JP2006508049A

JP2006508049A - 増殖因子βタンパク質を形質転換するための可溶化賦形剤としてのペプチド

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Publication number: JP2006508049A
Application number: JP2004528060A
Authority: JP
Inventors: ピラリンイー．エル．ニコルス，; ベルナルドペレツ−ラミレツ，
Original assignee: ワイエス
Priority date: 2002-08-13
Filing date: 2003-08-12
Publication date: 2006-03-09
Also published as: EP1542711A2; US20040102378A1; IL166699A0; US7638495B2; WO2004014940A2; AU2003259765A1; MXPA05001734A; US20070244050A1; US7241740B2; CN1735426A; BR0313429A; CA2495222A1; EP1542711A4; WO2004014940A3; AU2003259765B2

Abstract

本発明は、タンパク質に対する賦形剤または可溶化剤を含有する組成物に関する。本発明は、ｒｈＢＭＰ２のＴ２６６イソ型のＮ末端伸長に由来するペプチドが、タンパク質の溶解性を増強する特性を有するという発見に関する。本発明はまた、ｒｈＢＭＰ−２のＴ２６６イソ型の１７アミノ酸伸長から構成されるペプチドと、タンパク質を接触することにより、沈殿したタンパク質を再可溶化する方法に関する。本発明はまた、ｒｈＢＭＰ−２のＴ２６６イソ型の１７アミノ酸伸長から構成されるペプチドと、タンパク質を接触することにより、タンパク質の溶解性を増強する方法に関する。

Description

本発明は、一般に、タンパク質を可溶化する賦形剤および薬剤に関する。特に、本発明は、種々の生物化学的条件下で、タンパク質の溶解性を維持するかまたは増大するための組成物および方法に関する。本発明はまた、溶液から沈殿したタンパク質を再可溶化する方法および組成物に関する。特定の局面では、本発明は、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属するタンパク質の溶解性を維持するか、または増大するための組成物および方法に関する。

（発明の背景）
ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、脊椎動物および無脊椎動物の双方で見出される２５個より多い種々のシグナルタンパク質からなる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質メンバーは、多種多様な生物学的プロセス（細胞増殖、細胞増殖阻害、組織修復、細胞分化、アポトーシス、背側−腹側の胚の体軸の確立および細胞外マトリクス成分の分泌が挙げられる）に作用する（Ｅｂｅｎｄａｌら、１９９８、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ５１：１３９）。従って、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、スーパーファミリーの１つ以上のメンバーの活性により影響される多種多様なヒト疾患および状態を処置するために使用され得る薬学的なアゴニストおよびアンタゴニストの開発に対する魅力的な標的を提供する。例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのアンタゴニストおよびアゴニストは、組織修復および再生の部位、ならびに、好ましい系統の細胞または組織への多能性幹細胞の分化の部位において、実際に適用される。さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーはまた、遺伝子治療に対する標的を提供する。このファミリーの多数のメンバーのクローニングおよび発現が、記載されている（例えば、米国特許第４，８７７，８６４号、同第５，１０８，９２２号、同第５，０１３，６４９号、同第５，１１６，７３８号、同第５，１０６，７４８号、同第５，１８７，０７６号、同第５，１４１，９０５号、同第５，６８８，６７８号、同第５，６６１，００７号、同第５，６３７，４８０号、同第５，６３９，６３８号、同第５，６５８，８８２号および同第５，６３５，３７２号を参照のこと）。

ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの内の１つは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である。ＢＭＰは、軟骨形成および骨形成の調節因子として最初に同定された。その後の研究は、ＢＭＰが、他のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーと同様に、胚形成ならびに種々の器官および組織の形態形成を含む、多数の種々の生物学的プロセスにおいて役割を果たすことを示した。さらに、ＢＭＰはいくつかの異なる細胞型（例えば、造血細胞、上皮細胞、間葉細胞および神経細胞）の増殖、分化および走化性に役割を果たす（Ｒｅｄｄｉ、１９９８、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：２４７；Ｅｂｅｎｄａｌ、前出）。

ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーと同様に、異なる動物種にわたって、高度に保存されている。例えば、成熟ヒトＢＭＰ−２は、マウスＢＭＰ−２およびラットＢＭＰ−２と完全に相同である。ＢＭＰ−２の生物学的に活性な形態は、１１４アミノ酸のジスルフィド結合したカルボキシ末端ドメインからなるホモ二量体である。ＢＭＰ−２は、ヘテロオリゴマーからなる細胞表面レセプターに結合することによって、標的細胞にその効果を及ぼす。このレセプターは、２つのセリン／スレオニンキナーゼレセプターの複合体である（Ｅｂｅｎｄａｌ、前出；Ｒｅｄｄｉ、前出を参照のこと）。

ＢＭＰ−２のヒトホモログは、クローニングされている（Ｗｏｚｎｅｙ、１９８９、Ｐｒｏｇ．ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｓ．１（４）：２６７）。組換えヒトＢＭＰ−２は、アミノ酸２６６〜３９６またはアミノ酸２８３〜３９６のいずれかからなる全長ＢＭＰ−２のフラグメントとして発現され得る。このフラグメントは、６個の異なるイソ型を生じるホモ二量体およびヘテロ二量体の両方を形成する。６個のイソ型二量体は、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３、Ｑ２８３／Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｔ２６６、Ｑ２８３／Ｔ２６６およびＴ２６６／Ｔ２６６と表示され、カチオン交換クロマトグラフィーによって分離され得る（図１）。数２８３または２６６とは、全長ｒｈＢＭＰ−２のＮ末端アミノ酸位置をいう。文字は、Ｎ末端のアミノ酸（すなわち、ＱまたはＴ）をいい、そして、「＜」とは、ピログルタミン酸を形成する２８３位のグルタミン（Ｑ）の環化をいう。従って、例えば、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３とは、二量体の１つの単量体が、環化したＮ末端グルタミンを有し、そしてもう１つの単量体は有さないｒｈＢＭＰ−２ジスルフィド結合二量体をいう。

ｒｈＢＭＰ−２は、骨の再生を必要とするいくつかの臨床用途を有する。従って、ｒｈＢＭＰ−２は、変性円板疾患を処置するための脊椎固定術に使用され得る。ｒｈＢＭＰ−２はまた、長骨骨折を処置するために使用され得る。それはまた、移植物を支持する十分な骨量を欠如し、入れ歯を必要とする個体を処置するために使用され得る。

タンパク質の溶解性を維持することは、多くの場合、タンパク質のバイオアベイラビリティーおよび／またはタンパク質の活性を維持するために重要である。タンパク質溶解性は、種々の因子に依存する。これらの因子としては、ｐＨ、塩濃度、温度および溶媒の化学的特徴ならびに、目的のタンパク質の本質的な特徴（例えば、一次アミノ酸配列およびタンパク質の高次構造）のような環境条件が挙げられる。多くの場合、目的のタンパク質に関する生物医学的用途および／または薬理学的用途は、目的のタンパク質の溶解性を最適化しない環境条件を必要とする。タンパク質の沈殿は、結果であって、そのため、目的のタンパク質のバイオアベイラビリティーおよび／または活性を制限する。従って、本発明の１つの目的は、目的のタンパク質（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）の溶解性を増加させ、それによって、その薬学的組成物もしくは研究試薬のどちらかとしてのバイオアベイラビリティーおよび／または活性を増加させることである。

本発明は、ｒｈＢＭＰ−２の種々のペプチドフラグメントが、タンパク質（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）の溶解性を増加させ、そして／または、その沈殿を阻害することを示すことによって、タンパク質の溶解性の増加または沈殿の阻害の目的を達成する。

（発明の要旨）
本発明は、組換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）およびそのフラグメントのＴ２６６イソ型のＮ末端の１７アミノ酸伸長が、タンパク質（例えば、ｒｈＢＭＰ−２）の溶解性を増加し、そして／または、タンパク質の沈殿を阻害するという発見に関する。本発明はまた、ｒｈＢＭＰ−２のＴ２６６イソ型のＮ末端１７アミノ酸伸長が、溶液から沈殿したタンパク質を再可溶化し得るという発見に関する。従って、本発明は、薬学的組成物または研究試薬の中での目的のタンパク質の溶解性を維持するかまたは増加させるための賦形剤として使用され得る。本発明はまた、溶液から沈殿したタンパク質を再可溶化するために、使用され得る。

従って、本発明は、目的のタンパク質の溶液からの沈殿を阻害し、そして／または溶解性を増加させるｒｈＢＭＰ−２のＴ２６６イソ型のＮ末端１７アミノ酸伸長、またはその
フラグメントを含有する組成物に関する。１つの実施形態では、目的のタンパク質は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−６）である。別の実施形態では、目的のタンパク質は、ｒｈＢＭＰ−２イソ型（例えば、Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３およびＱ２８３／Ｑ２８３）の任意の１つである。

本発明はさらに、ｒｈＢＭＰ−２のＴ２６６イソ型のＮ末端１７アミノ酸伸長をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）、またはそのフラグメントを含有する組成物に関し、この組成物は、溶液からの沈殿を阻害し、そして／または、目的のタンパク質の溶解性を増加させる。一つの実施形態において、目的のタンパク質は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−６）である。別の実施形態において、目的のタンパク質は、ｒｈＢＭＰ−２イソ型（例えば、Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３およびＱ２８３／Ｑ２８３）の任意のタンパク質である。

本発明はまた、溶液からの目的のタンパク質の沈殿を阻害し、そして／または、目的のタンパク質の溶解性を増加させる方法に関する。上記方法は、上記タンパク質の沈殿を阻害するのに十分な量で、目的のタンパク質をペプチドまたはそのフラグメントと接触させる工程を包含し、ここで、上記ペプチドは、Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１）を含む。１つの特定の実施形態では、ペプチドは、上記タンパク質の沈殿を阻害するために十分な量で、ＡＣＧＴＴＴＧＧＣＣＡＣＧＡＣ
ＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧ
ＡＡＡＡＧＡ（配列番号２）を含むＤＮＡ配列によってコードされる。目的のタンパク質は、任意のタンパク質であってもよい。１つの実施形態において、目的のタンパク質は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−６）である。別の実施形態では、目的のタンパク質は、Ｑ２８３または＜Ｑ２８３からなるｒｈＢＭＰ−２イソ型サブユニットの少なくとも１つである。

本発明のさらなる目的および利点は、以下の記述に一部示され、そして、一部は記述から明らかになるか、または本発明の実施を通して明らかになる。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘した要素および組合せの手段によって、認識され、達成される。

前述の一般的な記述および以下の詳細な説明は、両方とも例示的であって、説明的でしかなく、特許請求した発明を制限しないことが理解される。

添付の図面は、本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成し、そして、記述と合わせて、発明の原理を説明するのに役立つ。

（実施形態の記述）
本発明は、ｒｈＢＭＰ−２に由来するペプチドおよびそのフラグメントが、ｒｈＢＭＰ−２の種々のイソ型の溶解性を増加するという驚くべき発見に基づく。ペプチドは、ｒｈＢＭＰ−２（配列番号１）のアミノ酸２６６〜２８２を含む。フラグメントは、配列番号１の少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸である。このペプチドはまた、ｒｈＢＭＰのＴ２６６イソ型のＮ末端１７アミノ酸伸長として公知である。

ｒｈＢＭＰ−２の６個の二量体イソ型が存在する。６個のイソ型としては、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３、Ｑ２８３／Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｔ２６６、Ｑ２８３／Ｔ２６６およびＴ２６６／Ｔ２６６が挙げられる。Ｔ２６６／Ｔ２６６二量体イソ型は、硫酸ナトリウムの存在下では、非常に可溶性であるが、その生物活性は、他のイソ型と比較して限定されている。Ｔ２６６／Ｔ２６６イソ型は、塩を含まない緩衝液または低塩緩衝液中に透析した場合、可溶化されたままであるが、＜Ｑ２８３またはＱ２８３のいずれかのイソ型サブユニットを含む二量体は、塩を除去するための透析の間に沈殿する。Ｑ２８３および＜Ｑ２８３イソ型サブユニットは、Ｎ末端のアミノ酸２８３で、切断されている。従って、Ｑ２８３イソ型サブユニットは、インビボでイソ型であることが見出されているＢＭＰ−２のアミノ酸２８３〜３９６を含む。２８３イソ型サブユニットは、Ｎ末端１７アミノ酸伸長を含まず、すなわち、アミノ酸２６６〜２８２は、Ｔ２６６イソ型サブユニットで見出される。

１７アミノ酸伸長が、Ｔ２６６イソ型に存在する場合、それは、ｒｈＢＭＰ−２の溶解性を増加させる。さらに、Ｔ２６６イソ型のＮ末端１７アミノ酸は、沈殿したｒｈＢＭＰ−２のイソ型を再可溶化させ得る。驚くべきことに、ｒｈＢＭＰ−２のＴ２６６イソ型の２６６〜２８２のＮ末端伸長由来のフラグメントはまた、ｒｈＢＭＰ−２の溶解性を増大させ、そして、沈殿を阻害する。

従って、本発明の１つの実施形態は、薬学的組成物または研究試薬として使用するためのより活性な形態のｒｈＢＭＰ−２の、溶解性を増大させる方法、沈殿を阻害する方法、および再可溶化させる方法を提供する。本発明の別の実施形態は、ｒｈＢＭＰのＴ２６６イソ型由来のペプチドを含有する組成物を提供し、前記ペプチドは、目的のタンパク質の溶解性を増大させ、そして／または、目的のタンパク質の沈殿を阻害し、そして／または、溶液から沈殿した目的のタンパク質を再可溶化する。このような１つの実施形態では、本発明の組成物は、ｒｈＢＭＰ−２（配列番号１）のＴ２６６イソ型のＮ末端１７アミノ酸伸長を含有する。別の実施形態では、本発明は、配列番号１のフラグメントを含み、そのフラグメントは、例えば、配列番号１のアミノ酸６〜１７、配列番号１のアミノ酸１１〜１７または配列番号１のアミノ酸１４〜１７を含むが、これらに限定されない。これらのフラグメントは、目的のタンパク質と接触する場合に、目的のタンパク質の溶解性を増大させ、そして／または、目的のタンパク質の沈殿を阻害し、そして／または、目的のタンパク質が溶液から沈殿した後に、そのタンパク質を再可溶化する。当業者は、配列番号１のフラグメントが目的のタンパク質の溶解性を増大させ、または、目的のタンパク質の沈殿を阻害し、または、目的のタンパク質を再可溶化させることを確認するために、当業者は、目的のタンパク質を配列番号１のフラグメントと接触させて、および接触させずに、または接触の前および後に、目的のタンパク質の溶解性を比較するか、または、目的のタンパク質の沈殿を比較するか、または、目的のタンパク質の再可溶化を比較する。

１つの実施形態において、溶解性は、１ｃｍの経路長を有する石英キュベット中で測定する場合、０．１以下の３４０ｎｍの波長で分光光度計により測定した光学濃度を有するとして定義される。分光光度計は、例えば、ＨｉｔａｃｈｉＵ−２０００であり得る。

本発明の１つの実施形態において、配列番号１によってコードされるペプチドまたは配列番号１によってコードされるペプチドのフラグメントは、目的のタンパク質と接触させる場合、より可溶性になり、そして／または、より沈殿しにくくなり、そして／または、上記タンパク質が既に沈殿している場合、再可溶化される上記目的のタンパク質を生じる。

代替的な実施形態では、配列番号２を含むＤＮＡ配列によってコードされるペプチドまたは配列番号２を含むＤＮＡ配列によってコードされるペプチドのフラグメントは、目的
のタンパク質と接触させる場合、より可溶性になり、そして／またはより沈殿しにくくなり、そして／または、上記タンパク質が既に沈殿している場合、再可溶化される上記目的のタンパク質を生じる。

遺伝子コードの既知の縮重に起因して、１つより多いコドンが同一のアミノ酸をコードし得るので、ＤＮＡ配列は、配列番号２に示されたＤＮＡ配列とは異なり得、そして、なお、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。このような改変ＤＮＡ配列は、サイレント変異（例えば、ＰＣＲ増幅の間に生じる）に起因し得るかまたは、天然配列の意図的な変異形成の産物であり得る。

従って、本発明は、以下：（ａ）配列番号２のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｃ）適度なストリンジェンシーの条件下で、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズし得、かつ、本発明のペプチドの機能特性（すなわち、目的のタンパク質の溶解性を増大させるかまたは、目的のタンパク質を再可溶化する）を有するペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）高ストリンジェンシーの条件下で、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズし得、かつ、本発明のペプチドの機能特性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に定義されるＤＮＡに対する遺伝子コードの結果としての縮重であって、かつ、本発明のペプチドの機能特性を有するペプチドをコードするＤＮＡから選択される、本発明のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。言うまでもなく、このようなＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドは、本発明に含まれる。

本明細書中で使用される場合、適度なストリンジェンシーの条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づいて、当業者によって容易に決定され得る。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版第１巻、ｐｐ．１．１０１−１０４、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）によって示され、ニトロセルロースフィルターに対する予洗溶液（５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ＰＨ８．０）の使用、約４２℃での約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中のＳｔａｒｋ溶液のような他の類似のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダーゼーション条件、そして、約６０℃での０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件を包含する。高ストリンジェンシーの条件はまた、例えば、ＤＮＡの長さに基づいて、当業者によって容易に決定され得る。一般的に、このような条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義され、約６８℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を伴なう。当業者は、必要な場合、プローブの長さのような因子に従って、温度および洗浄溶液の塩濃度が調節され得ることを認識する。

別の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号２に少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。また、核酸分子が、配列番号２に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一である配列を含む実施形態も企図される。

同一性百分率は、外観検査および数学上の計算によって決定され得る。あるいは、２つの核酸配列の同一性百分率は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７、１９８４）によって記載されるＧＡＰコンピュータープログラムバージョン６．０（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能である）を用いて、配列情報を比較することによって決定され得る。ＧＡＰプログラムに対する好ましい初期パラメーターとしては：（１）ヌクレオチドに対する単項の比較マトリクス（同一に対しては１および非同一に対しては０の値を含む）、そして、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、
ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｐｐ．３５３−３５８、１９７９に記載されるＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：６７４５、１９８６）の加重比較マトリクス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップの各記号に対するさらなる０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対しては、ペナルティなしが挙げられる。配列比較の分野の当業者によって使用される他のプログラムもまた、使用され得る。

本発明はまた、目的のタンパク質をより可溶性にするか、または溶液からより沈殿しにくくする方法に関し、上記方法は、ｒｈＢＭＰ（配列番号２）のＴ２６６イソ型のＮ末端アミノ酸伸長をコードするＤＮＡ配列、またはそのフラグメントを、上記目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列にアニーリングすることによる上記タンパク質を遺伝的に操作する工程を包含する。上記目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、翻訳される場合、上記目的のタンパク質を産生する任意のＤＮＡ配列（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）であり得る。１つの実施形態では、本発明のＤＮＡ配列（配列番号２）またはそのフラグメントは、上記目的のタンパク質のアミノ（Ｎ）末端にアニーリングされる。別の実施形態では、本発明のＤＮＡ配列（配列番号２）またはそのフラグメントは、上記目的のタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端にアニーリングされる。配列番号２またはそのフラグメントにアニーリングした上記目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、当該分野で公知の任意のベクターまたはプラスミド中に操作され得る。発現ベクターおよびクローニングベクターは、例えば、ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｐｏｗｅｌｌｓら、１９８５、補綴１９８７）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）に記載される。あるいは、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８９）を用いて増幅され得る。

配列番号２にアニーリングした目的のタンパク質は、適した宿主細胞を、配列番号２またはそのフラグメントにアニーリングする上記目的のタンパク質をコードするＤＮＡの全体またはその一部で形質転換またはトランスフェクトすることによって産生され得る。分子生物学分野の当業者は、配列番号２またはそのフラグメントにアニーリングした、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを発現するために、多種多様な発現系のいずれかが使用され得ることを理解する。使用される適格な宿主細胞は、本発明には重要ではない。宿主細胞の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞、またはＣＯＳ１、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３などの真核細胞、Ｓ．ＦｒｕｇｉｐｅｒｄａもしくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられるが、これらに限定されない。このような細胞は、広範な供給源（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍｄ．）から容易に利用可能である。トランスフェクション方法および発現プラスミドまたは発現ベクターの選択は、選択した宿主系に依存する。形質転換の方法およびトランスフェクション方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出に記載される。

本発明はまた、配列番号１によってコードされるペプチド、またはそのフラグメントに関し、ここで、このペプチドの活性を変えることなく、このペプチドまたはそのフラグメントの少なくとも１つのアミノ酸は、変異、欠失、または他のアミノ酸との置換によって変更されている。すなわち、この改変されたペプチドは、なお目的のタンパク質の溶解性を増大させるかもしくは沈殿を阻害するか、または代わりに、沈殿した目的のタンパク質を再可溶化させる。別の局面において、本発明は、配列番号１にコードされるペプチドま
たはそのフラグメントに関し、ここで、少なくとも１つのアミノ酸が、Ｃ末端上に付加されている。別の局面において、本発明は、配列番号１によってコードされるペプチドまたはそのフラグメントに関し、ここで、少なくとも１つのアミノ酸が、Ｎ末端上に付加されている。なお別の実施形態において、ペプチドまたはそのフラグメントにおける変異は、アミノ酸置換を生じ、ここで、この置換は、保存的置換である。保存的置換とは、１つのアミノ酸を類似の化学的性質（例えば、極性、疎水性、電荷）を有する別のアミノ酸と置換することを意味する。保存的置換の例としては、セリンのトレオニンへの置換、またはアルギニンのリジンへの置換、またはバリンのアラニンへの置換が挙げられる。当業者は、多くの保存的置換が可能であることを理解する。特定の実施形態において、改変されたペプチドは、配列番号１によってコードされるペプチドに対し、少なくとも７０％同一、８０％同一、９０％同一または９９％同一である。

配列番号１によってコードされるペプチドの変異体を作製するために、当該分野で公知の変異誘発のための任意の技術（特に、インビトロの部位特異的変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，（１９７８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，（１９８４）ＤＮＡ，３：４７９−４８８；Ｏｌｉｐｈａｎｔら，（１９８６）Ｇｅｎｅ４４：１７７；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１０；Ｈｕｙｇｅｎら，（１９９６）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２（８）：８９３−８９８）およびＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用）が使用され得る。ＰＣＲ技術は、部位特異的変異誘発のために使用され得る（Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，「ＵｓｉｎｇＰＣＲｔｏＥｎｇｉｎｅｅｒＤＮＡ」ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．
Ｅｒｌｉｃｈ（編）ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，第６章，ｐｐ．６１−７０）。

目的のタンパク質は、任意のタンパク質であり得る。本発明の１つの局面において、目的のタンパク質は、ＢＭＰ−２またはｒｈＢＭＰ−２である。別の局面において、目的のタンパク質は、ｒｈＢＭＰ−２の少なくとも１つのイソ型サブユニット（例えば、＜Ｑ２８３およびＱ２８３）である。ｒｈＢＭＰのイソ型サブユニットは、単量体または多量体（例えば、二量体）として存在し得る。なお別の局面において、目的のタンパク質は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意のメンバーである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ＢＭＰ−２と配列相同性および／または構造的相同性を共有する（例えば、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−１３）。

本発明はまた、配列番号１によってコードされるペプチドまたはそのフラグメント（例えば、配列番号１のアミノ酸６〜１７、配列番号１のアミノ酸１１〜１７、または配列番号１のアミノ酸１４〜１７）と、生物学的に活性な分子であって、ここで配列番号１によってコードされるペプチドまたはそのフラグメントが溶解性を増大させ、および／もしくは沈殿を阻害し、および／または再可溶化させる、生物学的に活性な分子と、キャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。１つの実施形態において、生物学的に活性な分子は、タンパク質またはペプチドである。従って、生物学的に活性な分子は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−１３またはＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのペプチドフラグメント））であり得る。例えば、タンパク質は、ＢＭＰ−２またはｒｈＢＭＰ−２であり得る。あるいは、タンパク質またはペプチドは、ｒｈＢＭＰ−２のイソ型サブユニット（例えば、＜Ｑ２８３およびＱ２８３）であり得る。このイソ型サブユニットは、単量体または多量体（例えば、二量体）であり得る。キャリアは、当該分野で公知の任意の適切なキャリアであり得る。例として、非限定であるが、キャリアは、吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）であり得る。

本発明は、配列番号１または配列番号１のフラグメント（例えば、配列番号１のアミノ酸６〜１７、配列番号１のアミノ酸１１〜１７、または配列番号１のアミノ酸１４〜１７が挙げられる）を含むペプチドに関する。このペプチド、またはそのフラグメントは、当該分野で公知のペプチド合成の任意の方法によって作製され得る。例として、非限定であるが、固相ペプチド合成を使用して本発明の組成物を作製し得る。このような方法は、例えば、ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）に記載される。

配列番号１によってコードされるペプチドまたはそのフラグメントは、組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９９０，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹに記載される技術を参照のこと。原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞または真核生物細胞（例えば、Ｃｏｓ細胞、ＣＨＯ細胞）は、本発明の組換えペプチドまたはそのフラグメントを発現するために使用され得る。あるいは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用する昆虫系は、本発明のペプチドまたはそのフラグメントを発現するために使用され得る。組換え昆虫ウイルスを、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖させ得る。

本発明のペプチドまたはそのフラグメントは、融合タンパク質として発現され得る。融合タンパク質は、より高い安定性およびペプチドまたはそのフラグメントの精製の容易さの利点を提供する。例として、非限定であるが、ペプチドまたはそのフラグメントは、ＧＳＴ融合ペプチドまたはＨｉｓタグ化融合ペプチドとして発現され得る。好ましくは、融合タグは切断可能であり、従って、精製工程後のタグの除去が可能である。

本発明はまた、疾患または状態の処置を必要とする哺乳動物への薬学的組成物送達方法に関する。薬学的組成物は、生物学的に活性な分子、および配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントを含む。本方法は、この哺乳動物に薬学的組成物を投与してこの状態を処置する工程を包含する。生物学的に活性な分子は、例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意のメンバー、または配列番号１を含むペプチドもしくはそのフラグメントと接触する場合に配列番号１を含むペプチドもしくはそのフラグメントと接触しない同じタンパク質と比較してより可溶性になるかまたはより再可溶化する、他のタンパク質であり得る。１つの実施形態において、生物学的に活性な分子は、ＢＭＰ−２またはｒｈＢＭＰ−２である。

本発明の方法は、生物学的に活性な分子の投与が必要な任意の状態を処置するために使用され得、ここで、この生物学的に活性な分子は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触する場合、しない場合よりもより可溶性である。本発明の方法は、生物学的に活性な分子の投与を必要とする任意の状態を処置するために使用され得、ここで、この生物学的に活性な分子は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触する場合、再可溶化する。１つの実施形態において、処置されるべき状態は、骨の再生を必要とし（例えば、脊椎固定または長骨骨折）、生物学的に活性な分子（すなわち、ＢＭＰ−２またはｒｈＢＭＰ−２またはｒｈＢＭＰ−２のイソ型サブユニット）を必要とする。

哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得、イヌ、ネコ、ラット、マウス、霊長類、家畜（例えばウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。

本発明の方法は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントの活性を妨げないような、任意の生化学的条件および物理的条件の下で実施され得る。例として、非限定であるが、本発明の方法は、２０℃の温度および４．５のｐＨで、実施され得、ここで、このペプチドのモル濃度は目的のタンパク質のモル濃度より１０〜２０倍過剰である。

当該分野で公知の任意の方法を使用して、本発明の方法が目的のタンパク質の溶解性の増大をもたらすか否か、または目的のタンパク質の再可溶化をもたらすか否かを決定し得る。例として、非限定であるが、目的のタンパク質を含有する溶液の吸光度の測定および／または光拡散の測定を使用して、本発明の方法が目的のタンパク質の溶解性の増大をもたらすか否か、または目的のタンパク質の再可溶化をもたらすか否かを決定し得る。測定は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと目的のタンパク質を接触させる前および後に行い得る。

本発明の方法は、０℃より高く６５℃未満の範囲の温度で実施され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、２０℃の温度で実施される。別の実施形態において、本発明の方法は、４℃の温度で実施される。なお別の実施形態において、本発明の方法は、３７℃の温度で実施される。

配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触させる場合に、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触されないこの目的のタンパク質の溶解性と比較して、本方法が目的のタンパク質の溶解性を増大する限り、本発明の方法は任意のｐＨで実施され得る。あるいは、本発明の方法は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触させる場合に、目的のタンパク質の再可溶化をもたらすｐＨで実施され得る。従って、１つの実施形態において、本発明の方法は、１より高く７．５未満の間のｐＨで実施され得る。別の実施形態において、本発明の方法は、生理的ｐＨで実施される。なお別の実施形態において、本発明は、ｐＨ４．５で実施される。

配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触させる場合に、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触されないこの目的のタンパク質の溶解性と比較して、本方法が目的のタンパク質の溶解性を増大する限り、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントの任意の濃度が、本発明の方法の実施において使用され得る。あるいは、本発明の方法は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触させる場合に、目的のタンパク質の再可溶化をもたらす限り、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントの任意の濃度が本発明の方法の実施に使用され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントを、１〜１，０００ナノモルの範囲の濃度で用いて実施され得る。別の実施形態において、本発明の方法は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントを、１〜１，０００マイクロモルの範囲の濃度で用いて実施され得る。別の実施形態において、本発明の方法は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントを、１〜１，０００ミリモルの範囲の濃度で用いて実施され得る。別の実施形態において、本発明の方法は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントを、１〜１，０００モルの範囲の濃度で用いて実施され得る。

本発明の方法は、目的のタンパク質を、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと接触させる工程であって、ここで、このペプチドまたはそのフラグメントは、目的のタンパク質の溶解性を増大させるかまたは目的のタンパク質を再可溶化させる工程を、包含する。本発明の１つの局面において、本発明の方法は、目的のタンパク質と比較して過剰なモル濃度で存在する配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントを用いて実施される。このペプチドは、目的のタンパク質と比較して、１〜１０００倍過剰なモル濃度の範囲で存在し得る。本発明の別の局面において、本発明の方法は、配列番号１を含む
ペプチドまたはそのフラグメントと比較して、過剰なモル濃度で存在する目的のタンパク質を用いて実施される。目的のタンパク質は、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントと比較して、１〜１０００倍過剰なモル濃度の範囲で存在し得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、目的のタンパク質と比較して１０〜２０倍過剰なモル濃度で存在する配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメントを用いて実施される。

実施例における以外、または他に示さない限り、成分の量、反応条件を表し、その他明細書および特許請求の範囲に使用される全ての数字は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。従って、反対に示されない限り、明細書および添付の特許請求の範囲の中に示される数値的なパラメーターは、本発明によって得られるべき、求められた所望の性質に依存して変動し得る近似値である。特許請求の範囲に対する等価物の原則の適用を限定することを意図しないが、少なくとも数値的なパラメーターのそれぞれは、有効数字の数および通常の切り捨てアプローチに照らして解釈されるべきである。

本発明の広範な範囲を示す数値的な範囲およびパラメーター設定は近似値であるが、特定の実施例において示される数値は、可能な限り正確に報告される。当業者は、任意の数値が、そのそれぞれの試験測定において得られる標準偏差から生じる幾らかの誤差を本質的に必ず含むことを理解する。

以下の実施例は例示であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。

（実施例１：ｒｈＢＭＰ−２の６種のイソ型の溶解性）
ｒｈＢＭＰ−２はＣＨＯ細胞中で産生され、６種の二量体イソ型（＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、Ｑ２８３／Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｔ２６６、Ｑ２８３／Ｔ２６６およびＴ２６６／Ｔ２６６）が挙げられる。Ｔ２６６サブユニットは、Ｑ２８３サブユニットおよび＜Ｑ２８３サブユニットにおいて欠失している１７個のアミノ酸の伸長を、Ｎ末端上に有する。この伸長は、ＰＡＣＥ酵素が、細胞処理工程の間に、Ｃ末端のＡｒｇ_２８２において切断し損なったことに起因する。これは、組換えタンパク質が、ＣＨＯ細胞中で過剰産生され、これにより、ＰＡＣＥ酵素の処理能力を飽和させることによる。

ｒｈＢＭＰ−２は、独特の溶解性プロフィールを有する。これは、低塩濃度かつ低いｐＨで最も可溶性である。しかし、ｒｈＢＭＰ−２は、塩濃度が０．１５Ｍのイオン強度以上に上昇する場合、より高いｐＨ値で可溶性を保つ。ｒｈ−ＢＭＰ２の異なったイソ型間に何らかの本質的な溶解性の相違が存在するか否かを決定するため、イソ型を精製して、５ｍＭの硫酸ナトリウムで処理した。溶解性を、３４０ｎｍの吸光度での光拡散を使用して測定した。

５ｍＭＮａ_２ＳＯ_４をタンパク質沈殿剤として用い、溶解性研究を行った。実験を、５ｍＭＬ−グルタミン酸、５ｍＭＮａＣｌ、２．５％グリシン、０．５％スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０（ｐＨ４．５）中で、０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度および０．５ｍＬの体積で行った。インキュベーション時間は、分子の沈殿および再可溶化の両方について、室温で１０分間であった。沈殿の程度を、３４０ｎｍでの光拡散によって測定した。

５ｍＭおよび１８ｍＭのＮａ_２ＳＯ_４で沈殿させたｒｈＢＭＰ−２から得た上清において、逆相クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーを行った。上清を、およそ１４，０００ＲＰＭで３０分間、約２℃〜８℃での微小遠心分離により、ペレットから分離した。

ｒｈＢＭＰ−２の６種の二量体イソ型を、カチオン交換クロマトグラフィーによって分離した（図１）。ｒｈＢＭＰ−２のイソ型の６種全ての混合物の、低レベルのＮａ_２ＳＯ_４とのインキュベーションにより、イソ型の沈殿の指標である吸光度の上昇を生じた。吸光度における上昇は、およそ３ｍＭ〜４ｍＭの範囲のＮａ_２ＳＯ_４で明らかとなった。沈殿した物質の量を、開始物質中のタンパク質濃度と沈殿した物質の上清中のタンパク質濃度との比較により、逆相クロマトグラフィーによって測定した。５ｍＭＮａ_２ＳＯ_４で、タンパク質濃度は最初の量の６３％に減少した。１８ｍＭＮａ_２ＳＯ_４で、タンパク質濃度は初期濃度の８１％に減少した。これらの沈殿物の上清を、カチオン交換クロマトグラフィーによって分析した。沈殿物の上清は、Ｔ２６６サブユニットを含有する二量体を富化されていたことを見出した。この最初の観察は、６種のｒｈＢＭＰ−２イソ型の間の溶解性の相違を実証した。

この現象をさらに研究するために、各イソ型を精製し、５ｍＭＮａ_２ＳＯ_４と共にインキュベートし、そのそれぞれの溶解性をよりよく評価した。イソ型の沈殿を、３４０ｎｍでの光拡散によって測定した。Ｔ２６６サブユニットを含有する全てのイソ型は、５ｍＭＮａ_２ＳＯ_４の添加後、透明なままであった。Ｑ２８３サブユニットまたは＜Ｑ２８３サブユニットのどちらかを含むがＴ２６６サブユニットを含まないすべてのイソ型は白濁し、３４０ｎｍでの吸光度の上昇を生じた。この結果は、Ｑ２８３イソ型および＜Ｑ２８３イソ型は、５ｍＭＮａ_２ＳＯ_４の存在下で沈殿したが、Ｔ２６６サブユニットは沈殿しなかったことを示した（図２）。

次の実験は、Ｔ２６６／Ｔ２６６イソ型の、沈殿したＱ２８３／Ｑ２８３イソ型を再可溶化させる能力を調べた。１０ナノモルのＱ２８３／Ｑ２８３イソ型を、５ｍＭＮａ_２ＳＯ_４で沈殿させた。種々の量のＴ２６６／Ｔ２６６イソ型を（やはり５ｍＭＮａ_２ＳＯ_４中で）沈殿したＱ２８３／Ｑ２８３イソ型に加え、そして吸光度を３４０ｎｍで測定した。沈殿したＱ２８３／Ｑ２８３イソ型へのＴ２６６／Ｔ２６６の添加は、３４０ｎｍでの溶液の吸光度の量依存的様式の低下を生じた。１０ナノモルのＱ２６３／Ｑ２６３は、５ナノモルのＴ２６６／Ｔ２６６の添加によって透明になった。これは、室温で１０分以内のインキュベーションで起こった（図３）。１０ナノモルの沈殿したＱ２８３／Ｑ２８３への＜Ｑ２８３／Ｔ２６６イソ型の添加は、３４０ｎｍでの吸光度において同様の低下をもたらしたが、同じ効果を達成するためにより高濃度の＜Ｑ２８３／Ｔ２６６イソ型が必要であった（図４）。

Ｔ２６６イソ型とＱ２８３イソ型および＜Ｑ２８３イソ型との間の相違は、Ｔ２６６イソ型のＮ末端における１７個のアミノ酸の伸長である。１７個のアミノ酸の伸長またはそのフラグメントが、ｒｈＢＭＰ−２を再可溶化させ得るか否かを決定するために、次の実験を行った。これらのペプチドが成熟ｒｈＢＭＰ−２を再可溶化させ得るか否かを決定するため、Ｔ２６６イソ型の１７個のアミノ酸Ｎ末端に相当するペプチドを合成し、研究を行った。

以下のペプチドを合成した：Ｓ１７：Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１）；Ｓ１２：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１の６〜１７アミノ酸）；Ｓ７：Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１の１１−１７アミノ酸）；Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１の１４−１７アミノ酸）。

全ての合成ペプチドが、５ｍＭＮａ_２ＳＯ_４で沈殿させた１０ナノモルの＜Ｑ２８３
／＜Ｑ２８３の再可溶化が可能であった（図５）。可溶化能力は、鎖長の減少に従って低下した。最小のペプチドであるＳ４は、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３の再可溶化においてなお有効であったが、ペプチドのより高い濃度を必要とした。

＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３イソ型を再可溶化させる合成ペプチドの能力を、サルフェート以外のアニオンで試験した。このペプチドは、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムのどちらで沈殿した＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３も、再可溶化し得た。

Ｔ２６６サブユニットを含むｒｈＢＭＰ−２のイソ型は、＜Ｑ２８３サブユニットまたはＱ２８３サブユニットのみを含むイソ型よりも可溶性である。種々のアニオンの存在下で増大した溶解性は、Ｔ２６６サブユニットの１７個のアミノ酸の伸長に関連する。

Ｔ２６６の１７個のＮ末端アミノ酸伸長を含むペプチドまたはそのフラグメントは、アニオンがｒｈＢＭＰ−２のようなタンパク質の沈殿を誘導するのを阻害する賦形剤として使用され得る。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー内に存在する高い程度の配列相同性および構造的相同性ゆえに、Ｔ２６６の１７個のＮ末端アミノ酸伸長またはそのフラグメントを、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意のメンバーのための賦形剤または可溶化剤として使用し得る。

Ｔ２６６の１７個のＮ末端アミノ酸伸長を、ｒｈＢＭＰ−２を溶解させるか、再可溶化させるか、またはその溶解性を増大するために使用し得る。従って、このペプチドまたはそのフラグメントは、タンパク質の産生または精製がタンパク質からの不完全なアニオン除去をもたらす場合、ｒｈＢＭＰ−２の溶解性を増大するために使用され得る。また、このペプチドまたはそのフラグメントを、それがｒｈＢＭＰ−２のための送達ビヒクルである吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）と接触する場合、ｒｈＢＭＰ−２タンパク質を溶解させるために使用し得る。ＡＣＳは、自由なレベルの、サルフェート、ホスフェートおよびクロリドを含む複数のアニオンを含む。

（実施例２：増大した溶解性を有するｒｈＢＭＰ−２の産生）
ＢａｍＨ１およびＮｄｅ１制限酵素部位に隣接してＮ末端上にライゲーションした、ｒｈＢＭＰのＱ２８３／Ｑ２８３イソ型をコードするＤＮＡフラグメント（配列番号２を有する）を、当該分野で公知の方法に従って、ＰＣＲによって産生する。ＰＣＲ産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴ−１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にライゲーションした。次いで、このプラスミドを使用し、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換する。配列番号２によってコードされるペプチドを有するｒｈＢＭＰタンパク質のＱ２８３／Ｑ２８３イソ型を含む融合タンパク質の発現の刺激を、細胞をＩＰＴＧで処理することによって達成する。組換えタンパク質を、当該分野で公知の方法に従い、金属キレート化クロマトグラフィーによって単離する（例えば、ＳｔｕｄｉｅｒらＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：６０−８９，１９９０）。融合タンパク質は、ｒｈＢＭＰのＱ２８３／Ｑ２８３イソ型と比較して増大した溶解性を示し、そして例えば、薬学的組成物中で使用される。

本発明の他の実施形態は、本明細書の考察および本明細書中で開示される本発明の実施から当業者に明らかである。本明細書および実施例は例示としてのみ意図され、本発明の真の範囲および精神は、特許請求の範囲およびそれによって与えられる等価物の範囲全体によって示される。

本明細書中で挙げた全ての参考文献は、各々独立の刊行物、特許または特許出願が、全ての目的に、その全体が参考として援用されることが特異的かつ個別に示されるのと同じ程度に、全ての目的にその全体が参考として本明細書中で援用される。

図１は、カチオン交換カラムから溶出したｒｈＢＭＰ−２の６個のイソ型の溶出プロフィールを示すクロマトグラムである。図２は、５ｍＭ硫酸ナトリウム中でのｒｈＢＭＰ−２イソ型の溶解性を示す。図３は、ｒｈＢＭＰ−２イソ型Ｔ２６６／Ｔ２６６を用いた、ｒｈＢＭＰ−２イソ型Ｑ２８３／Ｑ２８３の再可溶化を示す。図４は、ｒｈＢＭＰ−２イソ型＜Ｑ２８３／Ｔ２６６を用いた、ｒｈＢＭＰ−２イソ型Ｑ２８３／Ｑ２８３の再可溶化を示す。図５は、ｒｈＢＭＰ−２の伸長形態（２６６〜３９６）のＮ末端由来の合成ペプチドを用いた＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３の可溶化を示す。

Claims

配列番号１によってコードされるペプチドまたはそのフラグメントを含有する溶液からのタンパク質の沈殿を阻害する組成物。
前記タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項１に記載の組成物。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項２に記載の組成物。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項３に記載の組成物。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項４に記載の組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項５に記載の組成物。
前記イソ型が、＜Ｑ２８３またはＱ２８３からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項７に記載の組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３およびＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
前記ペプチドまたはそのフラグメントが配列番号１のアミノ酸６〜１７を含む、請求項１に記載の組成物。
前記タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項１０に記載の組成物。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項１１に記載の組成物。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項１２に記載の組成物。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項１３に記載の組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項１４に記載の組成物。
前記イソ型が、＜Ｑ２８３またはＱ２８３からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項１６に記載の組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸１１〜１７を含む、請求項１に記載の組成物。
前記タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項１９に記載の組成物。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項２０に記載の組成物。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項２１に記載の組成物。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項２２に記載の組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項２３に記載の組成物。
前記イソ型が、＜Ｑ２８３またはＱ２８３からなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項２５に記載の組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸１４〜１７を含む、請求項１に記載の組成物。
前記タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項２８に記載の組成物。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項２９に記載の組成物。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項３０に記載の組成物。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項３１に記載の組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項３２に記載の組成物。
前記イソ型が、＜Ｑ２８３またはＱ２８３からなる群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項３４に記載の組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項３５に記載の組成物。
溶液からの目的のタンパク質の沈殿を阻害する方法であって、該方法は、該タンパク質の沈殿を阻害するために有効な量で該タンパク質をペプチドと接触させる工程を包含し、ここで、該ペプチドは、配列番号１またはそのフラグメントを含む、方法。
前記タンパク質がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項３７に記載の方法。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項３８に記載の方法。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項３９に記載の方法。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項４０に記載の方法。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項４１に記載の方法。
前記イソ型が二量体である、請求項４２に記載の方法。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
生物学的に活性な分子と、配列番号１を含むペプチドと、キャリアとを含有する、薬学的組成物。
前記生物学的に活性な分子がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項４５に記載の薬学的組成物。
前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーがＢＭＰ−２である、請求項４６に記載の薬学的組成物。
前記ＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項４７に記載の薬学的組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項４８に記載の薬学的組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項４９に記載の薬学的組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項５０に記載の薬学的組成物。
前記キャリアが吸収性コラーゲンスポンジである、請求項４５に記載の薬学的組成物。
状態または疾患の処置の必要な哺乳動物に薬学的組成物を送達する方法であって、該方法は、該状態または疾患を処置するために、該哺乳動物に該薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該薬学的組成物は、生物学的に活性な分子、配列番号１を含むペプチドまたはそのフラグメント、およびキャリアを含有し、ここで、配列番号１から構成される該ペプチドまたはそのフラグメントは、該生物学的に活性な分子の溶解性を増大させる、方法。
前記生物学的に活性な分子がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項５３に記載の方法。
前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーがＢＭＰ−２である、請求項５４に記載の方法。
前記ＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項５５に記載の方法。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項５６に記載の方法。
前記イソ型が二量体である、請求項５７に記載の方法。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
前記哺乳動物がヒトである、請求項５３に記載の方法。
前記キャリアが吸収性コラーゲンスポンジである、請求項５３に記載の方法。
配列番号１によってコードされるペプチドまたはそのフラグメントを含有する溶液から沈殿させたタンパク質を再可溶化する組成物。
前記タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項６２に記載の組成物。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項６３に記載の組成物。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項６４に記載の組成物。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項６５に記載の組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項６６に記載の組成物。
前記イソ型が、＜Ｑ２８３またはＱ２８３からなる群から選択される、請求項６７に記載の組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項６８に記載の組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３およびＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項６９に記載の組成物。
前記ペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号１のアミノ酸６〜１７を含む、請求項６２に記載の組成物。
前記タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項７１に記載の組成物。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項７２に記載の組成物。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項７３に記載の組成物。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項７４に記載の組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項７５に記載の組成物。
前記イソ型が、＜Ｑ２８３またはＱ２８３からなる群から選択される、請求項７６に記載の組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項７７に記載の組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項７８に記載の組成物。
前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸１１〜１７を含む、請求項６２に記載の組成物。
前記タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項８０に記載の組成物。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項８１に記載の組成物。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項８２に記載の組成物。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項８３に記載の組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項８４に記載の組成物。
前記イソ型が、＜Ｑ２８３、Ｑ２８３またはＴ２６６からなる群から選択される、請求項８５に記載の組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項８６に記載の組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項８７に記載の組成物。
前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸１４〜１７を含む、請求項６２に記載の組成物。
前記タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項８９に記載の組成物。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項９０に記載の組成物。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項９１に記載の組成物。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項９２に記載の組成物。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項９３に記載の組成物。
前記イソ型が、＜Ｑ２８３またはＱ２８３からなる群から選択される、請求項９４に記載の組成物。
前記イソ型が二量体である、請求項９５に記載の組成物。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項９６に記載の組成物。
目的のタンパク質を再可溶化する方法であって、該方法は、該タンパク質を、目的のタンパク質を再可溶化するのに有効な量でペプチドと接触させる工程を包含し、ここで、該ペプチドは、配列番号１またはそのフラグメントを含む、方法。
前記タンパク質がＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項９８に記載の方法。
前記タンパク質がＢＭＰ−２である、請求項９９に記載の方法。
前記ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である、請求項１００に記載の方法。
前記ヒトＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項１０１に記載の方法。
前記ｒｈＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２のイソ型である、請求項１０２に記載の方法。
前記イソ型が二量体である、請求項１０３に記載の方法。
前記二量体が、＜Ｑ２８３／＜Ｑ２８３、＜Ｑ２８３／Ｑ２８３またはＱ２８３／Ｑ２８３からなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。