CN114917413A - 一种负载重组多肽的羊膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载重组多肽的羊膜及其制备方法,负载具备特异性胶原结合域的重组多肽于人体羊膜上,可提升现有多肽特异性结合人体羊膜胶原的效果,通过改变重组多肽的类别,还可以调控并赋予羊膜材料不同新功能,具有在眼科、心血管科、皮肤修复科等治疗领域中快速上皮化或内皮化,进而减少炎症、促进愈合、减少瘢痕等作用。

Description

一种负载重组多肽的羊膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,具体的说,是一种负载重组多肽的羊膜及其制备方法。
背景技术
人体羊膜是人体胎盘的最内层,厚约0.01-0.2mm,含有上皮细胞,无血管、神经及淋巴,组织主要成份为胶原蛋白。人体羊膜作为人源生物医用材料,由于属于同种移植,具有天然的低免疫原性。另外,人体羊膜中含有多种生长因子,可以促进上皮细胞、内皮细胞的黏附及迁移,因此,其同时具有促进上皮组织生成以及再表皮化的功能。
羊膜材料在用作生物医用材料产品中,经历清洗、脱细胞、冷冻解冻、冻干、常温保存等操作工序,羊膜中原本含有的促进上皮细胞、内皮细胞的黏附及迁移的生长因子等生物信号分子的活性可能会下降,进而导致其促进上皮组织生成以及再表皮化的功能下降。
已有文献报道一个由七肽(TKKTLRT)组成的胶原结合域,可以特异性地结合到胶原上(de Souza SJ,Brentani R.Collagen binding site in collagenase can bedetermined using the concept of sense-antisense peptide interactions.J BiolChem.1992 Jul 5;267(19):13763-7.)。另外,公布号为CN113490517A的发明专利也公开了一种嵌合肽修饰的SIS膜、其制备方法及应用,其中为修饰SIS膜以促进软组织愈合和骨再生的功能,提供了一种嵌合肽修饰的GBR膜,该嵌合肽由三部分组成:P9和P10:TKKTLRT(结合至SIS膜的I型胶原)、Hst1/JH8194(起到抗菌、成骨和愈合促进能力的功能)和GGGGSGGGGS(连接前两部分),P11和P12:KELNLVY(结合至SIS膜的III型胶原)、Hst1/JH8194和GGGGSGGGGS。但现有已报道的多肽(TKKTLRT)并不能很好的与人体羊膜实现特异性的胶原结合效果。
发明内容
本发明提供了一种负载重组多肽的羊膜,该羊膜采用具备特异性胶原结合域的重组多肽,解决了现有多肽无法提供特异性结合人体羊膜胶原的效果,同时,提升了人体羊膜多方面性能。为此,本发明还提供了该羊膜的制备方法。
本发明通过下述技术方案实现:一种负载重组多肽的羊膜,所述重组多肽具备特异性胶原结合域。
所述重组多肽包含具备特异性胶原结合域的多肽RRTTTKKRRT(氨基酸序列为:ArgArg Thr Thr Thr Lys Lys Arg Arg Thr)或RRTTTKKRRTKL(氨基酸序列为:Arg Arg ThrThr Thr Lys Lys Arg Arg Thr Lys Leu)。
所述重组多肽还包括多肽CAG(氨基酸序列为:Cys Ala Gly)、REDV(氨基酸序列为:Arg Glu Asp Val)、YIGSR(氨基酸序列为:Tyr Ile Gly Ser Arg)中的一种。
一种制备上述羊膜的方法,构建具备特异性胶原结合域的重组多肽,将所述重组多肽的水溶液对人体羊膜进行处理,即得。
所述构建的方法为基因工程法。
所述重组多肽的水溶液的摩尔浓度为100μM~100mM。
所述处理的方式为浸泡。
所述浸泡的温度为4~37℃。
所述浸泡的时间为1~24h。
本发明与现有技术相比,具有以下优点及有益效果:
(1)本发明提供的羊膜中涉及一种可特异性结合人体羊膜胶原的多肽RRTTTKKRRT或RRTTTKKRRTKL,并采用基于特异性胶原结合域重组多肽的方法提升了人体羊膜作为生物医用材料的多方面性能,包括促进上皮化功能,进而有利于其作为人工组织再生修复新材料在眼科、心血管科、皮肤修复科等治疗领域中快速上皮化或内皮化,进而减少炎症、促进愈合、减少瘢痕等。
(2)本发明利用与人体羊膜具有特异性胶原结合效果的多肽RRTTTKKRRT或RRTTTKKRRTKL与促进上皮化功能的多肽构建重组多肽,通过改变重组多肽的类别,还可以调控并赋予羊膜材料不同新功能。
附图说明
图1为本发明制备羊膜材料的原理示意图。
图2为本发明羊膜材料与对照组的表皮细胞增值率比对图。
图3为本发明羊膜材料与对照组的激光共聚焦显微镜荧光图像。
具体实施方式
下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对所要求的本发明提供进一步的说明,除非另有说明,本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式,当然,本发明的保护范围并不局限于以下实施例,参见图2。
(一)构建重组多肽
实施例1:
采用基因工程法,将促进上皮化功能多肽CAG(氨基酸序列为:Cys Ala Gly)和特异性胶原结合域功能多肽RRTTTKKRRT(氨基酸序列为:Arg Arg Thr Thr Thr Lys Lys ArgArg Thr)构建得到重组多肽。基因工程法构建重组多肽具体包括以下步骤:
(1)获取质粒DNA及扩增:将表达CAG-RRTTTKKRRT的质粒DNA冻干粉重悬,并在冰上融化感受态细胞;将质粒2uL加入到融化的感受态细胞100uL中,然后依次将质粒-感受态细胞复合物进行冰浴30min、42℃热激45s和冰浴2min处理,随后将复合物加入到不含抗生素的液体培养基中放入37℃摇床上,以200rmp的转速培养60min;然后取出,以5000rmp的速率离心5min丢弃上清,加入含抗生素的液体培养基60μL,重悬之后滴在含抗生素平板上涂布过夜培养。在20mL试管中,将携带有所需质粒的大肠杆菌接种到5mL培养基中,37℃振荡培养12~16h。
(2)提取质粒DNA:利用Omega公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I小提试剂盒,对经过步骤S1扩增后得到的含有质粒DNA的菌液进行提取。具体的为:取2mL菌液室温下6000×g离心2min,去上清,加250uL溶液I(含RNase A),涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。加250uL溶液II,温和颠倒离心管4~6次,获得澄清的裂解液。加350uL溶液III,温和颠倒数次混合,至出现白色絮状沉淀,室温13000×g离心10min。吸取离心后上清,移至洁净的装配好容积为2mL离心管的吸收柱中,室温13000×g离心1min,至裂解物完全通过吸收柱。弃滤过液,加500uL Buffer HB,13000×g离心1min,弃滤过液。再用100%乙醇稀释的750uLWash Buffer清洗吸收柱,13000×g离心1min。将吸收柱放入干净1.5mL离心管,加60μuL无菌去离子水在滤膜上,13000×g离心5min。收集提取及纯化的质粒。
(3)诱导表达目的多肽:在大肠杆菌中将上一步的重组质粒转入,通过菌落PCR对转化子进行验证。挑取平板上阳性克隆接种至5mL液体LB培养基(含Amp抗性)进行液体扩培过夜制备种子液,并接种1mL种子液与含100mL液体LB培养基(含Amp抗性),37℃培养至OD600值到达2时,诱导目的蛋白表达,IPTG终浓度为0.2mmol/L,18℃振荡培养过夜。将发酵液在4℃下5000r/min离心10min,收集菌体细胞,加入5~10倍体积的细菌裂解缓冲液,将混合液进行4℃20000r/min离心20min,分别收集上清及沉淀通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。
(4)目的多肽纯化:使用5mL含400mmol/L咪唑的LS-ID缓冲液平衡柱子。然后使用LS-ID缓冲液洗涤柱子。以一定的流速将收集的细胞裂解上清液,经滤膜过滤流过预先平衡的树脂,将目的多肽结合在树脂上。用5mL漂洗缓冲液洗脱柱子,除去非特异性结合的多肽。收集利用洗脱缓冲液对树脂进行洗脱液,对洗脱液SDS-PAGE检测。
实施例2:
采用基因工程法,将促进上皮化功能多肽REDV(氨基酸序列为:Arg Glu Asp Val)和特异性胶原结合域功能多肽RRTTTKKRRT(氨基酸序列为:Arg Arg Thr Thr Thr Lys LysArg Arg Thr)构建得到重组多肽。基因工程法构建重组多肽具体步骤与实施例1类似,仅替换目标基因序列。
实施例3:
采用基因工程法,将促进上皮化功能多肽YIGSR(氨基酸序列为:Tyr Ile Gly SerArg)和特异性胶原结合域功能多肽RRTTTKKRRT(氨基酸序列为:Arg Arg Thr Thr Thr LysLys Arg Arg Thr)构建得到重组多肽。基因工程法构建重组多肽具体步骤与实施例1类似,仅替换目标基因序列。
实施例4:
采用基因工程法,将促进上皮化功能多肽CAG(氨基酸序列为:Cys Ala Gly)和特异性胶原结合域功能多肽RRTTTKKRRTKL(氨基酸序列为:Arg Arg Thr Thr Thr Lys LysArg Arg Thr Lys Leu)构建得到重组多肽。基因工程法构建重组多肽具体步骤与实施例1类似,仅替换目标基因序列。
实施例5:
采用基因工程法,将促进上皮化功能多肽REDV(氨基酸序列为:Arg Glu Asp Val)和特异性胶原结合域功能多肽RRTTTKKRRTKL(氨基酸序列为:Arg Arg Thr Thr Thr LysLys Arg Arg Thr Lys Leu)构建得到重组多肽。基因工程法构建重组多肽具体步骤与实施例1类似,仅替换目标基因序列。
实施例6:
采用基因工程法,将促进上皮化功能多肽YIGSR(氨基酸序列为:Tyr Ile Gly SerArg)和特异性胶原结合域功能多肽RRTTTKKRRTKL(氨基酸序列为:Arg Arg Thr Thr ThrLys Lys Arg Arg Thr Lys Leu)构建得到重组多肽。基因工程法构建重组多肽具体步骤与实施例1类似,仅替换目标基因序列。
对比例1:
采用基因工程法,将促进上皮化功能多肽CAG(氨基酸序列为:Cys Ala Gly)和功能多肽TKKTLRT(氨基酸序列为:Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr)构建得到重组多肽。基因工程法构建重组多肽具体步骤与实施例1类似,仅替换目标基因序列。
(二)制备羊膜材料
实施例7:
取实施例1的重组多肽用酪蛋白进行1小时封闭处理,然后吸取封闭液,PBS清洗3遍;将重组多肽原液稀释成摩尔浓度为1mM的重组多肽的水溶液,将准备好清洗干净的人体羊膜浸泡于重组多肽的水溶液中,于4℃下摇床孵育1小时后,最后PBS清洗3次,取出羊膜材料,密封放入4℃保存备用。
实施例8:
取实施例2的重组多肽用酪蛋白进行1小时封闭处理,然后吸取封闭液,PBS清洗3遍;将重组多肽原液稀释成摩尔浓度为100mM的重组多肽的水溶液,将准备好清洗干净的人体羊膜浸泡于重组多肽的水溶液中,于20℃下摇床孵育2小时后,最后PBS清洗3次,取出羊膜材料,密封放入4℃保存备用。
实施例9:
取实施例3的重组多肽用酪蛋白进行1小时封闭处理,然后吸取封闭液,PBS清洗3遍;将重组多肽原液稀释成摩尔浓度为100μM的重组多肽的水溶液,将准备好清洗干净的人体羊膜浸泡于重组多肽的水溶液中,于37℃下摇床孵育24小时后,最后PBS清洗3次,取出羊膜材料,密封放入4℃保存备用。
实施例10:
取实施例4的重组多肽用酪蛋白进行1小时封闭处理,然后吸取封闭液,PBS清洗3遍;将重组多肽原液稀释成摩尔浓度为1mM的重组多肽的水溶液,将准备好清洗干净的人体羊膜浸泡于重组多肽的水溶液中,于4℃下摇床孵育1小时后,最后PBS清洗3次,取出羊膜材料,密封放入4℃保存备用。
实施例11:
取实施例5的重组多肽用酪蛋白进行1小时封闭处理,然后吸取封闭液,PBS清洗3遍;将重组多肽原液稀释成摩尔浓度为10mM的重组多肽的水溶液,将准备好清洗干净的人体羊膜浸泡于重组多肽的水溶液中,于4℃下摇床孵育1小时后,最后PBS清洗3次,取出羊膜材料,密封放入4℃保存备用。
实施例12:
取实施例6的重组多肽用酪蛋白进行1小时封闭处理,然后吸取封闭液,PBS清洗3遍;将重组多肽原液稀释成摩尔浓度为20mM的重组多肽的水溶液,将准备好清洗干净的人体羊膜浸泡于重组多肽的水溶液中,于4℃下摇床孵育1小时后,最后PBS清洗3次,取出羊膜材料,密封放入4℃保存备用。
对比例2:
取对比例1的重组多肽用酪蛋白进行1小时封闭处理,然后吸取封闭液,PBS清洗3遍;将重组多肽原液稀释成摩尔浓度为1mM的重组多肽的水溶液,将准备好清洗干净的人体羊膜浸泡于重组多肽的水溶液中,于4℃下摇床孵育1小时后,最后PBS清洗3次,取出羊膜材料,密封放入4℃保存备用。
(三)性能测试
测试例1:特异性结合人体羊膜胶原测试
分别取上述实施例7(十肽RRTTTKKRRT)、实施例10(十二肽RRTTTKKRRTKL)和对比例2(七肽TKKTLRT)的羊膜材料进行特异性胶原进行测试。样品裁成直径为6mm的小圆片放入冷冻干燥机干燥,然后展平贴在样品台上,喷金处理。由于重组多肽的半胱氨酸上含有巯基(SH),采用扫描电子显微镜能谱仪(EDS)对其特征元素进行分析。
实验结果如下表1所示。
表1表面硫元素质量百分比
测试对象 硫元素质量百分比(%)
实施例7(十肽RRTTTKKRRT) 12.3
实施例10(十二肽RRTTTKKRRTKL) 12.4
对比例2(七肽TKKTLRT) 1.1
由上表1可知,羊膜材料采用十肽(RRTTTKKRRT)和十二肽(RRTTTKKRRTKL)的表面硫元素质量百分比(即多肽结合率)相比于七肽(TKKTLRT)具有较大的提升。
测试例2:促进表皮化性能测试
以对比例2为对照组材料,实施例7至12的羊膜材料为实验组材料,进行以下测试:
将样品放进48孔板中,将不锈钢环放在样品顶部,防止样品漂浮。向每孔中加入500μL表皮细胞悬液(40,000个/mL)。在细胞培养箱中孵化1天和3天。接种48小时后,将预期培养3天的样品上清液替换为完全培养基。培养完毕后,用PBS冲洗样品3次,每次5分钟。随后加入200μL含有10%CCK-8试剂的完全培养基,在细胞培养箱中孵化1小时。随后检测培养基在450nm处的吸光度。吸光度高表明存活细胞数量多。
除此之外,还可以通过荧光图像评估样品的细胞活性。将培养过细胞的样品用4%多聚甲醛固定液固定10分钟,再用0.5%Triton-X 100的PBS溶液处理样品5分钟。随后将样品浸入200μL TRITC-鬼笔环肽溶液(100nM)中10分钟,最后将样品浸入200μL DAPI溶液(1μg/mL)中,孵化5分钟。每个步骤之间均使用PBS清洗3次,每次5分钟。使用激光共聚焦显微镜对样品进行拍照。
图2分别记录了对照材料组和较优的实验组材料的表皮细胞增值率数据,如图2和下表2所示:实验组材料(实施例7至12)相比于对照材料组(对比例2)具有更高的表皮细胞增值率,即高的促进表皮化性能。
表2表皮细胞增值率
表皮细胞增值率(%)
对比例2 100
实施例7 240
实施例8 310
实施例9 210
实施例10 230
实施例11 240
实施例12 250
如图3所示,激光共聚焦显微镜荧光图像结果与图2定量结果一致,图3中A为对照材料组(对比例2),B为较优的实验组材料。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明做任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化,均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 健诺维(成都)生物科技有限公司
<120> 一种负载重组多肽的羊膜及其制备方法
<130> 2022年05月24日
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Arg Thr Thr Thr Lys Lys Arg Arg Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Arg Thr Thr Thr Lys Lys Arg Arg Thr Lys Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Glu Asp Val
1
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Ala Gly
1

Claims (9)

1.一种负载重组多肽的羊膜,其特征在于:所述重组多肽具备特异性胶原结合域。
2.根据权利要求1所述的羊膜,其特征在于:所述重组多肽包含具备特异性胶原结合域的多肽RRTTTKKRRT或RRTTTKKRRTKL。
3.根据权利要求1所述的羊膜,其特征在于:所述重组多肽还包括多肽CAG、REDV、YIGSR中的一种。
4.一种制备权利要求1~3任一项所述羊膜的方法,其特征在于:构建具备特异性胶原结合域的重组多肽,将所述重组多肽的水溶液对人体羊膜进行处理,即得。
5.根据权利要求4所述方法,其特征在于:所述构建的方法为基因工程法。
6.根据权利要求4所述方法,其特征在于:所述重组多肽的水溶液的摩尔浓度为100μM~100mM。
7.根据权利要求4所述方法,其特征在于:所述处理的方式为浸泡。
8.根据权利要求7所述方法,其特征在于:所述浸泡的温度为4~37℃。
9.根据权利要求7所述方法,其特征在于:所述浸泡的时间为1~24h。
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