CN103705979A - 用于神经修复的功能组织工程材料及其制备与用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于神经修复的功能组织工程材料，其包括人羊膜及与其胶原蛋白特异结合的神经营养因子，并固定结合钙蛋白酶的抑制剂；本发明还提供一种该功能组织工程材料的制备方法，采用构建特异结合胶原蛋白结合域的神经营养因子融合蛋白，以及共价交联钙蛋白酶的抑制剂，形成引导神经修复的功能组织工程材料，可以有效地使得人羊膜特异结合神经营养因子促进神经修复，再生神经形成正确的突触连接，并消除钙蛋白酶的神经再次损伤作用，可用于中枢神经损伤疾病靶向治疗和神经功能修复。

Description

用于神经修复的功能组织工程材料及其制备与用途

技术领域

本发明涉及中枢神经损伤疾病中促进神经修复的功能组织工程材料，以及该功能组织工程材料制备及其在中枢神经损伤疾病靶向治疗、神经功能修复和抑制神经再次损伤中的用途。本发明涉及的功能组织工程材料包括人羊膜及与其胶原蛋白特异结合的神经营养因子，并固定结合钙蛋白酶的抑制剂，可用于中枢神经损伤患者靶向治疗、神经功能修复和神经再次损伤的临床用药。

背景技术

中枢神经损伤是致残率最高的疾病之一，其中外伤性脑损伤、脑出血、脑缺血和脊髓损伤是目前发病率极高的。中枢神经损伤后，神经元经历凋亡或坏死，轴突断裂，导致神经功能丧失。中枢神经损伤临床预后较差，目前临床上没有明确的治疗手段和特效药物，严重影响患者的生活质量和心理健康。

临床治疗中枢神经损伤需要促进神经修复，不仅要促使受损神经元的存活以及轴突生长，还要克服引起神经再次损伤的关键分子的作用，提供良好的再生和修复环境。神经营养因子能支持神经元存活，并促进神经元生长、分化以及维持其功能，已经在临床上应用。但是简单施加于损伤原位的神经营养因子不能长时间富集于损伤部位，而会随体液扩散到周围正常组织，导致神经营养因子的损失，不能维持其有效治疗浓度，治疗效果低；周期性重复给药虽可维持损伤部位的药物浓度，但易导致神经营养因子的过量使用，引发炎症反应和脑部癫痫。而且当更加严重的神经损伤发生时，损伤部位会出现不同程度的组织缺损，这时单纯依靠原位施加神经营养因子已不能满足促进神经修复的需要，同时损伤部位微环境中异常激活了造成神经再次损伤的钙蛋白酶。

目前，还没有专门针对中枢神经损伤的组织损伤、钙蛋白酶的存在和神经营养因子缺乏的这三大因素的产品和治疗手段。本发明针对中枢神经损伤这三大因素，应用人羊膜，与其胶原蛋白特异结合的神经营养因子，并固定结合钙蛋白酶的抑制剂制备成中枢神经损伤中促进神经修复的功能组织工程材料，实现对中枢神经损伤的靶向治疗，减少成本，增加疗效。

发明内容

中枢神经损伤疾病是神经损伤后经历神经元坏死和轴突断裂，以致神经功能丧失。中枢神经损伤整个发病过程中涉及神经组织损伤后神经营养因子缺乏，并异常激活了造成神经再次损伤的钙蛋白酶，严重影响组织缺损部位神经修复，发生退行性变化以及钙蛋白酶的再次损伤作用。本发明遴选出几乎无免疫原性和生物相容性好的人羊膜作为引导神经修复的生物材料，通过胶原蛋白特异结合了神经营养因子，其与促使神经元存活，以及促进神经元生长、分化和维持其功能密切相关；同时人羊膜上固定结合了钙蛋白酶的抑制剂。

人羊膜成细丝状的有序排列的基质材料，具有生物相容性好，几乎无免疫原性，可引导神经生长和延伸，支持神经元正常生长并具有促使神经修复和恢复其功能，并且自身含有很多促使细胞增殖的营养因子。它来源广泛，价格低廉，取材和保存简便。

人羊膜上胶原蛋白特异结合的神经营养因子(neurotrophin，NT)包括脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子等，它们在促使神经元存活、生长、分化和维持其功能方面发挥着关键的作用。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factors，BDNF)对周围神经元和中枢神经元具有广谱的营养保护作用；神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能；神经营养因子3(neurotrophin-3，NT-3)参与调控脊髓发育，影响神经-肌肉突触功能活性；胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)对保护多巴胺运动神经元、中枢及外周的运动神经元、感觉神经元及交感神经元等都具有同等的营养作用。需要应用这些神经营养因子靶向神经元存活、生长、分化和维持其功能，将有助于减少患者退行性变化和促进神经组织再生。同时采用钙蛋白酶的抑制剂，即异常激活的钙蛋白酶引起神经元或神经胶质细胞凋亡，随时间推移而扩大神经损伤区；通过钙蛋白酶的抑制剂，如钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和钙蛋白酶抑制蛋白等，特异性抑制钙蛋白酶的作用，使钙蛋白酶不能引起神经细胞凋亡，从而构建良好的神经组织再生的微环境。

本发明涉及一种用于神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，包括人羊膜作为载体，含有通过胶原蛋白特异结合的神经营养因子，并固定结合钙蛋白酶的抑制剂。

本发明涉及一种用于神经修复的功能组织工程材料，包括通过胶原蛋白特异结合了促进神经修复的神经营养因子，即脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子等；该神经营养因子是通过基因工程方法构建成神经营养因子与胶原蛋白特异结合域的融合蛋白，含有神经营养因子的成熟肽和与胶原蛋白结合域(Collagen binding domain，CBD)的多肽TKKTLRT。优选地，胶原蛋白特异结合的神经营养因子为两种或两种以上神经营养因子的混合物。

本发明涉及一种用于神经修复的功能组织工程材料，还包括钙蛋白酶的抑制剂为钙蛋白酶抑制剂，即钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和钙蛋白酶抑制蛋白等，通过共价交联固定在人羊膜胶原上。优选地，人羊膜胶原共价交联固定的钙蛋白酶的抑制剂为钙蛋白酶抑制剂I或钙蛋白酶抑制剂II。

本发明还提供一种用于神经修复的功能组织工程材料的制备方法。该制备方法为：首先获取新鲜人羊膜和制备重组神经营养因子与胶原蛋白特异结合的多肽融合蛋白；将钙蛋白酶抑制剂共价交联到人羊膜上，后利用胶原蛋白特异结合多肽吸附到人羊膜上，形成具有消除钙蛋白酶作用，富含神经营养因子，又能定向引导轴突生长的功能组织工程材料。

本发明还提供所述功能组织工程材料在中枢神经损伤疾病靶向治疗和神经功能修复中的应用，具有很好的生物相容性，支持细胞正常生长，保护神经元的生长不受其他因素的干扰，可有效修复中枢神经损伤患者的神经组织。

附图说明

图1表示本发明所述功能组织工程材料移植脑出血大鼠模型后mNSS评分改善图

图2表示本发明所述功能组织工程材料移植脑出血大鼠模型核磁共振检测血肿区域的大小改善图

图3表示本发明所述功能组织工程材料移植脑出血大鼠模型苏木素-伊红染色相对组织缺损改善图

图4表示本发明所述功能组织工程材料移植脑出血大鼠模型免疫组化检测神经丝蛋白表达率图

图5表示本发明所述功能组织工程材料移植脑出血大鼠模型免疫组化检测成熟神经元数量图

具体实施方式

本发明通过自主设计遴选适合作为组织工程材料载体的人羊膜，其富含大量胶质蛋白，通过胶原酶上能与CBD的多肽，TKKTLRT，通过基因工程技术重组到神经营养因子中，形成具有特异结合胶原蛋白的神经营养因子融合蛋白。钙蛋白酶的抑制剂通过共价交联到人羊膜上，再特异吸附神经营养因子融合蛋白得到神经修复的功能组织工程材料，不仅能使得神经营养因子靶向锚定于神经损伤部位，而且能消除钙蛋白酶的作用，减少成本并增加有效性。

对本发明涉及的用于神经修复的功能组织工程材料进行具体说明。本发明涉及一种用于神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，包括人羊膜作为载体，含有通过胶原蛋白特异结合的神经营养因子，并固定结合钙蛋白酶的抑制剂。

本发明涉及一种用于神经修复的功能组织工程材料，包括人羊膜采用无病毒感染的健康产妇来源的胎膜，即乙型肝炎5项、人类丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒和人乳头状瘤病毒等其他相关传染性指标均呈阴性。通过本领域技术人员熟知的方法制备成不含上皮细胞的人羊膜，作为本发明中神经营养因子的载体。

本发明涉及一种用于神经修复的功能组织工程材料，包括通过胶原蛋白特异结合了促进神经修复的神经营养因子，即脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子等；该神经营养因子是通过基因工程方法构建成神经营养因子与胶原蛋白特异结合域的融合蛋白，含有神经营养因子的成熟肽和与胶原结合域CBD的多肽TKKTLRT。通过本领域技术人员熟知的方法，通过构建含胶原结合域CBD和神经营养因子的重组质粒，转化到宿主中诱导表达和纯化获得含CBD域多肽的NT融合蛋白。

优选地，胶原蛋白特异结合的神经营养因子为两种或两种以上神经营养因子的混合物。

本发明涉及一种用于神经修复的功能组织工程材料，还包括钙蛋白酶的抑制剂为钙蛋白酶抑制剂，即钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和钙蛋白酶抑制蛋白等，通过共价交联固定在人羊膜胶原上。通过本领域技术人员熟知的方法，2-亚氨氢氯化硫醇(Traut′s试剂)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)的两步偶联反应将钙蛋白酶抑制剂固定在人羊膜上。

优选地，人羊膜胶原共价交联固定的钙蛋白酶的抑制剂为钙蛋白酶抑制剂I或钙蛋白酶抑制剂II。

本发明涉及用于神经修复的功能组织工程材料的制备，应用上述的人羊膜、含胶原蛋白结合域的CBD的神经营养因子以及钙蛋白酶的抑制剂来实施。

其中，人羊膜为新鲜来源，经修剪后浸泡于DMEM/F12培养基中，于4℃保存；

含胶原蛋白结合域CBD的神经营养因子为用生物软件Primer5.0设计合成引物后，将CBD的TKKTLRT基因序列引入到神经营养因子上游引物，从人cDNA中扩增出神经营养因子成熟片段，并在神经营养因子基因上下游分别含有Nde I和Xba I酶切位点，与含有Nde I和Xba I酶切位点的pET3áá质粒连接，构建成含CBD区基因-神经营养因子成熟片段的pET3á重组质粒。胶原结合域CBD与神经营养因子成熟肽融合蛋白的编码序列的原核表达载体pET-CBD-NT转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，LB平板培养后挑选克隆转至LB液体培养基中培养，并扩大培养后诱导融合蛋白表达，融合蛋白进行洗涤和溶解，透析复性以及亲和层析获取目的蛋白；

功能组织工程材料的制备方法如下：Traut′s试剂和Sulfo-SMCC分别溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH8.0，4mM EDTA)和PBS(pH7.2，4mM EDTA)中，将制备好的人羊膜浸泡于PBS(pH8.0，4mM EDTA)中，将Traut′s试剂与人羊膜在4℃下反应过夜后，去除多余交联剂，并用PBS(pH7.2，4mM EDTA)洗涤3次；另外将钙蛋白酶抑制剂与Sulfo-SMCC在PBS(pH7.2，4mM EDTA)中室温反应30分钟，然后与Traut′s试剂处理后的人羊膜室温反应2小时，反应完后用PBS(pH7.2，4mM EDTA)彻底洗涤，并用5％甘氨酸中和多余反应基团，得到固定了钙蛋白酶的抑制剂的人羊膜；

取固定了钙蛋白酶的抑制剂的人羊膜置于6孔板中，加入一个或一个以上的含胶原蛋白结合域CBD的神经营养因子融合蛋白，室温孵育2小时，然后将制备好的功能组织工程材料放置无菌锡箔袋中，用生理盐水浸润后密封，即吸附CBD-NF融合蛋白并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜，于4℃保存。

本发明所涉及的钙蛋白酶抑制剂是商业上可以购买的，主要为钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和钙蛋白酶抑制蛋白等，可以从美国西格玛公司和美国R&D公司等。

采用本发明用于神经修复的功能组织工程材料，对脑出血模型大鼠体内实验，大鼠血肿部位处敷上本发明的功能组织工程材料；与对照组相比，手术后第4周改良神经功能损伤评分(mNSS评分)分值显著低于其他对照组，表明促使了脑出血大鼠的神经功能恢复；手术后第4周核磁共振检测血肿区域的大小明显小于对照组；苏木素-伊红染色表明实验组相对组织缺损面积明显小于对照组；免疫组化分析大部分大鼠组织神经丝蛋白阳性率明显高于对照组，并且成熟神经元数量明显比对照组更高，表示其更好地促进了神经元的再生；同时促进了血肿周围区成熟神经元的存活；其中吸附了两种以上神经营养因子并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜效果更显著。

本发明的该功能组织工程材料手术操作简单而且几乎不发生免疫排斥反应，为临床上治疗中枢神经损伤疾病具有明显优势和应用价值。

以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。

实施例一

人羊膜的制备

羊膜取材：人羊膜采用无病毒感染的健康产妇来源的胎膜(与捐献者签署了知情同意书)，即乙型肝炎5项、人类丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒和人乳头状瘤病毒等其他相关传染性指标均呈阴性。

人羊膜含抗生素(4000U/ml的庆大霉素、青霉素500U/ml、链霉素500μg/ml)1×PBS(pH7.2)洗去胎盘的血凝块，钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离，同时用含抗生素的PBS冲洗干净后浸泡20min，上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上。将上述附有羊膜的纸片修剪成2.5cm×2.5cm的小块。PBS冲洗2次，置于细胞培养板中DMEM/F12培养液(含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，无血清)浸泡，4℃保存备用，所制羊膜均于取材后12h内使用。

羊膜去上皮：用0.25％胰酶(含0.01％EDTA)37℃消化40min，用细胞刮刀轻轻刮除上皮细胞，PBS清洗2次，相差倒置显微镜下确认上皮细胞全部清除。浸泡DMEM/F12培养液中置于6孔培养板内，4℃保存备用。

实施例二

制备含胶原蛋白结合域CBD的GDNF融合蛋白

用生物软件Primer5.0设计合成引物后，以GDNF为例，将CBD的TKKTLRT基因序列引入到GDNF上游引物中，

上游引物1：5′-GGTCTACGGAGACCGGATCCG-3′；

上游引物2：5′-CATATGACTAAGAAAACCCTGCGTACTGGGGTCTACGGAG-3′；

下游引物：5′-CTCGAG TCTCTGGAGCCAGAGATCT-3′

应用上游引物1和下游引物从人cDNA中扩增出GDNF成熟片段，PCR扩增反应液为：2μL10×PCR缓冲液(大连TaKaRa公司)，2U-5U的Taq酶(大连TaKaRa公司)，0.2～1.0mM的dNTPs(大连TaKaRa公司)以及0.2μmol的上游引物1和下游引物(美国Invitrogen公司合成)；将配制好的体系放入PCR仪(博奥公司)中，应用扩增程序如下：94℃5分钟；94℃30秒，45℃30秒，72℃40秒，15个循环；94℃30秒，60℃30秒，72℃40秒，30个循环；72℃10分钟，4℃保持。

应用上游引物2和下游引物以第一轮PCR产物为模板，将CBD片段基因引入GDNF中，PCR扩增反应液和扩增程序与上述第一轮PCR一样，第二轮PCR的CBD-PDNF产物同时引入Nda I和Xba I酶切位点，与含Nde I和XbaI酶切位点的pET3α质粒连接。将20μmol CBD-PDNF产物与20μmol pET3α质粒在10U的DNA连接酶作用，37℃下反应2小时，得到重组pET3α-CBD-PDNF质粒。

原核表达载体pET3á-CBD-PDNF转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，LB平板37℃培养后挑选克隆转至LB液体培养基中继续培养，并扩大到500mLLB液体培养基培养到OD600值约为0.8后，加入终浓度1mM的IPTG继续培养4小时，诱导融合蛋白表达。6000转每分钟离心收集菌体，用1×PBS(pH7.2)洗涤后再次离心收集菌体，超声破碎菌体后离心收集包涵体，用含0.4％3-巯基乙醇过夜溶解包涵体，溶解好的包涵体加入复性液透析复性，采用镍柱亲和层析获取目的蛋白，测样品浓度后冻干备用。

其他神经营养因子，即BDNF、NGF和NT-3与CBD形成融合蛋白的方法与PDNF一样，制备成CBD-BDNF、CBD-NGF和CBD-NT-3的融合蛋白。

实施例三

人羊膜交联上钙蛋白酶的抑制剂

Traut′s试剂(生工生物工程(上海)股份有限公司)和Sulfo-SMCC(美国西格玛公司)分别溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH8.0，4mM EDTA)和PBS(pH7.2，4mMEDTA)中，将实施例一中制备好的人羊膜浸泡于PBS(pH8.0，4mM EDTA)中，将Traut′s试剂与人羊膜在4℃下反应过夜后，去除多余交联剂，并用PBS(pH7.2，4mM EDTA)洗涤3次。

另外按人羊膜平方毫米加入5微克钙蛋白酶抑制剂I与Sulfo-SMCC在PBS(pH7.2，4mM EDTA)中室温反应30分钟，然后与Traut′s试剂处理后的人羊膜室温反应2小时，反应完后用PBS(pH7.2，4mM EDTA)彻底洗涤，并用5％甘氨酸中和多余反应基团，得到固定了钙蛋白酶抑制剂I-人羊膜。

实施例四

功能组织工程材料的制备

取实施例三中制备好的钙蛋白酶抑制剂I-人羊膜置于6孔板中，按人羊膜平方毫米加入1纳摩尔总数量，加入实施例二中制备好的一个或一个以上的CBD-NF融合蛋白(一个以上CBD-NF融合蛋白按等比例加入)，室温孵育2小时，然后将制备好的功能组织工程材料放置无菌锡箔袋中，用生理盐水浸润后密封，即吸附CBD-NF融合蛋白并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜，于4℃保存。

实施例五

大鼠脑出血后神经损伤修复体内实验

购自北京大学医学部动物中心的36只实验SD大鼠，用10％水合氯醛(400mg/kg)溶液腹腔注射麻醉后，俯卧位固定在立体定向仪上，根据大鼠大脑立体定位图谱，调整立体定向仪使门齿沟平面比耳间线平面低2.4mm，此时前卤和后卤在同一平面上。将头部背侧的鼠毛剪去，皮肤消毒、切开皮肤暴露颅骨，30％过氧化氢液腐蚀颅骨上腱膜及颅骨外膜，暴露前卤，用牙科钻在前卤点前0.5mm，右3.5mm处钻孔，用微量注射器沿钻孔方向垂直进针5mm，缓慢均速推注肝素胶原酶Ⅳ生理盐水液2ul(含肝素4U，胶原酶0.4U)5分钟，静置2分钟缓慢退出，缝合皮肤切口，建立脑出血大鼠模型。

建立的脑出血大鼠模型随机分为A、B、C、D、E和F六组，每组6只，A组为实施例一制备的生理盐水浸泡的人羊膜对照组，B组实施例三制备的交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜治疗组，C组为实施例四制备的吸附CBD-PDNF融合蛋白并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜治疗组，D组为实施例四制备的吸附CBD-PDNF及CBD-BDNF融合蛋白并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜治疗组，E组实施例4制备的为吸附CBD-PDNF、CBD-BDNF和CBD-NGF融合蛋白并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜治疗组，F组为实施例四制备的吸附CBD-PDNF、CBD-BDNF、CBD-NGF和CBD-NT-3融合蛋白并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜治疗组。

建立的脑出血大鼠模型分笼饲养72小时后，再度麻醉，俯卧位固定在立体定向仪上，根据大鼠大脑立体定位图谱，同样用牙科钻在前卤点推注肝素胶原酶IV位置钻孔，直径5mm，切开硬脑膜、蛛网膜，找到血肿部位，敷上人羊膜，分层缝合，分笼饲养。分别于移植后1天和移植后第1、2、3、4、6周对所有大鼠进行改良神经功能缺失评分(modified Neurological Severity Scores，mNSS)，结果如下表1所示。

表1

说明：改良神经功能缺失评分(modified Neurological Severity Scores，mNSS)从0～18分(正常，0分；最大神经功能缺失，18分)，1分无损伤；2～6分轻度损伤；7～12分中度损伤；13～18分重度损伤。

从表1可已看出，C组与A或B组相比p值远小于0.01，并且D、E和F组与C组相比p值远小于0.05，从图1中可以看出A和B组的mNSS评分明显高于C、D、E和F组，其中D、E和F组的mNSS评分明显低于C组(p＜0.05)，即用于治疗脑出血的本发明的功能组织工程材料具有优异的治疗效果，并且免疫排斥很小，吸附CBD-PDNF、CBD-BDNF、CBD-NGF和CBD-NT-3融合蛋白一种或两种以上并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜都促使了脑出血大鼠的神经功能恢复，其中吸附了两种以上神经营养因子并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜效果更显著。

本发明功能组织工程材料移植后核磁共振检测血肿区域的大小

脑出血大鼠模型在体内移植人羊膜后，分别在1天、1周，2周和4周四个时间点用核磁共振检测实验组大鼠的脑内血肿的动态变化。核磁共振仪磁场强度为7.0T，由英国Oxford公司生产。大鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，固定于核磁共振仪上，进行核磁共振成像观察主要获取T2W层面的图像，并用专业软件Scion Image，version Beta4.0.2分析T2W层面图象中高亮区域(即血肿区域)，占对侧大脑的百分比(相对血肿％)。

从图2中C、D、E和F组的相对血肿面积显著小于A和B组(p＜0.01)，并且D、E和F组的相对血肿面积要好于C组(p＜0.05)，而D、E和F组之间差别不大。可见，吸附CBD-PDNF、CBD-BDNF、CBD-NGF和CBD-NT-3融合蛋白一种或两种以上并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜在脑出血的早期和恢复的晚期都显著减少了血肿的相对面积，其中吸附了两种以上神经营养因子并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜更显著。

实施例六

大鼠脑出血后体内功能组织工程材料移植神经修复分析

实施例五种脑出血大鼠模型在人羊膜移植4周后，将大鼠断颈处死后立即取出鼠脑，4％多聚甲醛中固定48小时。石蜡包埋，大脑冠状切片(5um)，进行苏木素-伊红(HE)染色，应用购买北京碧云天生产的苏木素-伊红染色试剂盒按照使用说明书进行，最后显微镜观察，照相。

从图3中C、D、E和F组的相对组织缺损面积显著小于A和B组(p＜0.01)，并且D、E和F组的相对组织缺损面积显著小于C组(p＜0.05)，而D、E和F组之间差别不大。因而吸附CBD-PDNF、CBD-BDNF、CBD-NGF和CBD-NT-3融合蛋白一种或两种以上并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜都显著减少了脑出血后的组织缺损，其中吸附了两种以上神经营养因子并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜更佳。

大脑冠状石蜡切片(5um)进行免疫组化检测神经丝蛋白(NF)和成熟神经元标志物(NeuN)表达水平。石蜡切片粘附在多聚赖氨酸处理过的玻片上，脱蜡前在室温中放置60分钟。石蜡切片依次二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；无水乙醇，5分钟；95％乙醇，五分钟；75％乙醇，五分钟；50％乙醇，五分钟；去离子水，五分钟。PBS洗3次各5分钟。样品用0.1％胰酶在37℃湿盒中消化30分钟进行抗原修复；弃酶液后用PBS洗3次各5分钟；3％H2O2去离子水处理10分钟，使内源过氧化酶失活。PBS洗3次各5分钟，滴加一抗小鼠来源的抗NF单抗(1：200)或抗NeuN单抗(1：500)(购买美国Santa公司)50μl，4℃过夜后PBS洗3次每次5分钟；滴加碱性磷酸酶标记的抗小鼠二抗(1:1000)50μl(购买北京中杉公司)，37℃静置1小时；PBS洗3次各5分钟，滴加新鲜配置DAB显色10分钟，在显微镜下掌握染色程度；PBS冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10分钟；脱水、透明、中性树脂封片，显微镜观察拍照。

从图4中C、D、E和F组的表达神经丝蛋白比A和B组显著升高(p＜0.01)，并且D、E和F组比C组更明显(p＜0.05)。同时图5中C、D、E和F组中成熟神经元数量明显比A和B组更高(p＜0.01)，并且D、E和F组也比C组更多(p＜0.05)。因而吸附CBD-PDNF、CBD-BDNF、CBD-NGF和CBD-NT-3融合蛋白一种或两种以上并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜都显著表达神经丝蛋白，促使了神经的再生；同时促进了血肿周围区成熟神经元的存活，其中吸附了两种以上神经营养因子并交联钙蛋白酶抑制剂I的人羊膜效果更加明显。

Claims (10)

1.一种用于神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，其包括：作为载体的人羊膜；通过胶原蛋白特异结合的促进神经修复的神经营养因子；以及固定结合钙蛋白酶的抑制剂。

2.一种如权利要求1所述的用于神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，所述的促进神经修复的神经营养因子，包括脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子中的一种或多种；该神经营养因子是通过基因工程方法构建成神经营养因子与胶原蛋白特异结合域的融合蛋白。

3.一种如权利要求3所述的用于神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，所述促进神经修复的神经营养因子优选为两种或两种以上上述神经营养因子的混合物；并吸附到人羊膜胶原蛋白上。

4.一种如权利要求1-2所述的用于神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，所述的钙蛋白酶的抑制剂为钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和钙蛋白酶抑制蛋白中的一种；并通过共价交联固定在人羊膜胶原上。

5.一种如权利要求4所述的用于神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，所述的钙蛋白酶的抑制剂优选为钙蛋白酶抑制剂I或钙蛋白酶抑制剂II。

6.一种用于神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，其使用步骤如下：

含胶原蛋白结合域CBD的神经营养因子为用生物软件Primer5.0设计合成引物后，将CBD的TKKTLRT基因序列引入到神经营养因子上游引物，从人cDNA中扩增出神经营养因子成熟片段，并在神经营养因子基因上下游分别含有Nde I和Xba I酶切位点，与含有Nde I和Xba I酶切位点的pET3áá质粒连接，构建成含CBD区基因-神经营养因子成熟片段的pET3α重组质粒；含有胶原结合域CBD与神经营养因子成熟肽的融合蛋白的编码序列的原核表达载体pET-CBD-NT转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，LB平板培养后挑选克隆转至LB液体培养基中培养，并扩大培养后诱导融合蛋白表达，融合蛋白进行洗涤和溶解，透析复性以及亲和层析获取目的蛋白；

功能组织工程材料的制备方法如下：Traut′s试剂和Sulfo-SMCC分别溶于1×磷酸盐缓冲液(PBS)中，将制备好的人羊膜浸泡于1×PBS中，将Traut′s试剂与人羊膜在4℃下反应过夜后，去除多余交联剂，并用PBS洗涤3次；另外将钙蛋白酶抑制剂与Sulfo-SMCC在1×PBS中室温反应30分钟，然后与Traut′s试剂处理后的人羊膜室温反应2小时，反应完后用1×PBS彻底洗涤，并用5％甘氨酸中和多余反应基团，得到固定了钙蛋白酶的抑制剂的人羊膜；

取固定了钙蛋白酶的抑制剂的人羊膜置于6孔板中，加入一个或一个以上的含胶原蛋白结合域CBD的神经营养因子融合蛋白，室温孵育2小时，然后将制备好的功能组织工程材料放置无菌锡箔袋中，用生理盐水浸润后密封，即吸附CBD-NF融合蛋白并的，于4℃保存。

7.一种如权利要求6所述的神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，所述交联到人羊膜的钙蛋白酶抑制剂的数量为1-20微克每平方毫米，优选为5微克每平方毫米。

8.一种如权利要求6所述的神经修复的功能组织工程材料，其特征在于，所述吸附到人羊膜的神经营养因子的总摩尔数为0.5-10纳摩尔每平方毫米，优选为1纳摩尔每平方毫米。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的神经修复的功能组织工程材料的制备方法。

10.一种如权利要求1-8任一项所述的功能组织工程材料在中枢神经损伤疾病靶向治疗或神经功能修复中的应用。

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