DE60021388T2

DE60021388T2 - Monomeres protein der tgf-beta familie

Info

Publication number: DE60021388T2
Application number: DE60021388T
Authority: DE
Inventors: Gertrud Hötten; Rolf Bechtold; Jens Pohl
Original assignee: HyGene AG
Current assignee: HyGene AG
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2020-08-05
Also published as: NZ517125A; DK1198570T3; AU782481B2; AU6992700A; DE60021388D1; EP1198570A1; ATE299937T1; EP1198570B1; JP2003506086A; US7569227B2; EP1574578A1; CA2381219A1; ES2242630T3; WO2001011041A1; US6972321B1; CA2381219C; US20050282255A1; ZA200201032B; EP1074620A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein biologisch aktives Protein der TGF-R-Superfamilie, worin dieses Protein wegen der Substitution oder Deletion eines Cysteins, welches im Wildtypprotein für die Dimerisierung verantwortlich ist, in einer monomeren Form verbleibt. Ferner bezieht sich die Erfindung auf eine Nukleinsäure, welche für ein erfindungsgemäßes Protein codiert, einen Expressionsvektor, der eine solche Nukleinsäure enthält, und eine Wirtszelle, die eine korrespondierende Nukleinsäure oder einen Expressionsvektor enthält, wobei die Nukleinsäure zur Expression des Proteins geeignet ist. Die Erfindung bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Protein oder eine dafür codierende Nukleinsäure enthält. Die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung betrifft die Prävention oder Behandlung von allen Zuständen, die auch mit der dimeren Form des korrespondierenden Proteins behandelt werden können.
Viele Wachstumsfaktoren der TGF-ß-Superfamilie (Kingsley, Genes and Development 8, 133 – 146 (1994) sowie die darin zitierten Referenzen) sind für eine weite Bandbreite medizinischer Behandlungsverfahren und Anwendungen, die insbesondere die Promotion der Zellproliferation und Gewebebildung betreffen, einschließlich Wundheilung und Gewebenachbildung, maßgeblich. Solche Wachstumsfaktoren umfassen insbesondere Mitglieder der TGF-ß-(transformierender Wachstumsfaktor, siehe zum Beispiel Roberts and Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), Seite 419 – 472, Editoren: Sporn und Roberts), der DVR-Gruppe (Hötten et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 206 (1995), Seite 608 – 613 und weitere darin zitierte Literatur) einschließlich BMPs (Knochen-morphogenes Protein, siehe z.B. Rosen und Thies, Growth Factors in Perinatal Development (1993), Seite 39 – 58, Editoren: Tsang, Lemons und Balistreri) und GDFs (wachstumsdifferenzierende Faktoren), der Inhibin/Activin- (siehe zum Beispiel Vale et al., The Physiology of Reproduction, zweite Ausgabe (1994), Seite 1861 – 1878, Editoren: Knobil und Neill) und der GDNF-Proteinfamilie (Rosenthal, Neuron 22 (1999), Seite 201 – 204; Airaksinen et al., Mol Cell Neurosci 13 (1999), Seite 313 – 325). Obwohl die Mitglieder der TGF-ß-Superfamilie hohe Aminosäurehomologien im maturen Teil des Proteins aufweisen, insbesondere sieben konservierte Cysteine, zeigen sie bemerkenswerte Variationen in ihren genauen Funktionen. Oft zeigen einzelne Wachstumsfaktoren dieser Familien eine Vielzahl von Funktionen zur gleichen Zeit, so dass ihre Anwendung in verschiedenen medizinischen Indikationen von Interesse ist. Einige dieser multifunktionellen Proteine besitzen auch überlebens-fördernde Effekte auf Neuronen zusätzlich zu Funktionen, wie zum Beispiel der Regulation der Proliferation und Differenzierung in vielen Zelltypen (Roberts und Sporn, oben; Sakurai et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), Seite 14118 – 14122). Daher wurden zum Beispiel die trophischen Effekte auf motorische und sensorische embryonale Neuronen für TGF-ß in vitro gezeigt (Martinou et al., Devl. Brain Res. 52, Seite 175 – 181 (1990) und Chalazonitis et al., Dev. Biol. 152, Seite 121 – 132 (1992)). Zusätzlich werden überlebensfördernde Effekte für dopaminerge Neuronen des Mittelgehirns, für die Proteine TGF-ß-1, -2, -3, Activin A und GDNF (Glialzelllinien-abgeleiteter neurotrophischer Faktor), ein Protein, welches strukturelle Ähnlichkeiten mit den Mitgliedern der TGF-ß-Superfamilie zeigt, gezeigt, wobei diese Effekte nicht durch Astrocyten vermittelt werden (Krieglstein et al., EMBO J. 14, Seite 736 – 742 (1995)).
Interessante Mitglieder der TGF-ß-Superfamilie oder aktive Varianten davon umfassen TGF-β-Proteine, wie zum Beispiel TGF-ß1, TGF-ß2, TGF-ß3, TGF-ß4, TGF-ß5, (U.S. 5,284,763: EP 0376785 ; U.S. 4,886,747; DNA 7 (1988), Seite 1 – 8), EMBO J. 7 (1988), Seite 3737 – 3743), Mol. Endo. 2 (1988), Seite 1186 – 1195), J. Biol. Chem. 265 (1990), Seite 1089 – 1093), OP1-, OP2- und OP3-Proteine (U.S. 5,011,691, U.S. 5,652,337, WO 91/05802) sowie BMP2, BMP3, BMP4 (WO 88/00205, U.S. 5,013,649 und WO 89/10409, Science 242 (1988), Seite 1528 – 1534), BMP5, BMP6 und BMP-7 (OP1) (Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (1990), Seite 9841 – 9847, WO 90/11366), BMP8 (OP2) (WO 91/18098), BMP9 (WO 93/00432), BMP10 (WO 94/26893), BMP11 (WO 94/26892), BMP12 (WO 95/16035), BMP13 (WO 95/16035), BMP15 (WO 96/36710), BMP16 (WO 98/12322), BMP3b (Biochem. Biophys. Res. Comm. 219 (1996), Seite 656 – 662), GDF1 (WO 92/00382 und Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), Seite 4250 – 4254), GDF8 (WO 94/21681), GDF10 (WO 95/10539), GDF11 (WO 96/01845), GDF5 (CDMP1, MP52) (WO 95/04819; WO 96/01316; WO 94/15949, WO 96/14335 und WO 93/16099 und Nature 368 (1994), Seite 639 – 643), GDF6 (CDMP2, BMP13) (WO 95/01801, WO 96/14335 und WO 95/16035), GDF7 (CDMP3, BMP12) (WO 95/01802 und WO 95/10635), GDF14 (WO 97/36926), GFD15 (WO 99/06445), GDF16 (WO 99/06556), 60A (Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), Seite 9214 – 9218, DPP (Nature 325 (1987), Seite 81 – 84), Vgr-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 86 (1989), Seite 4554 – 4558), Vg-1 (Cell 51 (1987), Seite 861 – 867), Dorsalin (Cell 73 (1993), Seite 687 – 702), MIS (Cell 45 (1986), Seite 685 – 698), pCL13 (WO 97/00958), BIP (WO 94/01557), Inhibin a, Activin ßA und Activin ßB ( EP 0222491 ), Activin ßC (MP121) (WO 96/01316), Activin ßE und GDF12 (WO 96/02559 und WO 98/22492), Activin ßD (Biochem. Biophys. Res. Comm. 210 (1995), Seite 581 – 588), GDNF (Science 260 (1993), Seite 1130 – 1132, WO 93/06116), Neurturin (Nature 384 (1996), Seite 467 – 470), Persephin (Neuron 20 (1998), Seite 245 – 253, WO 97/33911), Artemin (Neuron 21 (1998), Seite 1291 – 1302), Mic-1 (Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 (1997), Seite 11514 – 11519), Univin (Dev. Biol. 166 (1994), Seite 149 – 158), ADMP (Development 121 (1995), Seite 4293 – 4301), Nodal (Nature 361 (1993), Seite 543 – 547), Screw (Genes Dev. 8 (1994), Seite 2588 – 2601). Weitere nützliche Proteine schließen biologisch aktive biosynthetische Konstrukte ein, einschließlich biosynthetischer Proteine, die unter Verwendung von Sequenzen von zwei oder mehr bekannten morphogenen Proteinen entworfen wurden. Beispiele für biosynthetische Konstrukte werden in U.S. 5,011,691 offenbart (zum Beispiel COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 und COP-16). Die Offenbarungen der zitierten Publikationen einschließlich Patente oder Patentanmeldungen werden hierin durch Referenz eingeschlossen.
Das Auftreten von Proteinen der TGF-ß-Superfamilie in verschiedenen Gewebestufen und Entwicklungsstufen korrespondiert mit Unterschieden bezüglich ihrer genauen Funktionen genauso gut wie bezüglich ihrer Zielgebiete, ihres Lebenszyklus, Erfordernissen für Hilfsfaktoren, der notwendigen zellularphysiologischen Umgebung und/oder dem Widerstand gegenüber Degradation.
Die Proteine der TGF-ß-Superfamilie existieren als Homodimere oder Heterodimere, die eine einzelne Disulfidbindung besitzen. Die Disulfidbindung wird durch einen spezifischen und in den meisten Proteinen konservierten Cysteinrest der entsprechenden Monomere vermittelt. Bis jetzt wurde es für die biologische Aktivität für unabdingbar gehalten, dass das Protein in seiner dimeren Form anwesend ist. Mehrere Publikationen wiesen darauf hin, dass biologische Aktivität nur für dimere Proteine erhalten werden kann und es wurde spekuliert, dass diese dimere Formation für eine weitere Polymerformation von zwei oder mehreren Dimeren wichtig ist, um so eine intrazelluläre Signalübertragung durch gleichzeitiges Binden an Typ I und Typ II Rezeptoren der TGF-ß-Superfamilienproteine auf Zellen zu erreichen. Es wurde angenommen, dass nur dieses simultane Binden an beiden Arten von Rezeptoren eine effekte interzelluläre Signalübertragung zum Wohl des Patienten erlauben würde (Bone, Band 19 (1996), Seite 569 – 574). Monomere Formen von TGF-ß-1 und Activin A wurden durch Austausch von Cys⁷⁷ bzw. Cys⁸⁰ durch einen Serinrest durch Mutagenese hergestellt. Diese Mutanten zeigten nur bis zu 20 % oder 1 % der biologischen Aktivität der korrespondierenden nativen Proteine (Amatayakul-Chantler et al., J. Biol. Chem. S. 27687 – 27691, Hüsken-Hindi et al., J. Biol. Chem., S. 19380 – 19384 (1994)).
Ein Nachteil der Verwendung dieser Proteine als Medikamente und ihrer Herstellung ist, dass sie durch rekombinante Expression in Prokaroyten ohne intensive Renaturierungsverfahren in biologisch aktiver und ausreichend reiner Form nicht einfach hergestellt werden können.
Daher war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine einfache und preisgünstige Möglichkeit bereitzustellen, um Proteine, die eine hohe biologische Aktivität aufweisen, reproduzierbar herzustellen, wobei diese biologische Aktivität im Wesentlichen zu der, der Dimere der Proteine dieser Familien korrespondieren sollte.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe durch ein Protein, das aus den Mitgliedern der TGF-ß-Protein-Superfamilie ausgewählt ist, gelöst, wobei das Protein wegen der Substitution oder Deletion eines Cysteins, das für die Dimerbildung verantwortlich ist, notwendigerweise monomer ist.
Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass die Substitution oder Deletion des Cysteins, welches normalerweise die Dimerisierung in den Proteinen bewirkt, nach der Expression und korrekter Faltung (richtige Bildung der intramolekularen Disulfidbrücken) zu einem monomeren Protein führt, das die biologische Aktivität der dimeren Form beibehält. Noch überraschender wurde herausgefunden, dass wenigstens einige der monomeren Proteine eine höhere Aktivität zeigen, basierend auf dem Gewicht des Proteins, als ihre entsprechenden dimeren Formen. Neben dieser verbesserten biologischen Aktivität ist es ein wichtiger Vorteil für die erfindungsgemäßen Proteine, dass sie in prokariotischen Wirten in großen Mengen exprimiert werden können und dass sie nach einfacher Rückfaltung der Monomere in einer großen Reinheit und mit großen Ausbeuten erhalten werden, ohne dass dimerisiertes von nicht-dimerisiertem (monomerem) Protein getrennt werden zu braucht. Diese Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung sind sehr überraschend, da, wie bereits oben erwähnt, es allgemeines Dafürhalten war, dass nur ein Dimer der morphogenen Proteine biologische Aktivität besitzt. Trotz dieses Dafürhaltens zeigen die erfindungsgemäßen Proteine eine zweifach höhere Aktivität als die des Dimers auf der Basis des Proteingewichts. Die kleinere Größe der erfindungsgemäßen Proteine, während die biologische Aktivität erhalten bleibt, kann auch als vorteilhaft betrachtet werden, z.B. für Anwendungen, die das Gehirn betreffen, da das monomere Protein die Blut-Hirn-Schranke sehr viel leichter passieren kann als die dimere Form.
Die erfindungsgemäßen Proteine umfassen alle Proteine der erwähnten Proteinfamilien, die normalerweise in dimerer Form vorliegen. Auch Teile von solchen Proteinen, die wesentliche Aktivität beibehalten, oder Fusionsproteine oder Vorläuferformen von Proteinen sollen durch die vorliegende Erfindung als umfasst gelten, genau wie biologisch aktive natürlich vorkommende oder biosynthetische Varianten von Proteinen der TGF-ß-Supertamilie, solange sie wenigstens ansehnliche biologische Aktivität zeigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das monomere Protein ein matures Protein oder ein biologisch aktiver Teil oder eine Variante davon. Der Ausdruck "biologisch aktiver Teil oder Variante davon" ist gedacht, entweder Fragmente, die Aktivität behalten, Vorläuferproteine, die zum Beispiel an der Aktivitätsstelle zu der maturen Form geschnitten sind oder selbst biologische Aktivität zeigen, oder auch Varianten, die im Wesentlichen noch immer die biologische Aktivität des Wildtypproteins beibehalten, bestimmt. Solche Varianten enthalten vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen, aber besonders am N-terminalen Ende des maturen Proteins führen auch erhebliche Deletionen oder Substitutionen nicht zu einem erheblichen Verlust der biologischen Aktivität. Es liegt eindeutig im Können des Fachmanns zu bestimmen, ob ein bestimmtes Protein die erforderte biologische Aktivität zeigt. Proteine, die wenigstens 70 % und vorzugsweise wenigstens 80 % Homologie zu den Wildtypproteinen der oben angegebenen Proteinfamilien zeigen, sollten als von der vorliegenden Erfindung umfasst zu sein verstanden werden, solange sie eine Deletion oder Substitution eines Cysteins enthalten, wie es für die erfindungsgemäßen Proteine erforderlich ist, und sie daher keine dimeren Formen ausbilden.
Es ist besonders bevorzugt, dass erfindungsgemäße Proteine wenigstens die 7 Cystein-Region enthalten, die charakteristisch für die TGF-ß-Protein-Superfamilie ist.
Diese spezifische 7 Cystein-Region wird als der wichtigste Teil der Proteine im Hinblick auf die biologische Aktivität erachtet. Daher sind die Proteine, die diese kritische Region erhalten, gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugte Proteine. Es ist im Fachgebiet offenbart, welches Cystein in einer bestimmten Proteinfamilie oder einem Protein für die Dimerbildung verantwortlich ist (siehe zum Beispiel: Schlunegger & Grutter (1992) Nature 358, 430 – 434; Daopin et al., (1992) Science 257, 369 – 373 und Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996), Seite 878 – 883). Dieses Cystein muss deletiert oder durch eine andere Aminosäure subsitutiert werden, um ein erfindungsgemäßes Protein auszubilden.
Die 7 Cystein-Region ist für viele Proteine der TGF-ß-Protein-Superfamilie bekannt. In dieser Region ist die jeweilige Lokalisierung der Cysteinreste zueinander wichtig und es ist nur erlaubt, leicht zu variieren, um die biologische Aktivität nicht zu verlieren. Konsesussequenzen für solche Proteine sind im Fachgebiet bekannt und alle Proteine, die solchen Konsensussequenzen entsprechen, werden als von der vorliegenden Erfindung umfasst angesehen.
Das Protein der vorliegenden Erfindung enthält eine Konsensussequenz gemäß der folgenden Sequenz, C(Y)₂₈CYYYC(Y)_30-32XC(Y)₃₁CYC (Formel I)worin C Cystein bedeutet, Y bedeutet jede beliebige Aminosäure einschließlich Cystein und X bedeutet jede beliebige Aminosäure außer Cystein.
Stärker bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Protein eine Konsensussequenz gemäß der folgenden Sequenz, worin C, X und Y dieselbe Bedeutung wie oben definiert besitzen. C(X)₂₈CXXXC(X)_31-33C(X)₃₁CXC (Formel II)worin C, X und Y dieselbe Bedeutung besitzen, wie sie oben definert wurde.
In diesen Konsensussequenzen sind besonders bevorzugte Abstände zwischen den jeweiligen Cystein-Resten enthalten, worin auch das Dimerbildende Cystein bereits durch eine andere Aminosäure substituiert ist. So wie es für alle Proteine der Protein-Superfamilie gilt, ist die Lokalisierung und der Abstand zwischen den Cysteinen wichtiger als die Identität der anderen Aminosäuren, die in der Region enthalten sind. Daher zeigt die Konsensussequenz die jeweilige Lokalisierung der Cysteine, zeigt aber nicht die Identität der anderen Aminosäuren, da diese anderen Aminosäuren innerhalb der Proteine der TGF-ß-Protein-Superfamilie weitgehend variabel sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße monomere Protein ein morphogenes Protein.
Die meisten Mitglieder der TGF-ß-Protein-Superfamilie sind morphogene Proteine, die in Behandlungen nützlich sind, worin die Regulation der Differenzierung und Proliferation von Zellen oder Vorläuferzellen von Interesse ist. Dies kann zum Ersatz von beschädigtem und/oder erkranktem Gewebe, wie zum Beispiel Skelett (Knochen, Knorpel)-Gewebe, Bindegewebe, peridontalem oder dentalem Gewebe, neuralem Gewebe, Gewebe des sensorischen Systems, Leber-, Pankreas-, Herz-, Blutgefäß- und Nierengewebe, Gebärmutter- oder Schilddrüsengewebe etc führen. Morphogene Proteine sind oft in der Behandlung von ulzerativem oder entzündetem Gewebeschaden und in Wundheilung jeglicher Art, wie zum Beispiel einer gesteigerten Heilung von Geschwüren, Verbrennungen, Verletzungen oder Hauttransplantationen, nützlich. Speziell bevorzugte Proteine gehören zu den BMP- oder GDF-Familien. Einige BMP-Proteine, die ursprünglich durch ihre Fähigkeit zur Induktion von Knochenbildung entdeckt wurden, sind, wie auch oben angezeigt wurde, beschrieben worden. In der Zwischenzeit wurden einige zusätzliche Funktionen gefunden, wie es auch für die Mitglieder der GDFs gilt. Diese Proteine zeigen ein sehr breites Feld von Anwendungen und sind zusätzlich zu ihrer Knochen- und Knorpelwachstum fördernden Aktivität (siehe zum Beispiel WO 88/00205, WO 90/11366, WO 91/05802) nützlich bei peridontalen Erkrankungen, zur Inhibierung von peridontalem und Zahngewebeverlust, zum Verschließen von Zahnkavitäten, zur Steigerung der Integration eines Zahns in einer Zahnfassung (siehe zum Beispiel WO 96/26737, WO 94/06399, WO 95/24210), für Bindegewebe, wie zum Beispiel Sehne oder Band (siehe zum Beispiel WO 95/16035), zum Verbessern des Überlebens von neuronalen Zellen, zum Induzieren des Wachstums von neuronalen Zellen und zum Reparieren neuronaler Defekte, für beschädigtes Zentralnervensystemgewebe infolge einer Apoplexie oder eines Traumas (sie zum Beispiel WO 97/34626, WO 94/03200, WO 95/05846), zum Erhalt oder Wiederherstellen der sensorischen Wahrnehmung (siehe zum Beispiel WO 98/20890, WO 98/20889), bei Nierenversagen (siehe zum Beispiel WO 97/41880, WO 97/41881), zur Leberregenerierung (siehe zum Beispiel WO 94/06449), zur Regenerierung des Herzmuskels (siehe zum Beispiel WO 98/27995), zur Behandlung oder zum Erhalt von Geweben oder Zellen zur Organ- oder Gewebetransplantation, für die Integrität der Magen-Darm-Schleimhäute (siehe zum Beispiel WO 94/06420), zum Erhöhen der Population an Vorläuferzellen, wie zum Beispiel hämopoetische Vorläuferzellen durch ex vivo Stimulation (siehe zum Beispiel WO 92/15323) etc. Ein bevorzugtes Mitglied der GDF-Familie ist das Protein MP52, welches auch als GDF-5 oder CDMP-1 bezeichnet wird. Die Anwendungen für MP52 spiegeln einige der bereits beschriebenen Anwendungen der BMP/GDF-Familie wider. MP52 wird für einen sehr effektiven Promotor der Bildung von Knochen und Knorpel genauso wie der Bildung von Bindegewebe gehalten (siehe zum Beispiel WO 95/04819, Hötten et al., (1996), Growth Factors 13, 65 – 74, Storm et al., (1994) Nature 368, 639 – 643, Chang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269 (45), 28227 – 28234).
In diesem Zusammenhang ist MP52 für Anwendungen, die die Verbindungen zwischen Skelettelementen betreffen, nützlich (siehe zum Beispiel Storm und Kingsley (1996), Development 122, 3969 – 3979). Ein Beispiel für Bindegewebe sind Sehne und Band (Wolfman et al., (1997), J. Clin. Invest. 100, 321 – 330, Aspenberg & Forslund (1999), Acta Orthop Scand 70, 51 – 54, WO 95/16035). MP52 ist auch für Zahnanwendungen (dental und peridontal) nützlich (siehe zum Beispiel WO 95/04819, WO 93/16099, Morotome et al. (1998), Biochem Biophys Res Comm 244, 85 – 90). MP52 ist in der Wundheilung jeglicher Art nützlich. Zusätzlich ist es zum Beispiel zur Förderung von Gewebewachstum im neuronalen System und dem Überleben von dopaminergen Neuronen sehr nützlich. In diesem Zusammenhang ist MP52 nützlich für Anwendungen in neurodegenerativen Erkrankungen, wie zum Beispiel der Parkinson Erkrankung und möglicherweise auch der Alzheimer Erkrankung, für Huntington Chorea Gewebe (siehe zum Beispiel WO 97/03188, Krieglstein et al., (1995) J. Neurosci Res. 42, 724 – 732, Sullivan et al., (1997) Neursci Lett 233, 73 – 76, Sullivan et al. (1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681 – 3688). MP52 erlaubt es, Nervenfunktionen zu erhalten oder Nervenfunktionen in bereits geschädigten Geweben zurückzuerhalten. MP52 wird deshalb für einen allgemein einsetzbaren neurotrophen Faktor gehalten. Es ist auch verwendbar für Erkrankungen des Auges, insbesondere der Retina, Hornhaut und dem Sehnerv (siehe zum Beispiel WO 97/03188, You et al. (1999), Invest Opthalmol Vis Sci 40, 296 – 311). Für das monomere MP52 wird erwartet, dass es alle bereits für die dimere Form beschriebenen Aktivitäten zeigt genauso wie weitere beschriebene Aktivitäten, wie sie für die dimeren Mitglieder der BMP/GDF-Familie beschrieben sind. Zum Beispiel wird erwartet, dass es auch zur Erhöhung von Vorläuferzellpopulationen und zur Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen ex vivo verwendbar ist. Vorläuferzellen können Zellen sein, die im Prozess der Knorpelbildung oder hämopoetischer Vorläuferzellen teilnnehmen. Es ist auch für beschädigtes oder erkranktes Gewebe verwendbar, wo eine Stimulation von Angiogenese vorteilhaft ist (siehe zum Beispiel Yamashita et al. (1997), Exp Cell Res 235, 218 – 226).
Ein erfindungsgemäß speziell bevorzugtes Protein ist deshalb das MP52 Protein oder ein biologisch aktiver Teil oder eine Variante davon. Wie in der bereits oben erwähnten Definition dieser Bezeichnungen kann MP52 zum Beispiel in seiner maturen Form verwendet werden, jedoch kann es auch verwendet werden als ein Fragment davon, welches wenigstens die 7 Cystein-Region enthält oder auch in einer Vorläuferform. Abweichungen am N-terminalen Teil des maturen MP52 beeinflussen seine Aktivität nicht in einem erheblichen Maß. Deshalb liegen Substitutionen, Deletionen oder Additionen am N-terminalen Teil der Proteine noch immer innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung. Es kann nützlich sein, ein Peptid am N-terminalen Teil des Proteins anzufügen, zum Beispiel zu Reinigungszwecken. Es kann nicht notwendig sein, dieses angefügte Peptid nach der Expression und Reinigung des Proteins abzuschneiden. Zusätzliche Peptide am N- oder C-terminalen Teil des Proteins können auch für das Targeting des Proteins auf ein spezielles Gewebe, wie zum Beispiel Nerven- oder Knochengewebe, oder für die Penetration der Blut/Hirn-Schranke dienen. Im Allgemeinen werden auch Fusionsproteine eines erfindungsgemäßen monomeren Proteins und eines anderen Peptids oder einer Gruppe als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung angesehen, wobei diese anderen Peptide oder Gruppen die Lokalisierung des Fusionsproteins steuern, zum Beispiel aufgrund von Affinität für einen bestimmten Gewebetyp etc. Beispiele für solche Fusionsproteine werden in WO 97/23612 beschrieben. Das Protein, das einen solchen Zusatz enthält, wird seine biologische Aktivität wenigstens so lange behalten, solange eine solche Addition die Bildung der biologischen aktiven Konformation des Proteins nicht beeinträchtigt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Proteine die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.ID.NO.1 (DNA- und Proteinsequenz) bzw. SEQ.ID.NO.2 (nur Proteinsequenz). SEQ.ID.NO.2 zeigt die gesamte Proteinsequenz von humanem MP52 Prepro- Protein, wie sie bereits in WO 95/04819 offenbart ist. Der Start des maturen Proteins liegt vorzugsweise in dem Gebiet der Aminosäuren 352 – 400, besonders bevorzugt an den Aminosäuren 381 oder 382. Daher umfasst das mature Protein die Aminosäuren 381 – 501 oder 382 – 501. Das erste Alanin des maturen Protein kann deletiert werden und das mature Protein umfasst dann vorzugsweise die Aminosäuren 383 – 501. Das Cystein an Position 465, das in dem bereits beschriebenen dimeren MP52-Protein anwesend ist, ist erfindungsgemäß entweder deletiert oder durch eine andere Aminosäure substituiert. Diese Deletion oder Substitution wird durch Xaa an der entsprechenden Position in SEQ.ID.NO.1 und 2 dargestellt.
Die Aminosäure, durch welche der Cystein-Rest, der die Dimerisierung bewirkt, substituiert wird, kann von jeder beliebigen Aminosäure ausgewählt werden, die die Bildung der biologisch aktiven Konformation nicht behindert. Die Aminosäure ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe von Alanin, Serin, Threonin, Leucin, Isoleucin, Glycin und Valin.
Die erfindungsgemäßen Proteine werden zusammenfassend durch die Abwesenheit des Cystein-Rests in der Aminosäuresequenz, der für die Dimerbildung verantwortlich ist, charakterisiert. Diese Abwesenheit kann durch Substitution des Cysteins durch eine andere Aminosäure oder durch Deletion erreicht werden. Im Falle der Deletion muss jedoch für das Protein gesichert werden, dass die Bildung der biologisch aktiven Konformation nicht behindert wird. Dasselbe trifft für die Wahl der Aminosäure zur Substitution zu, wobei es bevorzugt ist, eine Aminosäure zu verwenden, die eine ähnliche Form wie Cystein besitzt.
Die erfindungsgemäßen monomeren Proteine können leicht hergestellt werden, insbesondere durch Expression in Prokanoten und Renaturierung gemäß bekannter Verfahren. Es ist vorteilhaft, dass das Protein überwiegend in biologisch aktiver Form erhalten werden kann. Die Proteine in der monomeren Form weisen die gleiche Aktivität auf wie das Dimer, so dass basiernd auf der Menge an aktiver Substanz nur die gleiche Menge an monomerem Protein verwendet werden muss, um die gleichen positiven biologischen Effekte zu erreichen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die ein erfindungsgemäßes Protein codiert. Es ist offensichtlich, dass die Nukleinsäure eine solche Sequenz besitzen muss, dass eine Deletion oder Substitution des Cysteins, welches für die Dimerbildung verantwortlich ist, erreicht wird. Die Nukleinsäure kann eine natürlich vorkommende Nukleinsäure sein, aber auch eine rekombinant hergestellte oder eine prozessierte Nukleinsäure. Die Nukleinsäure kann sowohl eine DNA-Sequenz als auch eine RNA-Sequenz sein, solange das erfindungsgemäße Protein von dieser Nukleinsäure nach der Expression in einem geeigneten System erhalten werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäure eine DNA-Sequenz. Diese DNA-Sequenz umfasst in einer speziell bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine Sequenz, wie sie in SEQ.ID.NO.1 gezeigt ist und Teile davon. SEQ.ID.NO.1 zeigt eine Nukleinsäuresequenz, die für MP52 codiert, wobei das Codon für das Cystein, welches für die Dimerbildung verantwortlich ist, durch an anderes Codon ersetzt ist, welches nicht Cysteincodiert, oder deletiert ist. Diese Substitution oder Deletion wird in den Sequenzprotokollen als "nnn" gezeigt. Anstelle der gesamten Sequenz SEQ.ID.NO.1 können auch Teile verwendet werden, die für das mature Protein oder Fragmente, wie oben beschrieben, kodieren.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Nukleinsäure neben den codierenden Sequenzen auch Expressionskontrollsequenzen enthält. Solche Expressionskontrollsequenzen sind dem Fachmann bekannt und dienen dazu, die Expression des codierten Proteins in einer Wirtszelle zu kontrollieren. Die Wirtszelle muss nicht eine isolierte Zelle sein, vielmehr kann die Nukleinsäure im Patienten in vivo im Zielgewebe exprimiert werden. Dies kann durch Insertieren der Nukleinsäuren in das Zellgenom durchgeführt werden, jedoch ist es auch möglich, die Wirtszellen mit Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, zu transformieren. Solche Expressionsvektoren sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, wobei die Nukleinsäure in ein geeignetes Vektorsystem insertiert wird, wobei das Vektorsystem gemäß der gewünschten Expression des Proteins ausgewählt wird. Das Vektorsystem kann ein eukaryotisches Vektorsystem sein, aber innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung ist es vorzugsweise ein prokaryotisches Vektorsystem, mit welchem die Proteine in prokaryotischen Wirtszellen in einer besonders leichten und reinen Art hergestellt werden können. Zusätzlich kann der Expressionsvektor ein viraler Vektor sein.
Auch Wirtszellen sind wiederum ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Wirtszellen sind dadurch charakterisiert, dass sie eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthalten, und dass sie fähig sind, die Information, die in den Nukleinsäuren bzw. dem Expressionsvektor anwesend ist, zur Expression eines monomeren erfindungsgemäßen Proteins zu nutzen.
Obwohl im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch eukaryotische Wirtszellen für die Herstellung des Proteins geeignet sind, ist es, wie bereits oben mehrere Male erwähnt, insbesondere vorteilhaft, dass das erfindungsgemäße Protein in prokaryotischen Wirtszellen hergestellt werden kann, was daher eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.
Nach einer solchen bevorzugten Expression in prokaryotischen Wirtszellen wird das Protein gemäß bekannten Verfahren gereinigt und renaturiert, wobei intramolekulare Cysteinbrückenbildung bewirkt wird.
Da jedoch nicht nur die in vitro Herstellung des monomeren Proteins möglich ist, sondern auch die in vivo Expression von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform eine eukaryotische Wirtszelle und besonders eine eukaryotische Wirtszelle, die die DNA in ihrem Genom oder als einen Expressionsvektor enthält. Eine solche Wirtszelle kann zur Applikation gegenüber einem Individuum, welches eine morphogene Behandlung benötigt, anwendbar sein.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die wenigstens ein monomeres erfindungsgemäßes Protein enthalten, oder wenigstens eine Nukleinsäure, die für ein solches Protein codiert, oder wenigstens einen entsprechenden Expressionsvektor oder wenigstens eine eukaryotische Wirtszelle, die das monomere Protein exprimiert.
Das Protein selbst, aber auch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein Expressionsvektor oder eine Wirtszelle können vorteilhaft als Wirkstoffe in einer pharmazeutischen Zusammensetzung angesehen werden. Auch Kombinationen von monomeren Proteinen mit biologischen Aktivitäten entweder in der gleichen oder in verschiedenen Applikationen können in bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden. Besonders bevorzugt für neuronale Applikationen sind Kombinationen von MP52 mit anderen TGF-ß-Superfamilien-Proteinen, beide in monomerer Form, wie zum Beispiel mit GDNF (siehe WO 97/03188). Auch für Applikationen, die Knorpel und/oder Knochen betreffen, kann die Kombination von mehreren monomeren Proteinen nützlich sein, wie MP52 mit einem Protein der TGF-ß (siehe zum Beispiel WO 92/09697) oder MP52 mit einem Knorpelerhaltinduzierenden Protein, wie zum Beispiel BMP-9 (siehe zum Beispiel WO 96/39170). Wenn eine Nukleinsäure oder ein Expressionsvektor verwendet wird, muss jedoch sichergestellt werden, dass bei der Verabreichung gegenüber dem Patienten eine Umgebung vorhanden sein muss, in welcher die Nukleinsäure bzw. der Expressionsvektor exprimiert werden kann, und dass das erfindungsgemäße Protein an dieser Wirkungsstelle in vivo hergestellt werden kann. Das Gleiche betrifft entsprechend die erfindungsgemäße Wirtszelle. Wenn Expressionsvektoren oder Wirtszellen verwendet werden, ist es auch möglich, dass sie für mehr als nur ein monomeres erfindungsgemäßes Protein codieren, um eine Kombination von zwei oder mehr monomeren Proteinen herzustellen.
Es ist sowohl für das Protein und die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor oder die Wirtszelle vorteilhaft, wenn sie in und/oder auf einer biokompatiblen Matrix verabreicht werden. Das Matrixmaterial kann in den Patienten transplantiert werden, zum Beispiel chirurgisch, wobei das Protein entweder auf der Oberfläche des Matrixmaterials wirksam ist oder das Protein oder die DNA, die das Protein codiert, kann langsam aus dem Matrixmaterial freigesetzt werden und dann über einen langen Zeitraum wirksam sein. Zusätzlich ist es möglich und vorteilhaft, in der pharmazeutischen Zusammensetzung ein bioabbaubares Matrixmaterial zu verwenden, weil sich dieses Material vorzugsweise während der Protein-induzierten Gewebebildung auflöst, so dass ein Protein oder eine Nukleinsäure, die darin enthalten sind, freigesetzt wird und das neu gebildete Gewebe das Matrixmaterial ersetzt.
Schließlich ist es für den Fall von Applikationen, die die Knochenbildung betreffen, vorteilhaft, ein Matrixmaterial zu verwenden, welches selbst zum Beispiel osteogen aktiv ist. Durch Verwendung eines solchen Matrixmaterials wird es möglich, einen synergistischen Effekt des Proteins und des Matrixmaterials zu erzielen und eine besonders schnelle und effektive Knochenbildung zu bewirken.
Ein besonders bevorzugtes Matrixmaterial, das erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist in U.S. 5,231,169 und U.S. 5,776,193 beschrieben und ist besonders für Applikationen wie spinale Fusion geeignet.
Wenn eine Kombination von Matrixmaterial und Protein und/oder einer Nukleinsäure und/oder einem Expressionsvektor verwendet wird, ist es vorteilhaft, eine solche Kombination vor ihrer Verwendung zu sterilisieren. Die Matrix und das morphogene Protein können einzeln sterilisiert und dann kombiniert werden, aber es ist vorteilhaft, das Mittel, das aus Matrix und morphogenem Protein besteht, abschließend zu sterilisieren. Eine abschließende Sterilisierung kann durch Ionisierungsstrahlung, wie bereits für dimere Proteine (U.S. 5,674,292) beschrieben, erreicht werden, aber es ist auch vorteilhaft, Ethylenoxid zu verwenden.
Natürlich umfasst diese Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die weitere Substanzen, wie zum Beispiel pharmakologisch annehmbare Hilfsstoffe und Trägersubstanzen, enthalten. Jedoch muss das erfindungsgemäße Protein auch für den Fall, dass ein Matrixmaterial verwendet wird, nicht zusammen mit dem Matrixmaterial verwendet werden, sondern kann auch systemisch verabreicht werden, wobei es sich vorzugsweise in der Umgebung eines implantierten Matrixmaterials konzentriert.
Für einige Applikationen kann das erfindungsgemäße Protein bzw. die Nukleinsäure, die das Protein bildet, oder der Expressionsvektor oder die Wirtszelle vorzugsweise in einer injizierbaren Zusammensetzung anwesend sein. Implantate sind nicht für jede Form der Applikation von erfindungsgemäßen Proteinen notwendig oder möglich. Jedoch ist es auch möglich, einen implantierbaren Behälter oder eine implantierbare Mikropumpe, die zum Beispiel semipermeable Membranen, in welchen das erfindungsgemäße Protein oder die es erzeugende Nukleinsäure enthalten ist, bereitzustellen, aus welchen jedes der beiden über einen verlängerten Zeitraum langsam freigesetzt wird. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch andere Vehikel enthalten, welche es möglich machen, dass die Proteine oder die Nukleinsäuren oder die Expressionsvektoren, die diese Proteine codieren, an die Wirkungsstelle transportiert werden und dort freigesetzt werden, wobei zum Beispiel Liposomen oder Nanosphären verwendet werden können. Im Prinzip ist es auch möglich, Wirtszellen zu verwenden, wie zum Beispiel implantierte embryonale Zellen, die die Proteine exprimieren. Zellen, die mit rekombinanter DNA transfiziert wurden, können vor der Implantierung verkapselt werden. Jede andere praktizierbare, aber hierin nicht explizit beschriebene Form der Applikation der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung und deren entsprechende Herstellung werden durch die vorliegende Erfindung auch umfasst, solange sie ein erfindungsgemäßes Protein oder eine Nukleinsäure oder einen Expressionsvektor, der dafür codiert, oder eine Wirtszelle, die es exprimiert, enthalten.
Obwohl die Indikationen hierin nicht beschränkt werden sollen und alle Indikationen, die die dimere Form des erfindungsgemäßen Proteins aufweisen, auch umfasst sind, sind im Folgenden Arten der Applikation für erfindungsgemäße Zusammensetzungen aufgelistet, welche als besonders bevorzugte Indikationen für erfindungsgemäße Proteine gehalten werden. Auf der einen Seite ist die Prävention oder Therapie von Erkrankungen, die mit Knochen- und/oder Knorpelschaden verbunden sind, oder zur Beeinflussung von Knochen- und/oder Knorpelerkrankungen, oder allgemeine Situationen, in welchen Knorpel- und/oder Knochenbildung wünschenswert ist, oder für spinale Fusion und auf der anderen Seite ist die Prävention oder Therapie von beschädigtem oder erkranktem Gewebe, welches mit Bindegewebe verbunden ist, einschließlich Sehne und/oder Band, peridontalem oder dentalem Gewebe, einschließlich dentalen Implantaten, neuronalem Gewebe einschließlich Zentralnervensystemgewebe und neuropathologischen Situationen, Gewebe des sensorischen Systems, Leber-, Pankreas-, Herz-, Blutgefäß-, Nieren-, Uterus- und Schilddrüsengewebe, Haut, Schleimhäute, Endothelium, Epithelium, zur Promotion oder Induktion von Nervenwachstum, Geweberegenerierung, Angiogenese, Wundheilung einschließlich Geschwüren, Verbrennungen, Verletzungen oder Hauttransplantation, Induktion der Proliferation von Vorläuferzellen oder Knochenmarkzellen, zur Erhaltung eines Zustands der Proliferation oder Differenzierung, zur Behandlung oder Erhaltung von Gewebe oder Zellen für Organ- oder Gewebetransplantation, zur Integrität der Magen/Darmschleimhaut, zur Behandlung von Störungen von Fruchtbarkeit, Verhütung oder Schwangerschaft.
Erkrankungen, die Sinnesorgane wie das Auge betreffen, werden auch in die bevorzugte Indikation der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eingeschlossen. Als neuronale Erkrankungen können wiederum Parkinson- und Alzheimer-Erkrankungen als Beispiele erwähnt werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in jeder gewünschten Weise verwendet werden, wobei die pharmazeutischen Zusammensetzungen vorzugsweise für die chirurgische lokale Applikation, topische oder systemische Applikation formuliert werden. Hilfssubstanzen für die einzelne Applikationsform können selbstverständlich in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung anwesend sein. Für einige Applikationen kann es vorteilhaft sein, einige weitere Substanzen zu der pharmazeutischen Zusammensetzung zuzugeben, wie zum Beispiel Vitamin D (WO 92/21365), in Beziehung zu Parathyroidhormon stehendes Peptid (WO 97/35607), Chordin (WO 98/21335), antifibrinolytisches Mittel ( EP 535091 ), Antimetaboliten (WO 95109004), Alkylzellulose (WO 93/00050), Mannitol (WO 98/33514), Zucker, Glycin, Glutaminsäurehydrochlorid (U.S. 5,385,887), Antibiotika, Antiseptika, Aminosäuren und/oder Additive, welche die Löslichkeit oder Stabilität des monomeren morphogenen Proteins verbessern, wie zum Beispiel nicht-ionische Detergenzien (z.B. Tween 80), basische Aminosäuren, Trägerproteine (z.B. Serumalbumin), Volllängen-Propeptide der TGF-ß-Superfamilie und Teile davon.
Wie es bereits aus der Beschreibung der Proteine, Nukleinsäuren und pharmazeutischen Zusammensetzungen geschlossen werden kann, können die erfindungsgemäßen Proteine und die entsprechenden Nukleinsäuren, die für eine Expression der Proteine an der Wirkungsstelle bereitgestellt werden, vorteilhaft in allen Bereichen verabreicht werden, für die auch die dimeren Formen der Proteine, wie beschrieben, verabreicht werden können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist deshalb eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention jeglicher Indikationen der dimeren Formen der Proteine gemäß der Erfindung ein weiterer Gegenstand.
Hier ist es wiederum möglich, chirurgische Operationen durchzuführen und die pharmazeutische Zusammensetzung (insbesondere die, welche auf einem Matrixmaterial enthalten ist) zu implantieren, eine Verabreichung in einer flüssigen oder einer anderen geeigneten Form via zum Beispiel Injektion oder oraler Verabreichung scheint auch so geeignet wie eine topische Applikation für zum Beispiel Geweberegenerierung.
1A zeigt eine zweidimensionale Zeichnung der Konformation des rekombinant hergestellten dimeren MP52 mit dem deletierten ersten Alanin. In dieser Figur sind die 7 Cystein-Brücken, die in einem Dimer enthalten sind, gezeigt, wobei drei intramolekulare Cystein-Brücken pro Monomereinheit und eine intermolekulare Cystein-Brücke, die beide Monomere verbindet, vorliegen. 1B zeigt das erfindungsgemäße monomere Protein, wobei das Cystein der Aminosäuresequenz von MP52 durch X ersetzt wurde, das für jede beliebige Aminosäure außer Cystein steht.
Beispiele
Die Beispiele sollen die Erfindung bildhafter erklären und sind nicht gedacht, beschränkend zu wirken.
Expression von monomerem MP52 in E. coli, Rückfaltung, Reinigung und mögliche Testsysteme, um die biologische Aktivität zu bestimmen
Der mature Teil von humanem MP52 wurde durch Konvertierung von Cystein zu Alanin an Position 465 von SEQ.ID.NO.2 mutiert. Zu diesem Zweck wurden die Nukleotide an der Position 2032 und 2033 von SEQ.ID.NO.1 von TG zu GC umgewandelt. Die Substitution der Nukleotide wurde unter Verwendung des prokaryotischen Plasmids pBP2MP52m und eines PCR-Verfahrens durchgeführt.
Der Vektor pBP2MP52m ist ein Derivat des pBR322 Plasmids, das ein Ampicillin-Resistenzgen, einen T7-Promotor gefolgt von einer ribosomalen Bindestelle, ein Startcodon, den maturen Teil von MP52 (der für die Aminosäuren 382 – 501 in SEQ.ID.NO.2 mit einem Cystein an Position 465 codiert), Stoppcodons in jedem Leserahmen und einen Terminator enthält. Das Plasmid wurde beim DSM (DSM 10029, 2. Juni 1995) hinterlegt.
Die Mutation wurde unter Verwendung des QickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit mit PfuTurbo^TM DNA Polymerase und der Dpn I Endonuklease von Stratagene (Katalog #200518) gemäß der Gebrauchsanleitung des Herstellers durchgeführt. Das Oligonukleotid CCACACCACCCACCGCCTGTGTGCCCACGC (SEQ.ID.NO. 5) und das Oligonukleotid GCGTGGGCACACAGGCGGTGGGTGGTGTGG (SEQ.ID.NO. 6) wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt und als mutagene Primer verwendet. Das sich ergebende Plasmid pBP2MP52_ALA enthielt nach dem Startcodon die Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuren 382 – 501 in SEQ.ID.NO.2 mit einem Alanin an Position 465 codiert, was durch Sequenzierung bestätigt wurde.
Die Expression von monomerem MP52 kann durch Bereitstellen einer Quelle der T7 RNA Polymerase induziert werden. Unter Verwendung des Bakterienstammes BL21(DE3)pLysS (Novagen), der mit dem Plasmid pBP2MP52_ALA transformiert wurde, und Induktion des T7 RNA Polymerasegens gemäß den Anleitungen des Herstellers mit IPTG kann monomeres MP52 in Inclusion Bodies exprimiert werden, welche gemäß Standardverfahren isoliert werden können. Die weitere Reinigung wurde auf einer Umkehrphasensäule (Nucleosil 300-7C4, Machery-Nagel) mit einem 0 bis 50 % Puffer B Gradienten (Puffer A: 0,1 % TFA in Wasser, Puffer B: 90 % Acetonitril, 0,1 % TFA) in 50 Minuten (Flußgeschwindigkeit: 2 ml/min) durchgeführt. Die Fraktionen, die monomeres MP52 enthielten, wurden gepoolt, lyophilisiert und bei –70 °C gelagert. MP52 wurde in einem denaturierenden Puffer (6M Harnstoff, 500 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,3) gelöst und zur Rückfaltung in das 9-fache eines 50 mM Glycin-Puffersystems (pH 9,8), das CHAPS (20 mM), NaCl (500 mM) und 3 mM GSSG enthielt, zugegeben und bei 4 °C behutsam gerührt. Nach etwa 24 Stunden wurde die Probe mit dem 2,8-fachen an 14 mM NaH₂PO₄ verdünnt und einer isoelektrischen Präzipitierung unterzogen. Nach einer Zentrifugation wurde das Präzipitat in 0,1 % TFA gelöst und das gefaltete Monomer wurde durch Umkehrphasen-HPLC weiter aufgereinigt. Zu diesem Zweck wurde MP52 auf eine Säule geladen (Aquapore Octyl 20 Micron, Applied Biosystems), die mit 25 % Puffer B (Puffer A: 0,1 TFA in Wasser, Puffer B: 90 % Acetonitril, 0,1 % TFA) äquilibriert war. Monomeres MP52 wurde mit einem 25 – 60 % Puffer B-Gradienten in 70 Minuten (Flußgeschwindigkeit 3 ml/min) eluiert. Die Fraktionen, die gereinigtes zurückgefaltetes monomeres MP52 enthielten, wurden gepoolt, lyophilisiert, bei –70 °C gelagert und können für biologische Aktivitätsuntersuchungen verwendet werden. Nützlich für biologische Aktivitätsuntersuchungen von monomerem MP52 im Gebiet der Knorpel- und Knocheninduktion sind zum Beispiel die Messung der Steigerung der ALP-Aktivität (Takuwa et al., Am. J. Physiol. 257, E797 – E803, 1989) unter Verwendung Osteovorläuferzellenähnlicher ROB-C26-Zellen (Yamaguchi et al., Calcif. Tissue Int. 49, 221 – 225, 1991), wie es in WO 95/04819 beschrieben ist, oder ATDCS-Zellen (Riken Gene Bank, RCB 0565, embryonale Zellen, die wie Knorpelzellen differenzieren). Nützliche Aktivitätsuntersuchungen, die das neurologische Leistungsvermögen von zurückgefaltetem monomerem MP52 zeigen, sind die Messungen des gesteigerten Überlebens von dopaminergen Neuronen, wie zum Beispiel durch Krieglstein et al. (J. Neuroscience Res. 42, 724 – 732, 1995) oder Sullivan et al. (Neuroscience Letters 233, 73 – 76, 1997) beschrieben, oder der Auswuchs von Nervenfasern aus embryonaler Retina, wie es zum Beispiel in WO 97/03188 beschrieben ist. Das angiogene Leistungsvermögen von gefaltetem monomerem MP52 kann zum Beispiel in einem in vivo kornealen Mikrotaschenmodell bestätigt werden. In Kürze kann Hydron als ein langsam freisetzendes Pellet angepaßt nach D'Amato et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 4082 – 4085) verwendet werden. Etwa 2 μg von monomerem MP52 können in 20 μl von 50 % Acetonitril gelöst werden, stabilisiert mit 5 mg Sucralfat (Sucrosealuminiumsulfat; Bukh Medictec, Copenhagen) und mit 20 μl von 12 % (wt/vol) Hydron NCC (Interferon Science, New Brunswick, NJ) in Ethanol vermischt werden. Diese Mischung kann auf Teflon-Stöpsel pipettiert und getrocknet werden, um ein Pellet herzustellen. Nachfolgend kann das Pellet in korneale Mikrotaschen des Auges eines männlichen New Zealand White Kaninchens implantiert werden. Für diesen Zweck kann ein im Stroma liegender Tunnel, der an einer senkrechten linearen Inzision in der Pupillenebene beginnt und 2,75 mm vor dem Limbus endet, angelegt werden. Als eine postchirurgische Nachbehandlung sollte eine einzelne Dosis von Erythromycin-Wundsalbe auf die Oberfläche der Kornea gegeben werden. Etwa 10 Tage nach der Implantation sollten neue Kapillaren, welche aus der Implantationsstelle wachsen, gesehen werden. Der Auswuchs in Richtung auf das Pellet kann die chemotaktische Antwort der Endothelzellen auf das freigesetzte MP52 widerspiegeln und kann durch Messung des vaskularisierten Bereichs und der Zahl der Gefäße am Limbus quantifiziert werden.
Monomeres MP52, welches aus Inclusion Bodies isoliert und gereinigt wurde, aber nicht dem Rückfaltungsverfahren unterzogen wurde, kann als eine Negativkontrolle verwendet werden. Dimeres MP52 kann als die Positivkontrolle verwendet werden.
Die Stimulierung der Hematopoese kann zum Beispiel auf Kulturen von Knochenmarkaspirat, wie es zum Beispiel in Beispiel 8 von WO 98/22492 beschrieben ist, bestimmt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein, ausgewählt aus den Mitgliedern der TGF-ß-Superfamilie, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein wegen der Subsitution oder Deletion des Cysteins, welches für die Dimer-Bildung verantwortlich ist, notwendigerweise monomer ist, und welches die Konsensussequenz C(Y)₂₈CYYYC(Y)₃₀ _-32XC(Y)₃₁CYC umfasst, worin C Cystein bedeutet, Y bedeutet jede beliebige Aminosäure und X bedeutet jede beliebige Aminosäure außer Cystein.
Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein matures Protein oder ein biologisch aktiver Teil oder eine Variante davon ist.
Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein zu der BMP- oder GDF-Familie gehört.
Protein nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein MP52 (GDF-5) oder ein biologisch aktiver Teil oder eine Variante davon ist.
Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.2 oder einen Teil davon umfasst.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Cystein-Rest durch eine Aminosäure, die aus der Gruppe Alanin, Serin, Threonin, Leucin, Isoleucin, Glycin und Valin ausgewählt ist, substituiert ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzliche Aminosäuren enthält, die den Transport und die Lokalisierung des Proteins zu/in ein bestimmtes Gewebe erleichtern oder vermitteln.
Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie DNA ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz wie in SEQ ID NO. 1 gezeigt oder ein Fragment davon enthält.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner geeignete Expressions-Kontrollsequenzen enthält, welche die Expression des codierten Proteins erleichtern und/oder steuern.
Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 11 in einem geeigneten Vektorsystem enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Vektorsystem für die prokaryotische Expression geeignet ist.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 11 oder einen Expressionsvektor nach Ansprüchen 12 oder 13 enthält und nach der Expression der Nukleinsäure oder des Vektors fähig ist, ein monomeres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 herzustellen.
Wirtszelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine prokaryotische Wirtszelle ist.
Nicht-menschliche Wirtszelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Embryonalzelle ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder wenigstens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wenigstens einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 12 oder 13 oder eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein und/oder die Nukleinsäure sich in und/oder auf einem biokompatiblen Matrixmaterial befinden.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Matrixmaterial bioabbaubar ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Matrixmaterial selbst osteogen aktiv ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 zur Prävention oder Therapie von Erkrankungen, für welche auch die dimere Form des Proteins indiziert würde.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21 zur Prävention oder Therapie von Erkrankungen, die mit Knochen- und/oder Knorpelschäden verbunden sind oder zur Beeinflussung von Knochen- und/oder Knorpelerkrankungen oder Situationen, in welchen Knorpel- und/oder Knochenwachstum wünschenswert ist oder zur spinalen Fusion.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21 zur Prävention oder Therapie von beschädigtem oder erkranktem Gewebe in Verbindung mit Bindegewebe einschließlich Sehne und/oder Band, peridontalem oder dentalem Gewebe einschließlich dentalen Implantaten, neuralem Gewebe einschließlich Zentralnervensystemgewebe und neuropathologische Situationen, Gewebe des sensorischen Systems, Leber-, Pankreas-, Herz-, Blutgefäß-, Nieren-, Gebärmutter- und Schilddrüsengewebe, Haut, Schleimhäute, Endothelium, Epithelium, zur Promotion oder Induktion von Nervenwachstum, Geweberegenerierung, Angiogenese, Wundheilung einschließlich Geschwüren, Verbrennungen, Verletzungen oder Hauttransplantationen, Induktion der Proliferation von Vorläuferzellen oder Knochenmarkszellen, zur Erhaltung eines Zustands der Proliferation oder Differenzierung, zur Behandlung oder Erhaltung von Gewebe oder Zellen für die Organ- oder Gewebetransplantation, zur Integrität der Magen/Darmschleimhäute, zur Behandlung von Störungen von Fruchtbarkeit, Verhütung oder Schwangerschaft.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 23 für die chirurgische lokale Applikation, topische oder systemische Applikation.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner pharmakologisch annehmbare Hilfssubstanzen enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung injizierbar ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem Vehikel enthalten ist, das erlaubt, die Zusammensetzung zu einem festgelegten Wirkungsort zu leiten und dort freizusetzen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Vehikel aus Liposomen, Nanosphären, größeren implantierbaren Behältern und Mikropumpen ausgewählt ist.