DE69934110T2

DE69934110T2 - Monomeres mp52/gdf-5 mit knochenmorphogener aktivität, und dieses enthaltende arzneimittel, zur vorbeugung und behandlung von knochen- und knorpelerkrankungen

Info

Publication number: DE69934110T2
Application number: DE69934110T
Authority: DE
Inventors: Shinji Kawai; Michio Chigasaki-shi KIMURA; Hoechst Marion Roussel Ltd. Yoshifumi Minato-ku MURAKI; Mieko Higashimurayama-shi KATSUURA
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2007-03-01
Also published as: EP1078054B1; WO1999061611A1; CY1105933T1; ATE346151T1; JPH11335398A; US7235241B2; US20080318856A1; ES2272063T3; JP2002516098A; EP1078054A1; PT1078054E; DE69934110T8; AU3530999A; US7638129B2; DK1078054T3; US20060019886A1; JP4272357B2; DE69934110D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(1) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die monomeren Proteine MP52 und GDF-5, von welchen ein Cystein, welches mit einer Dimerbildung eines Proteins in Zusammenhang steht, mit einer anderen Aminosäure ersetzt worden ist. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser monomeren Proteine in großen Mengen und mit hoher Reinheit, wobei Escherichia coli verwendet werden, welche mit einem Plasmid transformiert worden sind, das eine DNA-Sequenz enthält, die das eine oder das andere dieser monomeren Proteine exprimieren kann. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Mittel, welches eines oder beide dieser monomeren Proteine enthält zur Vorbeugung und Behandlung einer Knochen- und/oder Knorpel betreffenden Erkrankung.
(2) Beschreibung des Fachgebiets
Gegenwärtig sind Östrogen, Calcitonin, Vitamin D3, dessen Derivate und Derivate von Biphosphonsäure als vorbeugende oder therapeutische Mittel für Knochenerkrankungen bekannt. Kürzlich wurde beschrieben, dass knochenmorphogenetische Aktivität in einer Reihe von knochenmorphogenetischen Proteinen (hierin im Folgenden als "BMP" bezeichnet) vorkommt, welche zur TGF-β-Superfamilie gehören, von BMP-2 bis BMP-14.
Darüber hinaus wurde ein Protein mit knochenmorphogenetischer Aktivität beschrieben, welches als GDF-5 oder humanes MP52 bezeichnet wird (WO 93/16099, WO 95/04819, WO 94/15949 und Nature Bd. 368, 1994, S. 639-643). GDF-5, wie es in WO 94/15949 beschrieben wird, ist das homologe Protein des humanen MP52 aus Maus.
Es wird angenommen, dass das reife humane Protein MP52 ein Protein mit 120 Aminosäureresten ist, welches an seinem N-Terminus mit Alanin beginnt und seine Aminosäuresequenz ist in diesen Patentanmeldungen beschrieben worden.
Diese Proteine kommen in der Natur als Homodimer mit einer einzigen Disulfidbindung vor. Im Gegensatz dazu wird die Herstellung ihres rekombinanten Proteins unter Verwendung ihrer Homodimere oder Heterodimere durchgeführt, um ein Protein zu ergeben, welches die Aktivität zeigt. Beispielsweise wurde das humane MP52 in der Veröffentlichung der ungeprüften Anmeldung JP 031098/97 beschrieben.
In der Zwischenzeit gibt es zwei Typen von Rezeptoren der TGF-β-Superfamilie, welche als Typ-I-Rezeptor und Typ-II-Rezeptor bezeichnet werden.
Interzelluläre Signalübertragung mittels Rezeptoren der TGF-β-Superfamilie, welche diese knochenmorphogenetischen Proteine (Dimere) umfasst, erfordert die gleichzeitige Kombination dieser Proteine sowohl an Typ I- als auch an Typ II-Rezeptoren und es wird angenommen, dass sich durch Zusammenlagern zweier oder mehrerer Dimere ein Polymer bildet, um die interzelluläre Signalübertragung durchzuführen (Bone, Bd. 19, 1996, S. 569-574). Es ist angenommen worden, dass es für die Polymerbildung wichtig ist, dass das Protein ein Dimer sein sollte. Bis jetzt wurde keine Aktivität eines Monomers gefunden. Darüber hinaus wurde eine Herstellung dieser monomeren Rekombinanten bis jetzt nicht durchgeführt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben den Versuch einer Massenherstellung von humanen MP52-Monomeren durch Genmanipulationstechnologie unter Verwendung von Escherichia coli unternommen. Die Erfinder haben nämlich ein Plasmid einer DNA-Sequenz konstruiert, welche die Aminosäuresequenz mit 119 Resten codiert, welche in SEQ ID NO:1 beschrieben sind, wobei unter diesen das Codon des Cysteinrests Nr. 83, welches mit einer Disulfidbindung zwischen monomeren MP52-Molekülen im Zusammenhang steht zum Alanincodon umgewandelt wurde. Darüber hinaus waren die Erfinder unter Verwendung von Escherichia coli bei der Expression einer großen Menge humaner MP52-Monomere erfolgreich, wobei das Plasmid verwendet wurde und wobei zur Herstellung von Monomeren des Proteins, welches in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls beschrieben ist, mit hoher Reinheit und sehr hoher Ausbeute Rückfaltung eingesetzt wurde.
Es wurde entgegen der herkömmlichen Auffassung, dass nur ein Dimer knochenmorphogenetische Aktivität aufweist, überraschenderweise herausgefunden, dass das Monomer die Aktivität zur Induzierung der Differenzierung zu Osteozyten in einigen Zelllinien (MC3T3-E1 und ATDC5) aufweist. Die vorliegende Erfindung wurde vervollständigt durch Beobachten, dass die Aktivität zur Induktion von Differenzierung auf Grundlage von Gewichtskonzentration zweifach höher ist als die des Dimers.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Plasmidkarte des Expressionsvektors (pKOT279), welcher in Beispiel 1 (2) erhalten wurde.
2 ist eine Vergleichsabbildung zu Osteoblastendifferenzierung fördernden Aktivitäten zwischen dem Monomer der vorliegenden Erfindung und humanem MP52-Dimer. (A) zeigt die Aktivität in MC3T3-E1-Zellen und (B) zeigt die Aktivität in ATDC5-Zellen. Der weiße Kreis zeigt die Aktivität des Monomers und der schwarze Kreis zeigt die Aktivität das humanen MP52-Dimers.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung betrifft nämlich die monomeren humanen MP52-Proteine und ihr homologes Protein GDF-5 aus Maus, von welchem mit der Dimerbildung des Proteins in Zusammenhang stehendes Cystein durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, ein Verfahren zur Expression dieser monomeren Proteine und ein Mittel zur Vorbeugung und Behandlung einer Erkrankung, welche Knochen und/oder Knorpel betrifft, wobei das Mittel eines oder beide dieser monomeren Proteine enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft die monomeren Proteine MP52 und GDF-5, von welchen Cystein, welches mit einer Dimerbildung des Proteins in Zusammenhang steht durch eine andere Aminosäure ersetzt worden ist. Eine andere Aminosäure kann jede beliebige Aminosäure sein, welche aus der aus Alanin, Threonin, Serin und Valin bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die Größe einer Aminosäureseitenkette berücksichtigt wird. Die am stärksten zu bevorzugende Aminosäure ist Alanin.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein monomeres Protein mit einer in SEQ ID NO:1 beschriebenen Aminosäuresequenz.
Im Einzelnen ist das monomere Protein ein Protein, in welchem Cystein mit Alanin ersetzt wurde und das vorausgehend genannte Cystein zu einer intermolekularen Disulfidbindung eines humanen MP52-Dimers mit einer intermolekularen Disulfidbindung beiträgt und welches an der Position 83 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 vorliegt. Das durch die vorliegende Erfindung erhaltene monomere Protein zeigt eine zweifach höhere Aktivität bei der Induktion von Differenzierung als ein aus dem monomeren Protein hergestelltes dimeres Protein.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des zu exprimierenden monomeren Proteins unter Verwendung von Escherichia coli, Hefe, Insektenzellen und Säugerzellen, die durch ein Plasmid mit einer DNA-Sequenz, welche das monomere Protein exprimieren kann, transformiert worden sind. Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit 119 Aminosäureresten, welches aus dem durch SEQ ID NO:2 dargestellten humanen MP52 abgeleitet ist, unter Verwendung von Escherichia coli. Mit anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung die Konstruktion eines Plasmids mit einer DNA-Sequenz, welche eine Aminosäuresequenz codiert, in welcher Methionin an den N-Terminus der aus humanen MP52 abgeleiteten Aminosäuresequenz angefügt ist und in welcher Alanin Cystein an Position 83 der 119 Reste, die in SEQ ID NO:1 dargestellt sind, ersetzt. Für humane MP52-cDNA wurde ein reifer Abschnitt nur durch Polymerasekettenreaktion (PCR-Verfahren) amplifiziert, wobei ein Plasmidvektor als Matrizen-DNA verwendet wurde, welcher in WO 93/16099 beschriebene cDNA enthielt. Das in der Erfindung verwendete PCR-Verfahren bedeutet allgemein Amplifizierung aus einer sehr kleinen Menge eines DNA-oder RNA-Fragments einer Nukleinsäure durch das in USP 4,683,195 beschriebene Verfahren.
In der vorliegenden Erfindung wurde ein mutiertes monomeres Protein durch Konstruktion eines Plasmids mit einer DNA-Sequenz erhalten, welche eine Aminosäuresequenz codiert, in welcher Methionin an den N-Terminus der durch SEQ ID NO:1 dargestellten Aminosäuresequenz hinzugefügt wurde, durch Transformation des Plasmids in Escherichia coli, durch Lösen des Einschlusskörpers (inclusion body), welcher durch Kultivieren der Escherichia coli erhalten wurde und durch Reinigung. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Proteins durch Rückfaltung, um Aktivität aufzuweisen und Reinigung des Proteins zu einem in SEQ ID NO:2 beschriebenen monomeren Protein.
Konkret wurde für das monomere Protein der vorliegenden Erfindung MP52-mutiertes monomeres Protein durch Auftragen der gelösten Einschlusskörperchen von Escherichia coli auf eine SP-Sepharose FF-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) und auf eine Superdex 200 pg-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) erhalten.
Anschließend wird das erfindungsgemäße gereinigte monomere Protein durch Rückfaltung und anschließendes Leiten über eine Umkehrphasen-HPLC RESOURCE RPC-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) erhalten. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des erhaltenen vorliegenden monomeren Proteins werden auf Grundlage von Daten einer N-terminalen Aminosäuresequenz, einer Aminosäurezusammensetzung und Elektrophorese analysiert.
Die biologischen Eigenschaften des monomeren Proteins der vorliegenden Erfindung wurden durch die Aktivität zur Induktion von Differenzierung für zwei Arten von Osteoblastenzelllinien bewertet, für welche eine fördernde alkalische Phosphataseaktivität in einem humanen MP52-Dimer bereits festgestellt worden war. Im Vergleich hinsichtlich der Gewichtskonzentration zeigte das monomere Protein der vorliegenden Erfindung eine zweifach höhere Aktivität als das herkömmliche dimere Protein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein vorbeugendes oder therapeutisches Mittel für Knorpel- und/oder Knochenerkrankungen mit einer in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz als einem wirksamen Inhaltsstoff. Im Einzelnen weist das monomere Protein der vorliegenden Erfindung eine Aktivität zur Induktion von Differenzierung auf, d.h. eine morphogenetische Aktivität für Knorpel und Knochen, und betrifft deshalb ein vorbeugendes oder therapeutisches Mittel für Osteoporose, angeborene Knochen- und/oder Knorpelerkrankungen, und Osteoarthritis, wie Gelenkosteoarthritis und Hüftgelenkosteoarthritis oder Arthrosteitis, Krorpelschädigung, wie beispielsweise Meniskusschädigung, Regenerierung von durch Verletzung und Tumorsektion verursachtem Knochen- und Knorpeldefizit, Knochen- und Knorpeldefizit, Bruch, angeborene Knorpel- und/oder Knochenerkrankungen wie beispielsweise Achondroplasie, Dyschondrogenese, Achondrogenese, Palatoschisis und Dysosteogenese und einem Defizit an Zahnwurzel und an Zahnfach.
Darüber hinaus kann das Protein der vorliegenden Erfindung mit knochen- und knorpelmorphogenetischer Aktivität zur Knochentransplantationstherapie auf dem Gebiet der ästhetischen Chirurgie verwendet werden. Die Therapie umfasst das Feld der Veterinärchirurgie.
Wie in einem systemischen Verabreichungsverfahren sind intravenöse, intramuskuläre und intraabdominale Verabreichungen möglich; bei einer intravenösen Verabreichung kann zusätzlich zu einer allgemeinen intravenösen Injektion ein intravenöses Tropfrohr angewandt werden.
Eine Injektionspräparation kann beispielsweise eine Pulverpräparation zur Injektion sein. In diesem Fall werden zur Herstellung als Produkt ein oder mehrere Arten von geeigneten wasserlöslichen Hilfsmitteln wie beispielsweise Mannitol, Saccharose, Lactose, Maltose, Glucose oder Fructose zur Auflösung in Wasser hinzugegeben, auf Glasfläschchen oder Ampullen aufgeteilt, gefriergetrocknet und luftdicht versiegelt.
Für ein lokales Verabreichungsverfahren gibt es ein Verfahren zur Bedeckung von Knorpel, Knochen oder Zahn an der Stelle mit dem vorliegenden Protein unter Verwendung von Collagenpaste, Fibrinklebemittel oder anderen Adhäsiven. Zwischen diesen kann ein zur Knochentransplantation verwendeter Knochen sowohl auch auf einen herkömmlich verwendeten künstlichen Knochen als auch auf einen natürlichen Knochen aufgetragen werden. Die künstlichen Knochen umfassen Knochen, welche aus natürlichen Materialien oder künstlichen anorganischen Materialien wie beispielsweise Metallen, Keramiken und Gläsern hergestellt sind. Die künstlichen anorganischen Materialien werden vorzugsweise durch Hydroxyapatit beispielhaft veranschaulicht. Beispielsweise wird ein Metall als inneres Material und Hydroxyapatit als äußeres Material eines künstlichen Knochens verwendet. Darüber hinaus kann das vorliegende Protein an karzinogenes Gewebe verabreicht werden, um die Rekonstruktion eines Knochens zu verbessern. Es ist auch möglich, es zur Transplantation von Knorpel zu verwenden.
Eine Dosierungseinheit zur Verabreichung wird durch einen verantwortlichen Arzt unter Berücksichtigung der folgenden verschiedenen Faktoren, welche die Wirkung des vorliegenden Proteins beeinflussen, bestimmt: das Gewicht von zu rekonstruierendem Knochen und Knorpel, die Stelle und der Zustand des Knochen- und Knorpelschadens, Geschlecht und Alter eines Patienten, Schwere der Infektion, Dauer der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Die Dosierungseinheit kann gemäß der Art des zur Rekonstruktion verwendeten Trägers variieren, wobei die Rekonstruktion in Kombination mit dem vorliegenden Protein verwirklicht wird. Im Allgemeinen werden betreffend die Dosierungseinheit ca. 10-10⁶ ng als das vorliegende monomere Protein für ein gegebenes Feuchtgewicht eines Knochens und Knorpels bei der Verwendung als Zusammensetzung, welche einen Träger enthält, und 0,1-10⁴ μg für einen Patienten als Injektion für eine lokale Verabreichung und bei systemischer Verabreichung bevorzugt verabreicht, wobei die Häufigkeit sich in einem Bereich von 1 × täglich bis 1 × wöchentlich bewegt.
Eine vervielfachte Wirkung kann für eine gleichzeitige Verabreichung eines bekannten Wachstumsfaktors wie beispielsweise dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I zur Regenerierung eines Knochens und von Knorpel erwartet werden.
Daher wurde ein Monomer, welches durch Substitution eines Cysteins des Proteins MP52 hergestellt wird und eine industrielle Herstellung dieses Proteins nicht beschrieben. Das Monomer weist morphogenetische Aktivität für Knorpel und Knochen auf und ist als therapeutisches Mittel für Knorpel- und/oder Knochenerkrankungen nützlich. Darüber hinaus weist das monomere MP52 Protein der vorliegenden Erfindung eine zweifach höhere gewichtsbezogene Aktivität als ein Dimer des Proteins auf und ermöglicht eine Verringerung einer wirksamen Dosierungseinheit eines therapeutischen Mittels für Knorpel- und/oder Knochenerkrankungen um die Hälfte. Diese Tatsache kann auf die Herstellung der zuvor beschriebenen der TGF-β-Superfamilie angehörenden knochenmorphogenetischen Faktoren übertragen werden.
Das monomere Protein, welches aus dem humanen MP52 abgeleitet worden ist und eine in SEQ ID NO:2 beschriebene Aminosäuresequenz aufweist, weist eine zweifach höhere Aktivität in einer Osteoblastenzelllinie zur Induktion der Differenzierung auf als das Dimer und ist als vorbeugendes oder therapeutisches Mittel für Knorpel- und/oder Knochenerkrankungen nützlich. Darüber hinaus reduziert eine Veränderung einer Aminosäure des monomeren Proteins der vorliegenden Erfindung Cystein und macht daher eine Massenherstellung von reinem monomeren Protein unter Verwendung von Escherichia coli möglich.
BEISPIELE
Die Erfindung soll mittels der im Folgenden beschriebenen Beispiele stärker veranschaulichend beschrieben werden. Die folgenden Beispiele sind in jeder Hinsicht veranschaulichend und nicht beschränkend aufzufassen.
Beispiel 1
Herstellung eines humanen MP52-Monomer-Expressionsvektors
(1) Isolierung eines reifen Abschnitts einer humanen MP52-Mutante.
Das humane MP52-Monomer wurde durch Ersetzen eines Cysteinrests, welcher für dimerbildend gehalten wird, mit einem anderen Aminosäurerest hergestellt, um die Bildung eines Dimers mit dem humanen MP52-Monomer zu verhindern. In der vorliegenden Erfindung wurde das Cysteincodon (TGC) an der Position 83 des reifen humanen MP52, welches wie in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls von WO 96/33215 beschrieben mit Prolin beginnt, in das Alanincodon (GCC) umgewandelt.
Die Substitution eines Aminosäurerests wurde unter Verwendung eines PCR-Primers (Vorwärtsrichtung) durchgeführt, in welchen eine objektive Mutation unter Verweis auf das Mutationsverfahren (Abschnitt 8.5) durch Polymeraskettenreaktion (PCR) eingeführt worden ist, wie es in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.) beschrieben ist. Die Sequenz des verwendeten PCR-Primers wurde in SEQ ID NO:3 als Sense-Primer und in SEQ ID NO:4 als Umkehr-Primer beschrieben.
Die PCR wurde unter Verwendung eines humanen MP52-Expressionsvektors (pKOT245), welcher in WO 96/33215 beschrieben ist, als Matrizen-DNA (10 ng), jeweils 10 pM Sense-Primer und Umkehr-Primer, 0,4 mM dNTP, 2,5 mM MgCl₂ und La-Taq-DNA-Polymerase (5U, Takara Shuzo Co., Ltd.; Katalog-Nr. RR013A) im gleichen Teströhrchen durchgeführt. Es wurden 30 Reaktionszyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus Denaturierung (94 °C, 1 min), Primeranlagerung (55°C, 1 min) und Primerverlängerung (72°C, 2 min) umfasste. Das PCR-Produkt wurde durch die Restriktionsenzyme NcoI und HindIII verdaut, durch Elektrophorese mit 1,5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC BioProducts Co., Katalog-Nr. 5170B) aufgetrennt und gereinigt, um ein DNA-Fragment mit ca. 170 Basen als objektivem Produkt erhalten.
Der Expressionsvektor für humanes monomeres MP52 (pKOT279) wurde hergestellt durch Ersetzen eines NcoI-HindIII-DNA-Fragments, in welches durch das zuvor beschriebene Verfahren eine Mutation eingeführt wurde in die NcoI-HindIII-Region eines Expressionsvektors für humanes monomeres MP52 (pKOT277), welcher durch Modifizierung eines Expressionsvektors für humanes monomeres MP52 (pKOT245), wie in WO 96/33215 beschrieben, hergestellt wurde. Konkret wurde ein DNA-Fragment mit 2717 Basenpaaren als objektives Produkt erhalten durch Herstellen des Expressionsvektors für humanes monomeres MP52 (pKOT277) von dem IacZ-Promotor, der transkribiert wird in Umkehrrichtung zu einem MP52, welches stromabwärts des Terminators des in WO 96/33215 beschriebenen Expressionsvektors für humanes monomeres MP52 (pKOT245) liegt, durch Verdauen des MP52-Expressionsvektors (pKOT277) mittels der Restriktionsenzyme NcoI und HindIII, durch Trennen mittels Elektrophorese in 1,5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC BioProducts Co., Kat.-Nr. 5170B) und durch Reinigung. Das DNA-Fragment und das DNA-Fragment mit ca. 170 Basenpaaren, in welches eine Mutation eingeführt worden war, wurden unter Verwendung eines DNA-Ligationkits (Takara Shuzo Co., Ltd., Katalog-Nr. 6021) zur Herstellung eines Expressionsvektors für humanes monomeres MP52 (pKOT279, 2,9 kb) ligiert. Der Vektor wurde am National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566, Japan, am 5. Februar 1998 hinterlegt (Hinterlegungsnr. Bikoukenki Nr. FERM P-16625) und der internationalen Hinterlegungsstelle gemäß dem Budapester Vertrag am 3. Februar 1999 überführt (Hinterlegungsnr. FERM BP-6637). Die Basensequenz des Expressionsvektors für humanes MP52-Monomer der vorliegenden Erfindung, Einführung der objektiven Mutation und die Richtigkeit der Basensequenz (sonstige Sequenz als die an der Stelle, an welcher eine Mutation eingeführt wurde) des hergestellten humanen MP52 wurden unter Verwendung eines DNA-Sequenzierungsgeräts (Amersham Pharmacia Biotech, ALF) bestätigt.
(2) Transformation
Die Transformation wurde experimentell gemäß dem Rubidiumchloridverfahren von Kushner et al. durchgeführt (Genetic Engineering S. 17, Elsevier. 1978). pKOT279 wurde nämlich gemäß dem obigen Verfahren zur Herstellung der Escherichia coli, welche ein Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren sollten, in Escherichia coli W3110M eingeführt.
Beispiel 2 Kultivierung
(1) Kultivierung
Die Escherichia coli, welche ein Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren sollten, wurden in einem modifizierten SOC-Kulturmedium vorkultiviert (Bacto-Trypton 20 g/l, Bacto-Hefeextrakt 5 g/l, NaCl 0,5 g/l, MgCl₂, 0,95 g/l und Glucose 3,6 g/l), 100 ml Zellsuspension (Bactotrypton 20 g/l, Zitronensäure 4,3 g/l, K₂HPO₄ 4,675 g/l, KH₂PO₄ 1,275 g/l, NaCl 0,865 g/l, FeSO₄·7H₂O 100 mg/l, CuSO₄·5H₂O 1 mg/l, MnSO₄·nH₂O 0,5 mg/l, CaCl₂·2H₂O 2 mg/l, Na₂B₄O₇·10 H₂O 0,225 mg/l, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0,1 mg/l, ZnSO₄·7H₂O 2,25 mg/l, CoCl₂·6H₂O 6 mg/l, MgSO₄·7H₂O 2,2 g/l, Thiamin-HCl 5,0 mg/l, Methionin 2 g/l und Glucose 3 g/l) wurden zu 5 l Kulturmedium zur Herstellung einer Kultur in einem 10 I-Kulturkessel unter belüftetem Rühren zugegeben und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid mit einer Konzentration von 1 mM wurden in einem Stadium, welches eine logarithmische Vermehrungsprophase (OD₅₅₀=50) erreichte, zugegeben, um bei einer OD₅₅₀ jenseits von 150 zu kultivieren. In der Kultur wurde die Temperatur auf 31°C eingestellt und der pH wurde durch Zugabe von Ammoniak auf 7,2 eingestellt. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde auf 50% Luftsättigung durch Erhöhen der Rührgeschwindigkeit eingestellt, um eine Abnahme der Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu verhindern. Eine 50%-Glucoselösung, welche 0,1 M Phosphat enthielt, wurde zugegeben, um eine Glucosekonzentration von 0,2% zu erhalten unter Bezugnahme auf eine schnelle Erhöhung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff als Hinweis, um eine höhere Zellkonzentration in der Kultur zu erzeugen.
(2) Herstellung der Einschlusskörperchen aus Escherichia coli
Die durch dieses Verfahren erhaltene Kulturlösung wurde dreimal durch eine Hochdruckhomogenisierungsvorrichtung (LAB40-10RBF1, APV, Gohrin Co.) unter 560 bar Druck hindurch geleitet, um Zellen aufzubrechen und zur Gewinnung eines Präzipitats, welches die Einschlusskörperchen enthielt, zentrifugiert.
Beispiel 3 Aufreinigung
(1) Lösung der Einschlusskörperchen aus Escherichia coli
Die gewonnenen Einschlusskörperchen wurden zweimal mit 20 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,3), welche 1 M Harnstoff und 5 mM EDTA enthielt, gewaschen und bei 4°C und 3.000 × g für 30 min zentrifugiert; das erhaltene Präzipitat wurde durch Ultraschallbehandlung in 20 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,3), welche 8 M Harnstoff, 50 mM NaCl, 64 mM DTT und 5 mM EDTA enthielt, gelöst.
(2) Aufreinigung von denaturiertem monomerem Protein
Die gelöste Lösung wurde bei 4°C und 20.000 × g für 30 min zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. Der gesammelte Überstand wurde auf eine SP-Sepharose-FF (Amersham Pharmacia Biotech)-Säule, welche mit 20 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,3), 6 M Harnstoff, 10 mM DTT und 1 mM EDTA equilibriert war, aufgetragen, mit der Lösung gewaschen und mit der Lösung enthaltend 0,4 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde einer Gelfiltration mit einer Superdex 200 pg-Säule (Amersham Pharmacia Biotech), welche durch 20 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,3), 6 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 10 mM DTT und 1 mM EDTA equilibriert war, unterzogen, um einzig ein denaturiertes monomeres Protein zu erhalten.
(3) Rückfaltung
50 mM Na-Glycinpufferlösung (pH 9,8), 0,5 M NaCl, 20 mM CHAPS und 3 mM GSSG (oxidiertes Glutathion) in neunfacher Menge wurden zu der Lösung des denaturierten monomeren Proteins, welches durch obige Behandlung erhalten wurde, hinzugegeben, wobei sich Rühren zur Rückfaltung bei 4°C für 20 h anschloss.
(4) Aufreinigung eines monomeren Proteins mit Aktivität.
Die rückgefaltete Probe wurde 2,8-mal mit 14 mM NaH₂PO₄ verdünnt und isoelektrischer Präzipitierung unterzogen. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 20 min gewonnen und in 0,05% TFA gelöst. Die Lösung wurde auf eine Resource-RPC-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) einer Umkehrphasen-HPLC, welche zuvor mit 0,05% TFA equilibriert worden war, aufgetragen und mit 0,05% TFA und einem 0-50%-Acetonitrilgradienten eluiert. Das Eluat wurde durch ein Absorptionsmeter bei 280 nm Absorption überwacht, um eine Fraktion an gereinigtem monomerem Protein der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Zu der Proteinfraktion wurde 5 N NaOH zugegeben, um einen Bereich zwischen pH 6,5 und 7,5 zur Präzipitierung am isoelektrischen Punkt einzustellen. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 h gesammelt und zur Einstellung von ca. 3 mg/ml in 10 mM HCl gelöst, um ein monomeres Protein mit einer Aktivität der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
(i) N-terminale Sequenzanalyse
Die N-terminale Analyse der Aminosäurezusammensetzung des oben erhaltenen gereinigten monomeren Proteins der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung einer Sequenzierungsvorrichtung (Applied Biosystem, Modell 476A) durchgeführt.
(ii) Analyse der Aminosäurezusammensetzung
Die Aminosäurezusammensetzung des oben erhaltenen gereinigten monomeren Proteins der vorliegenden Erfindung wurde durch eine Aminosäureanalysevorrichtung (Waters, PICO. TAG. WORK STATION) untersucht.
(iii) Elektrophoretische Analyse
Das Molekulargewicht des oben erhaltenen gereinigten monomeren Proteins der vorliegenden Erfindung wurde durch SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen zu einem Molekulargewicht von ca. 14 kDa bestimmt.
Basierend auf den durch (i), (ii) und (iii) bereitgestellten Ergebnissen wurde festgestellt, dass das monomere Protein der vorliegenden Erfindung ein monomeres Protein mit 119 Aminosäureresten ist, welches am N-Terminus mit Pro beginnt, wie es in SEO ID NO:2 des Sequenzprotokolls gezeigt ist.
Beispiel 4
Messung biologischer Aktivität
Eine Differenzierung induzierende Aktivität wurde unter Verwendung von zwei kultivierten Zelllinien bewertet; ATDC5 (Riken Gene Bank, RCB 0565), um wie eine Knorpelzelle, welche aus einer Embryozelle aus Maus abgeleitet ist, zu differenzieren und MC3T3-E1 (Riken Gene Bank, RCB 1126) mit Eigenschaften wie die eines Osteoblasten abgeleitet aus einer Maus, auf Grundlage der Bezugnahme auf alkalische Phosphatase fördernde Aktivität des Proteins. Das Ergebnis ist in 2 gezeigt.
ATDC5 und MC3T3-E1 der Konzentration 10.000 Zellen pro 1 ml wurden in 5% fötales Kälberserum enthaltendem DF-Kulturmedium (Gibco Ltd.) bzw. 10% fötales Kälberserum enthaltendem MEM-α^–-Medium (Gibco Ltd.) suspendiert und zur Kultivierung bei 37°C für 3 Tage unter 5% CO₂ in 24 Platten mit 1 ml pro Vertiefung beimpft.
Anschließend wurden die Zellen mit dem MEM-α^–-Medium ohne Serum gespült, ein natürliches Dimer oder ein monomeres Protein, welche stufenweise mit dem 0,3% Kälberalbumin enthaltendem MEM-α^–-Medium verdünnt waren, wurden mit 0,5 ml pro Vertiefung zugegeben, um die Differenzierungsinduktion zu starten. Die Kultivierung wurde für 3 Tage durchgeführt und die Zellen wurden zweimal mit PBS (20 mM Phosphatpufferlösung, 150 mM NaCl, pH 7,4) gewaschen und 250 μl zytolytische Lösung (0,2% NP-40, 1 mM MgCl₂) wurde zugegeben und man ließ die Ansätze bei 37°C für 2 h stehen. Im Anschluss an diesen Schritt wurde das Gesamtvolumen der die aufgebrochenen Zellen enthaltenden zytolytischen Lösung auf ein Mikrogefäß überführt und zur Verwendung seines Überstands in einem Assay zentrifugiert (10.000 × g, 5 min).
Eine Enzymaktivität wurde durch Beobachtung des Absorptionsanstiegs von p-Nitrophenol (pNp) bei 405 nm gemessen, wobei es sich um das aus p-Nitrophenolphosphat als Substrat mit einer Endkonzentration von 10 mM durch Lösen in einem 0,1 M Glycerinpuffer, pH 10,4, 1 mM ZuCl₂, und 1 mM MgCl₂ abgeleitete Dissoziationsprodukt handelt.
Der Absorptionsanstieg wurde für 40 min alle 2 min beobachtet und die alkalische Phosphatase fördernde Aktivität (μM pNp/min) wurde auf Grundlage der Daten im linearen Bereich berechnet.
Darüber hinaus war die Proteinkonzentration des gleichen Überstands durch Verwendung eines BCA Protein-Assay-Kits (Amersham Pharmacia Biotech) bekannt und die alkalische Phosphataseaktivität pro Protein wurde durch nmol pNp/min/mg Protein dargestellt.
Sequenzprotokoll

Claims

Monomeres MP52- oder GDF-5-Protein, in welchem das mit der Dimerbildung in Beziehung stehende Cystein mit einer anderen Aminosäure ersetzt worden ist.
Monomeres Protein nach Anspruch 1, wobei die andere Aminosäure eine Aminosäure ist, welche aus der aus Serin, Threonin, Alanin und Valin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Monomeres Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei die andere Aminosäure Alanin ist.
Monomeres Protein umfassend die in SEQ ID NO:2 beschriebene Aminosäuresequenz.
Verfahren zur Expression unter Verwendung von Escherichia coli, einer Hefe, einer Insektenzelle oder einer Säugerzelle, welche mit einem Plasmid umfassend eine DNA-Sequenz, welche ein monomeres Protein nach einem der Ansprüche 1-4 exprimieren kann, transformiert worden ist.
Mittel umfassend das monomere Protein nach einem der Ansprüche 1-4 enthaltend eine wirksame Menge des monomeren Proteins zur Vorbeugung und Behandlung einer Knochen und/oder Knorpel betreffenden Erkrankung.
Mittel zur Vorbeugung und Behandlung einer Knochen und/oder Knorpel betreffenden Erkrankung nach Anspruch 6, wobei die Erkrankung Osteoporose ist.
Mittel zur Vorbeugung und Behandlung einer Knochen und/oder Knorpel betreffenden Erkrankung nach Anspruch 6, wobei die Erkrankung Osteoarthritis oder Arthrosteitis ist.
Mittel zur Vorbeugung und Behandlung einer Knochen und/oder Knorpel betreffenden Erkrankung nach Anspruch 6, wobei die Erkrankung ein Knochenbruch ist.
Mittel zur Vorbeugung und Behandlung einer Knochen und/oder Knorpel betreffenden Erkrankung nach Anspruch 6, wobei die Erkrankung ein Defizit an Zahnwurzel oder an Zahnfach ist.