CN1484651A - 重组体bmp-2的生产 - Google Patents

Abstract

为了重组生产一种TGF－β超家族的生物活性蛋白质，将蛋白质在原核生物中表达。该被表达蛋白质的氨末端由一种TGF－β超家族蛋白质的前序列或其部分组成，将该蛋白质或另一种TGF－β超家族蛋白质的成熟区域连接到该蛋白质上，所连接上的蛋白质具有和成熟BMP－2至少35％的同源性。蛋白质的表达在至少有一部分蛋白质以包含体的形式而获得。分离出包含体，并在变性条件下溶解。从包含体中溶解的、变性的、单体的和无生物活性的蛋白质经过折叠和二聚体化变性形成可溶的、有生物活性的构象，必要时，在复性之后将成熟蛋白质从其前体形式中经蛋白水解而释放出来。

Description

重组体BMP-2的生产

本发明涉及用于获得具有生物活性的drBMP-2(dr：移动数字)和同源蛋白质的方法，该方法通过变性的无生物活性的proBMP-2的复性和视需要前肽的随后切除，其中复性的蛋白质前体形式已经具有生物活性，proBMP-2作为新产物，本发明还涉及该产物用于生产促进骨生长的组合物的用途。

BMP-2属于骨形态发生蛋白(BMP)家族。这些蛋白质是骨生长因子，在1988年首次完成了它们的克隆和鉴定。这些蛋白质的特有性质是能够引起软骨内的骨新生[Wozney等人，Science 242(1988)，1528-1534]。

在结构上，BMP-2和超过30种其他蛋白质一同属于TGF-β超家族，该超家族成员相互之间显示出非常高度的结构相似性，尽管它们的序列同一性有时低于30％[Griffith等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)，878-883]。这些蛋白质的基本结构特征是所谓的“胱氨酸结”结构。该结构是由4条反平行的β折叠链所形成，其中每两条链通过二硫键相互连接。在此两个胱氨酸和肽链骨架一起形成一个环，通过该环第三个二硫桥伸展开来。

在这些蛋白质中，β折叠是占主导地位的二级结构元件。可是，它们在这些蛋白质中比在其他富含β折叠的蛋白质中更长且缠绕得更紧密。由于TGF-β家族蛋白质相互之间的结构相关性，我们假定这些蛋白质也以相似的方式形成它们折叠的天然构象。

BMP和相关蛋白质，如DPP(decapentaplegic，果蝇)，在高等生物的胚胎发育中起着重要的作用。BMP基因或BMP受体基因的缺陷，或者它们调节的缺陷有时可导致严重的发育失调，如进行性骨化性纤维发育不良[Kaplan等人，Calcif.Tissue Int.47(1990)，117-125；Rao等人，Hum.Genet.90(1992)，299-302；Shafritz等人，N.Engl.J.Med.335(1996)，555-561]和牙本质生长不全[Tabas等人，Clin.Orthop.293(1993)，310-316]。BMP缺失的小鼠突变体早在胚胎时期或出生后不久死亡，它们显示出骨骼和很多种器官(如心、肾和眼)的畸形[Dudley等人，Genes Dev.9(1995)，2795-2807；Zhang和Bradley，Development 122(1996)，2977-2986]。

BMP和相似的生长因子只在某种条件下适合用于治疗全身性疾病，如骨质疏松症，因为它们能够引起不可忍受的副作用，如肿瘤诱发。BMP尤其是BMP-2更多地用于局部受限制的应用。这些施用包括与脊柱退化性疾病相关的脊柱融合术、颅骨新生、上颌外科和面外科手术，以及手足复杂骨折的治疗。就这些应用而言，rhBMP-2(rh-重组体，人)对于骨新生和由此对于愈合过程的有效性已经在多个动物模型中有令人印象深刻的表现[Lane等人，Clin.Orthop.361(1999)，216-227；Marden等人，J.Biomed.Mat.Res.28(1994)，1127-1138；Mayer等人，Plast.Recontr.Surg.98(1996)，247-259；Sandhu和Boden，Orthop.Clin.North Am.29(1998)，621-631；Toriumi等人，Arch.Otolyryngol.Head Neck Surg.117(1991)，1101-1112；Yasko等人，J.Bone Joint Surg.(Am.)74(1992)，659-670]。就脊柱融合术而言，已有了第一次临床研究[Boyne等人，Int.J.Periodontics Restorative Dent.17(1997)，11-25；Howell等人，Int.J.Periodontics RestorativeDent 17(1997)，124-139]。同样地，rhBMP-2也适合用于固定人造关节或在周围的骨组织中螺钉固定，例如用于稳定骨折。

除了不足的研究之外，这些研究本身，尤其是获得蛋白质的高额成本，阻碍了在临床实践中常规使用BMP。通过在本发明中所描述的方法能够以低的技术消耗和至今不可能获取的产率经济地以高纯度重组体的形式制备有生物活性的BMP-2以及相关的BMP，该方法只需较少的技术投入但产率却是以前所不能想象的。

人的BMP-2在身体中以396个氨基酸长度的前体蛋白质形式进行合成。信号肽(前序列)在体内用于将新生多肽链转运到内质网(ER)中。当其输入进ER中后，蛋白质折叠成其天然构象，形成了0二硫桥(Cys²⁹⁶-Cys³⁶¹，Cys^325-Cys³⁹³，Cys³²⁹-Cys³⁹⁵，分子间：Cys³⁶⁰-Cys³⁶⁰)，并发生翻译后修饰。后者包括天冬酰胺残基的糖基化和部分前肽的不完全切除[Israel等人，Growth Factors 7(1992)，139-150]。前体蛋白质的114个C末端氨基酸(Gln²⁸³-Arg³⁹⁶)形成成熟的BMP-2，其生物活性形式为具有二硫桥(Cys³⁶⁰-Cys³⁶⁰)的同型二聚体。

从骨组织中分离BMP-2需要巨大的投入，但只得到很低的产率(从40kg牛骨粉中得到40μg BMP混和物)[Wozney等人，Science242(1988)，1528-1534]。此外，从人的骨材料中分离在伦理上令人质疑，而且还有着病原体(朊病毒、HCV等)污染的危险。来自猪或牛的同源蛋白质的应用从免疫学的观点来看同样是危险的。

因此优先地选择重组地制备BMP-2。对此有两个主要的可能性。首先，蛋白质可以在真核表达系统中获得[Wang等人，Proc.Natl.Acda.Sci.USA 87(1990)，2220-2224]。这种方法的缺点为相对较低的重组蛋白质的数量(每1L培养基产25μg部分纯化的BMP-2[Wozney等人，Science 242(1988)，1528-1534])，以及相对高度的技术投入和由此产生的高成本。

第二条路线包括使用原核表达系统。它们的优点在于简单的技术操作、低成本和可分离得到非常高数量的蛋白质。可是，和真核生物相比较，细菌不能正确地加工前体蛋白质。由此至今该方法的使用在BMP-2成熟区域(Gln²⁸³-Arg³⁹⁶)的表达方面是受到限制的。该区域在细菌内以不溶的且无生物活性的形式出现，除此之外由于细胞溶胶中的还原条件，其不可能形成蛋白质的二硫桥。这些不溶蛋白质的聚集体称为包含体(IB)，其分离和纯化已经由如Marston[Biochem.J.240(1986)，1-12]进行了描述。

Ruppert等人[Eur.J.Biochem.237(1996)，295-302]用于复性成熟BMP-2的方法基于US专利5,650,494[Cerletti等人，1997]，该方法涉及类TGF-β蛋白质，BMP-2也属于这些蛋白质。该方法包括将类TGF-β蛋白质单体的且变性的成熟形式在温和去污剂存在下复性，从而得到具有生物活性的构象。就BMP-2而言，每1g这样的细胞中只获得0.2mg活性蛋白质的产率[Ruppert等人，Eur.J.Biochem.237(1996)，295-302]。

使用本发明以受诱导的细胞质量计则可能获得超过25倍的更高产率。该产率甚至比在真核细胞中表达时所获得的产率高大约3个数量级。

由于复杂的二硫模式(胱氨酸结)，复性大肠杆菌(E.coli)重组细胞中表达的成熟BMP的复性产率非常的低。本发明是基于以下的假设：BMP-2前肽和同源蛋白质的前肽一样在对于成熟区域的正确折叠负责。

根据本发明用于重组体制备TGF-β超家族的生物活性蛋白质的方法，其特征在于：(a)一种蛋白质，其氨末端由一种TGF-β超家族蛋白质的前序列或部分所述前序列组成，所述氨末端与此种或另一种TGF-β超家族蛋白质的成熟区域连接，该蛋白质与成熟BMP-2具有至少35％同源性。在至少部分蛋白质能以包含体的形式而获得的条件下将所述蛋白质于原核生物中进行表达；(b)分离包含体并在变性条件下溶解；(c)将包含体中溶解的、变性的、单体的和无生物活性的蛋白质复性，以此使其能够折叠和二聚体化形成可溶的、有生物活性的构象；和(d)如果必要，在复性之后经蛋白质水解将成熟蛋白质从其前体形式中释放出来。

我们的体外复性实验表明，根据本发明，甚至在缺少去污剂的条件下也有可能相对容易地通过用假定的BMP-2前体形式(Gly²⁰-Arg³⁹⁶)以及随后切除前肽(Gly²⁰-Arg²⁸²)的方法来获得大量的具有生物活性的drBMP-2。对于drBMP-2的理解是从Lys²⁹⁰、Arg²⁹¹或Leu²⁹²(见实施例2.2.1)至Arg³⁹⁶的BMP-2的C末端区域，其生物活性已经由Koenig等人[Mol.Cell Biol.14(1994)，5961-5974]进行了描述。氨基酸序列(Gln²⁸³至Arg²⁸⁹、Lys²⁹⁰或Arg²⁹¹)介导BMP-2与肝素的结合。

尽管这一非特异性的相互作用调节了BMP-2的效用，但是其对于BMP-2的生物活性不是必需的[Ruppert等人，Eur.J.Biochem.237(1996)，295-302]。

根据本发明，完整的前序列(Gly²⁰-Arg²⁸²)或者其部分可以用作前序列或前肽。

为了增加probmp-2在原核生物中的表达率，根据本发明可以将标签序列(例如编码组氨酸标签)连接到编码该基因序列的5′末端，或者采用诱变来优化用于原核表达的probmp-2密码子。还有可以用US专利5,336,602[Brinkmann等人，1993]中所描述的方法来增加表达，或者采用这些方法的联合。

当重组的probmp-2在原核生物细胞质中过量表达时，蛋白质就以无活性的且不溶的聚集体(包含体-IB)形式在细胞质中出现。为了分离它们，在发酵之后首先要采用一种或多种常规方法(例如，高压分散、酶裂解或超声破碎)将细胞破碎，该过程优选地在中性至弱酸性缓冲溶液(例如0.1M Tris/HCl pH 7.0)中进行。

通过机械的、化学的或者优选酶的处理将细胞DNA降解成不会与IB共沉降的片段。不溶的细胞组分(包括IB)以任意的方式与可溶的组分分离，优选地通过离心来分离。用溶液洗涤沉淀，由于它们的组成或添加到它们中的物质(如去污剂)从而使得该溶液能够从IB中溶解出干扰的细胞蛋白质和膜成分而不是重组体proBMP-2。随后根据本发明将剩下的、不溶的并含有proBMP-2的部分进行溶解、复性和用酶加工。

在复性之前，将IB溶解，该过程使用常用的变性试剂(离液序列高的物质)或这些试剂的联合物。除此之外，这些试剂包括胍盐如GdmCl或GdmSCN，以及尿素与其衍生物。在此变性试剂或其混和物的浓度是如此调整的，以便将重组的难于溶解的蛋白质完全地溶解。在氯化胍的情况下，浓度为3-8M；在尿素的情况下，浓度为6-10M。为了完全单体化经如此变性的、可溶的并含有胱氨酸的蛋白质，优选添加还原试剂，如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇或者还原试剂的联合物，溶解缓冲液的pH优选地调整至8-9。在溶解之后，或与之同时，也可以共价修饰游离的半胱氨酸，例如用氧化型谷胱甘肽。在溶解或者可选的半胱氨酸共价修饰之后，IB溶解液的pH优选地调整至5或稍低；再次可选地，通过透析除去过量的氧化还原当量物，若不考虑还原试剂，该透析缓冲液适当地具有和溶解缓冲液同样的组成。最后，将经过溶解程序后仍然不溶的组分分离出来(离心或过滤)并丢弃。可选的修饰步骤和过量还原试剂的去除能够使IB溶解液通过固定化金属亲和层析(IMAC)得到预纯化，只要proBMP-2的表达使用N末端组氨酸标签。

根据本发明用于复性rh-proBMP-2的方法包括降低变性试剂的浓度至无变性作用或只有弱变性作用的水平(如≤0.5M GdmCl)。该过程优选通过用复性缓冲液缓慢地连续或逐步稀释溶解液来实现。为了使生物活性蛋白质的产率最大化，必需注意在此的混和尽可能快速和彻底地进行，其例如通过剧烈搅拌得以保证。

用于稀释的另一种方法为用复性缓冲液来透析溶解液。每次的条件应如此选择从而使得形成的蛋白质聚集体最少。蛋白质的复性在变性试剂的最初稀释期间可能已经发生了。在稀释或透析之后，复性缓冲液中rh-proBMP-2的最终浓度为10-1000μg/ml，优选的为50-250μg/ml。

当不正确折叠的多肽链和折叠中间体(≥二级动力学方程[Kiefhaber等人，Biotechnology(N.Y.)9(1991)，825-829])的非生产性聚集进行得明显慢于多肽单链的折叠成天然的构象(一级动力学方程)时，则保证了最佳的蛋白质浓度。

所用复性缓冲液的pH为6.5-10，理想的为8-9。因此合适的缓冲液为任何具有中性至碱性pK_a的缓冲液，优选的为Tris缓冲液和磷酸缓冲液以及这些缓冲液的综合。此外，向复性缓冲液中加入能够增加复性产率的低分子量辅助试剂[US专利5,593,865，Rudolph等人，1995]是有利的。特别适合的是在L-精氨酸(浓度为0.2-2.0M，优选的为0.5-1.5M L-精氨酸)存在下进行复性。根据本发明，复性缓冲液的另一种成分为一种或多种硫醇化合物的还原和氧化形式的集合物。这样的集合物的例子为还原型(GSH)与氧化型(GSSG)谷胱甘肽、半胱氨酸与胱氨酸、半胱胺与胱胺以及β-巯基乙醇与2，2′-羟乙基二硫。借助这种人工氧化还原系统使蛋白质的复性在热力学上得以控制。通过硫醇成分氧化形式的存在来确保必要的形成二硫桥的可能性[Creighton，Biochemistry 378(1997)，731-744]，通过硫醇成分还原形式的存在来确保重新打断不正确形成的胱氨酸(改组)的可能性[Creighton等人，Trends Biotechnol.13(1995)，18-23]，是对于多肽链的正确折叠所必需的。

优选以还原(GSH)和氧化(GSSG)形式使用谷胱甘肽，其浓度分别可达10mM，且理想的比例为5mM GSSG：2mM GSH。

根据本发明，复性缓冲液优选地含有一种或多种络合试剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)，其浓度可达20mM(优选的为大约5mM)。这一方面是为了阻止还原性硫醇成分通过金属离子发生不受控制的加速的氧化；另一方面是为了抑制可能污染复性物的金属蛋白酶。

根据本发明，复性可以适当地于0-20℃的温度经历1-21天来进行，优选5-10℃和5-10天。

相对较长的复性时间可以用proBMP-2多肽链的共价二聚体化来解释。我们的实验表明，在本发明的条件下，游离硫醇基的氧化而不是蛋白质浓度决定了该过程的速率。

在复性过程结束之后，根据本发明将复性混和物优选地用酸性(pH≤5)缓冲液进行透析，该缓冲液不含有任何在本发明含义内的低分子量辅助试剂。当透析以最大可能的程度聚集不正确折叠的多肽链和折叠中间体而使之可以通过离心、过滤或其他常规方法来分离时，透析缓冲液则符合根据本发明的方法。在透析之前，最好先浓缩复性混和物(如采用交叉流过滤)，随后可以在复性条件下附加以孵育时间。向缓冲液中通气，也可以在浓缩过程中进行，其可加速游离硫醇基的氧化从而可具有缩短复性时间的效用。这也可以通过加入具有氧化作用的物质来完成。

根据本发明，层析分离方法能够用于将单体的、不正确折叠的或非二聚体的、正确折叠的从复性rh-proBMP-2的天然二聚体形式分离开，优选地采用反相HPLC。对于此目的，合适的柱材料尤其为基于二氧化硅的C4-基质或者具有同等或更强疏水性的基于多聚体的颗粒，由于蛋白质的大小而采用≥300的孔径是恰当的。合适的洗脱剂为那些在RP-HPLC中常用的试剂，如乙腈、2-丙醇或乙醇。根据本发明，在这方面可使用离子对形成剂，优选地以常规浓度使用三氟乙酸或全氟丁酸。

用于纯化二聚体的且天然折叠的proBMP-2的另一个可能性为使用肝素亲和层析。关于这方面，为了增加蛋白质的溶解性和避免proBMP-2与柱材料之间非特异性相互作用，应当使用浓度为2-8mol/L，优选的为5mol/L的尿素作为缓冲液的添加物。HiTrap肝素-琼脂糖(Amersham Phamracia Biotech)是在此特别合适作为柱材料。然后proBMP-2的单体形式在低于300mol NaCl/L的浓度下从基质上洗脱下来，同时二聚体形式在更高的盐浓度下洗脱。

WO 00/22119[Rattenholl等人，2000]已经描述了不属于TGF-β家族的神经生长因子β-NGF的生物活性蛋白质从其失活的变性前体形式中获取的方法。β-NGF与BMP-2的区别尤其在于它们前序列的长度(β-NGF-103氨基酸；BMP-2-263氨基酸)。在三级结构上也有着重要的差异[McDonald和Hendrickson，Cell 73(1993)，421-424]。因此本发明在基本观点上不同于WO 00/22119是不令人惊讶的。

对于正确折叠的rh-proBMP-2的最大产率所需的复性时间(1-21天)明显长于用于rh-proNGF的复性时间(3小时)。在体内，BMP-2的前体形式与β-NGF的一样由弗林蛋白酶类型的激素原转变酶进行加工。这种转变酶识别前序列末端的成对碱性序列基元。它们的最后一个氨基酸为Arg²⁸²。在体外，具有同样底物特异性的蛋白酶能够切除BMP-2前肽或β-NGF前肽。

可是，复性rh-proBMP-2的加工需要完全不同于那些用于切割proNGF的条件。虽然根据本发明使用的BMP-2前序列具有263个氨基酸比成熟蛋白质(114个氨基酸)长许多，但是在我们的实验中惊讶地发现proBMP-2的溶解特性是由其成熟区域决定的。因此与BMP-2前肽(Gly²⁰-Arg²⁸²)相反，proBMP-2在无任何增溶剂时只在≤5的pH下以高浓度可溶。在酸性pH，不可能用蛋白酶(胰蛋白酶，PACE(成对碱性氨基酸转化酶；在成对碱性基元之后切割的真核生物内肽酶))来有效地加工前体形式。可是，为了使得蛋白水解切割能够发生，根据本发明可使用任何非抑制性增溶剂，尤其是分别为1-5M和0.1-2M的浓度使用尿素或三羟甲基氨基甲烷(Tris)，它们可以单独或者联合使用(优选的为2-4M尿素与0.1-1M Tris联合)。使用这些添加剂，就有可能将proBMP-2以≥1mg/ml的浓度甚至在使用蛋白酶的最佳pH(7-8)条件下保持在溶液之中。

透析适合用于调节蛋白质水解的缓冲条件。根据本发明，优选地使用类胰蛋白酶的蛋白酶，其使用的质量比为1∶10-1∶1000(胰蛋白酶，rh-proBMP-2)，优选的为1∶20-1∶100。将混和物孵育1分钟至24小时，优选为30分钟至6小时，其温度为0-37℃，优选10-25℃。在Tris的情况下，增溶剂本身作为缓冲物质起作用，且在尿素的情况下，以指定的浓度附加Tris缓冲液作为缓冲物质起作用。此外，高浓度的Tris，例如0.5M，可防止通过可能是由尿素形成的异氰酸盐所引起的氨基酸侧链的共价修饰。

将pH调整至对于相关蛋白酶有利的值，优选的为7-8。为了抑制由金属蛋白酶所引起的非特异性的蛋白水解性降解，根据本发明加入络合试剂如1-20mM EDTA是适宜的。通过加入一种或多种蛋白酶抑制剂或者通过用酸调整pH≤5来终止蛋白水解，蛋白酶抑制剂优选1-5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)或者相对于胰蛋白酶过量2-20倍摩尔的获自牛胰腺或大豆的胰蛋白酶抑制剂(BPTI/SBTI)[Rudolph等人，蛋白质折叠(Folding proteins)，in Protein Function：A PracticalApproach，T.E.Creighton(编者)，第二版，(1997)，57-99]。

成熟BMP-2(Gln²⁸³-Arg²⁹¹)的N末端是松散的，因此其对于蛋白酶敏感。另外，其含有一些精氨酸和赖氨酸残基(Arg²⁸⁹，²⁹¹，Lys²⁸⁵，²⁸⁷，²⁹⁰)。用优选在这些碱性氨基酸之后切割的胰蛋白酶进行限制性蛋白水解，因此也导致成熟BMP-2易变形的N末端的切除。结果产生的drBMP-2的生物活性在动物实验中得到了证实。根据本发明，视需要也有可能通过蛋白质工程来引入附加的二硫桥以用于固定和稳定成熟BMP-2的N末端，如在相关的TGF-β中存在的一样，这样做是为了保护BMP-2的肝素结合位点不被蛋白水解性降解。我们对于rh-proBMP-2限制性蛋白水解的实验在缺少根据本发明的增溶剂浓度而相应较低的蛋白质浓度情况下进行，其表明前肽由至少一个从成熟蛋白质切除后仍具有大部分蛋白酶抗性的区域组成。所使用的一些增溶剂本身在其使用浓度下具有部分弱的变性作用。其结果是，没有通过链内二硫桥来稳定的BMP-2前肽的结构不稳定、易受蛋白酶影响并因此能够在根据本发明的限制性蛋白水解的条件下降解。

由于天然BMP-2的极端疏水性[Scheufler等人，J.Mol.Biol.287(1999)，103-115]，通过疏水相互作用的纯化作为纯化蛋白水解产物的方法。根据本发明，为此目的优选地使用与已获得的drBMP-2牢固结合的柱材料，而其他降解产物和所用蛋白酶和/或抑制剂只与该材料发生弱的相互作用。依照本发明，可以在蛋白水解之后改变缓冲条件，以使drBMP-2沉淀出来，而其他降解产物、蛋白酶和/或其抑制剂继续存在于溶液之中。在drBMP-2与上清液分离之后，沉淀的drBMP-2接着可以在合适的缓冲液或溶剂中再次溶解。在合适的柱材料存在的情况下，这种对于沉淀条件的改变优选地通过透析来实现，合适的柱材料尤其为“Fractogel EMD苯基S”(Merck)或可相比的材料如苯基琼脂糖(Pharmacia)。如果该材料以极过量的方式使用，就有可能获得这样的情形，即在蛋白质聚集之前其就已经结合到该材料上去了。在以这样的方式将蛋白质装载到柱材料上之后，不希望的成分可以通过适当的洗涤步骤来去除。将drBMP-2在由温和至强的变性(但绝不是还原)条件下适当地进行洗脱。根据柱材料，合适的洗脱剂相应地为精氨酸、尿素或胍盐，它们在低浓度下也可用于洗涤柱材料。视需要，在洗脱之后，将含有drBMP-2的组分合并，且特别优选地用0.1％三氟乙酸(TFA)或乙酸铵进行透析，它们是对于BMP-2的最终应用非常合适的溶剂。根据本发明，还可以用反相材料(优选的为C₄-RP-HPLC)分离蛋白水解产物，该洗脱优选地在乙腈梯度中使用0.1％TFA来进行。

根据本发明复性的且在切除前序列之后获得的成熟BMP-2可以用于促进骨生长，该应用以为此目的所常用的方式进行。可是，令人惊讶的是，仍含有完整的前序列或截短的前序列的复性proBMP-2具有和成熟BMP-2相等的生物活性，其可以像成熟BMP-2一样使用。因此本发明的一个目标还涉及含有作为活性化合物的proBMP-2用于促进骨生长的药物。其可以含有完整的前序列或截短的前序列。根据本发明，优选地使用proBMP-2和各种医用植入材料的联合物用于发生于创伤、矫形、耳、鼻、喉外科和口腔与上颌面外科以及神经外科之中的临时性骨替代(骨替代材料)和永久性骨与关节替代(金属植入物，如髋和膝关节内用假体)。在此proBMP-2一方面可用作后加的植入物涂层，以薄的蛋白质膜的形式，用或不用粘合剂(如硅烷)粘附于所有的内和外表面。另一方面proBMP-2可用作植入物的整合组分，这是通过将其加入到通过化学聚合或固化作用制备的固体终产物的非固体前体(例如磷酸钙胶结材料，如Norian SRS、Ostim及其他)之中来实现的。

天然或人工来源的无机和有机材料以及这两种材料的混和形式均适合作为植入物用于短暂的骨替代。无机骨替代材料的实例为由羟磷灰石构成的陶瓷材料、β-磷酸三钙、α-磷酸三钙、玻璃陶瓷材料、生物玻璃、碳酸钙、硫酸钙和其他未列出的以结晶和无定形形式(包括基于磷酸钙的注射用骨胶结剂)存在的钙盐。合适的有机材料为胶原蛋白、骨组织、去矿物质的骨基质、可凝胶多糖(如透明质酸)、生物耐受的合成材料(如聚乳酸、聚丙烯酸甲酯、聚乙二醇)以及其他等等，其采用不同的混和形式和处理形式。内用假体和其他金属植入物(如那些用于脊柱固定的金属)适合用于永久性骨替代。通常在此涉及由各种不锈钢和钛合金组成的产物，其中的一些也可以拟定使用羟磷灰石涂层。

因此，本发明的其他目标为在成熟BMP-2上连接有完整或截短前序列的proBMP-2，含有该物质的药物以及如专利权利要求中所定义的用于生产促进骨生长药物的方法。proBMP-2的完整序列Gly²⁰-Arg³⁹⁶，包含20个氨基酸的His标签和起始密码子Met，在表2中显示。氨基酸Met¹至His²⁰为pET-15b所编码的His标签的组成部分。BMP-2的前序列开始于Gly²²。附加的甲硫氨酸位于His标签和前序列之间。这里描述的序列中的Gly²²-Arg³⁹⁸相应于人类preproBMP-2cDNA的主要翻译产物之中的Gly²⁰-Arg³⁹⁶，本文中的序列数据就是引入该cDNA的序列。

下面的实施例结合图示阐明了本发明。在这些图示中：

图1  SDS-PAGE电泳图谱。

图2  UV-CD光谱。

图3  各种情况下proBMP-2的发射光谱。

图4  SDS-PAGE电泳图谱。

图5  RP-HPLC层析谱。

图6  UV-CD光谱。

图7  各种情况下drBMP-2的MALDI-TOF质谱图。

图8  rh-proBMP-2的RP-HPLC图解。

图9  rh-proBMP-2植入物的组织切片。陶瓷的内和外表面都被骨物质所覆盖。孔的内部包含着含有许多脂肪细胞的骨髓(植入材料-深暗色，骨-亮蓝色)。在左下部可以看到一些肌肉纤维(暗蓝色)和结缔组织。

图10 rh-proBMP-2植入物在高放大率下的组织切片。骨物质(左上部至右下部，亮蓝色)和它所覆盖的陶瓷材料(右边，灰色)非常紧密地接触。活性成骨细胞成排地存在于骨物质和造血组织之间。

图11 在植入物中AP活性的比较。

实施例

实施例1：制备proBMP-2

将probmp-2 cDNA克隆进大肠杆菌表达载体中

由Novagen所提供的T7表达系统[Studier和Moffat，J.Mol.Biol.189(1986)，113-130]用于克隆probmp-2 cDNA。

将含有插入的preprobmp-2-cDNA的pcDNA3载体(Boehringer-Mannheim GmbH)用作为起始DNA。编码BMP-2的氨基酸Gly²⁰-Arg³⁹⁶的DNA通过聚合酶链反应(PCR)来获得。在此，使用诱变引物从而在5′-末端插入一个甲硫氨酸密码子作为翻译起始点，并且将3′-末端终止密码子转变为大肠杆菌典型性终止密码子以及用第二终止密码子来补充之。此外引物含有NdeI切割位点(5′-末端)和BamHI切割位点(3′-末端)。这使得随后在表达载体pET-15b(Novagen)中的克隆成为可能。该载体还编码了N末端6个组氨酸标签，其能够大幅提高在大肠杆菌中的表达率。

在克隆结束之后，通过DNA测序检查核苷酸序列[Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467]。

使用下面的引物：

正向引物“PrimerFwProBMP”：

             NdeI5′-cg gaa ttc  ca↓t atg ggt gcg gct ggc ctc gtt cc-3′

                  Met Gly Ala Ala Gly Leu Val

                  H₂N→

反向引物“PrimerRevBMP”：

      BamHI5′-cc  g↓ga tcc tta cta gcg aca ccc aca acc-3′

               Stp Stp Arg Cys Gly Cys Gly

               HOOC←

用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌株。这些细菌中的染色体含有T7-RNA-聚合酶基因，其在lac-启动子的控制之下。因此，聚合酶的表达可用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。probmp-2基因由T7启动子控制。用IPTG的诱导结果导致proBMP-2的形成。为了进一步增加表达率，将细胞用pUBS520进行共转化。该质粒含有在大肠杆菌中稀少的精氨酸-tRNA(dnaY)基因。而该tRNA所识别的精氨酸密码子(AGA和AGG)特别频繁地出现在真核生物基因中，在probmp-2中也是如此。除此之外，这些基因在大肠杆菌中的表达率依赖于该tRNA的可供性[Brinkmann等人，Gene，85(1989)，109-114]。

人proBMP-2在大肠杆菌中的表达

为了增殖重组体细菌菌株，向适当体积(通常为1.5L)的2·YT培养基中加入100μg氨苄青霉素/ml和50μg卡那霉素/ml，该培养基用单克隆接种。

2·YT培养基(1L)：

17g胰蛋白胨

10g酵母提取物

5g NaCl

培养物于37℃以160-200rpm进行摇动。用1mM 1PTG诱导培养物(OD₆₀₀为1-1.3)。然后于相同的温度再摇动3-4小时，如此可重复的细胞密度在诱导后达到OD₆₀₀3-3.5。通过在10,000g离心来收获细胞。这样，每1L培养基可以获得3-3.5g细胞(湿重)。作为对于即刻的细胞分解的一种可选方法，首先将细胞在液氮中冷冻，然后在-20℃冷冻。

包含体(IB)的分离

当重组体probmp-2表达时，聚集体如包含体(IB)在细菌细胞中形成。这些IB按照Rudolph等人在“蛋白质折叠”(“ProteinFunction：A Practical Approach”，T.E.Creighton(出版社)，第二版，(1997)，57-99)中所描述的方法进行制备。

各将5g细胞沉淀再次悬浮于25ml的100mM Tris/HCl pH7.0、1mM EDTA溶液中。每1g湿重细胞加入1.5mg溶菌酶之后，将细胞悬浮液于4℃孵育30分钟。最后，采用高压分散(Gaulin匀浆器)将细胞破裂。加入3mM MgCl₂和10μgDNA酶/ml之后，将匀浆在25℃下再孵育30分钟。然后加入0.5体积的60mM EDTA、6％Triton X-100、1.5M NaCl pH7.0，再于4℃下继续孵育30分钟从而溶解不溶的细胞组分。在这些条件下，IB保持不溶并可通过于39,000g离心来分离。为了再次从IB中除去过量的去污剂，用100mM Tris/HClpH7.0、20mM EDTA再洗涤IB 5次，最后将其等分并贮存于-20℃。

这样就可以可重复地从每1g经诱导的大肠杆菌细胞中获得180-210mg IB，其具有30-35％的蛋白含量并含有90-95％rh-pro-BMP-2。

IB的溶解

将100-150mg IB沉淀在1ml的100mM Tris/HCl pH8.0、6MGdmCl、100mM DTT、1mM EDTA溶液中于25℃溶解4小时。随后，用乙酸调整pH至3-4，通过于16,000g离心20分钟将不溶组分沉淀出来。然后将上清液在超速离心机中于266,000g再次离心30分钟，从而分离出微聚集体。蛋白质浓度通过于λ＝280nm测量吸收来测定[Gill和von Hippel，Anal.Biochem.，182(1989)，319-326]，其为30-52mg/ml。

proBMP-2的纯化

在此回收率(大约70％)与分析规模相当。

在1ml HiTrap肝素-琼脂糖(Amersham Pharmacia Biotech)上的肝素亲和层析用作第二个纯化方法。所使用的缓冲系统为：

-0.1mol/L Tris pH7.56、6mol/L尿素(缓冲液A)，和

-0.1mol/L Tris/HCl pH7.5、6mol/L尿素、1mol/L NaCl(缓冲液B)。

柱用超过10倍柱体积的缓冲液A平衡。用0-20％梯度的缓冲液B洗脱掉杂质。用20-50％梯度的缓冲液B以每分钟1毫升的流速在30分钟内分离开单体和二聚体proBMP-2。

以制备规模复性rh-proBMP-2

将含有4M GdmCl pH4的proBMP-2-IB溶解液稀释以便复性，从而溶解液经过在折叠缓冲液中的完全稀释之后，GdmCl的最终浓度达到50-60mM。proBMP-2的最终浓度为3-4μM(相当于135-180μg/ml)。

折叠缓冲液：

100mM Tris/HCl，pH8.0

1M L-精氨酸

5mM GSSG

2mM GSH

5mM EDTA

折叠缓冲液经过滤和脱气之后，将溶解液在搅拌的同时缓慢加入(约20ml/小时)，然后将混和物于5℃孵育7天。在此溶解液所带有的DTT残余物相当于至多0.4mM GSH的浓度。

折叠混和物采用交叉流过滤进行浓缩(Filtron Minisette，膜：30kDa开放通道)。然后将浓缩液用20倍体积的50mM乙酸钠(pH5.0)进行透析5次，每次24小时，随后聚集的蛋白质于75,000g离心2小时而沉淀出来。留在溶液中的蛋白质量通过λ＝280nm测量吸收来测定，根据最初所使用的IB溶解液的蛋白质含量，其可重复地为大约50％。

proBMP-2的纯化

RP-HPLC用于分析性或半制备性分离(不正确或正确折叠的)单体rh-proBMP-2和天然二聚体rh-proBMP-2。当分析规模时，使用蛋白质RP柱(150×3.6mm，YMC)，并用0.1％全氟丁酸(HFBA)的水或ACN溶液作为流动相(见图8)。单体和二聚体的分离也通过用三氟乙酸作为离子对形成剂来完成。由于其更高的疏水性，与在成熟BMP-2的情况下一样，二聚体在比单体或不正确折叠的单体在更晚的阶段洗脱。当半制备规模时，使用含有Source 15 RPC材料(Pharmacia)的柱。在此分离波形和回收率(大约70％)相似于分析规模。

rh-proBMP-2的鉴定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的纯度分析和分子量测定

SDS-PAGE分析表明根据本发明所制备的proBMP-2 IB具有高纯度(≥90％；图1，泳道2-5)，这意味着可以不经任何预纯化而将它们用于复性。

在非还原性条件(添加碘乙酰胺导致游离硫醇基不可逆的氧化性修饰)下进行的SDS-PAGE显示出经复性的proBMP-2展现了高度的共价二聚体化(≥90％)，其表明正确地形成了二硫桥以及因此形成了蛋白质的天然结构(图1，泳道6)。

N末端序列分析

在完成SDS-PAGE和PVDF膜上的蛋白质印迹法之后，进行N末端测序[Edman和Begg，Eur.J.Biochem.1(1967)，80-91]。在复性的proBMP-2的情况下，测序得到下列氨基酸序列：Gly-Ser-Ser-His-His-。

这相当于切除起始甲硫氨酸后具有组氨酸标签的重组体proBMP-2的N末端。

圆二色谱法和荧光光谱法

对于复性的proBMP-2和再次变性的proBMP-2所进行的荧光光谱和CD光谱分析清晰地表明二级和三级结构的存在。通过复性的和变性的proBMP-2在远UV-CD光谱中大约λ＝220nm区域内椭圆率之间的明显差异，可以推断在根据本发明的复性过程中形成了二级结构元件。和变性蛋白质相比较，复性proBMP-2的荧光发射最大值向更低波长偏移(图3)，这对于天然三级结构的形成是典型的特征。在此蛋白质的色氨酸残基(每个proBMP-2多肽链有5个色氨酸)经过溶剂的极性环境进入折叠蛋白质的非极性中心，在那里它们在空间上也是固定的。这样就减少了激发能的损失，从而导致发射出更高频率的光[Schmid：“光学光谱学用于鉴定蛋白质构象和构象改变(Optical spectroscopy to characterize protein conformationand conformational changes)”，Protein Structure：APractical Approach，T.E.Creighton(出版社)，第二版，(1996)，261-297页]。从荧光光谱中还清晰地显示出在低pH中proBMP-2结构经历的变化，即为成熟BMP-2和proBMP-2具有高度溶解性的区域。根据我们的实验所表明的，这可能归因于部分地未折叠的前肽(未显示数据)。

MALDI-TOF质谱分析法和N末端序列分析

-表观分子量：89803.0078Da-见图7

-计算的分子量(不包括起始甲硫氨酸)：89801.2Da

rh-proBMP-2和rh-drBMP-2的生物活性

经修饰的rh-proBMP-2和rh-drBMP-2蛋白质的骨诱导活性在使用小实验室动物的异位骨诱导模型中进行检测。对此，将规定数量的用于测试的指定因子在经过过滤灭菌之后(40-200μg；drBMP-2或proBMP-2)应用于无菌的、立方形的、在化学和药理学上惰性的β-TCP陶瓷植入基体上。

植入物规格

厂商          -Fa.Mathys，Bettlach，Switzerland

商品名        -chronOs

相纯度        -＞95％β-TCP

孔体积份额    -72+/-6％

孔大小        -80-650μm

孔结构        -互相连接

硬度          -7.7+/-1.2MPa

将包覆有因子的植入物和没有包覆因子但在其他方面同样处理的对照植入物移植入8只完全长大的实验室大鼠的前腹壁肌肉组织中。对此，将大鼠麻醉之后，在皮肤内制造几个大约1cm长的外科切口，最上面的肌肉层位于其下。通过无出血性手术在腹部肌肉层的两个斜肌之间产生一个空腔，随后将植入物放入该空腔内并用外科缝合线缝合伤口。30天放置期后，处死动物，然后将植入物连同周围组织一起切除，并用显微镜和组织学手段检查骨新生状况。在所有包覆有因子的植入物的情况下，在组织学上可以清楚地观察到骨新生，同时伴随着具有造血活性的骨髓的形成(见图8和9)。因此，在二者因子的情况下(在proBMP-2情况下为16/16；在drBMP-2情况下为8/8)，生物活性分别为100％。所以，可以通过通常不能形成骨的肌肉组织中骨组织的形成明确地提供骨诱导活性的证据。在组织学结果中不能观察到proBMP-2和成熟drBMP-2之间任何性质上的差异。对照植入物绝没有导致任何骨新生。相反地，它们只是被包围于结缔组织之中。

通过测量植入物中碱性磷酸酶(AP)的活性提供了在rh-proBMP-2或rh-drBMP-2的影响下新生活性骨组织的进一步证据。为了进行此程序，每个植入物的一半在取出之后立即进行深度冷冻，并贮存于-80℃。为了提取碱性磷酸酶和测定其酶活性，将植入物解冻，并于pH7.4的0.1M Tris/HCl、1％Triton X-100(4℃)中用Potter S匀浆器(B.Braun Biotech)将其破碎，然后将不溶解的组分通过离心分离除去。随后将澄清的上清液用于测定碱性磷酸酶活性，该测定使用Ecoline 25(Merck)测试试剂盒。对于在该测试中释放的4-硝基酚的浓度于25℃和λ＝405nm进行5分钟监测，并用等

式1计算酶活性

$\mathrm{Akt}:=\frac{\mathrm{Vb}+\mathrm{Vs}}{\mathrm{\ϵ}\·\mathrm{Vs}\·d}\·\frac{\mathrm{\ΔE}}{t}\·1000----\left(1\right)$

其中Vb为缓冲液的体积(1ml)，Vs为样品体积(25ml)。依照厂商的说明，4-硝基酚的摩尔吸收系数采用ε＝18,518 L×mol^-1×cm^-1。结果所得活性的单位为μmol×min^-1×ml^-1。测试结果总结在表1和图10中。虽然含有rh-pro/drBMP-2样品中的酶活性与(-)对照相比有显著的增加，但是rh-drBMP-2样品的酶活性与含有rh-proBMP-2的样品相比只是略有增加，不是每种情况下都如此(例外：动物4、6和8)。考虑到rh-proBMP-2(大约45kDa)和rh-drBMP-2(大约12kDa)不同的分子量以及这样的事实，即rh-proBMP-2样品不是以纯化的形式使用，因此仍然以可达10％的比例含有不正确折叠的单体种类，所以可以作出以下结论，在该动物模型中，rh-proBMP-2具有可与蛋白质(截短)成熟形式相比的诱导骨新生的活性。表1：在用drBMP-2或proBMP-2包覆的β-TCP植入物中碱性磷酸酶活性(U)的比较

动物	对照	drBMP-2	proBMP-2(a)	proBMP-2(b)
					1	0.0009	2.1162	1.1654	1.049
2	0.0232	1.3459	0.7443	0.9126
					3	0.017	2.5307	1.3521	1.4508
4	0.0036	1.0461	1.1934	1.262
					5	0.0118	1.3884	1.0472	0.6895
6	0.0142	0.9195	1.7609	1.257
					7	0.0112	1.776	1.4601	1.1126
8	0.0149	0.7044	1.6968	1.053

实施例2：生物活性drBMP-2的获得

rh-proBMP-2的限制性蛋白水解

用于制备型蛋白水解rh-proBMP-2，将50ml复性的蛋白质用0.1M Tris/HCl pH7.0、4M尿素、1mM EDTA进行透析。聚集体通过离心(75,000g，1小时)分离，并用分光光度法测定蛋白质浓度(1.3mg/ml)。归因于透析的损失总计为13％。胰蛋白酶(RocheDiagnostics)以1∶100(胰蛋白酶：proBMP-2；w/w)的比例使用，并将混和物于5-7℃孵育4小时。用8倍摩尔过量的大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI；Sigma)将胰蛋白酶失活。将全部混和物在疏水性柱材料(20ml Fractogel-苯基，Merck)存在的条件下用无尿素缓冲液(0.1M Tris/HCl，pH7.0)进行透析。将按照此法装载了drBMP-2的柱材料装填进空柱子(XK-16，Pharmacia)中，然后用下列溶液洗涤：

·5CV(柱体积)的低盐缓冲液(透析缓冲液)，

·5 CV的50mM乙酸钠，pH5.0，

·2 CV的50mM乙酸钠，pH5.0，4M尿素，和

·2 CV的50mM乙酸钠，pH5.0，1M L-精氨酸。

柱子用6M GdmCl、0.2M乙酸洗脱。将含有drBMP-2的部分合并，然后用0.1％TFA进行透析。不可能观察到任何聚集体的形成。透析液通过过滤灭菌，并用分光光度法测定蛋白质浓度(1.3mg/ml)。以这种方法所获得的BMP-2的产率基于用于限制性蛋白水解的复性液为大约50％。因此，从1L大肠杆菌培养物中可获得17mg具有生物活性的drBMP-2，或者从1g(湿重)经诱导的大肠杆菌细胞中获得5.2mgdrBMP-2(相当于5.6mg包含N末端肝素结合位点的成熟BMP-2)。相反地，使用Ruppert等人[Eur.J.Biochem.237(1996)，295-302]所描述的方法，每1g细胞只能获得0.2mg BMP-2。

drBMP-2的鉴定

通过N末端测序来分析蛋白水解产物

在完成SDS-PAGE和PVDF膜上的蛋白质印迹法之后，进行N末端测序[Edman和Begg，Eur.J.Biochem.1(1967)，80-91]。测序提供了下列根据本发明所产生的drBMP-2的氨基酸序列：

a)Leu-Lys-Ser-Ser-Cys-Lys-Arg-

b)Lys-Arg-Leu-Lys-Ser-Ser-Cys-

c)Arg-Leu-Lys-Ser-Ser-Cys-Lys-

不同种类相互间的比例为大约3∶2∶1(a∶b∶c)。虽然不能检测半胱氨酸，但是可以检测跟随其后的氨基酸。可是，该序列是在DNA水平上完全验证的。其相当于无肝素结合位点的成熟BMP-2的N末端。drBMP-2以还原形式和非还原形式用于测序。非还原形式只可能测序至第二个丝氨酸，这暗示了随后的残基为胱氨酸，其为二硫桥的组分。综上所述，蛋白水解产物因此相当于在N末端被截短了7-9个氨基酸从而缺少肝素结合位点的成熟BMP-2。

在这里所描述的限制性蛋白水解条件下，未形成二硫桥的肽链被降解，这意味着，最终只获得了100％共价二聚体化的drBMP-2。

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和HPLC来分析drBMP-2的纯度

根据本发明所获得的drBMP-2的大小和纯度的检测方法为，在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE，然后进行银染(图4中的泳道6和11)。其为100％的二聚体化和超过95％的纯度。

另外，用反相高效液相层析(RP-HPLC；Vydac C₄)来检查drBMP-2的纯度和同质性。在该实验中，drBMP-2在46.57％乙腈和0.1％TFA的同一峰中洗脱下来(图5)，这为蛋白质具有相同的结构(尤其是二硫桥)提供了支持。

圆二色谱法

由于复性的和变性的drBMP-2，尤其是还原的和变性的成熟BMP-2(IB溶解液)，在远UV CD光谱中210-230nm区域内的椭圆率之间存在明显的差异(图6)，因此可以作出以下结论，在根据本发明用于复性前体蛋白质的方法中，在蛋白质的成熟区域内也形成了二级结构元件。

                        表2

涉及：3字母密码子的proBMP(包括20AA的His标签)MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHisMetGlyAlaAlaGlyLeuValProGluLeuGlyArgArgLysPheAlaAlaAlaSerSerGlyArgProSerSerGlnProSerAspGluValLeuSerGluPheGluLeuArgLeuLeuSerMetPheGlyLeuLysGlnArgProThrProSerArgAspAlaValValProProTyrMetLeuAspLeuTyrArgArgHisSerGlyGlnProGlySerProAlaProAspHisArgLeuGluArgAlaAlaSerArgAlaAsnThrValArgSerPheHisHisGluGluSerLeuGluGluLeuProGluThrSerGlyLysThrThrArgArgPhePhePheAsnLeuSerSerIleProThrGluGluPheIleThrSerAlaGluLeuGlnValPheArgGluGlnMetGlnAspAlaLeuGlyAsnAsnSerSerPheHisHisArgIleAsnIleTyrGluIleIleLysProAlaThrAlaAsnSerLysPheProValThrArgLeuLeuAspThrArgLeuValAsnGlnAsnAlaSerArgTrpGluSerPheAspValThrProAlaValMetArgTrpThrAlaGlnGlyHisAlaAsnHisGlyPheValValGluValAlaHisLeuGluGluLysGlnGltValSerLysArgHisValArgIleSerArgSerLeuHisGlnAspGluHisSerTrpSerGlnIleArgProLeuLeuValThrPheGlyHisAspGlyLysGlyHisProLeuHisLysArgGluLysArgGlnAlaLysHisLysGlnArgLysArgLeuLysSerSerCysLysArgHisProLeuTyrValAspPheSerAspValGlyTrpAsnAspTrpIleValAlaProProGlyTyrHisAlaPheTyrCysHisGlyGluCysProPheProLeuAlaAspHisLeuAsnSerThrAsnHisAlaIleValGlnThrLeuValAsnSerValAsnSerLysIleProLysAlaCysCysValProThrGluLeuSerAlaIleSerMetLeuTyrLeuAspGluAsnGluLysValValLeuLysAsnTyrGlnAspMetValValGluGlyCysGlyCysArg

Claims (50)

1.重组地制备TGF-β超家族的生物活性蛋白质的方法，其特征在于，

(a)一种蛋白质，其氨末端由一种TGF-β超家族蛋白质的前序列或部分所述前序列组成，该氨末端与此种或另一种TGF-β超家族蛋白质的成熟区域连接，该蛋白质与成熟BMP-2至少有35％同源性，在至少部分蛋白质能以包含体的形式而获得的条件下将所述蛋白质于原核生物中进行表达；

(b)分离包含体并在变性条件下溶解；

(c)将从包含体中溶解的、变性的、单体的和无生物活性的蛋白质复性，使之通过折叠和二聚体化能够形成可溶的、有生物活性的构象；和

(d)如果必要，在复性之后经蛋白质水解将成熟蛋白质从其前体形式中释放出来。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备了drBMP-2。

3.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，为了在原核生物中增加表达的目的，前体蛋白质用氨末端亲和标签尤其是聚组氨酸序列加以修饰。

4.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，pET载体尤其是pET-15b用作表达载体。

5.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，优化表达构建体中密码子的选择以适于在宿主生物中的翻译。

6.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，宿主生物中稀少的并对于翻译表达构建体所需的tRNA也是过量表达的。

7.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，过量表达用BL21(DE3)中的T7表达系统来实现，以及大肠杆菌中稀少的精氨酸tRNA(dnaY)基因与该表达构建体共转化。

8.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，采用高压分散、酶裂解或超声波将细胞破碎。

9.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，通过用含有去污剂的溶液洗涤来纯化包含体，去污剂的浓度经过选择因此能够溶解干扰的细胞蛋白质和膜成分而不溶解包含体。

10.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，去污剂为Triton X100。

11.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，离液序列高的物质或者离液序列高的物质的联合物用于溶解包含体。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所使用的离液序列高的物质为3-8M浓度的氯化胍或者6-10M浓度的尿素。

13.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，溶解在还原条件下进行。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所使用的还原试剂为二硫苏糖醇和/或β-巯基乙醇。

15.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，溶解之后共价修饰游离的半胱氨酸。

16.根据权利要求13-15中任何一项所述的方法，其特征在于，溶解之后除去还原试剂。

17.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，溶解之后在变性条件下进行预纯化。

18.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，通过降低变性试剂的浓度至无变性作用或只有弱变性作用的水平来复性前体蛋白质。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，通过缓慢地连续或逐步在复性缓冲液中稀释溶解液来降低变性试剂的浓度。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，稀释期间进行尽可能彻底的混和，如通过搅拌。

21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，通过用复性缓冲液透析溶解液来降低变性试剂的浓度。

22.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，使用具有中性至碱性pH的复性缓冲液。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，复性缓冲液含有L-精氨酸。

24.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，复性缓冲液含有至少一种还原和氧化形式的硫醇成分。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，硫醇成分为GSH/GSSH。

26.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，结束复性程序之后，将样品用酸性缓冲液进行透析。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，透析之前，将样品在透析前用酸性缓冲液浓缩。

28.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，将不溶于酸的组分分离。

29.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，用层析法纯化前体形式。

30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，采用RP-HPLC来进行纯化。

31.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，采用肝素亲和层析来进行纯化。

32.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，使用蛋白酶切割前体形式从而形成生物活性形式。

33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所使用的蛋白酶为激素原转化酶。

34.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，使用识别成对碱性序列基元的蛋白酶。

35.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，优选使用在P1位点(直接在切割位点的氨末端)为碱性残基的蛋白酶。

36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，用胰蛋白酶进行切割。

37.根据权利要求32-36中任何一项所述的方法，其特征在于，添加至少一种蛋白酶抑制剂以限制蛋白水解。

38.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，在发生切割的pH下使用不抑制酶的增溶剂来增加释放出的蛋白质的溶解性。

39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所使用的增溶剂为三羟甲基氨基甲烷和/或尿素。

40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，使用0.1-2摩尔的三羟甲基氨基甲烷和/或1-5摩尔的尿素。

41.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，采用沉淀和/或疏水性层析来纯化成熟或截短的成熟蛋白质。

42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，进行等电沉淀，并将沉淀下来的蛋白质再次溶解在酸性溶液中。

43.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，通过降低增溶剂的浓度来进行沉淀。

44.根据权利要求41-43中任何一项所述的方法，其特征在于，沉淀条件设定在层析材料存在的情况下。

45.根据权利要求1中a至c所获得的BMP-2前体形式对于生产药物的用途。

46.根据权利要求45所述的用途，用于生产促进骨愈合过程和骨新生过程的药物。

47.使用权利要求1的方法可以获得proBMP-2，其具有表2中氨基酸序列Gly²⁰-Arg³⁹⁶和同样的但缺少部分前序列Gly²⁰-Arg²⁸²的序列。

48.用于促进骨生长的组合物，其特征在于，含有根据表2具有完整的或截短的前序列Gly²⁰-Arg²⁸²的proBMP-2作为活性化合物。

49.用于生产可促进骨生长的组合物的方法，其特征在于，将根据表2具有完整的或截短的前序列Gly²⁰-Arg²⁸²的proBMP-2在适于施用的制剂之中配制。

50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，包括含有生理耐受的载体材料的制备，该材料用proBMP-2活性物质包覆或浸渍。

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