CN1884495A

CN1884495A - 可表达外源性基因的人羊膜细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1884495A
Application number: CNA2005100271288A
Authority: CN
Inventors: 郭礼和; 刘天津; 武家才; 王雪松; 蒋芝华; 黄勤
Original assignee: HEHONG BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) CO Ltd
Current assignee: HEHONG BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) CO Ltd
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2006-12-27
Also published as: KR20080025173A; JP2008543319A; EP1893750A1; AU2006261485A1; CA2620946A1; EP1893750A4; WO2006136114A1

Abstract

本发明涉及一类转基因的人羊膜细胞，具体涉及可表达外源性基因的人羊膜细胞及其制备方法以及在治疗中枢神经系统疾病方面的应用。本发明采用慢病毒载体转染的方法，将外源性基因转入人羊膜细胞，得到可表达外源性基因的人羊膜细胞；该细胞移植入脑内对脑缺血性疾病有明显的治疗作用。这为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的治疗途径。

Description

可表达外源性基因的人羊膜细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一类转基因的人羊膜细胞，具体涉及可表达外源性基因的人羊膜细胞及其制备方法以及在治疗中枢神经系统疾病方面的应用。

背景技术

中枢神经系统(CNS)疾病是长期困扰人类的疾病，一直缺乏有效的治疗手段和药物，如脑缺血性疾病、脑出血性疾病、中枢神经系统的损伤、神经系统遗传病、中枢神经系统慢性退变性疾病(帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病)以及中枢神经系统肿瘤等，其中中枢神经系统损伤死亡率高、致残率高，全球每年有1640万人遭受脑中风、创伤性脑损伤和脊髓损伤，其中，410万人因此丧失生命。这些疾病给全球千千万万的人带来难以摆脱的痛苦甚至死亡，在现代社会中已显得越发突出。

基因治疗正在成为常规方法难以治愈的中枢神经系统疾病的新治疗手段。CNS疾病的基因治疗主要有三种策略：1.应用反义技术或RNAi降低非显性突变蛋白的活性。针对CNS疾病基因缺陷引起的非显性突变蛋白表达，需要选择性阻断其生物合成，可采取反义核苷酸技术或RNAi，阻断特异性mRNA转录而达到。2.应用转基因产物替代脑内缺陷的酶或功能蛋白。3.应用保护性蛋白对神经元的存活提供支持，包括营养因子、抗氧化酶、热休克蛋白和抗凋亡因子等[Natsume Exp Neurol，2001，169：231-238；Berry M，Curr Opin Mol Ther，2001，3：338-349]。现在主要采用五种病毒载体类型：1)反转录病毒载体，仅感染正在分裂的细胞。2)腺病毒载体，不能整合，仅瞬间表达，且产生抗原。3)腺相关病毒载体：不能插入较大的外源基因，缺少高效的包装细胞，制备过程复杂，制备滴度低。4)单纯疱疹病毒载体，仅用在神经系统疾病中。5)慢病毒载体，不具有以上病毒存在的明显缺陷，转染细胞在所有时间点上均明显高于腺相关病毒载体和逆转录病毒载体，而且这种载体存在长期的转基因表达，而且无明显免疫反应。因此慢病毒载体有可能成为未来CNS基因治疗的最佳载体[Englund U，.Neuroreport，2000，11：3973-3977；Kafri T，Mol Ther，2000，1：516-521]。但是直接以工程病毒携带治疗性基因进入体内在有效性、可操作性和安全性等方面面临着不少问题，如病毒载体在体内的稳定性，是否会产生基因的重组，重排，缺失，突变等；病毒的靶细胞特异性，会不会进入其他不相关细胞，尤其是生殖系细胞；基于这些未可知的因素，使单纯的基因治疗在临床应用上很难开展。以细胞介导的基因治疗在一定程度上避免了这些问题，人们已利用胚胎干细胞和多种成体干细胞如神经干细胞，造血干细胞，CD34⁺前体细胞，脐带血干细胞以及中脑腹侧细胞等.进行细胞介导的基因治疗。[Georgievska B，Eur J Neurosci.2004；20(11)：3121-30；Englund U，Exp Neurol.2002Jan；173(1)：1-2；Kahn J，Byk T，Blood.2004；103(8)：2942-9；De Palma M，Nat Med.2003Jun；9(6)：789-95；Imren S，Humphries RK.J Clin Invest.2004953-62]，但胚胎干细胞和成体干细胞的移植若要在临床上应用还面临很多问题，如安全性、免疫排斥反应，细胞来源有限，伦理道德等。

羊膜(Amnion)，也可称作胎膜，是母体与胎儿间进行物质交换的重要组织。羊膜主要可分为上皮层、基底层、致密层、纤维母细胞层和海绵层五部分。羊膜细胞(humanamniotic cell，hAEC)主要由上皮层的羊膜上皮细胞和基底层的间充质细胞构成，是与发育中的胎儿的联系紧密的胚胎发育早期产物。羊膜细胞可表达早期干细胞的一些不同标记如：神经细胞特异的胶质纤维相关蛋白(GFAP)，神经元特异性标记(MAP2)神经干细胞特异性标记(nestin)，肝薄壁组织细胞蛋白，α-甲胎蛋白等。这说明既然羊膜形成于胚胎内细胞团发育早期，就有可能保留未成熟低分化的细胞，具有多能分化潜能。[Knezevic V.Anat.1996；189(Pt 1)：1-7；Yuge I，Transplantation.200415；77(9)：1452-4；Takashima S，Cell Struct Funct.2004；29(3)：73-84；Sakuragawa N，Neurosci Lett.1996；209(1)：9-12；Wei JP，Cell Transplant.2003；12(5)：545-52]。另外，人羊膜细胞本身自身缺乏I，II类抗原如HLA-A，-B，C和-DR抗原以及β2免疫球蛋白[Akle CA，Lancet，1981；2(8254)：1003-5；M.Adinolfi，nature vol 295：28]移植后不会产生免疫原性，此外人羊膜细胞同时存在HLA-E、G抗原，它们具有免疫抑制活性[Ueta M et al Clin Exp Immunol 2002；129(3)：464-70]。同时人羊膜细胞来源非常广泛，不会产生伦理或者道德的问题，因此人羊膜细胞适合作为细胞介导的基因治疗的工程性细胞载体，但因人羊膜细胞自身的特点使其转基因操作比较困难，目前只有利用很少几例腺病毒和电转的报道[Sakuragawa N，J Hum Genet.2000；45(3)：171-6；Nakajima T，Cell Transplant.2001；10(4-5)：423-7]，但电转方式效率低，对细胞损伤大，而腺病毒不能把外源基因整合到染色体，而且会使细胞产生免疫原性，移植后发生免疫排斥反应[Takahashi S，Tohoku J Exp Med 193(4)：279-92]。

发明内容

本发明之一在于提供了一类可表达外源性基因的人羊膜细胞。

本发明之一在于提供了可表达外源性基因的人羊膜细胞的制备方法。

本发明之一在于提供了一类可表达外源性基因的人羊膜细胞制剂。

本发明之一在于提供了可表达外源性基因的人羊膜细胞制剂在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。

本发明所涉及的外源性基因为标记基因，其选自：LacZ、EGFP、GFP。

本发明所涉及的外源性基因为中枢神经系统疾病相关基因，其选自：神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、β-葡萄糖醛酸甙酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、多巴胺合成酶、酪氨酸羟化酶、BH4合成酶、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、bcl-2、胆碱乙酰基转移酶、睫状神经节神经营养因子(CNTF)，其中优选GDNF。

本发明所涉及的上述外源性基因还带有基因调节结构元件，其选自：RNAi系统、Cre-LoxP系统、强力霉素诱导系统。

本发明所涉及的中枢神经系统疾病，其选自：脑缺血性疾病、脑出血性疾病、中枢神经系统的损伤、神经系统遗传病、中枢神经系统慢性退变性疾病、中枢神经系统肿瘤等，其中优选脑缺血性疾病。

近来发现一些基因与某些中枢神经系统疾病相关，如神经生长因子、脑源性神经生长因子、β-葡萄糖醛酸甙酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、多巴胺合成酶、酪氨酸羟化酶、BH4合成酶、胶质细胞源性神经营养因子、bcl-2、胆碱乙酰基转移酶、睫状神经节神经营养因子[Bemelmans AP，et al Hum Gene Ther，1999，10：2987-2997；Ghodsi A.Hum Gene Ther，1998，9：2331-2340；Snyder EY，et al Nature，1995，374：367-370；Palella TD，etal.Gene，1989，80：137-144；Bjorklund A，et al.Brain Res，2000，886：82-98；Kang UJ，et al.Hum Cell，2001，14：39-48；Yamada M，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：4078；Tuszynski MH，et al.Exp Neurol，1998，154：573-82；Saille C，et al.Neuroscience，1999，92：1455-63；Haase G，et al Ann Neurol，1999，45：296-304；Mohajeri MH，et al.Hum Gene Ther，1999，10：1853-1866；Azzouz M，et al.Hum Mol Genet，2000，9：803-811；Adachi Y，et al.HumGene Ther，2000，11：77-89]，因此可以利用表达相应外源基因的羊膜细胞来治疗相应的中枢神经系统疾病。本发明以GDNF基因为例，GDNF，属转化生长因子β超家族成员，它对多种原因引起的神经损害都有很好的保护作用。本发明将慢病毒PWPT-GDNF感染的人羊膜细胞植入大鼠短暂脑缺血模型脑内，注射部位一侧脑组织GDNF的表达量升高，同时出现更多的神经元和神经干细胞的标记，缺血面积减少，明显地改善了症状。

本发明所涉及的可表达外源性基因的人羊膜细胞是采用第三代慢病毒载体将外源性基因转入人羊膜细胞的。和原始的HIV-1相比，第三代慢病毒的改造主要有以下几个方面，在没有影响病毒的包装和滴度的前提下，删除3’LTR的U3区域约400bp的片断，删除一些调控因子如vif，vpr，vpu，nef，tats等，同时用口腔疱疹病毒衣壳蛋白(VSVG)替换HIV-1中的ENV，同时把这些片断插入到不同的载体上，最大程度上避免了重组复合体的形成，这使安全性得到更高的保证。同时为了调控外源性基因的表达，在慢病毒载体中可分别加上RNAi，Cre-LoxP系统、强力霉素诱导系统等基因调控结构元件，使外源基因在体外培养条件下能进行有效地被调控，移植入体内后也能使外源基因的表达受调控。

本发明所涉及的制备方法，包括下列步骤：

一、人羊膜细胞来源和培养

人羊膜从剖腹产孕妇的胎盘上剥离下来后，刮掉下面的海绵层和成纤维细胞层，酶消化分离羊膜细胞，加入细胞培养基培养；

二、慢病毒载体介导的基因转移

1.细胞培养和慢病毒的包装

所需包装细胞293T及检测细胞HeLa细胞系用DMEM培养基(10％胎牛血清、streptomycin 100μg/ml、penicillin 100U/ml、glutamine 0.3mg/ml)培养。慢病毒的包装是通过Ca₃(PO4)₂方法：混合20μg转移载体(PWPT或PLVTHM或PWPT-GDNF等图1)，10μg pMDLg/pRRE或者pCMVdR8.2，和5μg pRSVrev，5μpMD2.G.加水至250μl加入250μl 0.5M的CaCl₂，混合后加入到500μl的HeBS2x(0.28M NaCl，0.05MHEPES，1.5M Na₂HPO₄)，静置大约30分钟后加入到293T的培养基中，14小时后加入更换新培液，培养28个小时，收集上清液。1500rpm离心15分钟，用0.45μm膜过滤，在80000g 4℃下超速离心90分钟。弃上清，沉淀用1mlPBS悬浮，保存于-80℃冰箱，从而分别得到了包装好的带有不同外源基因的慢病毒。病毒梯度稀释后加入1×10⁵HeLa培养细胞中，通过流式细胞仪检测感染效率后根据公式(1×10⁵HeLa细胞×％EGFP阳性细胞×1000/μl病毒颗粒)得到病毒的滴度大约在0.1-1×10⁹TU/ml之间。

2.慢病毒感染人羊膜细胞

人羊膜细胞体外培养，然后分别加入包装好的慢病毒和终浓度1-10μg/mlpolybrene，培养处理24小时，然后PBS清洗3次，加入细胞培养基，继续培养。

本发明的优点：利用了慢病毒不会产生免疫原性的特点和人羊膜细胞本身缺乏I，II类抗原却存在具有免疫抑制活性的HLA-E、G抗原的特征，避免了移植可表达外源基因羊膜细胞时所面临的免疫排斥反应，同时本发明结合慢病毒为基础的RNAi系统，Cre-LoxP系统以及强力霉素诱导系统的调控，使外源基因在培养条件下进行有效的调控，移植入体内后也能在一定程度上调控外源基因的表达，使其安全性更高。本发明将慢病毒PWPT-GDNF感染的人羊膜细胞植入大鼠脑缺血模型脑内，结果表明缺血面积减少，明显地改善了症状。因此在中枢神经系统疾病治疗应用方面，本发明所提供了可表达外源性基因的人羊膜细胞，将具有广阔的临床应用前景和开发价值。

在本发明中，使用如下定义：

本文中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的细胞和细胞制剂。因此，术语“主要由…组成”和“由…组成”包含在术语“含有”中。

本文中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。更佳地，“药学上可被接受”是指不影响细胞活性的无毒物质。

本文中，术语“安全有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的治疗反应而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“安全有效量”因各种因素而异，如受治疗的特殊病情、患者的身体条件、受治疗的哺乳动物的种类、疗程、同时进行的治疗的种类(如果有的话)、所应用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构

剂量

在本发明中，对可表达外源性基因的人羊膜细胞的剂量没有特别限制，可用任何合适的剂量。在使用可表达外源性基因的人羊膜细胞治疗中枢神经系统疾病时，细胞的用量取决于疾病的性质、病程、轻重、药物反应情况以及病人接受治疗的情况等，最终由处方医生决定给予病人多少剂量。

一般，在治疗脑缺血性疾病时，可表达外源性基因的人羊膜细胞的有效剂量范围通常为10⁵-10⁹/人。

剂量单元包括一种可表达外源性基因的人羊膜细胞，或者多种可表达外源性基因的人羊膜细胞所形成的混合物。剂量单元还可含有稀释剂、生物材料载体等。剂量单位是液体或凝胶形式，它们适合颅内注射或者颅内填埋。

剂型

本发明经颅内填埋移植的可表达外源性基因的人羊膜细胞组合物可采用凝胶形式。这些凝胶物中混合了1种或1种以上的可表达外源性基因的人羊膜细胞和至少1种生物材料载体，例如，胶原、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、果胶、硅铝酸镁、铝酸镁。

经颅内注射移植的可表达外源性基因的人羊膜细胞组合物包括药学上可接受的溶液剂，通常可以是PBS、Hank’s液、无酚红细胞培养基。

治疗方法

治疗方法可以是，治疗中枢神经系统疾病的任何合适有效方法。治疗可以是颅内注射或者颅内填埋。

本发明的可表达外源性基因的人羊膜细胞制剂还可与其他治疗和辅助治疗中枢神经系统疾病的物质联用，以进一步提高治疗效果。

附图说明

图1.慢病毒系统转移载体的结构：插入转录调节元件(WPRE或者WHV)和多聚嘌呤片断(cPPT)，以提高病毒的转染效率，启动子采用CMV或者EFs，这两个启动子能在绝大多数细胞中表达。

图.2慢病毒介导的EGFP在羊膜细胞中高效整合并稳定表达。

A：慢病毒(Lenti-EGFP)或者脂质体(DOTAP)转染的羊膜细胞7天后的转染效率；B：慢病毒转染细胞持续5周EGFP的表达情况；C：基因组PCR和RT-PCR的结果证明，Lenti-EGFP整合到基因组并在mRNA水平上高表达；D：羊膜细胞转染前后细胞周期检测的结果，左图为慢病毒转染前的羊膜细胞周期，右图为慢病毒转染后的羊膜细胞周期。

图3.慢病毒介导的siGFP的系统抑制羊膜细胞EGFP的表达。

A：Lenti-EGFP转染的羊膜细胞的荧光影象；B：羊膜细胞EGFP表达效率；C：Lenti-EGFP和Len-siGFP共转染羊膜细胞的荧光影象；D：RT-PCR检测EGFP的mRNA水平。

图4.羊膜细胞EGFP的表达可以通过慢病毒介导的Cre-LoxP系统有效调控。A：Lenti-EGFP的羊膜细胞的荧光影象；B：Lenti-EGFP和Lenti-Cre共转染的荧光影象；C：Lenti-EGFP的羊膜细胞(PWPT)、Lenti-EGFP和Lenti-Cre共转染的羊膜细胞(PWPT/CRE)EGFP的表达效率；D：通过羊膜细胞基因组PCR发现这种抑制作用是通过剔除整合入基因组中的EGFP实现的。

图5.慢病毒介导的强力霉素表达系统对羊膜细胞的调控。A：Lenti-EGFP表达的细胞的荧光图象；B：Lenti-EGFP和PLVtTR-KRAB共转染羊膜细胞的荧光图象：C：强力霉素处理后，Lenti-EGFP和PLVtTR-KRAB共转染羊膜细胞的荧光图象。

图6慢病毒转染的羊膜细胞生物安全性检测。在羊膜细胞及羊膜细胞上清液培养的Hela细胞的基因组中，通过PCR检测发现用正常表达EGFP的羊膜细胞上清液培养的Hela细胞没有EGFP的表达(A)，同时在两个细胞中均没有发现病毒结构基因GAG的表达(B)。

图7.脑组织TTC染色后缺血体积比较。把二个组的大鼠脑子切成1mm厚的切片，TTC染色，然后利用Auto CAD软件计算每张切片缺血部分面积/总面积，最终算出缺血体积/总体积。对照组皮层大部分缺血，转GDNF的羊膜细胞组，皮层缺血症状几乎全部恢复。

图8.转GDNF羊膜细胞在注射入脑内两周后GDNF免疫组化。在注射转GDNF羊膜细胞的针道里(图8A)有大量GDNF阳性的转GDNF的羊膜细胞(5×)放大后如图8B(100×)苏木素复染后如图8C(200×)；对侧部位没有明显的阳性细胞图8D，8E(100×)。

图9.转GDNF羊膜细胞注射到脑内后针道周围的脑细胞免疫组化。针道周围的脑组织细胞(图A 5×，图B 100×，图C 200×)；与对侧部位(图D，E 100×)相比GDNF的表达明显增高。苏木素复染后如图C，E。

图10.转GDNF羊膜细胞注射到体内三周后后MAP-2免疫组化呈阳性；图A为针道(5×)，苏木素复染后如图C(100×)；图B为针道对侧脑组织(5×)，苏木素复染后如图D(100×)。

图11.大鼠MCAO术前两天及术后治疗期间(16天内)神经行为学评分。与对照组相比，hAEC-GDNF组效果明显其症状在第八天即出现明显好转。

图12.平衡木实验检测二组大鼠术后运动平衡性的恢复能力。术后第4天开始治疗组hAEC-GDNF组的得分明显高于对照组.

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NeW York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料

以下实验所用主要药品来源：

包装细胞293T及检测细胞HeLa细胞系来自ATCC(Rockville，Maryland)，慢病毒载体系统包括转运载体(PWPT，PLVTHM，)、包装载体(pCMVδR8.2、pMDLg/pRRE)、包被载体(pMD.G)来自Invitrogen； PLV-tTR-KRAB、lenti-cre、PLVTHMsiGFP、PWPI-GDNF按Invitrogen慢病毒载体说明书构建；siGFP序列(MluI)cgcgtccccgaacggca tcaaggtgaacttcaagagag，(ClaI)ttcaccttgatgccgttctttttggaaat和其它引物由上海生工生物工程公司合成。细胞培养试剂来自于GIBCO；polybrene来自于Sigma；基因组DNA抽提试剂盒、mRNA抽提试剂盒、PCR系统、RT-PCR系统均来自promega；GDNF抗体来自于santacruz，CA，MAP-2抗体来自于sigma。

实施例1人羊膜细胞的培养

人羊膜从健康的剖腹产孕妇的胎盘上剥离下来后，刮掉下面的海绵层和成纤维细胞层，把膜用剪刀剪成碎片，加入0.25％胰酶/EDTA，消化半小时后，加入血清终止，离心后将得到的细胞接种于6孔板，加入RPMI 1640培养基(10％胎牛血清，streptomycin100μg/ml，penicillin 100U/ml和glutamine 0.3mg/ml)在37°C含5％CO₂细胞培养箱培养。

实施例2流式细胞仪(FACS)和PCR分析病毒感染羊膜细胞的效率

hAEC以2×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板，48小时后加入慢病毒PWPT(MOI＝100)，同时加入10μg/ml polybrene，转染处理24小时，然后PBS清洗3次，换新RPMI 1640培养基继续培养。同时hAEC也加入EGFP-脂质体，转染处理24小时，然后PBS清洗3次，换新RPMI 1640培养基继续培养。

PWPT转染的人羊膜细胞培养1个星期后，通过流式细胞仪(FACS)检测EGFP的表达效率，并抽提细胞基因组DNA和mRNA检测在基因组和mRNA水平上的变化。基因组DNA和mRNA的抽提以及PCR、RT-PCR根据promega公司的说明书操作，扩增条件为：94℃5分钟；28个循环：94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟；最后72℃10分钟。EGFP引物：上游5’-cgagctggacggcgacgtaaac-3’下游5’-gcgcttctcgtggggtctttg-3’，内参β-actin：上游aacgagcggtccgatgccctgag，下游tgcgccttcaccgtccagt，扩增后片断的长度为EGFP：597bp，β-actin：590bp。取扩增产物10μl在1.5％琼脂糖(0.5μg/ml溴化己啶)，电泳检测。

结果：通过流式细胞仪检测转染效率，以脂质体转染羊膜细胞作为对照，发现慢病毒效率远高于脂质体转染，慢病毒能感染90％左右的细胞，而脂质体的感染效率低于5％(图2A)，连续传代培养5个星期，EGFP的表达效率保持稳定(图2B)；检测基因在细胞内的存在状态，发现EGFP在基因组水平上存在，mRNA水平上有稳定的表达(图2C)，说明慢病毒介导的基因是通过整合入基因组的方式在细胞内表达的。同时细胞周期检测的结果，感染前后G0-G1期细胞比率保持稳定(图2D)。这些结果说明慢病毒不影响羊膜细胞的状态，是一种稳定可靠的转基因方法。

实施例3慢病毒介导的RNAi抑制羊膜细胞EGFP的表达

RNAi被认为是在转录后水平上最有效的基因沉默方法。通过在羊膜细胞中利用慢病毒转入EGFP和siGFP的方法，发现慢病毒介导RNAi的表达能在mRNA水平上抑制细胞中特定基因。siGFP序列通过慢病毒PLVTHMsiGFP在细胞内转录后形成双链RNA，介导了细胞中EGFP mRNA的切除。

hAEC以2×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板，48小时后加入慢病毒PLVTHM(MOI＝100)，同时加入8μg/ml polybrene，转染24小时后，再加入pLVTHMsiGFP，处理24小时，然后PBS清洗3次，换新RPMI 1640培养基继续培养。

细胞培养1个星期后通过荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)检测EGFP的表达，并用半定量PCR检测EGFP表达与调控的关系。mRNA的抽提以及RT-PCR根据promega公司的说明书操作，扩增条件为：94℃5分钟；28个循环：94℃1分钟，58℃1分钟，72％1分钟；最后72℃10分钟。EGFP引物：上游5’-cgagctggacggcgacgtaaac-3’下游5’-gcgcttctcgttggggtctttg-3’，内参β-actin：上游aacgagcggttccgatgccctgag，下游tgcgccttcaccgttccagtt，扩增后片断的长度为EGFP：597bp，β-actin：590bp。取扩增产物10μl在1.5％琼脂糖(0.5μg/ml溴化己啶)，电泳检测。

结果：PLVTHM转染的羊膜细胞能稳定表达EGFP，PLVTHM和PLVTHMsiGFP共转染的细胞中EGFP的表达明显受到抑制(图3A，C)。流式细胞仪检测结果发现抑制后EGFP的表达低于15％(图3B)，RT-PCR结果表明这种抑制作用发生在羊膜细胞的mRNA水平(图3D)。

实施例4慢病毒介导的CRE-LoxP系统有效的套取转入的外源基因

Cre是整合酶家族中位点特异性的重组酶，能催化loxP之间片断的重组(Sternberg，N.(1981)J.Mol.Biol.150，467-486)，利用慢病毒介导的CRE-LoxP系统在羊膜细胞中特异性的剔除外源基因。慢病毒3’端具有LoxP位点，反转录后整合到基因组后两端都具有了LoxP位点，CRE酶可以将这两端间的片断剔除。

hAEC以2×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板，48小时后加入慢病毒PWPT(MOI＝200)，同时加入8μg/ml polybrene，转染24小时，然后加入Lenti-CRE，处理24小时，然后PBS清洗3次，换新RPMI 1640培养基继续培养。

细胞培养1个星期后通过流式细胞仪(FACS)检测EGFP的表达效率，并用半定量RT-PCR检测EGFP表达与调控的关系，mRNA的抽提以及RT-PCR根据promega公司的说明书操作，扩增条件为：94℃5分钟；28个循环：94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟；最后72℃10分钟。EGFP引物：上游5’-cgagctggacggcgacgtaaac-3’下游5’-gcgcttctcgttggggctttg-3’，内参β-actin：上游aacgagcggtccgatgccctgag，下游tgtcgccttcaccgtccagtt，扩增后片断的长度为EGFP：597bp，取扩增产物10μl在1.5％琼脂糖(0.5μg/ml溴化己啶)，电泳检测。

结果：PWPT感染的羊膜细胞EGFP能正常表达，PWPT和Lenti-CRE共转染的羊膜细胞中EGFP的表达能被有效的抑制，流式细胞仪分析的结果标明抑制后EGFP的表达效率低于10％(图4A)，基因组DNA中EGFP的PCR检测结果发现，慢病毒介导的CRE-LoxP系统能剔除整合入基因组中的EGFP(图4B)。

实施例5慢病毒介导的强力霉素调控的基因表达

tTR-KRAB蛋白能特异性的结合到基因组中的tetO位点，使附近的启动子(可达3kb)被抑制，同时也能被强力霉素结合而失去结合到tetO位点的特性，根据这一特点，可以利用慢病毒把特异性位点tetO与治疗基因以其整合到染色体，再通过慢病毒表达的tTR-KRAB蛋白和强力霉素的作用，使治疗基因在细胞内被调控表达。

hAEC以2×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板，48小时后加入慢病毒PLVTHM(MOI＝200)，同时加入10μg/ml polybrene，转染24小时，再加入PLV-tTR-KRAB，处理24小时，然后PBS清洗3次，换新RPMI 1640培养基继续培养。再经过24小时培养后，加入强力霉素(终浓度5μg/ml)。通过荧光显微镜观察荧光检测细胞EGFP的表达效率。

结果：发现PLVTHM感染的羊膜细胞能有效的表达EGFP(图5A)，PLVTHM与PLV-tTR-KRAB共转染后，EGFP的表达明显受到抑制(图5B)，加入强力霉素(DOX)后，细胞中EGFP恢复表达(图5C)。这一调控系统在羊膜细胞内可以有效的调控EGFP的表达。

实施例6生物安全性检测

PWPT感染羊膜细胞3天后，用PBS冲洗干净，继续培养3天，收集上清液，用0.45μm的膜过滤后，作为培养基培养HeLa细胞，培养3天。分别抽提hAEC和HeLa的基因组DNA，用病毒结构蛋白GAG及EGFP和β-actin引物扩增，引物序列分别为

gag：上游5’gagatctgatcatactgtcctac3’

下游5’ggaactactagtacccttcaggaa3’；

EGFP：上游5’cgagctggacggcgacgtaaac3’

下游5’gcgcttctcgtggggtctttg3’；

β-actin上游5’aacga gcggtccgatgccctgag 3’

下游5’tgcgccttcaccgtccagtt3’。

反应条件：94℃5分钟；28cycles：94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟；72℃10分钟。扩增片断长度：EGFP：597bp.；Gag：912bp；β-actin：590bp。取扩增产物10μl在1.5％琼脂糖(0.5μg/ml溴化己啶)，电泳检测。

结果：发现在羊膜细胞中整合入EGFP的情况下，Hela细胞的基因组中没有检测到EGFP的插入(图6A)同时检测了病毒结构蛋白GAG，在羊膜细胞以及Hela细胞基因组中均没有发现(图6B)。

实施例7大鼠短暂脑缺血模型(MCAO)的建立

250g雌性SD大鼠用10％水合氯醛麻醉(0.3ml/100g)。具体方法如下：大鼠仰卧位取颈部正中切口，暴露颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉和翼腭动脉。距颈总动脉分叉部10mm处将颈外动脉用3-0丝线结扎；用三个动脉夹分别夹闭颈总动脉、颈内动脉和翼腭动脉。用1ml注射器在颈外动脉上刺一小孔(在颈外动脉结扎处至颈总动脉分叉部之间)，用30mm长、4-0尼龙线(尖端烧成圆形，以免刺破血管内壁)经此小孔插入，松开颈内动脉上的动脉夹，将插线经颈总动脉分叉处插入颈内动脉直至堵塞住大脑中动脉(从颈总动脉分叉处插入线长约18-20mm)。40分钟后，拔出插线。近心端结扎颈外动脉，松开颈总动脉和翼腭动脉上的动脉夹，肉眼可见血管内血流恢复。分层缝合手术切口，注意动物保暖。(Zea longa E etal Stroke，1989，20：84-91)。MCAO模型制作完成24h后，将手术大鼠进行提尾试验以确定动物模型的成功与否。具体操作如下：将大鼠鼠尾提起离地面约20cm，模型成功大鼠表现为手术对侧前肢向胸壁靠拢，身体弯向手术对侧的脑梗塞症状。从而认定模型建立成功。[MarkgrafCG，et al.BrainRes，1992，20；575(2)：238-46]

实施例8细胞的移植

hAEC以2×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板，48小时后加入慢病毒PWPT-GDNF(MOI＝100)，同时加入10μg/ml polybrene，转染处理24小时，然后PBS清洗3次，换新RPMI 1640培养基继续培养；细胞移植前，0.05％胰酶消化成单细胞，PBS清洗，然后将细胞沉淀用PBS重悬为1-2×10⁸。

细胞移植：将MCAO大鼠固定于立体定向架上，取俯卧位，取顶部正中切口，钝性分离骨膜，暴露颅骨和前囟，定位后钻孔。注射部位：前囟后1mm，右侧方3mm，深度4mm，这个区域为缺血边缘区。分组：对照组注射PBS 5μl；hAEC-GDNF组注射慢病毒PWPI-GDNF感染的羊膜细胞4-8×10⁵5μl。

实施例9梗死体积的测定

大鼠MCAO手术后16d，二组分别随机取6只动物，用水合氯醛过量麻醉处死(500mg/kg，腹腔注射)，经心脏灌注生理盐水。在大脑耳间线前12mm(为额叶皮质的感觉和运动区)至5.0mm(为海马中部)处切成脑片，片厚1mm，然后将脑片放入2％四氮唑红(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)磷酸盐缓冲液中，37℃避光孵育30分钟，取出置于10％多聚甲醛液中固定。采用AutoCAD处理摄影图像，计算出脑片上梗死灶面积。梗死体积(mm3)＝所有脑片梗死面积的总和×1mm(脑片的厚度)。数据以梗死体积/脑组织体积的百分比值呈现。

结果：二组老鼠在大脑缺血面积上存在明显差异，主要表现在皮层上，对照组皮层大部分缺血，hAEC-GDNF皮层缺血症状几乎全部恢复(图7)。

实施例10免疫组织化学方法(DAB法)

检测针道及针道附近GDNF和神经元标记MAP-2的表达。取二组大鼠各3只，10％水合氯醛麻醉(0.3ml/100g)，经心脏灌注生理盐水和4％多聚甲醛，取出脑组织置于20％蔗糖中，待完全沉降后，取冠状面针道附近冰冻切片，片厚50μm。在0.3％的H2O2中30分钟以去处内源性的过氧化物酶，GDNF(1∶200)或MAP-2(1∶200)，4过夜；抗兔生物素二抗，37℃1小时，ABC混合液37℃1小时，DAB显色。苏木精复染封片。

结果：发现hAEC-GDNF组的大鼠脑针道附近大量的阳性细胞，而对侧的同位置几乎没有阳性细胞(图8.)。同时还发现针道周围的脑组织细胞也呈现GDNF阳性(图9)，说明hAEC-GDNF在注射到脑内后能够为大脑提供足够的GDNF或者诱导了针道周围的细胞自身产生GDNF。细胞移植三周后，免疫组化检测MAP-2的表达，发现hAEC-GDNF具有MAP-2阳性，说明羊膜细胞可能在体内分化成为神经元，对于脑内神经细胞的保护具有重要的作用(图10)

实施例11神经行为学检查

二组随机取6只大鼠神经学检查标准按照Longa等提出的进行评分：0分为正常；1分为栓塞动脉对侧上肢不能完全伸展，而同侧上肢正常；2分为栓塞动脉对侧上肢屈曲，向对侧推时抵抗力下降，没有旋转；3分为栓塞动脉对侧上肢屈曲，向对侧推时抵抗力下降，行走时向对侧有轻度旋转；4分表现为行走时向对侧有严重旋转；5分为大鼠身体倒向梗死对侧。[Longa EZ，et al Stroke.1989；20(1)：84-91]

结果：从术后4天到16天，hAEC-GDNF组与对照组表现相比较，神经行为学明显好转。在多个时间段都有显著差异(P＜0.05)随着术后时间的推移，hAEC-GDNF组大鼠的行为学评分分别在第8天和第12天降至1分左右；而对照组在第16天症状亦有所改善，但评分始终在2分以上，存在明显的神经行为学损伤(图11)。

实施例12协调性检测

通过beam-walking方法，用一根长1750cm宽19mm的杆子，检测老鼠通过杆子的能力评分标准为：0：老鼠跌落；1：老鼠能停在杆上，但不能爬行；2：老鼠在爬行中跌落；3：老鼠能通过杆子，但后肢不能发挥作用：4：能通过杆子后肢有50％脱步现象；5：能顺利通过杆子，有很少脱步；6：顺利通过。

结果：通过在平衡木上行走，可以检测其运动的协调能力，发现在术后4天，hAEC-GDNF组与对照组相比已经有明显差异，随着时间推移，症状逐渐改善。(图12)。

实施例13.细胞注射液的制备(每支)

采用实施例8制备的人羊膜细胞 109个细胞

PBS 1ml

数据统计

用SigmaPlot软件分析FACS的结果，所得分析结果以means±SE表示，Student′st-test和one-way ANOVA分析数据间的明显差异，显著性差异的标准P＜0.05。

Claims

1、一种可表达外源性基因的人羊膜细胞，其特征在于，该细胞含有由慢病毒载体导入的外源性基因。

2、按权利要求1所述的可表达外源性基因的人羊膜细胞，其特征在于，所述的外源性基因选自神经生长因子、脑源性神经生长因子、β-葡萄糖醛酸甙酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、多巴胺合成酶、酪氨酸羟化酶、BH4合成酶、胶质细胞源性神经营养因子、bcl-2、胆碱乙酰基转移酶或睫状神经节神经营养因子。

3、按权利要求1所述的可表达外源性基因的人羊膜细胞，其特征在于，所述的外源性基因为胶质细胞源性神经营养因子。

4、按权利要求1-3所述的可表达外源性基因的人羊膜细胞，其特征在于，含有基因调节结构元件，该元件选自：RNAi系统、Cre-LoxP系统、强力霉素诱导系统。

5、一种可表达外源性基因的人羊膜细胞制剂，其特征在于，含有按权利要求1-4所述的可表达外源性基因的人羊膜细胞和和药学上可接受的载体。

6、一种可表达外源性基因的人羊膜细胞的制备方法，包括下列步骤：

(1).人羊膜细胞培养

(2).慢病毒载体介导的基因转移。

7、按权利要5所述的可表达外源性基因的人羊膜细胞制剂在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。

8、按权利要7所述的应用，其特征在于，所述的中枢神经系统疾病为脑缺血性疾病、脑出血性疾病、中枢神经系统的损伤、神经系统遗传病、中枢神经系统慢性退变性疾病或中枢神经系统肿瘤。

9、按权利要7所述的应用，其特征在于，所述的中枢神经系统疾病为脑缺血性疾病。