WO1997018829A1

WO1997018829A1 - Materiaux inducteurs d'os/de cartilage en vue de leur reparation

Info

Publication number: WO1997018829A1
Application number: PCT/JP1996/003333
Authority: WO
Inventors: Takesada Shimura; Satsuki Toriyama
Original assignee: Hoechst Marion Roussel Ltd.
Priority date: 1995-11-17
Filing date: 1996-11-14
Publication date: 1997-05-29
Also published as: DK0884052T3; CN1207047A; KR100458413B1; CA2235400A1; DE69630811D1; ATE254470T1; ES2211993T3; HU226201B1; AU712445C; PT884052E; US20050013864A1; EP0884052A4; US7238657B2; KR19990067676A; DE69630811T2; US6903071B2; JPH09143093A; HK1018205A1; CA2235400C; RU2180234C2

Description

明細書

軟骨 · 骨誘導性修復用材料

技術分野

本発明は骨折あるいは骨欠損の治療に有用な软骨 ·骨誘導性修復用材料に関する。さらに詳しくは、本発明は骨誘導因子とポリオキシェチレンボリ才キシプロピレングリコール類を含む軟骨 ·骨誘導性修復用材料に関する。

： ^ 技

軟骨 ·骨の修復方法として、患者自身の自家骨移植以外に骨誘導因子と適当な担体との組み合わせによる钦骨 ·骨欠損部の補てつ剤を患部に埋め込む方法が行われている。この場合、外科的手術時に患部を露出し骨誘導因子を含む钦骨 ·骨修復用材料を直接患部に適用する事が可能であるため、取り扱い易いプロック、スポンジおよびシ一卜等の固体形態が広く用いられてきた。また、ゲルあるいはペースト等の半固体形態も使用できる。これらの固体または半固体形態を可能にする担体としては- 例えばステンレスおよびチタン合金等の金属やコラーゲンおよびハイド口キシァパタイ卜（HAP ) またはそれらの混合剤等が利用されている。一方、外科的手術を必要としない骨折や変形関節症などの治療に骨誘導因子を投与する試みがなされている。この投与形態は、非侵襲性投与すなわち注入形態が患者の苦痛を軽減する点で切望されている。しかしながら骨誘導因子の単なる水性液剤をこの形態で投与すると、投与後の薬物の拡散消失が起こるため骨誘導因子を効率よく投与するためには適応患部へ一定期間骨誘導因子を滞留させる必要がある。そこで、投与時には通針性を有する液状であって投与後にゲル状に相変化し患部に骨誘導因子を滞留させ得る担体が考えられている。この担体としては毒性が無く、生体との適合性が良く、生体吸収性が高いものが好ましい。

これまでに、骨誘導因子の担体としてはコラーゲンが知られており、良好な生体適合性及び生体吸収性が認められている（特公平 5— 75425 号）。さらに注射可能なコラーゲンとの組み合わせについても知られており、注入可能な軟骨 · 骨形成材の可能性を有している（特公平 7 — 23322号及び特公平 5— 53 1 4 0号）。しかしながら、現在医薬品として利用可能なコラーゲンはその起源がゥシあるいはブタなどの天然物由来の材料であるために、その分子量、アミノ酸組成量、保水量等が一定しない。さらに、これらはヒトにとつて異種の蛋白質であることに起因する抗原性等の副作用を有する。特に抗原性については、コラ一ンのテ口べプチド部位を排除したァテロコラーゲンを使用しても完全に無くすことは出来ない ( J . Amer i can Academy o f Derma to l ogy 10, 638- 646 and 647-651, 1984及び J . American Academy of Dermatol ogy 21 , 1203 - 1208, 1989)。

一方、ポリ乳酸やポリ乳酸グリコール酸共重合体等の生体分解性ポリマーを医薬用担体として用いることは知られている（US 5385887号及び特公平 6— 22570号）。しかし、これら生体分解性ボリマーの形状は固体形態または半固体形態であり、一定形態を保持する点で外科的手術時に適用する材料群に属する。仮に、この様な生分解性ポリマーを用いて注射可能な複合体を作製できたとしても、その製造工程において有機溶剤を使用せざるをえず、有効成分である骨誘導因子の失活か問題となることが容易に予測される。

発明の開示

本発明の目的は上に示したように従来法の不利点ないしは欠点を克服し、生体吸収性が高く、有効成分である骨誘導因子との親和性が良く、温度によってゾルーゲル可逆変化を起こすことにより骨誘導因子の薬効を持続させ、さらには抗原性等の副作用の少ない軟骨 ·骨誘導性修復用材料を提供することにある。

本発明者らは外科的手術を必要としない骨修復方法において、有効成分となる骨誘導因子とその担体との関係について鋭意検討していたところ、ある種のポリオキシエチレンポリオキンプロピレングリコール類に- 生体吸収性が高く骨誘導因子との親和性が良く温度によってゾルーゲル可逆変化を起こすものがあることを見い出した。本発明者らは、ポリオキシェチレンポリオキンプロピレングリコール類水性溶液に骨誘導因子を混合し、投与時 1 °Cから 30°Cにおいては注入可能な液体であり投与後 3分以内に 37°C付近でゲル化する骨形成材を作製し、マウス大腿部筋肉内に投与後投与位に骨誘導因子を保持させ、こで異^性钦骨 · 胃形成能があることを見い出し、本発明を完成した。

本発明は、ポリオキンエチレンポリオキンプロピレングリコール類と骨誘導因子とを含む钦骨 ·骨誘導性修復用材料に関するものである。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類とは、親水性の低いポリプロピレングリコールを疎水基としェチレンォキサイドを親水基として付加した高分子型の非イオン性界面活性剤の総称であり、ボリプロピレングリコールの分子量及びエチレンォキサイドとの混合比を変化させることにより種々の特性を有する界面活性剤を構成することが可能となる。合成可能なポリオキンエチレンボリォキシプロピレングリコール類の組成は、ポリプロピレングリコールの分子量力 900から 4000 の範囲にあり、総分子中のエチレンォキサイドの重量％が 5 %から 90 % である。例えば、旭電化社製のポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類（アデ力 ® ) は、ポリプロピレングリコ一ルの分子量と付加するェチレンォキサイドの重量比により系統的に命名されており、その分類図を図 1に示す。

ポリォキシェチレンポリォキシプロピレングリコール類の産業上の利用としては、一般洗浄剤 '消泡剤としての使用の他、医薬品の分野において钦下剤、軟膏基材、人工血液、錠剤の被膜、陚形剤、注射剤の可溶化剤および溶解促進剤などに使用されている。特にプルロニック F - 68 (ポリプロピレングリコールの分子量 1 750、ェチレンォキサイド含量が 80% ) の溶血防止作用は顕著であることより、血液の体外循環用添加剤として（株）ミドリ十字からェキソコポール③ として市販されている。各種動物における毒性試験結果から、ポリオキンエチレンポリオキンプロピレングリコール類は毒性及び刺激性が極めて低いことが明らかであり. 抗原性等の副作用を示すとの報告もない（フレグランスジャーナル 7 . 82 - 87, 1974)。毒性試験の結果を表 1 に示す。表 1

アデ力 ®プル口ニックの急性毒性試験結果

アデカ③プル口ニック —動 — 物 _種 — U ₅。（gZkg)

L-44, L-62, L-64 ラッ卜 5

F - 68 マウス > 1 5

F-68 ラッ卜、ゥサギ、ィヌ急性毒性反応なし

P-85 ラッ卜 3 4. 6

—方、取り扱い上において、ポリオキンエチレンポリオキシプロピレングリコール類は可逆的なゾル—ゲル相変化を示す点においてコラーゲンの温度変化における非可逆的相転移よりも優れる。この性質は、相変化を示す温度を至適なポリォキンエチレンポリォキシプロピレンダリコール類の選択及びそのポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類の水溶液の濃度を変えることにより制御可能である（In t. J . Pha rm. 22. 207-218, 1984, EP 0551626A 1号）。

以上のことから、ポリオキシエチレンボリォキシプロピレングリコール類は医薬用担体としての資質に優れており、局所麻酔剤 · 抗癌剤等の低分子量の薬物と組み合わせたり（Int . J . Pharm. 8， 89-99， 1981 及び Chem . Pharm. Bu l l . 32, 4205 -4208, 1984 )、インタ一ロイキン等の高分子量の生理活性タンパク質を混合する試みが既になされている (Pharm. Res. 9, 425-434, 1992) 。本発明は、ポリオキンエチレンポリオキンプロピレングリコール類と骨誘導因子とを含む钦骨 ·骨誘導性修復用材料に関し、ポリオキシェチレンポリオキシプロピレングリコ一ル類の構成成分のポリプロピレングリコールの分子量が約^ 00〜4000の範囲にあり、ェチレンォキシド含量が約 40〜80%ノ分子の範囲にある软骨 ·骨誘導性修復用材料に関する。この構成成分の範囲内であれば、本発明のプルロニックの特性である温度によるゾルーゲル可逆変化を成し得るプルロニックになる。

e りに、小？ e "、ノ K r 欣ン; i ,¾s のつ、丄 [：丁、リキン丄チレンポリオキシプロピレングリコール類の対水溶液濃度が約 10〜50% からなる軟骨 ·骨誘導性修復用材料に関する。ポリオキシエチレンポリォキシプロピレングリコール類は、一般的に水溶液の調製濃度等によりその可逆変化温度が変動することも知られており、上記構成成分の範囲にあるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類では体温付近すなわち 37°C近辺では対水溶液濃度約 10~90%の範囲でゲル化が起こる。最適な例としてはポリプロピレングリコールの分子量 3850、ェチレンォキサイド含量が 70%であるポリォキシェチレンポリォキシプロピレングリコール類（プル口ニック F— 127) を対水溶液濃度 15〜30%で調製する。

骨誘導因子（Bone morphogenetic protein ： BMP)とは、未分化間葉系細胞を軟骨細胞へ誘導し、骨組織を形成する活性をもつ蛋白質である。本発明で用いられる骨誘導因子の例としては、 TGF— /3ジーンスーパーフアミリーに属する MP— 2から BMP— 9等の一連のタンパク質、 M P 52と称されるタンパク質、 GDF— 5と称されるタンパク質などがあげられる力これらに限定されるものではない。 BMP— 2としては、 Wangらが報告した遺伝子組み替え技術により Chinese hamsterovary (CH0) 細胞を用いて生産したタンパク質 BMP— 2 (Pro atl. Acad. Sci. USA, 87, 2220 - 2224, 1990および US4877864号）および M P 52としては本発明者らが提案した遺伝子組み換え技術により製造される新規なタンパク質 M P 52 (特願平 7— 93644号）が特に好適である。この新規なタンパク質は、 M P 52由来の配列表配列番号 1記載のァミノ酸配列をコードする D N A配列の N末端にメチォニンをコ一ドするコドンを付加した D N A を含有するプラスミドを構築し、そのプラスミドを大腸菌に形質転換し- その大腸菌を培養することによって得られるインクルージョンボディを可溶化し、精製することによって得られる単量体のタンパク質を二量体に再生し、これを精製することによって得られる。

BMP - 2および 1^ ? 52を有効成分とする1 5 ~ 30 %ポリオキシエチレンボリォキシプロピレングリコール類の水性溶液をマウス大腿部筋肉内に注射し、投与後投与部位に M P 52を保持させ、そこで異所性軟骨 ·骨形成能があることを観察した。

このように、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類と骨誘導因子との組み合わせからなる軟骨 ·骨誘導性修復用注入材料は今まで報告されておらず、钦骨 ·骨修復、特に骨折治療剤として有効である。

本発明はさらに、骨誘導因子とポリォキシェチレンボリォキシプロピレングリコール類を含む钦骨 ·骨修復剤に関する。

さらに本発明は、骨誘導因子とポリォキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類を含む钦骨 ·骨修復剤をヒトまたは動物の骨折または骨欠損部位に適用することからなる钦骨 ·骨修復治療方法に関する。図面の簡単な説明

図 1は、アデ力 ®プル口ニックの分類図である。横軸はポリオキシェチレンポリオキシプロピレングリコール類の総分子中のエチレンォキサィドの含量を重量％で表し、縦軸はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類の構成成分のポリプロピレングリコールの分子量を表す。図 2は、実施例 4で得られたマウスの右後足大腿部の骨 ·軟骨石灰化組織の軟 X線写真である。（ a )はアデ力 ®プル口ニック F— 127のみ、 (1?)は^1?52含有ァデカプルロニック F—127をそれぞれ投与後 2週間に撮影した。筋肉内に黒く見える部分が異所性に形成された骨マ卜リックスである。

図 3は、実施例 4で得られたマウスの右後足大腿部の非脱灰切片の組織染色顕微鏡写真である。フォンコッサ（von- Kossa) 染色（a)においノか'、 '、マ十ン' リン '' 一 ' —ノン、 ii e in aし ΰ X y 1ュ π - 0 s 1 nノ染色（b)において骨芽細胞をともなった骨基質の形成および骨髄の形成が確認される。

図 4は、参考例 1 ( 2 )で得られたタンパク質 MP52の発現ベクター (PK0T245) のプラスミドマップである。

発明を実施するための最良の形態

以下に、実施例および参考例を示して本発明の効果を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。実施例 1 BMP - 2を含有する軟骨 ·骨誘導性修復用材料の調製法

アデ力 ®プル口ニック F— 127 (旭電化工業）は、ポリオキシェチレンポリオキンプロピレングリコール類種の中で最も毒性が少ないものの一つとして知られている（製薬工場 6， 875-880, 1986)。このアデ力 ®プル口ニック F— 127 3.0 gを注射用蒸留水 7.0 gに氷冷下溶解し、 30%アデ力 ®プル口ニック F—127水溶液を調製した。氷冷下アデ力 ® プル口ニック F— 127水溶液を 96—ウェルタィタープレー卜に 360 / ゥエルで分注し、 80yc g BMP— 2を含む 0.01N HC1 40〃を各ゥエルに加え混和後、 4 °Cで 0.22//mのフィルターを透過させて滅菌し、全量約 400〃の BMP— 2注射剤とした（アデ力 ®プル口ニック F— 127の最終濃度は 27%)。同様にアデカ③プル口ニック F—127の最終濃度が 10、 15、 18及び 22.5%の BMP— 2注射剤も作製した。その結果、アデカ③プルロニック F— 127最終濃度 27%では 5 °C以下、アデカ③プル口ニック F—127最終濃度 22.5%では 10°C以下、アデカ③ プルロニック F— 127最終濃度 10%から 18%では 25°C以下で注入可能であり、 37°Cにおいてゲル状に相変化したアデ力 ®プルロニック F— 127 注射剤は、最終濃度が 15%以上の製剤であった。従って、室温で液状であり 37°Cでゲル状を示したアデカ③プルロニック F— 127最終濃度 18% の製剤が最適である。

芙施 ' 2 M P52を含有する钦骨 ' 骨誘導性復用材料の ¾製法

実施例 1の BMP— 2を用いた軟骨 ·骨誘導性修復用材料の調製方法と同様にアデ力 ®プル口ニック F— 127の最終濃度が 10、 15、 18、 22.5および 27%の MP52注射剤を作製した結果、 MP52を用いても BMP— 2の場合と同様な注射剤つまりアデ力 ®プル口ニック F— 127最終濃度 27% では 5 °C以下、アデ力 ®プルロニック F— 127最終濃度 22.5%では 10°C 以下、アデカ③プル口ニック F— 127最終濃度 10%から 18%では 25°C以下で注入可能な製剤が得られた。

実施例 3 イン ' ビボ（in vivo) における軟骨 ·骨誘導性修復用材料投与後の M P 52の残存性

麻酔下雄性マウス（ICR系、 8週令）の右後足大腿部の筋肉内に、実施例 2の処方に^{1 25} I標識 MP52を添加して同様に作製した 18、 22.5 及び 27%アデカ③プルロニック F— 127最終濃度の'²⁵ I標識 M P52注射剤を 23G針で 100 投与し（約 37KBq ^{1 25} I — MP52/部位）、右後足からの放射能消失経過を 0.5、 2及び 8時間後のその残存率を観察した。対照として、 ^{1 25} I — M P52水溶液の注射剂を用いた。結果を表 2に示す。表 2 アデ力 ®ブルロニック F— 127製剤（最終濃度 18 % アデ力 ®プル口ニック F— 127) または水溶液剤を投与後の右後足における¹²⁵ I—MP 52の残存率

時間（hr) ブル口ニック製剤水溶液剤

0.5 60.5% 32.7%

2 19.7% 13.8%

8 14.9% 7.9% 表 2から、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコ一ル類を医薬用担体として用いた場合、残存する MP52は単に MP52水溶液を注入した場合に比較して明らかに薬物を保持することが示された。また実施例 1の注射剤についても同様の結果が得られた。

実施例 4 異所性钦骨 ·骨形成能による薬効試験

麻酔下雄性マウス（ICR系、 8週令）の右後足大腿部の筋肉内に、実施例 2で作製した 18%アデ力 ®プル口ニック F— 127最終濃度の MP 52 注射剤を 23G針で 100/ 投与した（20 g MP52Z部位）。この時対照としては、 M P 52を含有しないアデ力 ®プル口ニック F— 127の注射剤を用いた。软骨 ·骨形成の判断は、投与 2週間後に行った。マウスを頸椎脱臼により屠殺後、投与部位である右後足を切り出し钦 X線照射器により撮像を得、投与部位における骨形成の有無を確認した。結果を図 2に示す（n = 5)。軟 X線撮像の結果、アデ力 ®プル口ニック F— 127のみ (図 2— a )では投与部位である筋肉内に影は認められなかったが、 MP 52を含有するアデ力 ®プル口ニック F— 127 (図 2— b) では試験した動物の 80%以上に明らかな影が確認された。

さらに、 Ϊ欠 X線撮影終了後、検体を 10%ホルマリン内で保存し、組織学的検査を実施した。図 2— bに示した 5匹のマウスのうち右端のマウスの組織染色の顕微鏡写真を図 3に示す。図 3においてフォンコッサ (von-Kossa) 染色（図 3— a ) により影の部分にカルシウムの沈着が観察され、へマトキシリン一ェォシン（Hematoxylin- Eos in) 染色（図 3 一 b) の結果から骨芽細胞、骨基質および骨髄が認められ骨の形成が確認された。また炎症反応は観察されなかった。図中の BM、 OBおよび MAはそれぞれ骨基質、骨芽細胞および骨髄を示す。

実施例 1で作製した 18%アデカ③プルロニック F— 127最終濃度の BMP ― 2注射剤についての同様の試験を実施したところ、同様の結果が得られた。

以上の結果からポリォキシェチレンポリォキシプロピレングリコール類を骨形成因子の担体として使用する場合の安全性、有用性が確認された。

参考例新規なタンパク質 MP 52の調製

1. ベクターの作製

( 1 ) 変異型 MP 52成熟型部分の単離

ヒト MP52cDNAは、 WO 93/16099に記載された c D N Aを含んだプラスミドベクタ一（pSK52s) を銪型 DN Aとして、成熟型部分のみをポリメラーゼ連鎖反応（PCR) を用いて増幅した。

開始コドン A TG周辺の AT含量を上げる事により、目的タンパク質の生産性を上げる方法 {M. Nobuharaらの報告（Agric. Biol. Chem. , 52 (6), 1331〜1338, 1988)) に従い成熟型の Μ Ρ 52遺伝子の一部の D Ν A を置換した。

置換の方法は、配列番号 2の順方向 P C Rプライマーを用い、 P CR 法で行った。 P C Rプライマーの DNA配列は、順方向プライマーとして配列番号 2、及び逆方向ブライマ一として配列番号 3記載の D N Aを用いた。

P C Rは、同じ試験管中で、鍩型 D NA (10ナノグラム）、順方向及び逆方向 P C Rプライマー各々 50ピコモル、 d NT P (0.2ミリモル）、及び M g C 1₂ (1.5ミリモル）を Taq DNAポリメラーゼ（ 5 U) と共に加えることにより行った。

各サイクルが、変性（94° (：、 1分間）、プライマ一アニーリング（55 、 1分間）、およびプライマー伸長（72°C 2分間）からなる 30サイクルの P C Rを行った（以下の PCRはすべてこの条件で行った）。

P CR反応からの生成物を 1.5%低融点ァガロース（FMC社）中で電気泳動により分離し、配列番号 1のァミノ酸配列に相当する約 360bpから ,よ ( 'ノ mレ / 41¾ ソン z ι、丄こ s oノ o

(2) 本タンパク質の大腸菌発現べクタ一の構築

プラスミドの複製数を上げるためには、複製ォリジンを p B R系から p U C系に改変した。市販の大腸菌発現ベクター pKK223 _ 3 (フアルマシア · バイオテク株式会社より購入）の t a cプロモーター領域を制限酵素 Ssp l と EcoR Iで消化後、 Mun_g Bean Nuclease (宝酒造株式会社. カタログ番号 2420A)で処理し、フラグメント 1の開始コドン側に丁 4DNA Ligase (宝酒造株式会社，カタログ番号 2011A) で結合させ、 ρΚΠ23 一 3の rrnBTJz夕一ミネーター領域を制限酵素 Sal I と Ssp Iで消化し、 Sal I で消化したフラグメント 1の終止コドン側に結合させ、 p UC18 の Sma I部位に組み込むことにより、本タンパク質の生産のための発現ベクタ一（pKOT245) (図 4) を構築した。このベクターは通商産業省ェ業技術院生命工学工業技術研究所（NIBH) (曰本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番 3号に 1995年 4月 14日付で受託番号 FERM P- 895号として寄託され、 1996年 4月 10日付でブダぺスト条約に基づく寄託へ移管された (FERM BP- 5499 pKOT245の D N Aの長さは 3.7kbである。作製した本タンパク質発現べク夕一は、 Pharmacia ALF DNA シークェンサ一によりその塩基配列の決定を行った。

(3) 形質転換

形質牵云換は、 Kushnerらの塩化ノレビジゥム法 (Genetic Engineering, p.17, Elsevier (1978)) に従った。即ち、 pKOT245を宿主大腸菌 W3110M へ上記の手法に従い移入し、本タンパク質生産大腸菌とした。

2. 培養

(1) 培養

本タンパク質発現大腸菌を改変 S0C培地（Bacto tryptone 20g/^,

Bacto yeast extract 5 g/£, NaCl 0. g/e, gCl₂-6H₂0 2.03 g/ £, Glucose 3.6 ^) で前培養し、生産用培地（Bacto tryptone 5 g / Citric acid 4.3 /' i, Κ₂!!Γ04 4. C75 g / H, ΙΙ₂Ρ 0₄ 1.275 g / aCl 0.865 g/^, FeS0₄-7H₂0 100rag/i?, CuS0₄-5H₂0 1 m ^, MnS0₄-nH₂0 0. mg/ £, CaCl₂-2H₂0 2 mg/^, Na₂B₄0₇ · 10H₂0 0.225mg/ £, ( H₄)6 o₇0₂4 - 4H₂0 0. g/ ZnS0₄-7H₂0 2. 5mg ^, CoCl₂-6H₂0 6 mg ^, MgS0₄ ·7Η₂0 2.2 g / i, Thiamine HC1 5. Glucose 3 g/ 5 に対し菌体懸濁液を 100m 添加し、 10 の培養槽で通気攪拌しながら培養し、対数増殖前期（OD550 = 5.0) に達した段階で l mM の濃度でイソプロピル一 S— D—チォガラクトビラノシドを添加し、さらに〇 D 550が 150に達するまで培養した。培養中、温度は 32°C、 pHはアンモニアを添加することにより 7.15に制御し、溶存酸素濃度の低下を防ぐために攪拌速度をあげることにより空気飽和の 50%に溶存酸素濃度を制御した。また、高菌体濃度とするために溶存酸素濃度の急激な上昇を指標として、 50%グルコース溶液を 0.2%濃度で添加しながら培養した。

(2 ) 大腸菌インクル一ジョンボディの調製

上記方法により得られた培養液を遠心して菌体を回収し、 ΙΟπιΜェチレンヂァミン四酢酸を含む 25mM Tris-llCl緩衝液を（pH7.3) に懸濁し菌体破砕装置（ゴーリン社製）を用いて細菌を破碎し、再度遠心してインクルージョンボディを含む沈殿を回収した。

3. 精製 (1 ) 大腸菌インクル一ジョンボディの可溶化

大腸菌ィンクルージョンボディを 1 % Triton X—100で 3回洗浄後、 3000 x gで 30分間、 4°Cで遠心し、得られた沈殿を 20mM Tris— HC1緩衝液、 pH8.3、 8M尿素、 10mM DTT、 1 mM EDTAで超音波をかけながら可溶化した。

(2) 単量体精製

その可溶化液を 20000 X gで 30分間、 4°Cで遠心し、その上清を回収レた。侍られた上 ί¾¾τ/;ΰπι¾ 1 i.is · Ηし 1抜 ¾r欣 ριΐδ. ύ、 o Mw系、 1 mM EDTAで平衡化した SP— Sepharose FF (フアルマシア社）に通し、同溶液で洗浄後、 0.5M食塩を含む同溶液で溶出させた。溶出液に Na₂S0₃と Na₂S ₄0₆をそれぞれ最終濃度が lllraM、 13mMになるように加え 4て、 15 時間スルホン化を行った。スルホン化溶液を 20mM Tris— HC1緩衝液、 pH 8.3、 6M尿素、 0.2M食塩、 lmM EDTAで平衡化した Sephacryl S-200 HR (フアルマシア社）でゲル濾過を行い、単一なスルホン化された本夕ンパク質単量体を得た。

(3 ) リフォールデイング

スルホン化された本タンパク質単量体の溶液に 9倍量の 5 OmM Na- Glycine緩衝液 pH9.8、 0.2M塩化ナトリウム、 16m CHAPS. 5mM EDTAヽ 2πι GSH (還元型グルタチオン）、 l mM GSSG (酸化型グルタチオン）を加えた後、 1日間、 4 °Cで撹拌しリフォールデイングを行った。

(4) 二量体精製

リフオールディングされた試料を純水で 2倍希釈し、 6 N塩酸を加え pHを約 7.4に合わせて等電点沈殿を行った。沈殿を 3000x g 20分の遠心で集めた後、 30%ァセ卜二トリル、 0.1%TFAに溶解した。その溶液を純水で 2倍希釈し、 0.05%TFA、 25%ァセトニ卜リルで平衡化しておいた逆相 HPLCの RESOURCE RPCカラム（フアルマシア社）に通し、 0.05% TFA、 25〜45%ァセトニトリルグラジントにより溶出した。溶出液は吸光度光度計を用い 280ηπιの吸光度によりモニターし、精製された本発明のタンパク質二量体画分を得た。これを、スピードバックコンセントレーター（サーバント社）により凍結乾燥した。

(5) 精製された本タンパク質の物理化学的性質の測定

(ァ） Ν末端ァミノ酸配列分析

上記で得られた精製された本タンパク質にっき、 Ν末端ァミノ酸配列をアミノ酸シークェンサ一、モデル 476 Α (アプライドバイオシステムズ社）により分析したところ、配列表配列番号 1で示す N末端から 30番目までのアミノ酸配列が確認された。

(ィ）アミノ酸組成分析

上記で得られた精製された本タンパク質のァミノ酸組成をァミノ酸分析機〔PIC0 TAGシステム（ウォーターズ社）〕により調べた。その結果を表 3に示す。表に示された数は 1モノマー当りのアミノ酸残基数を示す。

表 3

ァミノ B 実刺値期待

A s X 11. 5 12

G 1 X 10. 9 11

S e r 8. 4 9

G I y 4. 3 4

H i s 4. 0 4

A r g 7. 7 7

Th r 5. 4 6

A 1 a 7. 3 7

P r o 10. 2 10

Ty r 2.9 3

V a 1 5. 7 7

Me t 5. 1

¹ん Cy s 2. 6 7

I 1 e 4. 9 6

L e u 1 ϋ. 0 10

P h e 4. 0 4

し y s 5. 9 6

T r p 2

列の長さ 119

：検出不可 (ゥ）電気泳動による分析

上記で得られた精製された本タンパク質の分子量を非還元条件下の

SDS— PAGEにより確認したところ、約 28KDaの分子量を示した。

上記（了）、（ィ）および（ゥ）に示された結果より、本タンパク質は N末端が単一に Proから始まる 1 19残基からなるタンパク質であることが解つた。

産業上の利用可能性

本発明の钦骨 ·骨誘導性修復 ffi材料は、外科的手術を必要としない骨折治療法において、生体吸収性が高く、有効成分である骨誘導因子との親和性が良く、温度によってゾルーゲル可逆変化を起こすことから操作が簡便なうえ、患者に外科的手術による苦痛を与えることなく患部に適用できる。本発明により骨誘導因子の薬効を持続させ、さらには副作用の少ない钦骨 ·骨誘導性修復用材料が提供できる。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 1 1 9

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直線状

配列の種類：ぺプチド

フラグメント型： N末端フラグメント

起源：

生物名：ヒ卜 (homo sapiens)

組織の種類：ヒト胎児

配列の特徴：

存在位置：

他の情報： MP52ァミノ酸配列の 383番目から 501番目のァミノ酸配列。配列：

CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT 48 Pro Leu Ala Thr Arg Gin Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala

5 10 15

CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG 96 Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp

20 25 30

GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG 144 Asp Asp Trp lie l ie Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu

35 40 45

GGG CTG TGC GAC TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG ΑΛΤ CAT 192 Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His

50 55 60

GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA 240 Ala Val lie Gin Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80

CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG CGA CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC 288 Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro lie Ser lie Leu Phe

85 90 95

ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC 336 He Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gin Tyr Glu Asp Met Val

100 105 110

GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 357 Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg

115

配列番号： 2

配列の長さ： 27

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直線状

配列の種類：他の核酸

起源：なし

生物名：なし

株名：なし

配列の特徴： MP52成熟型単離用順方向 PCRプライマ—。

配列：

ATAATGCCAC TAGC AACTCG TCAGGGC 27 配列番号： 3

配列の長さ： 26

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

Π— トポロジー：直線状

配列の種類：他の核酸

起源：なし

生物名：なし

株名：なし

配列の特徴： MP52成熟型単離用逆方向 PCRプライマー。

配列：

し（J I C LI Aししし 1 ししし Aし Λしし I z り

Claims

請求の範囲

1 . ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類と骨誘導因子とを含む钦骨 ·骨誘導性修復用材料。

2 . 請求項 1に記載のポリオキンエチレンポリオキシプロピレングリコール類の構成成分であるポリプロピレングリコールの分子量が約 1500

〜4000の範囲にあり、エチレンォキサイド含量が約 40〜 80 % /分子の範囲にある軟骨 ·骨誘導性修復用材料。

. 7j、 fti Π wノ门ン, ひリっヽ、ソ刁っ J J ノノしグリコール類の対水溶液濃度が約 10~ 50 %からなる請求項 2に記載の钦骨 ·骨誘導性修復用材料。

4 . 骨誘導因子がタンパク質 BMP— 2である請求項 1 〜 3のいずれかの項に記載の軟骨 ·骨誘導性修復用材料。

5 . 骨誘導因子がタンパク質 M P 52である請求項 1 ~ 3のいずれかの項に記載の钦骨 ·骨誘導性修復用材料。

6 . ボリォキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類と骨誘導因子とを含む骨折，骨欠損治療剤。

7 . ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコ一ル類と骨誘導因子とを含む骨折 ·骨誘導性修復用材料をヒトまたは動物の骨折または骨欠損部位に適用することからなる、骨折または骨欠損の治療方法。