JP2004514441A - 組み換えｂｍｐ−２の製造 - Google Patents

Abstract

ＴＧＦ−β−スーパーファミリーの生物学的に活性なタンパク質の組み換え的製造のために、アミノ末端がＴＦＧ−β−スーパーファミリーのプロ配列又はその一部からなる、成熟ＢＭＰ−２に対して少なくとも３５％のホモロジーを有するＴＧＦ−β−スーパーファミリーの前記の又は別のタンパク質の成熟ドメインに隣接したタンパク質を、タンパク質の少なくなくとも一部が封入体として得られる条件下に原生生物中で発現させ、封入体を単離し、かつ復元性条件下に可溶化させ、かつ封入体から可溶化される復元された、モノマーのかつ生物学的に不活性のタンパク質を再生させ、他方で折り畳まれかつ二量体化されて、可溶性の生物学的に活性な立体配置になり、かつ場合により成熟タンパク質を再生の後にその前駆形からタンパク質分解により遊離させる。

Description

【０００１】
本発明は、生物学的に活性なｄｒＢＭＰ−２（ｄｒ：足指欠損）及び相同タンパク質を、変性された生物学的に不活性なプロＢＭＰ−２の再生（Ｎａｔｕｒｉｅｒｕｎｇ）及び引き続いてのプロペプチドの分解によって製造する方法（該タンパク質の再生された前駆形は既に活性である）、新規の生成物としてのプロＢＭＰ−２及び骨成長の促進のための薬剤の製造のための使用に関する。
【０００２】
ＢＭＰ−２は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のファミリーに属する。これはクローニング及び特性決定が１９８８年に初めて達成された骨成長因子である。前記のタンパク質の特性は軟骨内性骨新生の誘発能力である［Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２（１９８８）， １５２８−１５３４］。
【０００３】
構造的にＢＭＰ−２は、非常に高い構造類似性を互いに有するにもかかわらず配列同一性が部分的に３０％未満であるにすぎない３０を越える他のタンパク質と一緒にＴＧＦ−β−スーパーファミリーに含まれる［Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３ （１９９６）， ８７８−８８３］。その実質的な構造特徴はいわゆる“シスチン結合である。これは４つのアンチパラレルなβ−折り畳みシートによって形成され、そのうち２つずつがジスルフィド結合を介して互いに結合されている。この場合、２つのシステインはペプチド骨格と一緒になって第３のジスルフィド結合がまたがる環を形成する。
【０００４】
β−折り畳みシートはこのタンパク質の優勢的な二次構造要素である。しかしながら該シートはβ−折り畳みシートが豊富な別のタンパク質よりも長くかつ強く曲がっている。ＴＧＦ−β−ファミリーのタンパク質の相互の構造的な類似性に基づいて、これらのタンパク質はまた類似のようにその本来の立体配置を取り、従って折り畳まれることが必要である。
【０００５】
ＢＭＰ及び類似のタンパク質、例えばＤＰＰ（デカペンタプレジック、ショウジョウバエ）は高等生物の胚発生において重要な役割を担う。ＢＭＰ−もしくはＢＭＰ−受容体遺伝子における欠失又はその調節によって、部分的に重大な発生障害、例えば進行性骨化線維異形性［Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｌｃｉｆ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ． ４７ （１９９０）， １１７−１２５； Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ９０ （１９９２）， ２９９−３０２； Ｓｈａｆｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３５ （１９９６）， ５５５−５６１］及び遺伝性象牙質形成不全症［Ｔａｂａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ． ２９３ （１９９３）， ３１０−３１６］がもたらされる。マウスのＢＭＰ−欠失突然変異は胎芽期において又は出生直後に既に死をもたらし、かつ骨格の異形性及び非常に多様な器官、例えば心臓、腎臓及び目に異形性を示す［Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９ （１９９５）， ２７９５−２８０７； Ｚｈａｎｇ ｕｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２ （１９９６）， ２９７７−２９８６］。
【０００６】
ＢＭＰ及び類似の成長因子は全身性疾患、例えば骨粗鬆症の治療のために制限されてのみ適当である。それというのも前記の成長因子は許容できない副作用、例えば腫瘍促進を引き起こすことがあるからである。ＢＭＰ、特にＢＭＰ−２はむしろ局所に限定された適用のために予定されている。これには、とりわけ変性性脊椎疾患における脊椎固定術、頭蓋骨の再生、医学的及び整形医学的な手術並びに四肢の複雑骨折の治療が該当する。これらの使用に関しては骨新生に対してｒｈＢＭＰ−２（ｒｈ　−　ヒトの組み換えの）がポジティブな作用を有し、かつそれによって治癒プロセスに対して既に多くの動物モデルにおいて印象深く証明されている［Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ． ３６１ （１９９９）， ２１６−２２７：Ｍａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔ． Ｒｅｓ． ２８ （１９９４）， １１２７−１１３８ ； Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｔ． Ｒｅｃｏｎｔｒ． Ｓｕｒｇ． ９８ （１９９６）， ２４７−２５９； Ｓａｎｄｈｕ ｕｎｄ Ｂｏｄｅｎ， Ｏｒｔｈｏｐ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． ２９ （１９９８）， ６２１−６３１； Ｔｏｒｉｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｏｔｏｌｙｒｙｎｇｏｌ． Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ． １１７ （１９９１）， １１０１−１１１２； Ｙａｓｋｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． （Ａｍ．） ７４ （１９９２）， ６５９−６７０］。脊椎固定手術については既に第一の臨床段階さえも存在する［Ｂｏｙｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｓ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｄｅｎｔ． １７ （１９９７）， １１−２５； Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｓ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｄｅｎｔ １７ （１９９７）， １２４−１３９］。同様に人工関節の固定又は周囲の骨組織における固定、例えば骨折の安定化のためにｒｈＢＭＰ−２を使用することに意義がある。
【０００７】
なおも不足した研究及び−またその研究自体−の他に、臨床的実務におけるＢＭＰの通常の使用を、タンパク質製造のための高い費用が妨害する。本発明に記載される方法によって、生物学的に活性なＢＭＰ−２、例えば類似のＢＭＰは少ない技術的労力で、かつ今まで可能であると見なされていない収率で廉価に高い純度で組み換え的に製造できる。
【０００８】
ヒトのＢＭＰ−２は体内で３９６アミノ酸長のプレプロタンパク質の形で合成される。シグナルペプチド（プレ配列はインビボで発生性ポリペプチド鎖を小胞体（ＥＲ）に輸送するために用いられる。ＥＲへの搬送の後に、該タンパク質は本来の立体配置に折り畳まれ、複数のジスルフィド結合を形成し（Ｃｙｓ^２９６−Ｃｙｓ^３６１、Ｃｙｓ^３２５−Ｃｙｓ^３９３、Ｃｙｓ^３２９−Ｃｙｓ^３９５、分子内：Ｃｙｓ^３６０−Ｃｙｓ^３６０）、かつ翻訳後修飾が行われる。翻訳後修飾にはアスパラギン残基のグリコシル化及び部分的に不完全なポリペプチドの分解が該当する［Ｉｓｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ７ （１９９２）， １３９−−１５０］。前駆タンパク質のＣ末端の１１４個のアミノ酸（Ｇｌｎ^２８３−Ａｒｇ^３９６）は生物学的に活性な形がジスルフィド架橋された（Ｃｙｓ^３６０−Ｃｙｓ^３６０）ホモダイマーである成熟ＢＭＰ−２を形成する。
【０００９】
骨組織からのＢＭＰ−２の製造は相当の出費と僅かだけの収率に結びついている（４０ｋｇのウシ骨粉から４０μｇのＢＭＰ−混合物）［Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２ （１９８８）， １５２８−１５３４］。更にヒトの骨マテリアルからの単離は倫理上疑問があり、かつ病原（プリオン、ＨＣＶ等）での汚染による危険をはらんでいる。ブタ又はウシからの相同のタンパク質の使用は免疫学的観点から同様に危険である。
【００１０】
従ってＢＭＰ−２の組み換え的製造が有利である。そのために優先的に２つの可能性が該当する。一つ目に、該タンパク質を真核性発現系で製造できる［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７ （１９９０）， ２２２０−２２２４］。この場合に比較的少量の組み換えタンパク質（１ｌの培地あたりに２５μｇの部分的に精製されたＢＭＰ−２［Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２ （１９８８）， １５２８−１５３４］、比較的高い技術的労力及びそこから生じるコストが欠点である。
【００１１】
第二の経路は原核性発現系の使用を含む。その利点はその簡単な技術的取扱い、低いコスト及び非常に高いタンパク質量の獲得にある。しかしながら真核生物に対して細菌は前駆タンパク質を正確にプロセシングすることができない。従って今まで使用された方法はＢＭＰ−２の成熟ドメイン（Ｇｌｎ^２８３−Ａｒｇ^３９６）の発現に制限されていた。これらのドメインは細菌中に不溶性の生物学的に不活性な形で生じる。それというのも、とりわけ細胞質の還元条件のゆえにタンパク質のジスルフィド結合が形成され得ないからである。これらの不溶性タンパク質凝集物を封入体（ＩＢ）と呼称し、その単離及び精製は、例えばマルストン（Ｍａｒｓｔｏｎ）［Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２４０ （１９８６）， １−１２］によって記載されている。
【００１２】
ルパート他（Ｒｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．）［Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３７ （１９９６）， ２９５−３０２］の成熟ＢＭＰ−２の再生のための方法はＢＭＰ−２も属するＴＧＦ−β−様タンパク質に関する米国特許第５６５０４９４号［Ｃｅｒｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７］に基づいている。該方法はＴＧＦ−β−様タンパク質のモノマーの変性された成熟形を緩効性の界面活性剤の存在下で再生させて、生物学的に活性な立体配置にすることを含む。ＢＭＰ−２の場合において、１ｇの細胞あたりに０．２ｍｇだけの活性タンパク質の収量が得られるに過ぎなかった［Ｒｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３７ （１９９６）， ２９５−３０２］。
【００１３】
しかしながら本発明によって、誘導された細胞材料に対して２５倍より高い活性タンパク質の収率を達成することが可能である。真核細胞での発現と比較して収量はほぼ３桁だけ高い。
【００１４】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組み換え的に発現された成熟ＢＭＰの再生の場合の収量は複雑なジスルフィドパターンに基づいて（シスチン結合）非常に低い。本発明は、ＢＭＰ−２−プロペプチド、例えば相同のタンパク質のプロペプチドも成熟ドメインの正確な折り畳みのために役割を果たすという仮定に基づいている。
【００１５】
ＴＧＦ−β−スーパーファミリーの生物学的に活性なタンパク質の組み換え的製造のための本発明による方法は、
（ａ）アミノ末端がＴＧＦ−β−スーパーファミリーのタンパク質のプロ配列又はその一部からなり、該末端に前記のＢＭＰ−β−スーパーファミリーのタンパク質又は、成熟ＢＭＰ−２に対して少なくとも３５％のホモロジーを有する別のタンパク質の成熟ドメインが接続されたタンパク質を、原核生物において少なくともタンパク質の一部が封入体の形で得られる条件下で発現させ、
（ｂ）該封入体を単離し、かつ変性条件下に可溶化させ、
（ｃ）前記封入体から可溶化され、変性されたモノマーの生物学的に不活性なタンパク質を再生させ、それによって可溶性の生物学的に活性な立体配置への折り畳み及び二量体化が可能であり、かつ
（ｄ）場合により再生の後に成熟タンパク質をその前駆形からタンパク質分解により遊離させる
ことを特徴としている。
【００１６】
我々のインビトロ復元試験は、本発明により界面活性剤の不在下にもＢＭＰ−２の仮定的前駆形（Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^３９６）の使用及び引き続いてのプロペプチド（Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^２８２）の分解において僅かな労力で大量の生物学的に活性なｄｒＢＭＰ−２を得ることが可能であることを示している。ｄｒＢＭＰ−２とは、本願ではＢＭＰ−２のＬｙｓ^２９０、Ａｒｇ^２９１もしくはＬｅｕ^２９２から（例２．２．１参照）からＡｒｇ^３９６までのＣ末端ドメインを表し、その生物学的活性はケーニッヒ他（Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．）［Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４ （１９９４）， ５９６１−−５９７４］によって記載されている。アミノ酸（Ｇｌｎ^２８３からＡｒｇ^２８９、Ｌｙｓ^２９０もしくはＡｒｇ^２９１）はヘパリンへのＢＭＰ−２の結合を媒介する。
【００１７】
このむしろ非特異的な相互作用は確かにＢＭＰ−２の作用を変化させるが、その生物学的活性のためには必須ではない［Ｒｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３７ （１９９６）， ２９５−３０２］。
【００１８】
本発明によればプロ配列もしくはプロペプチドとしてプロ配列全体（Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^２８２）又はその一部のいずれも使用できる。
【００１９】
原核生物におけるプロｂｍｐ−２の発現速度を高めるために、本発明によれば該遺伝子をコードしている配列の５′−末端にタグ配列、例えばヒスチジンタグを付与するか、又はプロｂｍｐ−２のコドンを突然変異誘発によって原核性発現のために最適化することも可能である。また米国特許第５３３６６０２号［Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３］による発現増強並びに前記の方法の組合せも可能である。
【００２０】
原核生物の細胞質での組み換えプロｂｍｐ−２の過剰発現において、該タンパク質はそこで不活性な不溶性の凝集物の形（封入体−ＩＢ）で生じる。その単離のために細胞を発酵後にまず１つ以上の慣用の方法（例えば高圧分散、酵素溶解又は超音波）によって溶解させる。これは有利には中性乃至弱酸性のバッファー溶液、例えば０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中で行われる。
【００２１】
細胞のＤＮＡを機械的、化学的又は有利には酵素処理によってＩＢと共沈しない断片に分解する。次いでＩＢを含む不溶性の細胞成分を任意の方法で可溶性の成分から分離し、その際、その分離は遠心分離によって有利に行われる。ペレットをその組成もしくはその添加物、例えば界面活性剤に基づいて、障害のある細胞タンパク質及び膜成分はしかしながらＩＢからの組み換えプロＢＭＰ−２を可溶化できない。残留する不溶性のプロＢＭＰ−２含有成分を本発明により後に可溶化、再生及び酵素処理する。
【００２２】
再生の前にＩＢを、慣用の変性剤（カオトロピック物質）もしくはこれらの組合せを使用して可溶化させる。これには、といわけグアニジウム塩、例えばＧｄｍＣｌ又はＧｄｍＳＣＮ並びに尿素及びその誘導体が該当する。変性剤もしくは変性剤混合物の濃度はこの場合、難溶性の組み換えタンパク質を完全に可溶化できるように調整する。グアニジウムクロリドの場合には、この濃度は３〜８Ｍの範囲であり、尿素の場合には６〜１０Ｍである。更に変性して可溶性のシスチン含有のタンパク質をモノマー化するために、還元剤、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はβ−メルカプトエタノール又はこれらの還元剤の組合せの添加が有利であり、その際、可溶化バッファーのｐＨは有利には８〜９に調整される。可溶化に引き続き又はそれと平行して、更に遊離のシステインを酸化されたグルタチオンで共有結合的に変性させることができる。可溶化もしくはシステインの場合による共有的な変性の後にＩＢ−可溶化物のｐＨを５未満に調整し、かつ更に場合により過剰の酸化還元当量を透析によって除去し、その際、透析バッファーは、還元剤から予測されて適宜に可溶化バッファーと同じ組成を有する。最後に可溶化プロセスの間に不溶性に保持される成分を分離し（遠心分離又は濾過）、かつ廃棄する。場合による変性段階及び過剰の還元剤の除去は、場合により固定された金属−親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を介してＩＢ−溶解物の前精製を可能にし、Ｎ−末端にヒスチジンタグを有するプロＢＭＰ−２の発現が行われる。
【００２３】
本発明によるｒｈ−プロＢＭＰ−２の再生過程は変性作用のない又は困難にのみ変性作用を有する水準まで（例えば≦０．５ＭのＧｄｍＣｌ）に変性剤の濃度を低減することを含む。これは、有利には再生バッファー中での可溶化物の緩慢な連続的又は段階的な希釈によって行われる。生物学的に活性なタンパク質の収量を最大にするために、この場合に、例えば激しい撹拌によって保証される完全混和を迅速にかつ徹底的に行うことに留意するべきである。
【００２４】
希釈の代替は、可溶化物の再生バッファーに対する透析である。これらの条件は、それぞれの場合にタンパク質凝集物の形成が最少化されるように選択される。変性剤の初期の希釈の間に既に、タンパク質の再生が行われてよい。再生バッファー中のｒｈ−プロＢＭＰ−２の最終濃度は希釈もしくは透析の後に１０〜１０００μｇ／ｍｌ、有利には５０〜２５０μｇ／ｍｌである。
【００２５】
最適なタンパク質濃度は、誤って折り畳まれたポリペプチド鎖及び折り畳み中間体の無駄な凝集（１プロセス≦２桁［Ｋｉｅｆｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ．Ｙ．） ９ （１９９１）， ８２５−８２９］）が本来の立体配置への個々のポリペプチド鎖の折り畳み（プロセス １桁）よりも緩慢に進行する場合に保証される。
【００２６】
使用される再生バッファーのｐＨは６．５〜１０、理想的には８〜９である。バッファーとしては従って中性乃至アルカリ性のｐＫ_ａを有する全ての、有利にはトリスバッファー及びリン酸バッファー並びにこれらの組合せが該当する。更に再生収量を高める低分子助剤［米国特許第５５９３８６５号、Ｒｕｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．， １９９５］の再生バッファーへの添加が適切である。Ｌ−アルギニンの存在下での再生が特に適当であり、その際、０．２〜２．０Ｍ、有利には０．５〜１．５ＭのＬ−アルギニンの濃度が使用される。再生バッファーの他の成分は本発明によれば１種以上のチオール化合物の還元形及び酸化形の組合せである。かかる組合せは、例えば還元グルタチオン（ＧＳＨ）及び酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、システイン及びシスチン、システアミン及びシスタミン並びにβ−メルカプトエタノール及び２，２′−ヒドロキシエチルジスルフィドである。かかる人工的なレドックス形を用いてタンパク質の再生を熱力学的に制御することができる。ポリペプチド鎖の正確な折り畳みのために必要なジスルフィド架橋の形成のための可能性［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７８ （１９９７）， ７３１−７７４］は酸化形の存在によって保証され、誤って形成されたシスチンの再分解（リシャッフリング）のための可能性はチオール成分の還元形のそれによって保証される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３ （１９９５）， １８−２３］。
【００２７】
有利にはグルタチオンは還元された形（ＧＳＨ）及び酸化された形（ＧＳＳＧ）の形で、それぞれ１０ｍＭまでの濃度で、理想的には５ｍＭのＧＳＳＧ対２ｍＭのＧＳＨの比で使用される。
【００２８】
再生バッファーは本発明によれば有利には１種以上の錯形成剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２０ｍＭ（有利には約５ｍＭ）までの濃度で、一方で還元されたチオール成分の制御されない促進された酸化を金属イオンによって阻止するため、かつ他方で復元物が汚染されうるメタロプロテアーゼを阻害するために含有する。
【００２９】
本発明によれば再生は適宜に０〜２０℃の温度で１〜２１日間にわたり、有利には５〜１０℃で５〜１０日間にわたって行われる。
【００３０】
比較的長い復元時間はプロＢＭＰ−２−ポリペプチド鎖の共有的な二量体化によって説明することができる。我々の調査は、このプロセスについて本発明の条件下にタンパク質濃度が速度を規定せず、遊離のチオール基の酸化が速度を規定する。
【００３１】
再生過程の完了後に本発明によれば、有利には、本発明の範囲内の低分子助剤を含有しない酸性（ｐＨ≦５）バッファーに対して透析する。透析バッファーは、透析によって誤って折り畳まれたポリペプチド鎖及び折り畳み中間体を十分に凝集でき、かつ従って遠心分離、濾過又は別の慣用の方法によって分離できる場合に本発明による方法に相当する。透析の前に、例えばクロスフロー濾過による再生バッチの濃縮、それに引き続いて再生条件下に付加的なインキュベート時間が適切である。場合により濃縮のプロセスにおいても生じ、かつチオール基の酸化を促進するバッファーのベンチレーション通気は再生時間の短縮に影響を及ぼし。これは、同様に酸化的に作用する物質の添加によって達成できる。
【００３２】
単量体の誤って折り畳まれたもしくは二量体化されていない正しく折り畳まれた種の復元されたｒｈ−プロＢＭＰ−２の本来の二量体形からの分離は本発明によればクロマトグラフィー的分離法によって実施でき、その際、有利には逆相ＨＰＬＣが使用される。カラム材料としては、このためにとりわけ、匹敵する又はより強い疎水性のシリカを主体とするＣ４−基体もしくはポリマーを主体とする粒子が適当であり、その際、タンパク質の大きさに基づいて孔径≧３００Åが推奨される。溶出物としてはＲＰ−ＨＰＬＣで慣用の、例えばアセトニトリル、２−プロパノール又はエタノールが適当である。本発明によればこの場合、イオン対形成剤、例えばトリフルオロ酢酸もしくは過フッ化酪酸を慣用の濃度で使用する。
【００３３】
二量体の天然に折り畳まれたプロＢＭＰ−２の精製のための更なる可能性はヘパリン−親和性クロマトグラフィーの使用である。この場合、タンパク質の可溶性を高めるために、かつプロＢＭＰ−２及びカラム材料の間の非特異的な相互作用を回避するために２〜８モルｌ^{− １}、有利には５モルｌ^{− １}の尿素濃度をバッファー添加物として使用できる。ＨｉＴｒａｐヘパリン−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍｒａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）はこの場合カラム材料として特に適当である。プロＢＭＰ−２のモノマー形はこの場合３００モルｌ^{− １}のＮａＣｌ下にマトリクスから溶出され、かつ二量体形はより高い塩濃度でマトリクスから溶出される。
【００３４】
ＴＧＦ−β−ファミリーに属さない神経成長因子β−ＮＧＦについては、既にＷＯ００／２２１１９号［Ｒａｔｔｅｎｈｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０００］において生物学的に活性なタンパク質をその不活性の変性された前駆形から得るための方法が記載されている。β−ＮＧＦ及びＢＭＰ−２は、特にそのプロ配列の長さにおいて異なる（β−ＮＧＦ−１０３ ＡＳ：ＢＭＰ−２−２６３ ＡＳ）。また三次構造においても本質的な差異が存在する［ＭｃＤｏｎａｌｄ ｕｎｄ Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｃｅｌｌ ７３ （１９９３）， ４２１−４２４］。従って、本発明は本質的な点でＷＯ００／２２１１９号とは異なることは意想外ではない。
【００３５】
正しく折り畳まれたｒｈ−プロＢＭＰ−２の最大の収量のために必要な再生時間は実質的にｒｈ−プロＮＧＦ（３時間）よりも長い（１〜２１日）。ＢＭＰ−２の前駆形、例えばβ−ＮＧＦの前駆形のようにインビボでフリン型のプロホルモン変換酵素によってプロセシングされる。これらは、プロ配列の末端で二塩基性の配列モチーフを認識する。その後者のアミノ酸はＡｒｇ^２８２である。インビボで、ＢＭＰ−２もしくはβ−ＮＧＦのプロペプチドを匹敵する基質特異性を有するプロテアーゼによって分解できる。
【００３６】
しかしながら再生されたｒｈ−プロＢＭＰ−２のプロセシングはプロＮＧＦの分解のために使用される条件とは全く別の条件を必要とする。本発明により使用される２６３アミノ酸を有するＢＭＰ−２のプロ配列が実質的に成熟タンパク質（１１４アミノ酸）よりも長いにもかかわらず、我々の調査においては意想外にも、プロＢＭＰ−２の溶解特性が成熟ドメインの溶解特性によって規定されることが示された。従ってプロＢＭＰ−２は、ＢＭＰ−２−プロペプチド単独（Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^２８２）に対して、溶解補助添加物を用いずにｐＨ≦５の場合にだけ高い濃度で可溶である。酸性のｐＨにおいて、前駆形の効果的なプロセシングはプロテアーゼ（トリプシン、ＰＡＣＥ（対塩基性アミノ酸変換酵素；二塩基性モチーフ切断性の真核性エンドペプチダーゼによる）を用いても不可能である。それにもかかわらずタンパク質分解による分解を可能にするために、本発明によれば全ての非阻害性の溶解助剤、特に尿素又はトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）を１〜５Ｍもしくは０．１〜２Ｍの濃度で単独又は、有利には２〜４Ｍの尿素を０．１〜１Ｍのトリスと組み合わせて使用する。前記の添加物を用いて、プロＢＭＰ−２を≧１ｍｇ／ｍｌの濃度で最適ｐＨ（７〜８）において溶液に保持することも可能である。
【００３７】
タンパク質分解のためのバッファー条件の調整は、適宜に透析によって実施する。本発明によればトリプシン様プロテアーゼが有利であり、これらのプロテアーゼは１：１０〜１：１０００（トリプシン、ｒｈ−プロＢＭＰ−２）の質量比、有利には１：２０〜１：１００の質量比で使用される。１分〜２４時間、有利には３０分〜６時間の時間にわたり０〜３７℃の温度、有利には１０〜２５℃の温度でインキュベートする。バッファー物質として、トリスの場合に溶解助剤自体が、かつ尿素の場合には付加的にトリスバッファーが前記の濃度で役割を果たす。高濃度のトリス、例えば０．５Ｍは更に場合により尿素から形成されるイソシアネートによるアミノ酸側鎖の共有的修飾を抑制する。
【００３８】
ｐＨは当該プロテアーゼについて有利な値、有利には７〜８に調整される。メタロプロテアーゼによる非特異的なタンパク質分解を遮断するために、本発明によれば錯形成剤、例えば１〜２０ｍＭのＥＤＴＡを添加することが適切である。タンパク質分解は１種以上のプロテアーゼインヒビター、有利には１〜５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）又はウシ膵臓又はダイズからのトリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ／ＳＢＴＩ）を２〜２０倍のモル過剰でトリプシンに添加するか、もしくはｐＨ≦５に酸によって調整することによって停止させる［Ｒｕｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．， ： Ｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （Ｈｒｓｇ．）， ２．Ａｕｆｌ． （１９９７）， ５７−９９］。
【００３９】
成熟ＢＭＰ−２のＮ−末端（Ｇｌｎ^２８３−Ａｒｇ^２９１）は構造化されておらず、従ってプロテアーゼ感受性である。そのＮ末端は更に幾つかのアルギニン基及びリジン基（Ａｒｇ^{２８９，２９１}、Ｌｙｓ^{２８５，２８７，２９０}）を有する。有利には前記の塩基性アミノ酸基の後で切断するトリプシンによる制限されたタンパク質分解は従って成熟ＢＭＰ−２のフレキシブルなＮ末端の分解をもたらす。得られるｄｒＢＭＰ−２の生物学的活性は動物試験で検出された。本発明によれば、場合によりタンパク質工学によって、ＢＭＰ−２のヘパリン結合部位をタンパク質分解から保護するために１つの付加的なジスルフィド架橋を、類似のＴＧＦ−β中に存在するのと同様に成熟ＢＭＰ−２のＮ−末端の固定及び安定化のために導入することが可能である。相応して低いタンパク質濃度での本発明による溶解助剤濃度の不在下にｒｈ−プロＢＭＰ−２の制限されたタンパク質分解のための我々の調査は、該プロペプチドが成熟タンパク質の分解の後に依然として十分にプロテアーゼ耐性な少なくとも１つのドメインからなることを示している。使用される溶解助剤の使用濃度で、これらのドメイン自体は部分的に弱く変性作用を有する。その結果として、鎖内（ｉｎｔｒａｃｈｅｎａｒｅ）ジスルフィド架橋によって安定化されないＢＭＰ−２のプロペプチドは構造的に不安定化され、プロテアーゼ反応性であり、かつ従って本発明による制限されたタンパク質分解の条件下に分解されうる。
【００４０】
タンパク質分解生成物の精製のために、本来のＢＭＰ−２の強い疎水性に基づいて［Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８７（１９９９）， １０３−１１５］疎水性相互作用による精製が提案される。本発明によればそのために有利には、得られるｄｒＢＭＰ−２が強く結合するカラム材料が使用され、他方でその他の分解生成物並びに使用されたプロテアーゼもしくはインヒビターは該カラム材料と弱く相互作用する。本発明に相応して、バッファー条件をタンパク質分解の後に、ｄｒＢＭＰ−２が沈殿し、かつその他の分解生成物、プロテアーゼもしくはそのインヒビターが溶液中に保持されるように変化させることが可能である。沈殿したｄｒＢＭＰ−２を次いで上清の分離の後に、適当なバッファーもしくは溶剤中に再び溶解させてよい。有利には沈殿性条件への前記の変化は適当なカラム材料、特に“Ｇｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓ”（メルク）又は匹敵する材料、例えばフェニルセファロース（ファルマシア）の存在下に透析によって実施する。該材料を大過剰で使用する場合には、凝集前に該材料上にタンパク質が結合することが達成可能である。カラム材料を前記のようにタンパク質で負荷した後に、不所望の成分を適当な洗浄工程によって除去してよい。ｄｒＢＭＰ−２の溶出は適宜に緩慢乃至激しく変性させるが決して還元性でない条件下に実施する。溶出剤としては、カラム材料に応じて、それに即してとりわけアルギニン、尿素又はグアニジウム塩が適当であり、これらは低い濃度でカラム材料の洗浄のためにも使用してよい。溶出の後に、ｄｒＢＭＰ−２を含有するフラクションを場合により精製し、かつ特に有利にはＢＭＰ−２の最終的な適用のために非常に適当な溶剤である０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又は酢酸アンモニウムに対して透析する。本発明によれば、タンパク質分解生成物を逆相材料、有利にはＣ_４−ＲＰ−ＨＰＬＣ上で分離し、その際、溶出を有利には０．１％のＴＦＡを用いてアセトニトリル勾配中で実施する。
【００４１】
本発明によれば復元されかつプロ配列の分解の後に得られる成熟ＢＭＰ−２はそれについて慣用のように骨成長の促進のために使用してよい。しかしながら意想外にも全体又は短縮されたプロ配列をなおも有する復元されたプロＢＭＰ−２自体もその生物学的な作用において成熟ＢＭＰ−２と等価であり、かつ前記のように使用できる。従って本発明の対象は骨成長を促進するための作用物質を含有する医薬品としてのプロＢＭＰ−２である。該医薬品は完全な又は欠損したプロ配列を含有してよい。有利には本発明によればプロＢＭＰ−２と種々の医学的移植材料との組合せを一時的な骨代替（骨代替材料）のために並びに永久の骨代替及び関節代替（金属製移植物、例えば股関節エンドプロテーゼ及び膝関節エンドプロテーゼ）のために外傷学、整形外科、ＨＮＯ、ＭＫＧ及び神経外科で使用される。この場合に、一方でプロＢＭＰ−２を追加の移植物被覆として全ての内表面及び外表面上に付着する薄いタンパク質被膜の様式で付着助剤（例えばシラン）を使用しかつ使用せずに使用してよい。第二にプロＢＭＰ−２を移植物の組み込み成分として、該成分を化学的重合又は硬化によって製造できる固形の最終生成物の非固形の出発材料に添加することで使用できる（リン酸カルシウムセメント、例えばノリアンＳＲＳ、オスチム（Ｏｓｔｉｍ）など）。
【００４２】
一時的な骨代替のための移植物として、天然及び合成起源の無機及び有機材料並びに両者の混合形が考慮される。無機の骨代替材料のための例はヒドロキシアパタイト、β−トリカルシウムホスフェート、α−トリカルシウムホスフェート、ガラスセラミック、バイオガラス、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム及びその他の挙げられていないカルシウム塩からのセラミックの結晶形及び非晶質形（専らリン酸カルシウムベースの骨セメントを含む）である。適当な有機材料はとりわけコラーゲン、骨組織、脱塩された骨基材、ゲル化される多糖、例えばヒアルロン酸、生体適合性プラスチック、例えばポリ乳酸、ポリメチルアクリレート、ポリエチレングリコール等の非常に多様な混合形及び加工形である。持続性の骨代替のためにエンドプロテーゼ及び別の金属製移植物、例えば脊椎体安定化のための移植物が考慮される。通常はこれは、種々の特殊鋼及びチタン合金からの、部分的にヒドロキシアパタイト被覆が設けられている製品である。
【００４３】
従って本発明の更なる対象は、特許請求の範囲に定義されるような成熟ＢＭＰ−２が結合されている完全又は欠損したプロ配列を有するプロＢＭＰ−２、この物質を含有する医薬品及び骨成長の促進のための医薬品の製造のための方法である。Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^３９６のプロＢＭＰ−２の、２０個のアミノ酸Ｈｉｓタグ及び開始コドンＭｅｔを含む完全な配列を第２表に示す。アミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｈｉｓ２０はｐＥＴ−１５ｂによってコードされるＨｉｓタグの成分である。ＢＭＰ−２のプロ配列はＧｌｙ２２で始まる。Ｈｉｓタグ及びプロ配列の間に付加的なメチオニンが存在する。本願に示される配列中のＧｌｙ２２〜Ａｒｇ３９８は、テキストの配列データに関するヒトのプレプロＢＭＰ−２−ｃＤＮＡの一次翻訳産物中のＧｌｙ２０〜Ａｒｇ３９６に相当する。以下の実施例は本発明を図面と関連づけて説明する。
【００４４】
図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示している。
【００４５】
図２はＵＶ−ＣＤ−スペクトルを示している。
【００４６】
図３はそれぞれプロＢＭＰ−２の発光スペクトルを示している。
【００４７】
図４はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示している。
【００４８】
図５はＲＰ−ＨＰＬＣ−クロマトグラムを示している。
【００４９】
図６はＵＶ−ＣＤ−スペクトルを示している。
【００５０】
図７はそれぞれｄｒＢＭＰ−２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量スペクトル図を示している。
【００５１】
図８はｒｈ−プロＢＭＰ−２のＲＰ−ＨＰＬＣ−図を示している。
【００５２】
図９はｒｈ−プロＢＭＰ−２−移植物の組織学的断片を示している。セラミックの内表面も外表面もいずれも骨物質で覆われている。孔内部は多数の脂肪細胞による骨標識を有する（移植物材料−暗部、骨−淡青色）。左下に幾らかの筋繊維（暗青色）並びに結合組織が見られる。
【００５３】
図１０は高拡大でのｒｈ−プロＢＭＰ−２−移植物の組織学的断片を示している。骨材料（左上乃至右下、淡青色）は該材料によって覆われたセラミック材料（右、灰色）と非常に密接して存在する。骨物質及び造血組織の間に活性骨芽細胞が一列で存在する。
【００５４】
図１１は移植物におけるＡＰの活性の比較を示している。
【００５５】
実施例
実施例１：プロＢＭＰ−２の製造
エシェリキア コリ−発現ベクターにおけるｐｒｏｂｍｐ−２−ｃＤＮＡのクローニング
ｐｒｏｂｍｐ−２−ｃＤＮＡのクローニングのためにノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社のＴ７−発現系［Ｓｔｕｄｉｅｒ ｕｎｄ Ｍｏｆｆａｔ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９ （１９８６）， １１３−１３０］を使用した。
【００５６】
出発ＤＮＡとして、挿入されるプレｐｒｏｂｍｐ−２−ｃＤＮＡを有するｐｃＤＮＡ３−ベクター（ベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ）を用いる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＢＭＰ−２のアミノ酸Ｇｌｙ^２０〜Ａｒｇ^３９６をコードするＤＮＡが得られた。この場合に、５′末端に翻訳開始のためにメチオニンコドンを導入し、かつ３′末端の終止コドンをＥ．ｃｏｌｉに典型的なものに変え、かつ第二の終止コドンによって補われる突然変異誘発プライマーを使用した。更にこれらのプライマーはＮｄｅＩ切断部位（５′末端）もしくはＢａｍＨＩ切断部位（３′末端）を有する。これは発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ（ノバゲン）への引き続いてのクローニングを可能にする。このベクターは付加的に、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現速度をかなり増大させることができるＮ末端−６ヒスチジンタグをコードしている。
【００５７】
該ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定［Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４ （１９７７）， ５４６３−５４６７］によるクローニングの完了後に調査した。
【００５８】
以下のプライマーを使用した：
【００５９】
【表１】

【００６０】
宿主生物としてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。この細菌の染色体はｌａｃプロモーターの制御下にあるＴ７−ＲＮＡポリメラーゼのための遺伝子を有する。従ってポリメラーゼの発現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導できる。ｐｒｏｂｍｐ−２遺伝子をＴ７プロモーターで制御する。ＩＰＴＧでの誘導は従ってプロＢＭＰ−２の形成をもたらす。発現速度の更なる向上のために細胞をｐＵＢＳ５２０で同時形質転換した。このプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ中に稀なアルギニンｔＲＮＡ（ｄｎａＹ）のための遺伝子を有する。それに対して、このｔＲＮＡによって認識されるアルギニンコドン（ＡＧＡ及びＡＧＧ）は真核性遺伝子中に特に頻繁に存在し、またｐｒｏｂｍｐ−２中にも存在する。かかる遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ中での発現速度は、とりわけ前記のｔＲＮＡの利用可能性に依存する［Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ８５ （１９８９）， １０９−１１４］。
【００６１】
Ｅ．ｃｏｌｉ中でのヒトのプロＢＭＰ−２の発現
組み換え細菌株の培養のために、適当な容量の２・ＹＴ−培地、一般に１．５ｌに１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加し、かつ単コロニーを接種した。
【００６２】
２・ＴＹ−培地（１ｌ）：
１７ｇのトリプトン
１０ｇの酵母エキス
５ｇのＮａＣｌ
該培養を３７℃及び１６０〜２００ｒｐｍで振盪した。１〜１．３のＯＤ_６００において１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。引き続き更に３〜４時間同じ温度で振盪し、かつ再現的に細胞密度が３〜３．５のＯＤ_６００の誘導後に達成された。細胞の回収を１００００ｇの遠心分離によって実施した。１ｌの培地あたりに３〜３．５ｇの細胞（湿式質量）を得ることができた。即座の細胞溶解の代わりに細胞をまず液体窒素中で、次いで−２０℃で凍結させた。
【００６３】
封入体（ＩＢ）の単離
組み換えｐｒｏｂｍｐ−２−発現において細菌細胞中に凝集物、封入体（ＩＢ）が形成する。このＩＢの調製をＲｕｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．， ：”Ｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”の”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （Ｈｒｓｇ．）， ２． Ａｕｆｌ． （１９９７）， ５７−９９に従って実施した。
【００６４】
５ｇの細胞ペレットごとに、２５ｍｌの１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁した。１ｇの細胞湿式質量あたりに１．５ｍｇのリゾチームを添加した後に、細胞懸濁液を４℃で３０分間インキュベートを実施した。最後にこれらの細胞を高圧分散（ゴーリンホモジナイザ）によって粉砕した。３ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１０μｇ／ｍｌのＤＮＡアーゼの添加の後に、均質物を２５℃で更に３０分間インキュベートした。それに引き続いて０．５容量部の６０ｍＭのＥＤＴＡ、６％のトライトンＸ−１００、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を添加し、かつ４℃で３０分間インキュベートを続け、不溶性の細胞成分を可溶化させた。ＩＢはその条件下で不溶性のままであり、かつ３９０００ｇでの遠心分離によって分離できた。過剰の界面活性剤をＩＢから分離するために、これをなおも５回１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭのＥＤＴＡで洗浄し、引き続きアリコートに取り、かつ−２０℃で保存した。
【００６５】
前記のようにして、１ｇの誘導されたＥ．ｃｏｌｉ細胞から再現的に１８０〜２１０ｍｇのＩＢが得られ、これらは３０〜３５％のタンパク質含量において９０〜９５％のｒｈ−プロＢＭＰ−２を含有している。
【００６６】
ＩＢの可溶化
１００〜１５０ｍｇのＩＢペレットを１ｍｌの１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で２５℃において４時間可溶化させた。次いでｐＨを酢酸で３〜４に調整し、かつ不溶性成分を遠心分離において１６０００ｇで２０分間にわたりペレット化した。上清を引き続き超遠心分離において２６６０００ｇでもう一度３０分間遠心分離して、微小凝集物を分離した。タンパク質濃度をλ＝２８０ｎｍでの吸光測定によって測定し［Ｇｉｌｌ ｕｎｄ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８２（１９８９）， ３１９−３２６］、３０〜５２ｍｇ／ｍｌであった。
【００６７】
プロＢＭＰ−２の精製
回収率（約７０％）はこの場合に分析的基準に匹敵した。
【００６８】
第二の精製法として、ヘパリン−親和性クロマトグラフィーを１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ヘパリンセファロース（アマシャム ファルマシア ビオテック）上で使用した。バッファー系としては：
−　０．１モルｌ^{− １}のトリス（ｐＨ７．５６）、６モルｌ^{− １}の尿素（バッファーＡ）及び
−　０．１モルｌ^{− １}のトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ６モルｌ^{− １}の尿素、１モルｌ^{− １}のＮａＣｌ（バッファーＢ）
が使用された。カラムをバッファーＡで１０カラム容量より多くで平衡化した。不純物を０〜２０％バッファーＢで溶出させた。単量体及び二量体のプロＢＭＰ−２の分離を２０〜５０％のバッファーＢの勾配で３０分間１ｍｌ分^{− １}の流動で実施した。
【００６９】
調製的基準でのｒｈ−プロＢＭＰ−２の再生
プロＢＭＰ−２−ＩＢ−溶解物を４ＭのＧｄｍＣｌ（ｐＨ４）での再生のために、溶解物の完全な希釈の後にＧｄｍＣｌの最終濃度が折り畳みバッファー中で５０〜６０ｍＭに達するように希釈した。プロＢＭＰ−２の濃度は最終的に３〜４μＭ（１３５〜１８０μｇ／ｍｌに相当）であった。
【００７０】
折り畳みバッファー：
１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１ＭのＬ−アルギニン
５ｍＭのＧＳＳＧ
２ｍＭのＧＳＨ
５ｍＭのＥＤＴＡ
折り畳みバッファーの濾過及び脱ガス後に、溶解物を緩慢に（〜２０ｍｌ／ｈ）かつ撹拌下に添加し、かつ該バッチを５℃で７日間インキュベートした。溶解物によって運ばれたＤＴＴ基はこの場合、最大０．４ｍＭのＧＳＨの濃度と等価である。
【００７１】
折り畳みバッチの濃縮はクロスフロー濾過（Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ， Ｍｅｍｂｒａｎ： ３０ｋＤａ ｏｐｅｎ ｃｈａｎｎｅｌ）によって実施した。濃縮物を引き続き２０容量の５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で５回、それぞれ２４時間透析し、次いで凝集したタンパク質を７５０００ｇで２時間遠心分離した。溶液中に残留するタンパク質の量をλ＝２８０ｎｍでの吸光によって測定し、かつ再現的に、使用されたＩＢ溶解物のタンパク質含量に対して約５０％であった。
【００７２】
プロＢＭＰ−２の精製
本来の二量体のｒｈ−プロＢＭＰ−２の（誤って又は正確に折り畳まれた）モノマー種の分析的もしくは半調製的な分離のために、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用した。分析的基準においては、とりわけＰｒｏｔｅｉｎ−ＲＰ−カラム（１５０×３．６ｍｍ、ＹＭＣ）を展開液としてＨ_２ＯもしくはＡＣＮ中の０．１％過フルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）を用いて使用した（図８参照）。またイオン対形成剤としてのトリフルオロ酢酸を用いてもモノマー及びダイマーの分離は達成された。二量体は、成熟ＢＭＰ−２の場合と同様に、その高い疎水性に基づいてモノマーもしくはモノマーの誤って折り畳まれた種よりも遅く溶出する。半調製的な基準においては、Ｓｏｕｒｃｅ１５ ＲＰＣ材料（ファルマシア）を有するカラムを使用した。分離プロフィール及び回復率（約７０％）はこの場合、分析的基準に匹敵した。
【００７３】
ｒｈ−プロＢＭＰ−２の特徴付け
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による純度分析及び分子量測定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって本発明により調製されたプロＢＭＰ−２−ＩＢの高い純度（≧９０％；図１、レーン２〜５）が得られるので、事前の精製を行わなくても再生のために使用できる。
【００７４】
非還元性条件（ヨードアセトアミドの添加は遊離チオール基の不可逆的な酸化的変性をもたらす）下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥは再生されたプロＢＭＰ−２の高い共有的な二量体化度（≧９０％）を示し、かつジスルフィド架橋の正確な形成を示唆し、かつそれによってタンパク質の本来の構造を示唆している（図１、レーン６）。
【００７５】
Ｎ−末端配列分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰＶＤＦメンブレン上でのウェスタンブロットの後にＮ−末端配列決定を実施した［Ｅｄｍａｎ ｕｎｄ Ｂｅｇｇ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １ （１９６７）， ８０−９１］。これらにより、再生されたプロＢＭＰ−２に関して以下のアミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−
の結果が得られた。
【００７６】
該配列は開始メチオニンの分解後のヒスチジンタグを有する組み換えプロＢＭＰ−２のＮ−末端に相当する。
【００７７】
円二色性分光分析及び蛍光分光分析
再生されたプロＢＭＰ−２及び更に変性されたプロＢＭＰ−２で実施された蛍光分光分析及びＣＤ分光分析は二次構造及び三次構造の存在に対して明らかな示唆を明らかにした遠−ＵＶ−ＣＤ−スペクトルのλ＝２２０ｎｍ付近の範囲における再生されたプロＢＭＰ−２及び変性されたプロＢＭＰ−２の楕円性の間の大きな差異（図２）は、本発明による再生過程において二次構造エレメントの形成が生じるという確認を可能にする。再生されたプロＢＭＰ−２の蛍光の発光極大が変性されたタンパク質に対してより低い波長に推移することは（図３）、本来の三次構造の形成のために典型的である。この場合に、該タンパク質のトリプトファン残基（ポリペプチド鎖プロＢＭＰ−２あたりに５個のトリプロファン）は折り畳まれるタンパク質の非極性の核への溶剤の極性の包囲から得られる（ｎｕｋｅ ｐ２４）。こうして低減された励起エネルギーの損失によってより高い周波数の光が放出される［Ｓｃｈｍｉｄ： ”Ｏｐｔｉｃａｌ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ． ” ｉｎ ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （Ｈｒｓｇ． ）， ２．Ａｕｆｌ． （１９９６）， Ｓ． ２６１−２９７］。蛍光スペクトルから、低いｐＨでのプロＢＭＰ−２の構造は、従って成熟のプロＢＭＰ−２の高い溶解性の範囲において変化を受ける。我々の実験がもたらしたように、このことはプロペプチドの部分的な展開に起因することがある（データ示さず）。
【００７８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分光分析及びＮ−末端配列分析
−　明らかな分子量：８９８０３．００７８Ｄａ　−　図７参照
−　計算された分子量（開始メチオニンなし）：８９８０１．２Ｄａ
ｒｈ−プロＢＭＰ−２及びｒｈ−ｄｒＢＭＰ−２の生物学的活性
修飾されたｒｈ−プロＢＭＰ−２及びｒｈ−ｄｒＢＭＰ−２の骨誘導活性を研究用小動物の異所性骨誘導モデルにおいて調査した。このために、定義された量のそれぞれ調査されるべき因子（４０〜２００μｇ；ｄｒＢＭＰ−２もしくはプロＢＭＰ−２）を滅菌濾過の後にβ−ＴＣＰからの滅菌の立方体状の化学的及び薬理学的に不活性なセラミック移植物基体上に施与した。
【００７９】
移植物仕様：
製造元　　−　Ｍａｔｈｙｓ社（Ｂｅｔｔｌａｃｈ， Ｓｃｈｗｅｉｚ）
商品名　　−　ｃｈｒｏｎＯｓ
相純度　　−　＞９５％β−ＴＣＰ
孔容量率　−　７２±６％
孔径　　　−　８０〜６５０μｍ
孔構造　　−　連続
強度　　　−　７．７±１．２ＭＰａ
因子被覆された移植物並びに未被覆であるがその他は同一に処理された対照移植物を８匹の成長した研究用ラットを前方腹膜筋組織に移植した。このために麻酔後に約１ｃｍ長の複数の外科的切断を皮膚及びその下にある最上筋肉層に施した。無血の調製によって２つの斜位の腹膜筋肉組織の間に中空部を生じ、その中に移植物を導入し、かつ傷口を外科的縫合によって閉じた。３０日の静置時間後にこれらの動物を屠殺し、かつ取り囲まれた組織を有する移植物を取り出し、かつ巨視的かつ組織学的に骨新生に関して調査した。全ての因子被覆された移植物において、造血的に活性な骨標識の形成を伴う骨新生は組織学的に明らかに確認できる（図８及び９を参照のこと）。生物学的作用は従って両者の因子についてそれぞれ１００％（プロＢＭＰ−２の場合に１６／１６；ｄｒＢＭＰ−２の場合に８／８）であった。それによって骨誘導活性の検出は骨組織の形成によって通常は骨形成能を有さない筋肉組織において明らかにもたらされうる。プロＢＭＰ−２及び成熟のｄｒＢＭＰ−２の間の組織学的な結果における定量的な差異は確認できない。対照移植物は骨新生を引き起こすことはない。その代わりに該移植物は専ら結合組織的に結合された。
【００８０】
ｒｈ−プロＢＭＰ−２もしくはｒｈ−ｄｒＢＭＰ−２の影響下での活性骨組織の新生に関する更なる証拠はアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の活性を移植物中で測定することによってもたらされる。このために各移植物の半分を外移植の直後に凍結させ、かつ−８０℃で貯蔵した。アルカリ性ホスファターゼの抽出及び酵素活性の測定のために移植物を解凍し、かつ０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ、１％のトライトンＸ−１００、ｐＨ７．４（４℃）でＰｏｔｔｅｒ Ｓホモジナイザ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分解し、かつ不溶性の成分を遠心分離によって分離した。澄明な上清を次いで試験キットのＥｃｏｌｉｎｅ２５（メルク）によるアルカリ性ホスファターゼの活性測定のために使用した。前記の試験で遊離された４−ニトロフェノールの濃度を２５℃及びλ＝４０５ｎｍにおいて５分間観察し、かつ酵素活性を式１に従って計算した：
【００８１】
【数１】

【００８２】
式中、Ｖｂはバッファーの容量（１ｍｌ）であり、かつＶｓは試料の容量（２５ｍｌ）である。製造者の指示に応じてε＝１８５１８ｌ×モル^{− １}×ｃｍ^{− １}を４−ニトロフェノールのモルの吸光係数とした。得られる活性の単位はマイクロモル×分^{− １}×ｍｌ^{− １}である。試験結果を第１表及び図１０にまとめる。ｒｈ−プロ／ｄｒＢＭＰ−２含有の試料における酵素活性は（−）−コントロールに対して相当高いが、ｒｈ−ｄｒＢＭＰ−２の活性はｒｈ−プロＢＭＰ−２を有する試料に対して僅かであり、またあらゆる場合にない（例外：動物４、６及び８）。ｒｈ−プロＢＭＰ−２（約４５ｋＤａ）及びｒｈ−ｄｒＢＭＰ−２（約１２ｋＤａ）の種々の分子量並びにｒｈ−プロＢＭＰ−２試料が精製されずに使用され、従ってなおも誤って折り畳まれたモノマー種を１０％までの割合で含有する事実を顧慮して、前記の動物モデルにおけるｒｈ−プロＢＭＰ−２は（欠損した）成熟形のタンパク質に匹敵する骨新生誘導活性を有する。
【００８３】
第１表：ｄｒＢＭＰ−２又はプロＢＭＰ−２で被覆された移植物でのアルカリ性ホスファターゼの活性の比較（Ｕ）
【００８４】
【表２】

【００８５】
実施例２：生物学的に活性なｄｒＢＭＰ−２の生産
ｒｈ−プロＢＭＰ−２の制限されたタンパク質分解
ｒｈ−プロＢＭＰ−２の調製的タンパク質分解のために、５０ｍｌの再生されたタンパク質を０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、４Ｍの尿素、１ｍＭのＥＤＴＡに対して透析した。凝集物を遠心分離（７５０００ｇ、１時間）によって分離し、かつタンパク質濃度を分光光度計で測定した（１．３ｍｇ／ｍｌ）。透析による損失は１３％であった。トリプシン（ロッヒェ ディアグノスティクス）を１：１００（トリプシン：プロＢＭＰ−２；ｗ／ｗ）の比で使用し、該バッチを５〜７℃において４時間インキュベートした。トリプシンの不活性化を８倍のモル過剰のダイズ−トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ；シグマ）で実施した。バッチ全体の尿素不含バッファー（０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０））に対する透析を疎水性カラム材料（２０ｍｌのフラクトゲル−フェニル メルク）の存在下に実施した。こうしてｄｒＢＭＰ−２で負荷されたカラム材料を空のカラム（ＸＫ−１６、ファルマシア）に充填し、引き続き：
・　５ＳＶ（カラム容量）の低塩バッファー（透析バッファー）
・　５ＳＶ ５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）
・　２ＳＶ ５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、４Ｍの尿素及び
・　２ＳＶ ５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１ＭのＬ−アルギニン
で洗浄した。６ＭのＧｄｍＣｌ、０．２Ｍの酢酸で溶出させた。ｄｒＢＭＰ−２含有フラクションを一緒にし、かつ０．１％のＴＦＡに対して透析した。凝集物の形成は確認できなかった。透析物を滅菌濾過し、タンパク質濃度を分光光度計で測定した（１．３ｍｇ／ｍｌ）。こうして得られたＢＭＰ−２の収率は制限されたタンパク質分解のために使用される復元物に対して約５０％であった。１ｌのＥ．ｃｏｌｉ培養から、従って約１７ｍｇの生物学的に活性なｄｒＢＭＰ−２が得られ、もしくは誘導されたＥ．ｃｏｌｉ細胞１ｇ（湿式質量）に対して５．２（Ｎ−末端のヘパリン結合部位を含む成熟ＢＭＰ−２の５．６ｍｇに相当する）が得られた。ルパート他によって記載された方法［Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３７ （１９９７）， ２９５−−３０２］によってそれに対して１ｇの細胞あたりに０．２ｍｇのＢＭＰ−２が得られた。
【００８６】
ｄｒＢＭＰ−２の特徴付け
Ｎ−末端配列決定によるタンパク質分解生成物の分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰＶＤＦメンブレン上でのウェスタンブロットに従ってＮ−末端配列決定を行った［Ｅｄｍａｎ ｕｎｄ Ｂｅｇｇ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １ （１９６７）， ８０−９１］。それにより、本発明により生じたｄｒＢＭＰ−２について以下のアミノ鎖配列の結果が得られた：
ａ）Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
ｂ）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−
ｃ）Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−
異なる種の互いの比は約３：２：１（ａ：ｂ：ｃ）である。システインを検出できないが、それに続くアミノ酸は検出できた。しかしながら該配列はＤＮＡレベルで完全に正しいと証明された。これはヘパリン結合部位を有さない成熟ＢＭＰ−２のＮ−末端に相当する。ｄｒＢＭＰ−２は還元された形及び還元されていない形で配列決定のために使用された。還元されていない形は２番目のセリンまで配列決定できるにすぎず、これについては後続の基がシスチンであり、従ってジスルフィド結合の成分であると報告された。従って全体的にタンパク質分解生成物は、ヘパリン結合部位を欠損した７〜９アミノ酸だけ短い成熟ＢＭＰ−２のＮ−末端に相当する。
【００８７】
本願に記載される制限されたタンパク質分解の条件下で、ジスルフィド結合されていないペプチド鎖が分解されるので、最終的には１００％までの共有結合的に二量体化されたｄｒＢＭＰ−２が得られる。
【００８８】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＨＰＬＣによるｄｒＢＭＰ−２の純度分析
本発明により得られるｄｒＢＭＰ−２のサイズ及び純度を還元された条件及び還元されていない条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び引き続いての銀染色によって対照をとった（図４中のレーン６及び１１）。９５％を上回る純度において１００％まで二量体化されている。
【００８９】
更にｄｒＢＭＰ−２の純度及び均一性の調査のために逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ；Ｖｙｄａｃ Ｃ_４）を使用した。ｄｒＢＭＰ−２はこの場合に４６．５７％のアセトニトリル及び０．１％のＴＦＡで均一なピークにおいて溶出し（図５）、これはタンパク質の均一な構造化及び特定のジスルフィド結合を支持している。
【００９０】
円二色性分光法
再生されたｄｒＢＭＰ−２及び変性されたｄｒＢＭＰ−２、特に還元されたＢＭＰ−２及び変性された成熟ＢＭＰ−２の楕円性（ＩＢ−溶解物）の間の遠ＵＶ−ＣＤ−スペクトルの２１０〜２３０ｎｍの範囲における大きな差異（図６）は、本発明によるプロタンパク質の再生過程においてタンパク質の成熟ドメインにおいても二次構造エレメントの形成が生じることの確認が可能である。
【００９１】
第２表
【００９２】
【表３】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はプロＢＭＰ−２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示している。レーン１はＬＭＷ、レーン２〜５はＩＢ−調製物、レーン６は再生されたプロＢＭＰ−２である。
【図２】
図２は再生されたプロＢＭＰ−２及び復元されたプロＢＭＰ−２の遠ＵＶ−ＣＤ−スペクトルを示している。
【図３】
図３は再生されたプロＢＭＰ−２及び復元されたプロＢＭＰ−２の発光スペクトルを示している（λ_ｅｘｃ＝２８０ｎｍ；不同のタンパク質濃度）。
【図４】
図４はｄｒＢＭＰ−２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示している。レーン１、６はＬＭＷ、レーン２〜５はｄｒＢＭＰ−２である。
【図５】
図５はｄｒＢＭＰ−２のＲＰ−ＨＰＬＣ−クロマトグラムを示している。
【図６】
図６は再生されたｄｒＢＭＰ−２、復元されたｄｒＢＭＰ−２及び還元されたｄｒＢＭＰ−２の遠ＵＶ−ＣＤ−スペクトルを示している。
【図７】
図７はそれぞれｄｒＢＭＰ−２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量スペクトル図を示している。
【図８】
図８はｒｈ−プロＢＭＰ−２のＲＰ−ＨＰＬＣ−図を示している。
【図９】
図９はｒｈ−プロＢＭＰ−２−移植物の組織学的断片を示している。セラミックの内表面も外表面もいずれも骨物質で覆われている。孔内部は多数の脂肪細胞による骨標識を有する（移植物材料−暗部、骨−淡青色）。左下に幾らかの筋繊維（暗青色）並びに結合組織が見られる。
【図１０】
図１０は高拡大でのｒｈ−プロＢＭＰ−２−移植物の組織学的断片を示している。骨材料（左上乃至右下、淡青色）は該材料によって覆われたセラミック材料（右、灰色）と非常に密接して存在する。骨物質及び造血組織の間に活性骨芽細胞が一列で存在する。
【図１１】
図１１は移植物におけるＡＰの活性の比較を示している。

Claims (50)

1. ＴＧＦ−β−スーパーファミリーの生物学的に活性なタンパク質の組み換え的製造のための方法において、
   （ａ）アミノ末端がＴＧＦ−β−スーパーファミリーのタンパク質のプロ配列又はその一部からなり、該末端に前記のＢＭＰ−β−スーパーファミリーのタンパク質又は、成熟ＢＭＰ−２に対して少なくとも３５％のホモロジーを有する別のタンパク質の成熟ドメインが連結されたタンパク質を、原核生物において少なくともタンパク質の一部が封入体の形で得られる条件下で発現させ、
   （ｂ）該封入体を単離し、かつ変性条件下に可溶化させ、
   （ｃ）前記封入体から可溶化され、変性されたモノマーの生物学的に不活性なタンパク質を再生させ、それによって可溶性の生物学的に活性な立体配置への折り畳み及び二量体化が可能であり、かつ
   （ｄ）場合により再生の後に成熟タンパク質をその前駆形からタンパク質分解により遊離させる
   ことを特徴とする、ＴＧＦ−β−スーパーファミリーの生物学的に活性なタンパク質の組み換え的製造方法。
2. ｄｒＢＭＰ−２を製造する、請求項１記載の方法。
3. プロタンパク質を原核生物中での発現の向上のためにアミノ末端親和性マーカー、特にポリヒスチジン配列で修飾する、請求項１又は２記載の方法。
4. 発現ベクターとしてｐＥＴベクター、特にｐＥＴ−１５ｂを使用する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 発現構築物のコドン選択が宿主生物での翻訳について最適化されている、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. 発現構築物の翻訳のために必要な宿主生物中に稀なｔＲＮＡを同様に過剰発現する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. 過剰発現をＴ７−発現系によってＢＬ２１（ＤＥ３）中で行い、かつ該発現構築物でエシェリキア・コリ中に稀なアルギニンｔＲＮＡのための遺伝子（ｄｎａＹ）を同時形質転換する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 細胞の溶解を高圧分散、酵素的溶解又は超音波によって実施する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
9. 封入体の精製を界面活性剤含有溶液での洗浄によって行い、その際、その界面活性剤濃度は、障害のある細胞タンパク質及び膜成分は可溶化されるが、封入体は可溶化されないように選択される、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
10. 界面活性剤がトライトンＸ１００である、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
11. 封入体の可溶化のためにカオトロピック物質又はカオトロピック物質の組合せを使用する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
12. カオトロピック物質としてグアニジウムクロリドを３〜８Ｍの濃度で又は尿素を６〜１０Ｍの濃度で使用する、請求項１１記載の方法。
13. 可溶化を還元条件下に実施する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
14. 還元剤としてジチオトレイトール及び／又はβ−メルカプトエタノールを使用する、請求項１３記載の方法。
15. 可溶化の後に遊離のシステインを共有結合的に変性する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
16. 可溶化の後に還元剤を除去する、請求項１３から１５までのいずれか１項記載の方法。
17. 可溶化の後に変性条件下で前精製を行う、請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法。
18. プロタンパク質の再生を、１種以上の変性剤の濃度を非変性性の又は弱変性性の水準まで低下させることによって実施する、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
19. １種以上の変性剤の濃度の低下を、再生バッファーにおいて可溶化物を緩慢に連続的又は段階的に希釈することによって実施する、請求項１８記載の方法。
20. 前記の希釈の際に、できるだけ徹底的な完全混和を、例えば撹拌によって実施する、請求項１９記載の方法。
21. １種以上の変性剤の濃度の低下を、再生バッファーに対して可溶化物を透析することによって実施する、請求項１８記載の方法。
22. 中性乃至アルカリ性のｐＨ値を有する再生バッファーを使用する、請求項１から２１までのいずれか１項記載の方法。
23. 再生バッファーがＬ−アルギニンを含有する、請求項２２記載の方法。
24. 再生バッファーが少なくとも１つのチオール成分を還元形及び酸化形で含有する、請求項１から２３までのいずれか１項記載の方法。
25. チオール成分がＧＳＨ／ＧＳＳＨである、請求項２４記載の方法。
26. 試料を再生過程の完了後に酸性バッファーに対して透析する、請求項１から２５までのいずれか１項記載の方法。
27. 試料を酸性バッファーに対する透析の前に濃縮する、請求項２６記載の方法。
28. 酸に不溶性の成分を分離する、請求項２６又は２７記載の方法。
29. 前駆形をクロマトグラフィーによって精製する、請求項１から２８までのいずれか１項記載の方法。
30. 精製をＲＰ−ＨＰＬＣによって実施する、請求項２９記載の方法。
31. 精製をヘパリン親和性クロマトグラフィーによって実施する、請求項２９記載の方法。
32. 生物学的に活性な形への前駆形の分解をプロテアーゼによって酵素的に実施する、請求項１から３１までのいずれか１項記載の方法。
33. プロテアーゼとしてプロホルモン変換酵素を使用する、請求項３２記載の方法。
34. 二塩基性の配列モチーフを認識するプロテアーゼを使用する、請求項３２記載の方法。
35. Ｐ１−部位（直接的に切断部位のアミノ末端）において塩基性基をとるプロテアーゼを使用する、請求項３２記載の方法。
36. 分解をトリプシンによって実施する、請求項３５記載の方法。
37. タンパク質分解の制限のために少なくとも１種のプロテアーゼインヒビターを添加する、請求項３２から３６までのいずれか１項記載の方法。
38. 分解が行われるｐＨでの遊離されたタンパク質の可溶性を、酵素を阻害しない溶解助剤によって高める、請求項１から３７までのいずれか１項記載の方法。
39. 溶解助剤としてトリスヒドロキシメチルアミノメタン及び／又は尿素を使用する、請求項３８記載の方法。
40. ０．１〜２モラーのトリスヒドロキシメチルアミノメタン及び／又は１〜５モラーの尿素を使用する、請求項３９記載の方法。
41. 成熟タンパク質もしくは欠損した成熟タンパク質を沈殿及び／又は疎水性クロマトグラフィーによって精製する、請求項１から４０までのいずれか１項記載の方法。
42. 等電点沈殿を行い、かつ沈殿されたタンパク質を酸性溶液中で再可溶化させる、請求項４１記載の方法。
43. 溶解助剤濃度の低下によって沈殿させる、請求項４１記載の方法。
44. クロマトグラフィー材料の存在下に沈殿条件を調整する、請求項４１から４３までのいずれか１項記載の方法。
45. 医薬品の製造のための、請求項１ａからｃまでのいずれか１項記載の方法により得られるＢＭＰ−２の前駆形の使用。
46. 骨治癒過程及び骨新生過程の促進のための医薬品の製造のための、請求項４５記載の使用。
47. 請求項１記載の方法によって得られる、第２表のアミノ酸配列Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^３９６及びプロ配列Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^２８２の一部を欠失する同配列を有するプロＢＭＰ−２。
48. 骨成長の促進のための医薬において、作用物質として、完全な又は欠損したプロ配列Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^２８２を有する第２表によるプロＢＭＰ−２の含量を特徴とする、骨成長の促進のための医薬。
49. 骨成長の促進のための医薬の製造方法において、完全な又は欠損したプロ配列Ｇｌｙ^２０−Ａｒｇ^２８２を有する第２表によるプロＢＭＰ−２を投与のために適当な調剤に配合することを特徴とする骨成長の促進のための医薬の製造方法。
50. 該調剤が、プロＢＭＰ−２−作用物質で被覆又は含浸されている生理学的に認容性の担体材料を含む、請求項４９記載の方法。

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