DE60205937T3

DE60205937T3 - Methode zur Herstellung einer homogen beschichtete Vorrichtung mit osteoinduktiven und osteokonduktiven Eigenschaft

Info

Publication number: DE60205937T3
Application number: DE60205937.2T
Authority: DE
Inventors: Ulrich Kohnert; Sylke PÖHLING; Klaus Hellerbrand; Peter Happersberger
Original assignee: Scil Technology GmbH
Current assignee: Bionet Pharma GmbH
Priority date: 2001-11-19
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2016-01-21
Anticipated expiration: 2022-03-28
Also published as: AU2002308204B2; CN1561235A; SI1448246T2; DK1448246T3; EP1448246A1; DE60205937D1; JP5054091B2; CA2466947A1; JP2010075737A; JP4473576B2; JP2005509494A; CN100425285C; US8546334B2; HK1071315A1; ES2247423T3; DK1448246T4; US20150080303A1; WO2003043673A1; PT1448246E; EP1448246B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, welche osteoinduktive und osteokonduktive Eigenschaften in vivo aufweist.
Von verschiedenen Calciumphosphaten, wie z. B. beta-Tricalciumphosphat (Ca₂(PO₄)₂) (beta-TCP), alpha-Tricalciumphosphat (alpha-TCP) und Hydroxyapatit (HA), wurde bereits gezeigt, dass sie effektiv als Knochenersatzmaterialien sind. So ist z. B. Beta-TCP sowohl als Granulat als auch in Blöcken für die Behandlung von Knochendefekten geeignet. Die Knochenersatzmaterialien, die Calciumphosphat enthalten, werden für gewöhnlich verwendet, wenn eine Regeneration des Knochens nicht mehr oder nur unter erschwerten Bedingungen möglich ist. Zudem werden Knochenersatzmaterialien verwendet, wenn die Bildung von zusätzlichem Knochen eine Voraussetzung für das nachfolgende Einsetzen eines Implantats darstellt. Die Calciumphosphate zeigen eine osteokonduktive Wirkung, d. h. sie stellen eine inerte Struktur dar, welche das Einwandern von Zellen des benachbarten Knochens begünstigt. Die Gegenwart von Knochen oder anderen mesenchymalen Zellen ist jedoch eine Grundvoraussetzung für die Neubildung von Knochen. Die Wirkung von Calciumphosphaten kann durch die Zugabe von Knochenspänen signifikant gesteigert werden. Die Knochen sind nicht nur osteokonduktiv sondern auch osteogen (Stimulation von Knochenzellen zur Neusynthese von Knochensubstanz) und osteoinduktiv, d. h. sie bewirken die Umwandlung von undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen in Osteoblasten und Chondrozyten. Aus Sicherheitsgründen werden autogene Knochenspäne gegenüber allogenen oder xenogenen Präparaten bevorzugt. Die Herstellung von autogenen Knochen schließt jedoch immer einen zweiten chirurgischen Eingriff ein, der in vielen Fällen vom Patienten nicht akzeptiert wird.
Eine Alternative zur Verwendung von autogenen Knochen ist die Verwendung von spezifischen Knochenwachstums- und Differenzierungsfaktoren, wie z. B. GDF-5, oder verschiedenen knochenmorphogenetischen Proteinen (BMPs). Diese Proteinfaktoren haben eine osteoinduktive Wirkung, welche sie jedoch nur dann ausüben können, wenn sie in immobilisierter Form verwendet werden. In der Literatur werden sowohl Calciumphosphate, Kollagen als auch mineralisiertes Kollagen (Calciumphosphat enthaltendes Kollagen) als Träger beschrieben (Hydroxyapatit und beta-TCP (Hotz, 1994), Hydroxylapatit aus Algenextrakten (Gao, 1996), Knochenextrakte (Gombotz, 1996) und Kollagen (Friess, 1999). Die Analysen der Wirksamkeit der in der Literatur beschriebenen beschichteten Träger zeigen kein einheitliches Bild, sondern weisen signifikante Unterschiede auf, und zwar entweder aufgrund der Art des gewählten Trägers oder des Beschichtungsverfahrens (Terheyden et al., 1997). Es wurden bereits verschiedene Verfahren beschrieben. In WO 98/21972 erfolgt die Beschichtung durch eine rasche Präzipitation von GDF-5 auf beta-TCP, indem GDF-5 zunächst in einem organischen Lösungsmittel gelöst und im Anschluss durch die Zugabe von Wasser präzipitiert wird. Aufgrund der Toxizität vieler Lösungsmittel ist ein derartiges Verfahren jedoch zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen nicht bevorzugt. Lind et al. (1996) führen die Beschichtung von verschiedenen Calciumphosphatkeramiken in der Gegenwart von Gelatine (gewöhnlich aus Rinder- oder Schweineknochen gewonnen) als Schutzprotein durch. Aufgrund des erhöhten Infektionsrisikos sollte die Verwendung von tierischen Substanzen bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Medizinprodukten jedoch vermieden werden. Friess et al. (1999) und Gao et al. (1996) beschreiben die Beschichtung von Kollagenen mit BMP-2. Aufgrund der geringen Druckfestigkeit von Kollagenen sind derartige Träger jedoch nicht für alle Indikationen geeignet. Dies betrifft insbesondere Indikationen, bei denen der neu gebildete Knochen einer späteren Druckbelastung standhalten muss. Weiterhin sind pharmazeutische Qualitäten von Kollagen bislang nur aus tierischen Quellen erhältlich. DE 196 47 853 beschreibt Knochenimplantate, die eine mit Protein (z. B. BMP, GDF) beschichtete Matrix aus Calciumphosphat umfassen. Diese Implantate werden bei einer Knochenaugmentation nach künstlich erzeugten Defekten sowie bei Knochendefekten nach der Exstirpation von Zysten oder Tumoren, zur Behandlung von Bandscheibenerkrankungen sowie zur Sinusanhebung verwendet.
US 5,385,887 beschreibt Formulierungen von knochenmorphogenetischen Proteinen, denen eine verbesserte Löslichkeit und/oder Stabilität zugeschrieben wird. Es wird dort beschrieben, diese verbesserte Löslichkeit und Stabilität werde durch die Verwendung einer Zusammensetzung aus Saccharose, Glycin und Glutaminsäure erreicht.
US 5,422,340 beschreibt mit TGF-beta.1 imprägnierte Tricalciumphosphatscheiben und Alam et al., Biomaterials 22 (2001), 1643–1651, beschreiben biphasische Calciumphosphatkeramiken, die mit rekombinantem, menschlichem knochenmorphogenetischem Protein imprägniert sind.
Wenngleich einige Veröffentlichungen die Verwendung von mit Protein beschichteten Trägern zur Knochenaugmentation beschreiben, so sind dennoch effiziente und verlässliche Verfahren für die Herstellung und die Verwendung bei der Behandlung von Knochendefekten nicht verfügbar und somit in hohem Maße wünschenswert.
Folglich besteht die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Aufgabe darin, Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur effizienten und verlässlichen Behandlung von Knochendefekten bereitzustellen, umfassend Knochenaugmentation.
Diese technische Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Dem entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, die osteoinduktive und osteokonduktive Eigenschaften in vivo aufweist und einen Träger umfasst, der Calciumphosphat und ein osteoinduktives Protein enthält, bei dem es sich entweder um GDF-5 oder BMP-2 handelt, wobei der Träger vollständig mit dem osteoinduktiven Protein beschichtet ist und wobei im Wesentlichen identische Mengen des osteoinduktiven Proteins in faktisch jedem Bereich der Oberfläche des Trägers vorhanden sind. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen einer Lösung umfassend gelöstes osteoinduktives Protein sowie einen Puffer, der eine schwache Säure mit einem pK-Wert von zwischen 3 und 7, bevorzugt zwischen 4 und 6, enthält, wobei die Lösung frei von toxischen Substanzen ist und der Puffer das Protein für eine Zeit in Lösung hält, die ausreichend ist, um eine homogene Beschichtung eines Calciumphosphat enthaltenden Trägers zu gestatten, wenn es mit dem Träger in Kontakt gebracht wird, wobei der Puffer dazu in der Lage ist, den durch das Inkontaktbringen der Pufferlösung mit dem Calciumphosphatträger bewirkten Anstieg des pH-Werts so auszugleichen, dass das Protein nicht aufgrund des Anstiegs des pH-Werts unmittelbar präzipitiert;
(b) Inkontaktbringen der Lösung aus Schritt (a) mit einem Träger, der Calciumphosphat enthält;
(c) Zulassen der Bildung einer homogenen Beschichtung der Oberfläche des Trägers mit dem gelösten Protein; und
(d) Trocknen des in Schritt (c) erhaltenen beschichteten Trägers.

Soweit spezifische Ausführungsformen oder Merkmale der vorliegenden Beschreibung nicht oder nicht mehr vom Wortlaut der Beschreibung oder der Ansprüche abgedeckt werden, stellt dies im Hinblick auf identische Ausführungsformen weder eine Auswahl noch einen Verzicht dar.
Der Begriff ”Vorrichtung”, so wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf eine Einheit, die mindestens zwei Komponenten umfasst. Bei einer dieser Komponenten handelt es sich um eine Trägermatrix. Bevorzugt besteht die Trägermatrix aus anorganischen Keramiken. Diese Keramiken haben aufgrund des Vorliegens von Makro- und Mikroporen eine besonders große Oberfläche. Bevorzugt weisen die Makroporen einen Durchmesser von etwa 100 bis 400 nm auf, während die Mikroporen über einen Durchmesser von weniger als 10 nm verfügen. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Träger um Calciumphosphat, siehe infra.
Eine weitere Komponente der Vorrichtung ist ein Protein oder Polypeptid, das über osteoinduktive Eigenschaften verfügt (z. B. GDF-5 oder BMP-2), wie nachstehend im Detail erläutert wird. Das Protein oder Polypeptid ist auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert. Die gemäß der vorliegenden Erfindung angewandten osteoinduktiven Proteine und Polypeptide verfügen über eine besonders hohe Affinität gegenüber anorganischen Trägermatrizen, wie z. B. Calciumphosphat. Bevorzugt ist die Bindung des Proteins oder Polypeptids an den Träger reversibel. Dadurch wird das Lösen des Proteins ermöglicht, sobald die Vorrichtung in eine geeignete Umgebung in vivo, wie z. B. eine Knochenkavität, eingebracht worden ist. Bevorzugt besteht das Lösen der Proteine in einer langsamen Freisetzung, welche die Diffusion des Proteins in das die Vorrichtung umgebende Gewebe gestattet. Somit dient die Vorrichtung als eine in vivo Quelle für osteoinduktive Proteine, die langsam freigesetzt und dadurch effizient in die umgebenden Gewebe verteilt werden können oder in der immobilisierten Form eine Wirkung aufweisen.
Darüber hinaus kann die Vorrichtung zusätzliche Exzipienten umfassen. Diese Exzipienten dienen der Stabilisierung des Proteins, wie z. B. Saccharide, Aminosäuren, Polyole oder Tenside, oder der Stabilisierung des pH-Werts, wie z. B. Puffersubstanzen. Von der vorliegenden Erfindung umfasste, bevorzugte Exzipienten werden nachstehend im Detail besprochen.
Der Begriff ”osteoinduktiv” bezieht sich auf die Fähigkeit zur Transformation von mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten und Chondrozyten. Eine Voraussetzung für die Osteoinduktion besteht in einem Signal, das durch die Vorrichtung in die umgebenden Gewebe ausgesandt wird, wodurch die vorstehend genannten Vorläufer der Osteoblasten aktiviert werden. Die Osteoinduktion, so wie hierin verwendet, umfasst die Differenzierung von mesenchymalen Zellen zu Knochenvorläuferzellen, den so genannten Osteoblasten. Darüber hinaus umfasst die Osteoinduktion ebenfalls die Differenzierung der Osteoblasten zu Osteozyten, den reifen Zellen des Knochens. Des Weiteren ist durch die Osteoinduktion auch die Differenzierung von mesenchymalen Zellen zu Chondrozyten umfasst. Insbesondere in den langen Knochen können die im Perichondrium des Knochens sitzenden Chondroblasten sowie die Chondrozyten ebenfalls zu Osteozyten differenzieren. Somit erfordert die Osteoinduktion die Differenzierung von undifferenzierten oder weniger ausdifferenzierten Zellen zu Osteozyten, die dazu in der Lage sind, den Knochen zu bilden. Somit besteht eine Voraussetzung für die Osteoinduktion in einem Signal, das durch die Vorrichtung in die umgebenden Gewebe ausgesandt wird, wo sich für gewöhnlich die vorstehend genannten Vorläufer der Osteozyten befinden. Wie vorstehend bereits beschrieben wurde, werden die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten osteoinduktiven Proteine nach der Implantation langsam von der Vorrichtung freigesetzt und effizient in die umgebenden Gewebe verteilt. Darüber hinaus verfügen die durch die vorliegende Erfindung umfassten Proteine und Polypeptide über osterinduktive Eigenschaften in vivo. So ist z. B. im Stand der Technik hinreichend bekannt, dass die Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors-beta (TGF-beta;) Vertreter umfasst, die osterinduktive Eigenschaften aufweisen. Einzelne Vertreter dieser Superfamilie von TGF-beta, welche über besonders gute osterinduktive Eigenschaften verfügen, werden nachstehend aufgeführt. Schlussendlich dienen die osteoinduktiven Proteine der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach deren Freisetzung von dem Träger als osteoinduktives Signal für die Vorläufer der Osteozyten des Gewebes, das den Ort der Implantation der Vorrichtung umgibt.
Der Begriff ”osteogen” beschreibt die Synthese von neuem Knochen durch Osteoblasten. Gemäß der vorliegenden Erfindung dient die Struktur der Vorrichtung, an die sich die Osteozyten anheften können, als Matrix für das Einwachsen von bereits in der Umgebung des Orts der Implantation der Vorrichtung bestehendem Knochen in die Vorrichtung.
Der Begriff ”Träger” umfasst dreidimensionale Matrizen, wie z. B. die vorstehend genannten Keramiken. Darüber hinaus verfügt der Träger bevorzugt über eine vergrößerte Oberfläche aufgrund der Bildung von Makro- und Mikroporen, so wie vorstehend beschrieben. Das Trägermaterial weist eine hohe Affinität gegenüber osteoinduktiven Proteinen auf und gestattet dennoch die Freisetzung der Proteine in vivo. Gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Träger bevorzugt um ein Calciumphosphat. Der von der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasste Träger kann in eine zur Verabreichung der Vorrichtung in vivo geeignete Form gebracht werden, wie z. B. Keramiken in Form von Granulaten, Blöcken, Würfeln, Zementen und amorphen Pasten. Zusätzlich kann der Träger auf eine metallische Oberfläche geschichtet werden.
Der Begriff ”Calciumphosphat” umfasst Zusammensetzungen, die Calciumionen, Phosphationen sowie gegebenenfalls weitere Ionen oder Atome umfassen, die jeweils für den erfindungsgemäßen Träger geeignet sind. Bei den gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Calciumphosphaten handelt es sich um Kristalle, die eine dreidimensionale Struktur aufweisen, die für die wie vorstehend dargestellte erfindungsgemäße Vorrichtung geeignet ist. Eine Liste von bevorzugten und hinreichend bekannten Calciumphosphaten ist nachstehend angegeben.
Der Begriff ”osteoinduktives Protein”, wie vorstehend erläutert, bezieht sich auf die Vertreter der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors-beta (TGF-beta), die über osteoinduktive Eigenschaften verfügen, wie z. B. den Wachstums- und Differenzierungsfaktor-5; siehe infra. Diese osteoinduktiven Proteine weisen eine hohe Affinität gegenüber Calciumphosphaten auf. Calciumphosphat kann zum Beispiel in Form von beta-TCP, alpha-TCP oder Hydroxyapatit vorliegen. In Abhängigkeit von den Makro- (100–400 nm) und Mikroporen (< 10 nm) absorbieren diese anorganischen Minerale wässrige Lösungen. Während dieses Prozesses werden Proteine wie GDF-5 oder BMP-2 fest an die Oberfläche des Trägers adsorbiert. Eine wichtige Voraussetzung für diesen Prozess ist eine ausreichende Löslichkeit der Proteine in der Beschichtungslösung.
Der Begriff ”homogen beschichtet” bedeutet, dass die Oberfläche des Trägers vollständig mit dem osteoinduktiven Protein beschichtet ist, wobei in ausnahmslos jedem Bereich der Oberfläche des Trägers im Wesentlichen identische Proteinmengen vorhanden sind. Ein gemäß der vorliegenden Erfindung homogen beschichteter Träger weist bevorzugt eine maximale Bedeckung mit dem osteoinduktiven Protein auf seiner Oberfläche auf. Eine homogene Beschichtung ist Grundvoraussetzung für die effiziente Freisetzung sowie homogene Verteilung und Aktivität des osteoinduktiven Proteins in dem Gewebe, das die Stelle der Implantation umgibt. Des Weiteren wird vorausgesetzt, dass die osteoinduktiven Proteine weder aggregiert noch aufgrund von Präzipitation oder Mikropräzipitation teilweise oder vollständig inaktiviert sind; vielmehr soll durch die homogene Beschichtung eine Anheftung von biologisch aktiven, nicht aggregierten Proteinen erreicht werden. Diese homogene Beschichtung kann durch das erfindungsgemäße Verfahren sowie gemäß der Beschreibung in den beigefügten Beispielen erreicht werden. Des Weiteren werden in den beigefügten Beispielen Mittel und Verfahren zur Regulierung der homogenen Beschichtung sowie zur Quantifizierung und Charakterisierung des immobilisierten Proteins beschrieben.
Vorteilhafterweise wurde gemäß der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die erfindungsgemäß hergestellte Vorrichtung nach der Implantation in ein Subjekt, bevorzugt in einen Menschen, verbesserte und zuverlässige osteoinduktive und osteokonduktive Eigenschaften in vivo aufweist. Eine Grundvoraussetzung für eine derartige Vorrichtung ist eine homogene Beschichtung des Trägers mit biologisch aktivem, nicht aggregiertem, osteoinduktivem Protein. Es wurde festgestellt, dass selbst eine durch Mikropräzipitation bedingte Aggregation zum Erhalt einer inhomogenen Schicht führt, wodurch sich wiederum zumindest signifikant reduzierte osteoinduktive Eigenschaften ergeben, so wie es für andere Vorrichtungen des Stands der Technik, z. B. in WO 98/21972 , beschrieben ist. Des Weiteren wurde festgestellt, dass unerwünschte Nebenwirkungen, wie z. B. Entzündungen und toxische Reaktionen des Subjekts nach der Implantation, durch die erfindungsgemäße Vorrichtung, die frei von toxischen Verunreinigungen oder infektiösen Kontaminanten ist, vermieden werden können. Insbesondere ist die Verwendung von Schutzproteinen (wie z. B. Gelatine) als Lösungsvermittler im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung gänzlich unnötig.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, die über osteoinduktive und osteokonduktive Eigenschaften in vivo verfügt, umfassend die Schritte:

Die Definitionen der Begriffe, die zur Beschreibung der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet werden, beziehen sich mutatis mutandis auf das vorstehend genannte Verfahren sowie die Verfahren, auf die nachstehend Bezug genommen wird.
Der Begriff ”trocknen” umfasst Mittel zur Entfernung von Flüssigkeiten, wie z. B. überschüssiger Pufferlösung, welche im Anschluss an die Beschichtung des Trägers mit dem osteoinduktiven Protein noch vorhanden sind. Bevorzugt wird das Trocknen durch Vakuum- oder Gefriertrocknung erreicht.
Der Begriff ”Puffer, der das Protein für eine Zeit in Lösung hält, die ausreichend ist, um eine homogene Beschichtung zu gestatten” bezieht sich auf einen Puffer, in dem die osteoinduktiven Proteine effizient gelöst werden können und der dazu in der Lage ist, einen durch das Inkontaktbringen der Pufferlösung mit dem Calciumphosphatträger verursachten Anstieg des pH-Werts derart auszugleichen, dass das Protein nicht unmittelbar präzipitiert, wie es z. B. aufgrund eines Anstiegs des pH-Werts der Fall ist. Der Puffer kann vom Fachmann basierend auf der Löslichkeit des osteoinduktiven Proteins, die vom pH-Wert, der Ionenstärke und dem Einfluss des Trägers auf diese Parameter nach dem Inkontaktbringen des Trägers mit der Pufferlösung abhängt, zusammengestellt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneter Puffer eine Puffersubstanz in niedriger Konzentration, eine schwache Säure oder ein Saccharid umfasst.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der homogenen Beschichtung, die durch die Begrenzung des Anstiegs des pH-Werts der Beschichtungslösung im Verlauf des Beschichtungsprozesses erreicht wird. Der beschriebene Prozess gestattet eine homogene Verteilung und Immobilisierung des osteoinduktiven Proteins auf dem Träger. Die Effizienz des Beschichtungsprozesses wird des Weiteren durch den Träger unterstützt, und zwar aufgrund der Kapillarkräfte, die sich aus dem Vorliegen der zahlreichen Makro- und Mikroporen ergeben, die aufgrund ihrer Größe dazu in der Lage sind, die Lösung in die Poren zu saugen. Darüber hinaus erfolgt die Anwendung des osteoinduktiven Proteins oder Polypeptids im Gegensatz zu anderen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, wie z. B. in WO 98/21972 , in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Anheftung an den Träger anstatt durch Präzipitation oder Mikropräzipitation. Diese der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Erkenntnisse zeigen, dass die Aggregation der Proteine durch die Verwendung von geeigneten Zusätzen, wie sie hierin beschrieben sind, vermieden werden kann. Eine wichtige Voraussetzung ist dabei die Kenntnis der Löslichkeit des osteoinduktiven Proteins, und zwar jeweils in Abhängigkeit von dem pH-Wert, der Ionenstärke sowie den vorhandenen Oberflächen. Insbesondere die Verzögerung des Anstiegs des pH-Werts, die durch den Kontakt der Beschichtungslösung mit den in alkalischer Weise reagierenden Calciumphosphaten bewirkt wird, spielt im Verlauf der Beschichtung eine bedeutende Rolle. Durch das erfindungsgemäße Verfahren findet vorteilhafterweise eine gleichmäßige Verteilung über die innere Oberfläche des Trägermaterials statt und eine Bindung an die Oberflächen kann vor einer durch den pH-Wert bewirkten Präzipitation des Proteins stattfinden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anstieg des pH-Werts, der im Verlauf der Beschichtung von Calciumphosphaten stattfindet, durch die Verwendung einer schwachen Säure, wie z. B. Essigsäure, in ausreichendem Maße verlangsamt wird. Weiterhin erweist sich die Zugabe von organischen Kombinationen, wie z. B. Saccharose, zusätzlich als vorteilhaft. Des Weiteren stellt eine niedrige Ionenstärke eine wichtige Voraussetzung für ein erfolgreiches Beschichten dar. Zudem zeigen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests, dass sich das Volumen der Beschichtungslösung ebenfalls in beachtlichem Maße auf die Qualität der Beschichtung auswirkt. Schlussendlich ist es das Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens, schädliche organische Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril, die in den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren routinemäßig verwendet werden, zu vermeiden. Durch die Vermeidung schädlicher organischer Lösungsmittel kann sowohl das Sicherheitsprofil als auch die lokale Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verbessert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt der Puffer in einer Pufferkonzentration von weniger als 100 mMol/l, weniger als 50 mMol/l oder weniger als 20 mMol/l vor.
Der Puffer enthält eine schwache Säure. Der Begriff ”schwache Säure” bezieht sich auf organische oder anorganische Verbindungen, die mindestens ein ionogen gebundenes Wasserstoffatom enthalten. Schwache Säuren sind im Stand der Technik hinreichend bekannt sowie in Standardfachbüchern wie Römpp, Lexicon of Chemistry, beschrieben. Die schwachen Säuren, die niedrige Dissoziationsgrade aufweisen, sind durch pK-Werte von zwischen 3 und 7, bevorzugt zwischen 4 und 6, gekennzeichnet.
Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der schwachen Säure um Essigsäure oder Bernsteinsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung enthält der Puffer des Weiteren Saccharide. Der Begriff ”Saccharide” umfasst Mono-, Di- und Polysaccharide. Die Struktur und Zusammensetzung von Mono-, Di- und Polysacchariden ist im Stand der Technik hinreichend bekannt sowie in Standardfachbüchern wie Römpp, Lexicon of Chemistry, beschrieben.
Mehr bevorzugt handelt es sich bei dem Saccharid um ein Disaccharid. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Disaccharid um Saccharose oder Trehalose.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Calciumphosphat um beta-Tricalciumphospat, alpha-Tricalciumphosphat, Apatit oder einen Calciumphosphat enthaltenden Zement. Die Calciumphosphate sind insbesondere als Träger für die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet und deren in vivo-Eigenschaften wurden bereits in Hotz, 1994, Gao, 1996 sowie in der WO 98/21972 beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem osteoinduktiven Protein um GDF-5 oder BMP-2. Beide Proteine sind Vertreter der TGF-β-Familie. Es wurde bereits gezeigt, dass die TGF-β-Familie der Wachstums- und Differenzierungsfaktoren an einer Vielzahl an biologischen Vorgängen beteiligt ist, umfassend die Knochenbildung. Alle Vertreter dieser Familie sind sezernierte Polypeptide, die eine charakteristische Domänenstruktur umfassen. Genau am N-Terminus umfassen die Vertreter der TGF-β-Familie ein Signalpeptid oder einen Sekretionsleader. Auf diese Sequenz folgen am C-Terminus die Prodomäne sowie die Sequenz des reifen Polypeptids. Die Sequenz des reifen Polypeptids umfasst sieben konservierte Cysteine, von denen sechs zur Bildung von intramolekularen Disulfidbindungen benötigt werden, während eine für die Dimerisierung von zwei Polypeptiden erforderlich ist. Bei einem biologisch aktiven Vertreter der TGF-β-Familie handelt es sich um ein Dimer, das bevorzugt aus zwei reifen Polypeptiden zusammengesetzt ist. Die Vertreter der TGF-β-Familie werden für gewöhnlich als Proproteine sezerniert, die zusätzlich zu der reifen Sequenz die Prodomäne umfassen. Die Prodomänen werden extrazellulär abgespalten und stellen keinen Bestandteil des signalgebenden Moleküls dar. Es wurde allerdings berichtet, dass die Prodomäne/n zur extrazellulären Stabilisierung der reifen Polypeptide erforderlich sein kann/können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff ”Vertreter der TGF-β-Familie” bzw. umfassen die Proteine dieser Familie, auf die nachstehend Bezug genommen wird, alle biologisch aktiven Varianten der Proteine oder Vertreter sowie alle ihre Varianten ebenso wie deren inaktive Vorläufer. Somit sind Proteine, die lediglich die reife Sequenz umfassen, ebenso wie Proteine, die das reife Protein und die Prodomäne oder das reife Protein, die Prodomäne und die Leadersequenz umfassen, ebenso wie biologisch aktive Fragmente davon, von der vorliegenden Erfindung umfasst. Ob ein Fragment eines Vertreters der TGF-beta-Familie über eine biologische Aktivität verfügt, kann in einfacher Weise anhand von biologischen Tests bestimmt werden, wie z. B. beschrieben in Katagiri T., Yamaguchi A., Ikeda T., Yoshiki S., Wozney J. M, Rosen V., Wang E. A., Tanka H., Omura S., Suda. T,: The nonosteogenic mouse pluripotent cell line, C3H10T1/2, is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990), 295–299, oder Nishitoh H., Ichijo H., Kimura M., Matsumoto T., Makishima F., Yamaguchi A., Yamashita H., Enomoto S., Miyazono K.: Identification of type I and type II serine/threonine kinase receptors for growth/differentiation factor-5. J. Biol. Chem. 271 (1996), 21345–21352.
Bevorzugt kann die biologische Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung anhand von in vivo Modellen bestimmt werden, wie in den beigefügten Beispielen beschrieben ist. Des Weiteren von der vorliegenden Erfindung umfasst sind Varianten der Vertreter der TGF-beta-Familie, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die zu mindestens 75%, zu mindestens 80%, zu mindestens 90%, zu mindestens 95%, zu mindestens 96%, zu mindestens 97%, zu mindestens 98% oder zu mindestens 99% identisch mit den Aminosäuresequenzen der Vertreter der TGF-β-Familie sind.
Eine Übersicht über die Vertreter der TGF-β-Superfamilie findet sich in: Wozney J. M., Rosen V.: Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. 346 (1998), 26–37. Die Aminosäuresequenzen der Vertreter der TGF-β-Familie können aus hinreichend bekannten Datenbanken, wie z. B. Swiss-Prot im Internet (http://www.expasy.ch/sprot/sgrot-top.html), erhalten werden. Die Aminosäuresequenzen von BMP-2 und GDF-5, Vertretern der TGF-β-Familie mit einem besonders hohen osteoinduktiven Potential, werden auch in den SEQ ID NRs: 1 bis 3 gezeigt.
Bei BMP-2 handelt es sich um einen Vertreter der BMP-Unterfamilie. Von den Vertretern der Unterfamilie des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) wurde ebenfalls gezeigt, dass sie unter anderem an der Induktion und Remodellierung von Knochengewebe beteiligt sind. BMPs wurden ursprünglich aus der Knochenmatrix isoliert. Diese Proteine sind gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit, eine Knochenneubildung an ektopischen Stellen auszulösen. In verschiedenen in vivo durchgeführten Untersuchungen wurde die Förderung der Osteogenese und Chondrogenese von Vorläuferzellen durch BMPs gezeigt und damit die Möglichkeit aufgetan, dass jedes BMP-Molekül im Verlauf der Entwicklung des Skeletts eine klar definierte Rolle spielt. Weitere Einzelheiten bezüglich der molekularen und biologischen Eigenschaften der BMPs sind beschrieben in: Wozney J. M., Rosen V.: Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. 346 (1998), 26–27; Schmitt J., Hwang K., Winn S. R., Hollinger J.: Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance. J. Orthop. Res. 17 (1999), 269–278 und Lind M.: Growth factors: possible new clinical tools. A review. Acta Orthop. Scand. 67 (1996): 407–17.
Die Aminosäuresequenz der Präproform von BMP-2 ist unter der Swiss-Prot-Zugangsnummer P12643 hinterlegt und nachstehend dargestellt. Die Aminosäuren 1 bis 23 entsprechen der Signalsequenz, die Aminosäuren 24 bis 282 entsprechen dem Propeptid und die Aminosäuren 283 bis 396 entsprechen dem reifen Protein. Bevorzugt bezieht sich BMP-2 auf die Preproform, auf die Proform bzw. auf das reife BMP-2-Peptid. Des Weiteren sind auch die Fragmente dieser Proteine umfasst, die über im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität und bevorzugt über osteoinduktive Eigenschaften verfügen. Weitere Sequenzinformationen bezüglich BMP-2 werden nachstehend zur Verfügung gestellt.
Es wurde ebenfalls bereits gezeigt, dass die Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (GDF) unter anderem an der Induktion und Remodellierung von Knochengewebe beteiligt sind. Bei dem Wachstums- und Differenzierungsfaktor 5 (GDF-5), ebenfalls bekannt als von Knorpel abgeleitetes morphogenetisches Protein 1 (CDMP-1), handelt es sich um einen Vertreter einer Untergruppe der BMP-Familie, die auch weitere verwandte Proteine, bevorzugt GDF-6 und GDF-7, einschließt. Die reife Form des Proteins ist ein Homodimer mit 27 kDa. In verschiedenen in vivo und in vitro durchgeführten Untersuchungen wird die Rolle von GDP-5 im Verlauf der Ausbildung unterschiedlicher morphologischer Merkmale im Säugerskelett gezeigt. Mutationen von GDF-5 zeichnen verantwortlich für Anomalien des Skeletts, einschließend eine Verkürzung der langen Knochen der Gliedmaßen sowie eine anomale Entwicklung der Gelenke in den Gliedmaßen und im Brustbein (Storm und Kingsley, Development Biology 209 (1999), 11–27). Die Aminosäuresequenz zwischen Maus und Mensch ist in hohem Maße konserviert.
Die Aminosäuresequenz der Präproform von GDF-5 ist unter der Swiss-Prot-Zugangsnummer P43026 hinterlegt bzw. in SEQ ID NR: 3 dargestellt. Die Aminosäuren 1 bis 27 entsprechen der Leadersequenz, die Aminosäuren 28 bis 381 entsprechen der Proform und die Aminosäuren 382 bis 501 entsprechen dem reifen Protein. Bevorzugt bezieht sich GDF-5 auf die Präproform, die Proform oder das reife GDF-5-Peptid. Des Weiteren sind auch Fragmente von GDF-5 umfasst, die über im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität und bevorzugt über osteoinduktive Eigenschaften verfügen. Am meisten bevorzugt umfasst das Fragment die Aminosäuren 383 bis 501 der in SEQ ID NR: 3 dargestellten Sequenz.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Puffer frei von toxischen Substanzen.
Der Begriff ”toxische Substanz” schließt bevorzugt toxische organische Lösungsmittel und Additive ein, die in dem im Stand der Technik beschriebenen Verfahren verwendet werden, wie z. B. Acetonitril. Diese Substanzen können nach der Implantation von Vorrichtungen, die derartige Substanzen enthalten, Entzündungen und andere Reaktionen hervorrufen. Diese Vorrichtungen sind therapeutisch weniger akzeptabel, und zwar aufgrund dieser unerwünschten Nebenwirkungen, die durch die im Stand der Technik beschriebenen Beschichtungsverfahren nicht vermieden werden können. Darüber hinaus fordern die internationalen Leitlinien für die Entwicklung von therapeutischen Proteinen, dass im Herstellungsverfahren schädliche und toxische Substanzen vermieden werden sollten (bezüglich detaillierter Informationen siehe: International Conference on Harmonisation (ICH), Thema Q3C; www.emea.eu.int/). Die Vorrichtung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist, ist jedoch vorteilhafterweise frei von diesen toxischen Substanzen und deshalb therapeutisch gut verträglich und erfüllt die Anforderungen der Aufsichtsbehörden.
Darüber hinaus ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung die Vorrichtung frei von infektiösem Material.
Neben toxischen Substanzen kann durch die Vorrichtung umfasstes infektiöses Material schwere Infektionen in einem Subjekt hervorrufen, in das die Vorrichtung transplantiert wurde. Allerdings wird in vielen Verfahren gemäß dem Stand der Technik potentiell infektiöse Gelatine, die aus Rinder- oder Schweineknochen erhalten wurde, als Schutzprotein verwendet (Lind, 1996).
Das Erzeugnis, das durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, kann als pharmazeutische Zusammensetzung oder medizinische Vorrichtung formuliert werden. Die Zusammensetzung dieses Erzeugnisses kann zusätzliche Verbindungen enthalten, wie z. B. Stabilisatoren, Puffersubstanzen oder weitere Exzipienten. Die an einen Patienten verabreichte Menge des durch die vorliegende Erfindung erhältlichen Erzeugnisses wird jeweils von dem behandelnden Arzt sowie in Abhängigkeit von weiteren klinischen Faktoren bestimmt, bevorzugt in Übereinstimmung mit beliebigen der vorstehend beschriebenen Verfahren. Wie auf dem Gebiet der Medizin hinreichend bekannt ist, hängt die einem Patienten verabreichte Menge von einer Vielzahl an Faktoren ab, einschließend Größe, Körperoberfläche, Alter und Geschlecht des Patienten, Zeitpunkt und Weg der Verabreichung, den allgemeinen Gesundheitszustand sowie weitere gleichzeitig verabreichte Arzneimittel. Die Progression kann anhand von regelmäßig durchgeführten Bewertungen überwacht werden.
Dank der vorliegenden Erfindung ist es möglich, verschiedene Knochendefekte, einschließend große Knochenkavitäten, zu behandeln. Insbesondere große Knochenkavitäten konnten bisher nicht oder nur unter Anwendung von autogenem Knochenmaterial effizient behandelt werden. Aufgrund der verlässlichen und effizienten osteoinduktiven und osteokonduktiven Eigenschaften der Vorrichtung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist, wird nunmehr die Behandlung von Knochendefekten, die eine extensive Knochenaugmentation oder -reparatur erfordern, ohne einen zweiten chirurgischen Eingriff möglich.
Die Vorrichtung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist, kann zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Knochenaugmentation verwendet werden.
Die Definitionen der Begriffe, auf die vorstehend Bezug genommen wird, gelten jeweils mutatis mutandis im Zusammenhang mit der vorstehend genannten sowie der nachstehend beschriebenen Verwendung der vorliegenden Erfindung.
Der Begriff ”Knochenaugmentation” bezieht sich auf die therapeutische Bildung von Knochen, die indiziert ist, um Knochendefekte, Kavitäten in Knochen oder Erkrankungen und Störungen, die mit einem Verlust von Knochengewebe einhergehen, zu behandeln oder das anschließende Einsetzen eines Implantats vorzubereiten. Die nachstehend beschriebenen Erkrankungen und Störungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt sowie in ausführlicher Weise in medizinischen Standardfachbüchern, wie z. B. Pschyrembel oder Stedman, beschrieben.
Bevorzugt erfolgt die Knochenaugmentation nach traumatischen, malignen oder künstlich erzeugten Defekten.
Die Vorrichtung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist, kann ebenfalls zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Knochendefekten verwendet werden.
Mehr bevorzugt handelt es sich bei diesen Knochendefekten um Defekte der langen Knochen oder um Knochendefekte, die nach einer Wurzelspitzenresektion, der Exstirpation von Zysten oder Tumoren, einer Zahnextraktion oder der chirurgischen Entfernung von retinierten Zähnen vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung oder einer Vorrichtung, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, zur Füllung von Knochenkavitäten und zur Unterstützung einer gesteuerten Geweberegeneration auf dem Gebiet der Parodontologie.
Die Vorrichtung, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung erhältlich ist, ist zur Sinusbodenanhebung, zur Augmentation eines atrophierten Oberkiefer- oder Unterkieferkamms sowie zur Stabilisierung von Sofortimplantaten zu verwenden.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst ist ein Verfahren zur Herstellung der Vorrichtung nach Anspruch 1 zur Behandlung einer oder mehrerer der Erkrankungen, auf die im Zusammenhang mit den Verwendungen der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, wobei das Verfahren zumindest den Schritt der Verabreichung der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung oder einer Vorrichtung, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, in einer pharmazeutisch akzeptablen Form an ein Subjekt umfasst. Bevorzugt handelt es sich bei dem Subjekt um einen Menschen.
In den folgenden Tabellen sind die Aminosäuresequenzen von BMP-2 und GDF-5 dargestellt:
Humanes BMP-2 (Swiss-Prot Prim. Zugangsnummer P12643); SEQ ID NR: 1:
Referenzen

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Humanes GDF-5 (Swiss-Prot Prim. Zugangsnummer: P43026); SEQ ID No. 3:
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Die Figuren zeigen:
1: Löslichkeit von GDF-5 in 5 mM Essigsäure, 5 mM H₃PO₄/NaOH, 150 mM NaCl bei unterschiedlichen pH-Werten.
2: Löslichkeit von GDF-5 in 20 mM Arginin/Essigsäure bei unterschiedlichen pH-Werten
3: Löslichkeit von GDF-5 in zwei Puffern, mit jeweils unterschiedlichen Ionenstärken und pH-Werten (HAc = Essigsäure).
4: Anstieg des pH-Werts während der Beschichtung in der Gegenwart von 10 mMol/l HCl.
5: Anstieg des pH-Werts in der Gegenwart von 75% Acetonitril.
6: Abhängigkeit des pH-Werts von den Beschichtungslösungen, die im Verlauf der Beschichtung unterschiedliche Konzentrationen an Essigsäure aufweisen.
7: Durch Beschichtung in der Gegenwart von 10 mmol/l Essigsäure, jeweils mit (rechts) und ohne (links) Saccharose, erzielte Homogenität der Verteilung von GDF-5 auf beta-TCP (100 μg GDF-5 auf 100 mg beta-TCP).
8: Durch Beschichtung in der Gegenwart von 20 mMol/l Glycin/NaOH, pH 10, erzielte Homogenität der Verteilung von GDF-5 auf beta-TCP (100 μg GDF-5 auf 100 mg beta-TCP).
9: Histomorphometrische Analyse eines in der Gegenwart von 20 mMol/l Glycin/NaOH, pH 10, beschichteten Implantats.
10: Homogenität der Verteilung von rhBMP-2 auf beta-TCP.
11: Durch Beschichtung in der Gegenwart von Saccharose (links) und Trehalose (rechts) erzielte Homogenität der Verteilung von GDF-5 auf beta-TCP.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden biologischen Beispiele beschrieben, die lediglich der Veranschaulichung dienen und nicht so auszulegen sind, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Beispiel 1: Quantifizierung von GDF-5 in Lösung unter Anwendung von RP-HPLC
Der GDF-5-Gehalt wurde mittels Umkehrphasen-(RP-)HPLC bestimmt. Aliquots der Probe wurden unter Verwendung einer Poros C8-18-Säule (R2/10, 2,1 × 30 mm, Applied Biosystems) analysiert. Als Lösungsmittel wurden 0,1% Ameisensäure in 21% Acetonitril (Lösungsmittel A) und 0,1% Ameisensäure in 84% Acetonitril (Lösungsmittel B) bei einer Durchflussrate von 0,4 ml/min verwendet. Das Elutionsprofil wurde anhand einer Messung des Absorptionsgrads bei 220 nm aufgezeichnet. Die Mengen an GDF-5 wurden jeweils anhand des Peakbereichs bei 220 nm unter Anwendung einer Standardkurve berechnet.
Beispiel 2: Extraktion und Quantifizierung des immobilisierten Proteins
Verfahren A:
Beschichtetes beta-TCP (40 mg) wurde in 700 μl einer Lösungsmatrix (1,22 Mol/l Zitronensäure, 1,22 Mol/l HCl, 8 Mol/l Harnstoff) suspendiert und für 60 min bei 4°C inkubiert. Nach der Zentrifugation (13.200 × g, 2 min) wurden 50 μl des Überstands mittels RP-HPLC analysiert (siehe Beispiel 1). Die Standardkurve wurde mit unterschiedlichen Mengen an GDF-5 in der entsprechenden Matrixlösung erstellt.
Verfahren B:
Beschichtetes beta-TCP (40 mg) wurde in 700 μl einer Lösungsmatrix (10 mmol/l Tris/HCl, pH 7,4, 8 Mol/l Harnstoff, 100 mMol/l EDTA) suspendiert, für 60 min bei 4°C inkubiert und zentrifugiert (5 min bei 13.500 × g). Im Anschluss wurde der Überstand gemäß der Beschreibung in Verfahren A quantifiziert oder weiter analysiert.
Beispiel 3: Löslichkeit von rhGDF-5 bei unterschiedlichen pH-Werten
GDF-5 wurde auf eine Konzentration von 4 mg/ml, 10 mMol/HCl, eingestellt. Aliquots (50 μl) der Stammlösung wurden mit 5 mMol/l Essigsäure, 5 mMol/l H₃PO₄/NaOH und 150 mMol/l NaCl mit jeweils unterschiedlichen pH-Werten im Verhältnis 1:100 verdünnt. Die Proben wurden für 15 min inkubiert und zentrifugiert (2 min bei 13.200 × g). Es erfolgte eine Bestimmung des pH-Werts und Proteingehalts im Überstand. In einem zweiten Test wurde die Stammlösung mit 20 mMol/l Arginin/HOAc mit jeweils unterschiedlichen pH-Werten verdünnt. Anhand der Daten der 1 und 2 ist zu erkennen, dass GDF-5 in Puffern mit niedriger Ionenstärke (≤ 20 mMol/l) nur in einer sauren (pH < 5) oder in einer alkalischen (> pH 10) Lösung löslich ist. In einem pH-Bereich zwischen 6,0 und 9,5 beträgt die Löslichkeit jedoch < 5 μg/ml.
Beispiel 4: Löslichkeit von GDF-5 in zwei Puffern mit jeweils unterschiedlicher Ionenstärke bei unterschiedlichen pH-Werten
GDF-5 wurde auf eine Konzentration von 4 mg/ml 10 mMol/l HCl eingestellt. Aliquots (50 μl) der Stammlösung wurden mit 10 mMol/l Essigsäure/NaOH sowie mit 5 mMol/l Essigsäure, 5 mMol/l H₃PO₄/NaOH und 150 mMol/l NaCl mit jeweils unterschiedlichen pH-Werten im Verhältnis 1:100 verdünnt. Die Proben wurden für 15 min inkubiert und zentrifugiert (2 Min bei 13.200 × g). Es erfolgte eine Bestimmung des pH-Werts und Proteingehalts im Überstand. Anhand der Daten der 3 ist zu erkennen, dass die Löslichkeit von GDF-5 bei allen gemessenen pH-Werten in einem Puffern mit höherer Ionenstärke, entsprechend den physiologischen Bedingungen, signifikant niedriger ist als in dem Puffer mit niedriger Ionenstärke (etwa 10 mMol/l).
Beispiel 5: Löslichkeit von GDF-5 in verschiedenen Lösungsmitteln
Gefriergetrocknetes GDF-5 wurde in reinem Acetonitril gelöst, für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert (13.200 × g, 2 min). Im Überstand war kein GDF-5 detektierbar.
Gefriergetrocknetes GDF-5 (50 μg) wurde mit 50 μl 75% Acetonitril gelöst, für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert (13.200 × g, 2 min). Es erfolgte eine Messung des pH-Werts sowie eine Bestimmung des Gehalts an GDF-5 im Überstand. Es wurden 100% des verwendeten GDF-5 detektiert, der pH-Wert der Lösung lag bei 3,0. Im Anschluss wurde der pH-Wert durch die Zugabe von NaOH auf 7,4 eingestellt und es erfolgte erneut eine Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Zentrifugation. Es wurden lediglich 3 μg/ml detektiert, was einer Löslichkeit von 60 μg/ml entspricht.
Die Daten zeigen, dass GDF-5 in reinem Acetonitril nicht löslich ist, wohl aber in sauren wässrigen Lösungen, die Acetonitril enthalten. Gemäß den Ergebnissen, die in den wässrigen Systemen erhalten wurden, nimmt die Löslichkeit in Acetonitril-Wasser-Gemischen mit zunehmendem pH-Wert ab.
Beispiel 6: Änderung des pH-Werts der GDF-5-Lösung im Verlauf der Beschichtung von beta-TCP
In einem Reaktionsgefäß wurden 200 mg beta-TCP mit 200 μl einer GDF-5 (1 mg/ml; hergestellt aus einem Lyophilisat, das aus einer HCl-Lösung hergestellt worden war) enthaltenden Beschichtungslösung vermischt. Der pH-Wert der Suspension wird für 30 min beobachtet. Die in den 4 bis 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der pH-Wert der Suspension nach etwa 2 min den Bereich von pH > 6,5 erreicht, der kritisch für die Löslichkeit von GDF-5 ist, wenn ungepufferte Beschichtungslösungen, wie z. B. 10 mMol/l HCl oder 75% Acetonitril, verwendet werden (der zu Beginn saure pH-Wert in 75% Acetonitril ist auf die vorhandenen verbleibenden Mengen an HCl zurückzuführen). Aufgrund der unzureichenden Löslichkeit findet eine Präzipitation des Proteins sowie eine Bildung von Aggregaten statt, was mittels Coomassie-Färbung (siehe Beispiel 7) detektiert werden kann.
Die Verwendung einer mit Acetat gepufferten Beschichtungslösung (6) führt zu einer Reduktion des Anstiegs des pH-Werts im Verlauf der Beschichtung. Während der pH-Wert in den ungepufferten Lösungen auf bis zu 8 ansteigt, erreicht der pH-Wert der mit Acetat (40–80 mMol/l) gepufferten Beschichtungslösung sein Maximum bei pH 5,4. Somit ist eine ausreichende Löslichkeit im Verlauf des Beschichtungsprozesses gewährleistet. Das verwendete GDF-5 kann sich gleichmäßig verteilen und an den Träger binden, ohne dass eine Präzipitation stattfindet (siehe Beispiel 7).
Eine Verzögerung des Anstiegs des pH-Werts wird ebenfalls durch die Verwendung von 60% Ethanol erreicht. Die Verzögerung ist ausreichend, um eine gleichmäßige Verteilung von GDF-5 über den Träger zu erreichen (siehe Beispiel 7).
Beispiel 7: Nachweis der Homogenität der Beschichtung
Das adsorbierte Protein wird durch Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau auf dem Träger sichtbar gemacht. Die Verteilung der blauen Farbe korreliert mit der Verteilung des jeweiligen Proteins auf dem beta-TCP-Träger.
Es wurden 3 bis 4 beschichtete Körnchen mit 200 μl Färbelösung (60% PBS, 40% Methanol, 0,4% Coomassie-Brilliant-Blau R250) in einem Well einer 96-Well-Platte inkubiert und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Ein unbeschichteter Träger diente als Kontrolle und wurde auf die gleiche Weise behandelt. Das überschüssige Färbemittel wird durch Waschen mit 60% PBS und 40% Methanol so lange entfernt, bis der als Kontrolle verwendete unbeschichtete Träger vollständig entfärbt ist. Der gefärbte Träger wird bei 40°C getrocknet und photographisch dokumentiert.
Beispiel 8: Beschichtung von Körnchen (I)
Es wurden 200 mg beta-TCP (Korngröße 0,5 bis 1,0 mm) in trockenem Zustand in ein 2R-Glas gegeben. Die Stammlösung von rhGDF-5 (4 mg/ml in 10 mM HCl) wurde mit dem entsprechenden Beschichtungspuffer auf 1 μg/ml verdünnt. Dann wurden 200 μl der so erhaltenen GDF-5-Lösung auf das beta-TCP pipettiert und absorbiert. Das feuchte Granulat wird für 1 Stunde bei 25°C inkubiert und im Anschluss vakuumgetrocknet.
Beispiel 9: Beschichtung von Granulat (II)
Es wurden 200 mg beta-TCP (Korngröße 0,5 bis 1,0 mm) in trockenem Zustand in ein 2R-Glas gegeben. Die Stammlösung von rhGDF-5 (4 mg/ml in 10 mM HCl) wurde mit dem entsprechenden Beschichtungspuffer auf 1 μg/ml verdünnt. Es wurden 200 μl der so erhaltenen GDF-5-Lösung auf das beta-TCP pipettiert und absorbiert. Das feuchte Granulat wird für 1 Stunde bei 25°C inkubiert und im Anschluss lyophilisiert.
Beispiel 10: Beschichtung von Blöcken
Ein beta-TCP-Block mit einer Masse von 360 mg wurde in ein geeignetes Reaktionsgefäß (Eppendorf) gegeben, mit 500 μl der Beschichtungslösung vermischt, für eine Stunde inkubiert und im Anschluss vakuum- oder gefriergetrocknet.
Beispiel 11: Vergleich zwischen unterschiedlichen Beschichtungsverfahren
Aufgrund der Verwendung von mit Acetat gepufferten Beschichtungslösungen konnte die Bildung von Präzipitaten signifikant reduziert werden. Eine weitere Verbesserung wurde durch die Zugabe von Saccharose erzielt. Die Qualität der Beschichtung mit und ohne Saccharose ist in 7 dargestellt. Während ohne Saccharose immer noch einzelne Präzipitate in Form von dunkelblauen Flecken zu erkennen waren, führte der Beschichtungsprozess in der Gegenwart von Saccharose zum Erhalt einer fleckenlosen Beschichtung.
Die Bedeutung der Homogenität der Beschichtung wird anhand eines Vergleichs zwischen zwei Präparaten deutlich, die während der Forschungsarbeiten unter Verwendung von Beschichtungslösungen in 60% Ethanol bzw. 20 mMol/l Glycin/NaOH, pH10, hergestellt wurden. Während in der Gegenwart von 60% Ethanol eine homogene Verteilung erreicht wurde (8), fand in der Gegenwart von Glycin eine signifikante Bildung von Präzipitaten auf der Trägeroberfläche statt (8). Beide Träger wurden in einem Schädeldachdefektmodell in der Ratte miteinander verglichen (siehe unten).
Beispiel 12: Schädeldachdefektmodell (über die vollständige Dicke) in der Ratte
Mit rhGDF-5 beschichtetes beta-TCP (50 μg/25 mg beta-TCP) wurde unter Verwendung unterschiedlicher Beschichtungspuffer (20 mMol/l Glycin/NaOH, pH 10 (C1) oder 60% Ethanol (C2)) hergestellt. Die Ratten wurden durch eine intramuskuläre Injektion mit Tiletamin-Zolazepam (ZOLETIL^® VIRBAC, CARROS, Frankreich, 50 mg/kg, intramuskulär) anästhesiert. Am dorsalen Teil des Schädels wurde das Fell entfernt. Dann wurde die Haut mit einer keimtötenden Seife (VETEDINE^®, VETOQUINOL, LURE, Frankreich) gereinigt. Das Operationsfeld wurde mit einem Desinfektionsmittel, wie z. B. Povidon-Iod (VETEDINE^®-Lösung, VETOQUINOL, LURE, Frankreich), abgerieben. In die Kopfhaut wurde ein 20 mm langer Einschnitt entlang der Scheitelnaht vorgenommen und Haut, Muskulatur und Knochenhaut wurden zur Seite geklappt, um das Scheitelbein freizulegen. Es wurde ein 6 mm Stanzbohrer (COVELY, GENAY, Frankreich) verwendet, um einen Defekt im dorsalen Teil des Scheitelbeins seitlich der Scheitelnaht zu erzeugen, wobei eine konstante Umspülung mit steriler physiologischer Lösung (AGUETTANT, LYON, Frankreich) erfolgte. Pro Tier wurden zwei identische Defekte erzeugt. Es wurde darauf geachtet, die Dura Mater nicht zu beschädigen und eine Punktion des Sinus sagittalis superior zu vermeiden. Nach dem Einsetzen der Implantate wurden Periosteum und Muskeln durch Nähen wieder an ihrer ursprünglichen Position fixiert und die Kopfhaut wurde ebenfalls wieder zusammengenäht (Polypropylen-Faden, Prolene^®, ETHNOR, ISSY LES MOULINEAUX, Frankreich).
Im Anschluss an eine Nachbehandlung über 6 Wochen wurden die Tiere durch eine intramuskuläre Injektion mit ZOLETIL^® (50 mg/kg) anästhesiert und daraufhin durch die Injektion einer letalen Dosis DOLETHALND (Pentobarbital-Natrium, VETOQUINOL, LURE, Frankreich) geopfert.
Den Explantaten wurden Proben entnommen und in gepufferter 10% Formalinlösung fixiert. Im Anschluss wurden die Proben in Alkohollösungen mit jeweils ansteigenden Konzentrationen dehydriert und in PMMA (Polymethylacrylat, Merck, KGaA, Darmstadt, Deutschland) eingebettet. Unter Anwendung einer Mikroschneide- und Mahltechnik, adaptiert von Donath (Donath K., Breuner G., A method for the study of undecalcified bone and teeth with attached soft tissues. J. Oral. Pathol. 11 (1982), 318–326), wurde ein Schnitt mit einer Dicke von 20 μm erhalten. Ein Schnitt wurde zur qualitativen und semi-quantitativen lichtmikroskopischen Analyse mit modifiziertem Paragon gefärbt.
Die Analyse der histologischen Schnitte erfolgte unter Verwendung eines Polyvar-Mikroskops (REICHERT), das mit einem ×4-, ×10-, ×25- und ×40-Objektiv ausgestattet war.
An der mit C2 behandelten Stelle waren große Menge an Knochenmark und Osteoblasten zu erkennen. Im Gegensatz hierzu war die Knochenbildung mit C1 stark reduziert. Die Degradation des Implantatmaterials war mit C2 im Vergleich zu C1 ebenfalls erhöht. Bezüglich der Ergebnisse der histomorphologischen Analysen des Implantatmaterials siehe Tabelle 1 und 9. Tabelle 1

Probe Knochengewebe % Implantat % Lakunengewebe % Fasergewebe %

C1 8,9 39,2 2,1 49,8

C2 43,4 18,5 21,4 16,7
Beispiel 13: Beschichtung von beta-TCP mit BMP-2
Es wurden 200 mg beta-TCP (Korngröße 0,5 bis 1,0 mm) in ein 2R-Glas gegeben. Die Stammlösung von BMP-2 wurde mit dem entsprechenden Beschichtungspuffer (10 mMol/l Essigsäure, 10% Saccharose) auf 1 mg/ml verdünnt. 200 μl der Beschichtungslösung wurden mit dem beta-TCP inkubiert (1 Std., 4°C) und gefriergetrocknet. Die Verteilung von BMP-2 auf dem beschichteten Träger wurde anhand einer Coomassie-Färbung gezeigt (10).
Beispiel 14: Vergleich des Beschichtungsverfahrens in der Gegenwart von Saccharose und Trehalose
Es wurden 200 mg beta-TCP (Korngröße 0,5 bis 1,0 mm) in ein 2R-Glas gegeben. Die Stammlösung von GDF-5 (4 mg/ml in 10 mMol/l HCl) wurde mit dem entsprechenden Beschichtungspuffer auf 1 mg/ml verdünnt. Die zwei Varianten des Beschichtungspuffers enthalten jeweils 10% Saccharose bzw. 10% Trehalose. Es erfolgte eine Inkubation von 200 μl der Beschichtungslösung mit dem beta-TCP (1 Std., 4°C) sowie eine anschließende Gefriertrocknung. Die Verteilung von GDF-5 auf dem beschichteten Träger wurde anhand einer Coomassie-Färbung gezeigt (11).
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Claims

Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, die osteoinduktive und osteokonduktive in vivo-Eigenschaften hat, umfassend einen Träger, der Calciumphosphat und ein osteoinduktives Protein enthält, wobei das osteoinduktive Protein entweder GDF-5 oder BMP-2 ist und wobei der Träger vollständig mit dem osteoinduktiven Protein beschichtet ist und wobei im Wesentlichen identische Mengen des osteoinduktiven Proteins in jedem einzelnen Bereich der Oberfläche des Trägers vorhanden sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Lösung, die gelöstes osteoinduktives Protein und einen Puffer umfasst, der eine schwache Säure enthält, die einen pK-Wert zwischen 3 und 7, vorzugsweise zwischen 4 und 6 hat, wobei die Lösung frei von toxischen Substanzen ist, wobei der Puffer das Protein für eine Zeit in Lösung hält, die ausreichend ist, um eine homogene Beschichtung eines Calciumphosphat enthaltenden Trägers zu erlauben, wenn sie mit dem Träger in Kontakt gebracht wird, und wobei der Puffer in der Lage ist, den Anstieg des pH-Werts, der durch Inkontaktbringen der Pufferlösung mit dem Calciumphosphatträger verursacht wird, auszugleichen, so dass das Protein nicht sofort aufgrund des pH-Anstiegs ausfällt; (b) Inkontaktbringen der Lösung von Schritt (a) mit einem Träger, der Calciumphosphat enthält; (c) Ermöglichen der homogenen Beschichtung der Oberfläche des Trägers mit dem gelösten Protein; und (d) Trocknen des in Schritt (c) erhaltenen beschichteten Trägers.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Puffer eine Pufferkonzentration von weniger als 100 mmol/l, weniger als 50 mmol/l oder weniger als 20 mmol/l hat.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die schwache Säure Essigsäure oder Bernsteinsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Puffer weiterhin Saccharide umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Saccharid ein Disaccharid ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Disaccharid Saccharose oder Trehalose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Vorrichtung frei von infektiösem Material ist.