CN1824773B - 人睾丸特异性蛋白50基因表达调节剂筛选系统及筛选其基因表达调节剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人睾丸特异性蛋白50(TSP50)表达调节剂的筛选模型和筛选TSP50基因表达调节剂的方法，该筛选系统包含一种含有外源多核苷酸的重组载体以及由该重组载体转化或转染的宿主细胞，该重组载体包含原始载体和人TSP50基因启动子，其中所述原始载体含有一个报告基因且不含启动子，所述人TSP50基因启动子连接到报告基因的上游，且人TSP50基因启动子的活性和报告基因的表达具有相关性。本发明还公开了构建该筛选系统的方法及其用途。此筛选模型具有较高的灵敏度，操作简便，可用于高通量筛选。本发明的筛选系统可用于筛选人TSP50基因表达调节剂。

Description

人睾丸特异性蛋白50基因表达调节剂筛选系统及筛选其基因表达调节剂的方法

技术领域：

本发明公开一种人睾丸特异性蛋白50基因表达调节剂筛选系统，同时还提供了筛选人睾丸特异性蛋白50基因表达调节剂的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术：

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，发病率有逐年上升的趋势，目前，乳腺癌的治疗手段仍以手术为主，放疗、化疗为辅。随着社会的发展，乳癌根治术将被保乳手术所代替，更易术后复发及转移，而现有的化疗药物由于不是特异的作用于肿瘤细胞，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常的细胞也有杀伤作用，因此副作用较大，而且极易产生耐药性，给患者带来的痛苦有目共睹。寻找一种特异有效且毒副作用较小的抗肿瘤药物成为人们亟待解决的问题。

本发明涉及的睾丸特异性蛋白50(testes specific protein 50，以下简称：TSP50)是最近新发现的一个原癌基因，它编码一个385个氨基酸的蛋白，且此蛋白与多种丝氨酸蛋白酶有相似的结构，但其接触反应的残基Ser被Thr所取代，因此它可能是一个特殊类型的苏氨酸蛋白酶。在正常情况下其只表达在人的睾丸组织中，且只存在于精原细胞中，而不在精子中，提示其在精子产生的过程中具有重要的作用。而在睾丸以外的其他正常组织中，此基因不表达(Yuan，L.，Shan，J.，De Risi，D.，Broome，J.，Levecchio，J.，Gal，D.，Vinciguerra，V.，and Xu HP.Isolation of a novel gene，TSP50，by ahypomethylated DNA fragment in human breast cancer.Cancer Res.1999，59，3215-3221)。但最近的研究表明，在90％以上的乳腺癌组织中发现TSP50的异常高表达，而且此种表达局限在恶变的上皮细胞中(Shan，J.，Yuan，L，Xiao，Q.，Chiorazzi，N.，Budman，D.，Teichberg，S.，and Xu，HP，TSP50，A possible protease in human testis，is activated in breast cancerepithelial cells.Cancer Res.2002，62，290-294)。由此我们推测TSP50是一个新的肿瘤-睾丸抗原(cancer testes antigen，CTA)，作为苏氨酸蛋白酶在乳腺癌发生和精子形成过程中起着重要的作用，它将是乳腺癌诊断和治疗的重要靶点。

TSP50的表达是受其启动子控制的，在启动子上有很多基元(motif)供转录因子识别。某些转录因子与相应的基元结合后，将抑制下游基因的表达；而某些转录因子与相应的基元结合后，将激活下游基因的表达。不同的药物可能会通过不同的途径，直接或间接地影响不同的转录因子，使其与启动子上的相应基元结合后，表现出对下游基因表达的激活或抑制。利用此原理我们可以通过一定的手段筛选出调节TSP50表达的药物。

发明内容：

本发明公开一种人TSP50基因表达调节剂筛选系统，此筛选系统是一个基因工程细胞的培养体系，此基因工程细胞的宿主细胞中含有一个重组载体，此重组载体是通过将TSP50启动子连接到载体报告基因上游构建而成，同时还提供了筛选人TSP50基因表达调节剂的方法。

本发明用包含人TSP50基因启动子和报告基因的重组载体转染宿主细胞，此基因工程细胞可用于筛选人TSP50基因表达调节剂。

本发明所用术语“载体”是指本领域熟知的用于将外源目的基因转入宿主细胞进行复制、转录和表达的运载工具，包括各种质粒、噬菌体、粘粒(cosmid，装配型质粒)、病毒颗粒或噬菌体等。本发明可适用的原始载体含有一个报告基因；报告基因的上游没有启动子，但有一个多克隆位点，可供克隆启动子之用。

术语“报告基因”是指一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即一种其表达产物非常容易被鉴定的基因；把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

术语“宿主细胞”是指人、鼠和其他哺乳动物细胞。

术语“待测样品”是指通过本发明的方法对之进行人TSP50基因表达调节活性筛选的蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它分子。

术语“激动剂”是指当与人TSP50基因启动子作用时，一种可导致该基因表达上调的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可作用于人TSP50基因启动子的分子。

术语“抑制剂”是指当与人TSP50基因启动子作用时，一种可导致该基因表达下调的分子。抑制剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可作用于人TSP50基因启动子的分子。

本发明提供了一种重组载体，它包含原始载体和人TSP50基因启动子，其中所述原始载体含有一个报告基因且不含启动子，所述人TSP50基因启动子连接到报告基因的上游，且人TSP50基因启动子的活性和报告基因的表达具有相关性。

本发明的重组载体所含的原始载体为质粒，优选pGL3质粒或pEGFP质粒；所述报告基因为荧光素酶基因或荧光蛋白基因。

本发明的重组载体还可以包含Neo基因。

本发明还提供一种基因工程细胞，它包括用本发明的任一重组载体转染的宿主细胞。

本发明还提供了该宿主细胞在筛选人TSP50基因表达调节剂中的用途。

本发明还提供一种筛选人TSP50基因表达调节剂的方法，它包括先将本发明的任一基因工程细胞与待测样品接触，再检测该基因工程细胞内报告基因表达强度的变化。所述报告基因的表达和人TSP50基因启动子的活性具有相关性。

若该基因工程细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度降低，则该待测样品可抑制所述人TSP50基因的表达；若该基因工程细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度提高，则该待测样品可促进所述人TSP50基因的表达。

本发明的具体解决方案如下：

TSP50启动子

本发明使用的TSP50启动子可通过如下方法获得：提取人基因组DNA，合成TSP50启动子引物，以人类基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，从而钓取TSP50启动子。

本发明人设计的TSP50启动子引物序列为：

上游端引物：5’-GGGGTACCCCCAAGCAGTCC-3’

下游端引物：5’-GAAGATCTTCCCGGGGTGGC-3’

5’端带有KpnI酶切位点，3’端带有BglII酶切位点。

本发明获得的人TSP50启动子序列如图1所示。

重组载体

本发明可适用的原始载体含有一个报告基因，其上游没有启动子，但有一个多克隆位点，可供克隆启动子之用。人TSP50基因启动子可连接到报告基因的上游，并且人TSP50基因启动子的活性和报告基因的表达具有相关性，用以反映待测样品对人TSP50基因启动子表达活性的影响。本发明中使用的原始载体包括但不限于：pGL3、PGL2、pEGFP、pd2ECFP-1、PECFP1、pDsRed1-1、pd2EGFP-1、pEGFP-1、pd2EYFP-1、pEYFP-1、pHcRed1-1、pd2EGFP-Basic、pGFP-1等(以上载体均可在Clontech公司购得)，优选pGL3质粒或pEGFP质粒；适用的报告基因包括但不限于：红色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、LacZ基因或荧光素酶基因等。总之，只要是符合上述特点的原始载体(报告基因)均在本发明的保护范围之内。这些载体(报告基因)可通过商业途径获得或者使用本领域的公知技术构建获得(参见实施例3、附图2)。

为了便于建立稳定的转染体系，还可对上述载体进行改建，使之含有Neo基因。(参见实施例5及附图2)

基因工程细胞

由本发明的重组载体转染的基因工程化宿主细胞也在本发明的保护范围之内。此类宿主细胞可以是包括人、鼠及其他各种哺乳动物细胞。上文所述载体可通过本领域常规的转化或转染技术引入哺乳动物细胞。术语“转染”(transfection)是指本领域公知的各种将外源核酸序列(如DNA)引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-dextranmediatedtransfection、lipofection或electroporation等。

可适用于本发明的宿主细胞包括但不限于：HEK293细胞和HEK293T细胞(人胚胎肾细胞系)、MCF-7细胞(人乳腺癌细胞系)、HT22细胞(小鼠海马神经细胞系)等。

筛选方法

本发明提供了一种筛选人TSP50基因表达调节剂的方法。该方法是基于本发明的基因工程细胞内所含报告基因的表达与其上游的人TSP50基因启动子的活性相关联。当人TSP50基因启动子受到刺激或抑制时，其下游报告基因的表达量也会随之发生变化。通过检测报告基因表达量的变化(如荧光强度的变化)即可了解人TSP50基因启动子的活性变化。若待测样品能调节人TSP50基因启动子的活性，其便可导致细胞内报告基因的表达量发生变化，进而引起荧光强度等的变化。因此，本发明的基因工程细胞可用于识别人TSP50基因表达的激动剂或拮抗剂。

在筛选过程中，本领域的技术人员可分别将用重组载体转染的宿主细胞和用空质粒转染的宿主细胞与待测样品接触，然后分别测定并比较两种细胞内报告基因表达强度的变化；若用重组载体转染的细胞接触待测样品后，细胞内的报告基因的表达减弱了，则该待测样品可能是一种人TSP50基因的表达抑制剂；相反，若基因工程细胞接触待测样品后，细胞内的报告基因的表达增强了，则该待测样品可能是一种人TSP50基因的表达激动剂。通过该方法可对不同的样品进行平行筛选。因此，该方法可应用于高通量筛选中。

药物组合物和治疗方法

药物组合物以及治疗人TSP50基因相关疾病如乳腺癌等的方法亦在本发明的范围之内。所述药物组合物包括治疗有效量的通过本发明的筛选方法获得的人TSP50基因表达调节剂(包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它分子)以及可药用载体。“可药用载体”包括溶剂、分散剂(dispersion medium)、包衣(a coating)、抗细菌和抗真菌剂以及等张剂(isotonic agent)和吸收延迟剂(absorption delaying agent)等。

本发明的药物组合物可通过传统方法制成各种适应于不同给药途径的药物剂型。例如，它可制成口服的胶囊或片剂。胶囊剂可包含任何标准的可药用物质如明胶、纤维素等。片剂可按传统方法即将药物组合物与固相载体以及润滑剂压缩制得。所述固相载体包括淀粉和糖斑脱土(sugar bentonite)。本发明的药物组合物还可制成硬壳片剂(hard shell tablet)或包含捆绑剂(binder)如乳糖或甘露醇、常规填充剂以及tableting agent的胶囊。本发明的药物组合物还可通过非肠道途径给药。非肠道途径给药剂型包括本发明的药物组合物的水剂、等张盐溶液或5％的糖溶液以及与其他本领域公知的可药用赋形剂形成的制剂。环式糊精或其他本领域技术人员所公知的促溶剂均可作为药用赋形剂来递呈本发明的药物组合物。

概括地讲，通过本发明的方法筛选获得的人TSP50基因表达调节剂可悬溶于可药用载体(如生理溶液)中，通过口服或静脉输液，或通过皮下、肌下、胸内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气道内、肺内注射或输液等途径给药。

剂型的选择受到给药途径、制剂类型、患者(病种、病情、体形、体重、体表面积、年龄、性别)、药物相互影响以及收治医师的诊断等诸多因素的影响。适用的制剂用量范围为0.01～100.00mg/kg。用量范围可随病人情况与给药途径的不同而做相应的调整。其将主要取决于收治医师的诊断。例如，口服剂量一般要高于静脉注射剂量。所述剂量可通过本领域公知的经验优化方法进行调整。将本发明的药物组合物包裹于适宜的药物递呈载体(如聚合微粒体或输入设备)可提高给药，特别是口服给药的效率。

本发明的药物组合物的活性可通过体外(in vitro)和体内(in vivo)实验进行评价。简而言之，本发明的药物组合物的药理活性反映在其调节人MDR1基因表达活性的能力上。在体内实验中，所述药物组合物被注射入动物(如小鼠模型)体内以评价其药理活性。在此基础上，合适的剂量范围和给药途径遂得以确定。

附图说明

图1：2Kb TSP50启动子区的核苷酸序列

图2：含人TSP50启动子的重组质粒构建示意图

图3：不同药物对TSP50-p-pGL3转染细胞荧光素酶活性影响。

Control：未用任何药物刺激

BMP2：用骨形成因子210ng/ml刺激，与对照组相比无明显刺激TSP50启动子活性

OX：用增食欲素(orexin，OX)1nM/ml刺激，与对照相比可明显刺激TSP50启动子活性

PAO：用钙调蛋白抑制剂PAO(pherylarsin oxide，PAO)1μM/ml刺激，与对照相比可显著抑制TSP50启动子活性

具体实施方式：

为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。上文所列各参考文献均以全文引入本发明作为参考。

实施例1

人基因组DNA的提取

取肝素抗凝的人外周血3ml，3000rpm 4℃离心20分钟，吸掉上层血浆后加5倍体积无菌双蒸水，混匀，室温放置5-10分钟。4000rpm，4℃，离心20分钟，弃上清。加5ml生理盐水，使白细胞恢复等渗环境。4000rpm，4℃，离心15分钟，弃上清，获取白细胞层。在白细胞中加入5ml消化缓冲液(TES液)(15mM Tris-cl，15mM EDTA，15mM Nacl，0.5％SDS)，加蛋白酶K至终浓度为0.1mg/ml，充分混匀，50℃水浴3-5小时(4.5h)。冷却后加等体积Tris酚抽提两次，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次。小心吸取上清，加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，沉淀DNA。

实施例2

TSP50启动子区的钓取

1.引物的设计

根据文献报道从GenBank中查找TSP50启动子区的碱基序列，根据此序列设计PCR扩增用引物，从而钓取TSP50启动子。其引物序列如下：上游端引物为：5’-GGGGTACCCCCAAGCAGTCC-3’；下游端引物为：5’-GAAGATCTTCCCGGGGTGGC-3’。5’端带有KpnI酶切位点，3’端带有BglII酶切位点。

2.PCR扩增、电泳及回收

以人类基因组DNA为模板，用以上合成的引物进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃，5min；94℃，1min，62℃，45sec，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。将上述PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳并回收1.7Kb条带。

3.PCR产物的TA克隆及筛选

将上述回收产物与TA克隆载体连接，方法按Promega TA克隆试剂盒说明进行，4℃过夜后，取1μl连接产物转化感受态的HB101细菌，将细菌涂在事先涂有IPTG和X-gal的选择培养基上，37℃孵箱培养过夜。次日挑取白色菌落，接种至2ml的LB培养基中，37℃振摇培养过夜，提取质粒，用KpnI和BglII酶切鉴定，将酶切鉴定阳性的质粒进行测序。

实施例3

TSP50-p-pGL3及TSP50-p-pEGFP重组质粒的构建

将上述TA克隆细菌进行大量扩增后提取质粒，用KpnI和BglII酶切，回收1.7Kb片段；同时将pGL3用KpnI和BglII酶切，回收酶切后的质粒，将回收后的片段和pGL3质粒用TAKARA的连接酶I进行连接，在构建TSP50-p-pEGFP重组质粒时，将阳性TA克隆质粒和pEGFP载体分别用EcoRI酶切并回收片段进行连接，连接方法按TAKARA Ligation Kit说明书进行，16℃连接4小时后，将连接产物按上述方法处理后电转化DH5α，将细菌涂至具有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃孵箱培养过夜。挑取菌落接种到2ml的LB培养基中，37℃振摇培养过夜，次日提取质粒，用KpnI和BglII或EcoRI酶切鉴定，将酶切鉴定阳性的质粒进行测序。

实施例4

细胞瞬时转染及荧光检测

(1)MCF-7细胞的转染：将MCF-7细胞用10％FCS的DMEM培养基传代培养，将生长良好的细胞以5×10⁵个/ml的密度接种24孔板，每孔0.5ml，37℃，5％CO₂孵箱培养过夜，次日，用无血清DMEM培养基稀释质粒DNA，以每孔200μlDMEM、0.6μg TSP50-p-pGL3(TSP50-p-pEGFP重组质粒或空质粒)、0.2μg CMV-β-gal的比例稀释，然后加入2.4μlTransfast转化试剂，涡旋混匀，室温静置15-20分钟，将细胞用PBS洗一次后，将质粒及转化试剂混合物加入细胞孔，37℃培养1小时后，每孔加入1ml完全培养基，继续培养12小时后加入刺激物，继续培养24小时后用荧光化学发光仪测绿色荧光强度或裂解细胞，测荧光素酶活性。

(2)荧光素酶活性的测定：将24孔板中的细胞收集至EP管中，5000rpm，离心5min，弃上清，每管加入1mlPBS，充分振荡使细胞悬浮，5000rpm，离心5min，弃上清，在每个EP管中加入100μl Extraction Buffer(1％ TritonX-100，15mM MgSO₄，4mM EGTA，1mM DTT，25mM glycylglycine)，涡旋振荡1分钟，冰上放置20min，待用。在测定管中加入5μlAssay cocktail(30mM ATP，0.1M KH₂PO₄(pH 7.4)，0.1M Mg₂SO₄)，再加入45μl细胞裂解液，最后每管加入100μl荧光素液(0.1MKH₂PO₄，50μg/ml的荧光素)，立即用化学发光仪(Lumat9507)测定荧光素酶活性。

(3)β-半乳糖苷酶活性的测定：在96孔酶标板中加入37.5μl β-gal缓冲液(0.5M Na₂HPO₄，1M NaH₂PO₄，3M KCl，1MMgCl₂，0.34％2-melcaptalethanol)，12.5μl ONPG，20μl细胞裂解液，振荡混匀，37℃避光反应直至液体变黄，用酶标仪测定OD420值。用此数值来标准化荧光素酶活性，以修正由于转染效率的差异而引起的误差。

实施例5

重组质粒的改建

用BglII及SalI将pKO质粒中的Neo基因表达元件切下，连接入用BamHI及SalI酶切后的重组质粒，使重组质粒中含有Neo基因，便于稳定转染体系的建立。

实施例6

哺乳动物细胞稳定转染及荧光检测

将MCF-7细胞接种到直径60mm的培养板中，次日，将3μg改建后的重组质粒，用TransFast转化试剂转染MCF-7细胞，继续培养24小时后全换液，继续培养24小时后胰酶消化并加入G418，最终浓度为400μg/ml，每2～3天观察并更换筛选培养基1次。2周左右克隆形成后，挑选细胞克隆30个，分别入6孔板。含G418(200μg/ml)的培养基维持培养1周，将克隆有限稀释后加入96孔板，使每个孔中只有3个细胞，继续培养直至克隆长至满孔，取出部分细胞检测荧光素酶活性，将荧光素酶活性较高的孔继续G418(200μg/ml)维持扩大培养，用于样品库的筛选。

实验例1

用荧光素酶报告基因模型对待测样品进行筛选

将重组质粒TSP50-p-pGL3-neo及空质粒pGL3-Basic-neo稳定转染的MCF-7细胞分别用含10％小牛血清的DMEM培养基进行培养，待其呈对数生长时，将其用胰酶消化后以含血清DMEM培养基稀释并均匀加入24孔细胞培养板，培养24小时后，弃上清，每孔加入250ul含1％血清的DMEM培养基，同时加入待测样品，继续培养24小时后，收集细胞放至EP管中，5000rpm离心5分钟，弃上清，用PBS洗一次后，每管加入100ul Extraction Buffer(1％ TritonX-100，15mM MgSO₄，4mM EGTA，1mM DTT，25mM glycylglycine)，涡旋振荡1分钟，冰上放置20min，待用。在测定管中加入5μlAssay cocktai l(30mM ATP，0.1M KH₂PO₄(pH 7.4)，0.1M Mg₂SO₄)，再加入45μl细胞裂解液，最后每管加入100μl荧光素液(0.1MKH₂PO₄，50μg/ml的荧光素)，立即用化学发光仪(Lumat 9507)测定荧光素酶活性，将重组质粒转染孔的荧光素酶活性用空质粒转染孔的荧光素酶活性进行标准化。结果见图2，图中：

Control：未用任何药物刺激

BMP2：用骨形成因子210ng/ml刺激，与对照组相比无明显刺激TSP50启动子活性

OX：用增食欲素(orexin，OX)1nM/ml刺激，与对照相比可明显刺激TSP50启动子活性

PAO：用钙调蛋白抑制剂PAO(pherylarsin oxide，PAO)1μM/ml刺激，与对照相比可显著抑制TSP50启动子活性

实验例2

用GFP报告蛋白基因筛选模型对待测样品进行筛选

将重组质粒TSP50-p-pEGFP及空载体pEGFP稳定转染的MCF-7细胞分别用含10％小牛血清的DMEM培养基进行培养，待其呈对数生长时，将其用胰酶消化后以含血清DMEM培养基稀释并均匀加入96孔细胞培养板，培养24小时后，弃上清，每孔加入100ul含1％血清的DMEM培养基，同时加入待测样品，继续培养24小时后，用博麦洁公司的Fluostar检测荧光强度，将重组质粒转染孔的荧光强度用相应的空质粒转染孔的荧光强度进行标准化。

Claims (11)

1.一种人睾丸特异性蛋白50基因表达调节剂筛选系统，此筛选系统是一个基因工程细胞的培养体系，包括基因工程细胞和细胞培养基，此基因工程细胞中含有一个重组载体，此重组载体是通过将TSP50启动子连接到载体报告基因上游构建而成，所述的启动子为TSP50基因翻译起始位点ATG上游2Kb的DNA序列，具体序列如附图1所示。

2.权利要求1所述的筛选系统，其特征在于：其重组载体包含一个报告基因，在报告基因上游除插入的人TSP50基因启动子外无其它启动子，且人TSP50基因启动子的活性和报告基因的表达呈正相关。

3.权利要求1所述的筛选系统，其特征在于：重组载体的原始载体为含有报告基因的载体，但其上游不含有启动子，却含有多克隆位点。

4.权利要求1所述的筛选系统，其特征在于：重组载体包含或不包含Neo基因。

5.一种含有外源重组载体的基因工程细胞，其特征在于，它是用权利要求1-4中任一权利要求所述的筛选系统中的重组载体转染的宿主细胞。

6.权利要求5的宿主细胞在筛选人TSP50基因表达调节剂中的用途。

7.权利要求6的用途，其中所述人TSP50基因表达调节剂为激动剂。

8.权利要求6的用途，其中所述人TSP50基因表达调节剂为抑制剂。

9.一种筛选人TSP50基因表达调节剂的方法，它包括先将权利要求5所述的基因工程细胞在细胞培养基中进行培养，之后在培养基中加入待测样品；再检测细胞内报告基因表达强度的变化，其特征在于，所述报告基因的表达和人TSP50基因启动子的活性呈正相关。

10.权利要求9的筛选方法，其特征在于，若所述基因工程细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度降低，则该待测样品可抑制人TSP50基因的表达。

11.权利要求9的筛选方法，其特征在于，若所述基因工程细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度升高，则该待测样品可促进人TSP50基因的表达。

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