DE69333229T2

DE69333229T2 - Verfahren zur reinigung eines neurotrophen faktors aus pigmentiertem retinalen epithelgewebe

Info

Publication number: DE69333229T2
Application number: DE69333229T
Authority: DE
Inventors: V. Lincoln JOHNSON; Joyce Tombran-Tink
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-06-04
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2013-06-05
Also published as: JP2005112863A; JPH07508646A; EP0662087A1; DE69333229D1; EP0662087A4; CA2137377C; WO1993024529A1; AU4406993A; JP2004262947A; EP0662087B1; EP1415994A1; CA2137377A1

Description

Sachgebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Reinigung eines neurotrophen Faktors aus dem pigmentierten Netzhautepithel (PEDNF).
Hintergrund der Erfindung
Viele Arten von Neuronen sind für ihr Überleben und ihr Wohlergehen von der Verfügbarkeit spezieller regulatorischer Moleküle, bekannt als neurotrophe Faktoren, abhängig. Der am besten charakterisierte neurotrophe Faktor ist der Nerven-Wachstumsfaktor (NGF). NGF reguliert das Überleben und die spezialisierte Funktion der sympathischen und der Dorsalwurzelganglion-Neuronen im peripheren Nervensystem und von einigen cholinergen Neuronen im Zentralnervensystem. Trophische Faktoren, die auf andere Neuronen wirken, wurden ebenfalls identifiziert und zwei solcher Faktoren, der ciliäre neurotrophe Faktor (CNTF) und der neurotrophe Faktor aus dem Hirn (BDNF) wurden gereinigt. Außerdem wurde unlängst gezeigt, dass einige Wachstumsfaktoren, wie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), die ursprünglich aufgrund ihres mitogenen Effekts auf Zellen identifiziert wurden, auch als überlebensfördernde Agenzien für Neuronen fungieren. Postsynaptische Zielzellen und Satellitenzellen wie Gliazellen scheinen die Hauptquellen der neurotrophen Faktoren zu sein. Es wurde vorgeschlagen, dass das Überleben der Photorezeptorzellen der Netzhaut ebenfalls durch spezifische neurotrophe Faktoren reguliert sein könnte. Ein Hinweis unter anderen, die diese Annahme unterstützen, ist die Beobachtung, dass Photorezeptoren in einigen Arten im Entwicklungsverlauf einen neuronalen Zelltod unterlaufen, ein Phänomen, von dem allgemein angenommen wird, dass es die beschränkte Verfügbarkeit von neurotrophen Faktoren widerspiegelt. Es wurde auch gezeigt, dass für die Entwicklung von Photorezeptoren, sowie auch für die Erhaltung ihrer normalen Funktion, eine Wechselwirkungen mit dem Pigmentepithel der Netzhaut (RPE) stattfinden müssen, was darauf hinweist, dass Moleküle oder Faktoren aus dem RPE für die Funktion und das Überleben der Photorezeptoren notwendig sein könnte.
Das RPE entwickelt sich zeitlich vor der neuralen Netzhaut und grenzt an diese an. In einem geschlossenen Raum zwischen diesen beiden Zellschichten liegt die Interphotorezeptor-Matrix und viele lösliche Produkte des RPE und der Zellen der neuralen Netzhaut sind in dieser Interphotorezeptor-Matrix enthalten. Nährstoffe, Metabolite und trophische Faktoren die zwischen dem RPE und der neuralen Netzhaut ausgetauscht werden, müssen die Interphotorezeptor-Matrix passieren. Es wird zum Beispiel angenommen, dass die Zellen des RPE einen Photorezeptor-Überlebensfaktor (PSPA) synthetisieren und sekretieren.
Gezüchtete RPE-Zellen synthetisieren eine Reihe von bekannten trophischen Faktoren, einschließlich des Wachstumsfaktors aus Blutplättchen (PDGF), FGF, transformierender Wachstumsfaktor-☐ (TGF-☐) und transformierender Wachstumsfaktor-☐ (TGF-☐). Es ist durchaus denkbar, dass diese oder andere unbekannte Faktoren aus dem RPE die Entwicklung der neuralen Netzhaut beeinflussen können. Tombran-Tink et al. (Exp. Eye Res. (1991) 53, Seiten 411–414) legen die Reinigung eines Faktors aus dem RPE mit hoher neuronaler Differenzierungsaktivität offen.
Das RPE ist neuraler Abstammung und bildet eine einzellige Schicht, die zwischen der neuralen Netzhaut und der Blutzirkulation innerhalb der Aderhaut angesiedelt ist. In dieser strategischen Lage bildet das RPE einen Teil der Blut-Netzhaut-Schranke, übernimmt für die Integrität und Funktionen der Netzhaut essentielle Aufgaben und spielt eine wichtige Rolle bei vaskulären, entzündlichen, degenerativen und dystrophen Erkrankungen der Netzhaut und der Aderhaut.
Die Funktionen des RPE bezüglich des Sehprozesses sind vielfältig und beinhalten hell/dunkel-Adaptation, die Phagocytose von abgeschilferten Membranen des äußeren Segments der Stäbchen und die Versorgung mit Nährstoffen. Andererseits weiß man seit langem, dass eine enge gegenseitige Abhängigkeit von RPE und neuraler Netzhaut während der normalen Entwicklung besteht, die aber funktionell nicht sehr gut aufgeklärt ist, obwohl bekannt ist, dass das RPE für die Regeneration der Netzhaut wichtig ist. Es wurde übereinstimmend beobachtet, dass der Kontaktverlust der neuralen Netzhaut mit dem RPE (Netzhautablösung) bei vielen Vertebraten zur Degeneration der Netzhaut führt. Als Nebeneffekt der Netzhautablösung wurde häufig eine starke vom RPE ausgehende Zellproliferation unterhalb der Ablösungsstellen beobachtet.
Daher wäre die Identifizierung von hypothetischen Überlebensfaktoren für Photorezeptorzellen von potenziell großer Bedeutung für die Behandlung von krankhaften Zuständen, die durch Photorezeptor-Degeneration aus ungeklärter Ursache zur Erblindung führen können. Während diese Arten von selektiver Photorezeptor-Degeneration auf eine Reihe von verschiedenen Mechanismen zurückzuführen sein können, lassen Analogien mit neuronalen Degenerationen in anderen Regionen des Nervensystems auf eine Beteiligung einer neurotrophen Aktivität der Netzhaut schließen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines neurotrophen Faktors aus dem pigmentierten Netzhautepithel. Das Verfahren der Reinigung umfasst die Bereitstellung einer unreinen, neurotrophen Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel enthaltenden Proteinfraktion, das Ausfällen der verunreinigenden Proteine aus der unreinen PEDNF enthaltenden Proteinfraktion, durch Einstellen der unreinen, PEDNF enthaltende Proteinfraktion auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 50% bis 60%, um eine 50 bis 60%-ige Ammoniumsulfat-Proteinfraktion zu erhalten und/oder Ausfällen von PEDNF aus der unreinen, PEDNF enthaltenden Proteinfraktion, durch Einstellen der unreinen, PEDNF enthaltende Proteinfraktion auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 70% bis 80%, um eine 70 bis 80%-ige Ammoniumsulfat-Proteinfraktion zu erhalten, sowie die Aufbringung der unreinen, neurotrophen Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel enthaltenden Proteinfraktion auf ein Kationenaustauschchromatographiemedium. Das Kationenaustauschchromatographiemedium wird dann gewaschen, um jegliche ungebundene Proteine zu eluieren und der neurotrophe Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel wird vom Kationenaustauschchromatographiemedium eluiert und gesammelt.
Weiterhin wird ein rekombinantes DNA-Molekül beschrieben, das ein Gen beinhaltet, welches einen neurotrophen Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel mit der DNA-Sequenz oder Aminosäure-Sequenz in SEQ ID NO 1 codiert und ein nicht-menschlicher Organismus, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das ein Gen für den neurotrophen Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel mit der in SEQ ID NO 1 festgelegten DNA-Sequenz beinhaltet.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung gereinigter PEDNF kann in einem Verfahren zur Behandlung von Tumoren, von Augenerkrankungen und von durch die Aktivität von Serinproteasen hervorgerufene Erkrankungen, verwendet werden, welches auf der Verabreichung von PEDNF beruht.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
Die Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch das Lesen der Ansprüche und der genauen Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den im Folgenden beschriebenen Abbildungen deutlicher.
1 ist ein mit Coomassie-Blau gefärbtes SDS Polyacrylamidgel, das die Lage der PEDNF Protein-Doppelbande zeigt, welche nur in RPE-konditioniertem Medium (RPE-CM) auftritt.
2 ist eine Differenzial-Interferenzkontrastmikroskop-Aufnahme, die Zellkulturen 8 Tage nach der Anheftung zeigen, nachdem sie für 7 Tage in serumfreiem Medium mit 2 μg/ml des elektroeluierten PEDNF (A) oder serumfreiem Kontrollmedium stimuliert wurden (B).
3 ist ein mit Silber gefärbtes zweidimensionales Gel. Molekulargewichte sind links und pH-Extremwerte oben angegeben.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Zellen des pigmentierten Netzhautepithels sind in vivo eng assoziiert mit differenzierenden Retinoblasten und tragen zu einer Umgebung bei, die für ihre Entwicklung und normale Funktion sowohl in vivo als auch in vitro notwendig ist. Retinoblastomazellen zeigen multipotente Differenzierungseigenschaften, die denen ihrer Vorläuferzellen, den primitiven Retinoblasten, ähneln, was durch die Tatsache belegt wurde, dass Agenzien wie Laminin, Natriumbutyrat und Dibutyryl-cAMP die Ausprägung von neuronalen, gliären und Pigmentepithel-Charakteristika in vitro hervorrufen können.
Eine menschliche gezüchtete Retinoblastoma-Zellinie, Y79-Zellen, zeigen einen hohen Grad von nervenzellartiger Differenzierung, wenn sie mit einem RPE-konditionierten Medium (RPE-CM) behandelt werden. Die Differenzierung wird sowohl in morphologischen als auch biochemischen Charakteristika der Zellen sichtbar. Die behandelten Zellen entsenden aus ihren Zellkörpern verzweigende neuritische Fortsätze und exprimieren erhöhte Spiegel von neuronspezifischer Enolase (NSE) und Neurofilament-Proteinen.
Die durch das RPE abgesonderten Proteine wurden aus RPE-CM fraktioniert und eine Protein-Doppelbande mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 50.000 bis etwa 55.000, welche ausschließlich im RPE-CM auftritt, identifiziert. Dieser neurotrophe Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel (PEDNF), welcher eines der wesentlichen sekretorischen Produkte von menschlichen fötalen RPE-Zellen ist, wurde isoliert und die neurotrophe Wirkung auf Y79-Retinoblastomazellen gezeigt.
PEDNF kann zur Behandlung von Netzhauterkrankungen angewendet werden unter anderem, jedoch nicht ausschließlich, Retinoblastoma und andere Tumoren des Auges, Retinitis pigmentosa, verschiedene Formen der Netzhautablösung, Maculadegeneration, diabetische Retinopathie und andere erbliche und altersbedingte Erkrankungen von Netzhautzellen.
Im Falle von Netzhauttumoren regt PEDNF die Tumorzellen dazu an, biochemische und phänotypische Merkmale von reifen neuronalen Zellen auszuprägen. Solche Veränderungen werden durch den Stillstand oder die Verringerung der Zellteilungsrate deutlich, was zu Tumorrückgang oder zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums führt. Im Falle von nicht-tumorösen Netzhauterkrankungen verstärken die neurotrophen Eigenschaften von PEDNF das Überleben und das Wohlergehen von Photorezeptor- und anderen Netzhautzellen, führen zur Verlängerung ihrer funktionstüchtigen Lebensspanne und zur Senkung der Rate des Einsetzens von Sehbehinderungen und endgültiger Erblindung. Im Falle der Netzhautablösung verlängert PEDNF die Lebensspanne von Photorezeptorzellen in ausreichendem Maße, damit die Netzhaut-RPE-Verbindung durch die üblichen Wiederanheftungsvorgänge erneuert werden kann, wodurch die normale Sehfähigkeit wiederhergestellt wird.
1. Herstellung einer unreinen, neurotrophen Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel enthaltenden Proteinfraktion
Neurotrophe Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel (PEDNF) kann aus jeglichen Geweben oder Zellen isoliert werden, die PEDNF herstellen.
Natürlich vorkommende Zellen, die PEDNF herstellen sind pigmentierte Netzhautepithelzellen. Solche Zellen können in Kultur gezüchtet werden, wobei sie PEDNF in das Medium, in dem sie wachsen, absondern. Das Medium kann in regelmäßigen Abständen geerntet und PEDNF aus dem Medium isoliert werden. Geeignete Zellkulturen können aus pigmentierten Netzhautepithelzellen von Menschen, Affen und anderen Primaten und anderen Tieren wie Hühnern, Mäusen, Ratten, Kühen und Schweinen gewonnen werden.
PEDNF kann auch durch Extraktion der Interphotorezeptormatrix (IPM) oder aus der Netzhaut von Menschen, Affen und anderen Primaten und anderen Tieren wie Hühnern, Mäusen, Ratten, Kühen und Schweinen isoliert werden.
Alternativ kann PEDNF aus Quellen gewonnen werden in denen er natürlicherweise nicht vorkommt, wie nicht-menschliche Organismen, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transfiziert sind, das so konstruiert ist, dass eine Expression von PEDNF in den für die Expression des Gens ausgewählten Wirtszellen erfolgt.
A. Züchtung von menschlichen pigmentierten Netzhautepithelzellen (RPE)
Kulturen von RPE-Zellen werden durch post-mortem-Präparation von Augen angelegt, indem die Augen unter aseptischen Bedingungen eröffnet und der Glaskörper und die Netzhaut entfernt werden. Die freigelegte Netzhaut wird mit einer gepufferten Lösung wie „Modified Earle's Balanced Salt Solution" (MEBS: 115,5 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 0,5 mM CaCl₂, 0,27 mM MgCl₂, 0,37 MgSO₄, 15 mM HEPES, 14 mM NaHCO₃, 12 mM Glukose, pH 7,2) gewaschen. RPE-Zellen werden von der Bruch'schen Membran geschabt und mittels eines Flüssigkeitsstrahls aus einer Pasteur- oder ähnlichen Pipette mit MEBS oder Kulturmedium abgelöst. Vor diesem Schritt kann eine Behandlung mit proteinspaltenden oder anderen Enzymen wie Dispase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, Katalog #295 825). Alternativ können RPE-Zellen isoliert werden, indem Stücke der Lederhaut des intakten Auges abgelöst werden, so dass Aderhautgewebe freigelegt wird, und diese Aderhaut-Oberfläche mit Protein-spaltenden oder anderen Enzymen wie Dispase vor der Entfernung des Glaskörpers und der Netzhaut behandelt wird und die RPE-Zellen durch Besprühen mit Zellkulturmedium wie von Pfeffer beschrieben abgelöst werden. Gewebefragmente werden in Gewebekulturschalen überführt in ein Medium wie komplettes RPE-47-Medium mit niedrigem bzw. hohem Gehalt an Ca⁺⁺, wie von Pfeffer beschrieben, oder „Eagle's Minimal Essential Medium" (MEM, erhältlich bei GIBCO Grand Island, NY) versetzt mit etwa 0,5% bis etwa 20% Volumenanteile fötalem Kälberserum. Bei Konzentrationen unterhalb von etwa 0,5% fötalem Kälberserum sind die Serumkonzentrationen zu niedrig, um das Zellwachstum effektiv zu unterstützen. Bei Konzentrationen oberhalb von etwa 20% fötalem Kälberserum kommt den Zellen kein zusätzlicher Vorteil bezüglich des Zellwachstums zu.
Das Medium kann auch mit Antibiotika und/oder Fungiziden versetzt werden, um das Wachstum von Bakterien und/oder Pilzen in den Kulturen zu verhindern. Antibiotika und Fungizide, die geeignet für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind, sind etwa 1.000 Einheiten/ml Penicillin, etwa 100 μg/ml Streptomycin, etwa 0,25 μg/ml Amphotericin und etwa 50 μg/ml Gentamycin oder andere geeignete, im Fachgebiet bekannte Agenzien solcher An. Diese Antibiotika können nach Belieben einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Die Zellen werden bei etwa 37°C bei einer Atmosphäre von etwa 5% Kohlendioxid bebrütet. Pigmentierte Netzhautepithelzellen (RPE) heften sich an die Oberfläche der Kulturschalen an, vermehren sich und bilden schließlich eine zusammengewachsene einzellige Schicht aus.
Wenn die Zellen zu einem dichten Zellrasen zusammengewachsen sind, was nach 3–7 Tagen nach Beginn der Züchtung der Zellen der Fall ist, werden sie geerntet, zum Beispiel durch Trypsinbehandlung der einzelligen Schicht oder durch andere dem Fachmann bekannte Verfahren und Aufnehmen der Zellen in einem Medium wie MEM, erhältlich bei GIBCO, das mit etwa 5% bis etwa 20% fötalem Kälberserum versetzt ist. Ein Teil der Zellen wird in sterile Gewebekulturflaschen wieder ausgesät, woraufhin man die Zellen wieder in einer Atmosphäre von etwa 5% Kohlendioxid und etwa 37°C wachsen lässt.
Alternativ können RPE-Zellen isoliert werden, indem man von den Augen die Hornhaut, den 2 mm Lederhautring sowie den Glaskörper und die neurale Netzhaut entfernt. Die Augen werden mit Calcium- und Magnesium-freier „Hanks Balanced Salt Solution" (HBSS: 1,3 mM CaCl₂, 5 mM KCl, 0.3 mM KH₂PO₄, 0,5 mM MgCl₂, 0,4 mM MgSO₄, 138 mM NaCl, 4 mM NaHCO₃, 0,3 mM NaH₂PO₄, 5,6 mM D-Glukose und 0,03 mM Phenolrot), erhältlich bei GIBCOBRL in Gaithersburg, MD, gewaschen. Die Augenschale wird mit einer Lösung gefüllt, die aus etwa 0,1 Gewichtsprozent Trypsin und etwa 0,1 Gewichtsprozent Hyaluronidase in Calcium- und Magnesium-freier „Hank's Balanced Salt Solution" besteht und das Auge wird bei etwa 37°C für etwa 15 Min. bis etwa 30 Min. bebrütet.
Die abgelösten RPE-Zellen werden durch vorsichtiges Absaugen gesammelt und das Verfahren wird solange wiederholt bis die RPE-Zellen freigesetzt sind. Das Trypsin wird durch Zugabe von etwa 5% bis etwa 20% fötalem Kälberserum zu der Probe mit den Zellen inaktiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei etwa 1200 UpM für etwa 7 Min. gesammelt.
Die RPE-Zellen werden dann auf sterile Gewebekulturplatten in einer Dichte von etwa 1 × 10⁵ Zellen pro 35 mm Platte ausgebracht. (Proportional mehr oder weniger Zellen werden ausgebracht, wenn größere oder kleinere Platten oder Gefäße benutzt werden). Die Zellen wachsen in „DulBecco's Modified Eagle's Medium" (DMEM), erhältlich bei GIBCO, oder in einem anderen geeigneten Medium wachsen. Das Medium kann mit einem gleichen Volumen von HAM's F12 Medium (erhältlich bei GIBCO) versetzt werden, sowie mit etwa 1 mM Natriumpyruvat, etwa 0,625 mM Hepes, etwa 6 mM L-Glutamin, etwa 1% nicht-essentielle Aminosäuren, etwa 5 μg/ml Insulin, etwa 5 μg/ml Transferrin, etwa 5 ng/ml Selen, Antibiotika wie oben beschrieben und etwa 0,5% bis etwa 20% fötalem Kälberserum wie oben beschrieben. Insulin, Transferrin und Selen sind bei Collaborative Research in Lexington, MA, erhältlich. Andere Reagenzien, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wenn nicht anders vermerkt, bei Sigma Chemical Co. in St Louis, MO, erhältlich.
Wenn die Zellen zu einem dichten Zellrasen zusammengewachsen sind, was nach 3–7 Tagen nach Beginn der Züchtung der Zellen der Fall ist, werden sie geerntet, zum Beispiel durch Trypsinbehandlung der einzelligen Schicht oder durch andere dem Fachmann bekannte Verfahren und Aufnehmen der Zellen in einem Medium wie MEM, erhältlich bei GIBCO, das mit etwa 5% bis etwa 20% fötalem Kälberserum versetzt ist. Ein Teil der Zellen wird in sterile Gewebekulturflaschen wieder ausgesät, woraufhin man die Zellen wieder in einer Atmosphäre von etwa 5% Kohlendioxid und etwa 37°C wachsen lässt.
Obwohl nur zwei Verfahren zur Züchtung von RPE-Zellen beschrieben werden, sind andere geeignete Verfahren zur Züchtung von RPE-Zellen auf dem Fachgebiet bekannt. Solche Verfahren sind auch für die Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
B. Herstellung von durch pigmentierte Netzhautepithelzellen konditioniertem Medium (RPE-CM)
PEDNF ist ein Protein, das abgesondert wird und RPE-Zellen sondern PEDNF in das Medium ab, in dem sie wachsen. Daher ist es ein einfaches Verfahren zur Herstellung von PEDhTF, RPE-Zellen in Kultur wachsen zu lassen und in regelmäßigen Abständen das Medium von diesen Kulturen zu ernten.
Ein Verfahren zur Isolierung von PEDNF aus Medium, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, besteht darin, die RPE-Zellen bis zum Erreichen eines dichten Zellrasens wachsen zu lassen, in einem Medium wie DMEM versetzt mit etwa 1 mM Natriumpyruvat, etwa 0,625 mM Hepes, etwa 6 mM L-Glutamin, etwa 1% nicht-essentielle Aminosäuren, etwa 5 μg/ml Insulin, etwa 5 μg/ml Transferrin, etwa 5 ng/ml Selen, Antibiotika und/oder Fungizide wie oben beschrieben und etwa 0,5% bis etwa 20% fötalem Kälberserum wie oben beschrieben. Die dichten Zellrasen der RPE-Zellen werden ausgiebig mit „Hank's Balanced Salt Solution" oder anderen geeigneten Waschlösungen gewaschen, um Serumproteine aus dem im Medium zur Züchtung der RPE-Zellen enthaltenen fötalen Kälberserum zu entfernen. Etwa 1 ml pro cm² der Zelloberfläche serumfreies Medium wie DMEM, versetzt mit etwa 1 mM Natriumpyruvat, etwa 0,625 mM Hepes, etwa 6 mM L-Glutamin, etwa 1% nicht-essentielle Aminosäuren, etwa 5 μg/ml Insulin, etwa 5 μg/ml Transferrin, etwa 5 ng/ml Selen, Antibiotika und/oder Fungizide wie oben beschrieben, wird zu den Kulturen gegeben und dann werden sie in einer Atmosphäre von etwa 5% CO₂ bei etwa 37°C für etwa 1 bis etwa 10 Tage bebrütet. In einer anderen Ausführungsform kann PEDNF aus Serum enthaltendem Medium wie DMEM, versetzt mit etwa 1 mM Natriumpyruvat, etwa 0,625 mM Hepes, etwa 6 mM L-Glutamin, etwa 1% nicht-essentielle Aminosäuren, etwa 5 μg/ml Insulin, etwa 5 μg/ml Transferrin, etwa 5 ng/ml Selen, Antibiotika und/oder Fungizide wie oben beschrieben und etwa 0,5% bis etwa 20% fötalem Kälberserum wie oben beschrieben, isoliert werden.
Das Medium wird dann gesammelt, indem das Medium in Zentrifugenröhrchen aus Plastik geschüttet wird und das Medium wird bei etwa 3.000 UpM für etwa 10 Min. zentrifugiert, um jegliche freien Zellen und andere Teilchen aus dem Medium zu entfernen und nach Filtration wird eine unreine PEDNF-Proteinlösung erhalten. Das Medium kann direkt für die Reinigung und die Testung von PEDNF verwendet oder bei –20°C aufbewahrt werden, bis es benötigt wird.
C. Isolierung von PEDNF aus Gewebe rohen
PEDNF kann direkt aus Augen isoliert werden indem die Augen eröffnet werden und der Glaskörper und die Netzhaut entfernt werden. Das pigmentierte Netzhautepithel wird mittels eines Einweg-Zellschabers von der Bruch'schen Membran geschabt. Gewebefragmente werden in einen Teflon- oder Glas-Homogenisator mit 10 mM „Phosphate-Buffered Saline" (PBS) überführt und zum Aufbrechen der Zellen homogenisiert. Die Lösung wird dann bei etwa 10.000 UpM für etwa 10 Min. zentrifugiert und gefiltert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Der PEDNF enthaltende Überstand wird gesammelt, wodurch man eine unreine PEDNF-Proteinlösung erhält. Das Medium kann direkt für die Reinigung oder Testung von PEDNF verwendet oder bei –20°C gelagert werden, bis es benötigt wird.
D. Isolierung von PEDNF aus rekombinanten Zellen
PEDNF kann auch aus rekombinanten Zellen isoliert werden, welche so konstruiert wurden, dass sie das PEDNF-Gen exprimieren. Der PEDNF kann als intrazelluläres oder extrazelluläres Protein exprimiert werden.
Intrazellulärer PEDNF wird isoliert, indem die Zellen in einem Dounce- oder einem anderen geeigneten Homogenisator in einem Puffer wie PBS, der Detergenzien oder andere löslichkeitsfördernde Agenzien wie Harnstoff oder Guanidiniumhydrochlorid enthalten kann, homogenisiert werden, und diese dann bei etwa 10.000 UpM für etwa 20 Min. zentrifugiert werden, um Zelltrümmer zu entfernen, wodurch man eine unreine PEDNF-Proteinfraktion erhält.
Extrazellulärer PEDNF wird isoliert, indem man das Medium, in dem die PEDNF exprimierenden Zellen wachsen, sammelt. Dies wird am einfachsten in einem kontinuierlichen Zentrifugationsverfahren, wie mittels einer Sharples-Zentrifuge, durchgeführt. Der Überstand wird gesammelt, wodurch man eine unreine PEDNF-Proteinlösung erhält. Das Medium kann direkt für die Reinigung oder Testung von PEDNF verwendet oder bei –20°C gelagert werden, bis es benötigt wird.
2. Reinigung von PEDNF
A. Reinigung von PEDNF im kleinen Maßstab
i. Ammoniumsulfatausfällung
Eine unreine PEDNF-Proteinfraktion kann teilweise durch Ammoniumsulfatausfällung gereinigt werden, wodurch man eine durch Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält. Die Prozentangaben für Ammoniumsulfat beziehen sich auf % Sättigung von Ammoniumsulfat bei 20°C und beruhen auf einer 100%-igen Sättigung bei 767 g/l.
Eine unreine PEDNF-Proteinfraktion wird auf eine etwa 50%-ige Ammoniumsulfatsättigung durch die Zugabe von etwa 313 g festem Ammoniumsulfat pro Liter unreiner Proteinfraktion bei etwa 20°C eingestellt. Das Ammoniumsulfat wird vorzugsweise langsam zu der unreinen Proteinfraktion gegeben, während die Lösung zum Beispiel mit einem Rührstab oder auf einem mechanischen Rührgerät gerührt wird. Das Ammoniumsulfat wird langsam zugegeben, um lokal hohe Konzentrationen von Ammoniumsulfat zu verhindern, was zu einer schnellen Ausfällung und Denaturierung von Proteinen in der unreinen Proteinfraktion führen kann. Nachdem das Ammoniumsulfat vollständig zugegeben wurde, wird die etwa 50%-ige Ammoniumsulfatlösung für etwa 30 Min. bei etwa 20°C gerührt. Die etwa 50%-ige Ammoniumsulfatlösung wird dann bei etwa 10.000 g bei etwa 20°C für etwa 20 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird zur weiteren Verarbeitung gesammelt. In einer anderen Ausführungsform wird die etwa 50%-ige Ammoniumsulfatlösung durch Filterpapier wie Whatman #1 gefiltert, um den Niederschlag zu entfernen. In diesem Fall wird das Filtrat für die weitere Verarbeitung gesammelt.
Die etwa 50%-ige Ammoniumsulfatlösung wird dann durch die Zugabe von etwa 137 g/l Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von etwa 70% eingestellt. Das Ammoniumsulfat wird langsam zugegeben und nachdem das Ammoniumsulfat vollständig zugegeben wurde, wird die etwa 70%-ige Ammoniumsulfatlösung für etwa 30 Min. bei etwa 20°C gerührt. Die etwa 70%-ige Ammoniumsulfatlösung wird zentrifugiert oder filtriert wie oben beschrieben und der Niederschlag wird zur weiteren Verarbeitung gesammelt.
Der Niederschlag mit Ammoniumsulfat wird dann in einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7, wiederaufgenommen, wodurch man eine 50–70%-ige Ammoniumsulfatfraktion erhält. Die Lösung wird dann unter Verwendung einer „Amicon Diaflo"-Ultrafiltrationseinheit diafiltriert oder gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7, dialysiert, um das restliche Ammoniumsulfat aus der wiederaufgenommenen 50–70%-igen Ammoniumsulfatfraktion zu entfernen.
ii. Reinigung von PEDNF durch SDS-Gelelektrophorese
Eine Reinigung von PEDNF im kleinen Maßstab wird mittels SDS-Polyacrylamidplattengelen durchgeführt. Solche SDS-Polyacrylamidgele sind im Fachgebiet sehr gut bekannt und die Präparation von solchen Gelen wurde beschrieben von Weber und Osborn, J. Biol. Chem., 244, 4406 (1969) und modifiziert von Lämmli, Nature, 277, 680 (1970).
Proben einer unreinen PEDNF-Proteinfraktion oder einer über Ammoniumsulfat gereinigten PEDNF-Proteinfraktion werden gegen einen Puffer wie 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, dialysiert, gefriergetrocknet und in 62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 0,001% Bromphenolblau und 0,1 M 2-Mercaptoethanol resuspendiert, wobei das Bromphenolblau als Markierung für die Wanderung im Gel dient. Zu den zusätzlichen Proben, die auf das Gel aufgetragen werden gehören auch Molekulargewichts-Standards wie Phosphorylase B, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Carboanhydrase, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Lysozym (erhältlich zum Beispiel von Bio-Rad, Katalog #161-0304) und Kontrollen soweit notwendig. Falls konditionierte Medien als Proben verwendet werden, dienen Medien, die nicht mit den RPE-Zellen in Kontakt waren (unkonditionierte Medien) als Kontrollen.
Die Proben werden dann in einem kochenden Wasserbad für etwa 5 Min. erhitzt und auf SDS-Polyacrylamidplattengele aufgetragen. Die Markierungsproben und die nicht-konditionierten Medien werden in die Geltaschen am Rand des Gels aufgetragen und die unreinen PEDNF-Fraktionen oder die über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion werden in die verbleibenden inneren Geltaschen aufgetragen. Die Proben werden dann der Elektrophorese unterzogen. Die Elektrophorese wird fortgesetzt bis der Bromphenolblau-Farbstoff den unteren Rand des Gels erreicht hat. Nach Abschluss der Elektrophorese werden Streifen von jeder Seite des Gels mit den Markierungsproben und je eine Spur mit der unreinen PEDNF-Proteinfraktion und einer Kontrolle mit nicht-konditioniertem Medium mit Coomassie-Blau gefärbt. Die gefärbten Proteinbanden, die auf den gefärbten Gelstreifen erscheinen, werden an den ungefärbten Teil des Gels angelegt, so dass die Position der Proteine abgelesen werden kann, die in der unreinen PEDNF-Proteinfraktion oder in der über Ammoniumsulfat gereinigten PEDNF-Proteinfraktion vorhanden sind, jedoch im Kontrollmedium fehlen.
Eine PEDNF-Proteindoppelbande mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 50.000 bis etwa 55.000, die einzigartig für die unreine PEDNF-Proteinfraktion ist, wird ausgeschnitten und die Proteine werden mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren aus dem ungefärbten Teil des Gels elektroeluiert. Das Eluat wird zentrifugiert, um Gelfragmente zu entfernen und der Überstand wird gegen 10 mM „Phosphate-Buffered Saline" (145 mM NaCl, 8,1 mM NaH₂PO₄ und 1,9 mM NaH₂PO₄*H₂O) dialysiert, wodurch man eine durch SDS-Polyacrylamid gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
iii. Reinigung von PEDNF durch Kationenaustauschchromatographie
Eine unreine PEDNF-Fraktion oder eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird gegen Wasser oder gegen einen Puffer wie 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, oder einen anderen geeigneten Puffer dialysiert, um Medium und Salze aus der unreinen Proteinprobe zu entfernen. PEDNF kann mittels Kationenaustausch-HPLC unter Verwendung eines Säulenchromatographiemediums gereinigt werden, wie zum Beispiel das unter dem Markennamen „Brownlee Aquapore CX-300" bei Western Analytical, Temecula, CA, erhältliche, in eine Säule wie zum Beispiel eine 4,6 × 30 mm Säule gepackte, oder irgendein anderes Kationenaustauschchromatographiemedium für HPLC.
Das Chromatographiemedium wird mit einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,2, äquilibriert. Die dialysierte unreine PEDNF-Proteinfraktion oder über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird auf das Chromatographiemedium aufgebracht und das Chromatographiemedium mit dem daran gebundenen PEDNF wird mit einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,2, gewaschen bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen sind. PEDNF wird vom Chromatographiemedium mit einem linearen Salzgradienten von etwa 0,0 bis etwa 0,5 M NaCl eluiert. PEDNF eluiert als einzelner Peak bei einer NaCl-Konzentration von etwa 0,25 M.
Der eluierte PEDNF wird durch Gefriertrocknung konzentriert und in Wasser oder einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,2, oder einem anderen geeigneten Puffer wieder gelöst, wodurch man eine durch Kationenaustausch-HPLC gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
iv. Reinigung von PEDNF durch Phasenumkehr-HPLC
Eine unreine PEDNF-Fraktion oder eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird gegen Wasser oder gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, oder einen anderen geeigneten Puffer dialysiert, um Medium und Salze aus der unreinen Proteinprobe zu entfernen. PEDNF kann mittels Phasenumkehr-HPLC unter Verwendung eines Säulenchromatographiemediums gereinigt werden, wie zum Beispiel das unter dem Markennamen „Vydac C8" bei The Separation Group, Hesperia, CA, erhältliche, in eine Säule wie zum Beispiel eine 4,6 × 250 mm Säule gepackte, oder ein anderes geeignetes Phasenumkehrchromatographiemedium für HPLC.
Das Chromatographiemedium wird mit einer Lösung wie etwa 0,1 Volumenprozent Trifluoressigsäure (TFA) äquilibriert. Die dialysierte unreine PEDNF-Proteinfraktion oder über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird auf das Chromatographiemedium aufgebracht und das Chromatographiemedium mit dem daran gebundenen PEDNF wird mit einer Elutionslösung wie 0,1 Volumenprozent TFA gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen sind. PEDNF wird vom Chromatographiemedium mit einem linearen Gradienten von etwa 0,1% TFA in Wasser bis etwa 95% Acetonitril (CH₃CN), 0,1% TFA, 5% H₂O eluiert. PEDNF eluiert als einzelner Peak bei einer CH₃CN-Konzentration von etwa 70%.
Der eluierte PEDNF wird durch Gefriertrocknung konzentriert und in Wasser oder einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,2, oder einem anderen geeigneten Puffer wiederaufgenommen, wodurch man eine durch Phasenumkehr-HPLC gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
v. Größenausschluss-HPLC
Eine unreine PEDNF-Fraktion, eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion, eine durch Kationenaustausch-HPLC gereinigte PEDNF-Proteinfraktion oder eine durch Phasenumkehr-HPLC gereinigte PEDNF-Proteinfraktion kann durch Größenausschluss unter Verwendung eines Chromatographiemediums gereinigt werden, wie zum Beispiel das unter dem Markennamen „Bio-Rad TSK-250" bei Bio-Rad in Richmond, CA, erhältliche, in eine Säule wie zum Beispiel eine 7,5 × 300 mm Säule gepackte Chromatographiemedium. Die unreine PEDNF-Proteinfraktion, die über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion, die durch Kationenaustausch-HPLC gereinigte PEDNF-Proteinfraktion oder die durch Phasenumkehr-HPLC gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird auf das Größenausschlusschromatographiemedium aufgebracht, welches mit einem Puffer wie 0,02 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,6 M NaCl, äquilibriert wird. PEDNF enthaltende Fraktionen werden gesammelt und gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,2, dialysiert, wodurch man eine mittels Größenausschluss gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
vi. Heparin-Chromatographie
Eine unreine PEDNF-Fraktion oder eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion kann auch mittels Heparin-Chromatographie gereinigt werden. Ein Heparin-Chromatographiemedium wie Heparin-Agarose, bei Sigma Chemical Co. in St. Louis, MO (Kat. No. H-5380) erhältlich, wird in einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, äquilibriert.
Eine unreine PEDNF-Fraktion oder eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Tris, pH 7,5, dialysiert, um jegliche Salze und Medium aus den Proben zu entfernen und die dialysierte PEDNF-Lösung wird auf die äquilibrierte Heparin-Agarose aufgebracht. Nachdem die PEDNF-Lösung auf die äquilibrierte Heparin-Agarose aufgebracht wurde, wird die Heparin-Agarose mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Heparin-Agarose eluiert sind. PEDNF wird dann von der Heparin-Agarose mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl eluiert.
Das PEDNF enthaltende Eluat wird dann in einer „Amicon Diaflo"-Ultrafiltrationseinheit diafiltriert oder gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert, um das im Eluat enthaltene NaCl zu entfernen, wodurch man eine mittels Heparin gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
Für die oben beschriebenen Reinigungsverfahren können unreine PEDNF-Fraktionen oder über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktionen als Ausgangsmaterial für die anschließende Säulenreinigung verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann auch eine Proteinfraktion, die bereits durch eine oder mehrere der beschriebenen Chromatographieschritte gereinigt wurde, verwendet werden. Daher können die Reinigungsverfahren allein oder in Kombination miteinander oder mit anderen im Fachgebiet bekannten Reinigungsverfahren verwendet werden, um eine PEDNF-Fraktion der gewünschten Reinheit zu erhalten.
B. Herstellung von PEDNF im großen Maßstab
i. Ammoniumsulfatausfällung
Die Reinigung von PEDNF im großen Maßstab kann durch Ammoniumsulfatausfällung erfolgen, wodurch man eine durch Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
Eine unreine PEDNF-Proteinfraktion wird auf eine etwa 50%-ige Ammoniumsulfatsättigung durch die Zugabe von etwa 313 g festem Ammoniumsulfat pro Liter unreiner Proteinfraktion eingestellt. Das Ammoniumsulfat wird vorzugsweise langsam zu der unreinen Proteinfraktion gegeben, während die Lösung zum Beispiel mit einem Rührstab oder auf einem mechanischen Rührgerät gerührt wird. Das Ammoniumsulfat wird langsam zugegeben, um lokal hohe Konzentrationen von Ammoniumsulfat zu verhindern, was zu einer schnellen Ausfällung und Denaturierung von Proteinen in der unreinen Proteinfraktion führen kann. Nachdem das Ammoniumsulfat vollständig zugegeben wurde, wird die 50%-ige Ammoniumsulfatlösung für etwa 30 Min. bei 20°C gerührt. Die 50%-ige Ammoniumsulfatlösung wird dann bei etwa 10.000 g bei 20°C für etwa 20 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird zur weiteren Verarbeitung gesammelt. In einer anderen Ausführungsform wird die 50%-ige Ammoniumsulfatlösung durch Filterpapier wie Whatman #1 gefiltert, um den Niederschlag zu entfernen. Das Filtrat wird für die weitere Verarbeitung gesammelt.
Die 50%-ige Ammoniumsulfatlösung wird dann durch Zugabe von 137 g/l Ammoniumsulfat auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 70% eingestellt. Das Ammoniumsulfat wird langsam zugegeben und nachdem das Ammoniumsulfat vollständig zugegeben wurde, wird die 70%-ige Ammoniumsulfatlösung für etwa 30 Min. bei 20°C gerührt. Die 70%-ige Ammoniumsulfatlösung wird zentrifugiert oder filtriert, wie oben beschrieben, und der Niederschlag wird gesammelt.
Der Niederschlag nach der Ammoniumsulfatfällung wird dann in einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7, wiederaufgenommen, wodurch man eine 55–70%-ige Ammoniumsulfatfraktion erhält. Die Lösung wird dann unter Verwendung einer „Amicon Diaflo"-Ultrafiltrationseinheit diafiltriert, oder gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7, dialysiert, um das restliche Ammoniumsulfat aus der wiederaufgenommenen 55–70%-igen Ammoniumsulfatfraktion zu entfernen, wodurch man eine durch Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
ii. Anionenaustauschchromatographie
Der pI (isoelektrische Punkt) des PEDNF-Proteins liegt bei etwa 3,9 bis etwa 7,2. Daher hat das Protein bei einem pH-Wert von etwa 7,5 eine Netto-Negativladung und bindet an ein Anionenaustauschchromatographiemedium wie DEAE (Diethylaminoethyl)-Cellulose.
Für die Verwendung wird ein Anionenaustauschchromatographiemedium wie DEAE-Cellulose mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris, pH 7,5, äquilibriert.
Der PEDNF wird auf das Anionenaustauschchromatographiemedium aufgebracht und das Medium wird mit einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,5, gewaschen bis alle ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind. Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wird PEDNF mit einem linearen Salzgradienten von etwa 0 bis etwa 1 M NaCl in einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,5, eluiert. Die PEDNF enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und vereinigt. Diese Fraktionen werden dann diafiltriert oder gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert, um NaCl zu entfernen, wodurch man eine durch Anionenaustauschchromatographie gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
Die Anionenaustauschchromatographie kann entweder im Batch-Verfahren oder mittels Säulenchromatographie-Verfahren durchgeführt werden.
iii. Heparin-Chromatographie
Für die Reinigung von PEDNF im großen Maßstab kann auch eine Heparin-Chromatographie verwendet werden. Ein Heparin-Chromatographiemedium wie Heparin-Agarose, erhältlich bei Sigma Chemical Co. in St. Louis, MO (Kat. No. H-5380) wird mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris, pH 7,5, äquilibriert.
Eine unreine PEDNF-Fraktion oder eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Tris, pH 7,5, dialysiert, und dann auf die Heparin-Agarose aufgebracht. Nachdem die PEDNF-Lösung auf die Heparin-Agarose aufgebracht wurde, wird die Heparin-Agarose mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Heparin-Agarose eluiert sind. PEDNF wird dann von der Heparin-Agarose mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl eluiert.
Das PEDNF enthaltende Eluat wird gesammelt und in einer „Amicon Diaflo"-Ultrafiltrationseinheit diafiltriert oder gegen einen Puffer wie 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert, um das im Eluat enthaltene NaCl zu entfernen, wodurch man eine mittels Heparin gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.
Für die oben beschriebenen Reinigungsverfahren können unreine PEDNF-Fraktionen oder über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktionen als Ausgangsmaterial für die anschließende Säulenreinigung verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann auch eine Proteinfraktion, die bereits durch eine oder mehrere der beschriebenen Chromatographieschritte gereinigt wurde, verwendet werden. Daher können die Reinigungsverfahren allein oder in Kombination miteinander oder mit anderen im Fachgebiet bekannten Reinigungsverfahren verwendet werden, um eine PEDNF-Fraktion der gewünschten Reinheit zu erhalten.
3. Testung von PEDNF
A. SDS-Gelelektrophorese
PEDNF kann durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese identifiziert werden, beispielsweise in 7,5%-, 10%- und 12,5%-igen SDS-Polyacrylamidgelen. Die Herstellung solcher Gele wurde von Weber und Osborn beschrieben und von Lämmli modifiziert und die Herstellung und Verwendung solcher Gele sind im Fachgebiet sehr gut bekannt.
PEDNF-Proteinproben werden mit etwa 5 μl 62,5 mM Tris, pH 6,8, 12% SDS, 0,001% Bromphenolblau, 10% Glycerin, und 0,1 M 2-Mercaptoethanol vermischt, wobei das Bromphenolblau als Markierung für die Wanderung im Gel dient. Molekulargewicht- Markierungsproben, die Molekulargewicht-Standards wie Phosphorylase B, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Carboanhydrase, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Lysozym (erhältlich zum Beispiel von Bio-Rad, Katalog #161-0304) beinhalten, werden als Kontrollen mitgeführt. Die PEDNF-Proteinproben und die Molekulargewicht-Standards werden für etwa 5 Min. gekocht und auf SDS-Polyacrylamidplattengele aufgetragen.
Die Proben werden dann der Elektrophorese unterzogen, bis der Bromphenolblau-Farbstoff den unteren Rand des Gels erreicht hat. Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Gel mit Silber, Coomassie-Blau oder einem anderen geeigneten Proteinfärbeverfahren gefärbt. Das Molekulargewicht der Proteine in der PEDNF-Probe wird dann mit den Molekulargewicht-Standards verglichen.
PEDNF wandert in SDS-Polyacrylamidgelen als Protein-Doppelbande mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 50.000 bis etwa 55.000.
B. Neuronale Induktivität
PEDNF-Aktivität in Proteinproben kann aufgrund seiner neuronalen Induktivität getestet werden. Verschiedene Konzentrationen von PEDNF werden zu Kulturen von Y79 Retinoblastoma(RB)-Zellen gegeben, erhältlich bei American Type Culture Collection, Zugangsnr. HTB 18, in Rockville, MD. Die Y79 RB-Zellen wachsen als Suspensionskultur. Die Zellen werden durch Zentrifugation für etwa 5 Min. bei etwa 900 UpM bei Raumtemperatur geerntet und in einem serumfreien Medium wie „Dulbecco's Modified Eagle's Medium" versetzt mit 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin, 5 ng/ml Selensäure und 876,6 μg/ml L-Glutamin (serumfreies Medium) aufgenommen, welches zuvor auf 37°C erwärmt wurde. Die gesammelten Zellen werden in einer Konzentration von etwa 10⁶ Zellen/ml in serumfreiem Medium resuspendiert. Etwa 50 bis etwa 500 ng/ml PEDNF werden zu 25 μl Portionen der Zellen gegeben. Die Zellen werden für 7 Tage bei etwa 37°C bebrütet und dann an Poly-D-Lysin-beschichtete Flaschen oder Deckgläschen gebunden. Die Poly-D-Lysin-beschichteten Flaschen werden hergestellt, indem man sie mit einer 200 μg/ml Poly-D-Lysin-Lösung (z. B. die bei Sigma erhältliche, Katalog #P7405) für etwa 1–24 h beschichtet und anschließend mit Wasser und serumfreiem Medium gespült.
i. Zellanalyse
Die Morphologie der angehefteten Zellen wird täglich überprüft, entweder durch Phasenkontrastmikroskopie der lebenden Zellen mit einem Mikroskop wie einem Diaphot- TMD-Umkehrmikroskop, erhältlich bei Nikon in Tokio, Japan, oder durch Differenzial-Interferenz-Kontrastnkroskopie von mit einem Fixiermittel wie 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat-Puffer fixierten Zellen unter Verwendung eines Mikroskops wie einem BHS-BH2-Mikroskop, erhältlich bei Olympus in Tokio, Japan.
Die Differenzierung wird geprüft indem der Prozentsatz an zellulären Aggregaten berechnet wird (mehr als 90% der ausplattierten Y79-Zellen aus der Suspensionskultur heften sich als Aggregate von mehr als 5 Zellen an die mit Poly-D-Lysin beschichteten Flaschen) in denen die Zellen Fortsätze am Tag 1, 3, 7 und 11 nach der Anheftung entsenden. Die Experimente werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und zweimal wiederholt.
Die Expression von Neuron-spezifischer Enolase (NSE) und von Neurofilament Molekulargewicht-200.000-Proteinuntereinheit (NF 200) wird mittels Immunfluoreszenz untersucht und entweder durch Epifluoreszenz-Mikroskopie (Olympus BHS-BH2-Mikroskop) oder Mikrospektrofluorometrie (MSA, Farrand Mikroscope Spectrum Analyzer). Die Quantifizierung erfolgt durch 1) visuelle Beurteilung der Fluoreszenzintensität bei einer Anregung bei 485 nm als + = schwach; ++ = moderat; +++ = stark; ++++ = sehr intensiv und 2) Messungen mittels mikrospektrofluorometrischer Analyse (MSA) (μA × 100, Zeitkonstante von etwa 0,3 Sek., Probengröße von etwa 2 mm oder etwa 100 Zellen/Aggregat; Zielgröße etwa 15 μm oder etwa die Größe einer Zelle).
Die Anwesenheit von PEDNF in einer Proteinprobe führt dazu, dass Y79 RB-Zellen Neuritenähnliche Fortsätze entsenden. Bei einer Konzentration von etwa 500 ng/ml entsenden etwa 70% der Zellen Neuriten-ähnliche Fortsätze.
ii. Differenzierung
Die Zellen wurden wie oben beschrieben gezüchtet. Die Zellen wurden dann täglich durch Phasenkontrastmikroskopie der lebenden Zellen (Olympus IMT 2) und durch Differenzial-Interferenz-Kontrastmikroskopie (Olympus BHS) von mit einem Fixiermittel wie etwa 4% Paraformaldehyd fixierten Zellen überprüft. Der Prozentsatz der differenzierenden Zellen wird abgeschätzt, indem die Zahl der zellulären Aggregate mit fünf oder mehr Zellen, die neuritische Auswüchse nach 8–10 Tagen der Kultur auf einem Poly-D-Lysin-Substrat zeigen, berechnet wird.
Mit etwa 50 bis etwa 500 ng/ml PEDNF durchlaufen annäherungsweise 80% der Zellen eine morphologische Differenzierung innerhalb von etwa 3 Tagen.
4. Charakterisierung des PEDNF-Proteins
A. Isolierung von PEDNF-Pentiden
Etwa 500 μg gereinigter PEDNF wird in Centricon-10 Mikrokonzentratoren (Amicon, Danvers, MA) konzentriert und dann in einem geeigneten Spaltungspuffer wie etwa 25 mM Tris, pH 8,5, 1 mM EDTA verdünnt. Zu der Proteinprobe wird ein proteolytisches (proteinspaltendes) Enzym wie Endoproteinase Lys-C, erhältlich bei Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, gegeben. Das PEDNF/Proteinase-Gemisch wird für etwa 18 Std. bei etwa 30°C belassen oder bis die Reaktion vollständig abgelaufen ist, d. h. bis PEDNF durch die Proteinase vollständig gespalten ist. In einer anderen Ausführungsform kann das Protein mit Trypsin in einem Puffer, der aus etwa 10 mM PBS besteht, oder unter Verwendung von anderen auf dem Fachgebieten bekannten Proteasen gespalten werden.
Die entstehenden PEDNF-Polypeptidfragmente werden mittels eines Trennungssystems wie zum Beispiel HPLC auf einer Vydac C8 Phasenumkehr-Säule getrennt. Eine 4,6 × 250 mm Säule ist für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Säule wird mit etwa 0,1% TFA in Wasser äquilibriert. Die Polypeptide werden mit etwa 90% CH₃CN, 0,1% TFA und 5% H₂O eluiert.
Die von der Säule eluierten Polypeptide, die gut von anderen Polypeptiden getrennt sind, werden gesammelt und der Proteinsequenzanalyse unterzogen.
B. Proteinsequenzanalyse
Die gereinigten Polypeptidfragmente werden der Aminosäuresequenzanalyse mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren unterzogen. In einer anderen Ausführungsform wird die Aminosäuresequenzanalyse einfach im Auftrag bei einem Anbieter für Aminosäuresequenzierungen durchgeführt, wie zum Beispiel bei der Mikrosequenzierungseinrichtung des Beckman Forschungsinstituts am City of Hope in Duarte, CA.
5. Charakterisierung des PEDNF-Gens
A. Klonierung des PEDNF-Gens
Oligonucleotide werden ausgehend von der vom isolierten PEDNF-Polypeptid abgeleiteten Sequenz entweder auf einem ABI 392 DNA/RNA-Synthesizer oder mit anderen im Fachgebiet wohlbekannten Verfahren konstruiert.
Die Oligonucleotide werden als Primer für die Polymerasenkettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Thermocyclers von Techne und Standard-Reagenzien und -Verfahren, erhältlich unter dem Markennamen „GeneAMP" bei Perkin Elmer Cetus in Emeryville, CA, hergestellt.
Eine Charon BS cDNA-Genbank aus menschlichem fötalem Auge wird mit PCR-Verfahren unter Verwendung eines Techne Thermocyclers und Standard-Reagenzien und -Verfahren abgesucht. Das bei der Reaktion entstehende cDNA-Fragment wird auf einem 3% NuSieve 3 : 1 Gel (FMC Biochemicals) unter Verwendung von NA-45 DEAE-Cellulosepapier (Schleicher und Schüll) isoliert, wie bei Sambrook et al. 1989 beschrieben in: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Zweite Ausgabe Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, welches hiermit durch diesen Verweis eingebunden wird. In Kurzform wird das Durchmusterungsverfahren durchgeführt, indem Proben der Genbank von etwa 1, 5 und 50 μl abgenommen und in Silikon-beschichtete 600 μl Reaktionsgefäße überführt werden, um sie dann mit zweifach destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von etwa 74 μl einzustellen. Die Phagenpartikel werden durch Erwärmen auf 70°C für etwa 5 Minuten und anschließende Abkühlung im Eisbad aufgebrochen.
Das PCR-Grundgemisch wird in einem 600 μl-Reaktionsgefäß für 3 Reaktionen wie folgt angesetzt:
30 μl 10-fach Taq-Polymerasepuffer;
24 μl dNTP-Mix;
und ein entsprechendes Volumen zweifach destillierten Wassers wird zugefügt, um das Grundgemisch auf ein Endvolumen von etwa 78 μl aufzufüllen.
Die gebrauchsfertige Lösung enthält daher etwa 192 mM KCl, 38,5 mM Tris-HCl, pH 8,3, 51,8 mM MgCl₂, 0,038% (Gew./Vol.) Gelatine, 0,77 mM von jedem dNTP und 3,8 μl von jedem Oligonucleotidprimer. Etwa 26 μl des Grundgemischs werden zu jedem Reaktionsgefäß gegeben. Die Genbankproben und die Grundgemischlösungen werden mit etwa 100 μl Mineralöl überschichtet und für etwa 5 Min. bei etwa 94°C erhitzt. Die Lösungen werden dann auf die gewünschte Primeranlagerungstemperatur eingestellt.
Nachdem die Lösungen auf die gewünschte Primeranlagerungstemperatur eingestellt wurden, werden etwa 1,5 μl Taq-Polymerase zu der Lösung hinzugefügt und für etwa 20 Min. bei der Temperatur belassen.
Das Thermocycler-Protokoll wird wie folgt fortgesetzt: etwa 3 Min. bei etwa 72°C für die Primerverlängerung, wobei die Zeit für die Primerverlängerung nach Wunsch verändert werden kann; etwa 1 Min. und 20 Sek. bei etwa 94°C, um das Produkt der Verlängerung von der Matrize abzulösen und etwa 2 min. bei 37°C, um die Primer an die Matrize anzulagern; und etwa 3 Min. bei etwa 72°C für die Primerverlängerung. Der Zyklus wird insgesamt etwa 25 bis etwa 30 Mal durchlaufen. Am Ende des letzten Zyklus wird ein letzter Primerverlängerungsschritt für etwa 7 Min. bei 72°C angefügt.
Das Fragment wird mit ³²P durch „Random Priming" unter Verwendung eines Kits, das unter dem Markennamen „Prime-It Random Primer Labeling Kit" bei Stratagene erhältlich ist, markiert. Die markierte Sonde wird verwendet, um etwa 200.000 Plaque-bildende Einheiten der Charon BS cDNA Genbank mit im Fachgebiet bekannten Methoden zu abzusuchen.
Positive Klone werden isoliert und die DNA mit Reagenzien gereinigt, die unter dem Markennamen „Qiagen Maxi" von Qiagen Inc., Studio City, CA, erhältlich sind.
Die Insertionen im Phagenvektor werden mit einem geeigneten Spaltungsenzym ausgeschnitten, mit der T4-Ligase von New England Biolabs, Beverly, MA, zum Ring geschlossen und in kompetente E. coli Sure Zellen von Stratagene Inc., La Jolla, CA, transformiert. Die Zellen werden dann auf Ampicillin/X-Gal-Platten ausgebracht.
Weiße Kolonien werden ausgewählt und durch „Mini-Präparation" mit einem Qiagen-Plasmid-Minipräparationsreagenz von Qiagen aufgearbeitet. Die gereinigten Plasmide werden gespalten, um die Insertion auszuschneiden und die Fragmente werden durch Gelelektrophorese getrennt, um die Größe der Insertionen zu bestimmen. Ein Klon mit einer Insertion der richtigen Größe wird dann für weitere Untersuchungen ausgewählt.
B. DNA-Sequenzanalyse
Die Sequenzanalyse wird mit einem automatischen Sequenzierer oder mittels anderer im Fachgebiet wohlbekannter Verfahren durchgeführt.
6. Expression des PEDNF-Gens in rekombinanten Zellen
Eine kommerzielle Herstellung von PEDNF oder eine Herstellung im großen Maßstab kann, nach Klonierung in einen geeigneten Vektor, durch Expression des Gens in einer geeigneten Wirtszelle erfolgen. Solch ein geeignetes Vektor/Wirtssystem ist das Baculovirus/Insektenzell-System.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das PEDNF-Gen in einen Baculovirus-Transfervektor kloniert, wie zum Beispiel pAc373, beschrieben von Lithgow et al., DNA and Cell Biology, 10, 443–449 (1991); pVL941, beschrieben von Ghiasi et al., Virology, 185, 187–194 (1991) oder andere solcher Baculovirus-Transfervektoren, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Im Allgemeinen umfassen solche Vektoren den Polyhedrin-Promotor des Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV), welcher in den Transfervektor wie z. B. pAC373 eingefügt ist, beschrieben von Summers und Smith (A manual for baculovirus vector and insect cell culture procedures, Texas Agric. Exp. Station Bull. No. 1555, welches hiermit als Verweis eingefügt wird). Rekombinante Plasmide werden durch Verfahren hergestellt, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, wie diejenigen, die beschrieben werden bei Maniatis et al. „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982), welches hiermit als Verweis eingefügt wird.
Die Wirtszellen, wie zum Beispiel S. frugiperda (Sf9) werden in TC100-Medium, erhältlich bei Gibco, mit 10% fötalem Kälberserum versetzt, gezüchtet. Die Sf9-Zellen werden mit etwa 1 μg infektiöser AcNPV DNA und etwa 50 μg rekombinanter DNA kotransfiziert. Die Kulturüberstände werden etwa 4 Tage nach Transfektion geerntet. Rekombinante Viren werden durch Plaque-Hybridisierung oder durch radioaktive Markierung der hergestellten Proteine identifiziert.
Die vorangegangene Beschreibung stellt ein Beispiel für die Expression des PEDNF-Gens in einem Vektor/Wirt-System bereit. Andere Expressionssysteme sind im Fachgebiet bekannt; zum Beispiel wurde Saccharomyces cerevisiae in Verbindung mit einer Reihe von Vektoren benutzt, wie diejenigen, die beschrieben wurden von Silar et al., Gene, 104, 99–102 (1991), Dietrich et al., Eur. J. Biochem., 201, 399–407 (1991), oder Akiyoshi-Shibata et al., DNA and Cell Biology, 10, 613–612 (1991) und rekombinante Vakziniavirus-Vektoren in HeLa-Wirtszellen wie die von Nakano et al., Gene, 105, 173–178 (1991) beschriebenen. Ein beliebiges dieser oder anderer im Fachgebiet bekannten Verfahren ist für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung zur Expression des PEDNF-Gens geeignet.
Das PEDNF-Gen kann als transportiertes Gen exprimiert werden, wobei PEDNF aus dem Medium, in dem der rekombinante Wirt wächst, isoliert wird; oder es kann durch Entfernen des Leaderpeptids als intrazelluläres Protein exprimiert werden, in welchem Fall PEDNF aus den Wirtszellen isoliert wird. Der so isolierte PEDNF wird dann nach den oben beschriebenen Verfahren gereinigt.
7. Behandlung mit PEDNF
A. Behandlung von Tumoren
PEDNF wird allein oder in Verbindung mit anderen klinischen (wie zum Beispiel chirurgischen) Verfahren verabreicht. PEDNF wird durch Injektion in den Glaskörper (intravitreal), unter die Netzhaut (subretinal), intravenös oder intramuskulär oder aber durch Injektion oder Anwendung an den Orten des Tumorwachstums verabreicht. PEDNF kann allein oder in Verbindung mit Stoffen wie Polymilchsäure verabreicht werden, welche eine langsame, zeitlich verzögerte Freisetzung von PEDNF fördert. Üblicherweise werden etwa 0,01 bis etwa 10 μg PEDNF pro Dosis bei einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml in physiologischer Kochsalzlösung oder anderen gepufferten Lösungen und etwa 0 bis etwa 10 Dosen pro Tag verabreicht. Wenn Substanzen zur verzögerten Freisetzung in der Zusammensetzung enthalten sind, werden sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml verwendet. Die Behandlung wird fortgesetzt bis das Tumorwachstum zum Stillstand kommt und/oder ein Tumorrückgang zu verzeichnen ist.
Die Behandlung mit PEDNF ist bei Tumoren der Netzhaut wie Retinoblastoma, bei neuronalen Tumoren wie Neuroblastoma oder bei Tumoren nicht-neuronalen Ursprungs wirksam. Die Behandlung führt zum Stillstand oder Rückgang der Zellteilungsrate und einer damit einhergehenden Verminderung der Tumorwachstumsrate, was wiederum zum Tumorrückgang führt.
B. Neurotrophe Behandlung von Erkrankungen des Auges
PEDNF wird allein oder in Verbindung mit anderen klinischen (wie zum Beispiel chirurgischen) Verfahren verabreicht. PEDNF wird durch Injektion in den Glaskörper (intravitreal) oder unter die Netzhaut (subretinal) verabreicht. PEDNF kann allein oder in Verbindung mit Stoffen wie Polymilchsäure verabreicht werden, welche eine langsame, zeitlich verzögerte Freisetzung von PEDNF fördert. Üblicherweise werden etwa 0,01 bis etwa 10 μg PEDNF pro Dosis bei einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml in physiologischer Kochsalzlösung oder anderen gepufferten Lösungen und etwa 0 bis etwa 10 Dosen pro Tag verabreicht. Wenn Substanzen zur verzögerten Freisetzung in der Zusammensetzung enthalten sind, werden sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml verwendet. Die Behandlung wird fortgesetzt bis die Erkrankung zum Stillstand gebracht und/oder rückgängig gemacht wird.
Die Behandlung mit PEDNF zielt auf Erkrankungen der neuralen Netzhaut, des pigmentierten Netzhautepithels oder anderen Augenerkrankungen. Die Behandlung verbessert das Überleben und Wohlergehen der Photorezeptorzellen und anderer Zellen des Auges, verlängert ihre funktionstüchtige Lebensspanne und verzögert das Einsetzen von Sehstörungen und endgültiger Erblindung.
C. Neurotrophe Behandlung von verletzten Nerven
PEDNF wird allein oder in Verbindung mit anderen klinischen (wie zum Beispiel chirurgischen) Verfahren verabreicht. PEDNF wird durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion oder aber durch Anwendung oder Injektion an den Orten der Nervenverletzung verabreicht. PEDNF kann allein oder in Verbindung mit Stoffen wie Polymilchsäure verabreicht werden, welche eine langsame, zeitlich verzögerte Freisetzung von PEDNF fördert. Üblicherweise werden etwa 0,01 bis etwa 10 μg PEDNF pro Dosis bei einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml in physiologischer Kochsalzlösung oder anderen gepufferten Lösungen und etwa 0 bis etwa 10 Dosen pro Tag verabreicht. Wenn Substanzen zur verzögerten Freisetzung in der Zusammensetzung enthalten sind, werden sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml verwendet. Die Behandlung wird fortgesetzt bis die Regeneration der Nerven abgeschlossen ist.
Die Behandlung mit PEDNF zielt auf die Verletzung von Nerven. Die Behandlung führt zur Förderung des Auswachsens von Neuriten und zur Regeneration von Nerven.
D. Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit Serinproteasen
PEDNF ist ein Serinproteaseinhibitor. Als solcher ist er wirksam bei der Behandlung von Erkrankungen, die durch Serinproteasen hervorgerufen werden oder bei denen ein Serinproteaseinhibitor von Vorteil wäre. Serinproteasen sind unter anderem, jedoch nicht ausschließlich, Chymotrypsin, Trypsin, Subtilisin, Elastin, Thrombin, und Plasmin. Daher ist PEDNF von Nutzen als Gerinnungshemmer, als Thrombosehemmer, als antimikrobieller, als antifungaler und als antiparasitischer Wirkstoff und als Verhütungsmittel; in kosmetischen Zubereitungen als Proteinaseinhibitor; als Gewichtszunahmeförderer; bei der Behandlung von Elastose, Gefäßerkrankungen mit Fibrinoiderzeugung, Gerinnungsstörungen, Arteriosklerose, Ischämie, diabetischer Arthrose, Emphysem, Arthritis, septischem Schock, Lungenerkrankungen, übermäßiger Komplementaktivierung, Geschwüren, Dickdarmgeschwüren, Entzündungen der Bauchspeicheldrüse, Schuppenflechte, fibrinolytischen Erkrankungen, Gelenkerkrankungen, Knochenresorption, Bluthochdruck, Herzversagen durch Gefäßverschluss, Zirrhose oder durch Proteasen ausgelöster Allergien. Für die Verwendung als Gerinnungshemmer, als Thrombosehemmer, als antimikrobieller, als antiparasitischer Wirkstoff und als Verhütungsmittel, oder bei der Behandlung von Elastose, Gefäßerkrankungen mit Fibrinoiderzeugung, Gerinnungsstörungen, Arteriosklerose, Ischämie, diabetischer Arthrose, Emphysem, Arthritis, septischem Schock, Lungenerkrankungen, übermäßiger Komplementaktivierung, Entzündungen der Bauchspeicheldrüse, Schuppenflechte, fibrinolytischer Erkrankungen, Gelenkerkrankungen, Knochenresorption, Bluthochdruck, Herzversagen durch Gefäßverschluss, Zirrhose oder durch Proteasen ausgelöster Allergien, wird PEDNF durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion oder örtliche Injektion oder Anwendung verabreicht. PEDNF kann allein oder in Verbindung mit Stoffen wie Polymilchsäure verabreicht werden, welche eine langsame, zeitlich verzögerte Freisetzung von PEDNF fördert. Üblicherweise werden etwa 0,01 bis etwa 10 μg PEDNF pro Dosis bei einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml in physiologischer Kochsalzlösung oder anderen gepufferten Lösungen und etwa 0 bis etwa 10 Dosen pro Tag verabreicht. Wenn Substanzen zur verzögerten Freisetzung in der Zusammensetzung enthalten sind, werden sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml verwendet. Die Behandlung wird fortgesetzt bis die Erkrankung zum Stillstand gebracht und/oder rückgängig gemacht wird.
Die Behandlung mit PEDNF zielt auf die Verletzung von Nerven. Die Behandlung führt zur Förderung des Auswachsens von Neuriten und zur Regeneration von Nerven.
Für die Verwendung in kosmetischen Zubereitungen als Proteinaseinhibitor, bei Arthritis oder Elastose wird PEDNF in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 100 μg/ml zu den Zubereitungen hinzugefügt.
Für die Verwendung als Gewichtszunahme-Förderer und für die Behandlung von Geschwüren, Dickdarmgeschwüren oder Entzündungen der Bauchspeicheldrüse, kann PEDNF oral in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 10 μg pro kg Körpergewicht pro Tag angewendet werden.
Für die Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen wie der Schuppenflechte, kann PEDNF topisch in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 100 μg/ml zubereitet in einer geeigneten Trägersubstanz verabreicht werden.
Beispiel 1
Anlegen von RPE-Zellkulturen
RPE-Zellen wurden aus menschlichen Augen post-mortem gewonnen, wie von Pfeffer (1991) beschrieben. Die Zellen wurden in 75 cm²-Flaschen mit „Eagle's Minimal Essential Medium" versetzt mit 15% fötalem Kälberserum bei 5% Kohlendioxid und 37°C gezüchtet. Die Zellen wurden bis zum Erreichen einer geschlossenen Zellschicht heranwachsen gelassen, durch Trypsinbehandlung der einzelligen Schicht geerntet und in MEM mit 15% fötalem Kälberserum resuspendiert. Ein Teil der Zellen (etwa 5%) wurde in neue 75 cm²-Flaschen wiederausgesät, worauf die Zellen wieder bei 5% CO₂ und 37°C wuchsen.
Beispiel 2
Herstellung von RPE-konditioniertem Medium
Zusammengewachsene Kulturen von RPE-Zellen wurden vor der Konditionierung ausgiebig mit HBSS gewaschen, um Serumproteine zu entfernen. 25 ml serumfreies Medium wurden zugesetzt und die Kulturen für 48 Stunden bei 5% CO₂ und 37°C bebrütet. Das konditionierte Medium wurde dann gesammelt und bei 1.000 UpM bei Raumtemperatur zentrifugiert, um jegliche freien Zellen und andere Teilchen zu entfernen, wodurch man eine unreine PEDNF-Proteinfraktion erhält.
Beispiel 3
Reinigung von PEDNF durch SDS-Gelelektrophorese
Proteine, die in von menschlichen fötalen RPE konditioniertem Medium, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, und in nicht-konditioniertem Medium enthalten sind, wurden auf einem SDS-Polyacrylamidplattengel analysiert.
Die konditionierten und nicht-konditionierten Medienproben wurden mit einem Elektrophorese-Probenpuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 0,001% Bromphenolblau und 0,1 M 2-Mercaptoethanol) gemischt. Molekulargewichts-Markierungsproteine, wie Phosphorylase B, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Carboanhydrase, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Lysozym (erhältlich zum Beispiel von Bio-Rad), wurden ebenfalls mit einem Elektrophorese-Probenpuffer gemischt. Alle Proben wurden bei 100°C für 5 Min. in einem kochenden Wasserbad denaturiert und auf ein SDS-enthaltendes 7,5%-iges Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 20 mA durchgeführt, bis die Bromphenolblau-Farbmarkierung zum unteren Ende des Gels gewandert war.
Nach Abschluss der Elektrophorese wurden Streifen von jeder Außenseite des Gels mit den Markierungsproben und je eine Spur mit konditioniertem und mit nicht-konditioniertem Medium mit Coomassie-Blau gefärbt. Die gefärbten Proteinbanden, die auf den gefärbten Gelstreifen erschienen, wurden an den ungefärbten Teil des Gels angelegt, so dass die Position der Proteine abgelesen werden kann, die im konditionierten Medium vorhanden sind, jedoch im nicht-konditioniertem Medium fehlen.
Die PEDNF-Proteindoppelbande mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 50.000 bis etwa 55.000, die einzigartig für das RPE-CM war, wurde ausgeschnitten und die Proteine wurden aus dem ungefärbten Teil des Gels elektroeluiert. Ein Streifen desselben Gels, der aus der Region ausgeschnitten wurde, die Rinderserumalbumin enthielt, wurde gleich behandelt, um als Kontrolle zu dienen. Das Eluat wurde zentrifugiert, um Gelfragmente zu entfernen und der Überstand wurde dialysiert und durch Gelelektrophorese analysiert, um seine Reinheit zu überprüfen. Das Elektrophoresemuster der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ist in 1 dargestellt.
Die Elektrophoresemuster von menschlichem fötalen RPE-CM und nicht-konditioniertem Kontrollmedium zeigt die Anwesenheit einer auffälligen PEDNF-Doppelbande mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 bis etwa 55.000, die ausschließlich im konditionierten Medium vorkommt.
Beispiel 4
Ammoniumsulfatausfällung im kleinen Maßstab
Eine unreine PEDNF-Proteinfraktion, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde in sechs 10 ml Proben aufgeteilt. Eine dieser Proben wurde auf 40% Sättigung bei 20°C durch Zugabe von 2,42 g Ammoniumsulfat eingestellt; eine andere Probe wurde auf 50% Sättigung bei 20°C durch Zugabe von 3,14 g Ammoniumsulfat eingestellt; eine andere Probe wurde auf 60% Sättigung bei 20°C durch Zugabe von 3,90 g Ammoniumsulfat eingestellt; eine andere Probe wurde auf 70% Sättigung bei 20°C durch Zugabe von 4,72 g Ammoniumsulfat eingestellt; eine andere Probe wurde auf 80% Sättigung bei 20°C durch Zugabe von 5,61 g Ammoniumsulfat eingestellt; eine andere Probe wurde auf 90% Sättigung bei 20°C durch Zugabe von 6,57 g Ammoniumsulfat eingestellt. Die Proben wurden durchmischt bis das Ammoniumsulfat vollständig aufgelöst war. Die Niederschläge, die sich in jedem Röhrchen bildeten, wurden durch Zentrifugation bei 10.000 UpM für 20 Min. gesammelt. Die Niederschläge wurden in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, resuspendiert und gegen 2 l 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5 für 24 Stunden dialysiert.
Die Proben wurden dann gesammelt und wie in Beispiel 3 beschrieben der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel unterzogen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1

% Ammoniumsulfatsättigung relative PEDNF-Konzentration

40 –

50 –

60 +

70 +++

80 –

90 –
Die Ergebnisse zeigen, dass PEDNF bei einer Ammoniumsulfatsättigung von 60% bis 70% ausfällt. Die kleine Menge an PEDNF in den 50% bis 60%-igen Proben weist darauf hin, dass eine gewisse Menge an PEDNF enthalten ist und dass der zur Ausfällung geeignete Bereich der Ammoniumsulfatsättigung bei 50% bis 70% liegt. Die Proben wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Die Reinheit von PEDNF in der 60%- bis 70%-igen Ammoniumsulfatfraktion konnte auf etwa 50% geschätzt werden.
Beispiel 5
Ammoniumsulfatausfällung
Eine unreine PEDNF-Proteinfraktion, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde auf eine 50%-ige Ammoniumsulfatsättigung bei 20°C durch Zugabe von 313 g/l Ammoniumsulfat eingestellt.
Das Ammoniumsulfat wurde langsam zu der unreinen Proteinfraktion gegeben, während die Lösung mit einem Rührstab auf einem mechanischen Rührgerät gerührt wurde. Nachdem das Ammoniumsulfat vollständig zugegeben wurde, wurde die 50%-ige Ammoniumsulfatlösung für 30 Min. bei 20°C gerührt. Die 50%-ige Ammoniumsulfatlösung wurde dann bei 10.000 g bei 20°C für 20 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt.
Die 50%-ige Ammoniumsulfatlösung wird dann durch Zugabe von 137 g/l Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 70% eingestellt. Das Ammoniumsulfat wurde langsam zugegeben und nachdem das Ammoniumsulfat vollständig zugegeben wurde, wurde die 70%-ige Ammoniumsulfatlösung für 30 Min. bei 20°C gerührt. Die 70%-ige Ammoniumsulfatlösung wurde zentrifugiert oder filtriert wie oben beschrieben und der Niederschlag wurde gesammelt.
Der Niederschlag nach Ammoniumsulfatfällung wurde dann in 10 mM Natriumphosphat, pH 7, wieder gelöst, wodurch man eine 55–70%-ige Ammoniumsulfatfraktion erhält, dann unter Verwendung einer „Amicon Diaflo"-Ultrafiltrationseinheit diafiltriert, oder gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7, dialysiert, um das Ammoniumsulfat aus der wieder gelösten 55–70%-igen Fraktion zu entfernen.
Die Proben wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Die Reinheit von PEDNF in der 55%- bis 70%-igen Ammoniumsulfatfraktion konnte auf etwa 50% geschätzt werden.
Beispiel 6
Kationenaustauschchromatographie
RPE-CM, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert, um Medium und Salze aus der unreinen Proteinprobe zu entfernen. Die dialysierte PEDNF-Probe wurde dann auf ein Brownlee-Aquapore CX-300 HPLC-Chromatographiemedium, das in eine 4,6 × 30 mm Säule gepackt war, aufgetragen. Das Chromatographiemedium wurde zuvor mit 10 mM Phosphat, pH 6,5, äquilibriert. Das dialysierte RPE-CM wurde auf das Chromatographiemedium aufgebracht und das Chromatographiemedium mit dem PEDNF wurde mit 10 mM Phosphat, pH 6,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen waren. PEDNF wurde vom Chromatographiemedium mit einem linearen Salzgradienten von etwa 0,0 bis etwa 0,5 M NaCl in 10 mM Phosphat, pH 6,5, eluiert. PEDNF eluierte bei einer NaCl-Konzentration von etwa 0,25 M. Der eluierte PEDNF wurde durch Gefriertrocknung konzentriert und in 10 mM Phosphat, pH 6,5, wieder gelöst. Der eluierte PEDNF wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Gelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass der eluierte PEDNF zu etwa 70% rein war.
Beispiel 7
Reinigung von PEDNF durch Kationenaustauschchromatographie-HPLC
Mit Ammoniumsulfat ausgefälltes RPE-CM, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Eine Probe von 80 μl der dialysierten durch Ammoniumsulfat gereinigten PEDNF-Proteinfraktion wurde auf ein Brownlee-Aquapore CX-300 HPLC-Chromatographiemedium, das in eine 4,6 × 30 mm Säule gepackt war, aufgetragen. Das Chromatographiemedium wurde zuvor mit 10 mM Phosphat, pH 7,2, äquilibriert. Das PEDNF/Chromatographiemedium wurde mit 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen waren. PEDNF wurde vom Chromatographiemedium mit einem linearen Salzgradienten von 0,0 bis etwa 0,5 M NaCl in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, eluiert. PEDNF eluierte als einzelner Peak bei einer NaCl-Konzentration von etwa 0,25 M.
Der eluierte PEDNF wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, dialysiert, gefriergetrocknet und in Wasser wieder gelöst. Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass der eluierte PEDNF zu etwa 70% rein war.
Beispiel 8
Reinigung von PEDNF durch Phasenumkehr-HPLC
Mit Ammoniumsulfat ausgefälltes RPE-CM, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Eine PEDNF enthaltende Probe von 80 μl wurde dann auf ein Vydac-C8-Chromatographiemedium, das in eine 4,6 × 250 mm Säule gepackt war, aufgetragen. Das Chromatographiemedium wurde zuvor mit 0,1% TFA in Wasser äquilibriert. Das PEDNF/Chromatographiemedium wurde mit 0,1% TFA in Wasser gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen waren. PEDNF wurde vom Chromatographiemedium mit einem linearen Gradienten von 0,0 bis etwa 95% CH₃CN, 0,1% TFA in Wasser und 5% H₂O eluiert.
Der eluierte PEDNF wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, dialysiert, gefriergetrocknet und in Wasser wieder gelöst. Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass der von der Säule eluierte PEDNF zu etwa 80% rein war.
Beispiel 9
Reinigung von PEDNF durch Phasenumkehr-HPLC
Eine PEDNF enthaltende Probe, teilweise gereinigt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde dann auf ein Vydac-C8-Chromatographiemedium, das in eine 4,6 × 250 mm Säule gepackt war, aufgetragen. Das Chromatographiemedium wurde zuvor mit 0,1% TFA in Wasser äquilibriert. Das PEDNF/Chromatographiemedium wurde mit 0,1% TFA in Wasser gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen waren. PEDNF wurde vom Chromatographiemedium mit einem linearen Gradienten von 0,0 bis etwa 95% CH₃CN in 0,1% TFA und 5% H₂O eluiert.
Der eluierte PEDNF wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, dialysiert, gefriergetrocknet und in Wasser wieder gelöst. Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass der von der Säule eluierte PEDNF zu etwa 60% rein war.
Beispiel 10
Reinigung von PEDNF durch Phasenumkehr-HPLC
Eine PEDNF enthaltende Probe, teilweise gereinigt wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde dann auf ein Vydac-C8-Chromatographiemedium, das in eine 4,6 × 250 mm Säule gepackt war, aufgetragen. Das Chromatographiemedium wurde zuvor mit 0,1% TFA in Wasser äquilibriert. Das PEDNF/Chromatographiemedium wurde mit 0,1% TFA in Wasser gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen waren. PEDNF wurde vom Chromatographiemedium mit einem linearen Gradienten von 0,0 bis etwa 95% CH₃CN in 0,1% TFA und 5% H₂O eluiert.
Der eluierte PEDNF wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, dialysiert, gefriergetrocknet und in Wasser wieder gelöst. Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass der von der Säule eluierte PEDNF zu etwa 80% rein war.
Beispiel 11
Reinigung von PEDNF durch Phasenumkehr-HPLC
Eine PEDNF enthaltende Probe, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde auf ein Brownlee RP-300 Chromatographiemedium, das in eine 4,6 × 250 mm Säule gepackt war, aufgetragen. Das Chromatographiemedium wurde zuvor mit 0,1% TFA in Wasser äquilibriert. Das PEDNF/Chromatographiemedium wurde mit 0,1% TFA in Wasser gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen waren. PEDNF wurde vom Chromatographiemedium mit einem linearen Gradienten von 0,0 bis etwa 95% CH₃CN in 0,1% TFA und 5% H₂O eluiert.
Der eluierte PEDNF wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, dialysiert, gefriergetrocknet und in Wasser wieder gelöst. Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass der von der Säule eluierte PEDNF zu etwa 90% rein war.
Beispiel 12
Reinigung von PEDNF durch Größenausschlusschromatographie
Teilweise gereinigter PEDNF, hergestellt wie in Beispiel 5 oder 6 beschrieben, wurde durch Chromatographie auf einem Bio-Rad TSK-250 Chromatographiemedium, das in eine 7,5 × 300 mm Säule gepackt war, weiter gereinigt. Eine Probe von 40 μl wieder gelöstem PEDNF wurde auf das Größenausschlusschromatographiemedium, welches zuvor mit 20 mM Tris, pH 7,0, 0,6 M NaCl äquilibriert wurde, aufgetragen. PEDNF wurde mit 20 mM Tris, pH 7,0, 0,6 M NaCl eluiert.
Der eluierte PEDNF wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, dialysiert, gefriergetrocknet und in Wasser wieder gelöst. Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass der von der Säule eluierte PEDNF zu etwa 75% rein war.
Beispiel 13
Anionenaustauschchromatographie
DEAE-Cellulose wird mit 10 mM Tris, pH 7,5, äquilibriert. PEDNF, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wird mit 10 mM Tris, pH 7,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind. Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wird PEDNF mit einem linearen Gradienten von 0 bis etwa 1 M NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, eluiert. Die PEDNF enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und vereinigt. Diese Fraktionen werden dann gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, diafiltriert, um NaCl zu entfernen.
Beispiel 14
Anionenaustauschchromatographie
DEAE-Cellulose wird mit 10 mM Tris, pH 7,5, äquilibriert. PEDNF, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wird mit 10 mM Tris, pH 7,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind. Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wird PEDNF mit einem linearen Gradienten von 0 bis etwa 1 M NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, eluiert. Die PEDNF enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und vereinigt. Diese Fraktionen werden dann gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, diafiltriert, um NaCl zu entfernen.
Beispiel 15
Kationenaustauschchromatographie
Bio-Rex 70 Resin-Cellulose (Bio-Rad) wird mit 10 mM PBS, pH 7,2, äquilibriert. PEDNF, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wurde mit 10 mM PBS, pH 7,2, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind. Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wird PEDNF mit einem linearen Gradienten von 0 bis etwa 1 M NaCl in 10 mM PBS, pH 7,2, eluiert. Die PEDNF enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und vereinigt. Diese Fraktionen werden dann gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, diafiltriert, um NaCl zu entfernen.
Beispiel 16
Kationenaustauschchromatographie
Bio-Rex 70 Resin-Cellulose (Bio-Rad) wird mit 10 mM PBS, pH 7,2, äquilibriert. PEDNF, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wird mit 10 mM PBS, pH 7,2, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind. Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wurde PEDNF mit einem linearen Gradienten von 0 bis etwa 1 M NaCl in 10 mM PBS, pH 7,2, eluiert. Die PEDNF enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und vereinigt. Diese Fraktionen werden dann gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, diafiltriert, um NaCl zu entfernen.
Beispiel 17
Heparin Chromatographie
2 ml Heparin-Agarose wurden in eine 0,7 × 10 cm Säule gepackt, mit 20 ml 10 mm Tris-HCl, pH 7,5, 3 M NaCl gewaschen und dann mit 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, äquilibriert. 12 ml einer PEDNF-Lösung, hergestellt wie in Beispiel 2, von einem 17 jährigen menschlichen Spender, wurden gegen 4 l 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, bei 4°C für 19 h dialysiert. Das Volumen nach der Dialyse betrug 19 ml. Das Dialysat wurde bei einer Flussrate von 0,4 ml/Min. auf die Heparin-Agarose aufgetragen. Nachdem die PEDNF-Lösung auf die Heparin-Agarose aufgetragen war, wurde die Heparin-Agarose mit 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, um die ungebundenen Proteine von der Heparin-Agarose zu entfernen. PEDNF wurde dann von der Heparin-Agarose mit 12 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M NaCl eluiert.
Das PEDNF enthaltende Eluat wurde gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert, um im Eluat enthaltenes NaCl zu entfernen. Das dialysierte Eluat wurde gefriergetrocknet, in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wieder gelöst und eine Probe wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, einer 12,5%-igen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass das PEDNF-Eluat zu etwa 60% rein war.
Beispiel 18
Heparin Chromatographie
2 ml Heparin-Agarose wurden in eine 0,7 × 10 cm Säule gepackt, mit 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M NaCl gewaschen und dann mit 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, äquilibriert. 1 ml einer PEDNF-Lösung, hergestellt wie in Beispiel 5, wurde gegen 4 l 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, bei 4°C für 19 h dialysiert. Das Volumen des Dialysats betrug 1,3 ml. Das Dialysat wurde bei einer Flussrate von 0,4 ml/Min. auf die Heparin-Agarose aufgetragen. Nachdem die PEDNF-Lösung auf die Heparin-Agarose aufgetragen war, wurde die Heparin-Agarose mit 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, um die ungebundenen Proteine von der Heparin-Agarose zu entfernen. Die Heparin-Agarose wurde dann nacheinander eluiert mit: 12 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl; 12 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl: 12 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 M NaCl; und 12 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M NaCl.
Jedes der Eluate wurde gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert, um im Eluat enthaltenes NaCl zu entfernen. Die dialysierten Eluate wurden dann gefriergetrocknet, in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wieder gelöst und eine Probe von jedem dialysierten Eluat wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, einer 12,5%-igen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Es wurde geschätzt, dass das PEDNF-Eluat zu etwa 70% rein war.
Beispiel 19
Neuronale Induktivität und Differenzierungsaktivität des isolierten PEDNF
Elektroeluierter PEDNF wurde wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Um die neuronale induktive Aktivität des isolierten PEDNF zu charakterisieren, wurden die optimale Konzentration und Stimulierungszeitspanne vor der Zelleinsaat bestimmt. Entweder 1, 2, 4, 6, 8, oder 10 μg/ml des elektroeluierten PEDNF wurden in serumfreiem DME, versetzt mit 1 mM Natriumpyruvat, 0,625 mM Hepes, 6 mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin und 5 ng/ml Selensäure, getestet. Als Kontrolle diente auch RPE-CM, welches mit einem gleichen Volumen nicht-konditionierten Mediums (50% RPE-CM) verdünnt wurde.
Die Y79-RB-Zellen wurden als Suspensionskultur gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für etwa 5 Min. bei 900 UpM bei Raumtemperatur geerntet und in serumfreiem DME-Medium resuspendiert, welches zuvor auf 37°C erwärmt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in einer Konzentration von 10⁶ ml in serumfreiem DME-Medium resuspendiert. 1, 2, 4, 6, 8, oder 10 μg/ml des elektroeluierten PEDNF oder 50% RPE-CM wurden zu getrennten Y79-RB-Zellkulturen zugegeben. Die Zellen wurden für 7 Tage bei 37°C bebrütet und dann an Poly-D-Lysin-beschichtete Flaschen gebunden. Die Zellen wurden täglich durch Phasenkontrastmikroskopie überprüft.
Die optimale Zeitspanne vor der Einsaat, die für die maximale induktive Aktivität von PEDNF benötigt wird, wurde durch Behandlung der Y79-RB-Zellkulturen mit 2 μg/ml elektroeluiertem PEDNF für 2, 4, 8 oder 16 Tage vor der Einsaat auf ein Poly-D-Lysin-Substrat getestet. Zusätzlich wurden 1 oder 2 μg/ml elektroeluierter PEDNF zu den angehefteten Kulturen der Zellen, die nicht zuvor in Suspensionskultur stimuliert wurden, gegeben. Mehr als 80% der Y79-Zellaggregate, die mit 2 μg/ml elektroeluiertem PEDNF behandelt wurden, bildeten verzweigte Zetlfortsätze innerhalb von 8-10 Tagen nach Anheftung an ein Poly-D-Lysin-Substrat; unbehandelte Zellen zeigten nur geringfügige Anzeichen neuronaler Differenzierung (2).
Y79-Zellen zeigten eine maximale Differenzierungsantwort auf elektroeluierten PEDNF bei einer Proteinkonzentration von 2 μg/ml; die Antwort war bei Konzentrationen, die 4 μg/ml überstiegen, verringert. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt.
Tabelle II
Eine Stimulationszeit vor der Einsaat (in Suspensionskultur) von 8 Tagen in Gegenwart dieses Faktors führt zu maximaler Differenzierung von Y79-Zellen am Tag 10 nach der Anheftung. Reduzierte Differenzierungshäufigkeiten (weniger als 50%) werden sowohl bei kürzeren als auch bei längeren Induktionszeiten vor der Einsaat beobachtet. Außerdem zeigen Zellen, die nicht vor der Anheftung mit PEDNF stimuliert wurden, eine niedrige Häufigkeit der neuronalen Differenzierung (ungefähr 20%), wenn 1–2 μg/ml elektroeluiertes Protein nach der Anheftung zugegeben werden. Diese Antwort ist jedoch relativ langsam, d. h. weniger als 15 Tage. Zur Kontrolle mit BSA behandelte Kulturen zeigen weniger als 10% Differenzierung, vergleichbar mit Zellen, die ausschließlich mit nicht-konditioniertem Medium behandelt wurden.
PEDNF rief ein hohes Maß an neuronaler Differenzierung in menschlichen Retinoblastoma-Zellen hervor. Das Auswachsen langer, verästelter neuritischer Fortsätze aus den Aggregaten der stimulierten Zellen wurde angeregt; eine damit einhergehende Erhöhung der Expression der neuronalen Markermoleküle, Neuron-spezifische Enolase und des 200.000-Molekulargewicht-Neurofilament-Proteins wurden auch beobachtet. An der Expression des neuronalen Phänotyps in Y79-Zellen scheinen drei aufeinander folgende Ereignisse beteiligt zu sein: 1) Stimulation der Zellen in Suspensionskultur durch PEDNF; 2) Anheftung der stimulierten Zellen an ein Substrat; gefolgt von 3) Auswachsen von Neuriten aus den angehefteten, stimulierten Zellen. Da nur 20% Differenzierung beobachtet wurde, wenn nichtstimulierte, angeheftete Kulturen mit PEDNF behandelt wurden, scheint die Entscheidung zur neuronalen Differenzierung in Y79-Zellen der Anheftung der Zellen und dem Auswachsen der Neuriten vorauszugehen und wird möglicherweise während der Stimulationszeit eingeleitet.
Beispiel 20
Vergleich der Wirkung von RPE-CM von verschiedenen Arten
Zellkulturen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben angelegt, jedoch stammten die Augen aus denen die Zellen gewonnen wurden entweder von menschlichen Föten, erwachsenen Menschen, fötalen Ratten, erwachsenen Ratten oder embryonalen Hühnern.
RPE-CM wurde von allen Zellkulturen wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Fötale menschliche Zellkulturen, die frisch angelegt wurden (Kurzzeitkulturen) und Kulturen, die für 6 Monate angelegt wurden (Langzeitkulturen) wurden mit eingeschlossen.
Die Differenzierungsaktivität der konditionierten Medien wurde wie in Beispiel 19 beschrieben bestimmt.

Die Ergebnisse der Experimente zur Messung der Effekte des RPE-CM von verschiedenen Arten sind in Tabelle III zusammengefasst. Tabelle III

Herkunft des RPE-konditionierten Mediums	% differenzierte Aggregate
Mensch (fötal, Kurzzeitkulturen)	88 ± 3
Mensch (fötal, Langzeitkulturen)	50 ± 8
Mensch (erwachsen)	55 ± 9
Ratte (erwachsen)	20 ± 11
Ratte (fötal)	42 ± 7
Huhn (embryonal)	86 ± 7

Die Tabelle fasst die induktive Aktivität verschiedener RPE-konditionierter Medien auf Y79-Zellen zusammen. Angegeben sind die Prozentzahlen der für 10 Tage angehefteten Aggregate (mehr als 5 Zellen/Aggregat), die ein Auswachsen von Neuriten nach 7-tägiger Stimulation mit 50% RPE-CM von verschiedenen Arten zeigen. 100 Aggregate wurden von jeder Probe in dreifacher Ausfertigung gezählt.
Die größte Differenzierungsantwort in Y79-Zellen wird durch menschliches fötales RPE-CM (Kurzzeitkulturen) und RPE-CM vom embryonalen Huhn hervorgerufen; beide rufen eine neuronale Differenzierung in mehr als 80% der zellulären Aggregate hervor, wenn sie in einer 50%-igen Konzentration eingesetzt werden. Im Gegensatz dazu werden verringerte Häufigkeiten (weniger als 50%) der zellulären Differenzierung für die konditionierten Medien von Langzeitkulturen (12–18 Monate) von menschlichem fötalen RPE und erwachsenem menschlichen RPE beobachtet. Nur 40% Neuronen-ähnlicher Differenzierung wird durch RPE-CM von fötalen Ratten und 20% durch RPE-CM von erwachsenen Ratten hervorgerufen.
Konditionierte Medien von menschlichem fötalen und embryonalem Hühner-RPE enthält eine ähnliche neurotrophe Aktivität, während diejenigen von erwachsenen Kulturen (Huhn und Ratte) und von Langzeitkulturen von menschlichem fötalen RPE-CM weniger wirksam bei der Förderung des neuronalen Phänotyps in Y79-Zellen sind. Es ist möglich, dass reife RPE-Zellen den neurotrophen Faktor nicht mehr absondern, oder dass sie verringerte Mengen absondern, die bei den verwendeten Kulturbedingungen weniger wirksam sind. Die Tatsache, dass eine gewisse neurotrophe Aktivität in RPE-konditionierten Medien von anderen Arten gefunden wird, legt nahe, dass PEDNF oder ein ähnlicher Faktor auch durch RPE-Zellen von anderen Arten abgesondert wird und grundsätzlich wichtig für die normale Entwicklung und Funktion der Netzhaut sein kann.
Beispiel 21
Zweidimensionale Gelelektrophorese
Eine zweidimensionale Gelanalyse wurde nach der von O'Farrell, J. Biol. Chem., 250, 4007– 4021 (1975) und Jones, J., J. Exp. Med. 14b, 1251–1279 (1977) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Silberfärbung wurde mit dem Bio-Rad „Silver-Stain Plus Kit" durchgeführt. 20 μg PEDNF, gereinigt über Kationenaustausch- und Größenausschluss-HPLC, wurden auf ein IEF-Kapillargel aufgetragen.
Eine zweidimensionale elektrophoretische Analyse von HPLC-gereinigtem PEDNF zeigt die Anwesenheit von vier eng gebündelten Molekülarten (3). Die vier Arten variieren leicht in ihrem relativen Molekulargewicht, aber alle befinden sich in der Molekulargewichtsregion 50.000 des Gels, was mit dem zuvor bestimmten Molekulargewicht von PEDNF übereinstimmt. Die aufgelösten Arten variieren auch geringfügig in ihrem isoelektrischen Punkt, was auf leichte Variationen bei der posttranslationalen Modifikation hindeutet. Die Aminosäuresequenzanalyse (siehe Beispiel 22) wies jedoch auf die Anwesenheit eines einzigen Polypeptids hin.
Beispiel 22
Isolierung von PEDNF-spezifischen Peptiden und Aminosäuresequenz
180 μg gereinigter PEDNF (gereinigt wie in den Beispielen 2, 6 und 12 beschrieben) wurden mit einem Centricon-10 Mikrokonzentrator, erhältlich bei Amicon, Danvers, MA, konzentriert und dann in 25 mM Tris, pH 8,5, 1 mM EDTA verdünnt. Zu der Proteinprobe wurde Endoproteinase Lys-C gegeben. Das PEDNF/Proteinase-Gemisch wurde für etwa 18 Stunden bei 30°C belassen, um PEDNF zu spalten.
Die erhaltenen PEDNF-Polypeptidfragmente wurden mittels HPLC auf einer Vydac C8 Phasenumkehr-HPLC, gepackt in eine 4,6 × 250 mm Säule, getrennt. Die Säule wurde mit 0,1% TFA in Wasser äquilibriert. Die Polypeptide wurden mit 90% CH₃CN, 0,1% TFA in Wasser eluiert.
Die von der Säule eluierten Polypeptide, die von anderen Polypeptiden gut getrennt waren, wurden gesammelt und der Proteinsequenzanalyse unterzogen. Die Aminosäuresequenzanalyse wurde im Auftrag bei der Mikrosequenzierungseinrichtung des Beckman Forschungsinstituts am City of Hope durchgeführt.
Die Aminosäuresequenzen der isolierten Polypeptide waren wie folgt:
Die Sequenzierung von PEDNF-13 ergab 19 Reste mit eindeutiger Sequenz. PEDNF-14 ergab 26 Reste von denen 25 eindeutig waren. Die Identifizierung von Rest 23 in PEDNF-14 als Tryptophan war nicht absolut sicher.
Beispiel 23
Isolierung von PEDNF-spezifischen Peptiden und Aminosäuresequenz
PEDNF, gereinigt wie in den Beispielen 2, 6 und 12 beschrieben, wurde reduziert und alkyliert. Die Probe wurde getrocknet, in 50 μl CRA-Puffer (8 M Harnstoff, 0,4 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,0) wieder gelöst und 5 μl 45 mM DTT (Calbiochem) wurden zugegeben. Nach Erhitzen bei 50°C für 15 Min. wurde die Lösung gekühlt und 5 μl 100 mM Jodessigsäure (Sigma Chemical. Co.) wurden zugegeben. Nach 15 Minuten wurde die Lösung auf eine Konzentration von 2 M Harnstoff verdünnt und einer Trypsinspaltung unterworfen (erhältlich bei Boehringer-Mannheim), unter Verwendung eines Enzym : Substrat-Verhältnisses von 1 : 25 (Gew./Gew.) für 22 Std. bei 37°C.
Tryptische Peptide wurden durch eine Engbohrung-Phasenumkehr-HPLC auf einer Hewlett-Packard-1090-HPLC, ausgestattet mit einem 1040-Diodenarray-Detektor und unter Verwendung einer Vydac 2,1 mm × 150 mm C18-Säule, getrennt. Puffer A war 0,06% Trifluoressigsäure/H₂O und Puffer B war 0,055% Trifluoressigsäure/Acetonitril. Ein Gradient von 5% B bei 0 Min., 33% B bei 63 Min., 60% B bei 95 Min. und 80% B bei 105 Min., mit einer Flussrate von 150 μl/Min. wurde angewendet. Chromatographische Daten bei 210, 277 nm und UV Spektren von 209 bis 321 nm wurden von jedem Peak erhalten. Proben für die aminoterminale Sequenzanalyse wurden auf einen vorzyklisierten Polybren-Glasfaserfilter aufgetragen und dem automatisierten Edman-Abbau bei der Harvard-Microchemical- Einrichtung in Boston, MA, auf einem ABI Modell 477A Gasphasen-Proteinsequenzierer unter Verwendung des Programms NORMAL 1 unterworfen. Die erhaltenen Phenylthiohydantoin-Aminosäurefraktionen wurden unter Verwendung einer angeschlossenen ABI Modell 120A-HPLC und einem Shimadzu CR4A-Integrator manuell identifiziert.
Die Sequenzen der isolierten Peptide waren wie folgt:
Beispiel 24
Vergleich der PEDNF-Peptide mit Ratten-Serinproteaseinhibitor-Sequenzen
PEDNF-13 zeigt eine signifikante Sequenz. Homologe Moleküle umfassen Ratten-Serinproteaseinhibitor 1 und 2, ein Ratten-Hepatocyten Wachstumshormon-reguliertes Protein, ein Ratten-Thyroidhormon-reguliertes Protein und Maus-Contrapsin. Menschliches, Affen-, Schaf- und Maus-Alpha-1-Antitrypsin und Schweine-Alpha-1-Antichymotrypsin, zeigen signifikante wenn auch etwas schwächere Homologie. PEDNF-14 zeigt Homologien mit verschiedenen Proteaseinhibitoren, aber der Grad der Homologie ist geringer als der für PEDNF-13 beobachtete. Diese beinhalten menschlichen Plasmaprotease-C1-Inhibitor und menschlichen alpha-2-Antiplasmininhibitor. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PEDNF eine Funktion als Proteaseinhibitor haben könnte, aber dass er molekular verschieden von solchen vorher beschriebenen Inhibitoren ist.
PEDNF zeigt signifikante Homologie mit den Serpinen, der Familie von Serinproteaseinhibitoren, die ein reaktives Zentrum nahe des C-terminalen Endes gemeinsam haben, welches als exponierte Bindestelle dient, die als „Köder" für Serinproteinase-Zielmoleküle fungieren. Es ist von Interesse, dass gezeigt werden konnte, dass eine Anzahl bekannter Mitglieder der Serpin-Familie neurotrophe Wirkung auf eine Vielfalt neuronaler Zelltypen ausübt. Zum Beispiel fördert gliäres Nexin (GDN) Neuritenwachstum bei Neuroblastomazellen, so wie dies eine Anzahl anderer Proteaseinhibitoren wie Hirudin und Leupeptin tun. Proteaseinhibitoren stimulieren auch die neuronale Differenzierung in Zellen der Dorsalwurzelganglien, sympathischen Neuronen und Pyramidalneuronen des Hippocampus. Es ist auch von Interesse, dass die Herstellung von Proteasen und Proteaseinhibitoren durch eine Anzahl bekannter Faktoren stimuliert wird. Während noch nachgewiesen werden muss, ob PEDNF Proteaseinhibitor-Aktivität besitzt, ist dies jedoch wahrscheinlich, da gezeigt werden konnte, dass eine inhibitorische Aktivität notwendig für die Neuriten-fördernde Aktivität von gliärem Nexin ist. Es wurde vorgeschlagen, dass die Erzeugung eines stabilen Protease-GDN-Komplexes und eine daraus folgende Konformationsänderung bei GDN und/oder der assoziierten Protease notwendig für die Neuriten-fördernde Aktivität von GDN ist. Es ist gut möglich, dass PEDNF ähnlich funktioniert, da bekannte Proteasen in der Interphotorezeptormatrix und in der sich entwickelnden neuralen Netzhaut vertreten sind.
Beispiel 25
Klonierung des PEDNF-Gens
Oligonucleotide wurden gegen PEDNF 13 konstruiert:
5'-AGYAAYTTYTAYGAYCTSTA-3'
bestimmt in Beispiel 22; und gegen PEDNF 2:
5'-CTYTCYTCRTCSAGRTARAA-3'
bestimmt in Beispiel 23.
Die Oligonucleotide wurden auf einem ABI 392 DNA/RNA-Synthesizer hergestellt und als Primer für die Polymerasenkettenreaktion (PCR) verwendet. Eine Charon BS cDNA-Genbank aus menschlichem fötalem Auge, zur Verfügung gestellt von Dr. A. Swaroop, wurde einmal vermehrt mit einem Verfahren, das in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben ist und mittels PCR abgesucht wie von Friedmann et al, beschrieben (1990, in "Screening of ☐ gt 11 libraries in PCR protocols: a guide to methods and applications". Innis, Gelfand, Sninsky und White, Hrsg., Academic Press, Seiten 253–260) unter Verwendung eines Techne Thermocyclers und Standardreagenzien (GeneAMP, Perkin Elmer Cetus), mit der Ausnahme, dass MgSO₄ in einer Konzentration von 3 mM verwendet wurde.
Das wiedergefundene Fragment wurde auf einem 3% NuSieve 3 : 1 Gel (FMC Biochemicals) unter Verwendung von NA-45 DEAE-Cellulosepapier (Schleicher und Schüll) und mit ³²P durch „Random Priming" (Prime-It Random Primer Labeling Kit, Stratagene) markiert.
Diese Sonde wurde verwendet, um 200.000 Pfu (Plaque-bildende Einheiten) derselben Genbank (10) abzusuchen. Positive Klone wurden isoliert wie bei Sambrook et al. vorstehend beschrieben und die DNA wurde mit „Qiagen-Maxi-Preparation"-Protokollen (Qiagen Inc.) gereinigt.
Die Insertionen wurden mit Notl (BRL, Gaithersburg, MD) ausgeschnitten, mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) zum Ring geschlossen, in kompetente E. coli Sure Zellen transformiert und auf 12,5 μg/ml Ampicillin/40 μg/ml X-Gal Agarplatten ausgebracht.
Weiße Kolonien wurden ausgewählt und einer Mini-Preparation (Qiagen Plasmid Mini-Prep Protokoll) unterzogen. Gereinigte Plasmide wurden mit EcoRI/HindIII (BRL) gespalten und auf einem 0,7%-Agarosegel getrennt, um die Größe der Insertionen zu bestimmen
Beispiel 26
DNA-Sequenzanalyse
Einer der identifizierten Klone, welcher eine dem PEDNF-Gen entsprechende Insertion enthielt, wurde für die Kartierung und anschließende Sequenzierung unter Verwendung eines USB-Sequenase-2,0-Protokolls und zugehöriger Reagenzien ausgewählt.
Beispiel 27
Behandlung von Tumoren der Netzhaut
PEDNF wird allein oder in Verbindung mit klinischen (wie zum Beispiel chirurgischen) Verfahren verabreicht. PEDNF wird durch Injektion in den Glaskörper (intravitreal) oder unter die Netzhaut (subretinal) verabreicht. PEDNF kann allein oder in Verbindung mit Stoffen wie Polymilchsäure verabreicht werden, welche eine langsame, zeitlich verzögerte Freisetzung von PEDNF fördert. Üblicherweise werden etwa 0,01 bis etwa 10 μg PEDNF pro Dosis bei einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml in physiologischer Kochsalzlösung oder anderen gepufferten Lösungen und etwa 0 bis etwa 10 Dosen pro Tag verabreicht. Wenn Substanzen zur verzögerten Freisetzung in der Zusammensetzung enthalten sind, werden sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml verwendet. Die Behandlung wird fortgesetzt bis das Tumorwachstum zum Stillstand kommt und/oder ein Tumorrückgang zu verzeichnen ist.
Die Behandlung mit PEDNF ist bei Tumoren der Netzhaut wie Retinoblastoma, bei anderen neuronalen Tumoren wie Neuroblastoma oder bei Tumoren nicht-neuronalen Ursprungs wirksam. Die Behandlung führt zum Stillstand oder Rückgang der Zellteilungsrate und einer damit einhergehenden Verminderung der Tumorwachstumsrate, was wiederum zum Tumorrückgang führt.
Beispiel 28
Neurotrophe Behandlung von Augenerkrankungen
PEDNF wird allein oder in Verbindung mit klinischen (wie zum Beispiel chirurgischen) Verfahren verabreicht. PEDNF wird durch Injektion in den Glaskörper (intravitreal) oder unter die Netzhaut (subretinal) verabreicht. PEDNF kann allein oder in Verbindung mit Stoffen wie Polymilchsäure verabreicht werden, welche eine langsame, zeitlich verzögerte Freisetzung von PEDNF fördert. Üblicherweise werden etwa 0,01 bis etwa 10 μg PEDNF pro Dosis bei einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml in physiologischer Kochsalzlösung oder anderen gepufferten Lösungen und etwa 0 bis etwa 10 Dosen pro Tag verabreicht. Wenn Substanzen zur verzögerten Freisetzung in der Zusammensetzung enthalten sind, werden sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml verwendet. Die Behandlung wird fortgesetzt bis das Tumorwachstum zum Stillstand kommt und/oder ein Tumorrückgang zu verzeichnen ist.
Die Behandlung mit PEDNF zielt auf Erkrankungen der neuralen Netzhaut, des pigmentierten Netzhautepithels oder anderen Augenerkrankungen. Die Behandlung verbessert das Überleben und Wohlergehen der Photorezeptorzellen und anderer Zellen des Auges, verlängert ihre funktionstüchtige Lebensspanne und verzögert das Einsetzen von Sehstörungen und endgültiger Erblindung.
Beispiel 29
Neurotrophe Behandlung von verletzten Nerven
PEDNF wird allein oder in Verbindung mit anderen klinischen (wie zum Beispiel chirurgischen) Verfahren verabreicht. PEDNF wird durch intravitreale oder subretinale Injektion oder aber durch Anwendung oder Injektion an den Orten der Nervenverletzung verabreicht. PEDNF kann allein oder in Verbindung mit Stoffen wie Polymilchsäure verabreicht werden, welche eine langsame, zeitlich verzögerte Freisetzung von PEDNF fördert. Üblicherweise werden etwa 0,01 bis etwa 10 μg PEDNF pro Dosis bei einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml in physiologischer Kochsalzlösung oder anderen gepufferten Lösungen und etwa 0 bis etwa 10 Dosen pro Tag verabreicht. Wenn Substanzen zur verzögerten Freisetzung in der Zusammensetzung enthalten sind, werden sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 μg/ml verwendet. Die Behandlung wird fortgesetzt bis die Regeneration der Nerven abgeschlossen ist.
Die Behandlung mit PEDNF zielt auf die Verletzung von Nerven. Die Behandlung führt zur Förderung des Auswachsens von Neuriten und zur Regeneration von Nerven.
Beispiel 30
Transfektion von Bakterienzellen
Kompetente E. coli Sure Zellen werden mit dem Ligierungsgemisch gemischt und für 60 Min. auf Eis gehalten. Das Gemisch wird dann für 2 Min. bei 42°C belassen, dann werden 800 μl 2% BACTO-Trypton, 2% BACTO-Hefeextrakt (beide erhältlich bei DIFCO LABORATORIES), 10 mM NaCl, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glukose zugegeben und das Gemisch wird für 60 Min. bei 37°C belassen. 50 bis 500 μl der DNA-Gemische werden dann auf Selektionsplatten mit 12,5 μg/ml Ampicillin aufgetragen.
Die rekombinanten Kolonien werden mittels Minipräparation und Spaltung der isolierten DNA abgesucht. Positive Kolonien, die geeignete Insertionen enthalten, werden dann präpariert, indem man die geeignete Kolonie in 200 ml „Luria Broth" mit 12,5 μg/ml AmpiCillin unter Schütteln bei 37°C über Nacht wachsen lässt. Nach der Bebrütung über Nacht werden die Kulturen in Zentrifugenbecher überführt und bei 2.500 UpM für 10 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden in 30 ml STET Puffer (0,23 M Saccharose, 5% Triton-X-100, 20 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8) bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 μl 10 mg/ml Lysozym werden zugegeben, das Gemisch wird geschwenkt und für etwa 5 Min. bei Raumtemperatur belassen. Jede Flasche wird dann vorsichtig direkt über einer Flamme geschwenkt bis die Zellen beginnen zu verklumpen und weiß zu werden. Das Gemisch wird dann für etwa 45 Sek. in ein kochendes Wasserbad überführt. Die Lösung wird dann in einem Eiswasserbad für 2 Min. gekühlt und das Gemisch wird in Zentrifugenröhrchen überführt und für 15 Min. bei 16.000 UpM zentrifugiert.
Der Überstand wird dann in einen sauberen Behälter überführt. Zwei Volumina 100% Ethanol werden hinzugefügt, gemischt und die DNA für 20 Min. bei –70°C ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation bei 2.500 g für 15 Min. gesammelt. Der Ethanol-Überstand wird entfernt und das Sediment wird mit etwa 10 ml kaltem (–20°C) 90%-igen Ethanol gewaschen. 2,5 ml Extraktionspuffer (0,2 M Tris, pH 7,5, 0,08 M EDTA und 0,2 M KCl) werden zu dem Sediment gegeben und dieses wird bei 4°C resuspendiert. 100 μl 10 mg/ml RNAse, gelöst in 0,1 × TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,6) und vorbehandelt durch Kochen für 10 Min.
Beispiel 31
Insektenzellkulturen
Sf9-Zellen werden in Spinnerflaschen mit Graces Antheraea-Medium, erhältlich bei GIBCO, Grand Island, NY, mit einer Anfangszelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml ausgesät und bei 27°C unter ständigem Rühren bei 50 UpM bebrütet. Die Zellen werden ungefähr 2 bis 3-mal pro Woche subkultiviert, wenn sie eine Dichte von 2,5 × 10⁶ Zellen/ml erreicht haben und werden dabei etwa 1 zu 5 verdünnt.
Beispiel 32
Klonierung von Genen in pAC373
2 μl pAC373, 25 μl 10-fach BamHI-Restriktionsenzympuffer, 20 Einheiten BamHI und steriles destilliertes Wasser ad 250 μl werden zusammengegeben und für mindestens 3 Stunden bei 37°C belassen. Nachdem das Plasmid gespalten wurde, wird es durch Zugabe von einer Einheit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CAP)/μg DNA dephosphoryliert und für 30 Min. bei 37°C belassen. CAP wird dann durch Einstellen der Lösung mit EDTA auf 25 mM und mit SDS auf 0,5% inaktiviert und für 15 Min. bei 65°C belassen. Die Lösung wird dann mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1). extrahiert.
Die wässrige Phase wird gesammelt und 125 μl 7,5 M Ammoniumacetat und 800 μl 95% Ethanol werden zugegeben und gemischt. Die DNA wird bei –70°C für 10 Min. ausgefällt. Der Niederschlag wird dann durch Zentrifugation bei 12.000 UpM für 10 Min. gesammelt. Das Sediment wird mit 90% Ethanol (–20°C) gespült. Dann wird das Ethanol entfernt und die DNA in 50 μl 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6 (1-fach TE) resuspendiert.
Beispiel 33
Ligierung von PEDNF in pAC373
Ein gereinigtes DNA-Fragment, welches das PEDNF-Gen umfasst, wird mit dem Transfervektor ligiert. Etwa 200 ng des gespaltenen pAC373 werden mit einer gleichen molaren Konzentration eines PEDNF enthaltenden Fragments gemischt. Ligierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 0,5 mM Spermidin, 2 mM ATP, 2,5 mM Hexamin-Kobaltchlorid und 20 μg/ml BSA) und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase werden zugegeben. Wasser wird bis zu einem Gesamtvolumen von 10 μl hinzugefügt. Das Gemisch wird für 3 Std. bei 14°C belassen.
Beispiel 34
Transfer von Genen in das AcMNPV-Genom
Sf9-Zellen werden in 25 cm²-Flaschen mit einer Dichte von 2,0 × 10⁶ Zellen/Flasche in Graces Antheraea-Medium ausgesät. Den Zellen lässt man für mindestens 1 Std. Zeit, um sich anzuheften. 1 μg MNPV DNA wird zu 2 μg das PEDNF-Gen enthaltende Plasmid-DNA gegeben. Das Medium wird aus der Flasche entfernt und durch 0,75 ml Graces Medium mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika (50 μg/ml Gentamycinsulfat, 2,5 μg/ml Amphotericin) ersetzt. 7,5 ml des Transfektionspuffers (25 mM HEPES, pH 7,1, 140 mM NaCl, 125 mM CaCl₂) werden zur DNA-Lösung gegeben und gemischt. Die DNA-Lösung wird zum Graces Medium gegeben, das sich bereits in den Kulturflaschen befindet.
Calciumphosphat-Niederschläge bilden sich aufgrund des Calciumchlorids im Transfektionspuffer und des Phosphats im Medium. Die Flaschen werden für 4 Std. bei 27°C belassen, wonach das Medium aus den Flaschen entfernt wird und die Zellen mit frischem TNM-FH (Graces Medium mit 3,3 g/l YEASTOLATE und 3,3 g/l Lactalbumin-Hydrolysat, beide erhältlich bei DIFCO Laboratories) mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika, wie zuvor beschrieben, gespült werden und dann 5 ml TNM-FH mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika, wie zuvor beschrieben, zu den Zellen gegeben wird. Die Zellen werden 4-6 Tage bebrütet. Sobald die Infektion in einem fortgeschrittenem Stadium ist, wird der Virus auf frische einzellige Schichten ausgebracht und die rekombinanten Viren werden aus den Plaques gereinigt.
Beispiel 35
Identifizierung von rekombinanten Proteinen
Aus Plaques gereinigte Viren werden mittels radioaktiver Markierung abgesucht. Die rekombinanten Proteine werden auf SDS-PAGE-Gelen identifiziert. Sf9-Zellen werden mit 6 × 10⁵ Zellen/Kavität in eine 24-Loch Platte ausgesät. Die Zellen lässt man für 1 Std. Zeit, um sich anzuheften. Das Medium wird dann entfernt und die Zellen werden mit Medium überschichtet, das den Virus enthält und für 1 Std. bei 27°C bebrütet, wonach die Virus-Impflösung entfernt und durch 500 μl Komplettmedium ersetzt wird. Die Zellen werden für 48 Std. bei 27°C bebrütet. Am Ende dieser Bebrütungszeit wird das Medium entfernt. 200 μl Methionin-freies Graces Medium wird zu den Zellen gegeben und die Zellen werden für 60 Min. bebrütet, wonach das Medium durch 200 μl frisches Methionin-freies Graces Medium ersetzt wird, zu dem 10 μCi ³⁵S-Methionin gegeben werden. Die Zellen werden bei 27°C für 6 Std. bebrütet und dann durch Zentrifugation geerntet. Der Überstand wird gesammelt und die Zellen werden in 62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 0,001% Bromphenolblau und 0,1 M 2-Mercaptoethanol resuspendiert. Ein gleiches Volumen 126 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 20% Glycerin, 0,002% Bromphenolblau und 0,2 M 2-Mercaptoethanol werden zu dem Überstand gegeben. Die Proben werden dann für 3 Min. gekocht und dann der Elektrophorese und der Autoradiographie des Gels unterzogen, um die Proteine zu identifizieren, die in das Medium abgesondert werden und diejenigen, die nicht abgesondert werden. Kontrollen mit nicht-infizierten Zellen und Zellen, die mit Wildtyp-Virus infiziert wurden werden mit eingeschlossen.
Die obigen Beschreibungen von beispielhaften Ausführungsformen des neurotrophen Faktors aus pigmentiertem Netzhautepithel dienen der Veranschaulichung. Aufgrund von Abwandlungen, die dem Fachmann offenbar werden, ist es nicht beabsichtigt, dass sich die vorliegende Erfindung auf die jeweiligen, oben beschriebenen Ausführungsformen beschränkt. Der Geltungsbereich der Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche definiert.
SEQUENZERFASSUNG

Claims

Verfahren zur Reinigung von PEDNF, der die folgenden Eigenschaften umfasst: (1) er ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 50.000 bis 55.000; (2) er besitzt einen pI-Wert von 3,9 bis 7,2; und (3) induziert die neuronale Differenzierung, wenn er für embryonale oder immortalisierte Zellen verwendet wird, wobei der PEDNF weiterhin eine Aminosäurezusammensetzung aus: Asp 25, Asn 11, Thr 28, Ser 38, Glu 26, Gln 15, Pro 29, Gly 23, Ala 25, Val 25, Met 7, Ile 22, Leu 57, Tyr 10, Phe 18, His 8, Lys 27, Trp 3 und Arg 18 umfasst, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer unreinen Proteinfraktion, die PEDNF enthält; (b) Ausfällen der verunreinigenden Proteine aus der unreinen, PEDNF enthaltenden Proteinfraktion durch Einstellen der unreinen, PEDNF enthaltenden Proteinfraktion auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 50% bis 60%, um eine 50 bis 60%-ige Ammoniumsulfat-Proteinfraktion zu erhalten, und/oder Ausfällen von PEDNF aus der unreinen, PEDNF enthaltenden Proteinfraktion durch Einstellen der unreinen, PEDNF enthaltenden Fraktion auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 70% bis 80%, um eine 70 bis 80%-ige Ammoniumsulfat-Proteinfraktion zu erhalten; (c) Aufbringen des PEDNF enthaltenden Produkts aus Schritt (b) auf ein Kationenaustauschchromatographiemedium; (d) Waschen des Kationenaustauschchromatographiemediums, um jegliche ungebundene Proteine zu eluieren; (e) Eluieren des PEDNF von dem Kationenaustauschchromatographiemedium; und (f) Sammeln der PEDNF enthaltenden Fraktionen, um einen durch Kationenaustauschchromatographie gereinigten PEDNF bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) PEDNF aus einer 50 bis 60%-igen Ammoniumsulfatfraktion durch Einstellen der 50 bis 60%-igen Ammoniumsulfatproteinfraktion auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 70% bis 80% ausgefällt wird, um eine 50 bis 80%-ige Ammoniumsulfatproteinfraktion bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend: (a) Aufbringen der durch Kationenaustauschchromatographie gereinigten PEDNF-Proteinfraktion auf ein Größenausschlusschromatographiemedium; (b) Eluieren der Proteine aus dem Größenausschlusschromatographiemedium; und (c) Sammeln der PEDNF enthaltenden Fraktionen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die unreine Proteinfraktion, die PEDNF enthält, durch pigmentiertes Netzhautepithel konditionierte Medien umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die unreine Proteinfraktion, die PEDNF enthält, einen Extrakt eines nicht-menschlichen Organismus umfasst, der mit einem ein PEDNF-Gen umfassenden rekombinanten DNA-Molekül in einer solchen Form transformiert ist, dass das PEDNF-Gen exprimiert werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die unreine Proteinfraktion, die PEDNF enthält, ein Medium umfasst, in dem ein nicht-menschlicher Organismus gezüchtet wird, der mit einem ein PEDNF-Gen umfassenden rekombinanten DNA-Molekül in einer solchen Form transformiert ist, dass das PEDNF-Gen exprimiert werden kann.