WO1997023612A2 - Zielgerichtete verbindungen mit knorpel- und/oder knocheninduzierender aktivität - Google Patents

Zielgerichtete verbindungen mit knorpel- und/oder knocheninduzierender aktivität Download PDF

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WO1997023612A2
WO1997023612A2 PCT/EP1996/005768 EP9605768W WO9723612A2 WO 1997023612 A2 WO1997023612 A2 WO 1997023612A2 EP 9605768 W EP9605768 W EP 9605768W WO 9723612 A2 WO9723612 A2 WO 9723612A2
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cartilage
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Gertrud Hötten
Rolf Bechtold
Jens Pohl
Michael Paulista
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Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to new compounds with cartilage and / or bone inducing activity, which have a high affinity for the extracellular matrix and / or for cellular components of cartilage and / or vertebrate bones and / or for a biocompatible carrier matrix for joint or bone implants, or Bone adhesives.
  • the new compounds can be enhanced in their action by simultaneously inhibiting bone resorption.
  • the invention further relates to the production of these compounds and pharmacological compositions containing these compounds for the treatment and prevention of diseases affecting the cartilage and / or bone, such as e.g. Osteoporosis, and for the treatment and prevention of damage to the cartilage and / or bone tissue can be used.
  • TGF-ß superfamily Many growth factors from the TGF-ß superfamily are relevant for a wide range of medical treatment methods and applications, which particularly concern wound healing and tissue restoration.
  • members of the TGF-ß superfamily cf. eg: Roberts, AB & Sporn, MB Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990) 419-472; Kingsley, DM, Genes & Development 8 (1994) 133-146 and the literature cited therein.
  • Members include the TGF- ⁇ proteins, such as the TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, TGF- ⁇ 4 and TGF- ⁇ 5, cf. for example: US Patent 5,284,763; EP 0376785; U.S. Patent 4,886,747; Madisen, L. et al.
  • BMP Bone Morphogenetic Protein
  • GDF Crowth Differentiation Factor family
  • GDF-1, GDF-3, GDF-9 and the GDF-5, GDF-6 and GDF-7 are of particular interest for cartilage and / or bone induction counting; see. : McPherron, AC & Lee, S.-J., J. Biol. Chem. 268 (1993) 3444-3449; Storm, EE et al. , Nature 368 (1994) 639-643; Lee, S.-J .; Proc. Natl. Acad. Be.
  • TGF- ⁇ , BMP and GDF families have a cartilage and / or bone-inducing potential, but also Active family members, at least in combination with other TGF-ß superfamily members, can influence bone formation; see. for example, Hock, JM et al., Endocrinol. 126: 421-426 (1990); Wang et al. , Proc. Natl. Acad. Be. USA 87: 2220-2224 (1990); Wozney et al., Mol. Reprod. Dev. 32 (1992) 160-167; Sampath et al.
  • WO 93/16099 and WO 95/04819 describe the DNA and protein sequences of other TGF- ⁇ -like proteins, in particular MP52, which were not isolated from bone.
  • MP121 is the Activin ßC already described.
  • MP52 for which i.a. a cartilage and bone inducing potential could be demonstrated.
  • the mature portion of the human MP52 has only one amino acid difference compared to the GDF-5 isolated from mice.
  • TGF-ß superfamily which have a cartilage and / or bone-inducing potential
  • TGF-ß superfamily members are characterized in the mature part by high amino acid homologies and have the seven conserved cysteines typical of TGF-ß superfamily members.
  • Members of this superfamily are normally all in their active form as homo- and / or heterodimeric proteins. Nevertheless, they show variations such as the appearance in different tissue levels and development stages.
  • some of these growth factors frequently show further functions, which enables their use in various medical indications. At the same time this means non-local application, such as systemic application of high doses, but also the risk of side effects.
  • the diphosphonic acids are best known for their influence on bone metabolism.
  • pathologically increased bone loss can be reduced by inhibiting osteoclast activity; see. e.g. Van Gelder, J.M. et al. (1995) Bone 16, 511-520, and Ott, S.M. (1993) J. Bone. Miner. Res. 8 Suppl. 2, S597-606.
  • This does improve the negative balance for diseases in bone metabolism such as osteoporosis, but a more inhibitory influence on human osteoblasts, which are responsible for the bone structure, could be shown for diphosphonic acids; see. Khokher, M.A. & Dandona, P. (1989) Metabolism 38, 184-187.
  • Inhibition of bone resorption can also be achieved by proteins which contain an arginine-glycine-aspartic acid (RGD).
  • RGD arginine-glycine-aspartic acid
  • Peptides with an RGD sequence bind to surface receptors of some cells and thus prevent their binding to extracellular matrix.
  • Proteins with RGD sequences e.g. the echistatin or kistrin are able to inhibit the adhesion of osteoclasts to the bone matrix and thus their absorption; see. e.g. : van der Pluijm G. et al. , J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 1021-1028; King, K.L. et al. , J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 381-387; Horton, M.A.
  • the present invention is therefore based on the object of providing new compounds which are said to have high cartilage and / or bone-inducing activities, and which at the same time should have a high affinity for the extracellular matrix and / or cellular components of cartilage and / or vertebrate bones and / or for a biocompatible carrier matrix.
  • the purpose of this is to enrich the compounds, in particular in the bone tissue, with the aim of increasing bone synthesis, in order to treat or prevent diseases which affect the cartilage and / or bone and which in particular are associated with a loss of bone substance or damage to the cartilage and / or to improve bone tissue and the fixation or stabilization of implants.
  • new compounds are to be made available which, in addition to cartilage and / or bone-inducing activity, simultaneously reduce bone breakdown by inhibiting the osteoclasts.
  • A is a protein of the TGF-ß superfamily with cartilage and / or bone-inducing activity or a fragment thereof
  • B depending on the indication, can simultaneously inhibit bone resorption.
  • X preferably remains stable in the body, but can also be split off, for example, hydrolytically, for some applications, preferably at the site of action, so that A and B are released, n can be the same or different from m.
  • protein of the TGF-ß superfamily with cartilage and / or bone-inducing activity means a protein which contains the characteristic preserved 7 cysteines in the mature portion. These include members of the TGF-ß, Activin, BMP and GDF families and in particular MP52 as well as fragments thereof with basically the same activity. Preferred are homodimers of the proteins mentioned, but also heterodimers from different family members. Proteins are preferably included which have the same receptor mechanism and / or the same signal transmission as the members of the BMP and / or GDF family, in particular of MP52.
  • the cartilage and / or bone-inducing potential can be determined in known experiments such as in vivo by inducing cartilage and / or bone after implantation of the protein with a suitable carrier matrix in the rat muscles; see. eg Sampath, TK et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 20352-20362 and / or in vitro by induction of alkaline phosphatase activity on ROB-C26 cells; see. Yamaguchi, A. et al., J. Cell Biol. 113 (1991) 681-687 and / or W-20-17 cells; see: Thies, RS, et al. Endocrinol.
  • the protein can be present as a mature protein but also as a precursor protein or protein with different processing in the propeptide portion and / or with N- and / or C-terminal amino acid sequences which essentially do not influence the biological activity.
  • the protein can contain or insert substituted or inserted amino acids, likewise provided that the activity is not significantly influenced, and can be isolated from various species, such as humans, mice, rats, cattle or pigs. Furthermore, the protein can be obtained by methods known in the art, for example glycosylation,
  • A is a protein from the GDF or BMP family or a fragment thereof.
  • protein A comprises the MP52 protein with the primary sequence shown in FIG. 1 or a fragment thereof.
  • this embodiment comprises the mature MP52 or functional parts or fragments thereof, the active form preferably being a dimer. Functional partial areas or sections or fragments which contain at least the area of the seven conserved cysteines are particularly preferred.
  • fragment means a part of protein A which essentially also has a cartilage and / or bone-inducing activity.
  • spacer means a compound with at least two reactive or functional groups capable of binding to A and B, these groups being able to be the same or different. Compounds with different reactive groups are preferred.
  • the reactive groups can be located inside or at the ends of the spacer X.
  • the reactive group can be a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group or a sulfhydryl group.
  • the spacer can e.g. be an oligopeptide.
  • the spacer can be a substituted or unsubstituted chain with preferably 1 to 100 atoms or chain atoms, in particular carbon, oxygen, nitrogen and / or sulfur atoms.
  • the spacer also comprises several such chains, which are bridged via carbon, oxygen, nitrogen and / or sulfur atoms.
  • the substituents can e.g.
  • the spacer preferably imparts a hydrophilic property to the compound according to the invention.
  • the term “attachment group” means a peptide with an affinity, in particular under physiological conditions, sufficient for specific constituents of the extracellular matrix and / or cellular constituents of cartilage or bone and / or a biocompatible carrier matrix in order to be bound to it .
  • This also includes peptides that contain an RGD sequence.
  • the term also includes polyclonal or monoclonal antibodies or specific fragments thereof.
  • the side chains of the peptide can be modified by methods known in the art as listed above. In particular, sugar residues can be introduced via N- or O-glycosidic bonds to hydrophilize the peptide.
  • extracellular matrix encompasses components of cartilage and bone outside of cells, in particular the different types of collagen, for example collagen I, II, V, IX, X, XI and XIII, furthermore hydroxyapatite, proteoglycans and glycosaminoglycans such as, for example, chondroitin sulfate, biglycan Decorin and / or hyaluronic acid, furthermore proteins such as eg osteopontin, sialoprotein, osteonectin, osteocalcin, laminin, fibronectin, vitronectin, thrombospondin, CMP (Cartilage Matrix Protein) and dentin phosphoprotein.
  • collagen I, II, V, IX, X, XI and XIII furthermore hydroxyapatite, proteoglycans and glycosaminoglycans such as, for example, chondroitin sulfate, biglycan Decorin and / or hyaluronic acid, furthermore
  • cellular constituents in cartilage and / or bone relates to living cells in cartilage and / or bone such as, for example, chondroblasts, chondrocytes, chondroclasts, osteoblasts, osteocytes, osteoclasts and odontoblasts.
  • biocompatible carrier matrix includes in particular joint or bone implants.
  • Matrices can consist of materials that are already used for implantations in general and dental medicine.
  • Components of carrier matrices are, for example, hydroxylapatite, calcium sulfates, calcium carbonates, tricalcium phosphates, polylactic acid or their derivatives (eg poly [D, L- (lactide-co-glycolide)) and / or components of the extracellular matrix, including the various types of collagen such as can be isolated, for example, from bones and / or from the skin.
  • Ceramic and / or metallic and / or glass-containing materials can also be used as carrier matrices Materials such as sintered hydroxylapatite or titanium.
  • the carrier matrices can also consist of plastic, including bone adhesives such as polymethylacrylates.
  • the carrier matrices can be composed of several components, for example hydroxylapatite combined with collagen (eg Healos, available from Orquest Inc , CA, USA)
  • the compound according to the invention must have an affinity for one or more have their constituents of the carrier matrix.
  • the connection according to the invention can be distributed in the entire carrier matrix or applied locally to a surface, such as when anchoring prostheses.
  • the attachment group B is a peptide and its C-terminus is linked to the N-terminus of A via an amide bond, preferably a peptide bond.
  • the attachment group B is a peptide and the spacer X is an oligopeptide, the peptide having its C-terminus being bound to the N-terminus of the oligopeptide via an amide bond, preferably a peptide bond and the oligopeptide with its C-terminus is bound to the N-terminus of A via an amide bond, preferably a peptide bond.
  • the compound according to the invention which contains an attachment group according to the first embodiment, may comprise amino acid sequences flanking the N and / or C terminus, such as signal peptides, propeptides or fragments thereof, which, for example, the compound according to the invention by enzymatic cleavage of the propeptide or fragments thereof biologically active or native or mature form.
  • the peptide as attachment group B according to the first embodiment or the oligopeptide as spacer X is preferably coupled to the N-terminus of protein A. It is already known that differences or modifications to the mature proteins, such as different N-termini, do not significantly change the activity of the mature proteins. In this context, the HisMP52 protein, which is active despite additional amino acids at the N-terminus, should be mentioned, cf. : Krieglstein K. et al. , J. Neuroscience Res. 42 (1995) 724-732. In the practical implementation, the DNA coding for the peptide and / or the oligopeptide can precede the DNA coding for the protein.
  • fusion proteins obtained in this way are expressed and purified by methods known in the art.
  • the peptide and / or the oligopeptide depend on the N-terminus of the protein in a defined manner. Coupling larger attachment groups such as peptides to the surface, i.e. certain side chains, the proteins can under certain circumstances strongly influence their binding behavior to receptors and / or their activity.
  • cartilage and / or bone-specific structures can be, for example, proteins such as various types of collagen, osteopontin or osteonectin.
  • These specific structures can now be used as an antigen to generate monoclonal antibodies.
  • the RNA can be isolated from it. After the RNA has been rewritten into a cDNA, it is used in a PCR which allows the amplification of the variable, antigen-binding regions of the antibody.
  • the DNA isolated in this way can be cloned in front of the DNA, which codes for the corresponding cartilage and / or bone inducing factor, artificially introduced at the ends of the PCR fragments. Care must be taken to maintain the reading frame of the antigen-binding domain and the protein.
  • monoclonal antibodies it is also possible to generate phage antibodies.
  • phage antibodies Such a system (Recombinant Phage Antibody System) is commercially available, for example from Pharmacia.
  • the selection of peptides with the desired binding affinities can preferably be carried out using peptide banks which are commercially available, for example from MoBiTec.
  • randomized peptides are fused to the N-terminus of a filamentous phage protein (eg pIII gene product).
  • the randomized peptides are typically 6, 8 or 15 amino acids in size. In order to achieve high specific affinities or the recognition of secondary structures, however, it can be advantageous to use randomized peptides up to a length of 90 amino acids.
  • the fusion protein is presented on the surface so that it is easily accessible to possible binding partners. Repeated affinity purification and amplification can be used to enrich phages which have peptides with an affinity for the immobilized cartilage and / or bone-specific components and / or biocompatible carrier matrix components. Single phage DNA can be isolated and the region encoding the randomized peptide sequenced.
  • This DNA can then in turn be cloned while maintaining the reading frame upstream of the DNA which codes for the cartilage and bone-inducing protein.
  • this can be done via oligonucleotide synthesis of the strand and counter strand with possibly additional restriction interfaces at the ends or via PCR techniques known in the art.
  • Some components of the extracellular matrix and / or the biocompatible carrier matrix such as e.g. Hydroxyapatite already knows a lot about the type of interaction with proteins; see. M.P. German, Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology 182, Academic Press, INC. P. 329 f). Based on such data, peptides can be created that are likely to have a high affinity for e.g. Have hydroxyapatite.
  • the osteoclasts bind the peptides with RGD sequences via receptors, thereby inhibiting the osteoclastic absorption of bone matrix.
  • Such peptides are, for example, echistatin, kistrin, GRGDSPK or GRGDSP; see. van der Pluijm G. et al. , J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 1021-1028; King, KL et al. , J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 381-387; Horton, MA et al. , J. Bone Miner. Res.
  • peptides can be attached directly or via a spacer to the N-terminus of a cartilage and / or bone-inducing protein of the TGF-ß superfamily.
  • a peptide as attachment group B is of particular interest if the cartilage and / or bone-inducing factors are used locally on a biocompatible carrier matrix.
  • Carrier materials often have collagen or hydroxyapatite as a component.
  • the compound according to the invention preferably remains on the support material, does not diffuse far and thus fixes the compound at the site of action. This can be of particular advantage when the support materials are not very porous.
  • An example of the application would be the better fixation of a prosthesis in the bone structure.
  • the prosthesis at the transition point to the bone is first coated with hydroxylapatite and subsequently with the compound according to the invention, the attachment group of which has an affinity for hydroxylapatite, or simultaneously with both.
  • a peptide as an attachment group B is also of particular interest in bone transplantations and tooth implants, it being possible to coat the surface of bones and / or teeth with the compound according to the invention in order to accelerate and improve the local fixation of the natural or artificial implants.
  • the two bone parts to be connected can be roughened before the connection according to the invention is applied.
  • the present invention furthermore relates to a nucleic acid which comprises at least one nucleic acid sequence coding for the compound according to the invention which contains an attachment group according to the first embodiment, it being possible for the nucleic acid sequence to be degenerate in accordance with the genetic code.
  • the compound according to the invention can be modified by post-translational reactions in vivo or by chemical and / or enzymatic methods known in the art in vitro.
  • the nucleic acid comprises the DNA sequence shown in FIG. 2.
  • the present invention furthermore relates to a vector which contains the above-defined nucleic acid according to the invention for expressing the compound according to the invention in prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • the vector according to the invention can preferably contain suitable regulatory elements, such as promoters, enhancers, termination sequences.
  • the vector according to the invention can, for example, be an expression vector or a vector for preferably stable integration of the nucleic acid according to the invention into the genetic material of a host cell.
  • a suitable expression system is, for example, the baculovirus system, the E. coli expression system, or expression vectors for mammalian cells such as e.g. vectors based on vaccinia, adeno, SV40 or retroviruses.
  • a suitable in vitro test system is described, for example, in Yamaguchi et al. J. Cell Biol. 113 (1991) 681-687 and / or in Hock, JM et al. Endocrinol. 126 (1990) 421-426, and a suitable in vivo test system, for example in Satnpath, TK et al. , J. Biol. Chem. 267 (1992) 20352-20362.
  • Suitable host cells are, for example, prokaryotes such as E. coli or Bacillus, a fungus such as yeast, or eukaryotic host cells such as plant cells, for example tobacco or Arabidopsis, mammalian cells, for example HuTK, NIH3T3, L, Mo, COS, Heia -, CHO cell lines, or insect cells, for example Spodoptera frugiperida (SF9) or Trichoplusia ni (TN368).
  • prokaryotes such as E. coli or Bacillus
  • a fungus such as yeast
  • eukaryotic host cells such as plant cells, for example tobacco or Arabidopsis
  • mammalian cells for example HuTK, NIH3T3, L, Mo, COS, Heia -, CHO cell lines
  • insect cells for example Spodoptera frugiperida (SF9) or Trichoplusia ni (TN368).
  • SF9 Spodoptera frugiperid
  • the nucleic acid according to the invention is either stably integrated in the genetic material of the host cell or the vector according to the invention contains suitable regulatory regions for replication, transcription and / or translation in vivo and / or in vitro, i.e. also in the cell-free system.
  • Another subject of the invention is a process for the preparation of the compound of the invention which contains an attachment group according to the first embodiment, comprising the steps:
  • (c) Isolation of the compound from the host cells or the culture medium. Expressed members of the TGF- ⁇ super family are cleaned using conventional methods.
  • the proteins can be in the form of inclusion bodies, as is the case, for example, with MP52. These inclusion bodies are renatured according to methods known per se in order to obtain the protein, for example MP52, in an active form.
  • MP52 expressed in E. coli can be folded back into an active protein see: Krieglstein K. et al. , J. Neuroscience Res. 42 (1995) 724-732. Further investigations have shown that, for example, BMP-2 can also be expressed in E. coli and folded into a dimer.
  • attachment group means a diphosphonic acid which contains at least one group which is capable of coupling to A or X, preferably a terminal group, or is a salt thereof.
  • Appendix Group B has the following formula:
  • radical R consists, for example, of groups as described in the patents WO 9506052 A, WO 9324499 A, WO 9324497 A, WO 9211269 A, WO 9211268 A, WO 9211267 A, WO 9203451 A, WO 9110646 A, WO 9015806 A, WO 9012017 A, WO 8909775 A, WO 8703598 A, US 5412141 A, US 5338731 A, US 5196409 A, US 5039819 A, JP 05339280 A, JP 05032684 A, JP 63295595 A, JP 63066190 A, EP 600834 A, EPy600371 A , EP 620227 A, EP 576396 A, EP 548884 A, EP 521622 A, EP 498424 A, EP 491374 A, EP 464509 A, DE 4244422 A, DE 3917153 A, DE 3719513 A, DE 3540150 A,
  • diphosphonic acids such as alendronic acid, clodronic acid, pamidronic acid, etidronic acid, neridronic acid, risedronic acid, tiludronic acid, mildronic acid, aminohydroxy propylidene diphosphonic acid, YM 175 or BM-210995 and their salts.
  • diphosphonic acids such as alendronic acid, clodronic acid, pamidronic acid, etidronic acid, neridronic acid, risedronic acid, tiludronic acid, mildronic acid, aminohydroxy propylidene diphosphonic acid, YM 175 or BM-210995 and their salts.
  • guanidinoal kyl-1, 1-diphosphonic acids and heterocyclic iminobismethylene diphosphonic acids and their derivatives and salts see. : EP 600371 A; EP 620227 A; EP 546548 A.
  • the radical R consists of R1-C-R2, where R1 is a hydroxyl group, amino group, halogen group, carboxyl group, sulfhydryl group, guanidinium group or a hydrogen atom and R2 is an unsubstituted or substituted by Cl-20-alkyl and / or aryl radicals and / or carbohydrate radicals , linear, branched-chain, cyclic or heterocyclic, saturated or unsaturated Cl-20 hydrocarbon radical which contains at least one group which is capable of coupling to A or X, preferably a terminal group, or a salt thereof.
  • attachment group according to the second embodiment are derivatives of 1-hydroxy-1, 1-diphosphonic acids; see. e.g. : EP 0 494 844, WO 9400462 A, DE 4244423 A, DE4011777 A, and GB-A-2 248 061.
  • the diphosphonic acid contains at least one, preferably terminal reactive group capable of coupling to A or X, or is a salt thereof.
  • the group capable of coupling to A or X is a carboxyl group, an amino group, a sulfhydryl group, a hydroxyl group or a carbohydrate residue.
  • Another object of the present invention is a method for producing a compound according to the invention which contains an attachment group according to the second embodiment, either (i) the attachment group B being chemically coupled to A or (ii) the attachment group B being chemically coupled to the spacer X is coupled and / or the spacer X is chemically coupled to A.
  • Methods known in the prior art can be used to prepare Appendix B; see. eg EP 0 494 844 and GB 2 248 061.
  • An important aspect in the preparation of this group of appendixes is the subsequent linking of components A and B or X and B of the compound according to the invention.
  • a protein can be coupled to a chemical substance using various chemical reactions - cf. e.g. Glazer, A.N., DeLange, R.J., Sigman, D.S. (Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, Chemical modifications of proteins, Elsevier Biomedical press, 1975), S.S. Wong (Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, 1991) and Means and Feeney (Chemical modifications of proteins, history and applications, Bioconjugate Chem. 1, 1990).
  • Glazer A.N., DeLange, R.J., Sigman, D.S.
  • S.S. Wong Choemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, 1991
  • Means and Feeney Chemical modifications of proteins, history and applications, Bioconjugate Chem. 1, 1990.
  • the attachment group or the spacer contains an amino or a carboxyl group.
  • the formation of a stable covalent amide bond can be via certain coupling reagents such as e.g. N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethyl-carbodimide hydrochloride, N-hydroxysuccinimide or sulfo-N-hydroxysuccinimide can be mediated; see. e.g. Sheehan, J.C. and Ledis, S.L. (1973) J. Am. Chem. Soc. 95, 875.
  • certain coupling reagents such as e.g. N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethyl-carbodimide hydrochloride, N-hydroxysuccinimide or sulfo-N-hydroxysuccinimide can be mediated; see. e.g. Sheehan, J.C. and Ledis, S.L. (1973) J. Am. Chem. Soc. 95, 875.
  • BMP members and also the MP52 protein have an accumulation of basic amino acids (lysine and arginine) near the N-terminus. Both the free amino groups of the lysine residues and the N-terminus itself can be used for coupling the attachment group or the spacer. Depending on the type of TGF-ß superfamily member, there are additional amino groups of lysines on the surface of the proteins that are freely accessible for coupling. Nevertheless, it can be advantageous to use an attachment group with an additional carboxyl group as a reactive group in order to preferably couple the attachment groups. group via an amide bond at or near the N-terminus.
  • Another object of the invention is the preparation and use of a compound which contains two or more pendant groups, which may be different.
  • An example is a compound with a peptide which contains the RGD sequence at the N-terminus of the cartilage and / or bone inducing protein of the TGF- ⁇ superfamily and additionally several diphosphonic acids.
  • Another example would be a compound consisting of a peptide with affinity for hydroxylapatite at the N-terminus of the cartilage- and / or bone-inducing protein of the TGF- ⁇ superfamily and additionally several diphosphonic acids.
  • the attachment groups can be connected to the protein of the TGF- ⁇ superfamily via a covalent bond and / or a spacer. With such connections, affinities for cartilage and / or bone components and / or biocompatible carrier matrix can be additionally increased and, depending on the indication, combined with a reduction in bone resorption.
  • the compounds of the invention can be tested for their effectiveness in common test systems such as e.g. be tested on the animal model of the ovariectomized rat; see. : Wronski et al. Calcif. Tissue int. 37 (1985) 324-328; Durbridge et al. Calcif. Tissue int. 47 (1990) 383-387.
  • the present invention furthermore relates to a pharmaceutical composition which contains at least one compound according to the invention in a pharmaceutically active concentration and, if appropriate, pharmaceutically acceptable carriers, auxiliaries, diluents and / or fillers.
  • the compound according to the invention can be used for the prevention or systemic or local treatment of diseases affecting the cartilage and / or bones, for example osteoporosis, Paget's disease, osteodystrophia, osteoarthritis or Osteoarthropathy and damage to the cartilage or bone tissue caused by injury or overload are used in vertebrates, especially mammals such as humans.
  • diseases affecting the cartilage and / or bones for example osteoporosis, Paget's disease, osteodystrophia, osteoarthritis or Osteoarthropathy and damage to the cartilage or bone tissue caused by injury or overload are used in vertebrates, especially mammals such as humans.
  • the compound according to the invention can be injected, e.g. Subcutaneously, venously or intramuscularly, non-orally, orally or by any other pharmaceutically common method. With local application, binding to a carrier matrix defined above and / or application directly to the bone or cartilage is possible.
  • the dose is in the range from 0.1 to 1000 ⁇ g / kg body weight, depending on the type of application, the clinical picture and the patient's condition.
  • FIG. 1 shows the complete amino acid sequence of the precursor protein of the human TGF- ⁇ protein MP52.
  • the beginning of the mature protein is preferably in the range of amino acids 361-400, particularly preferably amino acid 381 or 382.
  • the mature protein portion contains the seven conserved cysteines at positions 400, 429, 433, 465, 466, 498 and 500.
  • FIG. 2 shows the nucleic acid sequence coding for the protein shown in FIG. 1.
  • the ATG start codon for the precursor protein begins with nucleotide 640.
  • the mature protein preferably begins with nucleotide 1780 or nucleotide 1783.
  • the stop codon begins with nucleotide 2143.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of the fusion protein MP52mFusl, which contains the sequence of the mature MP52 and an additional peptide to increase the affinity for hydroxylapatite at the N-terminus.
  • FIG. 4 shows the nucleic acid sequence coding for the MP52mFusl fusion protein shown in FIG.
  • FIG. 5 shows the amino acid sequence of the MP52mFus2 fusion protein, which contains the sequence of the mature MP52, a spacer and an additional peptide to increase the affinity for hydroxylapatite at the N-terminus.
  • FIG. 6 shows the nucleic acid sequence coding for the MP52mFus2 fusion protein shown in FIG.
  • FIG. 7 shows a silver-colored gel with MP52m, MP52mFusl and MP52mFus2 expressed, then cleaned and refolded in the prokaryotic system.
  • FIG. 8 shows a chromatogram for the different affinity of dimeric MP52m and dimeric MP52mFusl for hydroxylapatite.
  • FIG. 9 shows a histological section through an uncoated matrix, 1 day after implantation.
  • FIG. 10 shows a histological section through a matrix coated with fluorescence-labeled MP52m, 1 day after implantation.
  • FIG. 11 shows a histological section through a matrix coated with fluorescence-labeled MP52mFusl, 1 day after implantation.
  • FIG. 12 shows an RP-HPLC chromatogram of EDC / bisphosphonate-modified MP52m.
  • Figure 13 shows an RP-HPLC chromatogram of MP52m.
  • Figure 8 Chromatogram of the elution of dimeric MP52m and dimeric MP52mFusl from a hydroxylapatite column using a potassium phosphate gradient (0.01 to 0.30 M PJ.
  • Figure 9 Photograph of the negative control with 40- (9a) and 100- (9b) magnification. No fluorescence activity can be seen.
  • Figure 10 Photograph of the MP52m coated matrix at 40- (10a) and 100- (10b) times magnification. No fluorescence activity can be seen.
  • Figure 11 Photograph of the MP52mFusl coated matrix with 40- (Ila) and 100- (Ilb) magnification. In the area of the macropores, the arrows show an edge fluorescence which corresponds to the adherent fluorochrome-coated proteins.
  • Figure 12 Chromatogram of RP-HPLC of EDC / bisphosphonate - modified MP52m.
  • Figure 13 Chromatogram of the RP-HPLC of untreated MP52m.
  • diseases associated with bone loss such as e.g. is caused by age, metabolic disorders or inflammatory
  • CORRECTED SHEET (RULE 91) ISA / EP Processes that are treated specifically.
  • One example is osteoporosis, in which there is insufficient new bone formation.
  • Diseases such as osteodystrophia fibrosa generalisata, which is accompanied by irregular bone loss, or Paget's disease, which is associated with the dissolution of normal bone substance, or else osteoarthritis or osteoarthropathy can be treated with the compounds according to the invention.
  • the compounds according to the invention are also suitable as preventive measures.
  • Targeted local treatments are also possible in the case of damage to the cartilage and / or bone tissue such as, for example, bone fractures or sports injuries, particularly after the musculoskeletal system has been overloaded or after accidents.
  • connections according to the invention also enable the fixation of two movable bone parts by their connection, such as the connection of two vertebrae via a newly formed bone bridge, which can be advantageous, for example, in the case of intervertebral disc problems.
  • the connection also offers advantages for large carrier matrices such as those required for artificial limb elongation or in plastic surgery.
  • the compounds according to the invention are also advantageous in dentistry, for example in jaw treatments and periodontal pants.
  • An advantage of the compounds according to the invention is the possibility of specifically fixing locally applied cartilage or bone-inducing factors at their destination and reducing diffusion into adjacent tissue. This advantageously results in a significant reduction in the required doses. Furthermore, release of the compound according to the invention from an implanted carrier matrix defined above can be slowed down or prevented.
  • the following shows an example of how additional amino acids can be attached to the N-terminus of the mature MP52.
  • pairs of oligonucleotides which code for the desired amino acids are synthesized and cloned into the MP52 sequence after hybridization while observing the reading frame.
  • the cloning took place in the plasmid pBP2MP52m, which was deposited on June 2, 1995 with the DSM (accession number: DSM 10029).
  • This plasmid can be used for the expression of monomeric mature MP52 protein (amino acids 382 to 501 in FIG. 1) with methionine (MP52m) in E.coli.
  • a more detailed description of the plasmid can be found in the patent PCT / EP96 / 03065.
  • the plasmid pBP2MP52m was first restricted with Nde I (restriction site at the N-terminus within the start codon) and Msc I (internal MP52 restriction site).
  • Nde I restriction site at the N-terminus within the start codon
  • Msc I internal MP52 restriction site
  • CCAGCGGCGCATGCGGACCGCGTTTACGCTGTTTCTTCA were (at one Final concentration of 0.1 nmol for each oligonucleotide per 1 H 2 O) hybridized by heating to 70 ° C. and slowly cooling to room temperature, so that the corresponding double-stranded DNA molecules with ends overhanging on one side of the Nde I interface are formed:
  • the hybridized oligonucleotide pairs were ligated into the restricted plasmid described above according to standard methods known to the person skilled in the art. Clonings are detailed and can be reworked by a person skilled in the art, for example described in the Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Wiley & Sons, 1987-1996) or in Molecular Cloning (Sambrook et al., Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). It was confirmed by sequencing that the two new plasmids pBP2MP52mFusl and pBP2MP52mFus2 contain the sequences shown in FIGS. 4 and 6 for the fusion constructs.
  • the corresponding amino acid sequences of the fusion proteins are shown in FIGS. 3 and 5.
  • the fusion proteins MP52mFusl and MP52mFus2 contain the portion of the mature MP52 (amino acid 382 to 501 in FIG. 1) and the additional amino acids KKARKR and KKQRKRGPH at the N-terminus.
  • MP52mFus2 differs from MP52mFusl in that it has an additional spacer (GPH) between the mature MP52 and the peptide KKZRKR with theoretically expected increased affinity for hydroxylapatite, Z being an A in the case of MP52mFusl and a Q in the case of MP52mFus2.
  • This method can be used to attach any peptides to the N-terminus. For example, in the course of the experiments through the use of the oligonucleotide pair TATGGGTCGTGGCGATAGCGCTAGCGCGCCGCTGG and
  • CCAGCGGCGCGCTAGCGCTATCGCCACGACCCA expresses a fusion protein which, in addition to the mature MP52 sequence (amino acid 382 to 501 in FIG. 1), contains the peptide GRGDSAS at the N-terminus and thus an RGD sequence.
  • the expression, purification and refolding to dimeric active fusion proteins can in principle be carried out according to the same methods as already described for mature MP52 proteins (see patent application PCT / EP96 / 03065 and Japanese patent application Hei- 7 (95) -93664)).
  • the expression was carried out by providing the T7 RNA polymerase in special bacterial strains which have integrated the gene for T7 RNA polymerase. Using the bacterial strain HMS174 (DE3) (Novagen) and BL21 (DE3) pLysS (Novagen) it was possible to overexpress MP52m and the fusion proteins by inducing the T7 RNA polymerase with IPTG according to the manufacturer's instructions.
  • the proteins are all present in the bacteria as inclusion bodies, from which they can be isolated using standard methods.
  • the bacterial cells were first centrifuged off and the cells were then lysed.
  • the lysis was carried out by first resuspending the bacterial sediment in lysis buffer (250 mM NaCl, 0.5% NP40, 20 mM Tris pH 8.0, 1 mM DTT). After four to five freezes and thaws, an ultrasound treatment, which lowers the viscosity, was connected.
  • lysis buffer 250 mM NaCl, 0.5% NP40, 20 mM Tris pH 8.0, 1 mM DTT.
  • an ultrasound treatment which lowers the viscosity
  • the lysis can also be achieved purely mechanically or enzymatically using buffers containing lysozyme.
  • the inclusion bodies were then obtained by centrifugation (10 min, 10-20 ° C, 12000 xg).
  • the degree of purity can be increased somewhat by washing the inclusion bodies repeatedly with lysis buffer, tris buffer (20 mM pH 8) with or without 0.5 M guanidinium hydrochloride or 1 M urea.
  • the inclusion bodies were further purified using a sucrose gradient.
  • the in lysis buffer the inclusion body located on approximately the same volume of a sucrose solution (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 40% sucrose) and centrifuged (30 min, 4 ° C, 12000 xg). The sediments with the inclusion bodies were then washed extensively in Tris buffer (20 mM, pH 8) with ultrasound treatment.
  • the inclusion bodies were resuspended in a guanidinium hydrochloride solution (6M guanidinium hydrochloride, 100 mM NaH 2 PO "adjusted to pH 8) (50 mg wet sediment / ml) and after addition of DTT to a final concentration of 100 mM for 2.5 Incubated for hours at room temperature. Insoluble components were separated by centrifugation (20 min, 15000 xg) and filtration (0.45 ⁇ m filter, Nalgene # 190-2545). The dissolved MP52m and fusion proteins were further purified using a reversed phase HPLC. A reversed phase column (Nucleosil 300-7C4 from Macherey-Nagel, Art.
  • MP52m or MP52mFusl and MP52mFus2 show an apparent molecular weight of approx. 14 kD (theoretical molecular weight: 13.7 kD) or approx. 15 kD (theoretical molecular weight: 14.5 kD or 14, respectively) in SDS-polyacrylamide gels (15%). 8 kD) as shown in FIG. 7 after silver staining.
  • the monomeric proteins expressed in E. coli and purified from inclusion bodies have to be folded back into dimeric proteins. This can be done according to the methods already described for the MP52m protein.
  • the solubilization was preferably carried out over 2 hours at room temperature in solubilization buffer (6 M guanidinium hydrochloride, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 3 mM DTT pH 8.0) to a final concentration of 2.6 mg protein per ml Solubilizate was then made into renaturation buffer (1 M NaCl / 50 mM Tris / 5 mM EDTA / 33 mM CHAPS / 1 mM
  • the fusion proteins such as the mature MP52m protein were placed on a column (Aquapore Octyl, 20 ⁇ m, 100 x 10 mm, Applied Biosystems) at 35% buffer B (buffer A: 0.1% TFA in water; buffer B: 90 % Acetonitrile, 0.1% TFA) at a flow rate of 3 ml / min.
  • buffer B buffer A: 0.1% TFA in water
  • buffer B 90 % Acetonitrile, 0.1% TFA
  • the dimeric MP52 proteins elute before the monomeric proteins. Fractions with dimeric protein were combined, lyophilized and stored at -70 ° C.
  • the dimeric MP52m runs at approximately 22 kD (theoretical molecular weight: 27.4 kD) and MP52mFusl or MP52mFus2 at approximately 23 or 24 kD (theoretical molecular weight: 28.9 kD or 29.6 kD) for a molecular weight marker (see Figure 7).
  • the additional amino acids at the N-terminus show no significant influence on the refolding efficiency in the experiments.
  • alkaline phosphatase (ALP) activity By determining the alkaline phosphatase (ALP) activity on R0B-C26 cells, as disclosed, for example, in WO 95/04819, it was shown that the dimeric fusion proteins are active despite the changed N-terminus, the activity being slightly reduced compared to MP52m .
  • the proteins were applied to a column filled with hydroxyapatite and eluted in a potassium phosphate gradient. Proteins with higher affinity for hydroxyapatite should only elute at higher potassium phosphate concentrations.
  • the column (Econo Pac-HTP cartridge, 5 ml, BioRad) was initially in buffer A (6th M urea, 0.01 M potassium phosphate pH 7.0). 100 ⁇ g of each protein were dissolved in 2.25 ml of buffer A and 2 ml were applied to the column.
  • the protein labels were carried out using the FluoReporter Kit # F 6153 Oregon Green 488, (Molecular Probes / MoBiTec GmbH, Göttingen).
  • osprovit hydroxylapatite ceramic, Ch.-B. 91 009, Feldmühle AG
  • osprovit hydroxylapatite ceramic, Ch.-B. 91 009, Feldmühle AG
  • 5 ⁇ g MP52m or MP52mFusl in 50% (v / v) acetonitrile / PBS were added to each and mixed carefully.
  • the frozen samples (-80 ° C) were then dried under sterile conditions using vacuum centrifugation.
  • the samples were rehydrated with 20 ⁇ l PBS immediately before the implantation and implanted with variation of the implantation location according to the protocol.
  • the muscle pockets were closed with silk 4x0 with single button seams.
  • the final skin suture was made with Seralon 4x0. Explantation took place after the animals were killed on the 1st postoperative day.
  • the histological specimens were produced using the thin-section technique.
  • the preparations were fixed in 70% ethanol.
  • the drainage took place in ascending order
  • MP52m samples after 1 day, no fluorescence activity can be detected either on the surface or in the macropores of the interconnecting hydroxylapatite ceramic granules.
  • the enlargement of the section shows homogeneous tissue and minor cracks due to artifacts in the area of the pores, but no evidence of marginal fluorescence activity.
  • MP52mFusl samples After one day there is marginal fluorescence in the area of the macropores, which corresponds to the adherent fluorochrome-coated proteins. Pores in the central area are occasionally fluorescence-marked, while peripheral pores and the entire surface no longer have any fluorescence.
  • FIG. 12 shows the chromatogram of the RP-HPLC of MP52 after modification with EDC / bisphosphonate.
  • the comparison with unmodified MP52m shows that the modification of the signal of the relatively hydrophobic MP52m dimer has disappeared and signals appear in the hydrophilic region, as is to be expected for bisphosphonate-labeled MP52m.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität, die eine hohe Affinität zur extrazellulären Matrix und/oder zu zellulären Bestandteilen von Knorpel und/oder Knochen von Wirbeltieren und/oder zu einer biokompatiblen Trägermatrix für Gelenk- oder Knochenimplantate, oder Knochenklebstoffe, aufweisen. Die neuen Verbindungen könnnen, abhängig von der Indikation, durch gleichzeitige Hemmung der Knochenresorption in ihrer Wirkung verstärkt werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung dieser Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende pharmakologische Zusammensetzungen, die zur Behandlung und Prävention von Erkrankungen, die den Knorpel und/oder Knochen betreffen, wie z.B. Osteoporose, sowie zur Behandlung und Prävention von Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewebes verwendet werden können.

Description

1 -
Zielgerichtete Verbindungen mit knorpel- und/oder knochenindu¬ zierender Aktivität
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität, die eine hohe Affinität zur extrazellulären Matrix und/oder zu zellulären Bestandteilen von Knorpel und/oder Knochen von Wirbeltieren und/oder zu einer biokompatiblen Trägermatrix für Gelenk- oder Knochenimplantate, oder Knochenklebstoffe, aufweisen. Die neuen Verbindungen können, abhängig von der Indikation, durch gleichzeitige Hemmung der Knochenresorption in ihrer Wirkung verstärkt werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die Her¬ stellung dieser Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende pharmakologische Zusammensetzungen, die zur Behandlung und Prävention von Erkrankungen, die den Knorpel- und/oder Knochen betreffen, wie z.B. Osteoporose, sowie zur Behandlung und Prävention von Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewe¬ bes verwendet werden können.
Viele Wachstumsfaktoren aus der TGF-ß-Superfamilie sind für einen weiten Bereich medizinischer Behandlungsmethoden und Anwendungen, die insbesondere Wundheilung und Gewebewiederher¬ stellung betreffen, relevant. Für einen Überblick über Mit¬ glieder der TGF-ß-Superfamilie vgl. z.B. : Roberts, A.B. & Sporn, M.B. Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990) 419-472; Kingsley , D.M., Genes & Development 8 (1994) 133-146 und die darin zitierte Literatur. Zu den Mitgliedern zählen die TGF-ß Proteine, wie das TGF-ßl, TGF-ß2, TGF-ß3, TGF-ß4 und TGF-ß5, vgl. z.B. : U.S. Patent 5,284,763; EP 0376785; U.S. Patent 4,886,747; Madisen, L. et al . , DNA 7 (1988) 1-8; Derynck, R. et al. , EMBO J. 7 (1988) 3737-3743; Jakowlew, S.B. et al., Mol. Endo. 2 (1988) 1186-1195; Kondaiah, P. et al . , J. Biol. Chem. 265 (1990) 1089-1093. Eine weitere Unterfamilie bilden die Activine/Inhibine mit den bislang bekannten Aktivin- ketten ßA, ßB, ßC und ßD, vgl. : Mason, A.J. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 135 (1986) 957-964; Hotten, G. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (1995) 608-613; Oda, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 210 (1995) 581-588. Von ßA und ßB ist bekannt, daß sie neben dem Homodimer auch ein Heterodimer ßAßB bilden können. Bei Kombination mit einer a- Untereinheit entstehen die Inhibine, die im wesentlichen entgegengesetzte Aktivitäten in Vergleich zu Aktivinen auf¬ weisen, vgl. : Vale, W. et al., Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990) 211-248; Vale, W. et al. , The Physiology of Reproduction, Raven Press, New York (1994) 1861-1878. Eine weitere Unterfamilie bilden die Mitglieder der BMP (Bone Morphogenetic Protein)- Familie, wozu die Proteine BMP-2 (BMP-2a) , BMP-3, BMP-4 (BMP-2b) , BMP5, BMP-6, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (OP-2) , BMP-9, BMP-10, BMP-11 zählen, vgl. z.B. : Wozney, J.M. et al. Science 242 (1988) 1528-1534; Celeste, A.J. et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 9843-9847; Özkaynak, E. et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 25220-25227; WO 93/00432; WO 94/26893; WO 94/26892. Eine weiter Untergruppe ist die GDF (Growth Differentiation Factor) -Familie, zu denen GDF-1, GDF-3, GDF-9 sowie die für die Knorpel- und/oder Knocheninduktion insbesondere interessanten GDF-5, GDF-6 und GDF-7 zählen; vgl. : McPherron,A.C. & Lee, S.-J., J. Biol. Chem. 268 (1993) 3444-3449; Storm, E.E. et al. , Nature 368 (1994) 639-643; Lee, S.-J.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 4250-4254. Für die TGF-ß Superfamilienmitglieder dpp und 60A aus Drosophila konnte auch ein knorpel- und knocheninduzierendes Potential nach¬ gewiesen werden, vgl. : Sampath, T.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) 6004-6008. Interessant sind auch die Proteine dorsalin und das Bone Formation-Inducing Protein, vgl. : Basler, K. et al . , Cell 73 (1993) 687-702; WO 94/01557. Beschrieben sind auch Heterodimere von verschiedenen Mit¬ gliedern, vgl. z.B. : Aono, A. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 210 (1995) 670-677; WO 93/09229; EP 0 626 451. Bekannt ist, daß viele Mitglieder, insbesondere aus den Unterfamilien der TGF-ß-, BMP- und GDF-Familien ein knorpel- und/oder knocheninduzierendes Potential aufweisen, wobei aber auch Mitglieder der Aktivinfamilie, zumindest in Kombination mit weiteren TGF-ß-Superfamilienmitgliedern, Einfluß auf die Knochenbildung nehmen können; vgl. beispielsweise Hock, J.M. et al., Endocrinol. 126 (1990) 421-426; Wang et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 2220-2224; Wozney et al., Mol. Reprod. Dev. 32 (1992) 160-167; Sampath et al. , J. Biol. Chem. 267 (1992) 20352-20362; Ogawa, Y. et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 14233-14237; WO 88/00205; US-PS 5,013,649; WO 89/10409: WO 90/11366; WO 91/05802; WO 92/15323; WO 91/18098; WO 93/00432; WO 93/09229; WO 94/01557; WO 94/26893; WO 94/26892; WO 94/15949; WO 95/01801; WO 95/01802 und EP 0 626 451.
In WO 93/16099 und WO 95/04819 werden die DNA- und Proteinse¬ quenzen von weiteren TGF-ß ähnlichen Proteinen, insbesondere von MP52, beschrieben, die nicht aus Knochen isoliert wurden. Bei MP121 handelt es sich um das bereits beschriebene Activin ßC. Insbesondere von Interesse ist MP52, für das u.a. ein knorpel- und knocheninduzierendes Potential nachgewiesen werden konnte. Das humane MP52 hat in seinem reifen Anteil nur eine Aminosäure Unterschied im Vergleich zu dem aus Mäusen isolier¬ ten GDF-5.
Die Mitglieder der TGF-ß Superfamilie, die ein knorpel- und/oder knocheninduzierendes Potential besitzen, zeichnen sich im reifen Anteil durch hohe Aminosäurehomologien aus und besitzen die für TGF-ß Superfamilienmitglieder typischen sieben konservierten Cysteine. Mitglieder dieser Superfamilie liegen in ihrer aktiven Form normalerweise alle als homo- und/oder heterodimere Proteine vor. Trotzdem zeigen sie Variationen wie z.B. das Auftreten in unterschiedlichen Gewebestufen und Entwicklungsstufen. Häufig zeigen einzelne dieser Wachstums¬ faktoren neben ihrem knorpel- und/oder knocheninduzierenden Potential noch weitere Funktionen, was ihre Anwendung bei verschiedenen medizinischen Indikationen ermöglicht . Gleichzei¬ tig bedeutet dies bei nicht lokaler Anwendung, wie z.B. systemischer Applikation von hohen Dosen, aber auch die Gefahr von Nebenwirkungen. Chemische Substanzen wie die Diphosphonsäuren bzw. Diphospho- nate bzw. Bisphosphonate oder deren Salze können sich im Knochen von lebenden Organismen anreichern. Untersuchungen haben gezeigt, daß typische Diphosphonsäuren nach intravenöser Applikation sehr schnell aus dem Blutkreislauf entfernt und zu einem hohen Prozentsatz in Knochengewebe angereichert werden; vgl. beispielsweise Lin, J.H. et al. (1991) Drug Metab. Dispos. 19, 926-932.
Bekannt geworden sind die Diphosphonsäuren vor allem durch ihren Einfluß auf den Knochenstoffwechsel . So kann krankhaft gesteigerter Knochenabbau durch Hemmung der Osteoklastentätig- keit vermindert werden; vgl. beispielsweise Van Gelder, J.M. et al. (1995) Bone 16, 511-520, und Ott, S.M. (1993) J. Bone. Miner. Res. 8 Suppl . 2, S597-606. Dies verbessert zwar die negative Bilanz bei Krankheiten im Knochenstoffwechsel wie z.B. der Osteoporose, jedoch konnte für Diphosphonsäuren ein eher inhibierenden Einfluß auf menschliche Osteoblasten, die für den Knochenaufbau verantwortlich sind, gezeigt werden; vgl. Khokher, M.A. & Dandona, P. (1989) Metabolism 38, 184-187.
Hemmung der Knochenresorption kann auch erreicht werden durch Proteine, die eine Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) enthal¬ ten. Peptide mit einer RGD Sequenz binden an Oberflächen-- Rezeptoren einiger Zellen und verhindern damit deren Bindung an extrazelluläre Matrix. Proteine mit RGD Sequenzen, wie z.B. das Echistatin oder Kistrin sind in der Lage, die Adhäsion von Osteoclasten an die Knochenmatrix und damit deren Resorption zu hemmen; vgl. z.B. : van der Pluijm G. et al. , J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 1021-1028; King, K.L. et al . , J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 381-387; Horton, M.A. et al . , J. Bone Miner. Res. 8 (1993) , 239-247; Sato, M. et al. , J. Cell Biol. 111 (1990) 1713-1723; Fisher et al. (1993) , Endocrinology 132, 1411-1413.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen bereitzustellen, die hohe knorpel- und/oder knocheninduzierende Aktivitäten aufweisen sollen, und die gleichzeitig eine hohe Affinität zur extrazellulären Matrix und/oder zellulären Bestandteilen von Knorpel und/oder Knochen von Wirbeltieren und/oder zu einer biokompatiblen Trägermatrix zeigen sollen. Dadurch sollen die Verbindungen insbesondere im Knochengewebe mit dem Ziel einer gesteigerten Knochensynthese angereichert werden, um die Behandlung oder Prävention von Erkrankungen, die den Knorpel- und/oder Knochen betreffen und die insbesondere mit einem Verlust an Knochensubstanz ein¬ hergehen oder Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewebes sowie die Fixierung bzw. Stabilisierung von Implantaten zu verbessern. Ferner sollen neue Verbindungen bereitgestellt werden, die neben einer knorpel- und/oder knocheninduzierenden Aktivität gleichzeitig eine Verringerung des Knochenabbaus durch Hemmung der Osteoklasten bewirken.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst. Insbesondere wird eine Verbindung bereitgestellt, die folgende allgemeine Formel umfaßt:
A X„ B-,
wobei A ein Protein der TGF-ß-Superfamilie mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität oder ein Fragment davon bedeutet, B ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Anhang¬ gruppen mit n=l-20 und mit einer Affinität zur extrazellulären Matrix und/oder zellulären Bestandteilen des Knorpels und/oder Knochens und/oder zu einer biokompatiblen Trägermatrix bedeu¬ tet. B kann, abhängig von der Indikation, gleichzeitig die Knochenresorption hemmen. X bedeutet eine oder mehrere kova- lente Bindungen oder einen oder mehrere Abstandshalter mit m=l-20, die gleich oder unterschiedlich sein können. X bleibt im Körper vorzugsweise stabil, kann für einige Anwendungen aber auch, vorzugsweise am Wirkort, beispielsweise hydrolytisch abgespalten werden, so daß A und B freigesetzt werden, n kann gleich oder verschieden von m sein.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Der Begriff "Protein der TGF-ß-Superfamilie mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität" bedeutet ein Protein, das im reifen Anteil die charakteristischen konservierten 7 Cysteine enthält. Dazu zählen Mitglieder der TGF-ß-, der Activin-, der BMP- und der GDF- Familie und insbesondere MP52 sowie Fragmente davon mit grundsätzlich derselben Aktivität. Umfaßt sind bevorzugt Homodimere der genannten Proteine aber auch Heterodimere aus verschiedenen Familienmitgliedern. Bevorzugt umfaßt sind Proteine, die denselben Rezeptormecha¬ nismus und/oder dieselbe Signalübertragung wie die Mitglieder der BMP- und/oder GDF-Familie, insbesondere von MP52 besitzen. Das knorpel- und/oder knocheninduzierende Potential kann in bekannten Versuchen wie z.B. in vivo durch Induktion von Knorpel und/oder Knochen nach Implantation des Proteins mit einer geeigneten Trägermatrix in die Rattenmuskulatur; vgl. z.B. Sampath, T.K. et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 20352-20362 und/oder in vitro durch Induktion von Alkalischer Phosphatase Aktivität auf ROB-C26 Zellen; vgl. Yamaguchi, A. et al., J. Cell Biol. 113 (1991) 681-687 und/oder W-20-17 Zellen; vgl.: Thies, R.S, et al. Endocrinol. 130 (1992) 1318-1324 und/oder Stimulation der Expression von Proteinen der extrazel¬ lulären Matrix, vgl.: Hock, J.M. et al . Endocrinol. 126 (1990) 421-426 und/oder in Versuchen wie sie bei Chen, P. et al. , Exp. Cell Res. 195 (1991) 509-515 und/oder Vukicevic, S., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 8793-8797 beschrieben sind, überprüft werden. Das Protein kann als reifes Protein aber auch als Vorlaufer-Protein oder Protein mit verschiedenen Prozessierungen im Propeptidanteil und/oder mit N- und/oder C-terminalen Aminosäuresequenzen, welche die biologische Aktivität im wesentlichen nicht beeinflussen, vorliegen. Das Protein kann substituierte oder eingefügte Aminosäuren enthal¬ ten oder deletiert sein, ebenfalls unter der Voraussetzung, daß die Aktivität nicht wesentlich beeinflußt wird, und aus verschiedenen Spezies, wie z.B. Mensch, Maus, Ratte, Rind oder Schwein isoliert sein. Ferner kann das Protein durch im Stand der Technik bekannte Methoden, beispielsweise Glykosylierungen,
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 9η ISA/EP Phosphatierungen, Sulfatierungen und Veresterung mit Fetten modifiziert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist A ein Protein aus der GDF- oder BMP-Familie oder ein Fragment davon.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Protein A das MP52-Protein mit der in Fig. 1 gezeigten Primärsequenz oder ein Fragment davon. Insbesondere umfaßt diese Ausführungsform das reife MP52 oder funktionelle Anteile bzw. Fragmente davon, wobei die aktive Form vorzugs¬ weise als Dimer vorliegt. Besonders bevorzugt sind funktionelle Teilbereiche bzw. Abschnitte bzw. Fragmente, die mindestens den Bereich der sieben konservierten Cysteine enthalten.
Der Begriff "Fragment" bedeutet einen Teil des Proteins A, der im wesentlichen auch eine knorpel- und/oder knocheninduzierende Aktivität aufweist.
Der Begriff "Abstandshalter" bedeutet eine Verbindung mit mindestens zwei reaktiven bzw. funktionellen, zur Bindung an A und B befähigte Gruppen, wobei diese Gruppen gleich oder unterschiedlich sein können. Bevorzugt sind Verbindungen mit unterschiedlichen reaktiven Gruppen. Die reaktiven Gruppen können innerhalb oder an den Enden des Abstandshalters X lokalisiert sein. Die reaktive Gruppe kann eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Sulfhydryl- gruppe sein.
Der Abstandshalter kann z.B. ein Oligopeptid sein. Der Ab¬ standshalter kann eine substituierte oder unsubstituierte Kette mit vorzugsweise 1 - 100 Atomen bzw. Kettenatomen, insbesondere Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Stickstoff- und/oder Schwefel-Atome sein. Der Abstandshalter umfaßt auch mehrere derartige Ketten, die über Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Stickstoff- und/oder Schwefel-Atome verbrückt sind. Die Substituenten können z.B.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Alkyl-, und/oder cyclische oder heterocyclische Gruppen wie z.B. Kohlenhydrate sein. Bei¬ spiele, die aber nicht begrenzend sein sollen, sind nachfolgend aufgeführt, wobei n 1 - 50 und AS eine beliebige Aminosäure bedeutet :
OH SH OH SH
<-CH2-)n; (-CH2-CH2)n; (-CH2-CH2)n; (-CH2-CH2-CH2-) n; (-CH2-CH2-CH2-) n;
(-CH2-CH2-0-)2; (-CH2-CH2-CH2-0-)n(-CH2-CH2-S-)n; (-CH2-CH2-CH2-S-)n;
OH OH OH SH i I ( I
(-CH2-CH2-0-)n; (-CH2-CH2-CH2-0-)n; (-CH2-CH2-CH2-S-)n; (-CH2-CH2-S-)n;
(CH2
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Vorzugsweise verleiht der Abstandshalter der erfindungsgemäßen Verbindung eine hydrophile Eigenschaft.
Der Begriff "Anhanggruppe" bedeutet in einer ersten erfindungs- gemäßen Ausführungsform ein Peptid mit einer insbesondere unter physiologischen Bedingungen ausreichenden Affinität für spezifische Bestandteile der extrazellulären Matrix und/oder zellulärer Bestandteile von Knorpel oder Knochen und/oder einer biokompatiblen Trägermatrix, um daran gebunden zu werden. Davon umfaßt sind auch Peptide, die eine RGD Sequenz enthalten. Der Begriff umfaßt weiterhin polyklonale oder monoklonale Antikör¬ per oder spezifische Fragmente davon. Die Seitenketten des Peptids können durch im Stand der Technik bekannte Methoden, wie vorstehend aufgeführt, modifiziert sein. Insbesondere können Zuckerreste über N- oder O-glykosidische Bindungen zur Hydrophilisierung des Peptids eingeführt werden. Der Begriff "extrazelluläre Matrix" umfaßt Bestandteile von Knorpeln und Knochen außerhalb von Zellen, insbesondere die verschiedenen Kollagentypen z.B. Kollagen I, II , V, IX, X, XI und XIII, weiterhin Hydroxylapatit, Proteoglycane und Gly- cosaminoglykane wie beispielsweise Chondroitinsulfat, Biglykan, Decorin und/oder Hyaluronsäure, weiterhin Proteine wie z.B. Osteopontin, Sialoprotein, Osteonectin, Osteocalcin, Laminin, Fibronectin, Vitronectin, Thrombospondin, CMP (Cartilage Matrix Protein) und Dentin Phosphoprotein.
Der Begriff "zelluläre Bestandteile im Knorpel und/oder Knochen" betrifft lebende Zellen im Knorpel und/oder Knochen wie beispielsweise Chondroblasten, Chondrocyten, Chondrokla- sten, Osteoblasten, Osteocyten, Osteoklasten und Odontoblasten.
Der Begriff "biokompatible Trägermatrix" umfaßt insbesondere Gelenk- oder Knochenimplantate. Matrices können aus Materialien bestehen, die bereits für Implantationen in der Allgemein- und Zahnmedizin eingesetzt werden. Bestandteile von Trägermatrices sind z.B. Hydroxylapatit, Calciumsulfate, Calciumcarbonate, Tricalciumphosphate, Poly-Milchsäure bzw. deren Derivate (z.B. Poly [D,L- (lactide-co-glycolide) ] und/oder Bestandteile der extrazellulären Matrix. Dazu zählen auch die verschiedenen Kollagentypen, wie sie z.B. aus Knochen und/oder aus der Haut isoliert werden können. Umfaßt ist auch von Korallen gebildetes Material wie z.B. Biocoral (erhältlich von Innoteb, Frank¬ reich) . Als Trägermatrices verwendbar sind auch keramische und/oder metallische und/oder glashaltige Werkstoffe, wie z.B. gesintertes Hydroxylapatit oder Titan. Die Trägermatrices können auch aus Kunststoff bestehen, darunter sind auch Knochenklebstoffe wie Polymethylacrylate umfaßt. Die Trägerma¬ trices können sich aus mehreren Bestandteilen zusammensetzen, so z.B. Hydroxylapatit kombiniert mit Kollagen (z.B. Healos, erhältlich von Orquest Inc., CA, USA) . Die erfindungsgemäße Verbindung muß eine Affinität zu einem oder mehreren Bestand¬ teilen der Trägermatrix haben. Die erfindungsgemäße Verbindung kann dabei in der gesamten Trägermatrix verteilt sein oder lokal auf eine Oberfläche appliziert werden wie z.B. bei der Verankerung von Prothesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Anhanggruppe B ein Peptid und mit seinen C-Terminus über eine Amidbindung, vorzugsweise eine Peptidbindung, am N-Terminus von A gebunden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Anhanggruppe B ein Peptid und der Abstands¬ halter X ist ein Oligopeptid, wobei das Peptid mit seinem C-Terminus über eine Amidbindung, vorzugsweise eine Peptidbin¬ dung, am N-Terminus des Oligopeptids gebunden ist und das Oligopeptid mit seinem C-Terminus über eine Amidbindung, vorzugsweise eine Peptidbindung, am N-Terminus von A gebunden ist.
Die erfindungsgemäße Verbindung, die eine Anhanggruppe gemäß der ersten Ausführungsform enthält, kann am N- und/oder C-Terminus flankierende Aminosäuresequenzen, wie Signalpeptide, Propeptide oder Fragmente davon umfassen, welche beispielsweise die erfindungsgemäße Verbindung durch enzymatische Abspaltung des Propeptids oder Fragmenten davon in ihre biologisch aktive bzw. native bzw. reife Form überführt.
Das Peptid als Anhanggruppe B gemäß erster Ausführungsform oder das Oligopeptid als Abstandshalter X wird vorzugsweise am N-Terminus des Proteins A gekoppelt. Es ist bereits bekannt, daß Unterschiede oder Modifikationen an den reifen Proteinen wie z.B. unterschiedliche N-Termini die Aktivität der reifen Proteine nicht wesentlich verändern. Genannt sei in diesem Zusammenhang das Protein HisMP52, das trotz zusätzlicher Aminosäuren am N-Terminus aktiv ist, vgl. : Krieglstein K. et al . , J. Neuroscience Res. 42 (1995) 724-732. Bei der prakti¬ schen Durchführung kann die DNA, die für das Peptid und/oder das Oligopeptid kodiert, der DNA, die für das Protein kodiert, vorangestellt werden. Dies kann mit den Standardmethoden der PCR (Polymerase-Kettenreaktion) und den rekombinanten Klonie- rungstechniken durchgeführt werden. Wichtig dabei ist, daß der Leserahmen eingehalten wird. Die Expression und Reinigung der so erhaltenen Fusionsproteine erfolgt nach im Stand der Technik bekannten Methoden.
Bei diesem Herstellungsverfahren ist es vorteilhaft, daß das Peptid und/oder das Oligopeptid definiert am N-Terminus des Proteins hängen. Ankoppeln größerer Anhanggruppen wie Peptide an die Oberfläche, d.h. bestimmten Seitenketten, der Proteine können unter Umständen deren Bindeverhalten an Rezeptoren und/oder deren Aktivität stark beeinflussen.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um Peptide, die eine Affinität zu knorpel- und/oder knochenspezifischen Strukturen besitzen, zu erhalten. Bei solchen knorpel- und/oder knochen¬ spezifischen Strukturen kann es sich z.B. um Proteine wie verschiedene Kollagen-Typen, Osteopontin oder Osteonectin handeln. Man kann diese spezifischen Strukturen nun als Antigen zur Generierung von monoklonalen Antikörpern einsetzen. Sobald eine Hybridomzellinie, die den gewünschten monoklonalen Antikörper mit einer einzigen Spezifität gegen das Antigen exprimiert, isoliert ist, können aus dieser die RNA isoliert werden. Nach Umschreiben der RNA in eine cDNA, wird diese in eine PCR eingesetzt, die die Amplifikation der variablen, antigenbindenden Regionen des Antikörpers erlaubt. Die so isolierte DNA kann durch künstlich an den Enden der PCR-Fragmente eingeführten Restriktionsschnittstellen vor die DNA, die für den entsprechenden knorpel- und/oder knochenindu¬ zierenden Faktor kodiert, kloniert werden. Dabei muß die Beibehaltung des Leserahmens der antigenbindenden Domäne und des Proteins beachtet werden. Alternativ zu monoklonalen Antikörpern ist es auch möglich, Phagen-Antikörper zu generie¬ ren. Ein solches System (Recombinant Phage Antibody-System) ist im Handel, beispielsweise bei Pharmacia, erhältlich. Die Selektion von Peptiden mit den gewünschten Bindungsaffini¬ täten kann vorzugsweise mit Peptid-Banken erfolgen, die im Handel, beispielsweise bei MoBiTec, erhältlich sind. Bei solchen Systemen werden randomisierte Peptide an den N-Terminus eines filamentösen Phagenproteins (z.B. pIII Genprodukt) fusioniert. Die randomisierten Peptide haben typischerweise eine Größe von 6, 8 oder 15 Aminosäuren. Zur Erzielung von hohen spezifischen Affinitäten oder Erkennung von Sekundär¬ strukturen kann es aber von Vorteil sein, randomisierte Peptide bis zu einer Länge von 90 Aminosäuren einzusetzen. Das Fusions- protein wird an der Oberfläche gut zugänglich für mögliche Bindungspartner präsentiert. Durch mehrmalige Affinitäts¬ reinigung und Amplifikation lassen sich Phagen anreichern, die Peptide mit einer Affinität zu den immobilisierten knorpel- und/oder knochenspezifischen Bestandteilen und/oder biokom¬ patiblen Trägermatrixbestandteilen aufweisen. Die DNA einzelner Phagen kann isoliert werden und der Bereich, der für das randomisierte Peptid kodiert, sequenziert werden. Diese DNA kann dann wiederum unter Beibehaltung des Leserahmens strom¬ aufwärts von der DNA, die für das knorpel- und knocheninduzie¬ rende Protein kodiert, kloniert werden. Dies kann je nach Größe des Peptides über eine Oligonukleotidsynthese des Strangs und Gegenstrangs mit eventuell zusätzlichen Restriktionsschnitt¬ stellen an den Enden oder über im Stand der Technik bekannte PCR-Techniken erfolgen.
Von einigen Bestandteilen der extrazellulären Matrix und/oder der biokompatiblen Trägermatrix wie z.B. dem Hydroxylapatit ist bereits einiges bekannt über die Art der Wechselwirkung mit Proteinen; vgl. M.P. Deutscher, Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology 182, Academic Press, INC. S. 329 f) . Aufgrund solcher Daten lassen sich Peptide erstellen, die voraussichtlich eine hohe Affinität zu z.B. Hydroxylapatit aufweisen.
Bekannt sind außerdem bereits Wechselwirkungen von zellulären Bestandteilen mit Peptiden. So verfügen z.B. die Osteoklasten über Rezeptoren die Peptide mit RGD Sequenzen binden, wodurch die osteoklastische Resorption von Knochenmatrix inhibiert wird. Solche Peptide sind z.B. das Echistatin, Kistrin, GRGDSPK oder GRGDSP ; vgl. van der Pluijm G. et al. , J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 1021-1028; King, K.L. et al . , J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 381-387; Horton, M.A. et al. , J. Bone Miner. Res. 8 (1993), 239-247; Gronowicz, G.A.& Derome, M.E., J. Bone Miner. Res. 9 (1994) 193-201. Diese Peptide können direkt oder über einen Abstandshalter an den N-Terminus eines knorpel- und/oder knochen-induzierenden Proteines der TGF-ß-Superfamilie gehängt werden.
Ein Peptid als Anhanggruppe B ist insbesondere dann von Interesse, wenn die knorpel- und/oder knocheninduzierenden Faktoren lokal auf einer biokompatiblen Trägermatrix verwendet werden. So haben Trägermaterialien häufig Kollagen oder Hydroxylapatit als Bestandteil. Somit kann durch Anhängen eines Peptides mit Affinität zu Kollagen und/oder Hydroxylapatit erreicht werden, daß die erfindungsgemäße Verbindung bevorzugt auf dem Trägermaterial verbleibt, nicht weit diffundiert und damit die Verbindung am Wirkort fixiert. Dies kann besonders bei wenig porösen Trägermaterialien von Vorteil sein. Ein Beispiel für die Anwendung wäre die bessere Fixierung einer Prothese im Knochengerüst. Dafür wird die Prothese an der Übergangsstelle zum Knochen zunächst mit Hydroxylapatit und nachfolgend mit der erfindungsgemäßen Verbindung, dessen Anhanggruppe eine Affinität zu Hydroxylapatit aufweist, oder gleichzeitig mit beiden beschichtet.
Ein Peptid als Anhanggruppe B ist auch von besonderem Interesse bei Knochentransplantationen und Zahnimplantaten, wobei die Oberfläche von Knochen und/oder Zähnen mit der erfindungs¬ mäßigen Verbindung bestrichen werden kann, um die lokale Fixierung der natürlichen oder auch künstlichen Implantate zu beschleunigen und zu verbessern. Die beiden zu verbindenden Knochenteile können vor der Applikation der erfindungsmäßigen Verbindung aufgerauht werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die mindestens eine für die erfindungsgemäße Verbindung, die eine Anhanggruppe gemäß der ersten Ausführungs- form enthält, kodierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, wobei die Nukleinsäuresequenz entsprechend dem genetischen Code degene¬ riert sein kann. Die erfindungsgemäße Verbindung kann durch post-translationale Reaktionen in vivo oder durch im Stand der Technik bekannte chemische und/oder enzymatische Methoden in vitro modifiziert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Nukleinsäure die in Fig. 2 gezeigte DNA-Sequenz.
Die Begriffe "Nukleinsäure" und Nukleinsäuresequenz" bedeuten natürliche oder halbsynthetische oder synthetische oder modifizierte Nukleinsäuremoleküle aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der die vorstehend definierte, erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Expression der erfindungsgemäßen Verbindung in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen enthält. Der erfindungsgemäße Vektor kann vorzugsweise geeignete regulato¬ rische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminationssequen- zen, enthalten. Der erfindungsgemäße Vektor kann beispielsweise ein Expressionsvektor oder ein Vektor zur vorzugsweise stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das gene¬ tische Material einer Wirtszelle sein. Ein geeignetes Ex¬ pressionssystem ist beispielsweise das Bakulovirus-System, das E. coli-Expressionssystem, bzw. Expressionsvektoren für Säugerzellen wie z.B. auf Vaccinia- , Adeno- , SV40- oder auf Retroviren basierende Vektoren.
Es ist leicht feststellbar, welcher minimaler Nukleinsäure-- Anteil erforderlich ist, um ein exprimiertes Protein zu erhalten, das knorpel- und/oder knocheninduzierende Aktivität besitzt. Ein geeignetes in vitro Testsystem ist z.B. in Yamaguchi et al. J. Cell Biol. 113 (1991) 681-687 und/oder in Hock, J.M. et al. Endocrinol. 126 (1990) 421-426, und ein geeignetes in vivo Testsystem z.B. in Satnpath, T.K. et al . , J. Biol. Chem. 267 (1992) 20352-20362, beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor enthält. Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise Prokaryonten, wie E. coli oder Bacillus, ein Pilz wie Hefe, oder eukaryotische Wirtszellen wie Pflanzenzel¬ len, beispielsweise Tabak oder Arabidopsis, Säugerzellen, beispielsweise HuTK-, NIH3T3-, L- , Mo-, COS-, Heia-, CHO-Zell- linien, oder Insektenzellen, beispielsweise Spodoptera frugi- perda (SF9) oder Trichoplusia ni (TN368) . Unter Ausnutzung von Insektenviren können Mitglieder der TGF-ß-Superfamilie auch in Insektenlarven zur Expression gebracht werden; vgl. beispiels¬ weise Ishida et al. (1994) J. Biochem. 115, 279-285. Für eine ausreichende Expressionsrate ist die erfindungsgemäße Nu¬ kleinsäure entweder im genetischen Material der Wirtszelle stabil integriert oder der erfindungsgemäße Vektor enthält geeignete regulatorische Bereiche zur Replikation, Trans¬ kription und/oder Translation in vivo und/oder in vitro, d.h. auch im zellfreien System.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung, die eine Anhang¬ gruppe gemäß der ersten Ausführungsform enthält, umfassend die Schritte :
(a) Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirts¬ zellen mit der vorstehend definierten Nukleinsäure oder dem vorstehend definierten Vektor,
(b) Züchten der transformierten Wirtszellen unter für die Expression der Verbindung geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium, und
(c) Isolierung der Verbindung aus den Wirtszellen oder dem Kulturmedium. Die Reinigung von exprimierten Mitgliedern der TGF-ß-Superfami¬ lie erfolgt nach herkömmlichen Methoden. Bei der Herstellung in Bakterien können die Proteine in Form von Einschlußkörpern ("inclusion bodies") vorliegen, wie es z.B. bei MP52 der Fall ist . Diese Einschlußkörper werden nach an sich bekannten Methoden renaturiert, um das Protein, beispielsweise MP52, in einer aktiven Form zu erhalten. In E.coli exprimiertes MP52 kann zu einem aktiven Protein zurückgefalten werden vgl.: Krieglstein K. et al. , J. Neuroscience Res. 42 (1995) 724-732. Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß z.B. BMP-2 ebenfalls in E. coli exprimiert und zum Dimer gefaltet werden kann.
Der Begriff "Anhanggruppe" bedeutet in einer zweiten erfin¬ dungsgemäßen Ausführungsform eine Diphosphonsäure, die minde¬ stens eine zur Kopplung an A oder X befähigte, vorzugsweise endständige Gruppe enthält oder ein Salz davon ist. Insbeson¬ dere hat die Anhanggruppe B die folgende Formel:
R- (P03H2)2
worin der Rest R beispielsweise aus Gruppen besteht, wie sie in den Patenten WO 9506052 A, WO 9324499 A, WO 9324497 A, WO 9211269 A, WO 9211268 A, WO 9211267 A, WO 9203451 A, WO 9110646 A, WO 9015806 A, WO 9012017 A, WO 8909775 A, WO 8703598 A, US 5412141 A, US 5338731 A, US 5196409 A, US 5039819 A, JP 05339280 A, JP 05032684 A, JP 63295595 A, JP 63066190 A, EP 600834 A, EPy600371 A, EP 620227 A, EP 576396 A, EP 548884 A, EP 521622 A, EP 498424 A, EP 491374 A, EP 464509 A, DE 4244422 A, DE 3917153 A, DE 3719513 A, DE 3540150 A, EP 416689 A, EP 354806 A, EP 304962 A, EP 304961 A, EP 252504 A, EP 282320 A, EP 207557 A, EP 197478 A, EP 189662 A, EP 170228 A, AU 8551534 A und EP 546548 A beschrieben werden und auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Umfaßt sind auch Diphosphonsäuren wie z.B. Alendronsäure, Clodronsäure, Pamidronsäure, Etidron- säure, Neridronsäure, Risedronsäure, Tiludronsäure, Mildronsäu¬ re, Aminohydroxy-Propyliden-Diphosphonsäure, YM 175 oder BM-210995 und deren Salze. Insbesondere sind auch Guanidinoal- kyl-1, 1-diphosphonsäuren und heterocyclische Iminobismethy- len-Diphosphonsäuren und deren Derivate und Salze umfaßt; vgl. : EP 600371 A; EP 620227 A; EP 546548 A.
Insbesondere besteht der Rest R aus R1-C-R2 wobei Rl eine Hydroxylgruppe, Aminogruppe, Halogengruppe, Carboxylgruppe, Sulfhydrylgruppe, Guanidiniumgruppe oder ein Wasserstoffatom bedeutet und R2 einen unsubstituierten oder durch Cl-20-Alkyl- und/oder Arylreste und/oder Kohlenhydratreste substituierten, linearen, verzweigtkettigen, cyclischen oder heterocyclischen, gesättigten oder ungesättigten Cl-20-Kohlenwasserstoffrest bedeutet, der mindestens eine zur Kopplung an A oder X befähig¬ te, vorzugsweise endständige Gruppe enthält, oder ein Salz davon.
Spezifische Bespiele der Anhanggruppe gemäß zweiter Ausfüh¬ rungsform sind Derivate der 1-Hydroxy-1, 1-diphosphonsäuren; vgl. z.B. : EP 0 494 844, WO 9400462 A, DE 4244423 A, DE4011777 A, und GB-A-2 248 061.
In allen Fällen gilt, daß die Diphosphonsäure mindestens eine zur Kopplung an A oder X befähigte, vorzugsweise endständige reaktive Gruppe enthält oder ein Salz davon ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zur Kopplung an A oder X befähigte Gruppe eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Sulfhydrylgruppe, eine Hydroxylgruppe oder ein Kohlenhy- dratrest.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung, die eine Anhanggruppe gemäß zweiter Ausführungsform enthält, wobei entweder (i) die Anhanggruppe B chemisch an A gekoppelt wird oder (ii) die Anhanggruppe B chemisch an den Abstands¬ halter X gekoppelt wird und/oder der Abstandshalter X chemisch an A gekoppelt wird. Zur Herstellung der Anhanggruppe B können im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden; vgl. z.B. EP 0 494 844 und GB 2 248 061. Ein wichtiger Gesichtspunkt bei der Herstellung dieser Anhanggruppe ist die nachfolgende Verknüpfung der Bestandteile A und B oder X und B der erfindungsgemäßen Verbindung.
Die Kopplung eines Proteins an eine chemische Substanz kann unter Ausnutzung verschiedener chemischer Reaktionen erfolgen,- vgl. beispielsweise Glazer, A.N., DeLange, R.J., Sigman, D.S. (Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, Chemical modifications of proteins, Elsevier Biomedical press, 1975) , S.S. Wong (Chemistry of protein conjugation and cross- linking, CRC Press, 1991) und Means and Feeney (Chemical modifications of proteins, history and applications, Bioconju- gate Chem. 1, 1990) . Von besonderem Interesse ist die Kopplung der Anhanggruppe oder des Abstandshalters über eine Amidbindung an das Protein der erfindungsgemäßen Verbindung. Dafür ist es notwendig, daß die Anhanggruppe oder der Abstandshalter eine Amino- oder eine Carboxylgruppe enthält. Die Bildung einer stabilen kovalenten Amidbindung kann über bestimmte Kopplungs- reagenzien wie z.B. N- (3-Dimethylaminopropyl) -N' -ethyl-carbo- diimid-hydrochlorid, N-Hydroxysuccin-imide oder Sulfo-N-Hydro- xy-succinimide vermittelt werden; vgl. beispielsweise Sheehan, J.C. and Ledis, S.L. (1973) J. Am. Chem. Soc. 95, 875.
Viele BMP-Mitglieder und auch das MP52-Protein verfügen über eine Anhäufung von basischen Aminosäuren (Lysin und Arginin) in der Nähe des N-Terminus. Sowohl die freien Aminogruppen der Lysinreste als auch der N-Terminus selbst können für eine Kopplung der Anhanggruppe oder des Abstandshalters genutzt werden. Auf der Oberfläche der Proteine gibt es in Abhängigkeit von der Art des TGF-ß Superfamilienmitgliedes aber noch zusätzliche Aminogruppen von Lysinen, die für eine Kopplung frei zugänglich sind. Trotzdem kann es von Vorteil sein, eine Anhanggruppe mit einer zusätzlichen Carboxylgruppe als reaktive Gruppe zu verwenden, um eine vorzugsweise Kopplung der Anhang- gruppe über eine Amidbindung an bzw. in der Nähe des N-Terminus zu bewirken.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung und Verwendung einer Verbindung, bei der zwei oder mehr Anhang¬ gruppen, die verschieden seien können, enthalten sind. Ein Beispiel ist eine Verbindung mit einem Peptid, das die RGD Sequenz am N-Terminus des knorpel- und/oder knocheninduzieren¬ den Proteins der TGF-ß-Superfamilie und zusätzlich mehreren Diphosphonsäuren enthält. Ein weiteres Beispiel wäre eine Verbindung bestehend auε einem Peptid mit Affinität zu Hydro¬ xylapatit am N-Terminus des knorpel- und/oder knocheninduzie¬ renden Proteins der TGF-ß Superfamilie und zusätzlich mehreren Diphosphonsäuren. Die Anhanggruppen können dabei über eine kovalente Bindung und/oder einen Abstandshalter mit dem Protein der TGF-ß-Superfamilie verbunden sein. Mit derartigen Ver¬ bindungen lassen sich Affinitäten zu Knorpel- und/oder Knochen¬ bestandteilen und/oder biokompatiblen Trägermatrix zusätzlich verstärken und in Abhängigkeit von der Indikation mit einer Reduktion der Knochenresorption kombinieren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf ihre Wirksamkeit in gängigen Testsystemen wie z.B. dem Tiermodell der ovariekto- mierten Ratte getestet werden; vgl. : Wronski et al. Calcif. Tissue Int. 37 (1985) 324-328; Durbridge et al. Calcif. Tissue Int. 47 (1990) 383-387.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine erfin¬ dungsgemäße Verbindung in einer pharmazeutisch wirksamen Konzentration und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Träger-, Hilfs-, Verdünnungs- und/oder Füllstoffe enthält.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann zur Vorbeugung oder systemischen oder lokalen Behandlung von Erkrankungen die den Knorpel- und/oder Knochen betreffen, beispielsweise Osteoporo- se, Paget'sche Krankheit, Osteodystrophia, Osteoarthritis oder Osteoarthropathie und von Schädigungen des Knorpel- oder Knochengewebes verursacht durch Verletzung oder Überbelastung, bei Wirbeltieren, insbesondere Säugern wie Menschen, verwendet werden.
Zur Behandlung von Knorpel- und/oder Knochenerkrankungen oder Defekten kann die erfindungsgemäße Verbindung bei systemischer Applikation injiziert, z.B. subcutan, venös oder intramusculär, nicht-oral, oral oder durch jegliche andere pharmazeutisch übliche Methode bereitgestellt werden. Bei lokaler Applikation ist die Bindung an eine vorstehend definierte Trägermatrix und/oder Applikation direkt auf dem Knochen oder Knorpel möglich. Die Dosis liegt je nach Art der Proteinkomponente und der Anhanggruppe in Abhängigkeit von der Applikationsart, dem Krankheitsbild und dem Zustand des Patienten im Bereich von 0,1 bis 1000 μg/kg Körpergewicht.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des Vorläufer¬ proteins des humanen TGF-ß-Proteins MP52. Der Beginn des reifen Proteins liegt vorzugsweise im Bereich der Aminosäuren 361-400, besonders bevorzugt bei Aminosäure 381 oder 382. Der reife Proteinanteil enthält die sieben konservierten Cysteine an den Positionen 400, 429, 433, 465, 466, 498 und 500.
Figur 2 zeigt die für das in Fig. 1 gezeigte Protein kodierende Nukleinsäuresequenz. Das ATG-Startcodon für das Vorläufer¬ protein beginnt mit Nukleotid 640. Das reife Protein beginnt bevorzugt mit Nukleotid 1780 oder Nukleotid 1783. Das Stopp- codon beginnt mit Nukleotid 2143.
Figur 3 zeigt die Aminosäuresequenz des Fusionsproteines MP52mFusl, das die Sequenz des reifen MP52 und ein zusätzliches Peptid zur Erhöhung der Affinität zu Hydroxylapatit am N-Termi¬ nus enthält. Figur 4 zeigt die für das in Figur 3 gezeigte Fusionsprotein MP52mFusl kodierende Nukleinsäuresequenz.
Figur 5 zeigt die Aminosäuresequenz des Fusionsproteines MP52mFus2, das die Sequenz des reifen MP52, einen Abstands¬ halter und ein zusätzliches Peptid zur Erhöhung der Affinität zu Hydroxylapatit am N-Terminus enthält.
Figur 6 zeigt die für das in Figur 5 gezeigte Fusionsprotein MP52mFus2 kodierende Nukleinsäuresequenz.
Figur 7 zeigt ein silbergefärbtes Gel mit im prokaryontischen System exprimierten, anschliessend gereinigtem und rückgefalte- nem MP52m, MP52mFusl und MP52mFus2.
Figur 8 zeigt ein Chromatogramm zur unterschiedlichen Affinität von dimerem MP52m und dimerem MP52mFusl zu Hydroxylapatit.
Figur 9 zeigt einen histologischen Schnitt durch eine unbe¬ schichtete Matrix, 1 Tag nach Implantation.
Figur 10 zeigt einen histologischen Schnitt durch eine mit fluoreszenzmarkiertem MP52m beschichtete Matrix, 1 Tag nach Implantation.
Figur 11 zeigt einen histologischen Schnitt durch eine mit fluoreszenzmarkiertem MP52mFusl beschichtete Matrix, 1 Tag nach Implantation.
Figur 12 zeigt ein RP-HPLC Chromatogramm von EDC/Bisphos- phonat-modifiziertem MP52m.
Figur 13 zeigt ein RP-HPLC- Chromatogramm von MP52m.
Detaillierte Beschreibung der Figuren:
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Figur 7 : Fotografie eines silbergefärbten 15%igen Polyacryl- amidgels mit je 100 ng MP52m (Spur 1 und 4) , 100 ng MP52mFusl (Spur 2 und 5) und 100 ng MP52mFus2 (Spur 3 und 6) zurückgefaltenes und gereinigtes Protein unter reduzierenden (100 mM DTT, Spur 1 bis 3) und nicht reduzierenden (Spur 4 bis 6) Bedingungen. In Spur 7 befindet sich ein Molekulargewichtsmarker, Novagen #69149-1) .
Figur 8: Chromatogramm über die Elution von dimeren MP52m und dimeren MP52mFusl von einer Hydroxylapatit-Säule mittels eines Kaliumphosphatgradienten (0,01 bis 0,30 M PJ .
Figur 9: Photographie der Negativkontrolle mit 40- (9a) und 100- (9b) -facher Vergrößerung. Es ist keine Fluoreszenzaktivität erkennbar.
Figur 10: Photographie der mit MP52m beschichteten Matrix mit 40- (10a) und 100- (10b) -facher Vergrößerung. Es ist keine Fluoreszenzaktivität erkennbar.
Figur 11: Photographie der mit MP52mFusl beschichteten Matrix mit 40- (Ila) und 100- (Ilb) -facher Vergrößerung. Die Pfeile zeigen im Bereich der Makroporen eine rand¬ ständige Fluoreszenz, die den adhärenten fluoro- chrombeschichteten Proteinen entspricht.
Figur 12: Chromatogramm der RP-HPLC von EDC/Bisphosphonat-- modifiziertem MP52m.
Figur 13: Chromatogramm der RP-HPLC von unbehandeltem MP52m.
Mit den erfindungsgemäßen Verbindungen können Erkrankungen, die mit einem Knochenverlust einherσehen, wie er z.B. bedingt ist durch Alter, StoffWechselerkrankungen oder entzündliche
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Prozesse, gezielt behandelt werden. Ein Beispiel ist die Osteoporose, bei der eine unzureichende Neubildung von Knochen- substanz erfolgt. Erkrankungen wie die Osteodystrophia fibrosa generalisata, die mit einem regellosem Knochenabbau einhergeht oder die Paget'sche Krankheit, die mit der Auflösung der normalen Knochensubstanz verbunden ist, oder auch Osteoarthri- tis oder Osteoarthropathie können mit den erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt werden. Geeignet sind die erfindungs¬ gemäßen Verbindungen auch als vorbeugende Maßnahmen. Gezielte lokale Behandlungen sind auch bei Schädigungen des Knorpel- und/oder Knochengewebes wie z.B. Knochenfrakturen oder Sport¬ verletzungen insbesondere nach Überbelastung des Bewegungs- apparates oder nach Unfällen möglich. Die erfindungsgemäßen Verbindungen ermöglichen auch die Fixierung zweier beweglicher Knochenteile durch deren Verbindung wie z.B. die Verbindung zweier Rückenwirbel über eine neu gebildete Knochenbrücke wie es z.B. bei Bandscheibenproblemen von Vorteil sein kann. Vorteile bietet die Verbindung auch bei großen Trägermatrices wie sie z.B. bei der künstlichen Verlängerung von Gliedmaßen oder in der plastischen Chirugie benötigt werden. Vorteilhaft sind die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in der Zahnmedizin bei z.B. Kieferbehandlungen und Paradonthose.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Möglich¬ keit, lokal applizierte knorpel- oder knocheninduzierende Faktoren an ihrem Zielort gezielt zu fixieren und eine Diffu¬ sion in benachbartes Gewebe zu vermindern. Dies hat vorteilhaf¬ terweise eine deutliche Reduzierung der erforderlichen Dosen zur Folge. Ferner kann eine Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung aus einem implantierten vorstehend definierten Trägermatrix verlangsamt oder verhindert werden.
Mit dem dieser Erfindung zugrundeliegenden synergistischen Effekt durch Kombination von zwei Wirkungsmechanismen in einer Verbindung, d.h. pharmazeutische Wirkung und deutlich erhöhte Affinität zum Wirkort, können deutlich bessere Ergebnisse bei Behandlungen erreicht werden. Zusätzlich ist nun gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, daß ein knocheninduzierender Faktor, der eine Aktivierung der Osteoblasten (Zellen, die verantwortlich für den Knochenaufbau sind) verursacht, gleich¬ zeitig mit einem Faktor, der die Hemmung von Osteoklasten (Zellen, die verantwortlich für den Knochenabbau sind) bewirkt, eingesetzt werden kann. Dies hat eine Erzeugung neuer Knochen¬ matrix zur Folge, was die negative Bilanz bei Krankheiten des Knochenstoffwechsels deutlich in einen positiven Bereich überführen kann. So können Krankheiten, die den Knochenstoff¬ wechsel, insbesondere den Verlust an Knochensubstanz betreffen, wie z.B. die Osteoporose, wesentlich wirkungsvoller behandelt werden.
Beispiel 1:
Herstellung von reifen MP52 mit zusätzlichen Peptiden am
N-Terminus
Im folgenden wird beispielhaft gezeigt, wie zusätzliche Aminosäuren an den N-Terminus des reifen MP52 gehängt werden können. Dazu werden Oligonukleotidpärchen, die für die ge¬ wünschten Aminosäuren kodieren, synthetisiert und nach Hybri¬ disierung unter Einhaltung des Leserahmens in die MP52 Sequenz kloniert. Die Klonierung erfolgte in das Plasmid pBP2MP52m, das am 2. Juni 1995 bei der DSM (Hinterlegungsnummer: DSM 10029) hinterlegt wurde. Dieses Plasmid kann für die Expression von monomerem reifem MP52 Protein (Aminosäure 382 bis 501 in Figur 1) mit vorangestellten Methionin (MP52m) in E.coli verwendet werden. Eine nähere Beschreibung des Plasmides befindet sich in dem Patent PCT/EP96/03065. Zur Herstellung der Fusionsproteine wurde das Plasmid pBP2MP52m zunächst mit Nde I (Restriktions- schnittstelle am N-Terminus innerhalb des Startcodons) und Msc I (interne MP52 Restriktionsschnittstelle) restringiert. Die Oligonukleotidpärchen
TAT G AAGAAAG C G C G TAAA C G C G C G C C G C T G G u n d
CCAGCGGCGCGCGTTTACGCGCTTTCTTCA sowie
TATGAAGAAACAGCGTAAACGCGGTCCGCATGCGCCGCTGG und
CCAGCGGCGCATGCGGACCGCGTTTACGCTGTTTCTTCA wurden (bei einer Endkonzentration von 0,1 nmol für jedes Oligonukleotid pro 1 H20) durch Erhitzen auf 70°C und langsames Abkühlen auf Raumtemperatur hybridisiert, so daß die entsprechenden doppel¬ strängigen DNA-Moleküle mit an einer Seite überhängenden Enden der Nde I Schnittstelle entstehen:
TATGAAGAAAGCGCGTAAACGCGCGCCGCTGG ACTTCTTTCGCGCATTTGCGCGCGGCGACC
und
TATGAAGAAACAGCGTAAACGCGGTCCGCATGCGCCGCTGG ACTTCTTTGTCGCATTTGCGCCAGGCGTACGCGGCGACC
Die hybridisierten Oligonukleotidpärchen wurden nach dem Fachmann bekannten Standardmethoden in das oben beschriebene restringierte Plasmid ligiert . Klonierungen sind ausführlich und für den Fachmann nacharbeitbar z.B. beschrieben in den Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Wiley & Sons, 1987-1996) oder in Molecular Cloning (Sambrook et al. , second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) . Durch Sequenzierung wurde bestätigt, dass die beiden neuen Plasmide pBP2MP52mFusl und pBP2MP52mFus2 die in Figur 4 und 6 gezeigten Sequenzen für die Fusionskonstrukte enthalten. Die entsprechen¬ den Aminosäuresequenzen der Fusionsproteine sind in Figur 3 und 5 gezeigt. Die Fusionsproteine MP52mFusl und MP52mFus2 enthal¬ ten den Anteil des reifen MP52 (Aminosäure 382 bis 501 in Figur 1) sowie die zusätzlichen Aminosäuren KKARKR bzw. KKQRKRGPH am N-Terminus. MP52mFus2 unterscheidet sich von MP52mFusl also durch einen zusätzlichen Abstandshalter (GPH) zwischen dem reifen MP52 und dem Peptid KKZRKR mit theoretisch zu erwarten¬ der erhöhter Affinität zu Hydroxylapatit, wobei Z im Falle von MP52mFusl ein A und im Falle von MP52mFus2 ein Q bedeutet. Diese Methode kann verwendet werden, um beliebige Peptide an den N-Terminus zu hängen. So wurde z.B. im Verlauf der Versuche durch die Verwendung des Oligonukleotidpärchens TATGGGTCGTGGCGATAGCGCTAGCGCGCCGCTGG und
CCAGCGGCGCGCTAGCGCTATCGCCACGACCCA ein Fusionsprotein expri- miert, das zusätzlich zur reifen MP52 Sequenz (Aminosäure 382 bis 501 in Figur 1) das Peptid GRGDSAS am N-Terminus und damit eine RGD-Sequenz enthält.
Die Expression, Reinigung und Rückfaltung zu dimeren aktiven Fusionsproteinen kann prinzipiell nach den gleichen Methoden erfolgen wie bereits für reife MP52-Proteine beschrieben (siehe Patentanmeldung PCT/EP96/03065 und japanische Patentanmeldung Hei- 7 (95) -93664) ) . Die Expression erfolgte durch Bereit¬ stellung der T7-RNA Polymerase in speziellen Bakterienstämmen, die das Gen für T7 RNA Polymerase integriert haben. Unter Verwendung des Bakterienstammes HMS174(DE3) (Novagen) sowie BL21 (DE3) pLysS (Novagen) konnten durch Induktion der T7 RNA Polymerase mit IPTG nach Herstellerangaben MP52m sowie die Fusionsproteine überexprimiert werden. Die Proteine liegen in den Bakterien alle als Einschlußkörper vor, aus denen sie mit Standardmethoden isoliert werden können.
Dazu wurden die Bakterienzellen zunächst abzentrifugiert und die Zellen anschließend lysiert. Die Lyse erfolgte, indem das Bakteriensediment zunächst in Lysepuffer (250 mM NaCl, 0,5% NP40, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM DTT) resuspendiert wurde. Nach vier- bis fünfmaligen Frieren und Tauen wurde noch eine Ultraschallbehandlung, die die Viskosität herabsetzt, ange¬ schlossen. Alternativ kann die Lyse auch rein mechanisch oder enzymatisch durch Lysozymhaltige Puffer erreicht werden. Die Einschlußkörper wurden dann durch Zentrifugation (10 min, 10-20°C, 12000 x g) gewonnen. Durch mehrmaliges Waschen der Einschlußkörper mit Lysepuffer, Trispuffer (20 mM pH 8) mit oder ohne 0.5 M Guanidiniumhydrochlorid bzw. 1 M Harnstoff kann der Reinheitsgrad etwas erhöht werden. Bei den vorliegenden Proteinen wurden die Einschlusskörper noch weiter über einen Saccharosegradienten gereinigt. Dazu wurden die in Lysepuffer befindlichen Einschlusskörper auf ungefähr das gleiche Volumen einer Saccharose Lösung (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 40% Saccharose) geschichtet und zentrifügiert (30 min, 4°C, 12000 x g) . Die Sedimente mit den Einschlusskörpern wurden anschliessend ausgiebig in Trispuffer (20 mM, pH 8) unter Ultraschallbehandlung gewaschen. Zur weiteren Aufreinigung wurden die Einschlusskörper in einer Guanidiniumhydrochlorid-- Lösung (6M Guanidiniumhydrochlorid, 100 mM NaH2PO„ auf pH 8 eingestellt) resuspendiert (50 mg Nasssediment/ml) und nach Zugabe von DTT auf eine Endkonzentration von 100 mM für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation (20 min, 15000 x g) und Filtration (0,45 μm Filter, Nalgene #190-2545) abgetrennt. Die gelösten MP52m- und Fusionsproteine wurden weiter über eine Reversed Phase HPLC gereinigt. Es wurde eine Reversed Phase Säule (Nucleosil 300-7C4 von Macherey-Nagel, Art. 715023) mit einer Flussrate von 2 ml/min und einem Puffer B Gradienten (Puffer A: 0,1% TFA; Puffer B: 90% Acetonitril, 0,1% TFA) von 0 bis 40% in 40 min verwendet. Die Hauptfraktionen mit den entsprechenden MP52m oder den Fusionsproteinen MP52mFusl und MP52mFus2 wurden vereinigt, lyophilisiert und bei -70°C aufbewahrt. MP52m bzw. MP52mFusl und MP52mFus2 zeigen in SDS-Polyacrylamid-Gelen (15%) ein apparentes Molekulargewicht von ca. 14 kD (theoretisches Molekulargewicht: 13.7 kD) bzw. ca. 15 kD (theoretisches Molekulargewicht: 14,5 kD bzw. 14,8 kD) wie es nach Silber¬ färbung in Figur 7 gezeigt ist.
Um biologisch aktives Material zu erhalten, müssen die in E.coli exprimierten und aus Einschlusskörpern aufgereinigten monomeren Proteine zu dimeren Proteinen zurückgefaltet werden. Dies kann nach Methoden erfolgen, wie sie für das MP52m Protein bereits beschrieben sind. Vorzugsweise erfolgte die Solubili- sierung über 2 Stunden bei Raumtemperatur in Solubilisierungs- puffer (6 M Guanidiniumhydrochlorid, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 3 mM DTT pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 2,6 mg Protein pro ml. Das jeweilige Solubilisat wurde dann zu Renaturierungs- puffer (1 M NaCl / 50 mM Tris / 5 mM EDTA / 33 mM CHAPS / 1 mM
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP GSSG / 2 mM GSH/pH 9,5) in einer Endkonzentration von 160 μg MP52m, MP52mFusl bzw. MP52mFus2 pro ml gegeben und bei 23°C über 48 Stunden inkubiert. Restliche monomere Proteine lassen sich durch eine HPLC Aufreinigung von den dimeren Proteinen trennen. Für die HPLC wurden die Fusionsproteine wie das reife MP52m Protein an eine Säule (Aquapore Octyl, 20 μm, 100 x 10 mm, Applied Biosystems) bei 35% Puffer B (Puffer A: 0,1 % TFA in Wasser; Puffer B: 90 % Acetonitril, 0.1 % TFA) mit einer Flussrate von 3 ml/min gebunden. In einem Acetonitrilgradienten von 35 bis 60% Puffer B über 50 min eluieren die dimeren MP52 Proteine vor den monomeren Proteinen. Fraktionen mit dimeren Protein wurden vereinigt, lyophilisiert und bei -70°C aufbe¬ wahrt. In 15 % Polyacrylamid Gelen läuft das dimere MP52m bei ungefähr 22 kD (theoretisches Molekulargewicht: 27,4 kD) und MP52mFusl bzw. MP52mFus2 bei ungefähr 23 bzw. 24 kD (theoreti¬ sches Molekulargewicht: 28.9 kD bzw. 29,6 kD) abgeschätzt nach einem Molekulargewichtsmarker (siehe Figur 7) . Die zusätzlichen Aminosäuren am N-Terminus zeigen in den Versuchen keine signifikante Beeinflussung der Rückfaltungseffizienz . Über die Bestimmung der alkalischen Phosphatase (ALP) Aktivität auf R0B-C26 Zellen, wie es z.B. in WO 95/04819 offenbart ist, wurde gezeigt, dass die dimeren Fusionsproteine trotz verändertem N-Terminus aktiv sind, wobei die Aktivität gegenüber MP52m leicht reduziert war.
Beispiel 2:
Affinität der Fusionsproteine MP52mFusl und MP52mFus2 zu
Hydroxylapatit
Um zu überprüfen, ob die Fusionsproteine MP52mFusl und MP52mFus2 im Vergleich zu normalen reifen MP52 die gewünschte höhere Affinität zu Hydroxylapatit aufweisen, wurden die Proteine auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule aufgetragen und in einem Kaliumphosphatgradienten eluiert. Proteine mit höherer Affinität zu Hydroxylapatit sollten erst bei höheren Kaliumphosphat-Konzentrationen eluieren. Die Säule (Econo Pac-HTP-Cartridge, 5 ml, BioRad) wurde zunächst in Puffer A (6 M Harnstoff, 0,01 M Kaliumphosphat pH 7,0) equilibriert . Je 100 μg von jedem Protein wurden in je 2,25 ml Puffer A gelöst und je 2 ml auf die Säule aufgetragen. Anschliessend wurde ein Gradient von 0 bis 100% Puffer B (6 M Harnstoff, 0,3 M Kalium¬ phosphat pH 7,0) in 100 min bei einer Flussrate von 0,5 ml/min angelegt. Unter diesen Bedingungen konnte gezeigt werden, dass das dimere MP52m bereits bei ungefähr 0,09 M Kaliumphosphat eluiert, während die dimeren Fusionsproteine MP52mFusl und MP52mFus2 beide erst bei ungefähr 0,20 M Kaliumphosphat eluieren. Das Ergebnis bestätigte sich bei gleichzeitiger Resuspension von je 100 μg dimeren MP52m und MP52mFusl in 2,25 ml Puffer A und anschliessenden Auftrag von 2 ml auf die Säule (siehe Elutionsprofil in Figur 8) . Die Ergebnisse zeigen die gewünschte, deutlich erhöhte Affinität der Fusionsproteine zu Hydroxylapatit.
Beispiel 3 :
Herstellung von fluoreszenzmarkiertem MP52m und MP52mFusl
Die Proteinmarkierungen wurden mit dem FluoReporter Kit # F 6153 Oregon Green 488, der (Molecular Probes/MoBiTec GmbH, Göttingen) durchgeführt.
Jeweils 100 μg Protein wurden in 200 μl PBS (10 mM Natrium¬ phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,2) , die 50 % (v/v) Acetonitril enthielt, bei Raumtemperatur gelöst. Nach einer Stunde wurden die Lösungen mit 20 μl eines frischen Natriumhydrogencarbo- nat-Puffers (1 M, pH 8,4) versetzt und anschließend ein 5-facher molarer Überschuß an Oregon Green in DMSO zugegeben. Die Modifikation erfolgte im Dunkeln unter Rühren für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wurden die Ansätze für 2 Minuten bei 14.000 rpm abzentrifugiert. Zur Abtrennung des freien Fluoreszenzreagenzes wurden die Überstände mittels Gelfiltration in 50% (v/v) Acetonitril/PBS in 'spin-columns' für 5 Minuten bei 2.400 rpm zentrifügiert und fünfmal mit jeweils 220 μl Puffer nachgespült. Die Durchläufe 1 und 2 enthielten das fluoreszenzmarkierte Protein und wurden ver¬ einigt. MP52m und MP52mFusl wiesen 13 bzw. 19 relative Fluores-
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP zenzeinheiten pro μg Protein auf, wobei die Abschätzung der Proteinmenge über SDS-Gelelektrophorese und die Fluoreszenz mittels Anregung bei 496 nm und Emission bei 524 nm bestimmt wurde.
Je 25 mg Osprovit (Hydroxylapatitkeramik, Ch.-B. 91 009, Feldmühle AG) wurden mit einem sterilen Spatel in sterile Eppendorf-Röhrchen abgewogen und mit jeweils 5 μg MP52m bzw. MP52mFusl in 50% (v/v) Acetonitril/PBS versetzt und vorsichtig gemischt. Die gefrorenen Proben (-80°C) wurden anschliessend unter sterilen Bedingungen mittels Vakuumzentrifugation getrocknet .
Beispiel 4 :
Lokalisation und Aktivität von MP52m, MP52mFusl in vivo
Es wurden in diesem Experiment je 25 mg der Matrix, an die 5 μg des fluoreszenzmarkierten Proteins gebunden waren, pro Implan¬ tat eingesetzt. Als Negativkontrolle wurde Matrix ohne Protein- beschichtung eingesetzt. Der Bioassay erfolgte mit 100 Tagen alten Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 400 g. Die Tiere wurden intraperitoneal mit Choralhydrat (4%, lml/lOOg Körpergewicht) narkotisiert. Nach Rasur der Bauchhaut erfolgte die Implantation der Prüfkörper unter aseptischen Kautelen. Von einer medianen vertikalen Hautinzision aus wurden rechts und links jeweils Bauchmuskeltaschen zwischen dem Musculus obliquus externus und internus präpariert . Die Proben wurden unmittelbar vor der Implantation mit 20 μl PBS rehydratisiert und mit Variation des Implantationsortes gemäß Protokoll implantiert. Die Muskeltaschen wurden mir Seide 4x0 mit Einzelknopfnähten verschlossen. Die abschließende Hautnaht erfolgte mit Seralon 4x0. Die Explantation erfolgte nach Tötung der Tiere am 1. postoperativen Tag.
Die Herstellung der histologischen Präparate erfolgte in der Sägedünnschliff-Technik. Dazu wurden die Präparate in 70% Ethanol fixiert. Die Entwässerung erfolgte in aufsteigender
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Alkoholreihe (70-80-90-96-100%) , gefolgt von Entfetten mit Aceton. Mit 100% Ethanol wurde das Aceton gründlich entfernt. Nach Behandlung mit Polymerisationslösung wurden die Proben mit Methylacrylatlösung Übergossen und zur Aushärtung auf 40°C gebracht. Mittels diamantbeschichteter Innenlochsäge wuren 120 μm dicke Schnitte hergestellt. Zur Beurteilung der fluoreszenz¬ markierten Proben erfolgte eine Durchmusterung unter dem Fluoreszenzmikroskop (Leitz Laborlux F) und die Dokumentation mittels angeschlossener Videokamera und Vieoprinter (Color Videoprinter UP-3000P, Mavigraph, Sony) . Die Befunde wurden jeweils in 40facher und lOOfacher Originalvergrößerung dokumen¬ tiert.
Ergebnis :
MP52m Proben: Nach 1 Tag läßt sich weder auf der Oberfläche noch in den Makroporen des interkonnektierenden Hydroxylapa¬ tit-Keramikgranulates eine Fluoreszenzaktivität nachweisen. Die Ausschnittsvergrößerung zeigt im Bereich der Poren homogenes Gewebe und artefaktbedingte kleinere Rißbildung, jedoch keinen Hinweis für eine randständige Fluoreszenzaktivität.
MP52mFusl Proben: Nach einem Tag besteht im Bereich der Makroporen eine randständige Fluoreszenz, die den adhärenten fluorochrombeschichteten Proteinen entspricht. Vereinzelt sind Poren im zentralen Bereich fluoreszenzmarkiert, während periphere Poren, sowie die gesamte Oberfläche keine Fluoreszenz mehr aufweist .
Beispiel 5 :
Herstellung von Bisphosphonat markiertem MP52m
20 μg MP52m wurden in 500 μl Acetonitril (Baker) gelöst und für 30 min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. 3,84 mg EDC (l-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimid hydrochlorid, Fluka) zur Aktivierung von Carboxylgruppen wurden in 455 μl Natriumcacodylatpuffer (50 mM, pH 5,0) , der 2 mg/ml 4-Ami- no-l-hydroxybutyliden-1, 1-diphosphorige Säure (AppliChem,
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Darmstadt) enthielt, gelöst und langsam der MP52m-Lösung zugegeben. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde der gesamte Ansatz gefriergetrocknet. Zur HPLC-Chromatographie auf Umkehrphase wurde das Lyophilisat in 130 μl Puffer (19,2 g Harnstoff (AppliChem) , 400 μl 10% NP-40 (Fluka), 2,5 ml Ampholine pH7-9 (Pharmacia) ad 40 ml mit dest. Wasser) gelöst und auf eine Aquapore RP-300 (2,1 x 100mm mit einer 2,1 x 30mm Vorsäule) aufgetragen. Bei einem Fluß von 0,2 ml/min wurde folgender Gradient zur Auftrennung verwendet: 7 Minuten mit 0 % B, danach in 140 Minuten auf 70 % B. Als Puffer A wurde 0,1% (w/v) Trifluoressigsaure in Wasser verwendet und als Puffer B 0,1% (w/v) Trifluoressigsaure in 90% (v/v) Acetonitril. Die Chromatographie wurde bei 25°C durchgeführt, die Detektion erfolgte bei 214 nm. Figur 12 zeigt das Chromatogramm der RP-HPLC von MP52 nach der Modifikation mit EDC/Bisphosphonat . Der Vergleich mit unmodifiziertem MP52m (Figur 13) zeigt, daß durch die Modifikation das Signal des relativ hydrophoben MP52m-Dimers verschwunden ist und dafür Signale im hydrophile¬ ren Bereich erscheinen, wie es für Bisphosphonat-markiertes MP52m zu erwarten ist.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP

Claims

P A T E N T A N S P Rs C H E
Verbindung, umfassend folgende allgemeine Formel:
A Xm Bn
wobei A ein Protein der TGF-ß-Superfamilie mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität oder ein Fragment davon bedeutet, B eine oder mehrere gleiche oder ver¬ schiedene Anhanggruppen mit einer Affinität zur extrazel¬ lulären Matrix und/oder zellulären Bestandteilen des Korpeis und/oder Knochens und/oder zu einer biokompatiblen Trägermatrix bedeutet, X eine oder mehrere kovalente Bindungen und/oder einen oder mehrere gleiche oder verschiedene Abstandshalter bedeutet, n eine ganze Zahl von 1-20 bedeutet und m eine ganze Zahl von 1-20 bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei A ein Protein aus der GDF- oder BMP- Familie oder ein Fragment davon ist.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei A ein Protein mit folgender Primärsequenz
MRLPKLLTFL LWYLAWLDLE FICTVLGAPD LGQRPQGTRP GLAKAEAKER PPLARNVFRP GGHSYGGGAT NANARAKGGT GQTGGLTQPK KDEPKKLPPR PGGPEPKPGH PPQTRQATAR TVTPKGQLPG GKAPPKAGSV PSSFLLKKAR EPGPPREPKE PFRPPPITPH EYMLSLYRTL SDADRKGGNS SVKLEAGLAN TITSFIDKGQ DDRGPWRKQ RYVFDISALE KDGLLGAELR ILRKKPSDTA KPAAPGGGRA AQLKLSSCPS GRQPASLLDV RSVPGLDGSG WEVFDIWKLF RNFKNSAQLC LELEAWERGR AVDLRGLGFD RAARQVHEKA LFLVFGRTKK RDLFFNEIKA RSGQDDKTVY EYLFSQRRKR RAPLATRQGK RPSKNLKARC SRKALHVNFK DMGWDDWIIA PLEYEAFHCE GLCEFPLRSH LEPTNHAVIQ TLMNSMDPES TPPTCCVPTR LSPISILFID SANNWYKQY EDMWESCGC R oder ein Fragment davon ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei X eine kovalente Bindung ist. 5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei X ein Abstandshalter mit mindestens zwei reaktiven, zur Bindung an A und B befähigten Gruppen, ist.
6. Verbindung nach Anspruch 5, wobei die reaktiven Gruppen gleich oder unterschiedlich sind.
7. Verbindung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die reaktive Gruppe eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Sulfhydrylgruppe ist.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Abstandshalter X ein Oligopeptid ist oder eine Verbindung ist, die eine oder mehrere Einheiten mit 1-100 Ketten¬ atomen umfaßt, wobei die Kettenatome unsubstituiert oder durch Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Alkyl-, und/oder cyclische oder heterocyclische Gruppen substituiert sind, und die Einheiten gegebenenfalls über Sauerstoff- und/oder Schwefel-Atome verbrückt sind.
9. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei X sowohl eine oder mehrere kovalente Bindungen als auch eine oder mehrere Abstandshalter nach einem der Ansprüche 5 bis 8 bedeutet.
10. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Anhanggruppe B ein Peptid ist.
11. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Anhanggruppe B ein Peptid ist und mit seinen C-Terminus über eine Amidbindung am N-Terminus von A gebunden ist.
12. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Anhanggruppe B ein Peptid ist und der Abstandshalter X ein Oligopeptid ist, und das Peptid mit seinem C-Terminus über eine Amidbindung am N-Terminus des Oligopeptids gebunden
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP ist und das Oligopeptid mit seinem C-Terminus über eine Amidbindung am N-Terminus von A gebunden ist.
13. Nukleinsäure, enthaltend mindestens eine für eine Ver¬ bindung von Anspruch 10, 11 oder 12 kodierende Nukleinsäu¬ resequenz .
14. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure von Anspruch 13.
15. Wirtszelle, enthaltend eine Nukleinsäure von Anspruch 13 oder den Vektor von Anspruch 14.
16. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 10, 11 oder 12, umfassend die Schritte:
(a) Transformation geeigneter Wirtszellen mit einer Nukleinsäure von Anspruch 13 oder einem Vektor von Anspruch 14,
(b) Züchten der transformierten Wirtszellen unter für die Expression der Verbindung geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium, und
(c) Isolierung einer Verbindung aus den Wirtszellen und/oder dem Kulturmedium.
17. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Anhanggruppe B eine Diphosphonsäure ist und mindestens eine zur Kopplung an A oder X befähigte, vorzugsweise endständige Gruppe enthält, oder ein Salz davon ist.
18. Verbindung nach Anspruch 17, wobei die Anhanggruppe B folgende Formel
R- (P03H2)2
umfaßt, worin der Rest R R1-C-R2 bedeutet, wobei Rl eine Hydroxylgruppe, Aminogruppe, Halogengruppe, Carboxylgrup¬ pe, Sulfhydrylgruppe, Guanidiniumgruppe oder Wasserstoff- gruppe bedeutet und R2 einen unsubstituierten oder durch Cl-20 Alkyl- und/oder Arylreste und/oder Kohlenhydratreste substituierten, linearen, verzweigtkettigen, cyclischen oder heterocyclischen, gesättigten oder ungesättigten Cl-20-Kohlenwasserstoffrest bedeutet.
19. Verbindung nach Anspruch 17, welche Alendronsäure, Clodronsäure, Pamidronsäure, Etidronsäure, Neridronsäure, Risedronsäure, Tiludronsäure, Mildronsäure, Aminohy- droxy-Propyliden-Diphosphonsäure, YM 175 oder BM-210995 ist .
20. Verbindung nach Anspruch 17, welche ein Derivat der Guanidinoalkyl-1, 1-diphosphonsäuren oder der heterocyc¬ lische Iminobismethylen-diphosphonsäuren ist.
21. Verbindung nach Anspruch 17, welche ein Derivat der 1-Hydroxy-1, 1-diphosphonsäuren ist.
22. Verbindung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei die zur Kopplung an A oder X befähigte Gruppe eine Carbo¬ xylgruppe, eine Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Sulfhy¬ drylgruppe ist .
23. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach den Ansprüchen 17 bis 22, wobei die Anhanggruppe B chemisch über eine kovalente Bindung an A gekoppelt wird.
24. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach den Ansprüchen 17 bis 22, wobei die Anhanggruppe B chemisch an den Abstandshalter X gekoppelt wird und/oder der Abstands¬ halter X chemisch an A gekoppelt wird.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Ver¬ bindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und 17 bis 22, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Träger-, Hilfs-, Verdünnungs- und/oder Füllstoffen. 26. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder 17 bis 22 zur Vorbeugung oder lokalen oder systemischen Behandlung von Erkrankungen die den Knorpel und/oder Knochen betreffen wie beispielsweise Osteoporose, Paget' sehe Krankheit, Osteodystrophia, Osteoarthritis oder Osteoarthropathie und von Schädigungen des Knorpel- oder Knochengewebes verursacht durch Verletzung oder Uberbela- stung.
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