AT511187A2

AT511187A2 - Polypeptidmaterial aus elastin-ähnlichen Segmenten und Coiled-Coil Segmenten

Info

Publication number: AT511187A2
Application number: ATA9495/2009A
Authority: AT
Original assignee: Kemijski Inst
Priority date: 2009-10-12
Filing date: 2009-10-12
Publication date: 2012-09-15
Also published as: WO2011046519A1; AT511187A5

Abstract

Die Erfindung stellt Polypeptidmaterial, zusammengesetzt aus mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln dar, und optional noch einer funktionellen Polypeptiddomäne. Die Elastinähnlichen Segmente aber stellen mindestens vier für Elastin typische Wiederholungen dar. Die Erfindung bezieht sich auf die Anwendung von Polypeptidmaterial zur Wachstumsbeschleunigungvon Zellen, Gewebe und Organen, zur Differenzierung von Zellen, der Wachstumshemmung von Pathogenen, zur Behandlung von lebendem menschlichen oder tierischen Gewebe und als medizinisches und pharmazeutischesMaterial, das zur Behandlung von Lebendgewebe von Nutzen sein wird.

Description

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Polypeptidmaterial, zusammengesetzt aus Elastin-ähnlichen Segmenten und Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln

Gebiet der Erfindung

Das Gebiet der Erfindung ist neues Polypeptidmaterial, zusammengesetzt aus Elastin-ähnlichen Segmenten, Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln und nach Wahl auch funktionalen Polypeptidedomänen, die mögliche Verwendungen des Polypeptidmaterials definieren. Das Gebiet der Erfindung ist ein Protein, das Polypeptidmaterial und DNK bildet, das ein Protein aufzeichnet, welches Polypeptidmaterial bildet.

Das Gebiet der Erfindung ist auch die Verwendung von Polypeptidmaterial zur Förderung von Zellwachstum, Gewebe oder Organen, zur Hemmung von Pathogen Wachstum und für medizinisches beziehungsweise pharmazeutisches Material, verwendbar zur Heilung von Lebendgewebe, vorrangig von menschlichem oder tierischem Gewebe.

Stand der Technik Für die biokompatible Grundlage zum Zell- und Gewebewachstum wurden verschiedene Materialien entwickelt, die nicht nur für die Zellzucht in vitro, sondern auch für Geweberekonstruktionen und weitere Anwendungen des Gewebeingenieurwesens sowie für Anwendungen in der Medizin wichtig sind. Als Grundlage der Zellteilung, Zellenmigration und Zellendifferenzierung können zahlreiche synthetische Polymere dienen (zum Beispiel Polystyrole, Polyethylen-Vinylacetate, Polypropylene, Polyethyl- 2 ene, usw.) und Biopolymere (einschließlich der Proteine, wie Kollagen und Fibrin, sowie Polysaccharide, wie Glykosaminoglykane und Alginate).

Rational geplante Peptide bieten einen aussichtsvollen Ansatz zur Konstruktion von Biomaterialien. Zum Beispiel wurde schon über mehrere Fälle von neuen sich selbst zusammensetzenden und selbstkomplementären amphiphilen Peptiden mit typischem Austausch von hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren berichtet. Diese Peptide bilden verschiedene Strukturen, die auf der Entstehung von Fibrillen mit ß-Blattstruk-turen zwischen Amphiphilen basieren (U.S. Pat. Appl. Pub. 0209145 A1) und auch mit biologisch aktiven Komponenten und/oder hydrophoben Alkylschwänzen an Terminalteilen (U.S. Pat. Appl. Pub. 0181973 A1, U.S. Pat. 7371719 B2) verbunden sind.

Biokompatible Materialien, die extrazelluläre Matrix (ECM) nachbilden, stellen fürs Zellwachstum eine günstige Umgebung dar. Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist aus heterogenen Makromolekülen, einschließlich Proteine und Polysaccharide, die eine dreidimensionale Umgebung fürs Zellwachstum bilden, aufgebaut, was die Grundlage zur Stabilisierung und Unterstützung von Zellschichten und Gewebe darstellt.

Ein Bestandteil der extrazellulären Matrix sind elastische Fasern, die aus dem amorphen Protein Elastin und aus Mikrofibrillen, größtenteils aufgebaut aus Fibrillin-1, aufgebaut sind. Präkursor eines stabilen, vernetzten Elastins ist die lösliche Moleküle Tropoelastin. Dieses Molekül besteht aus zwei unterschiedlichen Domänen: hydrophoben Domänen, reich an Aminosäureresten Glycin (G), Valin (V), Alanin (A) und Prolin (P), die oft in Wiederholungseinheiten auftreten (die ersten festgelegten waren Pentapeptid VPGVG, Hexapeptid VGVAPG und Tetrapeptid VPGG) sowie hydrophilen Domänen, die vor allem reich an Alanin- und Lysinresten sind, wichtig zur Querverbindung, die zur Entstehung von nicht löslichem und sehr stabilem Polymer führen.

Tropoelastin und Elastin-verwandte Polymere können über hydrophobe Domänen Ko-azervate bilden bevor sich die Moleküle kovalent quer binden (Prozess, der durch Temperaturerhöhung ausgelöst wird), was weiter zum Selbstaufbau führt. Die Neigung zur Selbstaggregation und die wichtige Stabilität von Elastin und Elastin- « * · · ft I« · « · * · * · · « « « · * • » · · · * * ·· · · 3 ähnlichen Polymeren bestimmen Elastin als entscheidende Komponente zur Entwicklung von synthetischen Nanomaterialien.

Lee und Mitarbeiter (Lee et al., 2001, Biomacromolecules. 2, 170-179) haben Polypeptide mit Elastin-ähnlichen hydrophoben Wiederholungseinheiten, die als lösliche Modelle für Elastin dienen können, genau analysiert. Zur Verwendung dieser Polypeptide als widerstandsfähigem Biomaterial aber ist eine Querverbindung der Polypeptidketten dringend notwendig. Diese kann durch Anwendung von γ-Strahlen, durch chemische Verbindungen, oder aber auch Enzym-übermittelnde Verbindungen entstehen. Es wurden schon einige Elastin-ähnliche Polypeptidmaterialien vorbereitet, wo man einige Modifikationen in hydrophobe, sich wiederholende Sequenzen, einschließlich dem Austausch einiger Aminosäuren mit Resten, die der Querverbindung dienen könnten, oder der Hinzufügung von Komponenten zur Querverbindung (Substrat zur Lysyloxidase) der elastomeren Komponente (Tetra- bzw. Pentapeptide, sich wiederholende Einheiten oder deren Mischung) eingeführt hat (U.S. Pat. 4589882).

Um ein System mit besserer Querverbindung zu erreichen, wurde auch Material vorbereitet, das an einem Intermediat des VPGVG Peptides einfache Aminogruppen und am anderen einfache Karboxyl-Gruppen aufweist, was eine Querverbindung mit einem chemischen Reagenten ermöglicht (U.S. Pat. 4187852).

Mit der Verwendung von rekombinanter Technologie wurden multimoduläre Polypeptide vorbereitet, die auf Elastin basieren und mechanische und funktionale Eigenschaften der Materialien, die auf dem Elastin basieren, ändern können. Die Beispiele schließen Hybride zwischen Elastin-ähnlichen Peptiden und der C5 Fibronektin-Domäne, die die Zellbefestigung beschleunigt, mit ein (Welsh et al., 2000, Biomacromolecules. 1,23-30), oder Hybride zwischen einem Peptid-ähnlichen Fibroin aus Seide und Elastin-ähnlichen Peptiden (Cappello et al., 1990, Biotechnology Progress. 6, 198-202). Elastin und Elastin-ähnliche Komponenten stellen auf dem Gebiet der Na-no-Biomaterialien (diese können ein Substrat zum Zellwachstum oder Material zur Lieferung von Medikamenten oder Wachstumsfaktoren darstellen) und des Gewebeingenieurwesens (auch als Ersatzstoffe für Haut, Blutgefäße, Herzklappen und elastische Knorpel) viel in Aussicht.

Aufgebautes Material kann auch verschiedene zusätzliche funktionale biologisch aktive Teile beinhalten, weswegen es die Befestigung, Adhäsion, Migration oder Proliferation der Zellen beeinflussen kann. Die Befestigungsmöglichkeit von funktionalen biologisch aktiven Teilen an ein Gerüst stellt bei der Konstruktion von selbstzusammen-setzenden Peptiden eine wichtige Eigenschaft dar. Diese Vorgehensweise ermöglicht uns das Zielen der Zielzelle und verringert die Substanzmenge, die notwendig ist, um den gewünschten lokalen Effekt zu erreichen. Die Lieferung einiger Wachstumsfaktoren in löslicher Form stellt einen zusätzlichen Nachteil dar, denn die Zellen reagieren wegen der Internalisierung und wegen der Regulierung in Form der verringerten Anzahl von Rezeptoren für den Wachstumsfaktor nicht mehr auf den Faktor.

Die Erfindung bezieht sich auf polypeptides Material, aufgebaut aus Elastin-ähnlichen Segmenten, die untereinander über nicht kovalente Interaktionen mit Verwendung eines neuen Verfahrens ausgewählter beziehungsweise geplanter Segmente zur Bildung von Doppelwendeln quer verbunden sind, womit man den Bedarf an chemischen Änderungen an Elastin-ähnlichen Wiederholungen mit Einführung von Stellen für die Querverbindung vermeidet. Die Erfindung wurde weiter mit Verwendung von reguliertem Aufbau und Zerlegung von Polypeptidmaterial vervollständigt. Das Polypeptidmaterial kann auch zusätzlich mit hinzugefügten funktionalen Protein-Domänen zur Förderung des Zellwachstums, der Differenzierung, der Hemmung des Mikroben-Wachs-tums, der Verbindung von Eisen-Ionen, der Zytotoxizität, der Zellreprogrammierung oder vieler anderen Funktionen vervollständigt werden und stellt deshalb neues Biomaterial zum Wachstum von Zellen/Gewebe/Organen und zur Heilung von lebendem Menschen- oder Tiergewebe dar. Ein solches Verfahren ermöglicht fast unzählige mögliche Kombinationen, außerdem ermöglicht es auch eine Befestigung von funktionalen Protein-Domänen an schon aufgebautes Biomaterial nach vorhergehendem Aufbau, was eine Planung des zeitlichen Verlaufs der Therapie ermöglicht.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptidmaterial, das mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln * * · · I · * I « t • · · · 4 » · · 4 t * * ♦ I i « ·*» ♦ * * · ♦ ♦ · « » # · i ·· «· · · ·· tp 5 enthält, wobei sich mindestens ein Elastin-ähnliches Segment zwischen zwei oder mehreren Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln befindet, separate Polypeptidmoleküle aber verbinden sich untereinander über Interaktionen zwischen Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln und befinden sich auf diesen Molekülen. Die Erfindung bezieht sich auch auf Polypeptidmaterial, das wahlweise mindestens eine funktionale Polypeptiddomäne enthält, ausgewählt unter, aber nicht eingeschränkt auf: Wachstumsfaktoren, Faktoren zur Zellendifferenzierung, Mikroben-abweisende Peptide, Domänen zur Bindung von Metallen und Inhibitoren des Bakterienwachstums. Wachstumsfaktoren wurden vorrangig gewählt, aber nicht eingeschränkt unter: epidermale Wachstumsfaktoren (EGF), fibroblaste Wachstumsfaktoren (FGF) und Wachstumsfaktoren, die das Wachstum von Neuronen anregen, vorrangig neuronale Wachstumsfaktoren (NGF). Mikroben-abweisende Peptide wurden vorrangig gewählt, aber nicht eingeschränkt unter Kathelizidinen und Defensinen, vorrangig Kathelizidin LL-37. Domänen zur Metallbindung sind zum Beispiel AEA oder Hexahistidinschwanz, vorrangig SEQ ID NO: 26. Eine oder mehrere funktionale Domänen können kovalent an Polypeptidmaterial gebunden sein oder aber sie wurden über Interaktionen zwischen den Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln, die mit der funktionalen Domäne verbunden sind, und Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln, die Teil des Polypeptidmaterials sind, ins Polypeptidmaterial eingeführt.

Die Erfindung umfasst auch Polypeptidmaterial, aufgebaut aus verschiedenen Verhältnissen der Polypeptidkomponenten, die auch verschiedene funktionale Domänen enthalten können.

Gemäß der Erfindung beinhaltet das Polypeptidmaterial mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln und wahlweise mindestens eine funktionale Polypeptiddomäne, wobei das dem Elas-tin-ähnliche Segment menschliches oder tierisches Elastin ist, dessen Mutant oder synthetisches Elastin-ähnliches Segment mit erhaltenen funktionalen Elastin-Eigen-schaften ist und das von mindestens 4 Elastin-ähnlichen Wiederholungen aufgebaut ist, einschließlich mit, aber nicht beschränkt auf: Pentapeptid Val-Pro-Gly-Val-Gly o-der Gly-Val-Gly-Val-Pro oder Gly-Val-Gly-Ile-Pro. Zusätzlich wird das Elastin-ähnliche • # * » · » · • · · « »· · ι · ♦ » « * · 6

Segment in dieser Erfindung dadurch bestimmt, das es von mindestens 12 Aminosäure-Resten aufgebaut wird, wobei die Summe (% (n/n) Glycinreste) und 2* {% (n/n) Prolinreste) höher ist als 60 % {n/n).

Die Erfindung bezieht sich auch auf das oben beschriebene Polypeptidmaterial, wo die Zahl der Elastin-ähnlichen Segmente zwischen 1 und 50 liegt, vorrangig zwischen 2 und 10, und die Zahl der Segmente zur Bildung von Doppelwendeln zwischen 2 und 50, vorrangig zwischen 3 und 10 liegt, und wo das Elastin-ähnliche Segment zur Bildung von geflochtenen Doppelwendeln mindestens in einem Fall zwischen zwei Segmente eingefügt ist.

Die Erfindung bezieht sich auf das oben beschriebene Polypeptidmaterial, wo natürliche oder ausgelegte Motive zur Bildung von Doppelwendeln Segmente zur Bildung von Doppelwendeln darstellen und aus mindestens zwei Heptaden aufgebaut und parallel oder antiparallel sind und entweder Homo-Oligomere mit oligomerem Zustand zwischen 2 und 7 oder Hetero-Oligomere mit oligomerem Zustand zwischen 2 und 7 bilden.

Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptidmaterial, wo Segmente zur Bildung von Doppelwendeln, die verschiedene Moleküle verbinden, zwischen ausgelegten Peptidepaaren zur Bildung von Doppelwendeln ausgewählt wurden: SEQ ID: 10 und SEQ ID: 12, SEQ ID: 28 und SEQ ID: 30; SEQ ID: 32 und SEQ ID: 34, SEQ ID: 36 und SEQ ID: 38 oder SEQ ID: 14 oder SEQ ID: 26.

Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptidmaterial, aufgebaut aus mindestens zwei verschiedenen oben beschriebenen Polypeptidmaterialien, wobei das aufgebaute Polypeptidmaterial mit der Verbindung von mindestens zwei Polypeptidmaterialien vorbereitet wurde und wobei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln aus einem Material Hetero-Oligomere mit Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln aus einem anderen Material bilden können, womit wir eine regulierte Verbindung von aufgebautem Polypeptidmaterial erwirken können. • * · i ··· · I « • · I · ** « » # • t I * · ft « I « » • * * »· ·· » · * · · 7

Die Erfindung bezieht sich auf Peptide, die Segmente zur Bildung von Doppelwendeln enthalten und nur in einer der Komponenten des oben beschriebenen Polypeptidmaterials vorhanden sind und wir sie zur Zerlegung des Polypeptidmaterials verwenden können, was ein sanftes Verfahren zur Trennung der Zellen vom Material ermöglicht.

Die Erfindung bezieht sich auf das oben beschriebene Polypeptidmaterial, wobei Segmente und Domänen im oben erwähnten Polypeptidmaterial untereinander wahlfrei mit einem Verbindungsteil, das von einer bis zu 20 Aminosäuren enthält, vorrangig von einer bis zu 6 Aminosäuren, verbunden sind und wobei das Protein wahlfrei eine Signalfolge, die das Ausscheiden des Proteins lenkt, und (einen) Aminosäure-Tracer enthält.

Die Erfindung bezieht sich auf die DNA, die die Aufzeichnung für die oben beschriebenen Proteine trägt, wobei die DNA operativ mit regulatorischen Elementen, dem Promotor und dem Terminator, verbunden ist, die eine Äußerung des Fusionsproteins im Gastgeberorganismus ermöglichen.

Die Erfindung bezieht sich auf den Vorbereitungsprozess des oben beschriebenen Polypeptidmaterials, der folgende Schritte enthält: a) Züchtung eines Gastgeberorganismus, der Protein äußert, welches DNA verzeichnet, beides oben beschrieben; b) die Isolierung des geäußerten Proteins; und c) die Bildung des oben beschriebenen Polypeptidmaterials mit Einbeziehung von gereinigtem(en) Protein(en).

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung des oben beschriebenen Polypeptidmaterials zum Zell- oder Organwachstum, wobei dieses Material wahlweise für gewünschte funktionale Eigenschaften für das Zellwachstum sorgt. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des oben beschriebenen Polypeptidmaterials als medizinischem und pharmazeutischem Material zur Heilung von Lebendgewebe, vorrangig von menschlichem oder tierischem Gewebe. Zum Beispiel, aber nicht eingegrenzt auf das Ersetzen von beschädigtem Gewebe, wie eine Prothese, zur Zellenregeneration, zur Reprogrammierung von Zellen und als pharmazeutisches Material, wie • · · · * · ♦ *·» * *· · # * * · » «

» · · * * ft * ι 4 I • · # * * » I »· I * · 8 z.B. Hüllen zur Heilung von Wunden und Verbrennungen, lokale Lieferung von zytotoxischen oder zytostatischen Polypeptiden.

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung des oben beschriebenen Polypeptidmaterials zur Wachstumshemmung von Pathogenen im Falle, dass die funktionalen Polypeptiddomänen des Polypeptidmaterials Mikroben-abweisende Peptide oder Domänen zur Metallbindung sind, besonders SEQ ID NO: 26., das Silber-Nanoteilchen bildet.

Bilderverzeichnis

Bild 1: Schematische Darstellung der Erfindung. Polypeptidmaterial ist aus Elastin-ähnlichen Segmenten und Segmenten, die Doppelwendeln bilden, aufgebaut. Abschnitte, die Doppelwendel bilden, oligomerisieren und verbinden einzelne Polypeptidketten des polypeptiden Biomaterialgerüstes. Funktionale Polypeptiddomänen können als Teil des Fusionsproteins in die Polypeptidkette integriert sein, oder aber mit dem Gerüst über Interaktionen zwischen Segmenten, die Doppelwendel am Gerüst bilden und jenen, die dem funktionalen Polypeptid angegliedert sind, verbunden sein.

Bild 2: Mikroben-abweisende Wirkung von Polypeptidmaterial, das eine funktionale Polypeptiddomäne - Mikroben-abweisendes Peptid LL-37 enthält. Auf dem Bild sind folgende Muster abgebildet: 1-MilliQ, 2-6 zunehmende Konzentrationen von Polypeptidmaterial, das eine funktionale Polypeptiddomäne - Mikroben-abweisendes Peptid LL-37, enthält; 2-0,1 mg/ml, 3-0,5 mg/ml, 4-1 mg/ml, 5-5 mg/ml, 6-10 mg/ml.

Bild 3: Differenzierung von PC12 Zellen auf Polypeptidematerial, das eine funktionale Polypeptiddomäne - Wachstumsfaktor NGF, enthält. Auf dem Bild wird folgendes dargestellt: [A, B] HEK293T Zellen auf Polypeptidematerial [A] ohne funktionale Polypeptiddomäne, [B] mit einer funktionalen Polypeptiddomäne - dem Wachstumsfaktor NGF; [C, D] PC12 Zellen auf Polypeptidematerial [C] ohne funktionale Polypeptiddomäne, [D] mit funktionaler Polypeptiddomäne - dem Wachstumsfaktor NGF.

Bild 4: Mikroben-abweisende Wirkung von Polypeptidematerial, das die funktionale Polypeptiddomäne AEA enthält, die Silber-Nanoteilchen bildet. Das Bild zeigt, dass eine funktionale Polypeptiddomäne, die Silber-Nanoteilchen bildet, das Bakterienwachstum hemmt.

Bild 5: Das CD Spektrum beweist die Bildung von Heterodimeren eines repräsentativen Paares geplanter Segmente, die ein Doppelwendel bilden, P1 und P2.

Detaillierte Offenlegung der Erfindung

Wenn nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hier verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie dies unter Experten auf dem Gebiet der Erfindung im Allgemeinen akzeptiert wird. Die Terminologie, die in der Beschreibung der Erfindung verwendet wird, ist der Beschreibung eines bestimmten Teils der Erfindung und nicht der Einschränkung der Erfindung zugedacht. Alle in der Beschreibung angeführten Veröffentlichungen sind unter den Referenzen angeführt.

In der Beschreibung der Erfindung und in den Ansprüchen wird in der Einzahl beschrieben, aber die Beschreibung enthält auch eine Mehrzahl, die aber wegen leichterem Verständnis nicht hervorgehoben wird.

Polypeptidmaterial

Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass mindestens ein Elastin-ähnliches Segment mit mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln Polypeptidmaterial bilden kann. Die dargestellte Erfindung beschreibt Polypeptidmaterial, dessen Aufbau auf dem Gebiet von Nano-Materialien auf jüngsten Geschehnissen von Erfindern basiert. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Protein, aufgebaut aus mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln Polypeptidmaterial mit spezifischen physischen Eigenschaften bildet, z.B. Förderung Wachstums von Zellen, Gewebe oder Organen. Elastin-ähnliche Segmente ahmen Elastin nach, sorgen für Elastomer-Eigenschaften und sind über die Oligomerisierung der Segmente zur Bildung von Doppelwendeln verbunden, was zur Bildung von Polypeptidmaterial führt. Polypeptid material ahmt deshalb die extrazelluläre Matrix nach, ist biokompatibel, lenkt das Zellwachstum und sorgt für eine entsprechende Umgebung für die Zellfunktion. • * * · 4 · * · 10

In der Beschreibung bezieht sich der Ausdruck „Polypeptidmaterial“ aufs Material, das aus Proteinen aufgebaut ist, die mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln enthalten und dessen Struktur zwei- oder dreidimensional ist. Segmente, die Elastin-Material ähneln, sorgen für Elastomer-Eigenschaften, während Segmente zur Bildung von Doppelwendeln eine wechselseitige Verbindung von Elastin-ähnlichen Segmenten ermöglichen.

Die Erfinder haben erkannt, dass Elastin-ähnliche Wiederholungen mit einem neuen Verfahren zur Verwendung der Segmente für die Bildung von Doppelwendeln, die oli-gomerisieren, in Polypeptidmaterial verbunden werden können. Dies stellt eine Verbesserung der vorausgehenden Erfindungen dar, denn vorher musste man die Vernetzung von Elastin-ähnlichen Wiederholungen mit der Einführung möglicher Stellen zur Querverbindung modifizieren (U.S. Pat. 4589882; U.S. Pat. 4187852).

Der Ausdruck „Elastin-ähnliches Segment“ hat in der Beschreibung der Erfindung eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf homologe Abschnitte tierischen und menschlichen Elastins, aufgebaut aus mindestens 4 Elastin-ähnlichen Wiederholungen. Elastin-ähnliche Segmente können aneinandergereiht oder können zumindest in einem Fall zur Bildung von Doppelwendeln zwischen zwei Segmenten angebracht sein. Der Ausdruck „Elastin-ähnliches Segment“ bezieht sich auch auf mutiertes oder synthetisches, künstlich erzeugtes, Elastin-ähnliches Segment, das die Charakteristiken von Elastin beibehält. Elastin-ähnliche Segmente können chemisch synthetisiert oder rekombiniert ausgedrückt werden. Der in der Beschreibung verwendete Ausdruck „homologe Abschnitte“ bezieht sich auf die Aminosäure-Abfolge des Proteins, das demselben oder einem anderen Organismus entstammt und beim Proteinausgleich eine große Ähnlichkeit aufweist, vorrangig mehr als 50 % der erhaltenen Struktur, vorrangig 60 %, vorrangig 70 % im Ausgleich der Abfolge. Der Ausdruck „homologe Abschnitte“ bezieht sich auch auf mutierte Proteinabschnitte, deren Mutationen die Abfolge der Aminosäuren minimal ändern.

Der Ausdruck „Elastin-ähnliche Wiederholungen“ bezieht sich auch auf im Elastin befindende hydrophobe sich wiederholende Abfolgen, die viel Gly (G), Val (V), Ala (A) • * * »«· · t t ·*·· * ♦ i « t » • * · * » » « 4 · • « l· * 11 und Pro (P) Reste enthalten, die häufig in Tandem-Wiederholungen einiger (von 3 bis 6) Aminosäuren Vorkommen. Der Ausdruck „Elastin-ähnliche Wiederholungen“ enthält, aber ist nicht eingeschränkt auf, Pentapeptide mit der Abfolge Val-Pro-Gly-Val-Gly oder Gly-Val-Gly-Val-Pro oder Gly-Val-Gly-Ile-Pro.

Der Ausdruck „Elastin-ähnliche Wiederholungen“ bezieht sich außerdem auf Abfolgen, die aus mindestens 12 Aminosäure-Resten aufgebaut sind, wobei die Summe (% (n/n) Glycinreste) und 2* (% (n/n) Prolinreste) höher ist als 60 % (n/n). Die Elastomer-Funktion des Elastins hängt nämlich nur von zwei Aminosäurerestearten ab - Glycin und Prolin. Diese Eigenschaften des Elastins machen sich erst über einer bestimmten Grenzsummer von Prolin und Glycin bemerkbar. Die zweite Eigenschaft von Elastomer-Domänen mit einem Glycin- und Prolingehalt über der erwähnten Grenze ist die Abwesenheit der α-Wendel und des ß-Blattes, das Polypeptid bleibt in seiner ungeregelten Form, auch wenn es aggregiert (Rauscher et al. 2006, Structure. 14,1667-1676).

Die Basis der Erfindung ist auch die Entdeckung, dass die Zahl der Elastin-ähnlichen Segmente zwischen 1 und 50 liegt, vorrangig zwischen 2 und 10, und die Zahl der Segmente für die Bildung von Doppelwendeln zwischen 2 und 50, vorrangig zwischen 3 und 10, wobei das Elastin-ähnliche Segment mindestens in einem Fall zwischen den Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln eingegliedert ist. Die Segmente zur Bildung von Doppelwendeln aber bilden Homo-Oligomere oder Hetero-Oligomere mit einem Oligomerisierungszustand zwischen 2 und 7.

Der in der Beschreibung der Erfindung angeführte Ausdruck „Homo-Oligomerisierung“ hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf den Bildungsprozess der Komplexe, aufgebaut aus einem einzelnen Monomere-Typ, wobei die Zahl der Monomere zwischen 2 und 7 liegt.

Der in der Beschreibung der Erfindung angeführte Ausdruck „Hetero-Oligomerisier-ung“ hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf den Bildungsprozess der

Komplexe, aufgebaut aus verschiedenen Monomere-Typen, wobei die Zahl der Monomere zwischen 2 und 7 liegt.

Der in der oben angeführten Beschreibung angeführte Ausdruck „Monomer“ bezieht sich auf ein Segment, das die Doppelwendel bildet und mit einem anderen Segment integrieren kann, das die Doppelwendel bildet, indem sich beide umwinden.

Der Ausdruck "Segment zur Bildung von Doppelwendeln" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf strukturelle Protein-Motive, aufgebaut aus 2 oder mehreren α-Wendeln, die sich umwinden und somit eine Superwendel bilden. Diese Motive enthalten Heptaden-Wiederholungen, gekennzeichnet (a-b-c-d-e-f-g)n, jede zwei Wendelwindungen. "a" und "d" stellen normalerweise nicht polare, hydrophobe Aminosäure-Reste dar, die sich auf der Zwischenfläche zwischen den Wendeln befinden, "e” und "g" sind polare Aminosäure-Reste, die dem Lösemittel ausgesetzt sind und elektrostatisch interagieren, "b", "c" und "f" aber sind Hydrophile und dem Lösungsmittel ausgesetzt. Verschiedene Aminosäure-Reste an den Stellen "a-g" bestimmen den Oligomerisierungszustand, die Spezifität, die Orientierung der Wendel und die Stabilität. Spezifischer bezieht sich der in der Beschreibung angeführte Ausdruck "Segment zur Bildung von Doppelwendeln“ auf natürliche oder geplante strukturelle Motive des Proteins, die Doppelwendeln bilden und mindestens zwei Heptaden enthalten und parallel oder antiparallel sein können und Homo- oder Hetero-Oligomere bilden können.

Segmente zur Bildung von Doppelwendeln können wir aus natürlichen oder ausgelegten strukturellen Motiven der Proteine zur Bildung von Doppelwendeln wählen, vorrangig aus natürlichen Proteinen mit Leucinverschluss, wie z.B. BZIP oder ausgelegten Abfolgen zur Bildung von Doppelwendeln, vorrangig aus: SEQ ID: 14 oder SEQ ID: 26 oder Paaren SEQ ID: 10 und SEQ ID: 12, SEQ ID: 28 und SEQ ID: 30; SEQ ID: 32 und SEQ ID: 34, SEQ ID: 36 und SEQ ID: 38.

Funktionelle Polypeptiddomäne

Die Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, dass das Polypeptidmaterial neben wegen der strukturellen Rolle wichtiger Domänen zur Bildung von Doppelwendeln und

Elastin-ähnlichen Domänen zusätzlich mindestens eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält, was dem Polypeptid material zusätzliche funktionelle Eigenschaften verleiht, wie zum Beispiel die Förderung des Zellwachstums und deren Differenzierung, die Wachstumshemmung von Pathogenen oder das Binden von Metall-Ionen.

Eine funktionelle Polypeptiddomäne kann kovalent an mindestens ein Elastin-ähnliches Segment mit mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln, die Polypeptidmaterial bilden, gebunden sein.

Neben der kovalenten Bindung der funktionellen Domäne ans Polypeptidmaterial, wie oben beschrieben, bezieht sich die Erfindung auch auf eine zweite Einbindungsmöglichkeit der Polypeptiddomäne ins Polypeptidmaterial. Die Erfinder haben entdeckt, dass es es nützlich ist, wenn man Polypeptidmaterial, das keine funktionelle Domäne enthält, funktionelle Eigenschaften einbringen kann. Die Erfinder haben entdeckt, dass man Polypeptidmaterial eine funktionelle Polypeptiddomäne hinzufügen kann, die mit dem Segment zur Bildung von Doppelwendeln vereint ist und somit wird die funktionelle Polypeptiddomäne, vereint mit dem Segment zur Bildung von Doppelwendeln über die Oligomerisierung von komplementären Segmenten zur Bildung von Doppel-wendeln im Polypeptidmaterial ins Polypeptidmaterial eingebunden.

Auf diese Weise können wir dem Polypeptidmaterial, das schon eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält, mit der Hinzufügung einer anderen funktionellen Polypeptiddomäne, verbunden mit dem Segment zur Bildung von Doppelwendeln, das dem Segment zur Bildung von Doppelwendeln im Polypeptidmaterial komplementär ist, zusätzliche gewünschte Eigenschaften hinzufügen. Funktionelle Polypeptiddomänen können Polypeptidmaterial zu Beginn des Aufbaus oder nachträglich hinzugefügt werden und außerdem können wir diese dem Organismus an verschiedenen Stellen einführen, aber damit zielen wir immer noch auf die Stelle des eingepflanzten Polypeptidmaterials mit komplementären Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln.

Wenn die funktionelle Polypeptiddomäne kovalent ans Polypeptidmaterial gebunden ist, ist sie den Zellen, dem Gewebe bzw. dem Organ zugänglich. Die lokale Konzent- ration einer funktionellen Polypeptiddomäne ist wegen Abwesenheit der Diffusion höher als im Falle einer löslichen funktionellen Polypeptiddomäne. Außerdem ist zur Erreichung der gewünschten lokalen Wirkung eine geringere funktionelle Polypeptiddomäne notwendig als im Falle einer Domäne in löslicher Form. Außerdem sind eine mögliche Toxizität und nachteilige Wirkungen auf diese Weise aufs Gebiet des eingepflanzten Polypeptidmaterials eingegrenzt. Ein solcher Materialtyp ermöglicht auch eine zeitliche Änderung der Therapie mit einer aufeinanderfolgenden Einbringung verschiedener funktioneller Proteine.

Der Ausdruck "vereint (fusioniert) oder Fusion" hat eine allgemeine Bedeutung, die Beschreibung aber bezieht sich auf den Prozess der Vorbereitung des Hybridproteins aus zwei vorangehend getrennten Proteinen/Domänen/Segmenten, nach Wahl verbunden mit einem Bindeglied, das von einer bis zu 20 Aminosäuren enthält.

Der Ausdruck "kovalente Bindung" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf funktionelle Polypeptiddomänen, die mit einer Peptidbindung ans Polypeptidmaterial gebunden sind.

Der Ausdruck "komplementär" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Segmentes zur Bildung von Doppelwendeln, dass dieses mit einem anderen Segment zur Bildung von Doppelwendeln homo- beziehungsweise hetero-oligomerisiert.

Der Ausdruck "funktionelle Polypeptiddomäne" bezieht sich auf Moleküle, die irgendwelche funktionellen Eigenschaften ins Polypeptidmaterial einbringen, wie zum Beispiel Förderung des Zellwachstums, Vermehrungsinhibition von Bakterien, Differenzierung von Zeilen oder Bindung von Metall-Ionen. Die funktionelle Polypeptiddomäne kann gehören zu, aber ist nicht eingeschränkt auf: Wachstumsfaktoren, Mikrobenabweisende Peptide und Domänen zur Bindung von Metall-Ionen.

Der Ausdruck "Wachstumsfaktor" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf das Molekül, das sich an Zellenrezeptoren bindet und das Wachstum, die Vermehrung oder die Differenzierung der Zielzellen oder des Zielgewebes steuert. Beispiele von 15

Wachstumsfaktoren enthalten, aber sind nicht eingeschränkt auf: Epidermal-Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblast-Wachstumsfaktor (FGF), Neuronen-Wachstumsfaktor (NGF), Erythropoietin und andere; vorrangig NGF, vorrangig SEQ ID NO: 24.

Der Ausdruck "Mikroben-abweisendes Peptid" bezieht sich auf ein Breitband-Antibiotikum, das bakterientötend wirkt, aber auch durch Verursachen von Schäden an der Membrane, der Einflechtung in den Stoffwechsel oder dem Zielen von Zytoplasma-Komponenten auf Pilze oder Viruse einwirkt. Beispiele von Mikroben-abweis-enden Peptiden enthalten, aber sind nicht eingeschränkt auf: Kathelizidine und De-fensine; vorrangig das Kathelizidin LL-37, vorrangig SEQ ID NO: 16.

Der Ausdruck "Domänen zur Bindung von Metallen" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf Peptide, die Metalle binden können, einschließlich mit, aber nicht eingeschränkt auf, Ag, Au, Pd, Pt, was eine Mikroben-abweisende Wirkung hat. Die Domäne zur Bindung von Metallen ist vorrangig SEQ ID NO: 26, die aus 3 Abschnitten, fähig zur Trimerisierung, aufgebaut ist und Silber-Nanoteilchen bildet.

Die Erfindung schließt auch die Erkenntnis ein, dass Polypeptidmaterial, das auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält, kovalent an ein Polypeptidmaterial gebunden ist, dies kann auch eine Mischung (i) von Polypeptidmaterial sein, das mindestens ein Elastin-ähnliches Segment enthält und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln, und (ii) Polypeptidmaterial, das neben mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält.

Hinsichtlich der gewünschten Eigenschaften des Polypeptidmaterials kann die Mischung aus verschiedenen Verhältnissen aufgebaut sein, wobei Polypeptidmaterial, das neben mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält, weniger als 50 % der Mischung, spezifischer 20 % und am häufigsten 1-5 % ·*»· t « « t » ·

• I » · · «« · · I ···· · · « ··· • · * · ♦ · · » · t · * * · *« ·» * * · i · 16 der Mischung darstellt. Polypeptidmateriale können aufgrund der Molarität, Masse, des Volumens, usw. vermischt sein.

Solche heterogene Mischungen körnen vor homogenen Mischungen bestimmte Vorteile haben. Homogene Mischungen enthalten nämlich nur Polypeptidmaterial, das mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln enthält, was keine gewünschten Eigenschaften gewährleistet, wie die Förderung des Zellwachstums, Zelladhäsion, Wachstumshemmung von Bakterien, Zelldifferenzierung, Metall-Ionen-Bindungen, usw. Auf der anderen Seite aber bilden homogene Mischungen, die nur Polypeptidmaterial enthalten, das neben mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält, Material, das im Vergleich zum Polypeptidmaterial, das aus mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln aufgebaut ist, schwächer ist.

Um die gewünschten Eigenschaften von Polypeptidmaterial, das aus verschiedenen zugehörigen funktionellen Polypeptiddomänen aufgebaut ist, zu vereinen, schließt die Erfindung auch das Mischen mehrerer Polypeptidmaterialien mit verschiedenen zugehörigen funktionellen Domänen mit Polypeptidmaterialien, die keine Polypeptiddomänen enthalten, mit ein.

Polypeptidmaterial, das mit Verwendung von Peptid, das ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln enthält, zerlegt werden kann

Grundlage der Erfindung ist ebenso die Entdeckung, dass Polypeptidmaterial mit Zusatz von Peptid, das ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln enthält, zerlegt werden kann und ebenso im Polypeptidmaterial vorhanden ist.

Die Erfinder haben entdeckt, dass der Peptidzusatz, der ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln enthält und dem Segment zur Bildung von Doppelwendeln in Polypeptidmaterial ähnelt, ein Verfahren darstellt, mit welchem man erreicht, dass sich Po- 17 • · · » * t » « lypeptidmaterial zersetzt. Das zugesetzte Segment zur Bildung von Doppelwendeln wird wegen der Fähigkeit der Bildung von Oligomeren mit einem der Segmente zur Bildung von Doppelwendeln in Polypeptidmaterial in die Struktur des Polypeptidmaterials integriert, weswegen Polypeptidmaterial gelockert wird, was zu dessen Zersetzung führt.

Auf diese Weise können wir Zellen trennen, die auf Polypeptidmaterial des erwähnten Materials wachsen, ohne auf chemische Änderungen (z.B. pH, lonenstärke), physikalische Änderungen (z.B. lange Inkubationen bei höhen Temperaturen, osmotischer Schock) oder enzymatischen Abbau von Polypeptidmaterial zu greifen, was die Oberflächenrezeptoren und Adhäsionsmoleküle beeinflussen oder beschädigen oder bei Zellen Stress auslösen könnte. So gewonnene Zellen können gezählt, weiterverpflanzt oder für weitere biochemische Analysen oder technologische Applikationen verwendet werden.

Der Ausdruck "Peptid, das ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln enthält" bezieht sich in der Beschreibung auf ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln, wobei das Segment mit einem der Segmente zur Bildung von Doppelwendeln im Polypeptidmaterial zur Oligomerisierung fähig ist. Der Ausdruck "Segment zur Bildung von Doppelwendeln" bezieht sich auf Segmente zur Bildung von Doppelwendeln, die oben beschrieben sind.

Polypeptidmaterial, aufgebaut aus mindestens zwei verschiedenen Polypeptidmaterialien

Die Grundlage der Erfindung ist auch die Entdeckung des Polypeptidmaterials, was eine Kombination von mindestens zwei verschiedenen Polypeptidmaterialien ist. Zusammengesetztes Polypeptidmaterial wird mit Kombinieren zweier Polypeptidmaterialien vorbereitet, wobei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln aus einem der Materialien Hetero-Oligomere mit Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln im anderen Material bilden können. Die Erfinder haben entdeckt, dass die Hetero-Oligomeri-sierung von Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln aus einem Material mit Seg- • ·* I « « « ·· · • I« t « · * * 1* • I · « ««· * * · #· · a « « » « · · · 18 menten zur Bildung von Doppelwendeln aus einem anderen Material eine Art Steuerung des Beginns der Zusammensetzung des Polypeptidmaterials darstellt. Lösliches Polypeptidmaterial, das ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln enthält und zur Hetero-Oligomerisierung fähig ist, setzt sich nämlich nicht zusammen, wenn es in der Lösung das einzige Polypeptidmaterial darstellt. Die Bildung von Polypeptidmaterial kann möglicherweise erst mit Zusatz eines anderen Materials ausgelöst werden, das das Segment zur Bildung von Doppelwendeln enthält und mit dem Segment zur Bildung von Doppelwendeln aus dem ersten Material hetero-oligomerisiert, was ein Mechanismus zur gelenkten Zusammensetzung des Materials darstellt.

Zusammengesetztes Material enthält mindestens zwei Polypeptidmaterialien, es kann aber auch aus mehreren, auch bis zu zehn, häufiger aus zwei bis acht verschiedenen Polypeptidmaterialien, die sich auf die Erfindung beziehen, zusammengesetzt sein.

Protein, das Polypeptidmaterial zusammensetzt

Die Beschreibung bezieht sich aufs Protein des oben beschriebenen Polypeptidmaterials. Das Protein enthält mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln, wobei sich mindestens ein Elastin-ähnliches Segment zwischen zwei oder mehreren Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln befindet, und wobei einzelne Polypeptidmoleküle untereinander über Interaktionen unter Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln an diese Moleküle gebunden sind. Außerdem kann das Protein, das Polypeptidmaterial zusammensetzt, auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthalten, die auch Teil des Proteins sein kann. Wenn die funktionelle Polypeptiddomäne Teil des Proteins ist, das Polypeptidmaterial zusammensetzt, ist diese kovalent gebunden und kann nicht wegdiffundieren, was einen wichtigen Vorteil darstellt.

Die Erfindung bezieht sich aufs Protein, das vereinte Segmente zur Bildung von Doppelwendeln und eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält. Die Erfinder haben entdeckt, dass die funktionelle Polypeptiddomäne über Interaktionen der Segmente zur Bildung von Doppelwendeln mit komplementären Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln, die sich im Material befinden, ins Polypeptidmaterial integriert werden • » · Φ · · · Φ I * • |f · « * · * « * Φ I · * * * * · * Φ ·« »· · Φ φ · φ Φ « 19 kann. Auf diese Weise können dem Material funktionelle Eigenschaften hinzugefügt werden.

Segmente und Domänen des oben beschriebenen Proteins können wahlweise mit einem Bindeglied, das eine bis 20 Aminosäuren, bevorzugt eine bis 6 Aminosäuren, voneinander getrennt sein. Proteine können wahlweise eine Signalsequenz enthalten, die das Ausscheiden des Proteins und Aminosäure-Marker zur Reinigung und Detektion des Proteins lenkt.

Der in der Beschreibung angeführte Ausdruck "Bindeglied" bezieht sich auf kürzere Aminosäureabfolgen, deren Aufgabe nur das Trennen einzelner Proteindomänen bzw. -Segmente ist. Die Rolle des Bindegliedes, das nach Wahl ins Protein mit eingeschlossen werden kann, kann auch die Einbringung von Impfstellen für post-translatorische Modifikationen sein, einschließlich der Einbringung von Stellen für ein besseres Prozessieren. Die Länge des Bindegliedes ist nicht begrenzt, obwohl dieses für gewöhnlich bis zu 30 Aminosäuren lang ist, vorrangig eine bis 20 Aminosäuren, am häufigsten eine bis 6 Aminosäuren. Beliebige Aminosäuren können im Bindeglied mit eingeschlossen sein, vorrangig aber werden Aminosäuren gewählt unter, aber sind nicht eingeschränkt auf: Serin-, Glycin-, Threonin-, Prolin-, Valin- und Alaninreste, die nur über Segmente zur Bildung von Doppelwendeln oder über Elastin-ähnliche Domänen eine Flexibilität und eine spezifische intermolekulare Assoziation ermöglichen.

Der in der Beschreibung verwendete Ausdruck "Signalabfolge" bezieht sich auf die Aminosäureabfolge, die für die Lenkung des Proteins an eine bestimmte Stelle in der Zelle notwendig ist. Die Signalabfolge ist vom Gastgeberorganismus abhängig, in welchem sich das Fusionsprotein äußert. Die Aminosäureabfolge von Signalabfolgen ist Experten gut bekannt, ebenso auch, welche Signalabfolge in einem bestimmten Organismus funktionell ist.

Der Ausdruck "Aminosäure-Marker" bezieht sich auf Abfolgen von Aminosäuren, die dem Protein mit der Absicht hinzugefügt wurden, um die Reinigung, Isolierung oder Detektion des Proteins zu erleichtern. • * · 4 I » I * * · ···· >4 * I ·

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Die Stelle der Signalabfolge, der Bindeglieder und der Aminosäure-Marker ist optional, aber sie muss die funktionelle Äußerung des Proteins ermöglichen und die Funktion beibehalten, wegen welcher diese Aminosäureabfolgen ausgewählt wurden. DNA, die Protein von Polypeptidmaterial aufzeichnet

Die Erfindung bezieht sich auch auf die DNA, die Protein von Polypeptidmaterial, das mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln enthält, aufzeichnet, wobei sich mindestens ein Elastin-ähnliches Segment zwischen zwei oder mehreren Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln befindet, und wobei sich einzelne Polypeptidmoleküle untereinander über Interaktionen zwischen Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln an diesen Molekülen verbinden und optional mit einer funktionellen Proteindomäne verbunden sind, Segmente bzw. Domänen des Polypeptids aber sind optional mit einem Bindeglied miteinander verbunden. Das Protein enthält optional eine Signalabfolge und Aminosäure-Marker. Die Beschreibung bezieht sich auch auf DNA, die Protein von Polypeptidmaterial aufzeichnet, das vereinte Segmente zur Bildung von Doppelwendeln und funktionelle Polypeptiddomänen enthält, wobei Segmente und Domänen optional mit einem Bindeglied miteinander verbunden sind, das Protein aber enthält optional auch Signalabfolgen und Aminosäure-Marker.

Der in der Beschreibung verwendete Ausdruck "DNA" bezieht sich auf die Nukleotidabfolge im offenen Leserahmen, die das Protein aufzeichnet, welches Gegenstand der Erfindung ist, und operativ mit regulatorischen Elementen, einem Promotor und Terminator verbunden ist, was eine Äußerung des Proteins in Gastgeberzellen ermöglicht. Die Länge der DNA-Abfolge kann sehr unterschiedlich sein, was vom einzelnen Protein abhängt.

Der in der Beschreibung verwendete Ausdruck "regulatorische Elemente" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf die DNA-Region im Expressionsvektor, wohin sich regulatorische Proteine binden, wie z.B. Transkriptionsfaktoren, und Genäußerungen steuern. »··* ··· · · * • · · · * » * * · · I · · * · « * ··· 21

Der in der Beschreibung verwendete Ausdruck "Promotor" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf die DNA-Region im Expressionsvektor, der eine Kopie des Zielgens ermöglicht. Der Promotor-Typ hängt vom Gastgeberorganismus, in dem das Gen geäußert wird, ab. Im Falle einer Äußerung in Prokaryoten, z.B. E.coli, ist die Verwendung mehrerer Promotoren möglich, z.B. Plac, PT5 , vorrangig wird PT7 verwendet. Im Falle einer Äußerung in Eukaryoten, z.B. in Säugetierzellen, stammen Promotoren am häufigsten von Viren ab, wie z.B. PCMV oder PSV40.

Der in der Beschreibung verwendete Ausdruck "Terminator" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf die Abfolge, die das Ende des zu kopierenden Gens markiert. Der Terminator-Typ hängt vom Gastgeberorganismus, in dem das Gen geäußert wird, ab. Im Falle einer Äußerung in Prokaryoten, z.B. E.coli, kann der Terminator aus dem Bakteriophage T7 verwendet werden.

Rekombinante Nukleinsäure

Die Erfindung basiert auf Standardmethoden der Molekularbiologie, die Experten auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind (siehe Sambrook et al. 1989. Molecular Clon-ing: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, NY, Ausubel et al. Current Pro-tocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., NY).

Die beschriebenen Proteine für Polypeptidmaterial können mit Äußerung der DNA, die diese Proteine in einem angemessenen Gastgeberorganismus verzeichnet, synthetisiert werden. DNA, die Proteine verzeichnet, wird in einen entsprechenden Expressionsvektor eingesetzt. Entsprechende Vektoren schließen mit ein, sind aber nicht eingeschränkt auf: Plasmide, Virusvektoren, usw. Expressionsvektoren, die mit Zellen des Gastgeberorganismus kompatibel sind, sind Experten auf dem Gebiet gut bekannt und enthalten entsprechende Kontrollelemente zur Transkription und Übersetzung der Nukleotidabfolge. Üblicherweise schließt ein Expressionsvektor eine Expressionskassette ein, die in 5' gegen 3' Richtung aus einem Promotor, einer Kodierabfolge fürs Fusionsprotein, das operativ mit regulatorischen Elementen, einem Promotor und ei- nem Terminator verbunden ist, einschließlich mit dem Stopcodon für die RNA Polymerase und einem Polyadenylation-Signal für die Polyadenylation zusammengesetzt ist.

Der Expressionsvektor kann zur Äußerung in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen vorbereitet werden. Ein Beispiel von prokaryotischen Zellen sind Bakterien, z.B. Escherichia coli. Gemäß der Erfindung werden prokaryotische Zellen zur Gewinnung einer genügenden Menge an Nukleinsäure verwendet. Der Expressionsvektor enthält üblicherweise Kontrollelemente, die operativ mit der DNA der Erfindung, die die Aufzeichnung für Proteine trägt, verbunden sind. Kontrollelemente werden so gewählt, dass sie eine wirkungsvolle und Gewebe-spezifische Äußerung auslösen. Der Promoter kann konstitutiv oder induzierbar sein, abhängig vom gewünschten Äußerungsmuster. Der Promotor kann einem Gastgeberorganismus abstammen oder aber ist fremder Abstammung (befindet sich in Zellen, wo wir diesen verwenden), er kann natürlich oder synthetisch sein. Der Promotor muss so ausgewählt sein, dass er in Zielzellen des Gastgeberorganismus wirkt. Außerdem sind auch Signale für den Beginn und eine wirkungsvolle Translation des Fusionsproteins - ATG und zugehörige Abfolgen, mit eingeschlossen. Wenn der in dieser Erfindung verwendete Vektor zwei oder mehr Leserahmen einschließt, müssen diese unabhängig mit den Kontrollelementen verbunden sein. Die Kontrollelemente aber können gleich oder aber verschieden sein, abhängig von der gewünschten Produktion von Proteinen.

Beispiele von bakteriellen Expressionsvektoren enthalten, aber sind nicht eingeschränkt auf: pET-Vektoren, pRSET-Vektoren und andere. Wenn Vektoren in bakteriellen Zellen verwendet werden, sind die Kontrollelemente bakterieller Herkunft.

Beispiele von Säugetier-Expressionsvektoren für Säugetierzellen enthalten, aber sind nicht eingeschränkt auf: pcDNA (Invitrogen), pFLAG (Sigma) und andere. Wenn Vektoren in Säugetierzellen verwendet werden, stammen die Kontrollelemente in den meisten Fällen von Viren ab, aus z.B. dem Adenovirus 2, dem Cytomegalovirus, dem Virus Simian Virus 40. 23

Gastgeberorganismus

Die Erfindung bezieht sich auch auf den Gastgeberorganismus, der die oben beschriebenen Proteine äußert.

Der Ausdruck "Gastgeberorganismus" bezieht sich auf den Organismus, in welchen die DNA, die Protein verzeichnet um sich dort zu äußern, eingesetzt wurde. Die Einschleusung von Vektoren in Gastgeberorganismen wird über konventionelle Methoden ausgeführt, die Experten auf diesem Gebiet bekannt sind. Diese Methoden sind: Transformation, Transfektion, einschließlich: chemische Transformation, Elektropora-tion, Mikroinjektion, DNA Lipofektion, Sonizierung von Zellen, Mikrobombardierung, DNA Viruseinbringung und andere. Gemäß der Erfindung wird die DNA mit Transformation in bakterielle Zellen eingebracht.

Der Gastgeberorganismus kann pro- oder eukariotisch sein. Eukariotische Zellen, geeignet zur Äußerung des Fusionsproteins, sind nicht auf die Verwendung eingeschränkt, solange die Zelllinien mit den Methoden der Propagation des Expressionsvektors und mit der Äußerung des Fusionsproteins kompatibel sind. Bevorzugte eukariotische Zellen schließen ein, sind aber nicht eingeschränkt auf: Hefepilze, Pilze, Pflanzenzellen und Säugetierzellen, wie: Mäuse-, Ratten-, Affen- oder Menschen-Fibroblastzellen.

Gemäß der Erfindung kann jeder beliebige bakterielle Gastgeber zur Äußerung der DNA verwendet werden. Zur Äußerung von Proteinen dieser Erfindung eignet sich die Verwendung von Bakterien oder Hefepilzen am besten. Das Protein kann sich in Bakterien E. coli oder B. subtilis oder in Hefepilzen S. cerevisiae oder P. pastoris äußern. Die Präferenzbakterie ist E. coli. Die Erfindung bezieht sich auf Bakterien oder Hefepilze, die Protein äußern, vorrangig auf Bakterien E. coli oder Hefepilze P. pastoris.

Produktion des Proteins/Prozess zur Vorbereitung von Polypeptidmaterial Die Erfindung bezieht sich auch auf den Prozess der Produktion von Polypeptidmaterial und schließt die Einschleusung der DNA ein, die das Protein des Polypeptidmaterials in den Gastgeberorganismus, die Kultivierung des Gastgeberorganismus bei ge- t « » · ·*» ··· « · · · » i Λ « V * 24 eigneten Bedingungen zur Expression des Proteins, die Isolierung des Proteins und die Exponierung des Proteins an spezifische Bedingungen mit der Absicht einer Bildung von Polypeptidmaterial aufzeichnet.

Fusionsprotein kann im Gastgeberorganismus, der heterologe Nukleinsäure äußert, die Fusionsprotein verzeichnet, synthetisiert werden. Fusionsprotein dieser Erfindung wird zur Vorbereitung von Polypeptidmaterial verwendet. Das Fusionsprotein kann durch eine Signalabfolge, die in der Nukleinsäure kodiert ist, verbunden sein.

Im Allgemeinen ist die heterologe Nukleinsäure in den Expressionsvektor eingeschlossen (Virus oder kein Virus), was oben beschrieben ist.

Die Erfindung umfasst Gastgeberzellen oder -Organismen, die Nukleinsäure enthalten (vorübergehend oder stabil), die die Aufzeichnung für die oben beschriebenen Fusionsproteine trägt. Geeignete Gastgeberorganismen sind Experten auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt und schließen bakterielle und eukariotische Zellen ein.

Die Einschleusung von Vektoren in Gastgeberzellen wird, wie oben beschrieben, auf konventionelle, bekannte Methoden durchgeführt.

Die Einschleusung der DNA kann vorübergehend oder stabil sein. Eine vorübergehende Äußerung bezieht sich auf die Einschleusung des DNA Vektors, der nicht ins Genom der Zelle eingeschleust wird. Eine stabile Einschleusung wird durch die Einschleusung der DNA ins Gastgebergenom erreicht. Eine DNA-Übertragung, besonders bei der Vorbereitung des Gastgeberorganismus mit einer stabilen DNA-Inte-gration, kann mit Anwesenheit von Markern beaufsichtigt werden. DNA, die Marker aufzeichnet, bezieht sich auf die Widerstandskraft im Stoff, z.B. Antibiotika, und kann im Vektor, der Gene für Fusionsproteine enthält, oder in einem separaten Vektor, eingeschlossen sein.

Das Protein wird in einem entsprechenden Gastgeberorganismus geäußert. Eine Expression großer Mengen von Fusionsprotein kann man bei Bakterien, wie E. coli, und « f » · · I» « 4« • · · I ·*· Ift» « « « · * · « · f * · ·« * · «« ·· * · *· 25 bei Hefepilzen P. Pastoris erreichen; außerdem können Kulturen von Säugetierzellen für die Produktion von geringeren Proteinmengen verwendet werden, wenn post-translatorische Modifikationen für eine richtige Stapelung und Funktion wichtig sind.

Es ist bekannt, dass Protein in Zellen folgender Organismen geäußert werden kann: Mensch, Nagetier, Rind, Schwein, Geflügel, Hasen, u.ä. Gastgeberzellen können als primäre oder als unsterbliche Linien kultiviert werden. Die Äußerung der Fusionsproteine kann konstitutiv oder induzierbar sein, z.B. die Äußerung des Proteins kann durch den Zusatz des Induktors IPTG, der wegen der Bindung des Lac-Repressors die Expression des gewünschten Proteins auslöst, aktiviert werden. Das Fusionsprotein kann in löslicher Fraktion oder aber in Inklusionskörpern geäußert werden.

Techniken zur Reinigung des Proteins schließen Chromotographie mit Trennung nach Größe, lonen(austausch)chromotographie, Chromotographie mit Umkehrphase und Affinitätschromotographie ein, wenn Proteine oder befestigte Markierungen spezifisch mit einer Reinigungskolonne reagieren. Diese Techniken sind Experten dieses Gebietes bekannt.

Zusammensetzungen von Polypeptidmaterial erreichen wir unter günstigen Bedingungen, die über Segmente zur Bildung von Doppelwendeln eine Verbindung von Elastin-ähnlichen Segmenten ermöglichen. Wenn Polypeptidmaterial aus einer einzigen Proteinart zusammengesetzt ist, finden wir geeignete Bedingungen durch Prüfung der Löslichkeit und der sekundären Struktur des löslichen Proteinteils, und besonders noch des Präzipitats in Puffer mit unterschiedlichem pH (normalerweise von pH 3 bis pH 9), der lonenstärke, organischen Lösemitteln (z.B. DMSO, Acetonytril, Trifluoro-Äthanol). Wichtige Faktoren bei der Selbstzusammensetzung sind die Konzentration des Fusionsproteins und die Temperatur. Polypeptidmaterial wird gebildet, wenn die Konzentration des Proteins zwischen 0.1 mg/mL und 20 mg/mL liegt, normalerweise von 0.5 bis 10 mg/mL. Die Selbstzusammensetzung von Polypeptidmaterial kann auch durch Erhitzung des Präzipitats des Fusionsproteins über die niedrigste Schmelzpunkt-Temperatur, der eine langsame Abkühlung folgt, aktiviert werden. « «

Wenn Polypeptidmaterial aus mehreren verschiedenen Fusionsproteinen zusammengesetzt wird, beginnt die Selbstzusammensetzung normalerweise, wenn man Proteine in einem geeigneten molaren Verhältnis in für die Selbstzusammensetzung günstigen Bedingungen vermischt.

Das Protein des Polypeptidmaterials, das mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln enthält, kann man in unterschiedlichen Verhältnissen mit dem Protein mischen, das auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält. Hinsichtlich der gewünschten Eigenschaften des Polypeptidmaterials kann die Mischung aus verschiedenen Verhältnissen vorbereitet sein, wobei das Protein, das neben mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält, weniger als 50% der Mischung, spezifischer 20% und am häufigsten 1-5 % der Mischung darstellt. Mit dem Mischen von zwei Proteinen, wobei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln eines Proteins Hetero-Oligomere mit Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln eines anderen Proteins bilden, kann der Beginn der Entstehung von Polypeptidmaterial gesteuert werden.

Protein, das eine funktionelle Polypeptiddomäne, vereint mit dem Segment zur Bildung von Doppelwendeln, das dem Segment zur Bildung von Doppelwendeln in Polypeptidmaterial komplementär ist, enthält, kann dem Polypeptidmaterial genauso hinzugefügt werden.

Durch die Inkorporation der funktionellen Teile, die mit den Segmenten zur Bildung der Doppelwendel vereint sind, können dem Polypeptidmaterial funktionelle Eigenschaften hinzugefügt werden. Mit Hinzufügung von Peptiden, die sich aus Segmenten zur Bildung der Doppelwendel zusammensetzen, die in einem von zwei Materialien, die Polypeptidmaterial zusammensetzen, vorhanden sind, kann eine Zersetzung von Polypeptidmaterial, das eine einfache Gewinnung von Zellen aus dem Material ermöglicht, erreicht werden. 27

Anwendung des Polypeptidmaterials

Die Erfindung bezieht sich auch auf mögliche Anwendungen des Polypeptidmaterials. Die Basis ist Polypeptidmaterial als Material/pharmazeutisches Präparat für Zell-, Gewebe- oder Organswachstum, Zelldifferenzierung, Zellreparatur, Zellreprogrammie-rung, zytotoxische Funktion, für medizinisches und pharmazeutisches Material für lebende menschliche bzw, tierische Gewebe, zur Wachstumsvorsorge von Pathogenen anwenden zu können.

Der Ausdruck "Wachstum" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf die Entwicklung von Zellen/Gewebe/Organe und die Zellteilung. Die dargestellte Erfindung bietet eine Umgebung zur Kultivierung jedes Zelltyps, einschließlich mit, aber nicht eingeschränkt auf: Zellen glatter Muskeln, Fibroblaste, Keratinozyten, Epithel-, Immun- und Endothelzellen. Polypeptidmaterial bildet die natürliche Umgebung von Zellen nach - extrazelluläre Matrix, denn es schließt ein Netz von Elastin-ähnlichen Segmenten ein. Zellen, Gewebe und Organe können auf der Oberfläche des Polypeptidmaterials kultiviert werden, außerdem können sich die Zellen in dessen Struktur verbreiten oder im Falle, dass das Material eine dreidimensionale Struktur bildet, ins Material selber migrieren.

Zellen, Gewebe und Organe können auf Polypeptidmaterial kultiviert werden, die den physiologischen Bedingungen ähnlich sind so wie diese in einem geeigneten Behälter für Zellkulturen kultiviert werden können. Abhängig von der Zellproliferation, deren Zahl und Dichte, was vom Zelltyp und dem Anwendungszweck abhängt, können Zellen auf Polypeptidmaterial entsprechend lang kultiviert werden.

Im Falle einer Zellkultivierung auf Polypeptidmaterial, das zusätzlich mindestens eine oder mehrere Kombinationen, üblicherweise 2 bis 10, funktioneller Polypeptiddomänen enthält, gehören Folgende, sie sind aber nicht darauf eingeschränkt: Wachstumsfaktoren, Moleküle für die Zelladhäsion, Molekül Chemotaxis, Ligand-Rezeptoren, Mik-roben-abweisende Peptide, Faktoren für die Reprogrammierung, Faktoren für die Zelldifferenzierung, zytotoxische oder zytostatische Polypeptide, wie z.B. der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), fibroblaste Wachstumsfaktoren, neuronale Wachs- tumsfaktoren (NGF), speziell SEQ ID NO: 24, Mikroben-abweisende Peptide wie Ka-thelizidine und Defensine; vorrangig das Kathelizidin LL-37, vorrangig SEQ ID NO: 16.

Ein Hinzufügen von funktionellen Polypeptiddomänen ist also nicht notwendig, denn diese ist schon ans Polypeptidmaterial, auf welchem Zellen wachsen, gebunden, was einen großen Vorteil bedeutet. Wie schon erwähnt, besteht auch die Möglichkeit Polypeptidmaterial mit verschiedenen funktionellen Polypeptiddomänen in unterschiedlichen Verhältnissen zu mischen, was eine Gewährleistung der gewünschten Eigenschaften für das optimale Zellwachstum ermöglicht und fast unzählige mögliche Kombinationen bietet.

Der Zusatz von Peptiden, die ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln, inkorporiert in Polypeptidmaterial, darstellen, kann zur Zersetzung des Materials führen, was die Möglichkeit einer sanften Entfernung von Zellen darstellt, die man danach zählen, weiterverpflanzen oder in der weiteren biochemischen Analyse oder verschiedenen technologischen Applikationen anwenden kann. Im Gegensatz zu den bekannten Methoden, die biochemische und physikalische Veränderungen oder die Zersetzung von Enzymen einschließen. Das erwähnte Verfahren beeinflusst oder beschädigt Moleküle auf der Zelloberfläche nicht oder verursacht den Zellen keinen Stress.

Polypeptidmaterial kann als Material zu medizinischen und pharmazeutischen Zwecken, zur Heilung von Lebendgewebe, vor allem menschlichem und tierischem Gewebe, angewandt werden.

Polypeptidmaterial mit oder ohne auf Oberflächen wachsenden Zellen oder Gewebe kann als Material zur Behandlung zahlreicher Verletzungen oder Gewebekrankheiten angewandt werden und man kann es mit chirurgischen oder anderen entsprechenden Eingriffen in den Körper verpflanzen.

Der Ausdruck "Behandlung" hat eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich in der Beschreibung aufs Verfahren zur Fehlerbehebung von geschädigtem oder verletztem menschlichem oder tierischem Gewebe mit Anwendung von Polypeptidmaterial. ···* · * · · · * • · · * * * * » * * t · · i ··· · · » • # « ·· * · · · «ft « ·« v» *0 «ft ♦ ♦ « * 29

Der Ausdruck "Vorbereitung von medizinischem und pharmazeutischem Material“ bezieht sich auf Verfahren, denen wir uns bedienen um Polypeptidmaterial in einer solchen Form zu regeln beziehungsweise es in einem solchen Zustand vorzubereiten, damit es z.B. als Ersatz für verletztes Gewebe, als Prothese oder als pharmazeutisches Material, wie z.B. Hüllen zur Behandlung von Wunden und Brandwunden, angewandt werden kann.

Das beschriebene Polypeptidmaterial ruft minimale oder kaum wahrnehmbare Immun-bzw. Entzündungsreaktionen hervor. Im Allgemeinen kann das in der Erfindung beschriebene Polypeptidmaterial in jeder Situation, die Verletzungen oder geschädigtes Gewebe betrifft, was Folge einer Operation, eines Traumas, Tumors, einerdegenerativen oder anderen Krankheit bzw. Zustandes ist, angewandt werden. Polypeptidmaterial kann zur Reperatur natürlicher elastischer Systeme angewandt werden, besonders jenen, in welchen Elastin und Tropoelastin enthalten sind, durch das Ersetzen des geschädigten Systemteils, wie z.B. Bänder, Sehnen, Blutgefäßwände, u.ä., mit Polypeptidmaterial. Polypeptidmaterial kann auch operativ an die Stelle eines geschädigten oder fehlenden vaskulären Materials in Menschen oder Tiere verpflanzt werden, und ist somit als vaskulärer Ersatz beziehungsweise zum Schließen von Verletzungen anwendbar. Polypeptidmaterial ist für eine erneute Herstellung der strukturellen und/oder funktionellen Integrität des Gewebes anwendbar.

Zellen, die sich auf dem Polypeptid material vermehrt/differenziert haben, können aus der Struktur entfernt und weiter in Behältern für Zellkulturen in vitro kultiviert werden. Später können wird diese dem Individuum weitervermitteln und sie als Ersatzgewebe oder -organe anwenden.

Die Anwendung von Polypeptidmaterial, das auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält, z.B. Wachstumsfaktoren für die Behandlung von lebendem menschlichem o-der tierischem Gewebe, hat vor Behandlungen mit Anwendung von Wachstumsfaktoren in löslicher Form bestimmte Vorteile. Lösliche Wachstumsfaktoren können ungewünschte Wirkungen aufweisen, besonders in vivo wie z.B. Wachstumsstimulation 30 * · von Zellen, die gegen Zielzellen antreten, weswegen diese Zellen Zielzellen durchwachsen, oder Diffusion in den Blutfluss und Äußerung neuer Effekte an anderen Stellen. Mit Zusatz einer funktionellen Polypeptiddomäne zum Polypeptidmaterial erzielen wir eine lokale Wirkung der funktionellen Domäne auf Zielzellen. Das beschriebene Material bietet eine mögliche Weise der Wachstumsinhibition von unerwünschtem Gewebe mit lokaler zytotoxischer oder zytostatischer Wirkung an der Anwendungsstelle, vor allem, aber nicht beschränkt auf Krebsgewebe u.ä.

Wenn Epithelzellen mit der Absicht einer Rekonstruktion eines Epidermisteils aufgesetzt sind, kann Polypeptidmaterial für die Transplantation auf den Empfänger als Hautgrundlage dienen. Polypeptidmaterial ist auch für die Konstruktion von Prothesen, die Menschen-ähnliches Elastin enthalten, anwendbar, z.B. Röhrchen als Ersatz für Blutgefäße und Hüllen zur Behandlung von Wunden und Brandwunden. Eine Prothese kann zum dauerhaften Gewebeersatz werden, denn Zellen des Patienten, einschließlich der Endothelzellen, dringen ins Polypeptidmaterial ein. Polypeptidmaterial kann auch zur Abdeckung von Oberflächen irgendeines Prothese-Typs angewandt werden, auch Prothesen aus synthetischen Materialien und/oder Metallen.

Der Ausdruck "Prothese" bezieht sich auf jedes in den Körper eingepflanzte Material, einschließlich des Ersatzes für Blutgefäße, Herzklappen oder Materialflicken. Es kann auch als Hülle, die die Behandlung von Wunden und Brandwunden anregt, angewandt werden.

Die Vorleger haben auch entdeckt, dass Polypeptidmaterial, wenn es neben mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln auch eine funktionelle Polypeptiddomäne enthält, das ein Mikro-ben-abweisendes Peptid darstellt, wie Kathelizidine und Defensine; vor allem das Ka-thelizidin LL-37, besonders SEQ ID NO: 16, oder eine Domäne zur Metallbindung, besonders SEG ID NO: 26, die Silber-Nanoteilchen bildet, auch für die Wachstumshemmung von Pathogenen anwendbar ist. Der Vorteil von Mikroben-abweisenden Peptiden und Metallen, vor allem Silber, ist in deren breiten Spektrum der Mikrobenabweisenden Funktion. 31

Der in dieser Beschreibung verwendete Ausdruck "Pathogene" bezieht sich auf häufige Bakterien, Pilze, Hefepilze und Viren, die Krankheiten erzeugen. Vor allem bezieht er sich auf häufige bakterielle Krankheitserreger wie, sie sind aber nicht darauf beschränkt, ein Gramm positiver Bakterien S. aureus, S. pyogenes, S. pneumonia, und ein Gramm negativer Bakterien H. influenzae, K. pneumoniae, L. pneumophila, P. aeruginosa, E. coli.

Infektionen treten oft häufig als Folge irgendwelcher Eingriffe ins Gewebe auf. In Hinsicht darauf, dass Polypeptidmateria! als Ersatz für geschädigtes oder beschädigtes natürliches elastisches Gewebe angewandt und es in den Empfänger eingepflanzt werden kann, stellt es einen bestimmten Vorteil dar, wenn Polypeptidmaterial auch das Wachstum von Pathogenen hemmt und somit eine mögliche Infektion lindert oder vorbeugt. Außerdem ist Polypeptidmaterial auch für die Konstruktion von Prothesen anwendbar, z.B. von Röhrchen als Ersatz für Blutgefäße oder Hüllen für andere Anwendungen wie die Behandlung von Wunden und Brandwunden, wie dies schon erwähnt wurde, oder fürs Abdecken von Protheseoberflächen. Prothesen stellen für den Patienten wegen der Entwicklung von Biofilmen oft eine Gefahr dar, was zu vielen für Menschen gefährliche Infektionen führen kann, einschließlich der Infektionen, die durch z.B. P. aeruginosa und S. aureus herbeigeführt werden, zwei Bakterien, die man oft in Biofilmen und auch bei Brandwundeninfektionen findet. Die in diesem Kontext beschriebene Erfindung stellt eine Möglichkeit zur Linderung und Vorbeugung von Infektionen dar, die durch auf Prothesen und Brandwunden anwesende Pathogene verursacht werden.

In Hinsicht darauf, dass Silber nicht selektiv und in kleinen Mengen außerordentlich aktiv ist, haben die Vorleger entdeckt, dass Polypeptidmaterial, das eine Domäne zur Metallbindung enthält, vor allem SEG ID NO: 26, Silber-Nanoteilchen bildet und ein besonders verheißungsvolles Material für die Wachstumshemmung von Pathogenen darstellt, besonders anwendbar fürs Bandagieren von Wunden und für Prothesen. • · • « « · · « * · * «··· I « I ·* • « · · · · · · · · 32

Um die Erfindung zu illustrieren sind unten Beispiele von Verfahren angeführt. Die Beschreibungen der Beispiele beabsichtigen keine Beschränkung der Erfindung und sollten als Vorführung verstanden werden.

Beispiele der Verfahren

Beispiel 1: Vorbereitung des DNA-Konstruktes

Das hier beschriebene Polypeptidmaterial wurde so konstruiert, dass es Elastin-ähnliche Segmente, Segmente zur Bildung von Doppelwendeln sowie funktionelle Domänen vereint. Aminosäureabfolgen von Segmenten zur Bildung von heterodimeren parallelen Doppelwendeln (SEQ ID: 10, SEQ ID: 12, SEQ ID: 28, SEQ ID: 30; SEQ ID: 32, SEQ ID: 34, SEQ ID: 36, SEQ ID: 38) wurden aufgrund von Tatsachen über die Zusammensetzung von Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln konstruiert, die Experten auf diesem Gebiet bekannt sind, mit der Absicht die Spezifitäten der Interaktionen zwischen den Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln zu erhöhen. Die Aminosäureabfolge der Segmente zur Bildung von homodimeren parallelen Doppelwendeln wurde dem Peptid GCN4 entnommen (SEQ ID: 14). Die Trimerisationsab-folge zur Bildung der Doppelwendel AEA (SEQ ID: 26), die Silber-Nanoteilchen bildet, wurde aufgrund der Tatsachen über die Zusammensetzung von Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln konstruiert, die Experten auf diesem Gebiet bekannt sind, und zwar mit Wiederholung von drei Segmenten, die sich in einen stufenförmigen Heterotrimer vereinen und an den Stellen der Heptade b, c und f Doppelwendeln von Aminosäureresten Ala (b), Ala (c) und Glu (f) haben.

Elastin-ähnliche Segmente wurden aus Wiederholungen des Pentapeptids ausgewählt (SEQ ID: 18).

Die für dieses Beispiel ausgewählten funktionellen Domänen sind: der neuronale Wachstumsfaktor (SEQ ID: 24), das Mikroben-abweisende Peptid LL-37 (SEQ ID: 16). Sie wurden aus den natürlichen Proteinabfolgen bei Nagetieren und Menschen ausgewählt.

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Fusionsproteine können eine Signalabfolge zur Lokalisierung des Proteins und eine Peptide-Markierung zur Detektion oder Reinigung des Proteins einschließen. DNA-Anfolgen, optimisiert für die Expression des Proteins im gewünschten Gastgeber (E.coli), wurden aufgrund von Aminosäureabfoigen und mit Hilfe des Programms Gene Designer DNA2.0 Inc. Version 1.0.0.1 (DNA2.0 Headquarter 1430 O’Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, USA) konstruiert. DNA-Abfolgen wurden bei MR.Gene GmbH (Im Gewerbepark B32, D-93059 Regensburg) bestellt und mit Rest-riktionsendonukleasen herausgeschnitten. Die LL-37 DNA-Abfolge wurde dem Plasmid mit offenem Leserahmen des Klons der Art Homo sapiens Cathelizidin des Mikro-ben-abweisenden Peptids (CAMP) entnommen. Ein Teil des Gens, der LL-37 kodiert, wurde mit PCR multipliziert. DNA-Konstrukte und zugehörige Fusionsproteine werden in Tabelle 1 beschrieben. Detaillierte Beschreibungen und Funktionen einzelner DNA- und/oder Proteinprodukte werden in Tabelle 2 beschrieben. Alle DNA-Konstrukte haben vor dem Histidinzeichen einen Startcodon (ATG). Die Konstrukte wurden mit einem hohen Expressionsgrad der Pepid-Sequenz, angeschlossen ans Protein der Ketosteroid-Isomerase, im Vektor pET-31b(+) geklont. Die Expressionskassette enthält in Richtung 5' gegen 3' den Promotor T7, die verschlüsselte Abfolge KSI und eine multiple Klonstelle fürs Fusionsprotein und den Terminator T7. Diese regulatorischen Elemente ermöglichen die Äußerung des Proteins in prokariotischer Zelllinie E. coli, die die T7 RNA Polymerase äußert. DNA-Konstrukte wurden mit der Anwendung von Methoden der Molekularbiologie vorbereitet, die im Handbuch der Molekularbiologie beschrieben sind (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cioning: A laboratory manual. 2nd ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1659 S.). Plasmide, Konstrukte und Zwischen kon st rukte wurden anhand chemischer Transformation in Bakterien E. coli DH5a oder BL21 (DE3) pLysS eingebracht. 34

Fusionsproteine, die den konstruierten DNA-Konstrukten zugehören, sind im Allgemeinen aus mindestens einem Elastin-ähnlichen Segment und mindestens zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln zusammengesetzt, außerdem enthalten sie optional auch eine funktionelle Polypeptiddomäne (z.B. NGF und/oder LL-37). Die KSI-DP-Domäne ermöglicht die Expression von Proteinen in Einschlusskörpern und die saure Spaltung in Aspartat-Prolin-Verbindungen (DP).

Tabelle 1: Fusionsproteine, angewandt zur Vorführung der Erfindung

Nukleotid/

Nr. Name Aufbau des Konstrukts Aminosäure abfolge Plasmid 1 KSI-DP-Histag-LL37- ELST-GCN-ELST DP-Hista-LL37-ELST-GCN-ELST -T7t SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 2 pET-31b(+) 2 KSI-DP-Histag-LL37-ELST-GCN-P2-ELST -NGF DP-Hista-LL37-ELST-GCN-P2-ELST-NGF -Th SEQ ID NO: 3/ SEQ ID NO: 4 pET-31b(+) 3 PI synthetisch SEQ ID NO: 9/ SEQ ID NO: 10 4 P2 synthetisch SEQ ID NO: 11/ SEQ ID NO: 12 5 KSl-DP-His(ag-LL37-ELST-GCN- Pl-ELST DP-Hista-LL37-ELST-GCN-Pl-ELST -T7, SEQ ID NO: 5/ SEQ ID NO: 6 pET-31b(+) 6 KSI-DP-HiStag-LL37-ELST-GCN- P2-ELST DP-His,a-LL37-ELST-GCN-P2-ELST -T7, SEQ ID NO: 7/ SEQ ID NO: 8 pET-31b(+) 7 KSI-DP-His,ag-ELST -GCN-P2-ELST-AEA DP-Hisla-ELST-GCN-P2- ELST-AEA-T7t SEQ ID NO: 19/ SEQ ID NO: 20 pET-31b(+)

Tabelle 2: Liste von Genen, Funktionen und der Zahlen aus der Datenbank sowie Aminosäure/Nukleotidabfolge, die eine Grenze der angewandten Genteile darstellt. 35

Name des Gens Swiss Prot Nr. Nukleotid abfolge Aminosäureabfolge Funktion T7p Promoter T7t Terminator Histag HHHHHH Aminosäure-Marker KSI P00947 SEQ ID NO: 21 AK:1-125 (SEQ ID NO: 22) Ketosteroid-Isomerase DP - GATCCT DP Dipeptid Aspartat-Prolin Segment zur Bildung ei- PI " SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 ner Doppelwendel, die Heterodimer mit P2 bildet Segment zur Bildung ei- P2 “ SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 ner Doppelwendel, die Heterodimer mit PI bildet GCN - SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 Segment zur Bildung einer Doppelwendel LL37 P49913 SEQ ID NO: 15 AK: 134-170 SEQ ID NO: 16 Mikroben-abweisendes Peptid ELST SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 Elastin-ähnliches Segment NGF PO1139 SEQ ID NO: 23 AK: 19-241 (SEQ ID NO: 24) Beta-Neuronen-Wachstumsfaktor (Beta-NGE) - von Mäusen AEA - SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 Domäne zur Bildung von Silber-Nanoteilchen Segment zur Bildung ei- P3 - SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 ner Doppelwendel, die Heterodimer mit P4 bildet Segment zur Bildung ei- P4 - SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 ner Doppelwendel, die Heterodimer mit P3 bildet Segment zur Bildung ei- P5 - SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 ner Doppelwendel, die Heterodimer mit P6 bildet Segment zur Bildung ei- P6 - SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 ner Doppelwendel, die Heterodimer mit P5 bildet Segment zur Bildung ei- P7 - SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36 ner Doppelwendel, die Heterodimer mit P8 bildet Segment zur Bildung ei- P8 " SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38 ner Doppelwendel, die Heterodimer mit P7 bildet

Beispiel 2: Herstellung des Fusionsproteins, zusammengesetzt aus Elastin-ähnlichem Segment und Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln, dem Mikrobenabweisenden Peptid und NGF

Es wurden mehrere Konstrukte vorbereitet, um die Möglichkeit der Herstellung von Fusionsproteinen zu beweisen, die in Tabelle 1 (SEQ IN Nr. 1,2, 5, 6) angeführt sind.

Plasmide mit Aufzeichnungen (im offenen Leserahmen) für Fusionsproteine, die in Tabelle 2 angeführt sind, wurden mit chemischer Transformation in die kompetenten E. coli BL21 (DE3) der pLysS-Zelle eingebracht. Ausgewählte Bakterienkolonien, die auf LB-Platten mit ausgewähltem Antibiotikum (Ampicilin) gewachsen sind, haben wir in 10 ml flüssige LB-Kulturen mit zugesetztem ausgewähltem Antibiotikum durchimpft. Nach einigen Stunden Wachstum bei 37°C haben wir 10-100 _Lder Kulturin 100 mL ausgewähltes Wachstumsmedium durchimpft, das danach über Nacht bei 37°C geschüttelt wurde. Am nächsten Tag haben wir die Kultur 20- bis 50-mal verdünnt, womit eine OD600 der verdünnten Kultur zwischen 0.1 und 0.2 erreicht wurde. Kulturenbehälter mit 500 ml der verdünnten Kultur wurden an der Schüttelmaschine angebracht, die Bakterien wurden kultiviert bis OD600 0.6 0.8 erreicht hat. Die Expression des Proteins haben wird mit Zusatz des Induktors IPTG induziert (0.4 mM oder 1 mM).

Vier Stunden nach der Induktion haben wir die Brühe zentrifugiert, Bakterienzellen im Lysinpuffer resuspendiert (Tris pH 8.0, 0.1 % Deoxycholat mit hinzugefügter Mischung von Proteaseinhibitoren) und mindestens über Nacht auf -80°C eingefroren. Die aufgetaute Zellen-Suspension haben wir weiter mit Sonikation lysiert, der ein Zentrifugieren folgte. Die Ablagerung (Zellenmembrane, Inklusionskörper) und das Supernatant haben wir mit der SDS-PAGE und der Western blot Analyse mit Anwendung von anti-His-tag Antikörpern als primäre Antikörper, wenn dies notwendig war, zur Bestätigung der Expression der Konstrukte überprüft. Die konstruierten Fusionsproteine waren größtenteils im nicht löslichen Teil anwesend {Inklusionskörper), die aus > 80 % des gewünschten Proteins zusammengesetzt waren. Dies war die Folge der Fusion mit der KSI-Domäne am N-Terminal-Teil des Proteins. Die Inklusionskörper haben wir zweimal mit Lysinpuffer, zweimal mit 2M Ureo in 10 mM Tris pH 8.0 und einmal mit MiliQ-Wasser ausgewaschen. Das Ergebnis ergab normalerweise > 95 % reines Protein. Falls die Ablagerung noch immer Unreinheiten enthielt, haben wir die Inklusionskörper in 6 m GdnHCI, pH 8.0 gelöst und auf eine Ni2+-NTA-Kolonne aufgetragen. Reinigungen unter denaturierenden Bedingungen verliefen nach Anweisungen des Herstellers. Nach der Elution mit 250 mM Imidasol in 100 mM Na3P04, 10 mM Tris pH 5.8, haben wir die Fraktionen, die Protein enthielten, vereint und zweimal gegen 10 mM Hepes pH 7.5 oder MilliQ Wasser dialysiert.

Wenn das Protein im Supernatant vorkam, haben wir das Supernatant auf die Kolonne Ni2+-NTA aufgetragen und bei nativen Bedingungen gereinigt. Nach der Elution mit 250 mM Imidasol pH 5,8 oder 500 mM Imidasol pH 8.0, haben wir die Fraktionen, die Protein enthielten, vereint und zweimal gegen 10 mM Hepes pH 7.5 oder einen anderen geeigneten Puffer dialysiert.

Beispiel 3: Vorbereitung des Materials

Unter geeigneten Bedingungen neigt das Protein mit Elastin-ähnlichen Segmenten und Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln (parallele Heterodimere oder Homodimere) zur Bildung von Polypeptidmaterial, das zum Wachstum von eukariotischen Zellen angewandt werden kann. Segmente zur Bildung von Doppelwendeln oligomeri-sieren mit anderen, was das Entstehen von vernetztem Material zur Folge hat.

Beim Suchen von Bedingungen, bei welchen Fusionsproteine löslich sind, haben wir das denaturierte Protein in 6M Guanudinium-HCI ungefähr 100-mal verdünnt, mit Puffern verschiedener pH-Werten (Zitrat-Acetat-Puffer pH 2 und pH 3, Acetatpuffer pH 4, pH 5, Phosphatpuffer pH 5, pH 6, pH 7, Puffer Hepes pH 7.5, Puffer Tirs pH 8, Karbonatpuffer pH 9, pH 10), unterschiedlicher lonenstärke (100 mM, 300 mM, 1 Μ, 2M NaCI) und in verschiedenen organischen Lösemitteln mit bis zu 20 % Acetonytril, DMSO, Methanol oder bis zu 50 % Trifluoroethanol. Wir haben das absorbierende Spektrum des Proteins gemessen. Im Falle von typischen Proteinspektren haben wir das Muster mit der CD-Spektroskopie analysiert, um sekundäre Strukturen des Proteins und der Temperaturstabilität festzulegen. Wenn geeignete Bedingungen bestimmt waren, haben wir die denaturierten Proteine gegen ausgewählte Puffer dialysiert.

Beispiel 4: Mikroben-abweisende Funktion des Materials, das Mikroben-abweisende Peptide enthält » · 38

Die Mikroben-abweisende Funktion von Material, das Mikroben-abweisende Peptide enthält, haben wir mit dem Antibiogramm überprüft. Die Anfälligkeit der Bakterie E. coli DH5a auf Mikroben-abweisendes Peptid wurde mit der halb quantitativen Methode überprüft, die auf der Diffusion basiert (Kirby-Bauer Methode). 20 L der über Nacht kultivierten Kultur E. coli DH5a haben wir über eine Agar-Agar-Platte mit einem Durchmesser von 10 cm (Petrischale) bestrichen, um ein konfluentes Wachstum zu erzielen. Danach haben wir 6 kleinere Scheiben auf die Platte gelegt und diese mit verschiedenen Konzentrationen des Materials mit Mikroben-abweisen-dem Peptid (LL-37) von 0.1-10 mg/ml Protein und MiliQ impregniert, was als negative Kontrolle diente. Nach 16 Stunden Inkubation bei 37°C wurde die Platte nach Klärungszonen überprüft. Die Mikroben-abweisende Funktion hing von der Konzentration des Materials ab (Bild 2).

Beispiel 5: Differenzierung von Nervenzellen auf Polypeptidmaterial, zusammengesetzt aus zwei Elastin-ähnlichen Segmenten, zwei Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln und NGF

Die Zelllinie des Ratten-Feochromozytoms PC12 ist ein geltendes Modell zur Formierung von Neuriten, induziert mit dem Neuronal-Wachstumsfaktor (NGF). Es wurde bewiesen, dass wenn Gangliosiden dem Medium der PC12-Zellen hinzugefügt wurden, dies die Formation der Neuriten, induziert mit dem Neuronal-Wachstumsfaktor (NGF) beschleunigt. Der Neuronal-Wachstumsfaktor hilft beim Überleben und der Differenzierung von Senzoren- und Sympathieneuronen. Es beeinflusst TrkA und den Rezeptor des Neuronal-Wachstumsfaktors mit niedriger Affinität (eng. Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor - LNGFR).

Den Versuch führten wir in Mikroskopiekammern mit jeweils 8 Löchern (Ibide) aus. Nach Entstehung von Polypeptidmaterial haben wir PC12-Zellen mit einer Konzentration von 0,25 x 105 Zellen pro Loch beimpft. Wir haben das Wachstumsmedium F12K (Gibco), ergänzt mit 2,5 % durch Temperatur inaktiviertes fötales Rinderserum und 15 % mit Temperatur inaktiviertes Pferdeserum, hinzugefügt. Die Bilder wurden 48 Stun- 39 den nach der Inkubation bei 37°'C mit 5 % C02 in der Atmosphäre aufgenommen.

Die Bildung von Neuriten ist auf Bild 3D dargestellt. NGF in Polypeptidmaterial verursacht keine morphologischen Änderungen an HEK293-Zellen (menschliche embryonale Nierenzellen 293 - eng. Human Embryonic Kidney 293 cells) (Bild 3B).

Lebende Zellen haben wir unter dem Konfokalmikroskop Leica TCS SPS auf Leica DMI 60000 CS Ständer untersucht. Wir haben ein 63x Ölimersionsobjektiv verwendet. Die Bilder haben wir mit dem Programm LAS AF 1.8.0. Leica Microsystem gewonnen.

Beispiel 6: Produktion von Fusionsprotein zwischen einem Elastin-ähnlichen Segment und einer funktionellen Polypeptiddomäne, die Silber-Nanoteilchen mit Mikrobenabweisender Aktivität bildet.

Das Konstrukt, das zum Zwecke der Produktionsdarstellung des Proteins mit funktioneller Polypeptiddomäne vorbereitet wurde, was ein Entstehen von Silber-Nanoteilchen auslöst, ist in Tabelle 1 angeführt (Nr. 7). Die Herstellung und die Isolierung des Proteins ist dieselbe wie in Beispiel 2.

Beispiel 7: Mikroben-abweisende Wirkung von Polypeptid material, das eine funktionelle Polypeptiddomäne zur Bildung von Silber-Nanoteilchen enthält. AEA ist eine konstruierte Trimerisationsabfolge zur Bildung einer Doppelwendel (SEQ ID: 26). Sie besteht aus drei Segmenten, die sich in einen stufenförmigen Heterotrimer vereinen und an den Stellen der Heptade b, c und f Doppelwendeln von Aminosäureresten Ala (b), Ala (c) und Glu (f) haben.

Die AEA katalysiert die Bildung der Silber-Nanoteilchen aus Silber-Ionen in Lösemittel. AEA, vereint mit einem Elastin-ähnlichen Segment (die Vorbereitung ist in Beispiel 6 beschrieben), ist Teil des Polypeptidmaterials. Das AEA-Segment des Materials reduziert Ag+ in AgO in Form von Nanoteilchen. Nach der Entfernung von nicht reduzierten Silber-Ionen mit Dialyse bleiben Silber-Nanoteilchen an der Matrix haften.

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Wir haben vier verschiedene Mischungen mit Bakterien (E. coli DC2) vorbereitet (Tabelle 3). Bei der Inkubation (37°C), die über Nacht stattgefunden hat, haben wir OD bei 600 mm (Nano Drop) gemessen. Der Wert von OD600-Mischungen 1 und 3 wird auf Bild 4 dargestellt.

Tabelle 3: Mischungen, die für die Überprüfung der Mikroben-abweisenden Funktion von Polypeptidmaterial vorbereitet wurden, das eine funktionelle Polypeptiddomäne zur Bildung von Silber-Nanoteilchen enthält, und des Silber-Acetats

Nr. Mischung 1 diaiysierte AEA-Ag + LB + E. coli DC2 2 diaiysierte AEA-Ag + LB (ohne Bakterien) 3 dialysiertes Ag-Acetat + LB + E. coli DC2 4 dialysiertes Ag-Acetat + LB (ohne Bakterien)

Beispiel 8: Neigung zur Bildung von heterodimeren Segmenten zur Bildung von Dop-pelwendeln P1 und P2

Segmente zur Bildung von Doppelwendeln P1 bis P8 haben die Vorlegenden ausgeformt. Paare (P1-P2, P3-P4, P5-P6, P7-P8) bilden die α-Doppelwendel nur dann, wenn beide Komponenten vorhanden sind. Das Prinzip wird am Paar P1-P2 dargestellt. Die beiden Peptide P1 und P2 wurden durch Synthese mit einer stabilen Phase synthetisiert, im KeckZetrum, Yale üniversity, New Heaven, USA. Das synthetische Segment zur Bildung der Doppelwendel P1 wurde in 0.1 % Amoniumbikarbonat mit einer Endkonzentration von 5 mg/ml aufgelöst. Das P2 wurde in destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 5 mg/ml aufgelöst.

Das CD-Spektrum wurde mit einem Spektro-Polarimeter unter Stickstoff-Durchfluss aufgenommen (Applied Photophysics, Surrey, UK). CD-Spektren des breiteren UV-Gebiets der jeweiligen Segmente zur Bildung von Doppelwendeln und deren Mischungen haben wir in der Zelle auf optischem Wege 0.1 cm jede 0.5 nm im Gebiet der Wellenlängen 190nm - 260 nm gemessen, wobei die Zeit der Messung bei einer Wellenlänge 1 Sekunde betrug. Die Konzentration der Segmente zur Bildung von • * · · * · * ·«* I · · « * * * · ·· » · · · · 4 · ·«» * · ♦ ·· · · · * ·· · * * 4« ·» * « * · ♦ · 41

Doppelwendeln war 0.1 mg/ml. Das CD-Spektrum der Jeweiligen Segmente zur Bildung von Doppelwendeln {P1 und P2) zeigt eine zufällige Proteinstruktur. Im Falle, wo die beiden Segmente zur Bildung der Doppelwendel vermischt waren, weist das Spek-turm auf eine a-Helixstruktur.

Beispiel 9: Gewinnung von Zellen aus Polypeptidmaterial

Mit Zusatz des Segmentes zur Bildung von Doppelwendeln und ist mit der Bildung einer Doppelwendel mit einem der Segmente des Polypeptidmaterials zur Oligomerisie-rung fähig, zersetzt sich Polypeptidmaterial einfach. Das zugefügte Segment depoli-merisiert Polypeptidmaterial auch so, dass es an Segmente zur Bildung von Doppelwendeln bindet und diese mit funktionellen Polypeptiddomänen verbunden sind. Die Zellen werden so sanft aus der Matrix freigesetzt, ohne Verwendung scharfer physikalischer Bedingungen, wie Temperatur, osmotischer Schock, lonen-Stärke oder Enzymabbau, die Oberflächenrezeptoren und Ahdäsionsmoleküle beeinflussen oder beschädigen.

Die Polypepidmatrix wurde aus Fusionsproteinen, angeführt in Tabelle 1, zusammengesetzt (SEQ ID NO: 6, 8). Nach der Polymerisierung war das Ergebnis des Zusatzes der 50-fachen molaren Überproduktion P1 und P2 der Abbau des Polypepidmaterials. 42

ABFOLGEN <210> 1 <?Al> 960

<212> DNA <213> Synthetisch <220> <221> CDS <222> (1) . . (960 ) <223 > KSI-DP-Histag-LL3 7-EL3T-GCN- ELST <400> 1 acg cat acc cca gaa cac atc acc gcc gtg gla cag cgc ttt gtg gct Met 1 H i s Thr Pro Glu 5 His Ile Thr Ala Val 10 Val Gin Arg Phe Val 15 Ala gcg ctc aat gcc ggc gat ctg gac ggc atc gtc gcg ctg ttt gcc gat Ala Leu Asn Ala 20 Gly Asp Leu Asp Gly 25 I le Val Ala Leu Phe 30 Ala Asp gac. gcc acg gtg gaa gac ccc gtg ggt tcc gag ccc agg tcc ggt acg Asp A1 a Th r 35 Val Glu Asp Pro Val 40 Gly Ser Glu Pro Arg 45 Ser Gly Th r gct gcg att egt gag ttt tac gcc aac teg ctc aaa ctg cct ttg gcg Ala Ala 50 Ile Arg Glu Phe Tvr 55 Ala Asn Ser Leu Lys 60 Leu Pro Leu Ala gtq gag ctg acg cag gag gta cgc gcg gtc gcc aac gaa gcg gcc t LC Val 6 5 Glu Leu Thr Gin Glu 70 Val Arg Ala Val Ala 75 Asn Glu Ala Ala Phe 80 gct ttc. acc gtc agc tr.c gag tat cag ggc cgc aag acc gta gtt gcg Ala Phe Thr Val Ser 85 Phe Glu Tyr Gin Gly 90 Arg Lys Thr Val Val 95 Al a ccc atc gat cac ttt cgc ttc aat ggc gcc ggc aag gtg gtq agc atc Pro Ile Asp Hi s 100 Phe Arg Phe Asn Gly 105 Ala Gly Lys Val Val 110 Ser Ile cgc gcc ttg trt ggc gag aag aat att cac gca tgc cag atg gat cct Arg Ala Leu 115 Phe Gly Glu Lys Asn 120 Ile His Al a Cys G1 n 125 Met Asp Pro a tg tat cat cac cat cac cat cac tet aga gcc ggc ctg ctg ggt gat Met Tyr 130 His H ls His His K i s 135 Hi s Ser Arg Ala Gly 140 Leu Leu Gly Asp ttc ttc egg aaa tet a a a gag aag att ggc aaa gag ttt a a a aga alt Phe 145 Phe Arg T.vs Ser Lys 15 0 Glu lys Tie Gly Lys 155 Glu Phe Lys Arg τ le 1 60 gtc cag aga atc aag gat tr.t Gtg egg aat ctc gta ccc agg aca gag Val Gin Arg ile Lys 165 Asp Phe Leu Arg Asn 170 Leu Val. Pro Arg Thr 175 Glu tcc tcc ggg gtL ccg ggt gtt ggt gtt cct ggc gtg ggt gtt cct ggt Ser Ser Gly Val 180 Pro Gly Val Gly Va 1 185 Pro Gl y Val Gly Val 190 Pro Gly gtt ggc gcg cca ggt gtg gga gtg cc.a ggc gtt ggt. gta ccg ggt gtg Val Gly Val 195 Pro Gly Val Gly Val 200 Pro Gly Val Gly Val 205 Pro Gly Val ggc gtt ccg gga gtc gga gtL ccg gaa g La ggc gtg cct ggt gtt ggg Gly Val Pro Gly Val Gly Va 1 Pro Gly V7 a 1 Gly Va 1 Pro Gly Val Gly 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 5 28 576 624 672 ·»·· II t ·*» •i*·· t - * m * * • I · « « » # · · 210 215 » t 43 * « * * 22C m * a * gtt ccg ggf- gta ggt tcc ggg egt atg aaa cag ctg gaa gat aaa atc 720 Val 225 Pro Gly Val Gly Ser 230 Glv Arg Ket Lys Gin 235 Leu Glu Asp Lys Ile 240 gag gag ctg ctg tct aag atc tac cac ctg gaa aac gaa att get ege 768 Glu Glu Leu Leu 5er 245 Lys Ile Tyr His Leu 250 Glu Asn Glu Ile Ala 255 Arg ctg aaa aag ctg att ggt gaa ege LCC ggg gtt ccg ggt gtt ggt gtt 816 Leu Lys Lys Leu 260 Ile Gly Glu Arg Ser 265 Gly Val Pro Gly Val 270 Gly Val cct ggc gtg ggt gtt cct ggt gtt ggc gtg cca ggt gtg gga gtg cca 864 Pro Gly Val 275 Gly Val Pro Gly Val 280 Gly Val Pro Gly Val 285 Gly Val Pro ggc gLL ggt g La ccg ggt gtg ggc gtt ccg gga gtc gga gtt ccg gga 912 Gly Val 290 Gly Val Pro Gly Val 295 Gly Val Pro Gly Val 300 Gly Val Pro Gly gta ggc gtg cct ggt gtt ggg gtt ccg ggt gta ggt tcc gga act agt 960 Val Gly 305 <21C> <211 > <21 2> <21 3> <400> Val Pro Gly 2 320 PRT Synthetisch 2 Val 310 Gly Val Pro Gly Val 315 Gly Ser Gly Thr Ser 320 MeL 1 Hls Thr Pro Glu 5 His ile Thr Al a Val 10 Val Gin Arg Phe Val 15 Ala A_ ä Leu Asn Ala 20 Gly Asp Leu Asp Gly 25 Ίθ Val Al a Leu Phe 30 Ala Asp Asp Ala Thr 3 5 Val Gl u Ä Sp Pro Val 40 Gly Ser Gl u Pro Arg 4 5 3er Gly Thr Ala Ala 50 Ile Arg Glu Phe Tyr 55 Ala Asn Ser Leu Lys 60 Leu Pro Leu Ala Val 65 Glu Leu Thr Gin Glu 70 Val Arg Ala va 1 Ala 75 Asn Glu Ala Ala Phe 80 Ala Phe Thr Val Ser 85 Phe Glu Tyr Gin Gly 9C Arg Lys Ihr Val Va 1 95 Ala Pro I le Asp H i s 100 Phe Arg Phe Asn Gly 105 Ala Gly Lys va* Val 110 Ser Ile Arg Ala Leu 115 Phe Gly G1 u Lys Asn 120 Ile His Ala Cys Gin 125 MeL Asp Pro .Met Tyr ] 30 His His His H i s His 135 His Ser Arg Ala Glv 140 Leu Leu Gly Asp Phe 145 Fhe Arq lys Ser Lys 150 Glu Lys Ile Gly Lys 1 55 Glu Phe Lys Arg Ile 1 60 Va". Gin Arg 1 Le Lys 165 Asp Phe Leu Arq Asp. 170 Leu Val Pro Arg Thr 175 Glu 44

Ser Ser Gly Val 180 Pro Gly Val Gly Val 185 Pro Gly Val Gly Val 190 Pro Gly Val Gly Val 195 Pro Gly Val Gly Val 200 Pro Gly Val Gly Val 205 Pro Gly Val Gly Val 210 Pro Gly Val Gly Val 215 Pro Gly Val Gly Val 220 Pro Gly Val Gly Val· 225 Pro Gly Val Gly Ser 230 Gly Arg MeL Lys Gin 235 Leu Glu Asp Lys Ile 240 Glu Glu Leu Leu Ser 245 T,vs I le Tyr His Leu 250 Glu Asn Glu Ile Ala 255 Arg Leu Ly s Lys Leu 260 Ile Gl y Glu Arg Ser 265 Gly Val Pro Gly Val 270 Gly Val Pro Gly Val 275 Gly Val Pro Gly Val 280 Gly Val Pro Gly Val 285 Gly Val Pro Gly Val 290 Gly Val Pro Gly Val 295 Gly Val Pro Gly Val 300 Gl.y Val Pro Gly Val 3C5 Gly Val Pro Gly Val 310 Gly Val Pro Gly Val 315 Gly Ser Gly Thr Ser 320 <210> <211> < 212. > <213 > -> 1740 DNA Synthet.il sch <220> <221 > <222> <223> CDS {D . . (1740) KS:-DP-Histag-LL37-ELST-GCN-P2-ELST-mNGF <400> atq eat MeL His 1 3 acc Thr cca Pro gaa Glu 5 cac His alc ile acc Thr gcc Ala gtg Va 1 10 g La Val cag Gin ege Arg ett Phe gtg Val 15 gct Ala 48 gcg Ara ctc Leu tiat Asn gcc Ala 20 ggc Gly gat Asp ctg Leu gac Asp ggc Gly 25 atc 71e gtc Va] gcg Ala ctg Leu ett Phe 30 gcc Ala gat Asp 96 gar. Asp gcc A1 a arg Thr 35 gtg Val gaa Gl u gac Asp ccc Pro gtg Val 4C ggt Gly tcc Ser gag Glu ccc Pro agg Arg 45 tcc Ser ggt Gly aeg Thr 1 44 gct Ala gcg A 1 a 50 att Tie egt Arg gag Glu tr. t Phe cac Tyr 55 gcc Ala ädC Asn teg Ser ctc Leu ddä Lys 60 ctg Leu cct Pro ttg Leu gcg Al a 192 gtg Val 65 gag Glu ctg Leu aeg Thr cag Gin gag Glu 70 gta Va_ ege Arg gcg Ala gtc Val gcc Ala 75 aac Asn gaa Glu gcg Ala gcc Ala ttc Phe 80 240 gct Ala tr.c Phe acc Thr gtc Val agc Ser 8 5 t tc Phe gag Glu tat Tyr cag Gin ggc Gly 90 ege Arg C-l CVL Lys acc Thr gta Val gtt Val 95 gcg A 1 a 288 c.cc Pro acc Ile gat Asp cac His ICO tat Phe ege Arg ctc Phe aat Asn ggc Gly 105 gcc Al a ggc Gly aag Lys gtg Val gtg Val 1 1 0 agc Ser atc I le 336 45 cgc gcc ttg ttt ggc gag aag aat et t cac gca tgc cag at.g gat cct 384 Arg Ala Leu 115 Phe Gly Glu Lys Asn 120 Ile Hls Al a Cvs Gin 125 Met Asp Pro ctg tat cat cac cat cac cat cac tet aga gcc ggc ctg ctg ggt gat 432 Met. 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Arg Ala Arg Ser Ala Pro Thr Ala Pro Ile Ala Ala Arg Val Thr C-ly « * 48 385 390 395 400 Gin Thr Arg Asn I le 405 Thr Val Asp Pro Arg 41 0 Leu Phe Lys Lys Arg 415 Arg Leu His Ser Pro 420 Arg Val Leu Phe Ser 425 Thr Gin Pro Pro Pro 430 Thr Ser Ser Asp Thr 435 Leu Asp Leu Asp Phe 440 Gl n A1 a His Gly Thr 445 Ile Pro Phe Asn Arg 450 Thr His Arg Ser Lys 455 Arg Ser Ser Thr Hi s 460 Pro Val Phe His Net 465 Gly Glu Phe Ser Val 470 Cys Asp Ser Val Ser 475 Val Trp Val Gly Asp 480 Lys Thr Thr Ala Thr 485 Asp Ile Lys Gly Lys 490 Gl u Val Thr Val Leu 495 Ala Glu Val Asn I le 500 Asn Asn Ser Val Phe 505 Arg Gin Tyr Phe Phe 510 Glu Thr lys Cys Arg 515 Ala Ser Asn Pro Val 520 Gl u Ser Gly Cys Arg 525 Gly Ile Asp Ser L y s 530 His Trp Asn Ser Ivr 535 Cys Thr Th Ι Thr His 540 Thr Phe Val Lys Al a 5 4 5 Leu Thr Thr Asp Glu 5 5 0 Lys Gin Ala Α 1 a Trp 555 Arg Phe Γ le Arq Ile 560 Asp Thr Ala Cys Val 565 Cys Val Leu Ser Arg 570 Lys A1 a Thr Arg Arg 575 Gly Ser Gly Thr Ser 580 <21 Ο > 5 <211> 1065

<212 > DNA <213> Synthetisch <220> < 2 21> CDS <222> (1) . . (1 065) <223> KS1-DP-Hisrag-LL3 7-ELST-GCN P I ELST <400> 5 aLg cat acc cca gaa cac acc acc gcc gtg gta cag ege ttt gtg gct. 48 Met 1 H 1 s Thr Pro Glu 5 His Ile Thr Ala Val 1 0 Val Gin Arg Phe Val 15 Ala gcg etc aal gcc ggc gaL ctg qae ggc a t c gtc gcg ctq Ltt gcc gat 96 A1 a Leu Asn Ala 20 Gly Asp Leu Asp Gly 25 Tie Va 1 Ala Leu Phe 30 Ala Asp gac gcc acg gtg gaa gac ccc gtg ggt Lee gag ccc agg tcc ggc acg 144 Asp Ala Thr 35 Va 1 Glu Asp Pro Val 40 Gly Ser Glu Pro Arg 45 Ser Gl y Thr gct gcg att egt gag Ltt tac gcc aac Leg ctc dää ctg cct ttg gcg 192 Ala Ala 50 Ile Arg Glu Phe Tyr 5 5 Ala Asn Ser Leu T..VS 6 0 Leu Pro Leu Al a gtg gag ctg acg cag gag gca ege gcg gcc gcc aac gaa gcg gcc r.tc 240 Val G1 u Leu ihr Gin Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe 49 • · φ > *»»φ φ »

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50

Val Pro Gly Val Gly Val 340 Pro Gly Val Gly Val 345 Pro Gly Val Gly Ser 350 gga Gly act fhr agt Ser 355 <210> δ <21Ί > 3 55

<212> PRT <213> Synthetisch <400> 6

Met 1 His Thr Pro Glu 5 His Ile Thr Ala Val 1 0 Val Gin Arg Phe Val 15 Ala Ala Leu Asn A L o. 20 Gly Asp Leu Asp Gly 25 Tie Val Ala Leu Phe 30 Ala Asp ASp Ala Thr 35 Val Glu Asp Pro Val 40 Gly Ser Glu Pro Arg 45 Ser Gly Thr Ala Al a 50 Ile Arg Glu Phe Tyr 55 Al a Asn Ser Leu Lys 60 Leu Pro Leu Ala Val 65 Glu Leu Thr Gin G^u 70 Val Arg Ala Val Al a 75 Asn Glu Ala Ala Phe 80 Al a Phe Thr Val Ser 85 Phe Glu Tyr Gin Gly 9C Arg Lys Thr Val Va 1 95 Al a Pro I le Asp His 100 Phe Arg Phe Asn Gly 105 Ara Gly Lys Val Val 110 Ser Ile Arg Ala Leu 115 Phe Gly Glu Lys Asn 1 20 Ile Hrs Ala Cys G1 n 1 2 5 Met Asp Pro Met Tyr 130 His His His His His 135 His Ser Arg Ala Gly 140 Leu Leu Gly Asp Phe 145 Phe Arg Lys Ser Lys 15C Glu Lys Ile Gly Lys 155 Glu Phe Lys Arg Ile 16C Val Gin Arg Ile L.ys 165 Asp Phe Leu Arg Asn 1 70 Leu Val Pro Arg Thr 175 Glu Ser Ser Gly Val 1 80 Pro Gly Val G.y Val 1.85 Pro Gly Val Gly Val 19C Pro Gly Val Gly Val 195 Pro c'-y Val Gly Val 200 Pro Gly Val Gly Val 205 Pro Gly Val Gly Val 210 Pro Gly Val Gly Val 215 Pro Gl y Val Gly Val 220 Pro Gly Val Gly Val 225 Pro Gly Val g y Ser 230 G' v Arg vet Lys Gin 235 Leu Glu Asp Lys Tie 240 Glu g: u Leu Leu Ser 245 Lys Tie T vr H i s Leu 250 Glu Asn Glu Ile Ala 255 Arg Leu Lys Lys Leu 260 Tie Gly Glu Arg Ser 265 Gl v Ser Pro Glu Asp 270 Glu Ile Gl n Ala Leu 275 Glu Glu Glu Asn Ala 280 Gin Leu Glu Gin Glu 285 Asn Ala Ala *·«· · · ·*·· • * ♦ * « · * * 51 • * • « • · • ♦ « • · • • ♦ • · ♦ · » · • • · ♦ « • · • · 9 * m 9 • « · • 9 9 * Leu Glu 290 Glu Glu Ile Ala Gin 295 Leu Glu l'yr Gly Ser 30 0 Gly Val Pro Gly Val 305 Gly Val Pro Gly Val 310 Gl y Val Pro Gly Val 315 Gly Val Pro Gly Val 320 Gly Val Pro Gly Val 325 Gly Val Pro Gly Val 330 Gly Val Pro Gly Val 335 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 340 345 Gly Ihr Ser 355 < 21 0 > 7 < 211> 1065 <212> DNA <213> Synthetisch <220> <221> CDS <222> (1)..(1065) <223> KSI-DP-Histag-LL37-ELST-GCN-<400> 7 Gly Val P2-ELST Pro Gly Val 350 Gly Ser atg cat acc cca gaa cac atc acc gcc gtg gta cag cgc ttt gtg gct 48 Met 1 HiS Thr Pro Glu 5 His Ile Thr Ala Val 10 V a 1 Gin Arg Phe Val 15 Al a gcg ctc aat gcc ggc gat Ctg gac ggc a Lc gtc gcg ctg ttt gcc gat 96 Ala Leu Asn Ala 20 Gly Asp Leu ASp Gly 25 Ile Val Ala Leu Phe 3 0 Ala Asp gac gcc acg gtg gaa gac ccc gtg ggt tcc gag ccc agg tcc ggt acg 144 Asp Ala Thr 3 5 Val Glu Asp Pro Val 40 Gl y Ser Glu Pro Arg 45 Ser Gly Thr gct gcg att. egt gag ttt tac gcc aac teg ctc aaa ctg cct teg gcg 192 Al a Ala 5 0 Ile Arg Glu Phe Tvr 55 Ala Asn Ser Leu Lys 60 Leu Pro Leu Ala g~g gag ctg acg cag gag gta cgc gcg gtc gcc aac gaa gcg gcc ttc 240 Val 65 Glu Leu Thr Gin Glu 70 Val Arg Ala Val Ala 75 Asn Gl u Ala Al a Phe 80 gct ttc acc gtc agc Lee gag tat cag ggc cgc aag acc gta gtt gcg 288 Ala Phe Thr Val Ser 8 5 Phe Glu Tyr Gin Gly 90 Arg Lys Thr Val Val 95 Ala ccc atc gat cac ttt cgc ttc aar. ggc gcc ggc aag gtg gtg agc atc 336 Pro Ile Asp His 100 Phe Arg Phe Asn Gly 105 Ala Gly Lys Val Val 1 10 Ser Ile cgc gcc ctg ttt ggc gag aag aal att cac gca tgc cag atg gat cct 384 Arg Ala Leu 115 Phe Gly Glu Lys Asn 120 Ile His Ala Cys Gin 125 Met ASp Pro atg tat cat cac cat cac cat cac tet dg α gcc ggc ctg ctg ggt. gat 432 Met Tyr 130 His His His Kis His 135 His Ser Arg Ala Gly 140 Leu Leu Gly Asp ttc ttc egg clä-cl tet aaa gag aag att ggc aaa gag ttt aga att 480 Phe 145 Phe Arg Ly s Ser Lys 150 Glu Lys Ile Gly Lys 155 Glu Phe Lys Arg Tie 160 528 • I · « * • * ·* ·* 52 gtc Val cag Gin aga Arg atc 11 e aag Lys 165 gat Asp tr.t Phe ttg T.eu tcc Ser tcc Ser ggg Gly gtt Val 18C ccg Pro ggt Gly gtt Val ggt Gly gLL Va] ggc Gly gtg Val 195 cca Pro ggt Gly gtg Val gga Gly gtg Val 200 ggc Gly gtt Val 210 ccg Pro gga Gly gtc Val gga Gly gtt Val 215 ccq Pro gtt Val 225 ccg Pro ggt Gly gta Val ggt Gly tcc Ser 23 0 ggg Gly cg L Arg gag Glu qag Glu erg Leu ctg Leu tCL Ser 245 aag Lys atc 1 le tac Tyr ctg Leu 3. gL «L :,ys aag Lys Ctg Leu 260 alt Ile ggt Gly gaa Glu ege Arg gca Ala cag Gin ctg Leu 275 aaa lys gaa Glu aag Lys aac Asn geg Ala 280 ctg Leu aag Ly s 290 gag Glu aaa Lys atc Ile caa Gin gca Ala 295 ctg Leu gtt Val 305 ggr Gly gtt Val ccL Pro ggc Gly gtg Val 310 ggt Gly gtt Val gga G'y gtg Va_ cca Pro ggc Gly gtt Val 325 gg- G'.y gta Va_ ccg Pro gtt Val ccg Pro gga Gly gta Val 340 ggc Gly gtg Val cct Pro ggL Gly gga Gly act Thr agt Ser 355 <210> <211 > <212> <213 > 8 355 PRT Synthet i; 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Pro Gly Val 320 ggt gtg ggc gtt ccg gga gtc gga Gly Val 330 Gly Val Pro Gly Va.l 335 Gly gtt 999 gtt ccg ggt gta ggt tcc Val 345 Gly Val Pro Gly Val 3 50 Gly Ser

Ai 3 Val 10 Val Gin Arg Phe Val 1 5 Ala Gly 25 Ile Väl A-ä Leu Phe 3 C Ala Asp Gly Ser Glu Pro Arg 45 Ser Gly Thr 576 624 672 720 768 816 864 912 960 10C 8 1056 1065 • * · ' « » * 4 4 * * * • * * ι * * I « · ♦ * • · Ψ V * * 4 · « • * · «4 * · 53

Ala Ala 50 Ue Arg Glu Phe Tyr 5 5 Ala Asn Ser Leu Lys 60 Leu Pro Leu Ala Val 65 Glu Leu Ihr Gl n Glu 70 Val Arg Ala val Ala 7 5 Asn Glu Ala Ala Phe 80 Ala Phe Thr Val Ser 85 Phe Glu Tyr Gl n Gly 90 Arg Lys Thr Val Val 95 Ala Pro Ile Asp His 100 Phe Arg Phe Asn Gly 105 Ala Gly Lys Val Val 110 Ser Ile Arg Ala leu 115 Phe Gly Glu lys Asn 120 T le His Ala Cys Gin 125 Met Asp Pro Met Tyr 130 His His His His His 135 His Ser Arg Ala Gl v 140 Leu Leu Gly Asp Phe 145 Phe Arg Lys Ser lys 1.50 G_U Lys Ile Gly Lys 1 55 Glu Phe Lys Arg Ile 160 Val Gin Arg Ile Lys 165 Asp Phe Leu Arg Asn 170 Leu Val Pro Arg Thr 175 Glu Ser Ser Gly Val 180 Pro Gly Val Gly Val 185 Pro Gly Val Gly Val 190 Pro Gly Val Gl y Val 195 Pro Gl y Val G .1 v Val 200 Pro Gly Val. Gly Val 2 05 Pro Gly Val Gly Va 1 210 Pro Gly Val Gly Val 7.1 5 Pro G.l v Val Giv Val 220 Pro Gly Val Giy Val 225 Pro Gly Val Gly Ser 230 Gly Arg Met Lys Gin 235 Leu Glu Asp Lys Ile 240 Glu Glu Leu Leu Ser 245 Lys Ile Tyr His Leu 250 Glu Asn Glu Ile Ala 255 Arg Leu Lys Lys Leu 260 j. le Gly Glu Arg Ser 2 6 5 Gly Ser Pro Glu Asp 270 Lys Ile Ala Gl π leu 275 -ys Gl u Lys Asn Ala 280 Ai a Leu Lys Glu Lys 285 Asn Gin Gl n Leu Lys 290 Glu Lys I le Gin Ala 295 Leu Lys Tyr Gly Ser 3 0C Gly Val Pro Gly Val 305 Gly Val Pro Gly Val 31 C Gly Val Pro Gly Val 315 Gly Val Pro Gly Val 32C Gly Val Pro Giy Val 325 Gly Val Pro Gly Val 330 Gly Val Pro Gly Val 335 C-ly Val Pro Gly Val 340 Gly Val Pro Gly Val 34 5 Gly Val Pro Gly Val 35C Glv Ser

Giy Thr Ser 355 <2’0> 9 <21J > 99

<712> DNA <213> Synthetisch <220> 48

• * * 54 <2 21> CDS <222> (1)..(99)

<223> PI <400> 9 agc cca gaa gac gaa att. cag gca ctg gaa gaa gaa aat. gct caa egg

Ser Pro Glu Asp Glu Ile Gin Ala Leu Glu Glu Glu Asn Ala Gin len 1 5 10 15 gaa cag gaa aac geg geg ctg gaa gaa gaa acc gca cag ctg gaa tac

Glu Gin Glu Asn A_a Ala Leu Glu Glu Glu Ile Ala Gin Leu Glu Tyr 20 25 30 ggc C-ly

< 210 > IC < 211> 33

<212> PRT <213> Synthetisch <4 00> 10

Ser Pro Glu Asp Glu Ile Gin Ala Leu Glu Glu Glu Asn Ala Gin Ieu 15 10 15

Glu Gin Glu Asn Ala Ala Leu Glu Glu Glu Ile Ala Gin Leu Glu Tyr 20 25 30

Gly <210> 11 <211> 99

<212> DNA <213> Synthetisch <220> <221> CDS <222> (1)..(99) <223> P2 96 99 <400> 11 tet cca Ser Pro 1 gaa Glu gac Asp aaa Lys 5 atc Ile gca Ala cag G_n ctg Leu aaa Lys 10 gaa Glu aag Lys aac Asn geg Ala gcc Ala 15 ctg Leu aaa gaa Lys Glu aag Lys aat Asn 20 caa Gin cag Gin ctg Leu aag Lys gag Glu 2 5 ädd Lys atc I le caa Gin gca Ala ctg Leu 30 aaa lys tat Tyr ggc Gly <210> 12 <211 > 33 < 21.2 > PRT < 213 > Synthetisch <400> 12 Ser Pro Glu Asp Lys Tie Ala Gin Lei: Lys Glu Lys Asn Ala Ala Leu l 5 10 15 4 8 96 I.ys Glu Lys Asn Gin Gin Leu Lvs Glu Lvs Ile Gin A*a Leu Lys Tyr 99 55 2ο 30 20 Gly <210> 13 <21 1 > 99 <21 2> DNA < 213 > Synthetisch <220> <221 > CDS <222> (1)..(99) <223> GCN <400> 13 cqt atg aaa cag ctg gaa gat aaa atc gag qag ctg ctg tet aag atc Arg 1 Met Lys Gin Leu 5 Glu Asp Lys Ile Glu 1 0 Glu Leu Leu Ser Lys 15 Ile tac cac ctg gaa aac gaa att get ege ctg aaa aag ctg at t ggt gaa Tyr his Leu Glu 20 Asn Glu 1 !e Al.a Arg 25 Leu Lys Ly 3 Leu T 1 e 30 Gly Glu cgc Arg 48 96 99 <210> 14 <211> 33 <212> PRT <21 3> Synthetisch <' 00> 14 Arg Met Lys G1n Leu Gl u Asp 1 5 Tyr H:s I.eu Glu Asn Glu Tie 2C Arg <210> 15 <211> 111 <212> DNA <21 3> Synthetisch <220> <221> CDS <222> ¢1)..(111) <223> Li 3 7 <400> 15 ctg ctg ggt gat. ttc ttc egg Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg 1 5 ttt aaa aga att. gtc Cag aga Phe Lys Arg Ile Val Gl n Arg 20 atc aag Ile :..ys 25 25

IC 15 3 0 aaa qag aag att ggc aaa gag Lys Glu l.ys iie Gly Lys Glu 10 15 gaL ctt ttg egg aat Asp Phe :,eu Arg Asn 30 :tt gta ccc agg aca gag tcc Pro Arg Ihr G'. u Ser 3 5 48 96 1 1 1 * 4 • · • • * > · * ♦ * * k · 56 <210> 16 <211> 37

<212> ?RT <213> Synthetisch <400> 16

Leu Leu 1 Gly Asp Phe 5 Phe Arg Lys Ser Lys 10 Glu Lys Ile Gly Lys 15 Glu Phe Lys Arg Ile 20 Val Gin Arg Ile Lys 25 Asp Phe Leu Arg Asn 30 Leu Val Pro Arg Thr 3 5 Glu Ser <2 10 > <211 > <212> <213> 17 150 DNA Syntheti sch <220> <221> <222> <223> CDS (1) . ELST .{15 0) <400> gtt ccg Val Pro 1 17 ggt Gly gtt Val ggt Gly 5 gtt Va 1 cct Pro ggc Gly gtg Val ggt Gly 10 gtt Val cct Pro ggt Gly gtt Val ggc Gly 1 o gtg Val 48 cca ggt Pro Gly gtg Val gga Gly 20 gzq Val cca Pro gqc Gly gtt Val ggt Gly 25 gta Val ccg Pro ggt Gly gtg Val ggc Gl y 30 gtt Val ccg Pro 96 gga gtc Gly Val gga Gly 3 5 gtt Val ccg Pro gga Gly gLa Val ggc gtg Gly Val 40 cct Pro ggt Gly gtt Val ggg Gly 43 gtt Val ccq Pro ggt Gly 144 gLa ggt Val Glv 50 150 <210> <211> <212> <213> 18 50 PRT Synthetisch <4 0C> 18 Va' Pro 1 Gly Vdl Gly 5 Val Pro Gly Val Glv 10 Val Pro Glv Val Glv 15 Val Pro Glv Val Gly 20 Val Pro Gly Val Gly 25 Val Pro Gly Val Glv 30 Val Pro G:y Val Gly 3 5 Val Pro Gly Val Gly 40 Val Pro Gly Val Gly 45 Val Pro Gly Val Glv 50 < 2.1C > <211> <212> <2 13> 19 1140 DKA Synthet i sch « · · * · * * * * · * • · * · · * • * I - * · ** 57 <220> <221> CDS <222> (1) . . (1.140) <223> KST DP-Hcstag-ELST-GCN- P2-ELST-AEA <400> 19 atq cat acc cca gaa cac atc acc gcc gtg gta cag cgc ttt gtg gct 48 Met 1 His Thr Pro Glu 5 Hi s Tie Thr Ala Val 10 va 1 G‘ n Arg Phe Val 15 Ala gcg ctc aat gcc ggc gat Ctg gac ggc atc gtc gcg Ctg L t L gcc gat 96 Ala Leu Asn Ala 20 Gly Asp Leu Asp Gl v 25 Ile Val Ala Leu Phe 3C Ala Asp gac gcc aeg gtg gaa gac ccc gtg ggt t.cc gag ccc agg tcc ggt aeg 144 Asp Ala Thr 35 Val Glu Asp Pro Val 40 Gly Ser Glu Pro Arg 45 Ser Gly Thr gcT gcg atz cgc gag ttt Lac gcc aac teg ctc aaa ctg cct ttg gcg 1 92 Ala Ala 50 Ile Arg Glu Phe Tyr 55 Ala Asn Ser Leu Lys 60 Leu Pro Leu Ala gtg gag ctg aeg cag gag gra cgc gcg gtc gcc aac gaa gcg gcc ttc 240 Val 6 5 Glu Leu Thr Gin Glu 70 Val Arg Ala Val Al.a 75 Asn Glu Ala Ala Phe 80 gct tLC acc gtc agc ttc gag tat cag ggc cgc aag acc gta gtt gcg 288 Ala Phe Thr Val Ser 85 Phe Glu Tyr Gin Gl v 90 ' Arg Lys Thr Val Val 95 Ala ccc atc gar cac ttL cgc ttc aat: ggc gcc ggc aag gt.g gtg agc ö t C 336 Pro lle Asp His 100 Phe Arg Phe Asn Gly 1 05 Ala Gly Lvs Val Val 110 Ser Tie cgc gcc LLg ttt ggc gag ci ciCJ S ä L att cac gca Lgc cag atg gat cct 384 Arg Ala Leu 115 Phe Gly Glu Lys Asr. 12C Ile His Ala Cys Gin 125 Met Asp Pro aug Lat cat cac cat cac cat cac tc I. aga gcc ggc gtc ccg ggt gtt 432 MeL Tyr 130 His His His Hin Hrs 135 His Ser Arg Ala Gly 1 40 Val Pro Gly Val ggt gt- - cct ggc grg ggt gtt. cc L ggt gtt. ggc gtg cca ggt gtg gga 480 G ly 145 V a 1. Pro Gly Val Gly 1 50 Val Pro Gly Val Gly 1 55 Val Pro Gly Val Gly 1 60 gtg cca ggc gtt ggt gta ccg ggt gtg ggc qtL ccg gga gtc gga gLt 528 va j Pro Giy Val Gly 1 65 Val Pro Gly Va 1 Gly 170 Val Pro Gly Val Gly 175 Val ccg gga gta ggc gtg cct ggt gtt ggg qtL ccg ggt gta ggt. tcc ggg 576 Pro G.'.y Val Gl v 180 Val Pro Gly Val Gly 185 Va 1 Pro Gly Va 1 Gly 19C Ser Gly egt atg aaa cag ctg gaa gat aaa atc gag gag CLg ctg tet aag atc 624 Arg Mer. lys 195 Gin Leu Glu Asp Lys 200 Ile Glu Gl u Leu Leu 205 Ser T.ys Ile Lac cac ctg gaa a ac gaa att gct cgc cLg aag ctg att ggt gaa 672 Tyr His 21 C Leu Glu Asn G 1,u Ile 215 Λ1 a Arg Leu ^ys lvs 220 Leu Tie Gly Glu cgc tcc ggg rer cca gaa gac cl £3 5 atc gca cag ctg aaa gaa aag aac 720 Arg 225 Ser Gly Ser Pro G_u 230 Asp i.ys Tie Ala Gin 235 T.eu T.y s Glu Lys Asn 240 gcg gcc ctg aaa CJitl ci aag aat caa cag ctg aag gag aaa atc caa gca 768 58

Ala Ala Leu Lys Glu 245 Lys Asn Gin Gin Leu 250 Lys Glu Lys Ile Gin 255 Ala ctg Leu aaa Lys Lat Tyr ggc Gly 260 tcc Ser ggg Gly gcL Val ccg Pro ggt Gly 2 65 gtt Val ggt Gly gtt Val ccL Pro ggc Gly 270 gtg Val ggt Gly 816 gtc Val cct Pro ggt Gly 275 gtt Val ggc Gly gtg Val cca Pro ggt. Gly 280 gtg Val gga Gly gtg Val cca Pro ggc Gly 28 5 gtt Val ggt Gly gta Val 864 ccg Pro ggt Gly 290 gtg Val ggc Gly gtt Val ccg Pro gga Gly 295 gtc Val gga Gly gtt Val ccg Pro gga Gly 300 gta Val ggc Gly gtg Val cct Pro 912 ggl Gly 305 gtt Val ggg Gly gtt Val ccg Pro ggt Gly 310 gta Val ggt. Gly tcc Ser ggg Gly 3 Lys 315 tgg Trp gct Ala gcc Ala atc Ile gaa Glu 320 960 gaa Glu gaa Glu gca Ala gcc Ala gct Ala 325 att Ile aaa Lys gaa Glu gag Glu gca A ±a 330 gca Ala gcg Ala atc Ile gaa Glu gaa Glu 335 33 5 Lys 1008 gcc Ala gca Ala gcc Ala atc T 1 e 340 3dd Lys gag Glu gaa G1 u gcc Al a gca Ala 345 gct. Ala atc i le gag Glu gaa Glu cl<3 ö Lys 350 tgg Trp gct Ala 1C56 gcg Ala att Ile gaa Glu 355 qaq Glu gaa Glu gct Ala gcg Ala gca Ala 36C ata Ile CJcäci Glu gag Glu aaa Lys tgg Trp 365 gct Ala gct Ala atc I le 1104 aaa Lys gaa Glu 370 <5.3.3. T,ys gcg Ala gct Ala gc a A1 a atc Ile 375 aaa Lys tcc Ser gga Gly ach Thr agt Ser 380 1140 <2 10> <211> <212> <213> 20 3 SO PRT SyntheLi sch <4 00 > 20 Met 1 His Thr Pro Glu 5 His Ile Thr Ala Val 1 0 Val Gin Arg Phe Val 15 Ala Ala Leu ASn Ala 20 Gly Asp I.eu Asp Gly 25 T Le Val Ala ΐ .eu Phe 30 Ala Asp ASp A.! a Thr 35 Val Glu Asp Pro Val 40 GIv Ser Glu Pro Arg 45 Ser Gly Thr Al a Ala 5C Ile Arg Glu Phe Tyr 5 5 Ala Asn Ser Leu Lys 60 Leu Pro Leu Ala Val 65 Glu Leu Thr Gin Glu 70 Val Arg Ala Val Ala 75 Asn Glu Ala Ala Phe 80 Ala Phe Thr Val Ser 85 Phe Glu Tyr Gin Gly 90 Arg Lys Thr Val Val 95 Ala Pro Ile Asp His 100 Phe Arg Phe Asn G-Y 105 Ala Gly Lys Va 1 Val 1 1 0 Ser I le Arg Ala Leu 115 Phe Gly Glu Lys Asn 120 T 1 e Hi s Ala Cys Gl n 125 Met Asp Pro Met Tyr His H i s His His His K-; s Ser Arg Ala Gly Val Pro Gly Val 59 130 135 140 Gly 145 Val Pro Gly Val Gly 150 Val Pro Gly Val Gly 155 Val Pro Gly Val Gly 1 60 Val Pro Gly Val Gly 16 5 Val Pro Gly Val Glv 170 Val Pro Gly Val Gly 175 Val Pro Gly Val Gly 180 Va 1. Pro Gly Val Gly 185 Val Pro Gly Va _ Gly 19C Ser Gly Arg Met Lys 195 Gin Leu G1 u Asp Lys 200 Tie Glu Glu Leu Leu 205 Ser hys I le Tyr His 210 Leu Glu Asn Glu Ile 215 Ala Arg Leu Lys Lys 220 Leu Ile Gly Gl u Arg 225 Ser Gly Ser Pro Glu 230 Asp Lys Ile Ala Gin 23 5 Leu Lys Glu Lys Asn 240 Ala Ala Leu Lys Glu 245 Lys Asn G_n G_n Leu 250 Lys Glu Lys Ile Gin 255 Ala Leu Lys Tyr Gly 260 Ser Gly Val Pro Gly 265 Val Gly Val Pro Gly 270 Val Gly Val Pro Glv 275 Val Gly Val Pro Glv 280 Va 1 Gly Va 1 Pro Gly 285 Val Gly Val Pro Gly 29C Val Gly Val Pro Gly 295 Val Gly Val Pro Gly 300 Val Gly Val Pro Gly 305 Val G1 v Val Pro Gly 310 Val Gl y Ser Gly Lys 315 Trp Ala Al a T 1 e Glu 320 Glu Glu Al a A 1 a Ala 325 ile Lys Glu Glu Ala 33 0 Ala Ala I le Glu G "1 u 335 Lys Ala Ala Ala Ile 340 Lys Glu Glu Ala Ala 345 Ala Tie Gl u Glu Lys 35C Trp Ala Ala I le Glu 355 Glu Glu Ala Ala 7ila 360 Ile Glu Glu Lys Trp 365 Ala Ala Ile Lys Glu 370 Lys Ala Ala Ala Ile 375 Lys Ser Gly Thr Ser 380 <210> <211> <212> <213> 21 375 DNA Synthet.i; sch <220> <221 > <2 22> <223> CLIS < 1) · K5I . (375) <400> cat acc His Thr 1 21 cca Pro gaa Glu cac Hi s 5 atc Ile acc Thr gcc Ala gtg Val gta Val 10 cag Gin cgc Arg LtL Fhe gtg Väi gc t Ala 15 gcg Ala ctc Leu aa t A s n gct Ala ggr, Gly 2 0 gat Asp ctg Leu gac Asp ggc Gly atc I le 25 gtc Val gcg A^a ctg Leu ttt Phe gcc Aid 30 gar Asp gac Asp gcc ci cg gtg gaa gac ccc gtg ggt tcc gag ccc agg tcc ggt ocg gct 48 98 144 60

Ala Thr Val Glu Asp Pro Val Gly Ser Gl u Pro Arg Ser Gly Thr Ala 35 40 45 geg a 11 egt gag ttt tac gcc aac teg ctc aa a ctg cct ttg geg gtg 192 Ala Ile Arg Glu Phe Tyr Ala Asn Ser Leu Lys Leu Pro Leu Ala Val 50 55 60 gag ctq aeg cag gag gra ege geg gtc gcc aac gaa geg gcc ttc get 240 Glu Leu Thr Gin Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe Ala 65 70 75 8C tr.c acc gtc agc ttc gag tat cag ggc ege aag acc gta gtl geg ccc 288 Phe Thr Val Ser Phe Glu Tyr Gin Gly Arg Lys Thr Val Val Ala Pro 85 90 95 aic gat cac ttt ege ttc aat ggc gcc ggc aag gtg gtg agc atc ege 336 Ile Asp His Phe Arg Phe Asn Gly Ala Gly Lys Val Val Ser Ile Arg 100 105 110 gcc ttg ttt. ggc gag aag aat atr. cac gca tgc cag atg 37 5 Ala Leu Phe Gl γ Glu Lys Asn Ile His Ala Cvs Gin Met 115 120 125 <210> 22 <211 > 125 <212> PRT < 2 13 > Synr.het! ; sch <400> 22 His Thr Pro Glu His Ile Thr Ala Val Val Gin Arg Phe Val Ala Ala 1 5 10 15 Leu Asn Ala Gly Asp ^eu Asp Gly Ile Val Ala Leu Phe Ala Asp Asp 20 25 30 Ala Thr Va : Glu Asp Pro Va 1 Gly Ser Glu Pro Arg Ser Gly Thr Al a 35 40 45 Ala Ile Arg Glu Phe Tyr Ala Asn Ser Leu Lys Leu Pro Leu Ala Val 50 55 60 Glu Leu Thr Gin Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe Ala 65 70 75 80 Phe Thr Val Ser Phe Glu Tyr Gin Gly Arg Lys Th r Val Val Ala Pro 85 90 95 Ile Asp His Phe Arg Phe Asn Gly Ala Gly Lys Val Val Ser Ile Arg 100 105 110 Ala Leu Phe Gly Glu Lys Asn Ile His Ala Cys Gin Met 115 120 125 <210> 23 <2ll> 669 <212> DNA <213 > Syntheti sch <220> <2 2 1 > CDS <222> (1) . .(669) <2 2 3 > mNGF < 4 0 0 > 23 gaa ccg tat act gar. agc aac gtg cca gaa ggc gat agc gta cca gaa 48 Glu Pro Tyr Thr Asp Ser Asn Va 1 Pro Glu Gly Asp Ser Val Pro G 1 u 61 1 5 10 15 gcc cat tqg aca aaa ctg caa cac agc ctg gat aca gca ctg egt egt 96 Ala Hrs Trp Thr Lys Leu Gin His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg 20 25 30 gcc egt -ca gca cca aca get cct. att get gcc cg L gtt act ggt cag 144 Ala Arg Ser Ala Pro Thr Ala Pro Ile Ala Ala Arg Val Thr Gly Gin 35 40 45 acc ege aa- atc aeg gtg gac cct egt ctg etc aaa aaa ege ege ctg 1 92 Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys I ,ys Arg Arg Leu 50 55 60 cat tcc cct egt gtt ctg ttt agc aca caa cct ccg cca aca tca agc 240 His Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gin Pro Pro Pro Thr Ser Ser 65 70 75 80 gat aca ctg gac ctg gac ttt caa gca cat gga acc att ccg ttc aat 288 Asp Thr Leu Asp Leu Asp Phe Gin Ala His Gly Thr Ile Pro Phe Asn 85 90 95 egt. acc cat egt. tca aaa ege tca agc acc cat ccg gtg ttt cat atg 33 6 Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Thr His Pro val Phe Hi s Met 100 1 05 110 ggg gaa ttt teg gtt tgt gac agc gtg tet gtc tgg gtt ggg gat aaa 384 Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys 115 120 125 acc aca geg acc gat a Le aaa ggc aaa gaa g Lg acc g Le ctg gcc gaa 432 Thr Th r Al a Thr Asp T 1 e Lys Gly Lys Glu Val Thr Val Leu Ala Glu 1 3 0 135 140 gtc aat aic aac aac agc gtc ttt egt caa tat ttc ttc gaa acc 333 480 Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr lys 145 150 155 160 tgc egt gcc tca aaL c et gLa gaa agc ggg tgt cg L gga att gat Lea 528 Cy s Arg Ala Ser Asn Pro Val Glu Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser 165 170 175 33 3 cat tgg aac teg tat tgt acc acc act cac acc ttc gtt aaa gcc 576 Lys H: s T rp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala 1 80 185 190 ctg act acc gac gag aaa caa get get tgg ege ttt atc egt atc gat 624 '..eu Thr Thr Asp Glu Lys Gin Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp 195 200 205 acc get tgt gtg tgt gtc ctg tcc egt aaa gca aca egt egt ggt 669 'Ihr Al a Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Thr Arg Arg Gly 2] 0 215 220 < 2 1 0 > 24 <211 > 223 <21 2> PRT <21 3> Syntl netisch < 4 0 0 > 24 Gl u Pro Tyr Thr Asp Ser- Asn Val Pro Glu Gly Asp Ser Val Pro Glu 1 5 1 0 15 Al a His Trp Thr Lys Leu Gin His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg 20 25 30 62 Ala Arg Ser 3 5 Ala Pro Thr Ala Pro 40 Thr Arg 50 Asn 1 le Thr Val Asp 55 Pro Hi s 65 Ser Pro Arg Val Leu 70 Phe Ser Asp Thr Leu Asp Leu 85 Asp Phe Gin Arg Thr His Arg 100 Ser Lys Arg Ser Gly Gl u Phe 115 Ser Val Cys Asp Ser 120 Thr Thr 130 Ala Thr Asp Ile Lys 135 Gly Val 145 Asn Ile Asn Asn Ser 150 Val Phe Cys Arg Ala Ser Asn 165 Pro Val Glu Lys His Trp Asn 180 Ser Tyr Cys Thr Leu Thr Thr 195 Asp Glu lys Gl n Ala 200 Thr Ala 210 <210 > <211 > <212> <213> <220> <221> <2 2 2 > <223> < 4 C 0 > Cys Val Cys 25 186 DNA Synthetisch CDS (1)..(186) AEA 25 Val Leu 215 Ser aag tgg gct gcc atc gaa gaa gaa Lys 1 Trp Ala Ala Ile 5 Glu Glu Glu gca gcg £ LC gaa gaa 3 3 3 gcc gca Ala Al a Ile Glu 20 Glu Lys A_a Ala atc gag gaa aaa tgg gct gc.g atr Tie Glu Glu 35 lys Trp Ala A— 3. Ile 40 gag aaa tgg gct gct atc aaa gaa Glu Lys 50 Trp Ala Al a Γ le I iV 5 55 Glu

Ile Ala Ala Arg Val 45 Thr Gly Gin Arg Leu Phe Lys 60 Lys Arg Arg Leu Thr Gin Pro 75 P r o Pro Thr Ser Ser 80 Ala His 90 Gly Thr Ile Pro Phe 9 5 Asn Ser 105 Thr His Pro Va_ Phe 110 His Met Val Ser Val Trp Val 125 Gly Asp Lys Lys Glu Val Thr 140 Val Leu Ala Glu Arg Gin Tyr 15 5 Phe Phe Glu Thr Lys 1 60 Ser Gly 170 Cys Arg Gly Tie Asp 175 Ser Thr 185 Thr His Thr Phe Val 190 Lys Ala Ala Trp Arg Phe l le 205 Arg Ile Asp Arg Lys Ala Thr 22C Arg Arg Gly gca Ala gcc Ala 10 gcL Ala aLL Ile aaa Lys CJacä G_U gag Glu 15 gca Ala gcc Ala 25 atc Ile aaa Lys gag Glu gaa Glu gcc A~a 30 gca Ala gct Ala gaa Glu gag Glu gaa Glu gct Ala gcg Ala 4 5 gca Ala ata Ile gaa Glu aaa Lys gcg Al a gct Ala gca Ala 60 atc Ile aaa Lys 48 96 144 <210> 26 < 211> 62 < 212 > PRT <213> Synthetisch 186 63 <400> 26

Lys Trp Ala Ala Ile Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ile Lys Glu Glu Ala 15 10 15

Ala Ala Ile Glu Glu Lys Ala Ala Ala Ile Lys Glu Glu Ala Ala Ala 20 ~ 25 30

Ile Glu Glu lys Trp Ala Ala Tie Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ile Glu 35 40 45

Glu Lys Trp Ala Ala Ile Lys Glu Lys Ala Ala Ala Ile Lys 50 55 60 <210> 27 <211> 99

<212> DNA <213> Synthetisch <2 2 0 > <2 21> CDS <222> (1)..(99) <223 > P3 <40G> 27 ccc. Ser 1 ccg Pro gaa Glu gat Asp gag Glu 5 atc Ile cag Gin caa Gin ctg Leu gaa Glu 10 gaa Glu gaa Glu atc Ile gct Ala cag Gin 15 ctg Leu 48 gaa Glu cag Gin aaa Lys aac Asn 20 gca Ala gcg Ala ctg Leu aaa Lys gag Glu 25 aaa Lys aac Asn cag Gin gcg Ala ctg Leu 30 aaa Lys tac Tyr 96 ggt Gly 99 <210> <211 > <2 12 > <2 13 > 28 33 PRT Synthetisch <4 00 > 28 Ser 1 Pro Glu ASp Glu 5 Ile Gin Gin Leu Glu 10 Glu Glu Ile Ala C-ln 15 Leu Glu Gin Lys Asn 2C Ala Ala Leu Lys Glu 25 Lys Asn Gin Ala Leu 30 Lys Tyr

Glv <210> 29 <211> 99

<212> DNA <213> Synthetisch <220> <221> CDS <2 22> (1)..(99) < 2 2 3 > P4 <400> 29 agc ccg gaa gat aaa att gct cag ctg aaa caa aaa atc caa gcg ctg Ser Pro Glu Asp Lys Ile Ala Gin Leu Lys Gin Lys Γe Gin Ala Leu 48 • » · « * _ * «· ···« ·* * * » . . »

1 5 aaa cag gaa aac cag cag ctg qaa gag Lys Gin Glu Asn Gin Gin Leu Glu Glu 20 25 ggt

Gly 15 aac gCc qca ctg gaa tat 96

Asn Aia Ala LeLi g:u Tyr 30 <210> 30 <211> 33

<212> PRT <213> Synthetisch <400> 30 Ser Pro Glu Asp Lys I le Ala Gl n Leu 1 5 Lys Gin Glu Asn Gin Gin Leu Glu Glu 20 25 Gly <21 0> 31 < 211 > 99 <21 2> DNA <213> Synthetisch <220> <221 > CDS <222> (1)-.(99) <223> P5 <4 00> 31 tct cct gaa gac qaa aac gca gct ctg Ser Pro Glu Asp Glu Asn Ala Ala Leu 1 5 33d 083 aag aac geg gca ctg aas gaa Lys Gin Lys Asn Ala Ala Leu Lys Glu 20 25 ggc Gly <21 0> 3 2 <211> 33 <2 12> PRT <213> Synthetisch <4Q0> 32 Ser Pro i Glu Asp Glu Ao n Ala Ala Leu 1 5 Lys Gin i Lys Asn Al a Ala Leu iys Glu 20 25 Gly

Gin I>ys Ile Gin Ala Leu 15

Asn Ala Ala Leu Glu Tyr 30 gag aaa att gca caa ctg 18

Glu Lys Ile Ala Gin Leu 15 atL caa gca ctg gaa tat 95

Ile Gin Ala Leu Glu Tyr 3 0

Glu Lys Ile Ala Gl.n Leu 15

Ile Gin Ala Leu Glu Tyr 3 0 3 3 99 <21Q> <211 >

65

<212> DNA <213> Synthetisch <22C> <221> CDS <222> (1)..(99) <223 > P6 <400> 33 agc Ser 1 ccg Pro gaa Glu gat Asp S. öci Lys 5 aac Asn gcc Ala gct Ala ctg Leu aaa Lys 10 gag Glu gaa Glu atc Ile cag Gin gcg Ala 15 ctg Leu gaa Glu gaa Glu gaa Glu aac Asn 20 cag Gl n gct Al a ctg Leu gaa Glu gag Glu 25 aaa Lys atc Ile gca Ala cag Gin ctg Leu 30 aaa Lys tat Tyr ggt Gly < 21 0 > <2 11> <2 1 2> <2 13> 34 33 PRT Syntheti sch <40 0> 34 Ser 1 Pro Glu Asp Lys 5 Asn Al a Al a Leu Lys 1 0 Glu Glu Ile Gin Ala 15 Leu 48 96 99

Glu Glu Glu Asn Gin Ala Leu Glu Glu Lys Ile Ala Gin Leu Lys Tyr 20 25 30

Gly <210> 35 <211> 99

<212> DNA <213> Synthetisch < 2 2 0 > <2 2 1> CDS <2 22> (1) . . (99) <2 23> P7 <400> 35 tcc ccg gag gat gag otc cag gcg ctg gaa gaa aag aac gcc cag ctg

Ser Pro Glu Asp Glu Ile Gin Ala Leu Glu Glu Lys Asn Ala Gin Leu 15 IC 15 aag cag gaa att gcg gca ctg gaa gag aag aac cag gcc clg aag Lac

Lys Gin Glu Ile Ala Ala Leu Glu Glu Lys Asn Gin Ala Leu Lys Tyr 20 25 30 gat

Gly <21C> 36 <211> 33

<212> PRT <213> Synthetisch <400> 36 48 96 99 66

Ser 1 Pro Gl u Asp Glu 5 T 1 e Gin Ala Leu Glu 1 0 Glu Lys Asn Ala Gl n 15 Leu Lys Gin Glu Ile 20 Ala Ala Leu Glu Glu 25 Lys Asn Gin Ala Leu 30 Lys Tyr

Gly <210> 37 <211> 99

<212> DNA <213> Synthetisch <220> < 2 21 > CDS <222> (1)..(99) <723> P8 <400> 37

Lee Ser 1 ccg Pro gaa Glu gac Asp aaa Lys 5 atc Ile get Ala cag Gin ctg Leu aaa Lys 10 gaa Glu gaa C-lu aac Asn cag Gin cag Gin 15 ctg Leu 48 gaa Glu caa Gin aag Lys att Ile 20 cag Gin gcc Ala ctg Leu aag Lys gag Glu 25 gaa Glu aac Asn gca Ala get Ala ctg Leu 30 gaa Glu tac Tyr 96 qgc 99

Gly <210> 38 <211> 33

<212> PRT <213> Synthetisch <400> 38

Ser Pro Glu Asp Lys Ile Ala Gin Leu Lys Glu Glu Asn Gin Gin Leu 15 10 15

Glu Gin Lys Tie Gin Ala Leu Lys Glu Glu Asn Ala Ala Leu Glu Tyr 20 25 30

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Claims

* « ι a » * » · 1 Patentanwälte Dipl.-Ing. Helmut Hübscher Dipl.-Ing. Karl Winfried Hellmich Spittelwiese 7, A 4020 Linz (38589) HEL Patentansprüche: 1. Polypepidmaterial, das mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln enthält.
2. Polypepidmaterial nach Anspruch 1 gekennzeichnet, dass es auch mindestens eine oder eine Kombination von mehreren, in der Regel 2 bis 10, funktionelle Polypeptiddomänen enthält, die unter Folgenden ausgewählt, aber nicht darauf eingeschränkt sind: Wachstumsfaktoren, Moleküle für die Zelladhäsion, Molekül Chemotaxis, Ligand-Rezeptoren, Mikroben-abweisende Peptide, Faktoren für die Reprogrammierung, Faktoren für die Zelldifferenzierung, zytotoxische oder zytostatische Moleküle, wie z.B. der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), fibroblaste Wachstumsfaktoren, neuronale Wachstumsfaktoren (NGF), speziell SEQ ID NO: 24, Mikroben-abweisende Peptide wie Kathelizidine und Defensine; vor allem das Kathelizidin LL-37, speziell SEQ ID NO: 16, wobei diese funktionelle DNA-Polypeptiddomäne kovalent ans Polypeptidmaterial gebunden ist.
3. Polypepidmaterial nach Anspruch 1 gekennzeichnet, dass es auch mindestens eine oder eine Kombination von mehreren, in der Regel 2 bis 10, funktionelle Polypeptiddomänen enthält, die unter Folgenden ausgewählt, aber nicht darauf eingeschränkt sind: Wachstumsfaktoren, Moleküle für die Zelladhäsion, Molekül Chemotaxis, Ligand-Rezeptoren, Mikroben-abweisende Peptide, Faktoren für die Reprogrammierung, Faktoren für die Zelldifferenzierung, zytotoxische oder zytostatische Moleküle, wie z.B. der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), fibroblaste Wachstumsfaktoren, neuronale Wachstumsfaktoren (NGF), speziell SEQ ID NO: 24, Mikroben-abweisende Peptide wie Kathelizidine und Defensine; vor allem das Kathelizidin LL-37, speziell SEQ ID NO: 16, wobei die funktionelle DNA-Polypeptiddomäne mit mindestens einem Segment zur Bildung von Doppelwendeln verbunden ist, das die funktionelle Domäne auf * * · * ··· II t φ « « · · »« * * · · · » » Φ·· * » φ φ ·φ . * · · · 2 mindestens ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln des Polypeptidmaterials nach Anspruch P1 und P2 binden kann und wobei die funktionelle Domäne dem Polypeptidmaterial während der anfänglichen Zusammensetzung oder später hinzugefügt werden kann.
4. Polypeptidmaterial, nach beliebigem Anspruch von 1 bis 3 gekennzeichnet damit, dass das Elastin-ähnliche Segment aus mindestens 4 Wiederholungen zusammengesetzt ist, die denjenigen ähnlich sind, die wir im tierischen und menschlichen Elastin, deren Mutant oder im synthetischen Elastin mit der beibehaltenen Funktion, ähnlich wie Elastin, vorfinden.
5. Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 4 gekennzeichnet damit, dass der Elastin-ähnliche Abschnitt aus mindestens 4 Elastin-ähnlichen Wiederholungen aufgebaut ist, einschließlich mit, aber nicht eingeschränkt auf: Pentapeptide Val-Pro-Gly-Val-Gly oder Gly-Val-Gly-Val-Pro oder Gly-Val-Gly-Ile-Pro.
6. Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 5 gekennzeichnet damit, dass das Elastin-ähnliche Segment aus mindestens 12 und vorrangig weniger als 600 Aminosäureresten aufgebaut ist, wobei die Summe (% (n/n Glycinreste) und 2* {% (n/n) Prolinreste) mehr als 60 % (n/n) beträgt,
7. Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 6, gekennzeichnet damit, dass die Zahl der Elastin-ähnlichen Segmente zwischen 1 und 50 liegt, vorrangig zwischen 2 und 10, und die Zahl der Segmente zur Bildung von Doppelwendeln zwischen 2 und 50, vorrangig zwischen 3 und 10, wobei das Elastin-ähnliche Segment mindestens in einem Fall zwischen Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln liegt.
8. Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 7, gekennzeichnet damit, dass Segmente zur Bildung von Doppelwendeln aus mindestens zwei Heptaden aufgebaut sind und fähig sind, Homo-Oligomerate oder Hetero-Oligomerate mit einem Oligomerisierungszustand zwischen 2 und 7 zu bilden, wobei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln, parallele oder antiparallele, aus natürlichen Polypeptiden oder kultivierten Polypeptiden gewählt werden können.
9. Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 7, gekennzeichnet damit, dass Segmente zur Bildung von Doppelwendeln ausgewählt wurden unter: SEQ ID: 14 oder SEQ ID: 26 oder Paaren SEQ ID: 10 und SEQ ID: 12, SEQ ID: 28 und SEQ ID: 30; SEQ ID: 32 und SEQ ID: 34, SEQ ID: 36 und SEQ ID: 38.
10. Polypeptidmaterial, das nach beliebigem Anspruch von 1 bis 9 aus mindestens zwei Komponenten aufgebaut ist, gekennzeichnet damit, das das zusammengesetzte Polypeptidmaterial mit Integration mindestens zweier Polypeptidmaterialien nach beliebigem Anspruch von 1 bis 9 vorbereitet wurde, und wobei mindestens ein Segment zur Bildung von Doppelwendeln aus einer Komponente des Polypeptidmaterials mit mindestens einem der Segmente zur Bildung von Doppelwendeln Hetero-Oligomere, andere Komponenten des Polypeptidmaterials bildet, was einen Mechanismus zur Steuerung des Aufbaus des zusammengesetzten Polypeptidmaterials darstellt.
11. Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 10, gekennzeichnet damit, das es mindestens ein Elastin-ähnliches Segment und mindestens zwei Segmente zur Bildung von Doppelwendeln enthält, die optional an die funktionelle Proteindomäne gebunden sind, Segmente und Domänen aber sind optional mit einem Bindeglied, das von einer bis zu 20 Aminosäuren, vorrangig von einer bis zu 6 Aminosäuren, aneinander gebunden, das Protein aber enthält optional auch eine Signalabfolge, die die Sekretion des Proteins und die Aminosäureabfolge, die markierend dient, steuert.
12. Polypeptidmaterial nach Anspruch 3, gekennzeichnet damit, dass es Segmente zur Bildung von Doppelwendeln enthält, vereint mit funktionellen Polypeptiddomänen, Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln und die funktionellen Polypeptiddomänen sind untereinander optional mit einem Bindeglied verbunden, das mindestens eine und bis zu 20 Aminosäuren enthält, vorrangig eine bis 6 Aminosäuren. Das Protein * * · * * « · # I I ·**« »kt · t 1 • ·· ·· i i « · » I « 4 enthält optional auch eine Signalabfolge, die die Sekretion des Proteins und die Aminosäuremarkierungien) steuert.
13. Polypeptidmaterial, das aus Polypeptid material in unterschiedlichen Verhältnissen nach beliebigem Anspruch von 1 bis 12 aufgebaut ist.
14. Zersetzungsprozess von Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 10 bis 13, mit Hinzufügung von Polypeptid, das eine Wendel, die mit Segmenten zur Bildung von Doppelwendeln regenerieren kann, in der Komponente des Polypeptidmaterials enthält und die Peptide vorrangig gewählt sind unter SEQ ID NO: 10,12, 28, 30, 32, 34, 36, 38.
15. DNA, die eine Aufzeichnung fürs Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 13 trägt, wobei die DNA funktionell mit regulatorischen Elementen, dem Promotor und dem Terminator verbunden ist, mit der Absicht einer erhöhten Äußerung von Polypeptidmaterial in Gastgeberorganismen.
16. Vorbereitungsprozess von Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 13, der folgende Schritte einschließt: a) Kultivierung eines Gastgeberorganismus, der Polypeptidmaterial äußert, nach beliebigem Anspruch von 1 bis 13, und nach Anspruch 15 in der DNA kodiert ist; b) Isolierung von Polypeptidmaterial; und c) Mischen von Polypeptidmaterial mit der Absicht der Bildung von Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 13.
17. Anwendung von Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 13 für medizinisches und pharmazeutisches Material, bestimmt zur Beschleunigung des Zell-, Gewebe- und Organwachstums in vitro.
18. Anwendung von Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 13 für medizinisches und pharmazeutisches Material, bestimmt zur Behandlung von Lebendgewebe, vor allem menschlichem oder tierischem Gewebe mit Applikationen wie zum Beispiel, aber nicht nur: Substitution oder Regeneration von beschädigtem Ge- webe, wie Prothese, Verbände zur Behandlung von Wunden und Brandwunden, lokale Lieferung von zytotoxischen oder zytostatischen Polypeptiden.
19. Anwendung von Polypeptidmaterial nach beliebigem Anspruch von 1 bis 13 für medizinisches und pharmazeutisches Material, bestimmt zur Wachstumshemmung von Pathogenen, vor allem Bakterien, Viren und Hefepilzen. Linz, am 12. April 2012 Kemijski

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