ES2886999T3

ES2886999T3 - Procedimiento para mejorar la eficacia de una vacuna de survivina en el tratamiento de cáncer

Info

Publication number: ES2886999T3
Application number: ES18188268T
Authority: ES
Inventors: Marc Mansour; Neil L Berinstein; Genevieve Mary Weir; Marianne M Stanford
Original assignee: Immunovaccine Technologies Inc
Current assignee: Immunovaccine Technologies Inc
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2033-03-27
Also published as: ES2702622T3; US20180289801A1; EP3421047B1; WO2014153636A1; US10729766B2; AU2013384879B2; HK1220914A1; CA2908042A1; JP2016516083A; EP2978450B1; JP6254251B2; CA2908042C; EP2978450A1; EP3421047A1; US20210052724A1; US10022441B2; CN111905099A; CN105324128B; CN105324128A; US20160067335A1

Abstract

Combinación de un agente que interfiere con la replicación del ADN y una vacuna que comprende al menos un antígeno de survivina para su uso en un procedimiento para mejorar la eficacia de la vacuna en el tratamiento de cáncer en un sujeto, en la que se le administra al sujeto al menos dos dosis del agente en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador; y se le administra posteriormente al sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de la vacuna, en la que el agente que interfiere con la replicación del ADN es ciclofosfamida y se le administra al sujeto la ciclofosfamida en una pauta posológica metronómica, en la que dicha pauta posológica metronómica comprende administrar la ciclofosfamida al sujeto diariamente durante un periodo de aproximadamente una semana cada dos semanas.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para mejorar la eficacia de una vacuna de survivina en el tratamiento de cáncer

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere en general a procedimientos para tratar cáncer y, en particular, a procedimientos para mejorar la eficacia de una vacuna de survivina en el tratamiento de cáncer por tratamiento previo con un agente que interfiere con la replicación del ADN.

Antecedentes de la invención

Las respuestas inmunitarias inducidas por vacunación se pueden clasificar a grandes rasgos en tipos humoral o celular. Se desea típicamente una respuesta humoral para proteger frente a invasores víricos o bacterianos, mientras que la inmunidad frente a células infectadas víricamente y células cancerosas implica típicamente una respuesta mediada por células. La inmunidad humoral está tipificada por niveles altos de producción de anticuerpos por linfocitos B, mientras que la inmunidad celular se caracteriza por activación incrementada de linfocitos T c D8+ citotóxicos.

Muchas vacunas que se han mostrado prometedoras en desarrollo preclínico no han podido finalmente demostrar beneficio clínico cuando se sometieron a prueba en seres humanos. En un estudio de fase II que evaluaba el tratamiento con una única dosis baja de ciclofosfamida en combinación con una vacuna que contenía cuatro péptidos modificados por HLA de clase I (Melan-A/MART-1, gp100, NY-ESO-1 y survivina) en melanoma temprano (Filipazzi et al., Clin Cancer Res, 18(23):6485-6496, 2012), se informó de que la vacunación inducía un incremento en linfocitos T CD8+ de memoria efectores específicos en un 75 % de los pacientes. Sin embargo, el estudio no incluía una comparación con pacientes que recibían vacuna sin tratamiento con ciclofosfamida. Como tal, no está claro si la ciclofosfamida tenía alguna contribución a la eficacia de la vacuna. Además, los autores informaron de que la frecuencia de linfocitos Treg no cambió significativamente tras la administración de ciclofosfamida a dosis baja (página 6489, columna derecha). En lo que se refiere a vacunas contra el cáncer, la intervención terapéutica es un reto complejo, y muchos aspectos de la enfermedad tal como la cronología de tratamiento en relación con el tratamiento de referencia, estadio y tipo de cáncer tienen todos influencia en el desenlace del tratamiento. Sin embargo, existen tres rasgos característicos de la inmunoterapia que pueden proporcionar un mejor desenlace si se combinan de manera rigurosa: (1) inmunogenicidad de la vacuna (es decir, adyuvante); (2) selección apropiada de antígenos asociados a tumores y (3) capacidad para superar la inmunodepresión inducida por tumores (Weir et al., Cancer 3: 3114-3142, 2011; Berzofsky et al., Semin Oncol 39(3): 348-357, 2012).

Sumario de la invención

Los solicitantes han descubierto ahora que la eficacia de una vacuna contra el cáncer (es decir, una vacuna de survivina) se puede mejorar con la administración previa de al menos dos dosis de un agente que interfiere con la replicación del ADN.

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención se refiere a una combinación para mejorar la eficacia de una vacuna en el tratamiento de cáncer en un sujeto, siendo dicha combinación como se define en la reivindicación 1 adjunta.

En un modo de realización del procedimiento de la presente invención, el agente que interfiere con la replicación del ADN se administra al sujeto diariamente durante siete días consecutivos cada catorce días (es decir, tratamiento semanal alterno). En un modo de realización, este tratamiento semanal alterno con el agente que interfiere con la replicación del ADN empieza aproximadamente una semana antes de la primera administración de la vacuna de survivina.

En un modo de realización de la presente invención, la vacuna de survivina se administra al sujeto una vez cada tres semanas.

En la presente invención, el agente que interfiere con la replicación del ADN es ciclofosfamida.

En un modo de realización de la presente invención, la vacuna de survivina es una vacuna que comprende uno o más antígenos peptídicos de survivina que tienen la secuencia de aminoácidos: FEELTLGEF (SEQ ID NO: 1); FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2); LTLGEFLKL (SEQ ID NO: 3); LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4); RISTFKNWPF (SEQ ID NO: 5); RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6); STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7) y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8).

En un modo de realización de la presente invención, la vacuna de survivina es la vacuna DPX-Survivac inmunoterápica antineoplásica candidata de Immunovaccine, Inc. DPX-Survivac comprende cinco antígenos peptídicos de survivina sintéticos que tienen las secuencias de aminoácidos: FEELTLGEF (SEQ ID NO: 2), LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4), RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6), STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7) y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8); un epítopo universal de linfocitos T cooperadores de toxoide tetánico ( a q y ik a n s k f ig it e l ; SEQ ID NO: 9); un adyuvante de polinucleótido poli l:C; liposomas que consisten en DOPC y colesterol; y el portador hidrófobo Montanide® ISA 51 VG.

Otros aspectos y rasgos característicos de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la revisión de la siguiente descripción de modos de realización específicos de la invención junto con las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

En las figuras que ilustran modos de realización de la invención solo ejemplares:

La figura 1 ilustra un diseño de ensayo clínico de fase I para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de DPX-Survivac. La vacuna se administró cada tres semanas (3 vacunaciones separadas aproximadamente 21 días) con o sin administración oral de ciclofosfamida a dosis baja (50 mg dos veces al día, Baxter) entre los días de estudio -7 y 49. La ciclofosfamida a dosis baja se administró diariamente durante 7 días consecutivos cada 14 días. La ciclofosfamida se inició una semana antes de la primera vacunación. Los pacientes recibieron (1) tres administraciones de 0,5 ml de DPX-Survivac (cohorte A ), (2) tres administraciones de 0,1 ml de DPX-Survivac en combinación con ciclofosfamida oral a dosis baja como se explica brevemente (cohorte B) o bien (3) tres administraciones de 0,5 ml de DPX-Survivac en combinación con ciclofosfamida a dosis baja como se explica brevemente (cohorte C). Se extrajeron muestras de sangre antes de la primera vacunación (nivel inicial) y aproximadamente 3-4 semanas tras cada vacunación para aislar y crioconservar células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se extrajeron también muestras de sangre en puntos de tiempo posteriores cuando fue posible. Se usaron PBMC para ensayos inmunológicos incluyendo ELISPOt y ensayos basados en citometría de flujo tales como tinción de tetrámeros y tinción de citocina intracelular (ICS).

La figura 2 proporciona resultados de detección de ELISPOT y muestra el incremento inducido por DPX-Survivac en la producción de interferón gamma en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer ovárico vacunados. Se estimularon las PBMC del sujeto durante la noche con péptidos de survivina en un ensayo de ELISPOT de IFN-y. Los datos presentados representan el número de unidades formadoras de puntos (UFP) por millón de PBMC de sujetos individuales y las líneas representan valores medios en el nivel inicial y después de una, dos y tres dosis de administración de la vacuna.

La figura 3 proporciona un resumen de factores de estimulación que representan el incremento en veces en células que secretan IFN-gamma para pacientes en relación con respuestas inmunitarias de nivel inicial en estos pacientes. Los factores de estimulación se calcularon usando los resultados de ELISPOT disponibles. Se excluyeron del análisis muestras con fondo alto no explicado en ELISPOT en ausencia de estimulación con péptido. Se requirió un factor de estimulación mínimo de 2x para considerar a un paciente como paciente que responde al tratamiento inmunitario en un punto de tiempo dado.

La figura 4 proporciona resultados de detección de ELISPOT y muestra el incremento inducido por DPX-Survivac en la producción de IFN-gamma en las PBMC de pacientes con cáncer ovárico vacunados. Se estimularon las PBMC del sujeto durante la noche con péptidos de survivina en un ensayo de ELISPOT de IFN-y. Los datos presentados representan el número de unidades formadoras de puntos (UFP) por millón de PBMC de sujetos individuales.

La figura 5 ilustra los resultados de tinción de multímeros de CMH del sujeto representativo 02-04. Se sometieron a prueba células mononucleares de sangre periférica para detectar la presencia de linfocitos T CD8+ específicos de péptido por su capacidad para unirse a reactivos de multímeros de CMH (tetrámeros) diseñados usando el péptido de DPX-Survivac y la correspondiente molécula de CMH. Se realizó el ensayo en PBMC no estimuladas (ex vivo) o bien estimuladas 10 días in vitro en presencia de péptido(s) de survivina histocompatible(s). El multímero de CMH irrelevante basado en péptido de VIH sirvió como control negativo. Las figuras mostradas representan el porcentaje de linfocitos T CD8+ en muestras de PBMC tras la vacunación, que se unen específicamente a reactivos de multímeros de CMH. Se detectaron linfocitos T específicos usando citometría de flujo donde se seleccionaron PBMC en células vivas CD3+, para mostrar células doblemente positivas para CD8+ y la unión a tetrámeros.

Figura 6: Detección de un incremento inducido por DPX-Survivac en linfocitos T CD8+ en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer ovárico vacunados. Se sometieron a prueba PBMC del sujeto para detectar la presencia de linfocitos T CD8+ específicos de péptido por su capacidad para unirse a reactivos de multímeros de CMH (tetrámeros) diseñados usando el péptido de DPX-Survivac y la correspondiente molécula de CMH. Se realizó el ensayo en PBMC no estimuladas (ex vivo) o bien estimuladas 10 días in vitro en presencia de péptido(s) de survivina histocompatible(s). Los datos presentados representan el porcentaje de linfocitos T CD8+ en la sangre periférica de sujetos individuales en el nivel inicial (círculos), después de 1 dosis (triángulos), 2 dosis (rombos) y 3 dosis (cuadrados).

La figura 7 ilustra análisis basados en tetrámeros y ELISPOT de respuestas inmunitarias y reactividad frente a secuencias peptídicas de survivina naturales no modificadas o modificadas con aminoácido únicas, que demuestran la capacidad de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna para reconocer tanto péptidos de survivina modificados como no modificados.

Descripción detallada

Los cánceres avanzados utilizan varios mecanismos para escapar de la detección y destrucción mediadas por el sistema inmunitario, reduciendo por tanto la eficacia de medicamentos contra el cáncer en múltiples niveles.

La inmunodepresión inducida por tumores es uno de los distintivos del cáncer y un obstáculo importante para cualquier inmunoterapia para el cáncer, incluyendo vacunas de péptidos (Hanahan y Weinberg, Cell, 144(5): 646 674, 2011). A medida que se desarrollan, los tumores se adaptan para evitar y escapar de la detección inmunitaria a través de varios mecanismos. El microentorno tumoral, por ejemplo, regula por incremento muchos factores que promueven el desarrollo de células inmunodepresoras, tales como linfocitos T reguladores CD4+FoxP3+ (Treg) (Curiel et al., Nat Med 10(9): 942-949, 2004) y células supresoras de origen mieloide (MDSC) (Nagaraj y Gabrilovich, Cancer Res 68(8): 2561-3, 2008). El microentorno tumoral también contribuye a la supresión directa de linfocitos T CD8+ activados liberando citocinas inmunodepresoras tales como TNF-p (Yang et al., Trends Immunol 31(6): 220-227, 2010). Otros mecanismos de escape tumoral que responden a la presión inmunitaria son inmunomodificación, regulación por disminución de CMH de clase I y alteraciones en la presentación y el procesamiento de antígenos. Por lo tanto, es imperativo que linfocitos T CD8+ inducidos por vacuna tengan la oportunidad de reconocer y destruir rápidamente células tumorales antes de que tengan una oportunidad para adaptarse. El uso de agentes inmunomoduladores para contrarrestar la inmunodepresión inducida por tumores podría mejorar la eficacia de vacunas contra el cáncer (Yong et al., J Biomed Biotechnol 2012: 605045).

La presente invención se refiere al tratamiento de cáncer en un sujeto por administración combinada de un agente que interfiere con la replicación del ADN y una vacuna de survivina.

La survivina, una proteína implicada en la regulación negativa de la apoptosis, está altamente expresada en muchos tipos de tumores y tiene valor de pronóstico informado. Como se usa en el presente documento, “vacuna de survivina” pretende engloba cualquier vacuna o medio de suministro de antígenos para administrar uno o más de los antígenos de survivina descritos en el presente documento a un sujeto. Los modos de realización ejemplares de dichas “vacunas de survivina” se describen en el presente documento; sin embargo, el experto en la técnica apreciará que se engloba cualquier vacuna o medios para suministrar antígenos a un sujeto.

Los modos de realización de la presente invención se refieren a mejorar la eficacia de una vacuna (es decir, vacuna de survivina) en el tratamiento de cáncer por administración previa de al menos dos dosis de un agente que interfiere con la replicación del ADN.

En un modo de realización particular por lo tanto, la invención se refiere a una combinación para mejorar la eficacia de una vacuna en el tratamiento de cáncer en un sujeto, siendo dicha combinación como se define en la reivindicación 1 adjunta.

Como se usa en el presente documento, “mejorar la eficacia de la vacuna” o “mejorar la eficacia de una vacuna” o similares se refiere a cualquier cambio o alteración en la respuesta inmunitaria de un sujeto que puede hacer que la vacuna de survivina de la invención sea más eficaz en el tratamiento de cáncer. En algunos modos de realización, esto puede implicar acelerar la aparición de una respuesta inmunitaria y/o mejorar la persistencia o fuerza de una respuesta inmunitaria a la vacuna de survivina. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria mediada por células o bien una respuesta inmunitaria humoral.

En la presente invención, un agente que interfiere con la replicación del ADN puede “mejorar la eficacia de la vacuna” potenciando directa o bien indirectamente la respuesta inmunitaria frente al antígeno de survivina en la vacuna. Esto se puede lograr, por ejemplo, reduciendo el número y/o la actividad de células inmunodepresoras. Se ha informado de que el microentorno tumoral, por ejemplo, regula por incremento muchos factores que promueven el desarrollo de células inmunodepresoras, tales como linfocitos T reguladores CD4+FoxP3+ (Treg) (Curiel et al., Nat Med 10(9): 942-949, 2004), células supresoras de origen mieloide (MDSC) (Nagaraj y Gabrilovich, Cancer Res 68(8): 2561-3, 2008) y linfocitos B CD19+CD5+CD1dhiIL-10+ (Breg) (Balkwill et al., Trends Immunol., 03 de diciembre de 2012, 10.1016/j.it.2012.10.007 (pub. elec. antes de la edición impresa)). Por lo tanto, la capacidad para reducir el número o la actividad de estas células inmunodepresoras representa un modo de realización para mejorar la eficacia de la vacuna.

“Mejorar la eficacia de una vacuna” también se puede lograr, por ejemplo, incrementando el número y/o la actividad de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. A este respecto, se ha informado de que el microentorno tumoral, por ejemplo, contribuye a la supresión directa de linfocitos T CD8+ activados liberando citocinas inmunodepresoras tales como TNF-p (Yang et al., Trends Immunol 31(6): 220-227, 2010). Por lo tanto, la capacidad para incrementar la actividad de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno representa un mecanismo potencial para mejorar la eficacia de la vacuna. Un incremento en linfocitos T CD8+ específicos de antígeno puede ser el resultado de un número incrementado de dichas células, actividad incrementada de dichas células y/o la generación de una población enriquecida de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno en relación con linfocitos T CD8+ totales, tal como, por ejemplo, por una disminución relativa en linfocitos T CD8+ totales.

Más en general, “mejorar la eficacia de una vacuna” se refiere a la capacidad de la invención para potenciar la inmunogenicidad de la vacuna, potenciando una respuesta inmunitaria mediada por células o bien una respuesta inmunitaria humoral inducida por la vacuna; incrementar el número de células inmunitarias en un sitio de vacunación o un sitio tumoral; o mejorar un efecto terapéutico proporcionado por la vacuna de la invención, tal como potenciando el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cáncer y/o aliviando, retrasando o inhibiendo la progresión de síntomas de enfermedad. Mejorar la eficacia de una vacuna también se puede asociar con una calidad de vida mejorada o una mortalidad disminuida, en comparación con el tratamiento de monoterapia.

“Mejorar la eficacia de una vacuna” también puede significar que son necesarias dosis menores de los ingredientes activos de la combinación de la invención para producir el resultado deseado. Esto engloba tanto modos de realización donde las propias dosificaciones son más pequeñas como modos de realización donde la vacuna, y/o el agente que interfiere con la replicación del ADN, se aplican con menos frecuencia.

Varios agentes quimioterápicos han demostrado actividad inmunomoduladora cuando se usaron a dosis bajas, no citotóxicas (Zitvogel et al., Nat Rev Immunol 8(1): 59-73, 2008; Liu y Dalgleish, Semin Oncol/39(3): 340-347, 2012). La ciclofosfamida fue uno de los primeros agentes inmunomoduladores descritos y tiene múltiples efectos sobre el sistema inmunitario cuando se usa a una fracción de la dosis comúnmente usada por sus efectos citotóxicos (Sistigu et al., Semin Immunopathol 33(4): 369-383, 2011). Se ha informado de que ciclofosfamida a dosis baja reduce selectivamente y altera la funcionalidad de Treg (Lutsiak et al., Blood 105(7):2862-2868, 2005), inhibe la angiogénesis tumoral (Browder et al., Cancer Res 60(7): 1878-1886, 2000), aumenta la activación de células dendríticas (Radojcic et al., Cancer Immunol Immunother 59(1): 137-148, 2009) y desvía la respuesta inmunitaria hacia Th1 (Schiavoni et al., Blood 95(6):2024-2030, 2000). En ratones, los efectos de una única administración a dosis baja de inyección intravenosa rápida de ciclofosfamida son transitorios, alcanzando típicamente el punto más bajo en el plazo de 4 días después de la administración y regresando a la normalidad en 7-10 días (Lutsiak et al., Blood 105(7):2862-2868, 2005).

Cuando se usa en combinación con vacunas contra el cáncer, la ciclofosfamida a dosis baja se administra típicamente como una única inyección i.v. en inyección intravenosa rápida de aproximadamente 100-300 mg/m2 en seres humanos (contrario a la dosis quimioterápica de 1-5 g/m2) de uno a tres días antes de la vacunación (Audia et al., Clin Exp Immunol 150(3):523-530, 2007; Vermeij et al., Int J Cancer 131(5): E670-680, 2012). Si bien esta pauta posológica ha demostrado ser prometedora en modelos preclínicos, su traslado a ensayos clínicos no ha proporcionado los mismos resultados ambiguos (Audia et al., Clin Exp Immunol 150(3):523-530, 2007; Vermeij et al., Int J Cancer 131(5): E670-680, 2012), aunque Walter et al. publicaron recientemente datos que mostraban que una única dosis de ciclofosfamida antes de una vacuna de péptido estaba asociada con una supervivencia del paciente más prolongada en un estudio de fase II en pacientes con carcinoma de células renales (RCC) (Walter et al., Nat Med 18: 1254-1261, 2012). Sin embargo, no había ningún efecto mensurable del tratamiento con sbCPA sobre la inmunogenicidad de la vacuna.

Un enfoque alternativo a la administración en inyección intravenosa rápida única de ciclofosfamida es suministrarla en un programa metronómico administrando ciclofosfamida a dosis muy baja diariamente. La administración de ciclofosfamida metronómica se ha informado de que tiene efectos inmunomoduladores similares a la ciclofosfamida a dosis baja única (Ghiringhelli et al., Cancer Immunol Immunother 56(5): 641-648, 2007; Le y Jaffee, Cancer Res 72(14): 3439-3444, 2012).

Ahora se ha encontrado de manera sorprendente e inesperada que la administración de al menos dos dosis de ciclofosfamida a un sujeto antes de la administración de una vacuna de survivina (por ejemplo DPX-Survivac) puede mejorar la eficacia de la vacuna. Este es un hallazgo bastante significativo puesto que los resultados divulgados en el presente documento se refieren a estudios de fase clínica en seres humanos, en comparación con estudios preclínicos en animales.

DPX-Survivac, una vacuna de survivina de acuerdo con la presente invención, es una vacuna inmunoterápica antineoplásica candidata para el tratamiento de cáncer. La vacuna DPX-Survivac está diseñada para seleccionar survivina. Como se describe en el presente documento, DPX-Survivac contiene un decapéptido (SEQ ID NO: 6) y cuatro nonapéptidos (SEQ ID NO: 2, 4, 7 y 8) de la secuencia proteica de survivina, con diferentes restricciones de HLA (HLA-A1, A2, A3, A24 y B7).

El tratamiento de sujetos con DPX-Survivac en la cohorte A, cohorte B y cohorte C (véase la figura 1), como se describe en el presente documento, se dirigió a abordar el mejor programa de tratamiento para generar respuestas inmunitarias específicas de antígeno fuertes anticipadas, y el mantenimiento de respuestas inmunitarias dirigidas a tumores, persistentes a lo largo del tiempo. Esta respuesta de linfocitos T específicos de antígeno se espera que ejerza una presión continua sobre tumores nuevos o en desarrollo, manteniendo a los pacientes en remisión más tiempo.

Los sujetos tratados con DPX-Survivac, de acuerdo con la presente invención, tenían análisis inmunitarios extensos que dieron lugar a varios hallazgos importantes en la parte de fase I del estudio clínico. Todos los sujetos que recibieron la politerapia con DPX-Survivac (grupo de cohortes C, n=12), que comprendía un periodo de tratamiento con ciclofosfamida a dosis baja antes de la administración de la vacuna, demostraron respuestas inmunitarias específicas de antígeno medidas por al menos uno de los tres ensayos de seguimiento inmunitario del estudio (ELISPOT, análisis de tetrámeros y tinción celular intracelular multiparamétrica; tabla 1).

Tabla 1: Resumen de los resultados de seguimiento inmunitario de 18 sujetos en fase 1 tratados con una vacuna de survivina, con o sin ciclofosfamida a dosis baja (IND n.° 14731).

En la tabla 1, se expresan los resultados de ELISPOT (UFP/106 PBMC), como se observan en puntos de tiempo tras el tratamiento, como bajos (L) cuando UFP fueron <128, medios (M) para UFP en el intervalo de 128-512 y altos (H) para UFP >512. El análisis de tetrámeros de PBMC se realizó ex vivo (sin estimulación) o bien in vitro (con estimulación de péptido), y un incremento de dos veces de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno con respecto a los niveles previos a la vacunación se indicaron como pacientes que responden al tratamiento positivos; N/A, no aplicable (falta de reactivo de prueba adecuado). Los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno polifuncionales se definen como las células que secretan IFN-y y al menos uno o ambos de TNF-a e IL-2 simultáneamente.

Todos los pacientes que responden intensamente al tratamiento del estudio se observaron dentro de las cohortes B y C que recibían politerapia de acuerdo con la presente invención. En 11 de 12 sujetos en la cohorte B y C, se confirmaron las respuestas inmunitarias por dos ensayos (cinco sujetos) o tres ensayos (seis sujetos). Se establecieron en general respuestas inmunitarias con una o dos vacunaciones y se incrementaron o mantuvieron con administraciones de refuerzo. Se observó una respuesta a la dosis, produciendo los pacientes de la cohorte C respuestas de magnitud significativamente mayor (cohorte C frente a cohorte B, P=0,013). La ciclofosfamida a dosis baja, empezando antes de la administración de vacuna, potenció significativamente la dosis de 0,5 ml (cohorte C frente a cohorte A, P=0,015). De manera notable, la máxima frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno se detectaron ex vivo en PBL usando tetrámeros y se caracterizaron además como polifuncionales por ICS multiparamétrica en pacientes de la cohorte C, demostrando que la combinación de ciclofosfamida a dosis baja con la vacuna de survivina producía la respuesta inmunitaria contra survivina más sólida.

Los datos de ELISPOT para las cohortes A y C en la figura 2 se resumen en la tabla 2.

Tabla 2:

Se observará a partir de la tabla anterior (tabla 2) que la máxima respuesta inmunitaria lograda después de una única vacunación en la cohorte A (solo vacuna; n=6) por ELISPOT fue de 130 UFP/106 PBMC (intervalo de 55 130). En cambio, la máxima respuesta lograda después de una única vacunación en la cohorte C (vacuna ciclofosfamida previa; n=6) por e L iSPOT fue de 2309 UFP/106 PBMC (intervalo de 2-2309). Esto representa una mejora de 17,7 veces en la máxima respuesta inmunitaria lograda, demostrando que los procedimientos de la invención que comprenden administración previa de un agente que interfiere con la replicación del ADN proporcionan una mejora significativa en la eficacia de una vacuna de survivina.

De forma similar, también se encontró que se potenciaba la eficacia de la vacuna DPX-Survivac por la invención cuando se administraron dos dosis o tres dosis de la vacuna. Como se muestra en la tabla 2, la máxima respuesta inmunitaria lograda después de dos vacunaciones en la cohorte A (vacuna sola; n=5) por ELISPOT es de 137 UFP/106 PBMC (intervalo de 22-137), mientras que la máxima respuesta lograda después de dos vacunaciones en la cohorte C (vacuna ciclofosfamida previa; n=6) por ELISPOT es de 1911 UFP/106 PBMC (intervalo de 25-1911). Esto representa una mejora de 13,9 veces en la máxima respuesta inmunitaria lograda.

Después de tres vacunaciones, la máxima respuesta inmunitaria lograda en la cohorte A (vacuna sola; n=6) por ELiSPOT fue de 284 UFP/106 PBMC (intervalo de 12-284). En cambio, la máxima respuesta inmunitaria lograda en la cohorte C (vacuna ciclofosfamida previa; n=6) por El ISPOT fue de 2517 UFP/106 PBMC (intervalo de 38 2517). Esto representa una mejora de 8,9 veces en la máxima respuesta inmunitaria lograda.

Además, como se muestra en la figura 4, se encontró que después de tres vacunaciones, 4/6 pacientes en la cohorte C (vacuna ciclofosfamida previa) tenían respuestas de ELISPOT por encima de 512 puntos/106 PBMC, en comparación con 0/6 pacientes en la cohorte A (vacuna de survivina sola) (véase la figura 4). Estos resultados muestran que la ciclofosfamida a dosis baja potenció significativamente la respuesta inmunitaria proporcionada por la dosis de 0,5 ml de vacuna de survivina. Incluso después de tres dosis de vacunación en la cohorte A, ninguno de los pacientes en la cohorte A pudo lograr lo que se consideraba para el estudio que es una alta respuesta inmunitaria (es decir, UFP > 512).

La capacidad de la combinación de la invención para mejorar la eficacia de la vacuna DPX-Survivac se ilustra además por los datos presentados en la figura 3 que muestra el índice de estimulación para las 1, 2 y 3 administraciones de dosis de vacuna en las cohortes A, B y C. El índice de estimulación representa el incremento en veces en células que secretan IFN-gamma para pacientes en relación con respuestas inmunitarias de nivel inicial en estos pacientes. Como se muestra en la figura 3, el factor de estimulación logrado después de tres vacunaciones en la cohorte A (vacuna sola; n=6) fue de 0,4-8,9x, mientras que el factor de estimulación logrado después de tres vacunaciones en la cohorte C (vacuna ciclofosfamida previa; n=6) fue de 1,2-79x. Esto representa una mejora de 8,9 veces en la máxima respuesta inmunitaria lograda en este punto de tiempo, demostrando que la invención que comprende administración previa de un agente que interfiere con la replicación del ADN proporciona una mejora significativa en la eficacia de una vacuna de survivina.

Además, el máximo factor de estimulación logrado en al menos un paciente después de 2 dosis en la cohorte A (vacuna sola; n=4) fue de 3,5x, mientras que el máximo factor de estimulación logrado en al menos un paciente después de 2 dosis en la cohorte C (vacuna ciclofosfamida previa; n=6) fue de 59,7x. Esto representa una mejora de 17,1 veces en la máxima respuesta inmunitaria lograda en este punto de tiempo por los procedimientos de la invención que comprenden la administración de un agente que interfiere con la replicación del ADN antes de la vacunación con una vacuna de survivina.

La mayor magnitud de las respuestas inmunitarias generada por la invención (por ejemplo, cohortes B y C), como se detectó por ELISPOT, también se caracterizó por la detección de respuestas de linfocitos T específicos de antígeno circulantes (por tinción de tetrámeros) y un perfil de respuesta de linfocitos T polifuncionales en la sangre (por tinción de ICS).

Tetrámero in vitro: 10 de 12 sujetos en las cohortes B y C se pudieron evaluar por tinción de tetrámeros (tabla 1). Los 10 mostraron pruebas fehacientes de inducción de linfocitos T CDS+ específicos de survivina tras una o dos vacunaciones con DPX-Survivac. La activación y el mantenimiento de estas células inmunitarias específicas son significativos puesto que los linfocitos T CD8+ están implicados en la identificación de células cancerosas, infiltración de tumores y destrucción de dianas cancerosas. Se encontró que todos los pacientes evaluables en la cohorte C tenían positividad de tetrámeros por encima de un 1 % de linfocitos T CD8+ totales (con estimulación in vitro) y alcanzando hasta tanto como un 34 % de linfocitos T CD8+ totales. Por el contrario, la máxima positividad de tetrámeros registrada en la cohorte A por SD70 estaba por debajo de un 1 % de linfocitos T CD8+ totales (0,7%).

Tetrámero ex vivo: Como se muestra en la tabla 1 anterior, 1/6 pacientes en la cohorte A tuvieron linfocitos T CD8+ positivos para tetrámeros detectables al menos en un punto de tiempo tras la vacunación en PBMC en reposo/no estimuladas. Sin embargo, es de importancia en este paciente que los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno no eran polifuncionales como se determinó por tinción de ICS. En cambio, 4/6 pacientes en la cohorte C tenían linfocitos T CD8+ positivos para tetrámeros al menos en un punto de tiempo tras la vacunación en PBMC en reposo/no estimuladas, y en estos pacientes se confirmó que los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno eran polifuncionales por ICS.

Polifuncionalidad por ICS: Además, 5/6 pacientes en la cohorte C tenían linfocitos T CD8+ polifuncionales específicos de antígeno detectables, en comparación con sólo 2/6 pacientes en la cohorte A (tabla 1). Estos resultados indican que pacientes en la cohorte C producían una magnitud significativamente mayor y mayor frecuencia de linfocitos T CD8+ polifuncionales específicos de antígeno que pacientes en la cohorte A.

Se encontró que estos resultados obtenidos por tinción de ICS y de tetrámeros se correlacionaban con respuestas inmunitarias fuertes por ELISPOT. Se encontró que pacientes de la cohorte A que tenían células positivas para tetrámeros en PBMC en reposo/no estimuladas o tenían linfocitos T CD8+ específicos de antígeno polifuncionales por ICS (es decir, positivos por al menos un ensayo pero no para ambos) tenían respuestas bajas/moderadas por ELISPOT (es decir, de entre 12-284 UFP/106 PBMc después de tres vacunaciones). Por el contrario, pacientes de la cohorte C que eran positivos para tetrámeros y tenían linfocitos T CD8+ específicos de antígeno polifuncionales confirmados tenían respuestas inmunitarias moderadas/altas por ELISPOT (es decir, de entre 773-2517 UFP/106 PBMC después de tres vacunaciones).

Los resultados divulgados en el presente documento demuestran que las combinaciones de la invención tienen la capacidad de mejorar la eficacia de una vacuna de survivina. Las combinaciones de la invención pueden por lo tanto ser adecuadas para el tratamiento de cáncer, en particular los cánceres que expresan antígenos de survivina en su superficie celular. Además, las respuestas inmunitarias generadas por las vacunas de la invención pueden tener el potencial de seleccionar como diana no solo células tumorales que expresan los antígenos de survivina específicos como se contienen en la vacuna. Como se muestra en la figura 7, la respuesta inmunitaria generada por los péptidos de survivina modificados en DPX-Survivac también presentaba reactividad cruzada a péptidos naturales.

El nivel de inducción inmunitaria observado por la invención, que comprende administración previa de ciclofosfamida seguido por una vacuna de survivina era muy pronunciado y se observa raramente en otros enfoques de vacunas que seleccionan como diana autoantígenos. Está aceptado en general que estas respuestas inmunitarias robustas son muy difíciles de lograr en pacientes con cáncer y serán probablemente la base de respuestas inmunitarias antitumorales clínicamente significativas. La fuerza de las respuestas en la cohorte C demuestra que la adición previa de ciclofosfamida a dosis baja, como fármaco inmunomodulador, es un factor significativo en la mejora de la eficacia de la vacuna y la generación de las respuestas inmunitarias fuertes que se registraron.

Los resultados clínicos divulgados en el presente documento proporcionan un modo de realización ejemplar de la invención que tiene una aplicación más amplia que cualquier agente que interfiere con la replicación del ADN y que cualquier vacuna de survivina, como se describe cada uno en el presente documento.

Agente que interfiere con la replicación del ADN

La presente invención implica administrar un agente que interfiere con la replicación del ADN antes de administrar la vacuna como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ interfiere con la replicación del ADN” pretende englobar cualquier acción que evita, inhibe o retrasa el proceso biológico de copiado (es decir, replicación) del ADN de una célula. El experto en la técnica apreciará que existen diversos mecanismos para evitar, inhibir o retrasar la replicación del ADN, tales como, por ejemplo, reticulación del ADN, metilación de ADN, sustitución de bases, etc.

La invención engloba el uso de un agente que interfiere con la replicación del ADN por cualquier medio conocido en la técnica. El agente que interfiere con la replicación del ADN es un fármaco, a saber, ciclofosfamida.

El agente que interfiere con la replicación del ADN es uno que, cuando se usa a dosis que no son quimioterápicas, puede afectar selectivamente a la replicación del ADN en células del sistema inmunitario, con la intención de modular el sistema inmunitario para potenciar respuestas a la vacuna. Por “no quimioterápica”, se quiere decir que la dosis del agente es una dosis menor que la que se usaría para destruir directa y selectivamente células y tejidos cancerosos o malignos.

Otras divulgaciones de un agente que interfiere con la replicación del ADN incluyen agentes que interfieren con la replicación del ADN para provocar muerte celular programada, con la capacidad para seleccionar selectivamente células en división rápida del sistema inmunitario. El propósito de dichos agentes es modular células del sistema inmunitario para potenciar respuestas a la vacuna. Dichos agentes se usan típicamente en dosis que no se espera que sean quimioterápicas y se consideran aceptables para su uso en seres humanos. El propósito de seleccionar selectivamente células inmunitarias puede ser reducir el número de células inmunodepresoras y/o agotar células inmunitarias útiles implicadas en la mediación de la respuesta inmunitaria con los propósitos de inducir una rápida proliferación tras la retirada del fármaco que selecciona la replicación del ADN.

La interferencia con la replicación del ADN que da lugar a muerte celular se puede provocar por numerosos mecanismos, incluyendo pero sin limitarse a, la formación de reticulación del ADN (por ejemplo por agentes alquilantes, compuestos de platino, etc.), metilación del ADN (es decir, por agentes metilantes), sustitución de bases (es decir, por análogos de nucleósidos). Los agentes ejemplares y sus mecanismos se describen en Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principies and Practice (Cabner B.A., 5.a edición, Lippincott Williams & Wilkins, PA, EE. UU., 2011).

El agente que interfiere con la replicación del ADN, a saber, ciclofosfamida, es un agente alquilante.

El agente que interfiere con la replicación del ADN, a saber, ciclofosfamida, es un agente alquilante de mostaza nitrogenada. Las mostazas nitrogenadas son agentes alquilantes del ADN no específicos. Las mostazas nitrogenadas forman iones aminio cíclicos (anillos aziridinio) por desplazamiento intramolecular del cloruro por el nitrógeno de la amina. A continuación, este grupo azidirio puede alquilar el ADN atacando el centro nucleófilo N-7 en la base de guanina. Tras el desplazamiento del segundo cloro, se produce una segunda etapa de alquilación que da como resultado la formación de reticulaciones dentro de la hebra (ICL). Estas lesiones son altamente citotóxicas puesto que bloquean procesos metabólicos fundamentales tales como replicación y transcripción del ADN.

Ciclofosfamida (CPA)

La ciclofosfamida (2-óxido de N,N-bis(2-cloroetil)-1,3,2-oxazafosfinan-2-amina), también conocida como citofosfano, es un agente alquilante de mostaza nitrogenada. La estructura química de ciclofosfamida es:

La ciclofosfamida también es conocida y se denomina con las marcas comerciales Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox® y Revimmune®. Otros agentes alquilantes de mostaza nitrogenada en la misma clase que la ciclofosfamida incluyen, sin limitación, palifosfamida, bendamustina e ifosfamida.

La ciclofosfamida (CPA) es un profármaco que se administra típicamente por medio de infusión intravenosa, pero también se puede administrar por vía parenteral y por vía oral (de Jonge, Huitema et al. 2005) con poca diferencia en biodisponibilidad (Juma, Rogers et al. 1979). CPA se convierte en sus metabolitos activos, 4-hidroxi-CPA y aldofosfamida, por oxidación por enzimas P450 en el hígado (Emmenegger, Shaked et a/.2007; 2011). Los metabolitos activos de CPA son solubles en lípidos y entran en las células a través de difusión pasiva. La 4-OH-CPA intracelular se descompone de manera espontánea en mostaza de fosforamida que es el metabolito activo definitivo. La mostaza de fosforamida cataliza reticulaciones de ADN dentro y entre las hebras así como reticulaciones de proteína de ADN que inhiben la replicación del ADN que da lugar a muerte celular (de Jonge, Huitema et al. 2005). La mostaza de fosforamida se elimina por conversión enzimática a carboxifosfamida por aldehído deshidrogenasa citoplásmica (ALDH) (Emmenegger, Shaked et al. 2007; 2011). Las células con bajos niveles de ALDH tienden a acumular metabolitos de CPA y son más sensibles a sus efectos y, efectivamente, la regulación por incremento tumoral de ALDH es un mecanismo de resistencia a CPA (Zhang, Tian et al. 2005).

Además de ALDH, bajos niveles de ATP intracelular también se han asociado con selectividad de CPA hacia tipos de células particulares (Zhao, Cao et al. 2010). A dosis altas, típicamente en el intervalo de 1-5 g/m2, los efectos de CPA son los más citotóxicos para células en división rápida indistintamente del tipo de célula, y CPA es mielosupresor puesto que la mayoría de las células hematogénicas se dividen rápidamente (Bruce, Meeker et al.

1966; Smith y Sladek 1985).

El aclaramiento general total de CPA y su metabolitos varía entre 5-9 horas, y los niveles plasmáticos máximos del original también varían considerablemente entre pacientes (3-11 horas) lo que refleja diferencias genéticas en el metabolismo entre personas (Cohén, Jao et al. 1971; Mouridsen, Faber et al. 1974). Se notifica que la administración repetida de CPA acorta la semivida de eliminación incrementando la actividad de enzimas implicadas en el metabolismo (D'lncalci, Bolis et al. 1979), pero se desconoce si esto da lugar a metabolismo incrementado del metabolito activo (de Jonge, Huitema et al. 2005), en particular a dosis bajas (Emmenegger, Shaked et al.2007).

La traducción de la dosis de estudios con seres humanos a murinos se calcula usando la siguiente ecuación:

Dosis humana (mg/kg) = Km de animal

Dosis de animal (mg/kg) = Km de ser humano

Donde el valor Km de ratón constante es 3 y el valor Km de ser humano es 37 (Reagan-Shaw, Nihal et al. 2008). Usando este cálculo, el tratamiento metronómico diario en seres humanos que consiste en 50 mg dos veces al día, por vía oral es equivalente a 20,56 mg/kg en ratón. La dosis de 20 mg/kg por vía oral se ha evaluado en modelos preclínicos y se determina que es biológicamente equivalente a la dosis humana (Voelcker, Wagner et al. 1984; Man, Bocci et al.2002).

En las últimas dos décadas, se ha apreciado que CPA a dosis bajas para sus efectos inmunomoduladores y antiangiogénicos. Contrario a CPA a dosis altas, las dosis bajas de CPA, típicamente de 100-300 mg/m2, carecen de actividad citotóxica generalizada pero parecen potenciar la eliminación tumoral mediada por el sistema inmunitario modulando selectivamente células del sistema inmunitario y también reduciendo la angiogénesis dentro del microentorno tumoral. Solo, el tratamiento con CPA a dosis bajas ha demostrado retardar el crecimiento tumoral en modelos animales, pero es ineficaz en la erradicación tumoral completa. Los mecanismos de retardo tumoral inducido por CPA son complementarios a la combinación con otras formas de tratamiento inmunitario, tal como vacunas contra el cáncer. Se puede administrar CPA a dosis bajas, típicamente <300 mg/m2, como una única inyección intravenosa rápida (sbCPA) o por vía oral a lo largo de varios días como tratamiento metronómico (mCPA). Los estudios pioneros de Robert North en los años 80 (North 1982; Awwad y North 1988) fueron los primeros en indicar que la CPA agota selectivamente células inmunodepresoras que eran responsables de reprimir respuestas inmunitarias activas hacia tumores. Desde entonces, también se ha informado de que CPA reduce y perjudica selectivamente la funcionalidad de linfocitos T reguladores CD4+CD25hiFoxP3+ (Lutsiak, Semnani et al.

2005), inhibe la angiogénesis tumoral (Browder, Butterfield et al. 2000), incrementa la activación de células dendríticas (Radojcic, Bezak et al. 2009), desvía la respuesta inmunitaria hacia Th1 (Schiavoni, Mattei et al. 2000) y restablece la función efectora de linfocitos T y células NK (Ghiringhelli, Menard et al. 2007). En ratones, los efectos de una única administración de bajas dosis en inyección intravenosa rápida de CPA son transitorios, alcanzando típicamente la máxima reducción en un plazo de 4 días después de la administración y volviendo a la normalidad a los 7-10 días (Lutsiak, Semnani et al. 2005; Salem, Al-Khami et al. 2012).

Se ha combinado CPA a dosis bajas con vacunas contra el cáncer en modelos preclínicos y en ensayos clínicos. Hermans et al. examinaron la eficacia del tratamiento con CPA a dosis bajas en ratones que portan tumores que se habían inmunizado profilácticamente con una estrategia de sensibilización/refuerzo de ADN/MVA. En resumen, los ratones se inmunizaron con ADN plasmídico que codifica el antígeno tumoral mel3, a continuación se reforzaron con MVA que codifica el mismo antígeno 14 días después. Siete días después del refuerzo con MVA, los ratones se expusieron a tumores con B16-F10 y a continuación se trataron cada 6 días con CPA a dosis bajas (175 mg/kg, IP) (Hermans, Chong et al. 2003). Encontraron que los ratones previamente inmunizados y a continuación tratados con CPA a dosis bajas tuvieron un retardo significativo en el crecimiento tumoral, pero ningún tratamiento solo tuvo efecto. No detectaron un incremento en el número de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. Un estudio de Barbón et al. en ratones que no portaban tumores demostró que 3 inyecciones diarias de CPA a dosis bajas (20 mg/kg/día IP) administradas antes de una vacuna de ADN que codifica el antígeno CYP1B1 proporcionaron mejores respuestas inmunitarias que la administración única de CPA a dosis bajas o altas (20 o 200 mg/kg) 2 días antes de la vacuna (Barbon, Yang et al. 2010). Las dosis diarias de CPA se administraron con la última dosis produciéndose 2 días antes de la vacunación. En este estudio, los tratamientos con CPA diarios fueron más eficaces en la reducción de los números totales de linfocitos Treg con un ahorro de linfocitos T efectores CD8+. Wada et al. estudiaron diversas pautas posológicas de CPA a dosis bajas (50 mg/kg i.v.) con una vacuna GVAX en un modelo tumoral de próstata TRAMP-C2/ HA autólogo (Wada, Yoshimura et al. 2009). Estos tumores se desarrollaron de manera natural en ratones y expresan el antígeno HA. CPA se administró una vez antes o una vez después de la vacunación para establecer la mejor pauta posológica. La administración previa de una única inyección intravenosa rápida a dosis bajas fue la más eficaz en la producción de linfocitos T CD8+. La inmunogenicidad de la vacuna se potenció además administrando a los ratones dos vacunaciones con 7 días de diferencia (día 0 y día 7) en combinación con una única dosis de ciclofosfamida a dosis bajas antes de cada vacuna (CPA administrada el día -1 y día 6). Informaron de un incremento en el número de CD4 y CD8 circulantes totales, y específicamente un incremento en linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. Un estudio de Salem et al. evaluó diferentes dosis de CPA como única inyección intravenosa rápida de bajas dosis 3 días antes de la vacunación (Salem, Kadima et al. 2007). Este estudio usó un modelo transgénico con lo que se trataron ratones naturales con una única inyección IP de CPA 2 días antes de que linfocitos T transgénicos OT-1 se transfirieran de manera adoptiva y 3 días antes de que los ratones se vacunaran con péptido de ovoalbúmina (100 ug; SIINFEKL, 257 264) s.c. administrado en PBS. La capacidad de la vacuna para incrementar el número de linfocitos T específicos de antígeno circulantes se midió después del pretratamiento con PBS, 1 mg de CPA o 4 mg de CPA. Encontraron que 1 mg de CPA (correspondiente a una dosis de 50 mg/kg) no expandió los linfocitos T OT-I específicos de antígeno más que el tratamiento simulado con PBS, pero sí 4 mg de c Pa (correspondientes a 200 mg/kg). Aunque ambas dosis se consideran “dosis bajas”, una única administración no dio como resultado potenciamiento uniforme de la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna. Más recientemente, Peng et al. compararon CPA diaria (10 mg/kg/día) con sbCPA (50 mg/kg) en combinación con una vacuna de ADN que codifica la proteína HPV16 E7 en un modelo tumoral TC-1 HPV16 (Peng, Lyford-Pike et al. 2012). En este modelo, los ratones se vacunaron terapéuticamente empezando 9 días después de la implantación y se repitió una vez a la semana durante las siguientes dos semanas. Se administró mCPA de manera continua durante cuatro semanas o se administró como una única dosis baja antes de cada vacunación. Todos los tratamientos con CPA comenzaron el día 8, un día antes de la primera vacunación. Encontraron que tanto sbCPA como mCPA se combinaron con la vacuna para proporcionar protección tumoral incrementada y que una única administración de CPA antes de cada vacuna proporciona las respuestas CD8 más fuertes y la mejor actividad antitumoral. Finalmente, Taieb et al. sometieron a prueba CPA a dosis bajas con una vacuna de exosoma Mart-1 en un modelo de melanoma (Taieb, Chaput et al.

2006). En resumen, a ratones transgénicos HLA-A2 se les implantó tumores B16.A2 el día 0, a continuación se trataron con CPA a dosis bajas (100 mg/kg IP) el día 6 y se vacunaron el día 12. Los ratones tratados con la combinación demostraron un control tumoral significativamente mejor que cualquier tratamiento solo, así como un incremento significativo en linfocitos T CD8+ específicos de antígeno y liberación de IFN-y.

También se ha sometido a prueba CPA a dosis bajas en ensayos clínicos. Ghiringhelli et al. informaron en primer lugar de que mCPA (sin vacunación) administrada durante un mes como 50 mg dos veces al día en pacientes con cáncer en fase IV dio como resultado una disminución significativa en linfocitos Treg circulantes, pero los niveles circulantes totales de células CD4, CD8 y NK no resultaron afectados (Ghiringhelli, Menard et al. 2007). Además, informaron de que los linfocitos T y las células NK en pacientes tratados tuvieron una capacidad de proliferación incrementada, lo que sugiere que el tratamiento con mCPA se puede combinar bien con la vacuna. Un estudio de fase l/ll (n=14) comparó la eficacia de una vacuna de células dendríticas (células dendríticas derivadas de monocitos cargadas con péptidos Her2/neu, hTERT y PADRE) con y sin única inyección intravenosa rápida a dosis bajas de CPA (sbCPA, 300 mg/m2 administrado por vía intravenosa 2 días antes de la vacuna) en 14 pacientes con cáncer ovárico (Chu, Boyer et al. 2012). Se informó de que los pacientes que recibieron el tratamiento de combinación tenían potencialmente mejor supervivencia libre de progresión y supervivencia global, pero los resultados no fueron estadísticamente significativos en este estudio debido a la pequeña población de pacientes. No detectaron disminuciones en linfocitos Treg circulantes en pacientes tratados con CPA, y no se demostró ningún potenciamiento de la respuesta de linfocitos T como se mide por ELISPOT de IFN-y entre los grupos con CPA y sin CPA. Otro estudio de fase II de único grupo en pacientes con melanoma (n=28) sometió a prueba la combinación de una vacuna de células dendríticas (células dendríticas autólogas, cargadas con péptidos derivados de KLH, survivina, hTERT, p53 y PADRE, vacunadas por vía intradérmica) con mCPA administrada por vía oral pero empezando después de la vacunación (50 mg dos veces al día, una semana sí, una semana no) (Engell-Noerregaard et al. 2012). En la evaluación de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna en este ensayo de único grupo (que combinó la vacuna basada en CD con IL-2, y un inhibidor de Cox-2 así como CPA), ELISPOt de IFN-y indicó respuestas inmunitarias moderadas desde el nivel inicial hasta la cuarta vacunación, produciéndose respuestas lentamente decrecientes a lo largo del tiempo. De manera importante, estas respuestas fueron de baja frecuencia o directamente indetectables ex vivo, típico del tratamiento de vacuna con péptidos sola. Las respuestas en estos pacientes no se compararon directamente con pacientes que recibieron vacuna sin tratamiento con CPA y no está claro si CPA sola o en combinación con IL-2 y un inhibidor de Cox-2 contribuyeron a la eficacia de la vacuna, en todo caso.

En un ensayo de fase II de único grupo en pacientes con cáncer ovárico (n=10), se combinó una vacuna que contenía un p53-SLP (péptido sintético largo), que consistía en diez péptidos solapantes sintéticos emulsionados en Montanide y administrados por vía subcutánea a pacientes (a intervalos de 3 semanas), con una única inyección intravenosa rápida a dosis bajas de CPA (sbCPA, 300 mg/m2, 2 días antes de la vacuna). Este estudio informó de respuestas de ELISPOT de IFN-y incrementadas en pacientes que recibieron la politerapia, en comparación con un ensayo anterior que sometía a prueba a la vacuna sola (Vermeij, Leffers et al. 2011). Sin embargo, comparar el resultado del tratamiento a lo largo de diferentes ensayos es propenso a sesgo de selección lo que podría desviar los resultados. Un ensayo realizado más sistemáticamente en melanoma comparó el uso de dos únicas vacunas multipeptídicas (que contenían péptidos de tirosinasa, MAGE-A1, MAGE-A3, gp100, MAGE-A10 y/o NY-ESO1) administradas con péptidos de linfocitos T cooperadores como una emulsión de agua en aceite, la mitad por vía subcutánea y la mitad por vía intradérmica con o sin sbCPA (300 mg/m2, antes de la vacunación). Este estudio examinó cuidadosamente las respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ tras la vacunación por ELISPOT, y encontró que sbCPA no proporcionó mejora detectable en combinación con la vacunación. Finalmente, un estudio de fase l/ll de Walter et al. en carcinoma de células renales sometió a prueba la combinación de una vacuna peptídica (IMA901) con sbCPA (300 mg/m23 días antes de la vacuna) (Walter, Weinschenk et al. 2012). El estudio de fase II de dos grupos (n=68) comparó la vacuna con y sin tratamiento con sbCPA. Informaron de que los pacientes con respuesta inmunitaria dentro del grupo tratado con la combinación de sbCPA/vacuna tuvieron mejor supervivencia que los pacientes que no respondían en el mismo grupo, y también el grupo tratado con vacuna sólo. Aún, no hubo ningún efecto medible del tratamiento con sbCPA sobre la inmunogenicidad de la vacuna.

En resumen, CPA se ha sometido a prueba en combinación con vacunas en ensayos clínicos, tanto como una única infusión intravenosa a dosis bajas antes de la vacunación, así como un tratamiento oral a dosis bajas metronómico empezando después de la vacunación. Estos ensayos han generado resultados contradictorios y no demostraron un beneficio definitivo y ampliamente aplicable para el uso de CPA a dosis bajas con el propósito de potenciar la actividad de la vacuna.

Hasta la fecha y según el conocimiento de los solicitantes, los beneficios de administrar una única dosis baja de CPA o múltiples dosis bajas de CPA antes de la vacunación no se han comparado directamente en un ensayo clínico. Se compararon los resultados obtenidos de acuerdo con los procedimientos de la presente invención que comprenden la administración de CPA repetida antes de la vacunación de pacientes con cáncer con la vacuna de survivina basada en múltiples péptidos (sometida a prueba frente a la vacuna sin CPA en el mismo ensayo) con resultados logrados con una única dosis baja de CPA antes de la vacunación con dos vacunas basadas en múltiples péptidos diferentes MELITAC 12.1 y MELITAC12.6 en pacientes con cáncer (ambas sometidas a prueba frente a la vacuna sin CPA en el mismo ensayo) por Slingluff et al. (2011).

En ausencia de tratamiento previo con CPA, la vacuna peptídica de survivina y las vacunas de melanoma MELITAC 12.1 y MELITAC 12.6 tuvieron potenciales de inmunogenicidad similares en base a resultados de ELISPOT. Las respuestas inmunitarias producidas por hasta tres vacunaciones con MELITAC 12.1 y MELITAC 12.6 solas variaron de 0-1095 puntos por 100.000 linfocitos T CD8+ para MELITAC 12.1 y 0-700 puntos para MELITAC 12.6. En comparación, los valores de ELISPOT de pacientes que recibieron hasta tres vacunaciones de DPX-Survivac solo, estaban en el intervalo de 0-291 puntos por 100.000 linfocitos T CD8+ después de convertir los valores de puntos por 1.000.000 de PBMC a puntos por 100.000 linfocitos T CD8+. Los recuentos de linfocitos T en PBMC de pacientes se determinaron por citometría de flujo y los datos presentados en el presente documento se convirtieron en número de puntos por 100.000 linfocitos T CD8+ para comparación directa con resultados producidos por las vacunas MELiTa C.

De manera comparativa, combinar MELITAC 12.1 y MELITAC 12.6 con una única dosis baja de CPA antes de la vacuna produjo respuestas inmunitarias que variaron de 0-1095 y 0-700 para MELITAC 12.1 y MELITAC 12.6, respectivamente. Por tanto, las respuestas inmunitarias generadas administrando una única dosis baja de CPA antes de MELITAC 12.1 y MELITAC 12.6 fueron esencialmente inalteradas en comparación con la vacuna sola.

Por el contrario, los pacientes a los que se les administraron múltiples dosis de CPA antes de la vacunación con DPX-Survivac generaron respuestas de ELISPOT que variaron de 0-8467 puntos por 100.000 linfocitos T CD8+. Este incremento significativo en respuestas inmunitarias después de la administración repetida de CPA antes de la vacunación con DPX-Survivac (0-8467 frente a 0-291) demuestra que el tratamiento previo con dosis bajas repetidas de ciclofosfamida antes de la vacunación es más beneficioso para potenciar una respuesta inmunitaria por una vacuna que administrar una única dosis baja de ciclofosfamida antes de la vacunación.

Composiciones de vacuna

Como se usa en el presente documento, los términos “vacuna”, “composición de vacuna” o “composición” se pueden usar de manera intercambiable.

Las composiciones de vacuna de la invención, para su uso conjuntamente con un agente que interfiere con la replicación del ADN, pueden ser de cualquier forma adecuada para la administración de un antígeno de survivina a un sujeto. Las composiciones de vacuna de acuerdo con la invención se pueden formular de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como por mezclado del uno o más antígenos de survivina con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, preferentemente los aceptables para la administración a seres humanos. Los ejemplos de dichos excipientes, vehículos y procedimientos de formulación se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton, PA). Para formular una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable adecuada para administración eficaz, dichas composiciones contendrán típicamente una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno de survivina, tal como un polipéptido de survivina, un péptido de survivina o una variante de péptido de survivina como se describe en el presente documento, o una molécula o vector de ácido nucleico que codifica dicho antígeno de survivina.

Las composiciones de vacuna de acuerdo con la invención se pueden administrar a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se usa en el presente documento, una “cantidad terapéuticamente eficaz” quiere decir una cantidad de vacuna o ingrediente activo (por ejemplo, uno o más antígenos de survivina) eficaz para tratar, prevenir, aliviar o mejorar cáncer o síntomas de cáncer; prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando; y/o estimular, inducir o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto, tal como una respuesta de linfocitos T citotóxicos. En algunos modos de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna es una cantidad que puede inducir una respuesta clínica en un sujeto en el tratamiento de cáncer. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna se encuentra bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación proporcionada en el presente documento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con una variedad de factores tales como el estado, el peso, el sexo y la edad del sujeto.

Una vez que se han seleccionado uno o más antígenos de survivina apropiados para su inclusión en una composición de vacuna de acuerdo con la invención, los antígenos se pueden administrar por diversos medios adecuados que son conocidos en la técnica. Las composiciones de vacuna para su uso en la invención descritas en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, y sin limitación, lipopéptidos (por ejemplo, Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), composiciones peptídicas encapsuladas en microesferas de poli(DL-lactida-coglucólido) (“PLG”) (véase, por ejemplo, Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso et al., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13:675-681, 1995), composiciones peptídicas contenidas en complejos estimuladores del sistema inmunitario (ISCOMS) (véase, por ejemplo, Takahashi et al. Nature 344:873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), múltiples sistemas de antígeno y péptido (MAP) (véase, por ejemplo, Tam, J. P., Proc. Nati. Acad. Sci. EE. u U. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para su uso en sistemas de administración balísticos, típicamente péptidos cristalizados, vectores de administración víricos (Perkus, M. E. et al., En: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986; Hu, S. L. et al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect. Dis.124:148, 1971; Chanda, P. K. et al., Virology 175:535, 1990), partículas de origen vírico o sintético (por ejemplo, Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H. S., Vogel, F. R., y Chedid, L.A. Annu. Rev. Immunol.

4:369,1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. et al, J. Immunol.148:1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996) o ADNc desnudo o adsorbido en partículas (Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L.A., y Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. et al., En: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 y Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993).

Las composiciones de vacuna de la invención también engloban modalidades mediadas por ácidos nucleicos. Por ejemplo, se puede administrar ADN o ARN que codifica para uno o más de los antígenos de survivina como se describe en el presente documento al sujeto. Dichos enfoques se describen, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247:1465 (1990) así como en las patentes de EE. UU. n.os 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; y el documento WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de administración a base de ADN incluyen “ADN desnudo”, administración facilitada (mediada por bupivicaína, polímeros, péptido), complejos lipídicos catiónicos y administración mediada por partículas (“cañón de genes”) o mediada por presión (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.922.687).

En otros modos de realización de las composiciones de vacuna, los antígenos de survivina (por ejemplo, péptidos de survivina) también se pueden expresar por vectores víricos o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión incluyen huéspedes víricos atenuados, tales como variolovacuna o viruela aviar. Este enfoque implica el uso de virus de la variolovacuna, por ejemplo, como un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de survivina como se describe en el presente documento. Tras la introducción en un huésped infectado de manera aguda o crónica o en un huésped no infectado, el virus de la variolovacuna recombinante expresa el péptido antigénico, y provoca de este modo una respuesta inmunitaria en el huésped. Se describen vectores de variolovacuna y procedimientos útiles en protocolos de inmunización en, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.722.848. Otro vector es BCG (bacilo de Calmette-Guérin). Los vectores de BCG se describen en Stover et al., Nature 351:456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración o inmunización terapéutica de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores de adenovirus y virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina carbunco destoxicado, y similares, serán evidentes para los expertos en la técnica y se engloban por las composiciones de vacuna descrita en el presente documento.

Las vacunas de acuerdo con la invención también engloban composiciones que contienen uno o más de los antígenos de survivina, donde el antígeno puede estar presente individualmente o como una construcción que contiene múltiples copias de los mismos o diferentes antígenos de survivina. Por ejemplo, el antígeno de survivina puede estar presente como una única molécula de ácido nucleico (por ejemplo, vector) que codifica varios de los mismos o diferentes antígenos de survivina. O, en otros modos de realización, se puede usar un homopolímero que comprende múltiples copias del mismo antígeno de survivina, o un heteropolímero de diversos antígenos de survivina diferentes. Dichos polímeros pueden tener la ventaja de proporcionar una reacción inmunológica incrementada ya que comprenden múltiples copias de antígenos de survivina, de modo que el efecto resultante puede ser una capacidad potenciada para inducir una respuesta inmunitaria con el uno o más determinantes antigénicos de survivina. La composición puede comprender una región que se produce de manera natural de uno o más antígenos de survivina o puede comprender antígenos preparados, por ejemplo, de manera recombinante o por síntesis química.

Una vacuna de la invención también puede incluir células que presentan antígenos (APC), tales como células dendríticas (CD), como un vehículo para presentar el uno o más antígenos survivina (por ejemplo, péptidos de survivina). Dichas composiciones de vacuna se pueden crear in vitro, tras la movilización y cosecha de células dendríticas, con lo que la carga de células dendríticas se produce in vitro. Por ejemplo, se transfectan células dendríticas con ADN o ARN que codifica el uno o más de los antígenos de survivina, o se pulsan con antígenos peptídicos de survivina. A continuación, la célula dendrítica se puede administrar a un sujeto para provocar una respuesta inmunitaria in vivo.

Una vacuna de acuerdo con la invención se puede administrar por cualquier medio adecuado, tal como, por ejemplo, inyección (por ejemplo, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal), aerosol, oral, nasal, tópica, intravaginal, transdérmica, transmucosa o cualquier otra vía adecuada. La vacuna se puede formular para distribución general o localizada en el cuerpo del sujeto. Las formulaciones generales incluyen las diseñadas para administración por inyección, así como las diseñadas para administración transdérmica, transmucosa u oral.

Para inyección, las vacunas se pueden formular en un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba como se describe en el presente documento, tal como una emulsión de agua en aceite o un vehículo a base de aceite. En algunos modos de realización, se pueden usar liposomas conjuntamente con el vehículo. Las vacunas también se pueden formular como disoluciones acuosas tales como en solución de Hank, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica.

Como será evidente a partir de lo anterior, se pretende que las composiciones de vacuna de la invención engloben cualquier medio de administración de composición o antígeno (por ejemplo, vectores víricos) que son útiles en el tratamiento de cáncer, incluyendo composiciones que pueden estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, tal como una respuesta de linfocitos T citotóxicos específica tras la administración.

Para obtener las composiciones de vacuna de la invención, puede ser adecuado combinar el antígeno de survivina, que puede ser un péptido de survivina relativamente pequeño, con diversos materiales tales como adyuvantes, excipientes, tensioactivos, componentes inmunoestimuladores y/o vehículos. Se pueden incluir adyuvantes en la composición de vacuna para potenciar la respuesta inmunitaria específica. Se pueden usar diferentes vehículos dependiendo de la vía de administración deseada o la distribución deseada en el sujeto, por ejemplo, general o localizada.

En un modo de realización particular, la vacuna para su uso en la invención es una composición que comprende al menos un antígeno de survivina, liposomas y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba. En otro modo de realización, la composición puede comprender además un adyuvante. En otro modo de realización, la composición puede comprender además un epítopo de linfocitos T cooperadores o antígeno.

Por tanto, en un modo de realización, la composición de vacuna comprende uno o más antígenos de survivina; un epítopo de linfocitos T cooperadores; un adyuvante; liposomas; y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba. El epítopo de linfocitos T cooperadores puede, por ejemplo, ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos AQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 9). El adyuvante puede ser, por ejemplo, un polinucleótido poli l:C.

En otro modo de realización, la vacuna para su uso en los procedimientos de la invención es una composición que comprende al menos un antígeno de survivina, conjuntamente con la plataforma adyuvante de vacuna basada en liposomas y/o basada en compuestos anfipáticos de Immunovaccine, Inc, incluyendo, pero sin limitarse a, las tecnologías de plataforma VacciMax® y DepoVax™ (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.793.923 y 7.824.686; los documentos WO 2002/038175; WO 2007/041832; WO 2009/039628; WO 2009/043165 y WO 2009/146523). La plataforma DepoVax™ es una formulación de administración de vacunas que proporciona exposición controlada y prolongada de antígenos más adyuvante al sistema inmunitario. La plataforma puede proporcionar una respuesta inmunitaria fuerte, específica y sostenida y puede proporcionar eficacia en una única dosis.

En otro modo de realización, la vacuna de la invención es cualquier composición adecuada como se describe anteriormente, que comprende uno o más antígenos peptídicos de survivina que tienen la secuencia de aminoácidos: FEELTLGEF (SEQ ID NO: 1); FTELTLGEF (SEQ ID N0: 2); LTLGEFLKL (SEQ ID NO: 3); LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4); RISTFKNWPF (SEQ ID NO: 5); RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6); STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7) y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8).

En otro modo de realización, la composición de vacuna comprende cinco antígenos peptídicos de survivina que comprenden las secuencias de aminoácidos: FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2), LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4), RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6), STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7) y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8); un epítopo de linfocitos T cooperadores; un adyuvante; liposomas y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba. El epítopo de linfocitos T cooperadores puede, por ejemplo, ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos AQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 9). El adyuvante puede ser, por ejemplo, un polinucleótido poli l:C. Los liposomas pueden, por ejemplo, estar compuestos por 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC; fosfolípido sintético) y colesterol. El vehículo hidrófobo puede, por ejemplo, ser Montanide® ISA51 VG.

En un modo de realización particular, la vacuna de la invención puede ser la vacuna inmunoterápica antineoplásica candidata de Immunovaccine Inc DPX-Survivac. DPX-Survivac comprende cinco antígenos peptídicos sintéticos de survivina que tienen las secuencias de aminoácidos: FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2), LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4), RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6), STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7) y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8); un epítopo universal de linfocitos T cooperadores de toxoide tetánico (AQYIKANSKFIGITEL; SEQ ID NO: 9; un adyuvante de polinucleótido poli l:C; liposomas que consisten en DOPC y colesterol; y el vehículo hidrófobo Montanide® ISA 51 VG. Las cantidades ejemplares de cada componente (por ml de vacuna) incluyen, sin limitación, 1,0 mg de cada antígeno de survivina; 0,5 mg de epítopo de linfocitos T cooperadores (por ejemplo SEQ ID NO: 9); 0,4 mg de adyuvante (por ejemplo polinucleótido poli l:C); 120,0 mg de fosfolípido DOPC sintético; 12,0 mg de colesterol y 0,7 ml de vehículo hidrófobo (por ejemplo Montanide® ISA51 VG).

La vacuna puede comprender opcionalmente además componentes adicionales tales como, por ejemplo, emulsionantes. Una divulgación más detallada de modos de realización ejemplares de la vacuna, y los componentes de la misma, se describen como sigue.

(i) Antígenos de survivina

Las composiciones de vacuna de la invención comprenden al menos un antígeno de survivina. La expresión “al menos uno” se usa en el presente documento de manera intercambiable con la expresión “uno o más”. Estas expresiones, a menos que se establezca explícitamente de otro modo en el presente documento, se refieren al número de diferentes antígenos de survivina en la vacuna, y no a la cantidad de cualquier antígeno de survivina particular. De acuerdo con el significado común de “al menos uno” o “uno o más”, la composición de vacuna de la invención contiene un mínimo de un antígeno de survivina.

La survivina, también denominada inhibidor baculovírico de repetición de apoptosis que contiene 5 (BIRC5), es una proteína implicada en la regulación negativa de apoptosis. Se ha clasificado como un miembro de la familia de inhibidores de proteínas de apoptosis (IAP). La survivina es una proteína citoplásmica de 16,5 kDa que contiene un único motivo BIR y una región helicoidal carboxiterminal altamente cargada en lugar de un dedo RING. La codificación génica para survivina es prácticamente idéntica a la secuencia de receptor-1 de proteasa de células efectoras (EPR-1), pero orientada en la dirección opuesta. La secuencia codificante para la survivina (Homo sapiens) es de 429 nucleótidos de longitud (SEQ ID NO: 10) incluyendo codones de terminación. La proteína codificada survivina (Homo sapiens) tiene 142 aminoácidos de longitud (SEQ ID NO: 11).

Se postula que la proteína survivina funciona para inhibir la activación de caspasa, lo que da lugar de este modo a regulación negativa de apoptosis o muerte celular programada. Coherente con esta función, la survivina se ha identificado como uno de los genes principales regulados por incremento de manera invariable en muchos tipos de cáncer pero no en tejido normal (véase, por ejemplo Altieri et al., Lab Invest, 79: 1327-1333, 1999; y la patente de EE. UU. n.° 6.245.523). Este hecho, por lo tanto, hace que la survivina sea una diana ideal para el tratamiento contra el cáncer ya que las células cancerosas se seleccionan mientras que las células normales no. En efecto, la survivina se expresa altamente en muchos tipos tumorales, incluyendo una gran parte de cáncer humano, y se ha informado de que tiene valor de pronóstico.

Las vacunas de la invención comprenden uno o más antígenos de survivina. Como se usa en el presente documento, el término “antígeno de survivina” engloba cualquier péptido, polipéptido o variante de los mismos (por ejemplo, variante de péptido de survivina) derivado de una proteína survivina o un fragmento de la misma. El término “antígeno de survivina” también engloba un polinucleótido que codifica un péptido de survivina, variante de péptido de survivina o equivalente funcional de péptido de survivina descrito en el presente documento. Los polinucleótidos pueden ser ADN (por ejemplo, ADN o ADNc genómico) o ARN (por ejemplo, ARNm) o combinaciones de los mismos. Se pueden producir de manera natural o sintética (por ejemplo, sintetizarse químicamente). Se contempla que el polinucleótido puede contener modificaciones de una o más bases nitrogenadas, azúcares de pentosa o grupos fosfato en la cadena de nucleótido. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica y pueden ser con el propósito de, por ejemplo, mejorar la estabilidad del polinucleótido.

En un modo de realización, el antígeno de survivina puede comprender el polipéptido de survivina de longitud completa o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de survivina de longitud completa. De forma alternativa, el antígeno de survivina puede ser un péptido de survivina que comprende un fragmento de cualquier longitud de la proteína survivina. Los modos de realización ejemplares incluyen un péptido de survivina que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 residuos de aminoácido. En modos de realización específicos, el péptido de survivina consiste en un heptapéptido, un octapéptido, un nonapéptido, un decapéptido o un undecapéptido, que consiste en 7, 8, 9, 10, 11 residuos aminoacídicos consecutivos de la proteína survivina (por ejemplo SEQ ID NO: 11), respectivamente. Los modos de realización particulares del antígeno de survivina incluyen péptidos de survivina de aproximadamente 9 o 10 aminoácidos.

Los antígenos de survivina de la invención también engloban variantes y equivalentes funcionales de péptidos de survivina. Variantes o equivalentes funcionales de un péptido de survivina engloban péptidos que presentan secuencias de aminoácidos con diferencias en comparación con la secuencia específica de la proteína survivina, tal como una o más sustituciones, deleciones o adiciones aminoacídicas, o cualquier combinación de las mismas. La diferencia se puede medir como una reducción en la identidad como entre la secuencia de proteína survivina y la variante de péptido de survivina o equivalente funcional de péptido de survivina.

La identidad entre secuencias de aminoácidos se puede calcular usando algoritmos bien conocidos en la técnica. Las variantes de péptido de survivina o equivalentes funcionales se han de considerar que se encuentran dentro del significado de un “antígeno de survivina” de la invención cuando son, preferentemente, respecto a la totalidad de su longitud, al menos un 70 % idénticas a una secuencia peptídica de una proteína survivina, tal como al menos un 75 % idénticas, al menos un 80 % idénticas, al menos un 85 % idénticas, al menos un 90 % idénticas, o al menos un 95 % idénticas, incluyendo un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idénticas a una secuencia peptídica de una proteína survivina. En un modo de realización particular, la variante de péptido de survivina tiene una secuencia que es al menos un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

La proteína survivina de la que se puede derivar el antígeno de survivina es una proteína survivina de cualquier especie animal en la que la proteína se expresa. Un modo de realización particular es la proteína survivina de seres humanos (SEQ ID NO: 11). en base a la secuencia de la proteína survivina seleccionada, el antígeno de survivina se puede derivar por cualquier tratamiento químico o enzimático apropiado de la proteína survivina o ácido nucleico codificante. De forma alternativa, el antígeno de survivina se puede sintetizar por cualquier procedimiento de síntesis de péptidos o ácidos nucleicos convencional con el que el experto habitual en la técnica está familiarizado.

El antígeno de survivina de la invención (péptido o ácido nucleico) puede tener una secuencia que es una secuencia de survivina natural. De forma alternativa, el antígeno de survivina puede ser un péptido o secuencia de ácido nucleico modificada por una o más sustituciones, deleciones o adiciones, tales como por ejemplo las variantes de péptido de survivina o equivalentes funcionales descritos en el presente documento. Los procedimientos y modificaciones de péptidos de survivina ejemplares que incrementan la inmunogenicidad de los péptidos incluyen, por ejemplo, los descritos en el documento WO 2004/067023 que implican sustituciones aminoacídicas introducidas en posiciones de anclaje que incrementan la unión del péptido a la molécula HLA de clase I.

En un modo de realización, el antígeno de survivina es cualquier péptido derivado de la proteína survivina, o cualquier variante de péptido de survivina de la misma, que puede unir moléculas de HLA de clase I del CMH. En este sentido, el antígeno de survivina puede ser cualquier péptido de survivina, o variante de péptido de survivina de la misma, que puede inducir o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto.

En un modo de realización, el antígeno de survivina es un antígeno peptídico que comprende una secuencia de aminoácidos de la proteína survivina (SEQ ID NO: 11) que puede provocar una respuesta en linfocitos T citotóxicos (CTL) en un sujeto, o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho péptido.

En un modo de realización, la vacuna comprende uno o más péptidos sintéticos de survivina, o variantes de los mismos, en base a la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina, tal como la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11.

Los péptidos de survivina, variantes de péptido de survivina y equivalentes funcionales de survivina, y sus usos con propósitos de diagnóstico y terapéuticos, específicamente en cáncer, se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 2004/067023 y WO 2006/081826. Se encontró que los péptidos novedosos divulgados en estas publicaciones podían provocar respuestas en linfocitos T citotóxicos (CTL) en pacientes con cáncer. En particular, en el documento WO 2004/067023, se encontró que se pueden derivar péptido limitados por la clase I del CMH a partir de la proteína survivina, que se pueden unir a moléculas de HLA de clase I del CMH y provocar de este modo tanto respuestas inmunitarias de c Tl ex vivo como in situ en pacientes que padecen una amplia gama de enfermedades oncológicas.

En un modo de realización, la vacuna de la invención puede incluir uno cualquiera o más de los péptidos de survivina, variantes de péptido de survivina o equivalentes funcionales de péptido de survivina divulgados en los documentos WO 2004/067023 y WO 2006/081826.

En otro modo de realización, la vacuna de la invención puede incluir uno o más de un péptido de survivina, variante de péptido de survivina o equivalente funcional de péptido de survivina que se puede unir a cualquiera de las moléculas de clase I del CMH seleccionadas de moléculas de HLA-A, HLA-B o HLA-C.

Las moléculas de HLA-A de clase I del CMH ejemplares a las que se puede unir el péptido de survivina, variante de péptido de survivina, o equivalente funcional de péptido de survivina incluyen, sin limitación, HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68 y HLA-A69.

Las moléculas de HLA-B de clase I del CMH ejemplares a las que se puede unir el péptido de survivina, variante de péptido de survivina, o equivalente funcional de péptido de survivina incluyen, sin limitación, HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-B22, HLA- B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-B41, HLA-B42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-B46 y HLA-B47.

Las moléculas de HLA-C de clase I del CMH ejemplares a las que se puede unir el péptido de survivina, variante de péptido de survivina, o equivalente funcional de péptido de survivina incluyen, sin limitación, HLA-C1, HLA-C2, HLA-C3, HLA-C4, HLA-C5, HLA-C6, HLA-C7 y HLA-C 16.

En un modo de realización particular, la vacuna de la invención puede comprender uno o más de los antígenos peptídicos de survivina seleccionados de:

i) FEELTLGEF (SEQ ID NO: 1) [HLA-A1]

ii) FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2) [HLA-A1]

iii) LTLGEFLKL (SEQ ID NO: 3) [HLA-A2]

iv) LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4) [HLA-A2]

v) RISTFKNWPF (SEQ ID NO: 5) [HLA-A3]

vi) RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6) [HLA-A3]

vii) LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 7) [HLA-A24]

viii) LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8) [HLA-B7]

Los péptidos de survivina enumerados anteriormente representan, sin limitación, péptidos limitados por la clase I del CMH ejemplares englobados por la invención. La molécula de HLA de clase I del CMH específica a la que se cree que se unen cada uno de los péptidos de survivina, se muestra a la derecha entre corchetes. Una vacuna de la invención puede comprender uno o más de estos péptidos de survivina, en cualquier combinación adecuada.

En otro modo de realización, la vacuna de la invención comprende uno cualquiera o más de los cinco péptidos de survivina enumerados a continuación, en cualquier combinación adecuada:

i) FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2) [HLA-A1]

N) LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4) [HLA-A2]

i¡¡) RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6) [HLA-A3]

¡v) STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7) [HLA-A24]

v) LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8) [HLA-B7]

En un modo de realización particular, la composición de la invención comprende los cinco antígenos peptídicos de survivina enumerados anteriormente, como se encuentra en Immunovaccine Inc o cualquier combinación o uno o más de los antígenos peptídicos. En un modo de realización preferente, la composición comprenderá los cinco de los antígenos peptídicos de survivina, vacuna inmunoterápica antineoplásica candidata DPX-Survivac.

Además del al menos un antígeno de survivina, otros modos de realización de la vacuna de la invención pueden comprender uno o más antígenos adicionales útiles en el tratamiento de cáncer o útiles en la inducción o potenciamiento de una respuesta inmunitaria contra el cáncer. Los modos de realización ejemplares de dichos antígenos adicionales se describen a continuación.

(ii) Antígenos adicionales

Otros antígenos que pueden ser útiles en las composiciones de la invención incluyen, sin limitación, antígenos que pueden inducir o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto que sería beneficiosa en el tratamiento de cáncer, por ejemplo, una respuesta inmunitaria mediada por células.

La inmunidad mediada por células es una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos pero más bien implica la activación de macrófagos y células citolíticas naturales, la producción de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y la liberación de diversas citocinas en respuesta a un antígeno. Los linfocitos T citotóxicos son un subgrupo de linfocitos T (un tipo de leucocito) que puede inducir la muerte de células somáticas o tumorales infectadas; destruyen células que se infectan con virus (u otros patógenos), o son de otro modo disfuncionales o están dañadas.

La mayoría de linfocitos T citotóxicos expresan receptores de linfocitos T que pueden reconocer un antígeno peptídico específico unido a moléculas del CMH de clase I. Estos CTL también expresan CD8 (linfocitos T CD8+), que se atrae a porciones de la molécula de clase I del CMH. Esta afinidad mantiene el CTL y la célula diana unidos estrechamente durante la activación específica de antígeno.

La inmunidad celular protege al cuerpo, por ejemplo, activando linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno que pueden lisar células corporales que presentan epítopos de antígeno foráneo sobre su superficie, tal como células infectadas por virus, células con bacterias intracelulares, y células cancerosas que presentan antígenos tumorales; activando macrófagos y células citolíticas naturales, permitiéndolos destruir patógenos intracelulares; y estimulando las células para secretar una variedad de citocinas que influyen en la función de otras células implicadas en respuestas inmunitarias adaptativas y respuestas inmunitarias innatas.

En consecuencia, en otros modos de realización, las composiciones de vacuna de la invención pueden comprender un antígeno adicional al uno o más antígenos de survivina. Por ejemplo, el antígeno adicional puede ser, sin limitación, un péptido, un polipéptido o proteína natural, no natural, recombinante o desnaturalizada adecuada o un fragmento de los mismos, o un epítopo que puede inducir o potenciar una respuesta inmunitaria de CTL en un sujeto.

El antígeno adicional también puede ser un polinucleótido que codifica el polipéptido que funciona como antígeno. son conocidas estrategias de vacunación basadas en ácido nucleico, en las que una composición de vacuna que contiene un polinucleótido se administra a un sujeto. El polipéptido antigénico codificado por el polinucleótido se expresa en el sujeto, de modo que el polipéptido antigénico está presente finalmente en el sujeto, justo como si la composición de vacuna por sí misma había contenido el polipéptido. Con los propósitos de la presente invención, el antígeno adicional, cuando el contexto lo dicta, engloba dichos polinucleótidos que codifican el polipéptido que funciona como antígeno.

El término “polipéptido” engloba cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud (por ejemplo, al menos 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 aminoácidos) o modificación postraduccional (por ejemplo, glucosilación o fosforilación), e incluye, por ejemplo, proteínas naturales, polipéptidos y péptidos sintéticos o recombinantes, epítopos, moléculas híbridas, variantes, homólogos, análogos, peptoides, peptidomiméticos, etc. Por lo tanto, una variante o derivado incluye deleciones, incluyendo truncaciones y fragmentos; inserciones y adiciones, por ejemplo sustituciones conservadoras, mutantes dirigidos al sitio y variantes alélicas; y modificaciones, incluyendo peptoides que tienen uno o más grupos acilo no amino (por ejemplo, azúcar, lípido, etc.) unidos covalentemente al péptido y modificaciones postraduccionales. Como se usa en el presente documento, el término “sustituciones aminoacídicas conservadas” o “sustituciones conservadoras” se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro en una localización dada en el péptido, donde la sustitución se puede realizar sin pérdida sustancial de la función pertinente. En la realización de dichos cambios, se pueden realizar sustituciones de residuos aminoacídicos similares en base a similitud relativa de sustituyentes de cadena lateral, por ejemplo, su tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad y similares, y dichas sustituciones se pueden evaluar para determinar su efecto sobre la función del péptido por pruebas de rutina. Los ejemplos específicos, no limitantes de una sustitución conservadora incluyen los siguientes ejemplos:

Residuo original Sustituciones conservadoras

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln, His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

His Asn; Gln

Ile Leu, Val

Leu Ile; Val

Lys Arg; Gln; Glu

Met Leu; Ile

Phe Met; Leu; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp; Phe

Val Ile; Leu

Se pueden usar polipéptidos o péptidos que tienen una identidad sustancial con respecto a una secuencia de antígeno preferente. Se considera que dos secuencias tienen identidad sustancial si, cuando se alinean de manera óptima (permitiéndose huecos), comparten al menos aproximadamente un 50 % de identidad de secuencia, o si las secuencias comparten motivos funcionales definidos. En modos de realización alternativos, se puede considerar que las secuencias alineadas de manera óptima son sustancialmente idénticas (es decir, tienen identidad sustancial) si comparten al menos un 60 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % de identidad respecto a una región especificada. El término “identidad” se refiere a similitud de secuencia entre dos moléculas de polipéptidos. La identidad se puede determinar comparando cada posición en las secuencias alineadas. Un grado de identidad entre secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias, por ejemplo, respecto a una región especificada. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparaciones de identidad se puede llevar a cabo usando una variedad de algoritmos, como son conocidos en la técnica, incluyendo el programa ClustalW, disponible en http://clustalw.qenome.ad.ip. el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48:443, el procedimiento de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, y las implementaciones informatizadas de estos algoritmos (tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programa informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, Madison, Wl, EE. UU.). También se puede determinar la identidad de secuencia usando el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (usando las configuraciones por defecto publicadas). Por ejemplo, se puede usar la herramienta “BLAST 2 Sequences”, disponible a través del National Center for Biotechnology Information (a través de internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/bl2sea/wblast2.cgi), seleccionando el programa “blastp” en las siguientes configuraciones por defecto: umbral esperado 10; tamaño de letra 3; matriz BLOSUM 62; existencia de huecos costes 11, extensión 1. En otro modo de realización, el experto en la técnica puede alinear rápida y adecuadamente cualquier secuencia dada y deducir la identidad de secuencia y/u homología por mera inspección visual.

Los polipéptidos y péptidos usados como antígeno adicional en la vacuna de la invención se pueden aislar de fuentes naturales, ser sintéticos o ser polipéptidos generados de manera recombinante. Los péptidos y proteínas se pueden expresar de manera recombinante in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos usados para practicar la invención se pueden preparar y aislar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los polipéptidos y péptidos usados para practicar la invención también se pueden sintetizar, en su totalidad o en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Hom (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Pa. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede realizar usando diversas técnicas de fase sólida (véase, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) y se puede lograr síntesis automática, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

En algunos modos de realización, el antígeno adicional puede ser un antígeno purificado, por ejemplo, de aproximadamente un 25 % a un 50 % puro, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 75 % puro, de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 85 % puro, de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 90 % puro, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 95 % puro, de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 98 % puro, de aproximadamente un 98 % a aproximadamente un 99 % puro, o superior a un 99 % puro.

Como se indica anteriormente, el antígeno adicional incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido que funciona como antígeno. Como se usa en el presente documento, el término “polinucleótido” engloba una cadena de nucleótidos de cualquier longitud (por ejemplo 9, 12, 18, 24, 30, 60, 150, 300, 600, 1500 o más nucleótidos) o número de hebras (por ejemplo monocatenario o bicatenario). Los polinucleótidos pueden ser ADN (por ejemplo ADN o ADNc genómico) o ARN (por ejemplo ARNm) o combinaciones de los mismos. Se pueden producir de manera natural o ser sintéticos (por ejemplo, sintetizados químicamente). Se contempla que el polinucleótido puede contener modificaciones de una o más bases nitrogenadas, azúcares de pentosa o grupos fosfato en la cadena de nucleótidos. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica y pueden ser con el propósito de, por ejemplo, mejorar la estabilidad del polinucleótido.

El polinucleótido se puede administrar en diversas formas. En algunos modos de realización, se puede usar un polinucleótido desnudo, en forma lineal, o bien insertarse en un plásmido, tal como un plásmido de expresión. En otros modos de realización, se puede usar un vector vivo tal como un vector vírico o bacteriano.

Pueden estar presentes una o más secuencias reguladoras que ayudan en la transcripción de ADN en ARN y/o traducción de ARN en un polipéptido. En algunos casos, tales como en el caso de un polinucleótido que es una molécula de ARN mensajero (ARNm), no se requieren secuencias reguladoras en relación con el proceso de transcripción (por ejemplo, un promotor) y la expresión de proteínas se puede efectuar en ausencia de un promotor. El experto en la técnica puede incluir secuencias reguladoras adecuadas como requieran las circunstancias.

En algunos modos de realización, el polinucleótido está presente en un casete de expresión, en el que se enlaza de forma funcional a secuencias reguladoras que permitirán que el polinucleótido se exprese en el sujeto al que se le administra la composición de la invención. La elección de casete de expresión depende del sujeto al que se le administra la composición así como los rasgos característicos deseados para el polipéptido expresado.

Típicamente, un casete de expresión incluye un promotor que es funcional en el sujeto y puede ser constitutivo o inducible; un sitio de unión a ribosoma; un codón de iniciación (ATG) si es necesario; el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés; un codón de terminación; y opcionalmente una región terminal 3' (terminador de la traducción y/o transcripción). Se pueden incluir secuencias adicionales tales como una región que codifica un péptido de señal. El polinucleótido que codifica el polipéptido de interés puede ser homólogo o heterólogo con respecto a cualquiera de las demás secuencias reguladoras en el casete de expresión. Las secuencias que se van a expresar conjuntamente con el polipéptido de interés, tal como un péptido de señal que codifica una región, se localizan típicamente contiguas al polinucleótido que codifica la proteína que se va a expresar y colocar en el marco de lectura apropiado. El marco abierto de lectura constituido por el polinucleótido que codifica la proteína que se va a expresar únicamente o conjuntamente con cualquier otra secuencia que se va a expresar (por ejemplo, el péptido de señal), se coloca debajo del control del promotor de modo que la transcripción y la traducción se producen en el sujeto al que se le administra la composición.

La cantidad de un antígeno adicional usado en un tratamiento único con una composición de vacuna como se describe en el presente documento puede variar dependiendo del tipo de antígeno y el tamaño del sujeto. Un experto en la técnica podrá determinar, sin experimentación indebida, la cantidad eficaz de un antígeno adicional para usar en una aplicación particular. El término “cantidad eficaz” como se usa en el presente documento quiere decir una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado deseado.

En algunos modos de realización, el antígeno adicional puede ser al menos un epítopo de CTL que puede inducir una respuesta de CTL. Por ejemplo, el antígeno adicional puede ser un epítopo de CTL derivado de una proteína identificada como que está regulada por incremento en células cancerosas.

En un modo de realización, el epítopo de CTL puede ser un epítopo de una proteína asociada a tumor, tal como por ejemplo, una proteína asociada a melanoma. En algunos modos de realización, la proteína asociada a melanoma es proteína 2 relacionada con tirosina (TRP-2) o p53, que se puede obtener por diversos procedimientos que incluyen tecnología recombinante o síntesis química.

Los siguientes genes, sin limitación, codifican proteínas asociadas a tumor que tienen secuencias peptídicas que se pueden incorporar como antígenos adicionales en la vacuna de la invención: p53, HPV E6 y E7, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, PRAME, P15, RUI, RU2, SART-1, SART-3, WT1, PSA, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, gp100, MART-1/Melan A, MAGE-A1,MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, NA88-A, NY-ESO-ala, NY-ESO-1a (CAG-3), AFP, p-catenina/m, caspasa-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, Ras, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina/m, RAGE, SART-2, survivina, TRP-2/INT2 y 707-AP.

En un modo de realización, la vacuna puede comprender una mezcla de epítopos de CTL asociados con cáncer como antígenos para inducir una respuesta de CTL. Por ejemplo, el antígeno puede comprender al menos uno o más de un antígeno de survivina como se describe en el presente documento, tal como por ejemplo y sin limitación, antígenos peptídicos de survivina que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: FEELTLGEF (SEQ ID NO: 1); FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2); LTLGEFLKL (SEO ID NO: 3); LMLGEFLKL (SEO ID NO: 4); RISTFKNWPF (SEQ ID NO: 5); RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6); STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7); y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8), conjuntamente con al menos un antígeno adicional de una proteína asociada a tumor.

(iii) Epítopo de linfocitos T cooperadores

En algunos modos de realización, la vacuna de la invención comprende al menos un epítopo de linfocitos T cooperadores o antígeno de linfocitos T cooperadores.

Los epítopos de linfocitos T cooperadores son una secuencia de aminoácidos (aminoácidos naturales o no naturales) que tienen actividad de linfocitos T cooperadores. Los epítopos de linfocitos T cooperadores se reconocen por los linfocitos T cooperadores, que desempeñan un papel importante en el establecimiento y la maximización de las capacidades del sistema inmunitario, y están implicados en la activación y el direccionamiento de otras células inmunitarias, tales como, por ejemplo, linfocitos T citotóxicos.

Un epítopo de linfocitos T cooperadores puede consistir en un epítopo continuo o discontinuo. Por consiguiente, no cada aminoácido de un linfocito T cooperador es necesariamente parte del epítopo. En consecuencia, los epítopos de linfocitos T cooperadores, incluyendo análogos y segmentos de epítopos de linfocitos T cooperadores, pueden potenciar o estimular una respuesta inmunitaria. Los epítopos de linfocitos T cooperadores inmunodominantes son grandes rasgos reactivos en poblaciones animales y humanas con tipos de CMH ampliamente divergentes (Celis et al. (1988) J. Immunol. 140:1808-1815; Demotz et al. (1989) J. Immunol. 142:394-402; Chong et al. (1992) Infect. Immun. 60:4640-4647). El dominio de linfocito T cooperador de los péptidos objeto tiene desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 aminoácidos y preferentemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 aminoácidos. Cuando están presentes múltiples epítopos de linfocitos T cooperadores, entonces cada epítopo de linfocitos T cooperadores actúa independientemente.

En algunos modos de realización, el epítopo de linfocitos T cooperadores puede formar parte de un antígeno descrito en el presente documento. En particular, si el antígeno es de tamaño suficiente, puede contener un epítopo que funciona como epítopo de linfocitos T cooperadores. En otros modos de realización, el epítopo de linfocitos T cooperadores es una molécula diferente del antígeno.

En otro modo de realización, los análogos de epítopo de linfocitos T cooperadores pueden incluir sustituciones, deleciones e inserciones de desde uno a aproximadamente 10 residuos aminoacídicos en el epítopo de linfocitos T cooperadores. Los segmentos de linfocito T cooperador son porciones contiguas de un epítopo de linfocitos T cooperadores que son suficientes para potenciar o estimular una respuesta inmunitaria. Un ejemplo de segmentos de linfocito T cooperador es una serie de péptidos solapantes que se derivan de un único péptido más largo.

En un modo de realización particular, las composiciones de la invención pueden comprender como epítopo de linfocitos T cooperadores o antígeno, el péptido de la toxina tetánica A16L (830 a 844; AQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 9), con un residuo de alanina añadido a su extremo amino para potenciar la estabilidad (Slingluff et al., Clin Cáncer Res., 7: 3012-3024, 2001).

Otras fuentes de epítopos de linfocitos T cooperadores que se pueden usar en las presentes composiciones incluyen, por ejemplo, epítopos de linfocitos T cooperadores del antígeno de la superficie de la hepatitis B, epítopos de linfocitos T cooperadores de toxina tosferínica, epítopo de linfocitos T cooperadores de la proteína F del virus del sarampión, epítopo de linfocitos T cooperadores de la proteína de la membrana exterior principal de Chlamydia trachomitis, epítopos de linfocitos T cooperadores de la toxina diftérica, epítopos de linfocitos T cooperadores de circumsporozoito de Plasmodium falciparum, epítopos de linfocitos T cooperadores de triosa fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni, epítopos de linfocitos T cooperadores de TraT de Escherichia coli y análogos y segmentos de potenciamiento del sistema inmunitario de cualquiera de estos epítopos de linfocitos T cooperadores.

En algunos modos de realización, el epítopo de linfocitos T cooperadores puede ser un epítopo universal de linfocitos T cooperadores. Un epítopo universal de linfocitos T cooperadores como se usa en el presente documento se refiere a un péptido u otra molécula inmunogénica, o un fragmento de la misma, que se une a una multiplicidad de las moléculas del CMH de clase II de manera que activa la función de linfocitos T de manera limitada a la clase II (linfocitos T CD4+). Un ejemplo de un epítopo universal de linfocitos T cooperadores es PADRE (epítopo pan-DR) que comprende la secuencia peptídica AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 12), en la que X pude ser ciclohexilalanilo. PADRE tiene específicamente un epítopo de linfocitos T cooperadores CD4+, es decir, estimula la inducción de una respuesta de linfocitos T cooperadores CD4+ específica de PADRE.

Además del péptido de la toxina tetánica modificado A16L mencionado anteriormente, el toxoide tetánico tiene otros epítopos de linfocitos T cooperadores que trabajan de manera similar que PADRE. Las toxinas tetánica y diftérica tienen epítopos universales para células CD4+ humanas (Dietelm-Okita, B.M. et al., J. Infect. Diseases, 181:1001-1009, 2000). En otro modo de realización, el epítopo de linfocitos T cooperadores puede ser un péptido toxoide tetánico tal como F21E que comprende la secuencia peptídica FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (aminoácidos 947-967; SEQ ID NO: 13).

En determinados modos de realización, el epítopo de linfocitos T cooperadores se fusiona con al menos uno del uno o más antígenos de survivina en la vacuna de la invención o con el antígeno adicional que se puede incluir en la vacuna (por ejemplo, un péptido de fusión).

(iv) Adyuvantes

En algunos modos de realización, la vacuna de la invención comprende uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Un gran número de adyuvantes se han descrito y son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EE. UU. 1985) y The United States Pharmacopoeia: The National Formulary (USP 24 NF19) publicada en 1999.

Los adyuvantes ejemplares incluyen, sin limitación, alumbre, otros compuestos de aluminio, bacilo de Calmette y Guerin (BCG), TiterMax™, Ribi™, adyuvante completo de Freund (FCA), oligodesoxinucleótidos que contienen CpG (CpG ODN), lipopéptidos y polinucleótidos poli l:C. Un CpG ODN ejemplar es 5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO: 14). El experto puede seleccionar fácilmente otros CpG ODN apropiados en base a la especie diana y la eficacia. Un lipopéptido ejemplar incluye, sin limitación, Pam3Cys-SKKK (EMC Microcollections, Alemania) o variantes, homólogos y análogos de los mismos. La familia Pam2 de lipopéptidos ha mostrado ser una alternativa eficaz a la familia Pam3 de lipopéptidos.

En un modo de realización particular, la vacuna comprende un polinucleótido poli l:C como adyuvante, tal como, por ejemplo, y sin limitación, un polinucleótido sintético de desoxiinosina/citoxina de 26 meros.

Como se usa en el presente documento, un “poli l:C” o “polinucleótido poli l:C” es una molécula de polinucleótido bicatenaria (ARN o ADN o una combinación de ADN y RNA), de la que cada hebra contiene al menos 6 residuos de ácido inosínico o citidílico contiguos, o 6 residuos contiguos seleccionados de ácido inosínico y ácido citidílico en cualquier orden (por ejemplo IICIIC, ICICIC o IIICCC), y que puede inducir o potenciar la producción de al menos una citocina inflamatoria, tal como interferón, en un sujeto mamífero. Los polinucleótidos poli l:C tendrán típicamente una longitud de aproximadamente 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1000 o más residuos. El límite superior no se cree que sea esencial. Los polinucleótidos poli l:C preferentes pueden tener una longitud mínima de aproximadamente 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 o 30 nucleótidos y una longitud máxima de aproximadamente 1000, 500, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45 o 40 nucleótidos.

Cada hebra de un polinucleótido poli l:C puede ser un homopolímero de residuos de ácido inosínico o citidílico, o cada hebra puede ser un heteropolímero que contiene ambos residuos de ácido inosínico y citidílico. En cualquier caso, el polímero puede estar interrumpido por uno o más residuos de ácido distinto de inosínico o distinto de citidílico (por ejemplo uridina), siempre que haya al menos una región contigua de 6 residuos de I, 6 de C o 6 de l/C como se describe anteriormente. Típicamente, cada hebra de un polinucleótido poli l:C contendrá no más de 1 residuo distinto de l/C por 6 residuos de l/C, más preferentemente, no más de 1 residuo distinto de l/C por cada 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 o 30 residuos de l/C.

Los residuos de ácido inosínico o ácido citidílico (u otros) en el polinucleótido poli l:C se pueden derivatizar o modificar como es conocido en la técnica, siempre que se conserve la capacidad del polinucleótido poli l:C para promover la producción de una citocina inflamatoria, tal como interferón. Los ejemplos no limitantes de derivados o modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de azido, modificaciones de flúor o el uso enlaces tioéster (o similares) en lugar de enlaces fosfodiéster naturales para potenciar la estabilidad in vivo. El polinucleótido poli l:C también se puede modificar para, por ejemplo, potenciar su resistencia a la degradación in vivo, por ejemplo, complejando la molécula con polilisina y carboximetilcelulosa cargadas positivamente, o con un péptido sintético cargado positivamente.

El polinucleótido poli l:C se incluirá típicamente en la composiciones de la invención en una cantidad de desde aproximadamente 0,001 mg a 1 mg por dosis unitaria de la composición. En determinados modos de realización, la cantidad de polinucleótido poli l:C será de aproximadamente 0,04 mg/ml de la composición de vacuna.

Otros adyuvantes adecuados de la vacuna son los que activan o incrementan la actividad de TLR2. Como se usa en el presente documento, un adyuvante que “activa” o “ incrementa la actividad” de un TLR incluye cualquier adyuvante, en algunos modos de realización un adyuvante a base de lípidos, que actúa como agonista de TLR. Además, activar o incrementar la actividad de TLR2 engloba su activación en cualquier forma monomérica, homodimérica o heterodimérica, y en particular incluye la activación de TLR2 como un heterodímero con TLR1 o TLR6 (es decir TLR1/2 o TLR2/6).

Un modo de realización ejemplar de un adyuvante que activa o incrementa la actividad de TLR2 es un adyuvante a base de lípidos que comprende al menos un resto lipídico o componente lipídico.

Como se usa en el presente documento, la expresión “resto lipídico” o “componente lipídico” se refiere a cualquier ácido graso (por ejemplo, acilos grasos) o derivado del mismo, incluyendo, por ejemplo, triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos. Los ácidos grasos ejemplares incluyen, sin limitación, grupos palmitoílo, miristoílo, estearoílo y decanoílo o cualquier grupo acilo graso saturado o insaturado C2 a C30, preferentemente cualquier grupo acilo graso saturado o insaturado C14 a C22, y más preferentemente un grupo acilo graso saturado o insaturado C16. Por tanto, tal como se denomina en el presente documento, la expresión “adyuvante basado en lípidos” engloba cualquier adyuvante que comprende un grupo acilo graso o derivado del mismo.

Los adyuvantes basados en lípidos contienen un mínimo de al menos un resto lipídico, o un análogo de resto lipídico sintético/semisintético, que se puede acoplar sobre un aminoácido, un oligopéptido u otras moléculas (por ejemplo un hidrato de carbono, un glucano, un polisacárido, biotina, rodamina, etc.). Por tanto, sin limitación, el adyuvante basado en lípidos puede ser, por ejemplo, un lipoaminoácido, un lipopéptido, un lipoglucano, un lipopolisacárido o un ácido lipoteicoico. Además, un resto lipídico o estructura que contiene un resto lipídico se puede acoplar covalente o no covalentemente a un antígeno para crear compuestos antigénicos con propiedades adyuvantes incorporadas. Por ejemplo, y sin limitación, el resto basado en lípidos puede comprender un catión (por ejemplo, níquel) para proporcionar una carga positiva para el acoplamiento no covalente.

En algunos modos de realización, el resto lipídico o componente lipídico se puede producir de manera natural, tal como, por ejemplo, un componente de la pared celular (por ejemplo, lipoproteína) de una bacteria grampositiva o gramnegativa, Rhodopseudomonas viridis, o micoplasma. En otros modos de realización, el resto lipídico o componente lipídico puede ser sintético o semisintético.

El adyuvante basado en lípidos puede comprender ácido palmítico (PAM) como al menos unos de los componentes o restos lipídicos del adyuvante. Dichos adyuvantes basados en lípidos se denominan en el presente documento “adyuvante de ácido palmítico”. El ácido palmítico es un lípido de bajo peso molecular encontrado en la lipoproteína de Braun inmunológicamente reactiva de Escherichia coli. Otros nombres químicos comunes para el ácido palmítico incluyen, por ejemplo, ácido hexadecanoico en la nomenclatura de la IUPAC y ácido 1-pentadecanocarboxílico. La fórmula molecular del ácido palmítico es CH³(CH²)-mCO²H. Como se entenderá por los expertos en la técnica, es posible que la cadena lipídica del ácido palmítico se pueda alterar. Los compuestos ejemplares que se pueden usar en el presente documento como adyuvantes de ácido palmítico, y procedimientos para su síntesis, se describen, por ejemplo, en las publicaciones de patente de Estados Unidos US 2008/0233143; US 2010/0129385; y US 2011/0200632.

Como se describe anteriormente para restos lipídicos en general, un adyuvante de ácido palmítico contiene como mínimo al menos un resto ácido palmítico, que se puede acoplar sobre un aminoácido, un oligopéptido u otras moléculas. Un resto ácido palmítico o una estructura que contiene ácido palmítico se puede acoplar covalente o no covalentemente a un antígeno para crear compuestos antigénicos con propiedades adyuvantes incorporadas. El resto ácido palmítico o una estructura química que contiene ácido palmítico se puede conjugar con un péptido de cisteína (Cys) para permitir diversas configuraciones estructurales del adyuvante, incluyendo estructuras lineales y ramificadas. El residuo de cisteína se ha extendido comúnmente por residuos polares tales como serina (Ser) y/ o lisina (Lys) en el extremo C para crear compuestos adyuvantes con solubilidad mejorada. Los compuestos adyuvantes que contienen ácido palmítico se podrían mezclar con un antígeno, asociar con un antígeno a través de interacciones no covalentes o de forma alternativa enlazar covalentemente a un antígeno, directamente o bien con el uso de un conector/espaciador, para generar respuestas inmunitarias potenciadas. Lo más comúnmente, se fijan dos restos ácido palmítico a una estructura principal de glicerilo y un residuo de cisteína para crear dipalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAM²Cys) o tripalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAMaCys), que se pueden usar también en múltiples configuraciones como se describe anteriormente.

Por lo tanto, en un modo de realización, el adyuvante de la composición puede comprender un resto o componente de ácido palmítico. El resto ácido palmítico se puede modificar o manipular para mejorar su estabilidad in vitro o in vivo, potenciar su unión a receptores (tales como, por ejemplo, receptores de tipo toll tal como se describe a continuación) o potenciar su actividad biológica.

En un modo de realización particular, el adyuvante de ácido palmítico puede comprender PAIVhCys o PAMaCys. En otro modo de realización particular, el adyuvante de ácido palmítico puede ser Pam-2-Cys-Ser-(Lys)4 o Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4. Dichos adyuvantes de ácido palmítico están disponibles, por ejemplo, como reactivos de investigación en EMC Microcollections GmbH (Alemania) e InvivoGen (San Diego, California, EE. UU.). También están disponibles en EMC Microcollections diversos análogos de Pam-2-Cys-Ser-(Lys)4 y Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4, incluyendo análogos marcados.

La composición de la invención puede comprender un adyuvante como se describe anteriormente en combinación con al menos otro adyuvante adecuado. Los modos de realización ejemplares del al menos otro adyuvante engloban, pero de ningún modo se limitan a, compuestos orgánicos e inorgánicos, polímeros, proteínas, péptidos, azúcares de fuentes sintéticas, no biológicas o biológicas (incluyendo pero sin limitarse a virosomas, partículas similivíricas, virus y bacterias de sus componentes).

Otros ejemplos de adyuvantes compatibles pueden incluir, sin limitación, quimiocinas, agonistas de receptores de tipo Toll, factores estimulantes de colonias, citocinas, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS04, AS15, ABM2, Adjumer, Algammulin, AS01B, AS02 (SBASA), ASO2A, BCG, calcitriol, quitosano, toxina del cólera, CP-870,893, CpG, poli IC, CyaA, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), ftalato de dibutilo (DBP), dSLIM, gamma inulina, GM-CSF, GMDP, glicerol, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISCOM, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, LPS, proteína central lipídica, MF59, monofosforil lípido A, Montanide® IMS1312, adyuvantes a base de Montanide®, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, sistema de vector PepTel, otras moléculas a base de palmitoílo, micropartículas de PLG, resiquimod, escualeno, SLR172, YF-17 DBCG, QS21, QuilA, P1005, poloxámero, saponina, polinucleótidos sintéticos, zimosano, toxina tosferínica.

En consecuencia, la composición puede comprender uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables. En algunos modos de realización, al menos uno del uno o más antígenos de survivina o el antígeno adicional se puede acoplar a al menos uno de los adyuvantes.

La cantidad de adyuvante usado depende de la cantidad de antígeno y del tipo de adyuvante. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de adyuvante necesaria en una aplicación particular por pruebas empíricas.

(v) Liposomas

En algunos modos de realización, la vacuna de la invención comprende liposomas. En un modo de realización particular, se incluyen liposomas cuando las composiciones de vacuna comprenden un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba como se describe en el presente documento.

Los liposomas representan un modo de realización particular de un sistema adyuvante englobado por la presente invención. Sin embargo, las vacunas de la invención pueden no incluir liposomas. Más bien, en otros modos de realización de las vacunas, los uno o más antígenos de survivina se pueden combinar con cualquier adyuvante adecuado para la administración del antígeno de survivina a un sujeto.

Los liposomas son membranas de bicapa lipídica completamente cerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los liposomas pueden ser vesículas unilamelares (que poseen una única membrana bicapa) o vesículas multilamelares caracterizadas por bicapas de múltiples membranas, cada bicapa puede estar o no separada de la siguiente por una capa acuosa. Se puede encontrar un análisis general de los liposomas en Gregoriadis G. Immunol. Today, 11:89-97, 1990; y Frezard, F., Braz. J. Med. Bio. Res., 32:181-189, 1999. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, el término “liposomas” pretende englobar todas de tales estructuras vesiculares como se describe anteriormente, incluyendo, sin limitación, las descritas en la técnica como “niosomas”, “transferosomas” y “virosomas”.

Aunque se puede usar cualquier liposoma en la presente invención, incluyendo liposomas preparados a partir de lípidos de arqueobacterias, los liposomas en particular útiles usan fosfolípidos y colesterol no esterificado en la formulación de liposoma. El colesterol se usa para estabilizar los liposomas y cualquier otro compuesto que estabilice los liposomas puede reemplazar al colesterol. Otros compuestos estabilizantes de liposomas son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fosfolípidos saturados producen liposomas con mayores temperaturas de transición indicando estabilidad incrementada.

Los fosfolípidos que se usan preferentemente en la preparación de liposomas son aquellos con al menos un grupo de cabeza seleccionado del grupo que consiste en fosfoglicerol, fosfoetanolamina, fosfoserina, fosfocolina (por ejemplo DOPC; 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) y fosfoinositol. Son más preferentes liposomas que comprenden lípidos que son un 94-100 % de fosfatidiIcolina. Dichos lípidos están disponibles comercialmente en la lecitina Fosfolipon® 90 G. Cuando se usa también colesterol no esterificado en la formulación de liposomas, el colesterol se usa en una cantidad equivalente a aproximadamente un 10 % del peso del fosfolípido. Si se usa un compuesto distinto de colesterol para estabilizar los liposomas, un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad necesaria en la composición.

Se pueden obtener composiciones de liposomas, por ejemplo, usando lípidos naturales, lípidos sintéticos, esfingolípidos, lípidos de éteres, esteroles, cardiolipina, lípidos catiónicos y lípidos modificados con poli(etilenglicol) y otros polímeros. Los lípidos sintéticos pueden incluir los siguientes constituyentes de ácido graso; lauroílo, miristoílo, palmitoílo, estearoílo, araquidoílo, oleoílo, linoleoílo, erucoílo o combinaciones de estos ácidos grasos.

(vi) Vehículos

En algunos modos de realización, la vacuna de la invención comprende un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, un vehículo farmacéuticamente aceptable se refiere a cualquier sustancia adecuada para administrar una composición de vacuna de la invención, y que es útil en la presente invención.

Son bien conocidos en la técnica vehículos que se pueden usar con las vacunas de la invención, e incluyen, pero de ningún modo se limitan a, por ejemplo, agua, solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, disoluciones que contienen suero, disolución de Hank, otras disoluciones acuosas fisiológicamente equilibradas, emulsiones de aceite en agua, aceites, emulsiones de agua en aceite, ésteres, poli(etileno-acetato de vinilo), copolímeros de ácido láctico y ácido glucólico, poli(ácido láctico), gelatina, matrices de colágeno, polisacáridos, poli(D,L lactida}, poli(ácido málico), poli(caprolactona), celulosas, albúmina, almidón, caseína, dextrano, poliésteres, etanol, metacrilato, poliuretano, polietileno, polímeros de vinilo, glucoles, tiroglobulina, albúminas tales como seroalbúmina bovina, toxoide tetánico, poliaminoácidos tales como poli-L-lisina, poli-ácido L-glutámico, gripe, proteína central del virus de la hepatitis B, mezclas de los mismos y similares. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 2000, Gennaro, A R ed., Eaton, Pa.: Mack Publishing Co.

En un modo de realización particular, el vehículo de la composición de vacuna es un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, preferentemente una sustancia hidrófoba líquida. La fase continua puede ser una sustancia hidrófoba esencialmente pura o una mezcla de sustancias hidrófobas. Además, el vehículo puede ser una emulsión de agua en una sustancia hidrófoba o una emulsión de agua en una mezcla de sustancia hidrófobas, siempre que la sustancia hidrófoba constituya la fase continua. Además, en otro modo de realización, el vehículo puede funcionar como adyuvante.

Las sustancias hidrófobas que son útiles en las composiciones como se describe en el presente documento son las que son farmacéutica y/o inmunológicamente aceptables. El vehículo es preferentemente un líquido pero determinadas sustancias hidrófobas que no son líquidas a temperatura atmosférica se pueden licuar, por ejemplo por calentamiento, y son también útiles en la presente invención. En un modo de realización, el vehículo hidrófobo puede ser una emulsión de solución salina tamponada con fosfato/adyuvante incompleto de Freund (PBS/FIA).

Las emulsiones de aceite o de agua en aceite son vehículos en particular adecuados para su uso en la composición de vacuna de la invención. Los aceites deben ser farmacéutica y/o inmunológicamente aceptables. Los aceites adecuados incluyen, por ejemplo, aceites de vaselina (especialmente aceite de vaselina fluido o de baja viscosidad tal como Drakeol® 6VR), aceites vegetales (por ejemplo, aceite de soja), aceites de nueces (por ejemplo, aceite de cacahuete), o mezclas de los mismos. Por tanto, en un modo de realización particular el vehículo es una sustancia hidrófoba tal como aceite vegetal, aceite de nueces o aceite de vaselina. También se pueden usar grasas animales y materiales poliméricos hidrófobos artificiales, en particular los que son líquidos a temperatura atmosférica o que se pueden licuar de manera relativamente fácil.

Para potenciar la inmunogenicidad de vacunas contra el cáncer, Immunovaccine Inc. ha desarrollado una plataforma de vacuna adyuvante diseñada para facilitar una respuesta inmunitaria fuerte y sólida a antígenos peptídicos. DepoVax™ (DPX) es una formulación de liposoma en aceite, que incluye un adyuvante de TLR y péptido universal de linfocitos T cooperadores, que se puede formular con cualquier epítopo, o mezcla de epítopos, para inducir una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T citotóxicos (Karkada et al., J Immunother 33(3):250-261, 2010) y/o una respuesta inmunitaria humoral. DPX forma un depósito fuerte en el sitio de inmunización que prolonga la exposición del antígeno al sistema inmunitario.

Se ha mostrado que una única vacunación con péptidos en DPX da como resultado respuestas inmunitarias equivalentes o mejores que múltiples vacunaciones con péptidos en otras formulaciones convencionales, tales como emulsiones de Montanide ISA51 VG, similar a VacciMax que era una plataforma de vacuna basada en emulsión de primera generación (Daftarian et al., J Transl Med 5: 26, 2007; Mansour et al., J Transl Med 5: 20, 2007). Una vacuna de péptidos basada en DepoVax™ denominada DPX-0907 ha completado recientemente un ensayo clínico de fase I en pacientes con cáncer de mama, ovario y próstata demostrando seguridad e inmunogenicidad en estos pacientes avanzados (Berinstein et al., J Transl Med 10(1): 156, 2012).

Por tanto, en un modo de realización particular, el vehículo de la vacuna de la invención puede ser el sistema adyuvante basado en liposomas de Immunovaccine, Inc. A diferencia de vacunas basadas en emulsión de agua en aceite, que depende de que el aceite atrape gotitas de agua que contienen antígeno y adyuvante, las formulaciones basadas en DepoVax™ dependen de liposomas para facilitar la incorporación de antígenos y adyuvantes directamente en el aceite, sin la necesidad de emulsificación. Las ventajas de este enfoque incluyen: (1) potenciación de la solubilidad de antígenos hidrófilos/adyuvante en diluyentes oleosos que de otro modo tendrían normalmente una solubilidad máxima en diluyentes de base acuosa, y (2) la eliminación de procedimientos de emulsificación engorrosos antes de la administración de la vacuna.

En un modo de realización preferente, el vehículo es aceite de vaselina o es un oleato de manida en solución de aceite de vaselina, tal como el disponible comercialmente como Montanide® ISA 51 (SEPPIC, Francia).

En determinados modos de realización, las composiciones pueden estar sustancialmente libres de agua (por ejemplo, “sin agua”). Es posible que el vehículo hidrófobo de estas composiciones “sin agua” pueda contener todavía pequeñas cantidades de agua, siempre que el agua esté presente en la fase no continua del vehículo. Por ejemplo, componentes individuales de la composición pueden tener agua unida que puede no retirarse completamente por procedimientos tales como liofilización o evaporación y determinados vehículos hidrófobos pueden contener pequeñas cantidades de agua disuelta en los mismos. En general, las composiciones de la invención que son “sin agua” contienen, por ejemplo, menos de aproximadamente un 10 %, un 9 %, un 8 %, un 7 %, un 6 %, un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 %, un 1 %, un 0,5 %, un 0,1 %, un 0,05 % o un 0,01 % de agua en una base de peso/peso del peso total del componente vehículo de la composición.

Procedimientos de preparación de composiciones de vacuna ejemplares

En un modo de realización particular, la composición de vacuna de la invención es una que comprende al menos un antígeno de survivina, liposomas y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.

Los procedimientos para preparar liposomas son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Gregoriadis (1990) y Frezard (1999), ambos citados previamente. Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para preparar liposomas en la práctica de la invención, o se pueden obtener liposomas de una fuente comercial. Los liposomas se preparan típicamente hidratando los componentes de liposomas que formarán la bicapa lipídica (por ejemplo, fosfolípidos y colesterol) con una solución acuosa, que puede ser agua pura o una solución de uno o más componentes disueltos en agua, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina sin fosfato o cualquier otra solución acuosa fisiológicamente compatible.

En un modo de realización, se puede solubilizar un componente de liposomas o mezcla de componentes de liposomas, tales como un fosfolípido (por ejemplo Fosfolipon® 90G) o DOPC y colesterol, en un disolvente orgánico, tal como una mezcla de cloroformo y metanol, seguido de filtración (por ejemplo, un filtro de PTFE de 0,2 |jm) y secado, por ejemplo por evaporación rotatoria, para retirar los disolventes.

La hidratación de la mezcla de lípidos resultante se puede efectuar, por ejemplo, inyectando la mezcla de lípidos en una solución acuosa o sometiendo a ultrasonido la mezcla de lípidos y una solución acuosa. Durante la formación de liposomas, los componentes de liposomas forman bicapas individuales (unilamelares) o bicapas múltiples (multilamelares) que rodean un volumen de la solución acuosa con la que los componentes de liposomas se hidratan.

En algunos modos de realización, los liposomas se deshidratan a continuación, tal como por secado por congelación o liofilización.

Los liposomas se combinan con un vehículo apropiado, tal como un vehículo que comprende una fase hidrófoba continua. Esto se puede realizar de una variedad de modos.

Si el vehículo se compone únicamente de una sustancia hidrófoba o una mezcla de sustancias hidrófobas (por ejemplo, uso de un vehículo de aceite mineral al 100 %), los liposomas se pueden simplemente mezclar con la sustancia hidrófoba, o si existen múltiples sustancias hidrófobas, mezclar con una cualquiera o una combinación de las mismas.

Si en su lugar el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba contiene una fase acuosa discontinua, el vehículo adoptará típicamente la forma de una emulsión de la fase acuosa en la fase hidrófoba, tal como una emulsión de agua en aceite. Dichas composiciones pueden contener un emulsionante para estabilizar la emulsión y para promover una distribución uniforme de los liposomas. En este sentido, los emulsionantes pueden ser útiles incluso si se usa un vehículo sin agua, con el propósito de promover una distribución uniforme de los liposomas en el vehículo. Los emulsionantes típicos incluyen oleato de manida (Arlacel™ A), lecitina (por ejemplo, lecitina S100), un fosfolípido, Tween™ 80 y Spans™ 20, 80, 83 y 85. Típicamente, la proporción en volumen (v/v) de sustancia hidrófoba con respecto a emulsionante está en el intervalo de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1 siendo preferente una proporción de aproximadamente 10:1.

Los liposomas se pueden añadir a la emulsión terminada, o pueden estar presentes en la fase acuosa o bien la fase hidrófoba antes de la emulsificación.

El/los antígeno(s) de survivina o un antígeno adicional como se describe en el presente documento se puede(n) introducir en diversas fases diferentes del procedimiento de formulación. Se puede incorporar más de un tipo antígeno en la composición. Como se usa en esta sección, el término “antígeno” se usa en general y se puede referir a un antígeno de survivina como se describe en el presente documento, a uno o más antígenos de survivina, a un antígeno adicional como se describe en el presente documento o a uno o más antígenos adicionales, o cualquier combinación de los mismos. El término se usa en general para describir cómo cualquier antígeno se puede formular en las composiciones de vacuna de la invención. El término “antígeno” engloba tanto la forma singular “antígeno” como el plural “antígenos”. No es necesario que todos los antígenos se introduzcan en la composición de vacuna del mismo modo.

En algunos modos de realización, el antígeno está presente en la solución acuosa usada para hidratar los componentes que se usan para formar las bicapas lipídicas de los liposomas (por ejemplo fosfolípido(s) y colesterol). En este caso, el antígeno se encapsulará en el liposoma, presente en su interior acuoso. Si los liposomas resultantes no se lavan ni se secan, de modo que hay solución acuosa residual presente que se mezcla en última instancia con el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, es posible que pueda estar presente antígeno adicional fuera de los liposomas en el producto final. En una técnica relacionada, el antígeno se puede mezclar con los componentes usados para formar las bicapas lipídicas de los liposomas, antes de la hidratación con la disolución acuosa. El antígeno se puede añadir también a liposomas preformados, en este caso el antígeno se puede cargar activamente en los liposomas, o unir a la superficie de los liposomas o el antígeno puede permanecer externo a los liposomas. En dichos modos de realización, antes de la adición de antígeno, los liposomas preformados pueden ser liposomas vacíos (por ejemplo, que no contienen antígeno encapsulado o adyuvante a base de lípidos) o los liposomas preformados pueden contener adyuvante a base de lípidos incorporado en o asociado con los liposomas. Estas etapas se pueden producir preferentemente antes del mezclado con el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.

En un enfoque alternativo, el antígeno se puede mezclar en su lugar con el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, antes, durante o después de que el vehículo se combine con los liposomas. Si el vehículo es una emulsión, el antígeno se puede mezclar con cualquiera o ambas de la fase acuosa o fase hidrófoba antes de la emulsificación. De forma alternativa, el antígeno se puede mezclar con el vehículo después de la emulsificación.

La técnica de combinar el antígeno con el vehículo se puede usar conjuntamente con la encapsulación del antígeno en los liposomas como se describe anteriormente, de modo que el antígeno está presente tanto dentro de los liposomas como en el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.

Los procedimientos descritos anteriormente para introducir el antígeno en la composición se aplican también al epítopo de linfocitos T cooperadores y/o al adyuvante de las composiciones como se describe en el presente documento, en modos de realización en los que se incluyen. Es decir, el epítopo de linfocitos T cooperadores y/o adyuvante se pueden introducir en, por ejemplo, uno o más de: (1) la solución acuosa usada para hidratar los componentes que se usan para formar las bicapas lipídicas de los liposomas; (2) la solución acuosa después de la formación de las bicapas lipídicas de los liposomas; (3) los componentes usados para formar las bicapas lipídicas de los liposomas; o (4) el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, antes, durante o después de que el vehículo se combine con los liposomas. Si el vehículo es una emulsión, el epítopo de linfocitos T cooperadores y/o adyuvante se puede mezclar con cualquiera o ambos de la fase acuosa o fase hidrófoba antes, durante o después de la emulsificación.

La técnica de combinar el epítopo de linfocitos T cooperadores y/o adyuvante con el vehículo se puede usar conjuntamente con la encapsulación de estos componentes en los liposomas, o con la adición de estos componentes a los liposomas, de modo que el epítopo de linfocitos T cooperadores y/o adyuvante esté presente dentro y/o fuera de los liposomas y en el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.

El epítopo de linfocitos T cooperadores y/o adyuvante se puede incorporar en la composición conjuntamente con el antígeno en la misma etapa de procesamiento, o por separado, en una etapa de procesamiento diferente. Por ejemplo, el antígeno, epítopo de linfocitos T cooperadores y adyuvante pueden estar todos presentes en la solución acuosa usada para hidratar los componentes de liposomas que forman la bicapa lipídica, de modo que los tres componentes quedan encapsulados en los liposomas. De forma alternativa, el antígeno y el epítopo de linfocitos T cooperadores se pueden encapsular en los liposomas, y el adyuvante mezclar con el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba. En otro modo de realización, el epítopo de linfocitos T cooperadores y/o adyuvante se puede incorporar en la composición después de la etapa de encapsulación del antígeno haciendo pasar la preparación de liposoma-antígeno a través de una miniextrusora manual y a continuación mezclando la preparación de liposoma-antígeno obtenida con el adyuvante a base de lípidos en, por ejemplo, tampón fosfato. El epítopo de linfocitos T cooperadores y/o adyuvante se puede incorporar también en la composición, solo o bien conjuntamente con antígeno, después de que se hayan formado los liposomas, de modo que el epítopo de linfocitos T cooperadores y adyuvante se puede asociar o permanece externo a los liposomas. El epítopo de linfocitos T cooperadores y/o adyuvante se puede incorporar también en o asociar con liposomas antes de la adición del antígeno, permaneciendo el antígeno fuera de los liposomas preformados o cargado en/asociado con los liposomas por procesamiento adicional. En dichos modos de realización, la preparación resultante se puede liofilizar y a continuación reconstituir en el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba. Se apreciará que son posibles muchas de dichas combinaciones.

En un modo de realización particular, la vacuna de la invención es DPX-Survivac. Un procedimiento ejemplar para preparar DPX-Survivac sigue. Sin embargo, se apreciará que también se engloban modos de realización alternativas en el presente documento, tales como las descritas anteriormente donde el antígeno, adyuvante y epítopo de linfocitos T cooperadores se pueden introducir en cualquier fase en la formulación de la vacuna, en cualquier orden y en última instancia se pueden encontrar dentro, fuera o tanto dentro como fuera de los liposomas.

Para preparar DPX-Survivac, en un procedimiento ejemplar, se forma un complejo con los cinco antígenos de survivina (SEQ ID No: 2, 4, 6, 7 y 8); adyuvante (polinucleótido poli l:C) y liposomas (DOPC y colesterol) en un tampón acuoso por un procedimiento de mezclado e hidratando los componentes lipídicos en presencia de los antígenos de survivina y adyuvante, se extruye para lograr un tamaño de partícula que se puede esterilizar por filtración, a continuación se carga en viales y se liofiliza hasta dar una torta seca. La torta seca se resuspende a continuación en el vehículo hidrófobo Montanide ISA51 VG antes de su inyección. Este procedimiento ejemplar de preparación se puede usar con cualquier combinación de antígenos de survivina, cualquier adyuvante adecuado y cualquier epítopo de linfocitos T cooperadores adecuado.

Si la composición contiene uno o más adyuvantes adicionales, dichos adyuvantes adicionales se pueden incorporar en la composición de un modo similar a como se describe anteriormente para el adyuvante o combinando varios de dichos procedimientos como puede ser adecuado para el/los adyuvante(s) adicional(es).

Se pueden añadir a dichas composiciones estabilizadores tales como azúcares, antioxidantes o conservantes que mantienen la actividad biológica o mejoran la estabilidad química para prolongar la vida útil de almacenamiento del antígeno, adyuvante, los liposomas o el vehículo hidrófobo continuo.

En algunos modos de realización, se puede usar una mezcla de antígeno/adyuvante, en este caso el antígeno y adyuvante se incorporan en la composición al mismo tiempo. Una “mezcla de antígeno/adyuvante” se refiere a un modo de realización en el que el antígeno y adyuvante están en el mismo diluyente al menos antes de su incorporación en la composición. El antígeno y adyuvante en una mezcla de antígeno/adyuvante pueden estar, aunque no necesariamente, enlazados químicamente, tal como por enlaces covalentes.

En algunos modos de realización, el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba puede tener por sí mismo actividad adyuvante. El adyuvante incompleto de Freund y Montanide® ISA 51 VG, son ejemplos de un vehículo hidrófobo con efecto adyuvante. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, cuando se usa el término “adyuvante”, pretende indicar la presencia de un adyuvante además de cualquier actividad adyuvante proporcionada por el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.

Modo de administración

El alcance de la invención comprende la administración combinada de un agente que interfiere con la replicación del ADN y una vacuna que comprende al menos un antígeno de survivina.

Para mejorar la eficacia de la vacuna, modos de realización de la invención comprenden la administración de al menos dos dosis del agente que interfiere con la replicación del ADN antes de la primera administración de la vacuna. Junto con estos modos de realización, el agente se puede administrar adicionalmente al sujeto en cualquier otro momento antes, durante o después del transcurso de tratamiento con la vacuna, siempre que se administren al menos dos dosis antes de una primera administración de la vacuna.

Como se usan en el presente documento, los términos “combinación”, “coadministración” o “administración combinada” o similares pretenden englobar la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN y la vacuna a un único paciente, y pretenden incluir casos en los que el agente y la vacuna no se administran necesariamente por la misma vía de administración o al mismo tiempo. Por ejemplo, el agente que interfiere con la replicación del ADN y la vacuna pueden ser para administración separada, secuencial o alterna.

Como se usa en el presente documento, la expresión “al menos dos dosis” pretende englobar cualquier número de dosis que sea mayor de una única dosis. En un modo de realización, las al menos dos dosis incluyen entre 2 50 dosis, más en particular entre 2-28 dosis y más en particular entre 2-14 dosis. En un modo de realización, las al menos dos dosis son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 dosis. Las al menos dos dosis pueden estar separadas por cualquier cantidad de tiempo adecuada. En un modo de realización particular, las al menos dos dosis comprenden 2 dosis diariamente durante un periodo de una semana, totalizando 14 dosis.

El agente que interfiere con la replicación del ADN se administra típicamente en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador. Como se usa en el presente documento, la expresión “efecto inmunomodulador” se refiere a la capacidad del agente que interfiere con la replicación del a Dn para alterar (modular) uno o más aspectos del sistema inmunitario y/o células del sistema inmunitario. En un modo de realización, la “cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador” es una cantidad del agente que pueden afectar selectivamente a la replicación del ADN en células del sistema inmunitario. Por ejemplo, la cantidad de agente puede ser una cantidad suficiente para seleccionar selectivamente células que se dividen rápidamente del sistema inmunitario para provocar muerte celular programada. Esta cantidad también se puede describir como una dosis que “no es quimioterápica”, como se define en el presente documento.

La “cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador” se puede denominar de manera intercambiable en el presente documento cantidad de “dosis baja”. Por tanto, la invención implica preferentemente el uso de una dosis baja de un agente que interfiere con la replicación del ADN en combinación con la vacuna. Cuando está relacionada con un modo de realización particular de la invención donde el agente que interfiere con la replicación del ADN es el agente alquilante ciclofosfamida, la expresión “dosis baja” se refiere típicamente a una dosis de ciclofosfamida que es menor de 300 mg/m2, tal como, por ejemplo, 100-300 mg/m2 En cuanto a administración diaria, una “dosis baja” de ciclofosfamida está típicamente entre aproximadamente 25-300 mg/día, y preferentemente 50-150 mg/día. Una cantidad de dosificación diaria en particular adecuada es de 100 mg de ciclofosfamida. También es en particular adecuado administrar aproximadamente 50 mg de ciclofosfamida por dosis. Las cantidades de “dosis baja” de otros agentes que interfieren con la replicación del ADN, como se engloba en el presente documento, serán conocidas por los expertos en la técnica, o se podrían determinar por la experiencia de rutina.

Los procedimientos de la invención implican administrar al menos dos dosis de un agente que interfiere con la replicación del ADN, y a continuación, posteriormente administrar una vacuna de la invención. Por “administrar posteriormente”, se quiere decir que la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN comienza antes de la primera administración de la vacuna (por ejemplo, se administran al menos dos dosis de agente al sujeto antes de la vacuna). Sin embargo, como se describe en el presente documento, la administración al sujeto de agente que interfiere con la replicación del ADN puede continuar después de que comienza la administración de la vacuna. En modos de realización alternativos, la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN se detiene antes de la primera administración de la vacuna.

En la invención, la primera dosis de un agente que interfiere con la replicación del ADN precede a cualquier tratamiento del sujeto con la vacuna. En un modo de realización, la cantidad mínima de tiempo que separa la primera administración del agente que interfiere con la replicación del ADN y la primera administración de la vacuna puede ser cualquier cantidad de tiempo suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador. Como apreciará el experto, la cantidad de tiempo suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador puede depender de muchas variables y puede no ser la misma para pacientes individuales.

En algunos modos de realización, la primera dosis de un agente que interfiere con la replicación del ADN se administra al menos 12 horas antes de la primera administración de la vacuna, y preferentemente al menos dos, cuatro o seis días antes de la primera vacunación. En otro modo de realización, la primera dosis del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede proporcionar aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días, o más, antes de la primera administración de la vacuna. En un modo de realización particular, la primera administración del agente que interfiere con la replicación del ADN se produce 1-4 días antes de la primera administración de la vacuna. Una primera administración del agente que interfiere con la replicación del ADN aproximadamente una semana antes de la primera administración de la vacuna es en particular adecuada.

Después de la primera dosis con el agente que interfiere con la replicación del ADN, las dosis posteriores se pueden administrarse a cualquier intervalo de tiempo deseado entre dosis, siempre que se administren al menos dos dosis del agente antes de la primera administración de la vacuna. La dosificación con el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede detener antes, durante o después del transcurso del tratamiento con la vacuna.

En un modo de realización, la primera dosis va seguida de una o más dosis de mantenimiento. Como se usa en el presente documento, el término “dosis de mantenimiento” pretende englobar una dosis del agente que interfiere con la replicación del ADN que se administra en un intervalo y/o cantidad tal como para mantener una cantidad suficiente del agente, y/o sus metabolitos activos, en el cuerpo del sujeto (por ejemplo, evitar el aclaramiento general total del mismo del agente y/o sus metabolitos activos). Al proporcionar una dosis de mantenimiento, puede ser posible prolongar y/o mantener el efecto inmunomodulador del agente que interfiere con la replicación del ADN durante un periodo de tiempo prolongado antes, durante y/o después del transcurso de la administración con la vacuna.

En un modo de realización, para mantener el efecto inmunomodulador, el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar 1, 2, 3, 4 o 5 veces al día, o más, siempre que se mantenga la administración a dosis baja (por ejemplo, las múltiples dosis más pequeñas se añaden a la dosis baja diaria deseada). Una única dosis (es decir, administración) del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar en un único punto de tiempo, tal como, por ejemplo, una píldora que se traga. De forma alternativa, una única dosis del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar a lo largo de un periodo continuo corto, tal como por ejemplo por goteo intravenoso.

Para modos de realización de la invención donde el agente que interfiere con la replicación del ADN es ciclofosfamida, puede ser apropiado proporcionar una dosis de mantenimiento, por ejemplo, cada 6-18 horas. El experto en la técnica sabría o podría determinar, por experiencia de rutina, el intervalo apropiado para la dosis de mantenimiento de ciclofosfamida, así como para otros agentes que interfieren con la replicación del ADN como se engloba en el presente documento.

En un modo de realización particular, el agente que interfiere con la replicación del ADN se administra durante un periodo de al menos dos días consecutivos antes de la primera administración de la vacuna. En estos días, el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar al sujeto al menos 1,2, 3 o 4 veces al día, o cualquier número deseado de veces para proporcionar la cantidad de dosis baja diaria del agente.

En otro modo de realización, el agente que interfiere con la replicación del ADN se administra durante un periodo de aproximadamente una semana antes de la primera administración de la vacuna. Se pueden proporcionar múltiples dosis durante este periodo de una semana. En modos de realización ejemplares, el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar cada día, cada dos días o a cualquier intervalo adecuado para proporcionar la dosis de mantenimiento descrita. Por ejemplo, un modo de realización particular del procedimiento de la invención comprende administrar el agente dos veces al día durante un periodo de aproximadamente una semana antes de administrar la vacuna.

En la invención, puede haber una interrupción en el tratamiento con el agente que interfiere con la replicación del ADN antes de la primera administración de la vacuna. En dichos modos de realización, la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede detener permanente o temporalmente antes de la primera administración de la vacuna. El periodo de tiempo entre la última dosis del agente que interfiere con la replicación del ADN y la primera dosis de la vacuna puede ser cualquier periodo de tiempo adecuado siempre que el sujeto todavía obtenga un beneficio inmunomodulador del agente. Por ejemplo, y sin limitación, la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede detener al mismo tiempo que se administra la primera dosis de la vacuna o en cualquier momento hasta aproximadamente una semana antes de la primera dosis de la vacuna. Por ejemplo, y sin limitación, la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede detener a las aproximadamente 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 o 72 horas, o más, antes de la primera dosis de la vacuna. En un modo de realización particular, la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN se detiene aproximadamente 2, 4 o 7 días antes de la primera dosis de la vacuna.

En un modo de realización alternativo, el tratamiento del sujeto con el agente que interfiere con la replicación del ADN continúa a lo largo de todo el transcurso del tratamiento con la vacuna, con o sin interrupciones intermitentes en la administración del agente. En otros modos de realización, el tratamiento con el agente que interfiere con la replicación del ADN puede continuar después de que cesa la vacunación.

Por tanto, en un modo de realización, el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar durante el periodo antes de cada administración con la vacuna. De forma alternativa, el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar solo durante el periodo antes de la primera administración con la vacuna.

Como se describe en el presente documento, el tratamiento con el agente que interfiere con la replicación del ADN puede continuar después de la primera administración con la vacuna. En un modo de realización, la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN continúa en una base diaria, con o sin interrupciones intermitentes, a lo largo de todo el transcurso del tratamiento con la vacuna. Por lo tanto, en algunos modos de realización, el agente se administrará antes de y durante el tratamiento con la vacuna. En dichos casos, una vez que comienza la administración de la vacuna, es posible que el agente que interfiere con la replicación del ADN se administre al mismo tiempo que la vacuna, de manera inmediatamente secuencial, o en momentos diferentes en el día. Cuando el agente que interfiere con la replicación del ADN se administra al mismo tiempo que la vacuna, se puede incluir en la composición de vacuna de la invención como una única composición o administrar en una composición separada.

De forma alternativa, la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede suspender durante los días que se administra la vacuna. Por lo tanto, los regímenes de la presente invención pueden incluir interrumpir la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN durante el transcurso de la administración de la vacuna.

Los modos de realización descritos en el presente documento para administrar el agente que interfiere con la replicación del ADN antes de la primera administración de la vacuna se aplican también a la administración del agente después de la primera administración de la vacuna (por ejemplo, antes de cada administración posterior de la vacuna).

Como modo de realización en particular adecuado, la invención comprende el tratamiento metronómico del sujeto con el agente que interfiere con la replicación del ADN. Para propósitos de la presente invención, “tratamiento metronómico”, “pauta posológica metronómica” o “dosificación metronómica” o similar, pretende referirse a una administración frecuente de una cantidad de dosis inferior a la normal del agente que interfiere con la replicación del ADN. Como se usa en el presente documento, el término “cantidad de dosis normal” se puede referir, por ejemplo y sin limitación, a: (i) la dosis tolerada máxima (MTD) establecida o dosis estándar por medio de un programa de dosificación tradicional, o bien (ii) en casos donde se ha establecido una cantidad de inyección intravenosa rápida única a dosis baja para un agente particular que interfiere con la replicación del ADN, que a esa cantidad de dosis baja.

En dosificación metronómica, se puede administrar en última instancia una dosis acumulada igual, menor o mayor a lo largo de un determinado periodo de tiempo que se administraría por medio de un programa de dosificación tradicional. En un modo de realización en particular adecuado, esto se logra prolongando el lapso de tiempo durante el que se lleva a cabo la dosificación y/o incrementando la frecuencia de administraciones, mientras que se disminuye la cantidad administrada en comparación con la cantidad de dosis normal. Por ejemplo, cuando se administra típicamente una cantidad de dosis baja de 300 mg/m2 de un agente que interfiere con la replicación del ADN (por ejemplo por inyección en inyección intravenosa rápida única), una pauta posológica metronómica puede comprender administrar la misma cantidad a lo largo de un periodo de varios días administrando una dosis baja frecuente. Por este enfoque, se puede usar la dosificación metronómica, por ejemplo, para proporcionar la dosis de mantenimiento como se describe en el presente documento.

En un modo de realización de la presente invención, el tratamiento metronómico con el agente que interfiere con la replicación del ADN pretende englobar una administración de dosis baja diaria del agente a lo largo de un determinado periodo de tiempo, tal como, por ejemplo, un periodo de 2, 3, 4, 5, 6 o 7, o más, días consecutivos. Durante estos días de dosificación metronómica, el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede proporcionar a intervalos regulares frecuentes o intervalos variables. Por ejemplo, en un modo de realización, una dosis del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar cada 1,2, 3, 4, 6, 8, 12 o 24 horas. En otro modo de realización, una dosis del agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar cada 2, 3 o 4 días.

En algunos modos de realización de la presente invención, puede haber interrupciones o huecos en los periodos de tratamiento metronómico con el agente que interfiere con la replicación del ADN. De esta manera, el tratamiento metronómico con el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede producir de un modo cíclico, alternando entre periodos con y sin administración. Son en particular adecuados intervalos donde el agente que interfiere con la replicación del ADN se administra al sujeto diariamente en intervalos semanales alternos. Por ejemplo, un periodo de administración de una semana del agente que interfiere con la replicación del ADN va seguido de una suspensión del tratamiento de una semana, y el ciclo se repite.

En un modo de realización por lo tanto, la invención comprende administrar el agente que interfiere con la replicación del ADN al sujeto diariamente durante un periodo de una semana cada dos semanas. En un aspecto particular de este modo de realización, la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN comienza aproximadamente una semana antes de la primera administración de la vacuna.

En lo que se refiere a la vacuna de la invención, en algunos modos de realización puede ser en particular adecuado administrar la vacuna al sujeto en un intervalo de una vez cada semana, una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas, preferentemente una vez cada tres semanas. La frecuencia y duración de la administración de la vacuna se puede ajustar, sin embargo, como se desee para cualquier sujeto dado, y puede ser más o menos frecuente que una vez cada semana, una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. El intervalo entre las administraciones también puede no ser constante durante el transcurso del tratamiento con la vacuna. En la invención, la vacuna se puede administrar al sujeto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. Se entenderá que el tratamiento con la vacuna se puede continuar durante un periodo indefinido dependiendo de cómo está progresando el tratamiento del cáncer en el sujeto.

En un modo de realización de la invención, el agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar como un agente de tratamiento previo durante el periodo intermitente antes de cada administración de la vacuna.

En un modo de realización particular, la invención que comprende la combinación de un agente que interfiere con la replicación del ADN y una vacuna de survivina implicará que la vacuna se administre al sujeto en un intervalo de una vez cada tres semanas (por ejemplo día 0, 21, 42, 63, 84, etc.) comenzando la primera administración el agente que interfiere con la replicación del ADN aproximadamente una semana antes (por ejemplo, día -7) de la primera administración de la vacuna y continuando diariamente (por ejemplo, de manera metronómica) a intervalos semanales alternos. En la figura 1 se muestra un régimen de tratamiento tal como este.

Como apreciará el experto, la frecuencia y duración de la administración del agente que interfiere con la replicación del ADN y la vacuna se pueden ajustar como se desee para cualquier sujeto dado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen, por ejemplo: la naturaleza de los uno o más antígenos de survivina en la vacuna; el tipo de cáncer; la edad, el estado físico, el peso corporal, el sexo y la dieta del sujeto; y otros factores clínicos.

El agente que interfiere con la replicación del ADN se puede administrar por cualquier medio de administración adecuado y cualquier vía de administración adecuada. En un modo de realización, el agente que interfiere con la replicación del a Dn se administra por vía oral, tal como en forma de una píldora, un comprimido o una cápsula. En un modo de realización alternativo, el agente se administra por inyección (por ejemplo, intravenosa). En un modo de realización particular de la invención, el agente es ciclofosfamida y se administra por vía oral.

La vacuna de la invención como se describe en el presente documento se puede formular en una forma que es adecuada para administración oral, nasal, rectal o parenteral. La administración parenteral incluye modos de administración intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intramuscular, transepitelial, intrapulmonar, intratecal y tópica. En modos de realización donde la vacuna se formula como una composición que comprende los uno o más antígenos de survivina, liposomas y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, una vía de administración en particular adecuada puede ser inyección (por ejemplo, intradérmica, intramuscular o subcutánea) para lograr un efecto de depósito en el sitio de inyección. La vacuna y el agente que interfiere con la replicación del ADN no se administran necesariamente por la misma vía de administración o al mismo tiempo.

En un modo de realización particular de la invención, el agente que interfiere con la replicación del ADN es un agente alquilante, tal como, por ejemplo, ciclofosfamida.

Indicaciones de tratamiento

Como se describe en el presente documento, la presente invención se refiere al tratamiento de cáncer. Los cánceres que se pueden tratar y/o prevenir por la invención pueden incluir, por ejemplo, cualquier cáncer que exprese survivina o que sobreexprese survivina en comparación con células normales.

En un modo de realización, los cánceres que se pueden tratar por la invención incluyen, sin limitación, carcinoma, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, sarcoma, blastoma, mieloma y tumores de células germinales. En un modo de realización, el cáncer está en forma de un tumor sólido. Sin limitación, los modos de realización en particular adecuados incluyen glioblastoma, mieloma múltiple, cáncer ovárico, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer peritoneal.

En algunos modos de realización, el sujeto se puede haber sometido a cirugía para retirar un gran volumen del tumor, y la invención se puede aplicar antes y/o después de la extirpación del volumen del tumor. En otros modos de realización, se puede haber administrado al sujeto radioterapia, quimioterapia o algún otro tratamiento no quirúrgico para controlar o destruir células cancerosas o malignas, y la invención se puede aplicar antes de o posteriormente a estos tratamientos. En determinados modos de realización, el cáncer está en un estadio avanzado.

Como se usa en el presente documento, los términos “tumor”, “células tumorales”, “cáncer” y “células cancerosas” (usados de manera intercambiable), se refieren a células que presentan crecimiento anómalo, caracterizadas por una pérdida significativa del control de la proliferación celular o células que se han inmortalizado. El término “cáncer” o “tumor” incluye tumores o cáncer metastásico así como no metastásico. Un cáncer se puede diagnosticar usando criterios en general aceptados en la técnica, incluyendo la presencia de un tumor maligno.

“Tratar” o “tratamiento de”, o “prevenir” o “prevención de”, como se hace referencia en el presente documento se refiere a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o más síntomas o estados, disminución del grado de enfermedad, estabilización del estado de enfermedad, prevención del desarrollo de la enfermedad, prevención de la propagación de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, retraso o ralentización del comienzo de la enfermedad, conferir inmunidad protectora frente a un agente causante de la enfermedad y mejora o alivio del estado patológico. “Tratar” o “prevenir” puede querer decir también prolongar la supervivencia de un paciente más allá de lo esperado en ausencia de tratamiento y puede querer decir también inhibir la progresión de la enfermedad temporalmente, aunque más preferentemente, implica prevenir la aparición de la enfermedad tal como previniendo la infección en un sujeto. “Tratar” o “prevenir” también se puede referir a una reducción en el tamaño de la masa tumoral.

En el tratamiento y/o la prevención del cáncer, la invención se puede usar para “mejorar la eficacia de la vacuna”, como se describe esta expresión en el presente documento. Esto puede implicar mejorar la eficacia de la vacuna en la inducción de cualquiera o ambas de una respuesta inmunitaria mediada por células o una respuesta inmunitaria humoral. Esto puede implicar también reducir la supresión inmunitaria inducida por el tumor.

Como se usa en el presente documento, “que induce” o “inducir” una respuesta inmunitaria es provocar, mejorar y/o potenciar una respuesta inmunitaria. La inducción de una respuesta inmunitaria engloba casos donde la respuesta inmunitaria se potencia, se eleva, se mejora o se fortalece en beneficio del sujeto en relación con el estado de respuesta inmunitaria previo, por ejemplo, antes de la aplicación de la invención.

Como se usa en el presente documento, el término “respuesta inmunitaria mediada por células” se refiere a un incremento en la cantidad de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno, macrófagos, células citotóxicas naturales o citocinas en el cuerpo de un sujeto en respuesta a la introducción del antígeno en el cuerpo del sujeto.

La inmunidad mediada por células es una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos sino que más bien implica la activación de macrófagos y células citotóxicas naturales, la producción de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y la liberación de diversas citocinas en respuesta a un antígeno. Los linfocitos T citotóxicos son un subgrupo de T linfocitos (un tipo de glóbulos blancos) que pueden inducir la muerte de células tumorales o somáticas infectadas; destruyen células que están infectadas con virus (u otros patógenos), o de otro modo están dañadas o son disfuncionales.

La mayoría de los linfocitos T citotóxicos expresan receptores de linfocitos T que pueden reconocer un antígeno peptídico específico unido a moléculas de CMH de clase I. Estos CTL también expresan CD8 (linfocitos T CD8+), que se atrae a porciones de la molécula de CMH de clase I. Esta afinidad mantiene el CTL y la célula diana unidos estrechamente entre sí durante la activación específica de antígeno.

La inmunidad celular protege el cuerpo, por ejemplo, activando linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T CD8+ específicos de antígeno) que pueden lisar células corporales que presentan epítopos de antígeno foráneo en su superficie, tales como células infectadas con virus, células con bacterias intracelulares y células cancerosas que presentan antígenos tumorales; activando macrófagos y células citotóxicas naturales, que les permiten destruir patógenos intracelulares; y estimulando a las células a secretar una variedad de citocinas que influyen en la función de otras células implicadas en respuestas inmunitarias adaptativas y respuestas inmunitarias innatas.

La inmunidad celular es un componente importante de la respuesta inmunitaria adaptativa y tras el reconocimiento del antígeno por las células a través de su interacción con células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas, los linfocitos B y, en un menor grado, los macrófagos, protegen al cuerpo por diversos mecanismos tales como:

1. activación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno que pueden inducir apoptosis en células del cuerpo que presentan epítopos de antígeno foráneo en su superficie, tales como células infectadas con virus, células con bacterias intracelulares y células cancerosas que presentan antígenos tumorales;

2. activación de macrófagos y células citotóxicas naturales, que les permiten destruir patógenos intracelulares; y

3. estimulación de células para que secreten una variedad de citocinas que influyen en la función de otras células implicadas en respuestas inmunitarias adaptativas y respuestas inmunitarias innatas.

La inmunidad mediada por células es la más eficaz para retirar células infectadas con virus, pero también participa en la defensa frente a hongos, protozoos, cánceres y bacterias intracelulares. También desempeña un papel importante en el rechazo de trasplantes.

Puesto que la inmunidad mediada por células implica la participación de diversos tipos de células y está mediada por diferentes mecanismos, se podrían usar varios procedimientos para demostrar la inducción o eficacia mejorada de inmunidad tras la aplicación de la invención. Estos se podrían clasificar a grandes rasgos en detección de: i) células presentadoras de antígeno específicas; ii) células efectoras específicas y sus funciones y iii) liberación de mediadores solubles tales como citocinas.

i) Células presentadoras de antígeno: las células dendríticas y linfocitos B (y en un menor grado macrófagos) están equipadas con receptores inmunoestimuladores especiales que permiten una activación potenciada de linfocitos T, y se denominan células presentadoras de antígeno (APC) profesionales. Estas moléculas inmunoestimuladoras (también denominadas moléculas coestimuladoras) se regulan por incremento en estas células tras la infección o vacunación, durante el proceso de presentación de antígenos a células efectoras tales como linfocitos T citotóxicos CD4+ y CD8+. Dichas moléculas coestimuladoras (tales como CD80, CD86, CMH de clase I o CMH de clase II) se pueden detectar usando citometría de flujo con anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra estas moléculas junto con anticuerpos que identifican específicamente APC (tales como CD11c para células dendríticas).

ii) Linfocitos T citotóxicos: (también conocidos como Tc, linfocito T supresor o linfocito T citotóxico (CTL)) son un subgrupo de linfocitos T que inducen la muerte de células que están infectadas con virus (y otros patógenos), o que expresan antígenos tumorales. Estos CTL atacan directamente a otras células que portan determinadas moléculas foráneas o anómalas en su superficie. La capacidad de dicha citotoxicidad celular se puede detectar usando ensayos citolíticos in vitro (ensayo de liberación de cromo). Por tanto, la inducción de inmunidad celular adaptativa se puede demostrar por la presencia de dichos linfocitos T citotóxicos, en los que, cuando las células diana cargadas con antígeno se lisan por CTL específicos que se generan in vivo tras la vacunación o infección.

Los linfocitos T citotóxicos vírgenes se activan cuando su receptor de linfocitos T (TCR) interacciona fuertemente con una molécula de CMH de clase I unida a péptido. Esta afinidad depende del tipo y la orientación del complejo de antígeno/CMH, y es lo que mantiene el CTL y la célula infectada unidos entre sí. Una vez activado, el c Tl experimenta un proceso denominado expansión clonal en el que gana funcionalidad, y se divide rápidamente, para producir un ejército de células efectoras “armadas”. Los CTL activados se desplazarán a continuación por todo el cuerpo en busca de células que llevan ese CMH de clase I péptido único. Esto se podría usar para identificar dichos CTL in vitro usando tetrámeros de péptido-CMH de clase I en ensayos de citometría de flujo.

Cuando se exponen a estas células somáticas infectadas o disfuncionales, los CTL efectores liberan perforina y granulisina: citotoxinas que forman poros en la membrana plasmática de la célula diana, permitiendo que fluyan iones y agua al interior de la célula infectada, y provocando que estalle o se lise. Los CTL liberan granzima, una serina proteasa que entra en las células por medio de poros para inducir apoptosis (muerte celular). La liberación de estas moléculas de CTL se puede usar como medida de la inducción satisfactoria de una respuesta inmunitaria celular tras la vacunación. Esto se puede hacer por enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción de puntos (ELISPOT) donde los CTL se pueden medir cuantitativamente. Puesto que los CTL también pueden producir citocinas importantes tales como iFN-y, se puede lograr la medición cuantitativa de células CD8 que producen IFN-y por ELISPOT y por medición por citometría de flujo de IFN-y intracelular en estas células.

Linfocitos T “cooperadores” CD4+: los linfocitos CD4+, o linfocitos T cooperadores, son mediadores de la respuesta inmunitaria, y desempeñan un papel importante en el establecimiento y la maximización de las capacidades de la respuesta inmunitaria adaptativa. Estas células no tienen actividad citotóxica o fagocítica; y no pueden destruir células infectadas o aclarar patógenos, sino que, en esencia “gestionan” la respuesta inmunitaria, dirigiendo a otras células para que realicen estas tareas. Se pueden inducir dos tipos de respuestas de linfocitos T cooperadores CD4+ efectores por una APC profesional, designados Th1 y Th2, cada uno diseñado para eliminar diferentes tipos de patógenos.

Los linfocitos T cooperadores expresan receptores de linfocitos T (TCR) que reconocen antígeno unido a moléculas de CMH de clase II. La activación de un linfocito T cooperador virgen provoca que libere citocinas, lo que influye en la actividad de muchos tipos de células, incluyendo la APC que las activó. Los linfocitos T cooperadores requieren un estímulo de activación mucho más suave que los linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T cooperadores pueden proporcionar señales adicionales que “ayudan” a activar a las células citotóxicas. Dos tipos de respuestas de linfocitos T cooperadores CD4+ efectores se pueden inducir por APC profesionales, designados Th1 y Th2, cada uno diseñado para eliminar diferentes tipos de patógenos. Las dos poblaciones de linfocitos Th difieren en el patrón de las proteínas efectoras (citocinas) producidas. En general, los linfocitos Th1 ayudan en la respuesta inmunitaria celular por activación de macrófagos y linfocitos T citotóxicos; mientras que los linfocitos Th2 promueven la respuesta inmunitaria humoral por estimulación de linfocitos B para su conversión en células plasmáticas y por formación de anticuerpos. Por ejemplo, una respuesta regulada por linfocitos Th1 puede inducir lgG2a e lgG2b en ratón (IgG1 e lgG3 en seres humanos) y favorecer una respuesta inmunitaria mediada por una célula a un antígeno. Si la respuesta de IgG a un antígeno está regulada por células de tipo Th2, puede potenciar predominantemente la producción de IgG1 en ratón (lgG2 en seres humanos). La medida de citocinas asociadas con respuestas Th1 o Th2 proporcionará una medida de vacunación satisfactoria. Esto se puede lograr por ELISA específico diseñado para citocinas Th1 tales como IFN-y, IL-2, IL-12, TNF-a y otras, o citocinas Th2 tales como IL-4, IL-5, IL10 entre otras.

iii) Medición de citocinas: liberadas de ganglios linfáticos regionales dan una buena indicación de inmunización satisfactoria. Como resultado de la presentación de antígenos y la maduración de APC y células efectoras inmunitarias tales como linfocitos T CD4+ y CD8+, las células de ganglios linfáticos liberan varias citocinas. Cultivando estas LNC in vitro en presencia de antígeno se puede detectar una respuesta inmunitaria específica de antígeno midiendo la liberación de determinadas citocinas importantes tales como IFN-y, IL-2, IL-12, TNF-a y GM-CSF. Esto se podría hacer por ELISA usando sobrenadantes de cultivo y citocinas recombinantes como patrones.

La inmunización satisfactoria se puede determinar de varios modos conocidos por el experto incluyendo, pero sin limitarse a, ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) y de inhibición de la neutralización en suero para detectar anticuerpos funcionales; estudios de exposición, en los que sujetos vacunados se exponen con el patógeno asociado para determinar la eficacia de la vacunación; y el uso de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para determinar la población de células que expresan un marcador de superficie celular específico, por ejemplo en la identificación de linfocitos de memoria o activados. Un experto puede determinar también si la invención mejoraba la eficacia de una respuesta mediada por una célula inmunitaria usando otros procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology Coligan et al., ed. (Wiley Interscience, 2007).

En algunos modos de realización, la invención también se puede usar para tratar cáncer induciendo una respuesta humoral inmunitaria o mejorando la eficacia de la vacuna en la inducción de una respuesta humoral inmunitaria. Dichos modos de realización pueden tener una aplicación particular en casos donde la vacuna de la invención incluye un antígeno adicional como se describe en el presente documento, distinto de un antígeno de survivina. Estos procedimientos pueden implicar el tratamiento de cáncer induciendo tanto una respuesta inmunitaria mediada por células como una respuesta inmunitaria humoral.

Una respuesta inmunitaria humoral, en contraposición a inmunidad mediada por células, está mediada por anticuerpos secretados que se producen en las células de la estirpe de linfocito B (linfocitos B). dichos anticuerpos secretados se unen a antígenos, tales como, por ejemplo, aquellos en las superficies de patógenos y/o sustancias foráneas (por ejemplo virus, bacterias, etc.) y los marcan para su destrucción.

Un “anticuerpo” es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancial o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante k, A, a, y, 5, £, y p, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como k o bien A. Las cadenas pesadas se clasifican como y, M, a, 5 o £, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina típica (anticuerpo) comprende una proteína que contiene cuatro polipéptidos. Cada unidad estructural de anticuerpo se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada uno una cadena “ligera” y una “pesada”. El extremo N de cada cadena define una región variable principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Las unidades estructurales de anticuerpos (por ejemplo, de las clases de IgA e IgM) también se pueden ensamblar para dar formas oligoméricas entre sí y cadenas polipeptídicas adicionales, por ejemplo como pentámeros de IgM en asociación con el polipéptido de cadena J.

Los anticuerpos son los productos de glucoproteína específicos de antígeno de un subconjunto de glóbulos blancos denominados linfocitos B. El acoplamiento de un antígeno con un anticuerpo expresado en la superficie de linfocitos B puede inducir una respuesta de anticuerpos que comprende la estimulación de linfocitos B para que se activen, experimenten mitosis y se diferencien de manera terminal dando células plasmáticas, que están especializadas para la síntesis y secreción de anticuerpo específico de antígeno.

Los linfocitos B son los únicos productores de anticuerpos durante una respuesta inmunitaria y son, por tanto, un elemento clave para una inmunidad humoral eficaz. Además de producir grandes cantidades de anticuerpos, los linfocitos B también actúan como células presentadoras de antígeno y pueden presentar antígeno a linfocitos T, tales como linfocito T cooperador CD4 o CD8 citotóxico, propagando por tanto la respuesta inmunitaria. Los linfocitos B, así como los linfocitos T, son parte de la respuesta inmunitaria adaptativa que puede ayudar en la eficacia de la vacuna. Durante una respuesta inmunitaria activa, inducida por vacunación o bien por infección natural, se activan linfocitos B específicos de antígeno y se expanden clonalmente. Durante la expansión, llos linfocitos B evolucionan para tener una mayor afinidad por el epítopo. La proliferación de linfocitos B se puede inducir indirectamente por linfocitos T cooperadores activados, y también directamente a través de la estimulación de receptores, tales como los receptores de tipo Toll (TLR).

Las células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas y linfocitos B, se atraen a los sitios de vacunación y pueden interaccionar con antígenos y adyuvantes contenidos en la vacuna. El adyuvante estimula a las células para que se activen y el antígeno proporciona el modelo para la diana. Diferentes tipos de adyuvantes proporcionan diferentes señales de estimulación a las células. Por ejemplo, el polinucleótido poli l:C (un agonista de TLR3) puede activar células dendríticas, pero no linfocitos B. Los adyuvantes tales como Pam3Cys, Pam2Cys y FSL-1 son especialmente adecuados para activar e iniciar la proliferación de linfocitos B, que se espera que facilite la producción de una respuesta de anticuerpos (Moile et al., Curr Med Chem, 2008; So., J Immunol, 2012).

Como se usa en el presente documento, el término “respuesta de anticuerpos” se refiere a un incremento en la cantidad de anticuerpos específicos de antígeno en el cuerpo de un sujeto en respuesta a la introducción del antígeno en el cuerpo del sujeto.

Un procedimiento de evaluación de una respuesta de anticuerpos es medir los valores de anticuerpos reactivos con un antígeno particular. Esto se puede realizar usando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica tales como enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) de sustancias que contienen anticuerpos obtenidas de animales. Por ejemplo, los valores de anticuerpos séricos que se unen a un antígeno particular se pueden determinar en un sujeto antes y después de la exposición al antígeno. Un incremento estadísticamente significativo en el valor de anticuerpos específicos de antígeno tras la exposición al antígeno indicaría que el sujeto ha establecido una respuesta de anticuerpos al antígeno.

Otros ensayos que se pueden usar para detectar la presencia de un anticuerpo específico de antígeno incluyen, sin limitación, ensayos inmunológicos (por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA)), ensayos de inmunoprecipitación y ensayos de inmunotransferencia de proteínas (por ejemplo, inmunoelectrotransferencia); y ensayos de neutralización (por ejemplo, neutralización de la infectividad vírica en un ensayo in vitro o in vivo).

La invención, al mejorar la eficacia de la vacuna en la inducción de una respuesta inmunitaria humoral, puede ser idónea para tratar y/o prevenir el cáncer.

Una respuesta inmunitaria humoral es el mecanismo principal para vacunas contra enfermedades infecciosas. Sin embargo, una respuesta inmunitaria humoral también puede ser útil para combatir el cáncer. Complementando una vacuna contra el cáncer, que está diseñada para producir una respuesta de linfocitos T CD8+ citotóxicos que pueden reconocer y destruir células cancerosas, una respuesta mediada por linfocitos B puede seleccionar células cancerosas a través de otros mecanismos que pueden en algunos casos cooperar con un linfocito T CD8+ citotóxico para lograr un beneficio máximo. Los ejemplos de mecanismos de respuesta antitumoral mediada por linfocitos B (por ejemplo mediada por respuesta inmunitaria humoral) incluyen, sin limitación: 1) Anticuerpos producidos por linfocitos B que se unen a antígenos de superficie encontrados en células tumorales u otras células que influyen en la oncogénesis. Dichos anticuerpos, por ejemplo, pueden inducir la destrucción de células diana a través de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o fijación del complemento, dando como resultado potencialmente la liberación de antígenos adicionales que se pueden reconocer por el sistema inmunitario; 2) anticuerpos que se unen a receptores en células tumorales bloqueando su estimulación y en efecto neutralizan sus efectos; 3) anticuerpos que se unen a factores liberados por o asociados con tumor o células asociadas a tumores para modular una ruta de señalización o celular que soporta el cáncer; y 4) anticuerpos que se unen a dianas intracelulares y median en la actividad antitumoral a través de un mecanismo actualmente desconocido.

El sujeto que se va a tratar por los procedimientos de la invención puede ser cualquier vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano.

Kits y reactivos

Para poner en práctica la presente invención, las composiciones como se describen en el presente documento se pueden proporcionar opcionalmente a un usuario como un kit. Por ejemplo, un kit de la invención contiene uno o más componentes de las composiciones de la invención. El kit puede comprender además uno o más reactivos adicionales, material de envasado, recipientes para contener los componentes del kit y un conjunto de instrucciones o manual de usuario que detalla procedimientos preferidos de uso de los componentes del kit.

En un modo de realización particular, la vacuna de la invención (por ejemplo, DPX-Survivac) se suministra como un kit que contiene dos recipientes. El recipiente 1, por ejemplo, puede comprender el sistema de adyuvante liofilizado (por ejemplo, liposomas), antígenos de survivina y adyuvante. El recipiente 2, por ejemplo, puede contener el componente oleoso (Montanide® ISA51 VG) solo. Un volumen apropiado (0,1 o 0,5 mi) de la vacuna reconstituida se puede inyectar por vía subcutánea.

En un modo de realización, el kit puede contener adicionalmente un agente que interfiere con la replicación del ADN. El agente que interfiere con la replicación del ADN se puede incluir en el kit con un tercer recipiente, o el agente se puede incluir en el recipiente 1 o recipiente 2, como se describe anteriormente. En un modo de realización particular, el agente que interfiere con la replicación del ADN que se incluye en el kit es un agente alquilante, tal como, por ejemplo, ciclofosfamida.

Aspectos de la divulgación

Los aspectos particulares de la presente descripción incluyen los siguientes:

(1) Un procedimiento para mejorar la eficacia de una vacuna en el tratamiento de cáncer en un sujeto, comprendiendo, consistiendo en o consistiendo esencialmente en, dicho procedimiento:

(1) administrar al sujeto al menos dos dosis de un agente que interfiere con la replicación del ADN en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador; y

(ii) posteriormente administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna, en el que la vacuna comprende al menos un antígeno de survivina.

(2) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (1) que comprende administrar una primera dosis del agente al sujeto al menos dos días antes de administrar la vacuna, y preferentemente al menos cuatro días antes de administrar la vacuna.

(3) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (1) que comprende administrar una primera dosis del agente al sujeto aproximadamente una semana antes de administrar la vacuna.

(4) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (3) que comprende administrar el agente durante un periodo de al menos dos días consecutivos.

(5) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (4) que comprende administrar al sujeto una primera dosis del agente, seguido de una o más dosis de mantenimiento del agente.

(6) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (5) que comprende administrar el agente al sujeto al menos 1,2, 3 o 4 veces al día antes de administrar la vacuna.

(7) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (6) que comprende administrar el agente dos veces al día durante un periodo de aproximadamente una semana antes de administrar la vacuna.

(8) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (7), en el que la administración al sujeto del agente se detiene antes de administrar la vacuna.

(9) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (7), en el que la administración al sujeto del agente continúa durante el transcurso de la administración de la vacuna.

(10) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (9) que comprende administrar la vacuna al sujeto aproximadamente una vez cada tres semanas.

(11) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (10) que comprende administrar la vacuna al sujeto 2, 3, 4 o más veces.

(12) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (11) que comprende administrar el agente que interfiere con la replicación del ADN al sujeto en una pauta posológica metronómica.

(13) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (12), en el que la pauta posológica metronómica comprende administrar el agente al sujeto diariamente durante un periodo de aproximadamente una semana cada dos semanas.

(14) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (13) que comprende administrar el agente al sujeto comenzando aproximadamente una semana antes de administrar una primera dosis de la vacuna, y que comprende administrar la vacuna al sujeto aproximadamente una vez cada tres semanas.

(15) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (14), en el que el antígeno de survivina es un antígeno peptídico o un ácido nucleico que codifica un antígeno.

(16) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (15), en el que el antígeno de survivina es un antígeno peptídico que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de la proteína survivina (SEQ ID NO: 11) que puede provocar una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) en el sujeto, o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho antígeno peptídico.

(17) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (16), en el que el antígeno de survivina es un antígeno peptídico que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos FEELTLGEF (SEQ ID NO: 1); FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2); LTLGEFLKL (SEQ ID NO: 3); LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4); RISTFKNWPF (SEO ID NO: 5); RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6); STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7); y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8), o cualquier combinación de las mismas; o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho antígeno peptídico.

(18) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (14), en el que el al menos un antígeno de survivina comprende, consiste en o consiste esencialmente en una mezcla de cinco antígenos peptídicos que comprende la secuencia de aminoácidos FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2); LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4); RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6); STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7) o LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8).

(19) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (18), en el que el agente que interfiere con la replicación del ADN puede seleccionar selectivamente células que se dividen rápidamente del sistema inmunitario y provocar muerte celular programada.

(20) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (19), en el que el agente que interfiere con la replicación del ADN es un agente alquilante.

(21) El procedimiento de acuerdo con el párrafo 20, en el que el agente alquilante es un agente alquilante de mostaza nitrogenada.

(22) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (21), en el que el agente alquilante de mostaza nitrogenada es ciclofosfamida.

(23) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (22), en el que la cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador es de aproximadamente 25-300 mg/día, preferentemente de aproximadamente 50-100 mg/día y más preferentemente de aproximadamente 100 mg/día de ciclofosfamida.

(24) El procedimiento de acuerdo con los párrafos (22) o (23), en el que la cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador es de aproximadamente 50 mg de ciclofosfamida por dosis.

(25) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (22) a (24) que comprende administrar por vía oral la ciclofosfamida al sujeto.

(26) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (25) que comprende administrar la vacuna al sujeto por inyección, tal como por inyección subcutánea.

(27) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (26), en el que la vacuna es una composición que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en el al menos un antígeno de survivina, liposomas y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.

(28) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (27), en el que la composición comprende además un epítopo de linfocitos T cooperadores.

(29) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (28), en el que el epítopo de linfocitos T cooperadores es un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos AQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 9).

(30) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (27) a (29), en el que la composición comprende además un adyuvante.

(31) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (30), en el que el adyuvante es un polinucleótido poli l:C.

(32) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (27) a (31), en el que el vehículo es una sustancia hidrófoba tal como un aceite vegetal, aceite de nueces o aceite de vaselina.

(33) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (27) a (31), en el que el vehículo es aceite de vaselina o es un oleato de manida en disolución de aceite de vaselina, por ejemplo, Montanide® ISA 51. (34) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (33), en el que el agente mejora la eficacia de la vacuna potenciando directamente la respuesta inmunitaria contra el antígeno, tal como incrementando la actividad o el número de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno.

(35) El procedimiento de acuerdo con el párrafo (34), en el que incrementar la actividad o el número de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno implica un enriquecimiento de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno debido a una disminución relativa en los linfocitos T CD8+ totales.

(36) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (33), en el que el agente mejora la eficacia de la vacuna reduciendo el número o la actividad de células inmunodepresoras, por ejemplo, linfocitos T reguladores CD4+FoxP3+ (Treg), células supresoras de origen mieloide (MDSC) y/o linfocitos B CD19+CD1d+CD5+ (Breg).

(37) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (36), en el que el cáncer es un tumor sólido subcutáneo.

(38) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (36), en el que el cáncer es cáncer ovárico, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer peritoneal.

(39) El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (38), en el que el sujeto es un ser humano.

(40) Uso de un agente que interfiere con la replicación del ADN en combinación con una vacuna que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en al menos un antígeno de survivina para mejorar la eficacia de la vacuna en el tratamiento de cáncer, en el que al menos dos dosis del agente son para su administración antes de la vacuna.

(41) Combinación de un agente que interfiere con la replicación del ADN y una vacuna que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en al menos un antígeno de survivina para su uso en un procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (39).

(42) Composición como se describe en el presente documento para su uso en un procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos (1) a (39).

La invención se ilustra además por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Un estudio de fase I llevado a cabo en los Estados Unidos (IND n.° 14731) y Canadá (CTA-A n.° 155301) examinó la seguridad y potencia inmunitaria de DPX-Survivac en combinación con ciclofosfamida en pacientes con cáncer ovárico.

DPX-Survivac es una vacuna inmunoterápica antineoplásica candidata que contiene un decapéptido y cuatro nonapéptidos derivados de la secuencia proteica de survivina, con restricciones de HLA diferentes (HLA-A1, A2, A3, A24 y B7). Específicamente, DPX-Survivac comprende cinco antígenos peptídicos de survivina sintéticos que tienen las secuencias de aminoácidos: FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2), LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4), RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6), STFKNWPFl (SEQ ID NO: 7) y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8); un epítopo universal de linfocitos T cooperadores de toxoide tetánico ( AQYIKANSKFIGITEL SEQ ID NO: 9; un adyuvante de polinucleótido de poli l:C; liposomas que consisten en DOPC y colesterol; y el vehículo hidrófobo Montanide® ISA 51 VG. La vacuna DPX-Survivac está diseñada para seleccionar survivina.

En el estudio clínico, 18 de 19 pacientes con cáncer ovárico avanzado tratados con quimioterapia de platino y que no mostraban progresión de la enfermedad completaron su tratamiento de vacuna. La cohorte A (6 pacientes) recibió tres inyecciones de vacuna de 0,5 ml separadas 3 semanas; la cohorte B y cohorte C (6 pacientes cada una) recibieron tres inyecciones de vacuna de 0,1 ml o 0,5 ml, respectivamente, en combinación con ciclofosfamida oral a dosis baja metronómica. El ensayo clínico se llevó a cabo de acuerdo con el programa mostrado en la figura 1.

Se evaluaron los acontecimientos adversos usando CTCAE v4.0. Se extrajo sangre para estudiar la función inmunitaria y la inmunidad de linfocitos T inducida por la vacuna (análisis realizados por (i) ELISPOT, (ii) análisis de tetrámeros y (iii) tinción de citocina intracelular multiparamétrica). Se analizaron estadísticamente medidas repetidas de inmunidad por ELISPOT en el nivel inicial y después de 1,2 y 3 inyecciones usando un modelo lineal general.

(i) Ensayo de ELISPOT de IFN-v para detectar PBMC específicas de antígenos funcionales

Se sometieron a prueba muestras de PBMC congeladas tomadas de sujetos del ensayo clínico en el ensayo de ELISPOT de IFN-y para determinar la respuesta de recuerdo a los antígenos de prueba especificados. Se estimularon PBMC descongeladas con un conjunto de cinco péptidos de survivina y con el/los correspondiente(s) péptido(s) dependiendo del tipo de HLA del sujeto. Las respuestas a los antígenos, control negativo (células en medio solo) y el control positivo (PHA) se sometieron a prueba en pocillos por duplicado. Se sometieron a prueba los antígenos a una concentración de 50 y 5 pg/ml para someter a prueba la dependencia de la dosis además de la especificidad de antígeno. Se sembraron en placa las muestras clínicas de PBMC a una concentración de 300.000 células/pocillo de una placa de ELISPOT de 96 pocillos junto con PBMC de sexo coincidente del sujeto de control sano.

El día 1, se recubrieron las placas con 80 pl/pocillo de un primer anticuerpo diluido en PBS y se refrigeraron las placas durante la noche en una caja humidificada. El día 2, se lavaron las placas 3x con PBS, 200 pl/pocillo; se retiró el PBS en exceso dando golpecitos a las placas. Se añadieron 100 ul/pocillo del/de los antígeno(s) deseados para la activación de linfocitos T seguido de 100 pl/pocillo de PBMC de prueba o control. Se incubaron las células a 37 °C en un incubador humidificado durante 24 horas para la secreción de IFN-y. Hasta esta etapa, todas las etapas se realizaron en una condición estéril. El día 3, se lavaron las placas 3x con PBS, 3x con PBS-TWEEN seguido de la adición de 80 pl/pocillo de anticuerpo secundario biotinilado en PBS-TWEEN-BSA y se incubaron durante la noche en un refrigerador, en una caja humidificada. El día 4, se lavaron las placas 3x con PBS-TWEEN, 200 pl/pocillo, seguido de la adición de 100 pl/pocillo de reactivo de detección terciario en PBS-BSA y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lavaron las placas 3x con PBS-TWEEN y 3x con PBS, y se añadirán 200 pl/pocillo de dilución de revelado recién preparada. Se supervisó el desarrollo de puntos a temperatura ambiente, típicamente durante 10-60 minutos, comprobando cuidadosamente la ausencia de desarrollo de color en los pocillos de control de medio y la aparición de puntos en pocillos que contienen antígeno. Se detuvo la reacción enjuagando las placas con agua corriente mientras se les daba golpecitos. Se secaron las placas al aire durante la noche y se almacenaron a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación se exploraron las placas de ELISPOT usando un analizador de placas automatizado. Se procesaron los recuentos de UFP sin procesar y se resumieron para obtener datos sobre la secreción por PBMC de IFN-y inducida por antígeno.

Materiales de ELISPOT:

Soluciones:

1. PBS: sometido a prueba en cultivo tisular estéril

2. PBS-TWEEN al 0,05 %: por ejemplo, 500 pl de Tween-20 en 1 I de PBS

3. PBS-BSA al 1 %: por ejemplo, 10 g de BSA-fracción V en 1 I de PBS (1 %)

4. PBS-TWEEN-BSA al 1 %: por ejemplo, 1 I de PBS-TWEEN más 10 g de BSA-fracción V

Medio:

Medio de prueba libre de suero complementado con L-glutamina al 1 %.

Células de prueba:

PBMC humanas (congeladas en nitrógeno líquido y descongeladas) 3 x 105 células por pocillo de las muestras de prueba

Incubador: 37 °C, humidificado, 7 % de CO²

Solución de AEC:

100 mg de AEC (3-amino-9-etilcarbazol) en 10 ml de DMF (N,N,dimetilformamida)

Preparada en un tubo de vidrio, en una campana de extracción

Tampón de AEC (acetato 0,1 M):

148 ml de ácido acético 0,2 M (11,55 ml de ácido acético glacial por I de H²O) más

352 ml de acetato de sodio 0,2 M (27,2 g por I de H²O).

Llevar hasta 1 I con H²O. Ajustar a pH 5,0

Solución de revelado (para usarse inmediatamente):

800 pl de disolución de AEC más 24 ml de tampón de AEC. Filtrar por 0,45 pm. Añadir 12 pl de H²O²(30 %)

(ii) Linfocitos T CD8+ específicos de antígeno usando multímeros de CMH (tetrámeros)

Los reactivos de multímeros de CMH ayudan a identificar linfocitos T CD8+ específicos de antígeno generado en sujetos vacunados. Estos linfocitos T específicos expresan TCR que puede reconocer y unirse al/a los péptido(s) usado(s) en la vacuna (cuando se conjugan con moléculas del c Mh ). La respuesta inmunitaria a los péptidos de vacuna se ve reflejada por la expansión de linfocitos T específicos de antígeno. Dichos linfocitos T CD8+ se midieron directamente ex vivo poco después de descongelar las PBMC y después de la estimulación in vitro y la expansión inducida por atocinas en presencia de los antígenos peptídicos de survivina incluidos en DPX-Survivac. Se usaron reactivos de multímeros de CMH, tales como tetrámeros (Beckman Coulter o TC Metrix, para HLA-A1, A2 y A3; TC Metrix para HLA-A24 y B7) para la detección específica de linfocitos T CD8+ inducidos por la vacuna. Para PBMC activadas tanto ex vivo como in vitro, se usaron PBMC de control y reactivos de multímeros de CMH de control en el ensayo. Se usaron PBMC de donantes sanos CMV+ conocidas junto con multímero de CMH específico de CMV como control positivo y se usará un reactivo específico de VIH como control negativo para la validación dentro de y entre ensayos y garantía de calidad.

A. Detección ex vivo de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno:

Se realizó la tinción ex vivo para detectar linfocitos T específicos en la sangre en citometría de flujo de 10 colores, junto con fenotipado de linfocitos T reguladores (Treg). El combinado de tinción incluía: vivo/muerto, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD27, CD25, Ki67, Foxp3 y el reactivo de tetrámero que coincidía con el tipo de HLA del sujeto. Las pruebas de cualificación del ensayo para verificar que la permeabilización celular para la tinción de Foxp3 intracelular para linfocitos Treg no interfiere con la tinción de la superficie celular se completaron satisfactoriamente. El análisis ex vivo de los tetrámeros consistía en teñir PBMC descongeladas y que reposaron durante la noche usando el combinado de anticuerpos (como se muestra anteriormente) y el reactivo de tetrámero para citometría de flujo. En resumen, se tiñeron en primer lugar PBMC descongeladas con el reactivo de tetrámero a 4 °C durante 30 minutos y se lavaron en tampón IMF (PBS BSA al 0,5 % azida de sodio al 0,01 %). A continuación se tiñeron las células con mezcla de anticuerpos, que contenía diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromo como marcadores fenotípicos, durante 30 minutos a 4°C. A continuación se lavaron las células y se fijaron en paraformaldehído al 1 % y se usaron para citometría de flujo. Para detectar los niveles de linfocitos B, se usaron tubos separados para teñir las células con anticuerpo frente a CD19, puesto que la permeabilización celular para Foxp3 afecta de manera adversa a la unión al anticuerpo frente a CD19.

B. Activación in vitro de PBMC para detectar linfocitos T CD8+ específicos:

Para la activación y expansión in vitro de linfocitos T específicos de antígeno, se cultivaron PBMC de las mismas células descongeladas y usadas para el análisis ex vivo en presencia de antígeno peptídico de survivina y citocinas (IL-2 e IL-15) durante 10 días. En resumen, se realizó la viabilidad de células descongeladas y que reposaron durante la noche y se suspendieron las PBMC a 1x106 células/ml en medio RPMI-1640 complementado con FCS inactivado por calor al 10 %, L-glutamina 2 mM, p-mercaptoetanol 50 jM , 100 U/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina, 10 Ul/ml de IL-2 recombinante humana y 10 ng/ml de IL-15 recombinante humana. En una placa de 24 pocillos, se colocaron 1x106 células/pocillo en 1,0 ml de medio y las células se dejaron sin tratar o bien se estimularon con péptido de survivina histocompatible apropiado a una concentración final de 5 jg/ml. Se incubaron las células en un incubador humidificado a 37 °C con un suministro de 5 % de CO². El día 3, 6 y 8, se aspiró cuidadosamente el medio sin alterar las células teniendo cuidado de dejar algo de medio de modo que las células no se secaran. Se añadió un volumen apropiado (1,0 ml) de medio RPMI completo precalentado con citocinas (10 Ul/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-15). El día 10, se recogieron todas las células y se lavaron una vez con medio RPMI sencillo, una vez con tampón IMF y se usaron para la tinción de tetrámeros (5 colores) de acuerdo con el protocolo: vivo/muerto, CD3, CD8, CD45RA y uno o dos reactivos de multímeros de CMH, dependiendo del tipo de HLA de los sujetos. Puesto que podría haber reactividad cruzada del tetrámero de HLA-A2 con PBMC de los sujetos A1 o bien A3, también se sometieron a prueba células de los sujetos con estos dos últimos tipos de HLA con el reactivo diseñado para HLA-A2. En paralelo con PBMC de pacientes, también se activaron PBMC de control sano CMV+ conocidas con el conjunto de péptidos CEF para generar una muestra de control positivo que se podría usar para comparaciones dentro de y entre ensayos. Tras la tinción, se fijaron las células en paraformaldehído al 1 % para la citometría de flujo.

(i¡¡) Citometría de flujo multiparamétrica (ICS)

El ensayo de citometría de flujo multiparamétrico se considera muy informativo porque permite la detección simultánea de múltiples citocinas/quimiocinas (IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-4, IL-17 y otros) y marcadores fenotípicos y/o funcionales (CD3, CD4, CD8, CD19, CD27, c D45RA, CD107a granzima-B, CCR7, etc.). Además, se ha mostrado que las linfocitos T multifuncionales (que secretan múltiples citocinas) están asociadas con una respuesta inmunitaria de tipo 1 protectora y la detección de dichas células en sujetos incluidos es probable que refleje la eficacia inmunitaria de la vacuna administrada.

Se realizó el ensayo de ICS como una citometría de flujo de 12 colores que incluía: marcador vivo/muerto, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD27 (como subconjunto y marcadores de diferenciación de memoria) junto con IFN-y, TNF-Y, IL-2, IL-17, granzima-B y CD107a (para citocinas y otros marcadores funcionales). La selección de marcadores fenotípicos usados en el ensayo permite la identificación de linfocitos T de memoria centrales/efectores específicos que es probable que respondan a los antígenos de vacuna en el ensayo. Las condiciones de estimulación celular incluían: sin estimulación, controles positivos de PMA/ionomicina, péptidos de survivina agrupados que están incluidos en la vacuna, péptido histocompatible para un sujeto dado y estimulación con conjunto de péptidos CEF (CMV/EBV/FLU) de PBm C de control. Además de PBMC de pacientes, se usaron PBMC de donantes sanos de HLA-A2 conocidas como control interno para garantía de calidad. En resumen, se estimularon 106 PBMC, después de reposar durante la noche, durante 1 hora con péptidos individuales y conjuntos de péptidos en presencia de anticuerpos anti-CD107a. Las concentraciones de péptidos individuales o conjuntos de péptidos finales usadas para la estimulación fueron de 1 jg/ml. Se añadieron inhibidores de la secreción de proteínas (GolgiPlug™/GolgiStop™, BD Bioscience) después de 1 hora de estimulación, y se incubaron las células durante 5 horas adicionales a 37 °C y 5 % de CO². Tras la estimulación in vitro, se lavaron las células y se tiñó la superficie durante 30 minutos a 4°C (CD8, CD27 CD3, CD4 y CD45RA y marcador de viabilidad) seguido de tinción intracelular (IFN-y, TNF-a, IL-17, IL-2) de células fijadas/permeabilizadas durante 30 minutos a 4 °C. Se adquirirán las células marcadas en un citómetro de flujo LSR II usando el software FACS DiVa (BD Bioscience) y se analizarán usando el programa informático FlowJo. Se realizarán análisis de citocinas multifuncionales después de la selección rigurosa de cada población positiva para citocinas. Además, se usó SPICE, una aplicación de programa informático de extracción de datos, para analizar conjuntos de datos de FlowJo grandes a partir de citometría de flujo policromática y para organizar gráficamente los datos normalizados.

Resultados:

Se establecieron en general respuestas inmunitarias específicas de antígeno, como se evaluaron por la producción de IFN-y en análisis de ELISPOT, con una o dos vacunaciones y se incrementaron o se mantuvieron con refuerzos (figuras 2-4). Se observó una respuesta a la dosis, produciendo los pacientes de la cohorte C respuestas de magnitud significativamente mayor (cohorte C frente a cohorte B, P=0,013). La ciclofosfamida a dosis baja potenció significativamente la dosis de 0,5 ml (cohorte C frente a cohorte A, P=0,015). Estos resultados demuestran que la combinación de modulación inmunitaria con ciclofosfamida a dosis baja en combinación con DPX-Survivac generó las respuestas inmunitarias más fuertes. Los pacientes en la cohorte C pudieron aumentar una respuesta inmunitaria con tan sólo una dosis de vacuna después de tan sólo una semana de administración de ciclofosfamida a dosis baja previa. Las respuestas logradas en la cohorte C después de una, dos o tres dosis (tan altas como 2309, 1911 y 2517 puntos por 106 PBMC) solo se pudieron lograr con la combinación de vacuna de survivina y ciclofosfamida a dosis baja.

La mayor magnitud de las respuestas inmunitarias generadas por la vacuna de survivina en las cohortes B y C se caracterizaban por la detección de respuestas de linfocitos T específicos de antígeno circulantes y un perfil de respuesta de linfocitos T polifuncionales en la sangre (figuras 5 y 6). En algunos sujetos, estos linfocitos T CD8+ específicos de antígeno circulantes se pueden detectar ex vivo por tinción de tetrámeros, y dichos linfocitos T específicos se pueden expandir también además por estimulación con antígeno(s) peptídico(s) histocompatible(s) in vitro. 10 de 12 sujetos que recibieron la politerapia de DPX-Survivac se pudieron evaluar por tinción de tetrámeros; los 10 mostraron una fuerte evidencia de inducción de linfocitos T CD8+ específicos de survivina después de una o dos vacunaciones con DPX-Survivac. De manera importante, las respuestas de linfocitos T CD8+ se mantuvieron con vacunaciones de refuerzo. La activación y el mantenimiento de estas células inmunitarias específicas es de interés particular en inmunoterapia puesto que los linfocitos T CD8+ están implicados en la identificación de células cancerosas, infiltración de tumores y destrucción de dianas de cáncer. Las respuestas más fuertes se observaron en la cohorte C por análisis de tetrámeros, confirmando los resultados obtenidos por ELISPOT. La mayoría de los pacientes en la cohorte C tenían una positividad de tetrámeros por encima de un 1 % de los linfocitos T CD8+ totales (con estimulación in vitro) y alcanzando tanto como un 22 % de los linfocitos T CD8+ totales. En cambio, la positividad de tetrámeros más alta registrada en la cohorte A estaba por debajo de un 1 % de los linfocitos T CD8+ totales (0,7 %). Esto demuestra que la combinación de ciclofosfamida a dosis baja y vacuna generaba respuestas inmunitarias específicas de antígeno significativamente mayores.

Varios sujetos tratados con DPX-Survivac también mostraron la inducción de linfocitos T CD8+ polifuncionales que eran indicativos de una respuesta inmunitaria protectora. Cada uno de dos sujetos, de seis, en cada una de las cohortes A y B y 5 sujetos de 6 en la cohorte C era positivo para linfocitos T CD8+ que secretan múltiples citocinas. La mayoría de estas células CD8 eran de un fenotipo de memoria central, lo que indica una exposición a antígeno previa e inducción de una respuesta inmunitaria duradera frente a survivina en sujetos tratados. En la tabla 4 se muestran resultados de sujetos representativos positivos para la positividad a múltiples citocinas tras el tratamiento.

Tabla 4:

La tabla anterior (tabla 4) proporciona los resultados de tinción de ICS de sujetos que responden representativos, los sujetos 09-08, 10-09, 11-10 y 02-16, que muestran linfocitos T CD8 de memoria central que secretan múltiples citocinas. Se sometieron a prueba células mononucleares de sangre periférica para detectar la presencia de linfocitos T CD8+ polifuncionales por tinción de citocinas intracelulares (ICS). Después de una estimulación a corto plazo (5 horas) con péptidos de survivina, se tiñó la superficie de las células para detectar marcadores fenotípicos tales como CD3, c D4, CD8, CD27, CD45RA, se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron además para detectar la presencia de citocinas intracelulares tales como INF-y, TNF-a e IL-2. Se usó análisis de citometría de flujo usando el programa informático Flow-Jo para detectar linfocitos T CD8+ (CD27+CD45RA-) de memoria central que secretan una única o múltiples citocinas en los puntos de tiempo de nivel inicial y tras la vacunación, excepto para el sujeto 09-08 con linfocitos T CD8+ (CD3+Cd 8+CD45RA+c D27-) diferenciados tardíamente. (+) indica detección de linfocitos T polifuncionales en muestras de sangre después del tratamiento con un intervalo de frecuencia de >0,05 % a >3,0 % de subconjuntos de linfocitos T CD8+ de memoria analizados. (-) indica ausencia de linfocitos T CD8 polifuncionales detectables. (*) no determinado debido a PBMC de mala calidad.

Ejemplo 2:

Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los pacientes 02-04, 11-10, 02-16, 03-07, 09-08, 10-09 y 01-12 el día de estudio 70, 4 semanas después de la tercera vacunación con DPX-Survivac, administrada en combinación con ciclofosfamida metronómica como se describe. La excepción es el paciente 09-08, donde la muestra analizada era del día de estudio 126, 12 semanas después de la tercera vacunación. Se determinó el haplotipo de HLA de todos los pacientes, y se muestran entre paréntesis junto con los números de ID de paciente (véase la figura 7). Se analizó la respuesta inmunitaria en estos pacientes ex vivo usando el ensayo de ELISPOT (figura 7; panel izquierdo) o análisis de tetrámeros in vitro por citometría de flujo (figura 7; panel derecho), tras la estimulación con péptidos de survivina agrupados. En el ensayo de ELISPOT, se estimularon las PBMC de pacientes con péptidos agrupados, que representan los péptidos modificados incluidos en la vacuna DPX-Survivac (barras negras; SurA1.T (SEQ ID NO: 2), SurA2.M (SEQ ID NO: 4), SurA3.K (SEQ ID NO: 6), así como los péptidos SurA24 (SEQ ID NO: 7) y SurB7 (SEQ ID NO: 8) sin modificar), o bien un agrupamiento de péptidos que sustituyen a los péptidos modificados para los péptidos naturales de proteína survivina (barras blancas; SurA1 (SEQ ID NO: 1), SurA2 (SEQ ID NO: 3), SurA3 (SEQ ID NO: 5)).

En la tabla 5 se muestran los péptidos modificados contenidos en DPX-Survivac:

Tabla 5:

_________________________

Para el análisis de tetrámeros, se usó un único péptido (natural o modificado) para estimular PBMC en presencia de citocinas IL-2/IL-15 durante 10 días y se detectó la frecuencia de linfocitos T específicos de antígeno usando reactivos de tetrámeros diseñados en base a péptido modificado y moléculas de HLA correspondientes. Se espera que los pacientes generen respuestas inmunitarias a los péptidos correspondientes a su tipo de HLA pertinente (es decir, SurA1 a HLA-A1, SurA2 a HLA-A2 y SurA3 a HLA-A3). Como se demuestra en la figura 7, las respuestas inmunitarias generadas a los péptidos de survivina modificados contenidos en DPX-Survivac demuestran una reactividad cruzada significativa con los péptidos naturales, como se observa tanto en los análisis de ELISPOT como de tetrámeros de muestras de sangre después de la vacunación. Por consiguiente, se espera que los linfocitos T CD8+ inducidos por la vacuna DPX-Survivac seleccionen células tumorales que expresan péptidos naturales junto con moléculas de HLA correspondientes sobre la superficie celular. Debido a la reactividad cruzada inmunitaria observada hacia secuencias de péptido de survivina naturales, se espera que la inclusión de péptidos naturales en una vacuna produjera una respuesta inmunitaria que puede reconocer secuencias naturales si están presentes sobre células seleccionadas por la vacuna.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Combinación de un agente que interfiere con la replicación del ADN y una vacuna que comprende al menos un antígeno de survivina para su uso en un procedimiento para mejorar la eficacia de la vacuna en el tratamiento de cáncer en un sujeto, en la que se le administra al sujeto al menos dos dosis del agente en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador; y se le administra posteriormente al sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de la vacuna,

en la que el agente que interfiere con la replicación del ADN es ciclofosfamida y se le administra al sujeto la ciclofosfamida en una pauta posológica metronómica, en la que dicha pauta posológica metronómica comprende administrar la ciclofosfamida al sujeto diariamente durante un periodo de aproximadamente una semana cada dos semanas.

2. Combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que:

- se le administra al sujeto una primera dosis de la ciclofosfamida al menos dos días, al menos cuatro días o aproximadamente una semana antes de administrar la vacuna; y/o

- se le administra al sujeto la ciclofosfamida 1,2, 3 o 4 veces al día antes de administrar la vacuna; y/o - se le administra al sujeto la ciclofosfamida dos veces al día durante un periodo de aproximadamente una semana antes de administrar la vacuna; y/o

- se detiene la administración de la ciclofosfamida antes de administrar la vacuna; y/o

- continúa la administración de la ciclofosfamida durante el transcurso de la administración de la vacuna. 3. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que:

- se le administra al sujeto la vacuna aproximadamente una vez cada tres semanas; y/o

- se le administra al sujeto la vacuna 2,

3, 4 o más veces.

4. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que se le administra al sujeto la ciclofosfamida comenzando aproximadamente una semana antes de una primera dosis de la vacuna, y se le administra al sujeto la vacuna aproximadamente una vez cada tres semanas.

5. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el antígeno de survivina es:

- un antígeno peptídico o un ácido nucleico que codifica un antígeno;

- un antígeno peptídico que comprende una secuencia de aminoácidos de la proteína de survivina (SEQ ID NO: 11) que puede provocar una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) en el sujeto, o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho antígeno peptídico; o

- un antígeno peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos FEELTLGEF (SEQ ID NO: 1); FTELTLGEF (SEO ID NO: 2); LTLGEFLKL (SEQ ID NO: 3); LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4); RISTFKNWPF (SEQ ID NO: 5); RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6); STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7); y LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8), o cualquier combinación de las mismas; o una molécula de ácido que codifica dicho antígeno peptídico.

6. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el al menos un antígeno de survivina comprende una mezcla de cinco antígenos peptídicos, en la que el primer antígeno peptídico comprende la secuencia de aminoácidos FTELTLGEF (SEQ ID NO: 2); el segundo antígeno peptídico comprende la secuencia de aminoácidos LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 4); el tercer antígeno peptídico comprende la secuencia de aminoácidos RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 6); el cuarto antígeno peptídico comprende la secuencia de aminoácidos STFKNWPFL (SEQ ID NO: 7) y el quinto antígeno peptídico comprende la secuencia de aminoácidos LPPAWQPFL (SEQ ID NO: 8).

7. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador es de aproximadamente 25-300 mg/día, preferentemente de aproximadamente 50-100 mg/día y más preferentemente de aproximadamente 100 mg/día de ciclofosfamida.

8. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la ciclofosfamida se administra a aproximadamente 50 mg de ciclofosfamida por dosis para proporcionar el efecto inmunomodulador.

9. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que se le administra al sujeto la ciclofosfamida por vía oral y se le administra al sujeto la vacuna por inyección.

10. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la vacuna es una composición que comprende el al menos un antígeno de survivina, liposomas y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.

11. Combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la composición comprende además un epítopo de linfocitos T cooperadores y/o un adyuvante.

12. Combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el epítopo de linfocitos T cooperadores comprende la secuencia de aminoácidos AQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 9) y el adyuvante es un polinucleótido poli l:C.

13. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el vehículo es un aceite vegetal, aceite de nueces o aceite de vaselina, y preferentemente aceite de vaselina.

14. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la ciclofosfamida mejora la eficacia de la vacuna:

- potenciando directamente la respuesta inmunitaria frente al antígeno incrementando la actividad o el número de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno; y/o

- reduciendo el número o actividad de células inmunodepresoras, en la que las células inmunodepresoras comprenden uno o más de linfocitos T reguladores CD4+FoxP3+ (Treg), células supresoras de origen mieloide (MDSC) y linfocitos B CD19+CD1d+CD5+ (Breg).

15. Combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en la que incrementar la actividad o el número de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno implica un enriquecimiento de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno debido a una disminución relativa en los linfocitos T c D8+ totales.

16. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que el cáncer es:

- un tumor sólido subcutáneo; y/o

- cáncer ovárico, cáncer de las trompas de Falopio o cáncer peritoneal.

17. Combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que el sujeto es un ser humano.