ES2265147T3

ES2265147T3 - Composiciones para la administracion de material genetico.

Info

Publication number: ES2265147T3
Application number: ES95915501T
Authority: ES
Inventors: Richard A. Carrano; David B. Weiner; Bin Wang
Original assignee: Wyeth LLC; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Wyeth LLC; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1994-04-01
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2015-03-30
Also published as: EP0772437B9; EP1616578A1; ATE328589T1; WO1995026718A1; PT772437E; US6197755B1; EP0772437A4; DK0772437T3; DE69535035T2; US5739118A; DE69535035D1; CA2186913A1; JPH09511146A; AU2236695A; EP0772437B1; AU709659B2; EP0772437A1

Abstract

SE MUESTRAN METODOS DE INTRODUCIR MATERIAL GENETICO EN EL INTERIOR DE CELULAS DE UN INDIVIDUO Y COMPOSICIONES Y EQUIPOS PARA LLEVARLOS A CABO. LOS METODOS INCLUYEN LOS PASOS DE PONER EN CONTACTO CELULAS DE UN INDIVIDUO CON UN FACILITADOR DE VACUNA GENETICA Y LA ADMINISTRACION A LAS CELULAS DE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO LIBRE DE PARTICULAS RETROVIRALES. LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO INCLUYE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE INCLUYE AL MENOS UN EPITOPE QUE ES IDENTICO O SUSTANCIALMENTE SIMILAR A UN EPITOPE DE UN ANTIGENO PATOGENO O UN ANTIGENO ASOCIADO A UNA ENFERMEDAD HIPERPROLIFERATIVA O AUTOINMUNE, POR OTRA PARTE UNA PROTEINA PERDIDA DE UN INDIVIDUO DEBIDO A UN GEN PARCIALMENTE FUNCIONANTE O NO FUNCIONAL, PERDIDO, O UNA PROTEINA QUE PRODUCE UN EFECTO TERAPEUTICO EN UN INDIVIDUO. SE MUESTRAN METODOS DE INMUNIZACION PROFILACTICA, TERAPEUTICA E INDIVIDUAL CONTRA EL HIV. SE MUESTRAN TAMBIEN COMPOSICIONES Y EQUIPOS FARMACEUTICOS PARA PONER EN PRACTICA LOS METODOS DELA PRESENTE INVENCION.

Description

Composiciones para la administración de material genético.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para introducir material genético en las células de un individuo. Las composiciones de la invención pueden utilizarse para administrar agentes protectores y/o terapéuticos, incluido material genético que codifica proteínas diana para la inmunización y proteínas terapéuticas.

Antecedentes de la invención

La introducción directa de un gen normal, funcional, en un animal vivo ha sido estudiada como un medio para el reemplazamiento de información genética defectuosa. En algunos estudios se introduce el ADN directamente en las células de un animal vivo sin utilizar una partícula vírica u otro vector infeccioso. Nabel, E. G., et al., (1990) Science 249: 1285-1288, describen la expresión génica específica de sitio in vivo de un gen de beta-galactosidasa que se transfirió directamente a la pared arterial de ratones. Wolfe, J. A. et al., (1990) Science 247: 1465-1468, describen la expresión de varios genes indicadores que se transfirieron directamente al músculo de ratones in vivo. Acsadi G., et al., (1991) Nature 352: 815-818, describen la expresión del gen de la distrofina humana en ratones tras la inyección intramuscular de construcciones de ADN. Wolfe, J. A., et al., 1991 BioTechniques 11 (4): 474-485, se refieren a condiciones que afectan a la transferencia directa de genes en el músculo de roedores in vivo. Felgner, P. L. y G. Rhodes, (1991) Nature 349: 351-352, describen la administración directa de genes purificados in vivo como fármacos, sin utilizar retrovirus.

Se ha propuesto la utilización de la transferencia directa de genes como método alternativo de vacunación contra patógenos. La utilización de la transferencia directa de genes mediante inyección única ha sido propuesta como posible estrategia de vacunación contra el VIH. Se ha descrito la observación de una respuesta de inmunidad celular contra la gp120 del VIH como resultado de al introducción en las células de un plásmido de ADN que codifica dicha proteína. La publicación PCT n.º WO/9011092 publicada el 4 de octubre de 1990 describe métodos para inmunizar a un individuo contra la infección por un patógeno mediante la inyección de polinucleótidos simples en las células del individuo en un procedimiento de una sola etapa. La utilización de agentes de transfección distintos de lipofectinas está específicamente excluida de los métodos descritos. No se describen ni se indica la estimulación de las células inoculadas. Se describe una vacuna contra el VIH que consiste en la introducción de polinucleótidos que codifican la proteína vírica gp120. No se ha probado el funcionamiento de esta vacuna.

El documento WO-A-9504548 se adapta a los términos del Artículo 54 (3) del CPE, y ha sido específicamente excluido. El documento Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 84 págs. 7851-7855, de noviembre de 1987, describe un plásmido que contiene un gen de la cloranfenicol-acetil-transferasa de E. coli bajo control de un promotor de mamífero regulado por AMPc, que está incluido en un liposoma recubierto con anticuerpos H-2K*.

Ulmer J.B. et al. en Science, volumen 259, págs. 1745-1749, describen la protección heteróloga contra la gripe mediante la inyección de un ADN que codifica una proteína vírica.

Además, en Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 1097, (1991) 1-17, Dr. Hug et al. describen liposomas para la transformación de células eucariotas.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica

a) que comprende

i): una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno de patógenos, una proteína cuya presencia compensará la ausencia, la falta de funcionamiento o el funcionamiento parcial de una proteína en un individuo, y una proteína que produce un efecto terapéutico en un individuo; y

ii): un facilitador de vacunas genéticas seleccionado a partir de lectinas, compuestos estrogénicos, dimetilsulfóxido y urea; o

b) que está constituida por

ii): uno o más alquilos inferiores hidroxilados; o

\newpage

c) que está constituida por

ii): uno o más lípidos aniónicos; o

en: la que la composición farmacéutica está exenta de partículas retrovíricas.

Preferentemente, la composición farmacéutica está formada por una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno de patógenos, una proteína cuya presencia compensará la ausencia, la falta de funcionamiento o el funcionamiento parcial de una proteína en un individuo, y una proteína que produce un efecto terapéutico en un individuo, y uno o más alquilos inferiores hidroxilados.

También preferentemente, los alquilos inferiores hidroxilados se seleccionan a partir de n-propanol, etanol, isopropanol, n-butanol y glicerol.

Preferentemente, la composición farmacéutica está formada por una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno de patógenos, una proteína cuya presencia compensará la ausencia, la falta de funcionamiento o el funcionamiento parcial de una proteína en un individuo, y una proteína que produce un efecto terapéutico en un individuo, y uno o más lípidos
aniónicos.

También preferentemente, los lípidos aniónicos se seleccionan a partir de ácido láurico, ácido oleico, ácido sulfúrico neutralizado, laurilsulfato de sodio, sulfatos de alquil-polioxietileno, sulfosuccinato de dioctilo y sodio, laurato de sodio, laurato de potasio, laurilsulfato de amonio, y sulfosuccinato de dioctilo y sodio.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende:

a): una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno de patógenos, una proteína cuya presencia compensará la ausencia, la falta de funcionamiento o el funcionamiento parcial de una proteína en un individuo, y una proteína que produce un efecto terapéutico en un individuo; y

b): un facilitador de vacunas genéticas seleccionado a partir de lectinas, compuestos estrogénicos, dimetilsulfóxido, n-propanol, isopropanol, n-butanol, urea, ácido láurico, ácido oleico, ácido sulfúrico neutralizado, laurilsulfato de sodio, sulfatos de alquil-polioxietileno, sulfosuccinato de dioctilo y sodio, laurato de sodio, laurato de potasio, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de potasio, laurilsulfato de amonio, y sulfosuccinato de dioctilo y sodio;

Preferentemente, el facilitador de vacunas genéticas se selecciona a partir de concanavalina A, abrina, aglutinina de soja, aglutinina de germen de trigo, estradiol, \beta-estradiol, 17-\beta-estradiol, estradiol-3-benzoato, estradiol 17-\beta-cipionato, estradiol 17-propionato o dipropionato, hemisuccinato, 17-heptanoato (enantato), 17-undecanoato (undecilato), 17-valerato, \alpha-estradiol, \alpha-estradiol-diacetato, o 3-benzoato, estra-1,3,5(10)-trieno-3,16,17-triol, 3-hidroxiestra-1,3,5(10)-trieno-17-ona, dimetilsulfóxido y urea.

Preferentemente, dicha molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de enzimas, proteínas estructurales, citocinas, linfocinas, y factores de crecimiento.

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

También preferentemente, la composición comprende por lo menos dos moléculas de ácido nucleico distintas adaptadas para la administración a células diferentes de un individuo, teniendo cada una de dichas moléculas distintas una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más antígenos patógenos del mismo patógeno.

Preferentemente, dicho patógeno es un virus seleccionado a partir del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la leucemia de células T humana, virus de la gripe, virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), virus del papiloma humano (VPH), virus del herpes simple 1 (VHS1), virus del herpes simple 2 (VHS2), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB), rinovirus y corona-
virus.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica:

a) que comprende

i): una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno proteico expresado por una célula hiperproliferante y un antígeno proteico expresado por células que caracterizan una enfermedad autoinmunitaria; y

b) que está constituida por:

ii): uno o más alquilos inferiores hidroxilados; o

c) que está constituida por:

ii): uno o más lípidos aniónicos;

Preferentemente, la composición farmacéutica está formada por una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno proteico expresado por una célula hiperproliferante y un antígeno proteico expresado por células que caracterizan una enfermedad autoinmunitaria, y uno o más alquilos inferiores hidroxilados.

Preferentemente, la composición farmacéutica está formada por una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno proteico expresado por una célula hiperproliferante y un antígeno proteico expresado por células que caracterizan una enfermedad autoinmunitaria, y uno o más lípidos aniónicos.

También preferentemente, los lípidos aniónicos se seleccionan a partir de ácido láurico, ácido oleico, ácido sulfúrico neutralizado, laurilsulfato de sodio, sulfatos de alquil-polioxietileno, sulfosuccinato de dioctilo y sodio, laurato de sodio, laurato de potasio, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de potasio, laurilsulfato de amonio, y sulfosuccinato de dioctilo y sodio.

Preferentemente, dicha molécula de ácido nucleico incluye una secuencia nucleótidos que codifica una o más regiones variables de anticuerpos implicados en una enfermedad autoinmunitaria mediada por células B, o una o más regiones variables de receptores de células T implicados en una enfermedad autoinmunitaria mediada por células T.

ii): un facilitador de vacunas genéticas seleccionado a partir de lectinas, compuestos estrogénicos, dimetilsulfóxido, n-propanol, isopropanol, n-butanol, urea, ácido láurico, ácido oleico, ácido sulfúrico neutralizado, laurilsulfato de sodio, sulfatos de alquil-polioxietileno, sulfosuccinato de dioctilo y sodio, laurato de sodio, laurato de potasio, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de potasio, laurilsulfato de amonio, y sulfosuccinato de dioctilo y sodio;

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que representa la construcción del plásmido pM160, que se preparó insertando un fragmento generado por PCR que codifica la glucoproteína gp160 del VIH-HXB2 en el plásmido pMAMneoBlue (Clonetech).

La Figura 2 es un mapa del plásmido pGAGPOL.rev.

La Figura 3 es un mapa del plásmido pENV.

La Figura 4 muestra las cuatro cadenas principales, A, B, C y D, utilizadas para preparar la construcción genética.

La Figura 5 muestra los cuatro insertos, 1, 2, 3 y 4, que se introducen las cadenas principales para producir las construcciones genéticas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una composición para su utilización en un método para introducir moléculas de ácido nucleico en las células de un animal, que posibilita un elevado nivel de captación y función de las moléculas de ácido nucleico. El método comprende las etapas de administrar moléculas de ácido nucleico que están exentas de partículas víricas, particularmente partículas retrovíricas, a la célula de un individuo en combinación con la administración de un agente facilitador de vacunas genéticas. El agente facilitador de vacunas genéticas se selecciona a partir de: lípidos aniónicos, lectinas, compuestos estrogénicos, alquilos inferiores hidroxilados; dimetilsulfóxido (DMSO) y urea. El agente facilitador de vacunas genéticas preferentemente aumenta la respuesta inflamatoria y/o aumenta la expresión de la molécula de ácido nucleico en el tejido y/o facilita la captación de la molécula de ácido nucleico por la célula.

También se describen métodos para la administración de moléculas de ácido nucleico a las células de un individuo sin la utilización de agentes infecciosos.

Las moléculas de ácido nucleico que se administran a las células pueden servir de: 1) moldes genéticos para proteínas que funcionan como agentes para la inmunización profiláctica y/o terapéutica; 2) copias para el reemplazamiento de genes defectuosos, ausentes o que no funcionan bien; 3) moldes genéticos para proteínas terapéuticas; 4) moldes genéticos para moléculas antisentido; o 5) moldes genéticos para ribozimas.

En el caso de las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, las moléculas de ácido nucleico pueden comprender las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y la traducción en las células del animal.

En el caso de las moléculas de ácido nucleico que sirven como moldes para moléculas antisentido y ribozimas, dichas moléculas de ácido nucleico pueden estar unidas a elementos reguladores necesarios para la producción de suficientes copias de moléculas antisentido y de ribozimas codificadas respectivamente de dicha forma. Las moléculas de ácido nucleico están exentas de partículas retrovíricas y pueden proporcionarse como ADN en forma de plásmidos.

El coagente también se denomina en la presente memoria "facilitador de vacunas genéticas" o "FVG". Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "facilitador de vacunas genéticas" se refiere a coagentes que se administran junto con moléculas de ácido nucleico, incluidas vacunas genéticas y medicamentos genéticos. El FVG se administra en forma de mezcla con la molécula de ácido nucleico o se administra de forma separada y simultánea, antes o después de la administración de moléculas de ácido nucleico. El FVG se utiliza como parte de métodos terapéuticos o profilácticos que incluyen la administración de una molécula de ácido nucleico que codifica dianas inmunógenas, proteínas terapéuticas, ribozimas o secuencias antisentido. Los FVG utilizados en la presente invención se seleccionan a partir de lípidos aniónicos; lectinas; compuestos estrogénicos; alquilos inferiores hidroxilados; dimetilsulfóxido (DMSO); y urea.

Según algunos aspectos de la presente invención, se proporcionan composiciones que inmunizan de forma profiláctica y/o terapéutica a un individuo contra un patógeno o una célula anómala relacionada con una enfermedad. El material genético codifica un péptido o proteína que comparte por lo menos un epítopo con una proteína inmunógena presente en el patógeno o en las células que constituyen el objetivo. El material genético se expresa por las células del individuo y sirve como diana inmunógena contra la que se genera una respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria resultante es de amplia base: además de una respuesta de inmunidad humoral, se generan ambas formas de respuesta de inmunidad celular. Los métodos son útiles para conferir inmunidad profiláctica y terapéutica. De este modo, un método de inmunización incluye ambos métodos para la protección de un individuo frente a la exposición a un patógeno, o frente a la presencia o proliferación de células específicas, así como a métodos de tratamiento de un individuo aquejado de una infección por patógenos, una enfermedad hiperproliferativa o una enfermedad autoinmunitaria.

La presente invención es útil para generar respuestas inmunitarias amplias contra una proteína diana, es decir: proteínas específicamente asociadas a patógenos o a las células "anómalas" del propio individuo. La presente invención es útil para inmunizar individuos contra agentes y organismos patógenos de modo que una respuesta inmunitaria contra una proteína de un patógeno proporciona inmunidad protectora contra el patógeno. La presente invención es útil para combatir enfermedades y trastornos hiperproliferativos tales como el cáncer, mediante la generación de una respuesta inmunitaria contra una proteína diana que está específicamente asociada a las células hiperproliferativas. La presente invención es útil para combatir enfermedades y trastornos autoinmunitarios mediante la generación de una respuesta inmunitaria contra una proteína diana que está específicamente asociada a células implicadas en el trastorno autoinmunitario.

Algunos aspectos de la presente invención se refieren a la terapia génica; es decir, a composiciones para introducir moléculas de ácido nucleico en las células de un individuo como copias exógenas de genes que, o bien corresponden a genes defectuosos, ausentes, no funcionales o parcialmente funcionales del individuo, o bien codifican proteínas terapéuticas, es decir proteínas cuya presencia en el individuo eliminará un defecto en el individuo y/o cuya presencia proporcionará un efecto terapéutico en el individuo, ofreciendo de esta manera un medio para la administración de la proteína de un modo alternativo al de la administración de la proteína.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteína deseada" se refiere a péptidos y proteínas codificadas por construcciones genéticas de la presente invención que actúan como proteínas diana para una respuesta inmunitaria o que actúan como proteínas terapéuticas o compensadoras en pautas de terapia génica.

El ADN o ARN que codifica una proteína deseada puede introducirse en las células de un individuo, en las que se expresa, con lo que se produce la proteína deseada. El ADN o ARN que codifica la proteína deseada está conectado a elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo. Los elementos reguladores para la expresión del ADN incluyen un promotor y una señal de poliadenilación. Además, también pueden incluirse en la construcción genética otros elementos, tales como una región Kozak.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "construcción genética" se refiere a la molécula de ADN o ARN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada y que incluye señales de iniciación y terminación conectadas de forma funcional a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células del individuo vacunado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "forma expresarle" se refiere a construcciones genéticas que contienen los elementos reguladores necesarios conectados de forma funcional a una secuencia codificante que codifica una proteína diana, de modo que cuando esté presente en la célula del individuo, la secuencia codificante se expresará.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "vacuna genética" se refiere a una preparación farmacéutica que comprende una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana, incluidas preparaciones farmacéuticas útiles para generar una respuesta inmunitaria terapéutica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "medicamento genético" se refiere a una preparación farmacéutica que comprende una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína terapéutica o compensadora. Como alternativa, un medicamento genético puede codificar secuencias antisentido que inhiben la expresión génica de genes cuya expresión no es deseable. Además, los medicamentos genéticos pueden codificar ribozimas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteína diana" se refiere a una proteína contra la que se puede generar una respuesta inmunitaria. La proteína diana es una proteína inmunógena que comparte por lo menos un epítopo con una proteína del patógeno o del tipo celular no deseable, tal como una célula cancerosa o una célula implicada en una enfermedad autoinmunitaria, contra la que se requiere la inmunización. La respuesta inmunitaria dirigida contra la proteína diana protegerá al individuo contra la infección o la enfermedad, y servirá para tratar al individuo de la infección o enfermedad específica a la que está asociada la proteína diana.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "compartir un epítopo" se refiere a proteínas que comprenden por lo menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de otra proteína.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "epítopo sustancialmente similar" se refiere a un epítopo que tiene una estructura que no es idéntica a la de un epítopo de una proteína, pero que, no obstante, genera una respuesta de inmunidad celular o humoral que presenta una reacción cruzada con la proteína.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteína terapéutica" se refiere a proteínas cuya presencia confiere un beneficio terapéutico al individuo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteína compensadora" se refiere a proteínas cuya presencia compensa la ausencia de una proteína endógena completamente funcional debido a la ausencia, defecto, falta de funcionamiento o funcionamiento parcial de un gen endógeno.

Las construcciones genéticas comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deseada conectada funcionalmente a elementos reguladores necesarios para la expresión génica. Por consiguiente, la incorporación de la molécula de ADN o ARN en una célula viva da lugar a la expresión del ADN o ARN que codifica la proteína deseada y, de este modo, a la producción de la proteína deseada.

Cuando es captada por una célula, la construcción genética que incluye la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada conectada funcionalmente a elementos reguladores, puede permanecer en la célula como molécula extracromosómica funcional, o puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula. Puede introducirse ADN en las células, donde permanece como material genético separado en forma de plásmido. Como alternativa, puede introducirse en la célula ADN lineal, que puede integrarse en el cromosoma. A la hora de introducir ADN en la célula pueden añadirse reactivos que fomentan la integración del ADN en los cromosomas. También pueden incluirse en la molécula de ADN secuencias de ADN que son útiles para promover la integración. Como alternativa, puede administrarse ARN a la célula. También se contempla proporcionar la construcción genética en forma de minicromosoma lineal que incluye un centrómero, telómeros y un origen de replicación.

La molécula que codifica una proteína deseada puede ser una molécula de ADN o ARN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Dichas moléculas pueden ser ADNc, ADN genómico, ADN sintético, un híbrido de los mismos o una molécula de ARN tal como ARNm. Por consiguiente, tal como se utilizan en la presente memoria, los términos "construcción de ADN", "construcción genética" y "secuencia de nucleótidos" se utilizan para referirse tanto a moléculas de ADN como de ARN.

Los elementos reguladores necesarios para la expresión de genes de una molécula de ADN incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de terminación y una señal de poliadenilación. Además, a menudo son necesarios potenciadores para la expresión de genes. Es necesario que dichos elementos estén conectados funcionalmente a la secuencia que codifica las proteínas deseadas y que los elementos reguladores sean funcionales en el individuo al que se administran.

Se considera generalmente que los codones de iniciación y el codón de terminación forman parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es necesario que dichos elementos sean funcionales en el individuo al que se administra la construcción génica. Los codones de iniciación y terminación deben estar en fase con la secuencia codificante.

Los promotores y señales de poliadenilación utilizados deben ser funcionales en las células del individuo.

Los ejemplos de promotores útiles especialmente para la producción de un vacuna genética para seres humanos incluyen, sin limitarse a los mismos, promotores del virus de simios 40 (SV40), promotor del virus del tumor de mama de ratón (MMTV), promotores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tales como el promotor de la repetición terminal larga (LTR) del VIH, virus de Moloney, ALV, promotores del citomegalovirus (CMV) tales como el promotor temprano inmediato del CMV, virus de Epstein-Barr (VEB), virus del sarcoma de Rous (RSV), así como promotores procedentes de genes humanos, tales como el de la actina humana, la miosina humana, la hemoglobina humana, la creatina del músculo humana y la metalotioneina humana.

Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles especialmente para la producción de una vacuna genética para seres humanos, incluyen, sin limitarse a las mismas, señales de poliadenilación del SV40 y señales de poliadenilación del LTR. En particular se utiliza la señal de poliadenilación del SV40 que está presente en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), a la que se alude como señal de poliadenilación del SV40.

Además de los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN, también pueden incluirse otros elementos en la molécula de ADN. Dichos elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador puede seleccionarse a partir del grupo que incluye, sin limitarse los mismos: el de la actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humana, y potenciadores víricos tales como los del CMV, RSV y VEB.

Las construcciones genéticas pueden proporcionarse con un origen de replicación de mamífero, con el objeto de mantener la construcción extracromosómica y producir múltiples copias de la construcción en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de replicación del virus de Epstein-Barr y la región que codifica el antígeno nuclear EBNA-1, que produce replicación episómica de elevado número de copias sin integración.

El vector utilizado puede seleccionarse a partir de los descritos en el Ejemplo 36. En métodos relacionados con la terapia génica, son preferidas las construcciones con orígenes de replicación que incluyen el antígeno necesario para la activación.

En algunas formas de realización preferidas relacionadas con aplicaciones para inmunización, la construcción genética contiene secuencias de nucleótidos que codifican una proteína diana y que incluyen además genes para proteínas que aumentan la respuesta inmunitaria contra dichas proteínas diana. Ejemplos de dichos genes son aquellos que codifican citocinas y linfocinas tales como \alpha-interferón, gamma-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8,
IL-10 e IL-12. El gen del GM-CSF se incluye en las construcciones genéticas utilizadas en composiciones para inmu-
nización.

Puede añadirse un elemento adicional que sirve como diana para la destrucción de células si es deseable eliminar las células que reciben la construcción genética, por cualquier motivo. Pueden incluirse en la construcción genética un gen de la timidina-quinasa (tk) del herpes en forma capaz de expresarse. El fármaco ganciclovir puede administrarse al individuo, con lo que se provocará la muerte selectiva de cualquier célula que produzca tk; de este modo se proporcionan los medios para la destrucción selectiva de células que portan la construcción genética.

Con el objeto de aumentar al máximo la producción de proteínas, pueden seleccionarse secuencias reguladoras que se adaptan bien para la expresión de genes en las células a las que se administra a la construcción. Además, pueden seleccionarse codones que se transcriben con la máxima eficacia en la célula. El experto en la materia puede preparar construcciones de ADN que son funcionales en las células.

Con el objeto de verificar la expresión, pueden probarse los niveles de expresión de construcciones genéticas in vitro utilizando un cultivo celular del mismo tipo de células a las que se va a administrar la construcción. Por ejemplo, si la vacuna genética se va a administrar a células musculares humanas, pueden utilizarse células musculares obtenidas en cultivo tales como células musculares de tumor sólido de rabdomiosarcoma como modelo in vitro para la medición del nivel de expresión.

Las construcciones genéticas utilizadas en la presente memoria no se incorporan en partículas retrovíricas. Las construcciones genéticas son captadas por la célula sin que tenga lugar inserción mediada por partículas retrovíricas, como la que tiene lugar cuando partículas retrovíricas con ARN retrovírico que está incorporado en partículas retrovíricas infecta una célula. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "exento de partículas retrovíricas" se refiere a construcciones genéticas que no están incorporadas en partículas retrovíricas. Tal como se utiliza en la presente memoria, "disociado de un agente infeccioso" se refiere a material genético que no forma parte de un vector vírico, bacteriano o eucariota, bien activo, inactivo, vivo o muerto, que es capaz de infectar una célula.

Las construcciones genéticas pueden constituir menos de un genoma vírico completo capaz de replicación, de modo que tras su introducción en la célula la construcción genética posee información genética insuficiente para dirigir la producción de partículas víricas infecciosas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "genoma vírico incompleto" se refiere a una construcción genética que contiene menos de un genoma completo, de modo que la incorporación de dicha construcción genética en una célula no constituye la introducción de información genética suficiente para la producción de virus infeccioso.

Pueden administrarse moléculas de ADN exentas del agente precipitante CaPO_{4}.

Puede administrarse una vacuna con un virus atenuado como construcción genética que contiene suficiente material genético como para permitir la producción de partículas víricas. La administración de la vacuna atenuada como construcción genética posibilita una forma más fácil para producir grandes cantidades de producto de inmunización seguro, puro y activo.

La construcción genética puede administrarse con o sin la utilización de microproyectiles. Las construcciones genéticas pueden administrarse a las células de un individuo exentas de partículas sólidas. Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase "exento de partículas sólidas" se refiere a un líquido que no contiene ningún microproyectil sólido utilizado como medio para perforar, agujerear o de otra forma romper la membrana celular de una célula para crear un puerto de entrada de material genético en la célula.

La presente invención puede utilizarse para inmunizar a un individuo contra todos los patógenos tales como virus, procariotas y organismos eucariotas patógenos tales como organismos unicelulares patógenos y parásitos multicelulares. La presente invención es particularmente útil para inmunizar a un individuo contra aquellos patógenos que infectan células y que no están encapsulados, tales como virus, y procariotas tales como Gonorrhoea, Listeria y Shigella. Además, la presente invención también es útil para inmunizar a un individuo contra patógenos de protozoos que tienen una etapa del ciclo vital en la que son patógenos intracelulares. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "patógeno intracelular" se refiere a un virus u organismo patógeno que, por lo menos durante parte de su ciclo reproductivo o vital, está presente dentro de una célula hospedadora en la que produce o provoca la producción de proteínas patógenas. La Tabla 1 proporciona una lista de algunas de las familias y géneros de virus para los que pueden prepararse vacunas. Las construcciones de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican los péptidos que contienen por lo menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado por un antígeno de un patógeno tal como los antígenos mencionados en las tablas son útiles para las vacunas. Además, los métodos y composiciones también son útiles para inmunizar a un individuo contra otros patógenos, incluidos patógenos procariotas y patógenos eucariotas que son protozoos, así como parásitos multicelulares tales como los presentados en la Tabla 2.

Con el objeto de producir una vacuna genética para la protección contra la infección por patógenos, el material genético que codifica proteínas inmunógenas contra las que puede provocarse una respuesta inmunitaria protectora debe ser incluido en la construcción genética. En el caso de que el patógeno produzca una infección intracelular, para la que la presente invención es particularmente útil, o extracelular, es poco probable que todos los antígenos de patógenos generen una respuesta protectora. Debido a que tanto el ADN como el ARN son relativamente pequeños y pueden producirse con relativa facilidad, la presente invención proporciona la ventaja adicional de posibilitar la vacunación con múltiples antígenos de patógenos. La construcción genética utilizada en la vacuna genética puede incluir material genético que codifica muchos antígenos de patógenos. Por ejemplo, pueden incluirse varios genes víricos en una sola construcción, proporcionando de esta manera múltiples dianas. Además, múltiples inóculos que pueden administrarse a diferentes células de un individuo pueden ser preparados para que incluyan de forma colectiva, en algunos casos, un conjunto de genes completo o, más preferentemente, un conjunto incompleto tal como un conjunto de genes casi completo en la vacuna. Por ejemplo, puede administrarse un conjunto completo de genes víricos utilizando dos construcciones que contienen, cada una, una mitad diferente del genoma que se ha de administrar en diferentes sitios. De este modo, puede generarse una respuesta inmunitaria contra cada antígeno sin riesgo de que se ensamble de un virus infeccioso. Esta estrategia hace posible la introducción de más de una sola diana antigénica, y puede eliminar la necesidad de identificar antígenos protectores.

La facilidad de manipulación y el carácter barato del ADN y del ARN contribuyen además a una mayor eficacia de los medios de cribado de antígenos protectores. Los genes pueden ordenarse y probarse de forma sistemática con mucha mayor facilidad que las proteínas. Se seleccionan los agentes y organismos patógenos contra los que se produce la vacuna para obtener protección y se identifica una proteína inmunógena. Las Tablas 1 y 2 incluyen listas de algunos de los agentes y organismos patógenos para los que pueden prepararse vacunas genéticas para proteger a un individuo de la infección por los mismos. En algunas formas de realización preferidas, los métodos para inmunizar a un individuo contra un patógeno están dirigidos contra el VIH, el HTLV o el VHB.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "enfermedades hiperproliferativas" se refiere a las enfermedades y trastornos caracterizados por la hiperproliferación de células. Los ejemplos de enfermedades hiperproliferativas incluyen todas las formas de cánceres y psoriasis.

Se ha descubierto que la introducción de una construcción genética que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína inmunógena expresada por una "célula hiperproliferante" en las células de un individuo da lugar a la producción de dichas proteínas en las células vacunadas de un individuo. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula hiperproliferante" se refiere a proteínas que están relacionadas con una enfermedad hiperproliferativa. Para inmunizar contra enfermedades hiperproliferativas, se administra a un individuo una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que está relacionada con una enfermedad hiperproliferativa.

Para que la proteína sea una diana inmunógena eficaz, tiene que ser una proteína que se produce exclusivamente, o a niveles más elevados, en células hiperproliferativas en comparación con células normales. Los antígenos diana incluyen dichas proteínas, fragmentos de las mismas y péptidos que comprenden por lo menos un epítopo presente en dichas proteínas. En algunos casos, dicha proteína es el producto de una mutación de un gen que codifica una proteína. El gen mutado codifica una proteína que es casi idéntica a la proteína normal, con la salvedad de que tiene una secuencia aminoácida ligeramente diferente que origina un epítopo distinto que no se encuentra en la proteína normal. Dichas proteínas diana incluyen proteínas codificadas por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y el gen de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Además de productos de oncogenes como antígenos diana, las proteínas diana para tratamientos antineoplásicos y pautas posológicas protectoras incluyen regiones variables de anticuerpos sintetizados por linfomas de células B y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T que, en algunas formas de realización, se utilizan también como antígenos diana en las enfermedades autoinmunitarias. También pueden utilizarse como proteínas diana otras proteínas asociadas a tumores, tales como proteínas que están presentes en elevados niveles en células tumorales, incluida la proteína reconocida por el anticuerpo monoclonal 17-1A y proteínas que se unen a folato.

Aunque puede utilizarse la presente invención para inmunizar a un individuo contra una o más de diversas formas de cáncer, la presente invención es particularmente útil para la inmunización profiláctica de un individuo que tiene predisposición a padecer un cáncer particular, o que ha tenido un cáncer y es, por consiguiente, susceptible de sufrir recaídas. Los avances en genética y en tecnología, así como en epidemiología, hacen posible la determinación de la probabilidad y de la valoración del riesgo de contraer cáncer que presenta un individuo. Utilizando cribado genético y/o los antecedentes médicos familiares, es posible predecir la probabilidad que tiene un individuo particular de contraer cualquiera de diversos tipos de cáncer.

De forma similar, los individuos que ya han tenido cáncer y han sido tratados para la eliminación del cáncer, o bien se encuentran en remisión, son particularmente susceptibles a recaídas y recidivas. Como parte de la pauta de tratamiento, dichos individuos pueden ser inmunizados contra el cáncer que les fue diagnosticado, para combatir una recidiva. De este modo, una vez que se sabe que un individuo ha tenido un tipo de cáncer y corre el riesgo de sufrir una recaída, puede ser inmunizado para preparar el sistema inmunitario para combatir cualquier futura aparición del cáncer.

Las composiciones de la presente invención pueden proporcionar un método para el tratamiento de individuos que padecen enfermedades hiperproliferativas. En dichos métodos, la introducción de construcciones genéticas sirve como inmunoterapia, dirigiendo y potenciando el sistema inmunitario del individuo para combatir las células hiperproliferativas que producen la proteína diana.

La composición de la presente invención también proporciona un método para el tratamiento de individuos que padecen enfermedades y trastornos autoinmunitarios, mediante la generación de una respuesta inmunitaria protectora de base amplia contra las dianas que están asociadas al problema autoinmunitario, incluidos receptores celulares y células que producen anticuerpos "contra sí mismas".

Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T incluyen la artritis reumatoide (AR), la esclerosis múltiple (EM), el síndrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes mellitus insulinodependiente (DMID), tiroiditis autoinmunitaria, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, esclerodermia, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por el hecho de que los receptores de células T se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a las enfermedades autoinmunitarias. La vacunación contra la región variable de las células T generaría una respuesta inmunitaria con inclusión de LTC para eliminar dichas células T.

En el caso de la AR, se han caracterizado varias regiones variables específicas de receptores de células T (RCT) que están involucrados en la enfermedad. Dichos RCT incluyen V\beta-3, V\beta-14, V\beta-17 y V\alpha-17. De este modo, la vacunación con una construcción de ADN que codifica por lo menos una de estas proteínas generará una respuesta inmunitaria que tendrá como objetivo las células T involucradas en la AR. Véase: Howell, M. D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253: 325-329; Williams, W. V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90: 326-333.

En el caso de la EM, se han caracterizado varias regiones variables específicas de RCT que están involucrados en la enfermedad. Dichos RCT incluyen V\beta-7 y V\alpha-10. De este modo, la vacunación con una construcción de ADN que codifica por lo menos una de estas proteínas generará una respuesta inmunitaria que tendrá como objetivo las células T involucradas en la EM. Véase: Wucherpfennig, K. W., et al., 1990 Science 248: 1016-1019; Oksenberg, J. R., et al., 1990 Nature 345: 344-346.

En el caso de la esclerodermia, se han caracterizado varias regiones variables específicas de RCT que están involucrados en la enfermedad. Dichos RCT incluyen V\beta-6, V\beta-8, V\beta-14 y V\alpha-16, V\alpha-3C, V\alpha-7, V\alpha-14, V\alpha-15, V\alpha-16, V\alpha-28 y V\alpha-12. De este modo, la vacunación con una construcción de ADN que codifica por lo menos una de estas proteínas generará una respuesta inmunitaria que tendrá como objetivo las células T involucradas en la esclerodermia.

Para tratar pacientes que padecen de una enfermedad autoinmunitaria mediada por células T, en particular aquellos para los que todavía no se ha caracterizado la región variable de los RCT, puede realizarse una biopsia sinovial. Pueden tomarse muestras de las células T presentes e identificarse la región variable de dichos RCT utilizando técnicas estándar. Pueden prepararse vacunas genéticas utilizando esta información.

Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por células B incluyen lupus (LES), enfermedad de Graves, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, asma, crioglobulinemia, esclerosis biliar primaria y anemia perniciosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por anticuerpos que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a las enfermedades autoinmunitarias. La vacunación contra la región variable de los anticuerpos generaría una respuesta inmunitaria que incluiría LTC para eliminar dichas células B que producen el anticuerpo.

Para tratar pacientes que padecen una enfermedad autoinmunitaria mediada por células B, es necesario identificar la región variable de los anticuerpos involucrada en la actividad autoinmunitaria. Puede realizarse una biopsia y pueden tomarse muestras de los anticuerpos presentes en el sitio de la inflamación. La región variable de dichos anticuerpos puede identificarse utilizando técnicas estándar. Pueden prepararse vacunas genéticas utilizando esta información.

En el caso del LES, se cree que un antígeno es el ADN. Así, en pacientes a los que se va a inmunizar contra el LES, puede hacerse un cribado de sus sueros en busca de anticuerpos contra el ADN, y puede prepararse una vacuna que incluye construcciones de ADN que codifican la región variable de dichos anticuerpos contra el ADN encontrados en los sueros.

Las características estructurales comunes entre las regiones variables de los RCT y los anticuerpos son bien conocidas. La secuencia de ADN que codifica un RCT o anticuerpo particular puede determinarse generalmente siguiendo métodos bien conocidos, tales como los descritos en Kabat, et al. 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Sanidad y Servicios Sociales de los EE. UU., Bethesda MD. Además, puede encontrarse un método general para la clonación de regiones variables funcionales de anticuerpos en Chaudhary, V. K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066.

En algunos ejemplos que se refieren a la terapia génica, las construcciones genéticas contienen genes compensadores o genes que codifican proteínas terapéuticas. Los ejemplos de genes compensadores incluyen un gen que codifica distrofina o un fragmento funcional, un gen para compensar el gen defectuoso en pacientes aquejados de fibrosis quística, una insulina, un gen para compensar el gen defectuoso en pacientes aquejados de deficiencia de ADA, y un gen que codifica el Factor VIII. Ejemplos de genes que codifican proteínas terapéuticas incluyen genes que codifican eritropoyetina, interferón, receptor de LDL, GM-CSF, IL-2, IL-4 y TNF. Además, pueden administrarse construcciones genéticas que codifican componentes de una sola de las cadenas de anticuerpos que se unen específicamente a sustancias tóxicas.

En algunos ejemplos, se proporciona el gen de la distrofina como parte de un mini-gen, que se utiliza para tratar individuos aquejados de distrofia muscular. En algunas formas de realización preferidas, se proporciona un mini-gen que contiene una secuencia que codifica una proteína parcial de distrofina. Las anomalías de la distrofina son responsables tanto del trastorno menos grave llamado distrofia muscular de Becker (BMD) como del trastorno más grave llamado distrofia muscular de Duchenne (DMD). En la BMD se sintetiza distrofina, pero su tamaño y/o cantidad son anómalos. El paciente presenta una debilidad leve a moderada. En la DMD no se sintetiza la proteína y el paciente queda confinado a una silla de ruedas hacia los 13 años, y generalmente fallece hacia los 20 años. En algunos pacientes, en particular los aquejados de BMD, la síntesis parcial de la proteína distrofina producida por expresión de un mini-gen administrado como se describe en la presente memoria puede mejorar la función muscular.

En algunos ejemplos, se administran genes que codifican IL-2, IL-4, interferón o TNF a células tumorales que están presentes o que se eliminan y después se introducen en el individuo. En algunos ejemplos, se administra un gen que codifica interferón gamma a un individuo aquejado de esclerosis múltiple.

También pueden administrarse moléculas antisentido y ribozimas a las células de un individuo mediante la introducción de material genético que actúa como molde para copias de dichos agentes activos. Estos agentes inactivan o interfieren de algún otro modo con la expresión de genes que codifican proteínas cuya presencia no es deseable. Las construcciones que contienen secuencias que codifican moléculas antisentido pueden utilizarse para inhibir o prevenir la producción de proteínas en el interior de las células. De este modo, puede eliminarse o reducirse la producción de proteínas tales como productos de oncogenes. De modo similar, las ribozimas pueden interferir con la expresión de genes mediante la destrucción selectiva de ARN mensajero antes de su traducción en proteínas.

En algunos ejemplos se tratan células utilizando construcciones que codifican moléculas antisentido o ribozimas como parte de una pauta terapéutica que implica la administración de otros productos terapéuticos y procedimientos. Las construcciones genéticas que codifican moléculas antisentido y ribozimas emplean vectores similares a los utilizados cuando se desea la producción de proteínas, con la salvedad de que la secuencia codificante no contiene un codón de iniciación para iniciar la traducción del ARN en proteínas.

Pueden utilizarse los vectores descritos en el Ejemplo 36, en particular aquellos que contienen un origen de replicación y una forma expresable del antígeno nuclear adecuado.

Las ribozimas son ARN catalíticos, que son capaces de autoescisión o de escisión de otra molécula de ARN. Se conoce en la técnica varios tipos distintos de ribozimas, tales como el de cabeza de martillo y el de horquilla, el del intrón del grupo I de Tetrahymena, el de cabeza de hacha, y la ARNasa P, que son conocidos en la técnica. (S. Edgington, Biotechnology 1992 10, 256-262.) Las ribozimas de cabeza de martillo poseen un sitio catalítico que ha sido cartografiado a un núcleo de menos de 40 nucleótidos. Varias ribozimas en viroides de plantas y ARN satélites comparten una estructura secundaria común y ciertos nucleótidos conservados. Aunque estas ribozimas sirven de forma natural como su propio sustrato, el dominio de enzima puede dirigirse a otros sustratos de ARN mediante apareamiento de bases con secuencias que flanquean el sitio de corte conservado. Esta capacidad para diseñar a medida ribozimas ha hecho posible su utilización para la escisión del ARN específica de secuencia (G. Paolella et al., EMBO 1992, 1913-1919). Por consiguiente, estará al alcance de un experto en la materia la utilización de diferentes secuencias catalíticas procedentes de varios tipos de ribozimas, tales como la secuencia catalítica de cabeza de martillo, para diseñarlas de la forma descrita en la presente memoria. Las ribozimas pueden diseñarse para ser dirigidas contra diversas dianas, incluidas secuencias de nucleótidos de patógenos y secuencias oncogénicas. Otros métodos incluyen suficiente complementariedad para dirigir específicamente el transcrito de fusión abl-bcr mientras se mantiene la eficacia de la reacción de escisión.

La construcción genética puede administrarse a un individuo utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. La construcción genética puede administrarse de forma simultánea a un individuo por vía intradérmica, subcutánea e intramuscular utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección sin aguja son bien conocidos y de amplia difusión en el mercado. Un experto en la materia puede seguir las descripciones de la presente memoria y utilizar dispositivos de inyección sin aguja para suministrar material genético a las células de un individuo. Los dispositivos de inyección sin aguja se prestan bien a la administración de material genético a todos los tejidos. Son particularmente útiles para la administración de material genético a las células de la piel y del músculo. Puede utilizarse un dispositivo de inyección sin aguja para impulsar un líquido que contiene moléculas de ADN hacia la superficie de la piel del individuo. El líquido se impulsa a suficiente velocidad, de modo que al impactar con la piel el líquido penetre en la superficie de la piel, atraviese la piel y se introduzca en el tejido muscular subyacente. De este modo, el material genético se administra de forma simultánea por vía intradérmica subcutánea e intramuscular. Puede utilizarse un dispositivo de inyección sin aguja para suministrar material genético a tejidos de otros órganos con el objeto de introducir una molécula de ácido nucleico en las células de dicho órgano.

Las construcciones genéticas pueden administrarse directamente al individuo que va a ser inmunizado, o bien pueden introducirse ex vivo en células extraídas del individuo, que se reimplantan después de la administración. El material genético puede introducirse por cualquiera de dichas vías en las células presentes en el organismo del individuo. Las vías de administración incluyen, sin limitarse a las mismas, vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular y oral, así como por vía transdérmica o mediante inhalación o supositorios. Las vías de administración preferidas incluyen la inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. La administración de construcciones genéticas que codifican proteínas diana puede conferir inmunidad mucosal a individuos inmunizados por una vía de administración en la que el material se presenta en tejidos asociados con la inmunidad mucosal. De este modo, en algunos ejemplos, la construcción genética se suministra por administración en la cavidad bucal de un individuo.

Las construcciones genéticas pueden administrarse por medios que incluyen, sin limitarse a los mismos, jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin aguja, o "pistolas génicas para el bombardeo de microproyectiles". Como alternativa, la vacuna genética puede introducirse por varios medios en las células que han sido extraídas del individuo. Dichos medios incluyen, por ejemplo, transfección ex vivo, electroporación, microinyección y bombardeo de microproyectiles. Una vez captada la construcción genética por las células, se reimplantan las células en el individuo. Se contempla que células que no son inmunógenas a las que se han incorporado construcciones genéticas puedan implantarse en el individuo incluso si las células vacunadas fueron extraídas originalmente de otro
individuo.

Las vacunas genéticas y medicamentos genéticos comprenden aproximadamente 1 nanogramo hasta aproximadamente 1000 microgramos de ADN. Las vacunas y medicamentos pueden contener aproximadamente 10 nanogramos hasta aproximadamente 800 microgramos de ADN. Las vacunas y medicamentos pueden contener de aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 500 microgramos de ADN. Las vacunas y medicamentos pueden contener de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 350 microgramos de ADN. Las vacunas y medicamentos pueden contener de aproximadamente 25 hasta aproximadamente 250 microgramos de ADN. Las vacunas y medicamentos pueden contener aproximadamente 100 microgramos de ADN.

Las vacunas genéticas y medicamentos genéticos se formulan de conformidad con la forma de administración que se va a utilizar. El experto en la materia puede formular fácilmente una composición farmacéutica que comprende una construcción genética. En los casos en los que se escoge la inyección intramuscular como forma de administración, se utiliza preferentemente una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para lograr la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos son preferidas soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizantes incluyen gelatina y albúmina. Puede añadirse un agente de vasoconstricción a la formulación. Las preparaciones farmacéuticas según la presente invención se proporcionan estériles y exentas de pirógenos.

Las construcciones genéticas de la invención se formulan con un facilitador de vacunas genéticas. El FVG aumenta la captación y/o la expresión de la construcción genética por las células, en comparación con el caso en el que se administra una vacuna genética idéntica en ausencia del FVG. El FVG se selecciona a partir de lípidos aniónicos, lectinas, compuestos estrogénicos, alquilos inferiores hidroxilados, dimetilsulfóxido (DMSO) y urea. El FVG facilita la captación de las construcciones genéticas por las células. El FVG también estimula la división celular y facilita la captación de las construcciones genéticas. La administración de FVG que facilitan la captación de las construcciones genéticas por las células da lugar a una mayor eficacia de la administración y de la expresión del material genético. El agente facilitador de vacunas genéticas preferentemente facilita la captación de ADN por las células y/o aumenta la respuesta inflamatoria.

Ejemplos de lípidos aniónicos útiles como facilitadores de vacunas genéticas incluyen las sales de los ácidos láurico y oleico, así como los ácidos láurico y oleico, alcoholes sulfatados que están neutralizados con ácido sulfúrico, ésteres de ácidos con alcohol laurilo y cetilo, incluidos laurilsulfato de sodio y sulfatos de alquil-polioxietileno. También pueden utilizarse sulfonatos tales como sulfosuccinato de dioctilo y sodio. Las sales de potasio, sodio y amonio de los ácidos láurico y oleico son solubles en agua y son buenos agentes emulsionantes del tipo de aceite en agua. Las sales de calcio, magnesio y aluminio de estos ácidos grasos son insolubles en agua, y dan lugar a emulsiones de agua en aceite. Estos compuestos son aditivos farmacéuticos de amplia utilización en ungüentos, polvos dentríficos y otras diversas preparaciones farmacéuticas como agentes emulsionantes, detergentes y humectantes. Ejemplos de dichos agentes de facilitación para vacunas genéticas de la invención son laurato de sodio, laurato de potasio, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de potasio, laurilsulfato de amonio, ácido láurico, ácido oleico, sulfosuccinato de dioctilo y sodio. Los facilitadores de vacunas genéticas preferidos son laurilsulfato de sodio y ácido oleico.

El laurilsulfato de sodio N.F. (monododecil-sulfato de sodio) es una mezcla de alquil-sulfatos de sodio que consta principalmente de laurilsulfato de sodio, y que está comercializado para su utilización farmacéutica (por ejemplo, Duponol®C/DuPont; Gardinol®WA/Proctor & Gamble). Se trata de un compuesto muy hidrófilo, que tiene un valor de HLB (balance hidrófilo/lipófilo) de 40. Las preparaciones pueden formularse para la administración parenteral en forma de agente facilitador de vacunas genéticas que contiene 0,1 mg a 100 mg de laurilsulfato de sodio por ml, preferentemente 1 mg a 10 mg, en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, preferentemente agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, u otro líquido acuoso para inyección, aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Pueden utilizarse otras dosis y concentraciones que logren la facilitación deseada del efecto de la construcción genética. Para esta aplicación, se inyecta el laurilsulfato de sodio en el lugar de la administración de la construcción genética, bien antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la administración de la construcción genética.

El ácido oleico N.F. consta principalmente de ácido (Z)-9-octadecenoico junto con cantidades variables de otros ácidos grasos tales como ácidos linolénico y esteárico. Las preparaciones de ácido oleico pueden formularse para la administración parenteral en forma de agente de facilitación de vacunas genéticas que contiene 0,1 mg de 100 mg de ácido oleico por ml, preferentemente 1,0 mg a 10 mg, en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, preferentemente agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, u otro líquido acuoso para inyección, aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Pueden utilizarse otras dosis y concentraciones que logren la facilitación deseada del efecto de la construcción genética. Para esta aplicación, se inyecta el ácido en el lugar de la administración de la construcción genética, bien antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la administración de la construcción genética.

Las enzimas activas en la matriz extracelular son hidrolasas que catalizan relaciones hidrolíticas que sirven para degradar componentes de la matriz extracelular que rodea a las células de los tejidos. Los ejemplos de enzimas activas en la matriz extracelular incluyen: colagenasa, hialuronidasa, que cuando se administran en combinación con una construcción para vacuna antivírica, se administran junto con un genoma vírico incompleto. Además, se contemplan otras enzimas que degradan componentes estructurales de los tejidos, tales como amilasa y tripsina.

La colagenasa (clostridiopeptidasa A) es un producto de Clostridium histolyticum. Se trata de una enzima proteolítica que degrada el colágeno natural no desnaturalizado a pH y temperatura fisiológicos. El colágeno constituye aproximadamente el 75% del peso seco de la piel. La colagenasa puede prepararse siguiendo el procedimiento de Keller et al., 1963 Arch. Biochem. Biophys. 101: 81. Está disponible en el mercado en forma de ungüento que contiene 250 unidades/gramo (Santyl®, Knoll). Pueden formularse preparaciones para la administración parenteral que contienen 1,0 a 1.000 unidades de colagenasa por ml en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, por ejemplo, agua estéril para inyecciones, cloruro de sodio inyectable, u otro líquido acuoso para inyección, aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Pueden utilizarse otras dosis y concentraciones, por ejemplo, 5,0 a 500 unidades, preferentemente 10 a 100 unidades, que logren la facilitación deseada del efecto de la construcción genética. Para esta aplicación, la colagenasa se inyecta en el lugar de la administración de la construcción genética, bien antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la administración de la construcción genética.

La hialuronidasa es una enzima de mamíferos capa de hidrolizar mucopolisacáridos del tipo del ácido hialurónico. La hialuronidasa inyectable está disponible para su utilización farmacéutica en seres humanos (Wydase® Wyeth-Ayerst). La hialuronidasa despolimeriza el polímero de ácido hialurónico que sirve de cemento intracelular que mantiene unidas las células del parénquima de los órganos, con lo que se acelera la dispersión subcutánea tanto de material particulado como de soluciones, lo que se traduce en una más amplia distribución de los fármacos en los espacios de los tejidos y se facilita su absorción. La absorción está asociada al movimiento del fármaco desde lugar de la inyección al sistema vascular; no obstante, se ha demostrado recientemente que la hialuronidasa también actúa como facilitador de vacunas genéticas. Para esta aplicación, la hialuronidasa se inyecta en el lugar de la administración de la construcción genética, bien antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la administración de la construcción genética. La hialuronidasa inyectable está comercializada en formas farmacéuticas que contienen 150 y 1.500 unidades. Una dosis de 150 unidades puede disolverse en 1 ml de cloruro de sodio inyectable e inyectarse directamente, o bien diluirse adicionalmente con una solución adecuada para hipodermoclisis, para su administración por hipodermoclisis. Pueden utilizarse otras dosis y concentraciones que logren la facilitación deseada del efecto de la construcción genética, por ejemplo, 100 a 1.000 unidades hialuronidasa por ml, preferentemente 10 a 100 unidades/ml, en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, por ejemplo, agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, o algún otro líquido acuoso aceptable para inyección. Para esta aplicación, la hialuronidasa se inyecta en el lugar de la administración de la construcción genética, bien antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la administración de la construcción
genética.

En algunas formas de realización de la invención, el FVG que se administra junto con la construcción génica es una lectina. El término lectinas se refiere un grupo de proteínas o glucoproteínas que se unen a azúcares, que no son de origen inmunitario, y que aglutinan células y/o precipitan glucoconjugados. Las lectinas están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se encuentran principalmente en las semillas de plantas, aunque también están presentes en las raíces, las hojas y la corteza, así como en invertebrados tales como almejas, caracoles, cangrejos de herradura y varias especies de vertebrados. Las lectinas se caracterizan por su capacidad de aglutinar eritrocitos y muchos otros tipos de células. Las lectinas se describen en las páginas 1670-1699 de la edición de 1992 del catálogo de SIGMA Chemical Co.: "Biochemicals, Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents", y en las páginas 1799-1810 de la edición de 1994.

Los ejemplos de lectinas incluyen concanavalina A, abrina, aglutinina de soja y aglutinina de germen de trigo. En algunas formas de realización, las lectinas son preferentemente no glucoproteicas; es decir, no tienen carbohidratos unidos covalentemente.

Una lectina no glucoproteica preferida es la concanavalina A (Con A), que está comercializada por Sigma Chemical Co. San Luis, Mo. La Con A puede aislarse de la judía de caballo, Canavalia ensiformis, Papilionatae (véase Sumner, J. B. y S. F. Howell, 1936, J. Bacteriol. 32: 227). La Con A aglutina diversas líneas celulares mediante interacciones específicas con receptores de la superficie celular que contienen carbohidratos. La Con A tiene un peso molecular de 27.000 y está en forma de dímero a pH 6, y en forma de tetrámeros a pH fisiológico. La secuencia aminoácida de la Con A se describe en Edelman et al. 1972 Proc. Natl. Acad. Science USA 69: 2580.

Pueden formularse preparaciones que contienen lectinas para la administración parenteral en forma de agente de facilitación de vacunas genéticas que contiene 0,1 \mug mg a 1,0 mg de una lectina seleccionada por ml, preferentemente 1,0 \mug a 100 \mug, en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, preferentemente agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, u otro líquido acuoso para inyección, aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Pueden utilizarse otras dosis y concentraciones que logren la facilitación deseada del efecto de la construcción genética. Para esta aplicación, la lectina se inyecta en el lugar de la administración de la construcción genética, bien antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la administración de la construcción genética.

Pueden formularse preparaciones que contienen Con A para la administración parenteral en forma de agente de facilitación de vacunas genéticas que contiene 0,1 \mug a 1,0 mg de Con A por ml, preferentemente 1,0 \mug a 100 \mug, en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, preferentemente agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, u otro líquido acuoso para inyección, aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Pueden utilizarse otras dosis y concentraciones que logren la facilitación deseada del efecto de la construcción genética. Para esta aplicación, la Con A se inyecta en el lugar de la administración de la construcción genética, bien antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la administración de la construcción genética.

Otro grupo de FVG incluye compuestos estrogénicos y derivados de los mismos. Los derivados de compuestos estrogénicos pueden ser hormonas esteroideas. Las hormonas esteroideas preferidas se seleccionan a partir del grupo formado por: \beta-estradiol y análogos y derivados del mismo estrechamente relacionados.

Pueden utilizarse tanto estrógenos naturales como sintéticos. Hay muchos compuestos comercializados. Ciertos compuestos estrogénicos no esteroideos, tales como el dietilestilbestrol tiene mayor biodisponibilidad y su síntesis es menos cara. Véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 18ª. edición, Gennaro Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA. 18042 (1990), incluido el capítulo 50, "Hormones".

El estradiol, 17-b-estradiol, (17b)-estra-1,3,5(10)-trieno-3,17-diol es la hormona estrogénica natural más potente de los mamíferos. Dado que es casi insoluble en agua, las formulaciones de líquidos parenterales pueden utilizar ésteres aceptables desde el punto de vista farmacéutico tales como el 3-benzoato de estradiol, 17b-cipionato de estradiol, 17-propionato o dipropionato de estradiol, hemisuccinato, 17-heptanoato (enantato), 17-undecanoato (undecilato), 17-valerato. Una crema vaginal que contiene 0,01% de estradiol está comercializada para uso tópico.

\alpha-estradiol, y ésteres tales como \alpha-estradiol-diacetato o -3-benzoato.

El estriol, estra-1,3,5(10)-trieno-3,16,17-triol, es un metabolito estrogénico del estradiol que es menos potente.

La estrona, 3-hidroxiestra-1,3,5(10)-trieno-17-ona, y ésteres tales como acetato, propionato, sulfato, sulfato de piperazina. La estrona está comercializada en forma de suspensión acuosa que contiene 20 y 50 mg de estrona/10 ml.

Las hormonas estrogénicas conjugadas constituyen un producto natural que contiene formas conjugadas hidrosolubles de estrógenos mixtos, obtenidos de la orina de yeguas preñadas. Se trata de un producto hidrosoluble que está comercializado en una formulación que puede reconstituirse para obtener una concentración de 25 mg/5 ml para inyección intravenosa o intramuscular,; y en forma de crema vaginal que contiene 0,625 mg de estrógenos conjugados/gramo (Premarin®/Wyeth-Ayerst).

También pueden utilizarse homólogos de estrógenos, tales como etinil-estradiol.

El compuesto o compuestos estrogénicos deseados pueden seleccionarse en la práctica a partir de diversos productos comercializados para su utilización farmacéutica en seres humanos, preferentemente productos en formulación líquida parenteral. Para lograr la inmunidad mucosal, por ejemplo, la inmunidad de la mucosa vaginal, puede utilizarse una formulación tópica tal como una crema o gelatina con estrógenos. Dado que lo que se desea es la facilitación de la actividad del ácido nucleico en el sitio de administración del ácido nucleico, en vez de la actividad estrogénica u hormonal sistémica, se seleccionará preferentemente una dosis y concentración que logre el efecto local deseado sin actividad estrogénica u hormonal sistémica significativa. Las preparaciones con estrógenos pueden formularse para la administración parenteral en forma de agente de facilitación de vacunas genéticas que contiene 0,001 mg/ml a 10 mg/ml de compuesto estrogénico por ml, preferentemente 0,01 mg/ml a 1,0 mg/ml, en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, preferentemente agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, u otro líquido acuoso para inyección, aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Pueden utilizarse otras dosis y concentraciones que logren la facilitación deseada del efecto de la construcción genética. Para esta aplicación se inyecta un compuesto estrogénico en el lugar de la administración de la construcción genética, bien antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la administración de la construcción genética. La optimización de la dosis/concentración puede lograrse utilizando la metodología y experimentación habitual conocidas por los expertos en farmacología y ciencias farmacéuticas. Pueda administrarse una dosis y concentración que proporcione la facilitación deseada de la captación y/o del aumento de la expresión o de la respuesta inmunitaria a las construcciones genéticas en las células. El compuesto o compuestos estrogénicos deseados pueden administrarse antes, después, y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la construcción deseada de ácido nucleico.

Se ha comprobado que los alquilos inferiores hidroxilados tienen actividad facilitadora de vacunas genéticas. Los alquilos inferiores hidroxilados incluyen etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, y glicerol; y son preferentemente etanol y glicerol.

El etanol está comercializado para su utilización farmacéutica; puede diluirse en agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, u otro líquido inyectable aceptable desde el punto de vista farmacéutico, y utilizarse en concentraciones de 0,01 a 100% (v/v), preferentemente 0,1 a 10%, más preferentemente aproximadamente 5%, para facilitar la actividad de una construcción de ácido nucleico. Puede administrarse antes, después, y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la construcción deseada de ácido nucleico.

La glicerina o glicerol (1,2,3-propanotriol) está comercializada para su utilización farmacéutica. Puede diluirse en agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, u otro líquido acuoso para inyección, aceptable desde el punto de vista farmacéutico, y utilizarse en concentraciones de 0,1 a 100% (v/v), preferentemente 1,0 a 50% más preferentemente aproximadamente 20% v/v, para facilitar la actividad de una construcción de ácido nucleico. Puede administrarse antes, después y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la construcción deseada de ácido nucleico.

Otro FVG es el DMSO, que es un disolvente aprótico con una notable capacidad de potenciación de la penetración de muchos fármacos aplicados localmente. Está autorizado para su utilización por instilación en la vejiga para el tratamiento de la cistitis intersticial. Cuando se aplica localmente a concentraciones por encima del 50%, el DMSO degrada el colágeno y tiene efectos antiinflamatorios y de anestésico local.

El DMSO puede diluirse en agua estéril para inyecciones, o en cloruro de sodio para inyecciones, u otro líquido acuoso para inyección, aceptable desde el punto de vista farmacéutico, y se utiliza a concentraciones de 0,1 a 100% (v/v), preferentemente 1,0 a 50%, más preferentemente aproximadamente 20% v/v, para facilitar la actividad de una construcción de ácido nucleico. Puede administrarse, agentes, después, y/o de forma simultánea, preferentemente de forma simultánea, a la construcción deseada de ácido nucleico.

La urea, H_{2}NCONH_{2}, que es el producto terminal natural del metabolismo de las proteínas y que se excreta normalmente por los riñones, es asimismo un FVG. Dos moléculas de amoníaco reaccionan con una molécula de dióxido de carbono para formar una molécula de agua y una molécula de urea. La urea se comercializa para varias utilizaciones farmacéuticas. La urea se utiliza por vía intravenosa en forma de solución de urea al 30% en solución de dextrosa al 5 ó 10% como diurético osmótico, para reducir la presión intracraneal causada por el edema cerebral y para reducir la presión intraocular. También se utiliza por vía tópica para diversas aplicaciones dermatológicas, incluidas psoriasis y dermatitis atópica, y para eliminar el exceso de queratina de la piel.

Pueden formularse preparaciones con urea para la administración parenteral que contienen 0,1 a 1000 mg por ml en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como cloruro de sodio para inyecciones USP, agua para inyecciones, USP, inyección de dextrosa al 5%, o inyección de dextrosa al 10%. Pueden utilizarse otras dosis y concentraciones, por ejemplo, 1,0 a 100 mg/ml, preferentemente 60 mg/ml (aproximadamente 1 M), que logren la facilitación deseada del efecto de la construcción genética.

En algunos métodos, se somete primero el individuo a inyección con FVG antes de la administración de la vacuna genética por inyección intramuscular. Ello significa, por ejemplo, hasta un máximo de aproximadamente una semana a diez días antes de la vacunación, se inyecta primero al individuo un FVG. En algunos métodos, antes de la vacunación, se inyecta primero al individuo un FVG aproximadamente 1 a 5 días antes de la administración de la construcción genética. En algunos métodos, antes de la vacunación, se inyecta primero al individuo un FVG aproximadamente 24 h antes de la administración de la construcción genética. Como alternativa, puede inyectarse un FVG de forma simultánea, minutos antes o después de la vacunación. Por consiguiente, el FVG y la construcción genética pueden combinarse e inyectarse de forma simultánea en una mezcla. En algunos métodos, el FVG se administra después de la administración de la construcción genética. Por ejemplo, hasta un máximo de aproximadamente una semana a diez días después de la administración de la construcción genética, se inyecta al individuo un FVG. En algunos métodos, se inyecta primero al individuo un FVG aproximadamente 24 h tras la vacunación. En algunos métodos, se inyecta primero al individuo un FVG aproximadamente 1 a 5 días tras la vacunación. En algunos métodos, se administra al individuo un FVG hasta un máximo de aproximadamente una semana a diez días tras la
vacunación.

Como alternativa, pueden administrarse combinaciones de agentes FVG junto con las construcciones genéticas.

Además, otros agentes que pueden funcionar como agentes de transfección y/o agentes de replicación y/o agentes inflamatorios, y que pueden administrarse conjuntamente con un FVG, incluyen factores de crecimiento, citocinas y linfocinas tales como \alpha-interferón, gamma-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12, así como el factor de crecimiento de fibroblastos, agentes con actividad superficial tales como complejos estimuladores del sistema inmunitario (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, análogos de LPS incluido el monofosforil-lípido A (MPL), muramil-péptidos, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno, y ácido hialurónico, que pueden administrarse también junto con la construcción genética. En algunos métodos, se administran combinaciones de estos agentes junto con un FVG y la construcción genética.

La construcción genética puede combinarse con colágeno en forma de emulsión, y administrarse por vía parenteral. La emulsión de colágeno proporciona un medio para la liberación sostenida de ADN. Se utilizan 50 \mul a 2 ml de colágeno. En un método preferido, se combinan aproximadamente 100 \mug de ADN con 1 ml de colágeno utilizando esta formulación. Otras formulaciones de liberación sostenida se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia en este campo.

Dichas formulaciones incluyen suspensiones acuosas, soluciones y suspensiones en aceite, emulsiones e implantes, así como depósitos y dispositivos transdérmicos. En algunos métodos, son preferidas las formulaciones de liberación retardada para la administración de las construcciones. En algunos métodos, es preferible que la construcción genética se libere de forma retardada entre 6 y 144 horas, preferentemente entre 12 y 96 horas, más preferentemente entre 18 y 72 horas.

Las construcciones genéticas de la presente invención pueden inyectarse con un dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección sin aguja son particularmente útiles para la administración simultánea de material por vía intramuscular, intradérmica y subcutánea.

En algunos métodos, la construcción genética se administra con un FVG utilizando un procedimiento de bombardeo de partículas con microproyectiles como el descrito por Sanford et al. en la patente U.S. n.º 4.945.050, publicada el 31 de julio de 1990.

En algunos métodos, se somete al individuo a una sola vacunación, para producir una respuesta inmunitaria completa y amplia. En algunos métodos, se somete al individuo a una serie de vacunaciones para producir una respuesta inmunitaria completa y amplia. Se administran por lo menos dos, y en ocasiones de cuatro a cinco, inyecciones durante un período de tiempo. El período de tiempo entre las inyecciones puede incluir desde 24 horas hasta dos semanas, a veces una sola semana. Como alternativa, se administran por lo menos dos, y hasta un máximo de cuatro, inyecciones independientes de forma simultánea en diferentes lugares.

Una vacunación completa puede incluir la inyección de un solo inóculo que contiene una construcción genética que incluye secuencias que codifican uno o más epítopos diana, o puede incluir la inyección de dos o más inóculos diferentes en lugares distintos. Por ejemplo, una vacuna contra el VIH puede comprender dos inóculos en los que cada uno comprende material genético que codifica proteínas víricas distintas. Este método de vacunación permite la introducción de un conjunto más completo de genes víricos en el individuo, sin riesgo de que se ensamble una partícula vírica infecciosa. De este modo, puede generarse una respuesta inmunitaria contra la mayor parte o contra todos los virus en el individuo vacunado. La inyección de cada inóculo se realiza en lugares diferentes, preferentemente separados de modo que se garantice que ninguna célula reciba ambas construcciones genéticas. Como precaución de seguridad adicional, pueden eliminarse o alterarse algunos genes para prevenir aún más la posibilidad de ensamblaje de un virus infeccioso.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "kit farmacéutico" se refiere de forma colectiva a un inóculo múltiple.

Dichos kits incluyen envases separados que contienen diferentes inóculos y/o FVG. El objetivo es proporcionar estos kits para que incluyan un conjunto de inóculos utilizados en métodos de inmunización y/o métodos tera-
péuticos.

Las composiciones de la presente invención son útiles tanto en medicina como en veterinaria. Por consiguiente, la presente invención se refiere a la inmunización genética de mamíferos, aves y peces. Las composiciones de la presente invención pueden ser particularmente útiles para especies de mamíferos, incluidos los seres humanos, especies bovinas, ovinas, porcinas, equinas, caninas y felinas.

Los Ejemplos presentados a continuación incluyen ejemplos representativos de aspectos de la presente invención. Los ejemplos se ofrecen a título ilustrativo, sin que supongan limitación del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1

La presente invención proporciona una vacuna contra el VIH que utiliza inmunización genética directa. Se proporcionan construcciones genéticas que, cuando se administran a las células de un individuo, se expresan y producen proteínas del VIH. Según algunas formas de realización, la producción de todas las proteínas víricas estructurales en las células del individuo genera una respuesta inmunitaria protectora que protege contra la infección por VIH. La vacuna contra el VIH de la presente invención puede utilizarse para inmunizar individuos no infectados contra la infección por VIH, o puede servir como inmunoterapia para aquellos individuos que ya están infectados. La vacuna contra el VIH de la presente invención genera una respuesta inmunitaria que incluye LTC que reconocen y atacan células infectadas por el VIH y reconocen un amplio espectro de proteínas del VIH. Así se protege a los individuos no infectados de la infección por VIH.

Se describe un método para inmunizar a un individuo contra el VIH mediante la administración de dos inóculos. Estos dos inóculos comprenden por lo menos dos y preferentemente más de dos, un gran número, o todos los genes del virus del VIH. Sin embargo, los inóculos no se administran juntos. Por consiguiente, una célula inoculada no recibirá un conjunto completo de genes. El individuo vacunado recibirá por lo menos dos genes diferentes, y preferentemente más de dos, más preferentemente un gran número, o todos los genes víricos. Así pueden dirigirse las respuestas inmunitarias al conjunto total de proteínas diana del VIH.

Esta estrategia aumenta la probabilidad de que el material genético que codifica la proteína diana más eficaz quede incluido en la vacuna, y reduce la probabilidad de que una partícula vírica no sea detectada por la respuesta inmunitaria a pesar de los cambios estructurales en una o más proteínas víricas que tienen lugar cuando el virus sufre mutaciones. Por consiguiente, es deseable la vacunación de un individuo con un grupo múltiple y preferentemente un conjunto casi completo o completo de genes que codifican proteínas víricas.

Si una célula recibe un conjunto completo de genes víricos es posible que se ensamble un virus completo infeccioso en el interior de la célula. Por consiguiente, no se proporciona una construcción genética con dicho conjunto completo de genes. Además, se administran dos o más inóculos, que tienen cada uno un conjunto incompleto de genes y que se combinan para formar un conjunto completo de genes víricos, a células diferentes, preferentemente situadas en lugares distintos, para garantizar que ninguna de las células vacunadas se vea expuesta de forma inadvertida a un conjunto completo de genes. Por ejemplo, puede insertarse una porción del genoma del VIH en una primera construcción, y la porción restante del genoma del VIH se inserta en una segunda construcción. La primera construcción se administra a un individuo en forma de vacuna genética en el tejido muscular de un brazo, mientras que la segunda construcción se administra a un individuo en forma de vacuna genética en el tejido muscular del otro brazo del individuo. El individuo puede quedar expuesto a un conjunto completo de genes víricos, de modo que quede esencialmente vacunado contra el virus completo, pero sin riesgo de que se ensamble una partícula vírica infecciosa.

Como precaución de seguridad adicional, incluso cuando se administra el material genético en dos o más inóculos en partes separadas del cuerpo del individuo, uno o más genes esenciales pueden ser eliminados o alterados de forma intencional para garantizar que no se forme una partícula vírica infecciosa. En dichos ejemplos, el individuo no recibe un conjunto completo funcional de genes víricos.

Otra precaución de seguridad adicional proporciona porciones no superpuestas del genoma vírico en las construcciones genéticas separadas que se incorporan respectivamente en los distintos inóculos. De este modo se previene la recombinación entre dos construcciones genéticas.

En algunos ejemplos, se proporciona un conjunto completo de genes estructurales. Los genes estructurales del VIH están formados por gag, pol y env. Estos tres genes se proporcionan en dos construcciones diferentes de ADN o ARN. De este modo, en una realización preferida, gag y pol se incorporan en una construcción de ADN o ARN y env se incorpora en otra. En otro ejemplo, gag se incorporan una construcción de ADN o ARN y pol y env se incorporan en otra. En otro ejemplo, gag y env se incorporan en una construcción de ADN o ARN y pol se incorpora en otra. En algunos ejemplos, las construcciones que contienen rev tienen un aceptor de corte y empalme situado corriente arriba del codón de iniciación de rev. En algunos ejemplos, las construcciones que contienen gag tienen un donador de corte y empalme situado corriente arriba del codón de iniciación de la traducción de gag. Opcionalmente, en cualquiera de dichas combinaciones, también pueden estar presentes los genes reguladores del VIH. Los genes reguladores del VIH son: vpr, vif, vpu, nef, tat y rev.

La construcción de ADN puede constar de un promotor, un potenciador y una señal de poliadenilación. El promotor puede seleccionarse a partir del grupo formado por: LTR del VIH, actina humana, miosina humana, CMV, RSV, Moloney, MMTV, hemoglobina humana, creatina de músculo humana y VEB. El potenciador puede seleccionarse a partir del grupo formado por: actina humana, miosina humana, CMV, RSV, hemoglobina humana, creatina de músculo humana y VEB. La señal de poliadenilación puede seleccionarse a partir del grupo formado por: señal de poliadenilación del LTR y señal de poliadenilación del SV40, en particular la señal de poliadenilación secundaria del SV40, entre otras.

La vacuna con dos inóculos puede administrarse por vía intramuscular en tejidos separados del individuo, preferentemente en distintas extremidades, como por ejemplo en los brazos derecho e izquierdo. Cada inóculo puede contener desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1.000 microgramos de ADN. Cada inóculo puede contener aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 microgramos de ADN. Cada inóculo puede contener aproximadamente 25 hasta aproximadamente 250 microgramos de ADN. Cada inóculo puede contener aproximadamente 100 microgramos de ADN.

En algunos ejemplos el inóculo está en un vehículo isotónico estéril, preferentemente solución salina tamponada con fosfato o solución salina.

Antes de la administración de la vacuna, se inyecta al tejido que se va a vacunar un facilitador de vacunas genéticas, como se ha descrito y explicado anteriormente. Las inyecciones de los FVG pueden llevarse a cabo hasta aproximadamente 24 horas antes de la vacunación. Se contempla que los FVG se administren inmediatamente antes o de forma simultánea a la administración de la construcción génica. El FVG se administra en el lugar que va a recibir la construcción génica. También se contempla que el FVG pueda administrarse tras la administración de las construcciones genéticas, por ejemplo: inmediatamente después.

En otros ejemplos, un facilitador de vacunas genéticas como se ha descrito y explicado anteriormente se administra junto con la construcción genética en forma de composición farmacéutica única. El FVG y la construcción genética pueden combinarse inmediatamente antes de la administración de la mezcla. En algunos ejemplos, un facilitador de vacunas genéticas como se ha descrito y explicado anteriormente se formula junto con la construcción genética en forma de composición farmacéutica única.

De este modo, algunos ejemplos comprenden una vacuna de dos inóculos: un inóculo comprende una construcción de ADN o ARN que tiene dos genes estructurales del VIH, y el otro inóculo comprende una construcción de ADN o ARN que porta el tercer gen estructural restante del VIH, de modo que los inóculos combinados contienen un conjunto completo de genes estructurales del VIH. Los genes estructurales en cada construcción de ADN están conectados funcionalmente a un promotor, un potenciador y una señal de poliadenilación. Elementos reguladores idénticos o distintos pueden controlar la expresión de los genes víricos. Cuando se vacuna a un individuo, los dos inóculos pueden administrarse por vía intramuscular en lugares diferentes, preferentemente en brazos diferentes.

Puede administrarse un facilitador de vacunas genéticas como se ha descrito y explicado anteriormente en el lugar en el que se va a administrar el inóculo.

Puede incluirse un facilitador de vacunas genéticas en las formulaciones junto con las construcciones genéticas.

El procedimiento de vacunación puede repetirse por lo menos una vez y preferentemente dos o tres veces. Cada procedimiento de vacunación se lleva a cabo con una separación temporal de 24 horas a dos meses.

La vacuna pueda administrarse utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. La vacuna puede administrarse por vía hipodérmica, utilizando un dispositivo de inyección sin aguja, proporcionando de esta manera administración intramuscular, intradérmica, subcutánea de forma simultánea, y administrando al mismo tiempo el material en el espacio intersticial.

Las construcciones genéticas pueden incluir las siguientes.

Plásmidos y estrategias de clonación

Se construyeron dos plásmidos: uno que contiene gag/pol del VIH y el otro que contiene env del VIH.

El clon genómico pNL43 del VIH-1 fue obtenido gracias al Dr. Malcolm Martin, del Programa de los NIH de reactivos de investigación y de referencia para el SIDA (ARRRP, por sus siglas en inglés), División del SIDA, NIAID, NIH, y puede utilizarse como material de partida para construcciones genéticas con los genes víricos del VIH-1. Como alternativa, puede modificarse cualquier clon molecular del VIH de una célula infectada, haciendo uso de tecnología de reacción en cadena de la polimerasa, de forma suficiente para que la construcción incluya el clon HXB2, el clon MN, así como el clon SF o BAL-1. El clon pNL43 es una construcción que consta del ADN provírico del VIH-1 más 3 kb de secuencia del hospedador procedente del sitio de integración clonado en pUC18.

Construcción del plásmido pNL-puro-env^{-}

Este plásmido fue construido para la expresión de gag pol. Se destruyó el sitio StuI dentro de la región del flanco 5', no perteneciente al VIH, del ADN humano de pNL43 mediante digestión parcial con StuI, seguido por digestión de los extremos libres con polimerasa 1 de E. coli. El plásmido lineal se rellenó y después se autoligó, dejando un sitio StuI único dentro del genoma del VIH. Este plásmido, pNLDstu, se digirió después con las enzimas StuI y BsaBI, que dan lugar a extremos romos, con lo que se eliminó una amplia sección de la secuencia codificante de gp120. El promotor del SV40 y la región que codifica la resistencia a la puromicina (puromicina-acetil-transferasa (PAC)) fueron aisladas de pBABE-puro (Morgenstern y Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18(12): 3587-3596, donado por el Dr. Hartmut Land, del Imperial Cancer Research Fund) utilizando EcoRI y ClaI. Se hicieron romos los extremos del fragmento y después se clonó en pNLDstu digerido con StuI/BsaBI. Se seleccionó un clon con el fragmento SV40-puro en la orientación correcta, de modo que el LTR en 3' del VIH pudiese proporcionar funciones de poliadenilación al mensaje PAC. Este plásmido se denominó pNLpuro.

Estrategia de clonación para la eliminación del gen regulador vpr del vector HIV gag pol

Una región desde justo corriente arriba del sitio PflMI único hasta justo después del codón de terminación de vif fue amplificada por PCR utilizando cebadores que introdujeron un cambio de aminoácido no conservativo (glu -> val)
en el aminoácido 22 del vpr, un codón de terminación en el marco de lectura de vpr inmediatamente después del aminoácido 22, y un sitio EcoRI situado inmediatamente después del nuevo codón de terminación. El fragmento PflMI-EcoRI de pNLpuro o pNL43 fue sustituido por este fragmento de PCR. Esta sustitución dio lugar a la eliminación de 122 nucleótidos del marco abierto de lectura de vpr, eliminándose de este modo la posibilidad de reversión que conlleva la estrategia de mutación puntual. Los plásmidos resultantes, pNLpuro\Deltavpr, codifican los primeros 21 aminoácidos naturales de vpr más una valina, más el resto de los genes del VIH-1 y las uniones de corte y empalme en su forma nativa. Dicha estrategia de eliminación también sería aplicable a nef, vif y vpu, y permite la expresión del gen estructural pero protege contra la generación de un virus recombinante vivo.

Construcción del plásmido de expresión de la cubierta

El segmento de ADN que codifica el gen de la cubierta de la cepa HXB2 del VIH-1 se clonó utilizando la técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleando el ADN clonado de lambda obtenido a partir del Programa de reactivos de investigación y de referencia para el SIDA. Las secuencias de los cebadores 5' y 3' son 5'-AGGCGTCTCGAGACAGAGGAGAGCAAGAAATG-3' (SEC ID n.º: 1) que incorpora el sitio XhoI y 5'-TTTCCCTCTAGATAAGCCATCCAATCACAC-3' (SEC ID n.º: 2) que incorpora el sitio XbaI, respectivamente, que engloban la región que codifica gp160, tat y rev. La amplificación específica de genes se realizó utilizando la ADN-polimerasa de Taq siguiendo las instrucciones del fabricante (Perkin-Elmer Cetus Corp.). Los productos de la reacción de PCR se trataron con 0,5 \mug/ml de proteinasa K a 37ºC durante treinta minutos, seguido por una extracción con fenol/cloroformo, y precipitación con etanol. El ADN recuperado se digirió después con XhoI y XbaI durante dos horas a 37ºC y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El fragmento XhoI-XbaI de PCR aislado y purificado se clonó en el plásmido Bluescript (Stratagene Inc., La Jolla, CA) y después se subclonó en el vector de expresión eucariota pMAMneoBlue (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). La construcción resultante se denominó pM160 (Figura 1). El ADN del plásmido se purificó por ultracentrifugación en gradiente de CsCl. La construcción de ADN pM160 codifica la glucoproteína de membrana gp160 del VIH-1/HXB2 (Fisher, A. G., et al., (1985) Nature 316: 262-265) bajo control de un elemento potenciador del RSV, utilizando el LTR del MMTV como promotor.

Construcción alternativa de un plásmido de expresión de la cubierta denominado plásmido HIV-1 env-rev

La región que codifica los dos exones de rev y los marcos abiertos de lectura de vpu y de la cubierta de la cepa HXB2 del VIH-1 se amplificó por PCR y se clonó en el vector de expresión pCNDA/neo (Invitrogen). Este plásmido dirige la producción de la cubierta empleando el promotor del CMV.

Producción y purificación

El plásmido se cultiva en E. coli (DH5 alfa) de la siguiente manera: una placa de agar con medio LB más ampicilina se siembra con el cultivo del plásmido deseado procedente de un cultivo madre congelado. La placa se incuba durante toda la noche (14-15 horas) a 37ºC. Se recoge una sola colonia de la placa y se inocula en 15 ml de medio LB con una preparación de peptona y 50 \mug/ml de ampicilina. Este cultivo se mantiene a 37ºC mientras se agita (aproximadamente 175 rpm) durante 8-10 horas. Las lecturas de la DO_{600} deben ser por lo menos 1,0. Se inocula 1 litro de medio LB con peptona y 50 \mug/ml de ampicilina con 1,0 DO del cultivo. Estos cultivos de 1-2 se mantienen durante toda la noche a 37ºC mientras se agita (175 rpm).

Se recogen los plásmidos cultivados en E. coli (cepa DH5 alfa) y se purifican con los siguientes métodos. Pueden encontrarse procedimientos generales para la lisis de células y la purificación de plásmidos en: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª. Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989. Las células se concentran y se lavan con tampón glucosa-tris-EDTA pH 8,0. Las células concentradas se lisan por tratamiento con lisozima y se tratan brevemente con KOH 0,2 N, y después se ajusta el pH a 5,5 con tampón de acetato de potasio/ácido acético. El material insoluble se elimina por centrifugación. Al sobrenadante se le añade 2-propanol para precipitar el plásmido. El plásmido se disuelve de nuevo en tampón tris-EDTA y se purifica adicionalmente mediante extracción con fenol/cloroformo y otra precipitación con 2-propanol.

Opcionalmente, pueden eliminarse las endotoxinas utilizando diversos métodos, que incluyen los siguientes: adsorción específica por materiales inmovilizados tales como polimixina (Tani et al., Biomater. Artif. Cells Immobilization Biotechnol. 20 (2-4): 457-62 (1992); Issekutz, J. Immunol. Methods 61 (3):275-81 (1983)); anticuerpos monoclonales contra endotoxinas, tales como 8A1 y HA-1A™ (Centocor, Malvern, PA; Bogard et al. J. Immunol. 150 (10): 4438-4449 (1993); Rietschel et al., Infect. Immunity página 3863 (1993)); filtros de profundidad con carga positiva (Hou et al., J. Parenter. Sci. Technol. 44 (4): 204-9 (julio-agosto 1990)); poli(gamma-metil-L-glutamato), Hirayama et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokio) 40 (8): 2106-9 (1992)); histidina (Matsumae et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 12:(2): 129-40 (1990)); columnas y membranas de interacción hidrófoba (Aida et al., J. Immunol Methods 132 (2): 191-5 (1990); Umeda et al., Biomater Artif Cells Artif Organs 18 (4): 491-7 (1990); Hou et al., Biochem. Biophys. Acta 1073 (1): 149-54 (1991); Sawada et al., J. Hyg. (London) 97 (1):103-14 (1986)); resinas hidrófobas específicas útiles para la eliminación de endotoxinas, incluidas las resinas hidrófobas de poliestireno/divinilbenceno o divinilbenceno, tal como resina Brownlee Polypore (Applied Biosystems, Palo Alto, CA); XUS 40323.00 (Dow Chemical, Midland, Mich.); HP20, CHP20P (Mitsubishi Kasei, U.S.); Hamilton PRP-1, PRP-infinity (Hamilton, Reno, Nev.); Jordi DVB para fase inversa, Jordi DVB para geles, PLgel™ de Polymer Labs (Alltech, Deerfield, IL); PLx™ de Vydac. (Separations Group, Hesperia, CA); otros materiales y métodos para la eliminación de endotoxinas incluyen el gel eliminador de endotoxinas Detoxi-Gel™ (Pierce Chemical, Rockford, IL); Nota 206 sobre aplicaciones, (Pharmacia Biotech Inc, Piscataway, N.J.). También puede consultarse en general, Sharma, Biotech. App. Biochem. 8: 5-22 (1986). Los anticuerpos monoclonales preferidos contra endotoxinas se unen a los dominios conservados de la endotoxina, preferentemente anticuerpos contra el lípido A, la porción de la molécula de endotoxina más conservada desde el punto de vista estructural. Dichos anticuerpos monoclonales contra el lípido A incluyen el anticuerpo monoclonal de IgG murina de elevada afinidad 8A1, y el anticuerpo monoclonal de IgM(k) humana contra el lípido A HA-1A™. El HA-1A™ de una vacuna humana de células B contra la cepa J5 de E. coli. HA-1A™. Se ha descrito que el HA-1A™ presenta amplia reactividad cruzada con diversas endotoxinas bacterianas (lipopolisacáridos).

Ejemplo 2

A continuación se presenta una lista de construcciones que pueden utilizarse en los métodos descritos en la presente memoria. El vector pBabe.puro, que se utiliza como material de partida para producir muchas de las construcciones presentadas más adelante, fue construido y descrito originalmente por Morgenstern, J. P. y H. Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18 (12): 3587-3596.

El plásmido pBabe.puro es particularmente útil para la expresión de genes exógenos en células de mamífero. Las secuencias de ADN que se van a expresar se insertan en los sitios de clonación bajo el control del promotor de las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo MuLV). El plásmido contiene el marcador seleccionable para la resistencia a la puromicina.

Ejemplo 3

El plásmido pBa.V\alpha3 es un plásmido de 7,8 kb que contiene un fragmento EcoRI genómico de 2,7 kb que codifica la región Va3 del receptor de células T que contiene los fragmentos L, V y J clonados en el sitio EcoRI de pBabe.puro. La proteína diana procedente del receptor de células T es útil para la inmunización y el tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria mediada por células T y del linfoma y leucemia de células T clonotípicas.

Ejemplo 4

El plásmido pBa.gagpol-vpr es un plásmido de 9,88 kb que contiene los genes gag/pol y vif del VIH/MN clonados en pBabe.puro. El gen vpr se elimina. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA. La secuencia de ADN del VIH está publicada en Reiz, M. S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549. Puede accederse a la secuencia con el número de GenBank: M17449.

Ejemplo 5

El plásmido pM160 es un plásmido de 11,0 kb que contiene el fragmento de PCR de 2,3 kb que codifica la proteína de la cubierta del VIH-I/3B y los genes rev/tat clonados en pMAMneoBlue. La región nef se ha eliminado. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA. La secuencia de ADN del VIH-1/3B está publicada en Fisher, A., 1985 Nature 316: 26672. Puede accederse a la secuencia con el número de GenBank: K03455.

Ejemplo 6

El plásmido pBa.VL es un plásmido de 5,4 kb que contiene el fragmento de PCR que codifica la región VL de un anticuerpo contra el ADN clonada en los sitios XbaI y EcoRI de pBabe.puro. La proteína diana derivada del anticuerpo es un ejemplo de una proteína diana útil para la inmunización y el tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria mediada por células B y del linfoma y leucemia de células B clonotípicas. Un método general para la clonación de regiones variables funcionales de anticuerpos puede consultarse en Chaudhary, V. K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066.

Ejemplo 7

El plásmido pOspA.B es un plásmido de 6,84 kb que contiene las regiones que codifican que los antígenos OspA y OspB de Borrelia burgdorferi, la espiroqueta responsable de la enfermedad de Lyme, clonadas en los sitios BamHI y SalI de pBabe.puro. Los cebadores de PCR utilizados para generar los fragmentos OspA y OspB son 5'-GAAG
GATCCATGAAAAAATATTTATTGGG-3' (SEC ID n.º: 3) y 5'-ACTGTCGACTTATTTTAAAGCGTTTTTAAG-3' (SEC ID n.º: 4). Véase: Williams, W. V., et al. 1992 DNA and Cell. Biol. 11 (3): 207. El plásmido que contiene estos genes del patógeno, que codifican proteínas diana, es útil para la inmunización contra la enfermedad de Lyme.

Ejemplo 8

El plásmido pBa.Rb-G es un plásmido de 7,10 kb que contiene un fragmento generado por PCR que codifica la proteína G de la rabia, clonado en el sitio BamHI de pBabe.puro. El plásmido que contiene este gen del patógeno, que codifica la proteína G de la rabia, es útil para la inmunización contra la rabia. La secuencia de ADN se describe en Genebank No.: M32751. Véase también: Anilionis, A., et al., 1981 Nature 294: 275.

Ejemplo 9

El plásmido pBa.HPV-L1 es un plásmido de 6,80 kb que contiene un fragmento generado por PCR que codifica la proteína L1 de la cápside del virus del papiloma humano (VPH) incluidas las cepas 16, 18, 31 y 33 del VPH, clonado en los sitios BamHI y EcoRI de pBabe.puro. El plásmido es útil para la inmunización contra la infección por el VPH y contra el cáncer causado por dicho virus. La secuencia de ADN se describe en Genebank No.: M15781. Véase también: Howley, P., 1990 Fields Virology, Volumen 2, Eds.: Channock, R. M. et al. Capítulo 58:1625; y Shah, K. y P. Howley, 1990 Fields Virology, Volumen 2, Eds.: Channock, R. M. et al. Capítulo 59.

Ejemplo 10

El plásmido pBa.HPV-L2 es un plásmido de 6,80 kb que contiene un fragmento generado por PCR que codifica la proteína L2 de la cápside del virus del papiloma humano (VPH) incluidas las cepas 16, 18, 31 y 33 del VPH, clonado en los sitios BamHI y EcoRI de pBabe.puro. El plásmido es útil para la inmunización contra la infección por VPH y contra el cáncer causado por dicho virus. La secuencia de ADN se describe en Genebank No.: M15781. Véase también: Howley, P., 1990 Fields Virology, Volumen 2, Eds.: Channock, R. M. et al. Capítulo 58:1625; y Shah, K. y P. Howley, 1990 Fields Virology, Volumen 2, Eds.: Channock, R. M. et al. Capítulo 59.

Ejemplo 11

El plásmido pBa.MNp7 es un plásmido de 5,24 kb que contiene un fragmento generado por PCR que codifica la región p7 que incluye la secuencia de la proteína gag de la cepa MN del VIH (proteína de la nucleocápside), clonado en el sitio BamHI de pBabe.puro. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil para la inmunización y para el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA. Reiz, M. S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549. Puede accederse a la secuencia con el número de GenBank: M17449.

Ejemplo 12

El plásmido pGA733-2 es un plásmido de 6,3 kb que contiene el antígeno GA733-2 de la superficie de tumores, clonado a partir de la línea celular SW948 de carcinoma colorrectal en el sitio BstXI del vector pCDM8 (Seed, B. y A. Aruffo, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365). La proteína diana asociada al tumor es un ejemplo de una proteína diana útil para la inmunización y el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa tal como el cáncer. El antígeno GA733-2 es un antígeno diana contra el cáncer de colon. El antígeno GA733 se describe en Szala, S. et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3542-3546.

Ejemplo 13

El plásmido pT4-pMV7 es un plásmido de 11,15 kb que contiene el ADNc que codifica el receptor CD4 humano clonado en el sitio EcoRI del vector pMV7. La proteína diana CD4 es útil para la inmunización y el tratamiento del linfoma de células T. El plásmido pT4-pMV7 puede obtenerse en el AIDS Repository, Núm. de catálogo 158.

Ejemplo 14

El plásmido pDJGA733 es un plásmido de 5,1 kb que contiene el antígeno GA733 de la superficie de tumores, clonado en el sitio BamHI de pBabe.puro. La proteína diana asociada al tumor es un ejemplo de una proteína diana útil para la inmunización y el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa tal como el cáncer. El antígeno GA733 es un antígeno diana útil contra el cáncer de colon.

Ejemplo 15

El plásmido pBa.RAS es un plásmido de 6,8 kb que contiene la región que codifica ras, que fue primero subclonada a partir del pZIPneoRAS y después clonada en el sitio BamHI de pBabe.puro. La proteína diana ras es un ejemplo de molécula de señalización citoplásmica. El método para la clonación de ras se describe en Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 1577. Los plásmidos que codifican ras son útiles para la inmunización y el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa tal como el cáncer, en particular, cánceres relacionados con ras tales como cáncer de vejiga, músculo, pulmón, cerebro y huesos.

Ejemplo 16

El plásmido pBa.MNp55 es un plásmido de 6,38 kb que contiene un fragmento generado por PCR que codifica la región p55 que incluye la secuencia del precursor de gag (proteína de la nucleocápside) de la cepa MN del VIH, clonado en el sitio BamHI de pBabe.puro. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA. Reiz, M. S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549. Puede accederse a la secuencia con el número de GenBank: M17449.

Ejemplo 17

El plásmido pBa.MNp24 es un plásmido de 5,78 kb que contiene un fragmento generado por PCR obtenido a partir del molde de pMN-SF1 que codifica la región p24 que incluye toda la región codificante de gag de la cepa MN del VIH, clonado en los sitios BamHI y EcoRI de pBabe.puro. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA. Reiz, M. S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549. Puede accederse a la secuencia con el número de GenBank: M17449.

Ejemplo 18

El plásmido pBa.MNp17 es un plásmido de 5,5 kb que contiene un fragmento generado por PCR que codifica la región p17 que incluye la secuencia de gag (proteína de la nucleocápside) de la cepa MN del VIH, clonado en los sitios BamHI y EcoRI de pBabe.puro. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA. Reiz, M. S., 1912092 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549. Puede accederse a la secuencia con el número de GenBank: M17449.

Ejemplo 19

El plásmido pBa.SIVenv es un plásmido de 7,8 kb que contiene un fragmento de 2,71 generado por PCR amplificado a partir de una construcción que contenía SIV 239 en pBR322 clonado en los sitios BamHI y EcoRI de pBabe.puro. Los cebadores utilizados son 5'-GCCAGTTTTGGATCCTTAAAAAAGGCTTGG-3' (SEC ID n.º:5) y 5'-TTGTGAGGGACAGAATTCCAATCAGGG-3' (SEC ID n.º:6). El plásmido puede obtenerse en el Programa de reactivos de investigación y de referencia para el SIDA; Núm. de catálogo 210.

Ejemplo 20

El plásmido pcTSP/ATK.env es un plásmido de 8,92 kb que contiene un fragmento generado por PCR que codifica toda la región de la cubierta del HTLV, obtenida de las cepas aisladas de HTLV-1/TSP y /ATK, subclonado en el vector pcDNA1/neo. Los cebadores utilizados son 5'-CAGTGATATCCCGGGAGACTCCTC-3' (SEC ID n.º:7) y 5'-GAATAGAAGAACTCCTCTAGAATTC-3' (SEC ID n.º:8). El plásmido pcTSP/ATK.env se describe en 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3599. La proteína diana env del HTLV es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por HTLV y del linfoma de células T.

Ejemplo 21

El plásmido pBa.MNgp160 es un plásmido de 7,9 kb que contiene un fragmento de 2,8 kb generado por PCR amplificado a partir de una construcción que contenía MNenv en pSP72 y clonado en los sitios BamHI y EcoRI de pBabe.puro. Los cebadores utilizados son 5'-GCCTTAGGCGGATCCTATGGCAGGAAG-3' (SEC ID n.º:9) y 5'-TAAGATGGGTGGCCATGGTGAATT-3' (SEC ID n.º:10). Reiz, M. S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549. Puede accederse a la secuencia con el número de GenBank: M17449. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA.

Ejemplo 22

El plásmido pC.MNp55 es un plásmido de 11,8 kb que contiene un fragmento de 1,4 kb generado por PCR amplificado a partir de la región gag de la cepa aislada MN y clonado en el vector pCEP4. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA. Reiz, M. S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8: 1549. Puede accederse a la secuencia con el número de GenBank: M17449.

Ejemplo 23

El plásmido pC.Neu es un plásmido de 14,2 kb que contiene un fragmento de ADN de 3,8 kb que contiene la región que codifica el oncogén neu humano, que fue cortado de la construcción LTR-2/erbB-2 y subclonado en el vector pCEP4. El plásmido pC.Neu se describe en DiFiore 1987 Science 237: 178. La proteína diana del oncogén neu es un ejemplo de un receptor de factores de crecimiento útil como proteína diana para la inmunización y el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa tal como el cáncer; en particular, cáncer de colon, mama, pulmón y cerebro.

Ejemplo 24

El plásmido pC.RAS es un plásmido de 11,7 kb que contiene un fragmento de ADN de 1,4 kb que contiene la región que codifica el oncogén ras, que fue subclonado primero a partir de pZIPneoRAS, y después subclonado en el sitio BamHI de pCEP4. El plásmido pC.RAS se describe en Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 1577. La proteína diana ras es un ejemplo de una molécula de señalización citoplásmica. Los plásmidos que codifican ras son útiles para la inmunización y el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa tal como el cáncer; en particular, cánceres relacionados con ras tales como cáncer de vejiga, músculo, pulmón, cerebro y huesos.

Ejemplo 25

El plásmido pNLpuro es un plásmido de 15 kb que contiene gag/pol del VIH y la inserción SV40-puro. El plásmido que contiene estos genes víricos del VIH que codifican proteínas diana del VIH es útil para la inmunización y el tratamiento de la infección por VIH y del SIDA.

Ejemplo 26

El plásmido pM160 puede utilizarse como material de partida para obtener varios plásmidos útiles para la expresión de uno o más genes de la porción env del VIH. La construcción de pM160 se ha descrito anteriormente. El plásmido engloba la región que codifica gp160, tat y rev. El gen nef está ausente.

El promotor que controla la expresión de gp160/rev/tat es el LTR del MMTV. El promotor puede eliminarse y sustituirse con un promotor de actina, promotor de miosina, promotor LTR del VIH y promotor del CMV.

El gen que confiere la resistencia a la ampicilina puede eliminarse o bien inactivarse. El gen que confiere la resistencia a la neomicina puede situarse bajo el control de un promotor bacteriano.

El potenciador del virus de sarcoma de Rous puede eliminarse del plásmido. El potenciador del RSV puede sustituirse con el potenciador de la creatina de músculo.

Los genes gp160/rev/tat se superponen y comparten las mismas secuencias de nucleótidos en diferentes marcos de lectura. El gen rev puede eliminarse cambiando su codón de iniciación a un codón diferente. De forma similar, el gen tat puede eliminarse de de la misma manera. En todo los plásmidos, excepto en aquellos que utilizan el promotor LTR del VIH para controlar gp160/rev/tat, puede eliminarse rev, tat, o tanto rev como tat. En los plásmidos que utilizan el promotor LTR del VIH, tat debe estar presente.

La siguiente Tabla presenta la lista de los plásmidos modificados a partir de pM160. Cada plásmido tiene un gen de ampicilina inactivado. Cada plásmido tiene un potenciador del RSV eliminado. Algunos no tienen potenciador (no); algunos tienen el potenciador de la creatina de músculo (CME). Algunos tienen el gen rev del HIV (sí) mientras que en otros está eliminado (no). Algunos tienen el gen tat del HIV (sí) mientras que en otros está eliminado (no).

Construcción	Promotor	Potenciador	rev	tat

RA-1	Actina	no	sí	sí
RA-2	Actina	no	sí	no
RA-3	Actina	no	no	sí
RA-4	Actina	CME	sí	sí
RA-5	Actina	CME	sí	no
RA-6	Actina	CME	no	sí
RA-7	CMV	no	sí	sí
RA-8	CMV	no	sí	no
RA-9	CMV	no	no	sí
RA-10	CMV	CME	sí	sí
RA-11	CMV	CME	sí	no
RA-12	CMV	CME	no	sí
RA-13	MMTV	no	sí	sí
RA-14	MMTV	no	sí	no
RA-15	MMTV	no	no	sí
RA-16	MMTV	CME	sí	sí
RA-17	MMTV	CME	sí	no
RA-18	MMTV	CME	no	sí
RA-19	Miosina	no	sí	sí
RA-20	Miosina	no	sí	no
RA-21	Miosina	no	no	sí
RA-22	Miosina	CME	sí	sí
RA-23	Miosina	CME	sí	no
RA-24	Miosina	CME	no	sí
RA-25	LTR del VIH-1	no	sí	sí
RA-26	LTR del VIH-1	no	no	sí
RA-27	LTR del VIH-1	CME	sí	sí
RA-28	LTR del VIH-1	CME	no	sí

Las construcciones RA-29 a RA-56 son idénticas a RA-1 a RA-32, respectivamente, con la salvedad de que en cada caso el promotor que controla el gen de la neomicina es un promotor bacteriano.

Ejemplo 27

El plásmido pNLpuro puede utilizarse como material de partida para producir varios plásmidos diferentes que expresan los genes gag/pol del VIH. Como se ha descrito anteriormente, pNLpuro fue construido para la expresión de gag pol. El plásmido pNLpuro\Deltavpr, que se ha descrito anteriormente, fue diseñado para eliminar el gen regulador vpr del vector HIV gag pol, para eliminar una proteína reguladora necesaria del conjunto de genes que se iban a introducir mediante la vacunación. Además de vpr, los expertos en la materia pueden realizar otros cambios en el plásmido pNL43puro utilizando técnicas estándar de biología molecular y materiales de partida de fácil obtención.

Las secuencias humanas en los flancos 5' y 3' de las secuencias del VIH pueden eliminarse utilizando varios métodos. Por ejemplo, utilizando PCR, sólo pueden amplificarse y reconstruirse secuencias del VIH, SV40-puro y pUC18.

La región psi del VIH, que es importante para el empaquetamiento del virus, puede eliminarse de los plásmidos basados en pNL43puro. Con el objeto de eliminar la región psi, se corta el plásmido pNLpuro con SacI y SpeI. Esta digestión elimina la región psi, así como el LTR en 5' situado corriente arriba, y la porción de la región gag/pol situada corriente abajo de psi. Con el objeto de reinsertar las secuencias eliminadas que no son psi, se lleva a cabo amplificación por PCR para regenerar dichas secuencias. Se diseñan cebadores que regeneran las porciones de la secuencia del VIH situadas en 5' y 3' de psi sin regenerar psi. Los cebadores vuelven a formar el sitio SacI en la porción del plásmido situada en 5' del LTR en 5'. Los cebadores siguen corriente abajo desde un sitio situado corriente arriba del sitio SacI hasta un sitio situado justo en 3' del extremo 5' de la región psi, generando un sitio AatI en el extremo 3'. Los cebadores que comienzan justo en la zona 5' de la región psi también generan un sitio AatI y, empezando en la zona 3' del sitio SpeI, regeneran dicho sitio. Los fragmentos generados por PCR se digieren con SacI, AatI y SpeI y se ligan con el fragmento pNLpuro-psi digerido con SacI/SpeI. El promotor del LTR en 5' del VIH puede eliminarse y sustituirse con el promotor del virus de Moloney, el promotor del LTR del MMTV, el promotor de la actina, el promotor de la miosina y el promotor del CMV.

El sitio de poliadenilación del LTR en 3' del VIH puede eliminarse y sustituirse con el sitio de poliadenilación del SV40.

El gen que confiere resistencia a la ampicilina puede eliminarse o bien inactivarse.

A continuación se presenta una lista de construcciones basadas en pNLpuro en las que se han eliminado las regiones psi y vpr del VIH y en las que se han eliminado las regiones humanas situadas en 5' y 3' de las secuencias del VIH.

\vskip1.000000\baselineskip

Construcción	Promotor	poli(A)	Amp^{r}

LA-1	Moloney	LTR en 3' del VIH	sí
LA-2	Moloney	SV40	sí
LA-3	Moloney	LTR en 3' del VIH	no
LA-4	Moloney	SV40	no
LA-5	CMV	LTR en 3' del VIH	sí
LA-6	CMV	SV40	sí
LA-7	CMV	LTR en 3' del VIH	no
LA-8	CMV	SV40	no
LA-9	MMTV	LTR en 3' del VIH	sí
LA-10	MMTV	SV40	sí
LA-11	MMTV	LTR en 3' del VIH	no
LA-12	MMTV	SV40	no
LA-13	LTR en 5' del VIH	LTR en 3' del VIH	sí
LA-14	LTR en 5' del VIH	SV40	sí
LA-15	LTR en 5' del VIH	LTR en 3' del VIH	no
LA-16	LTR en 5' del VIH	SV40	no

Las construcciones LA-17 a LA-32 son idénticas a las construcciones LA-1 a LA-16, respectivamente, con la salvedad de que en cada caso permanece por lo menos una de las secuencias flanqueantes humanas.

Ejemplo 28

En otra construcción para la expresión del gen env, dicha región del VIH puede insertarse en el plásmido comercializado pCEP4 (Invitrogen). El plásmido pCEP4 es particularmente útil, ya que contiene el origen de replicación del virus de Epstein-Barr y la región que codifica el antígeno nuclear EBNA-1, que produce replicación episómica de elevado número de copias sin integración. El pCEP4 también contiene el marcador de higromicina bajo control regulador del promotor y del sitio de poliadenilación de la timidina-quinasa. La región que codifica la env del VIH está situada bajo control regulador del promotor del CMV y del sitio de poliadenilación del SV40. La región que codifica la env del VIH se obtuvo en forma de fragmento de PCR de 2,3 kb a partir del VIH/3B, secuencia Genebank K03455. El plásmido resultante, pRA-100, que está basado en pCEP4, se mantiene en situación extracromosómica y produce la proteína gp160.

Ejemplo 29

En otra construcción para la expresión del gen env, dicha región del VIH puede insertarse en el plásmido comercializado pREP4 (Invitrogen). El plásmido pREP4 es particularmente útil, ya que contiene el origen de replicación del virus de Epstein-Barr y la región que codifica el antígeno nuclear EBNA-1, que produce replicación episómica de elevado número de copias sin integración. El pREP4 también contiene el marcador de higromicina bajo control regulador del promotor y del sitio de poliadenilación de la timidina-quinasa. La región que codifica la env del VIH está situada bajo control regulador del promotor del RSV y del sitio de poliadenilación del SV40. La región que codifica la env del VIH se obtuvo en forma de fragmento de PCR de 2,3 kb a partir del VIH/3B, secuencia Genebank K03455. El plásmido resultante, pCEP4, que está basado en pRA-101, se mantiene en situación extracromosómica y produce la proteína gp160.

Ejemplo 30

En otra construcción para la expresión de los genes gag/pol, dicha región del VIH puede insertarse en el plásmido comercializado pCEP4 (Invitrogen). El plásmido pCEP4 es particularmente útil, ya que contiene el origen de replicación del virus de Epstein-Barr y la región que codifica el antígeno nuclear EBNA-1, que produce replicación episómica de elevado número de copias sin integración. El pCEP4 también contiene el marcador de higromicina bajo control regulador del promotor y del sitio de poliadenilación de la timidina-quinasa. La región que codifica gag/pol del VIH está situada bajo control regulador del promotor del CMV y del sitio de poliadenilación del SV40. La región que codifica gag/pol del VIH se obtuvo a partir de la cepa MN del VIH, secuencia Genebank MI7449, e incluye el gen vif. El gen vpr no está incluido. El plásmido resultante, pLA-100, que está basado en pCEP4, se mantiene en situación extracromosómica y produce las proteínas GAG55, transcriptasa inversa, proteasa e integrasa.

Ejemplo 31

En otra construcción para la expresión de los genes gag/pol, dicha región del VIH puede insertarse en el plásmido comercializado pREP4 (Invitrogen). El plásmido pREP4 es particularmente útil, ya que contiene el origen de replicación del virus de Epstein-Barr y la región que codifica el antígeno nuclear EBNA-1, que produce replicación episómica de elevado número de copias sin integración. El pREP4 también contiene el marcador de higromicina bajo control regulador del promotor y del sitio de poliadenilación de la timidina-quinasa. La región que codifica gag/pol del VIH está situada bajo control regulador del promotor del CMV y del sitio de poliadenilación del SV40. La región que codifica gag/pol del VIH se obtuvo a partir de la cepa MN del VIH, secuencia Genebank MI7449, e incluye el gen vif. El gen vpr no está incluido. El plásmido resultante, pLA-101, que está basado en pREP4, se mantiene en situación extracromosómica y produce las proteínas GAG55, transcriptasa inversa, proteasa e integrasa.

Ejemplo 32

La siguiente construcción, denominada pGAGPOL.rev en la presente memoria, es útil para la expresión de los genes gag/pol del VIH.

El plásmido incluye un gen que confiere resistencia a la kanamicina y un origen de replicación del ADN procedente de pBR322. Las secuencias proporcionadas para la regulación de la transcripción incluyen: un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación del SV40. Las secuencias del VIH-1 incorporadas en pGAGPOL.rev incluyen una secuencia que codifica p17, p24, y p15 del marco abierto de lectura de gag; una secuencia que codifica una proteasa, una secuencia que codifica una transcriptasa inversa que contiene una pequeña deleción, y una secuencia que codifica el extremo aminoterminal inactivo de la integrasa del marco abierto de lectura de pol; y una secuencia que codifica rev. Cada una de las secuencias del VIH procede de la cepa HXB2 del VIH-1.

Se han incorporado varias medidas de seguridad en pGAGPOL.rev, que incluyen la utilización del promotor del CMV y un sitio de poli(A) no retrovírico. Además, la eliminación de la secuencia \psi limita la capacidad de empaquetamiento de ARN vírico. Además, múltiples mutaciones en la transcriptasa inversa proporcionan un producto enzimáticamente inactivo. Es más, una gran deleción de la integrasa da lugar a un producto inactivo, y un marcador de resistencia a la kanamicina se utiliza para estabilizar las bacterias transformadas.

El plásmido pGAGPOL.rev se construye de la siguiente manera.

Etapa 1

Un subclón de parte del genoma del VIH-1 (HXB2) se clona en Bluescript (Stratagene). El subclón del VIH-1 contiene el LTR en 5' completo y el resto del genoma del VIH-1 hasta el nucleótido 5795 (numeración de Genebank). Las secuencias del VIH-1 se obtienen del plásmido HXB2D (AIDS Repository).

Etapa 2

Se somete a PCR parte de gag a partir del marco abierto de lectura del plásmido HXB2D (AIDS Repository). Se corta el fragmento de PCR con NotI y SpeI y se liga con el subclón del VIH-1 descrito anteriormente y digerido con NotI y SpeI.

Etapa 3

Se somete a PCR la unión gag/pol y parte de las secuencias que codifican pol a partir del plásmido HXB2D (AIDS Repository) con los cebadores SEC ID n.º:11 y SEC ID n.º:12. Se corta el producto de la PCR con ClaI y se liga junto. Los fragmentos ligados se cortan con BclI y SalI y se ligan con el plásmido de la Etapa 2 digerido con BclI y SalI.

\newpage

Etapa 4

Se corta el plásmido de la Etapa 3 con BspMI y EcoRI y se vuelve a ligar con adaptadores formados por los conectores de hibridación SEC ID n.º:13 y SEC ID n.º:14.

Etapa 5

Se corta el plásmido de la Etapa 4 con NotI y SalI y se liga con el plásmido de 4a o 4b descritos para el caso de pENV (ver más adelante). Se corta también con NotI y SalI.

Etapa 6

Se digiere el plásmido de la Etapa 5 con SalI y MluI y se liga con el producto de la PCR obtenido por PCR de rev con los cebadores SEC ID n.º:15 y SEC ID n.º:16.

Etapa 7

Se corta el plásmido de la Etapa 6 con NotI y se liga con el producto obtenido por PCR del elemento de respuesta rev en el plásmido HXB2D (AIDS Repository) con los cebadores SEC ID n.º:17 y SEC ID n.º:18.

Las Etapas 6 y 7 son opcionales.

Ejemplo 33

La siguiente construcción, denominada pENV en la presente memoria, es útil para expresar los genes env del HIV.

El plásmido incluye un gen que confiere resistencia a la kanamicina y un origen de replicación del ADN procedente de pBR322. Las secuencias proporcionadas para la regulación de la transcripción incluyen: un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación del SV40. Las secuencias del VIH-1 incorporadas en pENV incluyen una secuencia que codifica vpu, una secuencia que codifica rev, una secuencia que codifica gp160, una secuencia que codifica el 50% de nef; una secuencia que codifica vif, y una secuencia que codifica vpr con una deleción de 13 aminoácidos en el extremo carboxiterminal. Las secuencias vpu, rev, gp160 y nef proceden de la cepa MN del VIH-1. Las secuencias vif y vpr secuencias proceden de la cepa HXB2 del
VIH-1.

Se han incorporado varias medidas de seguridad en pGAGPOL.rev, que incluyen la utilización del promotor del CMV y un sitio de poli(A) no retrovírico. Además, se ha eliminado tat y una deleción del 50% de nef proporciona un producto nef "inactivo". Además, vif y vpr están situados fuera de la secuencia normal y una deleción parcial de vpr garantiza de forma adicional un producto vpr inactivo.

El plásmido pENV se construye de la siguiente manera.

Etapa 1

Se empieza digiriendo pUC18 con HindIII y EcoRI. El fragmento resultante que contiene el origen de replicación de ColE1 y el gen laci se ligan con el fragmento de EcoRI/HindIII obtenido de pMAMneoBlue, que contiene el potenciador del virus del sarcoma de Rous. El plásmido resultante o pMAMneo-Blue de Clontech (Palo Alto, CA) puede digerirse a continuación con HindIII y BglI. Utilizando técnicas estándar, se liga con el fragmento que contiene el gen kan obtenido por PCR del plásmido GenBlock (Pharmacia).

Etapa 2

Si se utiliza pMAMneo-Blue como plásmido de partida, se digiere con MluI y EcoRI, se rellenan los extremos con el fragmento de Klenow de la Polimerasa I, y se liga de nuevo.

Etapa 3

A continuación, bien con el plásmido pMAMneo-Blue o con uno derivado de pUC18, se digiere con HindIII y se liga con el sitio de poliA y la región de corte y empalme temprana del SV40, obtenidos por PCR de pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) con los cebadores SEC ID n.º:19 y SEC ID n.º:20.

Etapa 4a

Se digiere con BamHI y se liga con el promotor del CMV obtenido por PCR de pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) con los cebadores SEC ID n.º:21 y SEC ID n.º:22.

\newpage

Etapa 4b

Se digiere con BamHI y se liga con el LTR del MoMLV obtenido por PCR con los cebadores SEC ID n.º:23 y SEC ID n.º:24.

Etapa 5

Se digiere con NotI y MluI y se liga con la región que codifica GP160, obtenida por PCR de pMN-ST1 con los cebadores SEC ID n.º:25 y SEC ID n.º:26.

Etapa 6

Se digiere con MluI y se liga con las secuencias que codifican vif en su totalidad y vpr con una deleción de 13 aminoácidos en su extremo carboxiterminal, mediante PCR del plásmido HXB2D (AIDS Repository) con los cebadores SEC ID n.º:27 y SEC ID n.º:28.

Ejemplo 34

Algunos ejemplos se refieren a un método para inmunizar a un individuo contra el VIH mediante la administración de un solo inóculo. Dicho inóculo incluye una construcción genética que comprende por lo menos uno, preferentemente dos, más preferentemente más de dos o varios genes del virus del VIH, o todos los genes estructurales. Sin embargo, el inóculo no contiene un conjunto completo de todos genes del VIH. Si se suministra a una sola célula un conjunto completo de genes víricos, es posible que se ensamble un virus infeccioso completo en el interior de la célula. Por consiguiente, no se suministra una construcción genética con dicho conjunto completo de genes. Como precaución de seguridad, pueden eliminarse o alterarse de forma intencionada uno o más genes esenciales para garantizar de forma adicional que no se forme una partícula vírica infecciosa.

En algunos ejemplos, se proporcionan por lo menos porciones de uno, dos o todos los genes estructurales del VIH. Los genes estructurales del VIH son gag, pol y env. Se proporcionan porciones de por lo menos uno de estos tres genes en una construcción genética. Por consiguiente, en algunos ejemplos, se proporciona por lo menos una porción de cada uno de los genes gag y pol en una construcción genética; en algunos ejemplos, se proporciona por lo menos una porción de env en una construcción genética; en algunos ejemplos, se proporciona por lo menos una porción de gag en una construcción genética; en algunos ejemplos se proporciona por lo menos una porción de pol y una porción de env en una construcción genética; en algunos ejemplos, se proporciona por lo menos una porción de gag y una porción de env en una construcción genética; en algunos ejemplos se proporciona por lo menos una porción de pol en una construcción genética. Opcionalmente, se proporciona el gen completo. Opcionalmente, en cualquiera de dichas construcciones, pueden estar presentes también los genes reguladores del VIH. Los genes reguladores del VIH son: vpr, vif, vpu, nef, tat y rev.

Ejemplo 35

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "unidad de expresión" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor unido funcionalmente a una secuencia codificante unida funcionalmente a una señal de poliadenilación. La secuencia codificante puede codificar una o más proteínas o fragmentos de las mismas. Una unidad de expresión puede estar incorporada en un plásmido.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "unidad de expresión del VIH" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor unido funcionalmente a una secuencia codificante unida funcionalmente a una señal de poliadenilación, en la que la secuencia codificante codifica un péptido que comprende un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presente en una proteína del VIH. "Epítopo sustancialmente similar" se refiere a un epítopo que tiene una estructura que no es idéntica a la de un epítopo de una proteína del VIH, pero que, no obstante, genera una respuesta de inmunidad celular o humoral que reacciona de forma cruzada con una proteína del VIH. En algunos ejemplos, la unidad de expresión del VIH comprende una secuencia codificante que codifica una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. En algunos ejemplos, una unidad de expresión del VIH está incorporada en un plásmido.

En algunos ejemplos, se proporciona una única construcción genética que tiene una sola unidad de expresión del VIH que contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "construcción de una sola unidad de expresión del VIH" se refiere a una única construcción genética que contiene una sola unidad de expresión del VIH. En algunos ejemplos, la construcción de una sola unidad de expresión del VIH está en forma de plásmido.

En algunos ejemplos, se proporciona una única construcción genética que tiene más de una unidad de expresión del VIH, en la que cada una contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "construcción genética de múltiples unidades de expresión del VIH" se refiere a un único plásmido que contiene más de una unidad de expresión del VIH. En formas de realización preferidas, una construcción de múltiples unidades de expresión del VIH está en forma de plásmido.

En algunos ejemplos, se proporciona una única construcción genética que tiene dos unidades de expresión del VIH, en la que cada una contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "construcción genética de dos unidades de expresión del VIH" se refiere a un único plásmido que contiene dos unidades de expresión del VIH, es decir, una construcción genética de múltiples unidades de expresión del VIH que contiene dos unidades de expresión genética del VIH. En una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH, es preferible que una unidad de expresión del VIH funcione en la dirección opuesta a la de la otra unidad de expresión del VIH. En algunos ejemplos, una construcción de dos unidades de expresión del VIH está en forma de plásmido.

En algunos ejemplos se proporciona una vacuna genética contra el VIH, que contiene una única construcción genética. La construcción genética única puede ser una construcción genética de una sola unidad de expresión del VIH, una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH o una construcción genética de múltiples unidades de expresión del VIH que contiene más de dos unidades de expresión del VIH.

En algunos ejemplos se proporciona una vacuna genética contra el VIH que contiene más de una construcción genética en un solo inóculo.

En algunos ejemplos se proporciona una vacuna genética contra el VIH que contiene más de una construcción genética en más de un inóculo. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inóculo múltiple" se refiere a una vacuna genética que comprende más de una construcción genética, cada una de las cuales se administra de forma separada. En algunos ejemplos se proporciona una vacuna genética contra el VIH que contiene dos construcciones genéticas. Cada construcción genética puede ser, independientemente, una construcción genética de una sola unidad de expresión del VIH, una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH o una construcción genética de múltiples unidades de expresión del VIH que contiene más de dos unidades de expresión del VIH. En algunos ejemplos, ambas construcciones genéticas son construcciones genéticas de una sola unidad de expresión del VIH. En algunos ejemplos, ambas construcciones genéticas son construcciones genéticas de dos unidades de expresión del VIH. En algunos ejemplos, ambas construcciones genéticas son construcciones genéticas de múltiples unidades de expresión del VIH. En algunos ejemplos, una construcción genética es una construcción genética de una sola unidad de expresión del VIH y la otra es una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH. El experto en la materia puede reconocer y apreciar fácilmente las muchas variaciones posibles en función del número de construcciones genéticas utilizadas en una vacuna genética y el número de unidades de expresión del VIH que pueden estar presentes en cada construcción genética.

En algunos ejemplos, las construcciones genéticas no contienen ciertas secuencias del VIH, en particular aquellas que participan en la integración del genoma del VIH en el material cromosómico de la célula en la que se introduce. En algunos ejemplos, las construcciones genéticas no contienen LTR del VIH. De forma similar, en algunos ejemplos, las construcciones genéticas no contienen un sitio psi del VIH. Además, puede eliminarse el gen de la transcriptasa inversa y puede eliminarse el gen de la integrasa. Las eliminaciones incluyen la eliminación de sólo algunos de los codones o la sustitución de algunos de los codones, con el objeto de eliminar, esencialmente, el gen. Por ejemplo, el codón de iniciación puede eliminarse o cambiarse o trasladarse fuera del marco de lectura, para dar lugar a una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento incompleto y no funcional.

En algunos ejemplos, las construcciones genéticas no contienen un gen tat del VIH que se pueda transcribir. El gen tat, que se superpone con el gen rev, puede eliminarse completamente mediante la sustitución de los codones que codifican rev con otros codones que codifican el mismo aminoácido en rev pero que no codifican el aminoácido necesario en tat en el marco de lectura en el que está codificado tat. Como alternativa, sólo algunos de los codones se cambian en uno de los sentidos, es decir: esencialmente se elimina el codón de iniciación para tat y/o se cambia, es decir: esencialmente se eliminan suficientes codones para dar lugar a una secuencia de nucleótidos que codifica un gen tat incompleto y no funcional.

Una construcción genética puede comprender secuencias codificantes que codifican péptidos que tienen por lo menos un epítopo idéntico, o sustancialmente similar, a un epítopo de las proteínas gag, pol, env o rev del VIH.

Una construcción genética puede comprender secuencias codificantes que codifican por lo menos una de las proteínas gag, pol, env o rev del VIH, o fragmentos de las mismas.

Una construcción genética puede comprender secuencias codificantes que codifican péptidos que tienen más de un epítopo idéntico, o sustancialmente similar, a un epítopo de las proteínas gag, pol, env o rev del VIH.

Una construcción genética puede comprender secuencias codificantes que codifican más de una de las proteínas gag, pol, env o rev del VIH, o fragmentos de las mismas.

Una construcción genética puede comprender secuencias codificantes que codifican péptidos que tienen por lo menos un epítopo idéntico, o sustancialmente similar, a un epítopo del las proteínas vif, vpr, vpu o nef del VIH.

Una construcción genética puede comprender secuencias codificantes que codifican por lo menos una de las proteínas vif, vpr, vpu o nef del HIV, o fragmentos de las mismas.

Una construcción genética de una sola unidad de expresión del VIH puede comprender regiones que codifican uno o más péptidos que comparten por lo menos un epítopo con una proteína del VIH, o con un fragmento de la misma, en una sola unidad de expresión situada bajo control regulador de un solo promotor y señal de poliadenilación

Las construcciones genéticas pueden codificar más de una proteína del VIH o fragmento de la misma. El promotor puede ser cualquier promotor funcional en una célula humana. El promotor puede ser un promotor del SV40 o un promotor del CMV, o un promotor temprano inmediato del CMV. La señal de poliadenilación puede ser cualquier señal de poliadenilación funcional en una célula humana. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación del SV40, o la señal de poliadenilación secundaria del SV40. Si se proporciona más de una región codificante en una sola unidad de expresión, pueden estar situadas de forma inmediatamente adyacente entre sí, o separadas por regiones no codificantes. Para que se exprese de forma adecuada, una región codificante debe tener un codón de iniciación y un codón de terminación.

Una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH puede comprender regiones que codifican uno o más péptidos que comparten por lo menos un epítopo con una proteína del VIH, o con un fragmento de la misma, en cada una de las dos unidades de expresión. Cada unidad de expresión está bajo control regulador de un solo promotor y señal de poliadenilación. Las construcciones genéticas pueden codificar más de una proteína del VIH o fragmento de la misma.

Las secuencias de nucleótidos que codifican gag y pol pueden estar presentes en una unidad de expresión, mientras que las secuencias de nucleótidos que codifican env y rev están presentes en la otra. El promotor puede ser cualquier promotor funcional en una célula humana. El promotor puede ser un promotor del SV40 o un promotor del CMV, o un promotor temprano inmediato del CMV. La señal de poliadenilación puede ser cualquier señal de poliadenilación funcional en una célula humana. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación del SV40, o la señal de poliadenilación secundaria del SV40. Si se proporciona más de una región codificante en una unidad de expresión, pueden estar situadas de forma inmediatamente adyacente entre sí, o separadas por regiones no codificantes. Para que se exprese de forma adecuada, una región codificante debe tener un codón de iniciación y un codón de terminación.

Según algunos ejemplos, el epítopo en env que reacciona de forma cruzada con el MHC de la clase II se elimina y se sustituye con la región análoga del VIH II.

Cuando una construcción genética contiene gag y/o pol, es generalmente importante que también esté presente rev. Además de rev, puede proporcionarse un elemento de respuesta a rev con gag y pol para aumentar la expresión de dichos genes.

Cuando se producen construcciones genéticas, el gen env utilizado en el plásmido 1 puede proceder de las cepas aisladas MN o de tipo MN, incluidas las cepas clínicas semejantes a MN, preferentemente las cepas clínicas no sinciciales, preferentemente aquellas que presentan tropismo para macrófagos, procedentes de cepas clínicas de etapas iniciales.

Pueden producirse múltiples proteínas a partir de una sola unidad de expresión mediante corte y empalme alternativo. Se proporcionan señales de corte y empalme para posibilitar la realización de corte y empalme alternativos, que producen diferentes mensajes que codifican diferentes proteínas.

Ejemplo 36

La figura 4 presenta cuatro cadenas principales, A, B, C y D. La figura 5 presenta 4 insertos, 1, 2, 3 y 4. El inserto 1 respalda la expresión de gag y pol; el elemento de respuesta a rev se clonó de forma que se conservara el aceptor de corte y empalme del VIH. El inserto 2 es similar al inserto 1, ya que respalda también la expresión de gag y pol, con la salvedad de que el elemento de respuesta a rev se clonó sin conservar el aceptor de corte y empalme del VIH. El inserto 3 respalda la expresión de gag y pol, e incluye una deleción del gen de la integrasa, y no incluye la presencia del elemento de respuesta a rev, que actúa en cis. El inserto 4 respalda la expresión de rev, vpu y env. El env puede tener el epítopo de reacción cruzada con el MHC de la clase II alterado para eliminar la reactividad cruzada, y el asa V3 puede estar alterada para eliminar la posibilidad de la formación de sincicios.

En algunos ejemplos, la cadena principal A se utiliza con el inserto 1. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA1ori+ es la cadena principal A con el inserto 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA1ori- es la cadena principal A con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Además, bien pA1ori+ o pA1ori- pueden incluir integrasa, para dar lugar a pA1ori+int+ y pA1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pA1ori+, pA1ori-, pA1ori+int+ y pA1ori-int+ pueden modificarse adicionalmente por eliminación funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), para dar lugar a pA1ori+RT-, pA1ori-RT-, pA1ori+int+RT- y pA1ori-int+RT-, respectivamente.

En algunos ejemplos, la cadena principal A se utiliza con el inserto 2. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA2ori+ es la cadena principal A con el inserto 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA2ori- es la cadena principal A con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Además, bien pA2ori+ o pA2ori- pueden incluir integrasa, para dar lugar a pA2ori+int+ y pA2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pA2ori+, pA2ori-, pA2ori+int+ y pA2ori-int+ pueden modificarse adicionalmente por eliminación funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), para dar lugar a pA2ori+RT-, pA2ori-RT-, pA2ori+int+RT- y pA2ori-int+RT-, respectivamente.

En algunos ejemplos, la cadena principal B se utiliza con el inserto 1. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pB1ori+ es la cadena principal B con el inserto 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pB1ori- es la cadena principal B con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Además, bien pB1ori+ o pB1ori- pueden incluir integrasa, para dar lugar a pB1ori+int+ y pB1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pB1ori+, pB1ori-, pB1ori+int+ y pB1ori-int+ pueden modificarse adicionalmente por eliminación funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), para dar lugar a pB1ori+RT-, pB1ori-RT-, pB1ori+int+RT- y pB1ori-int+RT-, respectivamente.

En algunos ejemplos, la cadena principal B se utiliza con el inserto 2. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pB2ori+ es la cadena principal B con el inserto 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pB2ori- es la cadena principal B con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Además, bien pB2ori+ o pB2ori- pueden incluir integrasa, para dar lugar a pB2ori+int+ y pB2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pB2ori+, pB2ori-, pB2ori+int+ y pB2ori-int+ pueden modificarse adicionalmente por eliminación funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), para dar lugar a pB2ori+RT-, pB2ori-RT-, pB2ori+int+RT- y pB2ori-int+RT-, respectivamente.

En algunos ejemplos, la cadena principal A sin el rev se utiliza con el inserto 3. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA/r-3ori+ es la cadena principal A con el inserto 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA/r-3ori- es la cadena principal A sin el rev con el inserto 3 sin el origen de replicación de SV40. Además, bien pA/r-3ori+ o pA/r-3ori- pueden incluir integrasa, para dar lugar a pA/r-3ori+int+ y pA/r-3ori- int+, respectivamente. Los plásmidos pA/r-3ori+, pA/r-3ori-, pA/r-3ori+int+ y pA/r-3ori-int+ pueden modificarse adicionalmente por eliminación funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), para dar lugar a pA/r-3ori+RT-, pA/r-3ori-RT-, pA/r-3ori+int+RT- y pA/r-3ori-int+RT-, respectivamente.

En algunos ejemplos, la cadena principal C se utiliza con el inserto 1. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC1ori+ es la cadena principal C con el inserto 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC1ori- es la cadena principal C con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Además, bien pC1ori+ o pC1ori- pueden incluir integrasa, para dar lugar a pC1ori+int+ y pC1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC1ori+, pC1ori-, pC1ori+int+ y pC1ori-int+ pueden modificarse adicionalmente por eliminación funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), para dar lugar a pC1ori+RT-, pC1ori-RT-, pC1ori+int+RT- y pC1ori-int+RT-, respectivamente.

En algunos ejemplos, la cadena principal C se utiliza con el inserto 2. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC2ori+ es la cadena principal C con el inserto 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC2ori- es la cadena principal C con el inserto 2 sin el origen de replicación de SV40. Además, bien pC2ori+ o pC2ori- pueden incluir integrasa, para dar lugar a pC2ori+int+ y pC2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC2ori+, pC2ori-, pC2ori+int+ y pC2ori-int+ pueden modificarse adicionalmente por eliminación funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), para dar lugar a pC2ori+RT-, pC2ori-RT-, pC2ori+int+RT- y pC2ori-int+RT-, respectivamente.

En algunos ejemplos, la cadena principal C se utiliza con el inserto 3. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC3ori+ es la cadena principal C con el inserto 3 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC3ori- es la cadena principal C con el inserto 3 sin el origen de replicación de SV40. Además, bien pC3ori+ o pC3ori- pueden incluir integrasa, para dar lugar a pC3ori+int+ y pC3ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC3ori+, pC3ori-, pC3ori+int+ y pC3ori-int+ pueden modificarse adicionalmente por eliminación funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), para dar lugar a pC3ori+RT-, pC3ori-RT-, pC3ori+int+RT- y pC3ori-int+RT-, respectivamente.

En algunos ejemplos, la cadena principal D se utiliza con el inserto 4. Dichas construcciones contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pD4ori+ es la cadena principal D con el inserto 4 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pD4ori- es la cadena principal D con el inserto 4 sin el origen de replicación de SV40.

Ejemplo 37

En algunos ejemplos, se proporciona una vacuna genética con una única unidad de expresión/inóculo único que comprende una construcción genética que incluye una secuencia codificante que codifica un péptido que tiene por lo menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a epítopos de proteínas del VIH. La secuencia codificante esta bajo control regulador del promotor temprano inmediato del CMV y la señal de poliadenilación secundaria del SV40.

En algunos ejemplos, se proporciona una vacuna genética con una única unidad de expresión/inóculo único que comprende una construcción genética que incluye una secuencia codificante que codifica por lo menos una proteína del VIH o un fragmento de la misma. La secuencia codificante está bajo control regulador del promotor temprano inmediato del CMV y la señal de poliadenilación secundaria del SV40. La proteína del VIH se selecciona a partir del grupo formado por gag, pol, env y rev.

En algunos ejemplos se proporciona una vacuna genética que comprende una construcción genética que incluye una secuencia codificante que codifica por lo menos dos proteínas del VIH o fragmentos de las mismas seleccionados a partir del grupo formado por gag, pol, env y rev, o fragmentos de las mismas. En algunos ejemplos, se proporciona una vacuna genética que comprende una construcción genética que incluye una secuencia codificante que codifica por lo menos tres proteínas del VIH o fragmentos de las mismas seleccionados a partir del grupo formado por gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas. En algunos ejemplos, se proporciona una vacuna genética que comprende una construcción genética que incluye una secuencia codificante que codifica gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas.

En algunos ejemplos, se proporciona una vacuna genética con doble unidad de expresión/inóculo único, que comprende una construcción genética que incluye dos unidades de expresión, que comprenden cada una de ellas una secuencia codificante que codifica un péptido que tiene por lo menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a epítopos de proteínas del VIH. La secuencia codificante está bajo control regulador del promotor temprano inmediato del CMV y de la señal de poliadenilación secundaria del SV40. Las dos unidades de expresión están codificadas en direcciones opuestas entre sí.

En algunos ejemplos, se proporciona una vacuna genética con doble unidad de expresión/inóculo único que comprende una construcción genética que incluye dos unidades de expresión que comprenden cada una de ellas una secuencia codificante que codifica por lo menos una proteína del VIH o un fragmento de la misma. Cada unidad de expresión comprende una secuencia codificante que está bajo control regulador del promotor temprano inmediato del CMV y de la señal de poliadenilación secundaria del SV40. La proteína del VIH se selecciona a partir del grupo formado por gag, pol, env y rev. En algunos ejemplos se proporciona una vacuna genética que comprende una construcción genética que incluye dos unidades de expresión, por lo menos una de las cuales comprende una secuencia codificante que codifica por lo menos dos proteínas del VIH o fragmentos de las mismas, seleccionadas a partir del grupo formado por gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas, y la otra comprende por lo menos una proteína del VIH o fragmentos de la misma seleccionada partir del grupo formado por gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas.

En algunos ejemplos se proporciona una vacuna genética que comprende una construcción genética que incluye dos unidades de expresión, por lo menos una de las cuales comprende una secuencia codificante que codifica por lo menos tres proteínas del VIH, o fragmentos de las mismas, seleccionadas a partir del grupo formado por gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas, y la otra comprende por lo menos una proteína del VIH, o fragmentos de la misma, seleccionada a partir del grupo formado por gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas. En algunos ejemplos se proporciona una vacuna genética que comprende una construcción genética que comprende dos unidades de expresión e incluye una secuencia codificante que codifica gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas.

Ejemplo 38

Se preparó una construcción genética, el plásmido pCMN160\Delta16, para su utilización en un kit farmacéutico o composición farmacéutica contra el VIH. El pCMN160\Delta16 se construyó de la siguiente manera:

Etapa 1

Se utilizaron los cebadores SEC ID n.º:31 y SEC ID n.º:30 para amplificar por PCR un fragmento del ADN genómico del VIH/MN.

Etapa 2

Se utilizaron los cebadores SEC ID n.º:29 y SEC ID n.º:32 para amplificar por PCR un fragmento del ADN genómico del VIH/MN.

Etapa 3

Los cebadores SEC ID n.º:31 y SEC ID n.º:32 se combinaron con 2 \mul del material de la reacción de las Etapas 1 y 2.

Etapa 4

El producto de reacción de la Etapa 3 se cortó con NotI y MluI y se insertó en la cadena principal A descrita en el Ejemplo 36, cortada con NotI y MluI.

De este modo se forma el plásmido pCMN160\Delta16, que contiene como inserto en la cadena principal A una región que codifica la cepa MN de la proteína ENV con la región rev y la mitad de nef que tiene la región HLA-DB cambiada a VIH-2.

Ejemplo 39

El plásmido pGAGPOL.rev2 se preparó de la siguiente manera. Primero se construyó la cadena principal. Después se generó un inserto con gag y pol del VIH y se incorporó en la cadena principal.

La cadena principal se preparó la siguiente manera.

Etapa 1

Se digiere pMAMneo (Clonetech) con BglI. Se rellena con el fragmento de Klenow de la Polimerasa I. Se corta con HindIII. El fragmento de 1763 pb se purifica en gel.

Etapa 2

Se amplifica el gen Kan® del plásmido pJ4\Omegakan^{+} (gen de resistencia a la kanamicina obtenido de Pharmacia Inc. y clonado en pJ4\Omega obtenido por cortesía del Imperial Cancer Research Fund, Reino Unido; pJ4\Omega fue construido y descrito originalmente por Morgenstern, J. P. y H. Land, Nucl. Acids Res. 18(4):1068, con los oligonucleótidos SEC ID n.º:33 y SEC ID n.º:34. El producto obtenido por PCR se hace romo. Se corta con HindIII. El fragmento de PCR se purifica en gel.

Etapa 3

Se liga a la cadena principal del vector generada a partir de pMAMneo y descrita en la etapa n.º 1 con el producto de la PCR que codifica el gen Kan® y que se ha descrito en la etapa n.º 2. Se aísla el plásmido que contiene el gen Kan® y el origen de replicación bacteriano.

Etapa 4

Se digiere el plásmido resultante con MluI, se rellena con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I. Se liga con el conector SacII (New England Biolabs).

Etapa 5

Se digiere el plásmido obtenido en la etapa 4 con AseI y SspI.

Etapa 6

Se somete a PCR parte del gen Kan® a partir del plásmido descrito en la etapa 3 utilizando los cebadores SEC ID n.º:35 y SEC ID n.º:36. Se corta el producto de la PCR con SspI y AseI.

Etapa 7

Se liga el fragmento más largo obtenido en la etapa 5 con el producto de la PCR obtenido en la etapa 6.

Etapa 8

Se corta el producto de la ligación/plásmido obtenido en la etapa 7 con HindIII. Se hace romo con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I.

Etapa 9

Se corta pCEP4 (Invitrogen) con SalI para liberar un fragmento de ADN que contiene el promotor del CMV, el sitio de clonación múltiple, y el sitio de poliadenilación del SV40. Se purifica este fragmento y se hace romo con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I.

Etapa 10

Se liga el plásmido obtenido en la etapa 8 y el fragmento obtenido en la etapa 9. Se aísla el plásmido que contiene el origen de replicación bacteriano, el gen Kan®, el potenciador del RSV, el promotor del CMV, el sitio de clonación múltiple, y el sitio de poliadenilación del SV40.

Etapa 11

Se corta plásmido obtenido en la etapa 10 con BamHI y NheI.

Etapa 12

Se hibridan los oligonucleótidos SEC ID n.º:37 y SEC ID n.º:38.

Etapa 13

Se liga el plásmido obtenido en la etapa 10 con los oligonucleótidos hibridados obtenidos en la etapa 12. Se aísla el plásmido que contiene el adaptador contenido en la etapa 12.

Etapa 14

Se digiere el plásmido obtenido en la etapa 13 con SalI y MluI.

Etapa 15

Se amplifica por PCR el marco abierto de lectura de rev utilizando BBG35 (RD Systems Inc. Minneapolis, MN; que contiene la región que codifica rev del VIH, cepa HX3B en pUC19) como molde y los cebadores SEC ID n.º:39 y SEC ID n.º:40. Se digiere el producto de la PCR con SalI y MluI.

Etapa 16

Se liga el plásmido obtenido en la etapa 14 con el producto de la PCR producido en la etapa 15. Se aísla el plásmido que contiene la región que codifica rev.

Preparación del inserto gag/pol

Etapa 1

Un subclón de parte del genoma del VIH-1 (HXB2) se clonó en Bluescript (Stratagene). El subclón del VIH-1 contiene el LTR en 5' completo y el resto del genoma del VIH-1 hasta el nucleótido 5795 (numeración de Genbank) clonado en los sitios XbaI y SalI de Bluescript. Las secuencias del VIH-1 se obtienen a partir del plásmido HXB2D (AIDS Repository).

Etapa 2

Se somete a PCR parte de la región que codifica gag a partir del marco abierto de lectura del plásmido descrito en la etapa 1 (el subclón de parte del genoma del VIH-1 HXB2 clonado en Bluescript) utilizando los cebadores SEC ID n.º:41 y SEC ID n.º:42.

Etapa 3

Se digiere el plásmido descrito en la etapa 1 (el subclón de parte del genoma del VIH-1 HXB2 clonado en Bluescript) con EcoRI. Se purifica el plásmido que contiene la cadena principal de pBluescript, el LTR en 5' del VIH-1, la región que codifica gag y parte de la región que codifica pol, y se liga de nuevo.

Etapa 4

Se corta el plásmido obtenido en la etapa 3 con NotI y SpeI y se liga con el fragmento de PCR descrito en la Etapa 2 tras su digestión con NotI y SpeI. Se aísla el plásmido que contiene el fragmento de PCR en vez del fragmento original NotI/SpeI que contiene el LTR en 5' del VIH-1.

Etapa 5

Se digiere el plásmido obtenido en la etapa 4 con EcoRI y SalI.

Etapa 6

Se hibridan los oligonucleótidos SEC ID n.º:43 y SEC ID n.º:44.

Etapa 7

Se liga el plásmido obtenido en la etapa 5 con el adaptador obtenido en la etapa 6. Se aísla el plásmido que contiene el adaptador clonado en los sitios EcoRI/SalI.

Etapa 8

Se digiere el plásmido obtenido en la etapa 7 con NdeI y EcoRI.

\newpage

Etapa 9

Se amplifica por PCR el elemento de respuesta a Rev (RRE) a partir de un plásmido que contiene la secuencia RRE de la cepa HXB2 del VIH-1, utilizando los cebadores SEC ID n.º:45 y SEC ID n.º:46. Se digiere el producto de la PCR con NdeI y EcoRI.

Etapa 10

Se liga el plásmido obtenido en la etapa 8 con el producto de la PCR obtenido en la etapa 9. Se aísla el plásmido que contiene el inserto con la secuencia RRE.

Etapa 11

Se digiere el plásmido obtenido en la etapa 10 con NotI y SalI y se aísla el fragmento que contiene la región que codifica gag, la región que codifica pol modificado, y la secuencia RRE.

Etapa 12

Se digiere el plásmido obtenido en la etapa 16 del protocolo para la preparación de la cadena principal que se ha descrito anteriormente con NotI y SalI.

Etapa 13

Se liga el plásmido obtenido en la etapa 12 con el inserto obtenido en la etapa 11. Se aíslan los plásmidos que contienen el inserto que incorpora la región que codifica gag, la región que codifica pol modificado, y la secuencia RRE.

Etapa 14

Se digiere el plásmido obtenido en la etapa 13 con XbaI y NheI. Se hacen romos los extremos, y se liga de nuevo. Se aísla el plásmido que carece del sitio KpnI presente entre los sitios XbaI y NheI en el plásmido obtenido en la etapa 13.

Etapa 15

Se digiere el plásmido obtenido en la etapa 14 con KpnI y se aísla el fragmento más largo.

Etapa 16

Se hibridan los oligonucleótidos SEC ID n.º:47 y SEC ID n.º:48.

Etapa 17. Se liga el fragmento purificado del plásmido obtenido en la etapa 15 con el adaptador obtenido en la etapa 16. Se aísla el plásmido que contiene el adaptador insertado en el sitio KpnI del plásmido obtenido en la etapa 15.

Ejemplo 40 Inmunización genética con genes de proteínas reguladoras

Parte de la dificultad para combatir el VIH proviene de la extraordinaria variabilidad del virus y de su capacidad para mutar rápidamente dando lugar a nuevas formas del mismo. No sólo hay una variación sustancial en la secuencia de las proteínas de las cepas del VIH aisladas del conjunto de la población humana, sino que el virus muta de forma tan rápida que lo cierto es que cada individuo infectado con el VIH aloja varias microvariantes relacionadas del VIH. Dichos cepas aisladas del VIH presentan diferencias en la eficacia de la replicación, el tropismo, la susceptibilidad a la neutralización y la resistencia a los fármacos. Cuando aparecen mutantes resistentes a fármacos los beneficios de la farmacoterapia se disipan. En el caso de la AZT, la resistencia al fármaco aparece típicamente en el primer año del tratamiento. Esta continua generación de mutantes de escape puede desempeñar un papel en la capacidad del VIH para superar las defensas del hospedador tras un período prolongado en el que el virus parece estar bajo control.

Se ha descrito esta deriva de mutación en varias regiones de la glucoproteína de la cubierta gp120, incluido el dominio neutralizante principal del asa V3, así como en las proteínas de la nucleocápside de VIH. Las proteínas reguladoras del VIH están mucho más conservadas que las proteínas estructurales y presentan también una menor deriva de mutación con el tiempo. Por consiguiente, las proteínas reguladoras constituyen dianas atractivas para el ataque antivírico.

El VIH presenta una notable regulación temporal de la expresión de proteínas reguladoras frente a proteínas estructurales. En la fase temprana de la replicación vírica, predominan los ARNm que codifican las proteínas reguladoras Tat, Rev y Nef, mientras que en la fase tardía hay una mayor expresión de los ARNm que codifican proteínas estructurales, incluidos precursores de Gag, Pol y Env, y muchas proteínas accesorias. Este cambio de la fase temprana a la tardía se pone en marcha cuando la proteína rev alcanza un nivel particular. El predominio de Tat, Rev y Nef al comienzo del ciclo de replicación vírica convierte asimismo a estas proteínas en dianas favorables para la ataque antivírico. Esto es especialmente cierto en el caso de tat y rev, que desempeñan papeles absolutamente esenciales en la regulación transcripcional y postraduccional de la expresión de los genes del VIH, y predominan al comienzo del ciclo de replicación vírica, antes de la transcripción de las proteínas víricas estructurales y la producción de partículas víricas infecciosas.

En contraposición a tat y rev, que desempeñan claramente papeles esenciales en la replicación del VIH, otras proteínas reguladoras tales como nef, vpr, vif y vpu se denominan a veces proteínas "accesorias". Sus funciones no se conocen tan bien, y el grado en el que se atenúa la replicación vírica debido a la pérdida de una función particular varía considerablemente y puede depender de la célula hospedadora que está infectada. No obstante, el alto grado de conservación de dichas funciones en cepas aisladas muy diversas del VIH, así como en otros virus de inmunodeficiencia de primates, indican la importancia de estas funciones "accesorias" en el proceso natural de la infección. (Véase en general, Terwilliger, E. F., (1992) AIDS Research Reviews 2:3-27, W. C. Koff, F. Wong-Staal, y R. C. Kennedy, eds. (Nueva York: Marcel Dekker, Inc.). De hecho, los virus recombinantes de primates con deleciones en vpr, nef o vif no son patógenos in vivo, lo que demuestra de forma adicional la importancia de dichos genes accesorios en el ciclo vital del virus.

Hay algunos indicios que apuntan a que podrían lograrse respuestas inmunitarias protectoras de mayor nivel contra el VIH presentando unas pocas proteínas reguladoras y/o enzimáticas seleccionadas, en vez de un conjunto completo de genes del VIH. Por consiguiente, una estrategia de inmunización centrada puede involucrar de forma deseable la inmunización genética utilizando secuencias codificantes para una o más proteínas reguladoras no estructurales del VIH, incluidas tat, rev, vpr, nef, vpu o vif. Solamente en el caso de vpr se ha comprobado que está asociada a partículas víricas, mientras que otras proteínas reguladoras, incluidas tat, rev, nef, vif y vpu, no están asociadas a los viriones.

En algunos ejemplos de inmunización genética contra el VIH utilizando genes reguladores, el gen o los genes de tat, rev, nef, vif y vpu se insertan en la cadena principal A que se ha descrito en el Ejemplo 37. Es preferible que se utilice tat y/o rev. En algunos ejemplos, se insertan tat o rev en la cadena principal A que se ha descrito en el Ejemplo 37. En algunos ejemplos, las dianas son, en orden descendente de preferencia, nef, vpr, vif y vpu. Puede emplearse más de un gen regulador, incluidos tat y rev; tat, rev, y nef; tat, rev, nef, y vpr; tat, rev, nef, vpr, y vif; tat, rev, nef, vpr, vif, y vpu; así como combinaciones de los mismos, y, opcionalmente, genes reguladores adicionales tales como tev.

La proteína Tat es un transactivador de la expresión de genes dirigida por LTR. Es absolutamente esencial para la replicación del VIH. Tat se produce al comienzo del ciclo de replicación vírica y es necesaria la presencia de Tat funcional para la expresión de Gag, Pol, Env y Vpr. La forma predominante de Tat es una proteína de 86 aminoácidos derivada de dos ARNm de exones. Los 58 aminoácidos del extremo aminoterminal son suficientes para la transactivación, aunque con actividad reducida. Tat actúa en una secuencia reguladora en cis denominada tar, produciendo un extraordinario aumento en la expresión genética dirigida por LTR. Tat puede actuar en parte aumentando la síntesis de ARN y en parte aumentando la cantidad de proteína sintetizada por cada transcrito de ARN. Hasta hace poco, se creía que Tat actuaba solamente en el LTR del VIH-1. Sin embargo, también se ha descrito la expresión, activada por Tat, del promotor tardío del virus JC. Tat también puede estimular la proliferación celular actuando como factor exógeno, y puede contribuir a fomentar el crecimiento del sarcoma de Kaposi en individuos infectados por el VIH. Debido a la posibilidad de dichos efectos perjudiciales tanto en individuos infectados con el VIH como en individuos no infectados, las construcciones preferidas con tat empleadas para la inmunización genética se modifican para expresar sólo Tat no funcional. Las mutaciones capaces de inactivar Tat o Rev pueden actuar además como mutaciones dominantes en trans, potenciando de esta manera la inactivación de cualquier Tat funcional que se produzca en un individuo infectado por el VIH.

Rev es una segunda proteína reguladora del VIH que es esencial para la replicación vírica. Se trata de una proteína de 19 kD (116 aminoácidos) que se expresa a partir de dos exones codificantes que se encuentran en diversos ARNm de corte y empalme múltiple. Se han identificado dos dominios diferentes, una región básica involucrada en la unión al RRE (elemento de respuesta a Rev) que contiene transcritos, y un dominio de "activación" que induce la exportación nuclear de dichos transcritos como resultado de la unión. En el curso de la infección natural por el virus, Rev es necesaria para la expresión de las proteínas estructurales del VIH Gag, Pol y Env, así como Vpr.

Vpr es una proteína de 15 kD (96 aminoácidos) en la mayoría de las cepas del VIH-1, aunque el marco abierto de lectura de Vpr está considerablemente truncado en muchas cepas víricas sometidas a numerosos ciclos de propagación por pases en cultivo celular. El marco abierto de lectura de vpr también está presente en el VIH-2 y en la mayoría de las cepas aisladas del SIV. Vpr es la primera proteína reguladora retrovírica que se ha comprobado que está asociada a partículas víricas del VIH. Su presencia en el virión del VIH apunta a que puede cumplir una función en algún punto del comienzo del ciclo de replicación vírica. Vpr acelera la replicación del VIH, especialmente al comienzo de la infección. Vpr aumenta aproximadamente tres veces el nivel de expresión de genes indicadores asociados al LTR del VIH. Además, parece que Vpr y Tat actúan de forma sinérgica con respecto a los genes asociados al LTR. Vpr puede aislarse a partir del suero de individuos infectados por el VIH y parece que aumenta la capacidad del virus para infectar nuevas células. También se ha comprobado que Vpr inhibe la proliferación celular y provoca la diferenciación celular (Levy, D. N. et al., Cell (1993) 72: 1-20), un resultado que puede ser significativo, dada la existencia de informes que indican que los monocitos/macrófagos primarios pueden ser infectados in vitro sólo mientras están en proceso de diferenciación (Schuitemaker, H. et al., (1992) J. Clin. Invest. 89: 1154-1160. Incluso células que son incapaces de respaldar la replicación del VIH pueden sufrir trastornos en su regulación debido a los efectos de Vpr. Por ejemplo, Vpr puede ser responsable de la atrofia muscular progresiva observada frecuentemente en los pacientes con SIDA. Debido a la posible actividad nociva de Vpr, la inmunización genética debe realizarse preferentemente con una construcción de vpr modificada que exprese una proteína Vpr no funcional.

Nef (también denominada ORF en 3' en la literatura antigua) es una proteína de 25-27 kD. Se ha postulado que Nef puede estar involucrada en la regulación por disminución de linfocitos T CD4+. Además, Nef puede desempeñar un papel en la señalización celular. Nef parece ser importante para el establecimiento de la infección por el VIH in vivo. Se cree que los CTL específicos de Nef son importantes para el control de la infección por el VIH in vivo.

Vif es una proteína citoplásmica de 23 kD denominada "factor de infectividad vírica". Aunque los virus mutantes que carecen de Vif no presentan deterioro en la transmisión de célula a célula, muestran un profundo descenso en su capacidad de infectar muchas líneas celulares CD4+. Sin Vif, hay menor liberación de virus por gemación, así como un descenso en la infectividad. En estudios realizados en primates, los mutantes de deleción de Vif presentan una considerablemente disminución en su capacidad para establecer la infección in vivo. Estos estudios apoyan la idea de que Vif desempeña un papel clínico en la replicación del virus en el hospedador.

Vpu es una proteína de 15-20 kD (81 aminoácidos). Aunque los virus Vpu(+) y Vpu(-) producen la misma cantidad de proteína vírica, éstos últimos presentan un aumento de la acumulación intracelular de proteínas víricas junto con un descenso del virus extracelular, lo que indica que Vpu puede estar involucrada en el ensamblaje y/o liberación de las partículas víricas.

Los retrovirus simples, tales como los virus murino y aviar, carecen de proteínas análogas a las proteínas reguladoras de VIH-1, VIH-2 y SIV. En dichos animales la infección por los retrovirus tiende a ser autolimitante, con eliminación del virus y descenso de la capacidad patógena. De forma similar, el HTLV-1, que incluye sólo Tax (que actúa de forma similar a Tat y también presenta actividad de tipo vpr) y Rex (que actúa de forma similar a Rev) es eliminado en muchos individuos. La inmunización genética con genes reguladores se considera pertinente no sólo para el caso del HIV, sino también para virus tales como VHB (producto génico X) y VHC, y HTLV-1 (Tax) y (Rex). Se cree que en todos estos virus, los genes reguladores desempeñan un papel crítico en el ciclo vital del virus y en el establecimiento la infección.

Ejemplo 41 Construcción del plásmido regulador de VIH-1, pREG

El plásmido pREG se construye por etapas, y pueda analizarse la expresión de proteínas de cada intermediario antes de continuar con la construcción. Un vector de expresión que permite la expresión de tat y rev se construye en dos etapas. En primer lugar, un producto de amplificación que contiene un sitio NheI en 5', el sitio principal donador de corte y empalme del VIH-1, la mayor parte de la región que codifica tat, la región que codifica la región aminoterminal de la proteína rev y un sitio AvaII, se amplifica a partir de un molde sintético. Este molde sintético se genera utilizando las secuencias publicadas de la cepa HXB2 del VIH-1 obtenidas a partir de la base de datos GenBank, y se altera para mutar los residuos de cisteína en las posiciones 22 y 30 de la proteína tat. Se ha demostrado que estas mutaciones dar lugar a una tat no funcional (Kuppuswamy, et al. (1989) Nucleic Acids Research 17 (9): 3551-3561).

El producto de la PCR se liga con el vector que ha sido digerido con NheI y AvaII y que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, la región que codifica rev y una señal de poliadenilación del SV40. La secuencia rev presente en el plásmido procede del clon provírico III_{B} del VIH-1. Así se genera un vector de expresión que contiene una región que codifica la tat completa, aunque mutada, y una región completa que codifica rev.

La etapa siguiente se lleva cabo para generar el producto de la PCR que contiene un sitio AvaII en su extremo 5', una mutación en la posición aminoácida 81 de rev, aproximadamente el 30% de la región que codifica rev, aproximadamente el 30% de la región de codifica nef, y un sitio MluI en el extremo 3'. Se ha comprobado que el cambio aminoácido en la posición 81 elimina la función rev, y por consiguiente, el plásmido resultante dará lugar a la producción de la proteína rev no funcional (Bogard, H. y Greene, W. C. (1993) J. Virol. 67(5): 2496-2502). Se supone que la principal deleción de la región que codifica nef dará lugar a la producción de una proteína nef no funcional. El sitio AvaII en 5' y la mutación en la posición aminoácida 81 de la proteína rev se introducen en el cebador 5' para la PCR que es complementario a la región que codifica rev y que contiene tanto el sitio AvaII como el nucleótido que codifica el aminoácido 81. Un codón de terminación que causa la terminación de Nef en la posición aminoácida 63 y el sitio de clonación en 3', MluI, serán introducidos por el cebador 3' para la PCR. El molde para esta amplificación por PCR es un plásmido o molde sintético que contiene las regiones que codifican rev y nef de la cepa MN del VIH-1. El producto de la PCR resultante será digerido con AvaII y MluI, y se utilizará para sustituir al fragmento AvaII - MluI, más pequeño, obtenido tras la digestión del plásmido tat-rev descrito en el párrafo anterior con AvaII y MluI.

Opcionalmente, puede añadirse vpr a este plásmido en uno de los sitios. Según una estrategia, puedo amplificarse vpr utilizando un cebador 5' para la PCR que contiene un sitio MluI corriente arriba de las secuencias que abarcan el codón de iniciación de la traducción de vpr y un cebador 3' para la PCR complementario al codón de terminación vpr y a las secuencias que lo flanquean, que también contienen un sitio de clonación MluI. Las secuencias situadas corriente arriba del codón de iniciación contienen un aceptor de corte empalme. El producto de la PCR puede digerirse con MluI e insertarse en el plásmido tat rev nef descrito anteriormente, antes de su digestión con MluI.

Como alternativa, la amplificación de vpr puede realizarse de forma análoga, no obstante, los cebadores para la PCR contendrán sitios de restricción compatibles con la clonación en otro vector, de modo que se exprese bajo el control de un segundo promotor eucariota. La casete procedente de este plásmido, que contiene un segundo promotor seguido por la región de codifica vpr, seguido una secuencia de poliadenilación, pueden liberarse por digestión con enzimas de restricción que flanquean la casete, pero que no cortan en su interior. El fragmento de ADN resultante se clonaría en un sitio único del plásmido tat, rev, vpr situado fuera la región necesaria para la expresión de tat rev vpr. De este modo, se forma un plásmido que tiene dos unidades de expresión.

Ejemplo 42 Construcción de los plásmidos de VHC y HTLV-1

Puede utilizarse una estrategia similar para generar un plásmido que expresa proteínas codificadas por el HTLV-1 o el VHC que tienen funciones enzimáticas necesarias para el ciclo vital del virus y/o para las proteínas reguladoras de estos virus. En el caso del HTLV-1, se genera un plásmido que codifica la proteína reguladora, TAX, utilizando una cadena principal del plásmido y una estrategia de de clonación similar a las descritas anteriormente. Dichos genes del VHC que codifican proteínas enzimáticas incluyen la ARN-polimerasa dependiente de ARN, una proteína que tiene una función helicasa/proteasa. Las secuencias necesarias están publicadas y disponibles en la base de datos GenBank. La organización vírica del HTLV-1 y del VHC está publicada en Cann, A. J. y Chen, I. S. Y. Virology 2ª. Edición, editado por B. N. Fiddr, Raven Press, Ltd., Nueva York, 1990, y en Bradley, D. W. Transfusion Medicine Reviews, 1(2):93-102, 1992, respectivamente.

Ejemplo 43 Inmunización genética con genes enzimáticos

La inmunización genética con genes que codifican proteínas con funciones enzimáticas, tales como el gen pol del HIV pueden constituir asimismo una estrategia antivírica importante, ya que enzimas como Pol son necesarias para la producción de virus vivos. En ausencia de la polimerasa o de cualquiera de sus funciones constitutivas, el VIH no es patógeno ni infeccioso. De forma similar, los genes enzimáticos de otros virus, tales como el de la polimerasa del VHB, son dianas atractivas para la inmunización genética. Ver, por ejemplo, Radziwill et al., Mutational Analysis of the Hepatitis B Virus P Gene Product: Domain Structure and RNase H Activity, J. Virol. 64 (2): 613-620 (1990).

Uno de los motivos de este interés de las enzimas víricas como dianas inmunológicas es la limitada capacidad de dichas enzimas para mutar su secuencia aminoácida y mantener al mismo tiempo sus funciones enzimáticas. Por ejemplo, en el caso del VIH-1, Pol presenta un número limitado de mutaciones "de escape" que están asociadas a la resistencia a análogos de nucleótidos tales como el AZT. Sin embargo, la inmersa mayoría de las dianas inmunológicas en la proteína se conservan incluso en los mutantes de escape resistentes al fármaco.

Ejemplo 44 Construcción del plásmido con la polimerasa del VHB

Los experimentos descritos en la literatura indican que la expresión de la polimerasa del VHB en células mantenidas en cultivo de tejido se consigue cuando están presentes en una molécula de ARNm tanto el marco abierto de lectura de la nucleocápside como el de la polimerasa. También se ha demostrado que en esta situación la mutación del ATG de la nucleocápside no influye en la expresión de la polimerasa.

El genoma del VHB se amplifica a partir de un plásmido que contiene un dímero de cabeza-cola de la cepa ADW del VHB. Debido a que se desea solamente la expresión de la polimerasa, y no la de la nucleocápside, se diseña el cebador 5' para la PCR para mutar los codones de iniciación de la traducción de la prenucleocápside y la nucleocápside. Además, este cebador también produce una secuencia mutante DR1 para eliminar la posibilidad de la generación de un ARN genómico del VHB capaz de replicarse. Este producto de la PCR se inserta en un plásmido que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación del SV40. Los codones de iniciación de la traducción para el antígeno de superficie y para el producto de la región que codifica X se mutan para prevenir la expresión de los productos de los genes HBS y X.

Según otra estrategia para lograr la expresión de la polimerasa del VHB, un producto de la PCR que codifica la región completa que codifica la polimerasa se amplifica y se clona en un vector que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación del SV40. El cebador 5' para la PCR en esta amplificación contiene un sitio de clonación y abarca el codón de iniciación de la traducción del gen de la polimerasa. El producto 3' de la PCR contiene un sitio de restricción para clonar el inserto en el vector de expresión y es también complementario al codón de terminación tradicional del gen de la polimerasa del VHB y a las secuencias que flanquean dicho codón de terminación. Tras ligar este producto de la PCR en un plásmido que contiene el gen de resistencia a la kanamicina, un origen de replicación de pBR322, un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación del SV40, los codones de iniciación de la traducción para los genes del antígeno de superficie de la hepatitis B y para X se mutan para prevenir la expresión de dichos productos génicos. Se utiliza una estrategia alternativa similar a la descrita anteriormente; sin embargo, el cebador 3' para la PCR incluye en este caso la señal de poliadenilación del VHB y las secuencias que flanquean dicha señal. Este cebador 3' se utiliza en el caso de que las secuencias que incluyen y/o que rodean la señal de poliadenilación del VHB sean importantes para la expresión. Un análisis mutacional ha demostrado que la función del producto del gen de la polimerasa del VHB puede eliminarse mediante ciertos cambios de nucleótidos (Radziwell, G. et al. (1990) J. Virol. 64 (2):613-620). Antes de utilizar un plásmido construido como se ha descrito anteriormente, la polimerasa expresada puede mutarse mediante la introducción de una de estas mutaciones, u otras análogas.

Ejemplo 45

El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) presenta efectos estimuladores en diversas líneas celulares, incluidas líneas de neutrófilos, monocitos/macrófagos y eosinófilos. Los efectos del GM-CSF lo convierten en un modelo terapéutico atractivo. El GM-CSF ha sido autorizado por la FDA para su utilización en el transplante autólogo de médula ósea y se han iniciado ensayos clínicos para verificar su eficacia en el tratamiento de varias neutropenias. En la actualidad, el GM-CSF se suministra en forma de proteína que requiere generalmente su administración en múltiples dosis. Las proteínas tienen que ser producidas y purificadas.

Una estrategia alternativa a la utilización de la proteína GM-CSF consiste en la administración directa de una construcción genética que contiene un gen que codifica GM-CSF junto con la administración de .. La construcción genética se lleva a cabo mediante PCR de un gen GM-CSF que incluye la secuencia señal. La construcción genética contiene preferentemente un gen de resistencia a la kanamicina (gen de la aminoglicósido-3'-fosfotransferasa), un origen de replicación bacteriano, secuencias que respaldan la expresión de la región que codifica GM-CSF en las células en las que se introduce el plásmido, tales como los vectores descritos como cadenas principales en el Ejemplo 36. El plásmido contiene preferentemente un origen de replicación de mamíferos, inducido por la replicación celular asociada a la administración. Si se utiliza el origen de replicación del VEB, la secuencia que codifica el antígeno nuclear EBNA-1 se incluye asimismo con las secuencias reguladoras apropiadas. Los cebadores para la amplificación por PCR del inserto contienen sitios para enzimas de restricción que permiten la clonación en el vector de expresión y son complementarios a los extremos 5' y 3' de las secuencias que codifican el GM-CSF. La reacción de PCR se lleva a cabo en un clon de ADNc como se describe en Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 4360-4364.

Ejemplo 46

La leucemia mielógena crónica (LMC) es un trastorno mieloproliferativo clonal de las células madre hematopoyéticas asociadas al cromosoma Filadelfia, una aberración cromosómica originada por una translocación entre los cromosomas 9 y 22. Los puntos de ruptura en el cromosoma 22 se agrupan en una región de 6 kb denominada región de agrupamiento de puntos de ruptura (BCR, por sus siglas en inglés), mientras que en el cromosoma 9 los puntos de ruptura están dispersos en toda una región de 90 kb situada corriente arriba del exón 2 de c-abl. Las diversas translocaciones 9:22 resultantes pueden subdividirse en dos tipos: translocaciones K28 y translocaciones L6. La transcripción a través de la translocación bcr-abl da lugar a la generación de ARNm de fusión. Se ha comprobado que las moléculas antisentido dirigidas contra la unión bcr-abl de los ARNm disminuye la capacidad de formación de colonias de las células hematopoyéticas obtenidas de pacientes con LMC.

Ejemplo 47

Las construcciones genéticas útiles en los kits y composiciones farmacéuticas para la vacunación contra del VHB, y para el tratamiento de la infección por VHB, se construyen con los vectores descritos como cadenas principales en el Ejemplo 36. Los plásmidos contienen genes estructurales del VHB, en particular genes que codifican el antígeno superficial del VHB y/o el antígeno de la nucleocápside del VHB y/o el antígeno de la prenucleocápside del VHB.

Ejemplo 48

Las construcciones genéticas útiles en los kits y composiciones farmacéuticas para la vacunación contra del VHC, y para el tratamiento de la infección por VHC, se construyen con los vectores descritos como cadenas principales en el Ejemplo 36. Los plásmidos contienen genes estructurales del VHC, en particular genes que codifican la proteína de la nucleocápside del VHC y/o la proteína de la cubierta del VHC.

Ejemplo 49

Se diseñó la construcción genética pREV, que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica rev del VIH como proteína diana única. La secuencia que codifica rev se clona en la cadena principal A descrita en el Ejemplo 36 de BBG35 (RD Sytems Inc. Minneapolis, MN.) que contiene la región que codifica rev de la cepa HX3B del VIH en pUC19.

TABLA 1

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los picornavirus

Géneros:: Rinovirus: (Medicina) responsables de \sim 50% de los casos de resfriado común.

\quad: Enterovirus: (Medicina) incluye virus de la poliomielitis, virus de Coxsackie, ecovirus, y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A.

\quad: Aftovirus: (Veterinaria) son los virus de la glosopeda.

\quad: Antígenos diana: VP1, VP2, VP3, VP4, VPG

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los calicivirus

Géneros:: Virus del grupo de Norwalk: (Medicina) estos virus son importantes agentes causantes de gastroenteritis epidémica.

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los togavirus

Géneros:: Alfavirus: (Medicina y veterinaria) los ejemplos incluyen virus de Sindbis, virus de RossRiver y virus de la encefalitis equina del Este y del Oeste.

\quad: Reovirus: (Medicina) virus de la rubéola.

\vskip1.000000\baselineskip

Familia Flaviviridae

\quad: Los ejemplos incluyen: (Medicina) virus del dengue, de la fiebre amarilla, de la encefalitis japonesa, de la encefalitis de San Luis, y virus de la encefalitis transmitida por garrapatas.

Virus de la hepatitis C:: (Medicina) estos virus no están incluidos todavía en una familia, pero se cree que son togavirus o flavivirus. La mayor similitud se da con la familia togavirus.

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los coronavirus:: (Medicina y veterinaria)

\quad: Virus de la bronquitis infecciosa (aves)

\quad: Virus de la gastroenteritis transmisible porcina (cerdos)

\quad: Virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (cerdos)

\quad: Virus de la peritonitis infecciosa felina (gatos)

\quad: Coronavirus entérico felino (gatos)

\quad: Coronavirus canino (perros)

\quad: Los coronavirus respiratorios humanos causan \sim40 casos del resfriado común. EX. 224E, 0C43. Nota - los coronavirus pueden causar la hepatitis no-A, B o C.

\quad: Antígenos diana:

\quad: E1 – también denominado proteína M o matriz

\quad: E2 - también denominado proteína S o espiga (spike, en inglés)

\quad: E3 - también denominado glucoproteína HE o hemaglutinina-esterasa (no está {}\hskip0,7cm presente en todos los coronavirus)

\quad: N - nucleocápside

\newpage

TABLA 1 (continuación)

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los rabdovirus

Géneros:: Vesiculovirus

\quad: Lisavirus: (Medicina y veterinaria) virus de la rabia

Antígeno diana:: proteína G

\quad: proteína N

\vskip1.000000\baselineskip

Familia Filoviridae: (Medicina)

\quad: Virus de la fiebre hemorrágica tales como el virus de Marburgo y el virus del Ébola

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los paramixovirus:

Géneros:: Paramixovirus: (Medicina y veterinaria)

\quad: Virus de la parotiditis, virus de la enfermedad de New castle (patógeno importante en pollos)

\quad: Morbilivirus: (Medicina y veterinaria)

\quad: Virus del sarampión, virus del moquillo

\quad: Pneumovirus: (Medicina y veterinaria)

\quad: Virus respiratorio sincicial

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los ortomixovirus (Medicina)

\quad: Virus de la gripe

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los bunyavirus

Géneros:: Bunyavirus: (Medicina) virus de la encefalitis de California, virus de LA Crosse

\quad: Flebovirus: (Medicina) virus de la fiebre del Valle del Rift

\quad: Hantavirus: el virus de Puumala causa fiebre hemorrágica

\quad: Nairovirus (Veterinaria) enfermedad de la ovejas de Nairobi

\quad: También muchos bunyavirus no asignados

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los arenavirus (Medicina)

\quad: LCM, virus de la fiebre de Lassa

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los reovirus

Géneros:: Reovirus: un posible patógeno humano

\quad: Rotavirus: gastroenteritis aguda en niños

\quad: Orbivirus: (Medicina y veterinaria)

\quad: Fiebre de las garrapatas de Colorado, virus de Lebombo (seres humanos), virus de la encefalosis equina, virus de la fiebre catarral ovina (blue tongue)

\newpage

TABLA 1 (continuación)

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los retrovirus

\quad: Subfamilia:

\quad: Oncorivirinae: (Veterinaria) (Medicina) virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII

\quad: Lentivirinae: (Medicina y veterinaria) VIH, virus de la immunodeficiencia felina, virus de infecciones equinas, virus de la anemia

\quad: Spumavirinae

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los papovavirus

\quad: Subfamilia:

\quad: Poliomavirus: (Medicina) virus BKU y JCU

\quad: Subfamilia:

\quad: Papilomavirus: (Medicina) muchos tipos víricos asociados a cánceres o progresión de neoplasias malignas de papilomas

Adenovirus (Medicina)

\quad: EX AD7, ARD., O.B. - causan enfermedades respiratorias - algunos adenovirus tales como 275 causan enteritis

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los parvovirus (Veterinaria)

\quad: Parvovirus felino: causes enteritis felina

\quad: Virus de la panleucopenia felina

\quad: Parvovirus canino

\quad: Parvovirus porcino

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los herpesvirus

\quad: Subfamilia: Alphaherpesvirinae

Géneros:: Simplexvirus (Medicina)

\quad: HSVI, HSVII

\quad: Varicelovirus: (Medicina - Veterinaria) virus de la pseudorabia - varicela zóster

\quad: Subfamilia: Betaherpesvirinae

Géneros:: Citomegalovirus (Medicina)

\quad: HCMV

\quad: Muromegalovirus

\quad: Subfamilia: Gammaherpesvirinae

Géneros:: Linfocriptovirus (Medicina)

\quad: EBV - (linfoma de Burkitt)

\quad: Radinovirus

\newpage

TABLA 1 (continuación)

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los poxvirus

\quad: Subfamilia: Chordopoxvirinae (Medicina - Veterinaria)

Géneros:: Virus variólico (viruela)

\quad: Virus vacunal (viruela vacuna)

\quad: Parapoxvirus - Veterinaria

\quad: Avipoxvirus - Veterinaria

\quad: Capripoxvirus

\quad: Leporipoxvirus

\quad: Suipoxvirus

\quad: Subfamilia: Entomopoxvirinae

\vskip1.000000\baselineskip

Familia de los hepadnavirus

\quad: Virus de la hepatitis B

No clasificados

\quad: Virus de la hepatitis delta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

Patógenos bacterianos

: Los cocos patógenos grampositivos incluyen: pneumococos, estafilococos y estreptococos.

: Los cocos patógenos gramnegativos incluyen: meningococos y gonococos.

: Los bacilos entéricos patógenos gramnegativos incluyen: enterobacterias, Pseudomonas, actinobacterias y Eikenella, melioidosis, Salmonella, shigelosis, Hemophilus, chancroide, brucelosis, tularemia, Yersinia (Pasteurella), Streptobacillus moniliformis y Spirillum, Listeria monocytogenes, Erysipelothrix rhusiopathiae, difteria, cólera, carbunco, donovanosis (granuloma inguinal), y bartonelosis.

: Las bacterias anaerobias patógenas incluyen: tétanos, botulismo, otros clostridios, tuberculosis, lepra, y otras micobacterias. Las enfermedades causadas por espiroquetas patógenas incluyen: sífilis, treponematosis: pian, mal de pinto y sífilis endémica, y leptospirosis. Otras infecciones causadas por bacterias y hongos patógenos de orden superior: actinomicosis, nocardiosis, criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis, candidiasis, aspergilosis, y mucormicosis, esporotricosis, paracoccidiodomicosis, infecciones por Petriellidium, infecciones por Torulopsosis, micetoma y cromomicosis, y dermatofitosis.

: Las infecciones por rickettsias incluyen trastornos producidos por rickettsias y rickettsiosis.

: Los ejemplos de infecciones por micoplasmas y clamidias incluyen: Mycoplasma pneumoniae, linfogranuloma venéreo, psitacosis, e infecciones perinatales por clamidias.

Patógenos eucariotas

: Los protozoos y helmintos patógenos y las infecciones causadas por los mismos incluyen: amebiasis, malaria, leishmaniasis, tripanosomiasis, toxoplasmosis, Pneumocystis carinii, babesiosis, giardiasis, triquinosis, filariasis, esquistosomiasis, nematodos, trematodos o duelas, e infecciones por cestodos (tenia).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Carrano, Richard A.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones para la administración de material genético

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 48

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DIRECCIÓN: Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: One Liberty Place 46th Floor

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Filadelfia

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Pennsilvania

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE. UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 19103

\vskip0.800000\baselineskip

(v): MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: compatible con PC de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 mb-MD/

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: 08/221.579

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 01 abril 1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: DeLuca, Mark

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33.229

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: APOL-0192

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 215-568-3100

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 215-568-3429

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCGTCTCG AGACAGAGGA GAGCAAGAAA TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCCCTCTA GATAAGCCAT CCAATCACAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGGATCCA TGAAAAAATA TTTATTGGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTGTCGACT TATTTTAAAG CGTTTTTAAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGTTTTG GATCCTTAAA AAAGGCTTGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTGAGGGA CAGAATTCCA ATCAGGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGATATC CCGGGAGACT CCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATAGAAGA ACTCCTCTAG AATTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTTAGGCG GATCCTATGG CAGGAAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAGATGGGT GGCCATGGTG AATT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTTTAACT TTTGATCGAT CCATTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTTGTATC GATGATCTGA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAGTAGCA AAAGAAATAG TTAAG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCTTAAC TATTTCTTTT GCTAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTGTCGAC TGGTTTCAGC CTGCCATGGC AGGAAGAAGC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGACGCGTA TTCTTTAGCT CCTGACTCC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGACGGTA GCGGCCGCAC AATT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTAAGCG GCCGCAATTG TT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAGCTTC GCGGATCCGC GTTGCGGCCG CAACCGGTCA CCGGCGACGC GTCGGTCGAc

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTCATGGC TGGGCCCC

\hfill

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTA GACATGATAA GATACATTG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCAGCTG GATCCCAGCT TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTTCTGG GGATCCAAGC TAGT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATAGGATCC GCGCAATGAA AGACCCCACC T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATGGATCC GCAATGAAAG ACCCCCGCTG A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAAGCGGCC GCTCCTATGG CAGGAAGACG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTC TTATGCTTCT AGCCAGGCAC AATG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTT TATTACAGAA TGGAAAACAG ATGGCAGGTG

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTT ATTGCAGAAT TCTTATTATG GC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGCTTGGA GAGGATTATA GAAGTACTGC AAGAGCTG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATCCTC TCCAAGCCTCAG CTACTGCTAT AGCTGTGGC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAATAAAG CGGCCGCTCC TATGGCAGGA AGAGAAGCG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAATTAC GCGTCTTATG CTTCTAGCCA GGCACAATG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTG GGAATGCTCT GCCAGTGTTAC

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGCCGGA AGGGCACAAT AAAACTGTCT GCTTAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGATTCAG GTGAAAATAT TGTTGATGCG CTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCATCAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGT TTATGCATTT C

\hfill

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCGCGGG GATCCGCGTT GCGGCCGCAA AAAGTCGACG GGCGACGCGT AAAAA

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCTTTTTAC GCGTCGCCC GTCGACTTTT TGCGGCCGCA ACGCGGATCC CCGCG

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTCGACTG GTTTCAGCCT GCCATGGCAG GAAGAAGC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCACGACG CGTCTATTCT TTAGCTCCTG ACTCC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGCGGCCG CGTAAGTGGA GAGAGATGGT GCGAG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGTGGGGC TGTTGGCTCT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTTAATAA GTAAGTAAGT GTCATATGTT TGTTTGAATT CTGCAACAAC TGCTGTTTAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATTTTCAG AATTGGGTG

\hfill

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGACACCCA ATTCTGAAAA TGGATAAACA GCACTTGTTG CAGAATTCAA ACAAACATAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACACTTACT TACTTATTA

\hfill

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAA TTGGAGAAGT G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTGTGG AATTCTTAAT TTCTCTGTCC GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGAAGTG

\hfill

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTATCTGG CATGGGTAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID n.º:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID n.º:48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGCCAGA TACTGGTAC

\hfill

29

Claims

1. Composición farmacéutica:

a) que comprende

b) que está constituida por

ii): uno o más alquilos inferiores hidroxilados; o

c) que está constituida por

ii): uno o más lípidos aniónicos;

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que está constituida por una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno de patógenos, una proteína cuya presencia compensará la ausencia, la falta de funcionamiento o el funcionamiento parcial de una proteína en un individuo, y una proteína que produce un efecto terapéutico en un individuo, y uno o más alquilos inferiores hidroxilados.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que los alquilos inferiores hidroxilados se seleccionan a partir de n-propanol, etanol, isopropanol, n-butanol y glicerol.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que está constituida por una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno de patógenos, una proteína cuya presencia compensará la ausencia, la falta de funcionamiento o el funcionamiento parcial de una proteína en un individuo, y una proteína que produce un efecto terapéutico en un individuo, y uno o más lípidos aniónicos.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que los lípidos aniónicos se seleccionan a partir de ácido láurico, ácido oleico, ácido sulfúrico neutralizado, laurilsulfato de sodio, sulfatos de alquil-polioxietileno, sulfosuccinato de dioctilo y sodio, laurato de sodio, laurato de potasio, laurilsulfato de amonio, y sulfosuccinato de dioctilo y sodio.

6. Composición farmacéutica que comprende:

: en la que la composición farmacéutica está exenta de partículas retrovíricas.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que el facilitador de vacunas genéticas se selecciona a partir de concanavalina A, abrina, aglutinina de soja, aglutinina de germen de trigo, estradiol, \beta-estradiol, 17-\beta-estradiol, estradiol-3-benzoato, estradiol 17-\beta-cipionato, estradiol 17-propionato o dipropionato, hemisuccinato, 17-heptanoato (enantato), 17-undecanoato (undecilato), 17-valerato, \alpha-estradiol, \alpha-estradiol-diacetato, o 3-benzoato, estra-1,3,5(10)-trieno-3,16,17-triol, 3-hidroxiestra-1,3,5(10)-trieno-17-ona, dimetilsulfóxido y urea.

8. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de enzimas, proteínas estructurales, citocinas, linfocinas y factores de crecimiento.

9. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, en la que la composición comprende por lo menos dos moléculas de ácido nucleico distintas adaptadas para la administración a células diferentes de un individuo, presentando cada una de dichas moléculas distintas una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más antígenos patógenos del mismo patógeno.

11. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la dicho patógeno es un virus seleccionado a partir del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la leucemia de células T humana (HTLV), virus de la gripe, virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), virus del papiloma humano (VPH), virus del herpes simple 1 (VHS1), virus del herpes simple 2 (VHS2), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB), rinovirus y coronavirus.

12. Composición farmacéutica:

a) que comprende

i): una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno proteico expresado por una célula hiperproliferante y un antígeno proteico expresado por células que caracterizan una enfermedad autoinmunitaria; y

b) que está constituida por:

ii): uno o más alquilos inferiores hidroxilados; o

c) que está constituida por:

ii): uno o más lípidos aniónicos;

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, que está constituida por una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno proteico expresado por una célula hiperproliferante y un antígeno proteico expresado por células que caracterizan una enfermedad autoinmunitaria, y uno o más alquilos inferiores hidroxilados.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que los alquilos inferiores hidroxilados se seleccionan a partir de n-propanol, etanol, isopropanol, n-butanol y glicerol.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, que está constituida por una o más moléculas de ácido nucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada a partir de un antígeno proteico expresado por una célula hiperproliferante y un antígeno proteico expresado por células que caracterizan una enfermedad autoinmunitaria, y uno o más lípidos aniónicos.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 15, en la que los lípidos aniónicos se seleccionan a partir de ácido láurico, ácido oleico, ácido sulfúrico neutralizado, laurilsulfato de sodio, sulfatos de alquil-polioxietileno, sulfosuccinato de dioctilo y sodio, laurato de sodio, laurato de potasio, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de potasio, laurilsulfato de amonio, y sulfosuccinato de dioctilo y sodio.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleótidos que codifica una o más regiones variables de anticuerpos implicados en una enfermedad autoinmunitaria mediada por células B, o una o más regiones variables de receptores de células T implicados en una enfermedad autoinmunitaria mediada por células T.

18. Composición farmacéutica que comprende:

19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, en la que el facilitador de vacunas genéticas se selecciona a partir de concanavalina A, abrina, aglutinina de soja, aglutinina de germen de trigo, estradiol, \beta-estradiol, 17-\beta-estradiol, estradiol-3-benzoato, estradiol 17-\beta-cipionato, estradiol 17-propionato o dipropionato, hemisuccinato, 17-heptanoato (enantato), 17-undecanoato (undecilato), 17-valerato, \alpha-estradiol, \alpha-estradiol-diacetato, o 3-benzoato, estra-1,3,5(10)-trieno-3,16,17-triol, 3-hidroxiestra-1,3,5(10)-trieno-17-ona, dimetilsulfóxido y urea.