ES2242630T3

ES2242630T3 - Proteina monomera de la familia tgf-beta.

Info

Publication number: ES2242630T3
Application number: ES00958383T
Authority: ES
Inventors: Gertrud Hotten; Rolf Bechtold; Jens Pohl
Original assignee: HyGene AG
Current assignee: HyGene AG
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2020-08-04
Also published as: DK1198570T3; CA2381219A1; EP1074620A1; EP1198570B1; US6972321B1; US7569227B2; CA2381219C; DE60021388T2; JP2003506086A; AU782481B2; AU6992700A; EP1574578A1; EP1198570A1; ZA200201032B; US20050282255A1; WO2001011041A1; NZ517125A; ATE299937T1; DE60021388D1

Abstract

Proteína seleccionada de los miembros de la superfamilia TGF-a caracterizada porque la proteína es necesariamente monómera debido a sustitución o deleción de la cisteína que es responsable de la formación de dímeros y que comprende la secuencia de consenso C(Y)28CYYYC(Y)30032XC(Y)31CYC, en la cual C denota cisteína, Y denota cualquier amino-ácido y X denota cualquier aminoácido excepto cisteína.

Description

Proteína monómera de la familia TGF-\beta.

La presente invención se refiere a una proteína biológicamente activa de la superfamilia TGF-\beta, en la cual esta proteína se mantiene en forma monómera debido a la sustitución o deleción de una cisteína que es responsable de la dimerización en la proteína de tipo salvaje. Adicionalmente, la invención concierne a un ácido nucleico, que codifica una proteína de acuerdo con la invención, un vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico y una célula hospedadora, que contiene un ácido nucleico correspondiente o un vector de expresión, siendo dicho ácido nucleico adecuado para la expresión de la proteína. La invención concierne también a una composición farmacéutica que contiene la proteína de acuerdo con la invención o un ácido nucleico que codifica la misma. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención concierne a la prevención o el tratamiento de todas las afecciones que pueden tratarse también con la forma dímera de la proteína correspondiente.

Muchos factores de crecimiento de la superfamilia TGF-\beta (Kingsley, Genes and Development 8, 133-146 (1994) así como las referencias citadas en dicho documento) son relevantes para una extensa gama de métodos y aplicaciones de tratamiento médico que conciernen en particular a la promoción de la proliferación celular y la formación de tejidos, con inclusión de la curación de las heridas y reproducción de tejidos. Dichos factores de crecimiento comprenden en particular miembros del TGF-\beta (factor de crecimiento transformante, véase v.g. Roberts and Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), páginas 419-472, compiladores: Sporn y Roberts), el grupo DVR (Hötten et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 206 (1995), páginas 608-613 y la bibliografía adicional citada en dicho documento) con inclusión de BMPs (proteína morfogenética ósea, véase v.g. Rosen y Thies, Growth Factors in Perinatal Development (1993), páginas 39-58, compiladores: Tsang, Lemons and Balistreri) y GDFs (factores de diferenciación del crecimiento), la inhibina/activina (véase v.g. Vale et al., The Physiology of Reproduction, 2ª edición (1994), páginas 1861-1878, compiladores: Knobil y Neill) y la familia de proteínas GDNF (Rosenthal, Neuron 22 (1999), páginas 201-203; Airaksinen et al. Mol Cell Neurosci 13 (1999), páginas 313-325). Aunque los miembros de la superfamilia TGF-\beta exhiben altas homologías de aminoácidos en la parte madura de la proteína, en particular 7 cisteínas conservadas, los mismos presentan variaciones considerables en sus funciones exactas. A menudo los factores de crecimiento individuales de estas familias exhiben una pluralidad de funciones al mismo tiempo, por lo que su aplicación es interesante en diversas indicaciones médicas. Algunas de estas proteínas multifuncionales tienen también efectos promotores de la supervivencia sobre las neuronas además de funciones tales como v.g. la regulación de la proliferación y diferenciación en muchos tipos de células (Roberts y Sporn, supra; Sakurai et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), páginas 14118-14122). Así, v.g., se demostraron efectos tróficos v.g. sobre neuronas motoras y sensoriales embrionarias para TGF-\beta in vitro (Martinou et al., Devl. Brain Res. 52, páginas 175-181 (1990) y Chalazonitis et al., Dev. Biol. 152, páginas 121-132 (1992)). Adicionalmente, se han demostrado efectos promotores de la supervivencia para neuronas dopaminérgicas del cerebro medio para las proteínas TGF-\beta-1, -2, -3, activina A y GDNF (factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales), una proteína que posee semejanzas estructurales con los miembros de la superfamilia TGF-\beta, no estando mediados estos efectos por astrocitos (Krieglstein et al., EMBO J., 14, páginas 736-742
(1995)).

Miembros interesantes de la superfamilia TGF-\beta o variantes activas de los mismos comprenden las proteínas TGF-\beta tales como TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4, TGF-\beta5 (documentos U.S. 5.284.763; EP 0376785; U.S: 4.886.747; DNA 7 (1988), páginas 1-8), EMBO J. 7 (1988), páginas 3737-3743), Mol. Endo. 2 (1988), páginas 1186-1195), J. Biol. Chem. 265 (1990), páginas 1089-1093), proteínas OP1, OP2 y OP3 (U.S. 5.011.691, U.S. 5.652.337, WO 91/05802) así como BMP2, BMP3, BMP4 (WO 88/00205), U.S. 5.013.649 y WO 89/10409, Science 242 (1988), páginas 1528-1534), BMP5, BMP6 y BMP-7 (OP1) (Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (1990), páginas 9841-9847, documento WO 90/11366), BMP8 (OP2) (documento WO 91/18098), BMP9 (documento WO 93/00432), BMP10 (documento WO 94/26893), BMP11 (documento WO 94/26892), BMP12 (WO 95/16035), BMP13 (WO 95/16035), BMP15 (WO 96/36710), BMP16 (WO 98/12322), BMP3b (Biochem. Biophys. Res. Comm. 219 (1996), páginas 656-662), GDF1 (WO 92/00382 y Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991, páginas 4250-4254), GDF8 (WO 94/21681), GDF10 (WO 95/10539), GDF11 (WO 96/01845), GDF5 (CBMP1, MP52) (WO 95/4819, WO 96/01316; WO 94/15949, WO 96/14335 y WO 93/16099 y Nature 368 (1994), páginas 639-643), GDF6 (CBMP2, BMP13) (WO 95/01801, WO 96/14335 y WO 95/16035), GDF7 (CBMP3, BMP12) (WO 95/01802 y WO 95/10635), GDF14 (WO 97/36926); GDF15 (WO 99/06445), GDF16 (WO 99/06556), 60A (Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), páginas 9214-9218), DPP (Nature 325 (1987), páginas 81-84), Vgr-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 86 (1989), páginas 4554-4558) Vg-1 (Cell 51 (1987), páginas 861-867), dorsalina (Cell 73 (1993), páginas 687-702), MIS (Cell 45 (1986), páginas 685-698), pCL13 (WO 97/00958), BIP (WO 94/01557), inhibina a, activina \betaA y activina \betaB (EP 0222491), activina \betaC (MP121) (WO 96/01316), activina \betaE y GDF12 (WO 96/02559 y WO 98/22492), activina \betaD (Biochem. Biophys. Res. Comm. 210 (1995), páginas 581-588), GDNF (Science 260 (1993), páginas 1130-1132, WO 93/06116), Neurturin (Nature 384 (1996), páginas 467-470), Persephin (Neuron 20 (1998), páginas 245-253, WO 97/33911), Artemin (Neuron 21 (1998), páginas 1291-1302), Mic-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), páginas 11514-11519), Univin (Dev. Biol. 166 (1994), páginas 149-158), ABMP (Development 121 (1995), páginas 4293-4301), Nodal (Nature 361 (1993), páginas 543-547), Screw (Genes Dev. 8 (1994), páginas 2588-2601). Otras proteínas útiles incluyen constructos biosintéticos biológicamente activos con inclusión de proteínas biosintéticas diseñadas utilizando secuencias de dos o más proteínas morfogenéticas conocidas. Ejemplos de constructos biosintéticos se describen en los documentos U.S. 5.011.691 (v.g. COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 y COP-16). La descripción de las citadas publicaciones, con inclusión de patentes o solicitudes de patente se incorpora en esta memoria por referencia.

La existencia de proteínas de la superfamilia TGF-\beta en diversas etapas tisulares y etapas de desarrollo se corresponde con diferencias en lo que respecta a sus funciones exactas así como sus sitios diana, duración de vida, requerimientos de factores auxiliares, ambiente fisiológico celular necesario y/o resistencia a la degradación.

Las proteínas de la superfamilia TGF-\beta existen como homodímeros o heterodímeros que tienen un solo enlace disulfuro. Este enlace disulfuro está mediado por un residuo cisteína, específico y conservado en la mayoría de las proteínas, de los monómeros respectivos. Hasta ahora, se consideraba como indispensable para la actividad biológica que la proteína esté presente en su forma dímera. Varias publicaciones indicaban que la actividad biológica puede obtenerse únicamente para proteínas dímeras y se especulaba que esta formación de dímeros es importante para la formación ulterior de polímeros de dos o más dímeros a fin de alcanzar la transmisión intercelular de señales por fijación simultánea a receptores de tipo I y tipo II para las proteínas de la superfamilia TGF-\beta en las células. Se suponía que únicamente esta fijación simultánea a ambas clases de receptores podría permitir la transmisión eficaz de señales intercelulares para el beneficio del paciente (Bone, volumen 19 (1996), páginas 569-574). Formas monómeras de TGF-\beta1 y activina A se produjeron por intercambio de Cys^{77} o Cys^{80}, respectivamente, para un residuo serina por mutagénesis. Estos mutantes exhibían sólo hasta 20% o 1%, respectivamente, de la actividad biológica de las proteínas nativas correspondientes (Amatayakul-Chantler et al., J. Biol. Chem. pp. 27687-27691, Hüsken-Hindi et al., J. Biol. Chem., pp. 19380-19384 (1994)).

Una desventaja del uso de estas proteínas como medicamentos y su producción es que las mismas no pueden obtenerse fácilmente en forma biológicamente activa y suficientemente pura por expresión recombinante en procariotas sin procedimientos de renaturalización intensivos.

Así, el objeto de la presente invención fue proporcionar una posibilidad sencilla y económica de producir de manera reproducible proteínas que exhiben alta actividad biológica, en la cual esta actividad biológica debería corresponder esencialmente a la de los dímeros de las proteínas de dichas familias.

Este objeto se resuelve de acuerdo con la invención por una proteína seleccionada de los miembros de la superfamilia de proteínas TGF-\beta, siendo dicha proteína necesariamente monómera debido a la sustitución o deleción de una cisteína que es responsable de la formación de los dímeros.

Sorprendentemente, se ha encontrado que la sustitución o deleción de la cisteína, que normalmente efectúa la dimerización en las proteínas, da como resultado la expresión y el plegado correcto (formación adecuada de los puentes disulfuro intramoleculares) en una proteína monómera que retiene la actividad biológica de la forma dímera. Todavía más sorprendentemente, se ha encontrado que al menos algunas de las proteínas monómeras exhiben una mayor actividad, basada en el peso de proteína, que sus respectivas formas dímeras. Aparte de esta actividad biológica mejorada, una ventaja importante de las proteínas de acuerdo con la invención es que las mismas pueden expresarse en gran cantidad en hospedadores procariotas y, después de replegado simple de los monómeros, se obtienen aquéllas con alta pureza y rendimiento muy alto sin necesidad de separar la proteína dimerizada de la no dimerizada (monómera). Los descubrimientos de la presente invención son muy sorprendentes dado que, como ya se ha mencionado anteriormente, era creencia generalizada que únicamente un dímero de las proteínas morfogenéticas tiene actividad biológica. A pesar de esta creencia, las proteínas de acuerdo con la invención exhiben una actividad hasta dos veces mayor que la del dímero sobre la base de peso de proteína. El tamaño más pequeño de las proteínas de la invención, a la vez que mantienen la actividad biológica, puede considerarse también como ventajoso, v.g. para aplicaciones que conciernen al cerebro dado que la proteína monómera puede atravesar mucho más fácilmente la barrera hematoencefálica que la forma dímera.

Las proteínas de acuerdo con la invención abarcan todas las proteínas de las familias de proteínas mencionadas que están presentes normalmente en forma dímera. Asimismo, partes de dichas proteínas que retienen actividad sustancial o proteínas de fusión o formas precursoras de proteínas deben considerarse abarcadas por la presente invención así como variantes biológicamente activas existentes naturalmente o biosintéticas de proteínas de la superfamilia TGF-\beta, con tal que las mismas exhiban al menos una actividad biológica considerable.

En una realización preferida de la presente invención, la proteína monómera es una proteína madura o una parte biológicamente activa o variante de la misma. La expresión "parte biológicamente activa o variante de la misma" tiene por objeto definir cualesquiera fragmentos que retengan actividad, proteínas precursoras que se escinden, v.g., en el sitio de actividad para dar la forma madura o exhiben actividad biológica por sí mismas, o también variantes que mantienen todavía esencialmente la actividad biológica de la proteína de tipo salvaje. Tales variantes contienen preferiblemente sustituciones conservadoras de aminoácidos, pero especialmente en la parte N-terminal de las proteínas maduras incluso deleciones o sustituciones considerables no conducen a una pérdida considerable de actividad biológica. Está plenamente dentro de la experiencia del experto en la técnica determinar si una determinada proteína exhibe la actividad biológica requerida. Proteínas que exhiben al menos 70% y preferiblemente al menos 80% de homología con las proteínas maduras de tipo salvaje de las familias de proteínas arriba citadas deberían considerarse abarcadas por la presente invención, con tal que contengan la deleción o sustitución de una cisteína, como se requiere para las proteínas de acuerdo con la invención, y por consiguiente no forman dímeros.

Se prefiere especialmente que las proteínas de acuerdo con la invención contengan al menos la región de 7 cisteínas característica para la superfamilia de las proteínas TGF-\beta.

La región específica de 7 cisteínas se considera como la parte más importante de las proteínas en lo que respecta a la actividad biológica. Por esta razón, las proteínas que retienen esta región crítica son proteínas preferidas de acuerdo con la invención. Se describen en la técnica anterior qué cisteína es responsable de la formación de dímeros en una determinada proteína o familia de proteínas (véase por ejemplo: Schlunegger & Grutter (1992) Nature 358, 430-434; Daopin et al., (1992) Science 257, 369-373 y Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996), páginas 878-883). Esta cisteína tiene que delecionarse o sustituirse por otro aminoácido para formar una proteína de acuerdo con la invención.

La región de 7 cisteínas se conoce para muchas proteínas de la superfamilia de proteínas TGF-\beta. En esta región, la localización respectiva de los residuos cisteína unos con respecto a otros es importante y sólo se permite que varíe ligeramente a fin de no perder la actividad biológica. Secuencias de consenso para tales proteínas se conocen en la técnica anterior y todas las proteínas que cumplen con tales secuencias de consenso se considera que están abarcadas por la presente invención.

La proteína de la presente invención contiene una secuencia de consenso de acuerdo con la secuencia siguiente

(fórmula I),C(Y)_{28} C Y Y Y C (Y)_{30-32} X C (Y)_{31} C Y C

en la cual C denota cisteína, Y denota cualquier aminoácido con inclusión de cisteína y X denota cualquier aminoácido excepto cisteína.

Más preferiblemente, la proteína de acuerdo con la invención contiene una secuencia de consenso de acuerdo con la secuencia siguiente

(fórmula II),C(X)_{28} C X X X C (X)_{31-33} C (X)_{31} C X C

en la cual C, X e Y tienen el mismo significado que se ha definido anteriormente.

En estas secuencias de consenso, están contenidas distancias especialmente preferidas entre los residuos cisteína respectivos, en las cuales ya también la cisteína formadora de dímeros está sustituida por otro aminoácido. Como sucede con todas las proteínas de dicha superfamilia de proteínas, la localización de y la distancia entre las cisteínas es más importante que la identidad de los otros aminoácidos contenidos en esta región. Por esta razón, la secuencia de consenso muestra la localización respectiva de las cisteínas, pero no muestra la identidad de los otros aminoácidos, dado que estos otros aminoácidos varían mucho en las proteínas de la superfamilia de proteínas TGF-\beta.

En una realización preferida de la presente invención, la proteína monómera de acuerdo con la invención es una proteína morfogenética.

La mayoría de los miembros de la superfamilia de proteínas TGF-\beta son proteínas morfogenéticas que son útiles para tratamientos en los cuales es interesante la regulación de la diferenciación y proliferación de las células o células progenitoras. Esto puede dar como resultado el reemplazamiento de tejidos dañados y/o enfermos como por ejemplo tejido esquelético (hueso, cartílago), tejido conectivo, tejido periodontal o dental, tejido neural, tejido del sistema sensorial, hígado, páncreas, cardíaco, vasos sanguíneos y tejido renal, tejido uterino o tiroideo, etc. Las proteínas morfogenéticas son útiles a menudo para el tratamiento de lesiones tisulares ulcerosas o inflamatorias y la curación de heridas de cualquier clase tal como la curación mejorada de úlceras, quemaduras, lesiones o injertos de piel.

Proteínas especialmente preferidas pertenecen a las familias BMP o GDF.

Han sido descritas varias proteínas BMP que fueron descubiertas originalmente por su capacidad para inducir la formación de hueso, como se ha indicado también anteriormente. Entretanto, se han encontrado varias funciones adicionales como sucede también para los miembros de las GDFs. Estas proteínas exhiben un campo muy extenso de aplicaciones y especialmente son además de su actividad promotora del crecimiento de hueso y cartílago (véase por ejemplo: WO 88/00205, WO 90/11366, WO 91/05802) útiles en enfermedad periodontal, para inhibir la pérdida de tejido periodontal y dental, para el sellado de cavidades dentales, para mejorar la integración de un diente en un alvéolo dental (véase por ejemplo: WO 96/26737, WO 94/06399, WO 95/24210), para tejido conectivo tal como tendón o ligamento (véase por ejemplo: WO 95/16035), para mejorar la supervivencia de las células neurales, para inducir el crecimiento de células neurales y reparación de defectos neurales, para tejido dañado del CNS debido a accidente cerebrovascular súbito o traumatismo (véase por ejemplo: WO 97/34626, WO 94/03200, WO 95/05846), para mantener o restaurar la percepción sensorial (véase por ejemplo WO 98/20890, WO 98/20889), para insuficiencia renal (véase por ejemplo: WO 97/41880, WO 97/41881), para regeneración hepática (véase por ejemplo WO 94/06449), para regeneración del miocardio (véase por ejemplo WO 98/27995), para tratamiento o preservación de tejidos o células para trasplante de órganos o tejidos, para integridad del revestimiento interior gastrointestinal (véase por ejemplo WO 94/06420), para aumento de la población de células progenitoras como por ejemplo células progenitoras hematopoyéticas por estimulación ex vivo (véase por ejemplo WO 92/15323), etc. Un miembro preferido de la familia DGF es la proteína MP52 que se denomina también GDF-5 o CBMP-1. Las aplicaciones para MP52 reflejan varias de las aplicaciones ya descritas para la familia BMP/GDF. Se considera que MP52 es un promotor muy eficaz de la formación de hueso y cartílago así como la formación de tejido conectivo (véase por ejemplo WO 95/04819, Hötten et al., (1996), Growth Factors 13, 65-74, Storm et al., (1994) Nature 368, 639-343, Chang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269 (45), 28227-28234). En este contexto, MP52 es útil para aplicaciones concernientes a las articulaciones entre elementos esqueléticos (véase por ejemplo Storm & Kingsley (1996) Development 122, 3969-3979). Un ejemplo para tejido conectivo es tendón y ligamento (Wolfman et al., (1997), J. Clin. Invest. 100, 321-330, Aspenberg & Forslund (1999), Acta Orthop. Scand 70, 51-54, WO 95/16035). MP52 es útil también para aplicaciones de odontología (dentales y periodontales) (véase por ejemplo WO 95/04819, WO 93/16099, Morotome et al. (1998), Biochem Biophys Res Comm 244, 85-90). MP52 es útil en la reparación de heridas de cualquier clase. Adicionalmente, es muy útil para promover el crecimiento de tejido en el sistema neuronal y la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas, por ejemplo. En este contexto, MP52 es útil para aplicaciones en enfermedades neurodegenerativas tales como v.g. la enfermedad de Parkinson y posiblemente también la enfermedad de Alzheimer, para los tejidos de la corea de Huntington (véase por ejemplo WO 97/03188, Krieglstein et al., (1995) J. Neurosci Res. 42, 724-732, Sullivan et al., (1997) Neurosci Lett 233, 73-76, Sullivan et al. (1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681-3688). MP52 permite mantener la función nerviosa o retener la función nerviosa en tejidos ya dañados. Por consiguiente, se considera que MP52 es un factor neurotrófico de aplicación general. El mismo es útil también para enfermedades oftálmicas, en particular de la retina, la córnea y el nervio óptico (véase por ejemplo WO 97/03188, You et al. (1999), Invest Opthalmol Vis Sci 40, 296-311). Se espera que la MP52 monómera exhiba todas las actividades ya descritas de la forma dímera así como algunas actividades descritas ulteriormente como se describe para los miembros de la familia de dímeros DPM/GDF. Se espera que aquélla sea útil también por ejemplo para aumentar las poblaciones de células progenitoras y para estimular la diferenciación de células progenitoras ex vivo. Las células progenitoras pueden ser células que toman parte en el proceso de formación de cartílago o células progenitoras hematopoyéticas. La misma es útil también para tejido lesionado o enfermo, en los casos en que es ventajosa una estimulación de la angiogénesis (véase por ejemplo: Yamashita et al. (1997), Exp Cell Res 235, 218-226).

Una proteína especialmente preferida de acuerdo con la invención es por consiguiente la proteína MP52 o una parte biológicamente activa o variante de la misma. Al igual que en la definición ya mencionada anteriormente de estos términos, MP52 puede utilizarse v.g. en su forma madura; sin embargo, puede utilizarse también la misma como uno de sus fragmentos que contenga al menos la región de 7 cisteínas o incluso en una forma precursora. Las desviaciones en la parte N-terminal de la MP52 madura no afectan a su actividad en un grado considerable. Por consiguiente, sustituciones, deleciones o adiciones en la parte N-terminal de las proteínas están todavía dentro del alcance de la presente invención. Podría ser útil añadir un péptido a la parte N-terminal de la proteína, v.g. por razones de purificación. Podría no ser necesario escindir este péptido añadido después de la expresión y purificación de la proteína. Péptidos adicionales en la parte N- o C-terminal de la proteína pueden servir también para el direccionamiento de la proteína a tejidos especiales tales como tejido nervioso o tejido óseo o para la penetración de la barrera hematoencefálica. Generalmente, también las proteínas de fusión de una proteína monómera de acuerdo con la invención y otro péptido o grupo se consideran dentro del alcance de la presente invención, en las cuales estos otros péptidos o grupos están dirigiendo la localización de la proteína de fusión, v.g. debido a afinidad para cierto tipo de tejido, etc. Ejemplos de tales proteínas de fusión se describen en WO 97/23612. La proteína que contiene dicha adición retendrá su actividad biológica al menos en tanto que dicha adición no sea perjudicial para la formación de la conformación biológicamente activa de la proteína.

En una realización especialmente preferida de la presente invención, las proteínas comprenden la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ. ID. No. 1 (secuencia de DNA y de proteína) y SEQ. ID. No. 2 (secuencia de proteína, sólo), respectivamente. SEQ. ID. No. 2 muestra la secuencia proteínica completa de la proteína prepro de MP52 humana, como se ha descrito ya en WO 95/04819. El comienzo de la proteína madura se encuentra preferiblemente en el área de los aminoácidos 352-400, de modo especialmente preferido en los aminoácidos 381 ó 382. Por consiguiente, la proteína madura comprende los aminoácidos 381-501 o 382-501. La primera alanina de la proteína madura puede estar delecionada y la proteína madura contiene entonces preferiblemente los aminoácidos 383-501. La cisteína en la posición 465 que está presente en la proteína MP52 dímera ya descrita está, de acuerdo con la invención, delecionada o sustituida por otro aminoácido. Esta deleción o sustitución se representa por Xaa en la posición respectiva en SEQ. ID. Nos. 1 y 2.

El aminoácido por el cual el residuo cisteína que efectúa la dimerización está sustituido puede seleccionarse por cualquier aminoácido que no deteriore la formación de una conformación biológicamente activa. El aminoácido se selecciona preferiblemente del grupo de alanina, serina, treonina, leucina, isoleucina, glicina y valina.

Las proteínas de acuerdo con la invención se caracterizan en suma por la ausencia del residuo cisteína en la secuencia de aminoácidos responsable de la formación del dímero. Esta ausencia puede realizarse por sustitución de esta cisteína por otro aminoácido o por deleción. Sin embargo, en el caso de deleción debe tenerse la seguridad para la proteína de que la formación de la conformación biológicamente activa no se vea impedida. Esto mismo es cierto para la selección del aminoácido de sustitución, en cuyo caso se prefiere utilizar un aminoácido que tenga una forma similar a la cisteína.

Las proteínas monómeras de acuerdo con la invención pueden producirse fácilmente, en particular por expresión en procariotas y renaturalización de acuerdo con métodos conocidos. Es ventajoso que la proteína pueda obtenerse en forma muy activa biológicamente. Las proteínas exhiben en forma monómera aproximadamente la misma actividad que el dímero, de tal modo que sobre la base de la cantidad de sustancia activa únicamente tiene que utilizarse la misma cantidad de la proteína monómera a fin de obtener los mismos efectos biológicos positivos.

Una cuestión adicional de la presente invención es un ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la invención. Es evidente que el ácido nucleico debe tener una secuencia tal que se consiga una deleción o sustitución de la cisteína responsable de la formación del dímero. El ácido nucleico puede ser un ácido nucleico existente naturalmente, pero también un ácido nucleico producido o procesado recombinantemente. El ácido nucleico puede ser tanto una secuencia de DNA como una secuencia de RNA, con tal que la proteína de acuerdo con la invención pueda obtenerse a partir de este ácido nucleico por expresión en un sistema adecuado.

En una realización preferida de la invención, el ácido nucleico es una secuencia de DNA. Esta secuencia de DNA en una forma especialmente preferida de la invención comprende una secuencia como la que se muestra en SEQ. ID. No. 1 o partes de la misma. SEQ. ID. No. 1 muestra un ácido nucleico que codifica MP52, en el cual el codón para la cisteína responsable de la formación del dímero está reemplazado por otro codón que no codifica cisteína o está delecionado. Esta sustitución o deleción se muestra como "nnn" en los protocolos de secuencia. En lugar de la secuencia completa de SEQ. ID. No. 1 pueden utilizarse también partes que codifican la proteína madura o fragmentos descritos también anteriormente.

En el marco de la presente invención se prefiere que el ácido nucleico, aparte de las secuencias codificantes, contenga también secuencias de control de la expresión. Tales secuencias de control de la expresión son conocidas por los expertos en la técnica y sirven para controlar la expresión de la proteína codificada en una célula hospedadora. La célula hospedadora no tiene que ser una célula aislada, y por otra parte, el ácido nucleico puede expresarse en el paciente in vivo en el tejido diana. Esto puede hacerse por inserción del ácido nucleico en el genoma de la célula; sin embargo, es posible también transformar células hospedadoras con vectores de expresión que contienen un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Tales vectores de expresión son un objeto adicional de la presente invención, en los cuales el ácido nucleico está insertado en un sistema vector adecuado, seleccionándose el sistema vector de acuerdo con la expresión deseada de la proteína. El sistema vector puede ser un sistema vector eucariota, pero -en el marco de la presente invención- el mismo es preferiblemente un sistema vector procariota, con el cual pueden producirse las proteínas en células hospedadoras procariotas de una manera particularmente fácil y pura. Adicionalmente, el vector de expresión puede ser un vector vírico.

Asimismo, las células hospedadoras son a su vez un objeto adicional de la presente invención. Las células hospedadoras se caracterizan porque contienen un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un vector de expresión de acuerdo con la invención y porque son capaces de utilizar la información presente en los ácidos nucleicos y en el vector de expresión, respectivamente, para la expresión de una proteína monómera de acuerdo con la invención.

Aunque en el marco de la presente invención son adecuadas también células hospedadoras eucariotas para la producción de la proteína, es particularmente ventajoso, como se ya se ha mencionado varias veces anteriormente, que la proteína de acuerdo con la invención pueda producirse en células hospedadoras procariotas, las cuales representan por tanto una realización preferida de la presente invención. Después de dicha expresión preferida en células hospedadoras procariotas, la proteína se purifica y se renaturaliza de acuerdo con métodos conocidos, efectuando de este modo la formación de puentes cistina intramoleculares.

Sin embargo, dado que no sólo es posible la producción in vitro de la proteína monómera, sino también la expresión in vivo de un ácido nucleico de acuerdo con la invención, una realización adicional preferida es una célula hospedadora eucariota, y especialmente una célula hospedadora eucariota que contenga el DNA en su genoma, o como un vector de expresión. Dicha célula hospedadora puede ser útil también para aplicación a un individuo que se encuentra en necesidad de tratamiento morfogenético.

Objetos adicionales de la presente invención son composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una proteína monómera de acuerdo con la invención o al menos un ácido nucleico codificante de una proteína de este tipo o al menos un vector de expresión correspondiente, o al menos una célula hospedadora eucariota que exprese la proteína monómera.

La proteína propiamente dicha, pero también un ácido nucleico de acuerdo con la invención, un vector de expresión o una célula hospedadora pueden considerarse como ventajosos como sustancias activas en una composición farmacéutica. Asimismo, combinaciones de proteínas monómeras, con actividades biológicas en la misma o diferentes aplicaciones, pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas preferidas. Especialmente preferidas para aplicaciones neuronales son combinaciones de MP52 con otras proteínas de la superfamilia TGF-\beta, ambas en forma monómera, como por ejemplo con GDNF (véase WO 97/03188).

Asimismo para aplicaciones concernientes a cartílago y/o hueso, podría ser útil la combinación de varias proteínas monómeras, como MP52 con una proteína de TGF-\beta (véase v.g. WO 92/09697) o MP52 con una proteína inductora del mantenimiento de cartílago tal como BMP-9 (véase v.g. WO 96/39170). Sin embargo, cuando se utiliza un ácido nucleico o un vector de expresión, es preciso tener la seguridad de que, cuando se administra al paciente, debe existir un entorno en el cual el ácido nucleico y el vector de expresión, respectivamente, puedan expresarse y la proteína de acuerdo con la invención pueda producirse in vivo en el sitio de acción. Esto mismo es aplicable, por consiguiente, a la célula hospedadora de acuerdo con la invención. Cuando se utilizan vectores de expresión o células hospedadoras, es posible también que los mismos codifiquen más de una proteína monómera de la invención para producir una combinación de dos o más proteínas monómeras.

Es ventajoso que tanto la proteína como el ácido nucleico o el vector de expresión o la célula hospedadora se apliquen en y/o sobre una matriz biocompatible. El material matriz puede ser transplantado al paciente, v.g. quirúrgicamente, en cuyo caso la proteína o bien es eficaz en la superficie del material matriz o la proteína o el DNA codificante de la proteína pueden liberarse lentamente del material matriz y ser eficaces luego durante un largo periodo de tiempo. Adicionalmente, es posible y ventajoso utilizar un material matriz biodegradable en la composición farmacéutica, en cuyo caso este material se disuelve preferiblemente durante la formación de tejido inducida por la proteína de tal manera que una proteína o un ácido nucleico contenido en él se libera y el tejido de nueva formación reemplaza al material matriz.

Finalmente, en el caso de aplicaciones relativas a la formación de hueso, es ventajoso utilizar un material matriz que es en sí mismo, v.g., osteogénicamente activo. Por la utilización de un material matriz de este tipo se hace posible conseguir un efecto sinérgico de proteína de material matriz y efectuar una formación de hueso particularmente rápida y eficaz.

Un material matriz especialmente preferido que puede utilizarse de acuerdo con la invención es un material matriz como se describe en los documentos U.S. 5.232.169 y U.S. 5.776.193, y especialmente para aplicaciones como la fusión espinal.

Cuando se utiliza una combinación de un material matriz y proteína y/o ácido nucleico y/o vector de expresión, es preferible esterilizar dicha combinación antes de su empleo. La matriz y la proteína morfogenética pueden esterilizarse por separado y combinarse luego, pero se prefiere esterilizar finalmente el dispositivo constituido por matriz y proteína morfogenética. La esterilización final puede realizarse por medio de radiación ionizante como se ha descrito ya para proteínas dímeras (U.S. 5.674.292), pero es también ventajoso utilizar óxido de etileno.

Por supuesto, esta invención abarca también composiciones farmacéuticas que contienen sustancias adicionales como v.g. sustancias auxiliares y vehículos farmacológicamente aceptables. Sin embargo, la proteína de acuerdo con la invención, también en el caso de utilización del material matriz, no tiene que utilizarse necesariamente junto con este material matriz, sino que puede administrarse también sistémicamente, en cuyo caso la misma se concentra preferiblemente en el entorno de un material matriz implantado.

Para algunas aplicaciones, la proteína de acuerdo con la invención y el ácido nucleico formador de esta proteína respectivamente, o el vector de expresión o la célula hospedadora pueden estar presentes preferiblemente en una composición inyectable. Los implantes no son necesarios o posibles para cualquier forma de aplicación de las proteínas de acuerdo con la invención. Sin embargo, es posible también proporcionar un depósito implantable o una microbomba implantable que contenga por ejemplo membranas semipermeables en las cuales está contenida la proteína de acuerdo con la invención o el ácido nucleico que genera la misma, a partir de los cuales se libera lentamente cualquiera de ellos a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede contener también otros vehículos que hacen posible que las proteínas o los ácidos nucleicos o los vectores de expresión que codifican estas proteínas se transporten al sitio de actividad y se liberen en el mismo, en cuyo caso pueden utilizarse v.g. liposomas o nanosferas. En principio, es también posible aplicar células hospedadoras, como v.g. células embrionarias implantadas que expresan las proteínas. Las células transfectadas con DNA recombinante pueden encapsularse antes de la implantación. Cualquier otra forma de aplicación de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención practicable pero no descrita explícitamente en esta memoria y su fabricación correspondiente están abarcadas también por la presente invención, con tal que las mismas contengan una proteína de acuerdo con la invención
o un ácido nucleico o un vector de expresión codificante de la misma, o una célula hospedadora que exprese la misma.

Aunque las indicaciones no deben restringirse en esta memoria y están comprendidas también todas las indicaciones que exhiben la forma dímera de la proteína de acuerdo con la invención, en lo que sigue se enumeran tipos de aplicación para las composiciones de acuerdo con la invención que se consideran como indicaciones particularmente preferidas para las proteínas de la presente invención. Por una parte, se encuentra la prevención o la terapia de enfermedades asociadas con el deterioro de hueso y/o cartílago o que afectan a enfermedades de hueso y/o cartílago, o situaciones generales en las cuales es deseable la formación de cartílago y/o hueso o para fusión espinal, y por otra parte se encuentra la prevención o terapia de tejido lesionado o enfermo asociado con tejido conectivo que incluye tendón y/o ligamento, tejido periodontal o dental con inclusión de implantes dentales, tejido neural con inclusión de tejido del CNS y situaciones neuropatológicas, tejido del sistema sensorial, hígado, páncreas, cardíaco, vasos sanguíneos, tejido renal, uterino o tiroideo, piel, membranas mucosas, endotelio, epitelio, para la promoción o inducción del crecimiento de los nervios, regeneración de tejidos, angiogénesis, curación de las heridas con inclusión de úlceras, quemaduras, lesiones o injertos de piel, inducción de la proliferación de células progenitoras o células de la médula ósea, para el mantenimiento de un estado de proliferación o diferenciación para el tratamiento o la preservación de tejido o células para transplante de órganos o tejidos, para la integridad del revestimiento gastrointestinal interior, para el tratamiento de alteraciones en la fertilidad, anticoncepción o embarazo.

Enfermedades concernientes a los órganos sensoriales tales como los ojos deben incluirse también en la indicación preferida de la composición farmacológica de acuerdo con la invención. Como enfermedades neuronales pueden mencionarse nuevamente como ejemplos las enfermedades de Parkinson y Alzheimer.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden utilizarse de cualquier manera deseada, formulándose preferiblemente las composiciones farmacéuticas para aplicación quirúrgica local, aplicación tópica o aplicación sistémica. Sustancias auxiliares para la forma de aplicación individual pueden estar presentes por supuesto en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Para algunas aplicaciones, puede ser ventajoso añadir algunas sustancias adicionales a la composición farmacéutica como por ejemplo vitamina D (WO 92/21365), péptido relacionado con la hormona paratiroidea (WO 97/35607), chordina (WO 98/21335), agente anti-fibrinolítico (EP 535091), anti-metabolitos (WO 95/09004), alquil-celulosa (WO 93/00050), manitol (WO 98/33514), azúcar común, glicina, hidrocloruro del ácido glutámico (U.S. 5.385.887), antibióticos, antisépticos, aminoácidos y/o aditivos que mejoran la solubilidad o la estabilidad de la proteína morfogenética monómera, como por ejemplo detergentes no iónicos (v.g. Tween 80), aminoácidos básicos, proteínas portadoras (v.g. seroalbúmina), propéptidos de longitud total de la superfamilia TGF-\beta o partes de los mismos.

Como puede deducirse ya de la descripción de las proteínas, ácidos nucleicos y composiciones farmacéuticas, las proteínas de acuerdo con la invención y sus respectivos ácidos nucleicos, que proporcionan una expresión de las proteínas en el sitio de actividad, pueden aplicarse ventajosamente en todas las áreas para las cuales se pueden aplicar también las formas dímeras de las proteínas, como se ha descrito. Por consiguiente, en el marco de la presente invención, un objeto adicional es el uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para el tratamiento o la prevención de cualesquiera indicaciones de las formas dímeras de las proteínas de acuerdo con la invención.

En este caso es nuevamente posible conducir las operaciones quirúrgicas e implantar la composición farmacéutica (contenida en particular sobre un material matriz), y una administración en forma líquida o adecuada de cualquier otro modo, v.g. por inyección o administración oral parece ser tan adecuada como una aplicación tópica para, v.g., la regeneración tisular.

La Fig. 1A muestra un gráfico bidimensional de la conformación de MP52 dímera producida recombinantemente con la primera alanina delecionada. En esta figura, se muestran los siete puentes cisteína contenidos en un dímero, existiendo tres puentes cistina intramoleculares por unidad de monómero y 1 puente cistina intermolecular que conecta ambos monómeros. La Fig. 1B muestra la proteína monómera de acuerdo con la invención en la cual la cisteína de la secuencia de aminoácidos de MP52 ha sido reemplazada por X, que designa cualquier aminoácido excepto cisteína.

Ejemplos

Los ejemplos explicarán la invención más ilustrativamente y no deben considerarse como limitantes.

Expresión de MP52 monómera en E. coli, replegado, purificación y posibles sistemas de ensayo para determinar la actividad biológica

La parte madura de la MP52 humana se mutó por conversión de cisteína en alanina en la posición 465 de SEQ. ID. No. 2. Para este propósito, los nucleótidos en la posición 2032 y 2033 de SEQ. ID. No. 1 se convirtieron de TG a GC. La sustitución de los nucleótidos se realizó por utilización del plásmido procariota pBP2MP52m y un método PCR.

El vector pBP2MP52m es un derivado del plásmido pBR322 que contiene un gen de resistencia a la ampicilina, un promotor T7 seguido por un sitio de fijación de ribosoma, un codón de partida, la parte madura de MP52 (codificante de los aminoácidos 382-501 en SEQ. ID. No. 2 con una cisteína en la posición 654, codones de parada en cada marco de lectura y un terminador. El plásmido fue depositado en el DSM (DSM 10029, 2 de junio de 1995).

La mutación se realizó utilizando el Kit de Mutagénesis Orientada QuickChange^{TM} con la DNA-polimerasa
PfuTurbo^{TM} y la endonucleasa Dpn I de Stratagene (Catálogo #200518) de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante. El oligonucleótido CCACACCACCCACCGCCTGTGTGCCCACGC (SEQ. ID. No. 5) y el oligonucleótido GCGTGGGCACACAGGCGGTGGGTGGTGTGG (SEQ. ID. No: 6) se purificaron por electroforesis en gel de poliacril-amida y se utilizaron como los iniciadores mutágenos. El plásmido resultante pBP2MP52_{ALA} contenía después del codón de partida la secuencia de nucleótidos codificante en los aminoácidos 382-501 en SEQ. ID. No: 2 con una alanina en la posición 465, lo que se comprobó por secuenciación.

La expresión de MP52 monómera puede inducirse proporcionando una fuente de RNA-polimerasa T7. Utilizando la cepa bacteriana BL21(DE3)pLysS (Novagen) transformada con el plásmido pBP2MP52_{ALA} e induciendo el gen de RNA-polimerasa T7 de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes con IPTG, puede expresarse la MP52 monómera en cuerpos de inclusión que pueden aislarse de acuerdo con procedimientos estándar. La purificación ulterior se realizó en una columna de fase inversa (Nucleosil 300-7C4, Machery-Nagel) con un gradiente de tampón B 0 a 50% (tampón A: 0,1% CFA en agua, tampón B: 90% acetonitrilo, 0,1% TFA) en 50 minutos (caudal: 2 ml/min). Las formación que contenían MP52 monómera se agruparon, liofilizaron y guardaron a -70ºC. se solubilizó MP52 en un tampón desnaturalizante (urea 6M, NaCl 500 mM, DTT 10 mM, EDTA 1 mM, Tris 20 mM, pH 8,3) y se añadió para replegado en 9 veces de un sistema tampón de glicina 50 mM (pH 9,8) que contenía CHAPS (20 mM), NaCl (500 mM) y GSSG 3 mM, después de lo cual se agitó moderadamente a 4ºC. Después de aproximadamente 24 horas, la muestra se diluyó 2,8 veces con NaH_{2}PO_{4} 14 mM y se sometió a precipitación isoeléctrica. Después de la centrifugación, el filtrado se disolvió en TFA al 0,1% y el monómero plegado se purificó ulteriormente por HPLC en fase inversa. Para este propósito, se cargó MP52 en una columna (Aquapore Octyl de 20 micrómetros, Applied Biosystems) equilibrada con 25% de tampón B (tampón A: TFA al 0,1% en agua, tampón B: 90% acetonitrilo, 90%, 0,1% TFA). La MP52 monómera se eluyó con un gradiente de tampón B 25-60% en 70 minutos (caudal 3 ml/min). Las fracciones que contenían MP52 monómera purificada replegada se agruparon, liofilizaron, y guardaron a -70ºC, y pueden utilizarse en estudios de actividad biológica. Útiles para estudios de actividad biológica de MP52 monómera en el campo de la inducción de cartílago y hueso son por ejemplo la medida de la actividad creciente de ALP (Takuwa et al., Am. J. Physiol. 257, E797-E803, 1989) utilizando células ROB-C26 semejantes a las osteoprogenitoras (Yamaguchi et al., Calcif. Tissue Int. 49, 921-925, 1991) como se describe en WO 95/04819 o células ATDC5 (Riken Gene Bank, RCB 0565, células embrionarias que se diferencian como células de cartílago). Ensayos útiles de actividad que muestran las capacidades neurológicas de la MP52 monómera replegada son la medida de la supervivencia incrementada de las neuronas dopaminérgicas como ha sido descrito por ejemplo por Krieglstein et al. (J. Neuroscience Res. 42, 724-732, 1995) o Sullivan et al. (Neuroscience Letters 233, 73-76, 1997) o el crecimiento de fibras nerviosas a partir de la retina embrionaria como se describe por ejemplo en el documento WO 97/03188. El potencial angiogénico de la MP52 monómera plegada puede verificarse por ejemplo en un modelo de microbolsa corneal in vivo. Resumidamente, puede utilizarse Hydron como un pelet de liberación lenta adaptado de D' Amato et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 4082-4085). Aproximadamente 2 \mug de MP52 monómera pueden disolverse en 20 \mul de acetonitrilo al 50%, estabilizado con 5 mg de sucralfato (sacarosa-sulfato de aluminio; Bukh Meditec, Copenhague) y mezclado con 20 \mul de Hydron NCC al 12% (peso/vol) (Interferon Science, New Brunswick, NJ) en etanol. La mezcla puede pipetearse sobre fichas de Teflón y secarse para producir un pelet. Subsiguientemente, el pelet puede implantarse en microbolsas corneales del ojo de un conejo blanco macho de Nueva Zelanda. Para este propósito, puede crearse un túnel intraestromático, partiendo de una incisión lineal perpendicular en el plano pupilar y que termina 2,75 mm delante del limbo. Como cuidado post-quirúrgico, debería administrarse una sola dosis de ungüento de eritromicina en la superficie de la córnea. Aproximadamente 10 días después de la implantación, deberían observarse nuevos capilares que crecen hacia el sitio de implantación. El crecimiento hacia el pelet puede reflejar la respuesta quimiotáctica de las células endoteliales a la MP52 liberada y puede cuantificarse por medida del área vascularizada y el número de vasos en el limbo.

Como control negativo puede utilizarse MP52 monómera aislada y purificada de cuerpos de inclusión, pero no sometida al proceso de replegado. Como control positivo se puede utilizar MP52 dímera.

La estimulación de la hematopoyesis puede determinarse por ejemplo sobre cultivos de aspirados de médula ósea como se describe en el Ejemplo 8 del documento WO 98/22492.

<110> HyGene AG

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<120> Proteína Monómera de la familia TGF-beta

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<130> 20780pwomd

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<140>

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<141>

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<150> EP99115613

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<151> 1999-08-06

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 2703

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (640)..(2142)

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<400> 1

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1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 501

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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6

7

8

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<210> 3

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador mutágeno

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccacaccacc caccgcctgt gtgcccacgc

\hfill

30

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<210> 4

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador mutágeno

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgtgggcac acaggcggtg ggtggtgtgg

\hfill

30

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<210> 5

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador mutágeno

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<400> 5

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ctggaggggg ctcagcctgt gtacccacgg

\hfill

30

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<210> 6

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador mutágeno

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtgggtac acaggccgag ccccctccag

\hfill

30

Claims

1. Proteína seleccionada de los miembros de la superfamilia TGF-\beta caracterizada porque la proteína es necesariamente monómera debido a sustitución o deleción de la cisteína que es responsable de la formación de dímeros y que comprende la secuencia de consenso

C(Y)_{28}CYYYC(Y)_{30-32}XC(Y)_{31}CYC,

en la cual C denota cisteína, Y denota cualquier amino-ácido y X denota cualquier aminoácido excepto cisteína.

2. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína es una proteína madura o una parte biológicamente activa o variante de la misma.

3. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la proteína pertenece a la familia de BMP o GDF.

4. Proteína de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada porque la proteína es MP52 (GDF5) o una parte biológicamente activa o variante de la misma.

5. Proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

caracterizada porque la misma comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ. ID. NO. 2 o una parte de la misma.

6. Proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,

caracterizada porque el residuo cisteína está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo de alanina, serina, treonina, leucina, isoleucina, glicina y valina.

7. Proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

caracterizada porque contiene aminoácidos adicionales que facilitan o median la transferencia y localización de la proteína en un tejido determinado.

8. Ácido nucleico, caracterizado porque codifica una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque es un DNA.

10. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque contiene una secuencia como la representada en SEQ. ID. NO. 1 o un fragmento de la misma.

11. Ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10,

caracterizado porque contiene adicionalmente secuencias adecuadas de control de la expresión que facilitan y/o dirigen la expresión de la proteína codificada.

12. Vector de expresión,

caracterizado porque contiene un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en un sistema vector adecuado.

13. Vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 12,

caracterizado porque el sistema vector es adecuado para expresión en procariotas.

14. Célula hospedadora,

caracterizada porque contiene un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 o un vector de expresión de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13 y después de la expresión de dicho ácido nucleico o vector es capaz de producir una proteína monómera de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

15. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 14,

caracterizada porque es una célula hospedadora procariota.

16. Célula hospedadora no humana de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque es una célula embrionaria.

17. Composición farmacéutica,

caracterizada porque contiene al menos una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o al menos un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, al menos un vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, o una célula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.

18. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17,

caracterizada porque la proteína y/o el ácido nucleico están contenidos en y/o sobre un material matriz biocompatible.

19. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18,

caracterizada porque el material matriz es biodegradable.

20. Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19,

caracterizada porque el material matriz es en sí mismo osteogénicamente activo.

21. Composición farmacéutica de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para la prevención o terapia de enfermedades para las cuales estaría indicada también la forma dímera de la proteína.

22. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21,

para la prevención o terapia de enfermedades asociadas con el deterioro de huesos y/o cartílagos o que afectan a enfermedades de los huesos y/o cartílagos o situaciones en las cuales es deseable el crecimiento de cartílago y/o hueso, o para fusión espinal.

23. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21,

para la prevención o terapia de tejido lesionado o enfermo asociado con tejido conectivo con inclusión de tendón y/o ligamento, tejido periodontal o dental con inclusión de implantes dentales, tejido neural con inclusión del tejido del CNS y situaciones neuropatológicas, tejido del sistema sensorial, hígado, páncreas, cardiaco, vasos sanguíneos, tejido renal, uterino y tiroideo, piel, membranas mucosas, endotelio, epitelio, para la promoción o inducción del crecimiento de los nervios, degeneración de tejidos, angiogénesis, curación de las heridas con inclusión de úlceras, quemaduras, lesiones o injertos de piel, inducción o proliferación de células progenitoras o células de la médula ósea, para mantenimiento de un estado de proliferación o diferenciación, para tratamiento o preservación de tejido o células para transplante de órganos o tejidos, para integridad del revestimiento interior gastrointestinal, para tratamiento de alteraciones en la fertilidad, anticoncepción o embarazo.

24. Composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, para aplicación quirúrgica local, aplicación tópica o aplicación sistémica.

25. Composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24,

caracterizada porque contiene adicionalmente sustancias auxiliares farmacológicamente aceptables.

26. Composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizada porque la composición es inyectable.

27. Composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26,

caracterizada porque está contenida en un vehículo que permite dirigir y liberar la composición a un sitio de acción determinado.

28. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 27,

caracterizada porque el vehículo se selecciona de liposomas, nanosferas, depósitos implantables mayores y microbombas.