KR100458413B1 - 연골·뼈유도성수복용재료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 뼈 유도 인자 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜류를 함유하는 연골·뼈 유도성 수복재에 관한 것이다. 구체적으로 바람직한 예로는, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜류의 성분인 폴리프로필렌 글리콜의 분자량이 약 1,500 내지 4,000의 범위에 속하며, 에틸렌 옥시드 단위의 중량비가 분자당 약 40 내지 80 %이고, 수용액에서 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜의 농도가 약 10 내지 50 %인 수복재이다. 이 재료는 수술할 필요가 없는 연골·뼈 유도 방법에 사용된다. 뼈 유도 인자와, 생체 흡수성이 높으며, 뼈 유도 인자와의 친화성이 좋고, 온도에 따라 가역적인 졸-겔 변화가 가능한 담체로 이루어지기 때문에, 이들은 골절 및 뼈 손실 부위에 적용하여 우수한 치료 효과를 발휘한다.
Description
본 발명은 골절 또는 뼈 손실의 치료에 유용한 연골·뼈 유도성 수복용 재료에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 뼈 유도 인자와 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류를 함유하는 연골·뼈 유도성 수복용 재료에 관한 것이다.
연골·뼈의 수복 방법으로서 환자 자신의 자가 골이식 이외에 뼈 유도 인자와 적당한 담체와의 조합에 의한 연골·뼈 결손부의 보철제를 환부에 집어 넣는 방법이 이루어지고 있다. 이 경우, 외과적 수술시에 환부를 노출시켜 뼈 유도 인자를 함유하는 연골·뼈 수복용 재료를 직접 환부에 적용하는 것이 가능하기 때문에, 취급이 쉬운 블록, 스폰지 및 시트 등의 고체 형태가 널리 사용되어 왔다. 또 겔 또는 페이스트 등의 반고체 형태도 사용할 수 있다. 이러한 고체 또는 반고체 형태를 가능하게 하는 담체로서는 예를 들면 스테인리스 및 티타늄 합금 등의 금속 또는 콜라겐 및 히드록시아파타이트 (HAP) 또는 이러한 것들의 혼합제 등이 이용되고 있다.
한편, 외과적 수술을 필요로 하지 않는 골절 또는 골관절염 등의 치료에 골유도 인자를 투여하는 시도가 이루어지고 있다. 이 투여 형태는 비관혈적 투여 즉 주입 형태가 고통을 경감한다는 점에서 절실히 요망되고 있다. 그러나 뼈 유도 인자의 단순한 수성 액제를 이 형태로 투여하면 투여 후의 약물의 확산 소실이 일어나기 때문에 뼈 유도 인자를 효율적으로 투여하기 위해서는 적응 환부에 일정 기간 뼈 유도 인자를 체류시킬 필요가 있다. 그래서 투여시에는 통침성 (通針性)을 갖는 액상으로 투여된 후에 겔상으로 상 변화하여 환부에 골유도 인자를 체류시킬 수 있는 담체가 고안되고 있다. 이 담체로서는 독성이 없고, 생체와의 적합성이 좋으며 생체 흡수성이 높은 것이 바람직하다.
지금까지 뼈 유도 인자의 담체로서는 콜라겐이 알려져 있으며, 양호한 생체 적합성 및 생체 흡수성이 인정되고 있다 (일본 특공평 5-75425호). 또한 주사 가능한 콜라겐과의 조합에 대해서도 알려져 있어, 주입 가능한 연골·뼈 형성재의 가능성을 가지고 있다 (일본 특공평 7-23322호 및 일본 특공평 5-53140호). 그러나, 현재 의약품으로서 이용 가능한 콜라겐은 그 기원이 소 또는 돼지 등의 천연물 유래의 재료이기 때문에 그 분자량, 아미노산 조성물, 수분보유량 등이 일정하지 않다. 또한 이러한 것들은 사람에게 있어서 이종의 단백질이기 때문에 항원성 등의 부작용이 있다. 특히 항원성의 경우 콜라겐에서 테로펩티드 부위를 제거한 아테로콜라겐을 사용하여도 완전히 없앨 수는 없다 (J. American Academy of Dermatology 10, 638-646 및 647-651, 1984, 및 J. American Academy of Dermatology 21, 1203-1208, 1989).
한편, 폴리 젖산 또는 폴리 젖산 글리콜산 공중합체 등의 생분해성 중합체를 의료용 담체로서 사용하는 것은 알려져 있다 (US 5,385,887호 및 일본 특공평 6-22570호). 그러나 이러한 생분해성 중합체의 형상은 고체 형태 또는 반고체 형태이며, 일정 형태를 유지한다는 점에서 외과적 수술시에 적용하는 재료군에 속한다. 만약 이와 같은 생분해성 중합체를 이용하여 주사 가능한 복합체를 제조할 수 있었다 해도, 그 제조 공정에서 유기 용제를 사용하지 않을 수 없어 활성 성분인 뼈 유도 인자의 불활성화가 문제가 된다는 것이 용이하게 예측된다.
<발명의 개시>
본 발명의 목적은 상기에 나타낸 바와 같이 종래법의 단점 내지는 결점을 극복하여 생체 흡수성이 높으며, 활성 성분인 뼈 유도 인자와의 친화성이 좋고, 온도에 따라 졸-겔 가역 변화를 일으킴으로써 뼈 유도 인자의 약효를 지속시키고, 나아가 항원성 등의 부작용이 적은 연골·뼈 유도성 수복용 재료를 제공하는 데에 있다.
본 발명자들은 외과적 수술을 필요로 하지 않는 뼈 수복 방법에서 활성 성분이 되는 뼈 유도 인자와 그 담체와의 관계에 대하여 예의 검토한 바, 어느 종류의 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류에 생체 흡수성이 높고, 뼈 유도 인자와의 친화성이 좋으며, 온도에 따라 졸-겔 가역 변화를 일으키는 것이 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류 수용액에 뼈 유도 인자를 혼합하고, 투여시 1 ℃ 내지 30 ℃에서는 주입 가능한 액체이며, 투여 후 3분 이내에 37 ℃ 부근에서 겔화되는 뼈 형성재를 제작하여 마우스 대퇴부 근육내에 투여 후 투여 부위에 뼈 유도 인자를 유지시키고, 그곳에서 이소성 연골·뼈 형성 능력이 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류와 뼈 유도 인자를 함유하는 연골·뼈 유도성 수복용 재료에 관한 것이다.
폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류란, 친수성이 낮은 폴리프로필렌글리콜을 소수성 기로 하고, 에틸렌옥시드를 친수성 기로서 부가한 고분자형의 비이온성 계면 활성제의 총칭이며, 폴리프로필렌글리콜의 분자량 및 에틸렌옥시드와의 혼합비를 변화시킴으로써 여러 가지 특성을 갖는 계면 활성제를 제조하는 것이 가능해진다. 합성 가능한 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 조성은 폴리프로필렌글리콜의 분자량이 900 내지 4000의 범위에 있고, 총 분자중의 에틸렌옥시드의 중량%가 5 % 내지 90 %이다. 예를 들면 아사히 덴까샤 제품인 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류 (아데카 (등록상표))는 폴리프로필렌글리콜 분자량과 부가되는 에틸렌옥시드의 중량비에 의해 계통적으로 명명되어 있으며 그 분류도를 도 1에 나타낸다.
폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 산업상 이용으로서는 일반 세정제, 소포제 (antifoaming)로서의 사용 이외에 의약품 분야에서 완하제, 연고 기재, 인공 혈액, 정제의 피막, 부형제, 주사제의 가용화제 및 용해 촉진제 등에 사용되고 있다. 특히 플루로닉 F-68 (폴리프로필렌글리콜의 분자량 1750, 에틸렌옥시드 함량이 80 %)의 용혈 방지 작용은 현저하여 혈액의 체외 순환용 첨가제로서 (주) 미도리쥬지에서 엑소폴 (등록상표)로서 시판되고 있다. 각종 동물에서의 독성 시험 결과로부터 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류는 독성 및 자극성이 매우 낮다는 것이 명백하며 항원성 등의 부작용을 나타낸다는 보고도 없다 (Fragrance Journal 7, 82-87, 1974). 독성 시험의 결과를 표 1에 나타냈다.
| 아데카(R) 플루로닉 | 동물종 | LD50(g/㎏) |
| L-44, L-62, L-62 | 래트 | 5 |
| F-68 | 마우스 | >15 |
| F-68 | 래트, 토끼, 개 | 급성 독성 반응 없음 |
| P-85 | 래트 | 34.6 |
한편, 취급상 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류는 가역적인 졸-겔의 상변화를 나타내는 점에서 온도 변화에 따라 비가역적 상전이를 보이는 콜라겐보다도 우수하다. 이 성질은 상전이를 나타내는 온도에 대해 최적인 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 선택하고 그 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 수용액의 농도를 변화시킴으로써 제어 가능하다 (Int. J. Pharm. 22, 207-218, 1984 및 EP 0551626A1호).
이상의 결과로 볼 때, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류는 의약용 담체로서의 자질이 우수하다는 것이 자명하며, 국소 마취제, 항암제 등의 저분자량의 약물과 조합하거나 (Int. J. Pharm. 8, 89-99, 1981 및 Chem. Pharm. Bull. 32, 4205-4208, 1984), 인터루킨 등의 고분자량의 생리 활성 단백질을 혼합하는 시도가 이미 이루어지고 있다 (Pharm. Res. 9, 425-434, 1992).
본 발명은 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류와 뼈 유도 인자를 함유하는 연골·뼈 유도성 수복용 재료에 관한 것이며, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 구성 성분인 폴리프로필렌글리콜의 분자량이 약 1500 내지 4000의 범위에 있으며, 에틸렌옥시드 함량이 약 40 내지 80 %/분자의 범위에 있는 연골·뼈 유도성 수복용 재료에 관한 것이다.
이 구성 성분의 범위내이면, 본 발명의 특성인 온도에 의한 졸-겔 가역 변화가 가능한 플루로닉이 된다.
또한, 본 발명은 수용액의 형태로서 상기에 기재한 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 수용액 중의 농도가 약 10 내지 50 %인 연골·뼈 유도성 수복용 재료에 관한 것이다. 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류는 일반적으로 수용액의 제조 농도 등에 의해 그 가역 변화 온도가 변동된다는 것도 알려져 있으며, 상기 구성 성분의 범위에 있는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류에서는 체온 부근 즉 37 ℃ 근처에서는 용액 농도 약 10 내지 90 %의 범위에서 겔화가 일어난다. 최적인 예로서는 폴리프로필렌글리콜의 분자량 3850, 에틸렌옥시드 함량이 70 %인 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류 (플루로닉 F-127)를 15 내지 20 % 농도의 수용액으로 제조한다.
골 유도 인자 (Bone morphogenetic protein: BMP)란, 미분화 간엽계 세포를 연골 세포로 유도하여 골조직을 형성하는 활성이 있는 단백질이다.
본 발명에서 사용되는 뼈 유도 인자의 예로서는 TGF-β진스퍼 패밀리에 속하는 BMP-2에서 BMP-9 등의 일련의 단백질, MP52라는 단백질, GDF-5라는 단백질 등을 들 수가 있는데, 이러한 것들에 한정되는 것은 아니다. BMP-2로서는 Wang 등이 보고한 유전자 재조합 기술에 의해 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary (CHO)) 세포를 이용하여 생산한 단백질 BMP-2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2220-2224, 1990 및 US 4,877,864호)이, MP52로서는 본 발명자들이 제안한 유전자 재조합 기술에 의해 제조되는 신규한 단백질 MP52 (일본 특원평 7-93644호)가 특히 적합하다. 이 신규한 단백질은 MP52 유래의 서열표 서열식 1에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열의 N 말단에 메티오닌을 코딩하는 코돈을 부가한 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 제작하여, 그 플라스미드를 대장균으로 형질전환하고, 그 대장균을 배양함으로써 얻어지는 봉입체 (inclusion body)를 가용화하여 정제함으로써 얻어지는 단량체의 단백질을 이량체로 재생하고 이것을 정제함으로써 얻어진다.
BMP-2 및 MP52를 활성 성분으로 하는 15 내지 30 % 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 수용액을 마우스 대퇴부 근육내에 주사하고, 투여 후 투여 부위에 MP52를 유지시키고, 그곳에서 이소성 연골·뼈 형성 능력이 있다는 것을 관찰하였다.
이와 같이 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류와 뼈 유도 인자와의 조합으로 이루어지는 연골·뼈 유도성 수복용 주입 재료는 지금까지 보고되어 있지 않으며, 연골·뼈 수복 특히 골절 치료제로서 유용하다.
본 발명은 또한 뼈 유도 인자와 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류를 함유하는 연골·뼈 수복제에 관한 것이다.
또한 본 발명은 뼈 유도 인자와 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류를 함유하는 연골·뼈 수복제를 사람 또는 동물의 골절 또는 뼈 결손 부위에 국부 투여하는 것을 포함하는 연골·뼈 수복 치료 방법에 관한 것이다.
도 1은 아데카 (등록상표) 플루로닉의 분류도이다. 횡축은 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 전체 분자중의 에틸렌옥시드의 함량을 중량%로 나타내고, 종축은 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 구성 성분인 폴리프로필렌글리콜의 분자량을 나타낸다.
도 2는 실시예 4에서 얻어진 마우스의 우측 뒷다리 대퇴부의 골, 연골 석회화 조직의 연X선 (soft X-ray) 사진이다. (a)는 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127만, (b)는 MP52 함유 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127을 각각 투여한지 2주 후에 촬영하였다. 근육내에 검게 보이는 부분이 이소성으로 형성된 뼈 매트릭스이다.
도 3은 실시예 4에서 얻어진 마우스의 우측 뒷다리 대퇴부의 비탈회절편의 조직 염색 현미경 사진이다. 폰코사 (von-Kossa) 염색 (a)에서 골기질의 형성이 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin-Eosin) 염색 (b)에서 골아 세포를 동반한 뼈 기질의 형성 및 골수의 형성이 확인된다.
도 4는 참고예 1(2)에서 얻어진 단백질 MP52의 발현 벡터 (pKOT245)의 플라스미드 지도이다.
<발명을 실시하기 위한 바람직한 형태>
다음의, 실시예 및 참고예를 통해 본 발명의 효과를 구체적으로 설명한다. 또한 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
BMP-2를 함유하는 연골·뼈 유도성 수복용 재료의 제조법
아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 (아사히 덴까 고교)은, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류 중에서 가장 독성이 적은 것의 하나로서 알려져 있다 (세이야꾸 고죠 6, 875-880, 1986). 이 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 3.0 g을 주사용 증류수 7.0 g에 얼음냉각시키면서 용해시켜 30 % 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 수용액을 제조하였다. 얼음냉각시키면서 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 수용액을 96-웰타이터 플레이트에 360 ㎕/웰로 나누어 붓고, 80 ㎕ BMP-2를 함유하는 0.01 N HCl 40 ㎕를 각 웰에 첨가하여 혼합한 후, 4 ℃에서 0.22 ㎛의 필터를 투과시켜 멸균하여 총량 약 400 ㎕의 BMP-2 주사제를 생성했다 (아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127의 최종 농도는 27 %). 마찬가지로 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127의 최종 농도가 10, 15, 18 및 22.5 %의 BMP-2 주사제도 제작하였다.
그 결과, 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도 27 %에서는 5 ℃ 이하, 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도 22.5 %에서는 10 ℃ 이하, 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도 10 % 내지 18 %에서는 25 ℃ 이하에서 주입 가능하며, 37 ℃에서 겔상으로 상전이된 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 주사제는 최종 농도가 15 % 이상의 제제였다. 따라서, 실온에서 액상이며 37 ℃에서 겔상을 나타낸 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도 18 %의 제제가 최적이었다.
<실시예 2>
MP-52를 함유하는 연골·뼈 유도성 수복용 재료의 제조법
실시예 1의 BMP-2를 사용한 연골·뼈 유도성 수복용 재료의 제조 방법과 마찬가지로 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127의 최종 농도가 10, 15, 18, 22.5 및 27 %의 MP52 주사제를 제작한 결과, MP52를 사용하여도 BMP-2의 경우와 같은 주사제, 즉 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도 27 %에서는 5 ℃ 이하, 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도 22.5 %에서는 10 ℃ 이하, 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도 10 % 내지 18 %에서는 25 ℃ 이하에서 주입 가능한 제제가 얻어졌다.
<실시예 3>
생체내 (in vivo)에서의 연골·뼈 유도성 수복용 재료 투여 후의 MP52의 잔존율
마취 상태에서 수컷 마우스 (ICR계, 나이 8주)의 우측 뒷다리 대퇴부의 근육내에 실시예 2의 처방에 125I 표지 MP52를 첨가하여 마찬가지로 제조한 18, 22.5 및 27 % 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도의 125I 표지 MP52 주사제를 23G침으로 100 ㎕ 투여하고 (약 37 KBq 125I-MP52/부위), 우측 뒷다리에서의 방사능 소실 경과를 투여한지 0.5, 2 및 8시간 후에 그 잔존율로 관찰하였다. 대조로서 125I-MP52 수용액의 주사제를 이용하였다. 결과를 표 2에 나타냈다.
<표 2>
아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 제제 (최종 농도 18 % 아데카 (등록상표) 플루로닉 f-127) 또는 수용액제를 투여 후의 우측 뒤다리에서의 125I-MP52의 잔존율
| 시간(hr) | 플루로닉 제제 | 수용액제 |
| 0.5 | 60.5 % | 32.7 % |
| 2 | 19.7 % | 13.8 % |
| 8 | 14.9 % | 7.9 % |
폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류를 의약용 담체로서 사용했을 경우, 잔존하는 MP52는 단순히 MP52 수용액을 주입했을 경우에 비해 명확히 약물을 유지한다는 것이 표 2에서 명확하게 보여진다. 또 실시예 1의 주사제에 대해서도 마찬가지 결과가 얻어졌다.
<실시예 4>
이소성 연골·뼈 형성 능력에 의한 약효 시험
마취 상태에서 수컷 마우스 (ICR계, 8주령)의 우측 뒷다리 대퇴부의 근육내에 실시예 2에서 제조한 18 % 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도의 MP52 주사제를 23 G침으로 100 ㎕ 투여하였다 (20 ㎕ MP52/부위). 이 때 대조용로는 MP52를 함유하지 않은 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127의 주사제를 사용하였다. 연골·뼈 형성 여부를 투여 2주 후에 확인했다. 마우스를 경추 탈구에 의해 죽인 후, 투여 부위인 우측 뒷다리를 꺼내 연X선 조사기로 투여 부위에서의 골형성의 유무를 확인하였다. 결과를 도 2에 나타냈다 (n=5). 연X선 이미지를 보면, 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127만 투여한 경우 (도 2(a))에서는 투여 부위인 근육내에 영상은 나타나지 않았지만 MP52를 함유하는 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 (도 2-b)에서는 시험한 동물의 80 % 이상에 명확한 영상이 확인되었다.
또한, 연X선 촬영 종료 후, 시료를 10 % 포르말린내에서 보존하고, 조직학적 검사를 실시하였다. 도 2(b)에 나타낸 5마리의 마우스 중, 우측끝의 마우스의 조직 염색의 현미경 사진을 도 3에 나타냈다. 도 3에서 폰코사 (von-Kossa) 염색 (도 3(a))에 의해 영상 부분에 칼슘의 침착이 관찰되고, 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin-Eosin) 염색 (도 3-b)의 결과로부터 골아 세포, 뼈 기질 및 골수가 확인되어 걸의 형성이 확인되었다. 또, 염증 반응은 관찰되지 않았다. 도면 중 BM, OB 및 MA는 각각 뼈 기질, 골아 세포 및 골수를 나타낸다.
실시예 1에서 제작한 18 % 아데카 (등록상표) 플루로닉 F-127 최종 농도의 BMP-2 주사제에 대한 마찬가지의 시험을 실시했더니 마찬가지 결과가 얻어졌다.
이상의 결과에서 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류를 뼈 형성 인자의 담체로서 사용하는 경우의 안전성, 유용성이 확인되었다.
<참고예>
신규한 단백질 MP52의 제조
1. 벡터의 제작
(1) 변이형 MP52 성숙형 부분의 단리
사람의 MP52cDNA는 WO93/16099에 기재된 cDNA를 플라스미드 벡터 (pSK52s)를 주형 DNA로 사용하여, 성숙형 부분만을 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭시켰다.
개시 코돈 ATG 주변의 AT 함량을 증가시켜 목적 단백질의 생산성을 향상시키는 방법 (M. Nobuhara 등의 보고 (Agric. Biol. Chem., 52(6), 13331 내지 1338, 1988))에 따라 성숙형의 MP52 유전자 일부의 DNA를 치환하였다.
치환 방법은 서열식 2의 순방향 PCR 프라이머를 이용하여 PCR법으로 행하였다. PCR 프라이머의 DNA 서열은 순방향 프라이머로서 서열식 2 및 역방향 프라이머로서 서열식 3에 기재한 DNA를 이용하였다.
PCR은 같은 시험관에, 주형 DNA (10 나노그램), 순방향 및 역방향 PCR 프라이머 각각 50 피코몰, dNTP (0.2 밀리몰) 및 MgCl2 (1.5 밀리몰)을 Taq DNA 중합효소 (5 U)와 함께 첨가하여 행하였다.
각 사이클이 변성 (94 ℃, 1분간), 프라이머 어닐링 (55 ℃, 1분간) 및 프라이머 신장 (72 ℃, 2분간)으로 이루어지는 30 사이클의 PCR을 행하였다 (이하의 PCR은 모두 이 조건으로 행하였다).
PCR 반응에서의 생성물을 1.5 % 저융점 아가로오즈 (FMC 사) 중에서 전기 영동에 의해 분리하여, 서열식 1의 아미노산 서열에 상응하는 약 360 bp로 이루어지는 DNA를 잘라냈다 (이것을 단편 1이라 한다).
(2) 본 단백질의 대장균 발현 벡터의 제작
플라스미드의 복제수를 증가시키기 위해서는 복제 개시점을 pBR 세포주에서 pUC 세포주로 변이시켰다. 시판중인 대장균 발현 벡터 pKK223-3 (파마시아 바이오텍 가부시끼가이샤로부터 구입)의 tac 프로모터 영역을 제한 효소 SspI와 EcoRI로 소화한 후, 뭉 빈 뉴클레아제 (Mung Bean Nuclease) (다까라 슈죠 가부시끼가이샤, 카타로그 번호 2420A)로 처리하고, 단편 1의 개시 코돈측에 T4 DNA 리가아제 (다까라 슈죠 가부시끼가이샤, 카타로그 번호 2011A)로 결합시키고 pKK223-3의 rrnBT1T2 종결 암호 (terminator) 영역을 제한 효소 SalI와 SspI로 소화하고, SalI로 소화한 단편 1의 종결 코돈측과 결합시켜, pUC18의 SmaI 부위에 넣음으로써 본 단백질의 생산을 위한 발현 벡터 (pKOT245) (도 4)를 제작하였다. 이 벡터는 통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소 (NIBH) (일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고에 1995년 4월 14일자로 수탁번호 FERM P-14895호로서 기탁되고, 1996년 4월 10일자로 부다페스트 조약에 근거하여 기탁으로 이관되었다 (FERM BP-5499). pKOT245의 DNA의 길이는 3.7 kb이다. 제작한 본 단백질 발현 벡터는 Pharmacia ALF DNA 서열분석기에 의해 그 염기 서열을 결정했다.
(3) 형질전환
형질전환은 쿠쉬너 (Kushner) 등의 염화 루비듐법 (Genetic Engineering, p.17, Elsevier (1978)에 따라 수행했다. 즉, pKOT245를 숙주 대장균 W3110M으로 상기의 수법에 따라 이입하여 본 단백질 생산 대장균을 제조했다.
2. 배양
(1) 배양
본 단백질 발현 대장균을 변형 SOC 배지 (박토 (Bacto) 트립톤 20 g/ℓ, 박토 효모 추출물 5 g/ℓ, NaCl 0.5 g/ℓ, MgCl2·6H2O 2.03 g/ℓ, 포도당 3.6 g/ℓ)에서 예비배양하고, 생산용 배지 (박토 트립톤 5 g/ℓ, 시트르산 4.3 g/ℓ, K2PHO4 4.675 g/ℓ, KH2PO4 1.275 g/ℓ, NaCl 0.865 g/ℓ, FeSO4·7H2O 100 ㎎/ℓ, CuSO4·5H2O 1 ㎎/ℓ, MnSO4·nH2O 0.5 ㎎/ℓ, CaCl2·2H2O 2 ㎎/ℓ, Na2B4O7·10H2O 0.225 ㎎/ℓ, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1 ㎎/ℓ, ZnSO4·7H2O 2.25 ㎎/ℓ, CoCl2·6H2O 6 ㎎/ℓ, MgSO4·7H2O 2.2 g/ℓ, 티아민 HCl 5.0 ㎎/ℓ, 포도당 3 g/ℓ) 5 ℓ에 균체 현탁액을 100 ㎖ 첨가하여, 10 ℓ의 배양조에서 통기 교반하면서 배양하고, 대수 증식기 (OD550=5.0)에 달한 단계에서 1 mM의 농도로 이소프로필-β-D-티오가락토피라노시드를 첨가하고, 다시 OD550이 150에 달할때까지 배양하였다. 배양중, 온도는 32 ℃, pH는 암모니아를 첨가함으로써 7.15로 제어하고, 용존 산소 농도의 저하를 방지하기 위하여 교반 속도를 올림으로써 공기 포화의 50 %로 용존 산소 농도를 제어하였다. 또, 고균체 농도로 하기 위하여 용존 산소 농도의 급격한 상승을 지표로 하여 50 % 포도당 용액을 0.2 % 농도로 첨가하면서 배양하였다.
(2) 대장균 봉입체의 제조
상기 방법에 의해 얻어진 배양액을 원심하여 균체를 회수하고, 10 mM 에틸렌디아민테트라아세트산을 함유하는 25 mM Tris-HCl 완충액을 (pH 7.3)로 현탁하여 균체 파쇄 장치 (고린사 제품)를 이용하여 세균을 파쇄하고, 다시 원심하여 봉입체를 함유하는 침전물을 회수하였다.
3. 정제
(1) 대장균 봉입체의 가용화
대장균 봉입체를 1 % Triton X-100으로 3회 세정 후, 3000×g으로 30분간, 4 ℃에서 원심하여 얻어진 침전을 20 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.3, 8M 요소, 10 mM DTT, 1 mM EDTA로 초음파를 가하면서 가용화하였다.
(2) 단량체 정제
그 가용화액을 2000×g으로 30분간, 4 ℃에서 원심하고, 그 상층물을 회수하였다. 얻어진 상층물을 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.3), 6M 요소, 1 mM EDTA로 평형화한 SP-세파로오즈 (Sepharose) FF (파마시아사)에 통과하고, 이 용액으로 세정 후, 0.5M 염화나트륨을 함유하는 동일 용액으로 용출시켰다. 용출액에 Na2SO3과 Na2S4O6을 각각 최종 농도가 111 mM, 13 mM이 되도록 첨가하여 4 ℃, 15시간 술폰화를 행하였다. 술폰화 용액을 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.3), 6M 요소, 0.2 M 식염, 1 mM EDTA로 평균화한 세파크릴 (Sephacryl) S-200 HR (파마시아사)로 겔 여과를 행하여 단일한 술폰화된 본 단백질 단량체를 얻었다.
(3) 리폴딩
술폰화된 본 단백질 단량체의 용액에 9 배 부피의 50 mM Na-글리신 완충액 (pH 9.8), 0.2 M 염화나트륨, 16 mM CHAPS, 5 mM EDPA, 2 mM GSH (환원형 글루타치온), 1 mM GSSG (산화형 글루타치온)을 첨가한 후, 1일간 4 ℃에서 교반하여 리폴딩을 행하였다.
(4) 이량체 정제
리폴딩된 시료를 순수한 물로 2배 희석하고, 6 N 염산을 첨가하여 pH를 약 7.4로 맞추어 등전점 침전을 행하였다. 침전물을 3000×g에서 20분 동안 원심분리하여 모은 후, 0.1 % TFA이 함유된 30 % 아세토니트릴에 용해시켰다. 이 용액을 순수한 물로 2배 희석하고, 0.05 % TFA 함유 25 % 아세토니트릴로 평형화해 둔 역상 HPLC의 리소스 (RESOURCE) RPC 칼럼 (파마시아사)에 통과하고, 0.05 % TFA 함유 25 내지 45 % 아세토니트릴의 선형 구배로 용출하였다. 용출액은 흡광도 광도계를 이용하여 280 nm의 흡광도에 의해 모니터하여, 정제된 본 발명의 단백질 이량체 분획을 얻었다. 이것을 스피드백 콘센트레이터 (서번트사)로 동결 건조하였다.
(5) 정제된 본 단백질의 물리 화학적 성질의 측정
(가) N 말단 아미노산 서열 분석
상기에서 얻어진 정제된 본 단백질에 대하여 N 말단 아미노산 서열을 아미노산 서열분석기, 모델 476A (어플라이드 바이오 시스템즈사)로 분석했더니, 서열표 서열식 1로 나타내는 N 말단에서 30번째까지의 아미노산 서열이 확인되었다.
(나) 아미노산 조성 분석
상기에서 얻어진 정제된 본 단백질의 아미노산 조성을 아미노산 분석기[PICO TAG 시스템 (워터즈사)]로 조사하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈다. 표에 나타낸 수는 1 단량체당의 아미노산 잔기수를 나타냈다.
<표 3>
| 아미노산 | 실측값 | 기대값 |
| Asx | 11.5 | 12 |
| Glx | 109 | 11 |
| Ser | 8.4 | 9 |
| Gly | 4.3 | 4 |
| His | 4.0 | 4 |
| Arg | 7.7 | 7 |
| Thr | 5.4 | 6 |
| Ala | 7.3 | 7 |
| Pro | 10.2 | 10 |
| Tyr | 2.9 | 3 |
| Val | 5.7 | 7 |
| Met | 5.1 | 4 |
| 1/2Cys | 2.6 | 7 |
| Lle | 4.9 | 6 |
| Leu | 10.0 | 10 |
| Phe | 4.0 | 4 |
| Lys | 5.9 | 6 |
| Trp | - | 2 |
| 배열의 길이 | 119 | |
| - : 검출 불가능 | ||
(다) 전기 영동에 의한 분석
상기에서 얻어진 정제된 본 단백질의 분자량을 비환원 조건하의 SDS-PAGE로 확인했더니 약 28KDa의 분자량을 나타냈다.
상기 (가), (나) 및 (다)에 표시된 결과로부터 본 단백질은 N 말단이 단일하게 Pro부터 시작되는 119 잔기로 이루어지는 단백질이라는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 연골·뼈 유도성 수복용 재료는 외과적 수술을 필요로 하지 않는 골절 치료법에서, 생체 흡수성이 높고, 활성 성분인 뼈 유도 인자와의 친화성이 좋으며, 온도에 따라 졸-겔 가역 변화를 일으키므로 조작이 간편한 데다가 환자에게 외과적 수술에 의한 고통을 주지 않고 환부에 적용할 수 있다. 본 발명에 의해 뼈 유도 인자의 약효를 지속시키고 나아가 부작용이 적은 연골·뼈 유도성 수복용 재료를 제공할 수 있다.
<서열표>
(1) 서열 1에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 길이: 119
(B) 유형: 아미노산
(C) 토폴로지: 직선상
(ii) 분자 형태: 펩티드
(iii) 단편형: N 말단 단편
(iv) 최초의 공급원:
(A) 유기체: 사람 (homo sapiens)
(B) 조직의 종류: 사람 태아
(v) 서열의 특징:
(vi) 존재 위치:
(vii) 기타 정보: MP52 아미노산 서열의 383번째부터 501번째의 아미노산 서열.
[서열 1]
(2) 서열 2에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 길이: 27
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산
(iii) 최초의 공급원: 없음
(iv) 세포주: 없음
(v) 서열의 특징: MP52 성숙형 단리용 순방향 PCR 프라이머
[서열 2]
(3) 서열 3에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 길이: 26
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산
(iii) 최초의 공급원: 없음
(iv) 세포주: 없음
(v) 서열의 특징: MP52 성숙형 단리용 역방향 PCR 프라이머
[서열 3]
Claims (7)
- 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류와 뼈 유도 인자를 함유하는 연골·뼈 유도성 수복용 재료.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 구성 성분인 폴리프로필렌글리콜의 분자량이 약 1500 내지 4000이고, 에틸렌옥시드 함량이 약 40 내지 80 %/분자인 연골·뼈 유도성 수복용 재료.
- 제2항에 있어서, 수용액 형태로서, 상기 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류의 수용액 중의 농도가 약 10 내지 50 %인 연골·뼈 유도성 수복용 재료.
- 제1 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 뼈 유도 인자가 단백질 BMP-2인 연골·뼈 유도성 수복용 재료.
- 제1 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 뼈 유도 인자가 단백질 MP52인 연골·뼈 유도성 수복용 재료.
- 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류와 뼈 유도 인자를 함유하는 골절, 뼈 결손 치료제.
- 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류와 뼈 유도 인자를 함유하는 연골·뼈 유도성 수복용 재료를 사람 또는 동물의 골절 또는 뼈 결손 부위에 국부투여하는 것을 포함하는 골절 또는 뼈 결손의 치료 방법.
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