CN105324128B - 用于改善存活蛋白疫苗在癌症治疗中的功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于改善疫苗在癌症治疗中功效的方法。本发明的方法包括在用存活蛋白疫苗接种前,给予至少两剂量的干扰DNA复制的剂。还提供了用于本发明方法的组合物。
Description
发明领域
本发明总体涉及用于治疗癌症的方法,并且具体地,涉及通过使用干扰DNA 复制的剂的预处理改善存活蛋白疫苗在癌症治疗中的功效的方法。
发明背景
由接种疫苗诱导的免疫应答可以主要地分为体液型或细胞型。典型地期望体液应答防止遭受病毒或细菌入侵者,而针对病毒感染的细胞和癌细胞的免疫性典型地涉及细胞介导的应答。体液免疫具有的本质特征是由B细胞产生高水平抗体,而细胞免疫的特征是CD8+细胞毒T淋巴细胞的活化作用增加。
许多已经在临床前开发中显示出希望的疫苗在人类中测试时,最终未能证实临床益处。由于涉及癌症疫苗,治疗性干预是一种复杂的挑战,并且疾病的许多方面例如相对于护理标准的治疗时机、癌症阶段与类型,对治疗的结果都具有影响。然而,存在着三种免疫疗法特性,如果它们被严格结合,则可以提供更好的结果: (1)疫苗免疫原性(即,佐剂);(2)肿瘤相关抗原的适当选择;和(3)克服肿瘤诱导的免疫抑制的能力(Weir等人,癌症(Cancer)3:3114-3142,2011; Berzofsky等人,放射肿瘤学研究(Semin Oncol)39(3):348-354,2012)。
发明概述
申请人现在已经发现癌症疫苗(即,存活蛋白疫苗)的功效可以通过预先给予至少两次剂量的干扰DNA复制的剂来提高。
因此,在一方面,本发明涉及用于受试者的癌症治疗中提高疫苗功效的方法,所述方法包括:(i)以足够提供免疫-调节作用的量向受试者给予至少两次剂量的干扰DNA复制的剂;和(ii)随后向受试者给予治疗有效量的疫苗,其中疫苗包括至少一种存活蛋白抗原。
在本发明方法的实施方式中,将干扰DNA复制的剂每日给予受试者,持续每 14天中的连续7天(即,每周交替治疗)。在一个实施方式中,这种用干扰DNA 复制的剂的每周交替治疗,在第一次给予存活蛋白疫苗之前约一周开始。
在本发明方法的实施方式中,将存活蛋白疫苗每三周一次向受试者给予。
在本发明方法的实施方式中,干扰DNA复制的剂是烷化剂,如例如环磷酰胺。
在本发明方法的实施方式中,存活蛋白疫苗是这样的疫苗,其包括一种或多种具有如下氨基酸序列的存活蛋白肽抗原:FEELTLGEF(SEQ ID NO:1); FTELTLGEF(SEQ ID NO:2);LTLGEFLKL(SEQ ID NO:3);LMLGEFLKL (SEQ ID NO:4);RISTFKNWPF(SEQ ID NO:5);RISTFKNWPK(SEQ ID NO: 6);STFKNWPFL(SEQ ID NO:7);和LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8)。
在本发明方法的实施方式中,存活蛋白疫苗是免疫疫苗公司的候选抗癌症免疫疗法疫苗DPX-Survivac。DPX-Survivac包括五种包括如下氨基酸序列的合成存活蛋白肽抗原:FTELTLGEF(SEQ ID NO:2)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO:4)、 RISTFKNWPK(SEQ ID NO:6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO:7)、和 LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8);来自破伤风类毒素的通用T辅助细胞表位 (AQYIKANSKFIGITEL;SEQ ID NO:9);聚肌胞甘酸(polyI:C)多核苷酸佐剂;由DOPC和胆固醇组成的脂质体;和疏水载体 ISA 51 VG。
在另一方面,本发明涉及干扰DNA复制的剂与包括至少一种存活蛋白抗原的疫苗组合用于提供疫苗在癌症治疗中功效的用途,其中至少两次剂量的剂在给予疫苗前给予。
在另一方面,本发明涉及用于在此所描述的方法的组合物。
本发明的其他方面以及特征在本领域普通技术人员结合相应图审阅本发明具体实施例的以下描述时将变得显而易见。
附图概述
在附图中,其仅通过举例解释说明了本发明的实施方式:
图1图解说明了评估DPX-Survivac的安全性和免疫原性的第一阶段临床试验的设计。在研究的第-7天和+49之间,在有或没有低剂量环磷酰胺的口服给予情况下 (50mg,1天两次,巴克斯特(Baxter)),疫苗每三周进行给予(3次接种,间隔约21天)。每14天中持续连续7天每天给药低剂量环磷酰胺。环磷酰胺旨在第一次接种前一周开始。患者接受(1)0.5mL的DPX-Survivac的三次给予(同龄组 A),(2)与所概括的低剂量口服环磷酰胺组合的0.1mLDPX-Survivac的三次给予(同龄组B)或(3)与所概括的低剂量口服环磷酰胺组合的0.5mLDPX- Survivac的三次给予(同龄组C)。至第一次接种之前(基线)和在每次接种后的约3-4周收集血液样品,以分离并冷-藏保存外周血单核细胞(PBMC’s)。当可能时,血液样品也在较晚的时间点进行收集。PBMC被用于包括ELISPOT的免疫测定,以及基于流式血细胞计数术的测定例如四聚体染色和胞内细胞因子染色 (ICS)。
图2提供ELISPOT检测结果,并显示在来自接种的卵巢癌患者的外周血单核细胞(PBMC)中,DPX-Survivac诱导的干扰素γ产生增加。在IFN-γELISPOT测定中,用存活蛋白肽刺激受试者PBMC过夜。所展现的数据代表来自个体受试者的点形成单位/百万PBMC的数量,并且线代表处于基线和在一次、两次和三次剂量的疫苗给予之后的平均值。
图3提供了相对于在患者的基线免疫应答代表这些患者的IFN-γ分泌细胞的成倍增加的刺激倍数(factor)的总结。使用可获得的ELISPOT结果来计算刺激倍数。在肽刺激不存在的情况下,将在ELISPOT中具有不明原因的高背景样品排除在分析之外。2倍的最小刺激倍数需要考虑到在给定时间点患者的免疫应答。
图4提供了ELISPOT检测结果,并显示在来自接种的卵巢癌患者的PBMC 中,DPX-Survivac诱导的IFN-γ产生的增加。在IFN-γELISPOT测定中,用存活蛋白肽刺激受试者PBMC过夜。所呈现的数据代表来自个体受试者的点形成单位 (SFU)/百万PBMC的数量。
图5图解说明了来自代表性受试者02-04的MHC-多聚体染色结果。通过利用 DPX-Survivac肽和相应的MHC分子设计的肽-特异性CD8+T细胞结合MHC-多聚体试剂(四聚物)的能力,来测试外周血单核细胞的肽-特异性CD8+T细胞的存在。该测定在未刺激的PBMC(先体外后体内(ex vivo))上或在体外在一种或多种 HLA-匹配的存活蛋白肽的存在下刺激10天的PBMC中进行。基于HIV肽的无关 MHC-多聚体充当阴性对照。所示的图描绘了特异地结合MHC-多聚体试剂的接种后 PBMC样品中的CD8+T细胞的百分数。使用流式细胞计数法检测具体的T细胞,其中PBMC被门控在CD3+活细胞上,以便显示细胞对CD8+的双阳性和四聚物结合。
图6:来自接种的卵巢癌患者的外周血单核细胞(PBMC)中DPX-Survivac诱导的CD8+T细胞增加的检测。通过利用DPX-Survivac肽和相应的MHC分子设计的肽特异性CD8+T细胞结合MHC-多聚体试剂(四聚物)的能力,测试受试者PBMC 的肽特异性CD8+T细胞的存在。该测定在未刺激的PBMC(活体外)或在体外在一种或多种HLA-匹配的存活蛋白肽的存在下刺激10天的PBMC中进行。所呈现的数据代表了处于基线(圈)、在1剂量后(三角)、2剂量后(菱形)、和3剂量后 (正方形)个体受试者的周围血液中的CD8+T细胞的百分比。
图7图解解释说明对单个氨基酸修饰的或未修饰的天然存活蛋白肽序列的免疫应答和反应性的基于ELISPOT和四聚物的分析,证实疫苗诱导的免疫应答识别修饰的和未修饰的存活蛋白肽的能力。
详细描述
晚期癌利用若干机制逃避免疫介导的检测和破坏,因此在多个水平上降低了癌症疗法的有效性。
肿瘤诱导的免疫抑制是癌症标志之一并且是针对癌症的任何免疫治疗——包括包括肽疫苗——主要障碍,其(哈纳汉(Hanahan)和温伯格(Weinberg),细胞(Cell),144(5):646-674,2011)。随着它们的发展,肿瘤通过若干机制来适应避免和逃避免疫检测。肿瘤微环境,例如,上调许多促进抑制性免疫细胞发展的因子,例如CD4+FoxP3+调节T细胞(Tregs)(柯里尔(Curiel)等人,自然医学 (Nat Med),10(9):942-949,2004)和髓源性抑制细胞(MDSC)(纳加拉杰 (Nagaraj)和加布里洛维奇(Gabrilovich),癌症研究(CancerRes),68(8):2561- 3,2008)。肿瘤微环境还通过释放免疫抑制细胞因子例如TNF-β(杨(Yang)等人,免疫学趋势(Trends Immunol)31(6):220-227,2010),促进活化的CD8+T细胞的直接抑制。应答免疫压力的其它肿瘤逃避机制是在抗原加工和呈递中的免疫编辑、MHC类别I的下调以及改变。因此,最重要的是疫苗-诱导的CD8+T细胞在它们有可能适应之前,有机会快速识别并破坏肿瘤细胞。免疫调节剂抵消肿瘤诱导的免疫抑制的用途可以改善癌症疫苗的功效(杨(Yang)等人,生物医学和生物技术杂志(J Biomed Biotechnol)2012:605045)。
本发明的方法涉及通过组合给予干扰DNA复制的剂和存活蛋白疫苗,治疗受试者的癌症。
存活蛋白,涉及细胞凋亡负向调控的蛋白质,在许多肿瘤类型中高度表达并且具有所报道的预后价值。如在此所使用的“存活蛋白疫苗”意在包括用于向受试者给予在此所描述的存活蛋白抗原中的一种或多种的任何疫苗或抗原送递手段。在此描述了此类“存活蛋白疫苗”的示例性实施方式;然而,本领域技术人员将理解包括任何疫苗或向受试者送递抗原的手段。
本发明方法的实施方式涉及通过在先给予至少2剂量的干扰DNA复制的剂,来提高疫苗(即,存活蛋白疫苗)在癌症治疗中的功效。
因此,在一个具体的实施方式中,本发明涉及用于在受试者中改善疫苗在癌症治疗中的功效的方法,所述方法包括:(i)以足够提供免疫-调节作用的量向受试者给予至少两剂量的干扰DNA复制的剂;并且(ii)随后向受试者给予治疗有效量的疫苗,其中该疫苗包括至少一种存活蛋白抗原。
如在此所使用的“改善疫苗功效(improving vaccine efficacy)”或“改善疫苗功效 (improving the efficacy of a vaccine)”等是指能够使得本发明的存活蛋白疫苗在癌症治疗中更加有效的受试者的免疫应答中的任何变化或改变。在一些实施方式中,这可能涉及加速免疫应答的出现和/或改善对存活蛋白疫苗的免疫应答的持久性或强度。免疫应答可以是细胞介导的免疫应答或是体液免疫反应。
在本发明的方法中,干扰DNA复制的剂可以通过直接或间接提高针对疫苗中存活蛋白抗原的免疫应答来“改善疫苗的功效”。例如,这可以通过降低抑制性免疫细胞的数量和/或活性来实现。例如,据报道,肿瘤微环境上调许多促进抑制性免疫细胞发展的因子,如CD4+FoxP3+调节T细胞(Treg)(柯里尔(Curiel)等人, Nat Med,10(9):942-949,2004)、髓源性抑制细胞(MDSC)(纳加拉杰(Nagaraj)和加布里洛维奇(Gabrilovich),癌症研究(CancerRes),68(8):2561- 3,2008)、和CD19+CD5+CD1dhiIL-10+B细胞(Bregs)(鲍克威尔(Balkwill)等人,免疫学趋势(Trends Immunol),2012年12月3日,10.1016/j.it.2012.10.007刊载前的电子版(Epub ahead of print))。因此,降低这些抑制性免疫细胞的数量或活性的能力代表改善疫苗功效的实施方式。
还可以通过增加抗原特异性的CD8+T细胞的数量和/或活性来实现“改善疫苗的功效(improving the efficacy of a vaccine)”。在此方面,据报道,例如,肿瘤微环境通过释放免疫抑制细胞因子例如TNF-β(杨(Yang)等人,免疫学趋势 (Trends Immunol)31(6):220-227,2010),促进活化的CD8+T细胞的直接抑制。因此,增加抗原特异性CD8+T细胞的活性的能力代表改善疫苗功效的潜在机制。抗原特异性CD8+T细胞的增加可以是增加此类细胞数量、增加此类细胞活性、和/ 或相对于总CD8+T细胞的抗原特异性CD8+T细胞的富集群的产生(如例如,通过总CD8+T细胞的相对减少)的结果。
更一般地说,“改善疫苗的功效(improving the efficacy of a vaccine)”是指本发明方法:通过提高细胞介导的免疫应答或由疫苗诱导的体液免疫反应,来提高疫苗免疫原性的能力;在接种部位或肿瘤部位增加免疫细胞的数量的能力;或改善由本发明疫苗所提供的治功效果的能力,例如通过提高癌症的预防性治疗和/或治疗性治疗和/或缓解、延迟或抑制疾病症状进展。与单一疗法的治疗相比,改善疫苗的功效也可与改善生活质量或降低发病率相关。
“改善疫苗功效(improving the efficacy of a vaccine)”也可以意味着需要更低剂量的本发明组合的活性成分来产生期望的结果。这包括其中剂量本身较小的实施方式和其中疫苗、和/或干扰DNA复制的剂以较少频率来应用的实施方式。
若干化疗剂在以低的非细胞毒素剂量使用时,已经显示了免疫调节活性(泽沃盖尔(Zitvogel)等人,自然综述免疫学(Nat Rev Immunol)8(1):59-73,2008;刘 (Liu)和达格利什(Dalgleish),肿瘤学研讨会(Semin Oncol)39(3):340-347, 2012)。环磷酰胺是在所描述的第一免疫调节剂之一,并且当以其细胞毒性效应所一般使用的剂量的部分使用时,其对免疫系统具有多重功效作用(西史蒂谷 (Sistigu)等人,免疫病理学研讨会(SeminImmunopathol)33(4):369-383, 2011)。已经报道低剂量的环磷酰胺选择性地减少并修复Tregs的功能(路西卡 (Lutsiak)等人,血液(Blood)105(7):2862-2868,2005),抑制肿瘤血管发生(布劳德(Browder)等人,癌症研究(Cancer Res)60(7):1878-1886,2000),增加树突细胞的激活(瑞吉思科(Radojcic)等人,癌症免疫现状(Cancer Immunol Immunother)59(1):137-148,2009)和向Th1偏斜免疫应答(施凡尼(Schiavoni)等人,血液(Bloody)95(6):2024-2030,2000)。在小鼠中,环磷酰胺的单次快速灌注方式低剂量给予的作用是暂时性的,典型的是在给予后的4天内到达最低点,并且经过7-10天返回到正常(路西卡(Lutsiak)等人,血液(Blood)105(7):2862-2868, 2005)。
低剂量的环磷酰胺,当与癌症疫苗组合使用时,典型地在接种前的一至三天,在人体中作为约100-300mg/m2的单次弹丸IV注射液给予(与1-5g/m2的化学疗法剂量相反)(奥迪雅(Audia)等人,临床和实验免疫学(Clin Exp Immunol)150(3): 523-530,2007;(维尔梅吉(Vermeij)等人,国际癌症杂志(Int J Cancer)131(5): E670-680,2012)。虽然这个方案已经证明在临床前模型中的希望,但是转化至临床试验没有产生同样的模棱两可的结果(奥迪雅(Audia)等人,临床和实验免疫学 (Clin Exp Immunol)150(3):523-530,2007;(维尔梅吉(Vermeij)等人,国际癌症杂志(Int J Cancer)131(5):E670-680,2012),尽管沃尔特(Walter)等人近期公布数据显示,在肾细胞癌(RCC)患者的II期研究中,在肽疫苗之前的环磷酰胺的单次剂量与更长的患者生存期相关(瓦尔特(Walter)等人,自然医学(Nat Med)18: 1254-1261,2012)。然而,sbCPA治疗对疫苗的免疫原性没有可测量的作用。
环磷酰胺的单次弹丸给予的可替代的方法是,以节律式方案,将其通过每日给予非常低剂量的环磷酰胺来递送。已经报道节律性环磷酰胺给予与单次低剂量环磷酰胺具有相似的免疫调节作用(林格利(Ghiringhelli)等人,癌症免疫现状(Cancer ImmunolImmunother)56(5):641-648,2007;李(Le)和贾非(Jaffee),癌症研究 (Cancer Res)72(14):3439-3444,2012)。
现已令人惊奇并出乎预料地发现,在存活蛋白疫苗(例如,DPX-Survivac)给予前向受试者给予至少两剂量的环磷酰胺能够改善疫苗的功效。这是非常重大的发现,因为相比于临床前动物研究,在此所披露的结果涉及到了人类临床阶段研究。
DPX-Survivac,是根据本发明的疫苗,是用于癌症治疗的候选抗癌症免疫疗法疫苗。DPX-Survivac疫苗被设计用来靶向存活蛋白。如在此所描述的,DPX- Survivac包含来自存活蛋白的蛋白质序列的一种十肽(SEQ ID NO:6)和四种九肽 (SEQ ID NOs:2、4、7和8),具有不同的HLA限制(HLA-A1、A2、A3、A24 和B7)。
如在此所述的,在同龄组A、同龄组B、同龄组C中,用DPX-Survivac对受试者的治疗(参见图1),旨在解决最佳治疗方案,来提前产生强抗原特异性免疫应答,并且维持随着时间的推移持久的肿瘤特异性免疫反应。预期这种抗原特异性T 细胞应答将对新肿瘤的发展施加持续的压力,保持患者处于较长的缓解期。
根据本发明的方法,用DPX-Survivac所治疗的受试者,具有广泛的免疫分析,其导致临床研究的I期部分中的若干重要的发现。所有的受试者接受了DPX- Survivac组合疗法(同龄组B和C,n=12)(该组合疗法包括在给予疫苗之前的一段时期的低剂量的环磷酰胺治疗),证实了抗原特异性免疫应答,如通过研究的三种免疫监测测定中的至少一种所测量的(ELISPOT,四聚物分析,和多参数胞内细胞染色,表1)。
表1:在有或没有低剂量的环磷酰胺的情况下,来自用存活蛋白疫苗所治疗的18名1期受试者的免疫监测结果的总结(IND#14731)。
a DPX-Survivac中HLA非匹配的存活蛋白肽;b与HLA-A1四聚物的交叉反应的;c具有基于两种HLA类型(A2和A3或者A1和A2)的四聚物剂的阳性。
在表1中,当SFU是<128时(中等的(M)SFU在128-512的范围内,高的 (H)SFU>512),ELISPOT结果(SFU/106PBMC),如在治疗后时间点所见的,被表示为低的(L)。PBMC的四聚物分析是先体外后体内(没有刺激)或体外 (具有肽刺激)进行的,并且相对于接种前水平的抗原特异性CD8+T细胞的两倍增长,被指示为正应答个体;N/A,不适用(缺少适当的测试试剂)。多功能性抗原特异性CD8+T细胞被定义为同时分泌IFN-γ以及TNF-α和IL-2中的一种或两种的那些细胞。
根据本发明方法,在接受组合疗法的同龄组B和C中,看到所有研究的高应答个体。在同龄组B和C中的12名受试者的11人中,通过两种测定(五名受试者) 或三种测定(六名受试者)来确认免疫应答。通常用一次或两次接种建立免疫应答并且用加强剂增加或维持该免疫应答。观察到了剂量反应,其中同龄组C患者产生了显著更高幅度的应答(同龄组C对同龄组B,P=.013)。在疫苗给予前开始的低剂量环磷酰胺显著提高了0.5ml剂量(同龄组C对同龄组A,P=.015)。值得注意的是,使用四聚物,在PBL中,先体外后体内检测抗原特异性CD8+T细胞的最大频率,并且进一步表征为同龄组C的患者中多-参数的ICS的多功能,证实了低剂量环磷酰胺与存活蛋白疫苗的组合产生了最强烈的抗存活蛋白的免疫应答。
图2中同龄组A和C的ELISPOT总结于表2中。
表2:
将从上表(表2)中看到,通过ELISPOT在同龄组A中单次接种(仅有疫苗;n=6)之后获得的最高免疫应答是130SFU/106PBMC(范围55-130)。相反,通过ELISPOT在同龄组C中单次接种(先前的环磷酰胺+疫苗;n=6)之后获得的最高应答是2309SFU/106PBMC(范围2-2309)。这代表了所获得的最高免疫应答的17.7倍改善,证实了本发明的方法(包括在先给予干扰DNA复制的剂),提供了存活蛋白疫苗功效的重大改善。
类似地,还发现,当给予两剂量或三剂量的疫苗时,DPX-Survivac疫苗的功效通过本发明的方法提高。如表2中所示,通过ELISPOT在同龄组A(仅有疫苗;n =5)中的两次接种之后获得的最高免疫应答是137SFU/106PBMC(范围22- 137),然而通过ELISPOT在同龄组C(先前的环磷酰胺+疫苗;n=6)中的两次接种之后获得的最高免疫应答是1911SFU/106PBMC(范围25-1911)。这代表了所获得的最高的免疫应答的13.9倍改善。
在三次接种后,通过ELISPOT在同龄组A(仅有疫苗;n=6)中获得的最高免疫应答是284SFU/106PBMC(范围12-284)。相反,通过ELISPOT在同龄组C (先前的环磷酰胺+疫苗;n=6)中获得的最高免疫应答是2517SFU/106PBMC(范围38-2517)。这代表了所获得的最高的免疫应答的8.9倍改善。
此外,如图4中所示,已经发现在三次接种后,相比于同龄组A(仅有存活蛋白疫苗)中的0/6的患者,同龄组C(先前的环磷酰胺+疫苗)中的4/6的患者具有 512点/106PBMC以上的ELISPOT应答(参见图4)。这些结果显示低剂量的环磷酰胺显著提高了由0.5ml剂量的存活蛋白疫苗所提供的免疫应答。甚至在同龄组A 的三次剂量的接种后,同龄组A中没有患者能够实现本研究所考虑的高免疫应答 (即,SFU>512)。
本发明方法的改善DPX-Survivac疫苗的能力进一步通过图3所呈现的数据来说明,该图3显示在同龄组A、B和C中,1、2、和3剂量给予的疫苗的刺激指数。刺激指数代表相对于患者中基线免疫应答的这些患者的IFN-γ分泌细胞的倍数增加。如图3中所示,在同龄组A(仅有疫苗;n=6)中三次接种后所获得的刺激因子是0.4-8.9x,而在同龄组C(先前的环磷酰胺+疫苗;n=6)中三次接种后所获得的刺激因子是1.2-79x。这代表了在该时间点所获得的最高免疫应答的8.9倍改善,证实了本发明的方法(包括预先给予干扰DNA复制的剂)提供了存活蛋白疫苗功效的显著改进。
此外,在同龄组A(仅有疫苗;n=4)中2剂量后的至少一名患者中所获得的最高刺激因子是3.5x,而在同龄组C(先前的环磷酰胺+疫苗;n=6)中2剂量后的至少一名患者中所获得的最高刺激因子是59.7x。这代表了在该时间点,通过本发明的方法(包括在用存活蛋白疫苗接种之前给予干扰DNA复制的剂)所获得的最高免疫应答的17.1倍改善。
如通过ELISPOLT所检测的,通过本发明方法(例如,同龄组B和C)所产生的较高幅度的免疫应答,还通过血液中循环抗原特异性T细胞应答(通过四聚物染色)和多功能T细胞应答曲线(通过ICS染色)的检测表征。
体外四聚物:通过四聚物染色可评估同龄组B和C中12名受试者中的10人 (表1)。全部10名受试者显示在用DPX-Survivac的一次或两次接种后,存活蛋白特异性CD8+T细胞诱导的有力证据。因为CD8+T细胞涉及识别癌细胞、浸润肿瘤和杀死癌症靶点,这些特异性免疫细胞的活化和维持具有重要意义。已经发现,同龄组C中所有可评估患者具有的四聚物阳性为总CD8+T细胞(具有体外刺激)的 1%以上并且高达总CD8+T细胞的34%。相反,通过SD70在同龄组A中记录的最高四聚物阳性低于总CD8+T细胞的1%(0.7%)。
先体外后体内四聚物:如表1中所示,在静止的/未受刺激的PBMC中,至少在接种后的一个时间点,同龄组A中的1/6患者具有可检出的四聚物阳性CD8+T 细胞。然而意义重大的是,在该患者中,抗原特异性CD8+T细胞并没有如通过ICS 染色所确定的是多功能的。相反,在静止的/未受刺激的PBMC中,至少在接种后的一个时间点,同龄组C中的4/6患者具有四聚物阳性的CD8+T细胞,并且在这些患者中抗原特异性CD8+T细胞通过ICS确认为是多功能的。
ICS的多功能性:此外,与同龄组A中仅2/6的患者相比,同龄组C中5/6患者具有可检出的抗原特异性多功能CD8+T细胞(表1)。这些结果指示同龄组C 中的患者产生了比同龄组A中的患者显著更高幅度和更高频率的抗原特异性多功能CD8+T细胞。
发现通过四聚物和ICS染色获得的结果与通过ELISPOT的强免疫应答相关。在静止的/未受刺激的PBMC中具有四聚物阳性细胞,或具有通过ICS的多功能抗原特异性CD8+T细胞的同龄组A的患者(即,通过至少一种测试阳性而不是两者),被发现具有通过ELISPOT的低的/中等的应答(即,在三次接种之后在12- 284SFU/106PBMC之间)。相反,四聚物阳性并具有确认的多功能抗原特异性 CD8+T细胞的同龄组C患者具有通过ELISPOT中等/高的免疫应答(即,在三次接种后在773-2517SFU/106PBMC之间)。
在此披露的结果证实了本发明的方法(包括预先给予干扰DNA复制的剂),具有改善存活蛋白疫苗功效的能力。因此,本发明的方法可以适于癌症的治疗,特别是在其细胞表面表达存活蛋白抗原的那些癌症。此外,由本发明疫苗所产生的免疫应答可能具有不仅靶向表达如疫苗中所包含的特异性存活蛋白抗原的肿瘤细胞的潜能。如图7中所示,由DPX-Survivac中的修饰存活蛋白肽所产生的免疫应答显示与天然肽的交叉反应性。
通过本发明方法(包括预先给予环磷酰胺随后给予存活蛋白疫苗)观察到的免疫诱导的水平,是非常明显的并且在其它自体抗原靶向的疫苗方法中是罕见的。这些强烈的免疫应答通常被认为在癌症患者中很难实现,并且它们将可能是临床上有意义的抗肿瘤免疫应答的基础。同龄组C中的应答强度证实了预先添加低剂量环磷酰胺,作为免疫调节药物,是改善疫苗功效和产生所记录的强免疫应答的重要因素。
在此披露的临床结果提供了本发明方法的示例性实施方式,其对干扰DNA复制的任何剂和任何存活蛋白疫苗具有较广泛的应用,如同在此所描述的每一个一样。
干扰DNA复制的剂
本发明的方法涉及在给予如在此所描述的疫苗之前给予干扰DNA复制的剂。
如在此所使用的,表述“干扰DNA复制”意图包括预防、抑制或延迟复制 (copying)(即,复制(replicating))细胞DNA的生物过程的任何行为。本领域技术人员将理解存在各种用于预防、抑制或延迟DNA复制的机制,如例如DNA交联、DNA甲基化、碱基取代,等等。根据本发明的方法包括通过本领域已知的任何手段干扰DNA复制的任何剂的应用。在示例性实施方式中,并且在非限制的情况下,干扰DNA复制的剂是药物。
在一个实施方式中,干扰DNA复制的剂是这样的剂,当其以非化学疗法的剂量使用时,能够选择性影响免疫系统细胞中的DNA复制,意图调节免疫系统从而改善疫苗应答。“非化学疗法的”,其意味着剂的剂量是低于被用于直接或选择性破坏恶性或癌性细胞和组织的剂量的剂量。
干扰DNA复制的剂的其它实施方式包括干扰DNA复制以造成程序性细胞死亡的剂,其具有选择性地靶向免疫系统快速分裂细胞的能力。此类剂的目的是调节免疫系统的细胞以提升疫苗应答。典型以不期望是化学疗法的剂量使用此类剂,并且被认为对于用于人类是可接受的。选择性地靶向免疫细胞的目的可能是降低免疫抑制细胞的数量,和/或用于在去除靶向DNA复制的药物时诱导快速增殖的目的,消除涉及介导免疫应答的有用免疫细胞。
导致细胞死亡的干扰DNA复制可能由多种机制引起,包括但不限制,DNA交联的形成(例如,通过烷基化剂、铂化合物,等等)、DNA甲基化(即,通过甲基化剂)、碱基取代(即,通过核苷类似物)。示例性剂和其机制描述于癌症化疗和生物疗法:原理和实践(CancerChemotherapy and Biotherapy:Principles and Practice)中(凯伯纳(Cabner)B.A.,第5版,利平科特-威廉姆斯和威尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins),宾夕法尼亚州(PA),美国,2011)。
在一个实施方式中,干扰DNA复制的剂是烷基化剂。烷基化剂包括,但不限于,环磷酰胺、替莫唑胺、异环磷酰胺、马磷酰胺、美法仑、白消安 (busulphan)、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、卡莫司汀、或双-氯乙基亚硝基脲 (BCNU)、苯丁酸氮芥、丝裂霉素C、及它们的衍生物、活性代谢物或代谢物中间体。适当的衍生物可以是,例如,并非限制,帕利伐米(例如,异环磷酰胺的衍生物)。
在另一实施方式中,干扰DNA复制的剂是铂化合物。铂化合物包括,但不限于,卡铂、顺铂、奥沙利铂及它们的衍生物。
在另一实施方式中,干扰DNA复制的剂是甲基化剂。甲基化剂包括,但不限于,替莫唑胺、丙卡巴肼和达卡巴嗪,及它们的衍生物。
在另一实施方式中,干扰DNA复制的剂是核苷类似物。核苷类似物的非限制性实例包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara-C)及它们的衍生物。
在另一实施方式中,也可以使用通过抑制DNA复制关键酶来间接抑制DNA复制的任何药物,例如拓扑异构酶I、拓扑异构酶II、或DNA聚合酶。此类药物包括,例如,并非限制,阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、依托泊苷、替尼泊苷、托泊替康、喜树碱、伊立替康、阿昔洛韦、和更昔洛韦。
干扰DNA复制并可以用于本发明方法的示例性剂包括,并不限制,在下表3 中所列出的那些。正如本领域技术人员将理解,这些是可以使用的剂的实例。另外的剂包括,例如,通过类似机制干扰DNA复制的和/或具有类似官能团的任何药物或化合物。
表3:
在具体的实施方式中,干扰DNA复制的剂是氮芥烷基化剂,或其任何中间代谢物或活性代谢物。氮芥是非特异的DNA烷化剂。通过胺氮的氯化物的分子内置换,使氮芥形成环状铵离子(吖丙啶环)。然后这种吖丙啶基团能够通过攻击鸟嘌呤碱基上的N-7亲核中心来烷基化DNA。当置换第二个氯时,发生了第二个烷基化步骤,其导致了链间交联(ICL)的形成。由于它们阻断了基础代谢过程例如DNA 复制和转录,所以这些损害是高度细胞毒性的。
本发明的方法包括使用任何此类非-特异性氮芥DNA烷基化剂。特别合适的氮芥烷基化剂可以包括,例如,并非限制,环磷酰胺、帕利伐米、苯达莫司汀、和异环磷酰胺(ifosfamide)。
本发明方法还包括使用DNA烷基化剂的中间代谢物和/或活性代谢物,特别是在此所描述的氮芥DNA烷基化剂的中间代谢物和/或活性代谢物。此类代谢物包括,并非限制,醛磷酰胺、4-羟基环磷酰胺、4-羟基异环磷酰胺、氯乙醛和磷酰胺氮芥。
在另外的实施方式中,干扰DNA复制的剂可以是在此所描述的烷基化剂、铂化合物、甲基化剂、或核苷类似物的任何合适的药学上可接受的盐、酯、互变异构体、立体异构体、外消旋混合物、溶剂化物、水合物或前体药物。
在具体的实施方式中,干扰DNA复制用于本发明方法中的剂是环磷酰胺。
环磷酰胺(CPA)
环磷酰胺(N,N-双(2-氯乙基)-1,3,2-氧杂磷杂环戊烷-2-氨基2-氧化物),还称为胞磷烷,是氮芥烷基化剂。环磷酰胺的化学结构是:
环磷酰胺(CPA)是被典型通过静脉输注给予的前体药物,但还可以胃肠外和口服给予(德·乔格(de Jonge),胡伊特马(Huitema)等人,2005),生物利用度几乎没有差异(朱马(Juma),罗杰斯(Rogers)等人,1979)。在肝脏中,通过 P450酶的氧化,CPA被转化为其活性代谢物,4-羟基-CPA和醛磷酰胺 ((Emmenegger,Shaked等人,2007;2011)。CPA的活性代谢物是脂溶性的并通过被动扩散进入细胞。胞内4-OH-CPA自发分解成作为最终活性代谢物的磷酰胺芥。磷酰胺芥催化链内和链间DNA交联以及DNA-蛋白交联,其抑制DNA复制导致细胞死亡(德·乔格(de Jonge),胡伊特马(Huitema)等人,2005)。磷酰胺芥通过由胞质醛脱氢酶(ALDH)的酶促转化为羧基磷酰胺来消除(埃门根 (Emmenegger),谢克德(Shaked)等人,2007;2011)。具有低水平ALDH的细胞倾向于积累CPA代谢物并且对它的作用更加敏感,并且事实上ALDH的肿瘤上调是CPA抗性的一种机制(张(Zhang),田(Tian)等人,2005)。除了ALDH,低的胞内ATP水平也与CPA对特定细胞类型的选择性有关(赵(Zhao),曹(Cao)等人,2010)。在高剂量下,典型的是在1-5g/m2的范围内,CPA的功效是对任意细胞类型的快速分裂细胞具有最大细胞毒性,并且因为大多数的造血细胞是快速分裂的,因此CPA是骨髓抑制的(布鲁斯(Bruce),米克(Meeker)等人,1966;史密斯(Smith)和史拉黛克(Sladek)1985)。
CPA的总系统清除以及它的代谢物在5-9小时之间变化,并且母体的峰值血浆水平也在患者之间具有很大差别(3-11小时),反映出从人到人的新陈代谢的遗传学差异(科恩(Cohen),饶(Jao)等人,1971;莫里森(Mouridsen),法伯尔 (Faber)等人,1974)。据报道,通过增加新陈代谢中所涉及的酶的活性,反复给予 CPA缩短消除半衰期(德茵凯茨(D’Incalci),博利(Bolis)等人,1979),但是这是否将导致增加活性代谢物的代谢是未知的(德·乔格(de Jonge),胡伊特马 (Huitema)等人,2005),特别是在低剂量下(埃门根(Emmenegger),谢克德(Shaked)等人,2007)。
从人类向小鼠的剂量转换研究是使用以下方程计算:
人类剂量(mg/kg)=动物Km
动物剂量(mg/kg)=人类Km
其中常数小鼠Km值是3,并且人类Km值是37(里根-肖(Reagan-Shaw),尼哈尔(Nihal)等人,2008)。使用这种计算,由50mg BID、PO组成的人类每日节律式治疗等价于小鼠的20.56mg/kg。20mg/kg PO的剂量已经在临床前模型中进行了评估,并且确定是与人类剂量生物等价(沃尔克(Voelcker),瓦格纳 (Wagner)等人,1984;曼(Man),博奇(Bocci)等人,2002)。
在近二十年中,已经意识到低剂量CPA的免疫调节和抗血管形成作用。与高剂量的CPA相反,低剂量CPA,典型的是100-300mg/m2,缺乏广泛的细胞毒性活性,但是似乎可以通过免疫系统的选择性调整细胞以及还通过降低肿瘤微环境内的血管发生,提高免疫介导的肿瘤消除。只是,低剂量CPA疗法已经被证实了在动物模型中延迟肿瘤生长,但是在完全根除肿瘤方面是无效的。CPA诱导的肿瘤延迟的机制是与免疫疗法的其他形式的组合互补的,例如癌症疫苗。低剂量CPA,典型的是<300mg/m2,可以按单次弹丸注射(sbCPA)或口服数天按节律式疗法 (mCPA)递送。20世纪80年代(诺思(North),1982;阿瓦德(Awwad)和诺思(North),1988)罗伯特·诺思(Robert North)的开创性研究第一次表明CPA选择性地耗尽免疫抑制细胞,该免疫抑制细胞负责平息对肿瘤的有效免疫应答。从那时起,也已经报道了CPA选择性地降低并修复CD4+CD25hiFoxP3+调节T细胞的功能(路西卡(Lutsiak),塞纳尼(Semnani)等人,2005),抑制肿瘤血管发生 (Browder(Browder),巴特菲尔德(Butterfield)等人,2000),增加树突细胞的活化(瑞吉思科(Radojcic),贝泽克(Bezak)等人,2009),向Th1偏斜免疫应答(施凡尼(Schiavoni),马泰(Mattei)等人,2000)和储存T和NK效应子功能 (林格利(Ghiringhelli),梅纳德(Menard)等人,2007)。在小鼠中,CPA的单次弹丸低剂量给予的功效是暂时性的,典型的是在给予后的4天内到达最低点,并且经过7-10天回到正常(路西卡(Lutsiak),塞纳尼(Semnani)等人,2005;塞伦(Salem),奥-卡米(Al-Khami)等人,2012)。
在临床前模型和临床试验中,低剂量CPA已经与癌症疫苗组合。赫曼斯 (Hermans)等人检查了在荷瘤小鼠中低剂量CPA治疗的效果,该荷瘤小鼠已经用 DNA/MVA初免/加强策略进行了预防免疫。简言之,将小鼠用编码肿瘤抗原mel3 的质粒进行免疫,然后在14天后用编码相同抗原的MVA进行加强。在MVA加强后的七天,小鼠用B16-F10肿瘤的激发,并且随后每6天用低剂量CPA(175 mg/kg,IP)进行治疗(赫曼斯(Hermans),庄(Chong)等人,2003)。他们发现先免疫并且然后用低剂量CPA进行治疗的小鼠的肿瘤生长显著延迟,但是任一单独治疗并没有作用。他们没有检测到抗原特异性CD8+T细胞数量的增加。巴尔邦 (Barbon)等人在非荷瘤小鼠中的研究证实了在编码CYP1B1抗原的DNA疫苗之前所给的低剂量CPA(20mg/kg/天IP)的3次每日注射提供了比在疫苗前2天单次给予低或高剂量(20或200mg/kg)CPA更好的免疫应答(巴尔邦(Barbon),杨 (Yang)等人,2010)。在最后一次剂量在接种前2天进行的情况下,服用CPA的每日剂量。在本研究中,每日CPA治疗,在少量(sparing)效应CD8+T细胞的情况下,在降低Treg总数量方面更有效。和田(Wada)等人研究了在自体TRAMP- C2/HA前列腺肿瘤模型中,低剂量CPA(50mg/kg IV)和GVAX疫苗的各种方案 (和田(Wada),吉村(Yoshimura)等人,2009)。这些肿瘤在小鼠体内自然地发展并且表达HA抗原。CPA在接种之前或之后被给予一次,以建立最好的方案。单次低剂量弹丸的预先给予在产生CD8+T细胞方面是最为有效的。通过与每次疫苗前(CPA给药的第-1天和第6天)单次剂量的低剂量环磷酰胺组合的给小鼠两次接种间隔7天(第0天和第7天),进一步提高疫苗的免疫原性。他们报导总循环 CD4和CD8的数量上的增加,并且尤其是抗原特异性CD8+T细胞的增加。塞伦 (Salem)等人的研究评估了在接种前3天,以单次快速灌注方式低剂量给予的 CPA的不同的剂量(塞伦(Salem),加地曼(Kadima)等人,2007)。本研究使用了转基因模型,由此在OT-1转基因T细胞过继转移前2天并且在小鼠用在PBS 中皮下注射(s.c.)递送的卵清蛋白肽(100ug;SIINFEKL,257-264)接种的前3 天,将野生型小鼠用CPA的单次IP注射进行治疗。疫苗增加循环抗原特异性T细胞的数量的能力在用PBS、1mg CPA或4mg CPA的预处理后进行测量。他们发现 1mg CPA(相对应于50mg/kg的剂量)并没有比PBS-假治疗扩增更多的抗原特异性OT-I T细胞,但是4mg CPA(相对应于200mg/kg)做到了。尽管这两种剂量都被认为是“低剂量”,单次给予并没有导致疫苗诱导的免疫应答的连续增强。最近,奔(Peng)等人在TC-1 HPV16肿瘤模型中,将每日CPA(10mg/kg/天)和与编码 HPV16 E7蛋白的DNA疫苗组合的sbCPA(50mg/kg)进行了比较(奔(Peng),莱福德-派克(Lyford-Pike)等人,2012)。在这种模型中,小鼠在移植后9天开始治疗上的接种,并且在接下来的两个周每周一次进行重复。连续给予mCPA持续四周,或在每次接种前以单低剂量进行给予。所有的CPA治疗在第8天开始,在第一次接种前一天。他们发现与疫苗组合的sbCPA和mCPA二者,提供了增加的肿瘤保护并且在每次疫苗之前CPA的单次给予提供了最强的CD8应答和最佳抗肿瘤活性。最终,泰伊白(Taieb)等人在黑色素瘤模型中测试了具有Mart-1胞外体疫苗的低剂量CPA(泰伊白(Taieb),查帕特(Chaput)等人,2006)。简言之,在第0 天将HLA-A2转基因小鼠用B16.A2肿瘤进行移植,然后在第6天用低剂量CPA (100mg/kg IP)进行治疗并且在第12天进行接种。用该组合所治疗的小鼠证实了比二者任一种的单独治疗更好的肿瘤控制,以及抗原特异性CD8+T细胞和IFN-γ释放的显著增加。
低剂量的CPA也在临床试验中进行了测试。林格利(Ghiringhelli)等人首先报到了mCPA(没有接种)在第IV阶段的癌症患者中以50mg BID递送一个月导致循环的Treg的显著降低,但是CD4、CD8和NK细胞的总循环水平并没有受到影响 (林格利(Ghiringhelli),梅纳德(Menard)等人,2007)。此外,他们报道了在所治疗的患者中T细胞和NK细胞具有提高的增殖能力,表明mCPA治疗可以与疫苗良好组合。第I/II期研究(n=14)比较了在14名卵巢癌患者中,在CPA的单次低剂量弹丸剂下(sbCPA,在接种前2天300mg/m2的静脉注射递送)和没有CPA 的单次低剂量弹丸剂下树突细胞疫苗(单核细胞衍生的树突细胞,载有Her2/neu,hTERT和PADRE肽)的功效(朱(Chu),波伊尔(Boyer)等人,2012)。据报道,接受组合治疗的患者潜在具有更好的无进展存活期和总体存活期,但是由于小患者群体,结果无统计学意义。他们没有在以CPA治疗的患者中检测出循环Treg 的降低,并且没有证实在CPA和非CPA组之间如通过IFN-γELISPOT所测量的T 细胞应答的提高。另一个在黑色素瘤患者中的单组的第II期研究(n=28)测试了树突细胞疫苗(自体树突细胞,载有衍生自KLH、存活蛋白、hTERT、p53和 PADRE的肽,皮内接种)与口服递送但是在接种后开始的mCPA(50mg BID,一周进行-一周停止)的组合(恩格尔-诺雷加德(Engell-Noerregaard)等人,2012)。在评估本单组试验疫苗诱导的免疫应答中(其结合了基于DC的疫苗与IL-2,和 Cox-2抑制剂以及CPA),IFN-γELISPOT表明从基线至第四次接种的适度的免疫应答,随着时间的推移伴随着缓慢的应答下降发生。重要的是,这些应答是低频的或不可直接先体外后体内检测的,典型的是单肽疫苗疗法。这些患者中的应答不直接与接受疫苗而没有用CPA治疗的患者相比,并且不清楚单独的CPA或与IL-2和 Cox-2抑制剂组合(如果有的话)是否有助于疫苗的功效。
在卵巢癌患者中的单组第II期试验(n=10)中,将包含p53-SLP(合成的长肽)的疫苗(其由十种在山小星蒜碱中乳化的合成重叠肽组成,并且被皮下递送至患者(每隔3周))与CPA的单次低剂量弹丸剂组合(sbCPA,300mg/m2,在接种前2天)。本研究报道了,当与测试单独疫苗的之前试验比较时,在接受组合疗法的患者中的IFN-γELISPOT应答增加(维尔梅吉(Vermeij),莱弗茨(Leffers)等人,2011)。然而,比较不同试验之间的治疗结果,容易选择偏差,这将能够使结果偏斜。在黑色素瘤中更系统进行的试验,比较了在有或没有sbCPA(300mg/m2,接种之前)的情况下,半皮下地和半皮内地与T协助细胞肽一起作为油包水乳剂一起递送的两种独特的多肽疫苗(包含肽到酪胺酸酶、MAGE-A1、MAGE-A3、 gp100、MAGE-A10和/或NY-ESO1)的用途。本研究通过ELISPOT仔细地检查接种后CD4+and CD8+T细胞应答,并且发现当与接种组合时sbCPA提供了不可检测到的改善。最终,沃尔特(Walter)等人在肾细胞癌中的第I/II期研究测试了肽疫苗(IMA901)与sbCPA(300mg/m2在接种前3天)的组合(沃尔特(Walter),魏因申克(Weinschenk)等人,2012)。这两组第II期研究(n=68)比较了用和没有用sbCPA治疗的疫苗。他们报道了在用sbCPA/疫苗组合治疗的组内的免疫应答个体比相同组中非应答个体具有更好的生存,并且仅用疫苗治疗的组也是如此。然而,sbCPA治疗对疫苗的免疫原性没有可测量的功效。
总之,已经在临床试验中测试与疫苗结合的CPA,两者在接种前以单次低剂量静脉输注,以及在接种后以节律式低剂量口服疗法开始。这些试验产生了矛盾的结果,并且没有证实用于增强疫苗活性的目的而使用低剂量CPA的明确和广泛适用的益处。
到目前为止并且根据诸位申请人的知识,在接种前给予单次低剂量CPA或多次低剂量CPA的益处还没有直接在临床试验中进行比较。我们将根据本发明方法 (包括在用基于我们多肽的存活蛋白疫苗接种癌症患者之前,重复CPA给予(在相同试验中,针对不使用CPA的疫苗进行测试))所获得的结果,与在癌症患者中用两种不同的基于多肽的疫苗MELITAC 12.1和MELITAC 12.6接种前,用单次低剂量CPA所获得的结果进行比较(两者都在相同试验中针对无CPA的疫苗进行测试),史林格勒夫(Slingluff)等人(2011)。
在不存在CPA预治疗的情况下,存活蛋白肽疫苗与黑色素瘤疫苗MELITAC 12.1和MELITAC 12.6都具有基于ELISPOT结果的类似的免疫原性潜力。由用单独的MELITAC 12.1和MELITAC 12.6的高达三次接种产生的免疫应答对MELITAC 12.1而言为0-1095点/100,000CD8+T细胞的范围和对MELITAC 12.6而言为0-700 点的范围。在比较中,来自接受高达三次单独DPX-Survivac接种的患者的ELISPOT 值,在从点/1,000,000PBMC转化值为点/100,000CD8+T细胞之后,为在0-291点 /100,000CD8+T细胞的范围内。通过流式血细胞计数术来确定患者PBMC中的T细胞计数,并且将在此呈现的数据转化为点/100,000CD8+T细胞的数量,用于与由 MELITAC疫苗产生的结果的直接比较。
比较起来,在疫苗之前将MELITAC 12.1和MELITAC 12.6与单次低剂量CPA 组合分别产生了对于MELITAC 12.1和MELITAC 12.6的从0-1095和从0-700范围的免疫应答。因此,在MELITAC 12.1和MELITAC 12.6之前通过给予单次剂量的 CPA产生的免疫应答与单独的疫苗相比基本上是不变的。
相反,在用DPX-Survivac接种之前被给予多剂量CPA的患者产生了0-8467点 /100,000CD8+T细胞范围的ELISPOT应答。这种在用DPX-Survivac接种前反复给予CPA之后的免疫应答的显著增加(0-8467与0-291),证实了在接种前用反复低剂量环磷酰胺的预-治疗,比在接种前给予单次低剂量环磷酰胺更有益于通过疫苗提高免疫应答。
疫苗组合物
如在此所使用的,术语“疫苗”、“疫苗组合物”或“组合物”可互换使用。
本发明的疫苗组合物,与干扰DNA复制的剂一起使用,可以是适于向受试者递送存活蛋白抗原的任何形式。根据本发明的疫苗组合物可以根据已知的方法进行配制,例如通过将一种或多种存活蛋白抗原与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体混合,优选的是可为向人类给予可接受的那些。此类赋形剂、载体和配制方法的实例例如可以在雷明顿药学大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(马克出版有限公司(Maack PublishingCo),伊斯顿(Easton),PA)中找到。为了配制适于有效给予的药学上可接受的疫苗组合物,此类组合物将典型地包含治疗有效量的存活蛋白抗原,例如如在此描述的存活蛋白多肽、存活蛋白肽或存活蛋白肽变体,或编码此类存活蛋白抗原的核酸分子或载体。
可以将根据本发明的疫苗组合物以治疗有效量给予受试者。如在此使用的,“治疗有效量”意指有效治疗、预防、缓解、或改善癌或癌症症状的疫苗或有效成分 (例如,一种或多种存活蛋白抗原)的量;延长被治疗患者的生存期;和/或刺激、诱导或增强受试者的免疫应答,例如细胞毒性T细胞应答。在一些实施方式中,疫苗的治疗有效量是能够在癌症治疗中在受试者中诱导临床应答的量。疫苗的治疗有效量的确定,尤其是根据在此提供的披露,完全在本领域技术人员的能力之内。治疗有效量可以根据多种因素例如受试者的状况、体重、性别和年龄而变化。
一旦一种或多种适当的存活蛋白抗原被选择包含在根据本发明的疫苗组合物中,那么抗原可以通过本领域已知的各种适当方式进行递送。用于在此所描述方法中的疫苗组合物可以包括,例如,并非限制,脂肽(例如,维迪耶罗(Vitiello)等人,临床研究杂志(J.Clin.Invest.)95:341,1995)、封装在聚(DL-乳酸-乙醇酸共聚物)(“PLG”)微球内的肽组合物(参见,例如,爱尔德里奇(Eldridge)等人,分子免疫学(Molec.Immunol.)28:287-294,1991;阿朗索(Alonso)等人,疫苗 (Vaccine)12:299-306,1994;琼斯(Jones)等人,疫苗(Vaccine)13:675-681, 1995)、包含在免疫刺激复合物(ISCOMS)的肽组合物(参见,例如,高桥 (Takahashi)等人,自然(Nature)344:873-875,1990;胡(Hu)等人,临床和实验免疫学(Clin Exp Immunol.)113:235-243,1998),多抗原肽系统(MAP)(参见,例如,塔姆(Tam),J.P,美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)85: 5409-5413,1988;塔姆(Tam),J.P,免疫法杂志(J.Immunol.Methods)196:17- 32,1996)、配制为多价肽的的肽、用于冲击式递送系统的肽、典型地结晶的肽、病毒传递载体(佩尔库斯(Perkus),M.E.等人,出处:疫苗发展的概念(In: Concepts in vaccine development),考夫曼(Kaufmann),S.H.E.,编辑,第379 页,1996;查克拉巴蒂(Chakrabarti),S.等人,自然(Nature)320:535,1986;胡 (Hu),S.L.等人,自然(Nature)320:537,1986;基尼(Kieny)M.-P.等人,艾滋病生物/技术(AIDS Bio/Technology)4:790,1986;托普(Top),F.H.等人,传染病期刊(J.Infect.Dis.)124:148,1971;钱达(Chanda),P.K.等人,病毒学 (Virology)175:535,1990)病毒或合成来源的粒子(例如,科夫勒(Kofler),N. 等人,免疫法杂志(J.Immunol.Methods.)192:25,1996;爱尔德里奇 (Eldridge),J.H.等人,血液学讲座(Sem.Hematol.)30:16,1993;法洛 (Falo),L.D.,Jr.等人,自然医学(Nature Med.)7:649,1995),佐剂(沃伦 (Warren),H.S.,沃格尔(Vogel),F.R.,和谢迪(Chedid),L.A.,免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)4:369,1986;古普塔(Gupta),R.K.等人,疫苗 (Vaccine)11:293,1993)、脂质体(雷迪(Reddy),R.等人,免疫学杂志(J. Immunol.)148:1585,1992;罗克(Rock),K.L.,今日免疫学(Immunol.Today) 17:131,1996)、或,裸cDNA或粒子吸收的cDNA(厄尔默(Ulmer),J.B.等人,科学(Science)259:1745,1993;罗宾逊(Robinson),H.L.,亨特(Hunt), L.A.,和韦伯斯特(Webster),R.G.,疫苗(Vaccine)11:957,1993;希弗 (Shiver),J.W.等人,出处:疫苗发展的概念(In:Concepts in vaccine development),考夫曼(Kaufmann),S.H.E.,编辑,第423页,1996;西斯 (Cease),K.B.,和波佐夫斯基(Berzofsky),J.A.,免疫学年度评论(Annu. Rev.Immunol.)12:923,1994和爱尔德里奇(Eldridge),J.H.等人,血液学讲座 (Sem.Hematol.)30:16,1993)。
本发明的疫苗组合物还包括核酸介导的形式。例如,可以向受试者给予编码如在此描述的存活蛋白抗原中的一种或多种的DNA或RNA。此类方法描述于,例如,沃尔夫(Wolff)等人,科学(Science)247:1465(1990)连同美国专利号 5,580,859;5,589,466;5,804,566;5,739,118;5,736,524;5,679,647;和WO 98/04720中。基于DNA的递送技术的实例包括“裸DNA”、促进(布比卡因、聚合物、肽介导的)递送、阳离子脂质复合物、和粒子介导的(“基因枪”)或压力介导的递送(参见,例如,美国专利号5,922,687)。
在疫苗组合物的另外实施方式中,存活蛋白抗原(例如,存活蛋白肽)还可以通过病毒或细菌载体来表达。表达型载体的实例包括减毒病毒宿主,例如牛痘或禽痘。这种方法涉及牛痘病毒的使用,例如,作为表达编码如在此描述的存活蛋白肽的核苷酸序列的载体。当引入急性或慢性感染的宿主或引入非感染宿主时,重组牛痘病毒表达抗原肽,并且从而引起宿主免疫应答。牛痘载体和用于免疫方案中的方法被描述于,例如,美国专利号4,722,848。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG 载体被描述于斯托弗(Stover)等人,自然(Nature)351:456-460(1991)中。用于治疗性给予或免疫本发明肽的多种多样的其他载体,例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门菌载体、脱毒的炭疽毒素载体、以及类似物,对本领域技术人员来说是显而易见的,并且被在此所描述的疫苗组合物所包括。
根据本发明的疫苗还包括,包含存活蛋白抗原中的一种或多种的组合物,其中抗原可以单独存在或作为包含多拷贝相同或不同存活蛋白抗原的构建物存在。例如,存活蛋白抗原可以作为编码相同或不同存活蛋白抗原中的若干种的单核酸分子 (例如,载体)存在。或者,在其他实施方式中,可以使用包括多拷贝相同存活蛋白抗原的均聚物,或各种不同存活蛋白抗原的均聚物。此类多聚体可具有的优点是,由于它们包括存活蛋白抗原的多重拷贝,因此提供了增加的免疫反应,这样使得产生的作用可以是增强的用存活蛋白的一个或多个抗原决定簇诱导免疫应答的能力。组合物可以包括一种或多种存活蛋白抗原的天然发生的区,或可以包括制备的抗原,例如,重组地或通过化学合成。
本发明的疫苗还可以包括抗原呈递细胞(APC),例如树突细胞(DC),作为运载体以呈现一种或多种存活蛋白抗原(例如,存活蛋白肽)。此类疫苗组合物可以在体外产生,随后树突细胞动员(motibilization)并收获,从而树突细胞的装载发生在体外。例如,树突细胞用编码多种存活蛋白抗原之一的DNA或RNA进行转染,或是用存活蛋白肽抗原脉冲处理。然后可以将树突细胞给予受试者,以在体内引起免疫反应。
根据本发明的疫苗可以通过适当的方式给予,如例如,注射(例如,肌内注射的、真皮内的、皮下的、静脉内的、或腹膜内的)、雾化吸入、口服、鼻、局部的、鞘内的、经皮肤的、经粘膜的、或任何其他适当的途径。针对受试者体内的全身分布或定位分布来配制疫苗。系统性配制品包括为通过注射所给予而设计的那些,以及为经皮的、经粘膜的或口服给予而设计的那些。
针对注射,疫苗可以被配制到载体中,该载体包括如在此描述的连续相的疏水物质,例如,油包水乳剂或油基载体。在一些实施方式中,脂质体可以与载体一起被使用。疫苗还可以被配制为水性溶液,例如汉克溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲剂。
如从以上可见的,本发明的疫苗组合物意在包括用于癌症治疗的任何组合物或抗原递送手段(例如,病毒载体),包括能够刺激受试者免疫应答的组合物,例如当给予时的特异性细胞毒性T细胞的应答。
为了获得本发明的疫苗组合物,可以适当地组合存活蛋白抗原,该存活蛋白抗原可以是相对小的存活蛋白肽,和各种材料例如佐剂、赋形剂、表面活性剂、免疫刺激组分和/或载体。佐剂可以包括在疫苗组合物中,以增强特异性免疫应答。根据所希望的给予途径或所希望的受试者中的分布,例如全身的或局部的,可以使用不同的载体。
在具体的实施方式中,用于本发明方法的疫苗是这样的组合物,其包括至少一种存活蛋白抗原、脂质体、和包括连续相的疏水性物质的载体。在进一步的实施方式中,组合物可另外包括佐剂。在进一步的实施方式中,组合物可另外包括T辅助细胞表位或抗原。
因此,在一个实施方式中,疫苗组合物包括一种或多种存活蛋白抗原;T辅助细胞表位;佐剂;脂质体;和包括连续相的疏水物质的载体。T辅助细胞表位可以,例如,是包括氨基酸序列AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:9)的肽。佐剂可以,例如,是polyI:C多核苷酸。
在进一步的实施方式中,用于本发明方法的疫苗是这样的组合物,其包括至少一种存活蛋白抗原,与免疫疫苗(immunocaccine)公司的基于脂质体和/或基于两亲化合物的疫苗辅助平台,包括但不限于,和DepoVaxTM平台技术(参见,例如,美国专利号6,793,923和7,824,686;WO 2002/038175;WO 2007/041832;WO 2009/039628;WO 2009/043165和WO 2009/146523)。该 DepoVaxTM平台是疫苗递送制剂,其向免疫系统提供抗原加佐剂的受控制的和延长的暴露。该平台能够提供强的、特异性的和持续的免疫应答,并且能够是单次剂量有效。
在进一步的实施方式中,本发明的疫苗是如以上所描述的任何适合的组合物,其包括一种或多种具有如下氨基酸序列的存活蛋白肽抗原:FEELTLGEF(SEQ ID NO:1);FTELTLGEF(SEQ ID NO:2);LTLGEFLKL(SEQ ID NO:3); LMLGEFLKL(SEQ ID NO:4);RISTFKNWPF(SEQ ID NO:5);RISTFKNWPK (SEQ ID NO:6);STFKNWPFL(SEQ ID NO:7);和LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8)。
在进一步的实施方式中,疫苗组合物包括五种包含如下氨基酸序列的存活蛋白肽抗原:FTELTLGEF(SEQ ID NO:2)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO:4)、 RISTFKNWPK(SEQ ID NO:6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO:7)、和 LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8);T辅助细胞表位;佐剂;脂质体;和包括连续相的疏水物质的载体。T-辅助细胞表位可以,例如,是包括氨基酸序列AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:9)的肽。佐剂可以,例如,是polyI:C多核苷酸。脂质体可以,例如,由1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC;合成的磷脂)和胆固醇构成。疏水的载体可以,例如,是 ISA51 VG。
在具体的实施方式中,本发明的疫苗可能是免疫疫苗公司的候选抗癌症免疫疗法疫苗DPX-Survivac。DPX-Survivac包括五种具有如下氨基酸序列的合成存活蛋白肽抗原:FTELTLGEF(SEQ ID NO:2)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO:4)、 RISTFKNWPK(SEQ ID NO:6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO:7)、和LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8);来自破伤风类毒素的通用T辅助细胞表位 (AQYIKANSKFIGITEL;SEQ ID NO:9);聚肌胞甘酸(polyI:C)多核苷酸佐剂;由DOPC和胆固醇组成的脂质体;和疏水载体 ISA 51 VG。每种组分的示例性的量(/ml疫苗)包括,但不限于,1.0mg的每种存活蛋白抗原;0.5mg 的T-辅助细胞表位(例如,SEQ IDNO:9);0.4mg的佐剂(例如,polyI:C多核苷酸);120.0mg的合成DOPC磷脂;12.0mg的胆固醇;和0.7ml的疏水载体(例如, ISA51VG)。
疫苗可以任选地进一步包括另外的组分如例如,乳化剂。疫苗的示例性实施方式的更详细披露,及其组分,描述如下。
](i)存活蛋白抗原
本发明的疫苗组合物包括至少一种存活蛋白抗原。表述“至少一种”在此可以与表述“一种或多种”互换使用。这些表达,在此除非另外明确指明,是指疫苗中不同存活蛋白抗原的数量,并且不是指任何具体的存活蛋白抗原的质量。根据“至少一种”或“一种或多种”的普通含义,本发明的疫苗组合物包含最少一种存活蛋白抗原。
存活蛋白,也称作凋亡重复相容5(apoptosis repeat containing 5)(BIRC5)的杆状病毒抑制剂,是涉及凋亡的负向调控的蛋白质。它已被归类为凋亡蛋白抑制剂 (IAP)家族中的成员。存活蛋白是包含单一BIR基序和代替无名指(RING finger)的高电荷羧基末端螺旋区的16.5kDa胞浆蛋白。编码存活蛋白的基因与效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)的序列几乎相同,但是定位于相反方向。存活蛋白的编码序列(智人)为包括终止密码子的429个核苷酸长(SEQ ID NO:10)。编码的蛋白质存活蛋白(智人)是142个氨基长(SEQ ID NO:11)。
假定,存活蛋白功能是抑制胱天蛋白酶活化,从而导致凋亡或程序性细胞死亡的负向调控。与该功能一致,存活蛋白已经被确定为在许多类型的癌症中而不是在正常组织中总是上调的TOP基因之一(参见,例如,阿尔铁里(Altieri)等人,实验室研究(LabInvest)79:1327-1333,1999;和美国专利号6,245,523)。因此,该事实使得存活蛋白成为理想的癌症疗法的靶标,因为癌细胞被靶向而正常细胞不被靶向。事实上,存活蛋白在包括人类癌症的大部分的许多肿瘤类型中高度表达,并且被报道具有预后价值。
本发明的疫苗包括一种或多种存活蛋白抗原。如在此使用的,术语“存活蛋白抗原”包括了任何肽、多肽或衍生自存活蛋白的或其片段的其变体(例如,存活蛋白肽变体)。术语“存活蛋白抗原”还包括多核苷酸,该多核苷酸编码在此所述的存活蛋白肽、存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等价物。多核苷酸可以是DNA(例如,基因组DNA或cDNA)或RNA(例如,mRNA)或其组合。它们可以是天然发生的或合成的(例如,化学合成的)。考虑多核苷酸可包含核苷酸链中的一种或多种含氮碱基、戊糖或磷酸基团的修饰。此类修饰在本领域是众所周知的,并且可为了例如改善多核苷酸稳定性的目的。
在一个实施方式中,存活蛋白抗原可包括全长存活蛋白多肽或编码全长存活蛋白多肽的核酸。可选地,存活蛋白抗原可以是包括任何长度存活蛋白的片段的存活蛋白肽。示例性实施方式包括存活蛋白肽,该存活蛋白肽包括至少5个、6个、7 个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸残基。在具体的实施方式中,存活蛋白肽由七肽、八肽、九肽、十肽或十一肽组成,这些七肽、八肽、九肽、十肽或十一肽分别由7个、8 个、9个、10个、11个存活蛋白(例如,SEQ ID NO:11)的连续的氨基酸残基组成。存活蛋白抗原的具体实施方式包括约9个或10个氨基酸的存活蛋白肽。
本发明的存活蛋白抗原还包括存活蛋白肽的变体和功能等价物。存活蛋白肽的变体和功能等价物包括显示与存活蛋白的特异序列相比具有差异的氨基酸序列的肽,例如一种或多种氨基酸取代、缺失或添加,或其组合。该差异可以测量为在存活蛋白蛋白质序列与存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等价物之间的同一性的降低。
在氨基酸序列之间的同一性可以使用本领域所熟知的算法来计算。存活蛋白肽变体或功能等价物,当他们是优选地在其整个长度范围,与存活蛋白的肽序列具有至少70%同一性,例如至少75%的同一性、至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、或至少95%的同一性,包括与存活蛋白肽序列的96%、 97%、98%或99%的同一性时,被看作是落入本发明“存活蛋白抗原”的含义中。在具体的实施例中,存活蛋白肽变体具有与SEQ ID NO:11的连续氨基酸序列至少 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。
可以从存活蛋白抗原衍生出的存活蛋白是来自表达蛋白质的任何动物品种中的存活蛋白。具体的实施方式是来自人类的存活蛋白(SEQ ID NO:11)。基于所选择的存活蛋白的序列,存活蛋白抗原可以通过存活蛋白或编码核酸的任何适当的化学或酶处理来进行衍生。可选地,存活蛋白抗原可以通过本领域普通技术人员熟悉的任何常规肽或核酸合成程序来合成。
本发明的存活蛋白抗原(肽或核酸)可以具有作为存活蛋白的天然序列的序列。可选地,存活蛋白抗原可以是通过一种或多种取代、缺失或添加修饰的肽或核酸序列,如例如,在此所描述的存活蛋白变体或功能等价物。增加肽的免疫原性的存活蛋白肽的示例性程序和修饰包括,例如,于WO 2004/067023中所描述的那些,其涉及在锚定位置引入氨基酸取代,这增加了结合至HLA I类分子的肽。
在一个实施方式中,存活蛋白抗原是衍生自存活蛋白、或其任何存活蛋白肽变体的任何肽,其能够结合MHC I类HLA分子。沿着这些线路,存活蛋白抗原可以是任何存活蛋白肽、或其存活蛋白肽变体,其能够诱导或加强受试者的免疫应答。
在一个实施方式中,存活蛋白抗原是包括来自存活蛋白(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的肽抗原,其能够在受试者中引起细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答,或是编码所述肽的核酸分子。
在一个实施方式中,CTL基于存活蛋白的氨基酸序列,疫苗包括一种或多种合成的存活蛋白肽、或其变体,例如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
存活蛋白肽、存活蛋白肽变体和存活蛋白功能等价物,以及其用于诊断和治疗的目的用途,特别是在癌症中,已经描述于,例如,WO 2004/067023和WO 2006/081826中。在这些出版物中所披露的新颖的肽被发现能够在癌症患者中引起细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。具体而言,在WO 2004/067023中,已经发现MHC I类限制性肽可以衍生自存活蛋白,其能够结合MHC I类HLA分子,从而在正在经受各式各样的癌症疾病的患者中引起先体外后体内和原位CTL免疫应答。
在一个实施方式中,本发明的疫苗可以包括披露于WO 2004/067023和WO 2006/081826中的存活蛋白肽、存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等价物中的任何一种或多种。
在另一个实施方式中,本发明的疫苗可以包括有能力结合选自HLA-A、HLA- B或HLA-C分子的任何MHC I类分子的存活蛋白肽、存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等价物中的一种或多种。
存活蛋白肽、存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等价物可以结合的示例性 MHC I类HLA-A分子包括,但不限于,HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、 HLA-A10、HLA-A11、HLA-A19、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A26、 HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、 HLA-A36、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、和HLA-A69。
存活蛋白肽、存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等价物可以结合的示例性 MHC I类HLA-B分子包括,但不限于,HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、 HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、 HLA-B22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、 HLA-B41、HLA-B42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-B46和HLA-B47。
存活蛋白肽、存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等价物可以结合的示例性 MHC I类HLA-C分子包括,但不限于HLA-C1、HLA-C2、HLA-C3、HLA-C4、 HLA-C5、HLA-C6、HLA-C7和HLA-C16。
在具体的实施例中,本发明的疫苗可以包括选自如下的存活蛋白肽抗原中的一种或多种:
以上列出的存活蛋白肽代表但不限于,本发明所包括的示例性MHC I类限制性肽。每种存活蛋白肽被认为结合的具体的MHC I类HLA分子显示在方括号右边。本发明的疫苗可以包括以任何适当的组合的这些存活蛋白肽中的一种或多种。
在另外实施方式中,本发明的疫苗包括以任何适当组合的以下列出的五种存活蛋白肽中的任何一种或多种:
在具体的实施方式中,本发明的组合物包括如在免疫疫苗公司发现的在以上列出的所有五种存活蛋白肽抗原、或任何组合或肽抗原中的一种或多种。在优选的实施方式中,组合物将包括所有五种存活蛋白肽抗原、候选抗癌免疫疗法疫苗DPX- Survivac。
除了至少一种存活蛋白抗原,本发明疫苗另外的实施方式可以包括用于治疗癌症或用于诱导或加强针对癌症的免疫应答的一种或多种另外的抗原。以下描述了此类另外的抗原的示例性实施方式。
(ii)另外的抗原
可以用于本发明组合物的其他抗原包括,但不限于,能够诱导或加强受试者免疫应答的剂,其将有益于癌症的治疗,例如,细胞介导的免疫应答。
细胞介导免疫是这样的免疫应答,其不涉及抗体而是涉及巨噬细胞和自然杀伤细胞的活化、抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的产生以及响应于抗原的各种细胞因子的释放。细胞毒T淋巴细胞是T淋巴细胞的亚群(白细胞的类型),其能够诱导感染的体细胞或肿瘤细胞的死亡;它们将杀死感染病毒(或其他病原体)的细胞,或以另外的方式损伤或功能障碍。
大多数细胞毒性T细胞表达T细胞受体,该T细胞受体可以识别与I类MHC 分子结合的特异性肽抗原。这些CTL还表达CD8(CD8+T细胞),该CD8吸引I 类MHC分子的部分。在抗原特异性活化期间,这种亲和性使得CTL和靶细胞紧密结合在一起。
细胞免疫通过,例如,活化抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(其能溶解在其表面显示外源抗原表位的身体细胞,例如病毒感染的细胞、具有胞内菌的细胞,和显示出肿瘤抗原的癌细胞);活化巨噬细胞和自然杀伤细胞(使他们来破坏胞内病原体);和刺激细胞分泌各种细胞因子(所述细胞因子影响涉及到获得性免疫应答和先天免疫应答的其他细胞的功能)来保护身体。
因此,在另外的实施方式中,本发明的疫苗组合物可以包括除一种或多种疫苗抗原以外的抗原。例如,该另外的抗原可以是,但不限于,肽,合适的天然的、非- 天然的、重组的或变性蛋白质或多肽,或其片段,或能够诱导或加强受试者CTL免疫应答的表位。
该另外的抗原还可以是编码起抗原作用的多肽的多核苷酸。基于核酸的接种策略是已知的,其中,向受试者给予包含多核苷酸的疫苗组合物。由多核苷酸编码的抗原多肽在受试者中表达,使得抗原多肽最终出现在受试者中,正如同疫苗组合物本身已经含有该多肽。用于本发明的目的,上下文规定的另外的抗原,包括此类多核苷酸,该多核苷酸编码起到抗原作用的多肽。
术语“多肽”包括氨基酸的任何链,不论长度(例如,至少6个、8个、10个、 12个、14个、16个、18个、或20个氨基酸)或翻译后修饰(例如,糖基化或磷酸化作用)如何,并且包括,例如,天然蛋白质、合成的或重组的多肽和肽、表位、杂交分子、变体、同系物、类似物、类肽、肽模拟物、等等。因此,变体或其衍生物包括缺失,其包括截短和片段;插入和添加,例如保守取代,定点突变,和等位变体;和修饰,其包括具有一种或多种非氨基酰基基团(例如,糖、脂质、等等) 的肽,该非氨基酰基基团共价地连接至肽和翻译后修饰。如在此使用的,术语“保守氨基酸取代”或“保持取代”是指在肽中的给定位置,一种氨基酸对另一种的取代,其中取代可以在相关功能没有实质性缺失的情况下完成。在进行此类变更中,可以在侧链取代基的相对相似度的基础上进行相似的氨基酸残基的取代,例如,其大小,电荷、疏水性、亲水性等等,并且此类取代可以通过常规测试针对其对肽功能的影响来评估。保持取代的特异性非限制性的实例包括以下实例:
可以使用与优选的抗原序列具有实质上同一性的多肽或肽。两种序列如果当最佳比对(允许有间隙)时,它们共同具有至少约50%序列同一性,或如果这些序列共同具有所定义的功能性基序,那么它们被认为是具有实质上同一性。在可选的实施方式中,最佳比对序列如果它们在指定区域上共同具有至少60%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性,那么可以被认为是实质上同一性的。术语“同一性”是指在两种多肽分子之间的序列相似性。同一性可以通过比较被比对的序列中的每个位置来确定。氨基酸序列之间的同一性程度是在由序列(例如,在指定区域上)所共有的位置上的相同的或匹配的氨基酸的数量的函数。用于同一性比较的序列的最优对比可以使用各种算法来进行,如本领域已知的,该算法包括ClustalW程序,可在http://clustalw.genome.ad.jp获得;史密斯 (Smith)和沃特曼(Waterman)的局部同源性算法,1981,应用数学进展(Adv.Appl.Math)2:482;内德勒曼(Needleman)和翁施(Wunsch)的同源性比对算法,1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443;皮尔森(Pearson)和李普曼 (Lipman)的相似性搜索方法,1988,美国科学院论文集(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)85:2444;和这些对比的计算机化实现(例如,在威斯康星遗传学分析软件包 (Wisconsin Genetics Software Package),遗传计算组(Genetics Computer Group),麦迪逊(Madison),威斯康辛州,美国中的GAP、BESTFIT、FASTA 和TFASTA)。还可以使用BLAST算法来确定序列同一性,其描述于阿尔丘尔(Altschul)等人,1990,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-10(使用所公开的默认设置)。例如,可以使用“BLAST 2序列”工具,其可以通过美国国家生物技术信息中心(通过在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi的互联网)获得,选择处于以下默认设置的“blastp”程序:期望阈值10;字号3;矩阵 BLOSUM 62;缺口值存在11,延伸1。在另一个实施方式中,本领域技术人员可以容易地并适当地对比任何既定的序列,并且仅通过肉眼观察推断序列同一性和/或同源性。
在本发明的疫苗中被用作为另外抗原的多肽和肽可以从自然来源中分离,合成,或是重组生成的多肽。肽和蛋白质可以在体外或体内重组表达。被用来实践本发明的肽和多肽可以使用本领域已知的任何方法完成并分离。被用来实践本发明的多肽和肽还可以使用本领域熟知的化学法,全部或部分地合成。参见,例如,卡拉瑟斯(Caruthers)(1980)核酸研讨会丛刊(Nucleic Acids Res.Symp.Ser.)215- 223;霍姆(Hom)(1980)核酸研讨会丛刊(Nucleic Acids Res.Symp.Ser.)225- 232;邦加(Banga),A.K,治疗性肽和蛋白、制品、处理和输送系统 (Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processing andDelivery Systems) (1995)Technomic出版社(Technomic Publishing Co.),兰卡斯特(Lancaster),宾夕法尼亚州。例如,可以使用各种固相技术来进行肽合成(参见,例如,罗贝热 (Roberge)(1995)科学(Science)269:202;梅里菲尔德(Merrifield)(1997) 酶学方法(Methods Enzymol.)289:3-13),并且可以,例如,使用根据由制造商所提供的说明书的ABI431A肽合成仪(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))来完成自动合成。
在一些实施方式中,另外的抗原可以是纯化的抗原,例如,约25%至50%纯度的,约50%至约75%纯度的,约75%至约85%纯度的,约85%至约90%纯度的,约 90%至约95%纯度的,约95%至约98%纯度的,约98%至约99%纯度的,或大于 99%纯度的。
如以上所指出,另外的抗原包括编码起抗原作用的多肽的多核苷酸。在此使用的,术语“多核苷酸”包括任何长度(例如,9个、12个、18个、24个、30个、60 个、150个、300个、600个、1500个或更多个核苷酸)或链数(例如,单链的或双链的)的核苷酸链。多核苷酸可以是DNA(例如,基因组DNA或cDNA)或RNA (例如,mRNA)或其组合。它们可以是天然发生的或合成的(例如,化学上合成的)。考虑多核苷酸可包含核苷酸链中的一种或多种含氮碱基、戊糖或磷酸基团的修饰。此类修饰在本领域是众所周知的,并且可用于例如将改善多核苷酸稳定性的目的。
可以用各种形式递送多核苷酸。在一些实施方式中,可以用线性形式或插入质粒中(例如表达质粒),使用裸多核苷酸。在其他实施方式,可以使用活载体例如病毒或细菌载体。
可以存在帮助将DNA转录为RNA和/或将RNA翻译成多肽的一种或多种调节序列。在一些情况中,例如在多核苷酸是信使RNA(mRNA)分子的情况下,不需要涉及转录过程的调节序列(例如,启动子),并且在启动子不存在的情况下可以影响蛋白质表达。技术人员可以根据情的需要况包括适合的调节序列。
在一些实施方式中,多核苷酸存在于表达盒中,其中多核苷酸可操作地连接到调节序列,该调节序列将允许多核苷酸在被给予本发明组合物的受试者中进行表达。表达盒的选择取决于组合物被给予的受试者,以及希望所表达的多肽的特征。
典型地,表达盒包括启动子,该启动子在受试者中是具有功能的,并且可以是组成型或可诱导型;核糖体结合部位;起始密码子(ATG)(必要的话);编码目标多肽的多核苷酸;终止密码子;和任选地3’末端区域(翻译和/或转录终止子)。可以包括另外的序列例如编码信号肽的区域。编码目标多肽的多核苷酸可以在表达盒中对任何其他调节序列是同源的或异源的。与目标多肽一起表达的序列,例如信号肽编码区域,典型地位于编码待表达蛋白质的多核苷酸附近并且置于适当的阅读框内。由编码单独表达的或与待表达的任何其他序列一起表达的蛋白质(例如,信号肽)的多核苷酸构成的开放阅读框处于启动子的控制下,以便转录和翻译在给予该组合物的受试者中发生。
被用于以如在此描述的疫苗组合物的单次治疗中的另外抗体的量可以根据抗原的类型和受试者的体型大小而变化。本领域技术人员将能够确定(无需过多的实验)用于具体应用的另外抗原的有效量。如在此使用的,术语“有效量”意指在某剂量下和需要的时期内有效实现期望结果的量。
在一些实施方式中,另外的抗原可以是能够诱导CTL应答的至少一种CTL表位。例如,另外的抗原可以是衍生自被确定为在癌细胞中表达上调的蛋白质的CTL 表位。
在一个实施方式中,CTL表位可以是肿瘤相关蛋白质的表位,如例如黑色素瘤相关的蛋白质。在一些实施方式中,黑色素瘤相关的蛋白质是酪氨酸相关蛋白质-2 (TRP-2)或p53,其可以通过包括重组技术或化学合成的各种方法来获取。
以下基因(并非限制),编码具有可以作为本发明疫苗中的另外抗原被掺入的肽序列的肿瘤相关蛋白质:p53、HPV E6和E7、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、 HER2/neu、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、PRAME、P15、RUI、RU2、 SART-1、SART-3、WT1、PSA、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、gp100、MART- 1/Melan A、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE- A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、 GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、NA88-A、NY-ESO-1、NY-ESO-1a (CAG-3)、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT- V、G250、Ras、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、存活蛋白、TRP-2/INT2、和707-AP。
在一个实施方式中,疫苗可以包括与癌症相关,作为用于诱导CTL应答的抗原的CTL表位的混合物。例如,抗原可以包括如在此描述的存活蛋白抗原的至少一种或多种,如例如但不限于,具有以下氨基酸序列的存活蛋白肽抗原:FEELTLGEF (SEQ ID NO:1);FTELTLGEF(SEQ ID NO:2);LTLGEFLKL(SEQ ID NO: 3);LMLGEFLKL(SEQ ID NO:4);RISTFKNWPF(SEQ ID NO:5);RISTFKNWPK(SEQ ID NO:6);STFKNWPFL(SEQ ID NO:7);和LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8),和肿瘤相关蛋白质的至少一种另外的抗原。
(iii)T辅助细胞表位
在一些实施方式中,本发明的疫苗包括至少一种T-辅助细胞表位或T辅助细胞抗原。
T辅助细胞表位是具有T辅助细胞活性的氨基酸(天然或非天然氨基酸)序列。T辅助细胞表位由T辅助淋巴细胞识别,该T辅助淋巴细胞在建立并最大化免疫系统的能力中发挥了重要作用,并且其涉及活化并指引其它免疫细胞,如例如细胞毒T淋巴细胞。
T辅助细胞表位可以由连续或非连续表位组成。因此不是T辅助细胞的每个氨基酸必须是表位的部分。因此,T-辅助细胞表位,其包括T辅助细胞表位的类似物和区段,能够增强或刺激免疫应答。免疫显性T辅助细胞表位在具有截然不同MHC 类型的动物和人类群体中具有广泛的反应性(Celis(Celis)等人(1988)免疫学杂志(J.Immunol.)140:1808-1815;德默茨(Demotz)等人(1989)免疫学杂志(J. Immunol.)142:394-402;庄(Chong)等人(1992)感染与免疫(Infect.Immun.) 60:4640-4647)。受试者肽的T辅助细胞结构域具有约10至约50个氨基酸,并且优选的是约10至约30个氨基酸。当多个T辅助细胞表位存在时,那么每个T辅助细胞表位独立地起作用。
在一些实施方式中,T辅助细胞表位可以形成在此所描述的部分抗原。具体而言,如果抗原具有足够大小,其可以包含起到T辅助细胞表位功能的表位。在其他实施方式中,T辅助细胞表位是独立于抗原的分子。
在另一个实施方式中,T辅助细胞表位类似物可以包括在T辅助细胞表位中的 1个至约10个氨基酸残基的取代、缺失和插入。T辅助细胞区段是T辅助细胞表位的邻接部分,该T辅助细胞表位足以增强或刺激免疫应答。T辅助细胞区段的实例是一系列衍生自单一长肽的重叠肽。
在具体的实施方式中,本发明的组合物可以包括修饰的破伤风毒素肽A16L (830至844;AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:9)),作为T-辅助细胞表位或抗原,具有添加至氨基端的丙氨酸残基以提高稳定性(史林格勒夫(Slingluff)等人,临床癌症研究(Clin CancerRes.),7:3012-3024,2001)。
可以被用于本组合物的T辅助细胞表位的其它来源包括,例如,乙型肝炎表面抗原T辅助细胞表位、百日咳毒素T辅助细胞表位、麻疹病毒F蛋白辅助性T细胞表位、沙眼衣原体主要外膜蛋白辅助性T细胞表位、白喉毒素辅助性T细胞表位、镰状疟原虫环孢子辅助性T细胞表位、曼氏裂体吸虫磷酸丙糖异构酶辅助性T细胞表位、大肠杆菌TraT辅助性T细胞表位和免疫增强类似物以及任何这些T-辅助细胞表位的区段。
在一些实施方式中,T辅助细胞表位可以是通用T辅助细胞表位。在此使用的通用T辅助细胞表位是指肽或其他免疫原性分子,或其片段,其以II类(CD4+T 细胞)-限制性方式活化T细胞功能的方式结合至多个MHC II类分子。通用T辅助细胞表位的实例是包括肽序列AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO:12)的PADRE (泛DR表位),其中X可以是环己基丙氨酰基。特别地,PADRE具有CD4+T辅助细胞表位,即,它刺激PADRE特异性CD4+T辅助细胞应答的诱导。
除了之前提到的修饰的破伤风毒素肽A16L,破伤风类毒素还具有以与PADRE 类似的方式工作的其他T辅助细胞表位。破伤风和白喉毒素针对人类CD4+细胞具有通用表位(迪耶特尔姆-冲田(Diethelm-Okita),B.M.等人,传染病期刊(J. Infect.Diseases),181:1001-1009,2000)。在另一个实施方式中,T辅助细胞表位可以是破伤风类毒素肽例如包括肽序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(氨基酸 947-967;SEQ ID NO:13)的F21E。
在某些实施方式中,将T辅助细胞表位与本发明疫苗中的一种或多种存活蛋白抗原中的至少一种融合,或与可以包括在疫苗内的另外的抗原融合(例如融合肽)。
(iv)佐剂
在一些实施方式中,本发明的疫苗包括一种或多种药学上可接受的佐剂。现已描述了大量的佐剂,并且其对本领域技术人员是已知的。参见,例如,雷明顿药学大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(雷明顿药学大全(Remington’sPharmaceutical Sciences),马克出版公司(Mack Publishing Company),伊斯顿,宾夕法尼亚州,美国,1985)和美国药典(The United States Pharmacopoeia):公布于1999国家处方集(The National Formulary)(USP 24NF19)。
示例性佐剂包括,但不限于,矾、铝的其他化合物、卡介苗(BCG)、 TiterMaxTM、RibiTM、完全弗氏佐剂(FCA)、包含CpG的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、脂肽和polyI:C多核苷酸。示例性CpG ODN是5′- TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′(SEQ ID NO:14)。基于靶标物种和功效,技术人员可以容易地选择其他适当的CpG ODN。示例性脂肽包括,但不限于, Pam3Cys-SKKK(EMC Microcollections,德国)或其变体、同系物和类似物。已经显示脂肽的Pam2家族是对脂肽的Pam3家族的有效替代。
在具体的实施方式中,疫苗包括作为佐剂的polyI:C多核苷酸,如例如但不限于,26聚体(mer)的脱氧肌苷/胞嘧啶合成多核苷酸。
如在此使用的,“聚肌胞甘酸(polyI:C)”或“聚肌胞甘酸(polyI:C)多核苷酸”,在哺乳动物受试者中,是双链的多核苷酸分子(RNA或者DNA或者DNA和 RNA的组合),其每条链包含至少6个连续的肌苷或胞苷酸残基,或以任何顺序选自肌苷酸和胞苷酸的6个连续残基(例如,IICIIC、ICICIC或IIICCC),并且其能够诱导或增强至少一种炎性细胞因子的产生,例如干扰素。聚肌胞甘酸多核苷酸将典型地具有约8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个、25 个、28个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75 个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、500 个、1000个或更多个残基的长度。上限被认为是不必要的。优选的聚肌胞甘酸多核苷酸可以具有约6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个、24 个、26个、28个、或30个核苷酸的最短长度,和约1000个、500个、300个、200 个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、45个或40个核苷酸的最大长度。
聚肌胞甘酸多核苷酸的每条链可以是肌苷酸或胞苷酸残基的均聚物,或者每条链可以是包含肌苷酸或胞苷酸残基二者的杂聚物。在任何一种情况下,聚合物可以由一种或多种非肌苷酸或非胞苷酸残基(例如尿苷)中断,条件是存在如以上所描述的6个I、6个C或6个I/C的残基的至少一个连续区域。典型地,聚肌胞甘酸多核苷酸的每条链的每6个I/C残基将包含不超过1个非I/C残基,更优选的是每8 个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个、26个、28个或30个 I/C残基中不超过1个非I/C残基。
在聚肌胞甘酸多核苷酸中的肌苷酸或胞苷酸(或其他)残基可以按本领域已知的进行衍生或修饰,条件是保留聚肌胞甘酸多核苷酸促进炎性细胞因子例如干扰素的产生的能力。衍生物或修饰的非限制性实例包括,例如,叠氮基修饰、氟修饰、或使用硫酯(或类似的)键而不是天然磷酸二酯键以增强体内稳定性。还可以通过例如将分子与带正电的聚赖氨酸和羧甲基纤维素或与带正电的合成肽进行复合,修饰聚肌胞甘酸多核苷酸以,例如增强其对体内降解的耐性。
聚肌胞甘酸多核苷酸将以约0.001mg至1mg/单位剂量组合物的量,典型地被包括在本发明的组合物中。在某些实施方式中,聚肌胞甘酸多核苷酸的量将是约 0.04mg/mL的疫苗组合物。
疫苗的其他适合的佐剂是活化或增加TLR2活性的那些。在此使用的,“活化”或“增加”TLR2活性的佐剂包括任何佐剂,在一些实施方式中,基于脂质的佐剂,其充当TLR激动剂。此外,活化或增加TLR2活性包括其以任何单体的、同源二聚体的、异源二聚体的形式的活化,并且具体地包括作为具有TLR1或TLR6(即, TLR1/2或TLR2/6)的异源二聚体的TLR2的活化。
活化或增加TLR2活性的佐剂的示例性实施方式是基于脂质的佐剂,其包括至少一种脂质部分或脂质组分。
如在此使用的,表述“脂质部分”或“脂质组分”是指任何脂肪酸(例如,脂酰基)或其衍生物,包括例如甘油三脂、甘油二酯、和甘油单酯。示例性脂质包括,没有限制,软脂酰、肉豆蔻酰、硬脂酰和癸酰基基团或任何C2至C30的饱和的或不饱和的脂酰基基团,优选的是任何C14至C22的饱和的或不饱和的脂酰基基团,并且更优选的是C16的饱和的或不饱和的脂酰基基团。因此,如本文提及的,表述“基于脂质的佐剂”包括含有脂酰基基团或其衍生物的任何佐剂。
基于脂质的佐剂在最低限度上包含至少一个脂质部分,或合成的/半合成的脂质部分类似物,其可以结合至氨基酸、寡肽或其他分子(例如,碳水化合物、聚糖、多糖、生物素、罗丹明、等等)上。因此,举例来说,并非限制,基于脂质佐剂可以是脂氨基酸、脂肽、脂聚糖、脂多糖、或脂磷壁质。此外,脂质部分或包含脂质部分的结构可以共价地或非共价地结合至抗原,以生成具有内置辅助性质的抗原化合物。举例来说,并非限制,基于脂质部分可以包括阳离子(例如镍),以提供用于非共价结合的正电荷。
在一些实施方式中,该脂质部分或脂质组分可以是天然发生的,如例如来自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、绿色红假单胞菌、或支原体的细胞壁组分(例如脂蛋白)。在其他实施方式中,脂质部分或脂质组分可以是合成的或半合成的。
基于脂质的佐剂可以包括棕榈酸(PAM)作为佐剂的脂质部分或组分中的至少一种。此类基于脂质的佐剂在此称为“棕榈酸佐剂”。棕榈酸是低分子量脂质,发现于大肠杆菌的免疫学反应性的布劳恩(Braun’s)脂蛋白中。棕榈酸的其他常见的化学名称包括,例如,以IUPAC命名法的十六烷酸以及1-十五烷羧酸。棕榈酸的分子式是CH3(CH2)14CO2H。如本领域技术人员将理解的,可能的是,可以改变棕榈酸的脂质链。在此可以用作棕榈酸佐剂的示例性化合物,以及其合成方法被描述于,例如,美国专利出版物US 2008/0233143;US 2010/0129385;和US 2011/0200632。
如以上针对脂质部分所描述的,一般地,棕榈酸佐剂在最低限度上包含至少一种棕榈酸部分,该棕榈酸部分可以结合(coupled)至氨基酸、寡肽或其他分子上。棕榈酸部分或包含棕榈酸部分的结构可以共价地或非共价地结合至抗原,以生成具有内置辅助性质的抗原化合物。可以将棕榈酸部分或包含棕榈酸的化学结构结合至半胱氨酸肽(Cys),以允许佐剂的各种结构构型,其包括线性和分支结构。半胱氨酸残基通常通过极性残基例如丝氨酸(Ser)和/或赖氨酸(Lys)在C端延伸,以生成具有改善的溶解度的佐剂化合物。可以将包含棕榈酸的佐剂化合物与抗原混合,通过非-共价作用与抗原结合,或直接地或用接头/间隔区可选地共价连接到抗原上,以产生增强的免疫应答。最常见地,将两个棕榈酸部分附接到甘油基骨架和半胱氨酸残基上,以生成二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸(PAM2Cys)或三棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸(PAM3Cys),其也可以被用于如以上所描述的多重构型。
因此,在一个实施方式中,组合物的佐剂可以包括棕榈酸部分或组分。可以修饰或操作该棕榈酸部分,以改善其体外或体内稳定性,提高其与受体的结合(如例如以下所描述的toll样受体)或提高其生物活性。
在具体的实施方式中,棕榈酸佐剂可以包括PAM2Cys或PAM3Cys。在另一个具体的实施方式中,棕榈酸佐剂可以是Pam-2-Cys-Ser-(Lys)4或Pam-3-Cys-Ser- (Lys)4。此类棕榈酸佐剂是可得的,例如,作为研究试剂来自EMC Microcollections GmbH(德国)和InvivoGen(圣地亚哥,加利福尼亚,美国)。还可以从EMC Microcollections获取的是Pam-2-Cys-Ser-(Lys)4和Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4的各种类似物,包括标记的类似物。
本发明的组合物可以包括如以上所描述的与至少一种其他适合的佐剂组合的佐剂。至少一种其他适合的佐剂的示例性实施方式包括,但绝不是限于,来自合成的、非生物或生物来源的有机和无机化合物、聚合体物、蛋白质、肽、糖(包括但不限于其组分的病毒微体、病毒样颗粒、病毒和细菌)。
相容佐剂的另外实例可以包括,没有限制,趋化因子、Toll样受体激动剂、集落刺激因子、细胞因子、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS04、AS15、ABM2、 Adjumer、Algammulin、AS01B、AS02(SBASA)、ASO2A、BCG、骨化三醇、壳聚糖、霍乱毒素、CP-870,893、CpG、polyIC、CyaA、双十八烷基二甲基溴化铵 (DDA)、邻苯二甲酸二丁基酯(DBP)、dSLIM、γ菊糖、GM-CSF、GMDP、甘油、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISCOM、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、LPS、脂质核心蛋白、MF59、单磷酰脂质A、 IMS1312、基于的佐剂、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、 ONTAK、PepTel载体系统、其他基于棕榈酰的分子、PLG微粒、瑞喹莫德、角鲨烯、SLR172、YF-17DBCG、QS21、QuilA、P1005、泊咯沙姆、皂苷、合成多核苷酸、酵母多糖、百日咳毒素。
因此,组合物可以包括一种或多种药学上可接受的佐剂。在一些实施方式中,可以将一种或多种存活蛋白抗原的至少一种或另外的抗原与佐剂的至少一种结合。
使用的佐剂的量取决于抗原的量以及取决于佐剂的类型。本领域技术人员可以很容易地通过实证检验来确定在一个具体应用中所需要佐剂的量。
(v)脂质体
在一些实施方式中,本发明的疫苗包括脂质体。在具体的实施方式中,当疫苗组合物包括载体——其包括如在此描述的连续相的疏水物质——时,脂质体被包括。
脂质体代表了本发明包括的佐剂系统的具体实施方式。然而,本发明的疫苗可以不包括脂质体。相反,在疫苗的其他实施方式中,可以将一种或多种疫苗抗原与用于向受试者递送存活蛋白抗原的任何适合的佐剂组合。
脂质体是包含包封的水体积的完全封闭的脂质双层膜。脂质体可以是单层小泡(具有单个的双层膜)或特征为多膜双层的多层小泡,每个双层可以通过水层与下一层分离,或可以不分离。脂质体的一般讨论可见于格里格阿迪斯(Gregoriadis) G.,今日免疫学(Immunol.Today)11:89-97,1990;和弗勒扎尔(Frezard),F.,巴西医学与生物学研究杂志(Braz.J.Med.Bio.Res.),32:181-189,1999。在此和权利要求中使用的,术语“脂质体”意在包括如以上所描述的所有此类的小泡结构,包括但不限于,本领域以“囊泡”、“传递体”和“病毒微体”描述的那些。
尽管任何脂质体可以被用于本发明,包括由古细菌脂质所制成的脂质体,但是特别有用的脂质体在脂质体制品中使用磷脂和未酯化的胆固醇。胆固醇被用来稳定脂质体,并且稳定脂质体的任何其他化合物可以置换胆固醇。其他脂质体稳定性化合物为本领域技术人员已知。例如,饱和磷脂产生具有较高转变温度的脂质体,这表示稳定性增强。
优选被用于制备脂质体的磷脂是具有选自下的至少一种头基的那些:磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷胆碱(例如,DOPC;1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)和磷酸肌醇。更优选的是包括脂质的脂质体,该脂质是94%-100%的磷脂酰胆碱。此类脂质以卵磷脂90 G是可商购的。当也将未酯化的胆固醇用于脂质体制品中时,胆固醇以等价于约10%的磷脂重量的量使用。如果将不同于胆固醇的化合物用于稳定脂质体,本领域技术人员可以容易地确定在组合物中所需要的量。
例如,可以通过使用天然脂质、合成脂质、鞘脂、醚脂、固醇、心磷脂、阳离子脂质和用聚(乙二醇)及其他聚合物,来获得脂质体组合物。合成的脂质可以包括以下脂肪酸组分;月桂酰基、肉豆蔻酰、软脂酰、硬脂酰、花生酰基、油酰、亚油酰、芥酰、或这些脂肪酸的组合。
(vi)载体
在一些实施方式中,本发明的疫苗包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。如在此使用的,药学上可接受的载体是指,适用于递送本发明疫苗组合物并且用于本发明方法中的任何物质。
可以与本发明疫苗一起使用的载体是本领域熟知的,包括但绝不限于,例如,水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、含有血清的溶液、汉克斯氏溶液、其他水性生理平衡溶液、水包油乳剂、油、油包水乳剂、酯、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚(乳酸)、明胶、胶原蛋白基质、多糖、聚(D,L丙交酯)、聚(苹果酸)、聚(己内酯)、纤维素、白蛋白、淀粉、酪蛋白、右旋糖酐、聚酯、乙醇、丙烯酸酯、聚氨酯、聚乙烯、乙烯基聚合物、乙二醇、甲状腺球蛋白、白蛋白例如人血清清蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸(例如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨基酸、流行性感冒、乙型肝炎病毒核心蛋白、其混合物以及类似物。参见,例如,雷明顿:药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy),2000,A R编辑,伊顿,宾夕法尼亚州:马克出版有限公司(Mack Publishing Co)。
在具体的实施方式中,疫苗组合的载体是包括连续相的疏水物质的载体,优选的是液体疏水物质。连续相可以是基本纯的疏水物质或疏水物质的混合物。此外,载体可以是在疏水物质中的水乳剂或疏水物质混合物中的水乳剂,条件是该疏水物质构成连续相。此外,在另一个实施方式中,载体可以起到佐剂的作用。
用于如在此描述的组合物中的疏水物质是药学上和/或免疫学上可接受的那些。载体优选的是液体,但是某些在常温下不是液体的疏水物质可以进行液化,例如通过加热,并且也用于本发明中。在一个实施方式中,疏水载体可以是磷酸盐缓冲盐水/弗氏不完全佐剂(PBS/FIA)乳剂。
油或油包水乳剂是用于本发明疫苗组合物的特别合适的载体。油应当是药学上和/或免疫学上可接受的。合适的油包括,例如,矿物油(特别是轻或低粘度的矿物油例如6VR)、植物油(例如,大豆油)、坚果油(例如,花生油)、或其混合物。因此,在具体的实施方式中,载体是疏水物质例如植物油、坚果油或矿物油。还可以使用动物油脂和人工疏水聚合物材料,特别是在大气温度下为液体或可以相对容易液化的那些。
为了增强癌症疫苗的免疫原性,免疫疫苗公司已经研发了佐剂疫苗平台,该佐剂疫苗平台设计用来促进针对肽抗原的强并且有力的免疫应答。DepoVaxTM (DPX)是油包脂质体制品,其包括TLR佐剂和通用T辅助细胞肽,可以用任何表位、或表位混合物进行配制,以诱导细胞毒T淋巴细胞介导的免疫应答(卡卡达 (Karkada)等人,免疫杂志(J Immunother)33(3):250-261,2010)和/或体液免疫应答。DPX在免疫部位上形成强的贮存部,该贮存部延长了抗原对免疫系统的暴露。
已经表明在DPX中使用肽单次接种导致等效的,或比在其他常见制剂中使用肽的多重接种更好的免疫应答,例如Montanide ISA51VG乳剂,类似于第一代基于乳剂的疫苗平台的VacciMax(达夫特里恩(Daftarian)等人,转化医学杂志(J Transl Med)5:26,2007;曼苏尔(Mansour)等人,转化医学杂志(J Transl Med) 5:20,2007)。最近,被称为DPX-0907的基于DepoVaxTM的肽疫苗在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌患者中完成了I期临床试验,证实了在这些晚期患者中的安全性和免疫原性(贝琳斯丁(Berinstein)等人,转化医学杂志(JTransl Med)10(1):156, 2012)。
因此,在具体的实施方式中,本发明疫苗的载体可以是免疫疫苗公司的基于脂质体的佐剂系统。不像基于油包水乳剂的疫苗依赖于包含抗原和佐剂的油包水(oilentrapping water)滴,基于DepoVaxTM的制品依赖于脂质体,以促进抗原和佐剂直接掺入油,而不需要乳化。此种方法的优点包括:(1)提高亲水抗原/佐剂在油稀释剂中的溶解度,否则该亲水抗原/佐剂通常将在基于水的稀释剂中具有最大溶解度,并且(2)在疫苗给予前消除繁琐的乳化操作。
在某些实施方式中,组合物可以是基本上没有水的(例如,“无水的”)。可能的是这些“无水的”组合物的疏水载体可以仍然包含少量的水,条件是该水存在于载体的非连续相中。例如,组合物的个别组分可以具有结合水,该结合水不可以通过方法例如冷冻干燥或蒸发完全去除,并且某些疏水载体可以包含其中溶解的少量水。一般来说,在组合物的载体组分的总重的重量/重量基础之上,“无水的”本发明组合物包含,例如,少于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、 0.5%、0.1%、0.05%或0.01%的水。
制备示例性疫苗组合物的方法
在具体的实施方式中,本发明的疫苗组合物是包括至少一种存活蛋白抗原、脂质体和包括连续相的疏水性物质的载体的组合物。
用于制作脂质体的方法是本领域众所周知的。参见,例如,之前引用的格里格阿迪斯(Gregoriadis)(1990)和弗勒扎尔(Frezard)(1999)二者。用于制作脂质体的任何适合的方法可以被用于本发明的实践中,或脂质体可以从商业来源获得。典型地通过水化脂质体组分来制备脂质体,这将形成具有水溶液的脂双层(例如,磷脂和胆固醇),该水溶液可以是纯水或于水中溶解了一种或多种组分的溶液,例如,磷酸盐缓冲盐水(PBS)、无磷酸盐的生理盐水、或任何其他生理上相容的水溶液。
在一个实施方式中,脂质体组合物或脂质体组分的混合物,例如磷脂(例如,90G)或DOPC和胆固醇,可以溶解于有机溶剂,例如氯仿和甲醇的混合物,随后过滤(例如,PTFE 0.2μm滤器)并干燥,例如通过旋转蒸发,以去除溶剂。
获得的脂质混合物的水化可以被如下影响,例如,注射脂质混合物到水溶液中或者超声处理脂质混合物和水溶液。在脂质体形成期间,脂质体组分形成了包围一定体积水溶液的单个双层(单层的)或多重双层(多层的),用该水溶液将脂质体组分水化。
在一些实施方式中,然后将该脂质体脱水,例如通过冻干法或冷冻干燥。
将脂质体与适当的载体组合,例如包括连续疏水相的载体。其可以按不同方式完成。
如果该载体仅由疏水物质或疏水物质的混合物组成(例如,使用100%矿物油载体),那么可以简单地将脂质体与疏水物质混合;或者如果存在多种疏水物质,那么与任何一种或它们的组合进行混合。
相反,如果包括连续相疏水物质的载体包含不连续水相,那么载体将典型地采用水相在疏水相中的乳剂形式,例如油包水乳剂。此类组合物可以包含乳化剂以稳定乳剂并且促进脂质体的平均分布。在此方面,为了促进载体中脂质体的平均分布的目的,即使使用无水载体,乳化剂也可以是有用的。典型的乳化剂包括二缩甘露醇油酸(ArlacelTM A),卵磷脂(例如,S100卵磷脂)、磷脂、吐温(Tween)TM 80、和司盘(Spans)TM 20、80、83和85。典型地,疏水物质与乳化剂的体积比率 (v/v)在约5∶1至约15∶1的范围内,优选的是约10∶1的比率。
可以将脂质体添加至已完成的乳剂,或者它们在乳化前可以存在于水相或疏水相中。
如在此描述的一种或多种存活蛋白抗原或另外的抗原可以在配制过程中各种不同的阶段引入。可以将超过一种类型的抗原掺入组合物中。如在此部分使用的,通常使用术语“抗原”并且可以是指如在此描述的存活蛋白抗原、一种或多种存活蛋白抗原、如在此描述的另外的抗原或一种或多种另外的抗原,或其任何组合。术语通常用来描述任何抗原可以如何被配制成本发明的疫苗组合物。术语“抗原”包括单数形式“抗原(antigen)”和多数的“抗原(antigens)”。不需要将所有的抗原以相同方式引入该疫苗组合物。
在一些实施方式中,抗原存在于被用来水化组分的水性溶液中,该组分被用来形成脂质体的脂质双层(例如,一种或多种磷脂和胆固醇)。在这种情况下,抗原将被封装在脂质体中,存在于它的水性内部。如果产生的脂质体没有被洗涤或干燥,这样使得残留的水溶液存在,这最终与包括连续相疏水物质的载体混合,那么可能的是另外的抗原可以在最终产品中出现在脂质体外。在相关的技术中,在用水溶液水化之前,可以将该抗原与被用来形成脂质体的脂质双层的组分混合。抗原还可以添加至预先形成的脂质体中,在这种情况下,可以将抗原积极地加载到脂质体中,或结合至脂质体的表面或抗原可以保留在脂质体之外。在此类实施方式中,在添加抗原之前,预先形成的脂质体可以是空的脂质体(例如,不包含封装抗原或基于脂质的佐剂),或者预先形成的脂质体可以包含被引入或结合脂质体的基于脂质的佐剂。这些步骤可以在与包括连续相疏水物质的载体混合之前优选地发生。
在可选的方法中,在载体与脂质体组合之前、期间、或之后,抗原可以替代地与包括连续相疏水物质的载体混合。如果载体是乳剂,则在乳化之前,可以将抗原与水相或疏水相中的之一或两者进行混合。可选地,在乳化之后,可以将抗原与载体混合。
将抗原与载体组合的技术可以与如以上所描述的封装抗原在脂质体中一起使用,使得抗原存在于脂质体和包括连续相疏水物质的载体中。
在其被包括的实施方式中,将抗原引入组合物的上述程序还可以施用于如在此描述的T辅助细胞表位和/或组合物的佐剂。即,可以将T辅助细胞表位和/或佐剂引入例如以下的一个或多个:(1)用于水化组分的水溶液,该组分被用于形成脂质体的脂质双层;(2)在形成脂质体的脂质双层后的水溶液;(3)用于形成脂质体的脂质双层的组分;或(4)在载体与脂质体组合之前、期间、或之后,包括连续相疏水物质的载体。如果该载体是乳剂,在乳化之前、期间或之后,可以将T辅助细胞表位和/或佐剂与水相或疏水相中的之一或两者进行混合。
将T辅助细胞表位和/或佐剂与载体组合的技术可以与封装这些组分在脂质体中,或与添加这些组分到脂质体一起使用,使得T辅助细胞表位和/或佐剂存在于脂质体内和/或脂质体外以及在包括连续相疏水物质的载体中。
T辅助细胞表位和/或佐剂可以在相同的处理步骤、或分别在不同的处理步骤与抗原一起掺入组合物。例如,抗原、T辅助细胞表位和佐剂可以都存在于用于水化脂质双层形成的脂质体组分的水溶液中,使得所有三种组成封装于脂质体中。可选地,可以将抗原和T辅助细胞表位封装于脂质体、和与包括连续相疏水物质的载体混合的佐剂。在进一步的实施方式中,在抗原封装步骤后,通过使脂质体-抗原制品通过手动小型挤出机,并且然后将所获得的脂质体抗原制品与在例如磷酸缓冲液中的基于脂质的佐剂混合,可以将T辅助细胞表位和/或佐剂掺入到组合物中。在脂质体已经形成后,还可以将T辅助细胞表位和/或佐剂单独地或与抗原一起掺入组合物中,使得T辅助细胞表位和佐剂可以结合或保留在脂质体之外。在添加抗原之前,还可以将T辅助细胞表位和/或佐剂掺入或与脂质体结合,通过进一步处理,抗原保留在预先形成的脂质体外或装载至/结合脂质体上。在此类实施方式中,可以冻干产生的制品,并且然后在包括连续相疏水物质的载体中重构。将理解的是许多此类组合是可能的。
在具体实施方式中,本发明的疫苗是DPX-Survivac。制备DPX-Survivac的示例性方法如下。然而,应当理解的是可选地实施方式也包括于此,例如上述的那些,其中抗原、佐剂和T辅助细胞表位可以以任何顺序在疫苗配制的任何阶段引入并且最终可以于脂质体内、脂质体外或者脂质体内和脂质体外见到。
在示例性方法中,为了制备DPX-Survivac,在存活蛋白抗原和佐剂的存在下,通过混合和水化脂质组分的方法,在水性缓冲液中,用五种存活蛋白抗原(SEQ ID Nos:2、4、6、7和8);佐剂(polyI:C多核苷酸)和脂质体(DOPC和胆固醇)形成复合物,挤出以获得可以无菌过滤的颗粒大小,然后填入小瓶中并冻干成干饼。然后在注射前将该干饼重新悬浮于疏水性载体Montanide ISA51 VG中。此示例性制备法可以与存活蛋白抗原、任何合适的佐剂和任何合适的T辅助细胞表位的任何组合一起使用。
如果该组合物包含一种或多种另外的佐剂,那么可以如以上针对佐剂所描述的类似方式,或通过将可以适用于一种或多种另外的佐剂的此类方法中的若干结合,将此类另外的佐剂掺入组合物中。
维持生物活性或改善化学稳定性以延长抗原、佐剂、脂质体或连续疏水载体的保质期的稳定剂例如糖、抗氧化剂、或防腐剂,可以被添加至此类组合物中。
在一些实施方式中,可以使用抗原/佐剂混合物,在这种情况下该抗原和佐剂同时被掺入组合物中。“抗原/佐剂混合物”是指这样的实施方式,其中抗原和佐剂至少在掺入组合物中之前处于相同的稀释剂中。在抗原/佐剂混合物中的抗原和佐剂可以是,但不必是化学上连接的,例如通过共价键合。
在一些实施方式中,包括连续相疏水物质的载体可以自身就佐剂活性。不完全弗氏佐剂和 ISA 51 VG,是具有佐剂作用的疏水载体。在此和权利要求中使用的,当使用术语“佐剂”时,这意图表示除了由包括连续相疏水物质的载体所提供的任何佐剂活性以外的佐剂的存在。
给药方式
本发明方法包括干扰DNA复制的剂和包括至少一种存活蛋白抗原的疫苗组合给予。
为了改善疫苗的功效,本发明方法的实施方式包括,在第一次给予疫苗之前,给予至少两剂量的干扰DNA复制的剂。结合这些实施方式,剂可以在疫苗的疗程之前、期间或之后的任何其他时间另外向受试者给予,只要在第一次给予疫苗之前给予至少两剂量。
在此使用的,术语“组合”、“共同给予”、或“组合给予”或诸如此类意指包括向单个患者给予干扰DNA复制的剂和疫苗,并且意图包括这样的情况,其中抗原和疫苗没有必要通过同样的给予途径或在同一时间给予。例如,干扰DNA复制的剂和疫苗可以分别、顺序或交替进行给予。
如在此使用的,表述“至少两剂量”意图包括大于单剂量的任何数的剂量。在一个实施方式中,至少两剂量包括在2-50剂量之间,更具体地在2-28剂量之间,和更具体地在2-14剂量之间。在一个实施方式,至少两剂量是2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13或14剂量。至少两剂量可以按任何合适量的时间分开。在具体的实施方式中,至少两剂量包括每日2剂量持续一周的时期,总计14剂量。
干扰DNA复制的剂典型地以足以提供免疫-调节作用的量给予。如在此使用的,表述“免疫-调节作用”是指干扰DNA复制的剂改变(调节)免疫系统和/或免疫系统细胞的一个或多个方面。在一个实施方式中,“足以提供免疫-调节作用的量”是能够选择性影响免疫系统细胞中DNA复制的剂的量。例如,剂的量可以是足以选择性靶向免疫系统的快速分裂细胞以造成程序性细胞死亡的量。如在此定义的,该量还可以被称作非化学疗法的量。
“足以提供免疫-调节作用的量”可以可互换地在此被称为“低剂量”的量。因此,本发明方法优选涉及与疫苗组合的低剂量干扰DNA复制的剂的使用。由于涉及本发明具体的实施方式,其中干扰DNA复制的剂是烷基化剂环磷酰胺,表述“低剂量”典型地是指少于300mg/m2,如例如100-300mg/m2的环磷酰胺剂量。就每日的给予而论,“低剂量”的环磷酰胺典型地在约25-300mg/天之间,并且优选的是50-150 mg/天。特别合适的是100mg环磷酰胺的每日给药量。还有特别合适的是每剂量约 50mg环磷酰胺/剂。如在此包括的,干扰DNA复制的其它剂的“低剂量”的量,是本领域技术人员已知的,或能够通过常规技能来确定的。
本发明的方法包括给予至少两剂量的干扰DNA复制的剂,并且随后给予本发明疫苗。“随后给予”,其意味着给予干扰DNA复制的剂是在第一次给予疫苗之前开始(例如,在疫苗前先向受试者给出至少两剂量的剂)。然而,如在此描述的,以干扰DNA复制的剂给予受试者可以在以疫苗给予开始后继续。在可选的实施方式中,干扰DNA复制的剂的给予在第一次疫苗给予之前停止。
在本发明的方法中,第一剂量的干扰DNA复制的剂先于任何以疫苗对受试者的治疗。在一个实施方式中,将第一次给予干扰DNA复制的剂与第一次给予疫苗分开的最小量的时间可以是足以提供免疫-调节作用的任何量的时间。如本领域技术人员将理解的,足以提供免疫-调节作用的时间量可取决于许多变量并且可以针对个体患者是不同的。
在一些实施方式中,第一剂量的干扰DNA复制的剂是在第一次给予疫苗前至少12小时给予,并且优选的是在第一次接种前至少2天、4天或6天。在进一步的实施方式中,第一剂量的干扰DNA复制的剂可以是在第一次给予疫苗前约1天、2 天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14 天、或更多天提供。在具体的实施方式中,第一次给予干扰DNA复制的剂发生在第一次给予疫苗前1-4天。特别合适的是第一次给予干扰DNA复制的剂是在第一次给予疫苗前一周。
在干扰DNA复制的剂的第一剂量后,后续的剂量可以在剂量之间的任何希望的时间间隔进行给予,只要至少两剂量的剂在第一次给予疫苗前给予。干扰DNA 复制的剂的给药可以在疫苗疗程之前、期间或之后停止。
在一个实施方式中,紧随第一剂量后的是一个或多个维持剂量。如在此所描述的,术语“维持剂量”意指包括干扰DNA复制的剂的剂量,该剂量以这样一段间隔和 /或量给出以便在受试者体内保持足够量的剂,和/或其活性代谢物(例如,避免其剂和/或其活性代谢物的总清除率)。通过提供维持剂量,可能在给予疫苗的进程前、期间和/或之后,延长和/或保持干扰DNA复制的剂的免疫-调节作用持续延长的时间期间。
在一个实施方式中,为了保持免疫-调节作用,干扰DNA复制的剂可以每天被给予1次、2次、3次、4次或5次,或更多,只要保持低剂量给予(例如,多次较小剂量合计达希望的每日低剂量)。干扰DNA复制的剂的单次剂量(即,给予) 可以在单个时间点给出,如例如,吞噬的药片。可选地,干扰DNA复制的剂的单次剂量可以经过在短持续期间内给予,如例如,通过静脉滴注。
针对本发明的实施方式,其中干扰DNA复制的剂是环磷酰胺,它可以适当的提供维持剂量,例如,每6-18小时。本领域技术人员通过常规技能将知道或可以确定如在此所包括的环磷酰胺、以及干扰DNA复制的其他剂的维持剂量的适当间隔。
在具体的实施方式中,在第一次给予疫苗之前至少连续两天的期间给予干扰 DNA复制的剂。在这些天,可以每天向受试者给予干扰DNA复制的剂至少1次、2 次、3次或4次,或任何所希望的次数以提供该剂的每日低剂量。
在另一个实施方式中,在第一次给予疫苗之前约一周的期间给予干扰DNA复制的剂。在这一周期间可以提供多次剂量。在示例性实施方式中,干扰DNA复制的剂可以每天、每两天、或以用于提供所描述的维持剂量的任何适合的间隔进行给予。例如,本发明方法的具体实施方式包括在给予疫苗前约一周的期间内每天两次给予该剂。
在本发明的方法中,在第一次给予疫苗前,在以干扰DNA复制的剂治疗中可以存在中断。在此类实施方式中,给予干扰DNA复制的剂可以在第一次给予疫苗前永久地或暂时地停止。干扰DNA复制的剂的最后一次剂量和疫苗的第一次剂量之间的时间期间可以是任何合适的时间期间,只要受试者仍然从该剂获得免疫-调节的益处。例如,但不限于,给予干扰DNA复制的剂可以在第一剂量疫苗给予的相同时间或在第一剂量疫苗前长达约一周的任何时间停止。例如,但不限于,给予干扰DNA复制的剂可以在疫苗第一剂量前约6小时、12小时、18小时、24小时、36 小时、48小时、60小时或72小时或更久停止。在具体的实施方式中,给予干扰 DNA复制的剂可以在疫苗的第一剂量前约2天、4天或7天停止。
在可选的实施方式中,用干扰DNA复制的剂对受试者的治疗在疫苗的整个疗程中继续,在给予该剂的过程中有或没有间歇的中断。在进一步的实施方式中,用干扰DNA复制的剂的治疗可以在接种停止后继续。
因此,在一个实施方式中,可以在每次给予疫苗之前的时间期间给予干扰 DNA复制的剂。可选地,可以在第一次给予疫苗之前的时间期间只给予干扰DNA 复制的剂。
如在此描述的,用干扰DNA复制的剂的治疗可以在第一次给予疫苗后继续。在一个实施方式中,干扰DNA复制的剂的给予在整个用疫苗的疗程中每天继续进行(有或没有间歇中断)。因此,在一些实施方式中,剂将在以疫苗治疗以前和期间进行给予。在这种情况下,一旦给予疫苗开始,这就有可以以与疫苗相同的时间、紧随其后、或一天中的不同时间给予干扰DNA复制的剂。当以与疫苗相同的时间给予干扰DNA复制的剂时,该剂可以作为单一组分包括在本发明的疫苗组合物中,或者以分开的组合物给予。
可选地,当给予疫苗时的这些天期间,可以中止给予干扰DNA复制的剂。因此,本发明的方案可以包括在给予疫苗的过程期间,中断干扰DNA复制的剂的给予。
在此针对在第一次给予疫苗前给予干扰DNA复制的剂所描述的实施方式还施用于在第一次给予疫苗后的给予该剂(例如在每次随后的给予疫苗之前)。
作为特别合适的实施方式,本发明的方法包括用干扰DNA复制的剂节律式治疗受试者。用于本发明的目的,“节律式治疗”、“节律式方案”或“节律式给药”或诸如此类,意在是指比干扰DNA复制的剂的正常剂量较低的量的频繁给予。在此使用的,术语“正常剂量”,例如但不限于,可以指如下之一:(i)建立的最大耐受剂量(MTD)或进过传统给药方案的标准剂量,或者(ii)在实例中针对干扰DNA复制的具体剂已将确立了低剂量单弹丸量,而不是至那个低剂量的情况。
在节律式给药中,经过某时间期间,最终给予相同的、较低的、或较高的累积剂量是按照通过传统给药方案给予。在特别合适的实施方式中,这是通过在进行给药和/或增加给予频率期间通过延长时间框架来实现,同时相比于正常剂量降低了给予的量。例如,当低剂量300mg/m2的干扰DNA复制的剂典型给予(例如,通过单次弹丸注射)的情况下,节律式方案可以包括在若干天的期间内通过给予频繁低剂量来给予相同的量。通过这种方法,可以使用节律式给药,例如,以提供如在此描述的维持剂量。
在本发明方法的实施方式中,用干扰DNA复制的剂的节律式治疗意指包括在某时间期间内每日低剂量给予剂,例如连续2、3、4、5、6或7、或更多天的期间。在节律式给药的这些天,干扰DNA复制的剂可以按频繁的定期的间隔或不同的间隔来提供。例如,在一个实施方式中,干扰DNA复制的剂的剂量可以是每1、 2、3、4、6、8、12或24小时进行给予。在另一个实施方式中,干扰DNA复制的剂的剂量可以是每2、3、或4天进行给予。
在本发明方法的一些实施方式中,在干扰DNA复制的剂的节律式治疗期间可能存在中断或间歇。以这种方式,干扰DNA复制的剂的节律式治疗可以以循环方式发生,在给予期间和不给予期间之间交替。特别合适的是时间间隔,其中按周间隔交替,将干扰DNA复制的剂每天向受试者给予。例如,给予干扰DNA复制的剂的一周期间随后是治疗停止一周,并且反复该循环。
因此,在一个实施方式中,本发明方法包括每天向受试者给予干扰DNA复制的剂,每两周持续一周的期间。在该实施方式的具体方面,给予干扰DNA复制的剂是在第一次给予疫苗前约一周开始。
由于涉及本发明的疫苗,在一些实施方式中,可能特别适合以每周一次、每两周一次或每三周一次的间隔向受试者给予疫苗,优选的是三周一次。然而,给予疫苗的频率和持续时间可以针对任何既定的受试者如所希望的进行调整,并且可以比每周一次、每两周一次或每三周一次更高频率的或更低频率。在用疫苗的疗程期间,给予之间的间隔还可以不是恒定的。在本发明的方法中,可以向受试者给予 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次疫苗。将理解的是用疫苗治疗可以持续无限期,取决于受试者的癌症治疗的进展如何。
在本发明方法的实施方式中,干扰DNA复制的剂可以在每次给予疫苗之前的间歇期中作为预激剂(引发剂,priming agent)给予。
在具体的实施方式中,包括干扰DNA复制的剂和存活蛋白疫苗组合的本发明方法涉及疫苗,该疫苗以每三周一次的间隔向受试者给予(例如,第0、21、42、 63、84天、等等),第一次给予该干扰DNA复制的剂在第一次疫苗给予前约一周时开始(例如,7天),并且按照间隔每周交替,每天继续给予(例如节律式)。如这样的治疗方案示于图1中。
正如技术人员将理解的,给予干扰DNA复制的剂和疫苗的频率和持续时间可以针对任何给定受试者如所希望的进行调整。可以考虑的因素包括,例如疫苗中一种或多种存活蛋白抗原的性质;癌症类型;年龄,身体状况,体重,受试者性别和饮食;及其他临床因素。
干扰DNA复制的剂可以通过适合的递送手段和任何适合的给予途径给予。在一个实施方式中,口服给予干扰DNA复制的剂,例如以丸剂、片剂或胶囊剂的形式。在可选的实施方式中,通过注射给予该剂(例如,静脉内)。在本发明方法的具体实施方式中,剂是环磷酰胺并且将其进行口服给予。
可以将如在此描述的本发明的疫苗以适合于口服、鼻腔、直肠或非消化道给予的形式进行配制。肠胃外给予包括静脉内、腹膜内、真皮内、皮下、肌内、经上皮、肺内、鞘内、和局部模式的给予。在其中将疫苗配制为包括一种或多种存活蛋白抗原、脂质体和包括连续相疏水物质的载体的组合物的实施方式中,特别合适的给予途径可以是注射(例如,真皮内的、肌内注射的或皮下的)以便实现在注射部位的储库效应。疫苗和干扰DNA复制的剂不是必须通过相同的给予途径或在相同时间给予。
在本发明方法的具体的实施方式中,干扰DNA复制的剂是烷化剂,如例如,环磷酰胺。
治疗指征
如在此描述的,本发明方法涉及癌症的治疗。通过本发明方法可以能够治疗和/或预防的癌症可以包括,例如,表达存活蛋白或与正常细胞相比过-表达存活蛋白的任何癌症。
在一个实施方式中,通过本发明方法可以能够被治疗的癌症可以包括,但不限于,癌症、腺癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤、母细胞瘤、骨髓瘤、和生殖细胞瘤。在一个实施方式中,癌症是处于实体瘤形式。特别合适的实施方式包括,但不限于,成神经胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、输卵管癌、或腹膜癌。
在一些实施方式中,受试者可以进行手术以去除大块的肿瘤,并且可以在切除肿瘤块之前和/或之后应用本发明方法。在其他实施方式中,受试者可以已经接受过放射治疗、化疗或一些其他非外科疗法以控制或杀死癌性或恶性细胞,并且本发明方法可以在这些疗法之前后之后应用。在某些实施方式中,癌症处于晚期。
在此使用的,术语“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌症”和“癌细胞”(可交替使用)是指表现出异常生长的细胞,其特征为细胞增殖的显著失控;或已永生化的细胞。术语“癌症”或“肿瘤”包括转移性的连同非转移性的癌症或肿瘤。可以使用本领域普遍接受的标准诊断癌症,包括存在恶性肿瘤。
在此所提及的“治疗”或“的治疗”或“预防”或“的预防”是指用于获得有益的或希望的结果的方法,包括临床结果。有益的或希望的临床结果可以包括但不限于,一种或多种症状或病症的缓解或改善、病变的范围的减小、疾病的状态的稳定、疾病发展的预防、疾病扩散的预防、疾病进展的延迟或减慢、疾病发作的延迟或减慢、赋予对致病剂的保护性免疫以及疾病状态的改善或减轻。“治疗”或“预防”还可以表示延长患者生存期,超过在治疗不存在下预期的生存期,并且还可以表示暂时抑制疾病的进展,然而更优选的是,其涉及预防疾病的发生例如通过预防受试者的感染。“治疗”或“预防”还可以是指减少肿瘤块的大小。
在治疗和/或预防癌症中,本发明的方法可以被用于“改善疫苗的功效”,正如在此描述的这种表述。这可以涉及改善在诱导细胞介导的免疫应答或体液免疫应答中的之一或两者中的疫苗的功效。这还可以涉及减少肿瘤诱导的免疫抑制。
在此使用的,“诱导(inducing)”或“以诱导(to induce)”免疫应答是引起、改善和/或增强免疫应答。诱导免疫应答包括这样的情况,其中相对于之前的免疫应答状态,为了受试者的利益加强、提高、改善或增强免疫应答,例如在应用本发明方法之前。
在此使用的,术语“细胞介导的免疫应答”是指响应于受试者体内抗原的引入,受试者体内的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、或细胞因子类的量的增加。
细胞介导免疫是不涉及抗体而是涉及巨噬细胞和自然杀伤细胞的活化、抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的产生以及响应于抗原的各种细胞因子的释放的免疫应答。细胞毒T淋巴细胞是T淋巴细胞的亚群(白细胞的类型),其能够诱导感染的体细胞或肿瘤细胞死亡;它们杀死感染病毒(或其他病原体)的细胞,或以另外的方式损坏或功能紊乱。
大多数的细胞毒性T细胞表达T细胞受体,该T细胞受体可以识别结合至I类 MHC分子的特异性肽抗原。这些CTL还表达CD8(CD8+T细胞),该CD8吸引I 类MHC分子的部分。在抗原特异性活化的期间,这种亲和性使得CTL和靶细胞紧密结合在一起。
细胞免疫通过,例如,活化抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(例如抗原特异性 CD8+T细胞)(这些细胞毒T淋巴细胞能溶解在其表面显示外源抗原表位的身体细胞,例如病毒感染的细胞、具有胞内菌的细胞,和显示肿瘤抗原的癌细胞);活化巨噬细胞和自然杀伤细胞(使他们破坏胞内病原体);并且刺激细胞分泌各种细胞因子(这些细胞因子影响涉及获得性免疫应答和先天免疫应答的其他细胞的功能) 来保护身体。
细胞免疫是适应性免疫应答的重要组分,并且随后由细胞通过它们与抗原呈递细胞例如树突细胞、B淋巴细胞和在较小程度上巨噬细胞的相互作用识别抗原,通过各种如不同的机制来保护身体,例如:
1.活化抗原特异性细胞毒T淋巴细胞,其能诱导在其表面显示外源抗原表位的身体细胞的凋亡,例如,病毒感染的细胞、具有胞内菌的细胞,和显示肿瘤抗原的癌细胞;
2.活化巨噬细胞和自然杀伤细胞,使它们能破坏细胞内病原体;和
3.刺激细胞分泌各种细胞因子,所述细胞因子影响涉及获得性免疫应答和先天免疫应答的其他细胞的功能。
细胞介导的免疫能最有效去除病毒感染的细胞,但是也参加防御真菌、原生动物、癌症、和胞内菌。它还在移植排斥中发挥主要作用。
由于细胞介导的免疫涉及各种细胞类型的参与,并且由不同机制介导,因此若干方法可以用来证实在应用本发明方法后免疫性的诱导或改善的功效。可以将这些广泛地分类为检测:i)特异性抗原递呈细胞;ii)特异性效应细胞及其功能和iii) 可溶性介质例如细胞因子的释放。
i)抗原递呈细胞树突细胞和B细胞(和在较小程度上巨噬细胞)配有特定的允许T细胞活化增强的免疫刺激受体,并且被称为专职抗原呈递细胞(APC)。在抗原呈递至效应细胞例如CD4+和CD8+细胞毒性T细胞的过程中,在这些细胞感染或接种后,这些免疫刺激分子(称作还共刺激分子)在这些细胞上被上-调了。此类共刺激分子(例如,CD80、CD86、MHC I类或MHC II类)可以通过使用流式血细胞计数术用针对这些分子的荧色物结合抗体和特异性识别APC的抗体(例如,对树突细胞,CD11c)来检测。
ii)细胞毒性T细胞:(又称Tc、杀伤T细胞、或细胞毒T淋巴细胞 (CTL))是T细胞的子组亚群,其诱导感染病毒(和其他病原体)的、或表达肿瘤抗原的细胞死亡。这些CTL直接攻击在其表面携带某种外源或异常分子的其它细胞。此类细胞毒效应的能力可以使用体外细胞溶解测定(铬释放测定)来检测。因此,获得性细胞免疫的诱导可以由此类细胞毒性T细胞的存在来证实,其中,当装载抗原时,靶细胞被接种或感染后体内生成的特异CTL裂解。
当其T细胞受体(TCR)与肽结合的MHC I类分子强烈地相互作用时,幼稚细胞毒性T细胞被活化。这种亲和力取决于抗原/MHC复合物的类型和定向,并且使得CTL和感染的细胞结合在一起。一旦活化的CTL经历了称作克隆扩增的过程,其中它增加过了功能性,并且快速分裂,以产生一组“武装的 (armed)”-效应细胞。然后激活的CTL行进经过全身以搜索具有独特MHC I类+ 肽的细胞。这可以在在流式细胞计数测定中通过使用肽MHC I类四聚物在体外识别此类CTL。
当暴露于这些感染的或功能失常的体细胞时,效应子CTL释放穿孔素和粒溶素:细胞毒素,其在靶细胞质膜中形成孔,允许离子和水流入受感染细胞并且导致其破裂或裂解。CTL释放粒酶,是丝氨酸蛋白酶,其经过孔进入细胞以诱导凋亡(细胞死亡)。从CTL释放这些分子可以被用作接种后细胞免疫应答的成功诱导的测量。这可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶联免疫斑点法(ELISPOT)来完成,其中CTL可以进行定量测量。由于CTL还能够产生重要的细胞因子例如 IFN-γ,因此IFN-γ产生的CD8细胞的定量测量可以通过ELISPOT和通过在这些细胞中胞内IFN-γ的流式细胞术测量来实现。
CD4+“辅助性”T细胞:CD4+淋巴细胞或辅助性T细胞,是免疫应答的介体,并且在确立和最大化获得性免疫应答能力的方面发挥了重要作用。这些细胞没有细胞毒性活性或吞噬活性;并且不能杀死受感染细胞或清除病原体,但是在本质上“管理”免疫应答,通过引导其它细胞进行这些任务。可以通过专职的APC、指定的Th1 和Th2来诱导两种类型的效应子CD4+T辅助细胞应答,每种被设计为消除不同类型的病原体。
辅助性T细胞表达T-细胞受体(TCR),该受体识别结合至II类MHC分子的抗原。幼稚辅助性T细胞的活化导致其释放细胞因子,该细胞因子影响包括将其活化的APC在内的许多细胞类型的活性。辅助性T细胞需要比细胞毒素T细胞更加温和的活化刺激。辅助性T细胞可以提供“帮助”活化细胞毒性细胞的额外的信号。可以通过专职APC、指定的Th1和Th2来诱导两种类型的效应子CD4+T辅助细胞应答,每种被设计为消除不同类型的病原体。这两种Th细胞群体差别在于所产生的效应子蛋白(细胞因子)的模式。一般来说,Th1细胞通过巨噬细胞和细胞毒性T细胞的活化来辅助细胞免疫应答;从而Th2细胞通过刺激B细胞转化成浆细胞并且通过形成抗体促进体液免疫应答。例如,通过Th1细胞调节的应答可以诱导小鼠中的lgG2a和lgG2b(人类中IgGI和lgG3)并且有利于细胞介导的针对抗原的免疫反应。如果对抗原的IgG应答是由Th2类型细胞调节,那么它可以显著地提高小鼠中IgGI(人类中lgG2)的产生。与Th1或Th2应答有关的细胞因子的测量将给出成功接种的测量。这可以通过针对Th1-细胞因子(例如IFN-γ、IL-2、IL-12、 TNF-α及其他),或Th2-细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL10等)所设计的特异性 ELISA来实现。
iii)细胞因子的测量:从局部淋巴结释放的细胞因子给出了成功免疫的良好指示。由于APC和免疫效应细胞例如CD4+和CD8+T细胞的抗原呈递和成熟,若干细胞因子由淋巴结细胞释放。在体外在抗原的存在下通过培养这些LNC,抗原特异性免疫应答可以通过测量释放(如果某些重要的细胞因子例如IFN-γ、IL-2、IL- 12、TNF-α和GM-CSF释放的话)来检测。这可以使用培养上清液和重组细胞因子作为标准,通过ELISA来完成。
成功免疫可以用本领域技术人员已知的来测定,包括但不限于,血凝抑制 (HAIJ和血清中和反应抑制分析以检测功能性抗体);激发研究,其中对接种的受试者用相关病原体进行激发,以确定接种功效;并且使用荧光激活细胞分选术(FACS)以确定表达特异性细胞表面标志的细胞群体,例如在活化或记忆性淋巴细胞的鉴定中。技术人员还可以确定,使用其他已知方法,本发明方法是否改善了细胞介导的免疫反应的功效。参见,例如,免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)科利根(Coligan)等人,编辑,(威利国际科学公司(Wiley Interscience),2007)。
在一些实施方式中,本发明的方法还可以用于通过诱导体液免疫应答或通过在导体液免疫应答中改善疫苗的功效来治疗癌症。此类实施方式可以在其中本发明的疫苗包括如在此描述的同于存活蛋白抗原的另外的抗原的情况中具有特定应用。这些方法可以涉及通过诱导细胞介导的免疫应答和体液免疫应答治疗癌症。
体液免疫反应,与细胞介导免疫相反,是通过分泌型抗体来介导的,该分泌型抗体是在B淋巴细胞谱系(B细胞)的细胞中产生。此类分泌型抗体结合至抗原,如例如,在外来物质和/或病原体(例如,病毒、细菌、等等)表面上的那些,并且为了破坏标记他们。
“抗体”是包括基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因,以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ、或ε,其依次分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括含有四种多肽的蛋白质。每个抗体结构单元由两对相同的多肽链构成,每对具有一条“轻”链和一条“重”链。每条链的N-末端定义主要负责抗原识别的可变区。抗体结构单元(例如,IgA和IgM类的)还可以彼此和另外的多肽链(例如,与J链多肽相关联的IgM五聚物)装配成寡聚物形式。
抗体是称为B淋巴细胞(B细胞)的白细胞亚类的抗原特异性糖蛋白产物。抗原与表达在B细胞表面的抗体的结合可以诱导抗体应答,包括刺激B细胞以将其活化,以进行有丝分裂和来最终分化为浆细胞,所述浆细胞对于抗原特异性抗体的合成与分泌是特化的。
B细胞是在免疫应答期间的抗体唯一的生产者,并且因此是有效体液免疫的关键要素。除生产大量的抗体之外,B细胞还充当抗原呈递细胞并且可以向T细胞例如T辅助CD4或细胞毒素的CD8呈递抗原,因此传播免疫应答。B细胞以及T细胞是可以协助疫苗功效的获得性免疫应答的部分。在由接种或天然感染诱导的活性免疫应答期间,抗原特异性B细胞被活化并克隆扩增。在扩增期间,B细胞进化为对表位具有较高亲和力。B细胞的增殖可以通过活化的T-辅助细胞间接诱导,并且还可以直接通过刺激受体例如toll样受体(TLR)来诱导。
抗原递呈细胞,例如树突细胞和B细胞,被吸引到接种部位并且可以与抗原和包含在疫苗中的佐剂相互作用。佐剂刺激细胞活化并且抗原提供针对靶标的蓝图。不同类型的佐剂向细胞提供不同的刺激信号。例如,polyI:C多核苷酸(TLR3激动剂)可以活化树突细胞,但不能活化B细胞。佐剂例如Pam3Cys、Pam2Cys和FSL- 1特别擅长活化并开始B细胞的增殖,其被预期有助于抗体应答的产生(莫伊尔 (Moyle)等人,当今医药化学(Curr MedChem),2008;So.,免疫学杂志(J Immunol),2012)。
在此使用的,术语“抗体应答”是指响应于受试者体内抗原的引入,受试者体内的抗原特异性抗体的量的增加。
评估抗体应答的方法是测量与特定抗原反应的抗体的效价。这可以使用本领域已知的各种方法进行,例如从动物获得的含有抗体的物质的酶联免疫吸附测定 (ELISA)。例如,结合特定抗原的血清抗体的效价可以在暴露于抗原之前和之后在受试者中确定。暴露于抗原之后的抗原特异性抗体的效价的统计上显著的增加将指示受试者已经引起(mounted)针对抗原的抗体应答。
可以用来检测抗原-特异性抗体的存在的其他测定包括但不限于,免疫测定 (例如放射免疫测定(RIA))、免疫沉淀测定、和蛋白质印迹(例如免疫印迹) 测定、和中和测定(例如,在体外或体内测定中病毒感染性的中和)。
本发明的方法,通过改善疫苗在诱导体液免疫应答中的功效,可以能够治疗和/或预防癌症。
体液免疫应答是有效传染性疾病疫苗的主要机制。然而,体液免疫应答还可以用于对抗癌症。补充癌症疫苗,即,设计产生可以识别并破坏癌细胞的细胞毒性 CD8+T细胞应答,B细胞介导的应答可以通过其他机制靶向癌细胞,这些机制在一些实例中为了最大化益处可以与细胞毒性CD8+T细胞合作。B细胞介导的(例如体液免疫应答介导的)抗肿瘤应答的机制的实例包括,但不限于:1)由B细胞产生的抗体,其结合在肿瘤细胞或其他细胞上发现的影响肿瘤发生的表面抗原。例如,此类抗体可以通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或补体结合诱导杀死靶细胞,潜在地导致可以由免疫系统识别的另外的抗原释放;2)结合肿瘤细胞上受体以阻断他们的刺激并且实际上中和其作用的抗体;3)结合由肿瘤或肿瘤相关细胞释放或与肿瘤或肿瘤相关细胞相关的因子以调节支持癌症的信号转导或细胞途径的抗体;和4)通过当前未知的机制结合胞内靶标并且介导抗-肿瘤活性的抗体。
通过本发明方法治疗的受试者可以是任何脊椎动物,优选的是哺乳动物,更优选的是人类。
试剂盒和试剂
为了实践本发明的方法,如在此描述的组合物可以任选地以试剂盒向使用者提供。例如,本发明的试剂盒包含一种或多种本发明组合物的组分。该试剂盒可以进一步包括一种或多种另外的试剂、包装材料、用于装试剂盒组件的容器,和详细说明使用试剂盒组件的优选方法的指令集或用户手册。
在具体的实施方式中,本发明的疫苗(例如,DPX-Survivac)被提供为含有两个容器的试剂盒。容器1,例如,可以包括冻干佐剂系统(例如脂质体)、存活蛋白抗原和佐剂。容器2,例如,可以仅包含油组分( ISA51 VG)。适当体积(0.1或0.5mL)的重构疫苗可以皮下注射。
在一个实施方式中,试剂盒可以另外包含干扰DNA复制的剂。干扰DNA复制的剂可以包含在具有第三个容器的试剂盒内,或者剂可以如以上所描述的包含在容器1或容器2中。在一个具体的实施方式中,包含在试剂盒中的干扰DNA复制的剂是烷基化剂,如例如环磷酰胺。
本发明实施方式
本发明的具体实施方式包括,但不限于,以下各项:
(1)在受试者中改善疫苗在癌症治疗中的功效的方法,所述方法包括、由以下组成或基本上由以下组成:
(i)以足够提供免疫-调节作用的量向受试者给予至少两剂量的干扰DNA复制的剂;并且
(ii)随后向受试者给予治疗有效量的疫苗,其中疫苗包括至少一种存活蛋白抗原。
(2)根据段落(1)所述的方法,其包括在给予疫苗前至少两天,向受试者给予第一剂量的剂,并且优选在给予疫苗前至少四天。
(3)根据段落(1)所述的方法,其包括在给予疫苗前约一周,向受试者给予第一剂量的剂。
(4)根据段落(1)至(3)任一项中所述的方法,其包括给予剂至少连续两天的期间。
(5)根据段落(1)至(4)任一项中所述的方法,其包括向受试者给予第一剂量的剂,后继一次或多次维持剂量的该剂。
(6)根据段落(1)至(5)任一项中所述的方法,其包括在给予疫苗前每天至少1次、2次、3次或4次向受试者给予该剂。
(7)根据段落(1)至(6)任一项中所述的方法,其包括在给予疫苗前约一周的期间内每天两次给予该剂。
(8)根据段落(1)至(7)任一项中所述的方法,其中用剂给予受试者在给予疫苗前停止。
(9)根据段落(1)至(7)任一项中所述的方法,其中用剂给予受试者在给予疫苗的过程中继续。
(10)根据段落(1)至(9)任一项中所述的方法,其包括约每三周一次向受试者给予疫苗。
(11)根据段落(1)至(10)任一项中所述的方法,其包括向受试者给予该疫苗2次、3次、4次或更多次。
(12)根据段落(1)至(11)任一项中所述的方法,其包括以节律式方案向受试者给予干扰DNA复制的剂。
(13)根据段落(12)所述的方法,其中该节律式方案包括每天向受试者给予该剂,每两周持续约一周的期间。
(14)根据段落(13)所述的方法,其包括在给予第一剂量的疫苗前约一周开始向受试者给予疫苗,并且其包括每三周一次向受试者给予该疫苗。
(15)根据段落(1)至(14)任一项中所述的方法,其中该存活蛋白抗原是肽抗原或编码抗原的核酸。
(16)根据段落(1)至(15)任一项中所述的方法,其中该存活蛋白抗原是肽抗原,该肽抗原包括、由以下组成或基本上由以下组成:来自存活蛋白(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列,其能够在受试者中引起细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)应答,或编码所述肽抗原的核酸分子。
(17)根据段落(1)至(16)任一项中所述的方法,其中该存活蛋白抗原是肽抗原,该肽抗原包括、由以下组成或基本上由以下组成:氨基酸序列FEELTLGEF(SEQ ID NO:1);FTELTLGEF(SEQ ID NO:2);LTLGEFLKL (SEQ ID NO:3);LMLGEFLKL(SEQ ID NO:4);RISTFKNWPF(SEQ ID NO: 5);RISTFKNWPK(SEQ ID NO:6);STFKNWPFL(SEQ ID NO:7);和LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8),或其任何组合;或编码所述肽抗原的核酸分子。
(18)根据段落(1)至(14)任一项中所述的方法,其中该至少一种存活蛋白抗原包括五种肽抗原的混合物、由五种肽抗原的混合物组成或基本上由五种肽抗原的混合物组成,该五种肽抗原包括氨基酸序列FTELTLGEF(SEQ ID NO:2); LMLGEFLKL(SEQ ID NO:4);RISTFKNWPK(SEQ ID NO:6);STFKNWPFL (SEQ ID NO:7)或LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8)。
(19)根据段落(1)至(18)任一项中所述的方法,其中该干扰DNA复制的剂能够选择性快速靶向免疫系统的分裂细胞,并且导致程序性细胞死亡。
(20)根据段落(1)至(19)任一项中所述的方法,其中该干扰DNA复制的剂是烷基化剂。
(21)根据段落20所述的方法,其中该烷基化剂是氮芥烷基化剂。
(22)根据段落(21)所述的方法,其中该氮芥烷基化剂是环磷酰胺。
(23)根据段落(22)所述的方法,其中足够提供免疫调节作用的量是约25- 300mg/天,优选约50-100mg/天,并且更优选约100mg/天的环磷酰胺。
(24)根据段落(22)或(23)所述的方法,其中足够提供免疫调节作用的量是每剂量约50mg的环磷酰胺。
(25)根据段落(22)至(24)任一项中所述的方法,其包括向受试者口服给予环磷酰胺。
(26)根据段落(1)至(25)任一项中所述的方法,其包括通过注射向受试者给予该疫苗,例如通过皮下注射。
(27)根据段落(1)至(26)任一项中所述的方法,其中该疫苗是组合物,所述组合物包括、由以下组成或基本上由以下组成:至少一种存活蛋白抗原、脂质体、和包括连续相的疏水性物质的载体。
(28)根据段落(27)述的方法,其中该组合物进一步包括T辅助细胞表位。
(29)根据段落(28)所述的方法,其中该T辅助细胞表位是肽,该肽包括、由以下组成或基本上由以项组成:氨基酸序列AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO: 9)。
(30)根据段落(27)至(29)中任一项所述的方法,其中该组合物进一步包括佐剂。
(31)根据段落(30)所述的方法,其中该佐剂是聚肌胞甘酸多核苷酸。
(32)根据段落(27)至(31)中任一项所述的方法,其中该载体是疏水物质,例如植物油、坚果油或矿物油。
(34)根据段落(1)至(33)中任一项所述的方法,其中该剂通过直接增强针对抗原的免疫应答来改善疫苗的功效,例如通过增加抗原特异性的CD8+T细胞的活性或数量。
(35)根据段落(34)所述的方法,其中由于总CD8+T细胞的相对减少,增加抗原-特异性的CD8+T细胞的活性或数量涉及抗原特异性的CD8+T细胞的富集。
(36)根据段落(1)至(33)中任一项所述的方法,其中该剂通过降低抑制性免疫细胞的数量或活性改善疫苗的功效,所述免疫细胞例如CD4+FoxP3+调节T细胞(Tregs)、髓源性抑制细胞(MDSC)、和/或CD19+CD1d+CD5+B细胞 (Bregs)。
(37)根据段落(1)至(36)任一项中所述的方法,其中该癌症是皮下实体瘤。
(38)根据段落(1)至(36)任一项中所述的方法,其中该癌症是卵巢癌、输卵管癌或腹膜癌。
(39)根据段落(1)至(38)中任一项所述的方法,其中该受试者是人类。
(40)干扰DNA复制的剂与包括至少一种存活蛋白抗原、由至少一种存活蛋白抗原组成或基本上由至少一种存活蛋白抗原组成的疫苗组合用于改善疫苗在癌症治疗中功效的用途,其中在疫苗之前至少给予两剂量的剂。
(41)用于根据段落(1)至(39)中任一项所述的方法的干扰DNA复制的剂和包括至少一种存活蛋白抗原、由至少一种存活蛋白抗原组成或基本上由至少一种存活蛋白抗原组成的疫苗的组合。
(42)如在此描述的组合物用于根据段落(1)至(39)中任一项所述的方法。
本发明进一步通过以下非限制性实施例进行说明。
实施例
实例1:
在美国(IND#14731)和加拿大(CTA-A#155301)进行的第I期研究在卵巢癌患者中检查了与环磷酰胺组合的DPX-Survivac的安全性和免疫效力。
DPX-Survivac是候选抗癌症免疫疗法疫苗,其包含衍生自存活蛋白的蛋白质序列、具有不同的HLAA限制性(HLA-A1、A2、A3、A24和B7)的一种十肽和四种九肽。具体地,DPX-Survivac包括五种具有如下氨基酸序列的合成存活蛋白肽抗原:FTELTLGEF(SEQ ID NO:2)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO:4)、 RISTFKNWPK(SEQ ID NO:6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO:7)、和LPPAWQPFL(SEQ ID NO:8);来自破伤风类毒素的通用T辅助细胞表位 (AQYIKANSKFIGITEL;SEQ ID NO:9);聚肌胞甘酸多核苷酸佐剂;由DOPC 和胆固醇组成的脂质体;和疏水载体 ISA 51 VG。DPX-Survivac疫苗被设计用来靶向存活蛋白。
在临床研究中,19名以铂化疗进行治疗并且显示没有疾病进展的晚期卵巢癌患者中的18名完成了他们的疫苗疗法。同龄组A(6名患者)间隔3周接受三次0.5 mL的疫苗注射;同龄组B和同龄组C(每组6名患者)分别接受三次0.1mL或 0.5mL的疫苗注射,与节律式低剂量口服环磷酰胺组合。根据示于图1中的时间表进行临床试验。
使用CTCAE v4.0评估不良事件。采集血液以研究免疫功能和疫苗诱导的T细胞免疫(分析通过(i)ELISPOT,(ii)四聚物分析和(iii)多参数胞内细胞细胞因子染色进行)。在基线和在1、2和3次注射后通过ELISPOT反复测量免疫性,使用一般线性模型进行统计学分析。
(i)用于检测功能性抗原特异性PBMC的IFN-γELISPOT测定
从临床试验受试者中获取的冷冻PBMC样品在IFN-γELISPOT测定中针对特异性测试抗原的回忆应答进行测试。解冻的PBMC用五种存活蛋白肽的池(pool)和用根据受试者HLA类型的相应的肽(一种或多种)进行刺激。在二重孔中测试针对抗原、阴性对照(仅在培养基中的细胞)和阳性对照(PHA)的应答。将抗原以50 和5μg/ml的浓度进行测试,以测试除了抗原特异性之外的剂量依赖性。PBMC临床样品与来自健康对照受试者的性别匹配的PBMC一起,以300,000细胞/孔的浓度铺 96孔ELSPOT板。
在第1天,将板用稀释于PBS中的第一抗体以80μl/孔包被,并且将板在加湿盒中冷藏过夜。在第2天,将板用PBS洗涤3次,200μl/孔;将过量的PBS通过轻弹板去除。针对T细胞活化添加100ul/孔的所希望的抗原(一种或多种),随后添加100ul/孔的测试或对照PBMC。在加湿培养箱中,针对IFN-γ分泌,将细胞在 37℃下温育24小时。导致直到这一步骤,所有步骤都在无菌条件下进行。在第3 天,在加湿盒中,将板用PBS洗涤3次、用PBS-TWEEN洗涤3次,随后添加80 ul/孔的在PBS-TWEEN-BSA中的生物素化的第二抗体并且在冷却器中温育过夜。在第4天,将板用PBS-TWEEN洗涤3次,200μl/孔,随后添加100μl/孔的在PBS- BSA中的三级检测试剂并且在室温下温育2小时。将板用PBS-TW洗涤3次并且用 PBS洗涤3次,并且将添加200μl/孔的新制备的显色(development)溶液。在室温下监测点显色,典型的是持续10-60分钟,仔细查看培养基对照孔中没有显色和包含抗原孔中的点的出现。通过用自来水冲洗板来停止反应,同时轻弹它。将板风干过夜并且在室温下在黑暗中储存。然后用板自动分析仪扫描ELISPOT板。处理原始 SFU计数并且总结以获得关于PBMC的抗原诱导的IFN-γ分泌的数据。
ELISPOT材料:
溶液:
1.PBS:无菌组织培养测试的
2.0.05%PBS-TWEEN:例如,在1L PBS中的500μl Tween-20
3.1%PBS-BSA:例如,在1L PBS(1%)中的10g BSA-部分V
4.1%PBS-TWEEN-BSA:例如,1L PBS-TWEEN加10g BSA-部分V
培养基:
以1%L-谷氨酰胺补充的无血清测试培养基。
测试细胞:
人类PBMC(冷冻在液氮中并且解冻)
3x 105细胞/孔的测试样品
培养箱:37℃、加湿的、7%CO2
AEC溶液:
在10ml DMF(N,N,二甲基甲酰胺)中的100mg AEC(3-氨基-9-乙咔唑)
通风橱中,制备于玻璃管中。
AEC缓冲液(0.1M乙酸盐):
148ml 0.2M的乙酸(11.55ml的冰醋酸/L水)加
352ml 0.2M乙酸钠(27.2g/水)。
用水使升至1L。调节至pH 5.0
显色溶液(被立即使用):
800μl AEC溶液加24ml AEC缓冲液。滤器0.45μm。添加12μl H2O2(30%)
(ii)使用MHC-多聚体(四聚物)的抗原特异性CD8+T细胞
MHC-多聚体试剂帮助鉴别在接种患者中所产生的抗原特异性CD8+T细胞。这些特异性T细胞表达TCR,该TCR可以识别并结合疫苗中所使用的一种或多种肽(当与MHC分子结合时)。对疫苗肽的免疫应答通过抗原特异性T细胞的扩增来反映。此类CD8+T细胞在解冻PBMC后并且在体外刺激与在包含在DPX- Survivac中的存活蛋白肽抗原的存在下细胞因子诱导的扩增后不久直接进行先体外后体内测量。
MHC-多聚体试剂,例如四聚物(贝克曼库尔特商贸公司或TC Metrix的HLA- A1、A2和A3;TC Metrix的HLA-A24和B7)被用于特异性检测疫苗诱导的CD8+ T细胞。针对先体外后体内和体外活化的PBMC,在本测定中使用对照PBMC和对照MHC-多聚体试剂。已知的CMV+健康供体PBMC与CMV-特异性MHC-多聚体一起被用作阳性对照,并且HIV-特异试剂将被用作阴性对照,用于分析内和分析间验证以及质量保证。
A.先体外后体内检测抗原特异性CD8+T细胞:
在10色流式细胞术中,针对血液中的特异性T细胞的先体外后体内染色,与调节T细胞(Treg)表型分析一起进行。染色混合物包括:匹配受试者HLA类型的 Live/dead,CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD27、CD25、Ki67、Foxp3和四聚物试剂。成功完成了检测鉴定试验,以验证对Treg细胞的细胞内Foxp3染色的细胞透化作用没有干扰细胞表面染色。先体外后体内四聚体分析由使用用于流式血细胞计数术的抗体混合物(如上所示)和四聚物试剂染色解冻并过夜静止的PBMC组成。简言之,将解冻的PBMC首先用四聚物试剂在4℃下染色30分钟,并且在IMF缓冲液(PBS+0.5%BSA+0.01%叠氮化钠)中洗涤。然后将细胞用抗体混合物在4℃下染色30分钟,该抗体混合物包含不同的荧色物结合的抗体作为表型标志物。然后将细胞洗涤,并且固定于1%多聚甲醛和用于流式血细胞计数术。针对检测B细胞水平,由于Foxp3的细胞透化作用负面影响CD19抗体结合,因此单独的管被用于以CD19抗体染色细胞。
B.体外活化PBMC以检测特异性CD8+T细胞:
针对抗原特异性T细胞的体外活化和扩增,在存活蛋白肽抗原和细胞因子 (IL-2和IL-15)的存在下,培养来自解冻用于先体外后体内分析的相同细胞的 PBMC 10天。简言之,进行解冻并过夜静止的细胞的活力分析并且使PBMC悬浮于 1x 106cells/ml的完全RPMI-1640培养基中,该完全RPMI-1640培养基补充有10%热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺、50μMβ-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素、10IU/ml人重组IL-2和10ng/ml人重组IL-15。在24孔板中,将1x 106细胞/孔置于1.0ml培养基中,并且这些细胞未被处理或者用适当的HLA-匹配的存活蛋白肽以5μg/ml的终浓度进行刺激。在供有5%CO2的情况下,将细胞在 37℃加湿培养箱中进行温育。在第3天、第6天和第8天,在不干扰细胞小心留一些培养基以便细胞不会变干的情况下,小心地抽吸培养基。添加适当的体积(1.0 ml)的具有细胞因子(10IU/ml IL-2和10ng/ml IL-15)预热完全RPMI培养基。在第10天,收集所有细胞并且用普通RPMI培养基洗涤一次、用IMF缓冲液洗涤一次并且根据方案被用于四聚物染色(5色):根据受试者HLA类型的live/dead、 CD3、CD8、CD45RA和一种或两种MHC-多聚体试剂。由于可能存在HLA-A2四聚物与来自A1或A3的受试者的PBMC的交叉反应性,因此也用设计用于HLA-A2 的试剂测试来自具有后面两种HLA-类型的受试者的细胞。与患者的PBMC平行,将已知的CMV+健康对照PBMC也用CEF肽池活化,以产生阳性对照样品,该阳性对照样品可以被用于分析内和分析间比较。在染色之后,针对流式血细胞计数术将细胞固定于1%的多聚甲醛。
(iii)多参数流式血细胞计数术(ICS)
多参数流式血细胞计数术测定被认为是非常具信息性的,因为它允许多种细胞因子/趋化因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17及其他)和表型标志物和/或功能性标志物(CD3、CD4、CD8、CD19、CD27、CD45RA、CD107a颗粒酶-B、 CCR7、等等)的同时检测。此外,已经显示多-功能T细胞(分泌多种细胞因子) 与保护类型1免疫应答相关,并且检测已登记的受试者的此类细胞有可能反映给予疫苗的免疫-效果。
ICS测定作为12色流式血细胞计数术进行,其包括:与IFN-γ、TNF-γ、IL-2、 IL-17、颗粒酶-B、和CD107a(针对细胞因子和其他功能性标志物)一起的 live/dead标志物、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD27(作为亚组和记忆分化标志物)。用于该测定的表型标志物的选择允许在测定中有可能响应于疫苗抗原的特异性效应子/中心记忆T细胞的鉴别。细胞刺激的条件包括:未刺激的、PMA/离子霉素阳性对照、包含于疫苗中的收集的存活蛋白肽、用于给定受试者的HLA-匹配的肽和对照PBMC的CEF(CMV/EBV/FLU)肽池的刺激。除了患者PBMC以外,将已知的HLA-A2健康供体PBMC用于质量保证的内部对照。简言之,在过夜静止之后,在抗-CD107a抗体的存在下,将106PBMC用单独肽和肽池刺激1小时。用来刺激的最终肽池或单独肽的浓度是1μg/mL。在刺激1小时后添加蛋白质分泌抑制剂(GolgiPlugTM/GolgiStopTM,BD生物科学公司(BD Bioscience)),并且将细胞在37℃和5%CO2下温育另外5小时。在体外刺激之后,洗涤细胞并且在4℃下表面染色30分钟(CD8、CD27CD3、CD4和CD45RA和存活标志物),随后在4℃下细胞内染色(IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-2)固定细胞/透性化细胞30分钟。使用 FACS DiVa软件(BD生物科学公司(BD Bioscience))将在LSR II流式细胞仪上获得标记的细胞,并且使用FlowJo软件分析这些细胞。多功能细胞因子分析将在每种细胞因子阳性群体的严格门控之后进行。此外,SPICE,数据挖掘软件应用,被用于分析来自多色的流式血细胞计数术的大FlowJo数据集,并且被以图形方式组织规范化数据。
結果:
抗原特异性免疫应答,如通过ELISPOT测定中IFN-γ的产生所评估的,通常用一种或多种接种来建立,并且用加强剂来增强或维持(图2-4)。在同龄组C患者产生显著更高幅度的应答的情况下,观察到剂量反应(同龄组C与同龄组B,P =.013)。低剂量环磷酰胺显著增强0.5ml剂量(同龄组C与同龄组A,P =.015)。这些结果证实免疫调节和与DPX-Survivac组合的低剂量环磷酰胺的组合产生了最强的免疫应答。同龄组C中的患者能够在少至一周的预先低剂量环磷酰胺给予之后用少至一剂量的疫苗引起(mount)免疫应答。在一、两或三剂量后在同龄组C中获得的应答(高达2309、1911和2517点/106PBMC)只能用存活蛋白疫苗和低剂量的环磷酰胺的组合来获得。
在同龄组B和C中通过存活蛋白疫苗产生的较高幅度的免疫应答的特征为血液中循环抗原特异性T细胞应答和多功能T细胞应答曲线的检测(图5和6)。在一些受试者中,这些循环抗原特异性CD8+T细胞可以通过四聚物染色先体外后体内检测,并且此类特异性T细胞还可以进一步通过在体外用HLA匹配的一种或多种肽抗原的刺激进行扩增。将12名接受DPX-Survivac组合治疗的受试者中的10名通过四聚物染色进行评估;所有10名显示在用DPX-Survivac的一次或两次接种后的存活蛋白-特异性CD8+T细胞诱导的有力证据。重要的是,CD8+T细胞应答用加强剂接种进行维持。因为CD8+T细胞涉及识别癌细胞、浸润肿瘤和杀死癌症靶点,这些特异性的免疫细胞的活化和维持在免疫治疗中是特别感兴趣的。通过四聚物分析在同龄组C中观察到最强的应答,证实由ELISPOT所获得的结果。大部分同龄组C中的患者具有的四聚物阳性在总CD8+T细胞的1%以上(在体外刺激的情况下)并且高达总CD8+T细胞的22%。相反,在同龄组A中记录的最高四聚物阳性为总 CD8+T细胞的1%以下(0.7%)。这证实了低剂量环磷酰胺和疫苗的组合产生显著更高的抗原特异性免疫应答。
用DPX-Survivac治疗的若干患者也显示出指示保护性免疫应答的多功能CD8+ T细胞的诱导。在每个同龄组A和B中六名中的每两名受试者和同龄组C中六名中的5名受试者均是多种细胞因子分泌CD8+T细胞阳性的。在所治疗的受试者中,大部分这些CD8细胞是中心记忆表型的,指示先前的抗原暴露和针对存活蛋白的持续免疫应答的诱导。将来自在治疗后多种细胞因子阳性的代表性受试者的结果示于表4中。
表4:
上表(表4)提供了来自代表性应答个体,受试者09-08、10-09、11-10和02- 16的ICS染色结果,显示多种细胞因子分泌的中心记忆CD8T细胞。通过胞内细胞细胞因子染色(ICS)测试外周血单核细胞的多功能CD8+T细胞的存在。在用存活蛋白肽的短期(5小时)刺激后,将细胞针对表型标志物例如CD3、CD4、CD8、 CD27、CD45RA进行表面染色,固定,透化处理和进一步针对胞内细胞因子例如 NF-γ、TNF-α和IL-2的存在进行染色。使用Flow-Jo软件的流式血细胞计数术分析被用于检测处于基线和接种后时间点的单种/多种细胞因子分泌的中心记忆 (CD27+CD45RA-)CD8+T细胞,除了具有后期分化的CD8+T细胞 (CD3+CD8+CD45RA+CD27-)的受试者09-08。(+)指示在具有>0.05%至> 3.0%的所分析记忆CD8+T细胞亚群频率范围的治疗后血液样品中的多功能T细胞的检测。(-)指示不存在可检测的多功能CD8T细胞。(*)由于质量差的PBMC 未能确定。
实例2:
在研究的第70天,第三次用DPX-Survivac接种后4周,收集来自患者02- 04、11-10、02-16、03-07、09-08、10-09和01-12的外周血单核细胞(PBMC),该DPX-Survivac接种如所述与节律式环磷酰胺组合给予。例外的是患者09-08,其中所分析的样品来自研究的第126天,第三次接种后的12周。确定所有患者的HLA 单倍型,并且与患者ID号码一起示于括号内(参见图7)。在用收集(pooled)的存活蛋白肽刺激后,先体外后体内使用ELISPOT测定(图7;左图)或由流式血细胞计数术的体外四聚物分析(图7;右图)来分析这些患者中的免疫应答。在 ELISPOT测定中,将患者PBMC用收集的肽进行刺激,该收集的肽代表了包含于疫苗DPX-Survivac(黑条;SurA1.T(SEQ ID NO:2)、SurA2.M(SEQ ID NO:4)、 SurA3.K(SEQ IDNO:6)的修饰肽、以及未修饰的SurA24(SEQ ID NO:7)和 SurB7(SEQ ID NO:8)肽),或用修饰的肽代替来自存活蛋白的天然肽的肽池(白条;SurA1(SEQ ID NO:1)、SurA2(SEQ ID NO:3)、SurA3(SEQ ID NO: 5))。
包含于DPX-Survivac中的修饰肽示于表5中。
表5:
对于四聚物分析,在IL-2/IL-15细胞因子的存在下,单种肽(天然的或修饰的)被用来刺激PBMC持续10天,并且使用基于修饰的肽和相对应的HLA分子所设计的四聚物试剂检测抗原特异性T细胞的频率。预期患者产生针对与其相关HLA 型相应的肽的免疫应答(即,SurA1对HLA-A1、SurA2对HLA-A2和SurA3对 HLA-A3)。如在图7中证实的,如在接种后血液样品的ELISPOT和四聚物分析二者中所见,针对包含于DPX-Survivac中的修饰存活蛋白肽所产生的免疫应答证实了与天然肽的明显交叉反应性。因此,预期DPX-Survivac疫苗诱导的CD8+T细胞靶向表达天然肽的肿瘤细胞,该天然肽与在细胞表面的相应HLA分子结合。由于观察到的对天然存活蛋白肽序列的免疫交叉-反应性,预期在疫苗中包含天然肽将产生免疫应答,该免疫应答能够识别天然序列(如果其存在于疫苗所靶向的细胞上)。
本说明书所引用的所用文献和专利申请都已纳入本文作为参考,这就如同已将各个出版物或专利申请单独列入本文作为参考一样。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露,并且不能理解为承认因为先前发明而本发明不能获得比这些公开物更早的申请日。
虽然上述发明已经通过说明和实例的方式用于清楚理解的目的在一些细节方面进行了描述,但是本领域技术人员根据本发明传授的内容很容易明白可以对其进行某些变化和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
必须注意的是,除非上下文中清楚地指出,如在本说明书及所附权利要求中所使用的单数形式“一种/一名”、“一个”和“该”包括复数指示物。除非另有限定,这里所用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的意思。
如本文在说明书和权利要求书中使用的,短语“和/或”应当理解为意味着元素中的“任一者或两者”如此联合,即,多个元素在一些情况下联合地存在并且在其他情况下分离地存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同方式解释,即“一个或多个”如此连接的要素。无论与具体指明的那些元素相关或无关,除了通过“和/或”项具体指明的元素之外可以任选地存在其他元素。因此,作为非限制性实例,当结合例如“包括”等开放式语言使用时,在一个实施例中对“A和/或B”的参考可以指代仅有A(任选地包括除了B之外的元件),在另一实施例中可以指代仅有B(任选地包括除了 A之外的元件),在又一实施例中可以指代A和B两者(任选地包括其他元件)等等。
如本文在说明书和权利要求书中使用的,“或”应当理解为包括与如上文定义的“和/或”相同的意义。举例来说,当在一个列表中划分多个项目时,“或”或“和/或”应当解释为包括性的,即包括若干元素或元素列表中的至少一个元素,但也包括一个以上的元素,并且任选地包括另外未列出的项目。
在此使用的,无论是在说明书中或在所附权利要求中,过渡性用语“包括(comprising或including)”、“携带”、“具有”、“包含”、“涉及”、等应当被理解为是包容性或开放式的(即,意指包括但不限于),并且他们不排除未列举的要素,材料或方法步骤。关于在此的权利要求和示例性实施方式段落,只有过渡性用语“由……组成”和“基本上由……组成”分别是封闭式或半封闭式过渡性用语。过渡性用语“由……组成”排除没有特别列举的任何要素、步骤、或成分。连接词“基本上由……组成”限制了特定元素、材料或步骤的范围并且限制了那些并没有实质上影响在此所披露的和/或所保护的本发明的一种或多种基本特征的范围。
Claims (81)
1.环磷酰胺和包括至少一种存活蛋白抗原的疫苗在制备用于在受试者中改善所述疫苗在癌症治疗中的功效的药物中的应用,所述治疗包括向所述受试者给予所述药物,所述给予包括:
(i)以足够提供免疫-调节作用的量向所述受试者给予至少两剂量的环磷酰胺,其中以节律式方案将所述环磷酰胺给予所述受试者,其中所述节律式方案包括每天向所述受试者给予所述环磷酰胺,持续每两周中的约一周的期间;并且
(ii)随后向所述受试者给予治疗有效量的疫苗,其中所述疫苗是用至少一种存活蛋白抗原、脂质体和包括连续相的疏水性物质的载体制备的组合物,其中所述癌症表达所述至少一种存活蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的应用,包括在给予所述疫苗前每天至少1次、2次、3次或4次向所述受试者给予所述环磷酰胺。
3.根据权利要求1或2所述的应用,包括在给予所述疫苗前约一周的期间内每天两次给予所述环磷酰胺。
4.根据权利要求1至2任一项中所述的应用,包括约每三周一次向所述受试者给予所述疫苗。
5.根据权利要求3所述的应用,包括约每三周一次向所述受试者给予所述疫苗。
6.根据权利要求4所述的应用,包括向所述受试者给予所述疫苗2次、3次、4次或更多次。
7.根据权利要求1所述的应用,包括在给予第一剂量的所述疫苗前约一周开始向所述受试者给予所述环磷酰胺,并且包括约每三周一次向所述受试者给予所述疫苗。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的应用,其中所述存活蛋白抗原是肽抗原或编码抗原的核酸。
9.根据权利要求3所述的应用,其中所述存活蛋白抗原是肽抗原或编码抗原的核酸。
10.根据权利要求1至2任一项中所述的应用,其中所述存活蛋白抗原是肽抗原,或编码所述肽抗原的核酸分子,所述肽抗原包括来自存活蛋白SEQ ID NO:11的氨基酸序列,所述存活蛋白能够在所述受试者中引起细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)应答。
11.根据权利要求3所述的应用,其中所述存活蛋白抗原是肽抗原,或编码所述肽抗原的核酸分子,所述肽抗原包括来自存活蛋白SEQ ID NO:11的氨基酸序列,所述存活蛋白能够在所述受试者中引起细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)应答。
12.根据权利要求1至2任一项中所述的应用,其中所述存活蛋白抗原是肽抗原,所述肽抗原包括FEELTLGEF;FTELTLGEF;LTLGEFLKL;LMLGEFLKL;RISTFKNWPF;RISTFKNWPK;STFKNWPFL;和LPPAWQPFL,或其任何组合;或编码所述肽抗原的核酸分子。
13.根据权利要求3所述的应用,其中所述存活蛋白抗原是肽抗原,所述肽抗原包括FEELTLGEF;FTELTLGEF;LTLGEFLKL;LMLGEFLKL;RISTFKNWPF;RISTFKNWPK;STFKNWPFL;和LPPAWQPFL,或其任何组合;或编码所述肽抗原的核酸分子。
14.根据权利要求1至2任一项中所述的应用,其中所述至少一种存活蛋白抗原包括五种肽抗原的混合物,所述五种肽抗原包括FTELTLGEF;LMLGEFLKL;RISTFKNWPK;STFKNWPFL和LPPAWQPFL。
15.根据权利要求3所述的应用,其中所述至少一种存活蛋白抗原包括五种肽抗原的混合物,所述五种肽抗原包括FTELTLGEF;LMLGEFLKL;RISTFKNWPK;STFKNWPFL和LPPAWQPFL。
16.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13和15中任一项所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是25-300mg/天的环磷酰胺。
17.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13和15中任一项所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是50-100mg/天的环磷酰胺。
18.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13和15中任一项所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是100mg/天的环磷酰胺。
19.根据权利要求3所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是25-300mg/天的环磷酰胺。
20.根据权利要求4所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是25-300mg/天的环磷酰胺。
21.根据权利要求8所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是25-300mg/天的环磷酰胺。
22.根据权利要求10所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是25-300mg/天的环磷酰胺。
23.根据权利要求12所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是25-300mg/天的环磷酰胺。
24.根据权利要求14所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是25-300mg/天的环磷酰胺。
25.根据权利要求16所述的应用,其中所述足够提供免疫调节作用的量是每剂量50mg的环磷酰胺。
26.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15和19至25任一项中所述的应用,包括向所述受试者口服给予所述环磷酰胺。
27.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15和19至25任一项中所述的应用,包括通过注射向所述受试者给予所述疫苗。
28.根据权利要求26所述的应用,包括通过注射向所述受试者给予所述疫苗。
29.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15和19至25任一项中所述的应用,包括通过皮下注射向所述受试者给予所述疫苗。
30.根据权利要求26所述的应用,包括通过皮下注射向所述受试者给予所述疫苗。
31.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28和30中任一项所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
32.根据权利要求3所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
33.根据权利要求4所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
34.根据权利要求8所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
35.根据权利要求10所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
36.根据权利要求12所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
37.根据权利要求14所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
38.根据权利要求16所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
39.根据权利要求17所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
40.根据权利要求18所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
41.根据权利要求26所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
42.根据权利要求27所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
43.根据权利要求29所述的应用,其中所述组合物进一步包括一种T辅助细胞表位。
44.根据权利要求31所述的应用,其中所述T辅助细胞表位是包括氨基酸序列AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:9)的肽。
45.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30和32至44中任一项所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
46.根据权利要求3所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
47.根据权利要求4所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
48.根据权利要求8所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
49.根据权利要求10所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
50.根据权利要求12所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
51.根据权利要求14所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
52.根据权利要求16所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
53.根据权利要求17所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
54.根据权利要求18所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
55.根据权利要求26所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
56.根据权利要求27所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
57.根据权利要求29所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
58.根据权利要求31所述的应用,其中所述组合物进一步包括佐剂。
59.根据权利要求45所述的应用,其中所述佐剂是polyI:C多核苷酸。
60.根据权利要求46-58中任一项所述的应用,其中所述佐剂是polyI:C多核苷酸。
61.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30、32至44和46-59任一项所述的应用,其中所述载体是植物油、坚果油或矿物油。
62.根据权利要求60所述的应用,其中所述载体是植物油、坚果油或矿物油。
63.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30、32至44、46-59和62中任一项所述的应用,其中所述载体是矿物油或矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸。
65.根据权利要求60所述的应用,其中所述载体是矿物油或矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸。
66.根据权利要求61所述的应用,其中所述载体是矿物油或矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸。
67.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30、32至44、46-59、62、65至66中任一项所述的应用,其中所述环磷酰胺通过直接增强针对所述抗原的免疫应答来改善所述疫苗的功效。
68.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30、32至44、46-59、62、65至66中任一项所述的应用,其中所述环磷酰胺通过增加抗原特异性的CD8+T细胞的活性或数量来改善所述疫苗的功效。
69.根据权利要求60所述的应用,其中所述环磷酰胺通过直接增强针对所述抗原的免疫应答来改善所述疫苗的功效。
70.根据权利要求61所述的应用,其中所述环磷酰胺通过直接增强针对所述抗原的免疫应答来改善所述疫苗的功效。
71.根据权利要求63所述的应用,其中所述环磷酰胺通过直接增强针对所述抗原的免疫应答来改善所述疫苗的功效。
72.根据权利要求64所述的应用,其中所述环磷酰胺通过直接增强针对所述抗原的免疫应答来改善所述疫苗的功效。
73.根据权利要求67所述的应用,其中所述环磷酰胺通过相对于总CD8+T细胞的抗原-特异性CD8+T细胞的富集群的产生来改善所述疫苗的功效。
74.根据权利要求69-72任一项所述的应用,其中所述环磷酰胺通过相对于总CD8+T细胞的抗原-特异性CD8+T细胞的富集群的产生来改善所述疫苗的功效。
75.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30、32至44、46-59、62、65至66、69-72任一项所述的应用,其中所述环磷酰胺通过降低抑制性免疫细胞的数量或活性改善疫苗的功效。
76.根据权利要求75所述的应用,其中所述抑制性免疫细胞是CD4+FoxP3+调节T细胞、髓源性抑制细胞、和/或CD19+CD1d+CD5+B细胞。
77.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30、32至44、46-59、62、65至66、69-72任一项中所述的应用,其中所述癌症是皮下实体瘤。
78.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30、32至44、46-59、62、65至66、69-72任一项中所述的应用,其中所述癌症是卵巢癌、输卵管癌或腹膜癌。
79.根据权利要求1至2、5至7、9、11、13、15、19至25、28、30、32至44、46-59、62、65至66、69-72中任一项所述的应用,其中所述受试者是人类。
80.环磷酰胺与用至少一种存活蛋白抗原、脂质体和包括连续相的疏水性物质的载体制备的疫苗组合在制备用于在受试者中改善所述疫苗在癌症治疗中功效的药物中的应用,其中在所述疫苗前给予至少两剂量的所述环磷酰胺,并且其中以节律式方案将所述环磷酰胺给予所述受试者,其中所述节律式方案包括每天向所述受试者给予所述环磷酰胺,持续每两周中的约一周的期间,并且其中所述癌症表达所述至少一种存活蛋白抗原。
81.用于根据权利要求1至79任一项所述的治疗中的环磷酰胺和用至少一种存活蛋白抗原、脂质体和包括连续相的疏水性物质的载体制备的疫苗的组合。
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