列を加えるとたった７個のアミノ酸同一性しか失われないことがわかった（マウスNGFおよびBDNFを比較すると61個のアミノ酸が同一である）。したがって約50％の第一次構造が保存されており、そしてこのものは３種のタンパク質全てに共通する塩基性三次元形状の形成に必要でありそうである。さらに、３種の配列を比較すると、４つの可変ドメインが示され、これはそれぞれ7-11アミノ酸の長さであり（第３図のV1からV4）、そしてこれらのタンパク質が行うニューロン特異性に関与しているのであろう。

NT-3遺伝子の発現を検べるには、種々のマウス組織からRNAを抽出し、NT-3特異的プローブで分析した（第４図）。検査した全ての組織中に約1.4 キロベースの１本のバンドが見出された（第４Ａ図）。しかしながら、このmRNAの発現レベルはかなり異なる。脳においては（第４Ｂ図）、著しい領域的差異が見られ、最高のmRNAレベルは小脳および海馬において観察される（第４Ｂ図）。これらの結果は成体マウス組織におけるNT-3 mRNAの分布がBDNFおよびNGF mRNAのそれとは非常に異なることを示している。事実、BDNF mRNAは脳の中に優勢に見出され、そしてNGF mRNAは肝臓または骨格筋のような組織にはほとんど検出されない (Heumannら、１９８４，ＥＭＢＯＪ．３：３１８３−
３１８９）。しかしながら、NGF mRNAを発現することが知られる海馬が(Korschingら、１９８５，ＥＭＢＯＪ．４：１
３８９−１３９３） BDNFおよびNT-3 mRNAも発現し、しかも他の大部分の脳領域よりもはるかに多量であることに注目することは興味深い（第４Ｂ図）。

NT-3が生物学的に活性でタンパク質を分泌するか否かを検査するために、全タンパク質コード配列を、COS細胞（サルの腎臓）をトランフェクションするのに使用される発現ベクター(pCMV)にクローンした（第５図）。NT-3 mRNAが末梢組織中に見出されるという事実が与えられたので、我々はこれらの組織中に突き出ておりそして生存のために栄養因子を必要とすることが知られる種々のニワトリ胚ニューロンを培養した。６日令の胚(E6) の脊髄から精製した運動ニューロン(Dohrmannら、 1986,Dev.Biol.118:209-221）、毛様体ニューロン(E8)および解離した交換神経ニューロン(E11) はNT-3の存在下での生存が観察されなかった。しかしながら、E8第一次感覚神経節から単離した感覚性ニューロンは応答することが見出された。ここで示すように（第５図）、NT-3は節状神経節から単離されたニューロンの約30％の生存を維持する。さらにこの作用は、BDNFは中央突起領域で合成されそして結節性ニューロンのサブ集団に作用することが知られているBDNF作用と相加的であり (Lindsayら、１９８５，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１２：３
１９−３２８）、そして協同した両因子はほとんどのニューロンを守る（90％）（第５図）。NT-3 mRNAは心臓，腸，肝臓および肺を含めたこの神経節の内蔵標的中に見出されることに注目することは重要である（第４Ａ図）。NT-3応答性感覚性ニューロンの集団は E8解離背根および三叉神経神経節中およびE8交換神経神経節の外植片中にも見出された。したがってNT-3は、肝臓(LindsayおよびTarbit,1979, Neuro Sci.Lett.12:195-200)および骨格筋(Davies, 1986,Dev.Biol.115:56-67)を含むいくつかの末梢組織に存在するこれまで特性決定されていない生物学的活性物であることが明らかとなり、そしてNGFには応答しない内蔵および自己刺激受容性の感覚性ニューロンの生存を維持することが知られる（概説としてDavies,1987,Development 101:185-208)。

総合すればこれらの所見は、NT-3がはじめの２つのニューロトロフィンであるNGFおよびBDNFに構造上および機能上関連している神経栄養因子であることを示している。この種のタンパク質を呼ぶのに、ニューロトロフィン(NT)という名前と、そしてインターロイキンと同様にそれらの発見順に番号をつけることを我々は提案する。

実施例２：ラットニューロトロフィン−３遺伝子のクローニングおよび特色決定 NGFおよびBDNFの間の相同性を、この遺伝子ファミリーの他のメンバーを探索するためのクローニング法を設計するのに用いた。我々がニューロトロフィン−３(NT-3)と表示するBDNF／NGFファミリーの三番目のメンバーをコードする遺伝子のクローニングを報告する。NGFおよびBDNFと比較するとこの新しい因子は別個の生物的活性および時空に関する発現を示す。

(1)材料および方法 (1.1)ポリメラーゼ連鎖反応 NGFおよびBDNF間で高度に保存された４つのタンパク質配列のセグメントに相当する縮重オリゴヌクレオチドを合成した。すなわちタンパク質配列（第７Ｄ図に示されるNGF／BDNF配列内に見出される）は(1)Gly-Glu-(Tyr-Phr)-Ser-Val-Cys-Asp -Ser,(2)Lys-Gln-Try-Phe-(Tyr/Phe)-Glu-Thr- Lys-Cys,(3)Gly-Cys-Arg-Ile-Asp，および(4) Trp-Arg-Phe-Ile-Arg-Ile-Asp-Thr-(Ser/Ala)- Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓである。一連の縮重センスおよ
びアンチセンスオリゴヌクレオチド（センスまたはアンチセンス方向の指示されるタンパク質配列の５ -9アミノ酸に相当する縮重部分15-26ヌクレオチド長、ならびに制限酵素認識部位コードする非縮重「尾部」を含有する）をPCR反応に使用した。アニーリング温度、Mg⁺⁺濃度、および伸張時間を各プライマー対の最適条件に合わせて決めたこと以外は、上流のセンスおよび下流のアンチセンスプライマーの一対間の増幅反応はPerkin-Elmer/Ce tusにより推奨された条件に従って実施した。１Ｂセンスプライマー（前記タンパク質配列「１」の一部分をコード）の正確な配列は、5'-GACTCG AGTCGACATCG-GTN-TGY-GAY-WSN-RTN-WS-3'でありそして2Cアンチセンスプライマー（前記タンパク質配列「２」の一部分のアンチセンスコドンに相当）は、5'-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YT C-RWA-RAA-RTA-YTG-3'(IUPACコードにおけるヌクレオチドの略語）であった。続く配列分析では、１ＢオリゴヌクレオチドはNT-3配列と２ヌクレオチドのミスマッチを有するが2CオリゴヌクレオチドはNT-3配列と１ヌクレオチドのミスマッチを有することが示された。PCRによる放射性標識はPe rkin-Elmer/Cetusにより推奨される遺伝子増幅反応に下記変更を加えて行った。すなわち低融点アガロース中の１〜10μｇDNA鋳型を、最終濃度50 μＭの未標識dATP,dGTP，およびdTTPを含有する反応混合物に加えた。50μｌの反応物につき50μ Ciのα-³²P-dCTP(3000Ci／ミリモル）を加え、そして反応物を７回増幅サイクルにかけた。増幅プライマーはもとのPCR反応で使用した縮重プライマーと同一であった。

（１．２）NT-3プローブを使用したラットゲノムDNA のサザンブロット上記(1.1)項記載の縮重1Bおよび2Cプライマーを使用するラットゲノムDNA鋳型からの増幅により、RIB/2C PCR生成物を得た。縮重1Bおよび2Cプライマー(RIB/2Cと表示）の使用により誘導されたPCR生成物により、新規遺伝子NT-3、ならびにラットゲノムDNA中のNGFおよびBDNF遺伝子が検出された。フィッシャーラットの肝臓からDNAを調製し（Maniatisら、1982,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor)、EcoRI で消化し、そして10μｇを１％アガロースゲルで分別した。DNAを10×SSCを使用してニトロセルロースに移し（Maniatisら、1982,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor)、^３２Ｐ標識RIB/2C PCR生成物と60℃でハイブリッド形成させ（MahmoudiおよびLin,1989,Biotechniques 7:331-3)そして65℃にて２×SSC/0.1％SDS中で洗浄した。NT-3，NGFおよびBDNFバンドが示される。NGFおよびBDNFバンドの位置は特異的プローブを使用して以前に決定した。左側にサイズをキロベース(kb)で示した。

(1.3)ニューロトロフィン−３の発現ラットNT-3発現構築物は、NT-3遺伝子を含有する3.2kb SstIラットゲノムフラグメント（第６Ｂ図）を含有するプラスミドからNT-3の想定される短い前駆体のコード領域を増幅するのにPCRを使用して作成した。すなわちPCR反応に使用するオリゴヌクレオチドは、増幅したコード領域をpC DM8発現ベクターのポリリンカー中のXhol部位に挿入しうるように、それらの末端に合成Xhol認識部位を含有する(Seed,1987,Nature 329:840-42)。

ラットNT-3遺伝子コード領域を増幅するのに使用した正確なオリゴヌクレオチドは上流センスプライマー5'-CGG TAC CCT CGA GCC ACC ATG TCC ATC TTG TTT TAT GTG-3'（下線を引いたATGが「Ｂ」の開始部位開始コドンに相当し、ATGの下流の配列はNT-3配列に正確に一致し、またATGの上流でこのプライマーは合成XhoI部位を含有）、および下流アンチセンスプライマー5'CGG TAC CCT CGA GAT GCC AAT TCA TGT TCT TCC G-3'（下線を引いたトリプレットはNT-3遺伝子の終止コドンに相補的である。すなわちこのトリプレットは正確なアンチセンスNT-3配列にはさまれており、そしてこのプライマーの5'末端にはXhol部位がある）であった。生成するラットNT-3の発現プラスミドは pC8-rN3(P1)で示される。ラットNGFおよびBDNF のコード領域を同じpCDM8ベクターのXhol部位に挿入するために同じような方法が以前使用された。

OKayamaおよびBerg（1982,Mol.Cell Biol.5: 1136-42)に記載されるようにして、NT-3，NGFおよびBDNF発現構築物を60mmプレート当り細胞５× 10^５個の密度で播いたCOS-M5細胞中にトランスフェクションさせ、多量のグルコース(4500mg/ml) および10％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地2.5ml中で培養した。トランスフェクション72時間後に上清を収集した。

(2)結果 (2.1)ニューロトロフィン−３遺伝子のクローニング予測したサイズの増幅生成物(NGFおよびBDNF配列から予測）は異なる対の縮重オリゴヌクレオチドを使用して得た。NGF，BDNFまたは新規な配列の相対的な含量を決定するために、これらの生成物をはじめに制限酵素分析にかけた。全ての場合において、NGFおよびBDNF配列のみに相当する制限フラグメントは臭化エチジウムでの染色により検出できた。しかしながら、ラットゲノムDNAのサザンブロットにハイブリダイゼーションプローブとして同じPCR生成物を使用すると、ひとつの生成物（RIB/2C表示、第６Ａ図参照）によりNGF およびBDNFに加えて新規ゲノムDNA配列が同定されることが明らかになった（第６Ａ図）。従ってサザンブロットによりPCR生成物をスクリーニングすると他の方法では検出できないまれな増幅配列の同定が可能となった。このRIB/2Cプローブはまた進化上分岐した種（ヒト，マウス，ニワトリおよびアフリカツメガエルを含む）のゲノムDNA 中における新規な配列をも検出し、このことはこのプローブが機能的な遺伝子を同定することを示唆している。

この遺伝子を単離するためには、NGFおよび BDNFに特異的なプローブだけでなくRIB/2Cプローブも、Sprague-DawleyラットDNA(Sau 3A制限エンドヌクレアーゼで部分消化しそしてEMBL3/SP6/T7 バクテオリファージベクター中にクローンした）から調製されたラットゲノムDNAライブラリー (Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA より購入）を選抜するのに使用した（Maniatisら、 1982,Molecular Cloning:A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor))。RIB/2Cプローブにはハイブリッド形成するが他の２本のプローブにはしない２個の別個のバクテオリファージクローンが見出された。これらクローン中のラットゲノム挿入物の制限地図分析では、それらが同じ遺伝子に相当することが示された（第６Ｂ図）。最長の挿入物を有するバクテリオファージクローンをφrN3(G1)と表示した。RIB/2Cにより同定された遺伝子が NGF/BDNF ファミリー（第７図参照）の新しいメンバーをコードすることを配列分析は示しており、これをニューロトロフィン−３と名付けた。

(2.2)成熟ニューロトロフィン−３の配列分析米国Biochemical Corporationより供給された SEQUENASE Version2.0キットを使用し、製造業者より推奨されたプロトコルを用いてジデオキシヌクレオチドチェインターミネーター法（Sanger ら、1977,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74: 5463-7）によりDNA配列を行った。

NGFはそのＮ末端配列の長さが異なる「長い」（開始部位「Ａ」から開始）および「短い」（開始部位「Ｂ」から開始）前駆体と呼ばれる２本の別個の前駆体形態を有する(Darlingら、1987 Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.1:427-34; Selbyら、1987,Mol.Cell Biol.7:3057-64; Edwardsら、1987,Mol.Cell Biol.8:2456-64)。

長い方および短い方の前駆体は両方ともタンパク分解的に切断されてNGFの成熟形を生成でき、このものは実質的に各前駆体のカルボキシ末端120 アミノ酸を構成する。BDNFも同様の長い前駆体形および短い前駆体形を有するであろう。

いくつかの種からのNGF遺伝子の配列により、短い（「Ｂ」開始部位）前駆体全体をコードするエクソンの5'末端に含まれる４個のコドン（Val- His-Ser-Val)を除いては、この付加的なＮ末端配列の大部分が別のエクソン上に見られることが明らかになっている。これら４個のコドン（Val-X- X-Val)のうち２個、ならびにこれらより先にある RNAスプライス受容部位がいくつかの種から単離されたBDNF遺伝子の保存された「Ｂ」開始部位のすぐ上流に保存されていることを我々は以前示している。この所見から、長い方および短い方の前駆体両形態のBDNFが存在することを我々は提案した。ラットNT-3遺伝子中には、スプライス受容部位だけでなく、（Val-X-X-Val）コドンも保存されている。このスプライス受容部位および提案したイントロン境界を第７Ａ図に示す。これらの配列を考察して、我々は長い前駆体形態をコードするであろうNT-3遺伝子の上流コードエクソンの存在を予測した。推定上のNT-3「Ａ」開始部位の上流にある保存された配列の発見により、長いBDNF前駆体が存在するという我々の予測がさらに強まり、そしてNGFファミリーの全てのメンバーにとってのこの長い前駆体の重要で進化上保存された役割が示唆される。

成熟NT-3の予測されるＮ末端はNGFおよびBDNF で見られると非常に類似した標準的プロテアーゼ切断配列(Arg-Arg-Lys-Arg)に続いている（第７Ａ，Ｃ図）。いくつかの種では、NGFの２個のＣ末端アミノ酸もまたタンパク分解的に除去される。

NGFと異なり、ラットNT-3はそのＣ末端にはっきりと切断部位となりうる部位はなく（第７Ａ，Ｃ図）、そして今日までに検査したすべての種からのBDNFと同様に、NT-3のＣ末端にはタンパク分解的修飾はないと推量する。

これらの考察に基づき、成熟NT-3ポリペプチドの予測されるサイズは119アミノ酸で、計算した pIは約9.5である。従ってサイズおよび電荷では、 NT-3はNGFおよびBDNFと非常に似ている。成熟NT -3のＮ末端の７個のアミノ酸はNGFおよびBDNFとは完全に異なる。成熟NT-3のアミノ酸８から開始すると、BDNFに対しては２個のアミノ酸からなる１個のギャップが最適な整列にとって必要であり、 NGFに対しては１個のアミノ酸の１個の挿入が必要である（第７Ｄ図）。成熟ラットNT-3はラット NGFと57％のアミノ酸相同性を示し、ラットBDNF とは58％のアミノ酸相同性を示す。すなわち120 残基中57残基（48％）が全３種のタンパク質で共通である（第２Ｄ図）。NGFおよびBDNF中に見られる６個のシステイン残基はNT-3中に完全に保存されており、そしてこの３種のタンパク質間の最もも相同性の高い領域には主にこれらシステイン残基のまわりに集まっている。

(2.3)ニューロトロフィン−３前駆体の分析成熟NT-3を放出する推定上の切断部位のすぐ上流にはNGFおよびBDNFでも同じ位置で見出される (Ullrichら、1983,Nature 303:821-5:Leibrock ら、1989,Nature 341:149-52）普遍的なグリコシル化受容部位(Asn-X-Thr/Ser、第７Ａ，Ｃ図参照）が存在する。このグリコシル化部位がNT-3，NGF，またはBDNF前駆体のプロセシングに役割を果たしているかどうかは不明のままである。

NT-3配列をNGFおよびBDNF前駆体とさらに比較すると、成熟NT-3配列の上流にアミノ酸相同性を有する２つの領域が示される（第７Ｂ，Ｃ図の領域IおよびII）。領域Iの相同性に基づき、NGF (241アミノ酸）およびBDNF(249アミノ酸）の短い前駆体とサイズが類似する258アミノ酸の短い前駆体を生じるであろう「Ｂ」開始部位（上記NGF で定義）がラットNT-3に存在することが予測される。すなわち３種の因子全ての短い前駆体に関し、明らかなメチオニン開始コドン、分泌シグナル配列およびシグナル配列切断部位が保存されている（第７Ｃ図）。領域Iの相同性は「Ｂ」開始部位の上流まで伸びているので「Ａ」開始部位から開始するであろうNT-3の長い前駆体の存在もまた我々は予測する（第７Ａ，Ｂ，Ｃ図参照）。NGF で見られ(Ullrichら、1983,Nature 303:821-5; Selbyら、1987,Mol.Cell Biol.7:3057-64)、そしてBDNFに関して提案されたように、かかる開始部位は短い前駆体全体をコードする１個のエクソンの上流にある付加的なエクソンに恐らくコードされているのであろう。

領域IおよびIIのアミノ酸相同性に加えて、 NT-3，NGFおよびBDNFの親水性プロットを比較すると、成熟生成物の上流にある前駆体の構造上の類似性が明らかとなる。

(2.4)ニューロトロフィン−３は神経栄養活性を有する NT-3，NGFおよびBDNF間のきわだった相同性により、NT-3が神経栄養活性を有する可能性が強く示唆された。NGFおよびBDNFはインビボおよびインビトロにおいて末梢および中枢神経系ニューロンの選択された集団の生存を促進できる（概説としてWhittemoreおよびSeiger,1987,Brain Res． Rev.12:439-64;Lindsay,1988,in“The Making of the Nervous System,”pp.149-65;Davies, 1988,Trends Genet.4:139-43参照）。例えば、発達中の鳥の胚にどちらかの因子を投与しても特異的な末梢神経節(例えばHofferおよびBarde,1988, Nature 331:261-2)で自然におこるニューロン死が阻止される。外植神経節に加えた場合、NGFおよびBDNFは、神経突起の成長を誘導する（Davies ら、1986,J.Neurosci.6:1897-904)。すなわち解離した神経節ニューロンの培養物に加えると、これらの因子はニューロンの生存と分化を促進する(Lindsayら、1985.Dev.Biol.112:319-28)。

いくつかの種類のニワトリ末梢神経節を用いるかかるインビトロアッセイがNGFとBDNF間の神経栄養活性を区別するのに用いられている。両因子は神経稜由来の背根神経節(DRG)に見られる感覚性ニューロンの集団に作用するが、BDNFだけが神経プラコード由来の節状神経節(NG)の感覚性ニューロンを維持する(Lindsayら、1985,Dev.Biol. 112:319-28)。対照的に、BDNFでなくNGFは、脊椎傍の鎖交感神経神経節(SG)のニューロンの生存と成長を維持できる(Bardeら、1982,EMBO J.1: 549-53)。

NT-3のありうる生物学的活性を評価するために、我々はラットNT-3遺伝子をベクターpCDM8(Seed, 1987,Nature 329:840-42)に挿入した。pCDM8は哺乳動物細胞中でBDNFおよびNGFを一時的に発現させるために以前使用された。この構築物はNT-3 の短い前駆体を発現させるよう設計された。すなわちNGFおよびBDNFの短い前駆体形の発現により生物学的に活性な物質が生成している(Edwardsら、 1988,Mol.Cell Biol.8:2456-64;Leibrockら、 1989,Nature 341:149-52)。NT-3，NGFおよびBD NF構築物を、COS細胞にトランスフェクションさせた。培養上清を収集し、そしてDRG外植片からの神経突起の伸びを誘導する能力について種々の濃度で初めにアッセイした。予想されたとおり、このアッセイにおいてNGFおよびBDNFは神経突起の伸びを促進した（第８図）。NT-3遺伝子はDRG外植片から豊富な神経突起の伸びを誘導する神経栄養活性のある産物を実際にコードするという第一の実例である（第８図）。

NT-3が直接ニューロンに作用することを確立するために、解離されたDRGニューロンが高度に富化された培養物中でこの因子をアッセイした（第９図）。シュワン細胞および繊維芽細胞の実質的非存在下で、NT-3はこれらDRGニューロンの約60 ％の生存および神経突起の伸びを促進した。NGF およびBDNFが共同して培養中のDRGニューロンの事実上100％を維持することが判明したので (Lindsayら、１９８５，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１２：３
１９−２８）、 NT -3は他の２因子のうち少なくとも１方にも応答する細胞
の生存を促進すると想定しなければならない。

(2.5)NT-3の神経栄養活性はNGFおよびBDNFとは別個である。

NT-3のニューロン特異性をさらに調査するために、NGおよびSG外植片でこの因子をアッセイした。

予想したとおり、NGFはE8ニワトリ胚からのSG外植片からの神経突起の伸びを誘導するが、NG外植片からは誘導せず、一方BDNFはNG外植片からの神経突起の伸びを誘導するがSG外植片からは誘導しないことが対照実験により実証された。おもしろいことに、NT-3はNGおよびSG両外植片からの神経突起の伸びを促進し（第８図）、このことはNGF またはBDNFのいずれよりも幅広い特異性を示唆している。しかしながら、NT-3はNGFおよびBDNFと同様にニワトリ毛様体神経節の外植片の生存を促進せずまたは解離されたニューロン富化培養物からの神経突起の伸びを促進しなかった。以前にされているように、神経節を含有する副交感神経ニューロンはラットCNTF(NGF/BDNF/NT-3ファミリーに関連しない神経栄養因子）に応答しなかった(Manthorpeら、1986,Brain Res 367:282-6; Stockliら、1989,Nature 342:21-28）。対照ベクターでトランスフェクションしたCOS細胞からの上清を使用したアッセイのどれにおいても全然応答は見られなかった（第８図）。

外植された胚日令８日(E8)のニワトリ背根神経節(DRG)、節状神経節(NG)、および脊椎傍交感神経神経節（ＳＧ）の漸増量のNT-3に対する応答を測定する代表的実験の結果を第IV表に示す。Lindsay およびRohrer(1985,Dev,Biol.112:30-48)に記載のようにして神経節を外植片として１mlのコラーゲンゲル中で指示される時間培養した。繊維の伸びを０から５の尺度で採点し、５は神経成長因子(NGF)（１−10ng/ml）の飽和量に応答して背根神経節で観察される最大の繊維の伸びである。ラットNT-3は上記のようにして、プラスミドpC8- rN3(P1)でトランスフェクションしたCOS-M5細胞からの馴化培地として得られた。偽似トランスフェクションしたCOM-M5細胞からの馴化培地を対照として使用した。50倍の範囲にわたる検査した全ての用量で、NT-3は全３種類の外植神経節から検出可能な繊維の伸びを促進したが、低い用量では交感神経神経節に及ぼす応答は弱かった。NT-3に対する背根神経節の最大繊維の伸び応答はNGFまたはBDNFで見られたそれと匹敵した。NT-3に対する節状神経節の最大の応答はBDNFに対して見られた最大の応答よりも高かった。節状神経節はNGF に対しては繊維伸び応答を示さない。NT-3に対する交感神経神経節の最大応答はNGFに対するこれら神経節の最大応答よりも低く、そして背根または節状神経節培養物中におけるNT-3に対する最大応答に必要とされるよりも高い濃度で観察された。

結果は各場合における４から６個の神経節からの繊維の伸び得点の範囲である。

＊NT-3の過飽和レベルでは、DRG外植片に対する繊維の長さによりおよびNG外植片に対する繊維の数により測定した場合繊維の伸びは低下する。

(2.6)ラットニューロトロフィン−３は哺乳動物のニューロンに対して活性であるラットNT-3が哺乳動物のニューロンに対して活性を示すか否か決定するために14日令ラット胚から切開してとった背根神経節を使用して外植片アッセイを反復した（第V表）。精製したNGFを対照として使用した。実質的にニワトリ神経節で記載されるようにして（第８図、第VI表）、E14ラット背根神経節外植片（１ml培養物当り４個の神経節）を、神経栄養因子を添加しないもの（対照）、マウス顎下腺神経成長因子(NGF) 、または組換えラットNT-3（上記のように、プラスミドpC8-rN3 (P1)でトランスフェクションしたCOS-M5細胞からの馴化培地）と24時間培養した。記載されるように（第VI表参照）、各神経節を繊維の伸びについて採点した。その結果は、NGFと同様NT-3がラット背根神経節外植片からの繊維の伸びを促進するのに高度に活性であることを示している。

DRG，NGおよびSG外植片各々は、３種の関連する神経栄養因子のうち少なくとも２種に応答したが、特定の神経節により示される最大の応答は使用した因子の如何によるものであった。DRGの場合、NGF，BDNFおよびNT-3の飽和レベルに対する応答は比較的同等であった。しかしながら、NGではNT-3に対する最大応答はBDNFに対するよりも高かったが、一方SGではNT-3に対する最大応答は NGFと比較すると相当低くそしてやや遅れていた。

(2.7)ニューロトロフィン−３合成部位調査発達期間中はニューロンの生存は標的由来の神経栄養分子に依存することが確立されている。成体においてさえ継続的生存には神経栄養的影響の存続が必要であろう(Thoenenら、1987,Ciba Found.Symp.126:82-95)。他の場合においては、成熟ニューロンの生存はもはや神経栄養因子には依存しないであろう。それにもかかわらずかかる因子がニューロンの分化した表現型に多大に影響することが示されている(LindsayおよびHarmar、 1989,Nature 337:362-4)。それゆえ神経栄養分子の合成部位を決定することはその生理学的役割を解明するのに役立つであろう。

NT-3合成部位を調査するためそしてNT-3発現を NGFおよびBDNFのそれと比較するために、種々の成体ラット組織から調製したRNA試料の三通りのノーザンブロットを、これらの遺伝子のそれぞれに特異的なプローブとハイブリッド形成させた（第10図）。以前に示されたように(Heumannら、19 84,EMBO J.3:3183-9;SheltonおよびReichardt, 1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7951 -5）、NGF mRNAの発現は脳，心臓および脾臓において最高であった。少なくとも痕跡レベルは検査した他の全ての組織で検出できた。BDNFはもっと限定された発現パターンを示した。すなわち最高レベルは脳で見られ、（Leibrockら、1989,Nature 341:149-52）、そして有意なレベルが心臓，肺，および筋肉で見られた。NGFでそうであるように、 NT-3転写物（１．４ｋｂ）は検査した全ての成体組織中で検出された。しかし検査した全ての末梢組織においては、NT-3 mRNAの発現レベルは成体脳でみられるそれと少なくとも同等であり、そしていくつかの場合（例えば腎臓，脾臓）においてはかなり高かった。

我々はまた新生マウスおよび成体マウスの脳におけるNGF，BDNFおよびNT-3転写物の相対的な量を比較した。NGFおよびBDNFの両方と比較して、新生児脳におけるNT-3 mRNAのレベルは成体の脳におけるよりも高かった（第８図）。さらに詳細な分析により、中枢神経系におけるNT-3 mRNAレベルは胎児の発育期間中は劇的に高くそしてその後は成体レベルまで減少することか明らかになった。

(3)論考 NGF，BDNFおよびこの遺伝子ファミリーの最新のメンバーであるNT-3の間での構造的比較によりいくつかの保存領域が強調されそしてこれらのタンパク質間の機能的差異がこれら保存領域の外にある配列により決定されることが示唆される。３種の全てのタンパク質に長いおよび短い前駆体形態の存在が予測されることは、インビボにおける両前駆体形態の関連性について興味深い疑問を生じる。長い形態は短い形態より効率的にプロセシングされよう。それにもかかわらず、これら因子の短い前駆体形態を発現するベクターはCOS細胞において生物学的に活性な物質を生ずる。

これら３種の神経栄養因子が別個の段階特異的かつ組織特異的発現パターンを示すという我々の知見により、神経の発達は別個の神経栄養活性の時間的および空間的に別々の発現に依存するという概念が支持される。NT-3発現の発達プロフィールは、この因子が神経系の発達初期にとりわけ重要な役割を果たしうることを示唆している。インビトロにおけるNT-3の神経栄養活性に関する我々の当初の特性決定は、成体脳および成体末梢組織両方におけるNT-3 mRNAの普遍的行き渡りと一緒になって、NT-3が成体のニューロン機能および／または生存に広範な影響を及ぼしうることをさらに示唆している。NT-3のもっと全体的な発現もまた、NGFについて提案されたようにこの因子が神経系外で細胞に作用する可能性をもたらすものである（Ottenら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.86:10059-10063）。

ニューロンは１個以上の神経栄養因子に同時に応答しうるということは、まだはっきりと示されてはいないが、NGF及びBDNFが重複するニューロン集団に作用しうることを示唆する証拠はある。

例えば、NGFまたはBDNFのいずれかの投与により、正常な鳥類の発達期間中にそうでなければ死んだであろうDRGニューロンの大部分を救うことができる(HoferおよびBarde,1988,Nature 331:261- 2)。ニワトリ末梢神経節に及ぼすNT-3の作用に関する我々の観察により、個々のニューロンが多数の関連した恩恵に応答できるという興味深い可能性が強く裏書きされる。もしこれが本当ならば、同時応答性の仲介および生理学的関連性の両方が魅力的な問題を提起するであろう。例えば、３種の構造的に関連する神経栄養因子のためのレセプターおよび／またはシグナルトランスダクションメカニズムの構成分は共通であるかもしれない。

原則として、同時応答性ニューロンは特定の神経栄養因子に各々特異的である多数のレセプターを有するか、または多数の神経栄養因子に対する応答を仲介する１個のレセプターを有することができよう。インビボにおいて、これら種々の因子は応答性ニューロン全てに同時に提示されうる。個々の因子の相対的利用可能性は時空的差異がありそうである（例えばDavirsら、1987,Nature 326: 353-8)。異なる因子が同じニューロンの異なる部位で利用可能であるという可能性さえあるだろう（例えば感覚性ニューロンはその末梢および中央末端から別個の因子を受けうる）(Kalcheimら、19 87,Le Douarin,ENBO J.6:2871-3）。もし多数の因子がいくつかのニューロンで同時利用可能ならば、それらの作用は余分であるかまたは相補的であるかであろう。

NGF，BDNFおよびNT-3の個々のおよびありうる相補的役割を解明することは、神経系の正常な発達および維持を理解するための決定的な情報を提供することになろう。動物研究では、NGFは変性性神経学的状態を治療するのに価値があろうことが示唆された(SniderおよびJohnson,1989,Ann. Ｎｅｕｒｏｌ．２６：４８９−５０６；Ｆｉｓｃｈｅｒ
ら、1989,Nature 429:65-8;Phelpsら、1989,Neurobiol．Ａｇｉｎｇ 10:205-7)。NGF/BDNF遺伝子ファミリーの新しいメンバーのクローニング、およびファミリーの他のメンバーとのありうる相互作用は、神経変性性疾患においてこれらタンパク質が治療上応用可能かどうかに関する新しい考察を提起するものである。

実施例３：ヒトニューロトロフィン−３遺伝子のクローニングおよび特性決定 (1)結果ラットNT-3遺伝子の同定に使用されたプローブ (RIB/2C)の調製は上記実施例２に記載されるようにして行った。そこに記載されるようにして、 NGFおよびBDNFにより共有されるアミノ酸配列相同性の「ボックス」のうち２個に相当する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ラットゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりプローブを調製した。新規遺伝子を表わすDNA分子の集団がRIB/2Cプローブ内に存在することは、 EcoRI制限エンドヌクレアーゼ消化ラットゲノム DNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより最初に明らかにされた。すなわちNGFおよび BDNF遺伝子に相当することが知られる予測されたフラグメントに加えて、プローブが新規DNAフラグメントも検出した。

ラットDNAの場合のように、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化したヒトゲノムDNAのサザンブロットを分析するために^３２Ｐ標識したRIB/2Cをプローブとして使用した場合、NGFおよびBDNF遺伝子に相当するバンドだけでなく新規なバンドへのハイブリダイゼーションも観察された。例えば、 HindIII制限エンドヌクレアーゼでは約1.8kbの新規（すなわち非NGF，非BDNF）バンドが観察された。BamHIで約15kbの新規バンドが観察された。

そしてEcoRIで８および12kbの新規バンドが観察された（２つのバンドの存在はヒトゲノムDNA中のEcoRI制限部位の多型現象から生じたものかも知れない）。これらのデータにより、ヒトDNAがラットおよびヒトの間でよく保存されているNT-3 遺伝子を含有することが示された。

ラットNT-3遺伝子の単離に関して記載されたように（実施例２参照）、ヒトNT-3遺伝子をゲノムライブラリーのスクリーニングにより単離した。

簡単に言えば、ヒト胎盤ゲノムDNAのSau 3A部分消化生成物をバクテリオファージベクターλEMBL 3/SP6/T7(Clontech Laboratories,Inc.から購入）にクローンしたライブラリーをRIB/2Cプローブ、およびラットNGFおよびラットBDNFプローブで選抜した。ヒトNT-3クローンはRIB/2Cとハイブリッド形成するが、NGFともBDNFともしないことが予測されよう。かかるファージクローンの１個が、選抜された約８×10⁵個のプラーク中で同定された。φhN3(G1)で示されるこのクローンは約16kb のヒトDNA挿入物を含有することが見出された。

このクローンを通常の方法により制限地図作成しそして選択した制限フラグメントをDNA配列分析するためにプラスミドpBluescriptII(Seratagene) にサブクローンした。ヒトNT-3遺伝子の配列およびそのタンパク質産物の推定アミノ酸配列をラットNT-3配列と並べて第11図に示す。

(2)論考配列分析の結果は、ラットとヒトNT-3の間で核酸およびアミノ酸配列に著しく高度の保存があることを示している。成熟ポリペプチド(119アミノ酸）をコードする領域内で、ヒトおよびラット遺伝子はDNA配列が約92％相同である。しかしながら、この領域におけるヒトとラットの間のヌクレオチド配列の相違はどれひとつとしてアミノ酸置換に至るものはない。すなわち成熟ラットおよびヒトNT-3（および成熟マウスNT-3、上記実施例１参照）の推定アミノ酸配列は完全に同一である。

これはラット，マウス，ヒトおよびブタの間での成熟ポリペプチドのアミノ酸配列の完全な同一性を示すBDNFの高度の保存の名残りである。これと対照的に、成熟ヒトNGFおよびゲッ歯類動物NGF （マウスまたはラット）のアミノ酸配列は約10％異なる。さらに、推定ヒトおよびラットNT-3前駆体のアミノ酸配列もほとんど違いがない（第11図の下線部）。成熟NT-3ポリペプチドを生成するであろうと予測されるプロテアーゼ切断部位（Arg- Arg-Lys-Arg)のすぐ上流で、ヒトの配列はラット配列に存在する１個のコドン（Proのための）が欠けている。４個のアミノ酸からなる１区画はヒトおよびラットプレプロNT-3の間で異なり、そして１個のアミノ酸からなるさらに６ヶ所の置換が、その区画および予測されるプロテアーゼ切断部位の間に散在している。

ヒトNT-3の生物学的活性成熟ヒトNT-3の推定アミノ酸配列は成熟ラット NT-3のそれと同一なので、ヒトおよびラットNT-3 タンパク質が区別をつけられない様な生物学的活性を示すであろうことが強く予測された。ヒトNT -3の神経栄養活性は、クローン化したヒト遺伝子をプラスミド発現ベクターpCDM8に挿入し、生じたプラスミドpC8-hN3(P1)をCOS-M5細胞にトランスフェクションし、（ChenおよびOkayama,1987, Mol.Cell Biol.7:2745-52に記載）、そしてトランスフェクションされた細胞からの馴化培地中における神経栄養活性をアッセイすることにより確認された。ラットNT-3遺伝子（実施例２）で記載されるように、ヒトNT-3遺伝子をバクテリオファージφhN3(G1)からPCRによって増幅させ、そしてプラスミド発現ベクターpCDM8に挿入した。

その結果生じたプラスミドをpC8-hN3(P1)で表わした。PCR増幅およびクローニング操作中に突然変異が導入されなかったことを確認するために、 NT-3挿入物全体のヌクレオチド配列を決定し、そして上記のようにして決定されたゲノム配列と比較した。トランスフェクシヨンおよびアッセイ法はラットNT-3の生物学的活性のアッセイに使用した方法と実質的に同一であった。

予測されるように、胚日令９日(E9)のニワトリ背根神経節および節状神経節の外植片に対してアッセイを行った場合、ヒトNT-3は神経栄養活性を有することが見出された（第VI表）。偽似トランスフェクションしたCOS-M5細胞からの、または組換えヒトBDNFまたは組換えラットNT-3[rNT-3；プラスミドpC8-rN3(P1)]または組換えヒトNT-3[hNT -3;プラスミドpC8-hN3(P1)]をコードするプラスミド（すべてpCDM8発現ベクターに由来）でトランスフェクションしたCOS-M5細胞からの馴化培地（上清）の存在下に神経節を24時間培養した（第８図，第IV表参照）。BDNFプラスミドを陽性対照として選択した。なせならBDNFは背根神経節および節状神経節の両方に神経栄養活性を有することが知られているからである。第VI表に示されるように、適度の用量において、（第IV表と比較）、ラットおよびヒトの組換えNT-3は、背根神経節に対してBDNFとほぼ同じレベルの活性を示し、そして節状神経節に対してBDNFよりかなり高い活性を示した。ヒトNT-3活性対ラットNT-3活性には何らの相違も観察されなかった。

得点は培養中24時間目での１個から５個の個々の神経節で見られる繊維の伸び（尺度０−５）の測定である。各個々の神経節の得点を示す。

代謝標識によるヒトNT-3遺伝子産物の同定成熟NT-3ポリペプチド（ラットまたはヒト）の予測されるサイズは13.6ダルトンの分子量を有する119アミノ酸である。成熟ヒトNT-3ポリペプチドのおよそのサイズを実験的に決定するために、ヒトNT-3発現プラスミドでトランスフェクションした細胞を代謝的に標識し、そして馴化培地を新規ポリペプチドの存在について分析した。第12図に示される実験において、COS-M5細胞をプラスミドpC8-hN3(P1)でトランスフェクションし（前記）、細胞を[³⁵S]メチオニンおよび[³⁵S]システインの混合物で標識し、成長培地を収集しそして15％ポリアクリルアミドゲル上で変性条件下に電気泳動することにより分別し、タンパク質を膜フィルターに移し（実質的にTowbinら、1979,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:4350-4354に記載）そして標識したポリペプチドをオートラジオグラフィーにより検出した。偽似トランスフェクションした細胞を対照として使用した（「偽似」と標識したレーン）。第12図に示されるように、発現プラスミドpC8-hN3(P1)は対照では見られない約 14kDa(図面中の標識NT-3）の１本のポリペプチドの合成を指示した。技術上分析できる範囲内で、このものは成熟NT-3の予測されるサイズとよく一致する。

実施例６：ニューロトロフィン−３は胚性ラット腹側中脳の培養ドーパミン作動性ニューロンの生存を支持する E14ラット胚腹側中脳の培養物を1988年８月30 日出願の米国特許出願07/400591号明細書（これはその全体が参考としてここに組込まれる）に記載されたようにして樹立した。培養物を密度50,0 00細胞／cm²（第13図）または100,000細胞／ cm^２（第14図）で播きそして神経栄養因子の非存在下対照または漸増量の組み換えヒトニューロトロフィン−３（NT-3）含有COS細胞上清の存在下で成長させた。培養８日後に細胞を固定し、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)に対する抗体、ドーパミン作動性ニューロンのマーカーで染色した。第13図および第14図に示すように、漸増量のNT-3は８日後に生存しているTH陽性細胞数を増大させることが見出され、NT-3 COS細胞上清の１：25希釈での対照値よりも最高で2.５倍増であった。精製した神経成長因子は効果がないと思われたが、NT-3の作用はBDNFについて観察されたのと類似していた。

実施例７：発達中のラット神経系中のNT-3、BDNF およびNGF：発現の平行ならびに相反するパターン (1)方法 (1.1)材料および切開 Harlan Sprague Dawley Inc.から得られたSpra gue-Dawleyラットをすべての切開に用いた。成体脳の切開は慣用の肉眼的解剖標認点に従った。皮質サンプルには新皮質および嗅覚皮質の背側部分が包含された。間脳サンプルはそれぞれ背側および腹側標認点としての線条骨髄および視交差を用いて取り出した。中脳サンプルは上丘および下丘のレベルで背側に取り出し、脳の腹側表面に脳橋の大部分の吻側単部まで伸ばした。後脳サンプルは小脳を欠いていたが脳橋および骨髄を含んでいた。視床組織による汚染を避けるため線条体の吻側部分だけをサンプリングしたことに注目すべきである。海馬サンプルはふさ／脳弓のレベルからほぼ尾側極まで集めた。新生脳の切開には、線条骨髄を除いて同様の標認点を用いた。胚組織を得るために時期を定めて妊娠させたラットを用いた。

精子を与えた日は日令E1と陽性表示し、誕生の日はP0と表示した。成体ラットは150〜275ｇに平均させた。（６〜８週令）。

(1.2)RNAの調製およびノーザンブロット選ばれた組織をSprague Dawleyラットから切開し、直ちに液体窒素中で凍結させた。記載されたようにして(Bothwellら、1990,Methods of Clon- ing and Analysis of Eukarotic Genes,Jones and Bartlett,Boston,MA)組織を3M LiC1/6M 尿素中でホモジナイズすることによりRNAを単離した。RNA(10μg)を４通りの１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル（Bothwellら、上記）を通して電気泳動し、続いて標準塩水シトレート(SSC)、 pH7を用いてナイロン膜（MagnaGraph,Micron Separations Inc.）にキャピラリーで移すことに Stratagene,Inc.）によりRNAを膜に架橋させ、そして0.5M NaH₂P0₄(pH7)、１％ウシ血清アルブミン（フラクシションＶ、Sigma.Inc.）、７％ SDS、１mM EDTA(MahmoudiおよびLin,1989, Biotechniques 7:31-33)および100μg/mlの音波処理変性サケ精子DNAの存在下に放射性標識プローブと68℃でハイブリダイゼーションさせた。

フィルターを68℃で２×SSC、0.1％SDSで洗浄 DuPont）およびX-線フィルム(XAR-5,Kodak)を用いて−70℃で１日ないし２週間オートラジオグラフィーを行った。これら４通りのゲルの臭化エチジウム染色は、同等のレベルの全RNAが異なるサンプルについてアッセイされたこと(Maisonpierre ら、1990,Science 247:1446-1451)を示しおり、このことはブロットのいくつかを28S rRNAに特異的なプローブを用いてプロービングすることにより確認された。

(1.3)NT-3、BDNF、NGFおよびNGFRプローブの調製ラットNT-3、BDNFおよびNGFのコード領域を pCDM8発現ベクター(AruffoおよびSeed,1987, Proc.Natl,Acad.Sci.USA.84:8573-8577)中に分子クローニングすることは以前に記載されている（Maisonpierreら、上記）。これらプラスミドの800塩基対(bp)XhoI挿入物をアクリルアミドゲルで分離し、電気泳動による溶離(Bothwellら、 1990）によって回収し、続いてランダム６量体ラベリング（Bothwellら、上記）による³²P-標識した。合成NT-3、BDNFおよびNGF転写物への各プローブのハイブリダイゼーションは一つのニューロトロフィンに特異的なプローブが関連ニューロトロフィンからの転写物にハイブリダイズしなかったことを示した。ラットNGFRプローブはラットNG FRタンパク質をコードする領域にを包含する1.6 kb NcoI cDNAフラグメントであった（Radekeら、 1987,Nature 325:593-597)。

(1.4)合成転写物の調製および定量上記のpCDM8/ニューロトロフィン発現構築物中に存在するT7ファージプロモーターを、NT-3、 BDNFおよびNGFをコードする領域のセンス方向に対応する合成RNA転写物の作製に用いた。これらの合成転写物の量をまず分光測光法により定量した。３つの転写物の共通5'末端（T7プロモーターのすぐ下流）にハイブリダイズした末端標識（Bothwellら、上記）30量体オリゴヌクレオチドを用いて転写物をさらにアッセイした。オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした（ハイブリダイゼーションおよび洗浄は55℃でその他は上記と同様に行った）合成転写物ドットブロットおよびノーザンブロットをデンシトメトリー走査することにより、同等のレベルの合成転写物が特定の標準物として用いられたことが確認された（代表的なデータを第15Ａ図に示す）。

(1.5)ニューロトフィン転写物レベルのデシントメトリー定量種々のサンプル中での転写物レベル標準化成体ラット脳サンプル（上記参照）に下記のようにして正常化した。成体脳RNAサンプルの同等の割合を各ノーザンブロットに含ませた。アッセイした各サンプルに関するシグナル強度を測定するために各ノーザンブロットについての種々のオートラジオグラフー照射物のデンシトメトリー走査を用いた。走査した各照射物について、その照射物における成体脳サンプル中のシグナル強度に関して得られた値で各サンプルのシグナル強度を割った。

このことにより、すべての値を標準化成体脳サンプルに関して正常化された。第18図において、異なるサンプルの転写物レベルは成体脳サンプルのレベルに比較して示されており、成体脳サンプルのレベルを自由裁量で1.0に設定した。成体脳サンプル中の全RNA１マイクログラム当りのニューロトロフィン転写物のフェムトグラムを測定すると、成体脳サンプルに関して正常化されたサンプルにおける実際の転写物レベル(fg/μg)を測定することができた。

(2)結果 (2.1)成体ラット脳中のNT-3、BDNF、およびNGF mRNAレベルの定量および比較種々の組織由来サンプル中でのNT-3、BDNFおよびNGF転写物の発現を定量して比較するために、ノーザンブロットアッセイを用いた。異なるサンプル中の各ニューロトロフィン転写物の量を特定の合成標準物に関して定量した。その量を精密に測定した合成NT-3、BDNFおよびNGF RNA転写物（第 15Ａ図およびその説明参照）を、成体ラット脳から単離した全RNA10μｇをも含有するノーザンブロットに含ませた。ブロットを各ニューロトロフィンに特異的な放射性標識プローブにハイブリダイズさせ、次いでオートラジオグラフィーを行った（第15Ｂ図）。次いで成体脳サンプルおよび合成標準物から得られたハイブリダイゼーションシグナル強度を比較するために走査デンシトメトリーを用いた。この定量により、成体ラット脳中の３つのすべてのニューロトロフィンについてほぼ等しいmRNAレベル（全RNA１μｇ当りNT-3転写物 40fg、BDNF転写物45fgおよびNGF転写物30fgと推定される）が存在することが明らかにされた。この標準化成体脳サンプルの一部分を続くすべてのノーザンブロットに包含させ、従って新しいRNA サンプル中のニューロトロフィン発現レベルを比較して定量することが可能になった。（後記参照）。

異なるサンプルの間での３つのニューロトロフィン転写物の可視的比較を助けるため、後続の図面に記載される照射物は、標準化成体脳サンプルのシグナク強度が３つの全ニューロトロフィンに関して類似しており、これにより他の組織サンプルのシグナルが特定の標準物に対して正常化されるように選ばれた。

(2.2)NT-3、BDNFおよびNGF遺伝子発現は共通のならびに特有の発達特徴を示すラット胚中でのニューロトロフィン遺伝子発現の調査により、３種の全ニューロトロフィンは胚日令11と12(E11-E12)の間でそれらの発現レベルの劇的な増加を示すことが明らかにされた（第16 Ａ図）。３種の全ニューロトロフィン転写物はE12 およびE13胚に広く分布している。ニューロトロフィン遺伝子発現の協調した上昇のタイミングは、神経組織発生（末梢および中枢の両方）が本格的に始まる期間と、およびこれらの新たに形成されたニューロンによる軸索の初期の伸びと一致する（例えばAltmanおよびBayer,1982,Adv.Anet. Embryol.Cell.Biol.Vol.74;AltmanおよびBayer, 1984,同上、Vol.85）。

胚組織発生中のニューロトロフィン遺伝子発現がこのように協調して開始するにもかかわらず、標準化成体脳サンプルと比較すると、NT-3 mRNA は早期胚中に極端に多く存在するが（180fg/μｇ全RNA）、BDNF mRNAはわずかに多く（５〜10fg/ μｇ全RNA）、NGF mRNAは中程度のレベル（30fg/μ ｇ全RNA）で存在することが示された（第16Ａ図）。

NT-3およびBDNFは発現レベルは発達中の脳（第16 Ｂ図）または密に神経支配された心臓（第16Ｃ図）で追跡すると相反する関係を示し続け、同様のレベルまで最初は高いNT-3発現が低下する一方、最初は低いBDNF発現が上昇することは、成体において最終的に達成され、それとは対照的にNGF発現はむしろ一定のままであった。興味深いことには、 NT-3発現は密に神経支配されず認めうるBDNF mRNA を発現しない臓器である肝および胸腺の発達中に増加する。

NGFR転写物の胚発現はニューロトロフィン遺伝子発現の上昇にみかけ上は先行し、初期脊髄中で著しく高く、脳の出生前発達中および心臓の出生後発達中に低下する（第16Ａ、Ｂ、Ｃ図）。

(2.3)新生および成体神経内でのNT-3、BDNF、 NGFおよびNGFRの発現の比較ラット神経系内でのニューロトロフィン遺伝子発現の空間的分布を特定し、かつ脳全体内での明確な発達プロフィールが別個の脳領域内での発達の変化とどのように関係しているかを理解するために、新生および成体脳内でのニューロトロフィン遺伝子の発現を調べた。３つの全因子はその発現パターンにおいて明確な空間的および時間的違いを示した（第17図）。末梢組織中での転写レベルを含む転写レベルの定量を第４図にグラフの形で示す。３個の全因子に共通の主要な類似点は、成体の海馬におけるそれらの一様に高いレベルの発現である。NT-3およびNGFの発現がそれらの広い分布においてより類似している（前記Maisonpierre ら）成体末梢組織での状況とは対照的に、成体脳内でNT-3およびBDNFは成体脳内でのそれらの全体的な発現パターンにおいて明らかに平行であることを示した（第17Ｂ、18Ｂ図）。興味深いことに、両因子は線条体には目立って存在していない。しかし、発現を新生および成体脳との間で比較したときに、NT-3およびBDNFは、最も興味深くかつ明らかに相反する違いをも示す（第17Ａ、Ｂ図および第18Ａ、Ｂ図）。新生物中でのNT-3の発現は最も高く、成体におけるよりも脳のより未成熟な領域（例えば小脳、海馬および新皮質）においてはるかに高い。BDNF発現はこれらの領域で最も低く、そしてより初期に成熟するより尾側の脳領域（即ち、後脳、中脳および間脳）において成体レベルと同様に最も高い。成体脳におけるように、新生線条体においてNT-3およびBDNFの転写物は検出できない。

NT-3およびBDNFと比較して、NGF mRNAレベルは新生対成体脳の比較においてあまり劇的でない相違を示す（第17図、18図）。臭神経NGFレベルは新生体においてより高いが、海馬および新皮質 NGFレベルは成体においてより高い。NGFR mRNA レベルは成体脳とは反対に新成体内で一般により高く、新生小脳および後脳において例外的に高かった（第17Ａ、Ｂ図）。

(2.4)解離CNS領域の発達中のNT-3、NGFおよび BDNF発現の調査 NT-3は個々のCNF領域の発達中に最も顕著に初期に発現される一方、BDNFは同じ領域の発達中に後で優勢に発現されることをさらに追跡するために、３つのCNS（その成熟は極めて異なる時間的経過に従う）の発達中のニューロトロフィン遺伝子発現を分析した。自然に起こる細胞死に迅速に従う神経組織発生は骨髄内で極めて初期に始まり（E12-E13）、誕生前の数日に完成する（AetmanおよびBayer,1984,上記）。これと対照的に、小脳および海馬中の大部分のニューロン（それらの小粒細胞集団により占められる）は誕生前に発生する（例えばAltman,1966,J.Comp.Neur. 128:431-474;Schlessingerら、1975,J.Comp. Neurol.159:149-176)。後で発達する小脳においては生涯の最初の３週間に広範囲な神経組織発生、神経芽細胞の移動およびニューロンの分化がある（例えばAltman,1966,上記）。海馬中のNGF mRNAレベルは誕生後約２週間までは容易に検出できるようにならないことが報告されており(Large ら、1986,Science 234:352-355）、この増加は広範囲の顆粒の細胞の増殖の周産期開始（例えば Altman,1966,上記）および基底前脳のコリン作動性ニューロンからの線維の侵入(KonおよびLoy, 1989,J.Neurosci.9:2999-3018)ののち長時間たってから起こるが、これらのニューロンのさらなる分化と一致する(Largeら、上記）。

発達中の骨髄の我々の研究（第５図Ａ、Ｅ図）により、誕生により減少し成体中ではほとんど検出できないE12-E13でのNT-3発現レベル(150〜280fg /μｇ全RNA)が高いことが示された。E12-E13でかろうじて検出できるBDNF mRNAは誕生時にピークであり（10-20fg/μｇ全RNA）、次いで成体中で減少する。NGF mRNAはE12-E13骨髄中で高レベルで発現されるが（15-25fg/μｇ全RNA）、同じ段階でのNT-3 mRNAレベルよりも10倍低いレベルにある。

興味深いことにNGFRは初期骨髄中で最高レベルで発現され、この発現は以前に初期骨髄中で新たに形成されたモーターニューロンの自然に起こる細胞死の時期と関係づけられた(Ernforsら、1989, Neuron 2:1605-1613)。

後で発達する小脳において（第19Ｂ、Ｆ図）著しく高レベルのNT-3 mRNA(500-820fg/μｇ全RNA）は誕生後の最初の３週間にわたって持続されるが、 BDNFはこの期間中に遅れて増加し始めるにすぎず、極めて低レベルのNGF発現は小脳発達の初期段階においてのみ検出できる。NGFRは小脳発達の初期に高レベルで発現され、次いで観察されたNT-3発現の低下に先立って低下する。

海馬において（第19Ｃ、Ｇ図）BDNFおよびNGF mRNAレベルの両方はE17での低レベルから誕生時の中レベルに上昇し、成体において最高レベルに達する。３つの全ニューロトロフィン転写物は成体海馬中で同様のレベルで発現されるが、NT-3発現はE17および新生海馬中のBDNFおよびNGFよりも著しく高く、新生海馬中のNT-3発現レベルは周産期小脳中で認められたレベル(820fg/μｇ全RNA）と同じく高い。ニューロトロフィンとは対照的に、 NGFR発現は海馬の発達中に低下する。

上記で検討した３つの全CNS領域においてNT-3 発現はそれらの発達中に著しく高く次いで成体レベルに低下するが、最初は低いBDNF mRNAレベルは上昇してNT-3の場合と同様に成体レベルに達する。NT-3およびBDNFの相反するプロフィールと対照的にNGF発現は一定のパターンを示さず、骨髄および小脳の発達中に初期に、しかし海馬の発達中に後で（低レベルではあるが）優先的に発現される。

(3)論考我々の分析は、３つのニューロトロフィン転写物の空間−時間的分布における類似性および相異の両方を示した。NT-3、BDNFおよびNGF転写物は全て、ラット胚形成の第11日目と第12日目の間にそれらの発現の同時増大を示し、12日および13日令の胚に広く分布している。発現のこの共通して突発するタイミングは神経組織形成の発達開始とほぼ同時に起こる（例えばAltmanおよびBayer, 1982,上記；AltmanおよびBayer,1984,上記）。

この関連は、３つのニューロトロフィンが神経系に対して特に重要な発達期の役割を果し、そしてすべてのニューロトロフィンが有糸核分裂後のニューロンの生存を維持するために一般的に必要とされるものに初めてなる時期を示すという概念を支持する。しかしながら、それらの発現のタイミングは、発達中の神経系におけるニューロトロフィンの他の役割をも示しうるであろう（下記参照）。

遺伝子発現の開始は３つのニューロトロフィンに関して同時に起るが、それらが初期の胚において達するレベルはおおいに異なる。NT-3 mRNAは胚において断然最とも豊富である。一方、BDNF mRNAは、最も低いレベルで発現される。NT-3とBD NF発現とのこの対照性は検査したほとんどすべての例において持続する。発達中には、NT-3発現はニューロンおよびその前駆体の増殖、移動および分化が進行しているCNS領域においてもっとも顕著であり、それらが成熟するにしたがいCNS領域内で一般に劇的に減少する。それとは対照的に新生児におけるBDNF発現は神経組織形成がすでに起こっているCNS領域においてもっとも顕著であり、それらが成熟するにしたがい、CNS領域内で一般に増大する。興味深いことに、NT-3およびBDNF転写物が種々の成体CNS領域において最終的に達するレベルは全く同様である。発達中のNT-3およびBD NF発現間の相反する関係は、成体CNSにおけるそれらの比較的類似するプロフィールと一緒になって、NT-3およびBDNFはある場合においてCNSにおける同じニューロン集団に作用するであろうことを示す。もしそうならば、我々のデータは、NT-3 がこれらのニューロン発達中（たぶん標的神経支配の確立中）に重要な役割を果す一方、BDNFは同じニューロンの生涯における後期に（すなわち、成熟または維持因子として）圧倒的に作用するかもしれないということを示唆するであろう。発達中のNGF発現は領域によって変化するが、これらの変化はNT-3およびBDNFのそれが行うような一貫したパターンに従わない。NGFR mRNAレベルは３つのニューロトロフィン遺伝子のいずれの発現をも特異的に反映しないが、それが個々のニューロトロフィンレセプターの共通成分として働らくかもしれないという可能性と一致する（Rodriguez- Tebarら、1990,Neuron 4:487-492)。NGFR発現はCNS領域の発達期の初期に最高になるという傾向を確かに有し、我々の研究は発達により調節されたNGFR発現の興味ある変化を明らかにし、それはさらに調査する課題である。

成体CNS内のそれらの同様な分布と対照的に、 NT-3およびBDNFは成体末梢組織内で顕著に異なるパターンの発現を有する。すなわちNT-3転写物のより広い末梢分布はBDNFよりも末梢におけるより広い（および異なる）範囲の（ニューロンならびに非ニューロン）細胞への作用を反映するであろう（Maisonpierreら、上記）。

NGFおよびBDNFの両方は神経系の発達期において重要な初期の役割を果すことを示唆するかなりの証拠があるが、我々の分析は著しく高いNT-3発現と初期のニューロンの発達との間によりいっそう一貫した印象的な相互関係を明らかにする。発達中の小脳および新生の海馬におけるNT-3 mRNA レベルは、任意の他の組織または脳の領域におけるどのニューロトロフィンのレベルよりも数倍高く、そして成体脳のどのニューロトロフィンのレベルよりも20倍以上高い。少なくともいくつかの BDNF-およびNGF-依存性のニューロンを支持することができ（Maisonpierreら、上記）、その時間的発現がニューロン発達の重要な時期と最も明確に平行する新規なNGF関連タンパク質としてNT-3 が発見されたことは、NT-3が、以前はBDNFまたは NGFに帰された発達上重要な機能のいくつかに通常原因がある生理的作用物質であるという可能性を生じる。これらの関連因子に対する抗体は交叉反応をする可能性があるので(Whittemoreおよび Seiger,1987,Brain Res.Rev.12:439-464）、このファミリーの全メンバーの真の発達上の役割の再調査がさらに強調される。

我々は、NT-3は古典的ニューロン生存分子として作用することができ（Maisonpierreら、上記）、 NT-3の作用は標的由来因子の限定された発現がニューロン選択および取り除きという結果を生じるその因子と考えられることを以前に示したが、このことはNT-3（ならびに他のニューロトロフィン）にとって他の発達上重要な役割を決して除外するものではない。発達中の神経系内のNT-3発現のパターンはネスティン(nestin)（新規な中間体フィラメントタンパク質であってその発現は神経組織形成を行うCNS領域に特徴的である）(Lendahlら、 1999)およびSNAP（初期神経突起伸長の抗原性マーカーYamamotoら、1986,J.Neurosci.6:357 6-3594）のパターンとの顕著な類似性を共有する。

NGFの場合と異なり（Cleggら、1989,Devel. Biol.134:30-37)、高レベルのNT-3発現は心臓への交感神経繊維の到達に先んじる。したがって、 NT-3はニューロン生存以外の発達過程に特に結びついているかもしれない。これには例えばニューロン前駆体の増殖／分化および／または移動する細胞まはそれらの軸索の案内が包含される。NT-3 がかかるありうる生理的役割を果すことのさらなる示唆は、ニューロトロフィンの１つ（すなわち NGF）はインビトロでニューロン前駆体増殖において役割を果しうるという最近の発見から来る。逆にBDNFは、発達期の初期に存在するが、ニューロンの死および選択の開始時期のずっと後に一般にさらに重要な役割を有するであろう。

成体における全３種のニューロトロフィンの発現プロフィルは劇的な類似性を共有する。全３種のニューロトロフィンは成体海馬中で比較的高レベルで発現される。基底前脳コリン作動性ニューロンの海馬への突出を破壊すると、萎縮およびこれらニューロンによる伝達体合成の低下を生ずる（総説としてSniderおよびJohnson,1989,Ann. Neruol.16:489-506）。同様の萎縮は加令ラットおよびアルツハイマー病のヒトの記憶特異的作業における低い性能と関連している。基底前脳コリン作動性ニューロンの萎縮はNGFの投与によりラットモデルで逆転できる。ここに示されるデータは、成体海馬が通常は全３種のニューロトロフィンを基底前脳に供給しうる可能性と一致しており、このことは培養コリン作動性ニューロンに及ぼす NGFおよびBDNFの相補的作用に関する最近の証拠がこれら分子の真正の生理学的役割を反映するものであることを示唆している。しかしながら、NT -3発現は海馬の発達の非常に初期では顕著に高く、次にNGFおよびBDNFのそれらと類似した成体レベルまで低下する。この初期の高い発現も、基底前脳または他の海馬求心部からの初期連結の案内または確立において、または菌状顆粒細胞前駆体の増殖において特有の役割を果している可能性を示唆している。海馬発達初期のNGFレベルが比較的低いことはNGFに関するかかる役割にさからって論議されている(Largeら、前出）。

微生物の寄託下記のものを米国、メリーランド州20852、ロックビルRockville パークローンドライブ12301 のAmerican Type Culture Collection 1990，２月 28日に寄託した。

本発明は本明細書に記載された詳細な態様により範囲を限定されるべきでない。事実、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の変更態様が明細書並びに添付図面から当業者には明らかであろう。かかる変更態様は本発明の特許請求の範囲に包含される。種々の刊行物が本明細書に引用されており、その開示はすべて参考文献として本明細書に取り込まれている。

【図面の簡単な説明】

第１図は種々の種に由来するBDNFおよびNGFの配列を比較して示す。第２図はマウスNT-3のゲノム配列および推定アミノ酸配列を示す。第３図は成熟マウスNT-3、NGFおよびBDNFのアミノ酸配列を比較して示す。第４図はマウスにおけるNT-3 mRNAの組織分布を示す。第５図はニワトリ胚の節状神経節から単離された感覚性ニューロンの生存を示す。第６図はラットNT-3の検出及びそのゲノムクローンの制限地図を示す。 (A)新規遺伝子NT-3の検出； (B)ラットNT-3ゲノムクローンの制限地図。第７図はラットNT-3の配列、およびラットNGF とラットBDNFに対するその相同性を示す。 (A)はNT-3のヌクレオチドおよびアミノ酸配列； (B)ラットNGFおよびラットBDNFとラットNT-3との配列比較； (C)相同領域IおよびIIに於けるNT-3、NGFおよびBDNFの配列比較。第８図は外植したニワトリ胚（８日）の神経節でアッセイしたNGF、BDNF、およびNT-3活性の比較。第９図はDGRニューロンの生存および神経突起成長に対するNT-3の効果を示す。第10図は齧歯類組織に於けるNT-3、NGF、およびBDNF発現のノーザンブロットによる比較を示す。第11図はラットおよびヒトNT-3遺伝子のDNA配列を比較して示す。第12図は代謝標識によって検出されたヒトNT-3 ポリペプチドの発現を示す。第13図．NT-3上精の無い場合（０）、および、 NT-3含有上精の1:300,1:100,1:50および1:25希釈の場合の培養物あたりの生存チロシンヒドロキシラーゼ細胞数を示す棒グラフ、第14図、１皿あたり900,000細胞密度であることを除き第１３図の説明に記載したのと同じ棒グラフ、第15図ＡはNT-3、BDNFおよびNGF合成転写物を比較した図、Ｂは規定の合成RNA標準物と比較した、成体ラット脳から調製した全RNA中のNT-3、 BDNFおよびNGF mRNAレベルの決定した図、第16図はラット胚(A)、発達中のラット脳(B) および選択された分娩時の生体組織(C)から調製された全RNA（10μｇ／レーン）中で発現された NT-3、BDNF、NGFおよびNRNA遺伝子を示す図、第17図は新生(A)および成体(B)神経系の別個の領域から調製した全RNA（10μｇ／レーン）中でのNT-3、BDNF、NGFおよびNRNA遺伝子発現を示す図、第18図は新生および成体CNS領域および末梢組織におけるNT-3、BDNF、およびNGF転写レベルの定量を示す図、第19図は脊髄(A,B)、小脳(B,F)および海馬（Ｃ，Ｇ）の発達中のNT-3、BDNF、NGFおよびNGFR遺伝
子発現を示す図、である。

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【手続補正書】

【提出日】平４．９．７ (1)別紙の通り (2)別紙の通り (3)別紙の通り（図面の浄書につき実体的内容に変更
なし） (4)明細書第１８１頁下から第２行目「を示す。」を
「を示す電気泳動写真である。」と補正する。明細書第１８２頁第２行目「第６図はラットＮＴの
検出及び……」を「第６図はラットＮＴの検出を表す電
気泳動写真及び……」と補正する。同頁第４行目「(A)新規遺伝子ＮＴ−３の検出；」
を「(A)新規遺伝子ＮＴ−３の検出を表す電気泳動写
真；」と補正する。同頁第１４行目「……ＮＴ−３活性の比較。」を
「……ＮＴ−３活性の比較を示す生物の形態写真であ
る。」と補正する。同頁第１６行目「成長に対するＮＴ−３の効果を示
す。」を「成長に対するＮＴ−３の効果を示す生物の形
態写真である。」と補正する。同頁下から３行目「……による比較を示す。」を
「……による比較を示す電気泳動写真である。」と補正
する。明細書第１８３頁第２行目「ポリペプチドの発現を
示す。」を「ポリペプチドの発現を示す電気泳動写真で
ある。」と補正する。同頁第１１行目「比較した図、……」を「比較した
電気泳動写真、……」と補正する。同頁第１３行目「……決定した図、」を「……決定
した電気泳動写真、」と補正する。同頁下から４行目「……ＮＲＮＡ遺伝子を示す
図、」を「……ＮＲＮＡ遺伝子を示す電気泳動写真であ
る。」と補正する。明細書第１８４頁第１行目「定量を示す図、」を
「定量を示す電気泳動写真である。」と補正する。同頁末行「伝子発現を示す図、である。」を「伝子
発現を示す電気泳動写真である。」と補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＭ 8314−4Ｃ 39/395 Ｄ 8413−4ＣＣ０７Ｋ 13/00 8619−4ＨＣ１２Ｎ 1/19 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 999999999 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッドアメリカ合衆国ニューヨーク州 10591・タリイタウン・オールド・ソー・ミル・リヴァー・ロード 777 (72)発明者アンドレアス・ホーンドイツ連邦共和国 8000ミュンヘン70・ムルナウエルシュトラーセ 252 (72)発明者ヨアヒム・ライブロックドイツ連邦共和国 8035ガウチング・ハングシュトラーセ 32アー (72)発明者カレン・バイレイドイツ連邦共和国 8000ミュンヘン70・レナウシュトラーセ 10 (72)発明者イフェス―アライン・バルデドイツ連邦共和国 8000ミュンヘン70・スティフツボーゲン 18 (72)発明者ハンス・フリードリッヒ・エルヴィン・テーネンドイツ連邦共和国 8000ミュンヘン40・クレペリンシュトラーセ４アー (72)発明者ペーター・シー・マイソンピールアメリカ合衆国ニューヨーク州 10566・ピークスキル・ホロウブルック・レーン 19 (72)発明者マーク・イー・フースアメリカ合衆国ニューヨーク州 10803・ペルハム・ハイブルック・アベニュー 54 (72)発明者ロナルド・エム・リンドセイアメリカ合衆国ニューヨーク州 10510・ニューヨーク・ブライアークリフ・チャッパクア・ロード 479 (72)発明者ジョージ・ヤンコプロスアメリカ合衆国ニューヨーク州 10032・ニューヨーク・アパートメント４エー・ヘヴン・アベニュー 100

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）を
コードする核酸配列または少なくとも約１０ヌクレオチドを含有するそのサブ配列を含んでなる、組み換えＤＮＡ分子。
【請求項２】ニューロトロフィン−３をコードする核
酸配列またはサブ配列が実質的に第２図に示されるヌクレオチド約５９８から約９５４までである、請求項１記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項３】ニューロトロフィン−３をコードする核
酸配列またはサブ配列が実質的に第７図に示されるヌクレオチド約５０８から約８６４までである、請求項１記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項４】ニューロトロフィン−３をコードする核
酸配列またはサブ配列が実質的に第１１図に示されるヌクレオチド約５３０から約８８６までである、請求項１記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項５】ｃＤＮＡ配列を含んでなる、請求項１、
２、３、または４記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項６】ゲノムＤＮＡ配列を含んでなる、請求項
１、２、３、または４記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７】実質的に第１１図に示されるヒトＤＮＡ
配列またはサブ配列を含んでなる請求項１記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項８】 ATCCに寄託され、受託番号40765号を有
するプラスミドpC8-rN3(P1)に含有される、請求項３記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項９】 ATCCに寄託され、受託番号40765号を有
するプラスミドpC8-hN3(P1)に含有される、請求項４記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項１０】 ATCCに寄託され、受託番号40763号を
有するバクテリオファージφrN3(G1)に含有される、請求項４記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項１１】請求項１、２、３、または４記載の組
み換えＤＮＡ分子に相補的な組み換えリボ核酸分子。
【請求項１２】第２図に示されるアミノ酸配列と実質
的に相同のタンパク質をコードする配列を含有する核酸配列またはその一部分。
【請求項１３】第１１図に示されるアミノ酸配列と実
質的に相同のタンパク質をコードする配列を含有する核酸配列またはその一部分。
【請求項１４】第１１図に示される核酸配列と実質的
に相同の配列を含有する核酸配列またはそのハイブリッド形成可能な部分。
【請求項１５】ニューロトロフィン−３タンパク質ま
たはそのペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現が、組み換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中においてニューロトロフィン−３タンパク質またはペプチドが発現されるように第２の核酸配列により調節されるものである、請求項１または４記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項１６】 ATCCに寄託され、受託番号40765号を
有するプラスミドpC8-hN3(P1)に含有される、請求項１５記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項１７】請求項１記載のＤＮＡ分子を含んでな
る核酸ベクター。
【請求項１８】請求項１、２、３、または４記載のＤ
ＮＡ分子を含有する組み換え微生物。
【請求項１９】細菌である請求項１８記載の組み換え
微生物。
【請求項２０】酵母である請求項１８記載の組み換え
微生物。
【請求項２１】請求項１５記載の組み換えＤＮＡ分子
を含有する細胞。
【請求項２２】請求項１６記載の組み換えＤＮＡ分子
を含有する細胞。
【請求項２３】実質的に第２図に示されるアミノ酸配
列をコードする配列、または抗原決定基を含有するそのサブ配列を含んでなる核酸配列。
【請求項２４】実質的に第２図に示されるアミノ酸配
列または抗原決定基を含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項２５】実質的に第７図に示されるアミノ酸配
列または抗原決定基を含有するそのサブ配列を含有する精製タンパク質。
【請求項２６】実質的に第１１図に示されるアミノ酸
配列または抗原決定基を含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項２７】実質的に第２図に示されるアミノ酸約
１４０から約２５８までを含有するアミノ酸配列または抗原決定基を含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項２８】実質的に第７図に示されるアミノ酸約
１から約１１９までを含有するアミノ酸配列または抗原決定基を含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項２９】実質的に第１１図に示される成熟タン
パク質配列のアミノ酸約１から約１１９までを含有するアミノ酸配列または抗原決定基を含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項３０】実質的に第２図に示されるマウスニュ
ーロトロフィン−３に関する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列または機能的に活性なペプチドを含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項３１】実質的に第７図に示されるラットニュ
ーロトロフィン−３に関する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列または機能的に活性なペプチドを含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項３２】実質的に第１１図に示されるヒトニュ
ーロトロフィン−３に関する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列または機能的に活性なペプチドを含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項３３】実質的に第１１図に示される成熟タン
パク質配列のアミノ酸約１から約１１９までを含有するアミノ酸配列または機能的に活性なペプチドを含有するそのサブ配列を有する精製タンパク質。
【請求項３４】請求項１記載のＤＮＡ分子を含有する
組み換え微生物を該ＤＮＡ分子が微生物による発現されるように増殖させ；そして発現されたニューロトロフィン−３タンパク質またはそのフラグメントを単離することからなる、ニューロトロフィン−３タンパク質またはそのフラグメントの製法。
【請求項３５】請求項１または４記載のＤＮＡ分子を
含有する組み換え宿主を該ＤＮＡ分子が微生物によって発現されるように増殖させ；そして発現されたニューロトロフィン−３タンパク質またはそのフラグメントを単離することからなる、ニューロトロフィン−３タンパク質またはそのフラグメント製法。
【請求項３６】 (a) 請求項１５記載のＤＮＡ分子を
含有する組み換え宿主を該ＤＮＡ分子がかかる微生物により発現されるような条件の下に増殖させ、そして、 (b) 発現されたニューロトロフィン−３タンパク質またはそのフラグメントを単離することからなる、ニューロトロフィン−３タンパク質またはそのフラグメントの製法。
【請求項３７】 (a) 請求項１６記載のＤＮＡ分子を
含有する組み換え宿主を該ＤＮＡ分子が微生物により発現されるような条件下に増殖させ、そして、 (b) 発現されたニューロトロフィン−３タンパク質またはそのフラグメントを単離することからなる、ニューロトロフィン−３タンパク質またはそのフラグメントの製法。
【請求項３８】宿主が真核生物細胞である請求項３６
記載の方法。
【請求項３９】宿主がヒト以外のトランスジェニック
動物である請求項３６記載の方法。
【請求項４０】宿主が微生物である請求項３６記載の
方法。
【請求項４１】宿主が細菌である請求項４０記載の方
法。
【請求項４２】宿主が酵母である請求項４０記載の方
法。
【請求項４３】請求項３５記載の方法による生産物。
【請求項４４】請求項３６記載の方法による生産物。
【請求項４５】請求項３７記載の方法による生産物。
【請求項４６】請求項３８記載の方法による生産物。
【請求項４７】請求項３９記載の方法による生産物。
【請求項４８】請求項４０記載の方法による生産物。
【請求項４９】請求項４１記載の方法による生産物。
【請求項５０】請求項４２記載の方法による生産物。
【請求項５１】グリコシル化されていない請求項３５
記載の生産物。
【請求項５２】グリコシル化されていない請求項３６
記載の生産物。
【請求項５３】グリコシル化されていない請求項３７
記載の生産物。
【請求項５４】グリコシル化されていない請求項３８
記載の生産物。
【請求項５５】グリコシル化されていない請求項３９
記載の生産物。
【請求項５６】グリコシル化されていない請求項４０
記載の生産物。
【請求項５７】グリコシル化されていない請求項４１
記載の生産物。
【請求項５８】グリコシル化されていない請求項４２
記載の生産物。
【請求項５９】グリコシル化されている請求項３５記
載の生産物。
【請求項６０】グリコシル化されている請求項３６記
載の生産物。
【請求項６１】グリコシル化されている請求項３７記
載の生産物。
【請求項６２】グリコシル化されている請求項３８記
載の生産物。
【請求項６３】グリコシル化されている請求項３９記
載の生産物。
【請求項６４】グリコシル化されている請求項４０記
載の生産物。
【請求項６５】グリコシル化されている請求項４１記
載の生産物。
【請求項６６】グリコシル化されている請求項４２記
載の生産物。
【請求項６７】ニューロトロフィン−３タンパク質、
そのペプチドフラグメントまたは誘導体を認識する抗体、抗体フラグメントまたはその誘導体。
【請求項６８】ニューロトロフィン−３タンパク質、
そのフラグメント、または誘導体をコードする組み換え核酸ベクターを発現する組み換え生物を増殖させることにより生産されるニューロトロフィン−３タンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導体を用いて宿主動物を免疫化することからなる方法により生成されるものである請求項６７記載の抗体、抗体フラグメントまたは誘導体。
【請求項６９】核酸ベクターが実質的に第２図に示さ
れる核酸配列またはそのサブ配列を含有する、請求項６８記載の抗体、抗体フラグメントまたは誘導体。
【請求項７０】核酸ベクターが実質的に第７図に示さ
れる核酸配列またはそのサブ配列を含有する、請求項６８記載の抗体、抗体フラグメントまたは誘導体。
【請求項７１】核酸ベクターが実質的に第１１図に示
される核酸配列またはそのサブ配列を含有する、請求項６８記載の抗体、抗体フラグメントまたは誘導体。
【請求項７２】 (a)ＢＤＮＦ／ＮＧＦ遺伝子ファミリ
ーの二つの異なった既知メンバーと相同の第１のアミノ酸配列、及び(b)(a)のＢＤＮＦ／ＮＧＦ遺伝子ファミリーの二つの異なったメンバーと相同でない第２のアミノ酸配列、を含有するタンパク質またはペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７３】既知メンバーの一つがＢＤＮＦである
請求項７２記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７４】既知メンバーの一つがＮＧＦである請
求項７２記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７５】既知メンバーの一つがニューロトロフ
ィン− ３である請求項７２記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７６】 (a)多様な核酸配列の中から、ＢＤＮ
Ｆ及びＮＧＦの双方と相同な配列を選択し、そして、 (b)(a)で選択された核酸配列の中からＮＧＦ及びＢＤＮＦと相同でない少なくとも約６の連続したヌクレオチドからなる配列を含有する配列を同定する、ことからなる方法により単離される、請求項７２記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７７】 (a)の工程が、センス鎖プライマーが
ＢＤＮＦ及びＮＧＦの第１の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成できそしてアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーがＢＤＮＦ及びＮＧＦの第２の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成できるように、ＢＤＮＦ及びＮＧＦ双方のＤＮＡの相同区域とハイブリッド形成し得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応技術を用いるものである、請求項７６記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７８】 (a)多様な核酸配列の中から、ＢＤＮ
Ｆ及びニューロトロフィン−３の双方と相同な配列を選択し、そして、 (b)(a)において選択された核酸配列の中からＢＤＮＦ及びニューロトロフィン−３と相同でない少なくとも約６の連続したヌクレオチドの配列を含有する配列を同定する、ことからなる方法により単離される、請求項７２記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項７９】 (a)の工程が、センス鎖プライマーが
ＢＤＮＦ及びニューロトロフィン−３の第１の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成できそしてアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーがＢＤＮＦ及びニューロトロフィン−３の第２の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るように、ＢＤＮＦ及びニューロトロフィン−３双方のＤＮＡの相同領域とハイブリッド形成し得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応技術を用いるものである、請求項７６記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項８０】 (a) 多様な核酸配列の中から、ＮＧ
Ｆ及びニューロトロフィン−３の双方と相同な配列を選択するし、そして、 (b) (a)において選択された核酸配列の中からＮＧＦ及びニューロトロフィン−３と相同でない少なくとも約６の連続したヌクレオチドの配列を含有する配列を同定する、ことからなる方法により単離される、請求項７２記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項８１】 (a)の工程が、センス鎖プライマーが
ＮＧＦ及びニューロトロフィン−３の第１の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成できそしてアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーがＮＧＦ及びニューロトロフィン−３の第２の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るように、ＮＧＦ及びニューロトロフィン−３双方のＤＮＡの相同領域とハイブリッド形成し得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応技術を用いるものである、請求項７６記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項８２】製剤上適する担体中の実質的に純粋な
ニューロトロフィン−３タンパク質の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項８３】製剤上適する担体中の実質的に純粋
な、機能的に活性なニューロトロフィン−３ペプチドフラグメントまたは誘導体の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項８４】製剤上適する担体中の抗原決定基を担
持する実質的に純粋なニューロトロフィン−３ペプチドフラグメントまたは誘導体の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項８５】ニューロトロフィン−３ペプチドフラ
グメントまたは誘導体が、実質的に第２図に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を含有する、請求項８２、８３または８４記載の医薬組成物。
【請求項８６】ニューロトロフィン−３ペプチドフラ
グメントまたは誘導体が、実質的に第７図に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を含有する、請求項８２、８３または８４記載の医薬組成物。
【請求項８７】ニューロトロフィン−３ペプチドフラ
グメントまたは誘導体が、実質的に第１１図に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を含有する、請求項８２、８３または８４記載の医薬組成物。
【請求項８８】ニューロンの生存を高め得る、請求項
８７記載の医薬組成物。
【請求項８９】ニューロンの成長を増進し得る、請求
項８７記載の医薬組成物。
【請求項９０】分化した細胞機能を支援し得る、請求
項８７記載の医薬組成物。
【請求項９１】タンパク質、ペプチドまたは誘導体が
グリコシル化されている、請求項８７記載の医薬組成物。
【請求項９２】タンパク質、ペプチドまたは誘導体が
グリコシル化されていない、請求項８７記載の医薬組成物。
【請求項９３】ニューロトロフィン−３タンパク質、
そのペプチドフラグメントまたは誘導体を認識する抗体の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項９４】実質的に純粋なニューロトロフィン−
３タンパク質またはそのペプチドフラグメントまたは誘導体と第２の薬剤との組合せ物の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項９５】第２の薬剤が神経成長因子である、請
求項９４記載の医薬組成物。
【請求項９６】第２の薬剤が脳由来神経栄養因子であ
る、請求項９４記載の医薬組成物。
【請求項９７】第２の薬剤がＢＤＮＦ／ＮＧＦファミ
リーの他のメンバーである、請求項９４記載の医薬組成物。
【請求項９８】請求項７２、７６、７８または８０記
載の組み換えＤＮＡ分子。によりコードされるタンパク質またはそのペプチドまたは誘導体の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項９９】 (a) ハイブリダイゼーションが生じ
得る条件下で、実質的に第１１図に示される少なくとも１０個のヌクレオチドを含有する検出可能に標識された核酸分子に組織を接触させ、そして、 (b) 生じたすべてのハイブリダイゼーションを検出する、ことからなる神経系の疾患または障害の診断法。
【請求項１００】 (a) ハイブリダイゼーションが生
じ得る条件下で、実質的に第１１図に示される少なくとも１０個のヌクレオチドを含有する検出可能に標識された核酸分子に、組織から収集したＲＮＡを接触させ、そして、 (b) 生じたすべてのハイブリダイゼーションを検出する、ことからなる神経系の疾患または障害の診断法。
【請求項１０１】 (a) ハイブリダイゼーションが生
じ得る条件下で、実質的に第１１図に示される少なくとも１０個のヌクレオチドを含有する検出可能に標識された核酸分子に、組織から収集したＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを接触させ、そして、 (b) 生じたすべてのハイブリダイゼーションを検出する、ことからなる神経系の疾患または障害の診断法。
【請求項１０２】神経系の疾患または障害が腫瘍、変
性性疾患および感覚性ニューロン疾患からなる群から選択される請求項９９、１００または１０１いずれかに記載の方法。
【請求項１０３】 (a) 結合が生じ得る条件下で、ニ
ューロトロフィン−３タンパク質またはそのペプチドフラグメントまたは誘導体を結合し得る検出可能に標識された抗体分子に組成を露出させ、そして、 (b) 生じたすべての結合を検出する、ことからなる神経系の疾患または障害の診断法。
【請求項１０４】インビボで実施される請求項１０３
記載の方法。
【請求項１０５】インビトロで実施される請求項１０
３記載の方法。
【請求項１０６】神経系の疾患または障害が腫瘍、変
性性疾患および感覚性ニューロン疾患からなる群から選択される請求項１０３記載の方法。
【請求項１０７】有効量のニューロトロフィン−３タ
ンパク質、または機能的に活性なそのペプチドフラグメントまたは誘導体を患者に投与することからなる、神経系の疾患または障害の治療法。
【請求項１０８】神経系の疾患または障害が変性性疾
患である、請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】変性性疾患がアルツハイマー病、ハ
ンチントン舞踏病、多発性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項107 記載の方法。
【請求項１１０】神経系の疾患または障害が神経系に
対する損傷からなる、請求項１０７記載の方法。
【請求項１１１】損傷が抹消神経障害からなる、請求
項110記載の方法。
【請求項１１２】損傷が糖尿病性神経障害からなる、
請求項110 記載の方法。
【請求項１１３】損傷がアルコール性神経障害からな
る、請求項110記載の方法。
【請求項１１４】損傷が後天性免疫不全症候群関連神
経障害からなる、請求項110記載の方法。
【請求項１１５】損傷が外傷、手術、梗塞、感染およ
び悪性腫瘍からなる群から選ばれる事象によって引き起こされたものである、請求項１１０記載の方法。
【請求項１１６】疾患または障害が有毒導剤への露出
により惹起されたものである、請求項１１０記載の方法。
【請求項１１７】疾患または障害が栄養不全により惹
起されたものである、請求項１１０記載の方法。
【請求項１１８】障害が先天性障害により惹起された
ものである、請求項１０７記載の方法。
【請求項１１９】ニューロトロフィン−３タンパク
質、または機能的に活性なそのペプチドフラグメントまたは誘導体と第２の薬剤との組み合せ物の有効量を投与することからなる、神経系の疾患または障害の治療法。
【請求項１２０】第２の薬剤が神経成長因子である、
請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】第２の薬剤が脳由来神経栄養因子で
ある、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２２】第２の薬剤がＢＤＮＦ／ＮＧＦファ
ミリーの他のメンバーである、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２３】疾患または障害が変性性疾患であ
る、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２４】変性性疾患がアルツハイマー病、ハ
ンチントン舞踏病、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項１２３記載の方法。
【請求項１２５】疾患または障害が神経系への損傷か
らなる、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２６】障害が外傷、手術、梗塞、感染およ
び悪性腫瘍からなる群から選択される事象によって引き起こされた損傷である、請求項１２５記載の方法。
【請求項１２７】疾患または障害が末梢神経障害から
なる、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２８】疾患または障害が先天性障害からな
る、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２９】 (a) 多様な核酸配列の中から、Ｂ
ＤＮＦ及びＮＧＦの双方と相同な配列を選択し、 (b) (a)において選択された核酸配列の中からＮＧＦ及びＢＤＮＦと相同でない少なくとも約６の連続したヌクレオチドの配列を含有する配列を同定し、そして、 (c) (b)で同定された配列を単離する、ことからなる、脳由来神経栄養因子／神経成長因子遺伝子ファミリーのメンバーではあるが神経成長因子も脳由来神経栄養因子もコードしない遺伝子を単離する方法。
【請求項１３０】 (a)の工程が、センス鎖オリゴヌク
レオチドプライマーがＢＤＮＦ及びＮＧＦの第１の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成できそしてアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーがＢＤＮＦ及びＮＧＦの第２の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るように、ＢＤＮＦおよびＮＧＦのＤＮＡの同相領域とハイブリッド形成し得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応技術を用いるものである、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３１】 (a) 多様な核酸配列の中から、Ｂ
ＤＮＦ及びニューロトロフィン−３の双方と相同な配列を選択し、 (b) (a)において選択された核酸配列の中からＢＤＮＦ及びニューロトロフィン−３と相同でない少なくとも約６の連続したヌクレオチドの配列を含有する配列を同定し、そして、 (c) (b)で同定された配列を単離する、ことからなる脳由来神経栄養因子／神経成長因子遺伝子ファミリーのメンバーではあるが神経成長因子も脳由来神経栄養因子もコードしない遺伝子を単離する方法。
【請求項１３２】 (a)の工程が、センス鎖オリゴヌク
レオチドプライマーがＢＤＮＦ及びニューロトロフィン− ３の第１の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成できそしてアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーがＢＤＮＦ及びニューロトロフィン −３の第２の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るように、ＢＤＮＦ及びニューロトロフィン−３のＤＮＡの相同領域とハイブリッド形成し得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応技術を用いるものである、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３３】 (a) 多様な核酸配列の中から、Ｎ
ＧＦ及びニューロトロフィン−３の双方と相同な配列を選択し、 (b) (a)で選択された核酸配列の中からＮＧＦ及びニューロトロフィン−３と相同でない少なくとも約６の連続したヌクレオチドの配列を含有する配列を同定し、そして、 (c) (b)で同定された配列を単離する、ことからなる、脳由来神経栄養因子／神経成長因子遺伝子ファミリーのメンバーではあるが神経成長因子も脳由来神経栄養因子もコードしない遺伝子を単離する方法。
【請求項１３４】 (a)の工程が、センス鎖オリゴヌク
レオチドプライマーがＢＤＮＦ及びニューロトロフィン− ３の第１の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成できそしてアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーがＢＤＮＦ及びニューロトロフィン −３の第２の相同ＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るように、ＮＧＦ及びニューロトロフィン−３のＤＮＡの相同領域とハイブリッド形成し得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応技術を用いるものである、請求項１３３記載の方法。
【請求項１３５】ニューロトロフィン−３の長い前駆
体形をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１５記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項１３６】ニューロトロフィン−３の長い前駆
体形をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１６記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項１３７】疾患または障害がパーキンソン病で
ある、請求項１０７記載の方法。
【請求項１３８】ドパーミン作動性ニューロンを有効
濃度のニューロトロフィン−３に暴露することを包含する、ドパーミン作動性ニューロンの生存を促進する方法。
【請求項１３９】有効量のNT-3をかかる治療を必要と
する患者に投与することを含有する、神経系発達の障害を治療する方法。
【請求項１４０】有効量のNT-3をかかる治療を必要と
する患者に投与することを包含する、神経系の悪性障害を治療する方法。