DE69535035T2

DE69535035T2 - Präparate zur verabreichung von genetischem material

Info

Publication number: DE69535035T2
Application number: DE69535035T
Authority: DE
Inventors: Richard A. Paoli CARRANO
Original assignee: Wyeth LLC; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Wyeth LLC; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1994-04-01
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2015-03-31
Also published as: ATE328589T1; EP0772437A1; AU709659B2; US5739118A; EP1616578A1; EP0772437A4; EP0772437B9; CA2186913A1; PT772437E; ES2265147T3; DE69535035D1; EP0772437B1; DK0772437T3; JPH09511146A; AU2236695A; US6197755B1; WO1995026718A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zum Einbringen von genetischem Material in die Zellen einer Person. Die Zusammensetzungen der Erfindung können verwendet werden, um schützende und/oder therapeutische Mittel, einschließlich genetischem Material, das Protein-Targets für die Immunisierung und therapeutische Proteine kodiert, abzugeben.
Hintergrund der Erfindung
Das direkte Einbringen eines normalen, funktionellen Gens in ein lebendes Tier wurde als Möglichkeit zum Ersetzen fehlerhafter genetischer Information untersucht. In einigen Untersuchungen wird DNA direkt ohne die Verwendung eines viralen Teilchens oder eines anderen infektiösen Vektors in Zellen eines lebenden Tiers eingebracht. Nabel, E.G., of al., (1990) Science 249:1285-1288, beschreibt Site-Specific-Genexpression in vivo eines Beta-Galactosidasegens, das direkt in die Arterienwand in Mäusen übertragen wurde. Wolfe, J.A., et al., (1990) Science 247:1465-1468, beschreibt die Expression verschiedener Reportergene, die direkt in vivo in Mäusemuskeln übertragen wurden. Acsadi G., et al., (1991) Nature 352: 815-818, beschreibt die Expression von humanem Dystrophin-Gen in Mäusen nach intramuskulärer Injektion von DNA-Konstrukten. Wolfe, J.A., et al., (1991) BioTechniques 11(4):474-485, bezieht sich auf die Bedingungen, die die direkte Genübertragung in Nagetiermuskeln in vivo beeinträchtigen. Felgner, P.L., und G. Rhodes, (1991) Nature 349:351-352, beschreiben die direkte Abgabe von gereinigten Genen in vivo als Medikament ohne die Verwendung von Retroviren.
Die Verwendung des direkten Gentransfers als alternatives Impfverfahren gegen Krankheitserreger wurde vorgeschlagen. Die Verwendung des direkten Gentransfers durch eine einzige Injektion wurde als mögliche Impfstrategie gegen HIV vorgeschlagen. Es wurde berichtet, dass eine zelluläre Immunreaktion auf HIV gp120 beobachtet wurde, die aus dem Einführen von Plasmid-DNA, die diese kodiert, in Zellen resultiert. Die PCT-Publikation Nr. WO/9011092, veröffentlicht am 4. Oktober 1990, beschreibt Verfahren zum Immunisieren einer Person gegen Krankheitserregerinfektionen durch direktes Injizieren nackter Polynukleotide in Zellen einer Person in einem einstufigen Verfahren. Die Verwendung von Transfektion gegen etwas anderes als Lipofektionen wird speziell von den beschriebenen Verfahren ausgeschlossen. Das Stimulieren von inokulierten Zellen wird weder beschrieben noch vorgeschlagen. Ein HIV-Impfstoff wird beschrieben, welcher aus dem Einbringen von Polynukleotiden besteht, die das virale Protein gp120 kodieren. Die Wirksamkeit dieses Impfstoffs wird nicht nachgewiesen.
WO-A-9504548 fällt in den Bereich des Artikels 54(3) EPC und wurde speziell ausgeschlossen. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 84, S. 7851-7855 vom November 1987 beschreibt ein Plasmid mit einem E. Coli Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen unter der Kontrolle eines Säugetier-cAMP-regulierten-Promotors, das in einem H-2K^k-Antikörper, der mit Liposom beschichtet ist, eingeschlossen ist.
Ulmer, J.B., et al. in Science, Band 259, S. 1745 bis 1749, zeigt den heterologen Schutz gegen Influenza durch Injektion von DNA, die ein virales Protein kodiert.
Weiterhin zeigt Dr. Hug, et al., in Biochemica oder Biophysical Acta., Bd. 1097, (1991) 1-17, Liposome für die Transformation von eukaryotischen Zellen. Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die

(a) umfasst: i) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht-funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und ii) einen genetischen Impfstoffförderer, ausgewählt aus Lektinen, Östrogenverbindungen, Dimethylsulfoxid und Harnstoff; oder
(b) bestehend aus: i) einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nichtfunktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und ii) einem oder mehreren hydroxylierten niederen Alkylen; oder
(c) bestehend aus i) einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nichtfunktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und ii) einem oder mehreren anionischen Lipiden, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung frei von retroviralen Partikeln ist.

Vorzugsweise besteht die pharmazeutische Zusammensetzung aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht-funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und einem oder mehreren hydroxylierten niederen Alkylen. Weiterhin bevorzugt sind die hydroxylierten niederen Alkyle ausgewählt aus n-Propanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol und Glycerin.
Vorzugsweise besteht die pharmazeutische Zusammensetzung aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vor handensein ein fehlendes, nicht-funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft, und einem oder mehreren anionischen Lipiden.
Weiterhin sind die anionischen Lipide bevorzugt ausgewählt aus Laurin säure, Ölsäure, neutralisierter Schwefelsäure, Natriumlaurylsulfat, Alkylpolyoxyethylensulfaten, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine phar mazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die umfasst:

(a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, ausgewählt aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht-funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und
(b) einen genetischen Impfstoffförderer, ausgewählt aus Lektinen, Östrogenverbindungen, Dimethylsulfoxid, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Harnstoff, Laurinsäure, Ölsäure, neutralisierter Schwefelsäure, Natriumlaurylsulfat, Alkylpolyoxyethylensulfaten, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat; wobei die pharmazeutische Zusammensetzung frei von retroviralen Partikeln ist.

Vorzugsweise wird der genetische Impfstoffförderer ausgewählt aus Conca navalin A, Abrin, Sojabohnenagglutinin, Weizenkeimagglutinin, Östradiol, β-Östradiol, 17-β-Östradiol, Östradiol-3-benzoat, Östradiol-17-β-cypionat, Östradiol-17-propionat oder -dipropionat, -hemisuccinat, -17-heptanoat (-önanthat), -17-undecanoat (-undecylat), -17-valerat, α-Östradiol, α-Östradioldiacetat oder -3-benzoat, Östra-1,3,5(10)-trien-3,16,17-triol, 3-Hydroxyöstra-1,3,5(10)-trien-17-on, Dimethylsulfoxid und Harnstoff.
Vorzugsweise umfasst das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das aus Enzymen, Strukurproteinen, Zytokinen, Lymphokinen und Wachstumsfaktoren ausgewählt ist.
Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül ein DNA-Molekül.
Weiterhin bevorzugt umfasst die Zusammensetzung mindestens zwei unter schiedliche Nukleinsäuremoleküle, die zur Verabreichung an verschiedene Zellen einer Person geeignet sind, wobei die unterschiedlichen Moleküle jeweils eine Nukleotidsequenz haben, die ein oder mehrere pathogene Antigene desselben Krankheitserregers aufweisen.
Vorzugsweise ist der Krankheitserreger ein Virus, ausgewählt aus Human Immunodeficiency Virus (HIV), humanem T-Zell-Leukämie-Virus (HTLV), Grippevirus, Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis B-Virus (HBV), Hepatitis C-Virus (HCV), humanem Papilloma-Virus (HPV), Herpes-simplex-1-Virus (HSV1), Herpes-simplex-2-Virus (HSV2), Zytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Rhinovirus und Coronavirus.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt:

a) umfassend: i) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind; und, ii) einen genetischen Impfstoffförderer, ausgewählt aus Lektinen, Östrogenverbindungen, Dimethylsulfoxid und Harnstoff; oder
b) bestehend aus: i) einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind; und, ii) einem oder mehreren hydroxylierten niederen Alkylen; oder
c) bestehend aus: i) einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind; und ii) einem oder mehreren anionischen Lipiden; worin die pharmazeutische Zusammensetzung frei von retroviralen Partikeln ist.

Vorzugsweise besteht die pharmazeutische Zusammensetzung aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind, und einem oder mehreren hydroxylierten niederen Alkylen.
weiterhin bevorzugt werden die hydroxylierten niederen Alkyle ausgewählt aus n-Propanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol und Glycerin.
Vorzugsweise besteht die pharmazeutische Zusammensetzung aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft, und einem oder mehreren anionischen Lipiden.
Weiterhin bevorzugt werden die anionischen Lipide ausgewählt aus Laurin säure, Ölsäure, neutralisierter Schwefelsäure, Natriumlaurylsulfat, Alkylpolyoxyethylensulfaten, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat.
Vorzugsweise umfasst das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die eine oder mehrere variable Regionen von Antikörpern, die an B-Zellen-vermittelter Autoimmunerkrankung beteiligt sind, oder eine oder mehrere variable Regionen von T-Zell-Rezeptoren, die an T-Zellen-vermittelter Autoimmunerkrankung beteiligt sind, kodiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend:

i) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von ei ner hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind, und
ii) einen genetischen Impfstoffförderer, ausgewählt aus Lektinen, Östrogenverbindungen, Dimethylsulfoxid, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Harnstoff, Laurinsäure, Ölsäure, neutralisierter Schwefelsäure, Natriumlaurylsulfat, Alkylpolyoxyethylensulfaten, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat; worin die pharmazeutische Zusammensetzung frei von retroviralen Partikeln ist.

Vorzugsweise wird der genetische Impfstoffförderer ausgewählt aus Concanavalin A, Abrin, Sojabohnenagglutinin, Weizenkeimagglutinin, Östradiol, β-Östradiol, 17-β-Östradiol, Östradiol-3-benzoat, Östradiol-17-β-cypionat, Östradiol-17-propionat oder -dipropionat, -hemisuccinat, -17-heptanoat (-önantat), -17-undecanoat (-undecylat), -17-valerat, α-Östradiol, α-Östradioldiacetat oder -3-benzoat, Östra-1,3,5(10)-trien-3,16,17-triol, 3-Hydroxyöstra-1,3,5(10)-trien-17-on, Dimethylsulfoxid und Harnstoff.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Konstruktion des Plasmids pM160 veranschaulicht, das durch Insertieren eines PCR-generierten Fragments, welches das HIV-HXB2-Glykoprotein gp160 kodiert, in das Plasmid pMAMneoBlue (Clonetech) erzeugt wurde.
2 ist eine Plasmidkarte von pGAGPOL.rev.
3 ist eine Plasmidkarte von pENV.
4 zeigt vier Hauptketten, A, B, C und D, die zur Herstellung des genetischen Konstrukts verwendet wurden.
5 zeigt vier Inserts, 1, 2, 3 und 4, die in Grundgerüste insertiert werden, um genetische Konstrukte zu erzeugen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Einführen von Nukleinsäuremolekülen in die Zellen eines Tiers, welches einen hohen Grad an Aufnahme und Funktion der Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung stellt. Das Verfahren umfasst die Schritte des Verabreichens von Nukleinsäuremolekülen, die frei von viralen Partikeln, insbesondere retroviralen Partikeln, sind, an die Zelle einer Person, zusammen mit der Verabreichung eines genetischen Impfstoffförderers. Der genetische Impfstoffförderer wird ausgewählt aus anionischen Lipiden, Lektinen, Östrogenverbindungen, hydroxylierten niederen Alkylen, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Harnstoff. Vorzugsweise verstärkt der genetische Impfstoffförderer die Entzündungsreaktionen und/oder die Expression des Nukleinsäuremoleküls im Gewebe und/oder erleichtert die Aufnahme des Nukleinsäuremoleküls durch die Zelle.
Es werden auch Verfahren zur Abgabe von Nukleinsäuremolekülen an Zellen einer Person ohne die Verwendung infektiöser Mittel beschrieben. Nukleinsäuremoleküle, die an Zellen abgegeben werden, dienen als: 1) genetische Template für Proteine, die als prophylaktische und/oder therapeutische Impfstoffe wirken; 2) Ersatzkopien für defekte, fehlende oder nicht-funktionierende Gene; 3) genetische Template für therapeutische Proteine; 4) genetische Template für Antisense-Moleküle; oder 5) genetische Template für Ribozyme.
Im Falle von Nukleinsäuremolekülen, die Proteine kodieren, umfassen die Nukleinsäuremoleküle die notwendigen Regulatorsequenzen zur Transkription und Translation in den Zellen des Tiers.
Im Falle von Nukleinsäuremolekülen, die als Template für Antisense-Moleküle und Ribozyme dienen, können solche Nukleinsäuremoleküle an Regulatorelemente gebunden werden, die zur Produktion ausreichender Kopien der Antisense- bzw. Ribozymmoleküle notwendig sind, die dadurch kodiert werden. Die Nukleinsäuremoleküle sind frei von retroviralen Partikeln und können als DNA in Form von Plasmiden bereitgestellt werden.
Das Hilfsmittel wird hier auch als "genetischer Impfstoffförderer" oder "GVF (Genetic Vaccine Facilitator)" beschrieben. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "genetischer Impfstoffförderer" Hilfsmittel, die zusammen mit Nukleinsäuremolekülen verabreicht werden, einschließlich genetischen Impfstoffen und genetischen Therapeutika. Der GVF wird als Gemisch mit dem Nukleinsäuremolekül oder separat gleichzeitig vor oder nach Verabreichung der Nukleinsäuremoleküle verabreicht. Der GVF wird als Teil therapeutischer oder prophylaktischer Verfahren verwendet, die die Verabreichung eines Nukleinsäuremoleküls umfassen, das immunogene Targets, therapeutische Proteine, Ribozyme oder Antisense-Sequenzen kodiert. Die GVFs, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind ausgewählt aus anionischen Lipiden, Lektinen, Östrogenverbindungen, hydroxylierten niederen Alkylen, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Harnstoff.
Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine Person prophylaktisch und/oder therapeutisch gegen einen Krankheitserreger oder eine anormale, krankheitsbedingte Zelle immunisieren. Das genetische Material kodiert ein Peptid oder ein Protein, das mindestens ein Epitop mit einem immunogenen Protein teilt, das im Krankheitserreger oder den Zellen, die erreicht werden sollen, gefunden wird. Das genetische Material wird von den Zellen der Person exprimiert und dient als immunogenes Target, gegen das eine Immunreaktion ausgelöst wird. Die resultierende Immunreaktion hat eine breite Basis: zusätzlich zu einer humoralen Immunreaktion werden beide Arme der zellulären Immunreaktion ausgelöst. Die Verfahren sind nützlich zur Übertragung von prophylaktischer und therapeutischer Immunität. Somit umfasst ein Immunisierungsverfahren sowohl Verfahren zum Schutz einer Person vor dem Angriff eines Krankheitserregers oder dem Auftreten oder der Proliferation spezieller Zellen, sowie Verfahren zur Behandlung einer Person, die an einer Krankheitserregerinfektion, einer hyperproliferierenden Erkrankung oder einer Autoimmunerkrankung leidet.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich, um breite Immunreaktionen gegen einem Target-Protein, d.h. Proteine, die speziell mit pathogenen oder den eigenen "anormalen" Zellen der Person in Zusammenhang stehen, hervorzurufen. Die vorliegende Erfindung ist nützlich, um eine Person gegen pathogene Wirkstoffe und Organismen so zu immunisieren, dass eine Immunreaktion gegen ein Krankheitserregerprotein eine schützende Immunität gegenüber dem Krankheitserreger zur Verfügung stellt. Die vorliegende Erfindung ist nützlich, um hyperproliferierende Erkrankungen und Störungen, wie beispielsweise Krebs, durch Auslösen einer Immunreaktion gegen ein Target-Protein, das speziell mit den hyperproliferierenden Zellen zusammenhängt, zu bekämpfen. Die vorliegende Erfindung ist nützlich, um Autoimmunerkrankungen und -störungen durch Auslösen einer Immunreaktion gegen ein Target-Protein, das speziell mit Zellen zusammenhängt, die an dem autoimmunen Zustand beteiligt sind, zu bekämpfen.
Einige Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen die Gentherapie; d.h. sie betreffen Zusammensetzungen zum Einführen von Nukleinsäuremolekülen in die Zellen exogener Genkopien einer Person, die entweder defekten, fehlenden, nicht-funktionierenden oder teilweise funktionierenden Genen in der Person entsprechen, oder welche therapeutische Proteine kodieren, d.h. Proteine, deren Auftreten in der Person ein Defizit in der Person eliminiert und/oder deren Auftreten eine therapeutische Wirkung beim Patienten bereitstellt, wobei eine Möglichkeit zur Abgabe des Proteins durch eine alternative Möglichkeit zur Proteinverabreichung zur Verfügung gestellt wird.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "gewünschtes Protein" Peptide und Proteine, die durch Genkonstrukte der vorliegenden Erfindung kodiert werden, welche entweder als Target-Proteine für eine Immunreaktion oder als therapeutisches oder kompensatorisches Protein in Gentherapieplänen wirken.
DNA oder RNA, die ein gewünschtes Protein kodieren, können in die Zellen einer Person eingebracht werden, wo sie exprimiert werden, so dass das gewünschte Protein hergestellt wird. Die DNA oder RNA, die das gewünschte Protein kodiert, ist mit Regulatorelementen verbunden, die für die Expression in den Zellen des Patienten erforderlich sind. Regulatorelemente für die DNA-Expression umfassen einen Promotor und ein Polyadenylierungssignal. Darüber hinaus können andere Elemente, wie beispielsweise eine Kozak-Region, in dem genetischen Konstrukt enthalten sein.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "genetisches Konstrukt" das DNA- oder RNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die das gewünschte Protein kodiert, und welche Anfangs- und Endsignale umfasst, die operabel an die Regulatorelemente gebunden sind, einschließlich einem Promotor und einem Polyadenylierungssignal, die in den Zellen des geimpften Patienten die Expression einleiten können.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "exprimierbare Form" Genkonstrukte, welche die erforderlichen Regulatorelemente, die operabel mit einer Kodiersequenz verbunden sind, enthalten, die ein Target-Protein kodiert, so dass bei Vorhandensein in der Zelle der Person die kodierende Sequenz exprimiert wird.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "genetischer Impfstoff" ein pharmazeutisches Präparat, das ein genetisches Konstrukt umfasst, das eine Nukleo tidsequenz umfasst, die ein Target-Protein kodiert, einschließlich pharmazeutische Präparate, die nützlich sind, um eine therapeutische Immunreaktion hervorzurufen.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "genetisches Therapeutikum" ein pharmazeutisches Präparat, das ein genetisches Konstrukt umfasst, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die therapeutisches oder kompensierendes Protein kodiert. Alternativ können ein genetische Therapeutika Antisense-Sequenzen kodieren, welche die Genexpression von Genen, deren Expression unerwünscht ist, inhibieren. Weiterhin können genetische Therapeutika Ribozyme kodieren.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Target-Protein" ein Protein, gegen das eine Immunreaktion hervorgerufen werden kann. Das Target-Protein ist ein immunogenes Protein, das mindestens ein Epitop mit einem Protein aus dem pathogenen oder unerwünschten Zelltyp teilt, wie beispielsweise einer Krebszelle oder einer Zelle, die an einer Autoimmunerkrankung beteiligt ist, gegen die die Immunisierung erforderlich ist. Die Immunreaktion, die gegen das Target-Protein gerichtet ist, schützt die Person gegen die spezifische Infektion oder Erkrankung, mit der das Target-Protein verbunden ist und behandelt sie.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Teilen eines Epitops" Proteine, die mindestens ein Epitop umfassen, das identisch oder im wesentlichen ähnlich zu einem Epitop eines anderen Proteins ist.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "im wesentlichen ähnliches Epitop" ein Epitop, das eine Struktur aufweist, die nicht identisch ist mit einem Epitop eines Proteins, aber dennoch eine zelluläre oder humorale Immunreaktion hervorruft, die mit dem Protein eine Kreuzreaktion ergibt.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "therapeutisches Protein" Proteine, deren Gegenwart für die Person einen therapeutischen Nutzen liefert.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Kompensationsprotein" Proteine, deren Gegenwart die Abwesenheit eines vollständig funktionierenden, endogen produzierten Proteins aufgrund eines abwesenden, defekten, nicht-funktionierenden oder teilweise funktionierenden endogenen Gens kompensiert.
Genetische Konstrukte umfassen eine Nukleotidsequenz, die ein gewünschtes Protein kodieret, das operabel mit Regulatorelementen verbunden ist, die für die Genexpression erforderlich sind. Demgemäß führt das Einführen des DNA- oder RNA-Moleküls in eine lebende Zelle zur Expression der DNA oder RNA, die das gewünschte Protein kodiert, und somit zur Produktion des gewünschten Proteins.
Bei der Aufnahme durch eine Zelle kann das genetische Konstrukt, das die Nukleotidsequenz umfasst, die das gewünschte Protein, das operabel an die Regulatorelemente gebunden ist, kodiert, in der Zelle als funktionierendes extrachromosomales Molekül vorliegen, oder es kann in die chromosomale DNA der Zelle integriert sein. Die DNA kann in die Zellen eingeführt werden, wo sie als separates genetisches Material in Form eines Plasmids verbleibt. Alternativ kann eine lineare DNA, welche in das Chromosom integriert werden kann, in die Zelle eingeführt werden. Beim Einführen der DNA in die Zelle können Reagenzien, die die DNA-Integration in die Chromosomen fördern, zugegeben werden. DNA-Sequenzen, welche nützlich sind, um die Integration zu fördern, können auch im DNA-Molekül enthalten sein. Alternativ kann RNA an die Zelle verabreicht werden. Es ist auch möglich, das genetische Konstrukt als lineares Minichromosom, einschließlich eines Zentromers, Telomeren und eines Replikationsursprungs zur Verfügung zu stellen.
Das Molekül, das ein gewünschtes Protein kodiert, kann DNA oder RNA sein, welche eine Nukleotidsequenz umfasst, die das gewünschte Protein kodiert. Diese Moleküle können cDNA, genomische DNA, synthetisierte DNA oder ein Hybrid davon, oder ein RNA-Molekül, wie beispielsweise mRNA sein. Demgemäß bedeuten die Begriffe "DNA-Konstrukt", "genetisches Konstrukt" und "Nukleotidsequenz", wie hier verwendet, sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle.
Die Regulatorelemente, die für die Genexpression eines DNA-Moleküls erforderlich sind, umfassen: einen Promotor, ein Startcodon, ein Stopcodon und ein Polyadenylierungssignal. Darüber hinaus sind oft Verstärker für die Genexpression erforderlich. Es ist erforderlich, dass diese Elemente operabel an die Sequenz gebunden sind, die die gewünschten Proteine kodiert, und dass die Regulatorelemente in der Person, an den sie verabreicht werden, operabel sind.
Startcodons und Stopcodons werden im allgemeinen als Teil einer Nukleo tidsequenz betrachtet, die das gewünschte Protein kodiert. Es ist jedoch erforderlich, dass diese Elemente in der Person, an die das Genkonstrukt verabreicht wird, funktionell sind. Die Start- und Stopcodons müssen im Raster der kodierenden Sequenz enthalten sein.
Die verwendeten Promotoren und Polyadenylierungssignale müssen in den Zellen der Person funktionell sein.
Beispiele für Promotoren, die insbesondere bei der Herstellung eines genetischen Impfstoffes für Menschen nützlich sind, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Promotoren aus Simian Virus 40 (SV40), Maus-Mamma-Tumorvirus (MMTV)-Promotor, Human Immunodeficiency Virus (HIV), wie beispielsweise der HIV Long Terminal Repeat (LTR)-Promotor, Moloney Virus, ALV, Zytomegalovirus (CMV), wie beispielsweise der CMV immediate early Promotor, Epstein-Barr-Virus (EBV), Rous Sarkom-Virus (RSV) sowie Promotoren aus humanen Genen, wie beispielsweise humanes Actin, humanes Myosin, humanes Hämoglobin, humanes Muskelkreatin und humanes Metallothionein.
Beispiele für Polyadenylierungssignale, die insbesondere bei der Herstellung von genetischen Impfstoffen für Menschen nützlich sind, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf SV40-Polyadenylierungssignale und LTR-Polyadenylierungssignale. Insbesondere wird das SV40-Polyadenylierungssignal, das sich im pCEP4-Plasmid (Invitrogen, San Diego CA) befindet und als SV40-Polyadenylierungssignal bezeichnet wird, verwendet.
Zusätzlich zu den Regulatorelementen, die für die DNA-Expression erforderlich sind, können auch andere Elemente im DNA-Molekül enthalten sein. Solche zusätzlichen Elemente umfassen Verstärker. Die Verstärker können aus der Gruppe ausgewählt werden, die umfasst, aber nicht eingeschränkt ist auf: humanes Actin, humanes Myosin, humanes Hämoglobin, humanes Muskelkreatin und virale Verstärker, wie beispielsweise diejenigen aus CMV, RSV und EBV.
Genetische Konstrukte können mit einem Säugetier-Replikationsursprung ausgestattet sein, um das Konstrukt extrachromosomal zu halten und mehrfache Kopien des Konstrukts in der Zelle zu erzeugen. Die Plasmide pCEP4 und pREP4 von Invitrogen (San Diego, CA) enthalten den Replikationsursprung des Epstein Barr Virus und die Kernantigen-EBNA-1-Kodierregion, die eine High-copy-episomale Replikation ohne Integration erzeugt.
Der verwendete Vektor kann aus denjenigen ausgewählt werden, die in Beispiel 36 beschrieben sind. In Verfahren, die mit Gentherapie zu tun haben, sind Konstrukte mit Replikationsursprüngen, einschließlich des erforderlichen Antigens, für die Aktivierung bevorzugt.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen, die Immunisierungsanwendungen betreffen, enthält das genetische Konstrukt Nukleotidsequenzen, die ein Target-Protein kodieren, und enthalten weiterhin Gene für Proteine, die die Immunreaktion gegen solche Target-Proteine verstärken. Beispiele für solche Gene sind die, die Zytokine und Lymphokine, wie beispielsweise α-Interferon, γ-Interferon, Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 und IL-12 kodieren.
Das Gen für GM-CSF kann in den genetischen Konstrukten enthalten sein, die in Immunisierungszusammensetzungen verwendet werden.
Ein zusätzliches Element kann zugegeben werden, welches als Target für die Zellzerstörung dient, falls es aus irgendeinem Grund erwünscht ist, um die Zellen, die die genetischen Konstrukte erhalten, zu eliminieren. Ein Herpes-Thymidin-Kinase (tk)-Gen in einer exprimierbaren Form kann im genetischen Konstrukt enthalten sein. Das Medikament Gangcyclovir kann an die Person verabreicht werden, und dieses Medikament bewirkt das selektive Abtöten jeder Zelle, die tk erzeugt, wobei somit die Möglichkeit für die selektive Zerstörung von Zellen mit dem genetischen Konstrukt zur Verfügung gestellt wird.
Um die Proteinproduktion zu maximieren, können Regulatorsequenzen ausgewählt werden, die sehr gut für die Genexpression in den Zellen geeignet sind, an die das Konstrukt verabreicht wurde. Darüber hinaus können Codons ausgewählt werden, die am effizientesten in den Zellen transkribiert werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann DNA-Konstrukte herstellen, die in den Zellen funktionell sind.
Um die Expression zu testen, können die genetischen Konstrukte auf die Expressionwerte in vitro unter Verwendung der Gewebekulturen von Zellen des gleichen Typs, wie die, die verabreicht werden, getestet werden. Wenn beispielsweise der genetische Impfstoff an humane Muskelzellen verabreicht werden soll, können Muskelzellen, die in Kultur gezüchtet wurden, wie beispielsweise feste Muskeltumorzellen von Rhabdomyosarkom, als ein in vitro-Modell verwendet werden, um den Expressionswert zu messen. Die hier verwendeten genetischen Konstrukte sind nicht in die retroviralen Partikel eingebaut.
Die genetischen Konstrukte können von der Zelle ohne retrovirale Partikelvermittelte Insertion, wie beispielsweise die, die auftritt, wenn Retroviruspartikel mit retroviraler RNA, die in den retroviralen Partikeln enthalten ist, eine Zelle infi zieren, aufgenommen werden. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "frei von retroviralen Partikeln" genetische Konstrukte, die nicht in retrovirale Partikel eingebaut sind. Wie hier verwendet, bedeutet "dissoziiert aus einem infektiösen Mittel" genetisches Material, das nicht Teil eines viralen, bakteriellen oder eukaryotischen Vektors ist, der entweder aktiv, inaktiv ist, lebend oder tot ist, und das in der Lage ist, eine Zelle zu infizieren.
Die genetischen Konstrukte können ein vollständiges replizierbares virales Genom bilden, so dass nach Einführen in die Zelle das genetische Konstrukt unzureichende genetische Information besitzt, um infektiöse virale Partikel direkt zu produzieren. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "unvollständiges virales Genom" ein genetisches Konstrukt, das weniger als ein vollständiges Genom enthält, so dass der Einbau eines solchen genetischen Konstrukts in eine Zelle nicht das Einführen einer ausreichenden genetischen Information für die Produktion des infektiösen Virus bereitstellt. DNA-Moleküle können frei vom Ausfällungsmittel CaPO₄ abgegeben werden.
Ein attenuierter viraler Impfstoff kann als ein genetisches Konstrukt abgegeben werden, das genug genetisches Material enthält, um die Herstellung viraler Partikel zu ermöglichen. Die Abgabe des attenuierten Impfstoffs als genetisches Konstrukt ermöglicht einen leichteren Weg, um große Mengen an sicherem, reinem, aktivem Immunisierungsprodukt herzustellen.
Das genetische Konstrukt kann mit oder ohne Verwendung von Mikroprojektilen verabreicht werden. Die genetischen Konstrukte können an die Zellen einer Person frei von Feststoffpartikeln abgegeben werden. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "ohne feste Partikel" eine Flüssigkeit, die keine festen Mikroprojektile enthält, die dazu verwendet werden, um die Zellmembran einer Zelle zu perforieren, zu punktieren oder anders zu durchstechen, um eine Eintrittsöffnung für den Einlass des genetischen Materials in die Zelle zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um eine Person gegen alle Krankheitserreger, wie beispielsweise Viren, prokaryotische und pathogene eukaryotische Organismen, wie beispielsweise einzellige Krankheitserregerorganismen und mehrzellige Parasiten, zu immunisieren. Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich, um eine Person gegen solche Krankheitserreger zu immunisieren, die Zellen infizieren und sich nicht einkapseln, wie beispielsweise Viren und Prokaryoten, wie beispielsweise Gonorrhoe, Listeria und Shigella. Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung nützlich, um eine Person gegen Protozoen-Krankheitserreger zu immunisieren, welche im Lebenszyklus ein Stadium einschließen, wo sie intrazelluläre Krankheitserreger sind. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "intrazellulärer Krankheitserreger" einen Virus oder einen Krankheitserregerorganismus, der mindestens zu einem Teil seines reproduktiven Lebens oder Lebenszyklus innerhalb einer Wirtszelle existiert und darin pathogene Proteine produziert oder die Produktion bewirkt. Tabelle 1 stellt eine Auflistung einiger der viralen Familien und Gattungen zur Verfügung, für die Impfstoffe hergestellt werden können. DNA-Konstrukte, die DNA-Sequenzen umfassen, welche die Peptide kodieren, die mindestens ein Epitop umfassen, das identisch mit oder im wesentlichen ähnlich einem Epitop ist, das auf einem Krankheitserregerantigen auftritt, wie beispielsweise die Antigene, die in der Tabellen aufgeführt sind, sind in Impfstoffen verwendbar. Darüber hinaus sind die Verfahren und Zusammensetzungen auch nützlich, um eine Person gegen andere Krankheitserreger, einschließlich prokaryotische und eukaryotische Protozoen-Krankheitserreger sowie mehrzellige Parasiten zu immunisieren, wie beispielsweise diejenigen, die in Tabelle 2 aufgeführt sind.
Um einen genetischen Impfstoff zum Schutz gegen Krankheitserregerinfektionen herzustellen, muss genetisches Material, das immunogene Proteine kodiert, gegen die eine schützende Immunreaktion gerichtet sein kann, im genetischen Konstrukt enthalten sein. Unabhängig davon, ob der Krankheitserreger, was für die vorliegende Erfindung besonders nützlich ist, oder extrazellulär infiziert, ist es jedenfalls unwahrscheinlich, dass alle Krankheitserregerantigene eine schützende Reaktion auslösen. Da sowohl DNA als auch RNA relativ klein sind und relativ leicht produziert werden können, stellt die vorliegende Erfindung den zusätzlichen Vorteil der Impfung mit mehrfachen Krankheitserregerantigenen zur Verfügung. Das im genetischen Impfstoff verwendete genetische Konstrukt kann genetisches Material enthalten, welches viele Krankheitserregerantigene kodiert. Beispielsweise können einige virale Gene in einem einzigen Konstrukt enthalten sein, wodurch mehrfache Targets bereitgestellt werden. Darüber hinaus können Mehrfach-Seren, die an verschiedene Zellen in einer Person abgegeben werden können, hergestellt werden, um gemeinsam in einigen Fällen einen kompletten oder noch bevorzugter, einen nicht kompletten, wie beispielsweise einen fast kompletten Gensatz im Impfstoff zu enthalten. Beispielsweise kann ein kompletter Satz an viralen Genen unter Verwendung von zwei Konstrukten verabreicht werden, wobei jeder eine andere Hälfte des Genoms enthält, welche an verschiedene Stellen verabreicht werden. Eine Immunreaktion kann somit gegen jedes Antigen hervorgerufen werden, ohne das Risiko, das ein infektiöser Virus zusammensetzt wird. Dies ermöglicht das Einführen von mehr als einem einzigen Antigen-Target und kann das Erfordernis eliminieren, dass schützende Antigene identifiziert werden müssen.
Das leichte Handhaben und die kostengünstige Beschaffenheit der DNA und RNA ermöglichen weiterhin effizientere Möglichkeiten zum Screenen schützender Antigene. Gene können leichter als Proteine sortiert und systematisch getestet werden. Die pathogenen Mittel und Organismen, für die der Impfstoff hergestellt wird, um dagegen zu schützen, werden ausgewählt, und ein immunogenes Protein wird identifiziert. Die Tabelle 1 und 2 enthalten Listen von einigen pathogenen Mitteln und Organismen, für welche genetische Impfstoffe hergestellt werden können, um eine Person vor einer Infektion durch diesen zu schützen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Verfahren des Immunisierens einer Person gegen einen Krankheitserreger gegen HIV, HTLV oder HBV gerichtet.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "hyperproliferierende Erkrankungen" die Erkrankungen und Störungen, die durch Hyperproliferation von Zellen charakterisiert sind. Beispiele für hyperproliferierende Erkrankungen umfassen alle Formen von Krebs und Psoriasis. Es wurde festgestellt, dass die Einführung eines genetischen Konstrukts, das eine Nukleotidsequenz enthält, die ein immunogenes Protein kodiert, das durch eine "hyperproliferierende" Zelle in die Zelle einer Person exprimiert wird, zur Produktion dieser Proteine in den geimpften Zellen einer Person führt. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff Protein, das von einer "hyperproliferierenden Zelle" exprimiert wird, Proteine, die mit einer hyperproliferierenden Erkrankung verbunden sind. Um gegen hyperproliferierende Erkrankungen zu immunisieren, wird ein genetisches Konstrukt, das eine Nukleotidsequenz enthält, die ein Protein kodiert, das mit einer hyperproliferierenden Erkrankung verbunden ist, an eine Person verabreicht.
Damit das Protein ein effektives immunogenes Target ist, muss es ein Protein sein, das ausschließlich oder mit höheren Gehalten in hyperproliferierenden Zellen im Vergleich zu normalen Zellen produziert wird. Target-Antigene umfassen solche Proteine, deren Fragmente und Peptide, welche mindestens ein Epitop umfassen, das auf solchen Proteinen gefunden wird. In einigen Fällen ist ein solches Protein das Produkt einer Mutation eines Gens, das ein Protein kodiert. Das mutierte Gen kodiert ein Protein, das fast identisch mit dem normalen Protein ist, außer dass es eine leicht unterschiedliche Aminosäuresequenz aufweist, was zu einem anderen Epitop führt, das in einem normalen Protein nicht gefunden wird. Solche Target-Proteine umfassen diejenigen Proteine, die von Onkogenen, wie beispielsweise myb, myc, fyn, und dem Translokationsgen bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk und EGRF kodiert werden. Zusätzlich zu Onkogenprodukten als Target-Antigene umfassen auch Target-Proteine für Antikrebsbehandlungen und Schutzmaßnahmen variable Regionen von Antikörpern, hergestellt durch B-Zell-Lymphome und verschiedene Regionen der T-Zell-Rezeptoren der T-Zell-Lymphome, welche in einigen Ausführungsformen auch als Target-Antigene für Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Andere Proteine, die mit Tumor im Zusammenhang stehen, können als Target-Proteine verwendet werden, wie beispielsweise Proteine, die mit höheren Werten in Tumorzellen gefunden werden, einschließlich des Proteins, das vom monoklonalen Antikörper-17-1A und Folat-Bindungsproteinen erkannt wird.
Während die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, um eine Person gegen eine oder mehrere verschiedene Krebsarten zu immunisieren, ist die vorliegende Erfindung besonders nützlich, einen Patienten prophylaktisch zu immunisieren, der gegenüber der Entwicklung einer speziellen Krebsart vorbelastet ist, oder der Krebs hatte und infolgedessen einen Rückfall erleiden kann. Entwicklungen in der Gentechnik und der Technologie sowie der Epidemiologie ermöglichen die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit und der Risikobewertung der Entwicklung von Krebs in einer Person. Unter Verwendung von Genscreening und/oder der familiären Gesundheitsvorgeschichte ist es möglich, die Wahrscheinlichkeit vorherzusagen, ob eine bestimmte Person eine oder mehrere Krebsarten entwickeln kann. In gleicher Weise sind die Patienten, die schon Krebs haben, und die behandelt werden, um den Krebs zu heilen, oder deren Zustand sich auf andere Weise verbessert hat, besonders empfänglich für einen Rückfall und ein Wiederauftreten. Als Teil eines Behandlungsplanes können solche Patienten gegen den Krebs immunisiert werden, der bei ihnen diagnostiziert wurde, um ein Wiederauftreten zu bekämpfen. Wenn somit einmal bekannt ist, dass eine Person eine Krebsart hatte, und das Risiko eines Rückfalls besteht, kann sie immunisiert werden, um das Immunsystem so zu stärken, dass jedes zukünftige Auftreten bekämpft wird.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ein Verfahren zur Behandlung von Personen zur Verfügung stellen, die an hyperproliferierenden Erkrankungen leiden. In solchen Verfahren dient die Einführung der genetischen Konstrukte als ein Immuntherapeutikum, das sich an das Immunsystem der Personen richtet und dieses unterstützt, um hyperproliferierende Zellen, die das Target-Protein produzieren, zu bekämpfen.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Behandlung von Patienten, die an Autoimmunerkrankungen und -störungen leiden, zur Verfügung, indem eine breit basierte, schützende Immunreaktion gegen Targets, die mit der Autoimmunität, einschließlich der Zellrezeptoren und der Zellen, die gegen sie selbst gerichtete Antikörper produzieren, in Zusammenhang stehen, hervorgerufen wird.
Autoimmunerkrankungen, die über T-Zellen vermittelt werden, umfassen rheumatoide Arthritis (RA), multiple Sklerose (MS), Sjögren-Syndrom, Sarkoidose, insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM), Autoimmunthyroiditis, reaktive Arthritis, Bechterew-Krankheit, Skleroderm, Polymyositis, Dermatomyositis, Psoriasis, Vasculitis, Wegener-Granulomatose, Crohn-Krankheit und Colitis ulcerosa. Jede dieser Erkrankungen ist durch T-Zell-Rezeptoren charakterisiert, die an endogene Antigene binden, und die Entzündungskaskaden auslösen, die mit den Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang stehen. Impfung gegen die variable Region der T-Zellen würde eine Immunreaktion einschließlich CTLs auslösen, um diese T-Zellen zu eliminieren.
Bei RA wurden mehrere spezifisch variable Regionen der T-Zell-Rezeptoren (TCRs), die an der Erkrankung beteiligt sind, charakterisiert. Diese TCRs umfassen Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 und Vα-17. Die Impfung mit einem DNA-Konstrukt, das mindestens eines dieser Proteine kodiert, wird somit eine Immunreaktion auslösen, die auf T-Zellen gerichtet ist, die an RA beteiligt sind. Siehe: Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253:325-329; Williams, W.V., et al., 1992 J. CIin. Invest. 90:326-333.
Bei MS werden mehrere spezifisch variable Regionen der TCRs, die an dieser Krankheit beteiligt sind, charakterisiert. Diese TCRs umfassen Vβ-7 und Vα-10. Die Impfung mit einem DNA-Konstrukt, das mindestens eines dieser Proteine kodiert, wird somit eine Immunreaktion auslösen, die gegen die T-Zellen gerichtet ist, die an MS beteiligt ist. Siehe: Wucherpfennig, K.W. et al., 1990 Science 248:1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature 345:344-346.
Bei Skleroderm wurden mehrere spezifisch variable Regionen der TCRs, die an der Krankheit beteiligt sind, charakterisiert. Diese TCRs umfassen Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 und Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 und Vα-12. Die Impfung mit einem DNA-Konstrukt, das mindestens eines dieser Proteine kodiert, wird somit eine Immunreaktion auslösen, die auf die T-Zellen, die an Skleroderm beteiligt sind, gerichtet ist. Um Patienten, die an T-Zellen-vermittelten Autoimmunerkrankungen leiden, zu behandeln, insbesondere diejenigen, bei denen die variable Region von TCR noch untersucht werden soll, kann eine synoviale Biopsie durchgeführt werden. Proben der vorhandenen T-Zellen können entnommen werden, und die variable Region dieser TCRs kann unter Verwendung von Standardtechniken identifiziert werden. Genetische Impfstoffe können unter Verwendung dieser Information hergestellt werden.
B-Zellen-vermittelte-Autoimmunerkrankungen, umfassen Lupus (SLE), Basedow-Krankheit, Erb-Goldflam-Syndrom, autoimmunhämolytische Anämie, Autoimmunthrombozytopenie, Asthma, Kryoglobulinämie, primäre Gallensklerose und perniziöse Anämie. Jede dieser Erkrankungen ist durch Antikörper charakterisiert, die an endogene Antigene binden und die Entzündungskaskade, die mit der Autoimmunerkrankung in Zusammenhang steht, auslösen. Impfen gegen die variable Region der Antikörper wird eine Immunreaktion, einschließlich CTLs auslösen, um diese B-Zellen zu eliminieren, die der Antikörper produziert.
Um Patienten zu behandeln, die an einer B-Zellen-vermittelten Autoimmunerkrankung leiden, muss die variable Region der Antikörper, die an der Autoimmunaktivität beteiligt sind, identifiziert werden. Eine Biopsie kann durchgeführt werden, und Proben der Antikörper, die an der Entzündungsstelle vorhanden sind, können entnommen werden. Die variable Region dieser Antikörper kann unter Verwendung von Standardtechniken identifiziert werden. Genetische Impfstoffe können unter Verwendung dieser Information hergestellt werden.
Im Falle von SLE nimmt man an, dass ein Antigen DNA ist. Bei Patienten, die gegen SLE immunisiert werden sollen, können somit ihre Seren auf Anti-DNA-Antikörper gescreent werden, und ein Impfstoff kann hergestellt werden, der DNA- Konstrukte umfasst, die die variable Region solcher Anti-DNA-Antikörper, die in den Seren gefunden wurden, kodiert.
Herkömmliche Strukturmerkmale unter diesen variablen Regionen sowohl von TCRs als auch Antikörpern sind gut bekannt. Die DNA-Sequenz, die ein bestimmtes TCR oder Antikörper kodiert, kann im allgemeinen nach gut bekannten Verfahren gefunden werden, wie beispielsweise denjenigen, die in Kabat, et al., 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD, beschrieben sind. Darüber hinaus findet sich ein allgemeines Verfahren zum Klonieren funktioneller variabler Regionen aus Antikörpern in Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066.
In einigen Beispielen, die die Gentherapie betreffen, enthalten die Genkonstrukte entweder Kompensationsgene oder Gene, die therapeutische Proteine kodieren. Beispiele für Kompensationsgene umfassen ein Gen, das Dystrophin oder ein funktionelles Fragment kodiert, ein Gen, das das defekte Gen in Patienten, die an zystischer Fibrose leiden, kompensiert, ein Insulin, ein Gen, das das defekte Gen in Patienten kompensiert, die an ADA leiden, und ein Gen, das Faktor VIII kodiert. Beispiele für Gene, die therapeutische Proteine kodieren, umfassen Gene, welche Erythropoietin, Interferon, LDL-Rezeptor, GM-CSF, IL-2, IL-4 und TNF kodieren. Darüber hinaus können genetische Konstrukte, die Antikörperkomponenten mit einer einzigen Kette kodieren, die spezifisch an toxische Substanzen binden, verabreicht werden. In einigen Beispielen wird das Dystrophin-Gen als Teil eines Minigens zur Verfügung gestellt und verwendet, um Personen zu behandeln, die an Muskeldystrophie leiden. In einigen Beispielen wird ein Minigen, das die Kodiersequenz für ein partielles Dystrophinprotein enthält, zur Verfügung gestellt. Dystrophie-Anomalien sind verantwortlich sowohl für die schwächere Becker-Muskeldystrophie (BMD) und die schwerere Duchenne-Muskeldystrophie (DMD). Bei der BMD wird Dystrophin hergestellt, aber es ist sowohl in der Größe und/oder Menge anormal. Der Patient ist schwach bis mäßig gebrechlich. Bei DMD wird kein Protein hergestellt, und der Patient ist schon im Alter von 13 an den Rollstuhl gebunden und stirbt normalerweise im Alter von 20. Bei einigen Patienten, insbesondere denjenigen, die an BMD leiden, kann partielles Dystrophinprotein, das durch Expression eines abgegebenen Minigens hergestellt wird, wie hier beschrieben, eine verbesserte Muskelfunktion zur Verfügung stellen.
In einigen Beispielen werden Gene, die IL-2, IL-4, Interferon oder TNF kodieren, an Tumorzellen abgegeben, welche entweder vorhanden oder entfernt sind und anschließend in einen Patienten wieder eingeführt werden. In einigen Beispielen wird ein Gen, das Gamma-Interferon kodiert, an eine Person verabreicht, die an multipler Sklerose leidet.
Antisense-Moleküle und Ribozyme können auch an Zellen einer Person abgegeben werden, indem genetisches Material, das als Templat für Kopien solcher Wirkstoffe wirkt, eingeführt wird. Diese Wirkstoffe aktivieren oder beeinträchtigen in anderer Weise die Expression der Gene, die Proteine kodieren, deren Auftreten unerwünscht ist. Konstrukte, die Sequenzen enthalten, die Antisense-Moleküle kodieren, können verwendet werden, um die Herstellung von Proteinen in den Zellen zu inhibieren oder zu verhindern. Somit können Produktionsproteine, wie beispielsweise Onkogenprodukte, eliminiert oder reduziert werden. In gleicher Weise können Ribozyme die Genexpression unterbrechen, indem die Messenger-RNA, bevor sie in das Protein durch Translation eingebracht wird, selektiv zerstört wird. In einigen Beispielen werden Zellen unter Verwendung von Konstrukten, die Antisense oder Ribozyme kodieren, als Teil eines therapeutischen Behandlungsplans behandelt, der die Verabreichung anderer Therapeutika und Verfahren beinhaltet. Genkonstrukte, die Antisense-Moleküle und Ribozyme kodieren, verwenden ähnliche Vektoren wie diejenigen, die verwendet werden, wenn die Proteinproduktion erwünscht ist, außer dass die Kodiersequenz kein Startcodon enthält, um die Translation von RNA in das Protein zu initiieren.
Die in Beispiel 36 beschriebenen Vektoren, insbesondere die, die einen Replikationsursprung und die exprimierbare Form des geeigneten Kernantigens enthalten, können verwendet werden. Ribozyme sind katalytische RNAs, die in der Lage sind, sich selbst zu spalten oder andere RNA-Moleküle zu spalten. Einige verschiedene Ribozymarten, wie beispielsweise Hammerheads, Hairpin, Tetrahymena Group I-Intron, Ahead, und RNase P sind aus dem Stand der Technik bekannt. (S. Edgington, Biotechnology 1992 10, 256-262.) Hammerhead-Ribozyme haben eine katalytische Stelle, die bis zu einem Kern von weniger als 40 Nukleotiden kartiert wurde. Einige Ribozyme in Pflanzenviroiden und Satelliten-RNAs teilen eine gemeinsame Sekundärstruktur und bestimmte konservierte Nukleotide. Obgleich diese Ribozyme in der Natur als ihr eigenes Substrat dienen, kann die Enzymdomäne durch Basenpaarung mit Sequenzen, die die konservierte Spaltungsstelle flankiert, auf andere RNA-Substrate zielen Diese Fähigkeit, Ribozyme maßzuschneidern, machte es möglich, sie für sequenzspezifische RNA-Spaltung zu verwenden (G. Paolella, et al., EMBO 1992, 1913-1919). Es gehört somit für einen Fachmann auf dem Gebiet zum Umfang, verschiedene katalytische Sequenzen aus verschiedenen Ribozymarten zu verwenden, wie beispielsweise die katalytische Hammerhead-Sequenz, und diese in der hier beschriebenen Weise zu konstruieren. Ribozyme können gegen eine Vielzahl von Targets konstruiert werden, einschließlich pathogenen Nukleotidsequenzen und Onkogensequenzen. Andere Verfahren umfassen ausreichende Komplementarität, um speziell auf das abl-bcr-Fusionstranskript zu zielen, während die Wirksamkeit der Spaltungsreaktion erhalten bleibt.
Das genetische Konstrukt kann an eine Person unter Verwendung einer nadellosen Injektionsvorrichtung verabreicht werden.
Das genetische Konstrukt kann gleichzeitig an einen Patienten intrakutan, subkutan und intramuskulär unter Verwendung einer nadellosen Injektionsvorrichtung verabreicht werden. Nadellose Injektionsvorrichtungen sind gut bekannt und vielfach erhältlich. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann nach den hier beschriebenen Lehren die nadellose Injektionsvorrichtung verwenden, um genetisches Material an Zellen einer Person abzugeben. Die nadellosen Injektionsvorrichtungen sind gut geeignet, um genetisches Material an alle Gewebe abzugeben. Sie sind besonders hilfreich, um genetisches Material an die Haut und Muskelzellen abzugeben. Eine nadellose Injektionsvorrichtung kann verwendet werden, um eine Flüssigkeit, die DNA-Moleküle enthält, auf die Oberfläche der Haut einer Person zu schießen. Die Flüssigkeit wird mit einer ausreichenden Geschwindigkeit geschossen, so dass sie beim Auftreffen auf die Haut die Hautoberfläche durchdringt und sich in der Haut und dem danebenliegenden Muskelgewebe verbreitet. Das genetische Material wird somit gleichzeitig intrakutan, subkutan und intramuskulär verabreicht. Eine nadellose Injektionsvorrichtung kann verwendet werden, um genetisches Material an Gewebe anderer Organe abzugeben, um ein Nukleinsäuremolekül in die Zellen dieses Organs einzuführen.
Die Genkonstrukte können direkt an die Person verabreicht werden, die immunisiert werden soll, oder ex vivo in entnommene Zellen der Person abgegeben werden, die nach Verabreichung wieder implantiert werden. Bei jedem Weg wird das genetische Material in die Zellen, die im Körper der Person vorhanden sind, eingebracht. Verabreichungswege umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf intramuskulär, intraperitoneal, intrakutan, subkutan, intravenös, intraarteriell, intraokulär und oral sowie transdermal oder durch Inhalieren oder Zäpfchen. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale und subkutane Injektion. Die Abgabe von Genkonstrukten, die Target-Proteine kodieren, können Schleimhautimmunität in Personen übertragen, die durch einen Verabreichungsmodus immunisiert werden, bei dem das Material in Geweben, die mit Schleimhautimmunität in Zusammenhang stehen, vorhanden ist. In einigen Beispielen wird somit das Genkonstrukt durch Verabreichung in den Wangenhohlraum im Mund einer Person abgegeben.
Genkonstrukte können durch Vorrichtungen verabreicht werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf herkömmliche Spritzen, nadellose Injektionsvorrichtungen oder "Mikroprojektilbeschuss-Genpistolen". Alternativ kann der genetische Impfstoff durch verschiedene Vorrichtungen in Zellen eingeführt werden, die aus der Person entnommen wurden. Solche Vorrichtungen umfassen beispielsweise ex vivo-Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion und Mikroprojektilbeschuss. Nachdem das genetische Konstrukt durch die Zellen aufgenommen wurde, werden sie wieder in die Person implantiert. Es wird in Erwägung gezogen, dass sonstige nicht-immunogene Zellen, die eingebaute genetische Konstrukte enthalten, in die Person implantiert werden können, selbst wenn die beimpften Zellen ursprünglich aus einer anderen Person entnommen wurden.
Die genetischen Impfstoffe und genetischen Therapeutika umfassen etwa 1 Nanogramm bis etwa 1000 Mikrogramm DNA. Die Impfstoffe und Therapeutika können etwa 10 Nanogramm bis etwa 800 Mikrogramm DNA enthalten. Die Impfstoffe und Therapeutika können etwa 0,1 bis etwa 500 Mikrogramm DNA enthalten. Die Impfstoffe und Therapeutika können etwa 1 bis 350 Mikrogramm DNA enthalten. Die Impfstoffe und Therapeutika können etwa 25 bis etwa 250 Mikrogramm DNA enthalten. Die Impfstoffe und Therapeutika können etwa 100 Mikrogramm DNA enthalten.
Die genetischen Impfstoffe und genetischen Therapeutika werden nach gemäß Verabreichungsweg, der verwendet werden soll, formuliert werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann leicht eine pharmazeutische Zusammensetzung formulieren, die ein genetisches Konstrukt umfasst. In Fällen, wo die intramuskuläre Injektion der ausgewählte Verabreichungsweg ist, wird vorzugsweise eine isotonische Formulierung verwendet. Im allgemeinen können Additive für die Isotonie Natriumchlorid, Dextrose, Mannit, Sorbit und Lactose umfassen. In einigen Fällen sind isotonische Lösungen, wie beispielsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung bevorzugt. Stabilisatoren umfassen Gelatine und Albumin. Ein Vasokonstriktionsmittel kann zur Formulierung zugegeben werden. Die pharmazeutischen Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung werden steril und pyrogenfrei bereitgestellt.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung werden mit einem genetischen Impfstoffförderer formuliert. Der GVF (Genetic Vaccine Facilitator = genetischer Impfstoffförderer) erhöht die Aufnahme und/oder Expression des genetischen Konstrukts durch die Zellen im Vergleich zu der, die auftritt, wenn der gleiche genetische Impfstoff ohne GVF verabreicht wird. Der GVF wird ausgewählt aus anionischen Lipiden, Lektinen, Östrogenverbindungen, hydroxylierten niederen Alkylen, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Harnstoff.
GVF erleichtert die Aufnahme von genetischen Konstrukten durch die Zellen. GVF stimuliert auch die Zellteilung und erleichtert die Aufnahme der genetischen Konstrukte.
Die Verabreichung von GVFs, die die Aufnahme von genetischen Konstrukten durch die Zellen erleichtern, führt zu einer effektiveren Abgabe und Expression des genetischen Materials. Der genetische Impfstoffförderewirkstoff erleichtert vorzugsweise die Aufnahme von DNA durch die Zellen und/oder verstärkt eine Entzündungsreaktion.
Beispiele für anionische Lipide, die als genetischer Impfstoffförderer verwendbar sind, umfassen die Salze von Laurin- und Ölsäuren, sowie Laurinsäure und Ölsäuren, sulfatierte Alkohole, die mit Schwefelsäure neutralisiert sind, Säureester von Lauryl- und Cetylalkohol, einschließlich Natriumlaurylsulfat und Alkylpolyoxyethylensulfat. Sulfonate, wie beispielsweise Dioctylnatriumsulfosuccinat können auch verwendet werden. Die Kalium-, Natrium- und Ammoniumsalze von Laurin- und Ölsäuren sind wasserlöslich und gute Öl/Wasser-Emulgatoren. Die Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalze dieser Fettsäuren sind wasserunlöslich und führen zu Wasser/Öl-Emulsionen. Diese Verbindungen sind pharmazeutische Erfordernisse, die in Salben, Zahnpulvern und verschiedenen anderen pharmazeutischen Präparaten als Emulgatoren, Tenside und Feuchthaltemittel verwendet werden. Beispiele für solche genetischen Impfstofffördererwirkstoffe der Erfindung sind Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat, Laurinsäure, Ölsäure und Dioctylnatriumsulfosuccinat. Bevorzugte genetische Impfstoffförderer sind Natriumlaurylsulfat und Ölsäure.
Natriumlaurylsulfat, N.F. (Natriummonododecylsulfat) ist ein Gemisch aus Natriumalkylsulfaten, das hauptsächlich aus Natriumlaurylsulfat besteht, das für pharmazeutische Verwendung kommerziell erhältlich ist (beispielsweise Duponol^®C/DuPont; Gardinol^®WA/Procter & Gamble). Es ist eine hoch hydrophile Verbindung mit einem HLB-Wert (hydrophil/lipophil-Gleichgewicht) von 40. Präparate können für die parenterale Verabreichung als ein genetisches Impfstofffördermittel mit 0,1 mg bis 100 mg Natriumlaurylsulfat pro ml, vorzugsweise 1 mg bis 10 mg, in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, vorzugsweise sterilem Wasser für die Injektion oder Natriumchloridinjektion oder einer anderen pharmazeutisch geeigneten Injektionsflüssigkeit formuliert werden. Andere Dosierungen und Konzentrationen, die die gewünschte Vereinfachung der Wirkung des genetischen Konstrukts erreichen, können verwendet werden. Für diese Anwendung wird Natriumlaurylsulfat in die Verabreichungsstelle des genetischen Konstrukts entweder vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des genetischen Konstrukts injiziert.
Ölsäure N.F. besteht hauptsächlich aus (Z)-9-Octadecensäure, zusammen mit variablen Mengen anderer Fettsäuren, wie beispielsweise Linolen- und Sterinsäuren. Ölsäurepräparate können für die parenterale Verabreichung als genetische Impfstofffördermittel mit 0,1 mg bis 100 mg Ölsäure pro ml, vorzugsweise 1,0 mg bis 10 mg, in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, vorzugsweise steriles Wasser für die Injektion oder Natriumchloridinjektion oder einer anderen pharmazeutisch geeigneten wässrigen Injektionsflüssigkeit formuliert werden. Andere Dosierungen und Konzentrationen, die die gewünschte Erleichterung der Wirkung des genetischen Konstrukts erreichen, können verwendet werden. Für diese Anwendung wird Ölsäure in die Verabreichungsstelle des genetischen Konstrukts entweder vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des genetischen Konstrukts injiziert.
Extrazelluläre matrixaktive Enzyme sind Hydrolasen, die hydrolytische Reaktionen katalysieren, die das Aufspalten der Komponenten der extrazellulären Matrix, die die Zellen in Geweben umgeben, katalysieren. Beispiele für extrazelluläre matrixaktive Enzyme umfassen: Kollegenase, Hyaluronidase, wobei beide, wenn sie zusammen mit einem antiviralen Impfstoffkonstrukt verabreicht werden, mit einem nicht-vollständigen viralen Genom verabreicht werden. Darüber hinaus werden andere Enzyme, die die strukturellen Komponenten in den Geweben abbauen, wie beispielsweise Amylase und Trypsin, in Erwägung gezogen.
Kollagenase (Clostridiopeptidase A) ist ein Produkt aus Clostridium histolyticum. Es ist ein proteolytisches Enzym, das natürliches, nicht-denaturiertes Kollagen bei physiologischem pH-Wert und Temperatur abbaut. Kollagen umfasst etwa 75% des Trockengewichts der Haut. Kollagenase kann nach dem Verfahren von Keller et al., 1963 Arch. Biochem. Biophys. 101:81, hergestellt werden. Es ist als Salbe mit 250 Einheiten/Gramm (Santyl^®, Knoll) erhältlich. Präparate können für die parenterale Verabreichung mit 1,0 bis 1000 Einheiten Kollagenase pro ml in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, z.B. sterilem Wasser für die Injektion, Natriumchloridinjektion oder anderen pharmazeutisch geeigneten wässrigen Injektionsflüssigkeiten formuliert werden. Andere Dosierungen und Konzentrationen, beispielsweise 5,0 bis 500 Einheiten, vorzugsweise 10 bis 100 Einheiten, die die gewünschte Erleichterung der Wirkung des genetischen Konstrukts erzielen, können verwendet werden. Für diese Anwendung wird Kollagenase in die Verabreichungsstelle des genetischen Konstrukts entweder vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des genetischen Konstrukts injiziert.
Hyaluronidase ist ein Säugetierenzym, das in der Lage ist, Mucopolysaccharide vom Hyaluronsäuretyp zu hydrolysieren. Hyaluronidase für die Injektion ist für menschliche pharmazeutische Verwendung (Wydase^®, Wyeth-Ayerst) erhältlich. Hyaluronidase depolymerisiert das Hyaluronsäurepolymer, das als intrazellulärer Zement wirkt, der die Parenchymzellen der Organe zusammenhält, wodurch die subkutane Verbreitung sowohl der festen Substanz als auch der Lösungen beschleunigt wird. Dies führt zu einer höheren Verteilung von Medikamenten in den Geweberäumen und erleichtert ihre Absorption. Die Absorption ist verbunden mit der Bewegung des Medikaments von der Injektionsstelle in das vaskuläre System, wobei jedoch nun gezeigt wurde, dass Hyaluronidase auch als genetischer Impfstoffförderer wirkt. Für diese Anwendung wird Hyaluronidase in die Verabreichungsstelle des genetischen Konstrukts entweder vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des genetischen Konstrukts injiziert. Hyaluronidase zur Injektion ist kommerziell in Dosierungsformen mit 150 und 1500 Einheiten erhältlich. Eine Dosis von 150 Einheiten kann in 1 ml Natriumchlordinjektion aufgelöst werden und direkt injiziert werden oder weiter mit einer geeigneten subkutanen Infusionslösung zur Verabreichung durch subkutane Infusion verdünnt werden. Andere Dosierungen und Konzentrationen, die die gewünschte Erleichterung der Wirkung des genetischen Konstrukts erreichen, können verwendet werden, beispielsweise 100 bis 1000 Einheiten Hyaluronidase pro ml, vorzugsweise 10 bis 100 Einheiten/ml, in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, beispielsweise sterilem Wasser zur Injektion oder Natriumchloridinjektion oder einer anderen geeigneten wässrigen Injektionsflüssigkeit. Für diese Anwendung wird Hyaluronidase in die Verabreichungsstelle des genetischen Konstrukts entweder vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des genetischen Konstrukts injiziert.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung ist der GVF zur Verabreichung zusammen mit dem Genkonstrukt ein Lektin. Der Begriff "Lektine" bezieht sich auf eine Gruppe von zuckerbindenden Proteinen oder Glykoproteinen nicht-immunen Ursprungs, die Zellen agglutinieren und/oder Glykokonjugate ausfällen. Lektine sind in der Natur weit verbreitet und werden hauptsächlich in den Samen von Pflanzen gefunden, obgleich sie auch in Wurzeln, Blättern und Rinden sowie in wirbellosen Tieren, wie beispielsweise Muscheln, Schnecken, Hufeisenkrebsen und verschiedenen Wirbeltierspezies auftreten. Lektine sind durch ihre Fähigkeit charakterisiert, Erythrozyten und viele andere Zelltypen zu agglutinieren. Lektine sind im SIGMA Chemical Co. "Biochemicals, Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents"-Katalog auf den Seiten 1670-1699 der Ausgabe von 1992 und den Seiten 1799-1810 der Ausgabe von 1994 beschrieben.
Beispiele für Lektine umfassen Concanavalin A, Abrin, Sojabohnenagglutinin und Weizenkeimagglutinin. In einigen Ausführungsformen sind die Lektine vorzugsweise nicht-Glykoproteine; d.h. ihnen fehlen kovalent gebundene Kohlenhydrate.
Ein bevorzugtes Lektin, das ein nicht-Glykoprotein ist, ist Concanavalin A (Con A), das von Sigma Chemical Co., St. Louis Mo., kommerziell erhältlich ist. Con A kann aus Hülsenbohnen isoliert werden, Canavalia Ensiformis, Papilionatae (vergleiche Sumner, J.B. und S.F. Howell, 1936, J. Bacteriol., 32:227). Con A agglutiniert eine Vielzahl von Zelllinien durch spezifische Wechselwirkung mit saccharidhaltigen Zelloberflächenrezeptoren. Con A hat eine Molmasse von 27000 und existiert als Dimer unterhalb pH 6 und als Tetramer bei physiologischem pH-Wert. Die Aminosäuresequenz für Con A ist in Edelman et al. 1972 Proc. Natl. Acad. Science USA 69:2580, beschrieben.
Präparate, die Lektine enthalten, können für die parenterale Verabreichung als genetisches Impfstofffördermittel mit 0,1 μg mg bis 1,0 mg eines ausgewählten Lektins pro ml, vorzugsweise 1,0 μg bis 100 μg in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, vorzugsweise sterilem Wasser für die Injektion oder Natriuminjektion oder einer anderen pharmazeutisch geeigneten wässrigen Injektionsflüssigkeit formuliert werden. Andere Dosierungen und Konzentrationen, die die gewünschte Erleichterung der Wirkung des genetischen Konstrukts erreichen, können verwendet werden. Für diese Anwendung wird Lektin in die Verabreichungsstelle des genetischen Konstrukts entweder vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des genetischen Konstrukts injiziert.
Präparate mit conA können für die parenterale Verabreichung als genetisches Impfstofffördermittel mit 0,1 μg bis 1,0 mg conA pro ml, vorzugsweise 1,0 μg bis 100 μg in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, vorzugsweise sterilem Wasser für die Injektion oder Natriumchloridinjektion oder einer anderen pharmazeutisch geeigneten wässrigen Injektionsflüssigkeit formuliert werden. Andere Dosierungen und Konzentrationen, die die gewünschte Erleichterung der Wirkung des genetischen Konstrukts erreichen, können verwendet werden. Für diese Anwendung wird conA in die Verabreichungsstelle des genetischen Konstrukts entweder vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des genetischen Konstrukts injiziert.
Eine andere Gruppe von GVFs umfasst Östrogenverbindungen und deren Derivate. Derivate von Östrogenverbindungen können Steroidhormone sein. Bevorzugte Steroidhormone werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus β-Östradiol und nahe verwandten Analogen und deren Derivaten besteht.
Sowohl natürliche als auch synthetische Östrogene können verwendet werden. Viele Verbindungen sind kommerziell erhältlich. Bestimmte nicht-steroide Östrogenverbindungen, wie beispielsweise Diethylstilböstrol, sind besser bioverfügbar und weniger kostenintensiv zu synthetisieren. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Gennaro Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA 18042 (1990), einschließlich Kapitel 50, "Hormone".
Östradiol, 17-β-Östradiol, (17β)-Östra-1,3,5(10)-trien-3,17-diol ist das wirksamste natürliche Säugetier-Östrogenhormon. Da es fast unlöslich in Wasser ist, können parenterale flüssige Formulierungen, pharmazeutisch geeignete Ester, wie beispielsweise Östradiol-3-benzoat, Östradiol-17β-cypionat, Östradiol-17-propionat oder -dipropionat, -hemisuccinat, -17-heptanoat (-önanthat), -17-undecanoat (-undecylat) und -17-valerat, verwenden. Eine 0,01 %-ige Östradiol-Vaginalcreme ist für die örtliche Anwendung erhältlich.
α-Östradiol und Ester, wie beispielsweise α-Östradioldiacetat oder -3-benzoat.
Östriol, Östra-1,3,5(10)-trien-3,16,17-triol, ist ein weniger wirksamer Östrogenmetabolit von Östradiol.
Östron, 3-Hydroxyöstra-1,3,5(10)-trien-17-on und Ester, wie beispielsweise Acetat, Propionat, Sulfat, Sulfatpiperazin. Östron ist als eine wässrige Suspension mit 20 und 50 mg Östron/10 ml erhältlich.
Konjugierte Östrogenhormone sind ein natürliches Produkt mit wasserlöslichen konjugierten Formen aus gemischten Östrogenen, die aus dem Urin von trächtigen Stuten gewonnen werden. Es ist wasserlöslich und in einer Formulierung kommerziell erhältlich, die bis zu einer Konzentration von 25 mg/5 ml für die intravenöse oder intramuskuläre Injektion in Wasser aufgelöst werden kann; und in einer Vaginalcreme mit 0,625 mg konjugierten Östrogenen/Gramm (Premarin^®/Wyeth/Ayerst).
Östrogen-Artverwandte, wie beispielsweise Ethinylöstradiol, können auch verwendet werden.
Die gewünschten Östrogenverbindung(en) können vorteilhafterweise aus einer Vielzahl von Produkten ausgewählt werden, die für die pharmazeutische Verwendung bei Menschen kommerziell erhältlich sind, vorzugsweise Produkte in flüssiger parenteraler Formulierung. Um Schleimhautimmunität zu erreichen, beispielsweise die Immunität der Vaginalschleimhaut, kann eine örtliche Formulierung, wie beispielsweise eine Östrogencreme oder -gel verwendet werden. Da die Förderung der Nukleinsäureaktivität an der Stelle der Nukleinsäureverabreichung eher als die systemische Östrogenaktivität oder andere hormonelle Aktivität gewünscht ist, wird eine vorzugsweise Dosierung und Konzentration, die die gewünschte lokale Wirkung ohne signifikante systemische Östrogenaktivität oder andere hormonelle Aktivität erzielt, ausgewählt. Östrogenpräparate können für die parenterale Verabreichung als ein genetisches Impfstofffördermittel mit 0,001 mg/ml bis 10 mg/ml Östrogenverbindung pro ml, vorzugsweise 0,01 mg/ml bis 1,0 mg/ml in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, vorzugsweise sterilem Wasser für die Injektion oder Natriumchloridinjektion oder einer anderen pharmazeutisch geeigneten wässrigen Injektionsflüssigkeit formuliert werden. Andere Dosierungen und Konzentrationen, die die gewünschte Förderung der Wirkung des genetischen Konstrukts erzielen, können verwendet werden. Für diese Anwendung wird eine Östrogenverbindung in die Verabreichungsstelle des genetischen Konstrukts entweder vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit der Verabreichung des genetischen Konstrukts injiziert. Die Optimierung der Dosis/Konzentration kann unter Verwendung bekannter Methoden und Routineexperimente vom Fachmann auf dem Gebiet der Pharmakologie und der pharmazeutischen Wissenschaften erreicht werden. Eine Dosierung und Konzentration kann verabreicht werden, die die gewünschte Förderung der Aufnahme und/oder Verbesserung der Expression oder der Immunreaktion auf die genetischen Konstrukte durch Zellen zur Verfügung stellt. Die gewünschten Östrogenverbindung(en) können vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit dem gewünschten Nukleinsäurekonstrukt verabreicht werden.
Es wurde festgestellt, dass hydroxylierte niedere Alkyle genetische Impfstoffförderaktivität aufweisen. Hydroxylierte niedere Alkyle umfassen Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol und Glycerin; bevorzugt sind Ethanol und Glycerin.
Ethanol ist für den pharmazeutischen Gebrauch kommerziell erhältlich; es kann mit sterilem Wasser für die Injektion oder Natriumchloridinjektion oder anderen pharmazeutisch geeigneten Injektionsflüssigkeiten verdünnt werden und in Konzentrationen von 0,01 bis 100% (Vol./Vol.), vorzugsweise 0,1 bis 10%, noch bevorzugter etwa 5%, verwendet werden, um die Aktivität eines Nukleinsäurekonstrukts zu fördern. Es kann vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit dem gewünschten Nukleinsäurekonstrukt verabreicht werden.
Glycerin oder Glycerol (1,2,3-Propantriol) ist für die pharmazeutische Verwendung kommerziell erhältlich. Es kann mit sterilem Wasser für die Injektion oder Natriumchloridinjektion oder anderen pharmazeutisch geeigneten wässrigen Injektionsflüssigkeiten verdünnt werden und in Konzentrationen von 0,1 bis 100% (Vol./Vol.), vorzugsweise 1,0 bis 50%, und noch bevorzugter etwa 20% (Vol./Vol.) verwendet werden, um die Aktivität eines Nukleinsäurekonstrukts zu fördern. Es wird vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit dem gewünschten Nukleinsäurekonstrukt verabreicht.
Ein anderer GVF ist DMSO, welches ein aprotisches Lösungsmittel mit einer bemerkenswerten Fähigkeit ist, das Durchdringen vieler lokal angewendeter Medikamente zu verstärken. Es ist für die Instillation in die Blase zur Behandlung von interstitieller Zystitis zugelassen. In Konzentrationen über 50% lokal angewandt, baut DMSO Kollagen ab und hat entzündungshemmende und lokal narkotische Wirkungen.
DMSO kann mit sterilem Wasser für die Injektion oder Natriumchloridinjektion oder anderen pharmazeutisch geeigneten wässrigen Injektionsflüssigkeiten verdünnt werden und in Konzentrationen von 0,1 bis 100% (Vol./Vol.), vorzugsweise 1,0 bis 50%, noch bevorzugter etwa 20% (Vol./Vol.), verwendet werden, um die Aktivität eines Nukleinsäurekonstrukts zu fördern. Es kann vor, nach und/oder gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig mit dem gewünschten Nukleinsäurekonstrukt verabreicht werden.
Harnstoff, H₂NCONH₂, welcher ein natürliches Endprodukt des Proteinmetabolismus ist und normalerweise von den Nieren ausgeschieden wird, ist auch ein GVF. Zwei Ammoniakmoleküle reagieren mit einem Molekül Kohlendioxid, um ein Wassermolekül und ein Harnstoffmolekül zu bilden. Harnstoff ist für verschiedene pharmazeutische Anwendungen kommerziell erhältlich. Harnstoff wird intravenös als 30%-ige Harnstofflösung in 5 oder 10%-iger Dextroselösung als osmotisches Diuretikum verwendet, um den intrakraniellen Druck zu verringern, der durch ein Hirnödem verursacht wird, und um den Augeninnendruck zu verringern. Er wird auch lokal bei einer Vielzahl von dermatologischen Anwendungen verwendet, einschließlich Psoriasis, atopischer Dermatitis, und um überschüssiges Keratin von der Haut zu entfernen.
Präparate mit Harnstoff können für die parenterale Verabreichung mit 0,1 bis 1000 mg pro ml in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, beispielsweise Natriumchloridinjektion, USP, Wasser für die Injektion, USP, 5% Dextroseinjektion oder 10% Dextroseinjektion formuliert werden. Andere Dosierungen und Konzentrationen, beispielsweise 1,0 bis 100 mg/ml, vorzugsweise 60 mg/ml (etwa 1 M), welche die gewünschte Förderung des Effekts des genetischen Konstrukts erreichen, können verwendet werden.
In einigen Verfahren wird die Person vor der genetischen Impfung durch in tramuskuläre Injektion zuerst mit GVF injiziert. D.h., bis zu beispielsweise etwa eine Woche bis zehn Tage vor der Impfung wird der Patient zunächst mit GVF injiziert. Bei anderen Verfahren wird die Person vor der Impfung etwa 1 bis 5 Tage vor Verabreichung des genetischen Konstrukts mit einem GVF injiziert. In einigen Verfahren wird die Person vor der Impfung etwa 24 Stunden vor Verabreichung des genetischen Konstrukts mit einem GVF injiziert. Alternativ kann ein GVF gleichzeitig Minuten vor oder nach der Impfung injiziert werden. Demgemäß können der GVF und das genetische Konstrukt kombiniert werden und als Gemisch gleichzeitig injiziert werden. In einigen Verfahren wird der GVF nach Verabreichung des genetischen Konstrukts verabreicht. Beispielsweise wird die Person bis zu etwa eine Woche bis zehn Tage nach Verabreichung des genetischen Konstrukts mit einem GVF injiziert. In einigen Verfahren wird die Person etwa 24 Stunden nach der Impfung mit einem GVF injiziert. In einigen Verfahren wird die Person etwa 1 bis 5 Tage nach der Impfung mit einem GVF injiziert. In einigen Verfahren wird an die Person bis zu etwa eine Woche bis zehn Tage nach Impfung ein GVF verabreicht. Alternativ können Kombinationen von GVF-Wirkstoffen zusammen mit genetischen Konstrukten verabreicht werden.
Darüber hinaus umfassen auch andere Wirkstoffe, die als Transfektionsmittel und/oder Replikationsmittel und/oder Entzündungsmittel wirken, und die mit einem GVF, mitverabreicht werden, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Lymphokine, wie beispielsweise α-Interferon, Gamma-Interferon, Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 und IL-12 sowie Fibroblastenwachstumsfaktor, oberflächenaktive Mittel, wie beispielsweise immunstimulierende Komplexe (ISCOMS), inkomplettes Freund-Adjuvans, LPS-Analoga, einschließlich Monophosphoryl-Lipid-A (MPL), Muramylpeptide, Chinonanaloga und Vesikel, wie beispielsweise Squalen und Squalen und Hyaluronsäure, die zusammen mit dem genetischen Konstrukt verabreicht werden. In einigen Verfahren werden Kombinationen dieser Mittel zusammen mit einem GVF und dem genetischen Konstrukt verabreicht.
Das genetische Konstrukt kann mit Kollagen als Emulsion kombiniert und parenteral abgegeben werden. Die Kollagenemulsion stellt eine Möglichkeit für die verzögerte Freisetzung von DNA zur Verfügung. 50 μl bis 2 ml Kollagen werden verwendet. Etwa 100 μg DNA werden mit 1 ml Kollagen in einem bevorzugten Verfahren unter Verwendung dieser Formulierung kombiniert. Andere Formulierungen mit verzögerter Freisetzung, sind beispielsweise die, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, beschrieben sind, einem StandardReferenztext auf diesem Gebiet.
Solche Formulierungen umfassen wässrige Suspensionen, Öllösungen und -suspensionen, Emulsionen und Implantate sowie Reservoirs und transdermale Vorrichtungen. In einigen Verfahren sind Formulierungen mit verzögerter Freisetzung für die genetischen Konstrukte bevorzugt. In einigen Verfahren ist es bevorzugt, dass das genetische Konstrukt in 6-144 Stunden, vorzugsweise 12-96 Stunden, und noch bevorzugter 18-72 Stunden freigesetzt wird.
Genetische Konstrukte der vorliegenden Erfindung können mit einer nadel losen Injektionsvorrichtung injiziert werden. Die nadellosen Injektionsvorrichtungen sind besonders nützlich für die intramuskuläre, intradermale und subkutane gleichzeitige Verabreichung der Substanzen.
In einigen Verfahren wird das genetische Konstrukt mit einem GVF durch die Vorrichtung eines Mikroprojektil-Partikelbeschusses verabreicht, wie von Sanford, et al., in US-Patent 4 945 050, erteilt am 31. Juli 1990, beschrieben.
In einigen Verfahren wird die Person einer einzelnen Impfung unterzogen, um eine vollständige, breite Immunreaktion zu erzeugen. In einigen Verfahren wird die Person einer Reihe von Impfungen unterzogen, um eine vollständige, breite Immunreaktion zu erzeugen. Mindestens zwei und manchmal vier bis fünf Injektionen werden über einen Zeitraum verabreicht. Der Zeitraum zwischen den Injektionen kann 24 Stunden bis zwei Wochen oder länger zwischen den Injektionen, manchmal auch eine Woche, umfassen. Alternativ werden mindestens zwei und bis zu vier separate Injektionen gleichzeitig an verschiedenen Stellen verabreicht. Eine vollständige Impfung kann die Injektion eines einzelnen Serums umfassen, das ein genetisches Konstrukt enthält mit Sequenzen, die ein oder mehrere Zielepitope kodieren, oder sie kann die Injektion von zwei oder mehreren unterschiedlichen Seren an verschiedenen Stellen umfassen. Beispielsweise kann ein HIV-Impfstoff zwei Seren umfassen, wobei jedes ein genetisches Material umfasst, das verschiedene virale Proteine kodiert. Dieses Impfverfahren ermöglicht soweit wie möglich das Einführen eines vollständigen Satzes viraler Gene in die Person, ohne das Risiko, ein infektiöses virales Teilchen zusammenzusetzen. Auf diese Weise kann eine Immunreaktion gegen die meisten oder alle Viren in der geimpften Person hervorgerufen werden. Die Injektion eines jeden Serums wird an verschiedenen Stellen durchgeführt, vorzugsweise mit einem Abstand, um sicherzustellen, dass keine Zellen beide genetischen Konstrukte aufnehmen. Als weitere Sicherheitsmaßnahme können einige Gene gelöscht oder verändert werden, um der Möglichkeit einer infektiösen viralen Anordnung vorzubeugen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "pharmazeutisches Kit" als Sammelbegriff auf mehrere Seren.
Solche Kits umfassen getrennte Behälter, die mehrere Seren und/oder GVFs enthalten. Diese Kits sollen so bereitgestellt werden, dass sie einen Satz von Seren enthalten, die in den Immunisierungsverfahren und/oder therapeutischen Verfahren verwendet werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind sowohl auf den Gebieten der Human- als auch der Veterinärmedizin verwendbar. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung die genetische Immunisierung von Säugetieren, Vögeln und Fischen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich für Säugetierspezies, einschließlich Menschen-, Rinder-, Schaf-, Schweine-, Pferde-, Hunde- und Katzen-Spezies.
Die nachstehend ausgeführten Beispiele umfassen repräsentative Beispiele für Aspekte der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken, sondern dienen nur zu veranschaulichenden Zwecken.
Beispiele
Beispiel 1
Die vorliegende Erfindung stellt einen HIV-Impfstoff unter Anwendung von direkter genetischer Immunisierung zur Verfügung. Es werden genetische Konstrukte bereitgestellt, die bei der Abgabe in Zellen einer Person so exprimiert werden, dass sie HIV-Proteine produzieren. Gemäß einigen Ausführungsformen ruft die Produktion aller viraler Strukturproteine in den Zellen der Person eine schützende Immunreaktion hervor, die gegen HIV-Infektion schützt. Der HIV-Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um nicht-infizierte Personen gegen HIV-Infektion zu immunisieren, oder sie können als Immuntherapeutika für solche Personen dienen, die bereits infiziert sind. Der HIV-Impfstoff der vorliegenden Erfindung ruft eine Immunreaktion, einschließlich CTLs, hervor, die HIV-infizierte Stellen erkennt und angreift und das breiteste Kontingent von HIV-Protein erkennt. Auf diese Weise werden nicht-infizierte Personen vor HIV-Infektion geschützt.
Es wird ein Verfahren zur Immunisierung einer Person gegen HIV durch Verabreichung von zwei Seren beschrieben. Diese zwei Seren umfassen mindestens zwei, und vorzugsweise mehr als zwei, eine Vielzahl oder alle Gene des HIV-Virus. Die Seren werden jedoch nicht zusammen abgegeben. Somit wird an eine geimpfte Zelle kein vollständiges Genkomplement verabreicht. Die geimpfte Person erhält mindestens zwei verschiedene, und vorzugsweise mehr als zwei, noch bevorzugter eine Vielzahl oder alle viralen Gene. Die Immunreaktionen können dann auf das gesamte Komplement des HIV-Protein-Targets zielen.
Diese Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass das genetische Material, das das effektivste Target-Protein kodiert, im Lmpfstoff enthalten sein wird, und sie verringert die Wahrscheinlichkeit, dass ein virales Teilchen der Entdeckung durch die Immunreaktion entkommt, trotz struktureller Veränderungen in einem oder mehreren viralen Proteinen, die auftreten, wenn das Virus eine Mutation erfährt.
Demzufolge ist es wünschenswert, eine Person mit einer Vielzahl, und vorzugsweise einem nahezu vollständigen oder vollständigen Komplement von Genen zu impfen, die die viralen Proteine kodieren.
Wenn eine einzelne Zelle ein vollständiges Komplement von viralen Genen erhält, ist es möglich, dass ein vollständiges infektiöses Virus innerhalb der Zelle zusammengesetzt wird. Daher wird kein genetisches Konstrukt mit einem solchen vollständigen Genkomplement bereitgestellt. Darüber hinaus werden zwei oder mehrere Seren, die jeweils einen unvollständigen Satz Gene und zusammen bis zu einem vollständigen Komplement viraler Gene haben, an unterschiedliche Zellen verabreicht, vorzugsweise an Stellen, die voneinander entfernt sind, um sicherzustellen, dass keine geimpfte Zelle unbeabsichtigt einem vollständigen Satz Gene ausgesetzt wird. Beispielsweise kann ein Teil des HIV-Genoms in ein erstes Konstrukt insertiert werden, und der restliche Teil des HIV-Genoms wird in ein zweites Konstrukt insertiert. Das erste Konstrukt wird als genetischer Impfstoff an eine Person in das Muskelgewebe eines Arms verabreicht, während das zweite Konstrukt als genetischer Impfstoff an eine Person in das Muskelgewebe des anderen Arms der Person verabreicht wird. Die Person wird einem vollständigen Satz viraler Gene ausgesetzt, und somit im wesentlichen gegen das gesamte Virus geimpft, aber ohne das Risiko, dass ein infektiöses virales Teilchen zusammengesetzt wird.
Selbst wenn genetisches Material durch zwei oder mehrere Seren an verschiedene Stellen des Körpers einer Person abgegeben wird, können ein oder mehrere essentielle Gene als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme gelöscht oder absichtlich geändert werden, um weiterhin sicherzustellen, dass kein infektiöses virales Partikel gebildet werden kann. In solchen Beispielen wird der Person kein vollständiger, funktioneller Satz viraler Gene verabreicht.
Eine weitere Sicherheitsmaßnahme stellt nicht-überlappende Teile des viralen Genoms auf den separaten genetischen Konstrukten zur Verfügung, welche die jeweiligen separaten Seren bilden. Auf diese Weise wird Rekombination zwischen den zwei genetischen Konstrukten verhindert.
In einigen Beispielen wird ein vollständiges Komplement struktureller Gene bereitgestellt. Die strukturellen Gene von HIV bestehen aus gag, pol und env. Diese drei Gene werden auf zwei unterschiedlichen DNA- oder RNA-Konstrukten bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich daher gag und pol auf einem DNA- oder RNA-Konstrukt, und env auf einem anderen. In einem anderen Beispiel befindet sich gag auf einem DNA- oder RNA-Konstrukt, und pol und env sind auf dem anderen. In einem anderen Beispiel sind gag und env auf einem DNA- oder RNA-Konstrukt, und pol ist auf dem anderen. In einigen Beispielen haben Konstrukte, die rev enthalten, einen Spleißakzeptor strangaufwärts vom Startcodon für rev. In einigen Beispielen haben Konstrukte, die gag enthalten, einen Spleißdonor strangaufwärts vom gag-Translations-Startcodon. In jeder dieser Kombinationen können wahlweise auch HIV-Regulatorgene vorliegen. Die HIV-Regulatorgene sind: vpr, vif, vpu, nef, tat und rev.
Das DNA-Konstrukt kann aus einem Promotor, einem Verstärker und einem Polyadenylierungssignal bestehen. Der Promotor kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus: HIV LTR, humanem Actin, humanem Myosin, CMV, RSV, Moloney, MMTV, humanem Hämoglobin, humanem Muskelkreatin und EBV besteht. Der Verstärker kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus: humanem Actin, humanem Myosin, CMV, RSV, humanem Hämoglobin, humanem Muskelkreatin und EBV besteht. Das Polyadenylierungssignal kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus: unter anderem dem LTR-Polyadenylie rungssignal und SV40-Polyadenylierungssignal, insbesondere dem SV40-Nebenpolyadenylierungssignal besteht.
Der Zwei-Serum-Impfstoff kann intramuskulär an ein räumlich getrenntes Gewebe der Person, vorzugsweise in unterschiedlichen Gliedmaßen, wie beispielsweise in den rechten und linken Arm verabreicht werden. Jedes Serum kann etwa 0,1 bis etwa 1000 Mikrogramm DNA enthalten. Jedes Serum kann etwa 1 bis etwa 500 Mikrogramm DNA enthalten. Jedes Serum kann etwa 25 bis etwa 250 Mikrogramm DNA enthalten. Jedes Serum kann etwa 100 Mikrogramm DNA enthalten.
In einigen Beispielen liegt das Serum in einem sterilen isotonischen Träger vor, vorzugsweise in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder in Kochsalzlösung.
Vor der Verabreichung des Impfstoffs kann in das zu impfende Gewebe ein genetischer Impfförderer injiziert werden, wie oben beschrieben und diskutiert. Injektionen von GVFs können bis zu etwa 24 Stunden vor der Impfung durchgeführt werden. Es ist sinnvoll, dass die GVFs direkt vor oder gleichzeitig mit der Verabreichung des Genkonstrukts verabreicht werden. Das GVF wird an die Stelle verabreicht, wo das Genkonstrukt verabreicht werden soll. Es ist auch sinnvoll, dass der GVF nach Verabreichung der genetischen Konstrukte, beispielsweise direkt danach, verabreicht wird.
In anderen Beispielen wird ein genetischer Impfstoffförderer, wie oben beschrieben und diskutiert, zusammen mit dem genetischen Konstrukt als einzelne pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht. Der GVF und das genetische Konstrukt können direkt vor der Verabreichung des Gemisches kombiniert werden. In einigen Beispielen wird ein genetischer Impfstoffförderer, wie oben beschrieben und diskutiert, zusammen mit dem genetischen Konstrukt als einzelne pharmazeutische Zusammensetzung formuliert.
Demgemäß umfassen einige Beispiele einen Zwei-Serum-Impfstoff: ein Serum, das ein DNA- oder RNA-Konstrukt mit zwei HIV-Strukturgenen umfasst, das andere Serum, das ein DNA- oder RNA-Konstrukt umfasst, welches das dritte, verbleibende HIV-Strukturgen enthält, so dass die kombinierten Seren ein vollständiges Komplement von HIV-Strukturgenen enthalten. Die Strukturgene auf jedem DNA-Konstrukt sind operabel mit einem Promotor, einem Verstärker und einem Polyadenylierungssignal verbunden. Die gleichen oder andere Regulator elemente können die Expression der viralen Gene kontrollieren. Beim Impfen einer Person können die beiden Seren intramuskulär an verschiedene Stellen, vorzugsweise auf den beiden Armen, verabreicht werden.
Ein genetischer Impfstoffförderer, wie oben diskutiert und beschrieben, kann an die Stelle verabreicht werden, an die das Serum verabreicht werden soll.
Ein genetischer Impfstoffförderer kann zusammen mit den genetischen Konstrukten in den Formulierungen enthalten sein.
Die Impfprozedur kann mindestens einmal, und vorzugsweise zwei- oder dreimal wiederholt werden. Jede Impfprozedur wird im Abstand von 24 Stunden bis 2 Monaten voneinander durchgeführt.
Der Impfstoff kann unter Verwendung einer nadellosen Injektionsvorrichtung verabreicht werden. Der Impfstoff kann unter Verwendung einer nadellosen Injektionsvorrichtung hypodermisch verabreicht werden, um so gleichzeitig eine intramuskuläre, intradermale und subkutane Verabreichung zu bewirken, wobei das Material auch interstitiell verabreicht wird.
Genetische Konstrukte können folgendes enthalten:
Plasmide und Klonierungsstrategien:
Zwei Plasmide wurden konstruiert: Eines, das HIV gag/pol enthält, und das andere, welches HIV env enthält.
Der HIV-1-Genomklon pNL43 wurde vom NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (ARRRP), Division of AIDS, NIAID, NIH, von Dr. Malcolm Martin, erhalten, und kann als Ausgangsmaterial für virale HIV-1-Gene für genetische Konstrukte verwendet werden. Alternativ kann irgendein molekularer HIV-Klon aus infizierten Zellen durch Anwendung der Polymerase-Kettentechnologie ausreichend modifiziert werden, um unter anderem den HXB2-Klon des MN-Klons sowie auch den SF- oder BAL-1-Klon zu konstruieren. Der pNL43-Klon ist ein Konstrukt, das aus proviraler HIV-1-proviraler DNA plus 3 kb einer Wirtssequenz aus der Integrationsstelle, die in pUC18 kloniert wurde, besteht.
Konstruktion des pNL-Puro-env-Plasmids:
Dieses Plasmid wurde zur Expression von gag pol konstruiert. Die StuI-Stelle in der humanen Nicht-HIV 5'-Seiten-DNA von pNL43 wurde durch partielle Digestion mit StuI, gefolgt von Digestion der freien Enden mit E. coli-Polymerase 1 zerstört. Das lineare Plasmid wurde aufgefüllt und dann selbstligiert, was eine einzelne StuI-Stelle im HIV-Genom zurückließ. Dieses Plasmid, pNLDstu, wurde dann mit den Abschwächungsenzymen StuI und Bsa81 digestiert, was einen großen Abschnitt der kodierenden Sequenz für gp120 eliminierte. Der SV40-Promotor und die Region, die Puromycin-Resistenz kodiert (Puromycin-Acetyl-Transferase (PAC)) wurden aus pBABE-puro (Morgenstern und Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18(12):3587-3596, freundlicherweise von Dr. Hartmut Land vom Imperial Cancer Research Fund zur Verfügung gestellt) unter Verwendung von EcoRI und ClaI isoliert. Dieses Fragment wurde abgeschwächt und dann in die StuI/BsaBI-digestierte pNLDstu kloniert. Ein Klon mit dem SV40-puro-Fragment in der korrekten Orientierung wurde ausgewählt, so dass die 3'-LTR von HIV die Poly-A-Funktionen für die PAC-Nachricht bereitstellen konnte. Dieses Plasmid wurde als pNLpuro bezeichnet.
Klonierungsstrategie für das Löschen des vpr-Regulatorgens aus dem HIV gag pol-Vektor:
Eine Region zwischen direkt stromaufwärts von der einzelnen PflMI-Stelle bis direkt nach dem vif-Terminierungscodon wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern, die eine nicht-konservative Aminosäureveränderung (glu→val) an der Aminosäure 22 von vpr, einen Stopcodon im vpr-Leseraster direkt nach der Aminosäure 22 und eine EcoRI-Stelle direkt nach dem neuen Stopcodon einführten, amplifiziert. Dieses PCR-Fragment wurde durch das PflMI-EcoRI-Fragment von pNLpuro oder pNL43 substituiert. Diese Substitution führte zur Löschung von 122 Nukleotiden des offenen Leserasters von vpr, wodurch die Möglichkeit von Reversion, die eine Punktmutationsstrategie zur Folge hat, eliminiert wird. Die erhaltenen Plasmide, pNLpuroΔvpr, kodieren die ersten 21 natürlichen Aminosäuren von vpr plus ein Valin plus alle anderen verbleibenden HIV-1-Gene und Spleißverbindungsstellen in ihrer natürlichen Form. Eine solche Löschungsstrategie wäre auch anwendbar auf nef, vif und vpu, und würde die Expression von Strukturgenen ermöglichen, aber vor der Erzeugung eines lebenden rekombinanten Virus schützen.
Plasmidkonstruktion für die Envelope-Expression:
Das DNA-Segment, das das Envelope-Gen von HIV-1 HXB2 kodiert, wurde durch die Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Amplifikationstechnik unter Verwendung der Lambda-klonierten DNA, erhältlich vom AIDS Research and Reference Reagent Program, kloniert. Die Sequenzen der 5'- und 3'-Primer sind 5'-AGGCGTCTCGAGACAGAGGAGAGCAAGAAATG-3' (SEQ.-ID.-NR.: 1) mit Ein schluss der Xhol-Stelle und 5'-TTTCCCTCTAGATAAGCCATCCAATCACAC-3' (SEQ.-ID.-NR.: 2) mit Einschluss der Xbal-Stelle, welche die gp160-, tat- und rev-Kodierregion enthalten. Die genspezifische Amplifikation wurde unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase gemäß den Angaben des Herstellers (Perkin-Elmer Cetus Corp.) durchgeführt. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden bei 37°C dreißig Minuten lang mit 0,5 μg/ml Proteinase K behandelt, gefolgt von einer Extraktion mit Phenol/Chloroform und Fällung mit Ethanol. Zurückgewonnene DNA wurde dann mit Xhol und Xbal zwei Stunden lang bei 37°C digestiert und einer Gelelektrophorese auf Agarose unterzogen. Das isolierte und gereinigte Xhol-Xbal-PCR-Fragment wurde in ein Bluescript-Plasmid kloniert (Stratagene Inc., La Jolla, CA) und dann in den eukaryotischen Expressionsvektor pMAMneoBlue (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) subkloniert. Das erhaltene Konstrukt wurde als pM160 (1) bezeichnet. Die Plasmid-DNA wurde durch CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugieren gereinigt. Das DNA-Konstrukt pM160 kodiert das HIV-1/HXB2 (Fischer, A.G., et al., (1985) Nature 316:262-265) gp160 membrangebundene Glykoprotein unter Kontrolle eines RSV-Verstärkerelements mit der MMTV LTR als Promotor.
Konstruktion eines alternativen Envelope-Expressionsplasmids, genannt HIV-1 env-rev-Plasmid.
Die Region, die die zwei Exons von rev und vpu und die offenen Envelope-Leseraster von HIV-1 HXB2 kodiert, wurde mittels PCR amplifiziert und in den Expressionvektor pCNDA/neo (Invitrogen) kloniert. Dieses Plasmid bewirkt die Envelope-Produktion durch den CMV-Promotor.
Herstellung und Reinigung:
Das Plasmid in E. coli (DH5 alpha) wird folgendermaßen gezüchtet. Eine LB plus Ampicillin-Agarplatte wurde mit der gewünschten Plasmidkultur aus einem gefrorenen Vorrat ausgestrichen. Die Platte wird bei 37°C über Nacht inkubiert (14-15 Stunden). Eine einzelne Kolonie wird von der Platte entnommen und in 15 ml LB-Medium mit einem Pepton-Präparat und 50 μg/ml Ampicillin beimpft. Diese Kultur wird bei 37°C unter Schütteln (ca. 175 U/min) 8-10 Stunden lang gezüchtet. OD₆₀₀-Ablesungen sollten mindestens 1,0 sein. 1 Liter LB-Medium mit Pepton und 50 μg/ml Ampicillin wird mit 1,0 OD der Kultur beimpft. Diese 1-2 Liter Kulturen werden über Nacht bei 37°C unter Schütteln (175 U/min) gezüchtet.
In E. coli (Strang DH5 alpha) gezüchtete Plasmide werden geerntet und nach den folgenden Verfahren gereinigt. Allgemeine Verfahren für die Lyse von Zellen und Reinigung von Plasmiden finden sich in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage, J. Sambrook, E.F. Fritsch, und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989. Die Zellen werden konzentriert und mit Glucose-tris-EDTA-Puffer bei pH 8,0 gewaschen. Die konzentrierten Zellen werden durch Behandlung mit Lysozym lysiert und kurz mit 0,2 N KOH behandelt, und der pH-Wert wird dann mit Kaliumacetat/Essigsäurepuffer auf 5,5 eingestellt. Unlösliches Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehende Lösung wird mit 2-Propanol versetzt, um das Plasmid auszufällen. Das Plasmid wird in tris-EDTA-Puffer wieder aufgelöst und durch Phenol/Chloroform-Extraktion und eine zusätzliche Fällung mit 2-Propanol weiter gereinigt.
Wahlweise kann Endotoxin durch eine Vielzahl von Verfahren abgetrennt werden, welche die folgenden einschließen: spezifische Absorption durch immobilisierte Materialien, wie beispielsweise Polymyxin (Tani et al., Biomater. Artif. Cells Immobilization Biotechnol. 20(2-4):457-62 (1992); Issekutz, J. Immunol. Methods 61(3):275-81 (1983)); Anti-Endotoxin-monoklonale Antikörper, wie beispielsweise 8A1 und HA-1A^TM (Centocor, Malvern, PA; Bogard et al., J. Immunol. 150(10):4438-4449 (1993); Rietschel of al., Infect. Immunity Seite 3863 (1993)); positiv geladene Tiefenfilter (Hou of al., J. Parenter. Sci. Technol. 44(4):204-9 (Juli-Aug. 1990)); Polygamma-methyl-L-Glutamat), Hirayama of al., Chem. Pharm. Bull. (Tokio) 40(8):2106-9 (1992); Histidin (Matsumae et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 12:(2):129-40 (1990)); hydrophobe Wechselwirkungssäulen und -membranen (Aida et al., J. Immunol. Methods 132(2):191-5 (1990); Umeda et al., Biomater. Artif. Cells Artif. Organs 18(4):491-7 (1990); Hou et al., Biochem. Biophys. Acta 1073(1):149-54 (1991); Sawada et al., J. Hyg. (London) 97(1):103-14 (1986); spezifische hydrophobe Harze, die sich zur Abtrennung von Endotoxin eignen, einschließlich hydrophoben Polystyrol/Divinylbenzol- oder Divinylbenzol-Harzen, wie beispielsweise Brownlee Polypore Resin (Applied Biosystems, Palo Alto, CA); XUS 40323.00 (Dow Chemical, Midland, MI); HP20, CHP20P (Mitsubishi Kasei, U.S.); Hamilton PRP-1, PRP-Infinity (Hamilton, Reno, NV); Jordi Reversed-Phase DVB, Jordi Gel DVB, Polymer Labs PLgel^TM (Alltech, Deerfield, IL); Vydac PLx^TM (Separations Group, Hesperia, CA); andere Endotoxinabtrennende Materialien und Methoden, umfassend Detoxi-gel^TM Endotoxin Removing Gel (Pierce Chemical, Rockford, IL); Application Note 206, (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ). Siehe auch allgemein Sharma, Biotech. App. Biochem. 8:5-22 (1986). Bevorzugte Anti-Endotoxin-monoklonale Antikörper binden an die konservierten Domänen von Endotoxin, vorzugsweise Antikörper gegen Lipid A, den strukturell am meisten konservierten Teil des Endotoxinmoleküls. Solche monoklonalen Anti-Lipid A-Antikörper umfassen den Hochaffinitäts-Ratten-IgG-monoklonalen Antikörper 8A1 und den humanen Anti-Lipid A-IgM (k)-monoklonalen Antikörper HA-1A^TM. HA-1A^TM wurde aus einem humanen B E. coli J5-Impfstoff erhalten. Es wurde berichtet, das HA-1A^TM weitgehend kreuzreaktiv mit einer Vielzahl von bakteriellen Endotoxinen (Lipopolysacchariden) ist.
Beispiel 2 Es folgt eine Liste von Konstrukten, die in den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden können. Der Vektor pBabe.puro, der als Ausgangsmaterial zur Herstellung vieler der nachstehend aufgeführten Konstrukte verwendet wird, wurde ursprünglich von Morgenstern, J.P, und H. Land, 1990, Nucl. Acids Res. 18(12):3587-3596, konstruiert und beschrieben.
Das pBabe.puro-Plasmid ist besonders zur Expression von exogenen Genen in Säugetierzellen nützlich. DNA-Sequenzen, die exprimiert werden sollen, werden unter der Kontrolle des Moloney-Rattenleukämievirus (Mo MuLV) Long Terminal Repeat(LTR)-Promotor an Klonierungsstellen insertiert. Das Plasmid enthält den selektierbaren Marker für Puromycin-Resistenz.
Beispiel 3
Das Plasmid pBa.Va3 ist ein 7,8 kb-Plasmid, das ein 2,7 kb EcoRI-Genomfragment enthält, das die T-Zellen-Rezeptor Va3-Region, die die L-, V- und J-Segmente enthält, die in die EcoRI-Stelle von pBabe-puro kloniert sind, kodiert. Das vom T-Zellen-Rezeptor abstammende Target-Protein ist nützlich bei der Immunisierung gegen T-Zellen-vermittelte Autoimmunerkrankung und klonotypes T-Zellen-Lymphom und Leukämie und deren Behandlung.
Beispiel 4
Das Plasmid pBa.gagpol-vpr ist ein 9,88 kb-Plasmid, das die gag/pol- und vif Gene von HIV/MN enthält, die in pBabe.puro kloniert sind. Das vpr-Gen wird gelöscht. Das Plasmid, das diese HIV-viralen Gene enthält, die die HIV-Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Immunisierung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung. Die HIV-DNA-Sequenz ist bei Reiz, M.S., 1992, AIDS Res. Human Retro. 8:1549, beschrieben. Die Sequenz ist zugänglich aus Genbank Nr.: M17449.
Beispiel 5
Plasmid pM160 ist ein 11,0 kb-Plasmid, das das 2,3 kb-PCR-Fragment enthält, das das HIV-I/3B-Envelope-Protein und rev/tat-Gene kodiert, die in pMAMneoBlue kloniert sind. Die nef-Region wird gelöscht. Das Plasmid, das diese HIVviralen Gene enthält, die die HIV-Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Immunisierung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung. Die DNA-Sequenz von HIV-1/3B ist bei Fisher, A., 1985 Nature 316:26672, beschrieben. Die Sequenz ist zugänglich aus Genbank Nr.: K03455.
Beispiel 6
Plasmid pBa.VL ist ein 5,4 kb-Plasmid, das ein PCR-Fragment enthält, das die VL-Region eines Anti-DNA-Antikörpers kodiert, der in pBabe.puro an den Xbal und EcoRI-Stellen kloniert ist. Das vom Antikörper abstammende Target-Protein ist ein Beispiel für ein Target-Protein, das bei der Immunisierung gegen B-Zellenvermittelte Autoimmunerkrankung und klonotypes B-Zellen-Lymphom und Leukämie und deren Behandlung nützlich ist. Ein generelles Verfahren zum Klonieren funktioneller variabler Regionen aus Antikörpern findet sich bei Chaudhary, V.K., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066.
Beispiel 7
Das Plasmid pOspA.B ist ein 6,84 kb-Plasmid, das die Kodierregionen enthält, die die OspA- und OspB-Antigene von Borrelia burgdorferi, dem Spirochäten, der verantwortlich ist für die Lyme-Krankheit, kloniert in pBabe.puro an den BamHI- und SalI-Stellen, kodiert. Die PCR-Primer, die zur Erzeugung der OspA- und OspB-Fragmente verwendet wurden, sind 5'-GAAGGATCCATGAAAAAATATTTATTGGG-3' (SEQ.-ID.-NR.: 3) und 5'-ACTGTCGACTTATTTTAAAGCGTTTTTAAG-3' (SEQ.-ID.-NR.: 4). Siehe: Williams, W.V., et al., 1992, DNA and Cell. Biol. 11(3):207. Das Plasmid, das diese Krankheitserregergene enthält, die die Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Immunisierung gegen die Lyme-Krankheit.
Beispiel 8
Das Plasmid pBa.Rb-G ist ein 7,10 kb-Plasmid, das ein PCR-generiertes Fragment enthält, das das Tollwut-G-Protein kloniert, das in pBabe.puro an der BamHI-Stelle kloniert wird. Das Plasmid, das dieses Pathogen enthält, das das Tollwut-G-Protein kodiert, ist nützlich bei der Immunisierung gegen Tollwut. Die DNA-Sequenz ist in Genbank Nr.: M32751 veröffentlicht Siehe auch Anilionis, A., et al., 1981, Nature 294:275.
Beispiel 9
Das Plasmid pBa.HPV-L1 ist ein 6,80 kb-Plasmid, das ein PCR-generiertes Fragment enthält, das das L1-Capsidprotein des menschlichen Papillomavirus (HPV), einschließlich den HPV-Strängen 16, 18, 31 und 33 kodiert, kloniert in pBabe.puro an den BamHI und EcoRI-Stellen. Das Plasmid ist bei der Immunisierung gegen HPV-Infektion und den dadurch verursachten Krebs nützlich. Die DNA-Sequenz ist in Genbank Nr.: M15781 veröffentlicht.
Siehe auch: Howley, P., 1990 Fields Virology, Band 2, Herausg.: Channock, R.M., et al, Kapitel 58:1625; und Shah, K., und P. Howley, 1990, Fields Virology, Band 2, Herausg.: Channock, R.M., et al., Kapitel 59.
Beispiel 10
Das Plasmid pBa.HPV-L2 ist ein 6,80 kb-Plasmid, das ein PCR-generiertes Fragment enthält, das das L2-Capsidprotein des menschlichen Papillomavirus (HPV), einschließlich den HPV-Strängen 16, 18, 31 und 33 kodiert, kloniert in pBabe.puro an den BamHI- und EcoRI-Stellen. Das Plasmid ist nützlich bei der Immunisierung gegen HPV-Infektion und den dadurch hervorgerufenen Krebs. Die DNA-Sequenz ist in Genbank Nr.: M15781 veröffentlicht.
Siehe auch: Howley, P., 1990 Fields Virology, Band 2, Herausg.: Channock, R.M., et al., Kapitel 58:1625; und Shah, K., und P. Howley, 1990, Fields Virology, Band 2, Herausg.: Channock, R.M., et al., Kapitel 59.
Beispiel 11
Das Plasmid pBa.MNp7 ist ein 5,24 kb-Plasmid, das ein PCR-erzeugtes Fragment enthält, das die p7-Kodierregion, einschließlich die HIV MN gag (Kernprotein)-Sequenz kodiert, die in pBabe.puro an der BamHI-Stelle kloniert ist. Das Plasmid, das diese HIV-viralen Gene enthält, die die HIV-Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Immunisierung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung. Reiz, M.S., 1992, AIDS Res. Human Retro., 8:1549. Die Sequenz ist aus der Genbank Nr.: M17449 erhältlich.
Beispiel 12
Das Plasmid pGA733-2 ist 6,3 kb-Plasmid, das das GA733-2-Tumoroberflächenantigen enthält, das aus der colorektalen Karzinom-Zelllinie SW948 in pCDM8-Vektor (Seed, B., und A. Aruffo, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3365 an der BstXI-Stelle kloniert wird. Das tumorassoziierte Target-Protein ist ein Beispiel für ein Target-Protein, das bei der Immunisierung gegen hyperproliferierende Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, und deren Behandlung nützlich ist. Das GA733-2-Antigen ist ein nützliches Target-Antigen gegen Dickdarmkrebs. Das GA733-Antigen ist in Szala, S., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 87:3542-3546 beschrieben.
Beispiel 13
Das Plasmid pT4-pMV7 ist ein 11,15 kb-Plasmid, das cDNA enthält, und menschlichen CD4-Rezeptor kodiert, der in pMV7-Vektor an der EcoRI-Stelle kloniert ist. Das CD4-Target-Protein ist nützlich bei der Immunisierung gegen T-Zellen-Lymphom und dessen Behandlung. Das Plasmid pT4-pMV7 ist aus AIDS Repository, Katalog Nr. 158, erhältlich.
Beispiel 14
Das Plasmid pDJGA733 ist ein 5,1 kb-Plasmid, das das GA733-Tumoroberflächenantigen enthält, das an der BamHI-Stelle in pBabe.puro kloniert ist. Das tumorassoziierte Target-Protein ist ein Beispiel für ein Target-Protein, das bei der Immunisierung gegen eine hyperproliferierende Erkrankung, wie beispielsweise Krebs, und deren Behandlung nützlich ist. Das GA733-Antigen ist ein nützliches Target-Antigen gegen Dickdarmkrebs.
Beispiel 15
Das Plasmid PBa.RAS ist 6,8 kb-Plasmid, das die ras-Kodierregion enthält, die zuerst aus pZIPneoRAS subkloniert und an der BamHI-Stelle in pBabe.puro kloniert wurde. Das ras-Target-Protein ist Beispiel für ein Zytoplasma-Signalmolekül. Das Verfahren zum Klonieren von ras ist bei Weinberg, 1984, Mol. Cell. Biol., 4:1577, beschrieben. Das ras-kodierende Plasmid ist nützlich bei der Immunisierung gegen hyperproliferierende Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, und deren Behandlung; insbesondere ras-bezogene Krebsarten, wie beispielsweise Blasen-, Muskel-, Lungen-, Gehirn- und Knochenkrebs.
Beispiel 16
Das Plasmid pBa.MNp55 ist ein 6,38 kb-Plasmid, welches ein PCR-generiertes Fragment enthält, das die p55-kodierende Region, einschließlich der HIV MN gag-Vorstufen (Kernprotein)-Sequenz kodiert, die an der BamHI-Stelle in pBabe.puro kloniert wurde. Das Plasmid, das diese HIV-viralen Gene enthält, die HIV-Target-Proteine kodieren, ist bei der Immunisierung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung nützlich. Reiz, M.S., 1992, AIDS Res. Human Retro., 8:1549. Die Sequenz ist aus Genbank Nr.: M17449 erhältlich.
Beispiel 17
Das Plasmid pBa.MNp24 ist ein 5,78 kb-Plasmid, das ein PCR-generiertes Fragment aus dem pMN-SF1-Templat enthält, das die p24-kodierende Region, einschließlich der gesamten HIV MN gag-kodierenden Region kodiert, die an den BamHI- und EcoRI-Stellen in pBabe.puro kloniert sind. Das Plasmid, das diese HIV-viralen Gene enthält, die HIV-Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Immunisierung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung. Reiz, M.S., 1992, AIDS Res. Human Retro., 8:1549. Die Sequenz ist aus Genbank Nr.: M17449 erhältlich.
Beispiel 18
Das Plasmid pBa.MNp17 ist ein 5,5 kb-Plasmid, das ein PCR-generiertes Fragment enthält, das die p17-kodierende Region, einschließlich der HIV MN gag (Kernprotein)-Sequenz kodiert, die an den BamHI- und EcoRI-Stellen in pBabe.puro kloniert sind. Das Plasmid, das diese HIV-viralen Gene enthält, die HIV-Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Immunisierung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung. Reiz, M.S., 1912092, AIDS Res. Human Retro., 8:1549. Die Sequenz ist aus Genbank Nr.: M17449 erhältlich.
Beispiel 19
Das Plasmid pBa.SIVenv ist ein 7,8 kb-Plasmid, das ein 2,71 PCR-generiertes Fragment enthält, das aus einem Konstrukt amplifiziert wurde, das SIV 239 in pBR322, kloniert an den BamHI- und EcoRI-Stellen in pBabe.puro, enthält. Die verwendeten Primer sind 5'-GCCAGTTTTGGATCCTTAAAAAAGGCTTGG-3' (SEQ.-ID.-NR.: 5) und 5'-TTGTGAGGGACAGAATTCCAATCAGGG-3' (SEQ.-ID.-NR.: 6). Das Plasmid ist erhältlich vom AIDS Research and Reference Reagent Program; Katalog Nr. 210.
Beispiel 20
Das Plasmid pcTSP/ATK.env ist ein 8,92 kb-Plasmid, welches das PCR-generierte Fragment enthält, das die komplette HTLV-Envelope-kodierende Region aus HTLV-1/TSP und /ATK-Isolaten kodiert, die in den pcDNA1/neo-Vektor subkloniert sind. Die verwendeten Primer sind 5'-CAGTGATATCCCGGGAGACTCCTC-3' (SEQ.-ID.-NR.: 7) und 5'-GAATAGAAGAACTCCTCTAGAATTC-3' (SEQ.-ID.-NR.: 8). Das Plasmid pcTSP/ATK.env ist in 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:3599, beschrieben. Das HTLV-env-Target-Protein ist nützlich bei der Immunisierung gegen Infektion durch HTLV und T-Zellen-Lymphom und deren Behandlung.
Beispiel 21
Das Plasmid pBa.MNgp160 ist ein 7,9 kb-Plasmid, das ein 2,8 kb-PCR-generiertes Fragment enthält, amplifiziert aus einem Konstrukt, das MNenv in pSP72 enthält, und kloniert in pBabe.puro an den BamHI- und EcoRI-Stellen. Die verwendeten Primer sind 5'-GCCTTAGGCGGATCCTATGGCAGGAAG-3' (SEQ.-ID.-NR.: 9) und 5'-TAAGATGGGTGGCCATGGTGAATT-3' (SEQ.-ID.-NR.: 10). Reiz, M.S., 1992, AIDS Res. Human Retro., 8:1549. Die Sequenz ist erhältlich aus Genbank Nr.: M17449. Das Plasmid, das diese HIV-viralen Gene enthält, die HIV- Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Immunisierung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung.
Beispiel 22
Das Plasmid pC.MNp55 ist ein 11,8 kb-Plasmid, das ein 1,4 kb-PCR-generiertes Fragment enthält, amplifiziert aus der gag-Region aus MN-Isolat und kloniert in den pCEP4-Vektor. Das Plasmid, das diese HIV-viralen Gene enthält, die HIV-Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Behandlung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung. Reiz, M.S., 1992, AIDS Res. Human Retro., 8:1549. Die Sequenz ist aus Genbank Nr.: M17449 erhältlich.
Beispiel 23
Das Plasmid pC.Neu ist ein 14,2 kb-Plasmid, das ein 3,8 kb-DNA-Fragment enthält, das das Human neu-Onkogen enthält, das die Region kodiert, die aus dem LTR-2/erbB-2-Konstrukt ausgeschnitten und in den pCEP4-Vektor subkloniert worden war. Das pC.Neu-Plasmid ist beschrieben bei DiFiore, 1987, Science, 237:178.
Das neu-Onkogen-Target-Protein ist ein Beispiel für einen Wachstumsfaktorrezeptor, der als Target-Protein für die Immunisierung gegen hyperproliferierende Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, und deren Behandlung nützlich ist, insbesondere Dickdarm-, Brust-, Lungen- und Gehirnkrebs.
Beispiel 24
Das Plasmid pC.RAS ist ein 11,7 kb-Plasmid, das ein 1,4 kb-DNA-Fragment enthält, das die ras-Onkogen-kodierende Region enthält, die zuerst aus pZIPneoRAS subkloniert und in pCEP4 an der BamHI-Stelle subkloniert wurde. Das pC.RAS-Plasmid ist beschrieben bei Weinberg, 1984, Mol. Cell. Biol., 4:1577. Das ras-Target-Protein ist ein Beispiel für ein Zytoplasma-Signalmolekül. Raskodierende Plasmide sind nützlich bei der Immunisierung gegen hyperproliferierende Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, und deren Behandlung; insbesondere ras-abhängigen Krebs, wie beispielsweise Blasen-, Muskel-, Lungen-, Gehirn- und Knochenkrebs.
Beispiel 25
Das Plasmid pNLpuro ist ein 15 kb-Plasmid, das eine HIV-gag/pol und SV40-puro-Insertion enthält. Das Plasmid, das diese HIV-viralen Gene enthält, die HIV-Target-Proteine kodieren, ist nützlich bei der Immunisierung gegen HIV-Infektion und AIDS und deren Behandlung.
Beispiel 26
Das Plasmid pM160 kann als Ausgangsmaterial für verschiedene Plasmide verwendet werden, die nützlich sind, um ein oder mehrere Gene aus dem env-Teil von HIV zu exprimieren. Die Konstruktion von pM160 ist oben beschrieben. Das Plasmid umfasst gp160-, tat- und rev-kodierende Regionen. Das env-Gen ist nicht vorhanden.
Der Promotor, der die gp160/rev/tat-Genexpression kontrolliert, ist MMTV LTR. Der Promotor kann gelöscht und durch Actin-Promotor, Myosin-Promotor, HIV LTR-Promotor und CMV-Promotor ersetzt werden.
Das Gen, das Resistenz gegen Ampicillin verleiht, kann gelöscht oder anderweitig inaktiviert werden. Das Gen, das Resistenz gegen Neomycin verleiht, kann unter die Kontrolle eines bakteriellen Promotors gebracht werden.
Der Rous Sarkom-Virusverstärker kann aus dem Plasmid gelöscht werden. Der RSV-Verstärker kann durch den Muskelkreatinverstärker ersetzt werden.
Die gp160/rev/tat-Gene überlappen und teilen sich die gleichen Nukleotidsequenzen in unterschiedlichen Leserastern. Das rev-Gen kann durch Verändern seines Anfangscodons in einen anderen Codon gelöscht werden. Auf die gleiche Weise kann das tat-Gen eliminiert werden. In jedem Plasmid, außer denjenigen, die den HIV LTR-Promotor zur Kontrolle von gp160/rev/tat verwenden, können entweder rev, tat, oder sowohl rev als auch tat eliminiert werden. In Plasmiden, die den HIV LTR-Promotor verwenden, muss tat vorhanden sein.
Die folgende Tabelle listet pM160-modifizierte Plasmide auf. Jedes Plasmid hat ein inaktiviertes Ampicillin-Gen. In jedem ist der RSV-Verstärker gelöscht. Einige haben keinen Verstärker (nein); einige haben Muskelkreatinverstärker (CME). Einige besitzen das HIV-rev-Gen (ja), während es in anderen gelöscht ist (nein). Einige haben das HIV-tat-Gen (ja), während es in anderen gelöscht ist (nein).
Die Konstruktionen von RA-29 bis RA-56 sind identisch mit RA-1 bis RA-32, außer dass in jedem Fall der Promotor, der das Neomycin-Gen kontrolliert, ein bakterieller Promotor ist.
Beispiel 27
Das Plasmid pNLpuro kann als Ausgangsmaterial verwendet werden, um einige unterschiedliche Plasmide zu erzeugen, welche die HIV gag/pol-Gene exprimieren. Wie oben beschrieben wurde pNLpuro zur Expression von gag pol konstruiert. Das Plasmid pNLpuroΔvpr, das oben beschrieben wurde, wurde konstruiert, um das vpr-Regulatorgen aus dem HIV gag pol-Vektor zu löschen, um ein notwendiges Regulatorprotein aus dem Satz von Genen zu eliminieren, die durch Impfung eingeführt werden sollten. Zusätzlich zum vpr können weitere Veränderungen am Plasmid pNL43puro von Fachleuten auf dem Gebiet unter Anwendung von standardmäßigen molekularbiologischen Techniken und frei erhältlichen Ausgangsmaterialien durchgeführt werden.
Die humanen Flankierungssequenzen 5' und 3' der HIV-Sequenzen können nach verschiedenen Verfahren entfernt werden. Unter Verwendung der PCR können beispielsweise nur die HIV-, SV40-puro- und pUC18-Sequenzen amplifiziert und rekonstruiert werden.
Die psi-Region von HIV, die beim Verpacken des Virus wichtig ist, kann aus pNL43puro-basierten Plasmiden gelöscht werden. Um die psi-Region zu löschen, wird das pNLpuro-Plasmid mit SacI und SpeI geschnitten. Diese Digestion entfernt die psi-Region sowie das 5'-LTR, das sich strangaufwärts befindet und ein Teil der gag/pol-Region ist, die sich strangabwärts vom psi befindet. Um die gelöschten nicht-psi-Sequenzen zu reinsertieren, wird eine PCR-Amplifikation durchgeführt, um diese Sequenzen zu regenerieren. Es werden Primer konstruiert, die die Teile der HIV-Sequenz 5' und 3' zu psi regenerieren, ohne psi zu regenerieren. Die Primer bilden die SacI-Stelle am Teil des Plasmids 5' der 5'-LTR zurück. Die Primer gehen strangabwärts von der Stelle strangaufwärts der SacI-Stelle zu der Stelle gerade 3' zum 5'-Ende der psi-Region, was eine AatI-Stelle am 3'-Ende erzeugt. Primer, die direkt 5' an der psi-Region starten, generieren eine AatI-Stelle und regenerieren diese Stelle, wenn sie 3' zur SpeI-Stelle starten. Die PCR-generierten Fragmente werden mit SacI, AatI und SpeI digestiert und zusammen mit SacI/SpeI-digestiertem pNLpuro-psi-Fragment miteinander ligiert. Der HIV 5' LTR-Promotor kann gelöscht und durch Moloney-Virus-Promotor, MMTV LTR, Actin-Promotor, Myosin-Promotor und CMV-Promotor ersetzt werden.
Die HIV 3' LTR-Polyadenylierungsstelle kann gelöscht und durch die SV40-Polyadenylierungsstelle ersetzt werden.
Das Gen, das Resistenz gegen Ampicillin verleiht, kann gelöscht oder anderweitig inaktiviert werden.
Es folgt eine Liste von pNLpuro-basierten Konstruktionen, in denen die HIV-psi- und vpr-Regionen und die humanen Flankierungsregionen 5' und 3' der HIV-Sequenzen gelöscht sind.
Die Konstruktionen LA-17 bis LA-32 sind identisch mit LA-1 bis LA-16, außer dass in jedem Fall mindestens eine der humanen Flankierungssequenzen verbleibt.
Beispiel 28
In einer anderen Konstruktion zum Exprimieren des env-Gens kann diese Region von HIV in das kommerziell erhältliche Plasmid pCEP4 (Invitrogen) insertiert werden. Das pCEP4-Plasmid ist besonders nützlich, da es den Epstein Barr-Virus-Replikationsursprung und die Kernantigen-EBNA-1-kodierende Region, die High-Copy-episomale Replikation ohne Integration produziert. pCEP4 enthält auch den Hygromycin-Marker unter der Regulatorkontrolle des Thymidinkinase-Promotors und der Polyadenylierungsstelle. Die HIV env-kodierende Region wird unter die Regulatorkontrolle des CMV-Promotors und der SV40-Polyadenylierungsstelle gestellt. Die HIV env-kodierende Region wurde als 2,3 kb-PCR-Fragmentform HIV/3B, Genbank Sequenz K03455, erhalten. Das erhaltene pCEP4-basierte Plasmid, pRA-100, wird extrachromosomal gehalten und produziert gp160-Protein.
Beispiel 29
In einer anderen Konstruktion zum Exprimieren des env-Gens kann diese Region von HIV in das kommerziell erhältliche Plasmid pREP4 (Invitrogen) insertiert werden. Das pREP4-Plasmid ist besonders nützlich, da es den Epstein Barr-Virus-Replikationsursprung und die Kernantigen-EBNA-1-kodierende Region enthält, die High-Copy-episomale Replikation ohne Integration erzeugt. pREP4 enthält auch den Hygromycin-Marker unter der Regulatorkontrolle des Thymidinkinase-Promotors und der Polyadenylierungsstelle. Die HIV env-kodierende Region wird unter die Regulatorkontrolle des RSV-Promotors und der SV40-Poly adenylierungsstelle gestellt. Die HIV env-kodierende Region wurde als 2,3 kb-PCR-Fragmentform HIV/3B, Genbank Sequenz K03455, erhalten. Das resultierende pCEP4-basierte Plasmid, pRA-101, wird extrachromosomal gehalten und produziert gp160-Protein.
Beispiel 30
In einer anderen Konstruktion zum Exprimieren der gag/pol-Gene kann diese Region von HIV in das kommerziell erhältliche Plasmid pCEP4 (Invitrogen) insertiert werden. Das pCEP4-Plasmid ist besonders nützlich, da es den Epstein Barr-Virus-Replikationsursprung und die Kernantigen-EBNA-1-kodierende Region enthält, die High-Copy-episomale Replikation ohne Integration erzeugt. pCEP4 enthält auch den Hygromycin-Marker unter der Regulatorkontrolle des Thymidinkinase-Promotors und der SV40-Polyadenylierungstelle. Die HIV gag/pol-kodierende Region wird unter die Regulatorkontrolle des CMV-Promotors und der SV40-Polyadenylierungsstelle gestellt. Die HIV gag/pol-kodierende Region wurde von HIV MN, Genbank Sequenz MI7449, erhalten, und umfasst das vif-Gen. Das vpr-Gen ist nicht enthalten. Das resultierende pCEP4-basierte Plasmid, pLA-100, wird extrachromosomal gehalten und produziert GAG55-, reverse Transkriptase-, Protease- und Integrase-Proteine.
Beispiel 31
In einer anderen Konstruktion zum Exprimieren der gag/pol-Gene kann diese Region von HIV in das kommerziell erhältliche Plasmid pREP4 (Invitrogen) insertiert werden. Das pREP4-Plasmid ist besonders nützlich, da es den Epstein Barr-Virus-Replikationsursprung und die Kernantigen-EBNA-1-kodierende Region enthält, die High-Copy-episomale Replikation ohne Integration erzeugt. pREP4 enthält auch den Hygromycin-Marker unter der Regulatorkontrolle des Thymidinkinase-Promotors und der Polyadenylierungsstelle. Die HIV gag/pol-kodierende Region wird unter die Regulatorkontrolle des CMV-Promotors und der SV40-Polyadenylierungsstelle gestellt. Die HIV gag/pol-kodierende Region wurde von HIV MN, Genbank Sequenz MI7449, erhalten, und umfasst das vif-Gen. Das vpr-Gen ist nicht enthalten. Das resultierende pREP4-basierte Plasmid, pLA-101, wird extrachromosomal gehalten und erzeugt GAG55-, reverse Transkriptase-, Protease- und Integrase-Proteine.
Beispiel 32
Die folgende Konstruktion, hier als pGAGPOL.rev bezeichnet, ist nützlich, um HIV gag/pol-Gene zu exprimieren.
Das Plasmid umfasst ein Kanamycin-Resistenzgen und einen pBR322-Ursprung der DNA-Replikation. Die Sequenzen, die für die Transkriptionsregulation bereitgestellt werden, umfassen: einen Zytomegalovirus-Promotor; einen Rous Sarkom-Virus-Verstärker; und ein SV40-Polyadenylierungssignal. Die in pGAGPOL.rev enthaltenen HIV-1-Sequenzen umfassen eine Sequenz, die p17, p24 und p15 des gag-offenen Leserasters kodiert; eine Sequenz, die Protease kodiert, eine Sequenz, die reverse Transkriptase kodiert, die eine kleine Löschung enthält, und eine Sequenz, die den inaktiven Aminoterminus der Integrase des pol-offenen Leserasters kodiert; und eine Sequenz, die rev kodiert. Jede der HIV-Sequenzen stammt vom HIV-1-Stamm HXB2 ab.
Im pGAGPOL.rev sind verschiedene Sicherheitsmerkmale enthalten. Diese enthalten die Verwendung des CMV-Promotors und einer nicht-retroviralen Poly(A)-Stelle. Weiterhin schränkt die Löschung der ψ-Sequenz die Fähigkeit ein, virale RNA zu verpacken. Darüber hinaus ergeben multiple Mutationen der reversen Transkriptase ein enzymatisch inaktives Produkt. Eine große Löschung der Integrase liefert darüber hinaus ein inaktives Produkt, und ein Kanamycin-Resistenzmarker wird zur Stabilisation der bakteriellen Transformanden verwendet.
Das Plasmid pGAGPOL.rev wird folgendermaßen konstruiert.
Schritt 1. Es wird ein Subklon eines Teils des HIV-1-(HXB2)-Genoms verwendet, das in Bluescript (Stratagene) kloniert ist. Der Subklon von HIV-1 enthält die komplette 5' LTR und den Rest des HIV-1-Genoms bis zum Nukleotid 5795 (Genbank-Numerierung). Die HIV-1-Sequenzen werden aus dem HXB2D-Plasmid (AIDS Repository) erhalten.
Schritt 2. PCR eines Teils von gag aus dem offenen Leseraster HXB2D-Plasmid (AIDS Repository). Schneiden des PCR-Fragments mit NotI und SpeI und ligieren mit HIV-1-Subklon, wie oben beschrieben, begrenzt mit NotI und SpeI.
Schritt 3. PCR gag/pol-Verbindung und Teil von pol-kodierenden Sequenzen aus dem HXB2D-Plasmid (AIDS Repository) mit den Primern SEQ.-ID.-NR.: 11 und SEQ.-ID.-NR.: 12. Schneiden des PCR-Produkts mit ClaI und gemeinsames Ligieren. Schneiden der ligierten Fragmente mit BclI und SalI und Ligieren mit dem Plasmid aus Schritt 2, das mit BclI und SalI ligiert ist.
Schritt 4. Schneiden des Plasmids aus Schritt 3 mit BspMI und EcoRI und Religieren mit Adaptern, gebildet durch Verbinden der Verbindungsstücke SEQ.-ID.-NR.: 13 und SEQ.-ID.-NR.: 14.
Schritt 5. Schneiden des Plasmids aus Schritt 4 mit NotI und SalI und Ligieren mit dem Plasmid aus entweder 4a oder 4b nach der Beschreibung für pENV (nachstehend). Schneiden auch mit NotI und SalI.
Schritt 6. Restriktion des Plasmids aus Schritt 5 mit SalI und MluI und Ligieren mit PCR-Produkt, das durch PCR von rev mit den Primern SEQ.-ID.-NR.: 15 und SEQ.-ID.-NR.: 16 erhalten wurde.
Schritt 7. Schneiden des Plasmids aus Schritt 6 mit NotI und Ligieren des Produkts, das durch PCR des rev-responsiven Elements im HXB2D-Plasmid (AIDS Repository) mit den Primern SEQ.-ID.-NR.: 17 und SEQ.-ID.-NR.: 18 erhalten wurde.
Die Schritte 6 und 7 sind optional.
Beispiel 33
Die folgende Konstruktion, hier als pENV bezeichnet, ist nützlich, um HIV env-Gene zu exprimieren.
Das Plasmid umfasst ein Kanamycin-Resistenzgen und einen pBR322-DNA-Replikationsursprung. Die Sequenz, die für die Transkriptionsregulierung zur Verfügung gestellt wird, umfasst: einen Zytomegalovirus-Promotor; einen Rous Sarkom-Virus-Verstärker; und ein SV40-Polyadenylierungssignal. Die HIV-1-Sequenzen, die in pENV enthalten sind, umfassen eine Sequenz, die vpu kodiert; eine Sequenz, die rev kodiert; eine Sequenz, die gp160 kodiert; eine Sequenz die 50% nef kodiert; eine Sequenz, die vif kodiert; und eine Sequenz die vpr mit einer Deletion von 13 Aminosäuren am Carbonsäureende kodiert. Die vpu-, rev-, gp160- und nef-Sequenzen stammen vom HIV-1-Stamm MN ab. Die vif- und vpr-Sequenzen stammen vom HIV-1-Stamm HXB2 ab.
Einige Sicherheitsmerkmale sind in pGAGPOL.rev enthalten. Diese umfassen die Verwendung des CMV-Promotors und eine nicht-retrovirale Poly(A)-Stelle. Weiterhin wurde tat entfernt, und eine 50%-ige Deletion von nef führte zu einem "inaktiven" nef-Produkt. Darüber hinaus werden vif und vpr aus der normalen Sequenz herausgenommen, und eine teilweise Deletion von vpr gewährleistet weiterhin ein inaktives vpr-Produkt.
Das Plasmid pENV wird wie folgt konstruiert.
Schritt 1. Beginn mit pUC18, das mit HindIII und EcoRI digestiert wird. Das erhaltene Fragment, das den ColEI-Replikationsursprung enthält und das laci-Gen sollten mit dem EcoRI/HindIII-Fragment aus pMAMneoBlue, das unseren Sarkom-Virus-Verstärker enthält, verknüpft werden. Das erhaltene Plasmid oder pMAMneo-Blue von Clontech (Palo Alto, CA) kann dann mit HindIII und BgII digestiert werden. Unter Verwendung von Standardtechnik Verknüpfung mit dem Fragment, das das kan-Gen enthält, das durch PCR des Genblockplasmids (Pharmacia) erhalten wird.
Schritt 2. Wenn pMAMneo-Blue als Ausgangsplasmid verwendet wird, wird mit MluI und EcoRI digestiert, und die Enden mit dem Klenow-Fragment der Polymerase I aufgefüllt und religiert.
Schritt 3. Anschließend wird entweder pMAMneo-Blue- oder pUC18-abstammendes Plasmid mit HindIII digestiert und mit der SV40-Poly(A)-Stelle und der früheren Spleißregion, die durch PCR von pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) mit den Primern SEQ.-ID.-NR.: 19 und SEQ.-ID.-NR.: 20 erhalten wird, verknüpft.
Schritt 4a. Digestion mit BamHI und Verknüpfung mit dem CMV-Promotor, der durch PCR von pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) mit den Primern SEQ.-ID.-NR.: 21 und SEQ.-ID.-NR.: 22 erhalten wird.
Schritt 4b. Digestion mit BamHI und Verknüpfung mit MoMLV LTR, das durch PCR mit den Primern SEQ.-ID.-NR.: 23 und SEQ.-ID.-NR.: 24 erhalten wird.
Schritt 5. Digestion mit NotI und MluI und Verknüpfung mit der GP160-Kodierregion, erhältlich durch PCR von pMN-ST1 mit den Primern SEQ.-ID.-NR.: 25 und SEQ.-ID.-NR.: 26.
Schritt 6. Digestion mit MluI und Verknüpfung mit Sequenzen, die vif in ihrer Gesamtheit kodieren und vpr mit einer 13aa Carboxy-endständigen Deletion durch CPR des HXCB2D-Plasmids (AIDS Repository) mit den Primern SEQ.-ID.-NR.: 27 und SEQ.-ID.-NR.: 2.
Beispiel 34
Einige Beispiele betreffen ein Verfahren zur Immunisierung einer Person gegen HIV durch Verabreichung eines einzigen Serums. Dieses Serum umfasst ein genetisches Konstrukt, das mindestens eines, vorzugsweise zwei, und noch bevorzugter mehr als zwei oder eine Vielzahl der Gene des HIV-Virus oder alle Strukturgene enthält. Das Serum enthält jedoch nicht ein vollständiges Komplement aller HIV-Gene. Wenn eine einzige Zelle mit einem vollständigen Komplement der viralen Gene ausgestattet wird, ist es möglich, dass ein vollständiges infektiöses Virus in der Zelle zusammengesetzt werden kann. Demgemäß wird ein genetisches Konstrukt nicht mit einem solchen vollständigen Komplement der Gene zur Verfügung gestellt. Als sichere Vorsichtsmaßnahme können ein oder mehrere essentielle Gene gelöscht oder absichtlich verändert werden, um zusätzlich zu gewährleisten, dass ein infektiöses virales Partikel nicht gebildet werden kann.
In einigen Beispielen werden mindestens Teile von einem, zwei oder allen HIV-Strukturgenen zur Verfügung gestellt. Die Strukturgene von HIV bestehen aus gag, pol und env. Teile mindestens eines dieser drei Gene werden auf einem genetischen Konstrukt bereitgestellt. In einigen Beispielen werden somit mindestens ein Teil von jeweils gag und pol auf dem genetischen Konstrukt zur Verfügung gestellt; in einigen Beispielen wird mindestens ein Teil von env auf einem genetischen Konstrukt zur Verfügung gestellt; in einigen Beispielen wird mindestens ein Teil von gag auf einem genetischen Konstrukt zur Verfügung gestellt; in einigen Beispielen wird mindestens ein Teil von jeweils pol und env auf einem genetischen Konstrukt zur Verfügung gestellt; in einigen Beispielen wird mindestens ein Teil von jeweils gag und env auf einem genetischen Konstrukt zur Verfügung gestellt; in einigen Beispielen wird mindestens ein Teil von pol auf einem genetischen Konstrukt zur Verfügung gestellt. Wahlweise wird das gesamte Gen zur Verfügung gestellt. In einigen dieser Konstrukte können wahlweise die HIV-Regulaturgene vorhanden sein. Die HIV-Regulatorgene sind: vpr, vif, vpu, nef, tat und rev.
Beispiel 35
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Expressionseinheit" eine Nukleinsäuresequenz, die einen Promotor umfasst, der operabel mit einer Kodiersequenz verbunden ist, die operabel mit einem Polyadenylierungssignal verbunden ist. Die Kodiersequenz kann ein oder mehrere Proteine oder Fragmente davon kodieren.
Eine Expressionseinheit kann im Plasmid enthalten sein. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "HIV-Expressionseinheit" eine Nukleinsäuresequenz, die einen Promotor umfasst, der operabel mit einer Kodiersequenz gebunden ist, die operabel mit einem Polyadenylierungssignal gebunden ist, in dem die Kodiersequenz ein Peptid kodiert, das ein Epitop umfasst, das identisch oder im wesentlichen ähnlich einem Epitop ist, das auf einem HIV-Protein gefunden wird. "Im wesentlichen ähnliches Epitop" bedeutet ein Epitop, das eine Struktur hat, die nicht identisch ist mit einem Epitop eines HIV-Proteins, aber trotzdem eine zelluläre oder humorale Immunreaktion hervorruft, die mit einem HIV-Protein kreuzreagiert. In einigen Beispielen umfasst die HIV-Expressionseinheit eine Kodiersequenz, die ein oder mehrere HIV-Proteine oder deren Fragmente kodiert. In einigen Beispielen ist eine HIV-Expressionseinheit im Plasmid enthalten.
In einigen Beispielen wird ein einzelnes genetisches Konstrukt bereitgestellt, das eine einzelne HIV-Expressionseinheit aufweist, die DNA-Sequenzen enthält, die ein oder mehrere HIV-Proteine oder Fragmente davon kodiert. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Konstrukt mit einer einzelnen HIV-Expressionseinheit" ein einzelnes genetisches Konstrukt, das eine einzelne HIV-Expressionseinheit enthält. In einigen Beispielen liegt ein Konstrukt mit einer einzelnen HIV-Expressionseinheit in Form eines Plasmids vor.
In einigen Beispielen ist ein einzelnes genetisches Konstrukt so ausgestattet, dass es mehr als eine HIV-Expressionseinheit hat, in der jede DNA-Sequenz enthalten ist, die ein oder mehrere HIV-Proteine oder deren Fragmente kodiert. Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "genetisches Konstrukt mit mehrfachen HIV-Expressionseinheiten" ein einziges Plasmid, das mehr als eine HIV-Expressionseinheit enthält. In bevorzugten Ausführungsformen liegt ein Konstrukt mit mehrfacher HIV-Expressionseinheit in Form eines Plasmids vor.
In einigen Beispielen ist ein einzelnes genetisches Konstrukt so ausgestattet, dass es zwei Expressionseinheiten hat, in denen jede DNA-Sequenzen enthält, die ein oder mehrere HIV-Proteine oder Fragmente davon kodieren. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "genetisches Konstrukt mit zwei HIV-Expressionseinheiten" ein einziges Plasmid, das zwei HIV-Expressionseinheiten enthält, d.h. ein genetisches Konstrukt mit mehreren HIV-Expressionseinheiten, die zwei HIV-Expressionseinheiten-genetische Expressionseinheiten enthält. In einem genetischen Konstrukt mit zwei HIV-Expressionseinheiten ist es bevorzugt, dass eine HIV-Expressionseinheit in entgegengesetzter Richtung zur anderen HIV-Expressionseinheit arbeitet. In einigen Beispielen liegt das Konstrukt mit zwei HIV-Expressionseinheiten in Form eines Plasmids vor.
In einigen Beispielen wird ein genetischer HIV-Impfstoff bereitgestellt, der ein einzelnes genetisches Konstrukt enthält. Das einzelne genetische Konstrukt kann ein genetisches Konstrukt mit einer einzelnen HIV-Expressionseinheit sein, ein genetisches Konstrukt mit zwei HIV-Expressionseinheiten oder ein genetisches Konstrukt mit mehreren HIV-Expressionseinheiten sein, welches mehr als zwei HIV-Expressionseinheiten enthält.
In einigen Beispielen wird ein genetischer HIV-Impfstoff bereitgestellt, der mehr als ein genetisches Konstrukt in einem einzelnen Serum enthält.
In einigen Beispielen wird ein genetischer HIV-Impfstoff zur Verfügung gestellt, der mehr als ein genetisches Konstrukt in mehr als einen Serum enthält. Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Mehrfach-Serum" einen genetischen Impfstoff, der mehr als ein genetisches Konstrukt enthält, wobei jedes getrennt verabreicht wird. In einigen Beispielen wird ein genetischer HIV-Impfstoff zur Verfügung gestellt, der zwei genetische Konstrukte enthält. Jedes genetische Konstrukt kann unabhängig voneinander ein genetisches Konstrukt mit einer einzelnen HIV-Expressionseinheit, ein genetisches Konstrukt mit zwei HIV-Expressionseinheiten oder ein genetisches Konstrukt mit mehrfachen HIV-Expressionseinheiten sein, das mehr als zwei HIV-Expressionseinheiten enthält. In einigen Beispielen sind beide genetischen Konstrukte genetische Konstrukte mit einer einzelnen HIV-Expressionseinheit. In einigen Beispielen sind beide genetische Konstrukte genetische Konstrukte mit zwei HIV-Expressionseinheiten. In einigen Beispielen sind beide genetische Konstrukte genetische Konstrukte mit mehrfachen HIV-Expressionseinheiten. In einigen Beispielen ist ein genetisches Kon strukt ein genetisches Konstrukt mit einer einzelnen HIV-Expressionseinheit und das andere ist ein genetisches Konstrukt mit zwei HIV-Expressionseinheiten. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann die vielen Variationen in Abhängigkeit von der Anzahl der genetischen Konstrukte, die in einem genetischen Impfstoff verwendet werden, und der Anzahl von HIV-Expressionseinheiten, die auf jedem genetischen Konstrukt vorhanden sind, leicht erkennen und einschätzen.
In einigen Beispielen enthalten die genetischen Konstrukte keine bestimmten HIV-Sequenzen, insbesondere diejenigen, die eine Rolle beim Integrieren des HIV-Genoms spielen, das in dem Chromosomenmaterial der Zelle, in der es eingeführt ist, integriert ist. In einigen Beispielen enthalten die genetischen Konstrukte LTRs aus HIV. In ähnlicher Weise enthalten in einigen Beispielen die genetischen Konstrukte keine psi-Stelle aus HIV. Weiterhin kann das reverse Transkriptasegen und das Integrasegen entfernt werden. Die Löschung umfassen die Löschung nur einiger Codons und das Ersetzen einiger der Codons, um das Gen im wesentlichen zu entfernen. Beispielsweise kann das Startcodon gelöscht oder verändert oder Gerüst herausgeschoben werden, um zu einer Nukleotidsequenz zu führen, die unvollständig und nicht-funktionierend kodiert.
In einigen Beispielen enthalten die genetischen Konstrukte kein transkribierbares tat-Gen aus HIV. Das tat-Gen, das mit de, rev-Gen überlappt, kann vollständig entfernt werden, indem die Codons, die rev mit anderen Codons, die die gleiche Aminosäure für rev kodieren, aber die nicht die erforderliche tat-Aminosäure in dem Leseraster, in dem tat kodiert wird, kodieren, substituiert werden. Alternativ wird nur an einigen Codons eine der Veränderungen durchgeführt, d.h. im wesentlichen Löschen des Startcodons für tat, d.h. und/oder Veränderung, d.h. im wesentlichen Löschen, von genügend Codons, um zu einer Nukleotidsequenz zu gelangen, die ein unvollständiges und nicht-funktionierendes tat kodiert.
Ein genetisches Konstrukt kann Kodiersequenzen umfassen, die Peptide kodieren, die mindestens ein Epitop aufweisen, das identisch oder im wesentlichen ähnlich einem Epitop aus HIV gag-, pol-, env- oder rev-Proteinen ist.
Ein genetisches Konstrukt kann Kodiersequenzen umfassen, die mindestens einer der HIV gag-, pol-, env- oder rev-Proteine oder Fragmente davon kodieren. Ein genetisches Konstrukt kann Kodiersequenzen umfassen, die Peptide kodieren, die mehr als ein Epitop aufweisen, das identisch und/oder im wesentlichen gleich einem Epitop aus HIV gag-, pol-, env- oder rev-Protein ist.
Ein genetisches Konstrukt kann Kodiersequenzen umfassen, die mehr als einer der HIV gag-, pol-, env- oder rev-Proteine oder Fragmente davon kodieren.
Ein genetisches Konstrukt kann Kodiersequenzen umfassen, die Peptide kodieren, die mindestens ein Epitop aufweisen, das identisch oder im wesentlichen ähnlich einem Epitop aus HIV vif-, vpr , vpu- oder nef-Protein ist.
Ein genetisches Konstrukt kann Kodiersequenzen umfassen, die mindestens einer der HIV vif-, vpr-, vpu- oder nef-Proteine oder Fragmente davon kodieren.
Ein genetisches Konstrukt mit einer einzigen HIV-Expressionseinheit kann Kodierregionen für ein oder mehrere Peptide umfassen, die mindestens ein Epitop mit einem HIV-Protein oder Fragment davon in einer einzigen Expressionseinheit unter der Regulatorkontrolle eines einzigen Promotors und des Polyadenylierungssignals teilen.
Genetische Konstrukte können mehr als ein HIV-Protein oder dessen Frag ment kodieren. Der Promotor kann jeder Promotor sein, der in einer menschlichen Zelle funktionell ist. Der Promotor kann ein SV40-Promotor oder ein CMV-Promotor oder ein direkter CMV-Frühpromotor sein. Das Polyadenylierungssignal kann irgendein Polyadenylierungssignal sein, das in einer menschlichen Zelle funktionell ist.
Das Polyadenylierungssignal kann ein SV40-Polyadenylierungssignal oder das SV40-Nebenpolyadenylierungssignal sein. Wenn mehr als eine Kodierregion in einer einzelnen Expressionseinheit vorhanden ist, kann sie direkt neben einer anderen sein oder durch nicht-kodierende Regionen getrennt sein. Um richtig exprimiert zu werden, muss eine Kodierregion ein Startcodon und ein Stopcodon haben.
Ein genetisches Konstrukt mit zwei HIV-Expressionseinheiten kann Kodier regionen für ein oder mehrere Peptide umfassen, die mindestens ein Epitop mit einem HIV-Protein oder einem Fragment davon auf jedem der zwei Expressionseinheiten teilen. Jede Expressionseinheit steht unter der Regulatorkontrolle eines einzelnen Promotors und Polyadenylierungssignals.
Genetische Konstrukte können mehr als ein HIV-Protein oder Fragmente davon kodieren.
Nukleotidsequenzen, die gag und pol kodieren, können auf einer Expressionseinheit, und Nukleotidsequenzen, die env und rev kodieren, können auf der anderen vorhanden sein. Der Promotor kann jeder Promotor sein, der in einer humanen Zelle funktionell ist. Der Promotor kann ein SV40-Promotor oder ein CMV-Promotor oder ein direkter CMV-Frühpromotor sein. Das Polyadenylierungssignal kann irgendein Polyadenylierungssignal sein, das in einer menschlichen Zelle funktionell ist. Das Polyadenylierungssignal kann ein SV40-Polyadenylierungssignal oder das SV40-Nebenpolyadenylierungssignal sein. Wenn mehr als eine Kodierregion in einer Expressionseinheit vorhanden ist, kann sie direkt neben der anderen liegen oder durch nicht-kodierende Regionen getrennt sein. Um richtig exprimiert zu werden, muss eine Kodierregion ein Startcodon und ein Stopcodon haben.
Gemäß einigen Beispielen wird das MHC-Klasse-II-kreuzreaktive Epitop in env gelöscht und durch die analoge Region aus HIV II ersetzt.
Wenn ein genetisches Konstrukt gag und/oder pol enthält, ist es im allgemeinen wichtig, dass rev auch vorhanden ist. Zusätzlich zu rev kann ein rev-Reaktionselement mit gag und pol für erhöhte Expression dieser Gene ausgestattet sein.
Wenn genetische Konstrukte erzeugt werden, kann das env-Gen, das im Plasmid 1 verwendet wird, von MN- oder MN-ähnlichen Isolaten, einschließlich klinischen Isolaten, die MN ähneln, abstammen, vorzugsweise klinischen Isolaten, die nicht Syncytium induzieren, vorzugsweise solchen, die makrophagentropisch aus klinischen Isolaten im frühen Stadium sind.
Multiple Proteine können aus einer einzelnen Expressionseinheit durch alternatives Spleißen erzeugt werden. Spleißsignale werden zur Verfügung gestellt, um alternatives Spleißen zu ermöglichen, das unterschiedliche Nachrichten erzeugt, die verschiedene Proteine kodieren.
Beispiel 36
4 zeigt vier Grundgerüste, A, B, C und D. 5 zeigt 4 Inserts, 1, 2, 3 und 4. Insert 1 unterstützt die Expression von gag und pol; das rev-Response-Element wurde auf eine Weise kloniert, dass der HIV-Spleißakzeptor erhalten blieb. Insert 2 ähnelt dem Insert 1, da es auch die Expression von gag und pol unterstützt, außer dass das rev-Response-Element ohne Konservierung des HIV-Spleißakzeptors kloniert wurde. Insert 3 unterstützt die Expression von gag und pol, enthält eine Löschung des Integrasegens und umfasst nicht das Vorliegen des cis-agierenden rev-Response-Elements. Insert 4 unterstützt die Expression von rev, vpu und env. Das env kann das kreuzreaktive MHC-Klasse II-Epitop haben, das so verändert wurde, dass die Kreuzreaktivität eliminiert wurde, und die V3-Schleife kann so verändert werden, dass die Möglichkeit von Syncytium-Bildung eliminiert wird.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst A mit dem Insert 1 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pA1ori+ ist ein Grundgerüst A mit dem Insert 1 und dem SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pA1ori- ist das Grundgerüst A mit dem Insert 1 ohne den SV40-Replikationsursprung. Zusätzlich können entweder pA1ori+ oder pA1ori- Integrase enthalten, was zu pA1ori+int+ bzw. pA1ori-int+ führt. Die Plasmide pA1ori+, pA1ori-, pA1ori+int+ und pA1ori-int+ können weiter modifiziert werden durch funktionelles Löschen des reversen Transkriptase (RT)-Gens, was zu pA1ori+RT-, pA1ori-RT-, pA1ori+int+RT- bzw. pA1ori-int+RT- führt.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst A mit dem Insert 2 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pA2ori+ ist das Grundgerüst A mit dem Insert 2 und dem SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pA2ori- ist das Grundgerüst A mit dem Insert 1 ohne den SV40-Replikationsursprung. Zusätzlich können entweder pA2ori+ oder pA2ori- Integrase enthalten, was zu pA2ori+int+ bzw. pA2ori-int+ führt. Die Plasmide pA2ori+, pA2ori-, pA2ori+int+ und pA2ori-int+ können weiter modifiziert werden durch funktionelles Löschen des reversen Transkriptase (RT)-Gens, was zu pA2ori+RT-, pA2ori-RT-, pA2ori+int+RT- bzw. pA2ori-int+RT- führt.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst B mit dem Insert 1 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pB1ori+ ist das Grundgerüst B mit dem Insert 1 und dem SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pB1ori- ist das Grundgerüst B mit dem Insert 1 ohne den SV40-Replikationsursprung. Zusätzlich können entweder pB1ori+ oder pB1ori- Integrase enthalten, was zu pB1ori+int+ bzw. pB1ori-int+ führt. Die Plasmide pB1ori+, pB1ori-, pB1ori+int+ und pB1ori-int+ können weiter modifiziert werden durch funktionelles Löschen des reversen Transkriptase (RT)-Gens, was zu pB1ori+RT-, pB1ori-RT-, pB1ori+int+RT-bzw. pB1ori-int+RT-führt.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst B mit dem Insert 2 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pB2ori+ ist das Grundgerüst B mit dem Insert 2 und dem SV40-Replikati onsursprung. Das Plasmid pB2ori- ist das Grundgerüst B mit dem Insert 1 ohne den SV40-Replikationsursprung. Zusätzlich können entweder pB2ori+ oder pB2ori- Integrase enthalten, was zu pB2ori+int+ bzw. pB2ori-int+ führt. Die Plasmide pB2ori+, pB2ori-, pB2ori+int+ und pB2ori-int+ können weiter modifiziert werden durch funktionelles Löschen des reversen Transkriptase (RT)-Gens, was zu pB2ori+RT-, pB2ori-RT-, pB2ori+int+RT- bzw. pB2ori-int+RT- führt.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst A minus rev mit dem Insert 3 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pA/r-3ori+ ist das Grundgerüst A mit dem Insert 2 und dem SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pA/r-3ori- ist das Grundgerüst A minus rev mit dem Insert 3 ohne den SV40-Replikationsursprung. Zusätzlich können entweder pA/r-3ori+ oder pA/r-3ori- Integrase enthalten, was zu pA/r-3ori+int+ bzw. pA/r-3ori-int+ führt. Die Plasmide pA/r-3ori+, pA/r-3ori-, pA/r-3ori+int+ und pA/r-3ori-int+ können weiter modifiziert werden durch funktionelles Löschen des reversen Transkriptase (RT)-Gens, was zu pA/r-3ori+RT-, pA/r-3ori-RT-, pA/r-3ori+int+RT- bzw. pA/r-3ori-int+RT- führt.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst C mit dem Insert 1 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pC1ori+ ist das Grundgerüst C mit dem Insert 1 und dem SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pC1ori- ist das Grundgerüst C mit dem Insert 1 ohne den SV40-Replikationsursprung. Zusätzlich können entweder pC1ori+ oder pC1ori- Integrase enthalten, was zu pC1ori+int+ bzw. pC1ori-int+ führt. Die Plasmide pC1ori+, pC1ori-, pC1ori+int+ und pC1ori-int+ können weiter modifiziert werden durch funktionelles Löschen des reversen Transkriptase (RT)-Gens, was zu pC1ori+RT-, pC1ori-RT-, pC1ori+int+RT- bzw. pC1ori-int+RT- führt.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst C mit dem Insert 2 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pC2ori+ ist das Grundgerüst C mit dem Insert 2 und dem SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pC2ori- ist das Grundgerüst C mit dem Insert 2 ohne den SV40-Replikationsursprung. Zusätzlich können entweder pC2ori+ oder pC2ori- Integrase enthalten, was zu pC2ori+int+ bzw. pC2ori-int+ führt. Die Plasmide pC2ori+, pC2ori-, pC2ori+int+ und pC2ori-int+ können weiter modifiziert werden durch funktionelles Löschen des reversen Transkriptase (RT)-Gens, was zu pC2ori+RT-, pC2ori-RT-, pC2ori+int+RT- bzw. pC2ori-int+RT- führt.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst C mit dem Insert 3 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pC3ori+ ist das Grundgerüst C mit dem Insert 3 und dem SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pC3ori- ist das Grundgerüst C mit dem Insert 3 ohne den SV40-Replikationsursprung. Zusätzlich können entweder pC3ori+ oder pC3ori- Integrase enthalten, was zu pC3ori+int+ bzw. pC3ori-int+ führt. Die Plasmide pC3ori+, pC3ori-, pC3ori+int+ und pC3ori-int+ können weiter modifiziert werden durch funktionelles Löschen des reversen Transkriptase (RT)-Gens, was zu pC3ori+RT-, pC3ori-RT-, pC3ori+int+RT- bzw. pC3ori-int+RT- führt.
In einigen Beispielen wird das Grundgerüst D mit dem Insert 4 verwendet. Solche Konstrukte enthalten wahlweise den SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pD4ori+ ist das Grundgerüst D mit dem Insert 4 und dem SV40-Replikationsursprung. Das Plasmid pD4ori- ist das Grundgerüst D mit dem Insert 4 ohne den SV40-Replikationsursprung.
Beispiel 37
In einigen Beispielen wird ein genetischer Impfstoff mit einer einzelnen Expressionseinheit/einem einzelnem Serum bereitgestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das eine Kodiersequenz umfasst, die ein Peptid kodiert, das mindestens ein Epitop aufweist, das identisch oder im wesentlichen ähnlich mit den Epitopen der HIV-Proteine ist. Die Kodiersequenz steht unter der Regulatorkontrolle des direkten CMV-Frühpromotors und des SV40-Nebenpolyadenylierungssignals.
In einigen Beispielen wird der genetische Impfstoff mit einer einzelnen Expressionseinheit/einem einzelnen Serum zur Verfügung gestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das eine Kodiersequenz umfasst, die mindestens ein HIV-Protein oder ein Fragment davon kodiert. Die Kodiersequenz steht unter der Regulatorkontrolle des direkten CMV-Frühpromotors und des SV40-Nebenpolyadenylierungssignals. Das HIV-Protein wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus gag, pol, env und rev besteht.
In einigen Beispielen wird ein genetischer Impfstoff zur Verfügung gestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das eine Kodiersequenz enthält, die mindestens zwei HIV-Proteine oder deren Fragmente kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gag, pol, env und rev oder deren Fragmenten besteht.
In einigen Beispielen wird der genetische Impfstoff zur Verfügung gestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das eine Kodiersequenz enthält, die mindestens drei HIV-Proteine oder deren Fragmente kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gag, pol, env und rev oder Fragmenten davon besteht.
In einigen Beispielen wird der genetische Impfstoff zur Verfügung bereitge stellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das eine Kodiersequenz enthält, die gag, pol, env und rev oder deren Fragmente kodiert.
In einigen Beispielen wird der genetische Impfstoff mit einer doppelten Ex pressionseinheit/einem einzelnen Serum zur Verfügung gestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das zwei Expressionseinheiten enthält, die jeweils eine Kodiersequenz umfassen, die ein Peptid kodiert, das mindestens ein Epitop hat, welches identisch oder im wesentlichen ähnlich mit den Epitopen der HIV-Proteine ist. Die Kodiersequenz steht unter der Regulatorkontrolle des direkten CMV-Frühpromotors und des SV40-Neben-Polyadenylierungssignals. Die beiden Expressionseinheiten werden in entgegengesetzten Richtungen voneinander kodiert.
In einigen Beispielen wird ein genetischer Impfstoff mit doppelter Expressi onseinheit/einem einzelnem Serum zur Verfügung gestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das zwei Expressionseinheiten umfasst, die jeweils eine Kodiersequenz enthalten, die mindestens ein HIV-Protein oder ein Fragment davon kodieren. Jede Expressionseinheit umfasst eine Kodiersequenz, die unter der Regulatorkontrolle des direkten CMV-Frühpromotors und des SV40-Nebenpolyadenylierungssignals steht. Das HIV-Protein wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus gag, pol, env und rev besteht.
In einigen Beispielen wird der genetische Impfstoff bereitgestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das zwei Expressionseinheiten enthält, wobei mindestens eine davon eine Kodierung umfasst, die mindestens zwei HIV-Proteine oder Fragmente davon kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gag, pol, env und rev oder Fragmenten davon besteht, und wobei die andere mindestens ein HIV-Protein oder Fragmente davon umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gag, pol, env und rev oder Fragmenten davon besteht.
In einigen Beispielen wird der genetische Impfstoff zur Verfügung gestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das zwei Expressionseinheiten enthält, wobei mindestens eine davon eine Kodiersequenz umfasst, die mindestens drei HIV-Proteine oder ein Fragment davon kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gag, pol, env und rev oder Fragmenten davon besteht, und wobei die andere mindestens ein HIV-Protein oder Fragmente davon umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gag, pol, env und rev oder Fragmenten davon besteht.
In einigen Beispielen wird der genetische Impfstoff zur Verfügung gestellt, der ein genetisches Konstrukt umfasst, das zwei Expressionseinheiten umfasst und eine Kodiersequenz enthält, die gag, pol, env und rev oder Fragmente davon kodiert.
Beispiel 38
Ein genetisches Konstrukt, Plasmid pCMN160Δ16, wurde für die Verwendung in einem pharmazeutischen Anti-HIV-Kit oder einer pharmazeutischen Anti-HIV-Zusammensetzung hergestellt. pCMN160Δ16 wurde folgendermaßen hergestellt:
Schritt 1: Primer SEQ.-ID.-NR.: 31 und SEQ.-ID.-NR.: 30 wurden als PCR-Fragment aus HIV/MN-Genom-DNA verwendet.
Schritt 2: Primer SEQ.-ID.-NR.: 29 und SEQ.-ID.-NR.: 32 wurden als PCR-Fragment aus HIV/MN-Genom-DNA verwendet.
Schritt 3: Primer SEQ.-ID.-NR.: 31 und SEQ.-ID.-NR.: 32 wurden mit 2 μl Reaktionsmaterial aus den Schritten 1 und 2 kombiniert.
Schritt 4: Das Reaktionsprodukt aus Schritt 3 wurde mit NotI und MluI gespalten und in das Grundgerüst A eingefügt, das in Beispiel 36 beschrieben wurde, und mit NotI und MluI gespalten wurde.
Das Plasmid pCMN160Δ16 wird so gebildet, das als Insert in das Grundgerüst A eine Kodierregion enthält, die das MN-Stamm-Env-Protein mit der rev-Region und der Hälfte von nef mit Veränderung der HLA-DB-Region zu HIV-2 kodiert.
Beispiel 39
Das Plasmid pGAGPOL.rev2 wurde folgendermaßen hergestellt. Zuerst wurde das Grundgerüst hergestellt. Anschließend wurde ein Insert mit HIV gag und pol erzeugt und in das Gerüst eingefügt. Das Grundgerüst wurde wie folgt, hergestellt. Schritt 1. Digestion von pMAMneo (Clonetech) mit Bgl1. Ergänzen mit Klenow-Fragment der Polymerase I. Spalten mit HindIII-Gel, gereinigtem 1763bp-Fragment.
Schritt 2. Amplifiziertes Kan^R-Gen aus Plasmid pJ4Ωkan (Kanamycin-Resistenzgen, erhältlich von Pharmacia Inc.) in pJ4Ω geklont, das als Geschenk von Imperial Cancer Research Fund UK erhältlich war; pJ4Ω wurde am Anfang konstruiert und von Morgenstern, J.P., und H. Land, Nucl. Acids Res., 18(4):1068, beschrieben, mit Oligos SEQ.-ID.-NR.: 33 und SEQ.-ID.-NR.: 34. Abgestumpftes PCR-Produkt, gespalten mit HindIII. Gelgereinigtes PCR.
Schritt 3. Ligieren des Vektorgrundgerüsts, erzeugt aus pMAMneo und beschrieben in Schritt Nr. 1, mit dem PCR-Produkt, das das Kan^R-Gen kodiert und in Schritt Nr. 2 beschrieben ist. Isolierung des Plasmids, das das Kan^R-Gen, und den bakteriellen Replikationsursprung enthält.
Schritt 4. Digestieren des erhaltenen Plasmids mit MluI, Ergänzen mit Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I. Ligieren mit SacII-Linker (New England Biolabs).
Schritt 5. Digestieren des Plasmids, das in Schritt 4 erhalten wurde mit AseI und SspI.
Schritt 6. PCR wird eines Teils des Kan^R-Gens aus dem Plasmid, das in Schritt 3 beschrieben wurde, unter Verwendung der Primer SEQ.-ID.-NR.: 35 und SEQ.-ID.-NR.: 36. Spalten des PCR-Produkts mit SspI und AseI.
Schritt 7. Ligieren des größten Fragments, das in Schritt 5 erhalten wurde, mit dem PCR-Produkt, das in Schritt 6 erhalten wurde.
Schritt 8. Spalten des Ligationsprodukts/Plasmids, das in Schritt 7 erhalten wurde, mit HindIII. Abstumpfen mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I.
Schritt 9. Spalten von pCEP4 (Invitrogen) mit SalI, um ein DNA-Fragment freizusetzen, das den CMV-Promotor, den Polylinker und die SV40-Poly(A)-Stelle enthält. Reinigen dieses Fragments und Abstumpfen mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I.
Schritt 10. Verknüpfen des Plasmids, das in Schritt 8 erhalten wurde und des Fragments, das in Schritt 9 erhalten wurde. Isolieren des Plasmids, das den bakteriellen Replikationsursprung, das Kan^R-Gen, den RSV-Verstärker, den CMV-Promotor, den Polylinker und die SV40-Poly(A)-Stelle enthält.
Schritt 11. Schneiden des Plasmids, das in Schritt 10 mit BamHI und NheI erhalten wurde.
Schritt 12. Annealing der Oligonukleotide SEQ.-ID.-NR.: 37 und SEQ.-ID.-NR.: 38.
Schritt 13. Ligieren des Plasmids, das in Schritt 10 erhalten wurde, mit den vereinigten Oligonukleotiden, die in Schritt 12 erhalten wurden. Isolieren des adapterhaltigen Plasmids, das in Schritt 12 erhalten wurde.
Schritt 14. Digestieren des Plasmids, das in Schritt 13 erhalten wurde, mit SalI und MluI.
Schritt 15. PCR-Amplifikation des geöffneten rev-Leserasters unter Verwendung von BBG35 (RD Systems Inc., Minneapolis, MN; welches die Kodierregion für rev aus dem HIV-Stamm HX3B in pUC19 enthält) als Templat und den Primern SEQ.-ID.-NR.: 39 und SEQ.-ID.-NR.: 40. Digestieren des PCR-Produkts mit SalI und MluI.
Schritt 16. Ligieren des Plasmids, das in Schritt 14 erhalten wurde, mit dem PCR-Produkt, das in Schritt 15 hergestellt wurde. Isolieren des Plasmids, das die rev-Kodierregion enthält. Herstellung von gag/pol-Insert.
Schritt 1. Ein Subklon eines Teils des HIV-1-(HXB2)-Genoms, das im Bluescript (Stratagene) kloniert wurde. Der Subklon von HIV-1 enthält das vollständige 5' LTR und den Rest des HIV-1-Genoms zum Nukleotid 5795 (Genbank-Nummerierung), kloniert in die Xbal und SalI-Stellen von Bluescript. Die HIV-1-Sequenzen werden aus dem HXB2D-Plasmid (AIDS Repository) erhalten.
Schritt 2. PCR-Teilung der gag-Kodierregion aus dem offenen Leseraster des Plasmids, das in Schritt 1 beschrieben wurde (der Subklon des Teils des HIV-1-HXB2-Genoms, der in Bluescript kloniert wurde) unter Verwendung der Primer SEQ.-ID.-NR.: 41 und SEQ.-ID.-NR.: 42.
Schritt 3. Digestieren des Plasmids, das in Schritt 1 beschrieben wurde (der Subklon des Teils des HIV-1-(HXB2)-Genoms, der in Bluescript kloniert wurde), mit EcoRI. Reinigen des Plasmids, das das pBluescript-Grundgerüst, das 5' HIV-1 LTR, die gag-Kodierregion und den Teil der pol-Kodierregion enthält und Religieren.
Schritt 4. Schneiden des Plasmids, das in Schritt 3 erhalten wurde, mit NotI und SpeI und Ligieren mit dem PCR-Fragment, das in Schritt 2 beschrieben wurde, nachdem es mit NotI und SpeI digestiert wurde. Isolieren des Plasmids, das das PCR-Fragment, anstelle des ursprünglichen NotI/SpeI-Fragments enthält, das das 5' HIV-1 LTR enthält.
Schritt 5. Digestieren des Plasmids, das in Schritt 4 erhalten wurde, mit EcoRI und SalI.
Schritt 6: Annealing der Oligonukleotide SEQ.-ID.-NR.: 43 und SEQ.-ID.-NR.: 44.
Schritt 7. Ligieren des Plasmids, das in Schritt 5 erhalten wurde, mit dem Adapter, der in Schritt 6 erhalten wurde. Isolieren des adapterhaltigen Plasmids, das in die EcoRI/SalI-Stellen kloniert wurde.
Schritt 8. Digestieren des Plasmids, das in Schritt 7 erhalten wurde, mit NdeI und EcoRI.
Schritt 9. PCR-Amplifikation des rev-Response-Elements (RRE) aus einem Plasmid, das die RRE-Sequenz, aus dem HIV-1-Stamm HXB2 enthält, unter Verwendung der Primer SEQ.-ID.-NR.: 45 und SEQ.-ID.-NR.: 46. Digestieren des PCR-Produkts mit NdeI und EcoRI.
Schritt 10. Ligieren des Plasmids, das im Schritt 8 erhalten wurde, mit dem PCR-Produkt, das in Schritt 9 erhalten wurde. Isolieren des Plasmids, das das Insert mit der RRE-Sequenz enthält.
Schritt 11. Digestieren des Plasmids, das in Schritt 10 erhalten wurde, mit NotI und SalI und Isolieren des Fragments, das die gag-Kodierregion, die modifizierte pol-Kodierregion und die RRE-Sequenz enthält.
Schritt 12. Digestieren des Plasmids, das in Schritt 16 des Protokolls zur Herstellung des Grundgerüsts, das oben beschrieben ist, erhalten wurde, mit NotI und SalI.
Schritt 13. Ligieren des Plasmids, das in Schritt 12 erhalten wurde, mit dem Insert, das in Schritt 11 erhalten wurde. Isolieren der Plasmide, die das Insert enthalten, das die gag-Kodierregion, die modifizierte pol-Kodierregion und die RRE-Sequenz enthält.
Schritt 14. Ligieren des Plasmids, das in Schritt 13 erhalten wurde, mit Xbal und Nhel, Abstumpfen der Enden und Religieren. Isolieren des Plasmids, dem die KpnI-Stelle fehlt, die zwischen der XbaI- und NheI-Stelle im Plasmid vorhanden sind, das in Schritt 13 erhalten wurde.
Schritt 15. Digestieren des Plasmids, das in Schritt 14 erhalten wurde, mit KpnI, und Isolieren des größten Fragments.
Schritt 16. Annealing der Oligonukleotide SEQ.-ID.-NR.: 47 und SEQ.-ID.-NR.: 48.
Schritt 17. Ligieren des gereinigten Plasmidfragments, das in Schritt 15 erhalten wurde, mit dem Adapter, der in Schritt 16 erhalten wurde. Isolieren des Plasmids, das den Adapter enthält, insertiert an der KpnI-Stelle des Plasmids, das in Schritt 15 erhalten wurde.
Beispiel 40 Genetische Immunisierung mit Genen für Regulatorproteine
Ein Teil der Schwierigkeiten bei der Bekämpfung von HIV ergibt sich aus der außerordentlichen Variabilität des Virus und seiner Fähigkeit, schnell in neue Formen zu mutieren. Es gibt nicht nur eine beträchtliche Proteinsequenzvariation unter den HIV-Isolaten, die in der menschlichen Population als Ganzes gefunden werden, sondern der Virus mutiert so schnell, dass jede HIV-infizierte Person tatsächlich eine Anzahl verwandter HIV-Mikrovarianten beherbergt. Solche HIV-Isolate zeigen Unterschiede in ihrer Replikationseffizienz, Tropismus, Empfänglichkeit gegenüber Neutralisation und Medikamentenresistenz. In dem Maße, in dem medikamentenresistente Mutanten auftreten, schwindet die Wirksamkeit der Medikamentenbehandlung. Bei AZT entwickelt sich normalerweise im ersten Jahr der Behandlung Medikamentenresistenz. Diese konstante Generation von nicht fassbaren Mutanten spielt teilweise eine Rolle bei der Fähigkeit von HIV, die Abwehr der Wirtszelle nach einem langen Zeitraum, in dem der Virus anscheinend unter Kontrolle gehalten wird, schließlich zu überwältigen.
Von dieser Mutantenverschiebung wurde in verschiedenen Regionen des umhüllten gp120-Glykoproteins berichtet, einschließlich der Hauptneutralisierungsdomäne, der V3-Schleife, und auch in den HIV-Kernproteinen. HIV-Regulatorproteine sind höher konserviert als die Strukturproteine und zeigen auch weniger Mutationsverschiebung mit der Zeit. Die Regulatorproteine sind somit attraktive Ziele für antivirale Attacken.
HIV zeigt eine bemerkenswerte temporale Regulierung der Expression der Regulatorproteine gegenüber den Strukturproteinen. In der frühen Phase der viralen Replikation dominieren mRNAs, die die Regulatorproteine Tat , rev und nef kodieren, wohingegen es in der späteren Phase eine höhere Expression der mRNAs vorliegt, die die Strukturproteine, einschließlich Gag-, Pol- und Env-Vor läufer, und viele Nebenproteine kodieren. Diese Verschiebung von der frühen zur späten Phase wird ausgelöst, wenn das Rev-Protein einen bestimmten Level erreicht. Die Vorherrschaft von Tat, Rev und Nef im frühen viralen Replikationszyklus macht diese Proteine zu favorisierten Target-Proteinen für einen antiviralen Angriff. Dies gilt insbesondere für tat und rev, die absolut essentielle Rollen bei der transkriptionellen und post-translationellen Regulation der HIV-Genexpression spielen und frühzeitig im viralen Replikationszyklus vor der Transkription von viralen Strukturproteine und Produktion von infektiösen viralen Partikel vorherrschend sind.
Im Gegensatz zu tat und rev, welche ganz offensichtlich essentielle Rollen in der HIV-Replikation spielen, werden andere Regulatorproteine, wie beispielsweise nef, vpr, vif und vpu, manchmal als "Nebenproteine" bezeichnet. Ihre Funktionen sind weniger gut verstanden, und das Ausmaß, in dem die virale Replikation durch Verlust einer speziellen Funktion abgeschwächt wird, variiert beträchtlich und kann von der Wirtszelle, die infiziert ist, abhängig sein. Die hohe Konservierbarkeit solcher Funktionen unter den weit verbreiteten HIV-Isolaten sowie andere Primaten-Immundefizienzviren legt die Bedeutung dieser "Neben" Funktionen im natürlichen Infektionsprozess nahe. (Siehe allgemein Terwilliger, E.F., (1992) AIDS Research Reviews, 2:3-27, W.C., Koff, F. Wong-Staal, und R.C. Kennedy, Herausg. (New York: Marcel Dekker, Inc.). Tatsächlich sind rekombinante Primatenviren, bei denen entweder vpr, nef oder vif gelöscht sind, nicht in vivo pathogen, was weiterhin die Bedeutung dieser Nebengene im Lebenszyklus des Virus zeigt.
Es gibt Hinweise darauf, dass stärkere und besser schützende Immunreaktionen gegen HIV erreicht werden können durch Anbieten ein weniger Regulator- und/oder Enzymproteine anstelle des gesamten Komplements von HIV-Genen. Demgemäß kann eine fokussierte Immunisierungsstrategie wünschenswerter sein, die eine genetische Immunisierung unter Verwendung von Kodiersequenzen für ein oder mehrere regulierende, nicht-strukturelle HIV-Proteine, einschließlich tat, rev, vpr, nef, vpu oder vif enthalten. Nur bei vpr wurde festgestellt, dass es mit Viruspartikeln assoziiert ist, wohingegen andere Regulatorproteine, einschließlich, tat, rev, nef, vif und vpu, nicht mit dem Viruspartikeln assoziiert sind.
In einigen Beispielen der genetischen Immunisierung gegen HIV unter Ver wendung von Regulatorgenen werden ein oder mehrere der tat-, rev-, nef-, vif- und vpu-Gene in das Grundgerüst A eingefügt, das in Beispiel 37 beschrieben ist. Es ist bevorzugt, dass tat und/oder rev verwendet werden. In einigen Beispielen werden tat oder rev in das Grundgerüst A, das in Beispiel 37 beschrieben ist, eingefügt. In einigen Beispielen sind mit abnehmender Tendenz als Target dann nef, vpr, vif und vpu wünschenswert. Mehr als ein Regulatorgen kann verwendet werden, einschließlich tat und rev; tat, rev und nef; tat, rev, nef und vpr, tat, rev, nef, vpr und vif; tat, rev, nef, vpr-, vif und vpu; sowie deren Kombinationen; und wahlweise zusätzliche Regulatorgene, wie beispielsweise tev.
Das Tat-Protein ist ein Transaktivator von auf LTR gerichteter Genexpres sion. Es ist absolut essentiell für die HIV-Replikation. Tat wird früh im viralen Replikationszyklus produziert, und funktionelles Tat ist für die Expression von Gag, Pol, Env und Vpr erforderlich. Die vorherrschende Form von Tat ist ein 86-Aminosäureprotein, das aus zwei exon-mRNAs abstammt. Die aminoterminalen 58 Aminosäuren sind ausreichend für die Transaktivierung, wenn auch mit reduzierter Aktivität. Tat wirkt auf eine cis-agierende Sequenz, die tar genannt wird, wodurch es einen dramatischen Anstieg in der LTR-angetriebenen Genexpression erzeugt. Tat kann teilweise durch erhöhte RNA-Synthese und teilweise durch Erhöhen der Menge an Protein, das pro RNA-Transkript synthetisiert wird, wirken. Bis vor kurzem wurde angenommen, dass Tat nur auf HIV-1-LTR wirkt. Es wurde jedoch auch über die Tat-aktivierte Expression aus dem JC-Virus-Spätpromotor berichtet. Tat kann auch die Zellproliferation als exogenen Faktor stimulieren und eine Nebenrolle bei der Wachstumsförderung des Kaposi-Sarkoms in HIV-infizierten Personen spielen. Aufgrund solcher potentiell nachteiliger Wirkungen sowohl in HIV-infizierten als auch in nicht-infizierten Personen werden bevorzugt verwendete tat-Konstrukte für die genetische Immunisierung modifiziert, um nur das nicht-funktionelle Tat zu exprimieren. Mutationen, die in der Lage sind, Tat oder Rev zu inaktivieren, können zusätzlich als transdominante Mutationen wirken, wodurch jedes funktionelle Tat, das in einer HIV-infizierten Person gebildet wird, potentiell inaktiviert wird.
Rev ist ein zweites Regulatorprotein von HIV, das für die virale Replikation essentiell ist. Es ist ein 19 kD(116 Aminosäuren)-Protein, das aus zwei Kodier-Exons exprimiert wird, die in einer Vielzahl von mehrfach gespleißten mRNAs gefunden wurden. Zwei verschiedene Domänen wurden identifiziert, eine Basisregion, die an der Bindung an RRE(rev-Response-Element)-haltige Transkripte, beteiligt ist, und eine "Aktivierungs"-Domäne, die Kernexporte solcher Transkripte als Ergebnis der Bindung induziert. Im Verlauf der natürlichen viralen Infektion wird Rev für die Expression der HIV-Strukturproteine Gag, Pol und Env sowie Vpr benötigt.
Vpr ist ein 15 kD-Protein (96 Aminosäuren) in den meisten HIV-1-Stämmen, obgleich das offene Leseraster von Vpr in vielen viralen Stämmen stark gekürzt ist, die oft die Zellkulturen durchlaufen. Das offene vpr-Leseraster ist auch in den HIV-2- und den meisten SIV-Isolaten vorhanden. Vpr ist das erste retrovirale Regulatorprotein, bei dem festgestellt wurde, dass es mit HIV-viralen Partikeln assoziiert ist. Seine Gegenwart im NIV-Viruspartikel lässt annehmen, dass es eine Funktion an einem sehr frühen Punkt im viralen Replikationszyklus einnimmt. Vpr beschleunigt die HIV-Replikation, insbesondere früh in der Infektion. Vpr erhöht den Grad der Expression der Reportergene, die an das HIV LTR gebunden sind, um etwa das Dreifache. Darüber hinaus scheinen Vpr und Tat synergistisch im Hinblick auf LTR-gebundene Gene zu wirken. Vpr kann aus dem Serum von HIV-infizierten Personen isoliert werden und scheint die Fähigkeit des Virus zu erhöhen, neue Zellen zu infizieren. Es wurde auch festgestellt, das Vpr die Zellproliferationen inhibiert und Zelldifferenzierungen induziert (Levy, D.N., et al., Cell (1993), 72:1-20), ein Befund, der im Hinblick auf Berichte signifikant sein kann, dass primäre Monozyten/Makrophagen in vitro nur infizierbar sind, während sie Differenzierungen eingehen (Schuitemaker, N., et al. (1992), J. Clin. Invest., 89:1154-1160. Selbst Zellen, die unfähig sind, die HIV-Replikation zu unterstützen, können durch die Wirkungen von Vpr disreguliert werden. Beispielsweise kann Vpr für den Muskelschwund, der häufig in AIDS-Patienten beobachtet wird, verantwortlich sein. Aufgrund der potentiell schädlichen Wirkung von Vpr sollte die genetische Immunisierung vorzugsweise mit einem modifizierten vpr-Konstrukt durchgeführt werden, welches ein nichtfunktionelles Vpr-Protein exprimiert.
Nef (in der älteren Literatur auch als 3' orf bezeichnet) ist ein 25-27 kD-Protein. Es wurde vorgeschlagen, dass Nef in der Strangabwärtsregulierung von CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sein könnte. Zusätzlich kann Nef eine Rolle bei der Zellsignalisierung spielen. Nef scheint für die Etablierung einer HIV-Infektion in vivo wichtig zu sein. Man nimmt an, dass nef-spezifische CTLs wichtig sind bei der Kontrolle von HIV-Infektion in vivo.
Vif ist ein 23 kD-Zytoplasmaprotein, das als "viraler Infektiositätsfaktor" bezeichnet wird. Obgleich Vif-defektive Mutantenviren im Hinblick auf Zell-zu-Zell-Übertragung nicht beeinträchtigt sind, zeigen sie eine starke Verringerung der Fähigkeit, viele CD4+-Zelllinien zu infizieren. Ohne Vif gibt es ein verringertes Sprossen des Virus und eine verringerte Infektiosität. In Primatenuntersuchungen zeigen Vif-Löschungsmutanten eine stark verringerte Fähigkeit, eine Infektion in vivo zu etablieren. Diese Untersuchungen unterstützen eine klinische Rolle von Vif bei der Virusreplikation im Wirt.
Vpu ist ein 15-20 kD (81 Aminosäuren)-Protein. Obgleich Vpu(+)- und Vpu(-) -Viren die gleiche Menge an viralem Protein produzieren, zeigt letzteres eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von Virusproteinen, zusammen mit verringertem extrazellulärem Virus. Dies legt nahe, dass Vpu bei der Konstruktion und/oder Freisetzung von viralen Partikeln beteiligt sein kann.
Einfachen Retroviren, wie beispielsweise Ratten- und Vogelviren, fehlen Proteine, die den HIV-1-, HIV-2- und SIV-Regulatorproteinen analog sind. In solchen Tieren neigt die retrovirale Infektion dazu, selbstbegrenzend zu sein, bei Verschwinden des Virus und verringerter Pathogenität. In ähnlicher Weise wird HTLV-1, das nur Tax (welches sehr ähnlich wie Tat wirkt und auch eine vpr ähnliche Aktivität zeigt) und Rex (welches sehr ähnlich wie Rev wirkt) enthält, in vielen Personen abgebaut. Man nimmt an, dass genetische Immunisierung mit Regulatorgenen nicht nur für HIV relevant ist, sondern auch für Viren, wie beispielsweise HBV (X-Genprodukt) und HCV, sowie HLTV-1 (Tax) und (Rex). Man nimmt an, dass in all diesen Viren die Regulatorgene eine kritische Rolle im Lebenszyklus des Virus und bei der Etablierung einer Infektion spielen.
Beispiel 41 Konstruktion des HIV-1-Regulatorplasmids, pREG
Das pREG-Plasmid wird schrittweise konstruiert, und jedes Intermediat kann auf Proteinexpression getestet werden, bevor mit der Konstruktion weitergemacht wird. Ein Expressionsvektor, der die Expression von Tat und Rev unterstützt, wird in zwei Schritten konstruiert. Zuerst wird ein Amplifikationsprodukt, das eine 5' Nhel-Stelle, die hauptsächliche HIV-1-Spleiß-Donorstelle, die Hauptmenge der tat-Kodierregion, die Region, die die aminoterminale Region des rev-Proteins ko diert, und eine AvaII-Stelle enthält, aus einem synthetischen Templat amplifiziert. Dieses synthetische Templat wird erzeugt unter Verwendung der veröffentlichten Sequenzen des HXB2-Stamm von HIV-1, erhalten aus der GenBank Database, und wird so verändert, dass die Cysteinreste in den Positionen 22 und 30 des tat-Proteins mutiert werden. Es wurde gezeigt, dass diese Mutationen das tat nichtfunktionell machen (Kuppuswamy, et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17(9):3551-3561).
Das PCR-Produkt wird in einen Vektor ligiert, der mit NheI und AvaII digestiert wird, und ein Kanamycin-Resistenzgen und einen pBR322-Replikationsursprung enthält. Zusätzlich enthält dieses Plasmid einen Zytomegalovirus-Promotor, einen Rous Sarkom-Virus-Verstärker, die rev-kodierende Region und ein SV40-Polyadenylierungssignal. Die rev-Sequenz, die im Plasmid vorliegt, stammt vom proviralen Klon von HIV-1 III_B ab. Dies erzeugt einen Expressionsvektor, der eine komplette, aber mutierte tat-Kodierregion und eine komplette rev-Kodierregion enthält.
Der nachfolgende Schritt wird durchgeführt, um ein PCR-Produkt zu erzeugen, das eine AvaII-Stelle an seinem 5'-Ende, eine Mutation an der Aminosäureposition 81 von rev, ungefähr 30% der rev-Kodierregion, ungefähr 30% der nef-Kodierregion und eine MluI-Stelle am 3'-Ende enthält. Es wurde gezeigt, dass die Aminosäureänderung in Position 81 die rev-Funktion eliminiert, und dass somit das erhaltene Plasmid zur Produktion von nicht-funktionellem rev-Protein führt (Bogard, H, und Greene, W.C. (1993), J. Virol., 67(5):2496-2502). Man nimmt an, dass die hauptsächliche Löschung der nef-Kodierregion zur Produktion eines nicht-funktionellen nef-Proteins führt. Die 5'-AvaII-Stelle und die Mutation in der Aminosäureposition 81 des rev-Proteins werden am 5'-PCR-Primer eingeführt, der zur Kodierregion von rev, die sowohl die AvaII-Stelle und die nukleotidkodierende Aminosäure 81 enthält, komplementär ist. Durch den 3'-PCR-Primer wird ein Stopcodon, der die Terminierung von rev an der Aminosäureposition 63 bewirkt, und die 3'-kodierende Klonierungsstelle MluI eingeführt. Das Templat für diese PCR-Amplifikation ist ein Plasmid oder ein synthetisches Templat, das die rev- und nef-Kodierregionen aus dem MN-Strang von HIV-1 enthält. Das erhaltene PCR-Produkt wird mit AvaII und MluI digestiert und verwendet, um das kleinere AvaII-MluI-Fragment zu ersetzen, das nach Digestion des tat-rev-Plasmids, wie im vorangehenden Absatz beschrieben, mit AvaII und MluI erhalten wurde.
An einer von zwei Stellen kann wahlweise vpr zu diesem Plasmid zugefügt werden. In einem Ansatz kann vpr unter Verwendung eines 5'-PCR-Primers amplifiziert werden, der eine MluI-Stelle strangaufwärts von den Sequenzen enthält, die vom vpr-Translations-Startcodon und einem 3'-PCR-Primer, der zum vpr-Stopcodon komplementär ist, und Sequenzen reichen, die diesen flankieren und auch eine MluI-Klonierungsstelle enthalten. Sequenzen strangaufwärts vom Startcodon enthalten einen Spleißakzeptor. Das PCR-Produkt kann mit MluI digestiert und nach seiner Digestion mit MluI in das oben beschriebene tat-, rev-, nef-Plasmid insertiert werden.
Alternativ kann die vpr-Amplifikation auf analoge Weise durchgeführt werden, wobei jedoch die PCR-Primer Restriktionsstellen enthalten, die mit dem Klonieren in einen anderen Vektor kompatibel sind, so dass er unter der Kontrolle eines zweiten eukaryotischen Promotors exprimiert wird. Die Kassette, die von diesem Plasmid abstammt und den zweiten Promotor, gefolgt von der vpr Kodierregion, gefolgt von der Poly(A)-Sequenz, enthält, kann durch Digestion mit Restriktionsenzymen, die die Kassette flankieren, aber nicht darin schneiden, freigesetzt werden. Das resultierende DNA-Fragment würde in eine einzelne Stelle des tat-, rev-, vpr-Plasmids kloniert, die außerhalb der Region liegt, die für die Expression von tat, rev, vpr notwendig ist. Auf diese Weise wird ein Plasmid mit zwei Expressionseinheiten gebildet.
Beispiel 42 Konstruktion von HCV- und HTLV-1-Plasmiden
Ein ähnlicher Ansatz kann angewendet werden, um ein Plasmid zu erzeugen, das HTLV-1- oder HCV-kodierte Proteine mit enzymatischen Funktionen exprimiert, die für den viralen Lebenszyklus und/oder für die Regulatorproteine dieser Viren erforderlich sind. Bei HTLV-1 wird ein Plasmid, das das Regulatorprotein Tax kodiert, unter Verwendung eines Plasmidgrundgerüsts und einer Klonierungsstrategie, die den oben beschriebenen vergleichbar ist, erzeugt. Solche HCV-Gene, die enzymatische Proteine kodieren, umfassen die RNA-abhängige RNA-Polymerase, ein Protein mit Helicase/Protease-Funktion. Die erforderlichen Sequenzen sind veröffentlicht und von GenBank erhältlich. Die virale Organisation von HTLV-1 und HCV ist veröffentlicht bei Cann, A.J., und Chen, I.S.Y., Virology, 2. Auflage, herausgegeben von B.N. Fiddr, Raven Press, Ltd., New York, 1990, und Bradley, D.W., Transfusion Medicine Reviews, 1(2):93-102, 1992.
Beispiel 43 Genetische Immunisierung mit enzymatischen Genen
Genetische Immunisierung mit Genen, die Proteine mit enzymatischen Funktionen kodieren, wie beispielsweise das HIV pol-Gen, kann auch eine wichtige antivirale Strategie sein, da Enzyme wie Pol für die Erzeugung lebender Viren erforderlich sind. Ohne Polymerase oder irgendeine ihrer Komponentenfunktionen ist HIV nicht-pathogen und nicht-infektiös. In gleicher Weise sind die enzymatischen Gene anderer Viren, wie beispielsweise die HBV-Polymerase, attraktive Targets für eine genetische Immunisierung. Siehe beispielsweise Radziwill, et al., Mutational Analysis of the Hepatitis B Virus P Gene Product: Domain Structure and RNase H Activity, J. Virol., 64 (2): 613-620 (1990).
Ein Grund für die Attraktivität viraler Enzyme als immunologisches Target ist die begrenzte Fähigkeit solcher Enzyme, ihre Aminosäuresequenz zu mutieren und dennoch ihre enzymatischen Funktionen beizubehalten. Bei HIV-1 zeigt beispielsweise Pol eine begrenzte Anzahl von "Ausweich"-Mutationen, die im Zusammenhang stehen mit Resistenz gegen Nukleotidanaloge, wie beispielsweise AZT. Die große Mehrheit der immunologischen Targets im Protein bleibt jedoch auch in den Medikamenten-Ausweichmutanten erhalten.
Beispiel 44 Konstruktion eines HBV-Polymerase-Plasmids
Experimente, die in der Literatur veröffentlicht sind, zeigen, dass HBV-Polymerase-Expression in Gewebekulturzellen erzielt wurde, wenn sowohl die Kernals auch Polymerase-offenen Leseraster in einem mRNA-Molekül vorhanden sind.
Es wurde auch gezeigt, dass in dieser Situation die Mutation der Kern-ATG die Polymerase-Expression nicht beeinflusste.
Das HBV-Genom wird aus einem Plasmid amplifiziert, das ein Kopf-Schwanz-Dimer des ADW HBV-Stamms enthält. Da nur die Expression von Polymerase und nicht des Kerns erwünscht ist, wird der 5'-PCR-Primer so konstruiert, dass er die Vorkern- und Kern-Translations-Startcodons mutiert. Darüber hinaus führt dieser Primer auch eine Mutanten-DR1-Sequenz ein, um die Möglichkeit der Regeneration einer Replikations-kompetenten HBV-Genom-RNA auszuschließen. Dieses PCR-Produkt wird in ein Plasmid eingebracht, das ein Kanamycin-Resistenzgen und einen pBR322-Replikationsursprung enthält. Weiterhin enthält dieses Plasmid einen Zytomegalovirus-Promotor, einen Rous Sarkom-Virus-Ver stärker und ein SV40-Polyadenylierungssignal. Die Translations-Startcodons für das Oberflächenantigen und das Produkt der X-Kodierregion werden mutiert, um die Expression der HBS- und X-Genprodukte zu verhindern.
Gemäß einem anderen Ansatz zum Erzielen von Expression der HBV-Polymerase wird ein PCR-Produkt, das die gesamte Polymerase-Kodierregion kodiert, amplifiziert und in einen Vektor, der ein Kanamycin-Resistenzgen und einen pBR322-Replikationsursprung enthält, kloniert. Zusätzlich enthält dieses Plasmid einen Zytomegalovirus-Promotor, einen Rous Sarkom-Virus-Verstärker und ein SV40-Polyadenylierungssignal. Der 5'-PCR-Primer für diese Amplifikation enthält eine Klonierungsstelle und umspannt den Translations-Startcodon des Polymerase-Gens. Das 3'-PCR-Produkt enthält eine Restriktionsstelle zum Klonieren des Inserts in den Expressionsvektor und ist auch komplementär zum traditionellen Stopcodon des HBV-Polymerase-Gens und den Sequenzen, die diesen Stopcodon flankieren. Nach Ligieren dieses PCR-Produkts in ein Plasmid, das das Kanamycin-Resistenzgen, einen pBR322-Replikationsursprung, einen Zytomegalovirus-Promotor, einen Rous Sarkom-Virus-Verstärker und ein SV40-Polyadenylierungssignal enthält, werden die Translations-Startcodons für das Hepatitis B-Oberflächenantigen und die X-Gene mutiert, um die Expression dieser Genprodukte zu verhindern. Eine alternative Strategie, die der oben beschriebenen vergleichbar ist, wird verwendet, wobei jedoch der 3'-PCR-Primer in diesem Fall das HBV-Poly(A)-Signal und Sequenzen enthält, die dieses Signal flankieren. Dieser 3'-Primer wird in dem Fall verwendet, wo Sequenzen für die Expression wichtig sind, die das HBV-Poly(A)-Signal umfassen und/oder umgeben. Eine Mutationsanalyse zeigte, dass die Funktion des HBV-Polymerase-Genprodukts durch spezielle Nukleotidveränderungen eliminiert werden kann (Radziwell, G., et al. (1990), J. Virol., 64(2):613-620). Vor der Verwendung eines wie oben beschrieben konstruierten Plasmids kann die exprimierte Polymerase durch Einführen einer dieser Mutationen oder anderen, die analog sind, mutiert werden.
Beispiel 45
Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) zeigt stimulierende Wirkungen auf eine Vielzahl von Zelllinien, einschließlich Neutrophilen, Monozyt/Makrophagen und Eosinophilen. Die Wirkungen von GM-CSF machen es zu einem attraktiven therapeutischen Modell. GM-CSF wurde von der FDA zur Verwendung bei der autologen Knochenmarktransplantation genehmigt, und es wurde mit klinischen Versuchen begonnen, um die Wirksamkeit bei der Behandlung verschiedener Neutropenien zu testen. Gegenwärtig wird GM-CSF als ein Protein verabreicht, bei dem es normalerweise erforderlich ist, dass es in mehrfachen Dosen verabreicht wird. Die Proteine müssen hergestellt und gereinigt werden.
Ein alternativer Ansatz zur Verwendung von GM-CSF-Protein ist die direkte Verabreichung eines Genkonstrukts, das ein Gen enthält, das GM-CSF enthält, zusammen mit der Verabreichung von ... Das Genkonstrukt wird durch PCR eines GM-CSF-Gens, das eine Signalsequenz umfasst, konstruiert. Das genetische Konstrukt enthält vorzugsweise ein Kanamycin-Resistenzgen (Aminoglykosid-3'-phosphotransferase-Gen), einen bakteriellen Replikationsursprung, Sequenzen, die die Expression der GM-CSF-Kodierregionen in den Zellen unterstützen, in die das Plasmid eingebracht wird, wie beispielsweise die Vektoren, die als Grundgerüste im Beispiel 36 beschrieben wurden. Vorzugsweise enthält das Plasmid einen Säugetier-Replikationsursprung, induziert durch zelluläre Replikation in Zusammenhang mit ...-Verabreichung. Wenn der EBV-Replikationsursprung verwendet wird, ist auch die Sequenz, die die Kern-Antigen-EBNA-1 kodiert, mit den geeigneten Regulatorsequenzen enthalten. Die Primer für die PCR-Amplifikation des Inserts enthalten Restriktions-Enzymstellen, um das Klonieren in den Expressionsvektor zu ermöglichen, und sind komplementär zu den 5'- und 3'-Enden der GM-CSF-kodierenden Sequenzen. Die PCR-Reaktion wird mit einem cDNA-Klon durchgeführt, wie beschrieben in Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:4360-4364.
Beispiel 46
Chronische myelogene Leukämie (CML) ist eine klonale myeloproliferierende Erkrankung der hematopoietischen Stammzellen, die mit dem Philadelphia-Chromosom in Zusammenhang gebracht wird, einer Chromosomenanomalie, die aus einer Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22 resultiert. Die Bruchpunkte am Chromosom 22 sammeln sich in einer 6 kb-Region, die als Bruchpunkt-Cluster-Region (BCR) bezeichnet wird, während am Chromosom 9 die Bruchpunkte über eine 90 kb-Region strangaufwärts vom c-abl exon 2 verstreut sind. Die resultierenden unterschiedlichen 9:22-Translokationen können in zwei Typen unterteilt werden: K28-Translokationen und L6-Translokationen. Transkription durch die bcr-abl-Translokation führt zur Erzeugung von Fusions-mRNAs. Es wurde gezeigt, dass Antisense, gerichtet auf die bcr-abl-Verbindung der mRNAs, die Fähigkeit von hemapoietischen Zellen aus CML-Patienten verringert, Kolonien zu bilden.
Beispiel 47
Genkonstrukte, die in pharmazeutischen Kits und Zusammensetzungen zur Impfung gegen und Behandlung von HBV verwendbar sind, werden mit Vektoren konstruiert, die als Grundgerüste im Beispiel 36 beschrieben wurden. Die Plasmide enthalten HBV-Strukturgene, insbesondere Gene, die das HBV-Oberflächenantigen und/oder den HBV-Kernantigen-Kern und/oder das HBV-Vorkern-Antigen kodieren.
Beispiel 48
Genkonstrukte, die in pharmazeutischen Kits und Zusammensetzungen zur Impfung gegen und Behandlung von HCV verwendbar sind, werden mit Vektoren konstruiert, die als Grundgerüste im Beispiel 36 beschrieben wurden. Die Plasmide enthalten HCV-Strukturgene, insbesondere Gene, die das HCV-Kernprotein und/oder HCV-Envelope-Protein kodieren.
Beispiel 49

Das Genkonstrukt pREV wurde konstruiert, das eine Nukleotidsequenz enthält, die HIV rev als einziges Target-Protein kodiert. Die Kodiersequenz von rev wird in das in Beispiel 36 beschriebene Grundgerüst A aus BBG35 (RD Systems Inc., Minneapolis, MN) kloniert, das die Kodierregion von rev aus dem HIV-Stamm HX3B in pUC19 enthält. Tabelle 1

Picornavirusfamilie
Gattung:	Rhinoviren: (medizinisch) verantwortlich für 50% der Fälle von allgemeinen Erkältungskrankheiten. Etheroviren: (medizinisch) umfassen Polioviren, Coxsackieviren, Echoviren und menschliche Enteroviren, beispielsweise Hepatitis-A-Viren. Apthoviren: (veterinär): Diese sind Maul- und Klauenseuche-Viren.
Target-Antigene:	VP1, VP2, VP3, VP4 und VPG
Calcivirusfamilie
Gattung:	Norwalk-Gruppe von Viren: (medizinisch) diese Viren sind ein wichtiger Erreger der epidemischen Gastroenteritis.
Togavirusfamilie
Gattung:	Alphaviren: (medizinisch und veterinär) Beispiele umfassen Senilisviren, Ross River-Virus, Eastern & Western Pferde-Enzephalitis. Reovirus: (medizinisch) Rubellavirus.
Flarivirduefamilie
	Beispiele umfassen: (medizinisch) Dengue-Fieber, Gelbfieber, Japanische Enzephalitis, St. Louis Enzephalitis- und Zecken-Enzephalitis-Viren.
Hepatitis C Virus:	(medizinisch) diese Viren sind keiner Familie zugeordnet, aber es wird davon ausgegangen, dass sie entweder ein Togavirus oder ein Flavivirus sind. Die größte Ähnlichkeit besteht mit der Togavirusfamilie.
Coronavirusfamilie:	(medizinisch und veterinär) Infektiöser Bronchitisvirus (Geflügel) übertragbarer Schweine-Magen-Darmvirus (Schwein) hämagglutinierender Schweine-Enzephalomyelitis-Virus (Schwein) infektiöser Katzen-Peritonitisvirus (Katzen) Katzenenterocoronavirus (Katze) Hundecoronavirus Die menschlichen respiratorischen Coronaviren verursachen etwa 40 Fälle der Erkältungskrankheiten. EX. 224E, 0C43 Zu beachten: Coronaviren können nicht -A-, -B- oder -C-Hepatitis verursachen.
Targetantigene:
	E1- auch M- oder Matrixprotein genannt: E2 – auch S- oder Spikeprotein genannt E3 – auch HE- oder Hemagglutinelterose-Glykoprotein genannt (nicht in allen Coronaviren vorhanden) (N-Nukleocapsid)

Rhabdovirusfamilie
Gattung:	Vesiliovirus Lyssavirus:(medizinisch und veterinär) Tollwut
Target-Aantigen:	G Protein N Protein
Filoviriduefamilie:
	(medizinisch) hämorrhagische Fieber-Viren, wie beispielsweise Marburgund Ebolavirus
Paramyxovirusfamilie.
Gattung:	Paramyxovirus: (medizinisch und veterinär) Mumpsvirus, Newcastle-disease-Virus (bedeutender Krankheitserreger bei Hühnern) Morbillivirus: (medizinisch und veterinär) Masern, Hundestaupe Pneuminvirus: (medizinisch und veterinär) Respiratorisches Syncytiumvirus
Orthomyxovirusfamilie	(medizinisch) Influenzavirus
Bungavirusfamilie
Gattung:	Bungavirus: (medizinisch) California-Enzephalitis; LA Crosse Phlebovirus: (medizinisch) Rift-Valley-Fieber Hantavirus: Puremala ist ein Hemahgin-Fiebervirus Nairviurs (veterinär) Nairobi-Schafkrankheit auch viele nicht zugeordntete Bungaviren
Arenavirusfamilie	(medizinisch) LCM, Lassa-Fiebervirus
Reovirus Familie:
Gattung:	Bungavirus: ein möglicher humaner pathogener Rotavirus: akute Gastroenteritis bei Kindern Orbiviren: (medizinisch und veterinär): Colorado-Zeckenfieber, Lebombo (Menschen), Pferdeencephalitis, blaue Zunge
Reovirusfamilie
Unterfamilie:
	Oncorivirinal: (veterinär) (medizinisch) Katzenleukämievirus, HTLVI und HTLVII Lentivirinal: (medizinisch und veterinär) HIV, Katzenimmundefizienzvirus, Infektionen bei Pferden, Anämievirus Spumavirinal
Papovavirusfamilie
Unterfamilie:
	Polyomaviren: (medizinisch) BKU- und JCU-Viren
Unterfamilie:
	Papillomauivirus: (medizinisch) viele virale Arten, die mit Krebsarten oder einem malignen Verlauf von Papilloma im Zusammenhang stehen.

Adenovirus (medizinisch)
	EX AD7, ARD., O.B. – verursacht Atemwegserkrankungen – einige Andenoviren, wie beispielsweise 275, verursachen Enteritis.
Parvovirusfamilie (veterinär):
	Katzenparvovirus: verursacht Enteritis bei Katzen Katzenpanleucopeniavirus Hundeparvovirus Schweineparvovirus
Herpesvirusfamilie
Unterfamilie:	Alphaherpesviridue
Gattung:	Simplexvirus (medizinisch) HSVI, HSVII Varicellovirus: (medizinisch – veterinär) Pseudotollwut – Varicella Zoster
Unterfamilie:	Betaherpesvirdue
Gattung:	Zytomegalovirus (medizinisch) HCMV Muromegalovirus
Unterfamilie:	Gammaherpesviridue
Gattung:	Lymphocryptovirus (medizinisch) EBV – (Burkitts lympho) Rhadinovirus
Pockenvirusfamilie
Unterfamilie:	Chordopockenviridue (medizinisch – veterinär)
Gattung:	Variola (Windpocken) Vaccinia (Kuhpocken) Parapoxvirus – veterinär Auipoxvirus – veterinär Capripoxvirus Leporipoxvirus Suipoxvirus
Unterfamilie:	Entmopoxviridue
Hepadnavirusfamilie:
	Hepatits-B-Virus
Unklassifiziert:
	Hepatitis-Delta-Virus

Tabelle 2
Bakterielle Krankheitserreger

Pathogene gram-positive Kokken umfassen: Pneumokokken, Staphylokokken und Streptokokken. Pathogene gram-negative Kokken umfassen: Meningokokken und Gonokokken.
Pathogene enterische gram-negative Bazilli umfassen: Enterobacteriaceae; Pseudomonas; Acinetobacteria und Eikenella; Melioidosis; Salmonella; Shigellose; Hemophilus; Chancroid; Brucellose, Tularimia; Yersinia (Pasteurella); Streptobacillus moniliformis und Spirillum; Listeria monocytogenes; Erysipelothrix rhusiopathiae; Diphtheria; Cholera; Anthrax; Donovanose (Granuloma inguinale); und Bartonellose.
Pathogene anaerobe Bakterien umfassen: Tetanus; Botulismus; andere Clostridien; Tuberkulose; Lepra; und andere Mycobakterien. Pathogene Spirochätenerkrankungen umfassen: Syphilis; Treponematosen: Yaws; Pinta und endemische Syphilis; und Leptospirose. Andere Infektionen, hervorgerufen durch höhere pathogene Bakterien und pathogene Pilze umfassen: Actinomykose, Nocardiose; Cryptococcose; Blastomycose, Histoplasmose und Coccidioidomykose, Candidiasis, Aspergillose und Mucormykose; Sporotrichose; Paracoccidiodomykose, Petriellidiose, Torulopsose, Mycetom und Chomomykose; und Dermatophytose.
Rickettsieninfektionen umfassen Rickettsien und Rickettsiosen.
Beispiele für Mycoplasma- und Chlamydieninfektionen umfassen: Mycoplasma pneumoniae; Lymphogranuloma venereum; Psittakose; und perinatale Chlamydieninfektionen.

Pathogene Eukaryoten

Pathogene Protozoen und Würmer und dadurch hervorgerufene Infektionen umfassen: Amöbiase; Malaria, Leishmaniase; Trypanosomiase; Toxoplasmose; Pneumocystsis; Carinii; Babesiose, Giardiasis, Trichinose, Filariasis, Schistosomiase; Nematoden; Trematoden oder Egel; und Zestoden (Bandwurm)-Infektionen.

SEQUENZLISTE

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung: a) umfassend: i) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und ii) einen genetischen Impfstoffförderer, ausgewählt aus Lectinen, Östrogenverbindungen, Dimethylsulfoxid und Harnstoff; oder (b) bestehend aus: i) einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und ii) einem oder mehreren hydroxylierten niederen Alkylen; oder c) bestehend aus: i) einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und ii) einem oder mehreren anionischen Lipiden; wobei die pharmazeutische Zusammensetzung frei von retroviralen Partikeln ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, bestehend aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, ausgewählt aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und einem oder mehreren hydroxylierten niederen Alkylen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die hydroxylierten niederen Alkyle ausgewählt sind aus n-Propanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol und Glycerin.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, bestehend aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, ausgewählt aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und einem oder mehreren anionischen Lipiden.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die anionischen Lipide ausgewählt sind aus Laurinsäure, Ölsäure, neutralisierter Schwefelsäure, Natriumlaurylsulfat, Alkylpolyoxyethylensulfaten, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend: a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, ausgewählt aus einem Krankheitserregerantigen, einem Protein, dessen Vorhandensein ein fehlendes, nicht funktionierendes oder partiell funktionierendes Protein in einer Person kompensiert, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft; und b) einen genetischen Impfstoffförderer, ausgewählt aus Lectinen, Östrogenverbindungen, Dimethylsulfoxid, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Harnstoff, Laurinsäure, Ölsäure, neutralisierter Schwefelsäure, Natriumlaurylsulfat, Alkylpolyoxyethylensulfaten, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat; wobei die pharmazeutische Zusammensetzung frei von retroviralen Partikeln ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin der genetische Impfstoffförderer ausgewählt ist aus Concanavalin A, Abrin, Sojabohnenagglutinin, Weizenkeimagglutinin, Östradiol, β-Östradiol, 17-β-Östradiol, Östradiol-3-benzoat, Östradiol-17-β-cypionat, Östradiol-17-propionat oder -dipropionat, -hemisuccinat, -17-heptanoat (-önanthat), -17-undecanoat (-undecylat), -17-valerat, α-Östradiol, α-Östradioldiacetat oder -3-benzoat, Östra-1,3,5(10)-trien-3,16,17-triol, 3-Hydroxyöstra-1,3,5(10)-trien-17-on, Dimethylsulfoxid und Harnstoff.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus Enzymen, Strukturproteinen, Zytokinen, Lymphokinen und Wachstumsfaktoren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Nukleinsäuremolekül ein DNA-Molekül ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin die Zusammensetzung mindestens zwei unterschiedliche Nukleinsäuremoleküle umfasst, die zur Verabreichung an unterschiedliche Zellen einer Person geeignet sind, wobei die unterschiedlichen Moleküle jeweils eine Nukleotidsequenz haben, die ein oder mehrere Krankheitserregerantigene desselben Krankheitserregers kodieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der Krankheitserreger ein Virus ist, ausgewählt aus human immunodeficiency virus (HIV), humanem T-Zell-Leukämievirus (HTLV), Grippevirus, Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis B-Virus (HBV), Hepatitis C-Virus (HCV), humanem Papillomavirus (HPV), Herpes-Simplex-1-Virus (HSV1), Herpes-Simplex-2-Virus (HSV2), Zytomegalievirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Rhinovirus und Coronavirus.
Pharmazeutische Zusammensetzung: a) umfassend: i) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind; und ii) einen genetischen Impfstoffförderer, ausgewählt aus Lectinen, Östrogenverbindungen, Dimethylsulfoxid und Harnstoff; oder b) bestehend aus: i) einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind; und ii) einem oder mehreren hydroxylierten niederen Alkylen; oder c) bestehend aus: i) einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind; und ii) einem oder mehreren anionischen Lipiden; wobei die pharmazeutische Zusammensetzung frei von retroviralen Partikeln ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, bestehend aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hy perproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind, und einem oder mehreren hydroxylierten niederen Alkylen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die hydroxylierten niederen Alkyle ausgewählt sind aus n-Propanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol und Glycerin.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, bestehend aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und von einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind, und einem Protein, das eine therapeutische Wirkung in einer Person hervorruft, und einem oder mehreren anionischen Lipiden.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die anionischen Lipide ausgewählt sind aus Laurinsäure, Ölsäure, neutralisierter Schwefelsäure, Natriumlaurylsulfat, Alkylpolyoxyethylensulfaten, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine oder mehrere variable Regionen von Antikörpern, die an B-Zellen-vermittelter Immunerkrankung beteiligt sind, oder eine oder mehrere variable Regionen von T-Zellrezeptoren, die an T-Zellen-vermittelter Immunerkrankung beteiligt sind, kodiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend i) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus einem Proteinantigen, das von einer hyperproliferierenden Zelle exprimiert wird, und einem Proteinantigen, das von Zellen exprimiert wird, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind, und ii) einen genetischen Impfstoffförderer, ausgewählt aus Lectinen, Östrogenverbindungen, Dimethylsulfoxid, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Harnstoff, Laurinsäure, Ölsäure, neutralisierter Schwefelsäure, Natriumlaurylsulfat, Alkylpolyoxyethylensulfaten, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Natriumlaurat, Kaliumlaurat, Natriumlaurylsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Ammoniumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat; wobei die pharmazeutische Zusammensetzung frei von retroviralen Partikeln ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin der genetische Impfstoffförderer ausgewählt ist aus Concanavalin A, Abrin, Sojabohnenagglutinin, Weizenkeimagglutinin, Östradiol, β-Östradiol, 17-β-Östradiol, Östradiol-3-benzoat, Östradiol-17-β-cypionat, Östradiol-17-propionat oder -dipropionat, -hemisuccinat, -17-heptanoat (-önanthat), -17-undecanoat (-undecylat), -17-valerat, α-Östradiol, α-Östradioldiacetat oder -3-benzoat, Östra-1,3,5(10)-trien-3,16,17-triol, 3-Hydroxyöstra-1,3,5(10)-trien-17-on, Dimethylsulfoxid und Harnstoff.