ES2305757T3 - Materiales osteoinductivos mejorados. - Google Patents
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Abstract
Material osteoinductivo que comprende un material de matriz y, adsorbido en las superficies interiores y/o exteriores de este material de matriz, una o más proteínas morfogenéticas, en donde dicho material osteoinductivo puede obtenerse por contacto del material de matriz y la o las proteínas morfogenéticas en condiciones adecuadas para mantener la proteína estable y disuelta en una solución, permitiendo así que el material de matriz llegue a recubrirse uniformemente con la o las proteínas morfogenéticas, en donde dichas condiciones adecuadas se seleccionan de: (a) utilización de un tampón o disolvente que es capaz de mantener un pH inferior a 4,5 o superior a 10,3 durante el proceso de recubrimiento, o (b) utilización de un tampón o disolvente que tiene una concentración iónica de 100 mmol/l o menos y es capaz de mantener un pH inferior a 5,2 o superior a 9,5 durante el proceso de recubrimiento.
Description
Materiales osteoinductivos mejorados.
La presente invención se refiere a materiales
osteoinductivos mejorados que comprenden materiales de matriz y
proteínas morfogenéticas, en los cuales, dependiendo del objeto, las
proteínas pueden ser proteínas dímeras o monómeras. Los materiales
osteoinductivos de acuerdo con la presente invención tienen
propiedades mejoradas. La invención se refiere adicionalmente a
métodos para producir los materiales osteoinductivos mejorados
respectivos.
US 6.118.043 se refiere a un material de
reemplazamiento óseo que comprende uno o más polipéptidos que tienen
la acción biológica de factores de crecimiento de fibroblastos en
una matriz porosa.
Muchos factores de crecimiento de la
superfamilia TGF-\beta (Kingsley, Genes y
Development 8, 133-146 (1994) así como las
referencias citadas en dicho lugar, son relevantes para una extensa
gama de métodos y aplicaciones de tratamiento médico que
conciernen, en particular, a la promoción de la proliferación
celular y la formación de tejido, con inclusión de curación de
heridas y reproducción de tejidos. Tales factores de crecimiento
comprenden en particular miembros del grupo
TGF-\beta (factor de crecimiento transformante,
véase v.g. Roberts y Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology
95 (1990), páginas 419-472, compiladores: Sporn y
Roberts), el grupo DVR (Hötten et al., Biochem. Biophys.
Res. Comm. 206 (1995), páginas 608-613 y la
bibliografía adicional citada en dicho lugar) con inclusión de BMPs
(proteína morfogenética ósea, véase v.g. Rosen y Thies, Growth
Factors in Perinatal Development (1993), páginas
39-58, compiladores: Tsang, Lemons y Balistreri) y
GDFs (factores de diferenciación del crecimiento), la
inhibina/activina (véase v.g. Vale et al., The Physiology of
Reproduction, 2ª edición (1994), páginas 1861-1878,
compiladores: Knobil y Neill) y la familia de proteínas GDNF
(Rosenthal, Neuron 22 (1999), páginas 201-203;
Airaksinen et al., Mol. Cell. Neurosci 13 (1999), páginas
313-325). Aunque los miembros de la superfamilia
TGF-\beta exhiben altas homologías de aminoácidos
en la parte madura de las proteínas, en particular 7 cisteínas
conservadas, los mismos exhiben variaciones considerables en sus
funciones exactas. A menudo los factores de crecimiento individuales
de estas familias exhiben una pluralidad de funciones al miso
tiempo, por lo que su aplicación es interesante en diversas
indicaciones médicas. Algunas de estas proteínas multifuncionales
tienen también efectos promotores de la supervivencia sobre las
neuronas además de funciones tales como v.g. regulación de la
proliferación y diferenciación en muchos tipos de células (Roberts
y Sporn, supra; Sakurai et al., J. Biol. Chem. 269
(1994), páginas 14118-14122). Así, v.g. se han
demostrado efectos tróficos sobre las neuronas embrionarias motoras
y sensoras para TGF-\beta in vitro
(Martinou et al., (Dev. Brain Res. 52, páginas
175-181 (1990) y Chalazonitis et al., Dev.
Biol. 152, páginas 121-132 (1992)). Adicionalmente,
se muestran efectos promotores de la supervivencia de las neuronas
dopaminérgicas para TGF-\beta-1,
-2, -3, activina A y GDNF, una proteína que tiene semejanzas
estructurales con los miembros de la superfamilia
TGF-\beta. (Krieglsein et al., EMBO J. 14,
páginas 736-742 (1995)).
La existencia de proteínas de la superfamilia
TGF-\beta en diversas etapas y estados de
desarrollo de los tejidos se corresponde con diferencias en lo que
respecta a sus funciones y sitios diana exactos, duración de vida,
requerimientos de factores adyuvantes, ambiente fisiológico celular
necesario y/o resistencia a la degradación.
Las proteínas de la superfamilia
TGF-\beta existen como homodímeros o heterodímeros
que tienen un solo enlace disulfuro en estado natural. Sin embargo,
se ha descubierto que también proteínas que carecen de la cisteína
responsable de la formación de dímeros mantienen las propiedades
características de las proteínas dímeras de tipo salvaje al menos
en un grado sustancial. Tales formas pueden presentar ventajas sobre
las proteínas dímeras, especialmente en lo que respecta a facilidad
de producción, es decir producción reproducible, simple y económica
por métodos de ingeniería genética. Ejemplos de tales proteínas y su
producción, así como su utilización se describen en WO
01/11041.
Principalmente para aplicaciones en el campo
relacionado con los huesos, como v.g. la reparación de defectos
óseos o regeneración de hueso, rellenado de defectos óseos causados
por enfermedad, traumatismos u operación o defectos óseos
degenerativos, etc., pero también para tejido cartilaginoso y
conectivo tal como tendones o ligamentos, aplicaciones dentales,
neurológicas, angiogenéticas o de otros tipos, es útil combinar
proteínas morfogenéticas con materiales de matriz. Dichos
materiales de matriz que están recubiertos o impregnados con
proteínas morfogenéticas pueden proporcionar un dispositivo para
liberación continua de proteína morfogenética y estimulación
constante consiguiente de células progenitoras para diferenciarse y
formar células nuevas de la clase del tejido deteriorado.
Adicionalmente, el material de matriz puede proporcionar un ambiente
favorable para adhesión y el crecimiento hacia dentro de células
proliferantes y acelerar por tanto la formación de tejido nuevo,
especialmente tejido óseo.
Dichos usos de proteínas morfogenéticas en
combinación con material de matriz están publicados y descritos
extensamente, como por ejemplo en WO 98/21972. Sin embargo, existe
todavía necesidad de materiales que contengan cantidades elevadas
de proteínas morfogenéticas en una forma que proporcione liberación
continua de proteína. El recubrimiento homogéneo y máximo de
materiales de matriz con proteínas morfogenéticas es un factor
crucial para materiales osteoinductivos satisfactorios y es todavía
un objeto pendiente de resolución. Un problema principal es la
solubilidad limitada de las proteínas morfogenéticas. Los materiales
osteoinductivos de la técnica anterior contienen a menudo sólo
pequeñas cantidades de proteínas morfogenéticas activas debido a
que las proteínas son inestables o se fijan de modo no uniforme a
las superficies de la matriz. Especialmente las superficies
internas de los materiales de matriz porosos se recubren
insuficientemente.
\newpage
Fue por tanto objeto de la presente invención
proporcionar materiales osteoinductivos mejorados para uso en el
campo farmacéutico y especialmente proporcionar métodos para obtener
materiales de matriz que están recubiertos eficientemente con
proteínas morfogenéticas.
Este problema se resuelve de acuerdo con la
presente invención proporcionando materiales osteoinductivos como se
describen en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas.
Con objeto de evitar malentendidos y
ambigüedades, algunos términos utilizados frecuentemente en esta
memoria se definen e ilustran como sigue:
El término "proteína morfogenética", tal
como se utiliza en esta memoria, significa una proteína de la
superfamilia TGF-\beta o una parte biológicamente
activa o variante de la misma. Este término comprende todas las
proteínas que contienen al menos una región de 7 cisteínas
característica para las proteínas de la superfamilia
TGF-\beta, con indiferencia de si la cisteína
responsable de la formación de dímeros presente en este dominio ha
sido reemplazada por otro aminoácido o no. Miembros interesantes de
la superfamilia TGF-\beta o partes o variantes
biológicamente activas de los mismos son p.ej. las proteínas
TGF-\beta como TGF-\beta1,
TGF-\beta2, TGF-\beta3,
TGF-\beta4, TGF-\beta5 (U.S.
5.284.763; EP 0376785; U.S. 4.886.747; DNA 7 (1988), páginas
1-8), EMBO J. 7 (1988), páginas
3737-3743), Mol. Endo. 2 (1988), páginas
1186-1195), J. Biol. Chem. 265 (1990), páginas
1089-1093), las proteínas OP1, OP2 y OP3 (U.S.
5.011.691, U.S. 5.652.337, WO 91/05802) así como BMP2, BMP3, BMP4
(WO 88/00205, U.S. 5.013.649 y WO 89/10409, Science 242 (1988),
páginas 1528-1534), BPM5, BPM6 y BPM7 (OP1) (Proc.
Natl. Acad. Sci. 87 (1990), páginas 9841-9847, WO
90/11366), BMP8 (OP2) (WO 91/18098), EMP9 (WO 93/00432), BMP10 (WO
94/26893), BMP11 (WO 94/26892), BMP12 (WO 95/16035), BMP13
(W095/16035), BMP15 (WO 96/36710), BMP16 (WO 98/12322), BMP3b
(Biochem. Biophys. Res. Comm. 219 (1996), página
656-662), GDF1 (WO 92/00382 y Proc. Natl. Acad.
Sci. 88 (1991), página 4250-4254), GDF8 (WO
94/21681), GDF10 (W095/10539), GDF11 (WO 96/01845), GDF5 (CBMP1,
MP52) (WO 95/04819; W096/01316; WO 94/15949, WO 96/14335 y WO
93/16099 y Nature 368 (1994), página 639-643), GDF6
(CBMP2, BMP13) (WO 95/01801, WO 96/14335 y W095/16035), GDF7 (CBMP3,
BMP12) (WO 95/01802 y WO 95/10635), GDF14 (WO 97/36926), GFD15 (WO
99/06445), GDF16 (WO 99/06556), 60A (Proc. Natl. Acad. Sci. 88
(1991), página 9214-9218), DPP (Nature 325 (1987),
página 81-84), Vgr-1 (Proc. Natl.
Acad. Sci. 86 (1989), página 4554-4558)
Vg-1, (Cell 51 (1987), página
861-867), dorsalina (Cell 73 (1993), página
687-702), MIS (Cell 45 (1986), página
685-698), pCL13 (WO 97/00958), BIP (WO 94/01557),
inhibina a, activina \betaA y activina \betaB (EP 0222491),
activina \betaC (MP121) (WO 96/01316), activina \betaE y GDF12
(WO 96/02559 y WO 98/22492), activina \betaD (Biochem. Biophys.
Res. Comm. 210 (1995), página 581-588), GDNF
(Science 260 (1993), página 1130-1132, WO 93/06116),
Neurturina (Nature 384 (1996), página 467-470),
Persefina (Neuron 20 (1998), página 245-253, WO
97/33911), Artemina (Neuron 21 (1998), página
1291-1302), Mic-1 (Proc. Natl.
Acad. Sci USA 94 (1997), página 11514-11519),
Univina (Dev. Biol. 166 (1994), página 149-158),
ABMP (Development 121 (1995), página 4293-4301),
Nodal (Nature 361 (1993), páginas 543-547), Screw
(Genes Dev. 8 (1994), páginas 2388-2601).
Adicionalmente, se incluyen también en el término "proteínas
morfogenéticas" proteínas de la superfamilia
TGF-\beta no existentes naturalmente y por tanto
producidas artificialmente, tales como v.g. proteínas de la
superfamilia TGF-\beta que carecen de una cisteína
responsable de la formación de dímeros como se describe p.ej. en WO
01/11041, que existen preferentemente como proteínas monómeras o
sólo en asociación débil con un monómero adicional debido a
asociación no covalente como puentes de hidrógeno. Otras proteínas
útiles incluidas también en la definición de "proteína
morfogenética" son constructos biosintéticos biológicamente
activos que incluyen proteínas biosintéticas diseñadas utilizando
secuencias de dos o más proteínas morfogenéticas conocidas.
Ejemplos de constructos biosintéticos se describen en U.S. 5011691
(v.g. COP-1, COP-3,
COP-4, COP-5, COP-7
y COP-16). La mayoría de los miembros de la
superfamilia de proteínas TGF-\beta son proteínas
morfogenéticas que son útiles para tratamientos en los cuales es
interesante la regulación de la diferenciación y proliferación de
células o células progenitoras. Esto puede dar como resultado el
reemplazamiento de tejido deteriorado y/o enfermo, por ejemplo
tejido esquelético (hueso, cartílago), tejido conectivo, tejido
periodontal o dental, tejido neural, tejido del sistema sensorial,
hígado, páncreas, cardiaco, vasos sanguíneos, piel y tejido renal,
tejido uterino o tiroideo, etc. Las proteínas morfogenéticas son
útiles a menudo para el tratamiento del deterioro ulceroso o
inflamatorio de tejidos y curación de heridas de toda clase tal como
curación mejorada de úlceras, quemaduras, lesiones o injertos de
piel.
La expresión "parte biológicamente activa o
variante de la misma", tal como se utiliza en esta memoria,
significa fragmentos de proteínas que retienen actividad, proteínas
precursoras que se escinden v.g. en el sitio de actividad para dar
la forma madura o muestran actividad biológica por sí mismas, o
también variantes de proteínas que mantienen todavía esencialmente
la actividad biológica de la proteína de tipo salvaje. Dichas
variantes contienen preferiblemente sustituciones de aminoácidos
conservadoras, pero especialmente en la parte
N-terminal de las proteínas maduras, incluso
deleciones o sustituciones considerables que no conducen a una
pérdida considerable de la actividad biológica. Las personas
expertas en la técnica son perfectamente capaces de determinar si
una cierta proteína exhibe la actividad biológica requerida. Debe
entenderse que las proteínas que exhiben al menos 70% y
preferiblemente al menos 80% de homología con las proteínas maduras
de tipo salvaje están abarcadas por la presente invención.
El término "homología", tal como se utiliza
en esta memoria, significa que los aminoácidos comprendidos
dentro de los grupos siguientes se consideran homólogos: "S, T, P,
A, G" y "N, Q, D, E" y "H, R, K" y "M, I, L, V" y
"F, Y, W", en donde la homología se determina utilizando una
alineación para correspondencia última de secuencias, con inclusión
de lagunas en los casos aplicables.
\newpage
La expresión "material de matriz", tal como
se utiliza en esta memoria, significa un material de matriz que
actúa como entramado para reclutamiento, fijación, infiltración,
proliferación y diferenciación de células y/o como dispositivo
potencial de suministro y conservación de proteínas morfogenéticas.
Todos los tipos de materiales de matriz son útiles de acuerdo con
la presente invención, con tal que los mismos sean biocompatibles y
estén seleccionados para el área o indicación de uso propuesta. El
material de matriz puede ser un material natural, un material
natural modificado, y un material sintético. Están abarcadas todas
las matrices ya conocidas para proteínas morfogenéticas. Ejemplos
de materiales naturales son v.g. materiales óseos autólogos,
heterólogos o xenólogos, colágeno, v.g. colágeno tipo I y III, o
metales como titanio. Asimismo pueden utilizarse otros componentes
de la matriz extracelular. La matriz extracelular comprende por
ejemplo los diversos colágenos, como por ejemplo los tipos I, II,
V, IX, X, XI y XIII, y adicionalmente
hidroxil-apatito, proteoglicanos y
glicosaminoglicanos, como por ejemplo sulfato de condroitina,
biglicano, decorina y/o ácido hialurónico, o proteínas no
colagenosas como por ejemplo osteopontina, laminina, fibronectina,
vitronectina, trombospondina, proteína matriz de cartílago y la
fosfoproteína dentina. Todos los materiales naturales mencionados
pueden utilizarse también en formas modificadas artificialmente.
Ejemplos de materiales naturales modificados son
hueso desmineralizado, mineral óseo termocalcinado, hueso
sinterizado o ácido hialurónico reticulado químicamente (hidrogel),
o aleaciones metálicas.
Ejemplos de materiales sintéticos son polímeros
como ácido poliglicólico, polilactida y derivados de polilactida
tales como p.ej. ácido poliláctico,
poli(lactida-co-glicolida),
copolímeros ácido
poliláctico-polietilen-glicol o
glicolida-L-lactida, y
adicionalmente polifosfatos, polietilen-glicol,
copolímeros polioxietileno-polioxipropileno o
materiales que contienen fosfatos de calcio tales como fosfato
beta-tricálcico
(Ca_{3}(PO_{4})_{2}), fosfato
alfa-tricálcico e
hidroxil-apatito.
Ejemplos adicionales de otras matrices vehículos
útiles pertenecientes a uno de los grupos arriba mencionados son
Ca(OH)_{2}, coral, mineral óseo natural, quitina,
partículas de hueso no desmineralizadas, partículas
óseo-cerámicas, dentina cerámica, esquirlas de hueso
esponjosas irradiadas, yeso calcinado, vidrio bioactivo, cerámica
de vidrio que contiene apatito-wollastonita.
Asimismo, una combinación de las matrices de vehículo arriba
mencionadas puede formar el material de matriz como por ejemplo la
combinación de hidroxi-apatito y colágeno (v.g.
Healos, disponible anteriormente de Orquest, Inc., CA, EE.UU.
[actualmente DePuy Acromed, MA, EE.UU.]), una combinación de ácido
poliglicólico y ácido poliláctico o derivados de polilactida, o
materiales compuestos coral-colágeno. Para una
lista no limitante de matrices de vehículo útiles, véase
adicionalmente Kirker-Head, Advanced Drug Delivery
43 (2000) páginas 65-92.
La expresión "material osteoinductivo", tal
como se utiliza en esta memoria, significa un dispositivo biológico
que comprende al menos un material de matriz y una proteína
morfogenética inmovilizada temporalmente dentro de y/o en la
superficie de dicho material de matriz. Adicionalmente, el
dispositivo puede comprender aditivos que son útiles para la
aplicación considerada. Tales sustancias incluyen por ejemplo, pero
sin carácter limitante, antibióticos, agentes antifibrinolíticos,
vitaminas, estabilizadores, tampones, emulsionantes, sustancias
antiinflamatorias u otros aditivos, como por ejemplo sustancias que
mejoran la solubilidad de las proteínas morfogenéticas. Es un
requisito previo de tales sustancias que las mismas no sean nocivas
para el paciente y no perturben la aplicación farmacéutica
propuesta. La expresión "material osteoinductivo" de acuerdo
con la presente invención no debe considerarse limitada al uso en
el área de la reparación ósea. Asimismo para otras indicaciones,
tales como por ejemplo para la reparación o el crecimiento de
cartílago, tejido conectivo con inclusión de tendón y/o ligamento,
tejido periodontal o dental, tejido neural, tejido del sistema
sensorial, hígado, páncreas, cardiaco, vasos sanguíneos, renal,
uterino, y tejido tiroideo, piel, membranas mucosas, endotelio,
epitelio, para la promoción o inducción del crecimiento de los
nervios, reparación y regeneración de tejidos, angiogénesis,
curación de heridas con inclusión de úlceras, quemaduras, lesiones o
injertos de piel, inducción de la proliferación de células
progenitoras o células de la médula ósea, el uso de una combinación
de proteína y material de matriz puede ser útil para v.g. aprovechar
la ventaja de la liberación lenta y continua de proteína y/o
proporcionar un entorno que permita que las células crezcan hacia
dentro y respalden así la formación de nuevo tejido sano. Más bien,
la expresión "material osteoinductivo" se utiliza debido al
significado que ha adquirido ya en la técnica anterior como
combinación de materiales de matriz y proteínas morfogenéticas. Los
materiales osteoinductivos de acuerdo con la invención son útiles en
todos aquellos casos en los cuales se aplican beneficiosamente
proteínas morfogenéticas, y especialmente donde se aplican proteínas
morfogenéticas junto con un material de matriz para proporcionar
una liberación lenta y sostenida de proteína y/o proporcionar un
entorno que facilita y mejora adicionalmente la proliferación
celular y la regeneración de tejido. El material osteoinductivo de
acuerdo con la invención puede utilizarse por ejemplo para
prevención, alivio o tratamiento de síntomas o condiciones de
enfermedades o condiciones anormales de cartílago, hueso, tejido
conectivo con inclusión de tendón y/o ligamento, tejido periodontal
o dental, tejido neural, tejido del sistema sensorial, hígado,
páncreas, cardiaco, vasos sanguíneos, renal, tejido uterino y
tiroideo, piel, membranas mucosas, endotelio o epitelio. Los
materiales pueden utilizarse, pero sin carácter limitante, para la
promoción o inducción de crecimiento de los nervios, reparación y
regeneración de tejidos, angiogénesis, curación de heridas con
inclusión de úlceras, quemaduras, lesiones o injertos de piel,
inducción o proliferación de células progenitoras o células de la
médula ósea, para la regeneración de la fijación funcional entre
tejido conectivo y hueso, reparación de cartílagos, tratamiento de
la osteoporosis u osteoartritis, para corregir fracturas no unidas,
anormalidades craneofaciales, esqueléticas o dentales adquiridas o
congénitas, para reemplazamiento del tejido no esquelético en
cirugía plástica o reconstructiva. Adicionalmente, la enfermedad o
condición anormal a tratar con el material osteoinductivo puede
estar causada por lesión isquémica o traumática, enfermedad
degenerativa, cardiomiopatías, ataques aterotrombóticos o
cardioembólicos, ulceración, cirrosis, enfisema, senescencia celular
o inactividad. Adicionalmente, el material osteogénico puede
utilizarse para modulación de una respuesta inflamatoria y alivio
de los efectos destructivos de tejido asociados con ello y para
aumentar la viabilidad del tejido deteriorado o lesionado.
Adicionalmente, el alivio de la fibrosis o formación de tejido de
escara puede evitarse y el material se puede utilizar
ventajosamente para tratamiento de lesiones de fusión de reparación
isquémica como las asociadas con una parada cardiaca, oclusión
pulmonar, oclusión arterial, oclusión coronaria o ataque oclusivo,
asociado con una interrupción necesaria, quirúrgica o de otro tipo,
del flujo sanguíneo, o asociado con un infarto cerebral, infarto de
miocardio, asfixia o parada cardiopulmonar. Una posible indicación
adicional es la curación y reparación de la unión de tejido
conectivo como se describe por ejemplo en WO 96/39169. Las
indicaciones posibles para la utilización de material osteogénico de
acuerdo con la invención son solamente ilustrativas y no deben
entenderse como limitantes de la invención. Los materiales
osteoinductivos de acuerdo con la presente invención contienen una
dosis máxima de proteínas morfogenéticas en una forma biológicamente
activa y eficaz en y/o sobre las superficies del material de matriz
preferiblemente poroso.
Las expresiones "recubierto uniformemente"
y "uniformidad de recubrimiento", tal como se utilizan en esta
memoria, significan que cada mm^{2} de la superficie del material
osteoinductivo contiene cantidades básicamente iguales de proteínas
morfogenéticas.
Los materiales osteoinductivos descritos en la
técnica exhiben a menudo una distribución irregular de las
proteínas morfogenéticas bioactivas en el vehículo. En la mayoría de
estos casos, o bien se está fijando menos proteína en algunas
partes de la matriz o un porcentaje considerable de la proteína
fijada exhibe bioactividad reducida. De acuerdo con la presente
invención, se ha encontrado que esta irregularidad se ve influida
principalmente por sucesos locales de precipitación que tienen
lugar durante el recubrimiento de los materiales de la matriz junto
con procesos de degradación de proteínas. Así pues, la capacidad
osteoinductiva del dispositivo está reducida significativamente.
Dichas distribución irregular y degradación de las proteínas pueden
evitarse modificando o mejorando a la vez la estabilidad y la
solubilidad de las proteínas durante el proceso de recubrimiento,
lo que puede alcanzarse por una selección y control hábiles de las
condiciones de pH, así como por el uso de las características
adecuadas del tampón o disolvente y aditivos específicos.
La solubilidad de las proteínas morfogenéticas
en los líquidos depende, además de otros factores importantes que
se describen también en esta memoria, del valor de pH del
disolvente. El recubrimiento de un material de matriz con proteínas
morfogenéticas es sumamente eficiente, si las proteínas están
disueltas por completo en la solución de recubrimiento de una
manera estable durante el periodo total del proceso de
recubrimiento. Sin embargo, dado que la mayoría de los materiales
de matriz son o bien donantes o aceptores de iones hidrógeno, los
materiales de matriz propiamente dichos afectan al pH durante el
proceso de recubrimiento. La superficie de la mayoría de los
materiales de matriz está maximizada y contiene innumerables
cavidades y poros, que exhiben microambientes locales con
condiciones de pH a veces diferentes, en las cuales las proteínas
tienden a precipitar. Los métodos de la presente invención permiten
que la solución de proteína se distribuya uniformemente a través de
la superficie externa e interna del material vehículo y se fije
homogénea y establemente a estas superficies sin el riesgo de una
precipitación de las proteínas inducida por el pH.
Esta uniformidad de recubrimiento y
especialmente la adsorción eficaz de las proteínas morfogenéticas al
material de matriz, de acuerdo con la presente invención, se
alcanza por tanto proporcionando las proteínas disueltas estable y
completamente en una solución. En general, el disolvente para las
proteínas morfogenéticas utilizadas en el proceso de recubrimiento
tiene que estabilizar las proteínas y compensar los cambios críticos
de pH causados por el vehículo. De acuerdo con esta invención, el
conocimiento exacto de la solubilidad dependiente del pH de las
proteínas morfogenéticas junto con un conocimiento básico de las
características de la matriz permite seleccionar un disolvente o
tampón adecuado para el proceso de recubrimiento. Por ejemplo, si
las proteínas morfogenéticas son solubles a un pH inferior a 4,5
pero precipitan a valores de pH superiores, y el material de la
matriz propiamente dicho tiene propiedades alcalinas, el disolvente
o tampón utilizado en el proceso de recubrimiento debería contener
sustancias adecuadas, preferiblemente un ácido débil, para compensar
el cambio de pH causado por el vehículo a fin de mantener las
proteínas morfogenéticas eficientemente en solución durante el
proceso total de recubrimiento. Si las proteínas morfogenéticas son
solubles a un pH superior a 10 pero precipitan a valores de pH
inferiores, y el material de matriz tiene en sí mismo propiedades
ácidas, el disolvente o tampón utilizado en el proceso de
recubrimiento debería contener otras sustancias adecuadas,
preferiblemente una base débil, para compensación eficiente.
Ejemplos que describen la influencia de diferentes matrices sobre
el pH así como las solubilidades de varias proteínas morfogenéticas
dependientes del pH se dan en esta memoria. De acuerdo con las
otras realizaciones de la presente invención que no se ilustran
explícitamente, una persona experta en la técnica es plenamente
capaz de determinar fácilmente la influencia de cualquier otra
matriz sobre el pH así como la solubilidad específica dependiente
del pH para cualquier otra proteína morfogenética.
Las proteínas morfogenéticas de esta invención
precipitan usualmente a valores de pH fisiológicos (aproximadamente
neutros) o ligeramente ácidos o básicos, en tanto que aquéllas son
solubles a valores de pH inferiores a 4,5 y superiores a 10,3, si
los disolventes exhiben concentraciones iónicas de 100 mmol/l o
mayores. Sorprendentemente, esta solubilidad dependiente del pH de
las proteínas morfogenéticas puede modificarse adicionalmente por
cambio de la composición o concentración de los tampones o
disolventes, conduciendo por tanto a un intervalo de pH claramente
ampliado en el cual es posible un recubrimiento uniforme y estable
de los materiales de matriz. En disolventes con concentraciones
iónicas inferiores tales como v.g. 10 ó 20 mmol/l, pueden alcanzarse
solubilidades de proteína de al menos 65 \mug/ml, preferiblemente
100 \mug/ml, más preferiblemente 150 \mug/ml y muy
preferiblemente mayores que 200 \mug/ml para valores de pH
inferiores a 5,2 y superiores a 9,5. Este intervalo ampliado de pH
es especialmente favorable si se recubren matrices sensibles al pH,
v.g. matrices que comprenden materiales naturales.
De acuerdo con este aspecto de la invención, la
solubilidad dependiente del pH de las proteínas morfogenéticas y el
recubrimiento estable del material de matriz depende de la fuerza
iónica del tampón o disolvente utilizado y puede mejorarse
claramente por la utilización de un tampón o disolvente de fuerza
iónica baja. Preferiblemente, dicho tampón o disolvente tiene una
fuerza iónica de 150 mmol/l o menos, preferiblemente 100 mmol/l o
menos, 80 mmol/l o menos, 40 mmol/l o menos, 20 mmol/l o menos, 10
mmol/l o menos, o 5 mmol/l o menos. Más preferiblemente, el tampón
o disolvente tiene una concentración de 20 mmol/l. Muy
preferiblemente, el tampón o disolvente tiene una concentración de
10 mmol/l.
Adicionalmente, se ha encontrado que también la
composición del disolvente influye en la solubilidad dependiente
del pH de las proteínas morfogenéticas y el recubrimiento estable
del material de matriz. En tanto que se ha demostrado que tampones
que contienen citrato de sodio,
2-amino-2-metil-1,3-propanodiol-HCl
o glicina sódica son menos adecuados como disolventes para las
proteínas morfogenéticas, se ha obtenido una estabilidad o
solubilidad muy satisfactoria de las proteínas en disolventes que
contienen acetato de sodio, carbonato de sodio o en soluciones no
tamponadas que contienen HCl o NaOH. Adicionalmente, se ha
encontrado de modo inesperado una solubilidad satisfactoria de las
proteínas en soluciones que comprenden disolventes orgánicos tales
como ácido trifluoroacético (TFA), composiciones TFA/etanol,
isopropanol, propanol, butanol, isopropanol,
dimetil-sulfóxido o acetona.
De acuerdo con este aspecto de la presente
invención, el tampón o disolvente para las proteínas morfogenéticas
contiene preferiblemente un ácido tal como v.g. ácido acético o
ácido clorhídrico o una base tal como v.g. NaOH. Más
preferiblemente, el disolvente es un tampón que contiene acetato de
sodio o carbonato de sodio. También preferiblemente, el disolvente
contiene más de 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, o incluso 100% de
disolventes orgánicos.
Resultó además totalmente inesperado que las
proteínas morfogenéticas no sólo son solubles sino que mantienen
además su actividad biológica a valores de pH claramente ácidos
(inferiores a pH 5,2) y a valores de pH claramente básicos
(superiores a pH 9,5) que se presentan rara vez en condiciones
fisiológicas. Estos resultados permiten el desarrollo de materiales
de matriz y métodos de recubrimiento específicos de aquéllas.
Soluciones de proteínas morfogenéticas activas que tienen estos
valores extremos de pH respaldan la esterilidad. Debido a esto,
aquéllas pueden utilizarse ventajosamente en el proceso de
recubrimiento, dado que el riesgo de contaminación indeseable con
microorganismos viables se reduce significativamente. Además de
ello, el recubrimiento a p.ej. pH básico entre 9,5 y 12 es
beneficioso en algunos casos debido a que varias matrices se
degradan en medios ácidos y por consiguiente precisan condiciones
de pH básico durante el recubrimiento. Adicionalmente, el
recubrimiento de los materiales de matriz que tienen propiedades
neutras o básicas por sí mismos puede realizarse a valores de pH
altos y generalmente excluye el riesgo de precipitación de la
proteína durante el proceso de recubrimiento. Por ejemplo,
Ca(OH)_{2} es un material utilizado rutinariamente
en los procesos de reparación de los dientes pero exhibe un valor
de pH de aproximadamente 12 en soluciones acuosas, lo cual impide
normalmente un recubrimiento con proteínas. Se ha demostrado
previamente que Ca(OH)_{2} estimula la formación de
cantidades menores de dentina secundaria. Este efecto puede
mejorarse espectacularmente recubriendo el
Ca(OH)_{2} a pH 12 con las proteínas morfogenéticas
de acuerdo con esta invención.
Los datos resumidos arriba permiten, en una
realización específica de la presente invención, un recubrimiento
de materiales de matriz con proteínas morfogenéticas biológicamente
activas a valores de pH inferiores a pH 5,2 y particularmente a
valores de pH elevado entre 9,5 y 13. Se prefieren valores de pH
entre 12 y 13. Son especialmente preferidos valores de pH entre 2 y
4,5, entre 4,5 y 5,2, entre 9,5 y 10,3, entre 10,3 y 12, y entre 12
y 13.
El recubrimiento de un material de matriz puede
mejorarse además claramente utilizando estabilizadores,
emulsionantes y otros adyuvantes y aditivos que v.g. previenen su
degradación o mejoran su solubilidad. Son especialmente preferidos
polietilen-glicoles que mejoran espectacularmente la
solubilidad de las proteínas morfogenéticas si se unen covalente o
no covalentemente a las proteínas. Otros aditivos y adyuvantes
útiles pueden ser sustancias que son v.g. beneficiosas para la
adsorción uniforme de la proteína en el material de matriz, así como
sustancias que estabilizan la proteína en solución. Adicionalmente,
puede incluirse cualquier sustancia, con tal que la misma tenga un
efecto positivo de cualquier modo o al menos no sea nociva para el
paciente. Ejemplos de sustancias útiles son detergentes no iónicos
tales como Tween 80, aminoácidos básicos, proteínas vehículo tales
como seroalbúmina, sales alcalinas de ácidos grasos (jabones) o
"syndets" (detergentes sintéticos distintos de los jabones),
azúcares o alcoholes como p.ej. sacarosa, manitol (WO 98/38514)
etanol o isopropanol. Se ha encontrado que especialmente azúcares y
alcoholes, así como jabones y syndets mejoran la uniformidad del
recubrimiento. Estas soluciones que contienen alcoholes, jabones y/o
syndets son muy ventajosas debido a su tensión superficial muy
baja, lo que mejora la eficacia de recubrimiento. En los materiales
de matriz inyectables y formulaciones útiles para administración
parenteral, los jabones y syndets son útiles debido a que forman
estructuras micelares. Dichas micelas son capaces de rodear y
emulsionar las proteínas morfogenéticas hidrófobas, respaldando con
ello el suministro de la proteína y previniendo la precipitación.
Dado que los jabones tienen propiedades básicas con valores de pH
superiores a 8, los mismos pueden combinarse fácilmente con las
proteínas morfogenéticas de la presente invención, que se ha
demostrado siguen siendo biológicamente activas a dichos valores de
pH básicos. En el intervalo de pH ácido inferior a 5,2, pueden
utilizarse syndets en lugar de jabones en combinación con las
proteínas morfogenéticas. Asimismo, pueden añadirse en caso
necesario otras sustancias tales como antibióticos, antisépticos,
vitaminas, anti-fibrinolíticos, etc, en caso
deseado.
En detalle, el recubrimiento de un material de
matriz puede mejorarse claramente de acuerdo con la presente
invención por utilización de uno o más sacáridos como aditivos.
Preferiblemente, dicho sacárido es sacarosa. También
preferiblemente, dicho sacárido es manitol. Son especialmente
preferidas soluciones de recubrimiento que incluyen hasta 8%, 10%,
12%, 15% o 20% de sacáridos.
Adicionalmente, el recubrimiento de un material
de matriz puede mejorarse claramente por la utilización de uno o
más alcoholes como aditivos. Preferiblemente, dicho alcohol es
etanol. También preferiblemente, dicho alcohol es isopropanol. Se
prefieren especialmente soluciones de recubrimiento que incluyen
hasta 50%, 55%, 60% o 65% de alcoholes.
Adicionalmente, el recubrimiento de un material
de matriz así como la composición de vehículos inyectables o
formulaciones parenterales de las proteínas morfogenéticas pueden
mejorarse por utilización de sales alcalinas de ácidos graos
(jabones) como aditivos. Preferiblemente, dicho jabón es estearato
de sodio, miristato de sodio, oleato de sodio o palmitato de sodio.
Son especialmente preferidas soluciones que incluyen hasta 10%, 20%,
30%, 40%, 50% o 75% de jabones.
El recubrimiento de un material de matriz así
como la composición de una formulación inyectable o parenteral de
las proteínas morfogenéticas puede mejorarse también por utilización
de sales alcalinas de syndets como aditivos. Preferiblemente, dicho
syndet es un alquilsulfonato lineal, un alquilsulfato, o un
alquilbencenosulfonato. Más preferiblemente, dicho syndet es un
laureth-sulfato. Muy preferiblemente, dicho syndet
es lauril-sulfato de sodio o de amonio. Son
especialmente preferidas soluciones que incluyen hasta 10%, 20%,
30%, 40%, 50% o 75% de syndets.
Un aspecto de la presente invención proporciona
un material osteoinductivo que comprende un material de matriz y,
adsorbida(s) en las superficies externas o internas de este
material de matriz, una o más proteínas morfogenéticas, en donde el
material osteoinductivo puede obtenerse por contacto del material de
matriz y las proteínas morfogenéticas en condiciones adecuadas para
mantener la proteína disuelta en una solución permitiendo con ello
que el material de matriz se recubra uniformemente con las
proteínas morfogenéticas. Este material de matriz actúa como
entramado para el reclutamiento, la fijación, la proliferación y/o
la diferenciación de las células y como dispositivo potencial de
suministro y conservación de proteínas morfogenéticas. En una
realización preferida, el material de matriz es un material poroso
y permite la penetración de una solución de la proteína en las
superficies internas del material. También preferiblemente, el
material de matriz es un material natural, un material natural
modificado o un material sintético. Aún más preferiblemente, el
material de matriz contiene un tipo de fosfato de calcio,
especialmente fosfato beta-tricálcico
(Ca_{3}(PO_{4})_{2}), fosfato
alfa-tricálcico e hidroxil-apatito.
Se prefieren también especialmente los materiales de matriz
siguientes: a) colágeno, b) Ca(OH)_{2}, c)
derivados de polilactida: polilactida, ácido poliláctico,
poli(lactida-co-glicolida),
ácido poliláctico-polietilenglicol, d) ácido
hialurónico, e) copolímeros
polioxietileno-polioxipropileno. Se prefiere
también especialmente una combinación de
hidroxi-apatito y colágeno (v.g. Healos, disponible
previamente de Orquest Inc., CA, EE.UU. [actualmente DePuy Acromed,
MA, EE.UU.]).
Las proteínas morfogenéticas comprendidas en el
material osteoinductivo son proteínas pertenecientes a la
superfamilia TGF-\beta o partes o variantes
biológicamente activas de las mismas, que pueden ser dímeras o
carecer de la cisteína responsable de la formación de dímeros.
Todos los miembros de la superfamilia
TGF-\beta contienen un dominio específico
denominado "región de 7 cisteínas". Esta región específica de
7 cisteínas está considerada como la parte más importante de las
proteínas por lo que se refiere a la actividad biológica. Por esta
razón, las proteínas que retienen esta región crítica son proteínas
preferidas de acuerdo con la invención. En esta región, la
localización respectiva de los residuos cisteína unos con respecto
a otros es importante y se permite que varíe sólo ligeramente con
objeto de no perder la actividad biológica. Secuencias de consenso
para tales proteínas se conocen en la técnica anterior y todas las
proteínas que cumplen con dichas secuencias de consenso se
consideran abarcadas por la presente invención Es especialmente
preferido que las proteínas de acuerdo con este aspecto de la
invención contengan al menos la región de 7 cisteínas
característica para la superfamilia de las proteínas
TGF-\beta, con indiferencia de si la cisteína
responsable de la formación de dímeros presente en este dominio ha
sido reemplazada por otro aminoácido o no.
En una realización preferida, las proteínas
morfogenéticas o la parte biológicamente activa o variante de la
misma es una proteína madura o una parte o variante biológicamente
activa de la misma.
Asimismo preferiblemente, las proteínas
morfogenéticas o la parte o variante biológicamente activa de la
misma es un miembro de los subgrupos de la superfamilia
TGF-\beta denominados familias
TGF-\beta, BMP, GDF, activina o GDNF.
Se han descrito varias proteínas BMP que fueron
descubiertas originalmente por su capacidad para inducir la
formación de hueso. Entretanto, se han encontrado varias funciones
adicionales, como sucede también para los miembros de las GDFs.
Estas proteínas exhiben un campo muy amplio de aplicaciones, y son
especialmente útiles, además de su actividad promotora del
crecimiento de hueso y cartílago (véase por ejemplo: WO 88/00205, WO
90/11366 y WO 91/05802) en la enfermedad periodontal, para inhibir
la pérdida de tejido periodontal y dental, para sellado de
cavidades en los dientes, para mejora de la integración de un diente
en un alvéolo dental (véase por ejemplo: WO 96/26737, WO 94/06399,
y WO 95/24210), para tejido conectivo tal como tendón o ligamento
(véase por ejemplo WO 95/16035, para mejora de la supervivencia de
las células neurales, para inducir el crecimiento de células
neurales y reparación de defectos neurales, para tejido deteriorado
del sistema nervioso central (CNS) debido a derrame cerebral,
traumatismo o enfermedades degenerativas (véanse por ejemplo WO
97/34626, WO 94/03200 y WO 95/05846), para mantenimiento o
restablecimiento de la percepción sensorial (véanse por ejemplo WO
98/20890 y WO 98/20889), para insuficiencia renal (véanse por
ejemplo WO 97/41880, WO 97/41881), para regeneración del hígado
(véase por ejemplo WO 94/06449), para regeneración del miocardio
(véase por ejemplo WO 98/27995), para el tratamiento o preservación
de tejidos o células para trasplante de órganos o tejidos, para
integridad del revestimiento gastrointestinal (véase por ejemplo WO
94/06420), para aumento de la población de células progenitoras
como por ejemplo células progenitoras hematopoyéticas por
estimulación ex vivo (véase por ejemplo WO 92/15323),
etc.
Más preferiblemente, las proteínas
morfogenéticas o parte o variante biológicamente activa de la misma
es una proteína dímera perteneciente a las familias
TGF-\beta, BMP, GDF, activina o GDNF. Aún más
preferiblemente, las proteínas morfogenéticas dímera o variante
biológicamente activa de la misma es BMP2, BMP7, BMP12 o BMP13.
Muy preferiblemente, la proteína dímera
contenida en el material osteoinductivo de acuerdo con la invención
es la proteína BMP52 (denominada también GDF5 o
CBMP-1) o una parte o variante biológicamente activa
de la misma. La secuencia de MP52 se muestra en SEQ. ID. NO. 1
(secuencia de DNA y de proteína) y SEQ. ID. NO. 2 (secuencia de
proteína únicamente), mientras que Xaa en la posición 465 representa
cisteína. SEQ. ID. NO. 2 muestra la secuencia proteínica completa
de la proteína prepro de MP52 humana como ha sido ya descrita en WO
95/04819. El comienzo de la proteína madura se encuentra
preferiblemente en el área de los aminoácidos
352-400, de modo especialmente preferido en los
aminoácidos 381 ó 382. Por esta razón, la proteína madura comprende
los aminoácidos 381-501 o 382-501.
La primera alanina de la proteína madura puede estar delecionada y
la proteína madura comprende entonces preferiblemente los
aminoácidos 383-501.
Las aplicaciones para MP52 reflejan varias de
las aplicaciones ya descritas para la familia BMP/GDF. Se considera
que MP52 es un promotor muy eficaz de la formación de hueso y
cartílago así como de la formación de tejido conectivo (véase por
ejemplo WO 95/04819, Hötten et al., (1996), Growth Factors
13, 65-74, Storm et al., (1994) Nature 368,
639-643, Chang et al., (1994) J. Biol. Chem.
269 (45), 28227-28234). En relación con esto, MP52
es útil para aplicaciones concernientes a las articulaciones entre
elementos esqueléticos (véase por ejemplo Storm & Kingsley
(1996) Development 122, 3969-3979). Un ejemplo de
tejido conectivo es tendón y ligamento (Wolfman et al.,
(1997), J. Clin. Invest. 100, 321-330, Aspenberg
& Forslund (1999), Acta Orthop Scand 70, 51-54,
WO 95/16035). MP52 es útil también para aplicaciones de los dientes
(dentales y periodontales) (véase por ejemplo WO 95/04819, WO
93/16099, Morotome et al., (1998), Biochem Biophys Res Comm
244, 85-90). MP52 es útil en la reparación de
heridas de todas clases. Adicionalmente, es muy útil para la
promoción de crecimiento de tejido en el sistema neuronal y la
supervivencia de las neuronas dopaminérgicas, por ejemplo. En este
contexto, MP52 es útil para aplicaciones en enfermedades
neurodegenerativas tales como v.g. la enfermedad de Parkinson y
posiblemente también la enfermedad de Alzheimer para tejidos de la
corea de Huntington (véase por ejemplo WO 97/03188, Krieglstein
et al., (1995) J. Neurosci Res. 42, 724-732,
Sullivan et al., (1997) Neurosci Lett 233,
73-76, Sullivan et al., (1998), Eur. J.
Neurosci 10, 3681-3688). MP52 permite mantener la
función nerviosa o retener la función nerviosa en tejidos ya
deteriorados. Se considera por tanto que MP52 es un factor
neurotrófico de aplicación general. Es útil también para
enfermedades de los ojos, en particular la córnea, la retina y el
nervio óptico (véase por ejemplo WO 97/03188, You et al.
(1999), Invest Opthalmol Vis Sci 40, 296-311), y
para crecimiento del cabello y el tratamiento y diagnóstico de
trastornos relacionados con la piel (WO 02/076494).
Como en la definición de estos términos ya
mencionada anteriormente, MP52 puede utilizarse p.ej. en su forma
madura; sin embargo, la misma puede utilizarse también como uno de
sus fragmentos que contiene al menos la región de 7 cisteínas, o
también en una forma precursora. Las desviaciones en la parte
N-terminal de MP52 madura no afectan a su actividad
en un grado considerable. Por esta razón, sustituciones o deleciones
dentro de los 9 primeros aminoácidos o adiciones en la parte
N-terminal de las proteínas están todavía dentro del
alcance de la presente invención. Podría ser útil añadir un péptido
a la parte N-terminal de la proteína, v.g. por
razones de purificación. Podría no ser necesario escindir este
péptido añadido después de la expresión y purificación de la
proteína. Péptidos adicionales en la parte N- o
C-terminal de la proteína pueden servir también
para el direccionamiento de la proteína a tejidos especiales tales
como tejido nervioso o tejido óseo o para la penetración a través de
la barrera hematoencefálica.
Asimismo más preferiblemente, las proteínas
morfogenéticas o la parte o variante biológicamente activa de la
misma es una proteína perteneciente a las familias
TGF-\beta, BMP, GDF, activina o GDNF, pero que
carece de un residuo cisteína que es responsable de la formación de
dímeros en las proteínas respectivas existentes naturalmente. La
proteína de acuerdo con este aspecto de la presente invención no
puede formar el puente disulfuro que está presente en la forma de
tipo salvaje de la proteína. Como se describe en WO 01/11041, la
sustitución o deleción de la cisteína, que efectúa normalmente la
dimerización en las proteínas, da como resultado después de la
expresión y el plegamiento correcto (formación apropiada de los
puentes disulfuro intramoleculares) una proteína monómera que
retiene la actividad biológica de la forma dímera. Generalmente,
también proteínas de fusión de una proteína monómera de acuerdo con
este aspecto de la invención y otro péptido o grupo se consideran
dentro del alcance de la presente invención, en donde dichos otros
péptidos o grupos dirigen la localización de la proteína de fusión,
v.g. debido a afinidad para un cierto tipo de tejido, etc. Ejemplos
de tales proteínas de fusión se describen en WO 97/23612. La
proteína que contiene dicha adición retendrá su actividad biológica
al menos en tanto que dicha adición no deteriore la formación de la
conformación biológicamente activa de la proteína.
Aunque las actividades biológicas de las
proteínas monómeras y dímeras (de tipo salvaje) son comparables,
las proteínas dímeras exhiben a menudo ciertas desviaciones de
propiedades químicas y biofísicas. Debido a su peso molecular
duplicado así como al enlace covalente persistente y las fuerzas
intermoleculares entre las dos subunidades monómeras, los libros
exponen más residuos y también algunos residuos de aminoácidos
diferentes al medio circundante que sus equivalentes monómeros. Los
dímeros están constituidos por dos subunidades conectadas
covalentemente que se encuentran en todas las circunstancias
fisiológicas a una distancia estrecha una de otra, creando por ello
tipos múltiples de interacciones recíprocas consigo mismos así como
con el disolvente. En la técnica anterior se describe qué
aminoácido es el responsable de la formación de dímero en cierta
familia de proteínas o en cierta proteína (véase por ejemplo:
Schlunegger & Grutter (1992) Nature 358,
430-434; Daopin et al., (1992) Science 257,
369-373 y Griffith et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 93 (1996), páginas 878-883). Especialmente,
los aminoácidos que se encuentran a corta distancia de este punto de
enlace entre las subunidades no están nunca en contacto directo con
el disolvente. Por el contrario, los monómeros están rodeados
usualmente en su totalidad por el fluido y no interaccionan
permanentemente con otras moléculas monómeras. Teóricamente, se
espera que estas diferencias entre las proteínas morfogenéticas
monómeras y dímeras den como resultado una solubilidad alterada
dependiente del pH de las moléculas monómeras. Una indicación
adicional hacia una solubilidad alterada está dada por la
determinación experimental del punto isoeléctrico (pI) de ambas
proteínas. El punto isoeléctrico se define como el pH para el cual
la carga neta de las proteínas a su pI es cero y la solubilidad de
las proteínas en el pI alcanza un mínimo. Como se muestra en el
Ejemplo 1 y la Figura 1, el pI de las proteínas monómeras de
acuerdo con esta invención se ha determinado, y difiere claramente
del pI de las proteínas dímeras.
Teniendo en cuenta esta predicción basada tanto
teórica como experimentalmente de las solubilidades alteradas de
las proteínas morfogenéticas monómeras, ha resultado totalmente
inesperado que la solubilidad dependiente del pH de las proteínas
morfogenéticas monómeras sea sin embargo equivalente a la de sus
equivalentes dímeros.
La presente invención está basada en los
resultados adicionalmente sorprendentes de que también estas
proteínas monómeras mantienen su actividad biológica a valores
extremos de pH y pueden ser adsorbidas en materiales de matriz sin
efectos adversos sobre la actividad y eficiencia. Durante el trabajo
que condujo a la presente invención se descubrió que si se
proporcionan ciertas condiciones de pH es posible mantener las
proteínas monómeras en solución incluso en presencia de materiales
de matriz. En tales condiciones, la proteína soluble puede
adsorberse uniformemente a todas las superficies alcanzables por la
proteína disuelta. La disponibilidad de superficies internas de
materiales más o menos porosos dependerá del tamaño de poro.
Utilizando las condiciones descritas en la presente invención será
posible adsorber proteína en todas aquellas superficies que estén
disponibles para la proteína solubilizada debido a su tamaño
molecular. La presente invención evita la formación de precipitados
y el bloqueo de los poros para acceso adicional de solución de
proteína. Este proceso permite el recubrimiento óptimo de todas las
superficies disponibles del material de matriz y los materiales
osteoinductivos de la presente invención exhiben una eficacia
mejorada en comparación con los materiales de la técnica
anterior.
Como se describe en la solicitud de patente WO
01/11041 arriba mencionada, se encontró que al menos algunas de
estas proteínas monómeras exhiben una actividad comparable o incluso
superior, basada en el peso de proteína, que sus formas dímeras
respectivas. Una ventaja importante adicional reside en el hecho de
que las proteínas pueden expresarse en una gran cantidad en
hospedadores procariotas y, por replegamiento simple de los
monómeros, se obtienen aquéllas con pureza elevada y rendimiento
muy alto sin necesidad de separar las proteínas dimerizadas de las
no dimerizadas (monómeras). Se prefiere que las proteínas de acuerdo
con este aspecto de la invención contengan al menos la región de 7
cisteínas característica de la superfamilia de proteínas
TGF-\beta. Se describe en la técnica anterior qué
cisteína es la responsable de la formación de dímeros en cierta
familia de proteínas o cierta proteína (véase por ejemplo:
Schlunegger & Grutter (1992) Nature 358,
430-434; Daopin et al., (1992) Science 257,
369-373 y Griffith et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 93 (1996), página 878-883). Esta cisteína
tiene que delecionarse o sustituirse por otro aminoácido para formar
una proteína utilizada dentro del marco de este aspecto de la
presente invención.
En una realización especialmente preferida de
este aspecto de la presente invención, la proteína que carece de un
residuo cisteína que es responsable de la formación de dímeros
contiene una secuencia de consenso de acuerdo con la secuencia
siguiente
(Fórmula
I),CC(Y)_{25-29}CYYYC(Y)_{25-35}XC(Y)_{27-34}CYC
en donde C denota cisteína, Y
denota cualquier aminoácido con inclusión de cisteína y X denota
cualquier aminoácido excepto
cisteína.
Más preferiblemente, la proteína que carece de
un residuo cisteína que es el responsable de la formación de
dímeros de acuerdo con este aspecto de la invención, contiene una
secuencia de consenso de acuerdo con la secuencia siguiente
(Fórmula
II),C(Y)_{28}CYYYC(Y)_{30-32}XC(Y)_{31}CYC
en donde C, X e Y tienen el mismo
significado que se ha definido
anteriormente.
Aún más preferiblemente, la proteína que carece
de un residuo cisteína que es el responsable de la formación de
dímeros de acuerdo con este aspecto de la invención, contiene una
secuencia de consenso de acuerdo con la secuencia siguiente
(Fórmula
III),C(X)_{28}CXXXC(X)_{31-33}C(X)_{31}CXC
en donde C y X tienen el mismo
significado definido
anteriormente.
En estas secuencias de consenso, están
contenidas las distancias especialmente preferidas entre los
residuos cisteína respectivos, en donde ya también la cisteína
formadora de dímeros está sustituida por otro aminoácido. Como en
el caso de todas las proteínas de dicha superfamilia de proteínas,
la localización de y la distancia entre las cisteínas es más
importante que la identidad de los otros aminoácidos contenidos en
esta región. Por consiguiente, la secuencia de consenso muestra la
localización respectiva de las cisteínas, pero no muestra la
identidad de los otros aminoácidos, dado que estos otros aminoácidos
son ampliamente variables en las proteínas de la superfamilia de
proteínas TGF-\beta.
En una realización especialmente preferida, la
proteína contenida en el material osteoinductivo es una forma
monómera de MP52 y comprende al menos la parte madura de la
secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ. ID. NO. 1 (secuencia
de DNA y de proteína) y SEQ. ID. NO. 2 (secuencia de proteína
únicamente), en donde el aminoácido indicado por Xaa en la posición
465 está delecionado o es cualquier aminoácido excepto cisteína.
Especialmente otros aminoácidos hidrófobos tales como glicina,
valina, leucina o isoleucina pueden estar presentes en la posición
465. El comienzo de la proteína madura se encuentra preferiblemente
en el área de los aminoácidos 352-400, de modo
especialmente preferido en los aminoácidos 381 ó 382. Por esta
razón, la proteína madura comprende los aminoácidos
381-501 o 382-501. La primera
alanina de la proteína madura puede estar delecionada y la proteína
madura comprende entonces preferiblemente los aminoácidos
383-501.
La proteína más preferida utilizada en la
presente invención es MP52-Ala83, una proteína que
comienza en el aminoácido 383 de SEQ. ID. NO. 1 ó 2, en donde la
cisteína existente naturalmente en la posición 465 está reemplazada
por el aminoácido hidrófobo alanina. Asimismo para
MP52-Ala83, la proteína madura comienza
preferiblemente entre los aminoácidos 352 y 400, y de modo
especialmente preferido en los aminoácidos 381 ó 382. La primera
alanina de la proteína madura puede estar delecionada y la proteína
madura comprende entonces preferiblemente los aminoácidos
383-501.
Teóricamente es posible que las proteínas que
corresponden a la definición de proteínas monómeras como se utiliza
en este contexto, formen cierto tipo de agregados en solución. Sin
embargo, estos agregados no corresponden a los dímeros o multímeros
de las proteínas formadas por los puentes intermoleculares definidos
y la unión covalente. Sin embargo, pueden existir fuerzas de van
der Waals y otras formas de enlaces débiles, y se considera que
tales agregados están abarcados por la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención es un
proceso para la producción de un material osteoinductivo de la
invención. Dicho proceso comprende poner en contacto un material de
matriz con una solución de una o más proteínas morfogenéticas en
condiciones adecuadas para mantener la proteína estable disuelta en
una solución tamponada y permitir de este modo que el material de
matriz llegue a recubrirse uniformemente con las propiedades
morfogenéticas, y secar subsiguiente el material de matriz
recubierto. El proceso proporciona la selección y el ajuste del pH
de la solución de proteínas a un valor de 5,2 o inferior o 9,5 y
superior, incluso cuando está en contacto con el material de
matriz. Se prefieren valores de pH comprendidos entre 12 y 13. Son
especialmente preferidos valores de pH entre 2 y 4,5, entre 4,5 y
5,2, entre 9,5 y 10,3 y entre 10,3 y 12. Las proteínas y los
materiales de matriz que pueden formar los materiales
osteoinductivos son como se ha descrito arriba para los otros
objetos de la presente invención, al igual que todos los
disolventes/tampones, aditivos y adyuvantes adecuados.
Los ejemplos no limitantes siguientes, junto con
las figuras y los protocolos de secuencia, tienen por objeto
utilizar adicionalmente la invención.
SEQ. ID. NO. muestra la secuencia de DNA y de
proteínas y SEQ. ID. NO. 2 la secuencia de proteínas de MP52 y
péptidos prepro MP52-Ala83, en donde el aminoácido
indicado por Xaa en la posición 465 es cisteína (en el caso de
MP52) o alanina (en el caso de MP52-Ala83). Las
proteínas maduras existentes naturalmente MP52 y
MP52-Ala83 comprenden los aminoácidos
382-501. En variantes recombinantes preferidas de
MP52 y MP52-Ala83, la primera alanina de la
proteína madura está delecionada y la proteína madura comprende los
aminoácidos 383-501. En todas las figuras y
ejemplos siguientes, se han utilizado estas versiones recombinantes
de MP52 y MP52-Ala83.
La Figura 1 muestra los resultados del enfoque
iso-eléctrico de acuerdo con el Ejemplo 1.
MP52-Ala83 está presente en la pista 1, mientras
que MP52 está presente en la pista 2. El pI de MP52 es
aproximadamente 7,65 y el pI de MP52-Ala83 es
aproximadamente 7,1.
La Figura 2 muestra una comparación de la
solubilidad dependiente del pH de MP52 y MP52-Ala83
de acuerdo con los Ejemplos 2 y 3 y la tabla siguiente. Los
tampones (acetato de sodio 0,1 M-ácido acético (p. 429) y carbonato
de sodio 0,1 M-bicarbonato de sodio (p. 439) se
prepararon de acuerdo con Dawson et al.: Data for
biochemicals research (3ª edición 1986, p. 429 y p. 439, Clarendon
Press, Oxford). Así, por lo que concierne a la solubilidad
dependiente del pH puede afirmarse que MP52 y
MP52-Ala83 exhiben propiedades prácticamente
idénticas.
La Figura 3 muestra una comparación de la
solubilidad de MP52 en dependencia de la fuerza iónica del
disolvente de acuerdo con los Ejemplos 2 y 3 y con la tabla
siguiente. Los tampones (acetato de sodio-ácido acético y carbonato
de sodio-bicarbonato de sodio) se prepararon de
acuerdo con Dawson et al.: Data for biochemical research
(tercera edición) 1986, p. 429 y p. 439, Clarendon Press, Oxford. En
los disolventes con alta fuerza iónica (0,1 M, véase también la
tabla correspondiente a Fig. 2), solubilidades de proteínas de 200
\mug/ml o más son alcanzables a valores de pH inferiores a 4,5 y
superiores a 10,3. En los disolventes con menor fuerza iónica (0,01
M, véase también la tabla siguiente), son alcanzables solubilidades
de proteína de aproximadamente 200 \mug/ml o más a valores de pH
inferiores a 5,2 y superiores a 9,5.
La Figura 4 muestra, de acuerdo con los Ejemplos
3 y 5, la estabilidad de MP52 y MP52-Ala83 en
tampones diferentes (HCl 10 mM, acetato de sodio 10 mM, pH 4,0 y
citrato de sodio 10 mM, pH 4,0) después de 2 semanas de conservación
a 20ºC como se determina por análisis RP-HPLC. Los
altos picos principales que representan MP52 (o
MP52-Ala83, respectivamente) están presentes a
aproximadamente 17-23 min (MP52) y a aproximadamente
11-18 min (MP52-Ala83). Los picos
adicionales (antepicos) que aparecen delante del pico principal y en
desviación de los Patrones de Referencia sin tratar indican
productos de degradación de las proteínas. Una degradación
importante de la proteína aparece en citrato de sodio 10 mM,
mientras que la estabilidad de la proteína aumenta en HCl 10 mM y
especialmente en tampón de acetato de sodio 10 mM.
La Figura 5 muestra, de acuerdo con los Ejemplos
3 y 6, la estabilidad de MP52 y MP52-Ala83 en
dependencia de la fuerza iónica del tampón/disolvente utilizado tal
como se determina por análisis RP-HPLC. La
degradación de MP52 en acetato de sodio 10 mM y 20 mM de pH 4,0
después de 2 semanas de conservación a 20ºC, así como la
degradación de MP52-Ala83 en citrato de sodio 10 mM
y 20 de pH 4,0 después de una semana de conservación a 20ºC se
muestran como ejemplos no limitantes. El alto pico principal que
representa MP52 (o MP52-Ala83, respectivamente)
está presente a aproximadamente 15-20 min. Los picos
adicionales (antepicos) que aparecen delante del pico principal y
en desviación de los Patrones de Referencia sin tratar indican
productos de degradación de las proteínas. La estabilidad de las
proteínas es satisfactoria en acetato de sodio 10 mM, pero es aún
mejor si las proteínas se conservan en un tampón con fuerza iónica
moderada (acetato de sodio 20 mM). Incluso en tampones que no son
generalmente adecuados para conservación de las proteínas
morfogenéticas (citrato de sodio), puede conseguirse una mejora de
la estabilidad de las proteínas en el tampón con fuerza iónica
moderada (20 mM).
La Figura 6 muestra, de acuerdo con los Ejemplos
3 y 7, la estabilidad de MP52 y MP52-Ala83 a pH 11,
pH 12 y pH 13 después de 0 y 90 min tal como se determina por
análisis RP-HPLC. El alto pico principal que
representa MP52 (o MP52-Ala83, respectivamente)
está presente a aproximadamente 15-20 min. Los picos
adicionales (antepicos) que aparecen delante del pico principal y
en desviación de los Patrones de Referencia sin tratar indican
productos de degradación de las proteínas. Las proteínas son
estables a valores de pH altos al menos hasta pH 12, durante
periodos de tiempo más cortos que no exceden de 90 min, incluso a pH
13.
La Figura 7 muestra radiografías de defectos
craneales de rata rellenados con materiales osteoinductivos 8
semanas después de la operación de acuerdo con el Ejemplo 9. A:
defectos sin tratar, B: defectos tratados con esponjas de colágeno
solamente; C: defectos rellenados con colágeno más MP52 dímera; D:
defectos rellenados con colágenos más MP52 monómera
(MP52-Ala83). En tanto que no es visible
regeneración ósea alguna en los defectos sin tratar (7A) o tratados
exclusivamente con matriz (7B), la osteorregeneración es apreciable
en los defectos craneales rellenados con colágeno y proteína
morfogenética (7C y 7D).
El enfoque isoeléctrico se realizó en
condiciones no reductoras utilizando un gel "CleanGel IEF"
(Pharmacia, Nº de Catálogo
18-1035-32). Antes de la
utilización, el gel seco se rehidrató durante 8 horas en 40 ml de
una solución acuosa que contenía 19,2 g de urea, 400 \mul de
NP-40 (solución al 10%) 100 \mul de Ampholine, pH
3,5-10,0 (Pharmacia, Nº. de Catálogo
80-1125-87) y 2,5 ml de
Am-pholine pH 7,0-9,0 (Pharmacia Nº.
80-1125-94). Las condiciones de la
ejecución fueron como sigue:
Se aplicaron 500 ng de proteína por pista.
Después de la ejecución, el gel se puso dos veces durante 15 minutos
cada una en solución fijadora (115 g/l de ácido tricloroacético y
35 g/l de ácido 5-sulfosalicílico dihidratado), se
lavó en agua destilada y se tiñó con plata (véase Fig. 1). Para
determinación del pI, después de IEF se cortó por separado un gel
del lado anódico en piezas de 1 cm, que se remojaron en agua para
inyección con objeto de la extracción. Cuando los valores de pH de
los extractos se representaron gráficamente en función de la
distancia del lado del ánodo, se observó una linealidad en el
gradiente de pH a lo largo del intervalo de 2,5-7,5
cm del lado anódico. Se determinaron luego los valores de pI por
medida de la distancia entre el ánodo (pH 7) y la banda principal y
utilizando coherencia lineal de pI y la distancia entre las bandas
del ánodo y principal. La distancia al ánodo para la banda del
dímero MP52 era x = 5,5 cm y para la banda
MP52-Ala83 la distancia era x = 3,2 cm. La ecuación
lineal utilizada es y = 0,227* x + 6,416. Por esta razón, el pI del
dímero MP52 determinado por vía experimental es aproximadamente 7,65
y el pI de MP52-Ala83 es aproximadamente 7,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se liofilizaron MP52 y/o
MP52-Ala83, disueltas previamente en HCl 10 mmol/l.
Los liofilizados se disolvieron durante periodos de tiempo iguales
de 5 min en disolventes diferentes (véase Fig. 2 y 3) con objeto de
crear concentraciones finales de proteínas de 0,4 mg/ml. Las
muestras se analizaron subsiguientemente por RP-HPLC
y se calculó la tasa de recuperación/cantidad de proteína
disuelta.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinación de la degradación de las
proteínas, se realizó un análisis HPLC en fase inversa conocido
comúnmente (RP-HPLC) de las muestras. Se utilizaron
dispositivos RP-HPLC de diferentes fabricantes. Un
ejemplo apropiado de condiciones de realización adecuadas es:
columna: Vydac C18; 5 \mum; 300 Angstrom, 2,1 x 250 mm; Fase
218TP52; Fase A: 0,15% TFA en agua; Fase B: 0,15% acetonitrilo/RFA;
velocidad: 0,3 ml/min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se liofilizó MP52, disuelta previamente en HCl
de 10 mmol/l. Los liofilizados se disolvieron durante periodos de
tiempo iguales de 5 min en los diferentes disolventes a fin de crear
concentraciones finales de proteína de 0,4 mg/ml. La solubilidad se
comparó utilizando dos valores de pH fijos (pH 10 y pH 4,6,
respectivamente) que se encontraban en el límite de la solubilidad
dependiente del pH. Las muestras se analizaron subsiguientemente por
RP-HPLC y se calculó la tasa de
recuperación/cantidad de proteína disuelta.
De acuerdo con la tabla siguiente, no se midió
solubilidad alguna a pH 10, tanto si se utilizaba como disolvente
AMP
(2-amino-2-metil-1,3-propanodiol-HCl;
véase Dawson et al.: Data for biochemical research (3ª
edición) 1986, 477, Clarendon Press, Oxford) como si se utilizó
glicina sódica. Se obtuvo una solubilidad satisfactoria en tampón
de carbonato de sodio o en solución de NaOH no tamponada (pH 10). A
pH 4,6, se demostró que el acetato de sodio era el mejor disolvente
en comparación con citrato de sodio.
\vskip1.000000\baselineskip
MP52 y MP52-Ala83 se disolvieron
en 3 disolventes diferentes, una solución no tamponada (HCl 10 mM) y
2 soluciones tamponadas (acetato de sodio 10 mM, pH 4,0, citrato de
sodio 10 mM de pH 4,0). Todas las muestras se guardaron a 20ºC.
Después de dos semanas, las muestras se sometieron a análisis por
HPLC en fase inversa (Ejemplo 3) para determinar cualquier
degradación de las proteínas. Los resultados se muestran en Fig. 4.
En comparación con un estándar de referencia de MP52 o
MP52-Ala83 guardado a -80ºC, las proteínas exhiben
un patrón de degradación importante si se disuelven en citrato de
sodio 10 mM, mientras que puede apreciarse mucho menos degradación
en HCl 10 mM. Los mejores resultados se obtuvieron por conservación
en tampón de acetato de sodio 10 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron MP52 y MP52-Ala83
en acetato de sodio 10 ó 20 mM, de pH 4 o en citrato de sodio 10 ó
20 mM de pH 4. Todas las muestras se guardaron a 20ºC. Después de
una o dos semanas, las muestras se sometieron a análisis por HPLC
en fase inversa (Ejemplo 3) para determinar cualquier degradación de
las proteínas. Los resultados se muestran en Fig. 5. La estabilidad
de las proteínas es satisfactoria en acetato de sodio 10 mM pero
mejora significativamente si las proteínas se guardan en un tampón
con fuerza iónica moderada (acetato de sodio 20 mM). Incluso en
tampones que no son generalmente adecuados para conservación de las
proteínas morfogenéticas (citrato de sodio), puede conseguirse una
mejora de la estabilidad de las proteínas en el tampón que tiene la
fuerza iónica mayor.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinación de la estabilidad de las
proteínas morfogenéticas a valores de pH básicos, se disolvieron
MP52 y MP52-Ala83 en tampón de Na_{2}HPO_{4}. El
pH se ajustó con NaOH a cualquiera de los valores pH 11, pH 12 o pH
13. Después de 0 y 90 min, las muestras se sometieron a análisis por
HPLC en fase inversa para determinar cualquier degradación de las
proteínas. Como se muestra en Fig. 6, en comparación con un estándar
de referencia de MP52 o MP52-Ala83, no pudo
apreciarse alteración importante alguna del perfil de picos después
de 0 y 90 min a pH 11 y pH 12, mientras que es claramente visible un
aumento significativo de antepicos que representan productos de
degradación después de 90 min a pH 13. Sin embargo, una mayor parte
del pico principal de MP52 está todavía presente a pH 13. Por
tanto, este ejemplo demostró la estabilidad de las proteínas
morfogenéticas a valores de pH altos al menos hasta pH 12.
Adicionalmente, estas proteínas son también estables a pH 13 durante
periodos breves que no exceden de
90 min.
90 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Este proceso de recubrimiento general es
preferiblemente ventajoso para recubrimiento de materiales de matriz
con propiedades neutras o básicas, pero puede utilizarse también
para el recubrimiento de vehículos ácidos.
Se disolvió MP52-Ala83 en HCl 10
mM, acetato de sodio 10 mM (pH 4) o acetato de sodio 20 mM o
combinaciones de los mismos para dar una concentración final de 1
\mug/ml. Opcionalmente, las soluciones contenían uno o más de los
aditivos siguientes: 8-15% sacáridos,
50-60% alcoholes, 10-75 syndets. Las
soluciones se pipetearon subsiguientemente a un material de matriz
de \beta-TCP. Se utilizaron 100 ng de
MP52-Ala83 para recubrimiento de 100 mg de material
de matriz. El \beta-TCP recubierto se secó al aire
durante una hora a 20ºC y finalmente se secó al aire o se secó a
vacío para eliminar cualquier fluido remanente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortaron esponjas hemostáticas de colágeno
absorbibles (tipo "Helistat", Integra Life Sciences,
Plainsboro, EE.UU.) en pequeños fragmentos (0,6 cm x 0,6 cm).
Seguidamente, los lados rugosos de las esponjas se recubrieron con
60 \mul de tampón de dilución solo (HCl 10 mM/acetato de sodio 20
mM, pH 4,0) como control negativo, MP52-Ala83
monómera (500 \mug/ml en tampón de dilución) o MP52 dímera (500
\mug/ml en tampón de dilución). Las matrices de esponja se
secaron al aire en condiciones estériles. La capacidad de estos
materiales osteoinductivos para inducir el nuevo crecimiento de
hueso in vivo se evaluó subsiguientemente utilizando un
estudio de defecto craneal en la rata. En este modelo animal bien
establecido, se practican defectos óseos circulares en el cráneo de
ratas y se colocan implantes de matriz recubiertos con proteínas
morfogenéticas en el interior de los orificios que no se curan
naturalmente. Después de un par de semanas, puede calcularse la
eficacia de los materiales osteoinductivos para inducir nuevo
crecimiento de hueso por determinación de la reducción del tamaño de
los defectos.
Las matrices de colágeno esponjoso se
rehidrataron antes de la implantación en 30 \mul de solución
salina tamponada con fosfato PBS durante 10 min. Los implantes se
colocaron finalmente en defectos bilaterales (diámetro de 6 mm cada
uno), que se han creado en los huesos parietales de ratas de acuerdo
con un proceso descrito previamente por Mulliken, J. B. y Glowacki,
J. Plast. Reconstr. Surg. 65:553-559 (1980).
Implantes que contenían colágeno puro sin proteína morfogenética
alguna sirvieron como control negativo, así como defectos sin
implantes. Después de 8 semanas, se sacrificaron los animales y se
tomaron radiografías de contacto. Las radiografías de los defectos
craneales de las ratas revelaron diferencias significativas (Figura
7). No pudo observarse regeneración ósea alguna en los defectos sin
tratar (7A) o en los defectos tratados con esponjas de colágeno
solo (7B). Los animales en los cuales los defectos craneales se
habían rellenado con colágeno + MP52 dímera (7C) demostraron una
creación importante de hueso que partía de los bordes de los
defectos. Se apreciaban efectos osteoinductivos comparables en las
muestras tratadas con colágeno + MP52 monómera
(MP52-Ala83) (7D).
\vskip1.000000\baselineskip
El proceso de recubrimiento básico general es
preferiblemente ventajoso para el recubrimiento de materiales de
matriz con propiedades ácidas o neutras, pero puede utilizarse
también para el recubrimiento de vehículos básicos. Adicionalmente,
MP52 y MP52-Ala83 se disolvieron en tampón de
carbonato de sodio/bicarbonato de sodio 10 ó 20 mM o NaOH (pH 12)
para dar una concentración final de 1 \mug/ml. Opcionalmente, las
soluciones contenían uno o más de los aditivos siguientes:
8-15% sacáridos, 50-60% alcoholes,
10-75% jabones o syndets. Las soluciones se
pipetearon subsiguientemente a un material de matriz de
\beta-TCP. Con este proceso, se utilizaron 100 ng
de MP52-Ala83 para recubrimiento de 100 mg de
material de matriz. El \betaTCP recubierto se secó al aire
durante una hora a 20ºC y finalmente se secó a vacío para eliminar
cualquier fluido remanente.
\vskip1.000000\baselineskip
El polvo convencional de
Ca(OH)_{2}, que se utiliza rutinariamente como
material de matriz en los procesos de reparación dental, se
esterilizó durante una hora a 180ºC antes del recubrimiento.
Ca(OH)_{2} exhibe un pH fuertemente básico de 12 en
soluciones acuosas. Durante el proceso de recubrimiento, se
mezclaron 71 mg de polvo de Ca(OH)_{2} esterilizado
en relación 1:1 con 71 \mul de MP52 solubilizada (3,15 mg/ml) o 71
\mul de agua como control y se incubaron para formar un material
osteoinductivo con un valor de pH 12.
\newpage
Con objeto de demostrar la estabilidad de MP52 a
valores de pH básicos, se ensayó la actividad biológica de MP52
recubierta después de proceso de recubrimiento. El material
osteoinductivo se neutralizó con HCl 1 M y se diluyó
subsiguientemente con medio de cultivo de células para liberar la
proteína morfogenética y producir concentraciones finales de
proteína de 400 ng/ml y 133,2 ng/ml de MP52. La actividad biológica
de estas soluciones de MP52 se midió in vitro por
cuantificación de la actividad de fosfatasa alcalina (ALP)
utilizando la línea de células de ratón establecida
MCHT-1/26. Las células se incubaron durante 3 días
en medio alfa-MEM que contenía 10% de FCS,
L-glutamina (20 mM) y penicilina/estreptomicina
hasta una confluencia menor que 95%. Las células lavadas y tratadas
con tripsina se resuspendieron en el mismo medio de cultivo y se
dispensaron en placas de microtitulación de 96 pocillos (4,5 x
10^{3} células por pocillo). Se dejó que las células se
adhirieran durante 24 horas, se lavaron (alfa-MEM
que contenía L-glutamina (20 mM)) y se sometieron a
las concentraciones de MP52 diluidas en medio de cultivo. Todos los
valores de las muestras de MP52 se compararon con un estándar de
MP52, para el cual se ha determinado la actividad de formación ósea
in vivo. Las células se incubaron durante 72 horas, se
lavaron y se lisaron por incubación en detergente Nonidet
P-40 al 0,2% y MgCl_{2} 1 mM durante una noche.
El sobrenadante se mezcló con fosfato de
p-nitrofenilo, el sustrato para fosfatasa alcalina,
y la reacción se interrumpió después de una hora a 37ºC. Se midieron
los cambios en absorbancia a 405 nm y se utilizaron como indicador
de la actividad biológica relativa. Los valores DO_{405} de MP52
utilizados en el proceso de recubrimiento con
Ca(OH)_{2} (400 ng/ml: 0,629; 133,2 ng/ml: 0,378)
son comparables a los del estándar de MP52 (400 ng/ml: 0,684; 133,2
ng/ml: 0,438), mientras que el control no exhibía absorbancia
alguna a 450 nm. Por tanto, este ejemplo demostró la posibilidad de
recubrir materiales de matriz con proteínas morfogenéticas a valores
altos de pH sin pérdida de actividad biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de proteína fijada en el material de
matriz se visualizó por tinción con Coomassie. El Azul Brillante
Coomassie es un tinte orgánico heterocíclico sintético que se fija
inespecíficamente pero de una manera aproximadamente
estequiométrica a prácticamente todas las proteínas. El tinte azul
Coomassie acidificado cambia de pardo rojizo a azul cuando se fija
a una proteína. Así, una distribución irregular de proteína en el
material de matriz se representa por un patrón azul moteado.
Los materiales de matriz recubiertos se
incubaron con solución de tinción de Coomassie (0,5% de Azul
Brillante Coomassie R-250 en metanol al 40%, 60%
PBS) durante 20 min a la temperatura ambiente. Materiales de matriz
idénticos sin recubrir se tiñeron también y sirvieron como
controles. Cualquier exceso de tinte se eliminó por lavado con 40%
metanol/60% PBS hasta que se produjo el desteñido completo de los
controles.
Se reconoció una distribución de proteínas
absolutamente uniforme en los materiales de matriz sin mancha azul
alguna por recubrimiento en presencia de polisacáridos,
especialmente sacarosa. Se obtuvieron resultados similares en
presencia de alcoholes, especialmente etanol, jabones o syndets.
<110> Biopharm Ges. zur biotechnologischen
Entwicklung v
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Materiales Osteoinductivos
Mejorados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 29725PEPAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 03 007 141.9
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-03-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2703
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (640)..(2142)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de consenso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (Y) 25-29,
siendo Y= cualquier aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5) .. (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Y, siendo Y= cualquier
aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (Y) 25-35,
siendo Y= cualquier aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = X, siendo X= cualquier
aminoácido excepto cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (Y) 27-34,
siendo Y= cualquier aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Y, siendo Y= cualquier
aminoácido con inclusión de cisteína
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de consenso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (Y) 28, siendo Y= cualquier
aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Y, siendo Y= cualquier
aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (Y) 30-32,
siendo Y= cualquier aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = X, siendo X= cualquier
aminoácido excepto cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (Y) 31, siendo Y= cualquier
aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Y, siendo Y= cualquier
aminoácido con inclusión de cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de consenso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
<221) REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (X) 28, siendo X= cualquier
aminoácido excepto cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = X, siendo X= cualquier
aminoácido excepto cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (X) 31-33,
siendo X= cualquier aminoácido excepto cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = (X) 31, siendo X= cualquier
aminoácido excepto cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = X, siendo X= cualquier
aminoácido excepto cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (26)
1. Material osteoinductivo que comprende un
material de matriz y, adsorbido en las superficies interiores y/o
exteriores de este material de matriz, una o más proteínas
morfogenéticas, en donde dicho material osteoinductivo puede
obtenerse por contacto del material de matriz y la o las proteínas
morfogenéticas en condiciones adecuadas para mantener la proteína
estable y disuelta en una solución, permitiendo así que el material
de matriz llegue a recubrirse uniformemente con la o las proteínas
morfogenéticas, en donde dichas condiciones adecuadas se seleccionan
de:
(a) utilización de un tampón o disolvente que
es capaz de mantener un pH inferior a 4,5 o superior a 10,3 durante
el proceso de recubrimiento, o
(b) utilización de un tampón o disolvente que
tiene una concentración iónica de 100 mmol/l o menos y es capaz de
mantener un pH inferior a 5,2 o superior a 9,5 durante el proceso de
recubrimiento.
2. Material osteoinductivo de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la proteína morfogenética contiene al
menos una región de 7 cisteínas característica de las proteínas de
la superfamilia TGF-\beta.
3. Material osteoinductivo de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el cual la proteína morfogenética es una
proteína madura o una parte biológicamente activa o variante de la
misma.
4. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la proteína
morfogenética pertenece a la familia TGF-\beta,
BMP, GDF, activina o GDNF.
5. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la proteína
morfogenética es una proteína dímera.
6. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual la proteína
morfogenética es BMP2, BMP7, BMP12, BMP13, MP52 (GDF5) o una parte o
variante biológicamente activa de las mismas.
7. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la proteína
morfogenética es una proteína que carece del residuo cisteína que es
responsable de la formación de dímeros en las proteínas respectivas
existentes naturalmente.
8. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 7, en el cual la proteína
morfogenética contiene una secuencia de consenso de acuerdo con
fórmula I:
- Fórmula I:
- C(Y)_{25-29}CYYYC(Y)_{25-35}XC(Y)_{27-34}CYC {}\hskip0.5cm o
- Fórmula II:
- C(Y)_{28}CYYYC(Y)_{30-32}XC(Y)_{31}CYC,
en donde C denota cisteína, Y
denota cualquier aminoácido y X denota cualquier aminoácido excepto
cisteína.
9. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 7 y 8, en el cual la
proteína es una forma monómera de MP52.
10. Material osteoinductivo de acuerdo con la
reivindicación 9, en el cual la proteína es
MP52-Ala83 o una parte o variante biológicamente
activa de la misma.
11. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el
material de matriz es un material biocompatible.
12. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el
material de matriz es un material natural, un material natural
modificado o un material sintético.
13. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el
material de matriz es un material poroso.
14. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el
material de matriz comprende al menos una de las sustancias
siguientes: a) colágeno, b) Ca(OH)_{2}, c)
polilactida o derivados de polilactida, d) ácido hialurónico, e)
copolímeros polioxietileno-polioxipropileno, f)
fosfato de calcio, g) una combinación de
hidroxi-apatito y colágeno, h) una combinación de
ácido poliglicólico y ácido poliláctico o derivados de
polilactida.
15. Un material osteoinductivo de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el
tampón o disolvente utilizado para recubrimiento tiene una fuerza
iónica de 80 mmol/l o menos, 40 mmol/l o menos, 20 mmol/l o menos,
10 mmol/l o menos, o 5 mmol/l.
16. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el tampón
o disolvente utilizado para recubrimiento comprende adicionalmente
sacáridos.
17. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el tampón
o disolvente utilizado para recubrimiento comprende adicionalmente
alcoholes u otros disolventes orgánicos.
18. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el tampón
o disolvente utilizado para recubrimiento comprende adicionalmente
jabones o syndets.
19. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la o las
proteínas morfogenéticas está(n) enlazada(s) covalente o no
covalentemente a polietilen-glicoles.
20. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el tampón
o disolvente utilizado para recubrimiento ácido contiene HCl o
acetato de sodio.
21. Material osteoinductivo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el tampón
o disolvente utilizado para recubrimiento básico contiene NaOH o
carbonato de sodio/bicarbonato de sodio.
22. Proceso para la producción de un material
osteoinductivo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 20,
comprendiendo dicho proceso poner en contacto un material de matriz
con una solución de al menos una proteína morfogenética,
caracterizado porque se seleccionan sustancias contenidas en
dicha solución para permitir el ajuste del pH de la solución a un
valor inferior a 5,2 incluso cuando están en contacto con el
material de matriz.
23. Proceso para la producción de un material
osteoinductivo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19 y 21,
comprendiendo dicho proceso poner en contacto un material de matriz
con una solución de una proteína morfogenética, caracterizado
porque se seleccionan sustancias contenidas en dicha solución para
permitir el ajuste del pH de la solución a un valor superior a 9,5
incluso cuando están en contacto con el material de matriz.
24. Uso de un material osteoinductivo de acuerdo
con las reivindicaciones 1 a 21 para la preparación de un
medicamento para la reparación o el crecimiento de cartílago, hueso,
tejido conectivo con inclusión de tendón y/o ligamento, tejido
periodontal o dental, tejido neural, tejido del sistema sensorial,
hígado, páncreas, cardiaco, vasos sanguíneos, renal, tejido uterino
y tiroideo, piel, membranas mucosas, endotelio y epitelio.
25. Uso de un material osteoinductivo de acuerdo
con las reivindicaciones 1 a 21 para la preparación de un
medicamento para la promoción o inducción del crecimiento de los
nervios, reparación y regeneración de tejidos, angiogénesis,
curación de las heridas con inclusión de úlceras, quemaduras,
lesiones o injertos de piel, inducción de la proliferación de
células progenitoras o células de la médula ósea, para regeneración
de la fijación funcional entre tejido conectivo y hueso, reparación
de cartílago, tratamiento de osteoporosis u osteoartritis,
corrección de fracturas no unidas, anormalidades craneofaciales,
esqueléticas o dentales adquiridas o congénitas, y para reparación
de tejido no esquelético en cirugía plástica o reconstructiva.
26. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 24 ó 25, en el cual la enfermedad o condición
anormal está causada por lesión isquémica o traumática, enfermedad
degenerativa, cardiomiopatías, ataques aterotrombóticos o
cardioembólicos, ulceración, cirrosis, enfisema, senescencia celular
o inactividad.
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