JP2002060400A - コラーゲン結合活性および血管新生調節活性を有するハイブリッドポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】血管新生調節活性およびコラーゲン結合活性の
両活性を有し、血管新生調節因子のＤＤＳとして有用な
ハイブリッドポリペプチド、さらに該ハイブリッドポリ
ペプチドとコラーゲンとの複合化バイオマテリアル、お
よびこれらの用途の提供。該ハイブリッドポリペプチド
をコードする遺伝子を含む形質転換システムの提供。 【解決手段】フィブロネクチンのプロテアーゼ分解によ
り得られるコラーゲン結合性ドメインを構成するアミノ
酸配列からなるポリペプチドと、血管新生調節因子とが
遺伝子工学的手法により連結したハイブリッドポリペプ
チド。血管新生調節因子は、コラーゲン結合性ＦＮポリ
ペプチドのカルボキシル末端に連結されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コラーゲン結合性
と血管新生調節活性の両活性を有するハイブリッドポリ
ペプチド、これをコードする遺伝子を含む組換えベクタ
ーおよび形質転換体、該ハイブリッドポリペプチドを含
むバイオマテリアルおよびこれらの用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】サイトカイン、細胞成長因子などの血管
新生調節因子の中には、医薬品としての用途を期待され
ているものが多い。例えばＰＤＧＦ（血小板由来増殖因
子）スーパーファミリーの一つであるＶＥＧＦ（血管内
皮細胞増殖因子）は、培養内皮細胞の増殖、遊走、プラ
スミノーゲンアクチベータやコラゲナーゼなどのプロテ
アーゼ活性、およびコラーゲンゲル中での血管様構造形
成など、いわゆる血管新生のすべてのステップを促進
し、血管透過性も著しく促進する。ＶＥＧＦは、in viv
o でも血管新生を促進することから、心臓あるいは下肢
の虚血部位における血管新生療法や血管内皮細胞損傷後
の血管内皮細胞修復における効果が期待されている。

【０００３】ところが血管新生調節因子は一般的に生体
内での安定性が悪く、局所保持あるいは徐放が困難なた
めに標的組織での効果が低い。このため活性を得るため
には大量投与が必要とされるが、一方大量投与による他
部位での副作用が懸念されるため、実用性が危惧されて
いるものが多い。たとえば上記ＶＥＧＦも、生体内での
安定性、局所での効果が低いが、これを大量投与した場
合には、他部位に拡散して血管新生し、ガンを増殖促進
するなどの副作用が懸念される。そのため血管新生調節
因子の効率のよいドラッグデリバリーシステム（ＤＤ
Ｓ）が切望されている。

【０００４】上記血管新生調節因子の生体内での安定性
および局所効果を改善し、ターゲッティング効果を付与
する方法として、コラーゲンをキャリヤーまたはマトリ
ックスとして利用することが期待されている。しかしな
がら血管新生調節因子は一般的にコラーゲンとの親和性
が低く、これらを単に混合するだけでは、血管新生調節
因子を長時間、安定にコラーゲンマトリックスに保持す
ることは困難である。一方血管新生調節因子とコラーゲ
ンとを化学的に結合すると、その血管新生調節活性が消
失または低下してしまう。

【０００５】また近年、盛んに開発が進められている遺
伝子組換え技術によれば、血管新生調節因子と他のポリ
ペプチドとの機能性ハイブリッドポリペプチドをEscher
ichia coli（E. coli)等で発現させることも可能である
と考えられる。しかしながら遺伝子工学的にハイブリッ
ド化したポリペプチドは必ずしも元の活性を示すとは限
らないという問題がある。特にポリペプチドに、コラー
ゲン結合活性を付与しようとするハイブリッド化例で
は、大腸菌で産生された封入体から回収された組換えタ
ンパクの多くで、そのコラーゲン結合活性が損なわれて
おり、かつ生理活性の低下も認められている。また血管
新生調節因子とコラーゲン結合性ポリペプチドとのハイ
ブリッド化によりコラーゲン結合後も血管新生調節活性
を示すようなハイブリッドポリペプチドを得た例は報告
されていない。

【０００６】コラーゲン結合活性の付与についてさらに
述べれば、細胞外マトリックスを介しての徐放効果をね
らったものとして、ウシフォンビルブランド因子由来の
コラーゲン結合性デカペプチド（decapeptide)を用いた
ハイブリッドポリペプチドがいくつか報告されており、
該デカペプチドとトランスフォーミング増殖因子β（Ｔ
ＧＦ−β) とのハイブリッド化によるコラーゲンターゲ
ッティングＴＧＦ−β(USP5,800,811、 Tuan ら、Conne
ctive Tissue Reserch 、第34巻、１号、１〜９頁（199
6）、Han ら、Protein Expression and Purification
、第11巻、169〜 178頁（1997）、Gordonら、Human Ge
ne Therapy、第8 巻、1385〜1394頁（1997））、および
該デカペプチドと血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と
のハイブリッドポリペプチド（ＷＯ00/06195）などが提
案されている。

【０００７】これらの中で、コラーゲン結合活性の残存
したハイブリッドポリペプチドはコラーゲンに結合させ
た後、細胞の捕捉は可能であったが、ＴＧＦ−βの活
性、特に増殖活性は認められないと報告しており、ＴＧ
Ｆ−β増殖活性の局所保持や徐放の目的は達成されてい
ない。このためハイブリッドポリペプチドであるコラー
ゲン結合性生理活性ポリペプチドのコラーゲン結合性ペ
プチド部分としては、フォンビルブランド因子のコラー
ゲン結合性デカペプチドは適切とはいえない。

【０００８】また Nishiらは、嫌気性のグラム陽性桿菌
であるクロストリジウム ヒストリチカム(Clostridium
histolyticum)のコラゲナーゼ由来のコラーゲン結合性
ポリペプチドと、ｂＦＧＦまたは上皮増殖因子（ＥＧ
Ｆ）とのハイブリッドポリペプチドであるコラーゲン結
合性細胞増殖因子の作製を試みている (Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA、第95巻、7018〜7023頁（1998））。この
コラーゲン結合性細胞増殖因子は、コラーゲンコートさ
れた細胞培養器または多くのコラーゲン材料に対し結合
不能であったことから、充分なコラーゲン結合活性を有
していないことが記載されている(Proc. Nat. Acad. of
Sci. USA 、第９５巻、７０１８〜７０２３頁（１９９
８））。当然の事ながら、コラーゲン材料に結合後、細
胞増殖活性を示すことは不可能である。さらにこのコラ
ーゲン結合性細胞増殖因子では、元のＥＧＦ活性が低下
することが認められている。また細菌のコラゲナーゼ由
来のポリペプチドは、免疫学的にヒトの組織再生に適切
ではない。

【０００９】またコラーゲン結合性ポリペプチドとし
て、細胞外マトリックス成分の一つであるフィブロネク
チン（ＦＮ）のコラーゲン（ゼラチン）結合性ポリペプ
チドを用いる例も提案されている。たとえばＵＳＰ5,34
2,762 、ＵＳＰ5,460,955 では、有用タンパク質を、バ
キュロウイルス発現システムによる昆虫細胞で生産、精
製するか、または動物細胞（ＣＯＳ細胞）を宿主にして
生産、精製する際に、フィブロネクチンのコラーゲン／
ゼラチン結合性ポリペプチドを精製タッグとして用いて
いる。

【００１０】上記では、フィブロネクチン由来のポリペ
プチド（タッグ）と有用タンパク質とのハイブリッドポ
リペプチドを発現させ、タッグのコラーゲン／ゼラチン
への親和性によって、捕捉させた後、次いで特異的なプ
ロテアーゼ等により、切断し有用タンパク質部分を回収
している。ここで得られたハイブリッドポリペプチド
は、フィブロネクチンのゼラチン結合性領域のアミノ末
端側にトリプシンによる切断部位が位置し、そのアミノ
末端側に有用タンパク質が位置し、続いてファクターXI
IIa サイトが位置し、さらにそのアミノ末端側にフィブ
ロネクチンのプレプロ配列またはリーダーシグナルペプ
チド配列が付加された構造である。これにより有用タン
パク質の例としてフィブロネクチンのホモロジーユニッ
トI-12（12番目のＩ型ホモロジーユニット）、フィブロ
ネクチンのホモロジーユニットI-9（９番目のＩ型ホモ
ロジーユニット）とIII-1 （１番目のIII 型ホモロジー
ユニット）またはヒトのファクターIXのさまざまな部分
の発現、精製例が示されている。

【００１１】しかしながらいずれにも、フィブロネクチ
ン由来のポリペプチドのパートナーとして血管新生調節
活性因子をハイブリッド化したことは示されていない。
またこれらでは、発現されるハイブリッドポリペプチド
について、コラーゲン結合性以外の有用タンパク質の生
理活性があるか否かについては全く検討されていない。
また上記構成では、活性を有するハイブリッドポリペプ
チドをE. Coli などのバクテリアで産生させることは不
可能である。

【００１２】またフィブロネクチンのコラーゲン結合性
ポリペプチドを利用した他の例としては、該フィブロネ
クチンのコラーゲン結合部分と、他のポリペプチドまた
は治療剤とが結合したポリペプチドおよびその精製法
（特開昭62-89699号）がある。上記特開昭62-89699号公
報では、ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からSer⁵⁷⁷（アミノ酸に付
した肩数字はヒト・ＦＮのＮ末端から数えた残基数）ま
でのアミノ酸配列で構成されるポリペプチドがコラーゲ
ン結合性部分として開示されている。この配列は、ＦＮ
のプロテアーゼ分解で得られる配列あるいは自然分解に
より得られる配列と異なり、制限酵素で切断される遺伝
子配列を選択するような遺伝子工学的手法によってのみ
産生可能なアミノ酸配列である。しかしながらこのよう
な配列のポリペプチドを血管新生調節因子のポリペプチ
ドパートナーとするハイブリッドポリペプチドでは、コ
レーゲン結合性または血管新生調節因子の活性が低下ま
たは消失する。したがって上記ポリペプチドは、機能性
ハイブリッドポリペプチドにおける血管新生調節因子の
ポリペプチドパートナーとして有用であるとはいえな
い。

【００１３】また同公報では、コラーゲン結合能を有す
る連続部分としてThr³⁷⁹からVal⁴⁴⁵までが記載されてい
るが、このThr³⁷⁹からVal⁴⁴⁵までを含むThe³⁷⁴からAla
⁴⁷⁹までのアミノ酸配列で構成されるポリペプチドには
コラーゲン結合性がないと報告する他の論文（Skorsten
gaard ら、FEBS letters、第343 巻、第47〜50頁（199
4））もある。このようにコラーゲン結合性ドメインに
相当するポリペプチドの全てまたは一部の配列を含んで
いても、プロテアーゼによる分解部位または自然分解に
よる部位を考慮せず、遺伝子工学的手法でのみ得られる
ようなＦＮ由来のコラーゲン結合性ポリペプチドを血管
新生調節因子に融合させて作製したハイブリッドポリペ
プチドは、コラーゲン結合活性または血管新生調節因子
の活性の低下を招く。

【００１４】さらにコラーゲン結合性ドメインではない
が、フィブロネクチンの細胞接着ドメイン配列からなる
ポリペプチドと、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ）とをハイブリッド化した機能性ポリペプチドの製造
法が開示されている（特開平5-178897号公報）。具体的
にはヒト・ＦＮのPro¹²³⁹ からSer¹⁵¹⁵ までの277 アミ
ノ酸残基からなるポリペプチドと、ｂＦＧＦとのハイブ
リッドポリペプチドである。ヒト・ＦＮのPro¹²³⁹ から
Ser¹⁵¹⁵ までのアミノ酸残基からなるポリペプチドは、
コラーゲン結合性ドメインが位置するヒト・ＦＮのＮ末
端側約２８ＫＤａから約７５ＫＤａまでに含まれるポリ
ペプチドとは全く異なるアミノ酸配列から構成されてお
り、コラーゲン結合性は有さない。このハイブリッドポ
リペプチドは細胞に接着し、細胞増殖活性を示すが、一
方、細胞に直接結合するため長期的な徐放効果あるいは
局所保持は期待できない。また機能性ポリペプチドのｂ
ＦＧＦとしての活性は著しく低下することが記載されて
いる。

【００１５】さらに他の機能性ポリペプチドのターゲテ
ィング技術として、機能性ポリペプチドを細胞外マトリ
ックス（ＦＮポリペプチド）中に挿入して不溶化させる
ことも提案されている。具体的にはＦＮポリペプチドの
Ｎ末端７０ｋＤａ領域とＣ末端３７ｋＤａ領域との間
に、異種タンパク質（機能性ポリペプチド）または該ポ
リペプチドのアミノ酸鎖を挿入したキメラタンパク質が
提案されている（特開平8-140677号）。しかしながらこ
のように不溶化されたキメラタンパク質においては、Ｆ
Ｎ分子の間に異種タンパク質またはペプチドのアミノ酸
配列を挿入するので、高次構造に影響を及ぼし、挿入タ
ンパク質の機能維持が困難である。また分子量が大き
く、水に不溶性であることから、機能を維持したタンパ
ク質として回収することが著しく困難であり、E. coli
（大腸菌）、酵母、動物細胞等による工業的生産は事実
上不可能である。使用法としてはヒト細胞で直接遺伝子
的発現させる遺伝子治療にのみに限定される。

【００１６】上記のように遺伝子組換え技術を用いてE.
coli 等で発現させても、ハイブリッドポリペプチドは
元の活性を示さない場合が多い。また血管新生調節因子
のターゲッティング技術として、これにフィブロネクチ
ン由来のコラーゲン結合性を付与したハイブリッドポリ
ペプチドを得ることも提案されていない。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、血管新生調
節活性およびコラーゲン結合活性の両活性を有し、血管
新生調節因子のＤＤＳとして有用なハイブリッドポリペ
プチドを提供することを目的としている。さらに、血管
新生調節因子の局所保持または長期的かつ調節可能な徐
放機能を実現するための該ハイブリッドポリペプチドと
コラーゲン由来のポリペプチドとを複合化したバイオマ
テリアル（血管新生調節因子複合化コラーゲン）、およ
びこれらハイブリッドポリペプチドまたはバイオマテリ
アルの用途を提供することを目的としている。またハイ
ブリッドポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え
ベクターおよび該組換えベクターを含む形質転換体を提
供することも目的としている。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記のよう
な課題を遺伝子工学的手法で解決すべく検討したとこ
ろ、フィブロネクチン（以下単にＦＮとも記す）のコラ
ーゲン結合性ドメインと血管新生調節因子とを連結する
ことにより、血管新生調節活性が維持され、かつコラー
ゲンに対する結合活性が付与されたコラーゲン結合性血
管新生調節因子の製造が可能であることを証明し、さら
に該コラーゲン結合性血管新生調節因子とコラーゲン由
来のポリペプチドとを複合化させたバイオマテリアル
（血管新生調節因子複合化コラーゲン）を考案し、本発
明を完成するに至った。すなわち本発明の課題は以下の
１）〜１５）によって解決される。

【００１９】１）本発明に係るハイブリッドポリペプチ
ドは、フィブロネクチン（ＦＮ）のプロテアーゼ分解ま
たは自然分解により得られ、かつコラーゲン結合性ドメ
インを構成するアミノ酸配列、あるいは該配列と相同ま
たは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もし
くは付加されたアミノ酸配列からなるコラーゲン結合性
ポリペプチドと、血管新生調節因子とが連結されてな
り、コラーゲン結合活性および血管新生調節活性を有す
る。

【００２０】２）上記ＦＮのコラーゲン結合性ポリペプ
チドは、ＦＮのアミノ（Ｎ）末端から約２８ｋＤａの位
置から約７５ｋＤａまでの間に位置する。上記プロテア
ーゼは、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、
プラスミン、トロンビン、カテプシンＤ、カテプシン
Ｇ、ペプシン、ズブチリシン、キマーゼ、白血球エラス
ターゼまたは大腸菌由来のプロテアーゼのいずれかであ
るかあるいは２種以上の組合わせが好ましい。プラスミ
ンとキモトリプシンとを併用することがさらに好まし
い。

【００２１】３）上記コラーゲン結合性ポリペプチド
は、ヒト・フィブロネクチン由来であることが好まし
い。具体的に、ヒト・フィブロネクチンのAla²⁶⁰からTr
p⁵⁹⁹までのアミノ酸配列からなるヒト・フィブロネクチ
ン由来のポリペプチドであるか、あるいは該配列と相同
であるか、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿
入または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
であることが好ましい。

【００２２】４）本発明のハイブリッドポリペプチドで
は、上記血管新生調節因子は、上記コラーゲン結合性ポ
リペプチドのカルボキシル末端に連結されている。

【００２３】５）上記血管新生調節因子は、血管新生を
促進する血管新生促進因子または血管新生を阻害する血
管新生阻害因子である。特に血管新生調節因子は、血管
新生促進因子が有用である。血管新生促進因子として
は、具体的に、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び酸性繊維
芽細胞増殖因子などのＦＧＦファミリーに属する細胞成
長因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ１１０、１２
１、１６５、１８９、２０６、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ) 、Ｉ
Ｌ−８、ＩＬ−４、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＨＧＦ、アンジオ
ジェニン、ＥＧＦファミリーに属する細胞成長因子（Ｔ
ＧＦ−α、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子、ＥＧＦ、
アンフィレグリン、ＳＤＧＦ、ベータセルリン）、血小
板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インテグリンαｖβ３、
アンジオポエチン−１、プレイオトロフィン、ミッドカ
イン、組織因子、ＴＮＦ−α（低濃度）、ＩＧＦ（イン
シュリン様成長因子）、ＣＹＲ６１、ＨＧＦのＮＫ１ド
メインおよびＨＧＦのＮＫ２ドメイン、エフリンＢ２、
マトリックスメタロプロティナーゼ、成長ホルモン、Ｇ
−ＣＳＦなどが含まれる。

【００２４】６）血管新生調節因子としては、具体的に
ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する細胞成長因子が挙
げられる。ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する細胞成
長因子には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内
皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および結合組織成長因子
（ＣＴＧＦ）がある。 ７）ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する細胞成長因子
のうちでも、ＶＥＧＦが好適であり、特にＶＥＧＦ１２
１およびＶＥＧＦ１６５が好適である。

【００２５】８）本発明のハイブリッドポリペプチド
は、血管新生調節因子と、ＦＮ由来のコラーゲン結合性
ポリペプチドとが遺伝子工学的手法により連結されたも
のである。

【００２６】上記において、血管新生調節因子とＦＮ由
来のポリペプチドとの連結部位に、スペーサーとしてア
ミノ酸またはポリペプチドが挿入されていてもよい。こ
の場合には、スペーサーまたはスペーサーとその隣接配
列とのいずれかがプロテアーゼ認識配列を含むものが好
ましい。プロテアーゼ認識配列はエンテロキナーゼ、血
液凝固因子Ｘａ、トロンビン、プレシジョン、カリクレ
イン、GenenaseＩまたはレニンが好ましい。プロテアー
ゼ認識配列はエンテロキナーゼの認識配列であることが
さらに好ましい。

【００２７】９）本発明のハイブリッドポリペプチド
は、バクテリアまたは酵母で産生することができる。特
にバクテリア好ましくはEscherichia coli(E. coli) で
産生することができる。 １０）本発明のハイブリッドポリペプチドは、水溶性で
ある。

【００２８】１１）本発明のハイブリッドポリペプチド
は、コラーゲンに結合後、結合を保持したままかまたは
徐放されることにより血管新生調節活性を示す。 １２）本発明は、上記１）〜１１）のいずれかに記載の
ハイブリッドポリペプチドを含有する血管新生調節因子
の局所維持剤、徐放剤、または血管新生調節活性付与剤
を提供する。

【００２９】１３）上記１）〜１１）のいずれかに記載
のハイブリッドポリペプチドとコラーゲン由来のポリペ
プチドとが複合化された血管新生調節因子複合化コラー
ゲンを含有するバイオマテリアル。上記１３）に記載の
バイオマテリアルを用いて血管新生調節活性を介して細
胞、組織、臓器に増殖、分化、再生または物質産生を促
進または阻害する方法。 １４）上記１３）に記載のバイオマテリアルを含有する
血管新生調節因子の局所維持剤、徐放剤、または血管新
生調節活性付与剤。

【００３０】上記ハイブリッドポリペプチドをコードす
る遺伝子を提供することができる。したがって本発明で
は、この遺伝子を含む組換えベクター、形質転換体、バ
クテリアなどの形質転換システムが提供され、具体的に １５）上記１）〜１１）のいずれかに記載のハイブリッ
ドポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えベクタ
ーを提供する。さらに １６）上記１５）の組換えベクターを含む形質転換体が
提供される。

【００３１】上記形質転換体は、バクテリア、酵母、昆
虫細胞および動物細胞を含む。上記１）〜１１）のいず
れかに記載のコラーゲン結合性血管新生調節因子をコー
ドする遺伝子を含有する組換えベクターを含むバクテリ
ア。上記１）〜１１）のいずれかに記載のコラーゲン結
合性血管新生調節因子をコードする遺伝子を含有する組
換えベクターを含むE. coli 。上記１）〜１１）に記載
のコラーゲン結合性血管新生調節因子をE. coli を用い
て生産する方法も挙げられる。

【００３２】

【発明の実施の形態】本発明に係るハイブリッドポリペ
プチドは、フィブロネクチン（ＦＮ）由来のコラーゲン
結合性ドメインのポリペプチドと、血管新生調節因子と
が遺伝子工学的に連結された機能性ハイブリッドポリペ
プチドすなわちコラーゲン結合性血管新生調節因子であ
る。このハイブリッドポリペプチドは、コラーゲン結合
活性および血管新生調節活性の両活性を示し、コラーゲ
ン結合後、血管新生調節活性を示す。

【００３３】本発明では、上記のようにコラーゲン結合
性ポリペプチドとしてＦＮ由来のコラーゲン結合性ポリ
ペプチドを用いることにより、ハイブリッドポリペプチ
ドのコラーゲン結合活性と血管新生調節活性の両方を良
好に維持し、かつコラーゲン結合後の血管新生調節活性
も維持されることが確認されており、新規な機能性ハイ
ブリッドポリペプチドであるコラーゲン結合性血管新生
調節因子とその用途も提供される。これにより、元来コ
ラーゲン結合性を有さない血管新生調節因子は当然のこ
とながら、コラーゲン結合性を有する血管新生調節因子
に対してもＦＮ由来のポリペプチドに依存したコラーゲ
ン結合性を付与することが可能になった。

【００３４】ここで「コラーゲン」とは、コラーゲン、
あるいはゼラチンなどの熱変性コラーゲンを含む意味で
用いられる。したがってコラーゲン結合性は、ゼラチン
結合性と同等の意味を有し、本明細書ではこれらを単に
コラーゲン結合性またはゼラチン結合性と表記すること
もある。

【００３５】フィブロネクチン（ＦＮ）は、血漿、細胞
外マトリックス及び培養細胞表面に存在する細胞接着性
の糖タンパク質で、コラーゲン（ゼラチン）、ヘパリ
ン、フィブリン及びインテグリンなどの生体高分子に結
合し、細胞接着、組織構築及び組織損傷の修復などの生
物学的作用を持つことが知られている(Ruoslahti、Annu
al Review of Biochemistry 、第５７巻、第３７５〜４
１３頁（１９８８））。

【００３６】ＦＮ由来のポリペプチドのコラーゲン結合
活性は、ハイブリッドポリペプチドにおいても強固で非
常に安定である。そして、コラーゲンに結合後、結合を
保持したままかまたは徐放されて血管新生調節活性を示
す新規のバイオマテリアルである血管新生調節因子複合
化コラーゲンを完成することが可能となった。

【００３７】さらに、本発明のコラーゲン結合性血管新
生調節因子は、そのコラーゲン結合性が血漿ＦＮにより
競合阻害される性質を持ち、血漿への暴露、その添加ま
たは共存下ではコラーゲンからの放出が起こり、血漿の
不足した、即ち液性因子（細胞成長因子サイトカインお
よび酵素）の飢餓状態にある部位ではコラーゲンに保持
される特徴を持つのである。したがってコラーゲン結合
性血管新生調節因子の作製において、コラーゲン結合性
ポリペプチド部分としてＦＮ由来のコラーゲン結合性ポ
リペプチドを用いたことが本発明の完成の鍵になってい
る。

【００３８】現在、組換えＤＮＡ技術、遺伝子工学の技
術によれば、ＦＮ由来のどの部分のポリペプチドの遺伝
子でも血管新生調節因子の遺伝子との融合遺伝子を作製
することが原理的には可能である。しかしながら、コラ
ーゲン結合性および血管新生調節活性を維持したままハ
イブリッドポリペプチド( 融合タンパク質) を作製する
には、適切なコラーゲン結合性ポリペプチド配列の選択
が必要である。この配列の選択も本発明の一つである。

【００３９】＜ＦＮ由来のポリペプチド（ＦＮＣＢＤ）
＞すなわち本発明を構成するＦＮ由来のポリペプチドと
は、ＦＮ由来のコラーゲン結合性ポリペプチドであり、
ＦＮの自然分解またはプロテアーゼ分解により得られ
る。好ましくはプロテアーゼによる限定分解で得られ
る。このＦＮのコラーゲン結合性ポリペプチドは、ＦＮ
のアミノ末端から約２８ｋＤａの位置から約７５ｋＤａ
までの間に位置する。

【００４０】具体的に、上記ＦＮ由来のポリペプチド
は、コラーゲンおよび／またはゼラチンに対して結合活
性を有するＦＮ由来のコラーゲン結合性ドメインを構成
するポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、全て相同
であるかまたは１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換、挿入もしくは付加された配列であることが好まし
い。なお本発明において、欠失、置換、挿入もしくは付
加される数個のアミノ酸とは、連続した３個以下のアミ
ノ酸であることが望ましい。

【００４１】上記プロテアーゼとしては、好ましくはト
リプシン、キモトリプシン、サーモリシン、プラスミ
ン、トロンビン、カテプシンＤ、カテプシンＧ、ペプシ
ン、ズブチリシン、キマーゼ、白血球エラスターゼ、ま
たはE. coli 由来のプロテアーゼなどが挙げられ、これ
らのいずれか或いは２種以上組合わせが挙げられる。こ
れらのうちでも、プラスミンとキモトリプシンとを併用
することが好ましい。ＦＮは、ヒトＦＮが好ましいが、
他の動物種のＦＮでもよい。

【００４２】したがって本明細書において、ＦＮのコラ
ーゲン結合性ドメインとは、実質的にＦＮのアミノ末端
から約２８ｋＤａの位置から約７５ｋＤａまでの間に位
置し、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、プ
ラスミン、トロンビン、カテプシンＤ、カテプシンＧ、
ペプシン、ズブチリシン、キマーゼ、白血球エラスター
ゼ、またはE. coli 由来のプロテアーゼのいずれかまた
はそれらプロテアーゼの組み合わせのいずれかにより限
定分解されたＦＮ由来のコラーゲン／ゼラチン結合性ポ
リペプチドを意味する。

【００４３】より具体的にはトリプシン、サーモリシン
またはズブチリシンの限定分解で得られる約３０ｋＤａ
のコラーゲンまたはゼラチン結合性ポリペプチド、ある
いはプラスミンとキモトリプシンの限定分解、カテプシ
ンＤとトロンビンの限定分解、白血球エラスターゼの限
定分解、サーモリシンの限定分解、またはキマーゼの限
定分解で得られるコラーゲンまたはゼラチン結合性の約
３９〜４５ｋＤａのポリペプチドまたはプラスミンとキ
モトリプシンの限定分解で得られるヒトＦＮのＡla²⁶⁰
からＴrp⁵⁹⁹ までのポリペプチドなどである。

【００４４】上記のようなコラーゲン結合性ＦＮポリペ
プチドの別の具体例として、たとえばヒトＦＮのＡla
²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ までのポリペプチドを構成するアミノ
酸配列あるいは、該配列と相同であるかまたはその一部
置換、欠失、挿入または付加体である配列が挙げられ
る。別の具体例として、本発明のヒトＦＮ由来のポリペ
プチドとして、（１）ヒトＦＮのＡla²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹
までのポリペプチドを構成するアミノ酸配列であるか、
該配列と相同であるか、またはそれらの一部欠失体また
は一部置換、欠失、挿入または付加体と同一の配列であ
り、かつカルボキシル末端がヒトＦＮ由来のアミノ酸で
あるプロテアーゼ認識配列を有するもの、（２）ヒトＦ
ＮのＡla²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ までのポリペプチドを構成す
るアミノ酸配列の全てを含む配列であるか、該配列と相
同であるか、またはそれらの一部置換、欠失、挿入また
は付加体と同一の配列、（３）プロテアーゼによる限定
分解でヒトＦＮのＡla²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ までのポリペプ
チドから得られ、かつコラーゲン／ゼラチンに対して結
合活性を有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列で
あるか、該配列と相同であるか、またはその一部置換、
欠失、挿入または付加体である配列が挙げられる。

【００４５】上記のようなＦＮポリペプチドをポリペプ
チドパートナーとするハイブリッドポリペプチドにおい
てゼラチン結合性が維持される事は、例えば本願実施例
で用いたヒト・ＦＮのＡla²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ までのポリ
ペプチドと血管新生調節因子から成るハイブリッドポリ
ペプチドを上述のプロテアーゼで限定分解して得られる
ポリペプチドのゼラチン結合活性を調べることでも比較
的簡単に確認できる。またゼラチン結合性の程度は、高
濃度の塩たとえば２ＭＮａＣｌ存在下での結合の維持、
あるいは血漿ＦＮとの競合阻害実験で調べることができ
る。

【００４６】なお、プロテアーゼによる限定分解で得ら
れ、かつゼラチンに対して結合活性を有するＦＮ由来の
ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と相同であるアミ
ノ酸配列との僅かな相違ではハイブリッドポリペプチド
のコラーゲン結合活性を消失させない例もある得る。

【００４７】ただし、ほとんどの場合、コラーゲン結合
性ドメインの全てまたは一部の配列を含んでいても、プ
ロテアーゼによる分解部位を全く無視して遺伝子工学的
手法でのみ得られるようなＦＮ由来のアミノ酸配列を血
管新生調節因子に融合させて大腸菌で発現させたハイブ
リッドポリペプチドは、著しくコラーゲン結合活性の低
下を招く。

【００４８】従って、遺伝子工学的手法によりハイブリ
ッドのコラーゲン結合性血管新生調節因子を作製する場
合でも、ＦＮ由来のコラーゲン結合性ポリペプチドの配
列選択には、プロテアーゼによる限定分解で得られるゼ
ラチン結合性のポリペプチドと相同の配列を選択して作
製するのがよい。

【００４９】プロテアーゼによる切断部位は、例えばト
リプシンではアルギニンとリジンのＣ末端側、キモトリ
プシンではイソロイシン、ロイシン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンのＣ末
端側、サーモリシンではイソロイシン、ロイシン、バリ
ン、フェニルアラニン、メチオニンのＣ末端側、プラス
ミンではアルギニンとリジンのＣ末端側、トロンビンで
はアルギニンとグリシンの間、カテプシンＤではリジ
ン、チロシン、フェニルアラニンおよびアルギニンのＣ
末端側、ペプシンではロイシン、フェニルアラニン、チ
ロシン、メチオニンのＣ末端側、白血球エラスターゼで
はグリシン、アラニンまたはバリンなどの側鎖の短いア
ミノ酸が２〜３個連続しているアミノ酸のＣ末端側、カ
テプシンＧはロイシン、チロシン、ファニルアラニンの
Ｃ末端側、ズブチリシンはアラニンのＣ末端側などであ
る。

【００５０】ただし、実際のＦＮの分解において、特に
限定分解においては、高次構造に依存して切断され易い
箇所と切断され難い部位があり、切断され易い箇所は限
定される。つまり、プロテアーゼの限定分解で得られる
コラーゲン／ゼラチン結合性のポリペプチドの種類は非
常に限られている。

【００５１】従って、遺伝子工学的作製でコラーゲン結
合性ポリペプチド部分の区切りを選択する場合にもプロ
テアーゼで切断され易い部位を区切りとして選択するの
である。ＦＮのプロテアーゼに切断されやすい部位及び
ゼラチン結合性は、文献または実際にＦＮをプロテアー
ゼで限定分解し、ゼラチンに結合するポリペプチドのア
ミノ末端、カルボキシル末端またはアミノ酸配列を決定
するなどでその部位を調べられる。この文献としては、
Ruoslahti ら、J. Biol. Chem.、第254 巻、第6054-605
9 頁 (1979) 、Balianら、J. Biol. Chem.、第254 巻、
第1429-32 頁、（1979）、Ruoslahti ら、J. Biol. Che
m.、第254 巻、第6054-6059 頁 (1979)、Hahnら、Proc.
Natl. Acad. Sci.、第76巻、第1160-1163 頁 (1979)
、Goldら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.、第76
巻、第4803-7頁、（1979）、Furie ら、J. Biol. Chem.
第255 巻、第4391-4頁、（1980）、Engvall ら、Coll.
Relat.Res. 、第1 巻、第505-516 頁(1981)、McDonald
ら、 J. Biol. Chem. 、第256巻、第5583-7頁（198
1）、Vartio Tら J. Biol. Chem. 第256 巻、第471-7
頁（1981）、De Petro Gら Proc. Natl. Acad. Sci. U
S A.第78巻、第4965-9頁（1981）、Ruoslahti ら、J. B
iol. Chem.、第256 巻、7277-81 頁（1981）、Vartioら
Eur. J. Biochem.第123 巻、第223-33頁、（1982）、Pe
tersenら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第80巻、第137-14
1 頁 (1983) 、Skorstengaard ら、Eur. J. Biochem.、
第 140巻、第235-243 頁 (1984) 、Zardi ら、Eur. J.
Biochem.、第146 巻、第571-579 頁(1985)、Skorstenga
ard ら、 Eur. J. Biochem. 、第161 巻、第 441-453頁
(1986) 等を利用することができる。

【００５２】なお現在まで、ＦＮ由来のコラーゲン結合
性ポリペプチドを同定する研究が多くの研究者によって
なされたが、各研究者の報告で対立があり、いまだに不
明な点が多く残されている（Owens ら、EMBO J、第5
巻、第2825〜2830頁（1986）、Inghamら、J. Biol. Che
m 、第264 巻、第16977 〜16980 頁（1989）、Litvinov
ich ら、J. Mol. Biol、第217 巻、第563 〜575 頁（19
91）、Banyaiら、Eur. J. Biochem 、第193 巻、第801
〜806 頁（1990）、Skorstengaard ら、FEBS letters、
第343 巻、第47〜50頁（1994）、Shimizu ら、Biochimi
ca et BiophysicaActa 、第１３３９巻、第５３〜６１
頁（1997）) 。本発明者らによれば、それらの報告の不
一致は遺伝子工学的に産生されたポリペプチドとプロテ
アーゼ処理で得られたポリペプチドを同様に考えて議論
しているので生じると判断される。

【００５３】遺伝子工学的にＦＮ由来のポリペプチドを
産生する際、不適切な部位で配列を区切り、さらに精製
タッグを付加する事は、本来コラーゲン結合性を有する
領域でもその活性を消失または低下させる原因となって
いる。特にハイブリッドポリペプチド中においては、Ｆ
Ｎ由来のポリペプチド単体でコラーゲン／ゼラチン結合
性を有していてもその結合性が維持されない場合が多
い。すなわち、本来の高次構造をゆがめる原因になり、
機能しなくなるのである。

【００５４】本発明のコラーゲン結合性血管新生調節因
子は、上述したような適切な部位で配列を区切り、かつ
精製タッグを付加しないＦＮのコラーゲン結合性ポリペ
プチドを血管新生調節因子に融合させて作製する。本発
明のコラーゲン結合性血管新生調節因子は、E. coli で
生産された組換えハイブリッドポリペプチドとして、Ｆ
Ｎのコラーゲン／ゼラチン結合性によりゼラチンセファ
ロースに結合し、容易にアフィニティー精製可能であ
り、血管新生調節因子に由来する血管新生調節活性も良
好に維持している。なお、本発明はハイブリッドポリペ
プチドの生産、精製のみならず、特異配列認識プロテア
ーゼなどを併用した血管新生調節因子の生産、精製シス
テムとしても適用可能である。

【００５５】なおコラーゲン結合性ポリペプチドの配列
としては、ＦＮに由来するもの以外では、マトリックス
メタロプロテアーゼであるコラゲナーゼ及びゼラチナー
ゼ並びに細胞外マトリックスではフォンビルブランド因
子、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミ
カン、オステオネクチン、ヴィトロネクチン、トロンボ
スポンジン等に由来する配列などが報告されている。し
かしながら、上述の細菌のコラゲナーゼまたはフォンビ
ルブランド因子由来のコラーゲン結合性ポリペプチドを
選択した試みも含め本発明と同等の機能を持ったハイブ
リッドポリペプチドは報告されていない。

【００５６】本発明では、ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からSer
⁵⁷⁷までのアミノ酸配列で構成されるポリペプチド（特
開昭62-89699号公報記載の配列）の全てを含んでいなく
てもコラーゲン結合性血管新生調節因子のＦＮ由来のポ
リペプチドとして適切であるアミノ酸配列の例を挙げる
ことができる。

【００５７】具体的には、プラスミン、キモトリプシン
とペプシンの限定分解で得られるヒト・ＦＮのAla²⁶⁰か
らLeu³⁷⁶までのアミノ酸配列で構成されるポリペプチ
ド、プラスミン、キモトリプシンとペプシンの限定分解
で得られるヒト・ＦＮのAla ²⁶⁰ からLeu⁴⁸³までのアミ
ノ酸配列で構成されるポリペプチド、トリプシンの限定
分解で得られるヒト・ＦＮのAla²⁶⁰からArg⁴⁸⁴までのア
ミノ酸配列で構成されるポリペプチド、プラスミン、キ
モトリプシンとペプシンの限定分解で得られるヒト・Ｆ
ＮのAla³⁷⁷からLeu⁴⁸³までのアミノ酸配列で構成される
ポリペプチド、プラスミン、キモトリプシンとペプシン
との限定分解で得られるヒト・ＦＮのVal³⁷⁷からTrp⁵⁹⁹
までのアミノ酸配列で構成されるポリペプチド、プラス
ミン、キモトリプシンとペプシンとの限定分解で得られ
るヒト・ＦＮのLeu⁴⁸³からTrp⁵⁹⁹までのアミノ酸配列で
構成されるポリペプチド、トリプシンとキモトリプシン
との限定分解で得られるヒト・ＦＮのArg⁴⁸⁴からTrp⁵⁹⁹
までのポリペプチドのアミノ酸配列である。

【００５８】またヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からSer⁵⁷⁷までの
アミノ酸配列で構成されるポリペプチド配列の全てを含
んでいてコラーゲン結合性血管新生調節因子のＦＮ由来
のポリペプチドとして適切であるポリペプチド配列の例
を挙げることができ、具体的にプラスミンとキモトリプ
シンの限定分解で得られるヒト・ＦＮのAla²⁶⁰からTrp
⁵⁹⁹までのポリペプチド、ズブチリシンとキモトリプシ
ンの限定分解で得られるヒト・ＦＮのVal²⁶²からTrp⁵⁹⁹
までのポリペプチドのアミノ酸配列が挙げられる。

【００５９】なおヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からSer⁵⁷⁷までの
アミノ酸配列で構成されるポリペプチド配列の全てを含
んでいても、コラーゲン結合性血管新生調節因子のＦＮ
由来のポリペプチドとしては、不適切なポリペプチドの
数は膨大であるが、たとえばヒト・ＦＮのAsn²²⁰からSe
r⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのArg²²¹からSer⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのGly²²²からSer⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのAsn²²³からSer⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのLeu²²⁴からSer⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのLeu²²⁵からSer⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのGln²²⁶からSer⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²²⁷からSer⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのIle²²⁸からSer⁵⁷⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からCys¹²⁰¹ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からThr¹²⁰² までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からPhe¹²⁰³ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からAsp¹²⁰⁴ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からAsn¹²⁰⁵ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からLeu¹²⁰⁶ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からSer¹²⁰⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からPro¹²⁰⁸ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からGly¹²⁰⁹ までのアミノ酸配列 などで構成されるポリペプチドが挙げられる。以上か
ら、特開昭62-89699号公報にコラーゲン結合性部分とし
て記載されたヒト・ＦＮのCys²⁷⁷からSer⁵⁷⁷までのポリ
ペプチドのアミノ酸配列の全てを含むか、含まないかは
本発明のコラーゲン結合性血管新生調節因子のＦＮ由来
のポリペプチドのアミノ酸配列の選択には重要でない。

【００６０】またＦＮ由来のポリペプチドとして適切な
場合あるいは不適切な場合のいずれもが、コラーゲン結
合能を有する連続部分として同公報に記載されたThr³⁷⁹
からVal⁴⁴⁵のアミノ酸配列を含んでおり、この連続部分
が本発明のコラーゲン結合性血管新生調節因子のＦＮ由
来のポリペプチドとしての充分条件でもない。このThr
³⁷⁹からVal⁴⁴⁵までを含むThe³⁷⁴からAla⁴⁷⁹までのアミ
ノ酸配列で構成されるポリペプチドは単独でもコラーゲ
ン結合能が無いことが他の論文（Skorstengaardら）で
報告されていることは前述したとおりである。

【００６１】なお前述したように過去の他の研究では、
コラーゲン結合性ポリペプチドと血管新生調節因子を含
むハイブリッドポリペプチドにおいて、コラーゲン結合
活性および血管新生調節活性の両方を維持することは困
難であった。特にこれらハイブリッドポリペプチドは、
コラーゲンに結合後、血管新生調節活性を示す事が実用
上重要になるが、従来これを十分には達成できなかっ
た。

【００６２】＜血管新生調節因子＞本明細書で意味する
血管新生調節因子とは、血管新生促進活性または血管新
生阻害活性を有する血管新生促進因子または血管新生阻
害因子の総称である。血管新生促進因子は、塩基性繊維
芽細胞増殖因子及び酸性繊維芽細胞増殖因子などのＦＧ
Ｆファミリー、血管内皮細胞増殖因子( ＶＥＧＦ１１
０、１２１、１６５、１８９、２０６、−Ｂ、−Ｃ、−
Ｄ) 、ＩＬ−８、ＩＬ−４、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＨＧＦ、
アンジオジェニン、ＥＧＦファミリーに属する細胞成長
因子（ＴＧＦ−α、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子、
ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＳＤＧＦ、ベータセルリ
ン）、ＰＤＧＦ、インテグリンαｖβ３、アンジオポエ
チン−１、プレイオトロフィン、ミッドカイン、組織因
子、ＴＮＦ−α（低濃度）、ＩＧＦ、ＣＹＲ６１、ＨＧ
ＦのＮＫ１ドメインおよびＨＧＦのＮＫ２ドメイン、エ
フリンＢ２、マトリックスメタロプロティナーゼ、Ｇ−
ＣＳＦ、成長ホルモンなどである。血管新生阻害因子
は、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＨＧＦのＮＫ
４、トロンボモジュリン、ＩＦＮ−α／ＩＮＦ−β、Ｔ
ＮＦ−α（高濃度）、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−１
２、ＩＰ−１０、ＧＲＯ−β、ＰＦ−４、コンドロモジ
ュリン、アンジオポエチン−２、ＴＩＭＰ−１，２、軟
骨細胞由来抑制因子、プロトロンビン（クリングル２）
などである。

【００６３】血管新生調節因子として、特にＰＤＧＦス
ーパーファミリーに属する細胞成長因子が挙げられる。
ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する細胞成長因子に
は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増
殖因子（ＶＥＧＦ）および結合組織成長因子（ＣＴＧ
Ｆ）がある。なおＣＴＧＦは、具体的にGrowth Factor
s,Mckay and Leigh edt. IRL Press(1993)に記載されて
いる。ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する細胞成長因
子のうちでも、ＶＥＧＦが好適である。

【００６４】ＶＥＧＦの活性にはダイマー（二量体）化
が必要であるが、ホモダイマーは酸に安定であり、糖鎖
を持つがレセプターへの結合や細胞増殖には影響しな
い。ＶＥＧＦのレセプターは、flt-1 と kdr／flk-1 が
コードするタンパク質である。ＶＥＧＦには４つのアイ
ソフォームが一般的には知られ、それぞれ、１２１（Ｖ
ＥＧＦ１２１）、１６５（ＶＥＧＦ１６５）、１８９
（ＶＥＧＦ１８９）、２０６個（ＶＥＧＦ２０６）のア
ミノ酸配列からなり、ＶＥＧＦ１６５が最もよく研究さ
れている。特にＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５が
好適である。

【００６５】＜血管新生調節活性＞血管新生調節活性と
は、内皮細胞の増殖、遊走、プラスミノーゲンアクチベ
ータやコラゲナーゼなどのプロテアーゼ活性、血管様構
造形成およびin vivo での血管新生のいずれか一部、ま
たは全てを促進または阻害する活性を意味する。また本
明細書において、血管新生調節活性とは、上述した血管
新生調節因子由来の活性の一部または全てを意味し、本
質的に、血管新生の正負の調節に関わり、局所保持また
はターゲティングというデリバリーシステムの対象にな
るポリペプチドに対して血管新生調節因子と総称してい
る。

【００６６】＜ハイブリッドポリペプチド＞本発明にお
けるフィブロネクチンコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮ
ＣＢＤ）と血管新生調節因子は、遺伝子工学的手法によ
り、血管新生調節因子がＦＮＣＢＤのカルボキシル末端
側に連結されていることが望ましい。本発明のコラーゲ
ン結合性血管新生調節因子は水溶性である。またバクテ
リア好ましくはE.coliで工業的に生産することができ
る。したがって血管新生調節因子が該フィブロネクチン
由来のポリペプチドのカルボキシル末端に遺伝子工学的
手法により連結され、バクテリア好ましくはE.coliで産
生されることが望ましい。また酵母、昆虫細胞、動物細
胞で産生することも可能である。

【００６７】例えば、ＦＮのコラーゲン結合性ドメイン
のカルボキシル末端側に血管新生調節因子を連結させ、
血管新生調節因子のアミノ末端側にプロテアーゼ（例え
ばヒトの生体中に存在する）により切断され得る任意の
アミノ酸配列を挿入し、余分な配列を付加せずに血管新
生調節因子を遊離させることが可能である。詳しく説明
すると、多くのプロテアーゼは認識配列のカルボキシル
末端を切断するので、血管新生調節因子のアミノ末端に
プロテアーゼ認識配列を付加すると、プロテアーゼによ
る切断後は血管新生調節因子のアミノ末端には余分なア
ミノ酸配列が残らないのである。このプロテアーゼの認
識配列は新しく挿入するだけでなく、ＦＮのコラーゲン
結合性ドメインのＣ末端側がプロテアーゼ認識配列及び
切断部位でもよい。従って、直接このカルボキシル末端
に血管新生調節因子を連結すれば全く人工的な配列の挿
入を含めないことも可能である。そして、この部位にお
ける切断後は、ＦＮのコラーゲン結合性ドメイン及び血
管新生調節因子の両者ともに余分なアミノ酸配列は残存
しない。マトリクラインおよびジャクスタクライン活性
という固相からレセプターに結合して、細胞に血管新生
調節活性を及ぼす様式が可能な場合は、ハイブリッドポ
リペプチドのままでもレセプターに結合し血管新生調節
活性を示すことが可能かもしれない。一方、血管新生調
節因子がＦＮのコラーゲン結合性ドメインから切断さ
れ、液相に遊離する必要がある場合、上記方法は重要で
ある。

【００６８】上記のようにＦＮＣＢＤと血管新生調節因
子とが連結された本発明のコラーゲン結合性血管新生調
節因子は、コラーゲンに対する結合活性及び血管新生調
節活性の両活性が維持されていることから、血管新生調
節因子をコラーゲンマトリックス中に安定に保持させる
ことが可能となり、血管新生調節活性を持続的に示すこ
とができる。

【００６９】上記において、血管新生調節因子と該フィ
ブロネクチン由来のポリペプチドの連結部位にスペーサ
ーとしてアミノ酸またはポリペプチドが挿入されていて
もよい。この場合、該スペーサーと該スペーサー及びそ
の隣接配列とのいずれかがプロテアーゼ認識配列を含む
ものが好ましい。プロテアーゼ認識配列はエンテロキナ
ーゼ、血液凝固因子Ｘａ、トロンビン、プレシジョン、
カリクレイン、GenenaseＩまたはレニンが好ましい。ま
たプロテアーゼ認識配列はエンテロキナーゼの認識配列
であることがさらに好ましい。

【００７０】エンテロキナーゼ認識配列は、スペーサー
としてＦＮＣＢＤとＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１６５
との間の距離の調整やエンテロキナーゼによりＦＮＣＢ
ＤからＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１６５が遊離するた
めの役割を果たす。エンテロキナーゼは高等動物の十二
指腸粘膜、膵臓に存在するプロテアーゼである。従っ
て、エンテロキナーゼ認識配列は十二指腸粘膜、膵臓で
エンテロキナーゼにより認識、切断され、ＶＥＧＦ１２
１又はＶＥＧＦ１６５が遊離される。また、エンテロキ
ナーゼはＤＤＤＤＫ（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ）という非
常に特異的配列を認識してＫ(Lys) のＣ末端側を切断す
る酵素であり、コラーゲン結合性血管新生調節因子の血
管新生調節活性を示すメカニズムを研究するために必要
な配列である。

【００７１】本発明のハイブリッドポリペプチドのコラ
ーゲン結合活性またはコラーゲン結合性は、ＦＮ由来の
ポリペプチドに依存したコラーゲンに対する結合性であ
り、血管新生調節因子に依存したコラーゲンへの結合で
はない。コラーゲン結合活性がＦＮに由来するかまたは
血管新生調節因子に由来するのかは天然のＦＮまたは血
管新生調節因子を用いた競合阻害実験で確認可能であ
る。

【００７２】本明細書で意味するコラーゲンまたはコラ
ーゲン由来のポリペプチドは、天然コラーゲン、未成熟
コラーゲン、アテロコラーゲン、またはゼラチン或いは
それらを構成するポリペプチドである。

【００７３】本発明のハイブリッドポリペプチドの一用
途として、上記コラーゲン結合性血管新生調節因子を含
む血管新生調節因子の局所維持剤、徐放剤、または血管
新生調節活性付与剤が提供される。またコラーゲンの分
解によるかまたは血管新生調節因子とＦＮ由来のポリペ
プチドとの連結部位またはその近傍におけるプロテアー
ゼによる切断によって血管新生調節因子が徐放され、血
管新生調節活性がコントロールされるバイオマテリアル
が提供される。上記バイオマテリアルを用いて血管新生
調節活性を介した細胞、組織、臓器に、増殖、分化、再
生または物質産生を促進または阻害する方法を提供する
ことができる。

【００７４】従って、例えば、閉塞性動脈硬化症、心筋
梗塞または狭心症に対して効果的な血管新生療法または
再狭窄防止を発揮させるためのＶＥＧＦなどの血管新生
促進因子の徐放性、局所保持またはターゲティングを狙
ったコラーゲン結合性血管新生調節因子及び血管新生調
節因子複合化コラーゲンマトリックスが提供される。心
臓や下肢など生体組織は多くの割合でコラーゲンから構
成されていて、あらゆる部位でコラーゲンは存在してい
るため、血管新生調節因子にコラーゲン結合性が備わっ
ていれば、投与した部位またはその近傍のコラーゲンに
結合し、局所濃度を高く維持し、有効性が高まる。それ
と同時に他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐことにな
る。

【００７５】また本発明では、上記コラーゲン結合性血
管新生調節因子（ハイブリッドポリペプチド）を用いた
細胞増殖方法が提供される。すなわち本発明の血管新生
調節因子が細胞増殖因子であるハイブリッドポリペプチ
ドは、そのコラーゲン／ゼラチン結合性を利用してコラ
ーゲン／ゼラチンマトリックスに固定することができ、
細胞増殖因子は灌流される培養液で流出しないため、容
易に細胞増殖を行うことができる。

【００７６】本発明は、血管新生療法や再狭窄防止を目
的とするＶＥＧＦの例に限られず、血管新生調節活性を
持つ多くのポリペプチドに適用可能である。即ち、本発
明により、さまざまな血管新生調節因子の血管新生調節
活性が維持され、かつコラーゲンに対する結合活性が付
与されることで血管新生調節因子の徐放性、局所保持ま
たはターゲティングを狙ったコラーゲン結合性血管新生
調節因子が提供される。

【００７７】また上記コラーゲン結合性血管新生調節因
子をコードする遺伝子、および該遺伝子を含有する組換
えベクター、該遺伝子を含有する形質転換体（動物細
胞、昆虫細胞、酵母、細菌）、または該遺伝子を含有す
るバクテリア好ましくはE. coli も提供される。さら
に、該コラーゲン結合性血管新生調節因子をコードする
遺伝子をレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴
ベクター等のウイルスベクターまたはリポソーム法等を
用いたベクターに組み込むことで遺伝子治療用ベクター
が提供され、さらに該ベクターが導入されることで該ポ
リペプチドまたは該遺伝子を含む細胞医薬が提供され
る。

【００７８】該ポリペプチドをコラーゲンと複合化させ
ること血管新生調節因子複合化コラーゲンマトリックス
が提供され、医療分野で利用される新規な組織再生のバ
イオマテリアルとして有用である。すなわち本発明は、
人工組織、人工器官（血管、神経、耳、鼻、指、皮膚、
十二指腸などの腸管、胃、心臓、肝臓、膵臓、腎臓な
ど）を構築させるための足場と血管新生調節活性を兼ね
備えた血管新生調節因子複合化コラーゲンを含むバイオ
マテリアルを提供する。

【００７９】以下に本発明の実施態様例について、より
詳細に説明する。ヒトＦＮのｃＤＮＡ及びタンパク質の
一次構造は、各々 EMBL データバンク（EMBL DATA BANK
)及びThe EMBO Journal、第４巻、第７号、1755-1759
頁 (1985) に記載されている。

【００８０】まず、ヒトＦＮをプロテアーゼ（プラスミ
ンとキモトリプシン）で限定分解して得られるコラーゲ
ン／ゼラチン結合性ドメインのアミノ酸配列に相当する
配列をクローニングする。ヒトの細胞から抽出されたｍ
ＲＮＡを用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡか
ら、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction ： Saiki
ら、Science 、第２３０巻、１３５０〜１３５４頁（１
９８５））によりヒトＦＮのコラーゲン結合性ドメイン
（ＦＮＣＢＤ）に対応するｃＤＮＡ部分が増幅される。
この際、ＰＣＲに用いられるセンスプライマーには５'
末端に制限酵素認識配列と開始コドン配列が、またアン
チセンスプライマーには５' 末端に制限酵素認識配列と
終始コドンが付加されている。

【００８１】そして、ＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ断片がクロ
ーニングベクターpBlueScript SKに挿入され、プラスミ
ドpBS(ＦＮＣＢＤ) が構築される。塩基配列確認後、こ
のｃＤＮＡ断片が切り出され発現ベクター pTYB1に組み
込まれてプラスミドpTYB1(ＦＮＣＢＤ) が構築される。
pTYB1(ＦＮＣＢＤ) は、ヒトＦＮのAla²⁶⁰−Trp⁵⁹⁹（３
４０アミノ酸残基）を発現するプラスミドであり、大腸
菌に導入されることによりコラーゲン結合性ポリペプチ
ドが調製される。

【００８２】本発明で必要とされるＦＮＣＢＤのｃＤＮ
Ａとしては、プラスミドpBS(ＦＮＣＢＤ) 由来のｃＤＮ
Ａ断片が用いられるが、ＰＣＲプライマーの設計によ
り、ｃＤＮＡ断片の５' 末端には開始コドン配列が付加
されており、ＦＮＣＢＤ翻訳領域のＣ末端に付加された
終止コドン直前にクローニングサイト、例えばＸｈｏＩ
の認識配列が導入されている。これにより、ＦＮＣＢＤ
のｃＤＮＡと血管新生調節因子のｃＤＮＡを連結させる
ことが可能である。

【００８３】本発明のポリペプチドは、ＦＮＣＢＤのｃ
ＤＮＡと血管新生調節因子のｃＤＮＡを連結し、遺伝子
工学的に発現させて調製される。本発明による機能性ポ
リペプチドは、例えば、ヒトＦＮをプロテアーゼ（プラ
スミンとキモトリプシン）で限定分解したときに得られ
る配列表配列番号４で表されるAla ²⁶⁰ −Trp ⁵⁹⁹ に相
当する３４０アミノ酸残基のポリペプチドを、配列表配
列番号８あるいは配列番号１２で表されるヒトＶＥＧＦ
１２１あるいはヒトＶＥＧＦ１６５に各々結合させた人
工の機能性ポリペプチドである。即ち、該ポリペプチド
はＦＮＣＢＤのｃＤＮＡにＶＥＧＦ１２１またはヒトＶ
ＥＧＦ１６５のｃＤＮＡが連結され、遺伝子工学的に調
製される。

【００８４】配列表配列番号４のアミノ酸番号１はヒト
ＦＮＣＢＤを遺伝子工学的に発現させるための開始コド
ンに対応するMet 、アミノ酸番号２〜３４１はヒトＦＮ
ＣＢＤのアミノ酸配列、アミノ酸番号３４２〜３４３は
血管新生調節因子のｃＤＮＡと連結するためのＸｈｏＩ
認識配列由来のアミノ酸Leu 及びGlu である。但し、ハ
イブリッドポリペプチドではＸｈｏＩ認識配列とＳａｌ
Ｉ認識配列の連結によりGlu は除かれる。

【００８５】配列表配列番号８のアミノ酸番号1 はＦＮ
ＣＢＤのｃＤＮＡとの連結するためのＳａｌＩ認識配列
由来のAsp 、アミノ酸番号１〜５はエンテロキナーゼの
認識配列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ;DDDDK) 、アミノ酸番
号６〜１２６はヒトＶＥＧＦ１２１のアミノ酸配列であ
る。

【００８６】配列表配列番号１２のアミノ酸番号１はＦ
ＮＣＢＤのｃＤＮＡと連結するためのＳａｌＩ認識配列
由来のAsp 、アミノ酸番号１〜５はエンテロキナーゼの
認識配列（DDDDK)、アミノ酸番号６〜170 はヒトＶＥＧ
Ｆ１６５のアミノ酸配列である。

【００８７】なお、ヒトＦＮのアミノ酸に付された肩数
字はEMBLデータバンク（EMBL DATABANK )中の成熟型ヒ
トＦＮのＮ末端から数えたアミノ酸残基数を示す。ま
た、配列表配列番号４で表されるヒトＦＮのAla²⁶⁰−Tr
p⁵⁹⁹に相当する３４０アミノ酸残基のポリペプチドは、
EMBL DATA BANK中のアミノ酸配列と２アミノ酸残基異な
り、人工的変異ではない。

【００８８】ヒトＶＥＧＦ１２１のｃＤＮＡ及びタンパ
ク質の一次構造は、Weindel ら、(Biochemical and Bio
physical Research communications、第183 巻、第3
号、1167-1174 頁（1992））に記載されている。また、
ヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡ及びタンパク質の一次構
造は、Leung ら（Science 、第246 巻、1306−1309頁
（1989））に記載されている。

【００８９】本発明では、ヒトのｍＲＮＡを用いて調製
したｃＤＮＡから、ＰＣＲ法によりヒトＶＥＧＦ１２１
及びヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡが増幅される。それ
ぞれのＰＣＲには５' 末端に制限酵素認識配列とプロテ
アーゼ認識配列をコードする塩基配列が付加されたセン
スプライマーと５' 末端に制限酵素認識配列が付加され
たアンチセンスプライマーを用いた。次に、これらｃＤ
ＮＡ断片をpBluescripSKに挿入して、pBS(ＶＥＧＦ１２
１) ベクター及びpBS(ＶＥＧＦ１６５) ベクターが作成
される。

【００９０】前記したヒトＦＮＣＢＤのc ＤＮＡをプラ
スミドpBS(ＶＥＧＦ１２１) あるいはpBS(ＶＥＧＦ１６
５) のヒトＶＥＧＦ１２１あるいはヒトＶＥＧＦ１６５
の５′末端制限酵素認識配列に結合し、ヒトＦＮＣＢＤ
のＣ末端にヒトＶＥＧＦ１２１またはヒトＶＥＧＦ１６
５の各々が連結しているｃＤＮＡを有するプラスミドpB
S(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１) あるいはpBS(ＦＮＣＢ
Ｄ−ＶＥＧＦ１６５)が得られる。これらのプラスミド
から切り出された融合遺伝子断片を発現ベクターpTYB1
に挿入し、配列表配列番号１４または配列番号１６で表
されるポリペプチドを発現する組換体プラスミドpTYB1
(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１) またはpTYB1(ＦＮＣＢ
Ｄ−ＶＥＧＦ１６５) が得られる。

【００９１】ＦＮＣＢＤのｃＤＮＡとＶＥＧＦ１２１ま
たはＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡとの連結部位にはＰＣＲ
プライマー由来の塩基配列が挿入されており、エンテロ
キナーゼ認識配列などをスペーサーペプチドとして発現
させることにより、ＦＮＣＢＤに対するＶＥＧＦ１２１
またはヒトＶＥＧＦ１６５の分子間距離の調整および／
またはプロテアーゼ認識配列の挿入が可能である。スペ
ーサー中のプロテアーゼ認識配列の有無、種類、ペプチ
ドの配列、長さは目的に応じて選択する。

【００９２】配列表配列番号１４はヒトＦＮＣＢＤとヒ
トＶＥＧＦ１２１のハイブリッドポリペプチドであり、
アミノ酸番号１は開始コドンに対応するMet 、アミノ酸
番号２〜３４１はヒトＦＮＣＢＤのアミノ酸配列、アミ
ノ酸番号３４２〜３４３はヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡと
ＶＥＧＦ１２１のｃＤＮＡとの連結（ＸｈｏＩ認識配列
とＳａｌＩ認識配列のライゲーション）により生じる塩
基配列がコードするLeu 及びAsp 、アミノ酸番号３４３
〜３４７はエンテロキナーゼの認識配列Asp-Asp-Asp-As
p-Lys （DDDDK)、アミノ酸番号３４８〜４６８はヒトＶ
ＥＧＦ１２１のアミノ酸配列である。ただし、アミノ酸
番号１の開始コドンに対応するMet は、翻訳後、除かれ
る場合と除かれない場合がある。

【００９３】配列表配列番号１６はヒトＦＮＣＢＤとヒ
トＶＥＧＦ１６５のハイブリッドポリペプチドであり、
アミノ酸番号1 は開始コドンに対応するMet 、アミノ酸
番号2 〜341 はヒトＦＮＣＢＤのアミノ酸配列、アミノ
酸番号３４２〜３４３はヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡとヒ
トＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡとの連結（ＸｈｏＩとＳａ
ｌＩサイトのライゲーション）により生じる塩基配列が
コードするLeu 及びAsp 、アミノ酸番号３４３〜３４７
はエンテロキナーゼ認識配列（DDDDK)、アミノ酸番号３
４８〜５１２はヒトＶＥＧＦ１６５のアミノ酸配列であ
る。ただし、アミノ酸番号１の開始コドンに対応するMe
t は、翻訳後、除かれる場合と除かれない場合がある。

【００９４】上記の様に構築されたプラスミドpTYB1(Ｆ
ＮＣＢＤ) 、pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１) 及び
pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５) は各々大腸菌に導
入され、適当な条件下で培養されることにより、目的ポ
リペプチドが大腸菌内に蓄積される。発現の確認にはイ
ムノブロッティングが用いられる。即ち、組換え大腸菌
の全菌体タンパク質が SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分離され、ニトロセルロース膜転写後、ＦＮＣ
ＢＤ、ＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５の各々を
認識するモノクローナル抗体で目的ポリペプチドのバン
ドが検出される。

【００９５】本発明のポリペプチドは、例えば次のよう
に調製される。プラスミドが導入された組換え大腸菌は
SBブロス等の培地で培養され、ＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−ガラクトシド）が添加される。これによって
導入された遺伝子の発現が誘導され、さらに培養してか
ら菌体が回収される。集められた菌体は超音波処理によ
って破砕される。そして、菌体破砕液から遠心分離して
回収される沈殿に目的ポリペプチドは封入体として得ら
れ、８Ｍ尿素により変性可溶化される。

【００９６】次いで、尿素濃度を段階的に低下させなが
ら透析して、目的タンパク質が再活性化される（リフォ
ールディング処理）。以上のように調製される４０ｋＤ
ａ、53.5ｋＤａ及び58.5ｋＤａのポリペプチドは各々、
ＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤとＶＥＧＦ１２１とのハイブリ
ッドポリペプチド（ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１）及び
ＦＮＣＢＤとヒトＶＥＧＦ１６５とのハイブリッドポリ
ペプチド（ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５）である。

【００９７】

【実施例】以下、本発明の実現性を実施例により具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。 （実施例１）ヒトＦＮＣＢＤとヒトＶＥＧＦ１２１との
ハイブリッドポリペプチド、及びヒトＦＮＣＢＤとヒト
ＶＥＧＦ１６５とのハイブリッドポリペプチドの調製 （ａ）ヒトＦＮＣＢＤをコードするｃＤＮＡのクローニ
ング ヒト腎臓の細胞から抽出したｍＲＮＡをテンプレートと
してプライマー（２）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、プ
ライマー（１）及び（２）の１組のプライマーを用い
て、プラスミンとキモトリプシンで限定分解したときの
配列に相当するヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅
させた（ＲＴ−ＰＣＲ）。

【００９８】配列表配列番号１で表されるプライマー
（１）の塩基番号1 〜２は、ＰＣＲ後のＫｐｎＩ消化に
備えた隣接付加配列、塩基番号３〜８は、クローニング
用のＫｐｎＩ認識配列、塩基番号７〜12は、ＮｃｏＩ認
識配列、塩基番号13〜14は、発現フレーム合わせの配
列、塩基番号15〜20は、ＮｄｅＩ認識配列、塩基番号18
〜20は、ヒトＦＮＣＢＤを発現させるための開始コドン
配列、塩基番号21〜49は、ヒトＦＮＣＢＤの塩基配列で
ある。

【００９９】また、配列表配列番号２で表されるプライ
マー（２）の塩基番号１〜２は、ＰＣＲ後のＢａｍＨＩ
消化に備えた隣接付加配列、塩基番号３〜８は、クロー
ニング用のＢａｍＨＩ認識配列、塩基番号９〜11は、終
止コドンのアンチセンス配列、塩基番号12〜17は、ＶＥ
ＧＦ１２１またはヒトＶＥＧＦ１６５などの血管新生調
節因子のｃＤＮＡと連結させるためのＸｈｏＩ認識配
列、塩基番号18〜46は、ヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡのア
ンチセンス配列である。

【０１００】ＲＴ−ＰＣＲは、RNA LAPCR Kit (AMV) Ve
r.1.1 （宝酒造）を用いて、まずトータルＲＮＡ 0.8μ
ｇを２０μｌの反応液量で６０℃で２０分間逆転写し、
さらに９９℃で５分間加温した。得られたｃＤＮＡをテ
ンプレートとしたＰＣＲ反応は、１００μｌの反応液量
で、９４℃で１分間保持した後、９４℃で３０秒間→６
３℃で１分間→７２℃で２分間の温度サイクルを１２回
繰り返した。反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動
で解析した結果、約１kbp のＤＮＡ断片が認められた。
これは、ヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡに相当するサイズで
あった。

【０１０１】この増幅されたｃＤＮＡ断片をＫｐｎＩ及
びＢａｍＨＩで消化後、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化
したクローニングベクターpBluescriptSK に、２５℃で
３分間、ライゲーションした（宝酒造製ライゲーション
キットVer.２を使用）。

【０１０２】塩基配列解析の結果、配列表配列番号３で
表されるｃＤＮＡが組み込まれたプラスミド得られ、こ
れをｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ) と命名した。配列表配列番号
３の塩基番号１〜６は、クローニング用のＫｐｎＩ認識
配列、塩基番号５〜10は、ＮｃｏＩ認識配列、塩基番号
11〜12は、フレーム合わせの配列、塩基番号13〜18は、
ＮｄｅＩ認識配列、塩基番号16〜18は、ヒトＦＮＣＢＤ
を発現させるための開始コドン配列、塩基番号19〜1038
は、ヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡの塩基配列、塩基番号10
39〜1044は、ＶＥＧＦ１２１またはヒトＶＥＧＦ１６５
などの血管新生調節因子のｃＤＮＡと連結させるための
ＸｈｏＩ認識配列、塩基番号1045〜1047は、終止コド
ン、塩基番号1048〜1053は、クローニング用のＢａｍＨ
Ｉ認識配列である。なおＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ配列は、
ＥＭＢＬデータバンク（EMBL DATA BANK )に登録された
配列と５塩基異なっていたが、この相違はＰＣＲによる
点変異に起因しないことは確認している。

【０１０３】（ｂ）ヒトＶＥＧＦ１２１をコードするｃ
ＤＮＡのクローニング ヒト細胞より抽出したｍＲＮＡをテンプレートとしてプ
ライマー（４）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、プライマ
ー（３）及び（４）の１組のプライマーを用いてヒトＶ
ＥＧＦ１２１のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。配列表配
列番号５で表されるプライマー（３）の塩基番号１〜２
はＰＣＲ後のＳａｌＩ消化に備えた隣接付加配列、塩基
番号３〜８はクローニング用及びＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ
との連結用ＳａｌＩ認識配列、塩基番号６〜20はエンテ
ロキナーゼの認識配列（DDDDK)をコードした塩基配列、
塩基番号21〜44はヒトＶＥＧＦ１２１のｃＤＮＡの塩基
配列である。

【０１０４】また配列表配列番号６で表されるプライマ
ー（４）の塩基番号１は、ＰＣＲ後のＥｃｏＲＩ消化に
備えた隣接付加配列、塩基番号２〜７は、クローニング
用のＥｃｏＲＩ認識配列、塩基番号８〜10は、終止コド
ンのアンチセンス配列、塩基番号11〜31は、ヒトＶＥＧ
Ｆ１２１のｃＤＮＡのアンチセンス配列である。

【０１０５】ＲＴ−ＰＣＲはRNA LAPCR Kit (AMV) Ver.
1.1 （宝酒造）を用い、まずテンプレートのトータルＲ
ＮＡ 1.0μｇを反応液量２０μｌで、６０℃で２０分間
逆転写し、さらに９９℃で５分間加熱した。ＰＣＲ反応
は、ｃＤＮＡを加えた１００μｌの反応液で、９４℃で
２分間保持した後、９４℃で３０秒間→６５℃で４分間
の温度サイクルを３０回行った。反応液の1/10量をアガ
ロースゲル電気泳動で解析した結果、約３９０ｂｐのＤ
ＮＡ断片が認められた。これはヒトＶＥＧＦ１２１に相
当するサイズであった。

【０１０６】このｃＤＮＡ断片をＳａｌＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで消化後、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化したpBlues
criptSK にライゲーションした。そして配列表配列番号
７で表されるｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドを得て
ｐＢＳ（ＶＥＧＦ１２１) と命名した。配列表配列番号
７の塩基番号１〜６は、クローニング用及びＦＮＣＢＤ
のｃＤＮＡとの連結用ＳａｌＩ認識配列、塩基番号４〜
18はエンテロキナーゼの認識配列（DDDDK)をコードする
塩基配列、塩基番号19〜381 はヒトＶＥＧＦ１２１のｃ
ＤＮＡの塩基配列、塩基番号382 〜384 は終止コドン、
塩基番号385 〜390 はクローニング用のＥｃｏＲＩ認識
配列である。

【０１０７】（ｃ）ヒトＶＥＧＦ１６５をコードするｃ
ＤＮＡのクローニング ヒト細胞より抽出したｍＲＮＡをテンプレートとしてプ
ライマー（６）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、プライマ
ー（５）及び（６）の１組のプライマーを用いてヒトＶ
ＥＧＦ１６５のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。配列表配
列番号９で表されるプライマー（５）の塩基番号１〜２
はＰＣＲ後のＳａｌＩ消化に備えた隣接付加配列、塩基
番号３〜８はクローニング用及びＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ
との連結用ＳａｌＩ認識配列、塩基番号6 〜20はエンテ
ロキナーゼの認識配列（DDDDK)をコードした塩基配列、
塩基番号21〜44はヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡの塩基
配列である。

【０１０８】また、配列表配列番号１０で表されるプラ
イマー（６）の塩基番号１はＰＣＲ後のＥｃｏＲＩ消化
に備えた隣接付加配列、塩基番号２〜７はクローニング
用のＥｃｏＲＩ認識配列、塩基番号８〜10は終止コドン
のアンチセンス配列、塩基番号11〜31は、ヒトＶＥＧＦ
１６５のｃＤＮＡのアンチセンス配列である。

【０１０９】ＲＴ−ＰＣＲは、TaKaRa RNA LA ＰＣＲTM
Kit (AMV) Ver.1.1（宝酒造）を用い、まずテンプレー
トのトータルＲＮＡ 1.0μg を反応液量２０μｌで、６
０℃で３０分間逆転写反応させ、９９℃で５分間加熱し
た。ＰＣＲ反応は、反応液量１００μｌで９４℃で１分
間保持した後、９４℃で３０秒間→６５℃で４５秒間の
温度サイクルを３０回行った。

【０１１０】反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動
で解析した結果、約520 ｂｐのＤＮＡ断片が認められ
た。これは、ヒトＶＥＧＦ１６５に相当するサイズであ
った。このＤＮＡ断片をＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化
後、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化したpBluescriptSK
にライゲーションした。そして、配列表配列番号１１で
表されるｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドが得られ、
ｐＢＳ（ＶＥＧＦ１６５) と命名した。

【０１１１】配列表配列番号１１の塩基番号１〜６はク
ローニング用及びＦＮＣＢＤのｃＤＮＡとの連結用Ｓａ
ｌＩ認識配列、塩基番号４〜18はエンテロキナーゼの認
識配列（DDDDK)をコードした塩基配列、塩基番号19〜51
3 はヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡの塩基配列、塩基番
号514 〜516 は終止コドン配列、塩基番号517 〜522 は
クローニング用のＥｃｏＲＩ認識配列である。

【０１１２】（ｄ）ヒトＦＮＣＢＤ発現ベクターの調製 上記（ａ）で得られたプラスミドｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ)
を、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩ（ＮｏｔＩ認識配列はpBlues
criptSK のマルチクローニングサイトに存在）で処理し
た。挿入されていたＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ断片を切り出
し、発現ベクターであるｐＴＹＢ１（New England BioL
ab) のＮｄｅＩ−ＮｏｔＩサイトにライゲーションし
た。構築されたプラスミドをｐＴＹＢ（ＦＮＣＢＤ) と
命名した。

【０１１３】（ｅ）ＦＮＣＢＤとＶＥＧＦ１２１とのハ
イブリッドポリペプチド発現ベクターの調製 上記（ａ）で得られたプラスミドｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ)
はＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化された。なお、EMBL DAT
A BANKに登録されたＦＮＣＢＤ配列にはＸｈｏＩ認識配
列は存在しないがヒトのメサンギウム細胞ＲＮＡからＲ
Ｔ−ＰＣＲで得られたＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ配列中には
ＸｈｏＩ認識配列が存在したので部分消化した。

【０１１４】この処理により挿入されていたＦＮＣＢＤ
のｃＤＮＡ断片が切り出され、上記（ｂ）で得られたプ
ラスミドｐＢＳ（ＶＥＧＦ１２１) のＫｐｎＩ−Ｓａｌ
Ｉサイトにライゲーションされた。このように構築され
たプラスミドには、配列表配列番号１３で表されるＤＮ
Ａが組み込まれており、このプラスミドをｐＢＳ（ＦＮ
ＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１) と命名した。

【０１１５】配列表配列番号１３の塩基番号１〜６はク
ローニング用ＫｐｎＩ認識配列、塩基番号５〜10はＮｃ
ｏＩ認識配列、塩基番号11〜12はフレーム合わせの配
列、塩基番号13〜18はＮｄｅＩ認識配列、塩基番号16〜
18は開始コドン配列、塩基番号19〜1038はヒトＦＮＣＢ
ＤのｃＤＮＡ配列、塩基番号1039〜1044はＸｈｏＩ認識
配列とＳａｌＩ認識配列のライゲーションによって生じ
た塩基配列、塩基番号1042〜1056はエンテロキナーゼの
認識配列（DDDDK)をコードする塩基配列、塩基番号1057
〜1419はヒトＶＥＧＦ１２１のｃＤＮＡ配列、塩基番号
1420〜1422は終止コドン、塩基番号1423〜1428はクロー
ニング用のＥｃｏＲＩ認識配列である。

【０１１６】ｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１) に
挿入されていた融合遺伝子のＤＮＡ断片がＮｄｅＩとＥ
ｃｏＲＩで切り出され、この断片は発現ベクターである
ｐＴＹＢ1 のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトにライゲーシ
ョンされた。このように構築されたプラスミドをｐＴＹ
Ｂ１（ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１) と命名した。

【０１１７】（ｆ）ＦＮＣＢＤとヒトＶＥＧＦ１６５と
のハイブリッドポリペプチド発現ベクターの調製 上記（ａ）で得られたプラスミドｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ)
から、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ（部分消化）処理で、挿入
されていたＦＮＣＢＤのＤＮＡ断片が切り出され、上記
（ｃ）で得られたプラスミドｐＢＳ（ヒトＶＥＧＦ１６
５) のＫｐｎＩ−ＳａｌＩサイトにライゲーションされ
た。このように構築されたプラスミドには配列表配列番
号１５で表されるＤＮＡが組み込まれており、このプラ
スミドをｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５) と命名
した。

【０１１８】配列表配列番号１５の塩基番号１〜６はク
ローニング用のＫｐｎＩ認識配列、塩基番号５〜10はＮ
ｃｏＩ認識配列、塩基番号11〜12はフレーム合わせの配
列、塩基番号13〜18はＮｄｅＩ認識配列、塩基番号16〜
18は開始コドン配列、塩基番号19〜1038はヒトＦＮＣＢ
ＤのｃＤＮＡ配列、塩基番号1039〜1044はＸｈｏＩ認識
配列とＳａｌＩ認識配列のライゲーションによって生じ
た塩基配列、塩基番号1042〜1056はエンテロキナーゼの
認識配列（DDDDK)をコードする塩基配列、塩基番号1057
〜1551はヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡ配列、塩基番号
1552〜1554は終止コドン、塩基番号1555〜1560はクロー
ニング用のＥｃｏＲＩ認識配列である。

【０１１９】ｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５) に
挿入されていた融合遺伝子のＤＮＡ断片がＮｄｅＩとＥ
ｃｏＲＩで切り出され、発現ベクターであるｐＴＹＢ1
のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトにライゲーションされ
た。このように構築されたプラスミドをpTYB1(ＦＮＣＢ
Ｄ−ヒトＶＥＧＦ１６５)と命名した。

【０１２０】（ｇ）ＦＮＣＢＤとＶＥＧＦ１２１とのハ
イブリッドポリペプチド及びＦＮＣＢＤとＶＥＧＦ１６
５とのハイブリッドポリペプチドの発現の確認 pTYB1(ＦＮＣＢＤ) 、pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２
１) 及びpTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５) で大腸菌
株ER2566（New England BioLabs ）を各々形質転換し
た。形質転換された大腸菌は、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで、一夜３７℃で培養さ
れた。この前培養液０．０２ｍｌを１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＳＢ培地２ｍｌに接種した。菌濁度
が０．５になるまで培養後、１ｍＭになるようにＩＰＴ
Ｇ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド）を添加し、
さらに３７℃で２時間培養後集菌した。

【０１２１】全菌体タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１
２％ゲル）で展開した後、クマシー染色を行った。その
結果、染色ゲルにおいて、ＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤとＶ
ＥＧＦ１２１とのハイブリッドポリペプチド及びＦＮＣ
ＢＤとＶＥＧＦ１６５とのハイブリッドポリペプチドそ
れぞれの分子量に相当する40ｋＤａ、53.5ｋＤａ及び5
8.5ｋＤａに各々のバンドが観察され、組換えポリペプ
チドの発現が確認された。

【０１２２】別に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをニトロ
セルロース膜に転写し、ＦＮＣＢＤを特異的に認識する
モノクローナル抗体（FNC4-4、宝酒造）、ＶＥＧＦ１２
１及びヒトＶＥＧＦ１６５を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を作用させた。

【０１２３】その結果、40ｋＤａのポリペプチドには抗
ヒトＦＮＣＢＤモノクローナル抗体が反応し、53.5ｋＤ
ａのポリペプチドには抗ヒトＦＮＣＢＤモノクローナル
抗体及び抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体が反応し、
58.5ｋＤａのポリペプチドには抗ヒトＦＮＣＢＤモノク
ローナル抗体及び抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体が
反応することが確認された。従って、４０ｋＤａのポリ
ペプチドはヒトのＦＮＣＢＤ、53.5ｋＤａのポリペプチ
ドはヒトＦＮＣＢＤとヒトＶＥＧＦ１２１とのハイブリ
ッドポリペプチド（ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１）、そ
して58.5ｋＤａのポリペプチドはヒトＦＮＣＢＤとヒト
ＶＥＧＦ１６５とのハイブリッドポリペプチド（ＦＮＣ
ＢＤ−ＶＥＧＦ１６５）と考えられる。

【０１２４】以上のようにプラスミドpTYB1(ＦＮＣＢ
Ｄ) 、pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１) 及び pTYB1
( ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５) で形質転換され、各々
のポリペプチドの発現が確認された大腸菌ＥＲ2566（Ne
w England BioLabs ）を、各々、ＥＲ2566 [pTYB1(ＦＮ
ＣＢＤ)]、ＥＲ2566 [pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２
１)]、ＥＲ2566 [pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５)]
と命名した。

【０１２５】（ｈ）発現ポリペプチドの調製 上記（ｇ）で得られた大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで一夜３７℃で前培養し
た。この前培養液0.2 ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含むＳＢ培地２ｍｌに接種した。濁度２〜５で
ＩＰＴＧを終濃度１０μＭになるように添加し、さらに
３７℃で１６時間培養した後、集菌した。

【０１２６】得られた菌体は２ｍｌの超音波処理用緩衝
液［５０ｍＭトリス(Tris)−塩酸緩衝液ｐH 8.0 、５０
ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸(E
DTA)］で洗浄後、遠心分離して再び同緩衝液２ｍｌに懸
濁し、超音波の１５秒処理・１５秒休止を氷冷で６回繰
り返して菌体を破砕した。

【０１２７】この懸濁液に終濃度１％になるようにトラ
イトンＸ-100(TritonX-100) を添加し、４℃、 5,000回
転／分で20分間遠心分離した。得られた沈査をさらに封
入体洗浄液［０．５％TritonX-100 、１ｍＭ EDTA ］で
３回洗浄した。遠心分離後、不溶画分を８Ｍ尿素溶液
［８Ｍ尿素、５０ｍＭ Tris-塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１
ｍＭのＥＤＴＡ］中に１時間室温で静置して溶解した。
次にこの溶解液を４℃、14,000回転／分で２０分間遠心
分離し、上清を回収した。

【０１２８】上清は、４Ｍ尿素溶液、２Ｍ尿素溶液に対
して順次透析され、最後にゼラチン結合活性実験用とし
て超音波処理用緩衝液に対して透析された。

【０１２９】透析後、４℃、14,000回転／分で２０分間
遠心分離し、上清を可溶化組換えタンパク質サンプルと
した。得られたサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ア
ミノ酸配列から算出される４０ｋＤａ、53.5ｋＤａ及び
58.5ｋＤａの位置に各々のバンドが検出され、組換えタ
ンパク質であるポリペプチドが確認された。

【０１３０】（実施例２） ＜コラーゲン結合性の検討＞実施例１で得られたＦＮＣ
ＢＤ−ＶＥＧＦ１２１及びＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５
を用いてコラーゲン結合活性を調べた。 (1) バッチ法 ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１及びＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ
１６５のゼラチン（ゼラチンセファロース４Ｂ、アマシ
ャムファルマシアバイオテク) に対する結合活性はバッ
チ法によって調べた。組換えタンパク質サンプルとして
は、超音波処理用緩衝液に透析された約５０μｇ／ｍｌ
のＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１及びＦＮＣＢＤ−ＶＥＧ
Ｆ１６５を用いた。１．５ｍｌのマイクロチューブに５
００μｌのＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１またはＦＮＣＢ
Ｄ−ＶＥＧＦ１６５と５００μｌのゼラチンセファロー
ス４Ｂ（超音波処理用緩衝液で２回洗浄後、５０％（容
積／容積) 混濁液とした）を加え、４℃で１時間回転器
で混合した。5000回転／分で３０秒遠心後、その上清を
回収した。次に沈査に超音波処理用緩衝液５００μｌを
加え４℃で１時間、回転器で混濁後、5,000 回転／分で
３０秒遠心し、その上清を回収した。同様に、トリス緩
衝生理的食塩水、１Ｍ塩化ナトリウム溶液、２Ｍ塩化ナ
トリウム溶液で沈査を洗浄した。次に同様の操作で１Ｍ
尿素、２Ｍ尿素、４Ｍ尿素、８Ｍ尿素溶液で順次ゼラチ
ンセファロース４Ｂに結合しているタンパク質の溶出を
試みた。最後に、５００μｌのＳＤＳバッファー中で９
０℃に加熱してゼラチンセファロース４Ｂに結合してい
るタンパク質を溶出させた。

【０１３１】クマシー染色後のゲルでは、ゼラチンとの
反応後の上清をアプライしたレーンにアミノ酸配列から
計算される53.5ｋＤａまたは58.5ｋＤａの付近にＦＮＣ
ＢＤ−ＶＥＧＦ１２１またはＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６
５のバンドが検出されず、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２
１、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５のゼラチンへの結合が
明らかになった。次いで、超音波処理用緩衝液、トリス
緩衝生理的食塩水、１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び２Ｍ塩
化ナトリウム溶液による洗浄によってもバンドは検出さ
れず、これら溶液の洗浄では、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１
２１、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５はゼラチンから溶出
しないことが明らかとなった。同様の操作で１Ｍ尿素、
２Ｍ尿素、４Ｍ尿素、８Ｍ尿素で溶出を試みた結果、１
Ｍ尿素、２Ｍ尿素では、ほとんどバンドは検出されず、
４Ｍ尿素、８Ｍ尿素で各々５３．５ｋＤａまたは５８．
５ｋＤａのバンドが検出された。９０℃のＳＤＳバッフ
ァーによる溶出でも、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１、Ｆ
ＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５のバンドは検出された

【０１３２】即ち、1 Ｍ尿素、２Ｍ尿素では、ＦＮＣＢ
Ｄ−ＶＥＧＦ１２１及びＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５は
ゼラチンからほとんど溶出されず、４Ｍ尿素、８Ｍ尿
素、90℃のＳＤＳバッファーによって殆どが溶出される
ことから、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１及びＦＮＣＢＤ
−ＶＥＧＦ１６５のゼラチンに対する強固な結合が裏付
けられた。同様の実験結果はゼラチンの代わりにコラー
ゲンスポンジを用いた場合にも得られた。以降の実験
は、ゼラチンセファロース４Ｂで精製後、リン酸緩衝液
で透析されたポリペプチドサンプルが使用された。

【０１３３】(2) ＥＬＩＳＡ法 酵素結合免疫評価法（ＥＬＩＳＡ法) では、ウシ天然コ
ラーゲン (Ｉ−ＡＣ、高研）、ウシアテロコラーゲン
（Ｉ−ＰＣ、高研）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、
シグマ）に対するＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１及びＦＮ
ＣＢＤ- ＶＥＧＦ１６５の結合活性を調べた。

【０１３４】最初に、ＥＬＩＳＡ用平底の９６ウエル
（well）マルチプレートに各々１ｍｇ／ｍｌの天然コラ
ーゲン、アテロコラーゲン、血清アルブミン溶液を２０
０μｌ／ウエルで分注し、４℃で一夜静置した。

【０１３５】０．０５％ Tween 20 のリン酸緩衝化生理
的食塩水溶液でウエルを６回洗浄後、リン酸緩衝化生理
的食塩水で希釈したＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１及びＦ
ＮＣＢＤ−ヒトＶＥＧＦ１６５溶液を 100μｌ、各々の
ウエルに分注し、37℃で１時間、静置した。

【０１３６】Tween 20を0.05％含むリン酸緩衝化生理的
食塩水溶液で３回洗浄後、１０００分の１に希釈された
抗ヒトＦＮＣＢＤモノクローナル抗体（宝酒造) を１０
０μｌ分注し、室温で１時間静置した。0.05％Tween 20
／リン酸緩衝化生理的食塩水溶液でウエルを３回洗浄
後、１０００倍希釈のペルオキシダーゼ標識抗マウスイ
ムノグロブリンポリクローナル抗体（ダコジャパン）を
１００μｌウエルに分注し、室温で１時間静置した。0.
05％ Tween20／リン酸緩衝化生理的食塩水溶液でウェル
を６回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌオルト- フェニレンジアミ
ン(o-phenylenediamine)と0.03％過酸化水素を含む 0.1
Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．７を分注し、１０分静置後、
４規定硫酸５０μｌで反応を停止し、４９２ｎｍ−６９
０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１３７】ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１およびＦＮＣ
ＢＤ−ＶＥＧＦ１６５を、天然コラーゲン、アテロコラ
ーゲン、血清アルブミンに反応させた結果、天然コラー
ゲン、アテロコラーゲンの場合の吸光度は、血清アルブ
ミンを用いた場合の吸光度より明らかに高かった。この
ように、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１およびＦＮＣＢＤ
−ＶＥＧＦ１６５の天然コラーゲン、アテロコラーゲン
に対する結合度は、血清アルブミンに対する結合度に比
べて顕著に高い値を示した。

【０１３８】ＥＬＩＳＡ法における吸光度は、結合活性
に相関して高くなると考えられるが、非特異的な結合と
見なせる固相化血清アルブミンとの反応に比べ、ＦＮＣ
ＢＤ−ＶＥＧＦ１２１及びＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５
と固相化天然コラーゲン、アテロコラーゲンとの反応で
は明らかに高い吸光度を示すことから、これらの反応は
特異的な結合反応と考えられる。このことは、本発明で
遺伝子工学的に産生されたポリペプチドが、ＦＮＣＢＤ
が本来持っているコラーゲン結合活性を消失することな
く血管新生調節因子がハイブリッド化された分子である
ことを示す。すなわち、ハイブリッドポリペプチドとし
たことにより、血管新生調節因子にフィブロネクチン由
来のコラーゲン結合活性の付与が可能であった。

【０１３９】（実施例３） ＜血管内皮細胞増殖活性＞上記実施例２でコラーゲン結
合活性を示したＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２
１及びＦＮＣＢＤ−ヒＶＥＧＦ１６５について、それら
が細胞増殖活性を維持しているかどうかを検討した。

【０１４０】ヒト微小血管内皮細胞を、２％牛胎児血清
を含む培地に懸濁し、２４穴マイクロプレートに1 ×10
⁴ 細胞／ウェルで分注後、５％二酸化炭素存在下、３７
℃で7 時間培養した。次に、ＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤ−
ＶＥＧＦ１２１、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５の各々を
培地中に添加し、３７℃で４日間培養した。そして、細
胞増殖活性の測定にはＷＳＴ−１法を用いた。反応液を
９６穴マイクロプレートに移し、マイクロプレートリー
ダーによって４５０ｎｍ−６９０ｎｍの吸光度を測定
し、細胞増殖活性を調べた。

【０１４１】ＦＮＣＢＤと比べて、明らかにＦＮＣＢＤ
−ＶＥＧＦ１２１、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５の各々
は、ヒト微小血管内皮細胞に対して濃度依存的に細胞増
殖活性を示した。従って、ＦＮＣＢＤをＶＥＧＦ１２１
またはＶＥＧＦ１６５にハイブリッド化させることで、
ヒトＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５の内皮細胞増
殖活性は消失しなかったと考えられる。

【０１４２】（実施例４） ＜コラーゲン結合後の血管内皮細胞増殖活性＞コラーゲ
ン結合性血管新生調節因子のコラーゲン結合後の血管内
皮細胞増殖活性を調べた。コラーゲン結合活性及び内皮
細胞増殖活性が確認されたコラーゲン結合性血管新生調
節因子の例として、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１、ＦＮ
ＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５の各々をコラーゲンに結合後
（ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ
１６５各々の複合化コラーゲン）、その細胞増殖活性が
調べられた。最初に、組織培養用２４穴マイクロプレー
トに１mg／mlのアテロコラーゲン塩酸溶液（pH3.0 ）を
500μl ／ウエルで分注し、一夜、４℃で静置した。そ
の溶液を捨て、0.05％ Tween 20 のリン酸緩衝化生理的
食塩水溶液で４回洗浄し、続いてリン酸緩衝化生理的食
塩水溶液で2 回洗浄後、無血清DMEM培地で1 回洗浄し
た。次に、無血清DMEM培地で連続希釈したＦＮＣＢＤ−
ＶＥＧＦ１２１、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５またはＦ
ＮＣＢＤ溶液を２５０μl 、各々のウエルに分注し、３
７℃で２時間、静置した。溶液を捨て0.05％ Tween 20
のリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で２回洗浄し、続いて
リン酸緩衝化生理的食塩水溶液で６回洗浄後、ハンクス
緩衝液で１回洗浄した。次に２％ＦＢＳを含む培地にヒ
ト微小血管内皮細胞が懸濁され、２４穴マイクロプレー
トに10⁴ 細胞／0.5 ml／ウェルで分注された。その後、
ヒト微小血管内皮細胞は５％二酸化炭素存在下、３７℃
で４日間培養された。そして、細胞増殖活性の測定には
ＷＳＴ−１法を用いた。反応液を９６穴マイクロプレー
トに移し、マイクロプレートリーダーによって、450nm-
690nm の吸光度を測定し、細胞増殖活性が調べられた。

【０１４３】ＦＮＣＢＤと比べて、明らかにＦＮＣＢＤ
−ＶＥＧＦ１２１、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５はヒト
微小血管内皮細胞に対して濃度依存的に細胞増殖活性を
示した。従ってＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１またはＦＮ
ＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５は、フィブロネクチン由来のコ
ラーゲン結合性ドメインとＶＥＧＦ１２１またはＶＥＧ
Ｆ１６５とが連結されたハイブリッドポリペプチド（で
あり、該ハイブリッドポリペプチドは、コラーゲン結合
性を示し、コラーゲンに結合後、結合を保持したままか
又は徐放されることによりＶＥＧＦ活性を示すコラーゲ
ン結合性血管新生調節（促進）因子（コラーゲン結合性
ＶＥＧＦ）である事が判明した。

【０１４４】また、ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１２１または
ＦＮＣＢＤ−ＶＥＧＦ１６５の結合したコラーゲンは、
コラーゲン結合性ＶＥＧＦ及びコラーゲン由来のポリペ
プチドを含むバイオマテリアル（血管新生調節因子複合
化コラーゲン）といえる。また上記ヒト微小血管内皮細
胞の培養法は、血管新生調節因子複合化コラーゲンを用
いて血管内皮細胞に対して増殖活性促進の血管新生調節
活性を与える方法の一例である。

【０１４５】

【発明の効果】本発明に係るハイブリッドポリペプチド
は、血管新生調節活性およびコラーゲン結合活性の両活
性を有し、特にコラーゲン結合後も血管新生調節活性を
示す。さらに該ハイブリッドポリペプチドとコラーゲン
との複合化バイオマテリアルは、血管新生調節活性を有
する新しいバイオマテリアルとして有用である。これら
ハイブリッドポリペプチドおよびバイオマテリアルは、
ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として有用であ
り、具体的に血管新生調節因子の局所維持剤、徐放剤ま
たは血管新生調節活性付与剤として有用である。

【０１４６】

【配列表フリーテキスト】配列番号１ 人工配列の説明：ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインのＰＣＲセンスプライマー 配列番号２ 人工配列の説明：ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインのＰＣＲアンチセンスプライマー 配列番号３ 人工配列の説明：修飾されたヒト・フィブロネクチンコ
ラーゲン結合性ドメインをコードするＤＮＡの塩基配列 配列番号４ 人工配列の説明：修飾されたヒト・フィブロネクチンコ
ラーゲン結合性ドメインのアミノ酸配列 (2)..(341)：／ノート＝“ヒト・フィブロネクチンコラ
ーゲン結合性ドメイン” 配列番号５ 人工配列の説明：ヒト血管内皮細胞増殖因子１２１のＰ
ＣＲセンスプライマー 配列番号６ 人工配列の説明：ヒト血管内皮細胞増殖因子１２１のＰ
ＣＲアンチセンスプライマー 配列番号７ 人工配列の説明：エンテロキナーゼ認識配列が付加され
たヒト血管内皮細胞増殖因子１２１をコードするＤＮＡ
の塩基配列 配列番号８ 人工配列の説明：エンテロキナーゼ認識配列が付加され
たヒト血管内皮細胞増殖因子１２１のアミノ酸配列 (1)..(5)：／ノート＝“エンテロキナーゼ認識配列” (6)..(126)：／ノート＝“ヒト血管内皮細胞増殖因子１
２１” 配列番号９ 人工配列の説明：ヒト血管内皮細胞増殖因子165 のＰＣ
Ｒセンスプライマー配列番号１０ 人工配列の説明：ヒト血管内皮細胞増殖因子165 のＰＣ
Ｒアンチセンスプライマー 配列番号１１ 人工配列の説明：エンテロキナーゼ認識配列が付加され
たヒト血管内皮細胞増殖因子165 をコードするＤＮＡの
塩基配列 配列番号１２ 人工配列の説明：エンテロキナーゼ認識配列が付加され
たヒト血管内皮細胞増殖因子165 のアミノ酸配列 (1)..(5)：／ノート＝“エンテロキナーゼ認識配列” (6)..(170)：／ノート＝“ヒト血管内皮細胞増殖因子16
5 ” 配列番号１３ 人工配列の説明：ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインとヒト血管内皮細胞増殖因子１２１からな
るハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基
配列 配列番号１４ 人工配列の説明：ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインとヒト血管内皮細胞増殖因子１２１から成
るハイブリッドポリペプチドのアミノ酸配列 (2)..(341)：／ノート＝“ヒト・フィブロネクチンコラ
ーゲン結合性ドメイン” (343)..(347)：／ノート＝“エンテロキナーゼ認識配
列” (348)..(468)：／ノート＝“ヒト血管内皮細胞増殖因子
１２１” 配列番号１５ 人工配列の説明：ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインとヒト血管内皮細胞増殖因子165 から成る
ハイブリッドポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列 配列番号１６ 人工配列の説明：ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインとヒト血管内皮細胞増殖因子165 から成る
ハイブリッドポリペプチドのアミノ酸配列 (2)..(341)：／ノート＝“ヒト・フィブロネクチンコラ
ーゲン結合性ドメイン” (343)..(347)：／ノート＝“エンテロキナーゼ認識配
列” (348)..(512)：／ノート＝“ヒト血管内皮細胞増殖因子
165 ”

【０１４７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Terumo Corporation <120> Collagen-Binding Angiogenesis Modulating Factor <130> TE0000097 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Sense Primer for Human Fibronectin Collagen-Binding Domain <400> 1 gaggtaccat ggtacatatg gcagctgttt accaaccgca gcctcaccc 49 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Antisense Primer for Human Fibronectin Collagen-Binding Domain <400> 2 cgggatcctt actcgagcca ctggatgggg tgggagttgg gctgac 46 <210> 3 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Modified Human Fibronectin Collagen-Binding Domain <220> <221> conflict <222> (109) <220> <221> conflict <222> (206) <220> <221> conflict <222> (270) <220> <221> conflict <222> (374) <220> <221> conflict <222> (681) <220> <221> CDS <222> (16)..(1044) <400> 3 ggtaccatgg tacat atg gca gct gtt tac caa ccg cag cct cac ccc cag 51 Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln 1 5 10 cct cct ccc tat ggc cac tgt gtc aca gac agt ggt gtg gtc tac tct 99 Pro Pro Pro Tyr Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser 15 20 25 gtg ggg atg cag tgg ctg aag aca caa gga aat aag caa atg ctt tgc 147 Val Gly Met Gln Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys 30 35 40 acg tgc ctg ggc aac gga gtc agc tgc caa gag aca gct gta acc cag 195 Thr Cys Leu Gly Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln 45 50 55 60 act tac ggt ggc aac tca aat gga gag cca tgt gtc tta cca ttc acc 243 Thr Tyr Gly Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr 65 70 75 tac aat ggc agg acg ttc tac tcc tgc acc aca gaa ggg cga cag gac 291 Tyr Asn Gly Arg Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp 80 85 90 gga cat ctt tgg tgc agc aca act tcg aat tat gag cag gac cag aaa 339 Gly His Leu Trp Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys 95 100 105 tac tct ttc tgc aca gac cac act gtt ttg gtt cag act cga gga gga 387 Tyr Ser Phe Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly 110 115 120 aat tcc aat ggt gcc ttg tgc cac ttc ccc ttc cta tac aac aac cac 435 Asn Ser Asn Gly Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His 125 130 135 140 aat tac act gat tgc act tct gag ggc aga aga gac aac atg aag tgg 483 Asn Tyr Thr Asp Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp 145 150 155 tgt ggg acc aca cag aac tat gat gcc gac cag aag ttt ggg ttc tgc 531 Cys Gly Thr Thr Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys 160 165 170 ccc atg gct gcc cac gag gaa atc tgc aca acc aat gaa ggg gtc atg 579 Pro Met Ala Ala His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met 175 180 185 tac cgc att gga gat cag tgg gat aag cag cat gac atg ggt cac atg 627 Tyr Arg Ile Gly Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met 190 195 200 atg agg tgc acg tgt gtt ggg aat ggt cgt ggg gaa tgg aca tgc att 675 Met Arg Cys Thr Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile 205 210 215 220 gcc tac tcg cag ctt cga gat cag tgc att gtt gat gac atc act tac 723 Ala Tyr Ser Gln Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr 225 230 235 aat gtg aac gac aca ttc cac aag cgt cat gaa gag ggg cac atg ctg 771 Asn Val Asn Asp Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu 240 245 250 aac tgt aca tgc ttc ggt cag ggt cgg ggc agg tgg aag tgt gat ccc 819 Asn Cys Thr Cys Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro 255 260 265 gtc gac caa tgc cag gat tca gag act ggg acg ttt tat caa att gga 867 Val Asp Gln Cys Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly 270 275 280 gat tca tgg gag aag tat gtg cat ggt gtc aga tac cag tgc tac tgc 915 Asp Ser Trp Glu Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys 285 290 295 300 tat ggc cgt ggc att ggg gag tgg cat tgc caa cct tta cag acc tat 963 Tyr Gly Arg Gly Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr 305 310 315 cca agc tca agt ggt cct gtc gaa gta ttt atc act gag act ccg agt 1011 Pro Ser Ser Ser Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser 320 325 330 cag ccc aac tcc cac ccc atc cag tgg ctc gag taaggatcc 1053 Gln Pro Asn Ser His Pro Ile Gln Trp Leu Glu 335 340 <210> 4 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:Modified Human Fibronectin Collagen-Binding Domain <400> 4 Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro Tyr 1 5 10 15 Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met Gln 20 25 30 Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu Gly 35 40 45 Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly Gly 50 55 60 Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly Arg 65 70 75 80 Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu Trp 85 90 95 Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe Cys 100 105 110 Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn Gly 115 120 125 Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr Asp 130 135 140 Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr Thr 145 150 155 160 Gln Asn Tyr 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Endothelial Growth Factor 121 <400> 5 gtgtcgacga cgatgataag gcacccatgg cagaaggagg aggg 44 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Antisense Primer for Human Vascular Endothelial Growth Factor 121 <400> 6 ggaattctta ccgcctcggc ttgtcacatt t 31 <210> 7 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Human Vascular Endothelial Growth Factor 121 with Enterokinase Recognition Sequence <220> <221> CDS <222> (4)..(381) <400> 7 gtc gac gac gat gat aag gca ccc atg gca gaa gga gga ggg cag aat 48 Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn 1 5 10 15 cat cac gaa gtg gtg aag ttc atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc 96 His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys 20 25 30 cat cca atc gag acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gat gag 144 His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu 35 40 45 atc gag tac atc ttc aag cca tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg 192 Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly 50 55 60 ggc tgc tgc aat gac gag ggc ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc 240 Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser 65 70 75 aac atc acc atg cag att atg cgg atc aaa cct cac caa ggc cag cac 288 Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His 80 85 90 95 ata gga gag atg agc ttc cta cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca 336 Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro 100 105 110 aag aaa gat aga gca aga caa gaa aaa tgt gac aag ccg agg cgg 381 Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg 115 120 125 taagaattc 390 <210> 8 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:Human Vascular Endothelial Growth Factor 121 with Enterokinase Recognition Sequence <400> 8 Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His 1 5 10 15 His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His 20 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Vascular Endothelial Growth Factor 165 with Enterokinase Recognition Sequence <220> <221> CDS <222> (4)..(513) <400> 11 gtc gac gac gat gat aag gca ccc atg gca gaa gga gga ggg cag aat 48 Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn 1 5 10 15 cat cac gaa gtg gtg aag ttc atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc 96 His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys 20 25 30 cat cca atc gag acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gat gag 144 His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu 35 40 45 atc gag tac atc ttc aag cca tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg 192 Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly 50 55 60 ggc tgc tgc aat gac gag ggc ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc 240 Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser 65 70 75 aac atc acc atg cag att atg cgg atc aaa cct cac caa ggc cag cac 288 Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His 80 85 90 95 ata gga gag atg agc ttc cta cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca 336 Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro 100 105 110 aag aaa gat aga gca aga caa gaa aat ccc tgt ggg cct tgc tca gag 384 Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu 115 120 125 cgg aga aag cat ttg ttt gta caa gat ccg cag acg tgt aaa tgt tcc 432 Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser 130 135 140 tgc aaa aac aca gac tcg cgt tgc aag gcg agg cag ctt gag tta aac 480 Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn 145 150 155 gaa cgt act tgc aga tgt gac aag ccg agg cgg taagaattc 522 Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 160 165 170 <210> 12 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:Human Vascular Endothelial Growth Factor 165 with Enterokinase Recognition Sequence <400> 12 Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His 1 5 10 15 His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His 20 25 30 Pro Ile 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tat ggc cac tgt gtc aca gac agt ggt gtg gtc tac tct 99 Pro Pro Pro Tyr Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser 15 20 25 gtg ggg atg cag tgg ctg aag aca caa gga aat aag caa atg ctt tgc 147 Val Gly Met Gln Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys 30 35 40 acg tgc ctg ggc aac gga gtc agc tgc caa gag aca gct gta acc cag 195 Thr Cys Leu Gly Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln 45 50 55 60 act tac ggt ggc aac tca aat gga gag cca tgt gtc tta cca ttc acc 243 Thr Tyr Gly Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr 65 70 75 tac aat ggc agg acg ttc tac tcc tgc acc aca gaa ggg cga cag gac 291 Tyr Asn Gly Arg Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp 80 85 90 gga cat ctt tgg tgc agc aca act tcg aat tat gag cag gac cag aaa 339 Gly His Leu Trp Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys 95 100 105 tac tct ttc tgc aca gac cac act gtt ttg gtt cag act cga gga gga 387 Tyr Ser Phe Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly 110 115 120 aat tcc aat ggt 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aat gtg aac gac aca ttc cac aag cgt cat gaa gag ggg cac atg ctg 771 Asn Val Asn Asp Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu 240 245 250 aac tgt aca tgc ttc ggt cag ggt cgg ggc agg tgg aag tgt gat ccc 819 Asn Cys Thr Cys Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro 255 260 265 gtc gac caa tgc cag gat tca gag act ggg acg ttt tat caa att gga 867 Val Asp Gln Cys Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly 270 275 280 gat tca tgg gag aag tat gtg cat ggt gtc aga tac cag tgc tac tgc 915 Asp Ser Trp Glu Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys 285 290 295 300 tat ggc cgt ggc att ggg gag tgg cat tgc caa cct tta cag acc tat 963 Tyr Gly Arg Gly Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr 305 310 315 cca agc tca agt ggt cct gtc gaa gta ttt atc act gag act ccg agt 1011 Pro Ser Ser Ser Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser 320 325 330 cag ccc aac tcc cac ccc atc cag tgg ctc gac gac gat gat aag gca 1059 Gln Pro Asn Ser His Pro Ile Gln Trp Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ala 335 340 345 ccc atg gca gaa gga gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg aag ttc 1107 Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe 350 355 360 atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc cat cca atc gag acc ctg gtg 1155 Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val 365 370 375 380 gac atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag tac atc ttc aag cca 1203 Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro 385 390 395 tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg ggc tgc tgc aat gac gag ggc 1251 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly 400 405 410 ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac atc acc atg cag att atg 1299 Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met 415 420 425 cgg atc aaa cct cac caa ggc cag cac ata gga gag atg agc ttc cta 1347 Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu 430 435 440 cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca aag aaa gat aga gca aga caa 1395 Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln 445 450 455 460 gaa aat ccc tgt ggg cct tgc tca gag cgg aga aag cat ttg ttt gta 1443 Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val 465 470 475 caa gat ccg cag acg tgt aaa tgt tcc tgc aaa aac aca gac tcg cgt 1491 Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg 480 485 490 tgc aag gcg agg cag ctt gag tta aac gaa cgt act tgc aga tgt gac 1539 Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp 495 500 505 aag ccg agg cgg taagaattc 1560 Lys Pro Arg Arg 510 <210> 16 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:Hybrid Polypeptide of Human Fibronectin Cllagen-Binding Domain and Human Vascular Endothelial Growth Factor 165 <400> 16 Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro Tyr 1 5 10 15 Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met Gln 20 25 30 Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu Gly 35 40 45 Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly Gly 50 55 60 Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly Arg 65 70 75 80 Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu Trp 85 90 95 Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe Cys 100 105 110 Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn Gly 115 120 125 Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr Asp 130 135 140 Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr Thr 145 150 155 160 Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala Ala 165 170 175 His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg Ile Gly 180 185 190 Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys Thr 195 200 205 Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile Ala Tyr Ser Gln 210 215 220 Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val Asn Asp 225 230 235 240 Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr Cys 245 250 255 Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln Cys 260 265 270 Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp Glu 275 280 285 Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg Gly 290 295 300 Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser Ser 305 310 315 320 Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn Ser 325 330 335 His Pro Ile Gln Trp Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Met Ala Glu 340 345 350 Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr 355 360 365 Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln 370 375 380 Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro 385 390 395 400 Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val 405 410 415 Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro 420 425 430 His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys 435 440 445 Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys 450 455 460 Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln 465 470 475 480 Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg 485 490 495 Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 500 505 510

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/78 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 CA12 DA06 EA04 GA11 HA01 HA03 4B065 AA26X AA93Y AB01 BA02 BD16 BD17 CA24 CA44 4C076 AA95 CC11 CC41 EE41 EE59 FF31 FF67 FF70 4C084 AA02 BA44 DB57 NA03 NA06 NA12 NA13 ZA442 4H045 AA10 BA41 CA40 EA20 EA34 FA72 FA74 GA01 GA10

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フィブロネクチンのプロテアーゼ分解また
   は自然分解により得られ、かつコラーゲン結合性ドメイ
   ンを構成するアミノ酸配列、あるいは該配列と相同また
   は１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしく
   は付加されたアミノ酸配列からなるコラーゲン結合性ポ
   リペプチドと、血管新生調節因子とが連結されてなり、
   コラーゲン結合活性および血管新生調節活性を有するハ
   イブリッドポリペプチド。
2. 【請求項２】前記コラーゲン結合性ポリペプチドが、フ
   ィブロネクチンのアミノ末端から約２８ＫＤａから約７
   ５ＫＤａまでに位置する請求項１に記載のハイブリッド
   ポリペプチド。
3. 【請求項３】前記コラーゲン結合性ポリペプチドが、ヒ
   ト・フィブロネクチンのAla²⁶⁰からTrp⁵⁹⁹までのアミノ
   酸配列からなるヒト・フィブロネクチン由来のポリペプ
   チドであるか、あるいは該配列と相同であるか、１もし
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加され
   たアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項１ま
   たは２に記載のハイブリッドポリペプチド。
4. 【請求項４】前記血管新生調節因子が前記コラーゲン結
   合性ポリペプチドのカルボキシル末端に連結されている
   請求項１〜３のいずれかに記載のハイブリッドポリペプ
   チド。
5. 【請求項５】前記血管新生調節因子が血管新生促進因子
   である請求項１〜４のいずれかに記載のハイブリッドポ
   リペプチド。
6. 【請求項６】前記血管新生調節因子がＰＤＧＦスーパー
   ファミリーに属する細胞成長因子である請求項１〜５の
   いずれかに記載のハイブリッドポリペプチド。
7. 【請求項７】前記血管新生調節因子がＶＥＧＦである請
   求項１〜６のいずれかに記載のハイブリッドポリペプチ
   ド。
8. 【請求項８】前記血管新生調節因子と前記コラーゲン結
   合性ポリペプチドとが遺伝子工学的手法により連結され
   ている請求項１〜７のいずれかに記載のハイブリッドポ
   リペプチド。
9. 【請求項９】バクテリアで産生される請求項１〜８のい
   ずれかに記載のハイブリッドポリペプチド。
10. 【請求項１０】水溶性である請求項１〜９のいずれかに
    記載のハイブリッドポリペプチド。
11. 【請求項１１】コラーゲンに結合後、結合を保持したま
    まかまたは徐放されることにより血管新生調節活性を示
    す請求項１〜１０のいずれかに記載のハイブリッドポリ
    ペプチド。
12. 【請求項１２】請求項１〜１１のいずれかに記載のハイ
    ブリッドポリペプチドを含有する血管新生調節因子の局
    所維持剤、徐放剤または血管新生調節活性付与剤。
13. 【請求項１３】請求項１〜１１のいずれかに記載のハイ
    ブリッドポリペプチドと、コラーン由来のポリペプチド
    とが複合化された血管新生調節因子複合化コラーゲンを
    含有するバイオマテリアル。
14. 【請求項１４】請求項１３に記載のバイオマテリアルを
    含有する血管新生調節因子の局所維持剤、徐放剤または
    血管新生調節活性付与剤。
15. 【請求項１５】請求項１〜１１のいずれかに記載のハイ
    ブリッドポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え
    ベクター。
16. 【請求項１６】請求項１５に記載の組換えベクターを含
    む形質転換体。