JP4832290B2 - 薬剤・遺伝子溶出型ステント - Google Patents

Description

本発明は、薬剤・遺伝子溶出型ステントに関するものである。

狭心症や心筋梗塞の基本病態は、動脈硬化による冠動脈の狭窄・血栓であり、これに対し動脈硬化性狭窄を拡張する冠インターベンション（ＰＣＩ、バルーン拡張、ステント拡張）が有用な治療として世界的に普及している。
しかし、いったん拡張した冠動脈が再び狭くなる「再狭窄」が高率に発生することが医学的問題となっている。再狭窄により再発する心筋虚血により、狭心症や心筋梗塞症が再び起こる可能性が高く、しばしば再ＰＣＩ施行あるいは冠動脈バイパス手術が必要になる場合が少なくない。
したがって、再狭窄を抑制する新しい治療方法が期待されているが、未だ確立した方法はなかった。
ＷＯ−Ａ０２／４７７３９，ＪＰ−Ａ２００２−０６０４００、ＪＰ−Ａ２００２−２８４６９８、Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ．２００３ Ｆｅｂ；２７（２）：１４７−５４、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ｎｏｖ；１８（１１）：１１８１−４．に見られる。
改善策として、最近、ステントに再狭窄を抑止する薬剤をコーティングするｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇ ｓｔｅｎｔが注目されており、このようなコーティングステントを用いれば、再狭窄抑制因子を局所に長期間作用させることが可能になるとして、２００２年６月、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ誌には、抗癌薬であり、抗増殖作用のあるｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（ラパマイシン）をコーティングしたステントが報告されている。しかし、亜急性期血栓に起因する死亡例発現、過敏反応（疼痛、湿疹、血圧変動等）、慢性炎症の持続、内皮再生／血管修復反応遅延などの問題があり、十分な改善は得られていなかった。
また、上記文献にも同様の目的に関する発明が記載されているが、やはり十分な効果は得られていなかった。

本発明が解決しようとする課題は、抗炎症作用、抗血栓作用、組織修復反応の保全、内皮再生能の保全などの機能を有する、より安全で効果の優れた薬剤・遺伝子溶出型ステントを提供することである。
本発明は、課題の解決手段として、ハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子を含む層を表面に有する薬剤・遺伝子溶出型ステントを提供するものである。
本発明はさらに、上記薬剤・遺伝子溶出型ステントを用いて、血管再狭窄、急性冠症候群又は脳虚血を治療する方法または上記薬剤・遺伝子溶出型ステントの血管再狭窄、急性冠症候群又は脳虚血の治療剤の製造に用いる用途を提供する。
本発明において、ハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子を含む層は、少なくとも１層、即ち１層又は２層以上の組み合わせからなるものであり、ステントの全表面又は一部表面に形成されているものである。
発明の詳細な説明
本発明の薬剤・遺伝子溶出型ステントは、ハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子を含む層を表面に有するものである。
ハイブリッドポリペプチドは、フィブロネクチン由来のコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）のポリペプチドと抗炎症因子又は血管新生因子が結合したものが好ましい。フィブロネクチン由来のコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）とは、ＪＰ−Ａ２００２−０６０４００の段落００１９〜００２１に記載されたポリペプチドである。
更にハイブリッドポリペプチドは、ＦＮＣＢＤのカルボキシ末端に抗炎症因子又は血管新生因子が結合したものが好ましい。
抗炎症因子とは、炎症に対し抑制的に働くサイトカインであり、具体的には例えばＴＧＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−５，ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ガレクチン−３、ケモカインのＮ末端欠失体などを挙げることができる。
これらの抗炎症因子の中でも、より好ましくは白血球やリンパ球の遊走／活性化を誘導するケモカインのＮ末端欠失体を挙げることができ、更に好ましくはモノサイト ケモアトラクタント プロテイン−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１；ＭＣＰ−１）のＮ末端欠失体である７ＮＤを挙げることができる。
血管新生因子とは、血管新生を促すシグナルを送るサイトカインであり、具体的には例えばＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＰ等を挙げることができ、なかでもＨＧＦがより好ましい。
本発明におけるハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子は、より好ましくは配列１（ＦＮＣＢＤ−７ＮＤ）又は配列２（ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ）である。
本発明のステントは、ステントの全表面（外表面及び内表面）又は一部表面（例えば、外表面のみであり、適宜選択できる）にハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子を含む層（遺伝子層）を形成することで得られる。
遺伝子層は１層でも２層以上の異なる機能を有する複数層の組み合わせからなるものでもよく、形成方法は特に制限されるものではない。例えば、バインダー成分等を用いて遺伝子層をステント表面に直接形成する方法、プライマー層を形成し、その上に遺伝子層を形成し、更に保護層を形成する方法などを適用することができる。
具体的な形成方法は、遺伝子、バインダー成分などを溶解できる水及び／又は有機溶媒を用いた塗布法、浸漬法又は噴霧法と、乾燥法（自然乾燥、減圧乾燥など）を適宜組み合わせる方法を使用できる。
本発明のハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子を含む層を表面に有するステントは、例えば動脈内の病変部位に留置したとき、アシドーシスにより抗炎症因子又は血管新生因子を徐々に遊離することができ、更に病変部位の細胞への導入効率を高めることができるので、長期間、持続して炎症又は低酸素状態にある組織に対して、直接、抗炎症作用・血管新生作用を発揮できる。導入効率は、病変部位の細胞に導入された遺伝子の量／遊離した遺伝子の量×１００で示されるものである。
本発明のステントは、血管再狭窄〔経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）又は経皮的血管形成術（ＰＴＡ）後の再狭窄〕、急性冠症候群又は脳虚血の治療方法において使用することができる。
本発明の薬剤・遺伝子溶出型ステントは、ハイブリッドポリペプチド、特に均一な微少サイズカプセルであるハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子を病変部位に直接送達できるため、投与量が少なくて済むので安全性及び効果がより高く、かつ効果が長期間持続するという利点がある。

図１は、金属ステント群における炎症像を示したヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色［Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎ］による光学顕微鏡写真である。
図２は、薬剤・遺伝子溶出型ステント群における炎症像を示した図１と同じ光学顕微鏡写真である。
図３は、ウサギ・マクロファージＲＡＭ１１に対するモノクロナール抗体陽性細胞数を比較した図である。
図４は、サル血清中ＭＣＰ−１濃度（ｐｇ／ｍｌ）を比較した図である。
図５は、空ベクタープラスミドコーティングステント群における血管を示した図１と同じ光学顕微鏡写真である。
図６は、薬剤・遺伝子溶出型ステント群における血管を示した図である。
図７は、図５及び図６の内膜面積を比較した図である。
図８は、内弾性板（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｅｌａｓｔｉｃ ｌａｍｉｎａ：ＩＥＬ）面積を比較した図である。
図９は、遺伝子コーティングステントにおける遺伝子発現を確認するための図である。

本発明を具体的に説明するため、以下に実施例を掲げるが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例１（薬剤・遺伝子溶出型ステントの作製）
以下の（１）〜（４）の手順にて、４層構造の薬剤・遺伝子溶出型ステントを作製した。
（１）シランカップリング剤をメタノール／水（容量比；５０／５０）に希釈し、内径約２．８ｍｍのステントの外表面に塗布後、乾燥しプライマー層を形成した。
（２）プライマー層の上に、吸水性のポリエーテルタイプ熱可塑性ポリウレタンをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した２質量％溶液をコーティングし、薬剤層ベースを形成した。
（３）１０質量％ハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子の水溶液中に、（２）で作製したステントを浸漬し、十分に膨潤させた。その後、真空乾燥にて水分を除き、薬剤層を形成した。
（４）薬剤層の上に、生体内で安定性の高いポリカーボネートタイプ熱可塑性ポリウレタンをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した２質量％溶液をコーティングし、保護層を形成し、本発明のステントを得た。この保護層により、薬剤のバースト放出が抑制される。
実施例２（コレステロール負荷ウサギ・モデルにおける遺伝子発現と炎症像の検討）
１％コレステロールを４週間負荷した高脂血症家兎の腸骨動脈に、マーカー遺伝子であるＬａｃＺをコードした遺伝子をコートしたステント（内径約２．８ｍｍ）を留置し３日後に遺伝子発現を検討した。遺伝子発現陽性細胞は、内膜細胞で６０〜７０％、中膜〜外膜細胞で５０％に認められた。遺伝子をコートしていないステントでは陽性細胞は認めなかった。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００Ｎｏｖ；１８（１１）：１１８１−４．の結果と比較すると、１０倍以上の導入効率が得られた。
実施例３（コレステロール負荷ウサギ・モデルにおける炎症像の検討）
１％コレステロールを１２週間負荷した高脂血症家兎の腸骨動脈に、金属ステント（ｎ＝５）、又は遺伝子コーティングステント（ｎ＝５）（いずれも内径約２．８ｍｍ）を留置し、１０日後に動脈組織のマクロファージ浸潤及び単球遊走因子ＭＣＰ−１の血中濃度測定を行った。
なお、遺伝子コーティングステントは、対照と同じ金属ステントと、ＦＮＣＢＤ−７ＮＤハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子からなるプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）を含む生分解性基材を用い、製造例に準じて作製したものである。
組織化学的検討では、ウサギ・マクロファージを特異的に認識する抗体を用い、動脈へのマクロファージ浸潤を検索したところ、金属ステント群に比べ、遺伝子コーティングステント群において、有意（ｐ０．０１未満）に浸潤程度が抑制された。
結果を図１、図２、図３または図４に示す。図１は、金属ステント群における炎症像を示した写真である（画面上部が内腔側、下部が外膜側）。泡沫化マクロファージの内膜下浸潤が認められる。図２は、遺伝子コーティングステント群における炎症像を示した写真（同）である。泡沫化マクロファージはほとんど認められない。図３は、ウサギ・マクロファージＲＡＭ１１に対するモノクロナール抗体陽性細胞数を比較した図である。図４は、サル血清中ＭＣＰ−１濃度（ｐｇ／ｍｌ）を比較した図である。
実施例４（コレステロール負荷サル・モデルにおける炎症像の検討）
１％コレステロールを１２週間負荷したカニクイザルの腸骨動脈に、空ベクタープラスミドコーティングステント（ｎ＝５）、又は遺伝子コーティングステント（実施例３と同じもの；ｎ＝５）を留置し、２８日後に動脈内膜肥厚（内膜占有面積）の測定を行った。
組織学的検討では、空ベクタープラスミドコーティングステント群に比べ、遺伝子コーティングステント群において、有意（ｐ０．０１未満）に内膜肥厚が抑制された。またステント置換１０日後の炎症性変化を表現する血中単球遊走因子ＭＣＰ−１濃度は、金属ステントに比べ、遺伝子コーティングステント群において、有意（ｐ０．０５未満）に抑制された。
図５、図６、図７または図８に結果を示す。図５は、空ベクタープラスミドコーティングステント群における血管を示した写真である。内膜肥厚による狭窄が認められる。図６は、遺伝子コーティングステント群における血管を示した図である。狭窄は認められない。図７は、図５及び６の内膜面積を比較した図である。（平均±標準偏差、空ベクタープラスミドコーティングステント群：２．７９±０．９２、遺伝子コーティングステント群：１．５９±０．７７）。図８は、内弾性板（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｅｌａｓｔｉｃ ｌａｍｉｎａ：ＩＥＬ）面積を比較した図である。
比較実験例１
ＦＮＣＢＤ−ＧＦＰプラスミドで被覆したステントを実施例１に準じて作製し、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ｎｏｖ；１８（１１）：１１８１−４．のＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌに従い、拡大断面像のβ−ｇａｌ染色にて導入効率を評価した（図９）。なお、コントロールとして遺伝子をコーティングしていないステントを用いた。
その結果、ＦＮＣＢＤ−ＧＦＰプラスミド／コーティングステント群では、内膜細胞で６２±１２％（ｎ＝３）、中膜−外膜細胞で５４±９％（ｎ＝３）にＧＦＰ陽性が認められたが、遺伝子をコーティングしていないステントでは陽性細胞は認めなかった（０％）。
一方、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ｎｏｖ；１８（１１）：１１８１−４．によると、ＧＦＰプラスミド／コーティングステントの導入効率は７．９±０．７％であった。
本発明は、従来の薬物を塗布したステントとは異なり、遺伝子を用いた実質的なナノカプセルによる高性能薬剤送達システム（ＤＤＳ）を成すものである。

Claims (4)

1. フィブロネクチン由来のコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）ポリペプチドのカルボキシ末端にモノサイト ケモアトラクタント プロテイン−１（monocyte chemoattractant protein-1;MCP-1）のＮ末端欠失体［７ＮＤ］が結合したハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子を含む層を表面に有する、泡沫化マクロファージの内膜下浸潤を抑制するための、薬剤・遺伝子溶出型ステント。
2. ハイブリッドポリペプチドをコードした遺伝子が配列１である、請求項１に記載の薬剤・遺伝子溶出型ステント。
3. 血管再狭窄、急性冠症候群又は脳虚血の治療に使用する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の薬剤・遺伝子溶出型ステント。
4. 血管再狭窄が、経皮的冠動脈形成術(PTCA)又は経皮的血管形成術(PTA)後の再狭窄である、請求項３記載の薬剤・遺伝子溶出型ステント。

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