CN1748029A

CN1748029A - 调控生存素表达的寡聚化合物

Info

Publication number: CN1748029A
Application number: CNA2004800039379A
Authority: CN
Inventors: 波·汉森; 夏洛特·阿尔巴克·特荣; 卡米尔·杜蒙·彼德森; 马伊肯·韦尔特加德; 玛吉特·维森巴赫
Original assignee: Santaris Pharma AS
Current assignee: American Businessmen Anlong Pharmaceutical Co Ltd; Santa Rees
Priority date: 2003-02-10
Filing date: 2004-02-10
Publication date: 2006-03-15
Anticipated expiration: 2024-02-10
Also published as: CN100360669C

Abstract

提供直接针对生存素(Survivin)基因的寡聚核苷酸来调控生存素的表达。这些成分包含寡聚核苷酸，特别是反义寡聚核苷酸，其针对编码生存素的核酸。提供利用这些化合物来调控生存素的表达以及治疗与生存素的过量表达、生存素突变体的表达或者与二者都相关的疾病的治疗。这些疾病的例子是癌症例如肺癌、乳癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、胃癌、肠癌、大肠癌、脊髓癌、鼻窦癌、膀胱癌、泌尿道癌、卵巢癌。这些寡聚核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸或者核酸类似物例如锚定核酸(locked nucleic acid)或者它们的组合物。

Description

调控生存素表达的寡聚化合物

技术领域

本发明提供调控生存素(Survivin)表达的组合物和方法。本发明尤其涉及寡聚化合物，且优选的该化合物是寡聚核苷酸，其可以和编码生存素的核酸特异性地杂交。已显示这些寡聚核苷酸化合物可以调控生存素的表达，并公开了它们的药用方面的制备以及治疗癌症疾病的应用。

背景技术

癌症是一种世界范围内引起死亡的主要原因，包含一组疾病，这些疾病是由源于基因组不稳定性的遗传紊乱所致。据推测，所有的癌细胞在几个调控途径上都存在缺陷，而这些调控途径可以控制正常细胞的增殖和动态平衡。这些缺陷导致获得各种癌细胞特异性标志的能力(Hanahan和Weinberg，200，Cell 100，57-70)。癌症的这些标志之一是逃脱凋亡或者程序性死亡的束缚，凋亡或者程序性死亡是进化上保守的细胞自杀程序(Hengartner，2000，Nature407，770-776)。凋亡在胚胎发育中是不可缺少的，可以清除不再需要的细胞，并通过平衡细胞生成和细胞清除来维持成年组织的动态平衡。同时，由于感染因子或者药物引起的表现出异常特征如突变或者基因组损伤的细胞会在这条途径中被清除。在恶性细胞中，这种细胞监控由于凋亡受到抑制而缺失，这导致了细胞的生存延长，增加了细胞被转化的风险，加剧了疾病的发展以及对治疗的抗性(Evan和Vousden，2001，Nature 411，342-348)。因此，对凋亡的调控已经成为了治疗癌症的一种新的治疗策略(Nicholson DW，2000，Nature 407，810-816)。

已经知道有两条引起凋亡被诱导的信号通路，即，内部或者线粒体通路，是由环境压力和化学疗法引起的；外部或者死亡受体通路，是由免疫系统的效应细胞引起的(Ashkenazi和Dixit，1998Science 281，1305-1308；Green和Reed，1998，Science 281，1309-1312)。这两条通路最终都会引起Caspases的激活，这是一种细胞内半胱氨酸蛋白酶家族，可以在几分钟内破坏细胞的结构导致细胞快速死亡(Cohen，1997，Biochem J 326，1-6)。同时，也已经知道了凋亡促进蛋白和抑制蛋白。Bcl-2蛋白家族既包含了前凋亡蛋白也包含了抗凋亡蛋白。在凋亡的抑制因子中，进化上高度保守的凋亡抑制蛋白(IAP)家族在人中包含有8种蛋白。生存素是其中的一种，最近才被鉴定出来(Ambrosini等，1997，Nat.Med.3，917-921)。生存素可以通过直接或者间接地抑制效应因子Caspase-3和Caspase-7胞内蛋白酶或者抑制凋亡而抑制Bcl-2下游的凋亡(Shin等，2001，Biochemistry 40，1117-1123)。目前的证据显示生存素直接调控上游发挥作用的Capase-9的激活。生存素的Thr³⁴-Ala显性抑制(dominant negative)突变体在凋亡体成分Apaf-1或者Caspase-9缺失的小鼠胚胎成纤维细胞中不能够诱导凋亡(Blanc-Brude等，2003，Clin.Cancer Res.9，2683-2692)。乙肝病毒X结合蛋白(HBXIP)作为磷酸化的生存素的辅助因子使其可以结合并抑制前caspase-9的激活来发挥作用(Marusawa等，2003，EMBO J.22，2729-2740)。其它的作用模式也被讨论了(Beltrami等，2004，J.Biol.Chem.279，2077-2084)。

生存素作为一种新型的治疗靶点已经吸引了大量的注意力，原因在于，它在癌细胞中是选择性表达的，并且对癌细胞的生存是必须的。生存素在胚胎发育过程中正常表达。除了胸腺、CD34+骨髓衍生干细胞、胎盘、基底结肠上皮细胞外，生存素在正常成年组织中是检测不到的，但在所有不依赖于有丝分裂状况的所有转化细胞内基本是过量表达的。表达通常通过一种细胞周期依赖的方式进行调节，并在有丝分裂时达到最高值(Li等1998，Nature396，580-584)。与间期比较，在G2/M期的上调可以达40倍以上。同时，由于CDC2-细胞周期蛋白-B1对Thr34的磷酸化引起的蛋白质稳定性的提高或许可以解释生存素在有丝分裂时期水平的提高。在间期，因为依赖泛素的蛋白质水解(Zhao等，2000，J.Cell Sci.113，4363-71)，蛋白水平会降低到基础水平。已有提示，生存素在癌细胞内的过量表达会消除默认的凋亡诱导作用，进而突破G2/M控制点，因而促进细胞有丝分裂进程(Li等，1998，Nature396，580-584)。

在细胞培养体系中，通过过量表达生存素来抑制细胞死亡已经很成熟了(Ambrosini等1997，Nat.Med.3，917-921；Tamm等1998，Cancer Res.58，5315-5320；Mahotka等，1999，Cancer Res.59，6097-6102)。

在体内，生存素作为凋亡抑制因子的作用已经通过在转基因鼠的皮肤中过表达生存素被证明，其可以抑制中波长紫外线(UVB)引起的角化细胞的凋亡(Grossman等，2001，J.Clin.Invest.108，991-999)。除了在细胞凋亡中的作用，生存素在有丝分裂的多个方面发挥重要的作用。例如，在纯合子敲除生存素的小鼠中生存素的敲除可以导致100％的死亡率(Uren等，2000，Curr.Biol.10，1319-1328；Conway等，2002，Gastroenterolgy 123，619-631)。已经发现，生存素与有丝分裂器的多种组分有关联，例如中心体，微管和纺锤体残余中间体。微管关联对于生存素抗凋亡功能是必需的。

生存素作为凋亡抑制因子和细胞分裂中的重要因子的双重功能被通过用与生存素基因互补的EPR-1 cDNA转染HeLa细胞而靶向下调生存素得到证明。反义EPR-1下调生存素而导致凋亡增加以及细胞增殖抑制(Ambrosini等，1998，J.Biol.Chem.273，11177-11182)。生存素的缺失的其他标志是有丝分裂停滞、中心体复制缺乏、微管成核和有丝分裂纺锤体装配/稳定以及细胞分裂的抑制。大多数这样的影响会在P53^-/-突变的情况下加剧(Beltrami等，2004，J.Biol.Chem.279，2077-2084；Carvalho等，2003，J.Cell.Sci.116，2987-2998；Lens等，2003，EMBO J.22，2934-2947)。生存素在有丝分裂中的重要作用可以通过其与有丝分裂器关联而得到加强，所述有丝分裂器包括分裂中期和后期纺锤体的微管和分裂中期染色体的着丝粒(Beltrami等，2004，J.Biol.Chem.279，2077-2084)。生存素与其他的染色体信使蛋白(passengerprotein)共存，例如内着丝粒蛋白(INCENP)和极光蛋白B(Aurora B)(Carvalho等，2003，J.Cell.Sci.116，2987-2998；Lens等，2003，EMBO J.22，2934-3947)。极光蛋白B的激酶活性依赖于与生存素的相互作用(Chen等，2003，J.Biol.Chem.278，486-490)。已有迹象表明，极光蛋白B的激酶活性对于胞质分裂是必需的，其提供了一种生存素与细胞分裂之间的机械连接(Chen等，2003，J.Biol.Chem.278，486-490)。两篇报道证明生存素对于姐妹染色质着丝点拉紧缺失所引起的控制点停滞的维持是需要的。在着丝点长时间缺少张力的情况下，生存素似乎对于维持着丝点的控制点蛋白BubR1和控制点停滞是必需的。红豆杉醇(Taxol)是一种微管稳定剂，可以使微管结合到着丝点上，但会阻止张力生成。通常经红豆杉醇处理的细胞会由于着丝点结合的BubR1介导的控制点的激活而停留在有丝分裂期。然而，生存素耗竭的细胞经红豆杉醇处理后，经过一段时间延迟后完成有丝分裂，在上述延迟期间BubR1从着丝点上丢失。诺考达唑(Nocodazol)也可以防止张力在着丝点形成，但是通过阻止微管与其结合来发挥作用的。然而，生存素的耗竭对于由诺考达唑引起的控制点激活和有丝分裂停滞没有影响。显然，生存素并不参与监控微管对着丝点的占据，而是对于施加到着丝点上的监控控制点的纺锤体张力是需要的(Carvalho等，2003，J.Cell.Sci.116，2987-2998；Lens等，2003，EMBOJ.22，2934-2947)。而且，已有迹象表明，生存素作为一种依赖p53的关键的有丝分裂控制蛋白，是基因组完整和细胞保护所需要的(Beltrami等，2004，J.Biol.Chem.279，2077-2084)。因此，生存素有可能是一种连接细胞死亡和调节细胞分裂的重要桥梁。由于其作为凋亡抑制因子和有丝分裂的促进因子的双重作用，生存素是在癌症开始和发展以及对化疗药物的耐受性的一种重要因子。

其在癌症临床治疗上的作用已经通过在几乎所有肿瘤类型中都有高表达的生存素得到强调。生存素在肿瘤中表达的提高与不良预后以及癌症复发增加和对治疗的耐受性有关(Kawasaki等，1998，Cancer Res.58，5071-5074；Adida等，1998，Lancet 351，882-883)。有意思的是，肺和乳腺肿瘤中表达最高水平的生存素。这些肿瘤通常与由于早期迁移和对许多机制上不相关的化疗药物的耐受性引起的不良预后有关。已经显示生存素的下调使肿瘤细胞对DNA损伤试剂例如拉司太特(etoposide)(Li等，1999，Nature Cell Biology1，461-466；Olie等，2000，Cancer Res.60，2805-2809；Jiang等，2001，J.Cell.Biochem.83，342-354)、氨氯铂(Cisplatin)(Pennati等，2004，Oncogene 23，386-394；)、亚德里亚霉素(doxorubicin)(Zhou等，2002，J.Pharmocol.Exp.Ther.303，124-131)和放射治疗(Pennati等，2003，J.Invest.Dermatol.120，648-654；Asanuma等，2002，Jpn.J.Cancer Res.93，1057-1062)变得敏感。生存素耗竭的细胞对紫杉醇(texol)特别敏感，同样对红豆杉醇也一样(Zaffaroni等，2002，Cell.Mol.Life Sci.59，1406-1412；Ling等，2004，J.Biol.Chem.印刷之前的电子版)。已经显示，对红豆杉醇和放射治疗的耐受性与生存素的表达水平相关(Zaffaroni等，2002，Cell.Mol.Life Sci.59，1406-1412；Rodel等，2003，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55，1341-1347)，已显示，亚致死量的红豆杉醇显著上调MCF-7乳癌细胞中的生存素的表达(Ling等，2004，J.Biol.Chem.印刷之前的电子版)。生存素似乎对纺锤体控制点对红豆杉醇处理的反应的功能是需要的(Carvalho等，2003，J.Cell.Sci.116，2987-2998；Lens等，2003，EMBO J.22，2934-2947)。没有生存素的细胞也因此丧失了它们的原本的抵抗机制之一，即，修复红豆杉醇对有丝分裂的负面影响。

有趣的是，生存素也在血管生成中发挥了重要的作用。发现生存素在体外和体内的血管生成刺激的内皮细胞中有所上调(O’Connor等，2000，Am.J.Pathol.156，393-398；Tran等，1999，Biochem.Biophy.Res.Commun.264，781-788)。生存素的反义靶向引起离体内皮细胞凋亡和毛细管样血管的快速退化(Mesri等，2001a，Am.J.Pathol.158，1757-1765)。将表达显性抑制的生存素的腺病毒注射入人乳腺癌异种移植体后，抑制了已有肿瘤的生长。这与肿瘤细胞和内皮细胞的凋亡，以及肿瘤衍生的血管的显著减少有关(Blanc-Brude等，2003，Clin.Cancer Res.9，2683-2692)。化学疗疗和放射疗法以肿瘤细胞和肿瘤血管的生长的内皮细胞为靶标。已显示，血管内皮生长因子(VEGF)显著降低了化学疗法对血管内皮细胞的促凋亡效力。已将这种对药物毒性的细胞保护作用与VEGF介导的生存素表达上调联系在一起。生存素活性的抑制会破坏VEGF对干扰微管动力学的药物(红豆杉醇)和损伤DNA的细胞保护作用以及针对肿瘤坏死因子的保护作用(Tran等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，4349-4354；Mesri等，2001a，Am.J.Pathol.158，1757-1765)。另外，显性抑制的生存素(T34A)蛋白在内皮细胞(HUVECC和DMVEC)中表达导致了凋亡被大量诱导(Blanc-Brude等，2003，Clin.Cancer Res.9，2683-2692)。

以生存素为靶标正日益被提及具有双重抗癌作用，即，诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤相关的血管生成(Altieri DC，2003，Oncogene 22，8581-8591)。

以生存素为靶标的几种治疗方法已被引入。最有前景的几种包括接种疫苗策略、利用生存素突变体作为具有显性抑制作用的拮抗剂、和使用生存素特异的反义寡聚核苷酸。使用表达显性抑制的生存素突变蛋白(Thr34-Ala)的复制缺陷型腺病毒，在小鼠的三个不同的乳癌异种移植体模型中均抑制了肿瘤生长。这种腺病毒在一种乳癌异种移植体模型上表现出体内功效，并诱导了生存素(T34A)在黑素瘤细胞中的表达，抑制了黑色素瘤异种移植模型的肿瘤生长(Blanc-Brude等，2003，Clin.Cancer Res.9，2683-2692；Grossman等，2001Proc.Natl.Sci.USA 98；635-640)。细胞培养中，通过突变的生存素结合到CDC2-细胞周期蛋白B1，进而抑制野生型生存素的磷酸化，从而使凋亡增加(Mesri等，2001b，J.Clin.Invest 108，981-990)。一些CDC 2拮抗剂，如purvalanol A和flavopiridol，可抑制生存素磷酸化，目前正在临床上与红豆杉醇联合测试(Schwartz等，2002，J.Clin.Oncol.20，2157-2170)。

几种利用反义寡聚核苷酸的方法显示，抗生存素的反义寡聚核苷酸下调培养细胞中生存素的表达，诱导凋亡和使肺癌细胞和HeLa细胞对肿瘤化疗药物拉司太特敏感(Li等，1999，Nature Cell Biology 1，461-466；Olie等，2000，Cancer Res.60，2805-2809；Jiang等，2001，J.Cell.Biochem.83，342-354)。反义寡聚物ISIS 28599是混合的骨架2’-O-MOE半体(wingmer)，当用其抑制几种细胞系时，导致产生了多核细胞，并诱导了凋亡(Chen等，2000，Neoplasia2，235-241)。在小鼠肺再生模型中，反义寡聚核苷酸ISIS 114926将生存素mRNA减少90％(Proceedings ofthe American Association for Cancer Research，Vol.42，2001，摘要#2468)。瘤内注射反义寡聚核苷酸ISIS 23722引起的降低对侵略性的小鼠内非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)异种移植体肿瘤的生长速率的影响有限(Ansell等，2004，Leukemia-印刷之前的电子版)。

目前还没有治疗药物可以有效地抑制生存素的合成。因此，通过降低生存素表达来抑制肿瘤细胞生长的药物是长期需求的。在WO9822589中，公开了使用药物调节凋亡的方法，其调节生存素量和活性，还公开了使用这种药物降低由生存素介导的病理状态的严重程度的方法。该药物是一种编码EPR-1编码链的结构体(construct)，其与survivin互补，特异的反义寡聚物并没有公开。WO0164741公开了一种“四环素关闭(tet-off)”启动子系统，调节生存素反义mRNA转录。然而，该申请并没有公开任何反义寡聚核苷酸。

目前临床上实验的大多数寡聚核苷酸均基于从1988年开始的硫代磷酸酯化学，而硫代磷酸酯化学是开发的第一个有用的反义化学。然而，鉴于近年来显示这门化学具有致命的缺点，因而其临床应用受到限制。这些包括与它们靶标mRNA的低亲和力，这负面地影响了其效力，并限制了活性寡聚核苷酸的大小，因此使制备复杂化同时增加了治疗成本。并且，它们的低亲和力会转换成难以接近靶标mRNA，这样就使识别活性化合物变得复杂。最终，硫代磷酸酯寡聚核苷酸会因为一定范围的副作用而限制了他们的治疗窗。

为了解决这些和其它的问题，已经在制造新型的特性得到改良的类似物上投入了大量的努力。如下面的示意图1所描述的，这些包括完全人工合成类似物例如多肽核酸(PNA)和吗酮(Morpholino)，以及多种传统的DNA类似物例如甲硼烷磷酸盐、N3′-P5′磷酰胺化物，以及几种2′修饰类似物例如2′-氟，2′-氧杂-甲基，2′-氧杂-甲氧基乙基(MOE)和2′-氧杂-(3-氨基丙基)(AP)。最近，也介绍了己糖醇核酸(HNA)、2′-氟-阿拉伯糖核酸(2′-F-ANA)和D-环己烯基核苷(CeNA)。

这些类似物中有许多表现出提高的与互补核酸结合的能力，生物稳定性改善，或者它们保持了补充细胞酶即RNAeH的能力，该酶参与多种反义化合物的功能模式(mode-of-action)。然而，它们都没有把所有这些优点结合在一起，在许多情况下，一种性质的改善包含了一种或者多种其它性质。并且，在许多情况下，已发现有新的并发症状，严重地限制了许多类似物的商业价值。这些包括，低溶解度、复杂的寡聚作用化学性质、非常低的细胞摄取、与其他化学性质的不相容性等。

用于治疗疾病的调控生存素表达的反义寡聚核苷酸在WO0018781和WO0157059中被公开。这些寡聚核苷酸长度都在18-19个碱基对之间并设计具有硫代磷酸或者MOE的化学性质。

WO014655公开了一种针对生存素的单链反义寡聚核苷酸，它是一种完全用一些MOE核苷修饰的硫代磷酸。MOE的化学性质具有几种局限。其只具有不大的亲和力，这只在几种MOE被全部插入到寡聚物时才显现。MOE属于2′-修饰物，非常有名，对这组化合物来说，其反义活性直接于体外RNA结合力相关。据报道，针对c-raf的经MOE修饰的20个碱基对的gapmer(5MOE/PO-10PS-5MOE/PO)在T24细胞中具有20nm的IC₅₀，针对PKC-a的MOE gapmer在A549细胞中具有25nm的IC₅₀。相比而言，使用在反义实验中的硫代磷酸酯核苷通常表现出150nm范围内的IC₅₀(Stein，Kreig，AppliedAntisense Oligonucleotide Technology，Wiley-Liss，1988，p87-90)。

在本发明之后提交的专利WO03027244公开了一种针对生存素的20mer的硫代磷酸酯反义寡核苷，其在非常高的浓度时即显示下调活性(例如化合物903在200nM时显示蛋白质减少51％)。

本发明的主要的目的是提供针对生存素mRNA的新型寡聚化合物。已经发现，本发明的化合物表现出降低的IC₅₀(也就是提高了活性)，因此有利于治疗多种癌症疾病，其中，生存素表达被蕴义为引起结果的或相关的作用因素。正如下面解释的，这种目的通过利用超高亲和力性质的名为锚定核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)得以最好实现。

本发明指向寡聚化合物，特别是LNA反义寡聚核苷酸，其针对编码生存素的核酸并调控生存素的表达。这种调控特别是显著下调生存素mRNA的表达，以及激发凋亡反应。这种含有LNA的寡聚化合物可以低到为8mer，而16mer时具有高活力，这比已报道的针对生存素的寡聚核苷酸要显著的短。这些16mer的寡聚化合物的IC50值在亚纳摩尔范围内。

本发明能够显著缩短反义寡聚物的通常长度(从20-25mer到例如8-16mer)，而不减少药理活性所需的亲和力。由于寡聚物内在的特异性与其长度负相关，因此缩短可以显著的提高反义化合物对其靶标RNA的特异性。进一步，预计较短的寡聚化合物比较长的寡聚化合物拥有更高的生物稳定性和生物渗透性。至少是鉴于这些原因，本发明对本领域技术是一种相当大的贡献。

发明内容

生存素对于细胞增殖是必需的，参与有丝分裂的多种阶段。它参与几个连接有丝分裂和细胞分裂以及凋亡的控制点。生存素是凋亡(IAP)基因家族的抑制因子的一员，抑制程序性细胞死亡(细胞凋亡)(参照图6)。可以在大部分常见的人瘤中观察到生存素表达提高，包括结肠癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、恶性胶质瘤和血癌。生存素的表达在几种癌症中与升级和侵袭相关。生存素在正常分化的组织是检测不到的或者以非常低的水平存在，这使得生存素在多种人类癌症中是优选靶标。

本发明的一个中心目的是提供一种由8-50个核苷酸组成的化合物，其中所述化合物包含至少8个核苷酸的子序列，其中所述的子序列位于从表1和2所列的序列中选择的序列之内。

由于人类基因组的序列是可以得到的，并且它的基因的注释发展很快，本发明的一种实施方式是鉴定靶标mRNA中尽可能是最短的、独有的序列。也将本发明的含有LNA的寡聚化合物与大量包含LNA和/或者硫代磷酸酯的18mer的化合物进行了比较，该18mer的化合物与ISIS 23722的反义寡聚物是异连续的(iso-sequential)。也进行了与ISIS 23722(是18mer的4MOE 10硫代磷酸酯并在其后连接有4MOE)的比较。

也提供了包含本发明的寡聚化合物的药物和其它组合物。进一步提供的是调控生存素在细胞或者组织中的表达的方法，其包括使所述细胞或者组织与一种或者多种本发明的多聚化合物或者组合物接触。同时公开了通过给予治疗有效量或者预防有效量的本发明的一种或者多种寡聚化合物或者组合物，来治疗被怀疑患有或易于患有与生物素表达相关联的疾病或者状况的动物或人的方法。这种疾病的例子是各种不同的癌症，本发明进一步提供使用寡聚化合物抑制生存素表达，从而治疗与生存素活性有关的疾病的方法。这些疾病是不同类型的癌症，例如肺癌、乳癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、胃癌、肠癌、大肠癌、脊髓癌、鼻窦癌、膀胱癌、泌尿道癌、卵巢癌。

附图说明

图1.本发明的不同设计的图解：间聚物(Gapmers)、头聚物(Headmers)和尾聚物(Tailmers)以及各种不同成份的混合聚物(Mixmer)。对于混合聚物，数字代表了DNA片段、β-D-氧杂-LNA、α-L-LNA的交替邻近伸长。在图中，线条表示DNA，灰影代表α-L-LNA，长方形代表β-D-氧杂-LNA。

图2.LNA反义寡聚化合物引起的生存素mRNA的下调。化合物2A、6A、9A、15A分别用0.2、1、5、25nM处理15PC3后提取总RNA，进行RNA印迹分析(Northern blot)，这些化合物在低浓度下都是有效的抑制剂。

图3A.LNA反义寡聚化合物引起的生存素mRNA的下调。化合物2A、15A分别用0.2、1、5、25nM处理SW480(上图)and A549(下图)后提取总RNA，进行RNA印迹分析，再用寡聚核苷酸转染细胞后培养24小时。

图4.合成硫代-LNA的一般方案。

图5.SEQ ID No.1基因库(GenBank)保藏号为NM 00168的人类生存素mRNA序列。

图6.生存素在凋亡途径中的示意路线。

图7.LNA反义寡聚核苷酸引起的生存素mRNA的下调。用寡聚核苷酸转染细胞后培养24小时，提取总RNA并用实时PCR(Realtime PCR)的方法检测15PC3和MCF-7的生存素的表达，生存素的表达表示为标准化成GAPDH转录的稳定状态的结果。

图8.含有LNA的反义寡聚核苷酸诱导的凋亡。用寡聚核苷酸转染15PC3细胞，浓度在96孔板中显示。转染24小时后，如描述的那样加入caspases3/7-Glo，用Thermo Labsystems的Luminoskan Ascent设备记录诱导的荧光(荧光酶活性)。荧光酶活性用每秒的相对光单位(RLU/s)来测量。

图9.含有LNA的化合物(145A和145C)与异连续的MOE化合物ISIS27322(此处145F)和异连续的硫代磷酸酯化合物(145D)比较，提高了对凋亡的诱导；LNA化合物的错配对照(146C)和MOE化合物(146F)以及LNA化合物15B也包括在本研究中；使用LNA反义寡聚物对生存素mRNA的下调致使15PC3细胞的凋亡增加；以流式细胞珠分析实验(cytometric bead array)检测凋亡的激活；成倍诱导表示为相对于模拟物(mock)处理的细胞的值(146F)。

图10.利用免疫组织化学检测经针对生存素的LNA反义寡聚核苷酸15A的处理后的15PC3细胞内激活的Caspase 3。

图11.在增殖的癌细胞内的生存素的LNA反义抑制，例如化合物6A尤其有效。

图12.化合物15A 100nM转染15PC3后，用蛋白质印记方法(westernblotting)检测生存素的下调。

具体实施方式

本发明使用寡聚化合物，特别是反义寡聚核苷酸，来调控编码生物素的核酸分子的功能。这种调控最终导致产生的生存素的量的变化。在一种实施方式中，是通过提供反义化合物完成的，该反义化合物特异地与编码生存素的核酸杂交。这种调控优选是对生存素表达的抑制，由此引起得到的功能蛋白数量的减少。

本发明的反义和其它寡聚化合物调控靶标的表达，其确认是通过试验或基于靶标的序列信息的合理设计，以及如何设计针对希望的靶标的寡聚化合物的小窍门来实现的。这些化合物的序列是本发明优选的实施方式。同样地，靶标上的与这些优选寡聚化合物互补的序列模体(motif)(被称为“热点”)是针对的优选位点。

本发明提供一种由8-50个核苷酸或者核苷酸类似物组成的化合物，所述化合物包含由至少8个核苷酸或者核苷酸类似物构成的子序列，所述子序列位于从由下列序列构成的组中选择的序列之内：SEQ ID NOS：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143和144。核苷酸类似物通常是具有SEQ ID NOS：2-144序列的核苷酸的类似物。这样，本发明化合物的子序列通常位于从由SEQ ID NOS：2-144构成的或包括SEQ ID NOS：2-144序列内的核苷酸的类似物的组中选择的序列之内。本发明的优选的核苷酸类似物是LNA。

8-50个核苷酸和/或者核苷酸类似物的总数是指，8-50个核苷酸或者8-50个核苷酸类似物或者它们的组合总共不超过50个核苷单元。

在本文中，术语“核苷”指的是其通常的意思，例如，它包含2-脱氧核糖单元或者核糖单元，上述单元通过1位上的碳原子连接下面的含氮碱基中的一种：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或者鸟嘌呤(G)。

同样的，术语“核苷酸”指的是2-脱氧核糖单元或者RNA单元，上述单元通过1位上的碳原子连接下面含氮碱基中的一种：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)，上述碱基通过5位上的碳原子与核苷间的磷酸基团或者末端基团连接。

这里所使用的术语“核苷酸类似物”指的是一种非天然的核苷酸，其中核糖单元不同于2-脱氧核糖或者RNA和/或者含氮碱基不同于A、C、T、G，和/或者核苷间的磷酸连接基团不同。详细的核苷类似物的例子在Freier和Altmann，Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443；和Uhimann，Curr.Opinion inDrug Development，2000，3(2)，293-213中已有介绍。

术语“相应的核苷类似物”和“相应的核苷”是指在核苷类似物中的核碱基和核苷是一样的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖连接上腺嘌呤时，“相应的核苷类似物”包含连接有腺嘌呤的五碳糖单元(不同于2-脱氧核糖)。

术语“核酸”定义为一种由两个或者多个核苷酸通过共价连接形成的分子。术语“核酸”和“多聚核酸”这里是可以互换的。

术语“核酸类似物”是指一种非天然的核酸结合化合物。

核苷酸类似物和核酸类似物在例如Freier & Altmann(Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443)以及Uhlmann(Curr.Opinion in Drug&Development(2000，3(2)：293-213)中有描述。方案1阐述的是选择出的适合作核酸的核苷酸类似物的例子。

术语“LNA”指含有一个双环核苷类似物的核苷酸，也指LNA单体，或者包含一个或者多个双环核苷类似物的寡聚核苷酸。LNA单体在WO9914226和在后申请WO0056746、WO0056748、WO0066604、WO00125248、WO0228875、WO2002094250以及PCT/DK02/00488中已有描述。胸苷LNA单体的特别例子是(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-5-甲基-3-(胸腺嘧啶-1-yl)-2，5-二氧杂-双环[2∶2∶1]庚烷((1S，3R，4R，7S)-7-hydroxy-1-hydroxymethyl-5-methyl-3-(thymin-1-yl)-2，5-dioxa-bicyclo[2∶2∶1]heptane)。

本发明中提到的术语“寡聚核苷酸”是指寡聚物(也被称为oligo)，或者核酸多聚物(例如核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA))，或者本领域已知的核酸类似物，优选锚定核酸(LNA)，或者它们的混合物。该术语包括由天然的核碱基、糖类、核糖(骨架)间连接组成的寡聚核苷酸，也包括具有具有相似功能或改善的特殊功能的非天然部分的寡聚核苷酸。较之原始形式，完全或者部分修饰的或者取代的寡聚核苷酸通常为优选，原因在于，这些寡聚核苷酸拥有几种合意的性能，例如：穿透细胞膜的能力、对细胞内外核酸酶的良好抗性、与靶标核酸的高亲和力和高特异性。LNA类似物尤其优选表现上述性质。

方案1

术语“单元”应理解为单体。

术语“至少一个”包括大于或者等于1的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17等。

术语“硫代-LNA”包含锚定核苷酸，其中示意图2中的X或者Y至少有1个是从S或者-CH₂-S-中选择的。硫代-LNA可以是β-D和α-L构象。

术语“氨基-LNA”包含锚定核苷酸，其中示意图2中的X或者Y至少有1个是从2-N(H)-、N(R)-、CH₂-N(H)-、-CH₂-N(R)-中选择的，其中R是从氢和C₁-C₄烷基中选择。氨基-LNA可以是β-D和α-L构象。

术语“氧-LNA”包含锚定核苷酸，其中示意图2中的X或者Y至少有1个代表-O-或者-CH₂-O-。氧-LNA可以是β-D和α-L构象。

术语“ena-LNA”包含锚定核苷酸，其中示意图2中的Y是-CH₂-O-。

术语“α-L-LNA”包含示意图3所示的锚定核酸(右边的结构)。

术语“LNA衍生物”包含示意图2中所有除了β-D-亚甲基LNA的锚定核酸，例如硫代-LNA、氨基-LNA、α-L-氧杂-LNA和ena-LNA。

术语“连接基团”是指一组可以将两个核苷、两个核苷类似物、一个核苷和一个核苷类似物等连接在一起的基团。特别的并优选的例子包括磷酸酯团和硫代磷酸酯基团。

本发明中，术语“结合体”是指由这里所述化合物(例如包含核苷序列或者核苷类似物序列的化合物)共价连接到一个或者多个非核苷酸或者非多聚核苷酸成分而得到的异源分子。非核苷酸或者非多聚核苷酸成分的例子包括大分子试剂，例如蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、多聚物或者它们的组合。典型的蛋白质可以是靶标蛋白的抗体。典型的多聚物可以是聚乙二醇。

术语“癌症”是指上皮起源的恶性肿瘤。

上皮组织覆盖或者衬贴于身体的内部和外部的表面。上皮组织的例子是皮肤和衬贴于身体的腔室和内脏例如肠道、膀胱、子宫等的粘膜浆膜。上皮组织也可以从腺体延伸到更深的组织层，例如粘液分泌腺。

术语“恶性肿瘤”是指从结缔组织例如软骨组织、脂肪、肌肉、腱和骨中生长出的恶性肿瘤。

这里使用的术语“神经胶质瘤”是指覆盖发源自神经胶质细胞的恶性肿瘤。

当术语“一种”用在一种核苷、一种核苷类似物、一种SEQ ID NO时，是指一个或者多个。特别在表述“从包含……的组中选择的一种成份(例如一种核苷、一种核苷类似物、一种SEQ ID NO或者类似的)”是指一个或者多个所述成份可以选择。因此，例如“从由A、B和C构成的组中选择的一种成份”的表述是指包含所有A、B和C的组合，例如A、B、C、A+B、A+C、B+C和A+B+C。

在本文中，术语“C₁-C₄烷基”是指直链或者支链饱和烃链，该链含有1-4个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

这里所使用的术语“靶标核酸”包括编码生物素的DNA、由该DNA转录得到的RNA(包括前体mRNA和mRNA)、以及由该RNA衍生的cDNA。

这里所使用的术语“基因”是指包括外显子、内含子、非编码的5’和3’端区域和调控区域和其所有目前已知的突变体以及更进一步的可能会被阐明的突变体。

这里所使用的术语“寡聚化合物”是指寡聚核苷酸，是可以通过例如以氢键结合到靶标基因上的“嵌合体(Chimeraplast)”和“三链形成寡核苷酸(TFO)上，结合到靶标基因上的“反义抑制剂(antisense inhibitors)”、“小分子干扰RNA(siRNA)”、“核酶(ribozymes)”、“寡聚酶(oligozymes)”的RNA转录产物，或者结合到靶标基因上的适体(aptamer)”、“斯皮格尔体(spiegelmer)”、“诱饵(decoy)”编码的蛋白质上，来在人类产生合意的治疗作用。

这里使用的术语“mRNA”是指目前已知的靶标基因的mRNA转录产物，以及可能会被鉴定出来的进一步的转录产物。

这里所使用的术语“调控”是指提高(激活)或者降低(抑制)基因的表达。在本发明中，抑制是调控基因表达的优选形式，mRNA是优选靶标。

这里所使用的“靶向”反义化合物至某特定的靶标核酸是指，以反义化合物能够结合到并调控其目的靶标的功能的方式，将反义寡核苷酸提供给细胞、动物或人。

这里所使用的“杂交”是指互补的核苷碱基或者核苷酸碱基之间形成氢键，其可能是沃森-克里克(Watson-Crick)、霍斯坦(Holstein)、反霍斯坦(reversed Holstein)模式的氢键等。沃森和克里克在大约50年前提出脱氧核糖核酸(DNA)是由两条链组成的，它们通过在两条链上的反向互补的核碱基之间形成氢键并以螺旋的结构结合在一起的。通常在DNA中发现的4种核碱基是：鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，其中G核碱基与C配对，A核碱基与T配对。在RNA核碱基中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)代替，其与T核碱基类似地与A配对。参与基本双链形成的核碱基的化学基团形成了沃森-克里克模式的外形。几年后，Hoogsteen提出嘌呤核碱基(G和A)除了它们的沃森-克里克模式的外形外，还具有Hoogsteen模式的外形，其可以从双链的外部识别，并通过形成氢键与嘌呤寡聚核苷酸结合，因此形成了三螺旋结构。

本发明中“互补”是指两条核苷酸或者核苷序列之间精确配对的能力。例如，如果一条寡聚核苷酸某位置上的核苷酸能够与在一个DNA或者RNA分子相应位置上的核苷酸形成氢键，那么该寡聚核苷酸与该DNA或者RNA被认为在这个位点是互补的。当寡聚核苷酸上的核苷酸与靶标DNA或者RNA上相应的核苷酸之间能够形成足够数目的氢键并形成稳定的复合物时，该寡聚核苷酸与该DNA或者RNA就被认为是互补的。为了达到在体外和体内的稳定，反义化合物的序列并不必与它的靶标核酸之间是100％配对的。因而，术语“互补”和“特异地杂交”是指反义化合物与靶标分子之间足够强地和特异地结合，以达到满意的干扰靶标基因的正常功能，同时不影响非靶标mRNA的功能。

本发明的寡聚化合物是靶标的有力的调节物。例如，表1中显示了用实时PCR测定的对靶标的体外抑制。图2显示了通过RNA印迹(Northern blot)测定的本发明的寡聚化合物的体外效力。表3显示了寡聚化合物的很低的IC₅₀值。所有上述实验结果显示，本发明的化合物可以构成药学组合物中的活性化合物。

本发明化合物的子序列通常位于从由下列序列构成的组中选择的一种序列：即，SEQ ID NOS：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132和133。核苷酸的类似物也适合于这些序列中的核苷酸。

典型地，本发明的化合物包含8-40个核苷酸，更为典型的是8-35个核苷酸，尤其典型的是8-30个核苷酸，适宜的是8-25个核苷酸，更适宜的是8-20个核苷酸，最合适的是12-20个核苷酸，例如12、13、14、15、16、17、18、19或者20个核苷酸。在本发明一个有较高吸引力的实施方式中，发明的化合物包含14-18个核苷酸，例如14、15、16、17或者18个核苷酸，优选15-17个核苷酸，例如15、16或者17个核苷酸，更典型的为15个核苷酸或者16个核苷酸或者17个核苷酸。

在本发明的一种适宜的实施方式中，SEQ ID NOS：2-144序列的子序列通常至少有8个核苷酸或者核苷酸类似物，如所述序列中的至少9个核苷酸或者所述序列中的至少9个核苷酸的核苷酸类似物。较典型的是，子序列至少有所述序列的酸或者核苷酸类似物，例如至少有14个核苷酸或者核苷酸类似物，比如10、11、12、13、14、15或者16个核苷酸或者核苷酸类似物。

核苷酸之间通常会通过连接基团相互连接，该连接基团选自由磷酸基团、硫代磷酸基团、硼代磷酸基团组成的组。合适的是，一些或者全部核苷酸会通过一种磷酸基团相互连接。适宜的是，所有核苷酸都通过磷酸基团相互连接。

同样的，本发明的核苷酸之间通常通过连接基团相互连接，该连接基团选自由磷酸基团、硫代磷酸基团、硼代磷酸基团组成的组。

本发明中优选的寡聚化合物是SEQ ID NO 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144，它们的序列在表1中介绍。

在发明的另一种实施方式中，所述核苷酸通过硫代磷酸基团互相连接，例如所有核苷酸通过硫代磷酸基团相互连接。一种本发明的使人感兴趣的实施方式是针对化合物SEQ NO 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143和144，其中，每个化合物之间的每个连接基团都是硫代磷酸基团。这种修饰用下标S表示。本发明的另外一个方面是针对化合物SEQ NO2_A、3_A、4_A、5_A、6_S、7_S、8_S、9_A、10_A、11_A、12_A、13_A、14_A、15_A、16_A、17_A、18_A、19_A、20_A、21_A、22_A、23_A、24_A、25_A、26_A、27_A、28_A、29_A、30_A、31_A、32_A、33_A、34_A、35_A、36_A、37_S、38_A、39_A、40_A、41_A、42_A、43_A、44_A、45_A、46_A、47_A、48_A、49_A、50_A、51_A、52_A、53_A、54_A、55_A、56_A、57_A、58_A、59_A、60_A、61_A、62_A、63_A、64_A、65_A、66_A、67_A、68_A、69_A、70_A、71_A、72_A、73_A、74_A、75_A、76_A、77_A、78_A、79_A、80_A、81_A、82_A、83_A、84_A、85_A、86_A、87_A、88_A、89_A、90_A、91_A、92_A、93_A、94_A、95_A、96_A、97_A、98_A、99_A、100_A、101_A、102_A、103_A、104_A、105_A、106_A、107_A、108_A、109_A、101_A、102_A、103_A、104_A、105_A、106_A、107_A、108_A、109_A、110_A、111_A、112_A、113_A、114_A、115_A、116_A、117_A、118_A、119_A、120_A、121_A、122_A、123_A、124_A、125_A、126_A、127_A、128_A、129_A、130_A、131_A、132_A、133_A、134_A、135_A、136_A、137_A、138_A、139_A、140_A、141_A、142_A、143_A、和144_A。

本发明的实施方式的优选子集是包含下述序列分子式的化合物，即，2_A、4_A、6_A、9_A、15_A、118_A、120_A、123_A、128_A、129_A、和131_A。

本发明的又一个方面是针对化合物SEQ NO 2_B、3_B、4_B、5_B、6_S、7_S、8_B、9_B、10_B、11_B、12_B、13_B、14_B、15_B、16_B、17_B、18_B、19_B、20_B、21_B、22_B、23_B、24_B、25_B、26_B、27_B、28_B、29_B、30_B、31_B、32_B、33_B、34_B、35_B、36_B、37_S、38_B、39_B、40_B、41_B、42_B、43_B、44_B、45_B、46_B、47_B、48_B、49_B、50_B、51_B、52_B、53_B、54_B、55_B、56_B、57_B、58_B、59_B、60_B、61_B、62_B、63_B、64_B、65_B、66_B、67_B、68_B、69_B、70_B、71_B、72_B、73_B、74_B、75_B、76_B、77_B、78_B、79_B、80_B、81_B、82_B、83_B、84_B、85_B、86_B、87_B、88_B、89_B、90_B、91_B、92_B、93_B、94_B、95_B、96_B、97_B、98_B、99_B、100_B、101_B、102_B、103_B、104_B、105_B、106_B、107_B、108_B、109_B、101_B、102_B、103_B、104_B、105_B、106_B、107_B、108_B、109_B、110_B、111_B、112_B、113_B、114_B、115_B、116_B、117_B、118_B、119_B、120_B、121_B、122_B、123_B、124_B、125_B、126_B、127_B、128_B、129_B、130_B、131_B、132_B、133_B、134_B、135_B、136_B、137_B、138_B、139_B、140_B、141_B、142_B、143_B、和144_B。

本发明实施方式的一种优选子集是包含下述序列分子式的化合物，即，118_B、119_B、120_B、121_B、122_B、123_B、128_B、129_B、130_B、和131_B。

本发明的又一个方面是针对化合物SEQ NO 2_C、3_C、4_C、5_C、6_S、7_S、8_C、9_C、10_C、11_C、12_C、13_C、14_C、15_C、16_C、17_C、18_C、19_C、20_C、21_C、22_C、23_C、24_C、25_C、26_C、27_C、28_C、29_C、30_C、31_C、32_C、33_C、34_C、35_C、36_C、37_S、38_C、39_C、40_C、41_C、42_C、43_C、44_C、45_C、46_C、47_C、48_C、49_C、50_C、51_C、52_C、53_C、54_C、55_C、56_C、57_C、58_C、59_C、60_C、61_C、62_C、63_C、64_C、65_C、66_C、67_C、68_C、69_C、70_C、71_C、72_C、73_C、74_C、75_C、76_C、77_C、78_C、79_C、80_C、81_C、82_C、83_C、84_C、85_C、86_C、87_C、88_C、89_C、90_C、91_C、92_C、93_C、94_C、95_C、96_C、97_C、98_C、99_C、100_C、101_C、102_C、103_C、104_C、105_C、106_C、107_C、108_C、109_C、101_C、102_C、103_C、104_C、105_C、106_C、107_C、108_C、109_C、110_C、111_C、112_C、113_C、114_C、115_C、116_C、117_C、118_C、119_C、120_C、121_C、122_C、123_C、124_C、125_C、126_C、127_C、128_C、129_C、130_C、131_C、132_C、133_C、134_C、135_C、136_C、137_C、138_C、139_C、140_C、141_C、142_C、143_C和144_C。

本发明的又一个方面是针对化合物SEQ NO 2_D、3_D、4_D、5_D、6_S、7_S、8_D、9_D、10_D、11_D、12_D、13_D、14_D、15_D、16_D、17_D、18_D、19_D、20_D、21_D、22_D、23_D、24_D、25_D、26_D、27_D、28_D、29_D、30_D、31_D、32_D、33_D、34_D、35_D、36_D、37_S、38_D、39_D、40_D、41_D、42_D、43_D、44_D、45_D、46_D、47_D、48_D、49_D、50_D、51_D、52_D、53_D、54_D、55_D、56_D、57_D、58_D、59_D、60_D、61_D、62_D、63_D、64_D、65_D、66_D、67_D、68_D、69_D、70_D、71_D、72_D、73_D、74_D、75_D、76_D、77_D、78_D、79_D、80_D、81_D、82_D、83_D、84_D、85_D、86_D、87_D、88_D、89_D、90_D、91_D、92_D、93_D、94_D、95_D、96_D、97_D、98_D、99_D、100_D、101_D、102_D、103_D、104_D、105_D、106_D、107_D、108_D、109_D、101_D、102_D、103_D、104_D、105_D、106_D、107_D、108_D、109_D、110_D、111_D、112_D、113_D、114_D、115_D、116_D、117_D、118_D、119_D、120_D、121_D、122_D、123_D、124_D、125_D、126_D、127_D、128_D、129_D、130_D、131_D、132_D、133_D、134_D、135_D、136_D、137_D、138_D、139_D、140_D、141_D、142_D、143_D和144_D。

本发明的又一个方面是针对化合物SEQ NO 2_E、3_E、4_E、5_E、6_S、7_S、8_E、9_E、10_E、11_E、12_E、13_E、14_E、15_E、16_E、17_E、18_E、19_E、20_E、21_E、22_E、23_E、24_E、25_E、26_E、27_E、28_E、29_E、30_E、31_E、32_E、33_E、34_E、35_E、36_E、37_S、38_E、39_E、40_E、41_E、42_E、43_E、44_E、45_E、46_E、47_E、48_E、49_E、50_E、51_E、52_E、53_E、54_E、55_E、56_E、57_E、58_E、59_E、60_E、61_E、62_E、63_E、64_E、65_E、66_E、67_E、68_E、69_E、70_E、71_E、72_E、73_E、74_E、75_E、76_E、77_E、78_E、79_E、80_E、81_E、82_E、83_E、84_E、85_E、86_E、87_E、88_E、89_E、90_E、91_E、92_E、93_E、94_E、95_E、96_E、97_E、98_E、99_E、100_E、101_E、102_E、103_E、104_E、105_E、106_E、107_E、108_E、109_E、101_E、102_E、103_E、104_E、105_E、106_E、107_E、108_E、109_E、110_E、111_E、112_E、113_E、114_E、115_E、116_E、117_E、118_E、119_E、120_E、121_E、122_E、123_E、124_E、125_E、126_E、127_E、128_E、129_E、130_E、131_E、132_E、133_E、134_E、135_E、136_E、137_E、138_E、139_E、140_E、141_E、142_E、143_E和144_E。

在一种使人感兴趣的实施方式中，本发明的化合物包含序列15E。

在一种优选的实施方式中，本发明的化合物包含8-50个核苷酸，其中所述化合物包含至少由8个核苷酸构成的子序列，所述子序列位于选自由SEQID NOS：2-144构成的组的序列内，其中至少有一个核苷酸被相应的核苷酸类似物所代替。典型地，本发明的化合物包含1-50个核苷酸类似物，例如2-45个核苷酸类似物、3-40个核苷酸类似物，适宜的是4-35个核苷酸类似物、5-30个核苷酸类似物、6-25个核苷酸类似物，典型的为6-20个核苷酸类似物，更典型的为6-14个核苷酸类似物，例如6-12个核苷酸类似物，例如6，7，8，9，10，11或12个核苷酸类似物。

发明人发现，包含6-16个具有一种不同核糖单元的核苷酸类似物的本发明的化合物足够具有比核苷酸提高的亲和力。这样，本发明的一个使人感兴趣的方面涉及一种包含6-10个核苷酸类似物的本发明的化合物，例如6、7、8、9或者10个具有一种不同核糖单元的核苷酸类似物，优选7、8或者9个具有不同核糖单元的核苷酸类似物，最有代表性的是8个具有不同核糖单元的核苷酸类似物。具有不同核糖单元的核酸类似物优选是LNA。

发明人进一步发现，具有不同核糖单元并进一步带有修饰过的核苷连接的核苷酸类似物的反义调控作用进一步提高。因而，6-16个核苷酸类似物可以带有修饰过的核糖单元、不同的连接基团或者两者都有。

适宜的是，所有核苷酸都被相应的核苷酸类似物代替。

本发明的优选核酸类似物是LNA。

本发明的进一步优选的核酸类似物是，核苷间磷酸连接是硫代磷酸酯。

本发明进一步优选的核酸类似物是，其中的核苷酸为LNA并且带有核苷硫代磷酸连接。

在一种使人感兴趣的实施方式中，本发明的化合物包含8-50个核苷酸，其中所述化合物包含由至少8个核苷酸构成的子序列，所述子序列位于选自由SEQ ID NOS：2-144构成的组中选择的序列内，其中至少有一个核苷酸被相应的核苷酸类似物所代替，并且它的3’末端含有核苷酸而不是一种核苷酸类似物。

在一种尤其使人感兴趣的实施方式中，化合物含有至少一个核苷酸类似物，其中所述核酸类似物是下式中的锚定核酸(LNA)，

其中Z和Z^*是独立缺失的，选自核苷间连接、末端基团或者保护基团；其中X和Y独立地选自由O、S、NR、CH₂、CH(如果是双键的一部分)、CH₂-O、CH₂-S、CH₂-NR、CH₂-CH₂、CH₂-CH(如果是双键的一部分)和CH＝CH，其中R是氢或者C₁-C₄烷基。键代表连接到连接基团上。典型地，X是O，Y独立地选自由O、S和NR构成的组，其中R是R是氢或者C₁-C₄烷基。更典型的是，X是O，Y选自由O、S和NH构成的组。最典型的是，X是O，Y是O。在实施方式中，至少有一个LNA核苷酸是在3’末端，在所述位置Z是一种末端基团，Z^*是一种核苷间连接。在实施方式中，至少有一个LNA核苷酸是在5’末端，在所述位置Z无基团，Z^*是一种末端基团。在核苷酸序列内，Z缺失，Z^*是一种核苷间连接。

在本发明的一种适宜的实施方式中，其包含LNA作为核苷酸类似物，所述LNA是以β-D或者α-L形式存在，优选β-D形式。

本发明的实施方式包含至少一个LNA作为核苷酸类似物，例如1-50个LNA核苷酸类似物，例如2-45个LNA核苷酸类似物，3-40个LNA核苷酸类似物，适宜的是4-35个LNA核苷酸类似物，5-30个LNA核苷酸类似物，6-25个LNA核苷酸类似物，典型的是6-20个LNA核苷酸类似物，更典型的是6-14个LNA核苷酸类似物，例如6-12个LNA核苷酸类似物，例如6、7、8、9、10、11或者12个LNA核苷酸类似物，所述核苷酸和/或者核苷酸类似物通过选自由磷酸基团、硫代磷酸、硼代磷酸构成的组中的连接基团互相连接。本发明的一种适宜的实施方式包含LNA核苷酸类似物，所述核苷酸和/或者核苷酸类似物通过磷酸基团互相连接。发明的一种优选的实施方式包含LNA核苷酸类似物，所述核苷酸和/或者核苷酸类似物通过硫代磷酸基团互相连接。

在使人感兴趣的实施例的组合中，本发明的实施方式包含LNA核苷酸类似物，所述核苷酸和/或者核苷酸类似物通过硫代磷酸基团互相连接，其中X是O，Y是O，所述LNA是β-D形式的。

本发明化合物的实施方式包含8-50个核苷酸，其中所述化合物包含由至少8个核苷酸构成的子序列，所述子序列位于选自SEQ ID NOS：2-144的组的序列内，所述核苷酸包含LNA核苷酸类似物，典型的子序列可以包含一段2-6个如这里所限定的LNA，其后有一段4-12个如这里所限定的核苷酸，其后又有一段2-6个LNA。

包含一段LNA的子序列，其后有一段核苷酸，其后又有一段LNA，这被认为是间聚物。

适宜的是，所述子序列包含一段4个如这里所限定的LNA，其后有一段8个如这里所限定的核苷酸，其后又有4个LNA。

本发明化合物的实施方式包含8-50个核苷酸，其中所述化合物包含由至少8个核苷酸构成的子序列，所述子序列位于选自由SEQ ID NOS：2-144构成的组的序列内，所述8-50个核苷酸包含LNA核苷酸类似物，所述子序列可以包含一段2-6个如这里所限定的LNA，其后有一段4-12个核苷酸，其后又有一段2-5个如这里所限定的LNA，其后又可有1-4个核苷酸，例如1个或者2个核苷酸，更典型的是单核苷酸。1-4个核苷酸、1个或者2个核苷酸或者单核苷酸典型地位于子序列的3’末端，并更典型地位于寡聚物的3’末端。

发明的化合物的实施方式包含8-50个核苷酸，其中所述化合物包含由至少8个核苷酸构成的子序列，所述子序列位于选自由SEQ ID NOS：2-144构成的组的序列内，所述核苷酸包含LNA核苷酸类似物，所述子序列可以典型地包含一段4个如这里所限定的LNA，其后有一段8个核苷酸，其后又有一段3个如这里所限定的LNA，其后又有天然单核苷酸。该单核苷酸典型地位于子序列的3’末端，更典型地位于寡聚物的3’末端。

本发明化合物的实施方式包含8-50个核苷酸，其中所述化合物包含由至少8个核苷酸构成的子序列，所述子序列位于选自由SEQ ID NOS：2-144构成的组的序列内，所述核苷酸包含LNA核苷酸类似物，所述子序列包含一段LNAs，其后有一段核苷酸，其后又有一段LNAs，这被定义为间聚物，所述核苷酸和/或者LNAs通过选自由磷酸基团、硫代磷酸基团和硼代磷酸基团构成的组的连接基团互相连接。

适宜地，所述核苷酸和/或者所述LNAs通过磷酸基团(phosphorate group)连接在一起。典型地，所述核苷酸和/或者LNAs通过硫代磷酸基团连接在一起。

本发明化合物的实施方式包含总共8-50个核苷酸和/或者核苷酸类似物，其中所述化合物包含由至少8个核苷酸构成的子序列，所述子序列位于选自由SEQ ID NOS：2-144构成的组的序列内，所述核苷酸包含LNA核苷酸类似物，所述子序列可以包含一段4个如这里限定的LNAs，一段8个核苷酸，和一段如这里所限定的4个LNAs，以达到在所述子序列内总计16个核苷酸和核苷酸类似物，所述核苷酸和所述LNAs通过硫代磷酸基团连接在一起。

在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：2a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：3a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQID NO：4a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：5a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：6a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：7a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：8a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：9a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：10a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ IDNO：11a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：12a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：13a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：14a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：15a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：117a。在一种适宜的实施方式中，子序列SEQ ID NO：118a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ IDNO：119a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：120a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：121a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：122a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：123a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：124a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：125a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：126a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：127a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：128a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：129a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQID NO：130a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：131a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：132a。在一种适宜的实施方式中，子序列是SEQ ID NO：133a。在前面刚刚提到的各适宜的实施方式中，其子序列是从SEQ ID NOS：2a-144a选择的一种，子序列3’末端LNA可以被相应核苷酸适当代替。

在进一步适宜的实施方式中，本发明化合物是选自由SEQ ID NOS：2-144构成的组的序列，其中，所述序列由一段4个如这里所限定的LNAs、一段8个核苷酸、和一段如这里所限定的LNAs构成，以使所述化合物总共含有16个核苷酸和核苷酸类似物，所述核苷酸和所述LNA通过硫代磷酸基团连接在一起。

在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：2a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：3a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：4a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：5a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：6a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：7a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：8a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQID NO：9a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：10a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：11a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：12a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：13a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：14a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：15a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：117a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：118a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：119a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：120a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：121a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：122a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：123a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：124a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ IDNO：125a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：126a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：127a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：128a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：129a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ IDNO：130a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：131a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：132a组成。在一种适宜的实施方式中，化合物由SEQ ID NO：133a组成。在前面刚刚提到的各适宜的实施方式中，化合物是从SEQ ID NOS：2a-144a选择的一种，化合物3’末端LNA可以被相应核苷酸适当代替。

本发明又一个方面涉及一种结合物(conjugate)，其包括如这里所限定的化合物，并且至少一个非核苷酸或者非多聚核苷酸部分共价连接到所述化合物上。

在本发明的一个相关方面中，本发明的化合物与配体相连接而形成一种一种结合物；与反义寡核苷酸相比，所述配体旨在提高细胞对结合物的摄取。这种结合可以位于末端的5′/3′-OH，但配体还可以位于糖和/或者碱基。特别地，可连接到反义寡聚核苷酸上的生长因子可以包括转铁蛋白(Transferrin)或者叶酸(folate)。可制备转铁蛋白-多聚赖氨酸-寡聚核苷酸复合体或者叶酸-多聚赖氨酸-寡聚核苷酸复合体，用以被表达高水平的转铁蛋白或者叶酸受体的细胞摄入。其它结合物/配体的例子是胆固醇部分(cholesterol moieties)、双向嵌入物(duplex intercalators)例如吖啶、L-多聚赖氨酸，用一个或者几个耐核酸酶的连接基团加帽(end-capping)例如单硫代磷酸(phosphoromonothioate)和其类似物。

制备转铁蛋白复合体作为细胞摄入寡聚核苷酸的载体的方法在Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)中已有介绍。叶酸-大分子结合物通过叶酸受体运输入细胞，包括反义寡聚核苷酸的运输，在Low等，美国专利5,108,921中已有介绍。

本发明的化合物或者结合物也可以结合到或者进一步结合到活性药物成分上，例如阿斯匹林、布洛芬、磺胺类药、抗糖尿病药物、抗菌剂、化学治疗剂或者抗生素。

本发明的一个特别使人感兴趣的方面是针对一种药物组合物，其包含这里所限定的化合物或者这里所限定的结合物，以及药学上可以接受的稀释剂、载体或者佐剂。

应该理解为，本发明也特别的与一种药物组合物相关，其包含至少一种本发明的反义核苷酸结构体作为活性成分。应该理解为，根据本发明的药物组合物可选择包含药物载体，这种药物组合物可选择包含进一步的反义化合物、化学治疗药物、抗炎化合物、抗病毒化合物和/或者免疫调节化合物。

正如描述的，本发明的药物组合物可进一步包含至少一种化学治疗药物。这种化学治疗药物通常选自由肾上腺皮质甾类，例如强的松、地塞米松或者氟美松；六甲蜜胺(六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(乙醇基)(thyol)；氨苯哌啶酮(氨鲁米特)；胺苯丫啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄性激素，例如睾丸激素；天冬酰胺酶(爱施巴)；结核预防注射液；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(平阳霉素)；白消安(马勒兰)；卡铂(伯尔定)；卡氯芥(BCNU，BiCNU)；瘤可宁(苯丁酸氮芥)；氯去氧腺苷(2-CDA，克拉利宾，leustatin)；顺氯氨铂(顺铂)；阿糖胞苷(赛德萨)；甲嗪咪唑胺(DTIC)；更生霉素(放线菌素-D，更新霉素)；道诺霉素(cerubidine)；多西他赛(泰素帝)；亚德里亚霉素(阿霉素)；表阿霉素；雌莫司汀(emcyt)；雌性激素例如：己烯雌酚(DES)；足叶乙甙(VP-16，鬼臼叉甙，依托泊苷)；氟阿糖腺苷(福达华)；氟他米特(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他宾(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；依达比星(去甲氧基柔红霉素)；异环磷酰胺；白介素-2(proleukin，aldesleukin)；干扰素α(intron A，roferon A)；依立替康(伊立替康)；亮丙瑞林(lupron)；左旋四咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；氮芥(mechlorathamine，nitrogen mustard)；美法仑(左旋溶内瘤素)；巯嘌呤(巯基嘌呤，6-MP)；甲氨蝶呤(mexate)；丝裂霉素-C(mutamucin)；米托蒽醌(novantrone)；奥曲肽(善得定)；喷司他丁(2-脱氧咖啡霉素，nipent)；普卡霉素(光神霉素，光辉霉素)；甲基苄肼(matulane)；链氮霉素；三苯氧胺(诺瓦得士)；紫杉醇(paclitaxel)；替尼泊甙(vumon，VM-26)；塞替派；拓扑替康(hycamtin)；维甲酸(vesanoid，全反式维A酸)；长春碱(valban)；长春新碱(oncovin)和长春瑞滨(去甲长春碱)构成的组。

包含在本发明的寡聚化合物或者结合物可以在一系列药学上可接受的盐中使用。正如这里使用的，该术语是指保持这里所提及的化合物的所希望的生物学活性，并且显示最少的不希望的毒性的盐。这些盐的非限制性例子可以由有机氨基酸和碱性盐组成，该碱性盐由金属阳离子例如锌、钠、钾、以及类似物，或者由形成自氨水、N，N-二苄基亚乙基-二胺、D-葡糖胺、四乙胺或者乙二胺形成的阳离子来形成；或者是(a)与(b)的组合物(c)，例如锌丹宁酸盐或类似物。

在本发明的一种实施方式中，结合物的寡聚化合物可以是前体药物的形式。寡聚核苷酸带负电离子。由于细胞膜亲脂性，细胞摄入寡聚核苷酸与中性或者亲脂性的等价物相比要少。这种极性“阻碍”可以通过使用前体药物的方法来避免(参照Crooke，R.M.(1998)in Crooke，S.T.Antisense researchand Application.Springer-Verlag，柏林，德国Vol.131，Page 103-140)。在这种方法中，寡聚核苷酸通过一种受保护的方式制备，使得寡聚物在使用时是中性。这些保护基团设计成在细胞摄入寡聚物后可被去掉。这种保护基团的例子是S-乙酰硫代乙基(SATE)或者S-新戊酰硫代乙基(t-butyl-SATE)。这些保护基团耐受核酸酶，并在细胞内被选择性清除。

本发明同时还包括了这里公开的一种或者多种寡聚核苷酸化合物或者结合物的配方。药学上可接受的粘合剂和佐剂可以构成该药物配方的一部分。胶囊、片剂和丸剂等可包含例如下列化合物：微晶纤维素、树胶或者明胶作为粘合剂；淀粉或者乳糖作为赋形剂；硬脂酸盐作为润滑剂；各种甜味剂或者调味剂。对于胶囊，剂量单位可以包含液体载体例如油脂。同样，糖衣或者肠溶性物质可以是剂量单位的一部分。寡聚核苷酸配方也可以是活性药物成分的乳状液，和形成微胶束乳状液的脂类。

本发明的寡聚核苷酸可以与任何不损害其期望作用的物质混合，或者与补充其期望作用的物质混合。这些可以包括其他药物，如其他核苷酸化合物。

为了注射、皮下、皮内、或者局部使用，这种配方可以包括灭菌稀释液、缓冲液、强度调节剂和抑菌剂。这种活性化合物可以与保护其不被降解或者立刻从体内清除除去的载体一起制备，这些包括释放特性可控的植入体(implants)或者微胶囊。为了进行静脉注射，优选的载体是生理盐水或者磷酸缓冲盐溶液。

优选的是，在单位配方，例如在药学上可接受的载体或稀释剂中包含足量寡聚化合物，并使得寡聚化合物以治疗有效量分布于受治患者体内而不引起严重副作用。

本发明的药物组合物可以多种方式给予，这是由局部还是全身给予适宜，以及治疗部位决定的。给药可以是(a)口服，(b)肺部，例如通过吸入或者吹入粉末或者气雾剂，包括使用喷雾器；气管内，鼻内，(c)局部，包括表皮、透皮、眼部以及粘膜包括阴道和直肠运输；或者(d)注射，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内注射或者肌肉注射或灌输，例如鞘内或者心室内给予。在一种实施方式中，活性寡聚物通过静脉注射、腹腔注射、口服、局部或者作为丸剂注射给予或者直接应用于靶器官。

局部给予的药物组合物和配方可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、栓剂、液体制剂和散剂。传统的药物载体、含水的、粉末或者油类化合物(oily bases)、稠化剂以及类似物可能是必要的，或是适宜含有的。包衣避孕套、手套以及类似物也可能是有用的。优选的局部配方包括将本发明的寡聚核苷酸与局部运输物质混合而得的配方，所述局部运输物质例如脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、络合剂和表面活性剂。口服给予的组合物和配方包括但不限于散剂或者颗粒剂、微粒、纳米颗粒、悬浮剂或者水溶液或非水介质、胶囊、凝胶胶囊、袋装剂(sachet)、片剂或者小片剂。注射、鞘内或者心室内给予的组合物和配方可以包括灭菌水溶液，其中还可以包含缓冲剂、稀释剂和其它适宜的添加物，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物以及其他药学上可以接受的载体或者赋形剂。

本发明的药物组合物包括但不限制于，溶液、乳液和包含脂质体的配方。这些组合物可以从多种成分得到，上述成分包括但不限于预成型的液体、自乳化固体和自乳化半固体。药物向肿瘤组织的运输可以通过载体介导的运输得到增强，包括但不限于阳离子脂质体、环式糊精、卟啉衍生物、支链树枝状聚合物、聚乙氨多聚物、纳米颗粒和微球体(Dass CR.，J Pharm Pharmacol2002，54(1)：3-27)。

本发明的药物配方可以便利地以单位剂量形式存在，可以通过传统地在制药工业领域已知的技术制备。这些技术包括将活性成分与药物载体或者赋形剂结合在一起。通常，这些配方通过均一地和紧密地将活性成分和液态载体或者精细粉碎的固体载体或者二者结合而制备，接着，如果必要的话，将产物成型。

本发明的组合物可以配制成任何可能的多种剂型，例如但不限于，片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶和栓剂。本发明的组合物可以配制成水、非水或者混合介质悬浮液。水悬浮液可以进一步包含提高悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或者右旋糖苷。该悬浮液还可以含有稳定剂。

含有LNA的寡聚化合物对于大量上述治疗性应用是有用的。通常，本发明的治疗方法包括给予哺乳动物、特别是人治疗有效量的LNA修饰的寡聚核苷酸。

在一种特定的实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包括(a)一个或者多个反义化合物，和(b)一个或者多个其他通过非反义机制发挥作用的化疗试剂。当与本发明的化合物一起使用时，这些化疗试剂可以单独使用(例如光神霉素和寡聚核苷酸)、相继使用(例如光神霉素和寡聚核苷酸使用一段时间后，接着使用另一种药物和寡聚核苷酸)，或者与一种或几种这样的化疗试剂联合或者放射治疗联合使用。所有本领域技术人员知道的化疗试剂在这里都可以与本发明的化合物联合治疗。

抗炎药物包括但不限制于非类固醇抗炎药物和皮质类固醇药物，抗病毒药物、和免疫调节药物也可以与本发明的组合物联合使用。两种或者多种组合的化合物可以一起使用或者相继使用。

在另一种实施方式中，本发明的组合物可以包含一种或者多种针对第一核酸(first nucleic acid)反义化合物，尤其是寡核苷酸，以及一种或者多种其他针对第二核酸(second nucleic acid)的反义化合物。两个或者多个组合的化合物可以一起使用或者相继使用。

给药剂量依赖于待治疗的疾病状态的严重程度和反应性，并且，疗程从几天到几个月不等，或者直到痊愈，或者疾病状况减轻。优选的给药方案可以通过测量药物在患者体内的累积来计算。

优选的给药剂量根据单独寡聚核苷酸的相对效力而定。通常，可以基于体内和体外动物模型中有效的EC50s值来确定。通常，每公斤体重的剂量是从0.01μg-1g，可以一次或多次每天、每周、每月、或者每年，或者甚至每2-10年一次或者持续几小时到几个月的连续灌输。用药的重复率可以基于测量在体液或者组织中残留的时间和浓度来计算。在治疗成功后，继续保持治疗以防止疾病的复发是值得的。

正如描述的，在发明的一种使人感兴趣的实施方式中，寡聚化合物包含至少一个被称为LNA(Locked Nucleic Acid)的化学单元。

LNA单体通常指一种双环核苷酸类似物，其中核苷部分是在国际申请WO99/14226以及在后申请WO0056746，WO0056748，WO0066604，WO00125248，WO0228875，WO2002094250和PCT/DK02/00488中描述的类似物，这里作为引用文献加以引用。

优选的形成本发明的化合物的LNA核苷酸结构例示为方案2：

方案2

其中X和Y独立地选自O、S、-N(H)-、N(R)-、-CH₂-、-CH-(如果是双键的一部分)、-CH₂-O-、-CH₂-S-、-CH₂-N(H)-、-CH₂-N(R)、-CH₂-CH₂-、或-CH₂-CH-(如果是双键的一部分)、-CH＝CH-，其中R选自氢和C₁-C₄烷基；Z和Z^*是独立缺失的，选自核苷间连接、末端基团或者保护基团。在实施例中，其中至少一个LNA核苷酸是在3’末端，在所述位置Z是一种末端基团，Z^*是一种核苷间连接。不对称基团可存在于任一方向。在方案2中，4个手性存在于一种固定构型。然而方案2中的构型不是必然固定的。本发明还包含了一般方案2中的化合物，其中手性中心存在于不同构型，例如在方案3，4所表示的。这样，方案2阐述的目的并不是限制手性中心的构型。方案2中的每个手性中心都可以以R或者S构型存在。R(右)和S(左)的定义在IUPAC1974年推荐的E部分，基础立体化学有描述：其规则可以在PureAppl.Chem.45，13-30，(1976)和在″Nomenclature of organic Chemistry″pergamon，NewYork，1979中找到。

Z和Z^*用来形成核苷间连接，是一种末端基团或者一种保护基团，这依赖于LNA在化合物内的位置，也就是在子序列内部或者在子序列或者化合物的3’末端的位置。

核苷间连接可以是-O-P(O)₂-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-S-P(O)₂-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)₂-O-、-O-P(O)₂-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)₂-S-、-O-PO(R^H)-O-、O-PO(OCH₃)-O-、-O-PO(NR^H)-O-、-O-PO(OCH₂CH₂S-R^H)-O-、-O-PO(BH₃)-O-、-O-PO(NHR^H)-O-、-O-P(O)₂-NR^H-、-NR^H-P(O)₂-O-、-NR^H-CO-O-、-NR^H-CO-NR^H-、-O-CO-O-、-O-CO-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-、-O-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-CO-NR^H-CH₂-、-CH₂-NR^H-CO-、-O-CH₂-CH₂-S-、-S-CH₂-CH₂-O-、-S-CH₂-CH₂-S-、-CH₂-SO₂-CH₂-、-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-CO-、-CH₂-NCH₃-O-CH₂-，其中R^H选自氢和C₁-C₄烷基。

末端基团独立地从氢、叠氮、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、Act-O-、巯基、Prot-S-、Act-S-、C_1-6-硫烷基、氨基、Prot-N(R^H)-、Act-N(R^H)-、单或者双(C_1-6烷基)氨基、任意取代的C_1-6-烷氧基、任意取代的C_1-6-烷基、任意取代的C_2-6-烯烃基、任意取代的C_2-6-烯烃氧基、任意取代的C_2-6-烯烃基、任意取代的C_2-6-炔基、任意取代的C_2-6-炔氧基、单磷酸基、单硫代磷酸基、双磷酸基、双硫代磷酸基、三磷酸基、三硫代磷酸基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、络合基团、报告基团、配体、羧基、磺酰基、羟甲基、Prot-O-CH₂-、Act-O-CH₂-、氨甲基、Prot-N(R^H)-CH₂-、Act-N(R^H)-CH₂-、羧甲基、硫酰甲基，其中Prot分别是-OH、-SH、和-NH(R^H)的保护基团，Act分别是-OH、-SH、和-NH(R^H)的激活基团，R^H选自氢和C_1-6烷基。

羟基取代基的保护基团包括取代的三苯甲基，例如4，4′-二甲氧三苯甲氧基(DMT)、4-单甲氧基三苯甲氧基(MMT)、和三苯甲氧基，可被任意取代的9-(9-苯基)夹氧蒽基氧基(pixyl)、可被任意取代的甲氧四氢吡喃氧基(mthp)，甲硅氧基例如三甲基甲硅氧基(TMS)、三异丙基甲硅氧基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅氧基(TBDMS)、三乙基甲硅氧基、和苯二甲基甲硅氧基、叔丁基醚、缩醛(包含两个羟基基团)，酰氧基例如乙酰基或者卤素取代的乙酰基，例如氯乙酰氧基或者氟乙酰氧基、异丁酰氧基、三甲基乙酰氧基、苯酰氧基和取代的苯酰基、甲氧基甲基氧(MOM)、苯甲醚或者取代的苯甲醚，例如2，6-二氯苯酰氧基(2，6-Cl₂Bzl)。另外，当Z或者Z^*是羟基时，他们可以任意通过连接基团(linker)结合到固态支持物上而被保护。

当Z或者Z^*是氨基时，氨基保护基团的例子是：芴基甲氧基碳酰氨(Fmoc)、叔丁氧基碳酰氨(BOC)、三氟代乙酰氨、烯丙氧基碳酰氨(alloc，AOC)、Z苄氧基碳酰氨(Cbz)，取代的苄氧基碳酰氨例如：2-氯苄氧基碳酰氨(2-ClZ)、单甲氧基三苯甲氨(MMT)、二甲氧基三苯甲氨(DMT)、邻苯二甲酰氨、和9-(9-苯基)夹氧蒽氨基(pixyl)。

在上面的实施方式中，Act代表-OH、-SH、和-NH(R^H)各自的激活基团，这种激活基团是例如从任意取代的O-磷酰亚胺、任意取代的O-磷酸三酯(O-phosphortriester)、任意取代的O-磷酸二酯、任意取代的H-膦酸酯和任意取代的O-膦酸酯。

在本发明中，术语“磷酰亚胺”是指一组分子式为-P(OR^X)-N(R^Y)₂的基团，其中R^X代表任意取代的烷基基团，例如甲基、2-氰乙基或者苄基，每一个R^Y代表任意取代的烷基基团，例如乙基、异丙基，或者基团N(R^Y)₂形成吗啉基(-N(CH₂CH₂)₂O)。R^X优选为2-氰乙基，两个R^Y优选同为异丙基。因此，一种特别相关的磷酰亚胺是N，N-二异丙基-O-(2-氰乙基)磷酰亚胺。

B为天然或者非天然核碱基，选自腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、2，6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤。

特别优选的双环结构如下面方案3所示。

方案3

其中，Y是-O-、-S-、-NH-或者N(R^H)，

Z和Z^*是独立缺失的，选自核苷间连接、末端基团或者保护基团。在实施方式中，至少一个LNA核苷酸是在3’末端，所述位置Z是一种末端基团，Z^*是一种核苷间连接。在实施方式中，至少一个LNA核苷酸是在5’末端，所述位置Z是缺失的，Z^*是一种末端基团。在核苷酸序列内部，Z是缺失的，Z^*是一种核苷间连接。

核苷酸间连接可以是-O-P(O)₂-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-S-P(O)₂-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)₂-O-、-O-P(O)₂-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)₂-S-、-O-PO(R^H)-O-、O-PO(OCH₃)-O-、-O-PO(NR^H)-O-、-O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-、-O-PO(BH₃)-O-、-O-PO(NHR^H)-O-、-O-P(O)₂-NR^H-、-NR^H-P(O)₂-O-、-NR^H-CO-O-，其中R^H选自氢和C₁-C₄烷基。

末端基团独立地选自氢、叠氮、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、Act-O-、巯基、Prot-S-、Act-S-、C_1-6-硫烷基、氨基、Prot-N(R^H)-、Act-N(R^H)-、单或者双(C_1-6烷基)氨基、任意取代的C_1-6-烷氧基、任意取代的C_1-6-烷基、任意取代的单磷酸、单硫代磷酸、双磷酸、双硫代磷酸、三磷酸、三硫代磷酸，其中Prot是-OH、-SH、和-NH(R^H)各自的保护基团，Act是-OH、-SH、和-NH(R^H)各自的激活基团，R^H选自氢和C_1-6烷基。

特别优选的LNA单元示于方案4。

方案4

当Z或者Z^*是氨基时，氨基保护基团的例子是：芴基甲氧基碳酰氨(Fmoc)、叔丁氧基碳酰氨(BOC)、三氟代乙酰氨、烯丙氧基碳酰氨(alloc，AOC)、单甲氧基三苯甲氨(MMT)、二甲氧基三苯甲氨(DMT)、邻苯二甲酰氨。

在上面的实施方式中，Act代表-OH、-SH、和-NH(R^H)各自的激活基团，这种激活基团是例如从任意取代的O-磷酰亚胺、任意取代的O-磷酸三酯、任意取代的O-磷酸二酯、任意取代的H-膦酸酯和任意取代的O-膦酸酯。

在本发明中，术语“磷酰亚胺”是指一组分子式为-P(OR^X)-N(R^Y)₂的基团，其中R^X代表任意取代的烷基基团，例如甲基、2-氰乙基，每一个R^Y代表任意取代的烷基基团，R^X优选为2-氰乙基，两个R^Y优选同为异丙基。因此，一种特别相关的磷酰亚胺是N，N-二异丙基-O-(2-氰乙基)磷酰亚胺。

B在方案3和4中是天然或者非天然核碱基，选自腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤。

本领域的技术人员可以认识到含有LNA的寡聚化合物通过多种不同的原理来与生存素关联的疾病抗争，这也自然落在了本发明的主旨内。

例如，LNA寡聚化合物可以设计成反义抑制剂，其是单链核酸，通过在mRNA水平进行干扰来阻止致病蛋白的产生。它们也可以设计成核酶或者寡聚酶，其是反义寡聚核苷酸，除了靶标结合区域外，还具有降解靶标mRNA的催化活性(核酶)，或者包含外部引导序列(EGS)以招募降解靶标mRNA的的内源酶(RNase P)(寡聚酶)。

同样的，LNA化合物可以设计成小分子干扰RNA(SiRNA)，其是双链RNA小分子，其被细胞用来抑制特异的内源或者外源基因，该“反义类似”机制尚不清楚。

LNA寡聚化合物也可以设计成适体(以及其突变体，称为斯皮格尔体)，其是核酸，通过形成分子间氢键而具有的三维结构使其能够高效和高特异性地结合并阻断它们的生物学靶标结合。LNA寡聚化合物也可以设计成诱饵，其是小分子双链核酸，通过选择性阻断细胞转录因子的DNA结合位点来阻止细胞转录因子激活其靶标基因。

进一步，LNA寡聚化合物可以被设计为嵌合体，嵌合体是小分子单链核酸，能够与它们的靶标基因序列特异性配对和使其改变。包含LNA的寡聚化合物利用了这种原理，因此对于治疗生存素基因突变引起的生存素相关的疾病是特别有用的。

如在寡聚核苷酸发挥功能的治疗原理中部分介绍的那样，本发明的LNA寡聚化合物优选含有约8-60个核碱基，例如约8-60个相连的核苷酸。特别优选的化合物是包含约12-30个核碱基的反义寡核苷酸，最优选的是包含约12-20个核碱基的反义化合物。在表1和2中所列出的都是16个聚体。

参考，LNA寡聚化合物可发挥治疗功能的上述原理，本发明的靶标可以是生存素基因、mRNA或者蛋白质。在最优选的实施方式中，LNA寡聚化合物被设计成直接针对生存素前体mRNA或者生存素mRNA的反义抑制剂。这种寡聚核苷酸可以和生存素前体mRNA或者mRNA上的任意位点杂交，例如5’非翻译引导区、外显子、内含子和3’非翻译尾。

在一种优选的实施方式中，寡聚核苷酸杂交到人类生存素前体mRNA或者mRNA的包含翻译起始位点的部分。更优选的是，生存素寡聚核苷酸包含一个CAT序列，该序列与生存素前体mRNA或者mRNA的起始序列AUG互补。在另一种实施方式中，生存素寡聚核苷酸杂交到人类生存素前体mRNA的一段剪接受体位点。在另一种实施方式中，生存素寡聚核苷酸杂交到人类生存素前体mRNA或者mRNA的参与多聚腺嘌呤化、转运或者降解的位点。本领域的技术人员可以认识到，优选的寡聚核苷酸可以和一段生存素前mRNA或者mRNA序列杂交，该序列通常不出现在无关基因的转录产物中，以便保持治疗的特异性。

本发明的寡聚化合物设计成与靶标充分互补，以提供期望的临床反应，例如寡聚化合物必须与靶标进行足够强度和特异性的结合以得到期望的作用。在一种实施方式中，所述调控生存素的化合物被设计成同时调控其他不编码生存素的特异核酸的形式。本发明的寡聚化合物优选设计成避免分子内和分子间杂交的形式。

在多数情况下，基于靶标基因的序列信息，来鉴定有效地在体内或者临床上调控生存素活性的LNA寡聚化合物。然而一名本领域内的普通技术人员也能认识到这种寡聚化合物也可以通过经验测试来鉴定。例如，虽然生存素寡聚化合物，与优选实施方式相比，含有较少的同源序列、较多或者较少的修饰的核苷酸，或较长或较短的长度，但在临床治疗中仍表现出效应，则该生存素寡聚核苷酸也包括在发明的范围内。

在本发明的一种实施方式中，寡聚化合是适宜的反义药物。设计一种有效的和安全的反义药物需要精细地调节各种参数，例如亲和力/特异性，在生物液中的稳定性、细胞的摄取、作用方式、药物动力学性质和毒性。

亲和力和特异性：带有氧亚甲基2′-O，4′-C连接基团的LNA(β-D-oxy-LNA)表现出与DNA和RNA靶标序列前所未有的结合性质。类似的LNA衍生物，例如氨基-、硫代-和α-L-氧-LNA表现出与互补RNA和DNA空前的亲和力，对于硫代-LNA，其与RNA的亲和力比β-D-氧-LNA还要大。

除了这些显著的杂交性质，LNA单体可以与DNA和RNA单体，以及其他核酸类似物例如2′-O-烷基修饰的RNA单体混合并协同作用。因而，本发明的寡聚核苷酸可以完全由β-D-氧-LNA单体组成，或者由β-D-氧-LNA与DNA、RNA或者包括LNA衍生物的同时代的核酸类似物任意组合而成，上述LNA衍生物是例如氨基-LNA、硫代-LNA和α-L-氧-LNA。LNA与DNA或者RNA靶标序列之间具有空前的结合亲和力，并能够与DNA、RNA以及一系列同时代的核酸类似物自由地混合，因而其对于根据本发明开发有效和安全的反义化合物来说，具有重要的地位。

首先，本发明的一种实施方式中，大大缩短了反义寡聚物的通常长度(从20-25mer到例如12-16mer)，而没有减少对药物活性必需的亲和力。由于寡聚物内在的特异性与其长度负相关，因此这种缩短可以提高反义化合物对其靶标RNA的特异性。由于人类基因组的序列是可以得到的，并且它的基因注释发展也很快，本发明的一种实施方式是鉴定靶标mRNA中的尽可能最短的、独有序列

在另一种实施方式中，利用锚定核酸来减少寡聚物的大小，显著减少了制作工序和成本，这样也为反义治疗成为一种经济上有竞争力的治疗多种疾病的治疗方法提供了基础。

在另一种实施方式中，LNA的空前的亲和性可以用来充分地提高反义寡聚物与其靶标mRNA在体内地杂交，这样与使用其他化学物质相比，显著降低了鉴定活性化合物所耗费的时间和精力。

在另一种实施方式中，LNA的空前的亲和性用来提高反义寡聚核苷酸的效力，进而能够开发出具有比目前临床应用的药物更有利的治疗窗的化合物。

当本发明的发明的寡聚核苷酸被设计成一种反义抑制剂时，该寡聚核苷酸与靶标核酸结合并调控其同源蛋白的表达。优选的是，这种修饰可以使与正常表达水平相比至少有10％或者20％的表达抑制，更优选的是与正常表达水平相比至少有30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％的抑制。

典型地，本发明的LNA寡聚核苷酸将含有除了β-D-氧-LNA外的其他残基，例如天然DNA单体、RNA单体，N3′-P5′磷酰胺、2′-氟，2′-氧杂-甲基，2′-氧杂-甲氧基乙基(MOE)，2′-氧杂-(3-氨基丙基)(AP)、己糖醇核酸(HNA)、2′-氟-阿拉伯糖核酸(2′-F-ANA)和D-环己烯基核苷(CeNA)。同时β-D-氧-LNA修饰的寡聚核苷酸，除氧-LNA基团外也可以含有其他LNA单元或者用其他LNA单元来代替氧-LNA基团。特别地，优选附加的LNA单元包括硫代-LNA或者氨基-LNA单体，可以D-β或者L-α的构型或者它们的组合、或者ena-LNA的形成存在。通常，LNA修饰的寡聚核苷酸会大约20、25、30、40、50、60、70、80或者90％的LNA单元，这是根据寡聚核苷酸的总碱基数得到的。

在生物液中的稳定性：发明的一种实施方式包括将LNA单体并入标准DNA或者RNA寡聚核苷酸中，以提高所得的寡聚化合物在生物液中的稳定性，例如通过提高对核酶(内切酶和外切酶)的耐性。稳定性程度将依赖于所使用的LNA单体的数目、它们在寡聚核苷酸的位置和使用的LNA单体的类型。与DNA和硫代磷酸相比，可得到下面的顺序，表明稳定寡聚核苷酸以抵抗核苷酸降解的能力：DNA＜＜硫代磷酸～氧-LNA＜α-L-LNA＜氨基-LNA＜硫代-LNA。

鉴于LNA与标准DNA合成是一致的，并和许多同时代的核酸类似物自由混合，则根据本发明，通过并入其他表现出提高的核酸酶稳定性的类似物或者使用核酸酶耐受性核苷间连接例如单硫代磷酸、二硫代磷酸和甲基膦酸连接等，可以进一步加强LNA-寡聚化合物对核酸酶的耐受性。

作用方式：根据本发明的反义化合物可以通过多种机制来诱发它们的治疗作用，并且将几种机制组合在同一化合物中。一种情形是，寡聚核苷酸结合到它的靶标(前体mRNA或者mRNA)所起的作用是阻止靶标正常功能所需的其他因子(蛋白质、其他核酸等)的结合，例如，通过空间位阻行使功能。例如，反义寡聚核苷酸可以结合到前体mRNA或者mRNA序列模体，该模体对识别和结合参与剪接、多聚腺嘌呤化、细胞转运、RNA中核苷的转录后修饰、5’末端加帽、翻译等的转录因子是重要的。在前体mRNA剪接时，多聚核苷酸与其靶标相互作用的结果可以是，抑制不希望蛋白的表达或者，或者产生编码期望得到的蛋白的选择性剪接的mRNA，或者两者都有。

在另一种实施方式中，寡聚核苷酸结合到其靶标是通过制造出核糖体器的物理屏障而阻止翻译进程的。

在另一种实施方式中，寡聚核苷酸结合到其靶标而干扰RNA获得对其正常功能是重要的二级或者更高级结构的能力，例如结构抑制。例如，寡聚核苷酸可以干扰茎环结构的形成，该结构在不同功能中发挥重要作用，例如为RNA提供附加稳定性或者为不同的蛋白获得重要的识别区域。

在另一种实施方式中，寡聚核苷酸的结合通过招募降解mRNA的细胞酶，使靶标失活而无法进行进一步的细胞代谢过程。例如，寡聚核苷酸可以包含一段具有招募降解DNA/RNA二聚体的RNA部分的核糖酶H(RNaseH)的能力的核苷。同样地，寡聚核苷酸可以包含一段可以招募双链RNA酶的序列，例如RNAseIII或者其可以包括外部引导序列(EGS)以招募降解靶标mRNA的内源酶(RNase P)。而且，寡聚核苷酸可以包含具有RNAse催化活性的序列模体或者可以连到寡聚核苷酸上的成分(moieties)，该成分当通过杂交与靶标接近时，使得靶标不能参与进一步的代谢活动。

据显示，β-D-氧-LNA不支持RNaseH活性。然而，根据本发明，这可以通过构建包含β-D-氧-LNA和DNA的嵌合寡聚核苷酸来改变，该嵌合寡聚核苷酸被称为间聚物。间聚物基于以可被RNaseH识别和剪切的一段4-12个DNA或修饰单体(间隙(gap))为中心，并通常以1-6个β-D-氧-LNA为侧翼(侧翼(flank))而得到的。侧翼也可以用LNA的衍生物来构建。根据本发明还有其它的嵌合结构体，其可以通过RNaseH介导的机制来发挥作用。头聚物被定义为一种5’末端有β-D-氧-LNA或者LNA衍生物的相邻片段，其后有相邻的可以被RNaseH识别和剪切的一段DNA或者修饰的单体在3’末端，尾聚物被定义为一种在5’末端有相邻的可以被RNaseH识别和剪切的一段DNA或者修饰单体，其后有一段相邻的β-D-氧-LNA或者LNA衍生物在3’末端。根据本发明的其他嵌合物，被称作混聚物，是由交替组成的可以被RNaseH识别和剪切的DNA或者修饰单体构成，β-D-氧-LNA和/或者LNA衍生物也可以介导RnaseH的结合和剪接。由于α-L-LNA只在一定程度上招募RNaseH活性，因此可能需要可被RNaseH识别和剪切的较小的DNA或者修饰单体作为间隙来构建间聚物，并有可能使混聚物结构的柔韧性更好。图1显示根据本发明的不同设计的概要。

反义寡聚核苷酸的临床效果很大程度上依赖与它们的药物动力学性质例如：吸收、分布、细胞摄入、代谢和排泄。接下来，这些参数通过寡聚物的基本的化学和大小以及三维结构而被显著支配。

前面所提到的，根据本发明的LNA不是一种单独的而是几种相关的化学性质，其尽管分子上不同但都在与DNA和RNA互补中都表现出很大的亲和力。这样，LNA家族的化学性质特别适合开发具有合适的药物动力学性质的本发明的寡聚物，利用高亲和力的LNA来调节活性化合物的大小或者利用不同LNA的化学性质来调节活性化合物的特定分子组成。在后面的情况下，例如利用氨基-LNA而不是氧-LNA，可以改变寡聚物的整体电荷，并影响摄取和分布行为。同样地，利用硫代-LNA而不是氧-LNA，可以提高寡聚核苷酸的亲脂性，并因此影响其通过亲脂屏障例如细胞膜的能力。

根据本发明，调节LNA聚核苷酸的药物动力学性质可以进一步通过结合多种成分来达到。例如，寡聚核苷酸通过细胞膜的能力可以通过在寡聚核苷酸上结合如脂类成分例如胆固醇成分、硫醚、脂肪链、磷脂或者聚氨来提高。同样地，细胞对LNA寡聚核苷酸的吸收可以通过在寡聚核苷酸上结合与细胞膜上的分子相互作用的成分来增强，所述细胞膜上的分子是介导转运至细胞质的分子。

根据本发明，药物动力学性质可以用提高寡聚物摄取、增强生物稳定性例如增强寡聚物对降解的耐受性和/或者提高寡聚核苷酸与靶标序列如mRNA序列杂交特征的特异性和亲和力的基团得到增强。

基本上有两种毒性类型与反义寡聚物相关：序列依赖性毒性，包括碱基序列序列；以及非依赖序列性毒性，种类相关毒性。除了与由CpG序列模体所带来的免疫激活相关的问题外，毒性已经成为开发反义寡核苷酸最突出的问题，是不依赖序列的，例如与寡聚核苷酸的化学性质以及剂量、模式、用药频率和持续时间相关。寡聚核苷酸的硫代磷酸类尤其已经被详细描述，并发现表现出许多负作用，例如激活补体、延长PTT(部分促凝血酶原激酶时间)、血小板减少、肝中毒(肝脏酶的减少)、心脏中毒、脾大和网状内皮组织细胞增生。

如前面提到的，LNA家族的化学性质提供了空前的亲和力、非常高的生物稳定性和调节寡聚核苷酸的特定分子组成的能力。在本发明的一种实施方式中，含有LNA的化合物能够形成以高强度与少量硫代磷酸连接相结合的连接，并因此可以表现出比现有反义化合物更好的效率和安全性。

本发明的寡聚和多聚核苷酸可以使用对有机化学领域普通的技术人员是熟悉的核酸化学的聚合技术来制备。通常，使用基本的磷酰亚胺聚合循环方法(S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1993，49，6123；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223)，但例如H-磷酸酯化学、磷酸三酯化学也可以使用。

对本发明的几种单体，采用了较长的配对时间，和/或者使用新鲜试剂反复配对，和/或者使用更加浓缩的配对试剂。使用磷酰亚胺(phosphoramidite)进行配对得到使人满意的＞95％的逐步配对产率。磷酸的硫化通过与使用博凯吉试剂(Beaucage’s reagent)(可购买)的氧化反应交换常规的，例如碘/嘧啶/H₂O、用来合成磷酸二酯寡聚物的氧化反应来进行，也包含其它的硫化试剂。硫代磷酸LNA寡聚物以逐步配对率＞＝98％的高效率被合成。

采用磷酰亚胺步骤，β-D-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA寡聚核苷酸、α-L-LNA和β-D-甲基氨-LNA寡聚核苷酸也以逐步配对率＞＝98％的高效率被合成。

LNA寡聚化合物的纯化是使用一次性反相纯化套筒和/或者反相HPLC和/或者从乙醇或者丁醇中沉淀来完成。使用毛细管凝胶电泳、反相HPLC、MALDI-MS和ESI-MS来检测合成的寡聚核苷酸的纯度。而且，固体支持物质上已经固定有核碱基被任选保护的和5’-OH被任选保护的LNA，该固体支持物作为合成含LNA的寡聚化合物的物质是使人感兴趣的，其中LNA单体包含在3’末端。在这种情况下，固体支持物优选CPG，例如易获得(可购买的)的CPG材料或者聚苯乙烯，并且其上连接有3’功能化的、核碱基被任选保护的、并且5’-OH被任选保护了的LNA，采用提供商描述的具体材料的使用条件。

到这里应该清楚了，本发明的一个使人感兴趣的方面是针对用作药物的本发明的化合物或者本发明的结合物。同时也应该明确，本发明的化合物或者结合物在制备治疗癌症的药物方面的应用是本发明特别感兴趣的方面。

根据本发明的药物组合物可以用来治疗多种不同疾病。例如生存素已经被发现在人肺癌(Monzo等，1999，J.Clin.Oncol 17，2100-2104)、乳癌(Tanaka等，2000，Clin.Cancer Res.6，127-134；Nasu等，2002，Anticancer Res.22，1839-1844)、直肠癌(Kawasaki等，1998，Cancer Res.58，5071-5074；Rode等，2002，Strahlenther.Onkol.8，426-434)、胃癌(Lu等，1998，Cancer Res.58，1808-1812；Tsuburaya等，2002，Hepatogastroenterology 49，1150-1152)、食管癌(Kato等，2001，Int.J.Cancer 95，92-95；Ikeguchi and Kaibara，2002，Br.J.Cancer 87，883-887)、胰腺癌(Satoh等，2001，Cancer 92，271-278；Sarela等，2002，Br.J.Cancer86，886-892)、肝癌(Ikeguchi等，2002，Clin.Cancer Res.8，3131-3136)、子宫癌(Saitoh等，1999，Int.J.Oncol.15，137-141；Takai等，2002，Cancer Lett.184，105-116)、卵巢癌(Yoshoda等，2001，Int.J.Oncol.19，537-542；Takai等，2002，Int.J.Mol.Med.10，211-216)、何杰金病(Garcia等，2003，Blood101，681-689)、非何杰金淋巴癌(Adida等，2000，Blood 96，1921-1925.；Kuttler等，2002，Leukemia 16，726-735)、白血病(Adida等，2000，Br.J.Haematol.111，196-203.；Kamihira等，2001，Br.J.Haematol.114，63-69；Mori等，2001，Int.J.Haematol.75，161-165)、成神经细胞瘤(Islam等，2000，Oncogene 19，617-623；Adida等，1998，Lancet 351，882-883)、肾上腺嗜铬细胞瘤(Koch等，2002，Eur.J.Endocrinol.146，381-388)、软组织恶性肿瘤(Wurl等，2002，Lancet359，943-945)、神经胶质瘤(Chakravarti等2002，J.Clin.Oncol.20，1063-1068)、黑素瘤(Grossman等，1999，J.Invest.Dermatol.113，1076-1081)、膀胱癌(Swana等，1999，New Engl.J.)中过量表达。和癌细胞一样，增殖的血管内皮细胞对于生存素表达的下调也是敏感的。因此，根据本发明的药物组合物可以被用于治疗以异常疾病所引起的血管生成为特征的疾病。这种疾病的例子一般是癌症和关节硬化、牛皮癣、糖尿病性视网膜炎、类风湿性关节炎、哮喘、疣和过敏性皮炎药物和卡布斯肿瘤(Karposis sarcoma)。而且，生存素可以积极地参与调控在HIV-1感染中的细胞存活(Zhu等，2003，Apoptosis 8，71-79)。生存素对于正常执行有丝分裂和细胞分裂的完成是重要的。因而，生存素的下调对于治疗任何以细胞生长失控或者不正常为特征的疾病都是相关的。

通常，本发明的一个方面是针对一种治疗受苦于异常血管生成引起的疾病或者对其敏感的哺乳动物的方法，包括：给予哺乳动物治疗有效量的一种针对生物素的寡聚核苷酸，其包含一个或者多个LNA单元。

本发明的一个感兴趣的方面是针对这里所述的化合物或这里所述的结合物作为制备一种治疗关节硬化、牛皮癣、糖尿病性视网膜炎、类风湿性关节炎、哮喘、疣和过敏性皮炎药物的应用。

本发明的方法优选适用于治疗或者预防癌症引起的疾病，特别治疗发生在例如肺部、乳房、结肠、前列腺、胰腺、肝脏、脑、甲状腺、胃、肠、大肠、脊髓、鼻窦、泌尿道、卵巢癌的组织的癌症。

而且，这里所描述的发明包括一种预防或者治疗癌症的方法，其包含给予需要治疗的人一种治疗有效量的生存素调控寡聚化合物，包含但不限制于高剂量的寡聚物。发明还包含了一种短期给予调控生存素的寡聚化合物的方法。通常，非肿瘤细胞以一种作为细胞种类特征的频率进行分裂。当一种细胞被转化为癌状态，会导致细胞增值失控和细胞死亡减少，因此混杂的细胞分裂或者细胞生长是癌性细胞类型的一种特征。癌症的例子包括但不限制于非何杰金淋巴癌、何杰金淋巴癌、白血病(例如：急性白血病例如，急性淋巴细胞白血病、急性中幼粒细胞白血病、慢性骨髓白血病、慢性脉络丛白血病，多发性骨髓瘤)、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、膀胱癌、黑色素瘤、头颈癌、脑癌、初始位置不明的癌症、肿瘤，周围神经系统癌症、中枢神经系统癌症、肿瘤(例如：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴血管瘤、淋巴血管内皮瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、扁平细胞肉瘤、基质细胞瘤、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺瘤、乳头状癌、乳头状腺癌，囊腺癌、骨髓瘤、支气管瘤精原细胞瘤、胚胎瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少枝胶质细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤和眼癌)、重链疾病、转移或者任何以细胞生长失控或者不正常为特征的疾病或紊乱。

在使用本发明的化合物或者本发明的结合物来制备治疗癌症药物的应用中，所述癌症可以适合的以一种固体瘤的形式。而且，所述癌症也适合是肿瘤。肿瘤典型地从由恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳瘤、结肠癌、肾细胞瘤、膀胱瘤、复发性浅层膀胱癌、胃瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、子宫颈癌、子宫颈发育不良、喉乳头状瘤病、结肠癌、直肠癌和良性肿瘤构成的组中选择。更典型的是，所述肿瘤可以从由恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳瘤、结肠癌、肾细胞瘤构成的组中选择。恶性黑色素瘤典型地从由浅层蔓延黑色素瘤、结节状黑色素瘤、斑点恶性黑色素瘤、肢体末端黑色素瘤、无黑色素性黑素瘤和结缔组织黑色素瘤构成的组中选择。

另外，癌症可以适合是肉瘤。肉瘤典型地从由骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤构成的组中选择。

另外，癌症可以适合是一种神经胶质瘤。

应该知道，本发明也涉及一种药物组合物，其含有至少一种本发明构建的反义寡聚核苷酸作为活性成分。还应该知道，根据本发明的药物组合随意含有药物载体，并且这种药物载体随意包含进一步的反义化合物、化学治疗性化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物和/或者免疫调节化合物。

本发明的寡聚化合物可以用作多种药学上可以接受的盐类。正如这里使用的，术语是指保持这里所鉴定的化合物的需要的生物学活性并表现出最少的不希望的毒性的盐。这些盐的非限制的例子可以由有机氨基酸和碱性盐形成，碱性盐由金属阳离子例如锌、钙、铋、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾以及其类似物形成，或者由氨、N，N-二苄及亚乙基-二乙胺、D-葡糖胺、四乙铵或者乙二胺形成的阳离子；或者(a)与(b)的组合物(c)例如锌丹宁酸盐或类似物。

在本发明的一种实施方式中，寡聚化合物可以是前体药物的形式。寡聚核苷酸带有负电离子。由于细胞膜亲脂性特点，细胞摄入寡聚核苷酸与中性或者亲脂性等价物相比要少。这种极性“阻碍”可以通过使用前体药物的方法来避免(参照(Crooke，R.M.(1998)在Crooke，S.T.Antisense research andApplication.Springer-Verlag，柏林，德国Vol.131，Page 103-140)。在这种方法中，寡聚核苷酸通过一种受保护的方法制备，以使得寡聚物在使用时是中性。这些保护基团设计成在细胞摄入寡聚物后可被去掉。这种保护基团的例子是S-乙酰硫乙基(SATE)或者S-新戊酰硫乙基(t-butyl-SATE)。这些保护基团耐受核酸酶，并在细胞内被选择性清除。

在本发明的一种实施方式中，寡聚化合物被连接到配体/结合物上。这是提高细胞摄入反义寡聚核苷酸的方法，这种结合物可以占据5’/3’-羟基末端位置，但配体也可以占据糖基和/或碱基。其他结合物/配体的例子是胆固醇成分、双向嵌合剂例如吖啶、L-多聚赖氨酸、用一个或者几个核酸酶耐受性连接基团加帽(end-capping)。

如这里所公开的，发明还包括了一种或者多种寡聚核苷酸化合物的配方。药物上可以接受的粘合剂和佐剂可以包含部分的配制的药物。胶囊、片剂或者丸剂等可以包含例如下列化合物：微晶纤维素、树胶或者明胶作为粘合剂；淀粉或者乳糖作为赋形剂；硬脂酸盐作为润滑剂；各种甜味剂或者调味剂。对于胶囊，剂量单位可以包含一种液体载体例如油脂。同样地，糖衣或者肠溶性物质也可以是剂量单位的一部分。寡聚核苷酸配方也可以是活性药物成分的乳状液，和形成一种微胶束乳状液的脂类。本发明的寡聚核苷酸可以与任何不损害其期望作用的物质混合，或者与补充其期望作用的物质混合。这些包括其它核苷酸化合物在内的其它药物。为了通过注射、皮下、皮内、或者局部给予，这种配方可以包括灭菌稀释液、缓冲液、强度调节剂和抗菌剂。这种活性化合物可以与保护其不被降解或者立刻从体内除去的载体一起制备，这些包括释放特性可控的植入体(implants)或者微胶囊。为了进行静脉注射，优选的载体是生理盐水或者磷酸缓冲盐溶液。优选的是，在单位配方，例如在药学上可接受的载体或稀释剂中包含足量寡聚化合物，并使得寡聚化合物以治疗有效量分布于受治患者体内而不引起严重副作用。

本发明的药物组合物可以多种方式给予，这是由局部还是全身给予适宜，以及治疗部位决定的。给药可以是(a)口服，(b)肺部，例如通过吸入或者吹入粉末或者气雾剂，包括使用喷雾器；气管内，鼻内，(c)局部，包括表皮、透皮、眼部以及粘膜包括阴道和直肠运输；或者(d)注射，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内注射或者肌肉注射或灌输，例如鞘内或者心室内给予。在一种实施方式中，活性寡聚物通过静脉注射、腹腔注射、口服、局部或者作为丸剂注射给予或者直接应用于靶器官。局部给予的药物组合物和配方可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、栓剂、液体制剂和散剂。传统的药物载体、含水的、粉末或者油类化合物(oily bases)、稠化剂以及类似物可能是必要的，或是适宜含有的。包衣避孕套、手套以及类似物也可能是有用的。优选的局部配方包括将本发明的寡聚核苷酸与局部运输物质混合而得的配方，所述局部运输物质例如脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、络合剂和表面活性剂。口服给予的组合物和配方包括但不限于散剂或者颗粒剂、微粒、纳米颗粒、悬浮剂或者水溶液或非水介质、胶囊、凝胶胶囊、袋装剂(sachet)、片剂或者小片剂。注射、鞘内或者心室内给予的组合物和配方可以包括灭菌水溶液，其中还可以包含缓冲剂、稀释剂和其它适宜的添加物，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物以及其他药学上可以接受的载体或者赋形剂。

本发明的药物组合物包括但不限制于，溶液、乳液和包含脂质体的配方。这些组合物可以从多种成分得到，上述成分包括但不限于预成型的液体、自乳化固体和自乳化半固体。药物向肿瘤组织的运输可以通过载体介导的运输得到增强，包括但不限于阳离子脂质体、环式糊精、卟啉衍生物、支链树枝状聚合物、聚乙氨多聚物、纳米颗粒和微球体(Dass CR.，J Pharm Pharmacol2002，54(1)：3-27)。本发明的药物配方可以便利地以单位剂量形式存在，可以通过传统地在制药工业领域已知的技术制备。这些技术包括将活性成分与药物载体或者赋形剂结合在一起。通常，这些配方通过均一地和紧密地将活性成分和液态载体或者精细粉碎的固体载体或者二者结合而制备，接着，如果必要的话，将产物成型。本发明的组合物可以配制成任何可能的多种剂型，例如但不限于，片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶和栓剂。本发明的组合物可以配制成水、非水或者混合介质悬浮液。水悬浮液可以进一步包含提高悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或者右旋糖苷。该悬浮液还可以含有稳定剂。本发明的寡聚化合物也可以连接上活性药物成分，例如阿斯匹林、布洛芬、磺胺类药物、抗糖尿病药物、抗菌剂、或者抗生素。

含有LNA的寡聚化合物对于一些上述的治疗性应用是有用的。通常，本发明的治疗性方法包括给予哺乳动物特别是人有效治疗剂量的LNA修饰的寡聚核苷酸。在一种特定的实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包括(a)一个或者多个反义化合物，和(b)一个或者多个其他通过非反义机制发挥作用的化疗试剂。当与本发明的化合物一起使用时，这些化疗试剂可以单独使用(例如光神霉素和寡聚核苷酸)、相继使用(例如光神霉素和寡聚核苷酸使用一段时间后，接着使用另一种药物和寡聚核苷酸)，或者与一种或几种这样的化疗试剂联合或者放射治疗联合使用。所有本领域技术人员知道的化疗试剂在这里都可以与本发明的化合物联合治疗。抗炎药物包括但不限制于非类固醇抗炎药物和皮质类固醇药物，抗病毒药物、和免疫调节药物也可以与本发明的组合物联合使用。两种或者多种组合的化合物可以一起使用或者相继使用。

因此，本发明的一个进一步的观点是针对这里所述的化合物和这里所述的结合物在制备治疗癌症的药物中的应用，其中所述药物进一步含有化学治疗性药物，其从由肾上腺皮质甾类，例如强的松、地塞米松或者氟美松；六甲蜜胺(六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(乙基)；氨苯哌啶酮(氨鲁米特)；胺苯丫啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄性激素，例如睾丸激素；天冬酰胺酶(爱施巴)；结核预防注射液；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(平阳霉素)；白消安(马勒兰)；卡铂(伯尔定)；卡氯芥(BCNU，BiCNU)；瘤可宁(苯丁酸氮芥)；氯去氧腺苷(2-CDA，克拉利宾，leustatin)；顺氯氨铂(顺铂)；阿糖胞苷(赛德萨)；甲嗪咪唑胺(DTIC)；更生霉素(放线菌素D-D，更新霉素)；道诺霉素(cerubidine)；多西他赛(泰素帝)；亚德里亚霉素(阿霉素)；表阿霉素；雌莫司汀(emcyt)；雌性激素例如：己烯雌酚(DES)；足叶乙甙(VP-16，鬼臼叉甙，依托泊苷)；氟阿糖腺苷(福达华)；氟他米特(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他宾(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；依达比星(去甲氧基柔红霉素)；异环磷酰胺；白介素-2(proleukin，aldesleukin)；干扰素α(intron A，roferon A)；依立替康(伊立替康)；亮丙瑞林(lupron)；左旋四咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；氮芥(mechlorathamine，nitrogen mustard)；美法仑(左旋溶内瘤素)；巯嘌呤(巯基嘌呤，6-MP)；甲氨蝶呤(mexate)；丝裂霉素-C(mutamucin)；米托蒽醌(novantrone)；奥曲肽(善得定)；喷司他丁(2-脱氧咖啡霉素，nipent)；普卡霉素(光神霉素，光辉霉素)；甲基苄肼(matulane)；链氮霉素；三苯氧胺(诺瓦得士)；紫杉醇(paclitaxel)；替尼泊甙(vumon，VM-26)；塞替派；拓扑替康(hycamtin)；维甲酸(vesanoid，全反式维A酸)；长春碱(valban)；长春新碱(oncovin)和长春瑞滨(去甲长春碱)构成的组中选择。适宜的是，这种进一步的化学治疗性药物是从紫杉烷类药物例如红豆杉醇、紫杉醇和多西他赛中选择的。

类似地，发明的一个进一步的观点是针对这里所述的化合物和这里所述的结合物在制备治疗癌症的药物中的应用，其中所述治疗进一步给予进一步的化学治疗性药物，其从由肾上腺皮质甾类，例如强的松、地塞米松或者氟美松；六甲蜜胺(六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(乙基)；氨苯哌啶酮(氨鲁米特)；胺苯丫啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄性激素，例如睾丸激素；天冬酰胺酶(爱施巴)；结核预防注射液；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(平阳霉素)；白消安(马勒兰)；卡铂(伯尔定)；卡氯芥(BCNU，BiCNU)；瘤可宁(苯丁酸氮芥)；氯去氧腺苷(2-CDA，克拉利宾，leustatin)；顺氯氨铂(顺铂)；阿糖胞苷(赛德萨)；甲嗪咪唑胺(DTIC)；更生霉素(放线菌素D-D，更新霉素)；道诺霉素(cerubidine)；多西他赛(泰素帝)；亚德里亚霉素(阿霉素)；表阿霉素；雌莫司汀(emcyt)；雌性激素例如：己烯雌酚(DES)；足叶乙甙(VP-16，鬼臼叉甙，依托泊苷)；氟阿糖腺苷(福达华)；氟他米特(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他宾(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；依达比星(去甲氧基柔红霉素)；异环磷酰胺；白介素-2(proleukin，aldesleukin)；干扰素α(intron A，roferon A)；依立替康(伊立替康)；亮丙瑞林(lupron)；左旋四咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；氮芥(mechlorathamine，nitrogen mustard)；美法仑(左旋溶内瘤素)；巯嘌呤(巯基嘌呤，6-MP)；甲氨蝶呤(mexate)；丝裂霉素-C(mutamucin)；米托蒽醌(novantrone)；奥曲肽(善得定)；喷司他丁(2-脱氧咖啡霉素，nipent)；普卡霉素(光神霉素，光辉霉素)；甲基苄肼(matulane)；链氮霉素；三苯氧胺(诺瓦得士)；紫杉醇(paclitaxel)；替尼泊甙(vumon，VM-26)；塞替派；拓扑替康(hycamtin)；维甲酸(vesanoid，全反式维A酸)；长春碱(valban)；长春新碱(oncovin)和长春瑞滨(去甲长春碱)构成的组中选择。适宜的是，所述治疗包括给予进一步的化学治疗性药物，该化学治疗性药物是从紫杉烷类药物例如红豆杉醇、紫杉醇和多西他赛中选择的。

另外来讲，发明进一步针对治疗癌症的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者这里所述的化合物或者这里所述的结合物，或者这里所述的药物组合物，并进一步包括给予进一步的化学治疗性药物。所述进一步使用可以是这样的，即，进一步的化学治疗性药物连接到发明的化合物上去，包含在药物组合物中，或者以单独配方使用。

在另一种实施方式中，本发明的组合物可以包含一种或者多种针对第一核酸(first nucleic acid)的反义化合物，特别是寡聚核苷酸，和一种或者多种附加的针对第二核酸(second nucleic acid)的反义化合物。两个或者多个联合的化合物可以一起使用或者相继使用。

在一种优选的实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括(a)一种或者多种反义化合物；和(b)一种或者多种化学治疗性药物，其稳定微管或抑制微管动力学而阻止在姐妹染色质着丝点上形成张力。这种化学治疗性药物包括紫杉烷类，尤其是红豆杉醇、紫杉醇和多西他赛。当与本发明的化合物一起使用时，该化学治疗性药物应该在首先使用寡聚核苷酸治疗一段时间紧接着使用，该寡聚核苷酸通过降低肿瘤细胞和肿瘤血管中增殖的内皮细胞生存素蛋白的水平，使靶标细胞对接下来的化学治疗性药物的共同治疗变得敏感。

在一种优选的实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括(a)一种或者多种反义化合物，和(b)放射治疗药物。当与本发明的化合物一起使用时，放射药物应当在首先使用寡聚核苷酸治疗一段时间后紧接着使用，该寡聚核苷酸通过降低肿瘤细胞和肿瘤血管中增殖的内皮细胞生存素蛋白的水平，使靶标细胞对接下来的放射药物变得敏感。

给药剂量依赖于疾病状态的严重程度和反应来定，并且，疗程从几天到几个月不等，或者直至痊愈，或者疾病状态减轻。优选的给药方案可以通过测量药物在患者体内的累积来计算。优选的给药剂量根据单独寡聚核苷酸的相对效力而定。通常，可以基于体内和体外动物模型中有效的EC50s值来确定。通常，每公斤体重的剂量是从0.01μg-1g，可以一次或多次每天、每周、每月、或者每年，或者甚至每2-10年一次或者持续几小时到几个月的连续灌输。用药的重复率可以基于测量在体液或者组织中残留的时间和浓度来计算。在治疗成功后，继续保持治疗以防止疾病的复发是值得的。

本发明的包含LNA的寡聚化合物也可以用作诊断、治疗和预防的研究试剂。在研究中，反义寡聚核苷酸可以用来特异地抑制生存素基因在细胞和实验动物体内的合成，进而辅助靶标功能的分析或者评估其作为治疗干扰的靶标的有用性。在诊断中，反义寡聚核苷酸用来检测和定量生存素在细胞和组织中的表达，采用RNA印迹、原位杂交或者相似的技术进行。就治疗而言，对被怀疑患有可以通过调控生存素表达得到治疗的疾病或者状况紊乱的动物或者人，通过给予本发明的反义化合物进行治疗。进一步提供了治疗被怀疑患病或者有患病倾向的动物特别是小鼠和大鼠和治疗人的方法，该疾病与生存素表达相关，是通过给予治疗上或预防上有效量的本发明的一种或多种反义化合物或组合物进行治疗。

本发明进一步的方面是针对阻止或者限制凋亡的方法，其包括给予这里所述化合物、这里所述的结合物或者这里所述的药物组合物。对凋亡的阻止可以是体外或者体内的。该阻止也可以在细胞分析或者在组织样品或者在活体哺乳动物内进行。

本发明一个相关方面是针对阻止细胞增殖的方法，其包括给予这里所述化合物，这里所述的结合物或者这里所述的药物组合物。对增殖的阻止可以是体外或者体内的。该阻止也可以在细胞分析或者在组织样品或者在活体哺乳动物内进行。

发明将以非限制性方式通过下面的实施例进行进一步描述。

实施例1：单体合成

根据下列发表的步骤和此处引用的参考文献，构建LNA单体模块及其衍生物，参看：

●WO 03/095467A1；

●D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparation of LNAPhosphoramidites，Synthesis 6，802-808；

●M.D.Sφensen，L.Kvaernφ，T.Bryid，A.E.Hakansson，B.Verbeure，G.Gaubert，P.Herdewijn，J.Wengel(2002)α-L-ribo-configured LockedNucleic Acid(o-l-LNA)：Synthesis and Properties，J.Am.Chem.Soc.，124，2164-2176；

●S.K.Singh，R.Kumar，J.Wengel(1998)Synthesis ofNovel Bicyclo[2.2.1]Ribonucleosides：2′-Amino-and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides，J.Org.Chem.1998，63，6078-6079；

●C.Rosenbohm，S.M.Christensen，M.D.Srensen，D.S.Pedersen，L.E.Larsen，J.Wengel，T.Koch(2003)Synthesis of 2′-amino-LNA：a newstrategy，Org.Biomol.Chem.1，655-663。

合成2’-硫代-LNA核糖胸腺苷磷酰亚胺。试剂和条件：

i)Pd/C、氢气、丙酮、甲醇；ii)苯甲酰氯(BzCl)、嘧啶、二甲基甲酰胺(DMF)；iii)0.25M硫酸(水)、DMF，80℃(79％从4开始；3步)；iv)Tf₂O，DMAP，CH₂Cl₂，0℃；v)Na₂S，DMF(72％从7开始；2步)；vi)NaOBz，DMF，100℃(81％)；vii)NH₃，甲醇(76％)；viii)DMT-Cl，嘧啶(88％)；ix)P(OCH₂CH₂CN)(N(′Pr)₂)₂，4，5-二氰基咪唑，CH₂Cl₂(99％)。DMT＝4，4′-二甲氧三苯甲基、PN₂＝2-氰乙氧基(二异丙基氨)磷酸基(phosphinoyl)

1-(3-O-苯甲酰-5-O-甲烷磺酰-4-C-甲烷磺酰氧基甲基-β-D-苏型-戊呋喃)胸腺嘧啶(1-(3-O-Benzoyl-5-O-methanesulfonyl-4-C-methanesulfonyloxymethyl-β-D-threo-pentofuranosyl)thymine(7，图4)

将脱水核苷4(C.Rosenbohm，S.M.Christensen，M.D.Srensen，D.S.Pedersen，L.E.Larsen，J.Wengel，T.Koch(2003)Synthesis of 2′-amino-LNA：anew strategy，Org.Biomol.Chem.1，655-663)(30.0g，58.1mmol)在甲醇(1000cm³)和丙酮(1000cm³)的混合物中加热到70℃，直到溶液变得澄清，而后将其冷却到室温。用氩气冲洗反应瓶后加入Pd/C(钯为碳的10重量％，6.2g，5.8mmol)。在氢气环境(球形大烧瓶，balloon)下剧烈摇晃混合物。23小时后，将浆液用一层硅藻土过滤。催化剂可以从硅藻土中回收并在DMF(1000cm³)中回流1小时。热的DMF浆液用一层硅藻土过滤，结合上的有机层在真空中挥发，得到了黄色粉末核苷5。残余的溶剂在高真空泵中过夜除掉。

核苷5粗产品(23g)在DMF中加热到70℃(300cm³)以得到澄清黄色溶液，而后将其冷却到室温。在加入苯甲酰氯(81.7g，581mmol，67.4cm³)后加入嘧啶(70cm³)。反应18小时后，用甲醇(200cm³)停止反应。并在真空中除去过量甲醇。加入含水的硫酸溶液(0.25M，400cm3)得到深棕色核苷溶液6。在油浴中将溶液加热到80℃(在大约50℃时出现沉淀，在80℃时溶液重新变清)。置于80℃22小时后，将溶液冷却到室温。将反应混合物用乙酸乙酯(1000cm³)转移到分液漏斗。有机层用饱和NaHCO₃的饱和水溶液(2×1000cm³)清洗。收集的水层用乙酸乙酯(1000+500cm³)抽提。收集有机层，并用饱和NaHCO₃的饱和水溶液1000cm³)清洗、干燥(Na₂SO₄)、过滤并在真空中蒸发而得到黄色固体。残余的溶剂在高真空泵中过夜去除，得到黄色浆液。产物用干柱真空色谱法纯化(内径10cm；馏分100cm³；浓度为50-100％乙酸乙酯的正庚烷溶液(体积比)-10％增量；2-24％甲醇的乙酸乙酯溶液(体积比)-2％增量)。收集包含产物的馏分，并在真空中蒸发而得到核苷7(25.1g，79％)的白色泡沫。

R_f＝0.54(5％甲醇的乙酸乙酯溶液(体积比))；

ESI-MSm/z实验值549.0([MH]⁺，计算值549.1)；

¹H NMR(DMSO-d6)δ11.39(br s，1H，NH)，8.10-8.08(m，2H，Ph)，7.74-7.70(m，1H，Ph)，7.60-7.56(m，2H，Ph)，7.51(d，J＝1.1Hz，1H，H6)，6.35(d，J＝4.9Hz，1H，H1’)，6.32(d，J＝5.3Hz，1H，2’-OH)，5.61(d，J＝4.0Hz，1H，H3′)，4.69(d，J＝10.8Hz，1H)，4.59(m，1H，H2′)，4.55(d，J＝10.8Hz，1H)，4.52(d，J＝10.8Hz，1H)，4.46(d，J＝10.6Hz，1H)(H5′和H1″)，3.28(s，3H，Ms)，3.23(s，3H，Ms)，1.81(s，3H，CH₃)；

¹³CNMR(DMSO-d6)δ164.5，163.6(C4，Ph C(O))，150.3(C2)，137.7(C6)，133.8，129.6，128.7，128.6(Ph)，108.1(C5)，84.8(C1′)，81.1(C4′)，78.0(C3′)，73.2(C2′)，68.0，67.1(C5′，C1″)，36.7，36.6(2×Ms)，11.9(CH₃)；

元素分析计算值：C₂₀H₂₄N₂O₁₂S₂·0.33H₂O(％)：C，44.34；H，4.65；N，4.85.

实验值：C，44.32；H，4.58；N，4.77。

(1R，3R，4R，7R)-7-苯酰氧基-1-甲烷磺酰氧基甲基-3-(胸腺激素-1-酰)-2-氧杂-5-硫杂双环[2∶2∶1]庚烷(9)

1-(3-O-苯甲酰-5-O-甲烷磺酰-4-C-甲烷磺酰氧基甲基-β-D-苏型-戊呋喃)胸腺嘧啶(7)(10.00g，18.23mmol)溶解在二氯甲烷(500cm³)中，并冷却到0℃。加入嘧啶(15cm³)和DMAP(8.91g，72.9mmol)后，逐滴地加入三氟甲烷磺酸酐(10.30g，36.5mmol，6.0cm³)。1小时后，用饱和NaHCO₃水溶液(800cm³)停止反应并转移到一个分液漏斗。有机层用0.1M HCl的水溶液(500cm³)、饱和NaHCO₃水溶液(500cm³)和盐水(500cm³)清洗。有机层在真空中用甲苯(100cm³)干燥，得到一种黄色粉末1-(3-O-苯甲酰-5-O-甲烷磺酰-4-C-甲烷磺酰氧基甲基-2-O-三氟甲烷磺酰-β-D-苏型-戊呋喃)胸腺嘧啶(8)。

核苷8粗产品溶解在DMF(250cm³)中，加入Na₂S(1.57g，20.1mmol)而得到深绿色浆液。3小时后，用半饱和的NaHCO₃水溶液(500cm³)停止反应，并用二氯甲烷(500+2×250cm³)抽提。收集有机层，并用盐水(500cm³)清洗、干燥(Na₂SO₄)、过滤并在真空中浓缩而得到黄色固体。残余的溶剂在高真空泵中过夜去除，得到黄色胶浆。产物用干柱真空色谱法纯化(内径6cm；馏分50cm³；浓度为50-100％乙酸乙酯的正庚烷溶液(体积比)-10％增量；2-20％甲醇的乙酸乙酯溶液(体积比)-2％的增量)而得到核苷9(6.15g，72％)的黄色泡沫。

Rf＝0.27(20％庚烷的乙酸乙酯(体积比))；

ESI-MSm/z实验值469.0([MH]⁺，计算值469.1)；

¹H NMR(CDCl₃)δ8.70(br s，1H，NH)，8.01-7.99(m，2H，Ph)，7.67(d，J＝1.1Hz，1H，H6)，7.65-7.61(m，1H，Ph)，7.50-7.46(m，2H，Ph)，5.98(s，1H，H1′)，5.34(d，J＝2.4Hz，1H，H3′)，4.66(d，J＝11.7Hz，1H，H5′a)，4.53(d，J＝11.5Hz，1H，H5′b)，4.12(m(用残留的乙酸乙酯重叠)，1H，H2′)，3.15-3.13(m，4H，H1″a和Ms)，3.06(d，J＝10.6Hz，1H，H1″b)，1.98(d，J＝1.1Hz，3H，CH₃)；

¹³CNMR(CDCl₃)δ165.2，163.5(C4，PhC(O))，149.9(C2)，134.1，133.9，129.8，128.7，128.3(C6，Ph)，110.7(C5)，91.1(C1′)，86.8(C4′)，72.6(C3′)，65.8(C5′)，50.5(C2′)，37.9(Ms)，35.1(C1″)，12.5(CH₃)；

元素分析计算值：C₁₉H₂₀N₂O₈S₂·0.33EtOAC(％)：C，49.21；H，4.72；N，5.47。

实验值：C，49.25；H，4.64；N，5.48。

(1R，3R，4R，7R)-7-苯酰氧基-1-苯甲酰氧基甲基-1-3-(胸腺激素-1-基)-2-氧杂-5-硫杂双环[2∶2∶1]庚烷(10)

核苷(9)(1.92g，4.1mmol)溶解在DMF(110cm³)中，加入安息香酸钠(1.2g，8.2mmol)，再将混合物中加热到100℃，保持24小时。反应混合物用半饱和盐溶液(200cm³)转移到一个分液漏斗，并用乙酸乙酯抽提(3×100cm³)。收集有机层，干燥(Na₂SO₄)、过滤并在真空中浓缩而得到一种棕色液体。产物在高真空泵中将残余的溶剂过夜去除，得到的黄色胶浆，再将该黄色胶浆用干柱真空色谱法纯化(内径4cm；馏分50cm³；浓度为0-100％乙酸乙酯的正庚烷溶液(体积比)-10％增量；2-10％甲醇的乙酸乙酯溶液(体积比)-2％的增量)而得到核苷10(1.64g，81％)的淡黄色泡沫。

Rf＝0.57(20％庚烷的乙酸乙酯(体积比))；

ESI-MS m/z实验值495.1([MH]⁺，计算值495.1)；

¹H NMR(CDCl₃)δ9.02(br s，1H，NH)，8.07-7.99(m，4H，Ph)，7.62-7.58(m，2H，Ph)，7.47-7.42(m，5H，Ph和H6)，5.95(s，1H，H1′)，5.46(d，J＝2.2Hz，1H，H3′)，4.93(d，J＝12.8Hz，1H，H5′a)，4.60(d，J＝12.8Hz，1H，H5′b)，4.17(d，J＝2.2Hz，1H，H2′)，3.27(d，J＝10.6Hz，1H，H1″a)，3.16(d，J＝10.6Hz，1H，H1″b)，1.55(d，J＝1.1Hz，3H，CH₃)；

¹³C NMR(CDCl3)δ165.8，165.1，163.7(C4，2×PhC(O))，150.0(C2)，133.9，133.7，133.6，129.8，129.6，129.0，128.8，128.6，128.5(C6，2×Ph)，110.3(C5)，91.3(C1′)，87.5(C4′)，72.9(C3′)，61.3(C5′)，50.6(C2′)，35.6(C1″)，12.3(CH₃)；

元素分析计算值：C₂₅H₂₂N₂O₇S(％)：C，60.72；H，4.48；N，5.66。

实验值：C，60.34；H，4.49；N，5.35。

(1R，3R，4R，7R)-7-羟基-1-羟甲基-3-(胸腺激素-1-基)-2-氧杂-5-氮杂双环[2∶2∶1]庚烷(11)

核苷(10)(1.5g，3.0mmol)溶解在用氨水饱和的甲醇溶液中(50cm³)中。反应瓶封口并在周围温度下摇晃20小时。反应混合物在真空中浓缩而得到一种黄色胶浆，接下来用干柱真空色谱法纯化(内径4cm；馏分50cm³；浓度为0-16％甲醇的乙酸乙酯溶液(体积比)-1％的增量)而得到核苷11(0.65g，76％)的澄清的针状物。

R_f＝0.31(10％甲醇的乙酸乙酯溶液(体积比))；

ESI-MS m/z实验值287.1([MH]⁺，计算值287.1)；

¹H NMR(DMSO-d6)δ11.32(br s，1H，NH)，7.96(d，J＝1.1Hz，1H，H6)，5.95(s，1H，H6)，5.70(d，J＝4.2Hz，1H，3′-OH)，5.62(s，1H，H1′)，4.49(t，J＝5.3Hz，1H，5′-OH)，4.20(dd，J＝4.1和2.1Hz，1H，H3′)，3.77-3.67(m，2H，H5′)，3.42(d，J＝2.0Hz，1H，H2′)，2.83(d，J＝10.1Hz，1H，H1″a)，2.64(d，J＝10.1Hz，1H，H1″b)，1.75(d，J＝1.1Hz，3H，CH₃)；

¹³C NMR(DMSO-d6)δ163.8(C4)，150.0(C2)，135.3(C6)，107.5(C5)，90.2，89.6(C1′and C4′)，69.4(C3′)，58.0(C5′)，52.1(C2′)，34.6(C1″)，12.4(CH₃)。

元素分析计算值：C₁₁H₁₄N₂O₅S(％)：C，46.15；H，4.93；N，9.78。

实验值：C，46.35；H，4.91；N，9.54。

(1R，3R，4R，7R)-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-7-羟基-5-甲基3-(胸腺激素-1-基)-2-氧杂-5-硫杂双环[2∶2∶1]庚烷(12)

核苷11(0.60g，2.1mmol)溶解在嘧啶溶液中(10cm³)中。加入4，4’-二甲氧三苯甲基氯化物(0.88g，2.6mmol)，在周围温度下摇晃反应3小时。反应混合物用水(100cm³)转移到一个分液漏斗，并用乙酸乙酯(1000+2×50cm³)抽提。收集有机层，并用NaHCO₃的饱和水溶液(100cm³)、盐水(100cm³)清洗，然后在真空下蒸发干燥而得到粘性黄色液体。将产物重新溶解在甲苯(50cm³)中，并在真空中浓缩而得到黄色泡沫。用干柱真空色谱法过夜纯化(内径4cm；馏分50cm³；浓度为10-100％乙酸乙酯的庚烷溶液(体积比)-10％的增量)而得到核苷12(1.08g，88％)的白色泡沫。

R_f＝0.24((20％正庚烷的乙酸乙酯(体积比)))；

ESI-MS m/z实验值587.1([MH]⁺，计算值587.2)；

¹H NMR(CDCl₃)δ8.96(br s，1H，NH)，7.74(d，J＝1.1Hz，1H，H6)，7.46-7.44(m，2H，Ph)，7.35-7.22(m，9H，Ph)，7.19-7.15(m，2H，Ph)，6.86-6.80(m，2H，Ph)，5.82(s，1H，H1′)，4.55(dd，J＝9.3and 2.1Hz，1H，H3′)，3.79(s，6H，OCH3)，3.71(d，J＝2.0Hz，1H，H2′)，3.50(s，2H，H5′)，2.81(d，J＝10.8Hz，1H，H1″a)，2.77(d，J＝10.8Hz，1H，H1″b)，2.69(d，J＝9.2Hz，1H，3′-OH)，1.42(s，3H，CH₃)；

¹³C NMR(CDCl)δ158.7(C4)，150.1(C2)，144.1，135.2，135.1，130.1，129.1，128.1，128.0，127.1，127.0，113.3(C6，3×Ph)，110.0(C5)，90.2(C(Ph)₃)，89.6(C1′)，87.0(C4′)，71.7(C3′)，60.9(C5′)，55.2(C2′)，34.7(C1″)，12.2(CH₃)。

元素分析计算值：C₃₂H₃₂N₂O₇S·0.5H₂O(％)：C，64.31；H，5.57；N，4.69。

实验值：C，64.22；H，5.67；N，4.47。

(1R，3R，4R，7R)-7-(2-氰乙氧基(二异丙基氨基)氧膦基)-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺激素-1-基)-2-氧杂-5-硫杂双环[2∶2∶1]庚烷(13)

根据发表的方法(D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)PreparationofLNA Phosphoramidites，Synthesis，6，802-808)，将核苷12(0.78g，1.33mmol)溶解在二氯甲烷溶液(5cm³)中，加入1.0M的4，5-二氰基咪唑的乙腈溶液(0.93m³，0.93mmol)后逐滴加入2-氰乙基-N，N，N’，N′-四异丙基磷酰二亚氨(0.44cm³，1.33mmol)。2小时后，反应物用二氯甲烷(40cm³)转移到分液漏斗中，并用NaHCO₃的饱和水溶液(2×25cm³)、盐水(25cm³)清洗。将有机层干燥(Na₂SO₄)、过滤并在真空中蒸发而得到白色泡沫核苷13(1.04g，99％)。R_f＝0.29和0.37-两个非对映异构体(20％正庚烷的乙酸乙酯(体积比))；ESI-MSm/z实验值789.3([MH]⁺，计算值789.3)；³¹P NMR(DMSO-d6)δ150.39，150.26。

实施例2合成寡聚核苷酸

寡聚核苷酸是利用膦酰亚胺方法在Expedite 8900/MOSS合成仪(MultipleOligonucleotide Synthesis System，多步寡聚核苷酸合成系统)上以1或者15μmol合成的。在合成的最后(DMT-on)，寡聚核苷酸从固态支持物通过使用氨水在室温下剪切1小时，并在65℃去保护3个小时。寡聚核苷酸通过反向HPLC(RP-HPLC)来提纯。去掉DMT基团后，寡聚核苷酸通过IE-HPLC或者RP-HPLC来辨别。寡聚核苷酸的身份通过ESI-MS来鉴定。下面将详细介绍。

制备LNA琥珀酰半酯

将5′-O-Dmt-3′-羟基的-LNA单体(500mg)、琥珀酸酐(1.2当量)和二甲氨基吡啶(1.2当量)溶解在DCM(35mL)中。反应在室温下摇晃进行过夜。用NaH₂PO₄0.1M、pH5.5(2×)和盐水(1×)抽提后，有机层后进一步用无水Na₂SO₄干燥、过滤和蒸发。半酯衍生物以95％的产率获得并可以使用而不需要进一步的纯化。

制备LNA-支持物

将前面制备的半酯衍生物(90μmol)溶解在最少量的DMF、DIEA和pyBOP(90μmol)中，并混合在一起1分钟。这种前活化混合物与LCAA-CPG(500，80-120目大小，300mg)在一种人工合成仪内结合并摇晃。在室温下15小时后，过滤除去支持物并用DMF、DCM和甲醇清洗。干燥后和确定上样量为57μmol/g(参看Tom Brown，Dorcas J.S.Brown，″Modern machine-aidedmethods of oligodeoxyribonucleotide synthesis″，F.Eckstein，editor.Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach.Oxford：IRL Press，1991：13-14)。

寡聚核苷酸的延长

0.1M的5′-O-DMT-保护的酰亚胺的乙腈溶液中，以DCI(4，，5-二氰基咪唑)的(0.25M)乙腈溶液作为催化剂，进行磷酰亚胺(A(bz)、G(ibu)、5-甲基-C(bz))或者T-(β-氰乙基-磷酰亚胺)的结合反应。硫代反应是通过使用氯化黄原胶(xanthane chloride)(0.01M在乙腈：嘧啶为10％的溶液中)进行。其它的试剂是典型地使用在寡聚核苷酸合成中的试剂。

通过RP-HPLC纯化：

柱子：XTerra，RP18，5μm，7.8×50mm柱；

洗脱液：洗脱液A：0.1M NH₄OAc，pH：10；

洗脱液B：乙腈

流速：5ml/min；

梯度：

时间(分钟)	洗脱液A	洗脱液B
时间(分钟)	洗脱液A	洗脱液B	0.05分钟	95％	5％
5分钟	95％	5％	0.05分钟	95％	5％
5分钟	95％	5％	12分钟	65％	35％
16分钟	0％	100％	12分钟	65％	35％
16分钟	0％	100％	19分钟	0％	100％
21分钟	100％	0％	19分钟	0％	100％

用IE-HPLC分析：

柱子：Dionex，DNAPac PA-100，2×250mm柱；

洗脱液：洗脱液A：20mM Tris-HCI，pH 7.6；1mM EDTA；10mM NaClO4

洗脱液B：20mM Tris-HCI，pH 7.6；1mM EDTA；1M NaClO4

流速：0.25ml/min；

梯度：

时间(分钟)	洗脱液A	洗脱液B
时间(分钟)	洗脱液A	洗脱液B	1分钟	95％	5％
10分钟	65％	35％	1分钟	95％	5％
10分钟	65％	35％	11分钟	0％	100％
15分钟	0％	100％	11分钟	0％	100％
15分钟	0％	100％	16分钟	95％	5％
21分钟	95％	5％	16分钟	95％	5％

缩写

DMT：二甲氧三苯甲基

DCI：4，5-二氰基咪唑

DMAP：4-二甲氨基吡啶

DCM：二氯甲烷

DMF：二甲基甲酰胺

THF：四氢呋喃

DIEA：N，N-二异丙基乙胺

PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基磷-六氟磷酸酯

Bz：苯甲酰基

Ibu：异丁酰

实施例3：对设计的寡聚化合物的检测

我们的兴趣是评价寡聚核苷酸不同设计的反义活性，以证明选择靶向生存素的核苷酸的最好设计的重要性。为了这个目的，我们设计了一种体外分析方法，通过检测用反义寡聚核苷酸下调后的萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶的活性，使我们可以筛选不同的寡聚核苷酸设计。图1包含了大多数本文提到的设计的说明。在最初的筛选中，对包含有β-D-氧-LNA的设计进行了评估，它们都是针对被检测的mRNA内的模体。检测了由具有不同的间隙大小、不同数目的硫代磷酸核苷间连接以及不同数目的LNA构成的间聚物的设计。制备了具有不同数目的β-D-氧-LNA、不同数目的硫代磷酸核苷间连接、不同数目的DNA的头聚物和间聚物。多种组分的混聚物是指携带可变数目的β-D-氧-LNA、α-L-LNA和DNA，也在体外进行分析。而且，LNA衍生物也已经被包含在不同的设计中，同时它们的反义活性也被检测。一种好的设计的重要性可以通过在一种荧光素酶活性实验中得到的数据反映。荧光素酶表达水平用％表示，并为包含β-D-氧-LNA和LNA衍生物的不同的设计提供了一种反义活性的指示。我们可以容易的看出，有些设计是强效的反义寡聚核苷酸，而其它则只是很温和地下调表达水平。因此，一种好的反义活性和优选的寡聚核苷酸的设计之间的紧密相关是明显的。我们重视具有高水平下调的各种设计。具有7-10个DNA间隙的间聚物和全部硫化遍布骨架或仅在间隙发生硫化，并且PO位于侧翼的间聚物表现出好的结果。这些设计包含β-D-氧-LNA和LNA衍生物。具有6个和8个β-D-氧-LNA的头聚物也具有很好的下调水平。各种可变数目的β-D-氧-LNA、α-L-LNA和DNA，组成了混聚物，参见图1。混聚物3-9-3-1在3’末端含有脱氧核苷酸残基，表现出显著的下调水平。在混聚物4-1-1-5-1-1-3中，我们在β-D-氧-LNA的侧翼设置了两个α-L-LNA残基来破坏间隙。进一步，我们用两个α-L-LNA残基破坏间隙，并用α-L-LNA将两侧翼取代。这两种设计都表现出显著的下调水平。α-L-LNA可能通过嵌入到脱氧核苷酸残基内，而在North-锚定侧翼(North-lockedflanks)(氧-LNA)和α-L-氧-LNA残基之间引入柔韧的过渡。同样感兴趣的是研究设计4-3-1-3-5，其中α-L-氧-LNA残基打断了DNA链。除了位于间隙的α-L-氧-LNA外，我们还用两个α-L-氧-LNA取代了侧翼边缘的两个氧-LNA残基。仅仅一个β-D-氧-LNA(4-3-1-3-5设计)在间隙破坏DNA链，就导致了下调的显著缺失。若只是通过使用α-L-LNA的话，则设计表现出在50nM的寡聚核苷酸浓度下有显著的下调。将α-L-LNA设置在连接处和将一个α-L-LNA设置在间隙的中间也能够表现出下调。α-L-LNA是一种构建具有高水平反义活性的不同的混聚物的有利工具。也可以制备其它混聚物例如4-1-5-1-5和3-3-3-3-1。我们可以容易的看出一些设计是强效的反义寡聚核苷酸，而其它则只是很温和地下调表达水平。因此，寡聚核苷酸的优良的反义活性和优选的设计之间的紧密相关再次就非常明显了。其他优选的设计是(1-3-8-3-1)，其中DNA残基是位于侧翼，3个β-D-氧-LNA单体位于间隙的每一侧。进一步的优选设计是(4-9-3-1)，其具有D-氧-LNA侧翼和9个间隙，并且DNA在3’末端。

分析报告：

使用一种稳定转染了“四环素-关闭”系统的X1/5Hela细胞株(ECACC Ref.No：95051229)。在四环素缺失的情况下，荧光素酶结构性表达。加入荧光素酶的底物萤光素，可以测量荧光测定仪中的光强来表示表达水平。X1/5Hela细胞株在补充有1×非必需氨基酸(Sigma M7145)、1×Glutamax I(Invitrogen35050-038)、10％胎牛血清，25μg/m庆大霉素(Sigma G1397)，500μg/ml G418(Invitrogen 10131-027)和300μg/ml潮霉素B(Invitrogen 10687-010)的Minimun Essential Medium Eagle(Sigma M2279)培养基中培养。X1/5Hela细胞在转染的前一天，以每孔8000个细胞接种到白色96孔板(Nunc 136101)。在转染前，细胞用OptiMEM(Invitrogen)洗一遍，接着加入含有2μg/mlLipofectamine 2000(Invitrogen)OptiMEM 40μl。在加入寡聚核苷酸之前，孵育细胞7分钟。加入10μl寡聚核苷酸溶液后，于37℃和5％CO₂下培养细胞4个小时。培养4小时以后，细胞用OptiMEM清洗并加入培养液(100μl)。第二天检测荧光素酶的表达。荧光素酶的表达用Promega公司的Steady-Glo荧光素酶检测系统进行检测.每孔加入100μl Steady-Glo试剂后，将96孔板以700rpm震动30秒。在8分钟孵育完全裂解细胞后，用ThermoLabsystems公司的LuminoskanAscent仪器读取96孔板。荧光素酶表达表示为每秒的相对光单位(RLU/s)。用Ascent software(v2.6)来处理数据，图标用SigmaPlot2001绘制。

实施例4：体外模型：细胞培养

反义化合物对靶标核酸表达的作用，可以在任何具有可测量水平的靶标核酸的多种细胞类型中测试。靶标可以通过内源表达也可以通过瞬时或者稳定转染编码所述核酸的核酸来表达。

靶标核酸的表达水平可以例如通过RNA印迹分析、实时PCR、核酸酶保护测试来常规确定。提供下面的细胞种类是用于阐述目的，而其他细胞种类只要是靶基因在所选择的细胞类型中表达，就可以常规使用。

细胞培养在如下面所述的合适的培养基中，维持在37℃，95-98的湿度和5％的CO₂环境中。细胞每周传代2-3次。

15PC3：人类前列腺癌细胞株15PC3由F.Baas博士，NeurozintuigenLaboratory，AMC，The Netherlands and馈赠，培养在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+庆大霉素(gentamicin)；

A549：人非小肺癌细胞株A549从ATCC购买，培养在DMEM(Sigma)+10％FB S+Glutamax I+gentamicin；

MCF7：人乳癌细胞株MCF7从ATCC购买，培养在Eagle MEM(Sigma)+10％FBS+Glutamax I+gentamicin；

SW480：人结肠癌细胞株SW480从ATCC购买，培养在L-15Leibovitz(Sigma)+10％FBS+Glutamax I+gentamicin；

SW620：人结肠癌细胞株SW620从ATCC购买，培养在L-15Leibovitz(Sigma)+10％FBS+Glutamax I+gentamicin；

HT29：人前列腺癌细胞株HT29从ATCC购买，培养在McCoy′s 5a MM(Sigma)+10％FBS+Glutamax I+gentamicin；

NCI H23：人非小肺癌细胞株从ATCC购买，培养在RPMI 1640+Glutamax I(Gibco)+10％FB S+HEPES+gentamicin；

HCT-116：人结肠癌细胞株从ATCC购买，培养在McCoy′s 5a MM+10％FBS+Glutamax I+gentamicin；

MDA-MB-231：人乳癌细胞株MDA-MB-231从ATCC购买，培养在L-15Leibovitz+10％FBS+Glutamax I+gentamicin；

MDA-MB-435s：人乳癌细胞株MDA-MB-435s从ATCC购买，培养在L-15Leibovitz+10％FBS+Glutamax I+gentamicin；

DMS273：人非小肺癌细胞株DMS273从ATCC购买，培养在+10％FBS+Glutamax+gentamicin；

PC3：人前列腺癌细胞株PC3从ATCC购买，培养在F12Coon′s withglutamin(Gibco)+10％FB S+gentamicin；

U373：人成神经胶质星状细胞瘤细细胞株U373从ECACC购买，培养在EMEM+10％FBS+glutamax+NEAA+sodiumpyrovate+gentamicin；

HeLa Sur-GFP：Wheately，S.P.et al，Curr.Biol.11446-490，2001；

HUVEC-C：人脐静脉血管内皮细胞从ATCC购买，根据其手册的指导进行繁殖；

HMVEC-d(DMVEC皮肤微血管内皮细胞)从Clonetics购买，根据其手册的指导进行培养；

HMVEC：皮肤微血管内皮细胞从Clonetics购买，根据其手册的指导进行培养；

人胚胎肺成纤维细胞：从ATCC购买并根据其手册的指导进行培养；

HMEC-1：人乳房上皮细胞从从Clonetics购买，根据其手册的指导进行培养。

实施例5：体外模型：用反义寡聚核苷酸治疗

以阳离子脂质体配方LipofectAMINE 2000(Gibco)作为转染试剂，用寡聚核苷酸处理细胞。

细胞接种到12孔细胞培养板(NUNC)，并在长满80-90％的时候处理。使用的寡聚物的浓度从125nM-0.2nM。寡聚物-脂类复合体的配方基本上依照Dean等人(Journal ofBiological Chemistry 1994，269，16416-16424)描述的方法进行，使用不含血清的OptiMEM(Gibco)，并且脂类的最终浓度为10μg/mlLipofectAMINE 2000，总体积为500μl。

细胞在37℃培养4小时并通过移走含有寡聚物的细胞培养液来停止处理。将细胞清洗以后加入含有血清的培养基。寡聚物处理细胞以后，再培养18小时，收集细胞进行RNA或者蛋白质分析。

实施例6：体外模型：RNA表达和cDNA合成

提取总RNA

利用RNeasy小试剂盒(Qiagen批号74104)或者使用Trizol(Lifetechnologies批号15596)试剂提取总RNA。对于从细胞株中提取总RNA，RNeasy是优选的方法，对于组织样品，Trizol是优选的方法。

利用Qiagen RNA OPF Robot-BIO Robot 3000根据其使用手册提供的步骤，从细胞株中提取总RNA。

利用Ultra Turrax T8(IKAAnalysen technik)匀浆机将组织样品匀浆，而后利用Trizol试剂根据其手册提供的步骤提取总RNA。

合成第一条链

利用OmniScript Reverse Transcriptase试剂盒(批号205113，Qiagen)根据其使用说明合成第一条链。

对每个样品，用无RNA酶的水将0.5μg总RNA调至12μl，而后与2μl多聚(dT)_12-18(2.5μg/ml)(Life Technologies，GibcoBRL，Roskilde，DK)、2μldNTP混合物(5mM每个dNTP)、2μl 10×Buffer RT，1μl RNAguard^TMRNaseINHIBITOR(33.3U/ml)(批号27-0816-01，Amersham Pharmacia Biotech，Horsholm，DK)以及1μl OmniScript Reverse Transcriptase(4U/μl)混合，接下来在37℃孵育60分钟，再在93℃加热5分钟将酶热失活。

实施例7：体外模型：用实时PCR分析寡聚核苷酸对生存素表达的抑制

生存素的反义调控可以通过本领域已知的方法来进行检测。例如，生存素mRNA水平采用例如RNA印迹分析、竞争PCR或者实时PCR来定量。实时定量PCR是目前优选的方法，可以用于总细胞RNA或者mRNA。

分离RNA和分析RNA的方法例如RNA印迹分析是本领域中常规的技术，例如在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons.中有介绍。

实时定量PCR可以利用商业上的iQ Multi-Color Real Time PCR DetectionSystem(BioRAD提供)方便地完成。

生存素mRNA水平的实时定量PCR分析

mRNA水平的定量是使用iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System(BioRAD)根据使用说明通过实时PCR来确定的。

实时定量PCR是本领域熟知的技术，在Heid等，Real time quantitativePCR，Genome Research(1996)，6：986-994有例子介绍。

Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG 2×PCR master mix是从Invitrogen(批号11730)购买的，引物和TaqMan探针从MWG-Biotech AG，Ebersberg，Germany获得。

人生存素的探针和引物被设计成与一种人生存素序列杂交，使用出版公开的序列信息(基因库保藏号NM 001168，在这里作为SEQ ID NO：1使用)。

人生存素的PCR引物是：

试验1：

正向引物：5′caggtccccgctttctttg 3′(本试验终浓度为0.6μM)

反向引物：5′ggaggagggcgaatcaaa 3′(本试验终浓度为0.6μM)，并且

PCR探针是：5′FAM-ccatcatcttacgccagacttcagcc-TAMRA 3′(本试验终浓度为0.1μM)

试验2：

正向引物：5′aaggaccaccgcatctctaca 3′(本试验终浓度为0.9μM)

反向引物：5′ccaagtctggctcgttctcagt 3′(本试验终浓度为0.6μM)，并且

PCR探针是：5′FAM-cgaggctggcttcatccactgcc-TAMRA 3′(本试验终浓度为0.1μM)

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA数量用来作为一种内源参照，以较正样品制备中的偏差。

人GAPDH mRNA的样品含量可以利用人类GAPDH ABI PrismPre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems批号4310884E)根据其说明书来定量。

为了定量鼠源GAPDH mRNA，设计了下面的引物和探针：

正义引物：5′aaggctgtgggcaaggtcatc 3′(终浓度为0.3μM)，

反义引物：5′gycagatccacgacggacacatt(终浓度为0.6μM)，

TaqMan probe：5′FAM-gaagctcactggcatggcatggccttccgtgttc-TAMRA 3′(终浓度为0.2μM)。

实时PCR

如在实施例6中所描述的将合成的第一条链的cDNA稀释2-20倍后，进行实时定量PCR。引物和探针与2×Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG(批号11730，Invitrogen)混合后，加入到3.3μl cDNA直至总体积为25μl，每个样品设置3个复孔。从表达感兴趣的RNA的细胞中提纯的物质制备的cDNA，将其进行两倍稀释，绘制分析曲线供使用。以灭菌水而不是cDNA作为无模板对照。PCR程序：50℃2分钟，95℃10分钟，其后以95℃15秒、60℃、1分钟的方式循环40次。靶标mRNA序列的相对含量通过使用iCycleriQ Real-time Detection System软件计算达到域值所需要的循环数来确定。

参看图7和表1、2、3、4、5。

实施例8：体外分析：生存素mRNA水平的RNA印迹分析。

RNA印迹分析通过采用如Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons所述本领域基本熟知的步骤来进行。杂交探针通过从1μl通过反转录PCR获得的cDNA进行PCR扩增一段373个碱基的片段而得到。反应使用终浓度均为0.5μM的引物5′agcacaaagccattctaagtcattg3′(正向引物)和5′tccatcatcttacgccagacttc3′(反向引物)、200nM各dNTP，1.5mM MgCl₂和Platinum Taq DNA polymerase(Invitrogen批号：10966-018)来进行。

DNA在Perkin Elmer 9700thermocycler上使用下列程序扩增40个循环：94℃2分钟，接下来是40个循环的94℃30秒、72℃30秒，每个循环降低0.5℃，然后72℃7分钟。

扩增的PCR产物用S-400MicroSpin柱(Amersham Pharmacia Biotech批号27-5140-01)，根据其说明书进行纯化，并用分光光度计定量分析。

杂交的探针用RedivueT[α-³²P]dATP 3000Ci/mmol(Amersham PharmaciaBiotech批号AA 0005)和Prime-It RmT labeling kit(Stratagene批号300392)，根据其手册的介绍进行标记，并使用S-300MicroSpin柱(Amersham PharmaciaBiotech批号27-5130-01)纯化放射标记的探针。

使用之前，探针需要在96℃变性并立即放于冰上。

2μg实施例6中所述的纯化的总RNA样品，用甲醛/3-(N-吗啡啉)乙磺酸(MOPS)琼脂糖凝胶进行变性和大小分离。使用TurboBlotter(Schleicher &Schuell)，通过向下毛细管转移而将RNA转移到带正电荷的尼龙膜上，并使用Stratagene交联剂通过UV交联，将RNA固定到膜上。膜在ExpressHybHybridization Solution(Clontech批号8015-1)中于60℃进行预杂交，随后加入探针进行杂交。杂交在60℃进行，然后用低严紧性清洗缓冲液(2×SSC，0，1％SDS)在室温清洗印迹，并在50℃，用高严紧性清洗缓冲液(1×SSC，0，1％SDS)清洗。

印迹暴露于Kodak储藏磷屏上，进而用BioRAD FX分子成像仪扫描。生存素的mRNA水平用Quantity One软件(BioRAD)进行定量分析。

同样的RNA上样样品通过85℃剥离印迹于0.5％SDS水溶液，并用标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)探针进行再探查，此探针基本根据前面所述的方法，使用引物5′aacggatttggtcgtatt 3′(正向)和5′taagcagttggtggtgca 3′(反向)而得到。参看图2和3。强度用同位素成像仪Biorad，FX-scanne检测(如下)。被检测的化合物在实施例10中有介绍。

通过生存素RNA印迹确定的mRNA下调的百分比

(数据用GAPDH进行了标准化)

化合物(SEQID)	0.2nM	1nM	5nM	25nM
化合物(SEQID)	0.2nM	1nM	5nM	25nM	2A6A9A15A	31％22％21％45％	34％48％44％79％	55％71％67％93％	77％91％64％95％

实施例9：体外分析：生存素蛋白质水平的蛋白质印迹分析

生存素的蛋白质水平可以通过一系列本领域熟知的方法进行定量，例如免疫沉淀、蛋白质印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附分析、放射免疫分析或者荧光活化细胞筛选技术(FACS)。针对生存素的抗体可以被鉴定出并从许多途径得到，例如Upstate Biotechnologies(Lake Placid，USA)，NovusBiologicals(Littleton，Colorado)，Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，Califomia)或者可以用传统制备抗体的方法制备。

蛋白质印迹：

通过蛋白质印迹的方法来确定生存素寡聚物对转染的细胞生存素蛋白质水平的体外作用。

按照实施例5所述的方法转染细胞，大约转染24小时后，收集细胞，在2.5％SDS，5mM DTT和6M urea并添加有混合型蛋白酶抑制剂(Roche)的溶液中裂解。总蛋白浓度利用布拉德福(Bradford)试剂测定。在12％Bis-Tris胶中，上样150μg总蛋白，根据说明书的建议(Invitrogen)在MOPS缓冲液中进行电泳并印迹到PVDF膜。在阻断缓冲液(Invitrogen)中孵育过夜后，将膜与兔抗生存素抗体(R&D的AF886或者Abcam的Novus 500-201)孵育2个小时，接着在二抗中孵育1个小时。可以选择的是，膜可以与辣根过氧化物酶(HRP)结合的兔免疫球蛋白(DAKO)孵育，接着与ECL⁺试剂(Amersham)孵育，并用VersaDoc化学发光检测系统显象(参看图13，被检测的化合物在实施例10中有介绍。)

实施例10体外分析：寡聚化合物对人生存素表达的反义抑制。

根据本发明，利用已经出版公开的序列(基因库保藏号NM 001168，在这里作为SEQ ID NO：1使用)设计了一系列寡聚核苷酸来针对人生存素RNA的不同部位。长度为16个寡聚核苷酸在表1和2中有介绍。“靶标位点”是指寡聚核苷酸结合的特定靶标序列的第一个核苷酸的号。优选的化合物是含有LNA的化合物。表3显示了四种化合物的低IC₅₀值。

表1本发明的寡聚化合物

15PC3细胞内检测寡聚化合物降低生存素mRNA水平的能力。数据以相对于模拟转染细胞的下调百分比来表示。转录稳定状态用实时PCR检测并用GAPDH转录稳定水平进行标准化。注意所有LNA的C都是5’-甲基-胞嘧啶。

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表1，接上页

			10C	T_OG_OG_OT_Og_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sc_sT_OC_OT_OG
			10C	T_OG_OG_OT_Og_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sc_sT_OC_OT_OG						10D	t_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sc_st_sc_st_sg
521	11	GAATAAACCCTGGAAG	11A	G_sA_sA_sT_sa_sa_sa_sc_sc_sc_st_sg_sG_sA_sA_sG	58					10D	t_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sc_st_sc_st_sg
521	11	GAATAAACCCTGGAAG	11A	G_sA_sA_sT_sa_sa_sa_sc_sc_sc_st_sg_sG_sA_sA_sG	58					11B	G_sA_sA_sT_sa_sa_sa_sc_sc_sc_st_sg_sG_sA_sA_sg
			11C	G_OA_OA_OT_Oa_sa_sa_sc_sc_sc_sc_sg_sG_OA_OA_OG						11B	G_sA_sA_sT_sa_sa_sa_sc_sc_sc_st_sg_sG_sA_sA_sg
			11C	G_OA_OA_OT_Oa_sa_sa_sc_sc_sc_sc_sg_sG_OA_OA_OG						11D	g_sa_sa_st_sa_sa_sa_sc_sc_sc_st_sg_sg_sa_sa_sg
531	12	TGGCACCAGGGAATAA	12A	T_sG_sG_sC_sa_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sA_sT_sA_sA	44					11D	g_sa_sa_st_sa_sa_sa_sc_sc_sc_st_sg_sg_sa_sa_sg
531	12	TGGCACCAGGGAATAA	12A	T_sG_sG_sC_sa_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sA_sT_sA_sA	44					12B	T_sG_sG_sC_sa_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sA_sT_sA_sa
			12C	T_OG_OG_OC_Oa_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sA_OT_OA_OA						12B	T_sG_sG_sC_sa_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sA_sT_sA_sa
			12C	T_OG_OG_OC_Oa_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sA_OT_OA_OA						12D	t_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sa_st_sa_sa
566	13	CTAAGACATTGCTAAG	13A	C_sT_sA_sA_sg_sa_sc_sa_st_st_sg_sc_sT_sA_sA_sG	78					12D	t_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sa_st_sa_sa
566	13	CTAAGACATTGCTAAG	13A	C_sT_sA_sA_sg_sa_sc_sa_st_st_sg_sc_sT_sA_sA_sG	78					13B	C_sT_sA_sA_sg_sa_sc_sa_st_st_sg_sc_sT_sA_sA_sg
			13C	C_OT_OA_OA_Og_sa_sc_sa_st_st_sg_sc_sT_OA_OA_OG						13B	C_sT_sA_sA_sg_sa_sc_sa_st_st_sg_sc_sT_sA_sA_sg
			13C	C_OT_OA_OA_Og_sa_sc_sa_st_st_sg_sc_sT_OA_OA_OG						13D	c_st_sa_sa_sg_sa_sc_sa_st_st_sg_sc_st_sa_sa_sg
579	14	TTGATCTCCTTTCCTA	14A	T_sT_sG_sA_st_sc_st_sc_sc_st_st_st_sC_sC_sT_sA	73					13D	c_st_sa_sa_sg_sa_sc_sa_st_st_sg_sc_st_sa_sa_sg
579	14	TTGATCTCCTTTCCTA	14A	T_sT_sG_sA_st_sc_st_sc_sc_st_st_st_sC_sC_sT_sA	73					14B	T_sT_sG_sA_st_sc_st_sc_sc_st_st_st_sC_sC_sT_sa
			14C	T_OT_OG_OA_Ot_sc_st_sc_sc_st_st_st_sC_OC_OT_OA						14B	T_sT_sG_sA_st_sc_st_sc_sc_st_st_st_sC_sC_sT_sa
			14C	T_OT_OG_OA_Ot_sc_st_sc_sc_st_st_st_sC_OC_OT_OA						14D	t_st_sg_sa_st_sc_st_sc_sc_st_st_st_sc_sc_st_sa_s
608	15	GCACAGTTGAAACATC	15A	G_sC_sA_sC_sa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sC_sA_sT_sC	96	93				14D	t_st_sg_sa_st_sc_st_sc_sc_st_st_st_sc_sc_st_sa_s
608	15	GCACAGTTGAAACATC	15A	G_sC_sA_sC_sa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sC_sA_sT_sC	96	93				15B	G_sC_sA_sC_sa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sC_sA_sT_sc	89	79
			15C	C_OC_OA_OC_Oa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sC_OA_OT_OC						15B	G_sC_sA_sC_sa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sC_sA_sT_sc	89	79
			15C	C_OC_OA_OC_Oa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sC_OA_OT_OC						15D	g_sc_sa_sc_sa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sc_sa_st_sc
			15E	G_sC_SA_Sc_sa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sC_sA_sT_sc	83	78				15D	g_sc_sa_sc_sa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sc_sa_st_sc
			15E	G_sC_SA_Sc_sa_sg_st_st_sg_sa_sa_sa_sC_sA_sT_sc	83	78	1	16	GATTCAAATCTGGCGG	16A	G_sA_sT_sT_sc_sa_sa_sa_st_sc_st_sg_sG_sC_sG_sG
			16B	G_sA_sT_sT_sc_sa_sa_sa_st_sc_st_sg_sG_sC_sG_sg			1	16	GATTCAAATCTGGCGG	16A	G_sA_sT_sT_sc_sa_sa_sa_st_sc_st_sg_sG_sC_sG_sG
			16B	G_sA_sT_sT_sc_sa_sa_sa_st_sc_st_sg_sG_sC_sG_sg				16C	G_OA_OT_OT_Oc_sa_sa_sa_st_sc_st_sg_sG_OC_OG_OG
			16D	g_sa_st_st_sc_sa_sa_sa_st_sc_st_sg_sg_sc_sg_sg				16C	G_OA_OT_OT_Oc_sa_sa_sa_st_sc_st_sg_sG_OC_OG_OG
			16D	g_sa_st_st_sc_sa_sa_sa_st_sc_st_sg_sg_sc_sg_sg	17	17	TGCCAACGGGTCCCGC	17A	T_sG_sC_sC_sa_sa_sc_sg_sg_sg_st_sc_sC_sC_sG_sC
			17B	T_sG_sC_sC_sa_sa_sc_sg_sg_sg_st_sc_sC_sC_sG_sc	17	17	TGCCAACGGGTCCCGC	17A	T_sG_sC_sC_sa_sa_sc_sg_sg_sg_st_sc_sC_sC_sG_sC
			17B	T_sG_sC_sC_sa_sa_sc_sg_sg_sg_st_sc_sC_sC_sG_sc				17C	T_OG_OC_OC_Oa_sa_sc_sg_sg_sg_st_sc_sC_OC_OG_OC
			17D	t_sg_sc_sc_sa_sa_sc_sg_sg_sg_st_sc_sc_sc_sg_sc				17C	T_OG_OC_OC_Oa_sa_sc_sg_sg_sg_st_sc_sC_OC_OG_OC
			17D	t_sg_sc_sc_sa_sa_sc_sg_sg_sg_st_sc_sc_sc_sg_sc	33	18	CCGCCGCCGCCACCTC	18A	C_sC_sG_sC_sc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sa_sC_sC_sT_sC

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表1，接上页

18B	C_sC_sG_sC_sc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sa_sC_sC_sT_sc
18B	C_sC_sG_sC_sc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sa_sC_sC_sT_sc				18C	C_OC_OG_OC_Oc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sa_sC_OC_OT_OC
18D	c_sc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sa_sc_sc_st_sc				18C	C_OC_OG_OC_Oc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sa_sC_OC_OT_OC
18D	c_sc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sg_sc_sc_sa_sc_sc_st_sc	49	19	CGTCGGGGCACCCATG	19A	C_sG_sT_sC_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sC_sA_sT_sG
19B	C_sG_sT_sC_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sC_sA_sT_sg	49	19	CGTCGGGGCACCCATG	19A	C_sG_sT_sC_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sC_sA_sT_sG
19B	C_sG_sT_sC_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sC_sA_sT_sg				19C	C_OG_OT_OC_Og_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sC_OA_OT_OG
19D	c_sg_st_sc_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_st_sg				19C	C_OG_OT_OC_Og_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sC_OA_OT_OG
19D	c_sg_st_sc_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_st_sg	65	20	GCCAGGCAGGGGGCAA	20A	G_sC_sC_sA_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sG_sC_sA_sA
20B	G_sC_sC_sA_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sG_sC_sA_sa	65	20	GCCAGGCAGGGGGCAA	20A	G_sC_sC_sA_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sG_sC_sA_sA
20B	G_sC_sC_sA_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sG_sC_sA_sa				20C	G_OC_OC_OA_Og_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sG_OC_OA_OA
20D	g_sc_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sa				20C	G_OC_OC_OA_Og_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sG_OC_OA_OA
20D	g_sc_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sa	81	21	TCCTTGAGAAAGGGCT	21A	T_sC_sC_sT_st_sg_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sG_sG_sC_sT
21B	T_sC_sC_sT_st_sg_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sG_sG_sC_st	81	21	TCCTTGAGAAAGGGCT	21A	T_sC_sC_sT_st_sg_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sG_sG_sC_sT
21B	T_sC_sC_sT_st_sg_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sG_sG_sC_st				21C	T_OC_OC_OT_Ot_sg_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sG_OG_OC_OT
21D	t_sc_sc_st_st_sg_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sg_sg_sc_st				21C	T_OC_OC_OT_Ot_sg_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sG_OG_OC_OT
21D	t_sc_sc_st_st_sg_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sg_sg_sc_st	97	22	TGTAGAGATGCGGTGG	22A	T_sG_sT_sA_sg_sa_sg_sa_st_sg_sc_sg_sG_sT_sG_sG
22B	T_sG_sT_sA_sg_sa_sg_sa_st_sg_sc_sg_sG_sT_sG_sg	97	22	TGTAGAGATGCGGTGG	22A	T_sG_sT_sA_sg_sa_sg_sa_st_sg_sc_sg_sG_sT_sG_sG
22B	T_sG_sT_sA_sg_sa_sg_sa_st_sg_sc_sg_sG_sT_sG_sg				22C	T_OG_OT_OA_Og_sa_sg_sa_st_sg_sc_sg_sG_OT_OG_OG
22D	t_sg_st_sa_sg_sa_sg_sa_st_sg_sc_sg_sg_st_sg_sg				22C	T_OG_OT_OA_Og_sa_sg_sa_st_sg_sc_sg_sG_OT_OG_OG
22D	t_sg_st_sa_sg_sa_sg_sa_st_sg_sc_sg_sg_st_sg_sg	113	23	AGGGCCAGTTCTTGAA	23A	A_sG_sG_sG_sc_sc_sa_sg_st_st_sc_st_sT_sG_sA_sA
23B	A_sG_sG_sG_sc_sc_sa_sg_st_st_sc_st_sT_sG_sA_sa	113	23	AGGGCCAGTTCTTGAA	23A	A_sG_sG_sG_sc_sc_sa_sg_st_st_sc_st_sT_sG_sA_sA
23B	A_sG_sG_sG_sc_sc_sa_sg_st_st_sc_st_sT_sG_sA_sa				23C	A_OG_OG_OG_Oc_sc_sa_sg_st_st_sc_st_sT_OG_OA_OA
23D	a_sg_sg_sg_sc_sc_sa_sg_st_st_sc_st_st_sg_sa_sa				23C	A_OG_OG_OG_Oc_sc_sa_sg_st_st_sc_st_sT_OG_OA_OA
23D	a_sg_sg_sg_sc_sc_sa_sg_st_st_sc_st_st_sg_sa_sa	129	24	GCGCAGCCCTCCAAGA	24A	G_sC_sG_sC_sa_sg_sc_sc_sc_st_sc_sc_sA_sA_sG_sA
24B	G_sC_sG_sC_sa_sg_sc_sc_sc_st_sc_sc_sA_sA_sG_sa	129	24	GCGCAGCCCTCCAAGA	24A	G_sC_sG_sC_sa_sg_sc_sc_sc_st_sc_sc_sA_sA_sG_sA
24B	G_sC_sG_sC_sa_sg_sc_sc_sc_st_sc_sc_sA_sA_sG_sa				24C	G_OC_OG_OC_Oa_sg_sc_sc_sc_st_sc_sc_sA_OA_OG_OA
24D	g_sc_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sc_sc_sa_sa_sg_sa				24C	G_OC_OG_OC_Oa_sg_sc_sc_sc_st_sc_sc_sA_OA_OG_OA
24D	g_sc_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sc_sc_sa_sa_sg_sa	145	25	CCGCTCCGGGGTGCAG	25A	C_sC_sG_sC_st_sc_sc_sg_sg_sg_sg_st_sG_sC_sA_sG
25B	C_sC_sG_sC_st_sc_sc_sg_sg_sg_sg_st_sG_sC_sA_sg	145	25	CCGCTCCGGGGTGCAG	25A	C_sC_sG_sC_st_sc_sc_sg_sg_sg_sg_st_sG_sC_sA_sG
25B	C_sC_sG_sC_st_sc_sc_sg_sg_sg_sg_st_sG_sC_sA_sg				25C	C_OC_OG_OC_Ot_sc_sc_sg_sg_sg_sg_st_sG_OC_OA_OG
25D	c_sc_sg_sc_st_sc_sc_sg_sg_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg				25C	C_OC_OG_OC_Ot_sc_sc_sg_sg_sg_sg_st_sG_OC_OA_OG

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表1，接上页

161	26	AGCCAGCCTCGGCCAT	26A	A_sG_sC_sC_sa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sC_sC_sA_sT
161	26	AGCCAGCCTCGGCCAT	26A	A_sG_sC_sC_sa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sC_sC_sA_sT	26B	A_sG_sC_sC_sa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sC_sC_sA_st
			26C	A_OG_OC_OC_Oa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sC_OC_OA_OT	26B	A_sG_sC_sC_sa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sC_sC_sA_st
			26C	A_OG_OC_OC_Oa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sC_OC_OA_OT	26D	a_sg_sc_sc_sa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sa_st
177	27	GTGGGGCAGTGGATGA	27A	G_sT_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_sT_sG_sA	26D	a_sg_sc_sc_sa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sa_st
177	27	GTGGGGCAGTGGATGA	27A	G_sT_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_sT_sG_sA	27B	G_sT_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_sT_sG_sa
			27C	G_OT_OG_OG_Og_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_OT_OG_OA	27B	G_sT_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_sT_sG_sa
			27C	G_OT_OG_OG_Og_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_OT_OG_OA	27D	g_st_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sa_st_sg_sa
193	28	GTCTGGCTCGTTCTCA	28A	G_sT_sC_sT_sg_sg_sc_st_sc_sg_st_st_sC_sT_sC_sA	27D	g_st_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sa_st_sg_sa
193	28	GTCTGGCTCGTTCTCA	28A	G_sT_sC_sT_sg_sg_sc_st_sc_sg_st_st_sC_sT_sC_sA	28B	G_sT_sC_sT_sg_sg_sc_st_sc_sg_st_st_sC_sT_sC_sa
			28C	G_OT_OC_OT_Og_sg_sc_st_sc_sg_st_st_sC_OT_OC_OA	28B	G_sT_sC_sT_sg_sg_sc_st_sc_sg_st_st_sC_sT_sC_sa
			28C	G_OT_OC_OT_Og_sg_sc_st_sc_sg_st_st_sC_OT_OC_OA	28D	g_st_sc_st_sg_sg_sc_st_sc_sg_st_st_sc_st_sc_sa
209	29	AGAAACACTGGGCCAA	29A	A_sG_sA_sA_sa_sc_sa_sc_st_sg_sg_sg_sC_sC_sA_sA	28D	g_st_sc_st_sg_sg_sc_st_sc_sg_st_st_sc_st_sc_sa
209	29	AGAAACACTGGGCCAA	29A	A_sG_sA_sA_sa_sc_sa_sc_st_sg_sg_sg_sC_sC_sA_sA	29B	A_sG_sA_sA_sa_sc_sa_sc_st_sg_sg_sg_sC_sC_sA_sa
			29C	A_OG_OA_OA_Oa_sc_sa_sc_st_sg_sg_sg_sC_OC_OA_OA	29B	A_sG_sA_sA_sa_sc_sa_sc_st_sg_sg_sg_sC_sC_sA_sa
			29C	A_OG_OA_OA_Oa_sc_sa_sc_st_sg_sg_sg_sC_OC_OA_OA	29D	a_sg_sa_sa_sa_sc_sa_sc_st_sg_sg_sg_sc_sc_sa_sa
225	30	AGCTCCTTGAAGCAGA	30A	A_sG_sC_sT_sc_sc_st_st_sg_sa_sa_sg_sC_sA_sG_sA	29D	a_sg_sa_sa_sa_sc_sa_sc_st_sg_sg_sg_sc_sc_sa_sa
225	30	AGCTCCTTGAAGCAGA	30A	A_sG_sC_sT_sc_sc_st_st_sg_sa_sa_sg_sC_sA_sG_sA	30B	A_sG_sC_sT_sc_sc_st_st_sg_sa_sa_sg_sC_sA_sG_sa
			30C	A_OG_OC_OT_Oc_sc_st_st_sg_sa_sa_sg_sC_OA_OG_OA	30B	A_sG_sC_sT_sc_sc_st_st_sg_sa_sa_sg_sC_sA_sG_sa
			30C	A_OG_OC_OT_Oc_sc_st_st_sg_sa_sa_sg_sC_OA_OG_OA	30D	a_sg_sc_st_sc_sc_st_st_sg_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sa
241	31	TGGCTCCCAGCCTTCC	31A	T_sG_sG_sC_st_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sc_sT_sT_sC_sC	30D	a_sg_sc_st_sc_sc_st_st_sg_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sa
241	31	TGGCTCCCAGCCTTCC	31A	T_sG_sG_sC_st_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sc_sT_sT_sC_sC	31B	T_sG_sG_sC_st_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sc_sT_sT_sC_sc
			31C	T_OG_OG_OC_Ot_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sc_sT_OT_OC_OC	31B	T_sG_sG_sC_st_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sc_sT_sT_sC_sc
			31C	T_OG_OG_OC_Ot_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sc_sT_OT_OC_OC	31D	t_sg_sg_sc_st_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sc_st_st_sc_sc
257	32	CTATGGGGTCGTCATC	32A	C_sT_sA_sT_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sC_sA_sT_sC	31D	t_sg_sg_sc_st_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sc_st_st_sc_sc
257	32	CTATGGGGTCGTCATC	32A	C_sT_sA_sT_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sC_sA_sT_sC	32B	C_sT_sA_sT_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sC_sA_sT_sc
			32C	C_OT_OA_OT_Og_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sC_OA_OT_OC	32B	C_sT_sA_sT_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sC_sA_sT_sc
			32C	C_OT_OA_OT_Og_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sC_OA_OT_OC	32D	c_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sc_sa_st_sc
273	33	TGCTTTTTATGTTCCT	33A	T_sG_sC_sT_st_st_st_st_sa_st_sg_st_sT_sC_sC_sT	32D	c_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sc_sa_st_sc
273	33	TGCTTTTTATGTTCCT	33A	T_sG_sC_sT_st_st_st_st_sa_st_sg_st_sT_sC_sC_sT	33B	T_sG_sC_sT_st_st_st_st_sa_st_sg_st_sT_sC_sC_st
			33C	T_OG_OC_OT_Ot_st_st_st_sa_st_sg_st_sT_OC_OC_OT	33B	T_sG_sC_sT_st_st_st_st_sa_st_sg_st_sT_sC_sC_st

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表1，接上页

33D	t_sg_sc_st_st_st_st_st_sa_st_sg_st_st_sc_sc_st
33D	t_sg_sc_st_st_st_st_st_sa_st_sg_st_st_sc_sc_st	289	34	AGCGCAACCGGACGAA	34A	A_sG_sC_sG_sc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sC_sG_sA_sA
34B	A_sG_sC_sG_sc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sC_sG_sA_sa	289	34	AGCGCAACCGGACGAA	34A	A_sG_sC_sG_sc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sC_sG_sA_sA
34B	A_sG_sC_sG_sc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sC_sG_sA_sa				34C	A_OG_OC_OG_Oc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sC_OG_OA_OA
34D	a_sg_sc_sg_sc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sa				34C	A_OG_OC_OG_Oc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sC_OG_OA_OA
34D	a_sg_sc_sg_sc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sa	305	35	TCTTGACAGAAAGGAA	35A	T_sC_sT_sT_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sa_sa_sG_sG_sA_sA
35B	T_sC_sT_sT_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sa_sa_sG_sG_sA_sa	305	35	TCTTGACAGAAAGGAA	35A	T_sC_sT_sT_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sa_sa_sG_sG_sA_sA
35B	T_sC_sT_sT_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sa_sa_sG_sG_sA_sa				35C	T_OC_OT_OT_Og_sa_sc_sa_sg_sa_sa_sa_sG_OG_OA_OA
35D	t_sc_st_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sg_sa_sa				35C	T_OC_OT_OT_Og_sa_sc_sa_sg_sa_sa_sa_sG_OG_OA_OA
35D	t_sc_st_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sg_sa_sa	321	36	AATTCTTCAAACTGCT	36A	A_sA_sT_sT_sc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc_sT_sG_sC_sT
36B	A_sA_sT_sT_sc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc_sT_sG_sC_st	321	36	AATTCTTCAAACTGCT	36A	A_sA_sT_sT_sc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc_sT_sG_sC_sT
36B	A_sA_sT_sT_sc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc_sT_sG_sC_st				36C	A_OA_OT_OT_Oc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc_sT_OG_OC_OT
36D	a_sa_st_st_sc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc_st_sg_sc_st				36C	A_OA_OT_OT_Oc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc_sT_OG_OC_OT
36D	a_sa_st_st_sc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc_st_sg_sc_st	337	37	AAATTCACCAAGGGTT	37A	A_sA_sA_sT_st_sc_sa_sc_sc_sa_sa_sG_sG_sG_sT_sT
37B	A_sA_sA_sT_st_sc_sa_sc_sc_sa_sa_sG_sG_sG_sT_st	337	37	AAATTCACCAAGGGTT	37A	A_sA_sA_sT_st_sc_sa_sc_sc_sa_sa_sG_sG_sG_sT_sT
37B	A_sA_sA_sT_st_sc_sa_sc_sc_sa_sa_sG_sG_sG_sT_st				37C	A_OA_OA_OT_Ot_sc_sa_sc_sc_sa_sa_sg_sG_OG_OT_OT
37D	a_sa_sa_st_st_sc_sa_sc_sc_sa_sa_sg_sg_sg_st_st				37C	A_OA_OA_OT_Ot_sc_sa_sc_sc_sa_sa_sg_sG_OG_OT_OT
37D	a_sa_sa_st_st_sc_sa_sc_sc_sa_sa_sg_sg_sg_st_st	353	38	CTCTGTCCAGTTTCAA	38A	C_sT_sC_sT_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_sC_sA_sA
38B	C_sT_sC_sT_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_sC_sA_sa	353	38	CTCTGTCCAGTTTCAA	38A	C_sT_sC_sT_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_sC_sA_sA
38B	C_sT_sC_sT_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_sC_sA_sa				38C	C_OT_OC_OT_Og_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_OC_OA_OA
38D	c_st_sc_st_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sa				38C	C_OT_OC_OT_Og_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_OC_OA_OA
38D	c_st_sc_st_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sa	369	39	TTGTTCTTGGCTCTTT	39A	T_sT_sG_sT_st_sc_st_st_sg_sg_sc_st_sC_sT_sT_sT
39B	T_sT_sG_sT_st_sc_st_st_sg_sg_sc_st_sC_sT_sT_st	369	39	TTGTTCTTGGCTCTTT	39A	T_sT_sG_sT_st_sc_st_st_sg_sg_sc_st_sC_sT_sT_sT
39B	T_sT_sG_sT_st_sc_st_st_sg_sg_sc_st_sC_sT_sT_st				39C	T_OT_OG_OT_Ot_sc_st_st_sg_sg_sc_st_sC_OT_OT_OT
39D	t_st_sg_st_st_sc_st_st_sg_sg_sc_st_sc_st_st_st				39C	T_OT_OG_OT_Ot_sc_st_st_sg_sg_sc_st_sC_OT_OT_OT
39D	t_st_sg_st_st_sc_st_st_sg_sg_sc_st_sc_st_st_st	385	40	GGTTTCCTTTGCAATT	40A	G_sG_sT_sT_st_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sA_sA_sT_sT
40B	G_sG_sT_sT_st_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sA_sA_sT_st	385	40	GGTTTCCTTTGCAATT	40A	G_sG_sT_sT_st_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sA_sA_sT_sT
40B	G_sG_sT_sT_st_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sA_sA_sT_st				40C	G_OG_OT_OT_Ot_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sA_OA_OT_OT
40D	g_sg_st_st_st_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sa_st_st				40C	G_OG_OT_OT_Ot_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sA_OA_OT_OT
40D	g_sg_st_st_st_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sa_st_st	401	41	CTTTCTTCTTATTGTT	41A	C_sT_sT_sT_sc_st_st_sc_st_st_sa_st_sT_sG_sT_sT
41B	C_sT_sT_sT_sc_st_st_sc_st_st_sa_st_sT_sG_sT_st	401	41	CTTTCTTCTTATTGTT	41A	C_sT_sT_sT_sc_st_st_sc_st_st_sa_st_sT_sG_sT_sT

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表1，接上页

			41C	C_OT_OT_OT_Oc_st_st_sc_st_st_sa_st_sT_OG_OT_OT
			41C	C_OT_OT_OT_Oc_st_st_sc_st_st_sa_st_sT_OG_OT_OT	41D	c_st_st_st_sc_st_st_sc_st_st_sa_st_st_sg_st_st
417	42	GCAGTTTCCTCAAATT	42A	G_sC_sA_sG_st_st_st_sc_sc_st_sc_sa_sA_sA_sT_sT	41D	c_st_st_st_sc_st_st_sc_st_st_sa_st_st_sg_st_st
417	42	GCAGTTTCCTCAAATT	42A	G_sC_sA_sG_st_st_st_sc_sc_st_sc_sa_sA_sA_sT_sT	42B	G_sC_sA_sG_st_st_st_sc_sc_st_sc_sa_sA_sA_sT_st
			42C	G_OC_OA_OG_Ot_st_st_sc_sc_st_sc_sa_sA_OA_OT_OT	42B	G_sC_sA_sG_st_st_st_sc_sc_st_sc_sa_sA_sA_sT_st
			42C	G_OC_OA_OG_Ot_st_st_sc_sc_st_sc_sa_sA_OA_OT_OT	42D	g_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sc_st_sc_sa_sa_sa_st_st
433	43	ACGGCGCACTTTCTTC	43A	A_sC_sG_sG_sc_sg_sc_sa_sc_st_st_st_sC_sT_sT_sC	42D	g_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sc_st_sc_sa_sa_sa_st_st
433	43	ACGGCGCACTTTCTTC	43A	A_sC_sG_sG_sc_sg_sc_sa_sc_st_st_st_sC_sT_sT_sC	43B	A_sC_sG_sG_sc_sg_sc_sa_sc_st_st_st_sC_sT_sT_st
			43C	A_OC_OG_OG_Oc_sg_sc_sa_sc_st_st_st_sC_OT_OT_OC	43B	A_sC_sG_sG_sc_sg_sc_sa_sc_st_st_st_sC_sT_sT_st
			43C	A_OC_OG_OG_Oc_sg_sc_sa_sc_st_st_st_sC_OT_OT_OC	43D	a_sc_sg_sg_sc_sg_sc_sa_sc_st_st_st_sc_st_st_sc
449	44	CCAGCTGCTCGATGGC	44A	C_sC_sA_sG_sc_st_sg_sc_st_sc_sg_sa_sT_sG_sG_sC	43D	a_sc_sg_sg_sc_sg_sc_sa_sc_st_st_st_sc_st_st_sc
449	44	CCAGCTGCTCGATGGC	44A	C_sC_sA_sG_sc_st_sg_sc_st_sc_sg_sa_sT_sG_sG_sC	44B	C_sC_sA_sG_sc_st_sg_sc_st_sc_sg_sa_sT_sG_sG_st
			44C	C_OC_OA_OG_Oc_st_sg_sc_st_sc_sg_sa_sT_OG_OG_OC	44B	C_sC_sA_sG_sc_st_sg_sc_st_sc_sg_sa_sT_sG_sG_st
			44C	C_OC_OA_OG_Oc_st_sg_sc_st_sc_sg_sa_sT_OG_OG_OC	44D	c_sc_sa_sg_sc_st_sg_sc_st_sc_sg_sa_st_sg_sg_sc
465	45	CCTCAATCCATGGCAG	45A	C_sC_sT_sC_sa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sG_sC_sA_sG	44D	c_sc_sa_sg_sc_st_sg_sc_st_sc_sg_sa_st_sg_sg_sc
465	45	CCTCAATCCATGGCAG	45A	C_sC_sT_sC_sa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sG_sC_sA_sG	45B	C_sC_sT_sC_sa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sG_sC_sA_sg
			45C	C_OC_OT_OC_Oa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sG_OC_OA_OG	45B	C_sC_sT_sC_sa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sG_sC_sA_sg
			45C	C_OC_OT_OC_Oa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sG_OC_OA_OG	45D	c_sc_st_sc_sa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sc_sa_sg
481	46	CAGCTCCGGCCAGAGG	46A	C_sA_sG_sC_st_sc_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sG_sA_sG_sG	45D	c_sc_st_sc_sa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sc_sa_sg
481	46	CAGCTCCGGCCAGAGG	46A	C_sA_sG_sC_st_sc_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sG_sA_sG_sG	46B	C_sA_sG_sC_st_sc_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sG_sA_sG_sg
			46C	C_OA_OG_OC_Ot_sc_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sG_OA_OG_OG	46B	C_sA_sG_sC_st_sc_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sG_sA_sG_sg
			46C	C_OA_OG_OC_Ot_sc_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sG_OA_OG_OG	46D	c_sa_sg_sc_st_sc_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sg_sa_sg_sg
497	47	CCACTCTGGGACCAGG	47A	C_sC_sA_sC_st_sc_st_sg_sg_sg_sa_sc_sC_sA_sG_sG	46D	c_sa_sg_sc_st_sc_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sg_sa_sg_sg
497	47	CCACTCTGGGACCAGG	47A	C_sC_sA_sC_st_sc_st_sg_sg_sg_sa_sc_sC_sA_sG_sG	47B	C_sC_sA_sC_st_sc_st_sg_sg_sg_sa_sc_sC_sA_sG_sg
			47C	C_OC_OA_OC_Ot_sc_st_sg_sg_sg_sa_sc_sC_OA_OG_OG	47B	C_sC_sA_sC_st_sc_st_sg_sg_sg_sa_sc_sC_sA_sG_sg
			47C	C_OC_OA_OC_Ot_sc_st_sg_sg_sg_sa_sc_sC_OA_OG_OG	47D	c_sc_sa_sc_st_sc_st_sg_sg_sg_sa_sc_sc_sa_sg_sg
513	48	CCTGGAAGTGGTGCAG	48A	C_sC_sT_sG_sg_sa_sa_sg_st_sg_sg_st_sG_sC_sA_sG	47D	c_sc_sa_sc_st_sc_st_sg_sg_sg_sa_sc_sc_sa_sg_sg
513	48	CCTGGAAGTGGTGCAG	48A	C_sC_sT_sG_sg_sa_sa_sg_st_sg_sg_st_sG_sC_sA_sG	48B	C_sC_sT_sG_sg_sa_sa_sg_st_sg_sg_st_sG_sC_sA_sg
			48C	C_OC_OT_OG_Og_sa_sa_sg_st_sg_sg_st_sG_OC_OA_OG	48B	C_sC_sT_sG_sg_sa_sa_sg_st_sg_sg_st_sG_sC_sA_sg
			48C	C_OC_OT_OG_Og_sa_sa_sg_st_sg_sg_st_sG_OC_OA_OG	48D	c_sc_st_sg_sg_sa_sa_sg_st_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg
529	49	GCACCAGGGAATAAAC	49A	G_sC_sA_sC_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sa_st_sA_sA_sA_sC	48D	c_sc_st_sg_sg_sa_sa_sg_st_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg

接下页

表1，接上页

657	57	GCTGCACAGGCAGAAG	57A	G_sC_sT_sG_sc_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sG_sA_sA_sG
657	57	GCTGCACAGGCAGAAG	57A	G_sC_sT_sG_sc_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sG_sA_sA_sG	57B	G_sC_sT_sG_sc_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sG_sA_sA_sg
			57C	G_OC_OT_OG_Oc_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sG_OA_OA_OG	57B	G_sC_sT_sG_sc_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sG_sA_sA_sg
			57C	G_OC_OT_OG_Oc_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sG_OA_OA_OG	57D	g_sc_st_sg_sc_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sa_sa_sg
673	58	GTTACCAGCAGCACCC	58A	G_sT_sT_sA_sc_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sA_sC_sC_sC	57D	g_sc_st_sg_sc_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sa_sa_sg
673	58	GTTACCAGCAGCACCC	58A	G_sT_sT_sA_sc_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sA_sC_sC_sC	58B	G_sT_sT_sA_sc_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sA_sC_sC_sc
			58C	G_OT_OT_OA_Oc_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sA_OC_OC_OC	58B	G_sT_sT_sA_sc_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sA_sC_sC_sc
			58C	G_OT_OT_OA_Oc_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sA_OC_OC_OC	58D	g_st_st_sa_sc_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sc_sc_sc
689	59	GAGAGAAGCAGCCACT	59A	G_sA_sG_sA_sg_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sC_sA_sC_sT	58D	g_st_st_sa_sc_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sc_sc_sc
689	59	GAGAGAAGCAGCCACT	59A	G_sA_sG_sA_sg_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sC_sA_sC_sT	59B	G_sA_sG_sA_sg_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sC_sA_sC_st
			59C	G_OA_OG_OA_Og_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sC_OA_OC_OT	59B	G_sA_sG_sA_sg_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sC_sA_sC_st
			59C	G_OA_OG_OA_Og_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sC_OA_OC_OT	59D	g_sa_sg_sa_sg_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sc_st
705	60	AaaAAAGAGAGAGAGA	60A	A_sA_sA_sA_sa_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sG_sA_sG_sA	59D	g_sa_sg_sa_sg_sa_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sc_st
705	60	AaaAAAGAGAGAGAGA	60A	A_sA_sA_sA_sa_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sG_sA_sG_sA	60B	A_sA_sA_sA_sa_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sG_sA_sG_sa
			60C	A_OA_OA_OA_Oa_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sG_OA_OG_OA	60B	A_sA_sA_sA_sa_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sG_sA_sG_sa
			60C	A_OA_OA_OA_Oa_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sG_OA_OG_OA	60D	a_sa_sa_sa_sa_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa
721	61	GCAAAAATGAGCCCCC	61A	G_sC_sA_sA_sa_sa_sa_st_sg_sa_sg_sc_sC_sC_sC_sC	60D	a_sa_sa_sa_sa_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa_sg_sa
721	61	GCAAAAATGAGCCCCC	61A	G_sC_sA_sA_sa_sa_sa_st_sg_sa_sg_sc_sC_sC_sC_sC	61B	G_sC_sA_sA_sa_sa_sa_st_sg_sa_sg_sc_sC_sC_sC_sc
			61C	G_OC_OA_OA_Oa_sa_sa_st_sg_sa_sg_sc_sC_OC_OC_OC	61B	G_sC_sA_sA_sa_sa_sa_st_sg_sa_sg_sc_sC_sC_sC_sc
			61C	G_OC_OA_OA_Oa_sa_sa_st_sg_sa_sg_sc_sC_OC_OC_OC	61D	g_sc_sa_sa_sa_sa_sa_st_sg_sa_sg_sc_sc_sc_sc_sc
737	62	CCCGGGAATCAAAACA	62A	C_sC_sC_sG_sg_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sA_sA_sC_sA	61D	g_sc_sa_sa_sa_sa_sa_st_sg_sa_sg_sc_sc_sc_sc_sc
737	62	CCCGGGAATCAAAACA	62A	C_sC_sC_sG_sg_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sA_sA_sC_sA	62B	C_sC_sC_sG_sg_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sA_sA_sC_sa
			62C	C_OC_OC_OG_Og_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sA_OA_OC_OA	62B	C_sC_sC_sG_sg_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sA_sA_sC_sa
			62C	C_OC_OC_OG_Og_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sA_OA_OC_OA	62D	c_sc_sc_sg_sg_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sa_sa_sc_sa
753	63	CTTCTCACCTGGTAAG	63A	C_sT_sT_sC_st_sc_sa_sc_sc_st_sg_sg_sT_sA_sA_sG	62D	c_sc_sc_sg_sg_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sa_sa_sc_sa
753	63	CTTCTCACCTGGTAAG	63A	C_sT_sT_sC_st_sc_sa_sc_sc_st_sg_sg_sT_sA_sA_sG	63B	C_sT_sT_sC_st_sc_sa_sc_sc_st_sg_sg_sT_sA_sA_sg
			63C	C_OT_OT_OC_Ot_sc_sa_sc_sc_st_sg_sg_sT_OA_OA_OG	63B	C_sT_sT_sC_st_sc_sa_sc_sc_st_sg_sg_sT_sA_sA_sg
			63C	C_OT_OT_OC_Ot_sc_sa_sc_sc_st_sg_sg_sT_OA_OA_OG	63D	c_st_st_sc_st_sc_sa_sc_sc_st_sg_sg_st_sa_sa_sg
769	64	CCTTCTTCCTCCCTCA	64A	C_sC_sT_sT_sc_st_st_sc_sc_st_sc_sc_sC_sT_sC_sA	63D	c_st_st_sc_st_sc_sa_sc_sc_st_sg_sg_st_sa_sa_sg
769	64	CCTTCTTCCTCCCTCA	64A	C_sC_sT_sT_sc_st_st_sc_sc_st_sc_sc_sC_sT_sC_sA	64B	C_sC_sT_sT_sc_st_st_sc_sc_st_sc_sc_sC_sT_sC_sa
			64C	C_OC_OT_OT_Oc_st_st_sc_sc_st_sc_sc_sC_OT_OC_OA	64B	C_sC_sT_sT_sc_st_st_sc_sc_st_sc_sc_sC_sT_sC_sa
			64C	C_OC_OT_OT_Oc_st_st_sc_sc_st_sc_sc_sC_OT_OC_OA	64D	c_sc_st_st_sc_st_st_sc_sc_st_sc_sc_sc_st_sc_sa

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表1，接上页

785	65	AGCAAAAGGGACACTG	65A	A_sG_sC_sA_sa_sa_sa_sg_sg_sg_sa_sc_sA_sC_sT_sG
785	65	AGCAAAAGGGACACTG	65A	A_sG_sC_sA_sa_sa_sa_sg_sg_sg_sa_sc_sA_sC_sT_sG	65B	A_sG_sC_sA_sa_sa_sa_sg_sg_sg_sa_sc_sA_sC_sT_sg
			65C	A_OG_OC_OA_Oa_sa_sa_sg_sg_sg_sa_sc_sA_OC_OT_OG	65B	A_sG_sC_sA_sa_sa_sa_sg_sg_sg_sa_sc_sA_sC_sT_sg
			65C	A_OG_OC_OA_Oa_sa_sa_sg_sg_sg_sa_sc_sA_OC_OT_OG	65D	a_sg_sc_sa_sa_sa_sa_sg_sg_sg_sa_sc_sa_sc_st_sg
801	66	CAAAGCTGTCAGCTCT	66A	C_sA_sA_sA_sg_sc_st_sg_st_sc_sa_sg_sC_sT_sC_sT	65D	a_sg_sc_sa_sa_sa_sa_sg_sg_sg_sa_sc_sa_sc_st_sg
801	66	CAAAGCTGTCAGCTCT	66A	C_sA_sA_sA_sg_sc_st_sg_st_sc_sa_sg_sC_sT_sC_sT	66B	C_sA_sA_sA_sg_sc_st_sg_st_sc_sa_sg_sC_sT_sC_st
			66C	C_OA_OA_OA_Og_sc_st_sg_st_sc_sa_sg_sC_OT_OC_OT	66B	C_sA_sA_sA_sg_sc_st_sg_st_sc_sa_sg_sC_sT_sC_st
			66C	C_OA_OA_OA_Og_sc_st_sg_st_sc_sa_sg_sC_OT_OC_OT	66D	c_sa_sa_sa_sg_sc_st_sg_st_sc_sa_sg_sc_st_sc_st
817	67	GCTCTGCCCACGCGAA	67A	G_sC_sT_sC_st_sg_sc_sc_sc_sa_sc_sg_sC_sG_sA_sA	66D	c_sa_sa_sa_sg_sc_st_sg_st_sc_sa_sg_sc_st_sc_st
817	67	GCTCTGCCCACGCGAA	67A	G_sC_sT_sC_st_sg_sc_sc_sc_sa_sc_sg_sC_sG_sA_sA	67B	G_sC_sT_sC_st_sg_sc_sc_sc_sa_sc_sg_sC_sG_sA_sa
			67C	G_OC_OT_OC_Ot_sg_sc_sc_sc_sa_sc_sg_sC_OG_OA_OA	67B	G_sC_sT_sC_st_sg_sc_sc_sc_sa_sc_sg_sC_sG_sA_sa
			67C	G_OC_OT_OC_Ot_sg_sc_sc_sc_sa_sc_sg_sC_OG_OA_OA	67D	g_sc_st_sc_st_sg_sc_sc_sc_sa_sc_sg_sc_sg_sa_sa
833	68	ACATTCACTGTGGAAG	68A	A_sC_sA_sT_st_sc_sa_sc_st_sg_st_sg_sG_sA_sA_sG	67D	g_sc_st_sc_st_sg_sc_sc_sc_sa_sc_sg_sc_sg_sa_sa
833	68	ACATTCACTGTGGAAG	68A	A_sC_sA_sT_st_sc_sa_sc_st_sg_st_sg_sG_sA_sA_sG	68B	A_SC_sA_sT_st_sc_sa_sc_st_sg_st_sg_sG_sA_sA_sg
			68C	A_OC_OA_OT_Ot_sc_sa_sc_st_sg_st_sg_sG_OA_OA_OG	68B	A_SC_sA_sT_st_sc_sa_sc_st_sg_st_sg_sG_sA_sA_sg
			68C	A_OC_OA_OT_Ot_sc_sa_sc_st_sg_st_sg_sG_OA_OA_OG	68D	a_sc_sa_st_st_sc_sa_sc_st_sg_st_sg_sg_sa_sa_sg
849	69	AACATGAGGTCCAGAC	69A	A_sA_sC_sA_st_sg_sa_sg_sg_st_sc_sc_sA_sG_sA_sC	68D	a_sc_sa_st_st_sc_sa_sc_st_sg_st_sg_sg_sa_sa_sg
849	69	AACATGAGGTCCAGAC	69A	A_sA_sC_sA_st_sg_sa_sg_sg_st_sc_sc_sA_sG_sA_sC	69B	A_sA_sC_sA_st_sg_sa_sg_sg_st_sc_sc_sA_sG_sA_sc
			69C	A_OA_OC_OA_Ot_sg_sa_sg_sg_st_sc_sc_sA_OG_OA_OC	69B	A_sA_sC_sA_st_sg_sa_sg_sg_st_sc_sc_sA_sG_sA_sc
			69C	A_OA_OC_OA_Ot_sg_sa_sg_sg_st_sc_sc_sA_OG_OA_OC	69D	a_sa_sc_sa_st_sg_sa_sg_sg_st_sc_sc_sa_sg_sa_sc
865	70	CTGTGACAGCCTCAAC	70A	C_sT_sG_sT_sg_sa_sc_sa_sg_sc_sc_st_sC_sA_sA_sC	69D	a_sa_sc_sa_st_sg_sa_sg_sg_st_sc_sc_sa_sg_sa_sc
865	70	CTGTGACAGCCTCAAC	70A	C_sT_sG_sT_sg_sa_sc_sa_sg_sc_sc_st_sC_sA_sA_sC	70B	C_sT_sG_sT_sg_sa_sc_sa_sg_sc_sc_st_sC_sA_sA_sc
			70C	C_OT_OG_OT_Og_sa_sc_sa_sg_sc_sc_st_sC_OA_OA_OC	70B	C_sT_sG_sT_sg_sa_sc_sa_sg_sc_sc_st_sC_sA_sA_sc
			70C	C_OT_OG_OT_Og_sa_sc_sa_sg_sc_sc_st_sC_OA_OA_OC	70D	c_st_sg_st_sg_sa_sc_sa_sg_sc_sc_st_sc_sa_sa_sc
881	71	AAGTCCACACTCAGGA	71A	A_sA_sG_sT_sc_sc_sa_sc_sa_sc_st_sc_sA_sG_sG_sA	70D	c_st_sg_st_sg_sa_sc_sa_sg_sc_sc_st_sc_sa_sa_sc
881	71	AAGTCCACACTCAGGA	71A	A_sA_sG_sT_sc_sc_sa_sc_sa_sc_st_sc_sA_sG_sG_sA	71B	A_sA_sG_sT_sc_sc_sa_sc_sa_sc_st_sc_sA_sG_sG_sa
			71C	A_OA_OG_OT_Oc_sc_sa_sc_sa_sc_st_sc_sA_OG_OG_OA	71B	A_sA_sG_sT_sc_sc_sa_sc_sa_sc_st_sc_sA_sG_sG_sa
			71C	A_OA_OG_OT_Oc_sc_sa_sc_sa_sc_st_sc_sA_OG_OG_OA	71D	a_sa_sg_st_sc_sc_sa_sc_sa_sc_st_sc_sa_sg_sg_sa
897	72	TCAACAGGCACCTGCC	72A	T_sC_sA_sA_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sT_sG_sC_sC	71D	a_sa_sg_st_sc_sc_sa_sc_sa_sc_st_sc_sa_sg_sg_sa
897	72	TCAACAGGCACCTGCC	72A	T_sC_sA_sA_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sT_sG_sC_sC	72B	T_sC_sA_sA_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sT_sG_sC_sc
			72C	T_OC_OA_OA_Oc_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sT_OG_OC_OC	72B	T_sC_sA_sA_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sT_sG_sC_sc

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表1，接上页

72D	t_sc_sa_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sc_st_sg_sc_sc
72D	t_sc_sa_sa_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sc_st_sg_sc_sc	913	73	AACCTGCAGCTCAGAT	73A	A_sA_sC_sC_st_sg_sc_sa_sg_sc_st_sc_sA_sG_sA_sT
73B	A_sA_sC_sC_st_sg_sc_sa_sg_sc_st_sc_sA_sG_sA_st	913	73	AACCTGCAGCTCAGAT	73A	A_sA_sC_sC_st_sg_sc_sa_sg_sc_st_sc_sA_sG_sA_sT
73B	A_sA_sC_sC_st_sg_sc_sa_sg_sc_st_sc_sA_sG_sA_st				73C	A_OA_OC_OC_Ot_sg_sc_sa_sg_sc_st_sc_sA_OG_OA_OT
73D	a_sa_sc_sc_st_sg_sc_sa_sg_sc_st_sc_sa_sg_sa_st				73C	A_OA_OC_OC_Ot_sg_sc_sa_sg_sc_st_sc_sA_OG_OA_OT
73D	a_sa_sc_sc_st_sg_sc_sa_sg_sc_st_sc_sa_sg_sa_st	929	74	GGTGTGACAGATAAGG	74A	G_sG_sT_sG_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sA_sA_sG_sG
74B	G_sG_sT_sG_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sA_sA_sG_sg	929	74	GGTGTGACAGATAAGG	74A	G_sG_sT_sG_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sA_sA_sG_sG
74B	G_sG_sT_sG_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sA_sA_sG_sg				74C	G_OG_OT_OG_Ot_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sA_OA_OG_OG
74D	g_sg_st_sg_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sa_sa_sg_sg				74C	G_OG_OT_OG_Ot_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sA_OA_OG_OG
74D	g_sg_st_sg_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sa_sa_sg_sg	945	75	CCTCTGAGGAGGCACA	75A	C_sC_sT_sC_st_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sg_sC_sA_sC_sA
75B	C_sC_sT_sC_st_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sg_sC_sA_sC_sa	945	75	CCTCTGAGGAGGCACA	75A	C_sC_sT_sC_st_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sg_sC_sA_sC_sA
75B	C_sC_sT_sC_st_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sg_sC_sA_sC_sa				75C	C_OC_OT_OC_Ot_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sg_sC_OA_OC_OA
75D	c_sc_st_sc_st_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sa				75C	C_OC_OT_OC_Ot_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sg_sC_OA_OC_OA
75D	c_sc_st_sc_st_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sg_sc_sa_sc_sa	961	76	ACAACAAAAAAACTGT	76A	A_sC_sA_sA_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_sT_sG_sT
76B	A_sC_sA_sA_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_sT_sG_st	961	76	ACAACAAAAAAACTGT	76A	A_sC_sA_sA_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_sT_sG_sT
76B	A_sC_sA_sA_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_sT_sG_st				76C	A_OC_OA_OA_Oc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_OT_OG_OT
76D	a_sc_sa_sa_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sc_st_sg_st				76C	A_OC_OA_OA_Oc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_OT_OG_OT
76D	a_sc_sa_sa_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sc_st_sg_st	977	77	AAAACAAAAAAACACA	77A	A_sA_sA_sA_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_sA_sC_sA
77B	A_sA_sA_sA_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_sA_sC_sa	977	77	AAAACAAAAAAACACA	77A	A_sA_sA_sA_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_sA_sC_sA
77B	A_sA_sA_sA_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_sA_sC_sa				77C	A_OA_OA_OA_Oc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_OA_OC_OA
77D	a_sa_sa_sa_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sc_sa_sc_sa				77C	A_OA_OA_OA_Oc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sC_OA_OC_OA
77D	a_sa_sa_sa_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sc_sa_sc_sa	993	78	CATCTACCAAAAAAAA	78A	C_sA_sT_sC_st_sa_sc_sc_sa_sa_sa_sa_sA_sA_sA_sA
78B	C_sA_sT_sC_st_sa_sc_sc_sa_sa_sa_sa_sA_sA_sA_sa	993	78	CATCTACCAAAAAAAA	78A	C_sA_sT_sC_st_sa_sc_sc_sa_sa_sa_sa_sA_sA_sA_sA
78B	C_sA_sT_sC_st_sa_sc_sc_sa_sa_sa_sa_sA_sA_sA_sa				78C	C_OA_OT_OC_Ot_sa_sc_sc_sa_sa_sa_sa_sA_OA_OA_OA
78D	c_sa_st_sc_st_sa_sc_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa				78C	C_OA_OT_OC_Ot_sa_sc_sc_sa_sa_sa_sa_sA_OA_OA_OA
78D	c_sa_st_sc_st_sa_sc_sc_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa_sa	1009	79	TCACACACAAGTCATG	79A	T_sC_sA_sC_sa_sc_sa_sc_sa_sa_sg_st_sC_sA_sT_sG
79B	T_sC_sA_sC_sa_sc_sa_sc_sa_sa_sg_st_sC_sA_sT_sg	1009	79	TCACACACAAGTCATG	79A	T_sC_sA_sC_sa_sc_sa_sc_sa_sa_sg_st_sC_sA_sT_sG
79B	T_sC_sA_sC_sa_sc_sa_sc_sa_sa_sg_st_sC_sA_sT_sg				79C	T_OC_OA_OC_Oa_sc_sa_sc_sa_sa_sg_st_sC_OA_OT_OG
79D	t_sc_sa_sc_sa_sc_sa_sc_sa_sa_sg_st_sc_sa_st_sg				79C	T_OC_OA_OC_Oa_sc_sa_sc_sa_sa_sg_st_sC_OA_OT_OG
79D	t_sc_sa_sc_sa_sc_sa_sc_sa_sa_sg_st_sc_sa_st_sg	1025	80	TGTCTCCATTCTCTCA	80A	T_sG_sT_sC_st_sc_sc_sa_st_st_sc_st_sC_sT_sC_sA

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表1，接上页

80B	T_sG_sT_sC_st_sc_sc_sa_st_st_sc_st_sC_sT_sC_sa
80B	T_sG_sT_sC_st_sc_sc_sa_st_st_sc_st_sC_sT_sC_sa				80C	T_OG_OT_OC_Ot_sc_sc_sa_st_st_sc_st_sC_OT_OC_OA
80D	t_sg_st_sc_st_sc_sc_sa_st_st_sc_st_sc_st_sc_sa				80C	T_OG_OT_OC_Ot_sc_sc_sa_st_st_sc_st_sC_OT_OC_OA
80D	t_sg_st_sc_st_sc_sc_sa_st_st_sc_st_sc_st_sc_sa	1041	81	GAGGAGCCAGGGACTC	81A	G_sA_sG_sG_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sA_sC_sT_sC
81B	G_sA_sG_sG_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sA_sC_sT_sc	1041	81	GAGGAGCCAGGGACTC	81A	G_sA_sG_sG_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sA_sC_sT_sC
81B	G_sA_sG_sG_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sA_sC_sT_sc				81C	G_OA_OG_OG_Oa_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sA_OC_OT_OC
81D	g_sa_sg_sg_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sc_st_sc				81C	G_OA_OG_OG_Oa_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sA_OC_OT_OC
81D	g_sa_sg_sg_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sc_st_sc	1057	82	ATGTTGTTAAACAGTA	82A	A_sT_sG_sT_st_sg_st_st_sa_sa_sa_sc_sA_sG_sT_sA
82B	A_sT_sG_sT_st_sg_st_st_sa_sa_sa_sc_sA_sG_sT_sa	1057	82	ATGTTGTTAAACAGTA	82A	A_sT_sG_sT_st_sg_st_st_sa_sa_sa_sc_sA_sG_sT_sA
82B	A_sT_sG_sT_st_sg_st_st_sa_sa_sa_sc_sA_sG_sT_sa				82C	A_OT_OG_OT_Ot_sg_st_st_sa_sa_sa_sc_sA_OG_OT_OA
82D	a_st_sg_st_st_sg_st_st_sa_sa_sa_sc_sa_sg_st_sa				82C	A_OT_OG_OT_Ot_sg_st_st_sa_sa_sa_sc_sA_OG_OT_OA
82D	a_st_sg_st_st_sg_st_st_sa_sa_sa_sc_sa_sg_st_sa	1073	83	ACAAAATAAGAAAGCC	83A	A_sC_sA_sA_sa_sa_st_sa_sa_sg_sa_sa_sA_sG_sC_sC
83B	A_sC_sA_sA_sa_sa_st_sa_sa_sg_sa_sa_sA_sG_sC_sc	1073	83	ACAAAATAAGAAAGCC	83A	A_sC_sA_sA_sa_sa_st_sa_sa_sg_sa_sa_sA_sG_sC_sC
83B	A_sC_sA_sA_sa_sa_st_sa_sa_sg_sa_sa_sA_sG_sC_sc				83C	A_OC_OA_OA_Oa_sa_st_sa_sa_sg_sa_sa_sA_OG_OC_OC
83D	a_sc_sa_sa_sa_sa_st_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sc_sc				83C	A_OC_OA_OA_Oa_sa_st_sa_sa_sg_sa_sa_sA_OG_OC_OC
83D	a_sc_sa_sa_sa_sa_st_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sg_sc_sc	1089	84	TGAATTAACAATTCAA	84A	T_sG_sA_sA_st_st_sa_sa_sc_sa_sa_st_sT_sC_sA_sA
84B	T_sG_sA_sA_st_st_sa_sa_sc_sa_sa_st_sT_sC_sA_sa	1089	84	TGAATTAACAATTCAA	84A	T_sG_sA_sA_st_st_sa_sa_sc_sa_sa_st_sT_sC_sA_sA
84B	T_sG_sA_sA_st_st_sa_sa_sc_sa_sa_st_sT_sC_sA_sa				84C	T_OG_OA_OA_Ot_st_sa_sa_sc_sa_sa_st_sT_OC_OA_OA
84D	t_sg_sa_sa_st_st_sa_sa_sc_sa_sa_st_st_sc_sa_sa				84C	T_OG_OA_OA_Ot_st_sa_sa_sc_sa_sa_st_sT_OC_OA_OA
84D	t_sg_sa_sa_st_st_sa_sa_sc_sa_sa_st_st_sc_sa_sa	1105	85	AGTTTGTGCTATTCTG	85A	A_sG_sT_sT_st_sg_st_sg_sc_st_sa_st_sT_sC_sT_sG
85B	A_sG_sT_sT_st_sg_st_sg_sc_st_sa_st_sT_sC_sT_sg	1105	85	AGTTTGTGCTATTCTG	85A	A_sG_sT_sT_st_sg_st_sg_sc_st_sa_st_sT_sC_sT_sG
85B	A_sG_sT_sT_st_sg_st_sg_sc_st_sa_st_sT_sC_sT_sg				85C	A_OG_OT_OT_Ot_sg_st_sg_sc_st_sa_st_sT_OC_OT_OG
85D	a_sg_st_st_st_sg_st_sg_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg				85C	A_OG_OT_OT_Ot_sg_st_sg_sc_st_sa_st_sT_OC_OT_OG
85D	a_sg_st_st_st_sg_st_sg_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg	1121	86	GCTTAGTTTTAATTGT	86A	G_sC_sT_sT_sa_sg_st_st_st_st_sa_sa_sT_sT_sG_sT
86B	G_sC_sT_sT_sa_sg_st_st_st_st_sa_sa_sT_sT_sG_st	1121	86	GCTTAGTTTTAATTGT	86A	G_sC_sT_sT_sa_sg_st_st_st_st_sa_sa_sT_sT_sG_sT
86B	G_sC_sT_sT_sa_sg_st_st_st_st_sa_sa_sT_sT_sG_st				86C	G_OC_OT_OT_Oa_sg_st_st_st_st_sa_sa_sT_OT_OG_OT
86D	g_sc_st_st_sa_sg_st_st_st_st_sa_sa_st_st_sg_st				86C	G_OC_OT_OT_Oa_sg_st_st_st_st_sa_sa_sT_OT_OG_OT

接下页

表1，接上页

1137	87	CTTAGAATGGCTTTGT	87A	C_sT_sT_sA_sg_sa_sa_st_sg_sg_sc_st_sT_sT_sG_sT
1137	87	CTTAGAATGGCTTTGT	87A	C_sT_sT_sA_sg_sa_sa_st_sg_sg_sc_st_sT_sT_sG_sT	87B	C_sT_sT_sA_sg_sa_sa_st_sg_sg_sc_st_sT_sT_sG_st
			87C	C_OT_OT_OA_Og_sa_sa_st_sg_sg_sc_st_sT_OT_OG_OT	87B	C_sT_sT_sA_sg_sa_sa_st_sg_sg_sc_st_sT_sT_sG_st
			87C	C_OT_OT_OA_Og_sa_sa_st_sg_sg_sc_st_sT_OT_OG_OT	87D	c_st_st_sa_sg_sa_sa_st_sg_sg_sc_st_st_st_sg_st
1153	88	CCCGTTTCCCCAATGA	88A	C_sC_sC_sG_st_st_st_sc_sc_sc_sc_sa_sA_sT_sG_sA	87D	c_st_st_sa_sg_sa_sa_st_sg_sg_sc_st_st_st_sg_st
1153	88	CCCGTTTCCCCAATGA	88A	C_sC_sC_sG_st_st_st_sc_sc_sc_sc_sa_sA_sT_sG_sA	88B	C_sC_sC_sG_st_st_st_sc_sc_sc_sc_sa_sA_sT_sG_sa
			88C	C_OC_OC_OG_Ot_st_st_sc_sc_sc_sc_sa_sA_OT_OG_OA	88B	C_sC_sC_sG_st_st_st_sc_sc_sc_sc_sa_sA_sT_sG_sa
			88C	C_OC_OC_OG_Ot_st_st_sc_sc_sc_sc_sa_sA_OT_OG_OA	88D	c_sc_sc_sg_st_st_st_sc_sc_sc_sc_sa_sa_st_sg_sa
1169	89	TCCACCTGAAGTTCAC	89A	T_sC_sC_sA_sc_sc_st_sg_sa_sa_sg_st_sT_sC_sA_sC	88D	c_sc_sc_sg_st_st_st_sc_sc_sc_sc_sa_sa_st_sg_sa
1169	89	TCCACCTGAAGTTCAC	89A	T_sC_sC_sA_sc_sc_st_sg_sa_sa_sg_st_sT_sC_sA_sC	89B	T_sC_sC_sA_sc_sc_st_sg_sa_sa_sg_st_sT_sC_sA_sc
			89C	T_OC_OC_OA_Oc_sc_st_sg_sa_sa_sg_st_sT_OC_OA_OC	89B	T_sC_sC_sA_sc_sc_st_sg_sa_sa_sg_st_sT_sC_sA_sc
			89C	T_OC_OC_OA_Oc_sc_st_sg_sa_sa_sg_st_sT_OC_OA_OC	89D	t_sc_sc_sa_sc_sc_st_sg_sa_sa_sg_st_st_sc_sa_sc
1185	90	CTATTCTGTCTCCTCA	90A	C_sT_sA_sT_st_sc_st_sg_st_sc_st_sc_sC_sT_sC_sA	89D	t_sc_sc_sa_sc_sc_st_sg_sa_sa_sg_st_st_sc_sa_sc
1185	90	CTATTCTGTCTCCTCA	90A	C_sT_sA_sT_st_sc_st_sg_st_sc_st_sc_sC_sT_sC_sA	90B	C_sT_sA_sT_st_sc_st_sg_st_sc_st_sc_sC_sT_sC_sa
			90C	C_OT_OA_OT_Ot_sc_st_sg_st_sc_st_sc_sC_OT_OC_OA	90B	C_sT_sA_sT_st_sc_st_sg_st_sc_st_sc_sC_sT_sC_sa
			90C	C_OT_OA_OT_Ot_sc_st_sg_st_sc_st_sc_sC_OT_OC_OA	90D	c_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sc_st_sc_sc_st_sc_sa
1201	91	GACGCTTCCTATCACT	91A	G_sA_sC_sG_sc_st_st_sc_sc_st_sa_st_sC_sA_sC_sT	90D	c_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sc_st_sc_sc_st_sc_sa
1201	91	GACGCTTCCTATCACT	91A	G_sA_sC_sG_sc_st_st_sc_sc_st_sa_st_sC_sA_sC_sT	91B	G_sA_sC_sG_sc_st_st_sc_sc_st_sa_st_sC_sA_sC_st
			91C	G_OA_OC_OG_Oc_st_st_sc_sc_st_sa_st_sC_OA_OC_OT	91B	G_sA_sC_sG_sc_st_st_sc_sc_st_sa_st_sC_sA_sC_st
			91C	G_OA_OC_OG_Oc_st_st_sc_sc_st_sa_st_sC_OA_OC_OT	91D	g_sa_sc_sg_sc_st_st_sc_sc_st_sa_st_sc_sa_sc_st
1217	92	AAAGGAGTATCTGCCA	92A	A_sA_sA_sG_sg_sa_sg_st_sa_st_sc_st_sG_sC_sC_sA	91D	g_sa_sc_sg_sc_st_st_sc_sc_st_sa_st_sc_sa_sc_st
1217	92	AAAGGAGTATCTGCCA	92A	A_sA_sA_sG_sg_sa_sg_st_sa_st_sc_st_sG_sC_sC_sA	92B	A_sA_sA_sG_sg_sa_sg_st_sa_st_sc_st_sG_sC_sC_sa
			92C	A_OA_OA_OG_Og_sa_sg_st_sa_st_sc_st_sG_OC_OC_OA	92B	A_sA_sA_sG_sg_sa_sg_st_sa_st_sc_st_sG_sC_sC_sa
			92C	A_OA_OA_OG_Og_sa_sg_st_sa_st_sc_st_sG_OC_OC_OA	92D	a_sa_sa_sg_sg_sa_sg_st_sa_st_sc_st_sg_sc_sc_sa
1233	93	TCACACAGCAGTGGCA	93A	T_sC_sA_sC_sa_sc_sa_sg_sc_sa_sg_st_sG_sG_sC_sA	92D	a_sa_sa_sg_sg_sa_sg_st_sa_st_sc_st_sg_sc_sc_sa
1233	93	TCACACAGCAGTGGCA	93A	T_sC_sA_sC_sa_sc_sa_sg_sc_sa_sg_st_sG_sG_sC_sA	93B	T_sC_sA_sC_sa_sc_sa_sg_sc_sa_sg_st_sG_sG_sC_sa
			93C	T_OC_OA_OC_Oa_sc_sa_sg_sc_sa_sg_st_sG_OG_OC_OA	93B	T_sC_sA_sC_sa_sc_sa_sg_sc_sa_sg_st_sG_sG_sC_sa

接下页

表1，接上页

93D	t_sc_sa_sc_sa_sc_sa_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sc_sa
93D	t_sc_sa_sc_sa_sc_sa_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sc_sa	1249	94	CACTGGGCCTGTCTAA	94A	C_sA_sC_sT_sg_sg_sg_sc_sc_st_sg_st_sC_sT_sA_sA
94B	C_sA_sC_sT_sg_sg_sg_sc_sc_st_sg_st_sC_sT_sA_sa	1249	94	CACTGGGCCTGTCTAA	94A	C_sA_sC_sT_sg_sg_sg_sc_sc_st_sg_st_sC_sT_sA_sA
94B	C_sA_sC_sT_sg_sg_sg_sc_sc_st_sg_st_sC_sT_sA_sa				94C	C_OA_OC_OT_Og_sg_sg_sc_sc_st_sg_st_sC_OT_OA_OA
94D	c_sa_sc_st_sg_sg_sg_sc_sc_st_sg_st_sc_st_sa_sa				94C	C_OA_OC_OT_Og_sg_sg_sc_sc_st_sg_st_sC_OT_OA_OA
94D	c_sa_sc_st_sg_sg_sg_sc_sc_st_sg_st_sc_st_sa_sa	1265	95	CATGTGCCCCGCGGCT	95A	C_sA_sT_sG_st_sg_sc_sc_sc_sc_sg_sc_sG_sG_sC_sT
95B	C_sA_sT_sG_st_sg_sc_sc_sc_sc_sg_sc_sG_sG_sC_st	1265	95	CATGTGCCCCGCGGCT	95A	C_sA_sT_sG_st_sg_sc_sc_sc_sc_sg_sc_sG_sG_sC_sT
95B	C_sA_sT_sG_st_sg_sc_sc_sc_sc_sg_sc_sG_sG_sC_st				95C	C_OA_OT_OG_Ot_sg_sc_sc_sc_sc_sg_sc_sG_OG_OC_OT
95D	c_sa_st_sg_st_sg_sc_sc_sc_sc_sg_sc_sg_sg_sc_st				95C	C_OA_OT_OG_Ot_sg_sc_sc_sc_sc_sg_sc_sG_OG_OC_OT
95D	c_sa_st_sg_st_sg_sc_sc_sc_sc_sg_sc_sg_sg_sc_st	1281	96	AGGGAGGAGCGGCCAG	96A	A_sG_sG_sG_sa_sg_sg_sa_sg_sc_sg_sg_sC_sC_sA_SG
96B	A_sG_sG_sG_sa_sg_sg_sa_sg_sc_sg_sg_sC_sC_sA_sg	1281	96	AGGGAGGAGCGGCCAG	96A	A_sG_sG_sG_sa_sg_sg_sa_sg_sc_sg_sg_sC_sC_sA_SG
96B	A_sG_sG_sG_sa_sg_sg_sa_sg_sc_sg_sg_sC_sC_sA_sg				96C	A_OG_OG_OG_Oa_sg_sg_sa_sg_sc_sg_sg_sC_OC_OA_OG
96D	a_sg_sg_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sg				96C	A_OG_OG_OG_Oa_sg_sg_sa_sg_sc_sg_sg_sC_OC_OA_OG
96D	a_sg_sg_sg_sa_sg_sg_sa_sg_sc_sg_sg_sc_sc_sa_sg	1297	97	CCACTGCCTTTTTCTG	97A	C_sC_sA_sC_st_sg_sc_sc_st_st_st_st_sT_sC_sT_sG
97B	C_sC_sA_sC_st_sg_sc_sc_st_st_st_st_sT_sC_sT_sg	1297	97	CCACTGCCTTTTTCTG	97A	C_sC_sA_sC_st_sg_sc_sc_st_st_st_st_sT_sC_sT_sG
97B	C_sC_sA_sC_st_sg_sc_sc_st_st_st_st_sT_sC_sT_sg				97C	C_OC_OA_OC_Ot_sg_sc_sc_st_st_st_st_sT_OC_OT_OG
97D	c_sc_sa_sc_st_sg_sc_sc_st_st_st_st_st_sc_st_sg				97C	C_OC_OA_OC_Ot_sg_sc_sc_st_st_st_st_sT_OC_OT_OG
97D	c_sc_sa_sc_st_sg_sc_sc_st_st_st_st_st_sc_st_sg	1313	98	TTAAAAAGGATTTAGG	98A	T_sT_sA_sA_sa_sa_sa_sg_sg_sa_st_st_sT_sA_sG_sG
98B	T_sT_sA_sA_sa_sa_sa_sg_sg_sa_st_st_sT_sA_sG_sg	1313	98	TTAAAAAGGATTTAGG	98A	T_sT_sA_sA_sa_sa_sa_sg_sg_sa_st_st_sT_sA_sG_sG
98B	T_sT_sA_sA_sa_sa_sa_sg_sg_sa_st_st_sT_sA_sG_sg				98C	T_OT_OA_OA_Oa_sa_sa_sg_sg_sa_st_st_sT_OA_OG_OG
98D	t_st_sa_sa_sa_sa_sa_sg_sg_sa_st_st_st_sa_sg_sg				98C	T_OT_OA_OA_Oa_sa_sa_sg_sg_sa_st_st_sT_OA_OG_OG
98D	t_st_sa_sa_sa_sa_sa_sg_sg_sa_st_st_st_sa_sg_sg	1329	99	CATCGAGCCAAGTCAT	99A	C_sA_sT_sC_sg_sa_sg_sc_sc_sa_sa_sg_sT_sC_sA_sT
99B	C_sA_sT_sC_sg_sa_sg_sc_sc_sa_sa_sg_sT_sC_sA_st	1329	99	CATCGAGCCAAGTCAT	99A	C_sA_sT_sC_sg_sa_sg_sc_sc_sa_sa_sg_sT_sC_sA_sT
99B	C_sA_sT_sC_sg_sa_sg_sc_sc_sa_sa_sg_sT_sC_sA_st				99C	C_OA_OT_OC_Og_sa_sg_sc_sc_sa_sa_sg_sT_OC_OA_OT
99D	c_sa_st_sc_sg_sa_sg_sc_sc_sa_sa_sg_st_sc_sa_st				99C	C_OA_OT_OC_Og_sa_sg_sc_sc_sa_sa_sg_sT_OC_OA_OT
99D	c_sa_st_sc_sg_sa_sg_sc_sc_sa_sa_sg_st_sc_sa_st	1345	100	AGCCAGTCCCCCACAG	100A	A_sG_sC_sC_sa_sg_st_sc_sc_sc_sc_sc_sA_sC_sA_sG
100B	A_sG_sC_sC_sa_sg_st_sc_sc_sc_sc_sc_sA_sC_sA_sg	1345	100	AGCCAGTCCCCCACAG	100A	A_sG_sC_sC_sa_sg_st_sc_sc_sc_sc_sc_sA_sC_sA_sG

接下页

表1，接上页

			100C	A_OG_OC_OC_Oa_sg_st_sc_sc_sc_sc_sc_sA_OC_OA_OG
			100C	A_OG_OC_OC_Oa_sg_st_sc_sc_sc_sc_sc_sA_OC_OA_OG	100D	a_sg_sc_sc_sa_sg_st_sc_sc_sc_sc_sc_sa_sc_sa_sg
1361	101	CGGCCTGCAGCAGCCC	101A	C_sG_sG_sC_sc_st_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sG_sC_sC_sC	100D	a_sg_sc_sc_sa_sg_st_sc_sc_sc_sc_sc_sa_sc_sa_sg
1361	101	CGGCCTGCAGCAGCCC	101A	C_sG_sG_sC_sc_st_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sG_sC_sC_sC	101B	C_sG_sG_sC_sc_st_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sG_sC_sC_sc
			101C	C_OG_OG_OC_Oc_st_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sG_OC_OC_OC	101B	C_sG_sG_sC_sc_st_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sG_sC_sC_sc
			101C	C_OG_OG_OC_Oc_st_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sG_OC_OC_OC	101D	c_sg_sg_sc_sc_st_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sc
1377	102	TGGGCTGACAGACACA	102A	T_sG_sG_sG_sc_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sC_sA_sC_sA	101D	c_sg_sg_sc_sc_st_sg_sc_sa_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sc
1377	102	TGGGCTGACAGACACA	102A	T_sG_sG_sG_sc_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sC_sA_sC_sA	102B	T_sG_sG_sG_sc_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sC_sA_sC_sa
			102C	T_OG_OG_OG_Oc_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sC_OA_OC_OA	102B	T_sG_sG_sG_sc_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sC_sA_sC_sa
			102C	T_OG_OG_OG_Oc_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sC_OA_OC_OA	102D	t_sg_sg_sg_sc_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sc_sa_sc_sa
1393	103	TGACAGATGTGAAGGT	103A	T_sG_sA_sC_sa_sg_sa_st_sg_st_sg_sa_sA_sG_sG_sT	102D	t_sg_sg_sg_sc_st_sg_sa_sc_sa_sg_sa_sc_sa_sc_sa
1393	103	TGACAGATGTGAAGGT	103A	T_sG_sA_sC_sa_sg_sa_st_sg_st_sg_sa_sA_sG_sG_sT	103B	T_sG_sA_sC_sa_sg_sa_st_sg_st_sg_sa_sA_sG_sG_st
			103C	T_OG_OA_OC_Oa_sg_sa_st_sg_st_sg_sa_sA_OG_OG_OT	103B	T_sG_sA_sC_sa_sg_sa_st_sg_st_sg_sa_sA_sG_sG_st
			103C	T_OG_OA_OC_Oa_sg_sa_st_sg_st_sg_sa_sA_OG_OG_OT	103D	t_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sg_st_sg_sa_sa_sg_sg_st
1409	104	CCCCGTGTGGAGAACG	104A	C_sC_sC_sC_sg_st_sg_st_sg_sg_sa_sg_sA_sA_sC_sG	103D	t_sg_sa_sc_sa_sg_sa_st_sg_st_sg_sa_sa_sg_sg_st
1409	104	CCCCGTGTGGAGAACG	104A	C_sC_sC_sC_sg_st_sg_st_sg_sg_sa_sg_sA_sA_sC_sG	104B	C_sC_sC_sC_sg_st_sg_st_sg_sg_sa_sg_sA_sA_sC_sg
			1004C	C_OC_OC_OC_Og_st_sg_st_sg_sg_sa_sg_sA_OA_OC_OG	104B	C_sC_sC_sC_sg_st_sg_st_sg_sg_sa_sg_sA_sA_sC_sg
			1004C	C_OC_OC_OC_Og_st_sg_st_sg_sg_sa_sg_sA_OA_OC_OG	104D	c_sc_sc_sc_sg_st_sg_st_sg_sg_sa_sg_sa_sa_sc_sg
1425	105	GCGGACTGCGTCTCTC	105A	G_sC_sG_sG_sa_sc_st_sg_sc_sg_st_sc_sT_sC_sT_sC	104D	c_sc_sc_sc_sg_st_sg_st_sg_sg_sa_sg_sa_sa_sc_sg
1425	105	GCGGACTGCGTCTCTC	105A	G_sC_sG_sG_sa_sc_st_sg_sc_sg_st_sc_sT_sC_sT_sC	105B	G_sC_sG_sG_sa_sc_st_sg_sc_sg_st_sc_sT_sC_sT_sc
			105C	G_OC_OG_OG_Oa_sc_st_sg_sc_sg_st_sc_sT_OC_OT_OC	105B	G_sC_sG_sG_sa_sc_st_sg_sc_sg_st_sc_sT_sC_sT_sc
			105C	G_OC_OG_OG_Oa_sc_st_sg_sc_sg_st_sc_sT_OC_OT_OC	105D	g_sc_sg_sg_sa_sc_st_sg_sc_sg_st_sc_st_sc_st_sc
1441	106	GAAAGCGGGGACCTGG	106A	G_sA_sA_sA_sg_sc_sg_sg_sg_sg_sa_sc_sC_sT_sG_sG	105D	g_sc_sg_sg_sa_sc_st_sg_sc_sg_st_sc_st_sc_st_sc
1441	106	GAAAGCGGGGACCTGG	106A	G_sA_sA_sA_sg_sc_sg_sg_sg_sg_sa_sc_sC_sT_sG_sG	106B	G_sA_sA_sA_sg_sc_sg_sg_sg_sg_sa_sc_sC_sT_sG_sg
			106C	G_OA_OA_OA_Og_sc_sg_sg_sg_sg_sa_sc_sC_OT_OG_OG	106B	G_sA_sA_sA_sg_sc_sg_sg_sg_sg_sa_sc_sC_sT_sG_sg
			106C	G_OA_OA_OA_Og_sc_sg_sg_sg_sg_sa_sc_sC_OT_OG_OG	106D	g_sa_sa_sa_sg_sc_sg_sg_sg_sg_sa_sc_sc_st_sg_sg
1457	107	AGCTGCTGCCTCCAAA	107A	A_sG_sC_sT_sg_sc_st_sg_sc_sc_st_sc_sC_sA_sA_sA	106D	g_sa_sa_sa_sg_sc_sg_sg_sg_sg_sa_sc_sc_st_sg_sg

接下页

表1，接上页

107B	A_sG_sC_sT_sg_sc_st_sg_sc_sc_st_sc_sC_sA_sA_sa
107B	A_sG_sC_sT_sg_sc_st_sg_sc_sc_st_sc_sC_sA_sA_sa				107C	A_OG_OC_OT_Og_sc_st_sg_sc_sc_st_sc_sC_OA_OA_OA
107D	a_sg_sc_st_sg_sc_st_sg_sc_sc_st_sc_sc_sa_sa_sa				107C	A_OG_OC_OT_Og_sc_st_sg_sc_sc_st_sc_sC_OA_OA_OA
107D	a_sg_sc_st_sg_sc_st_sg_sc_sc_st_sc_sc_sa_sa_sa	1473	108	ACTTCAGCCCTGCGGG	108A	A_sC_sT_sT_sc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sg_sC_sG_sG_sG
108B	A_sC_sT_sT_sc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sg_sC_sG_sG_sg	1473	108	ACTTCAGCCCTGCGGG	108A	A_sC_sT_sT_sc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sg_sC_sG_sG_sG
108B	A_sC_sT_sT_sc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sg_sC_sG_sG_sg				108C	A_OC_OT_OT_Oc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sg_sC_OG_OG_OG
108D	a_sc_st_st_sc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sg_sc_sg_sg_sg				108C	A_OC_OT_OT_Oc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sg_sC_OG_OG_OG
108D	a_sc_st_st_sc_sa_sg_sc_sc_sc_st_sg_sc_sg_sg_sg	1489	109	CATCATCTTACGCCAG	109A	C_sA_sT_sC_sa_st_sc_st_st_sa_sc_sg_sC_sC_sT_sG
109B	C_sA_sT_sC_sa_st_sc_st_st_sa_sc_sg_sC_sC_sA_sg	1489	109	CATCATCTTACGCCAG	109A	C_sA_sT_sC_sa_st_sc_st_st_sa_sc_sg_sC_sC_sT_sG
109B	C_sA_sT_sC_sa_st_sc_st_st_sa_sc_sg_sC_sC_sA_sg				109C	C_OA_OT_OC_Oa_st_sc_st_st_sa_sc_sg_sC_OC_OA_OG
10gD	c_sa_st_sc_sa_st_sc_st_st_sa_sc_sg_sc_sc_sa_sg				109C	C_OA_OT_OC_Oa_st_sc_st_st_sa_sc_sg_sC_OC_OA_OG
10gD	c_sa_st_sc_sa_st_sc_st_st_sa_sc_sg_sc_sc_sa_sg	1505	110	GAGGGCGAATCAAATC	110A	G_sA_sG_sG_sg_sc_sg_sa_sa_st_sc_sa_sA_sA_sT_sC
110B	G_sA_sG_sG_sg_sc_sg_sa_sa_st_sc_sa_sA_sA_sT_sc	1505	110	GAGGGCGAATCAAATC	110A	G_sA_sG_sG_sg_sc_sg_sa_sa_st_sc_sa_sA_sA_sT_sC
110B	G_sA_sG_sG_sg_sc_sg_sa_sa_st_sc_sa_sA_sA_sT_sc				110C	G_OA_OG_OG_Og_sc_sg_sa_sa_st_sc_sa_sA_OA_OT_OC
110D	g_sa_sg_sg_sg_sc_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sa_st_sc				110C	G_OA_OG_OG_Og_sc_sg_sa_sa_st_sc_sa_sA_OA_OT_OC
110D	g_sa_sg_sg_sg_sc_sg_sa_sa_st_sc_sa_sa_sa_st_sc	1521	111	GCTCTATGACAGGGAG	111A	G_sC_sT_sC_st_sa_st_sg_sa_sc_sa_sg_sG_sG_sA_sG
111B	G_sC_sT_sC_st_sa_st_sg_sa_sc_sa_sg_sG_sG_sA_sg	1521	111	GCTCTATGACAGGGAG	111A	G_sC_sT_sC_st_sa_st_sg_sa_sc_sa_sg_sG_sG_sA_sG
111B	G_sC_sT_sC_st_sa_st_sg_sa_sc_sa_sg_sG_sG_sA_sg				111C	G_OC_OT_OC_Ot_sa_st_sg_sa_sc_sa_sg_sG_OG_OA_OG
111D	g_sc_st_sc_st_sa_st_sg_sa_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sg				111C	G_OC_OT_OC_Ot_sa_st_sg_sa_sc_sa_sg_sG_OG_OA_OG
111D	g_sc_st_sc_st_sa_st_sg_sa_sc_sa_sg_sg_sg_sa_sg	1537	112	AACAATCCACCCTGCA	112A	A_sA_sC_sA_sa_st_sc_sc_sa_sc_sc_sc_sT_sG_sC_sA
112B	A_sA_sC_sA_sa_st_sc_sc_sa_sc_sc_sc_sT_sG_sC_sa	1537	112	AACAATCCACCCTGCA	112A	A_sA_sC_sA_sa_st_sc_sc_sa_sc_sc_sc_sT_sG_sC_sA
112B	A_sA_sC_sA_sa_st_sc_sc_sa_sc_sc_sc_sT_sG_sC_sa				112C	A_OA_OC_OA_Oa_st_sc_sc_sa_sc_sc_sc_sT_OG_OC_OA
112D	a_sa_sc_sa_sa_st_sc_sc_sa_sc_sc_sc_st_sg_sc_sa				112C	A_OA_OC_OA_Oa_st_sc_sc_sa_sc_sc_sc_sT_OG_OC_OA
112D	a_sa_sc_sa_sa_st_sc_sc_sa_sc_sc_sc_st_sg_sc_sa	1553	113	TTTCCAGCGAAGCTGT	113A	T_sT_sT_sC_sc_sa_sg_sc_sg_sa_sa_sg_sC_sT_sG_sT
113B	T_sT_sT_sC_sc_sa_sg_sc_sg_sa_sa_sg_sC_sT_sG_st	1553	113	TTTCCAGCGAAGCTGT	113A	T_sT_sT_sC_sc_sa_sg_sc_sg_sa_sa_sg_sC_sT_sG_sT
113B	T_sT_sT_sC_sc_sa_sg_sc_sg_sa_sa_sg_sC_sT_sG_st				113C	T_OT_OT_OC_Oc_sa_sg_sc_sg_sa_sa_sg_sC_OT_OG_OT
113D	t_st_st_sc_sc_sa_sg_sc_sg_sa_sa_sg_sc_st_sg_st				113C	T_OT_OT_OC_Oc_sa_sg_sc_sg_sa_sa_sg_sC_OT_OG_OT

接下页

表1，接上页

1569	114	AGATGACCTCCAGAGG	114A	A_sG_sA_sT_sg_sa_sc_sc_st_sc_sc_sa_sG_sA_sG_sG
1569	114	AGATGACCTCCAGAGG	114A	A_sG_sA_sT_sg_sa_sc_sc_st_sc_sc_sa_sG_sA_sG_sG	114B	A_sG_sA_sT_sg_sa_sc_sc_st_sc_sc_sa_sG_sA_sG_sg
			114C	A_OG_OA_OT_Og_sa_sc_sc_st_sc_sc_sa_sG_OA_OG_OG	114B	A_sG_sA_sT_sg_sa_sc_sc_st_sc_sc_sa_sG_sA_sG_sg
			114C	A_OG_OA_OT_Og_sa_sc_sc_st_sc_sc_sa_sG_OA_OG_OG	114D	a_sg_sa_st_sg_sa_sc_sc_st_sc_sc_sa_sg_sa_sg_sg
1585	115	TTCTCAGGAACAGCCG	115A	T_sT_sC_sT_sc_sa_sg_sg_sa_sa_sc_sa_sG_sC_sC_sG	114D	a_sg_sa_st_sg_sa_sc_sc_st_sc_sc_sa_sg_sa_sg_sg
1585	115	TTCTCAGGAACAGCCG	115A	T_sT_sC_sT_sc_sa_sg_sg_sa_sa_sc_sa_sG_sC_sC_sG	115B	T_sT_sC_sT_sc_sa_sg_sg_sa_sa_sc_sa_sG_sC_sC_sg
			115C	T_OT_OC_OT_Oc_sa_sg_sg_sa_sa_sc_sa_sG_OC_OC_OG	115B	T_sT_sC_sT_sc_sa_sg_sg_sa_sa_sc_sa_sG_sC_sC_sg
			115C	T_OT_OC_OT_Oc_sa_sg_sg_sa_sa_sc_sa_sG_OC_OC_OG	115D	t_st_sc_st_sc_sa_sg_sg_sa_sa_sc_sa_sg_sc_sc_sg
1601	116	ATGACAGGCTTTTTAT	116A	A_sT_sG_sA_sc_sa_sg_sg_sc_st_st_st_sT_sT_sA_sT	115D	t_st_sc_st_sc_sa_sg_sg_sa_sa_sc_sa_sg_sc_sc_sg
1601	116	ATGACAGGCTTTTTAT	116A	A_sT_sG_sA_sc_sa_sg_sg_sc_st_st_st_sT_sT_sA_sT	116B	A_sT_sG_sA_sc_sa_sg_sg_sc_st_st_st_sT_sT_sA_st
			116C	A_OT_OG_OA_Oc_sa_sg_sg_sc_st_st_st_sT_OT_OA_OT	116B	A_sT_sG_sA_sc_sa_sg_sg_sc_st_st_st_sT_sT_sA_st
			116C	A_OT_OG_OA_Oc_sa_sg_sg_sc_st_st_st_sT_OT_OA_OT	116D	a_st_sg_sa_sc_sa_sg_sg_sc_at_st_st_st_st_sa_st

表2本发明的寡聚化合物

在15PC3细胞内检测寡聚化合物降低生存素mRNA水平的能力。数据以相对于模拟转染细胞的百分比表示出来。转录稳定状态用实时PCR检测，并用GAPDH转录稳定水平进行标准化。注意所有LNA的C都是5’-甲基-胞嘧啶。

接下页

表2，接上页

215(c)	123	AGCAGAAGAAACACTG	123A	A_sG_sC_sA_sg_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sc_sA_sC_sT_sG	85	26
215(c)	123	AGCAGAAGAAACACTG	123A	A_sG_sC_sA_sg_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sc_sA_sC_sT_sG	85	26			123B	A_sG_sC_sA_sg_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sc_sA_sC_sT_sg
			123C	A_OG_OC_OA_Og_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sc_sA_OC_OT_OG					123B	A_sG_sC_sA_sg_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sc_sA_sC_sT_sg
			123C	A_OG_OC_OA_Og_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sc_sA_OC_OT_OG					123D	a_sg_sc_sa_sg_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sc_sa_sc_st_sg
261(c)	124	TCCTCTATGGGGTCGT	124A	T_sC_sC_sT_sc_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_sT_sC_sG_sT	23	＜20			123D	a_sg_sc_sa_sg_sa_sa_sg_sa_sa_sa_sc_sa_sc_st_sg
261(c)	124	TCCTCTATGGGGTCGT	124A	T_sC_sC_sT_sc_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_sT_sC_sG_sT	23	＜20			124B	T_sC_sC_sT_sc_st_ga_st_sg_sg_sg_sg_sT_sC_sG_st
			124C	T_OC_OC_OT_Oc_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_sT_OC_OG_OT					124B	T_sC_sC_sT_sc_st_ga_st_sg_sg_sg_sg_sT_sC_sG_st
			124C	T_OC_OC_OT_Oc_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_sT_OC_OG_OT					124D	t_sc_sc_st_sc_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st
286(c)	125	GCAACCGGACGAATGC	125A	G_sC_sA_sA_sc_sc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sA_sT_sG_sC	64	＜20			124D	t_sc_sc_st_sc_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st
286(c)	125	GCAACCGGACGAATGC	125A	G_sC_sA_sA_sc_sc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sA_sT_sG_sC	64	＜20			125B	G_sC_sA_sA_sc_sc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sA_sT_sG_sC
			125C	G_OC_OA_OA_Oc_cc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sA_OT_OG_OC					125B	G_sC_sA_sA_sc_sc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sA_sT_sG_sC
			125C	G_OC_OA_OA_Oc_cc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sA_OT_OG_OC				125D	g_sc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sa_st_sg_sc
267(c)	126	TTATGTTCCTCTATGG	126A	T_sT_sA_sT_sg_st_st_sc_sc_st_sc_st_sA_sT_sG_sG	53			125D	g_sc_sa_sa_sc_sc_sg_sg_sa_sc_sg_sa_sa_st_sg_sc		＜20
267(c)	126	TTATGTTCCTCTATGG	126A	T_sT_sA_sT_sg_st_st_sc_sc_st_sc_st_sA_sT_sG_sG	53			126B	T_sT_sA_sT_sg_st_st_sc_sc_st_sc_st_sA_sT_sG_sg		＜20
			126C	T_OT_OA_OT_Og_st_st_sc_sc_st_sc_st_sA_OT_OG_OG				126B	T_sT_sA_sT_sg_st_st_sc_sc_st_sc_st_sA_sT_sG_sg
			126C	T_OT_OA_OT_Og_st_st_sc_sc_st_sc_st_sA_OT_OG_OG				126D	t_st_sa_st_sg_st_st_sc_sc_st_sc_st_sa_st_sg_sg
325(c)	127	GGTTAATTCTTCAAAC	127A	G_sG_sT_sT_sa_sa_st_st_sc_st_st_sc_sA_sA_sA_sC	17			126D	t_st_sa_st_sg_st_st_sc_sc_st_sc_st_sa_st_sg_sg		＜20
325(c)	127	GGTTAATTCTTCAAAC	127A	G_sG_sT_sT_sa_sa_st_st_sc_st_st_sc_sA_sA_sA_sC	17			127B	G_sG_sT_sT_sa_sa_st_st_sc_st_st_sc_sA_sA_sA_sc		＜20
			127C	G_OG_OT_OT_Oa_sa_st_st_sc_st_st_sc_sA_OA_OA_OC				127B	G_sG_sT_sT_sa_sa_st_st_sc_st_st_sc_sA_sA_sA_sc
			127C	G_OG_OT_OT_Oa_sa_st_st_sc_st_st_sc_sA_OA_OA_OC				127D	g_sg_st_st_sa_sa_st_st_sc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc
353(c)	128	CTCTGTCCAGTTTCAA	128A	C_sT_sC_sT_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_sC_sA_sA	76			127D	g_sg_st_st_sa_sa_st_st_sc_st_st_sc_sa_sa_sa_sc		60
353(c)	128	CTCTGTCCAGTTTCAA	128A	C_sT_sC_sT_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_sC_sA_sA	76			128B	C_sT_sC_sT_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_sC_sA_sa	77	60
			128C	C_OT_OC_OT_Og_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_OC_OA_OA				128B	C_sT_sC_sT_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_sC_sA_sa	77
			128C	C_OT_OC_OT_Og_st_sc_sc_sa_sg_st_st_sT_OC_OA_OA				128D	c_st_sc_st_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sa
375(c)	129	GCAATTTTGTTCTTGG	129A	G_sC_sA_sA_st_st_st_st_sg_st_st_sc_sT_sT_sG_sG	73			128D	c_st_sc_st_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sa		49
375(c)	129	GCAATTTTGTTCTTGG	129A	G_sC_sA_sA_st_st_st_st_sg_st_st_sc_sT_sT_sG_sG	73			129B	G_sC_sA_sA_st_st_st_st_sg_st_st_sc_sT_sT_sG_sg		49
			129C	G_OC_OA_OA_Ot_st_st_st_sg_st_st_sc_sT_OT_OG_OG				129B	G_sC_sA_sA_st_st_st_st_sg_st_st_sc_sT_sT_sG_sg
			129C	G_OC_OA_OA_Ot_st_st_st_sg_st_st_sc_sT_OT_OG_OG				129D	g_sc_sa_sa_st_st_st_st_sg_st_st_sc_st_st_sg_sg
464(c)	130	CTCAATCCATGGCAGC	130A	C_sT_sC_sA_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sC_sA_sG_sC	77			129D	g_sc_sa_sa_st_st_st_st_sg_st_st_sc_st_st_sg_sg		40
464(c)	130	CTCAATCCATGGCAGC	130A	C_sT_sC_sA_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sC_sA_sG_sC	77		lead	130B	C_sT_sC_sA_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sC_sA_sG_sc		40
			130C	C_OT_OC_OA_Oa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sC_OA_OG_OC			lead	130B	C_sT_sC_sA_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sC_sA_sG_sc
			130C	C_OT_OC_OA_Oa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sC_OA_OG_OC				130D	c_st_sc_sa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sc_sa_sg_sc
159(c)	131	CCAGCCTCGGCCATCC	131A	C_sC_sA_sG_sc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sA_sT_sC_sC	80			130D	c_st_sc_sa_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_sc_sa_sg_sc		29
159(c)	131	CCAGCCTCGGCCATCC	131A	C_sC_sA_sG_sc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sA_sT_sC_sC	80			131B	C_sC_sA_sG_sc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sA_sT_sC_sc	94	29
			131C	C_OC_OA_OG_Oc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sA_OT_OC_OC				131B	C_sC_sA_sG_sc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sA_sT_sC_sc	94
			131C	C_OC_OA_OG_Oc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sA_OT_OC_OC				131D	c_sc_sa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sa_st_sc_sc
350(c)	132	TGTCCAGTTTCAAAAA	132A	T_sG_sT_sC_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sA_sA_sA_sA	＜20			131D	c_sc_sa_sg_sc_sc_st_sc_sg_sg_sc_sc_sa_st_sc_sc		＜20

接下页

表2，接上页

132B	T_sG_sT_sC_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sA_sA_sA_sa
132B	T_sG_sT_sC_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sA_sA_sA_sa						132C	T_OG_OT_OC_Oc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sA_OA_OA_OA
132D	t_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sa_sa_sa_sa						132C	T_OG_OT_OC_Oc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sA_OA_OA_OA
132D	t_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sa_sa_sa_sa			351(c)	133	CTGTCCAGTTTCAAAA	133A	C_sT_sG_sT_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sA_sA_sA_sA	＜20	＜20
133B	C_sT_sG_sT_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sA_sA_sA_sa			351(c)	133	CTGTCCAGTTTCAAAA	133A	C_sT_sG_sT_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sA_sA_sA_sA	＜20	＜20
133B	C_sT_sG_sT_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sA_sA_sA_sa						133C	C_OT_OG_OT_Oc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sA_OA_OA_OA
133D	c_st_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sa_sa_sa						133C	C_OT_OG_OT_Oc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sA_OA_OA_OA
133D	c_st_sg_st_sc_sc_sa_sg_st_st_st_sc_sa_sa_sa_sa			47(c)	134	TCGGGGCACCCATGCC	134A	T_sC_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_sT_sG_sC_sC
134B	T_sC_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_sT_sG_sC_sc			47(c)	134	TCGGGGCACCCATGCC	134A	T_sC_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_sT_sG_sC_sC
134B	T_sC_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_sT_sG_sC_sc				134C	T_OC_OG_OG_Og_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_sT_OG_OC_OC
134D	t_sc_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_st_sg_sc_sc				134C	T_OC_OG_OG_Og_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_sT_OG_OC_OC
134D	t_sc_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sc_sc_sc_sa_st_sg_sc_sc	456(c)	135	ATGGCAGCCAGCTGCT	135A	A_sT_sG_sG_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sc_sT_sG_sC_sT
135B	A_sT_sG_sG_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sc_sT_sG_sC_st	456(c)	135	ATGGCAGCCAGCTGCT	135A	A_sT_sG_sG_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sc_sT_sG_sC_sT
135B	A_sT_sG_sG_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sc_sT_sG_sC_st				135C	A_OT_OG_OG_Oc_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sc_sT_OG_OC_OT
135D	a_st_sg_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sc_st_sg_sc_st				135C	A_OT_OG_OG_Oc_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sc_sT_OG_OC_OT
135D	a_st_sg_sg_sc_sa_sg_sc_sc_sa_sg_sc_st_sg_sc_st	470(c)	136	AGAGGCCTCAATCCAT	136A	A_sG_sA_sG_sg_sc_sc_st_sc_sa_sa_st_sC_sC_sA_sT
136B	A_sG_sA_sG_sg_sc_sc_st_sc_sa_sa_st_sC_sC_sA_st	470(c)	136	AGAGGCCTCAATCCAT	136A	A_sG_sA_sG_sg_sc_sc_st_sc_sa_sa_st_sC_sC_sA_sT
136B	A_sG_sA_sG_sg_sc_sc_st_sc_sa_sa_st_sC_sC_sA_st				136C	A_OG_OA_OG_Og_sc_sc_st_sc_sa_sa_st_sC_OC_OA_OT
136D	a_sg_sa_sg_sg_sc_sc_st_sc_sa_sa_st_sc_sc_sa_st				136C	A_OG_OA_OG_Og_sc_sc_st_sc_sa_sa_st_sC_OC_OA_OT
136D	a_sg_sa_sg_sg_sc_sc_st_sc_sa_sa_st_sc_sc_sa_st	55(c)	137	GGGCAACGTCGGGGCA	137A	G_sG_sG_sC_sa_sa_sc_sg_st_sc_sg_sg_sG_sG_sC_sA
137B	G_sG_sG_sC_sa_sa_sc_sg_st_sc_sg_sg_sG_sG_sC_sa	55(c)	137	GGGCAACGTCGGGGCA	137A	G_sG_sG_sC_sa_sa_sc_sg_st_sc_sg_sg_sG_sG_sC_sA
137B	G_sG_sG_sC_sa_sa_sc_sg_st_sc_sg_sg_sG_sG_sC_sa				137C	G_OG_OG_OC_Oa_sa_sc_sg_st_sc_sg_sg_sG_OG_OC_OA
137D	g_sg_sg_sc_sa_sa_sc_sg_st_sc_sg_sg_sg_sg_sc_sa				137C	G_OG_OG_OC_Oa_sa_sc_sg_st_sc_sg_sg_sG_OG_OC_OA
137D	g_sg_sg_sc_sa_sa_sc_sg_st_sc_sg_sg_sg_sg_sc_sa	66(c)	138	TGCCAGGCAGGGGGCA	138A	T_sG_sC_sC_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sG_sG_sC_sA
138B		66(c)	138	TGCCAGGCAGGGGGCA	138A	T_sG_sC_sC_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sG_sG_sC_sA
138B					138C	T_sG_sC_sC_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sG_sG_sC_sA
138D	t_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sg_sc_sa				138C	T_sG_sC_sC_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sG_sG_sC_sA
138D	t_sg_sc_sc_sa_sg_sg_sc_sa_sg_sg_sg_sg_sg_sc_sa	140(c)	139	CCGGGGTGCAGGCGCA	139A	C_sC_sG_sG_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg_sg_sC_sG_sC_sA
139B	C_sC_sG_sG_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg_sg_sC_sG_sC_sa	140(c)	139	CCGGGGTGCAGGCGCA	139A	C_sC_sG_sG_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg_sg_sC_sG_sC_sA
139B	C_sC_sG_sG_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg_sg_sC_sG_sC_sa				139C	C_OC_OG_OG_Og_sg_st_sg_sc_sa_sg_sg_sC_OG_OC_OA
139D	c_sc_sg_sg_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg_sg_sc_sg_sc_sa				139C	C_OC_OG_OG_Og_sg_st_sg_sc_sa_sg_sg_sC_OG_OC_OA
139D	c_sc_sg_sg_sg_sg_st_sg_sc_sa_sg_sg_sc_sg_sc_sa	148(c)	140	CATCCGCTCCGGGGTG	140A	C_sA_sT_sC_sc_sg_sc_st_sc_sc_sg_sg_sG_sG_sT_sG
140B	C_sA_sT_sC_sc_sg_sc_st_sc_sc_sg_sg_sG_sG_sT_sg	148(c)	140	CATCCGCTCCGGGGTG	140A	C_sA_sT_sC_sc_sg_sc_st_sc_sc_sg_sg_sG_sG_sT_sG

接下页

表2，接上页

			140C	C_OA_OT_OC_Oc_sg_sc_st_sc_sc_sg_sg_sG_OG_OT_OG
			140C	C_OA_OT_OC_Oc_sg_sc_st_sc_sc_sg_sg_sG_OG_OT_OG	140D	C_sA_sT_sC_sC_sG_sC_sT_sC_sC_sG_sG_sG_sG_sT_sG
177(c)	141	GTGGGGCAGTGGATGA	141A	G_sT_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_sT_sG_sA	140D	C_sA_sT_sC_sC_sG_sC_sT_sC_sC_sG_sG_sG_sG_sT_sG
177(c)	141	GTGGGGCAGTGGATGA	141A	G_sT_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_sT_sG_sA	141B	G_sT_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_sT_sG_sa
			141C	G_OT_OG_OG_Og_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_OT_OG_OA	141B	G_sT_sG_sG_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_sT_sG_sa
			141C	G_OT_OG_OG_Og_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sA_OT_OG_OA	141D	g_st_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sa_st_sg_sa
260(c)	142	CCTCTATGGGGTCGTC	142A	C_sC_sT_sC_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sC_sG_sT_sC	141D	g_st_sg_sg_sg_sg_sc_sa_sg_st_sg_sg_sa_st_sg_sa
260(c)	142	CCTCTATGGGGTCGTC	142A	C_sC_sT_sC_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sC_sG_sT_sC	142B	C_sC_sT_sC_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sC_sG_sT_st
			142C	C_OC_OT_OC_Ot_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sC_OG_OT_OC	142B	C_sC_sT_sC_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sC_sG_sT_st
			142C	C_OC_OT_OC_Ot_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sC_OG_OT_OC	142D	c_sc_st_sc_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sc
274(c)	143	ATGCTTTTTATGTTCC	143A	A_sT_sG_sC_st_st_st_st_st_sa_st_sg_sT_sT_sC_sC	142D	c_sc_st_sc_st_sa_st_sg_sg_sg_sg_st_sc_sg_st_sc
274(c)	143	ATGCTTTTTATGTTCC	143A	A_sT_sG_sC_st_st_st_st_st_sa_st_sg_sT_sT_sC_sC	143B	A_sT_sG_sC_st_st_st_st_st_sa_st_sg_sT_sT_sC_st
			143C	A_OT_OG_OC_Ot_st_st_st_st_sa_st_sg_sT_OT_OC_OC	143B	A_sT_sG_sC_st_st_st_st_st_sa_st_sg_sT_sT_sC_st
			143C	A_OT_OG_OC_Ot_st_st_st_st_sa_st_sg_sT_OT_OC_OC	143D	a_st_sg_sc_st_st_st_st_st_sa_st_sg_st_st_sc_sc
384(c)	144	GTTTCCTTTGCAATTT	144A	G_sT_sT_sT_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sA_sT_sT_sT	143D	a_st_sg_sc_st_st_st_st_st_sa_st_sg_st_st_sc_sc
384(c)	144	GTTTCCTTTGCAATTT	144A	G_sT_sT_sT_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sA_sT_sT_sT	144B	G_sT_sT_sT_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sA_sT_sT_st
			144C	G_OT_OT_OT_Oc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sA_OT_OT_OT	144B	G_sT_sT_sT_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sA_sT_sT_st
			144C	G_OT_OT_OT_Oc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sA_OT_OT_OT	144D	g_st_st_st_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sa_st_st_st
ISIS23722	145	TGTGCTATTCTGTGAATT(18-mer)	145A	T_sG_sT_sG_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sg_sA_sA_sT_sT	144D	g_st_st_st_sc_sc_st_st_st_sg_sc_sa_sa_st_st_st
ISIS23722	145	TGTGCTATTCTGTGAATT(18-mer)	145A	T_sG_sT_sG_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sg_sA_sA_sT_sT	145C	T_OG_OT_OG_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sg_sA_OA_OT_OT
			145D	t_sg_st_sg_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sg_sa_sa_st_st	145C	T_OG_OT_OG_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sg_sA_OA_OT_OT
			145D	t_sg_st_sg_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sg_sa_sa_st_st	145F	T_sG_sT_sG_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sg_sA_sA_sT_sT
	146		146A	T_sA_sA_sG_sc_st_sg_st_st_sc_st_sa_st_sg_sT_sG_sT_sT^*	145F	T_sG_sT_sG_sc_st_sa_st_st_sc_st_sg_st_sg_sA_sA_sT_sT
	146		146A	T_sA_sA_sG_sc_st_sg_st_st_sc_st_sa_st_sg_sT_sG_sT_sT^*	146C	T_OA_OA_OG_sc_st_sg_st_st_sc_st_sa_st_sg_sT_OG_OT_OT
			146F	T_sA_sA_sG_sc_st_sg_st_st_sc_st_sa_st_sg_sT_sG_sT_sT	146C	T_OA_OA_OG_sc_st_sg_st_st_sc_st_sa_st_sg_sT_OG_OT_OT

*下划线的化合物代表与上面的化合物相比有错配。化合物145F和146F包含以大写斜体字字母表示的MOE成分，其是化合物ISIS23722。

表3：含有LNA(β-D-氧-LNA)的寡聚化合物在两种不同来源的细胞系中的IC₅₀(nM)。

检测了寡聚化合物在15PC3和MCF7细胞内降低生存素mRNA水平的能力。通过实时PCR监视转录稳定状态，并用GAPDF转录稳定水平进行标准化。

Seq ID/design	MCF7	15PC3
Seq ID/design	MCF7	15PC3	2A	28	5
2B		＜5	2A	28	5
2B		＜5	4A		＜5
4B		5	4A		＜5
4B		5	6A	8	3
6B		＜5	6A	8	3
6B		＜5	9A	11	3
15A	1	＜1	9A	11	3
15A	1	＜1	15B		＜1
15E		1	15B		＜1
15E		1	118A		＜5
120A		＜25	118A		＜5
120A		＜25	123A		＜5
128A		＜5	123A		＜5
128A		＜5	128B		＜25
129A		＜25	128B		＜25
129A		＜25	131A		＜25
131B		＜5	131A		＜25

如表1和2所示，SEQ ID NO 2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、118、119、120、121、122、123、125、126、128、129、130和131在25nM时表现出对生存素表达的至少30％的抑制，因此它们是优选的。

尤其感兴趣的化合物是2A、2B、4A、4B、6A、6B、15A、15B、15E、119A、119B、121A、121B、128A、128B、130A、130B、131A和131B。

实施例11：与硫代磷酸和MOE相比，使用锚定核酸反义寡聚化合物体外对生存素的表达抑制提高。

用硫代磷酸和MOE(Calbiochem)与含有LNA的寡聚核苷酸在15PC3细胞中的比值来进行对mRNA抑制的比较。一种LNA即ISIS23722与含有MOE的化合物比较，上述含有MOE的化合物是18mer的4MOE/PS+10PS+4MOE/PS，还与一种异连续的硫代磷酸进行了比较。用寡聚核苷酸或者培养基(mock)转染15PC3细胞(参看实施例5)。生存素mRNA用实时PCR来检测，并用GAPDH转录稳定水平进行标准化。生存素mRNA表示为与模拟物表达的相对值(参看表4)

表4.mRNA下调的百分比

	0.2nM	1nM	5nM	25nM	100nM
	0.2nM	1nM	5nM	25nM	100nM	含有LNA的ISIS23722(4LNA/PS+10PS+4LNA/PS)145A	＜20％	＜48％	＜79％	84％	76％
MOE化合物ISIS23722(4MOE/PS+lOPS+4MOE/PS)145F	＜20％	＜20％	＜20％	＜20％	＜46％	含有LNA的ISIS23722(4LNA/PS+10PS+4LNA/PS)145A	＜20％	＜48％	＜79％	84％	76％
MOE化合物ISIS23722(4MOE/PS+lOPS+4MOE/PS)145F	＜20％	＜20％	＜20％	＜20％	＜46％	硫代磷酸ISIS23722(18PS)145D	22％	＜20％	＜20％	＜20％	＜20％
有6个不配对的LNAISIS23722146C				＜20％	＜20％	硫代磷酸ISIS23722(18PS)145D	22％	＜20％	＜20％	＜20％	＜20％
有6个不配对的LNAISIS23722146C				＜20％	＜20％	有6个不配对的MOEISIS23722146F				＜20％	＜20％

在另一个实验中，也分析了各细胞培养孔的上清，以分析细胞后期的凋亡。上面的18mer的LNA、PS和MOE化合物与本发明的16mer的LNA进行了比较。用给定浓度的所述寡聚物转染15PC3细胞(参看实施例5)。总RNA第24小时提取。培养液上清中的细胞包括在分析中。生存素mRNA用实时PCR监控，并用GAPDH进行标准化。

生存素mRNA表示为与模拟物表达的相对值(参看表5)

Seq.ID	100nM	25nM	5nM
Seq.ID	100nM	25nM	5nM	含有LNA的ISIS23722(4LNA/PS+10PS+4LNA/PS)145A	91％	94％	89％
含有LNA的ISIS23722(4LNA/PO+10PS+4LNA/PO)145A	89％	88％	79％	含有LNA的ISIS23722(4LNA/PS+10PS+4LNA/PS)145A	91％	94％	89％
含有LNA的ISIS23722(4LNA/PO+10PS+4LNA/PO)145A	89％	88％	79％	MOE化合物ISIS23722(4MOE/PS+lOPS+4MOE/PS)145F	68％	36％	＜20％
硫代磷酸ISIS23722(18PS)145D	35％	＜20％	＜20％	MOE化合物ISIS23722(4MOE/PS+lOPS+4MOE/PS)145F	68％	36％	＜20％
硫代磷酸ISIS23722(18PS)145D	35％	＜20％	＜20％	LNA化合物2A(16mer)	99％	90％	66％
LNA化合物6A(16mer)		98％	90％	LNA化合物2A(16mer)	99％	90％	66％
LNA化合物6A(16mer)		98％	90％	LNA化合物15B(16mer)	97％	97％	99％

实施例12：LNA反义寡聚化合物引起的细胞凋亡

在转染前一天，以每孔12000个细胞接种到白色96孔板(Nunc 136101)的DMEM培养基中。第二天，用预温的OptiMEM(Invitrogen)洗一遍细胞，接着加入含有5μg/ml Lipofectamine2000(Invitrogen)的72μl OptiMEM。在加入18μl以OptiMEM稀释的寡聚核苷酸之前，培养细胞7分钟。最终寡聚核苷酸的浓度是5nM-25nM。处理4小时以后，细胞用OptiMEM清洗，再加入100μl含有血清的OptiMEM培养液。

在用寡聚物处理之后，让细胞恢复一段时间后从CO₂培养中取出，并平衡到室温15分钟。将高敏感的Caspase3/7-Glo^TM试剂(Promega)直接加入到96孔板的各孔中，将96孔板孵育20分钟后，再进一步延迟1分钟后，用Lumnioskan Ascent仪器通过Thermo Labsystems记录荧光(荧光素酶活性)。荧光素酶活性以每秒的相对光单位(RLU/s)来计算，用Ascent软件(v2.6)来处理数据，在EXCEL中绘制图表(参看图8)

实施例13：体外使用LNA反义寡聚具有与硫代磷酸和MOE相比更高的凋亡诱导率。

使用BD^TM流式微珠阵列(CBA)(批号：557816)来检测凋亡。如前所述(参看实施例5)，使用Lipofecamine2000转染细胞。转染24小时后，上清中的细胞离心下来，贴壁的细胞用胰蛋白消化后再离心。用PBS重悬/清洗细胞沉淀，计数后用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液将细胞调至2×10⁶个/ml的浓度。实验步骤是按照手册的介绍进行并进行了下面的修改。将细胞裂解40分钟，并每隔10分钟震荡一次。将1×105个细胞与Caspase 3，Bcl-2和PARP珠孵育，在简单混合后，在室温培养1个小时。使用BD^TMCBA软件分析经寡聚化合物处理的细胞的Caspase 3的活性、Bcl-2的表达以及PARP的诱导。数据转换成excel格式并绘制图表。所有数据都是与模拟物(mock)(将其设定为1)的相对值。图9说明，包含LNA的化合物(145A和145C)，与异连续的MOE化合物ISIS27322(此处145F)、异连续的硫代磷酸化合物(145D)相比，对凋亡的诱导增加。本研究还包括了作为错配对照的一种LNA化合物(146C)和一种MOE化合物(146F)，也包括LNA化合物15A。而且，经LNA寡聚化合物处理的细胞可以通过组织化学分析检测到化合物15A引起Caspase3激活(图10)。

实施例14：反义寡聚核苷酸对增殖的癌细胞中生存素的抑制。

在转染前一天，以每孔12000个细胞接种到白色96孔板(Nunc 136101)的DMEM培养基中。第二天，用预温的OptiMEM(Invitrogen)洗一遍细胞，接着加入含有5μg/ml Lipofectamine2000(Invitrogen)的72μl OptiMEM。在加入18μl用OptiMEM稀释的寡聚核苷酸之前，培养细胞7分钟。最终寡聚核苷酸的浓度是5nM-100nM。处理4小时以后，细胞用OptiMEM清洗，再加入100μl含有血清的OptiMEM培养液。寡聚物处理细胞后，让细胞恢复一段需要的时间。通过添加20μl的四唑化合物[3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-硫苯基)-2H-四唑内盐；MTS]和一种电子偶联剂(乙硫吩嗪PES)(CeIlTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega)来检测活细胞。用Powerwave仪器在490nm处检测活细胞。生长率(ΔOD/小时)以寡聚物浓度为参照作图(参看图11)。

实施例15：在用针对生存素的寡聚核苷酸处理细胞后，检测细胞整倍体(ploidy)(细胞周期)和DNA降解(凋亡)。

凋亡的最后阶段会引起大量小片段DNA的产生，这可以通过碘化丙啶染色来分析，而且碘化丙啶染色可以用来分析被处理细胞的整倍体。为了估算用针对生存素的寡聚化合物处理的细胞的整倍体/凋亡，在PBA中清洗细胞并70％乙醇于4℃固定1个小时。在室温下用50μg/ml的RNA酶(Sigma)处理20分钟后，用PBS清洗细胞，再与40μg/m的碘化丙啶(Sigma或者BD)孵育30分钟。所有样品使用荧光活化细胞筛选仪(FACSCalibur，BectonDickinson)和CellQuest软件分析。在DNA直方图中，亚二倍体或者亚G1峰代表凋亡的细胞。

实施例16：在用针对生存素的寡聚核苷酸处理细胞后，检测细胞线粒体膜势能的变化。

为了检测细胞线粒体膜势能的变化，使用了MitoSensor^TM试剂和方法(Becton Dickinson，批号：K2017-1)。MitoSensor^TM被正常细胞吸收，在细胞内聚集并发出红色荧光。对于凋亡细胞，其线粒体膜势能变化，不允许该试剂在线粒体内聚集，因此其以单体的形式保留在细胞质内，此时发出绿色荧光。将经针对生存素的寡聚化合物处理的细胞清洗，并根据厂商说明，用孵育缓冲液稀释MitoSensor试剂后，将细胞在其中孵育。寡聚物处理后膜势能的变化，用荧光活化细胞筛选仪(FACSCalibur，Becton Dickinson)和CellQuest软件分析。

实施例17：反义寡聚物处理后，对内皮细胞毛细血管形成的抑制。

将内皮单层细胞(例如HUVEC)与针对生存素的反义寡聚物共同孵育。利用下面两种方法的任一种来分析导管的形成。第一种方法是BD BioCoat血管生成系统。如所述的那样(实施例5)，用寡聚物转染细胞。将转染的细胞以2×10⁴个/孔接种于基底膜基质(matrigel)聚合的BD BioCoat血管生成平板上。将平板在有/无PMA(5-50nM)、VEGF(20-200ng/ml)、苏拉明或者溶剂对照(vehicle)的情况下孵育几小时/几天。用Cacein AM如手册所述将平板染色并拍照。使用MetaMorph检测总导管长度。可以选择的是，将细胞接种到含有大鼠尾I型胶原蛋白(3mg/ml，Becton Dickinson)的0.1倍体积的10×DMEM中，用灭菌的1M NaOH中和并放置在冰上或者基底膜基质上。将细胞加入到胶原蛋白悬浮液中直至终浓度为1×10⁶细胞/ml胶原蛋白。将细胞-胶原蛋白混合物加入到6孔板或者35毫米平板中，放于37℃潮湿的培养箱中。加入3ml凝胶状的并另外含有10％胎牛血清的培养液后，使细胞在一段时间内形成毛细管样血管，所述时间长短根据含有还是不含PMA(16nM)、VEGF(50ng/ml)来决定。在将凝胶冷冻切片后，用相差显微镜观察切片，对血管形成进行定量。

实施例18：在用针对生存素的寡聚核苷酸处理细胞后，检测体外细胞毒性。

接种细胞(0.3～1.2×10⁴)，并用所述反义核苷酸(实施例12中用于MTS分析的样品)处理。在所述时间，将20-50μl培养基从反义物处理的细胞转移到96孔板，检测释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)。加入与说明书所述的相等体积的LDH底物。进行30分钟酶联检测来测定释放出的LDH，最终导致一种四唑盐(INT)转化成一种红色甲瓒产物。所形成的颜色的量与被裂解的细胞的数目成比例。使用标准96孔板阅读器(Powerwave，Bio-TekInstruments)收集可见波长的吸收数据(在490nm处检测)。作为阳性对照，将细胞用0.9％的Triton X-100处理大约45分钟(相当于100％裂解)。毒性通过与模拟物和TritonX-100的相对值在描绘(100％裂解相当于100％毒性)。

实施例19：体内模型：用反义寡聚核苷酸处理后，对人肿瘤细胞体内生长的肿瘤生长抑制。

从M&B、Denmark购买6个月的NMRI雌性无胸腺裸鼠，并在进行实验之前驯化至少一个星期。将人癌细胞(通常是悬浮在300μl基底膜基质(BDBioscience)的10⁶个细胞)皮下注射入7～8周的雌性NMRI无胸腺裸鼠的胁腹。当肿瘤生长被确立时，通常是后注射肿瘤细胞7～12天；使用皮下埋入的ALZET渗透泵将不同的反义寡聚核苷酸以5mg/kg/天的剂量给予28天。在腹部埋入之前，泵于室温在灭菌的PBS中孵育过夜，再开始泵液。对照动物只接受同样时间处理的盐溶液。每个实验组至少含有5只小鼠。通过确定对肿瘤体积的抑制来确定抗肿瘤活性。肿瘤的生长通常通过测量两个垂直的参数来确定。肿瘤体积通过公式(π×L×D²/6)来计算，其中L代表最大的直径，D代表肿瘤垂直于L的直径参数。在处理的最后，将动物处死并测量肿瘤的重量。用曼-怀氏检验(Mann-Whitney′s test)来比较各组的平均肿瘤体积和重量。使用SPSS11.0软件进行所有分析，该版本用于Windows。优选的是，进行蛋白质印迹分析来检测是否反义寡聚核苷酸会在蛋白质水平上有抑制作用。在处理的最后阶段，将小鼠麻醉后取出肿瘤并立即将肿瘤在液氮中冷冻。将细胞在裂解缓冲夜(例如20mM Tris-Cl[pH 7.5]；2％Triton X-100；1/100体积的蛋白酶抑制剂Cocktail Set III(Calbiochem)；1/100体积的蛋白酶抑制剂Cocktail Set II(Calbiochem))中于4℃用一种马达驱动的匀浆机进行匀浆。每组小鼠的肿瘤裂解夜集中在一起并13,000G 4℃离心5分钟，除去组织碎片。肿瘤提取物的蛋白浓度通过BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce，Rockford)来确定。将蛋白质提取物(50-100μg)在跨度为4-20％的SDS-PAGE梯度胶上分离并转到PVDF膜上，接下来使用氨基黑染色来显像。生存素的表达使用抗人的生存素的抗体，接着使用耦联了辣根过氧化物酶的抗羊IgG(DAKO)来检测。通过ECL Plus(Amersham biotech)来检测免疫反应性，并用Versadoc5000lite system(Bio-Rad)来定量。

实施例20：体内模型：腹膜内给予LNA反义寡聚物，对移植在裸鼠内的人肿瘤碎片的肿瘤生长的抑制。

在无胸腺裸鼠上检测LNA反义寡聚物的肿瘤生长抑制活性，该鼠是从Oncotest′s(Freiburg，Germany)饲养群落获得的NMRI nu/nu小鼠。人乳癌(MDA MB 231)、前列腺癌(PC3)或者肺癌(LXFE 397，Oncotest)的肿瘤碎片从裸鼠中经过一系列传代的异种移植体获得。将肿瘤从供体小鼠取出后，将其切成碎片(1-2毫米直径)并置于RPMI1640培养基中直到皮下埋入。将受体鼠用异氟醚麻醉。在背部皮肤切开一个小口。用镊子将肿瘤碎片(每只小鼠2个片断)埋入该小口内。MDA MB 231和LXFE 397肿瘤移植入雌性小鼠内，PC3肿瘤移植入雄性小鼠内。当肿瘤的平均直径达到4-6毫米时，随机选取小鼠，用寡聚核苷酸以每日一次20mg/kg腹膜内给予，持续三个星期(除去周末)。在所有实验中包括了溶剂对照(盐水)和阳性对照(红豆杉醇，20mg/kg/天)组。所有组都包括6只小鼠。肿瘤体积通过用一种测径器两维测量来确定，随机选取一天开始(Day 0)，以后每星期测量两次。肿瘤体积通过公式：(a×b²)×0.5来计算，其中a代表最大直径，b代表垂直肿瘤直径。在随机化后，每天观察小鼠持续28天，直到肿瘤的体积变为两倍。当肿瘤的直径超过1.6厘米时，处死小鼠。

为了评定肿瘤抑制的统计显著性，进行了曼-惠特尼(Mann-Whitney-Wilcoxon)U-检测。按照惯例，P-值＜0.05表示肿瘤抑制的显著性。

实施例21：寡聚核苷酸在小鼠体内的生物分布

在开始实验之前，将从M&B，Denmark获得的6周大的雌性NMRI无胸腺裸鼠适应至少一个星期。将人癌细胞(通常是溶解在300μl基底膜基质(BDBioscience)的10⁶个细胞)皮下注射入7～8周雌性NMRI无胸腺裸鼠的胁腹。当肿瘤生长明显以后，使用皮下埋入的ALZET渗透泵，用不同的反义寡聚核苷酸以5mg/kg/天的剂量处理14天。寡聚核苷酸是氚标记的，如Graham MJ等(J Pharmacol Exp Ther 1998；286(1)：447-458)所述。通过对所有器官中的组织提取物(肝、肾、脾脏、心、胃、肺、小肠、大肠、淋巴结、皮肤、肌肉、脂肪、骨头、骨髓)以及皮下移植的人肿瘤组织进行闪烁计数来定量寡聚核苷酸。

实施例22：锚定核酸化合物在人肿瘤异源移植物中的摄入

根据实施13，将人15PC3异种移植体在10倍体积的0.5％Igepal CA-630、25mM Tris pH 8.0、25mM EDTA、100mM NaCl、1mg/ml蛋白酶K1中匀浆并在37℃中孵育过夜后用酚氯仿抽提。在收集的水相中的反义寡聚核苷酸2650的浓度通过一种序列特异的酶联免疫吸附测定来确定。两个含有反义寡聚酸的互补序列的探针与反义寡聚物杂交，一个用生物素标记，一个用地高辛标记。用固定的链霉亲和素捕获复合物，并利用辣根过氧化物酶耦联的抗地高辛抗体和基本的酶联免疫吸附测定来定量。简单的说，10mMDNA捕获探针(5′-aactgtgc-生物素-3′)和10nM LNA检测探针(5′-DIG-GATGTTTCgatgtttc-3′)与样品或者标准品在包含1％封闭试剂(Roche批号：1096176)的PBS混合。通过加热混合物到70℃，以及逐步冷却到20℃，使探针与寡聚物退火。将混合物转移到链霉亲和素包被的孔中。通过使用一种辣根过氧化物酶耦联的抗地高辛抗体片段(Roche)和基本的酶联免疫吸附测定来对被捕获的地高辛抗体-探针进行定量。肿瘤组织中至少检测到1.3μg/g的寡聚化合物15A(数据没有调整为回归)。

本发明已经通过结合其优选的实施例进行了特别描述。因此，这些实施例只是用来说明发明而不是来限制。

Claims

1.一种由8-50个核苷酸和/或者核苷酸类似物组成的化合物，所述化合物包含至少8个核苷酸或者核苷酸类似物的子序列，所述子序列位于从由下列序列构成的组中选择的序列内：SEQ ID NOS：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143和144。

2.根据权利要求1所述化合物，所述子序列位于从由下列序列构成的组中选择的序列内：SEQ ID NOS：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132和133。

3.根据权利要求1或2所述化合物，其由8-40个核苷酸组成。

4.根据权利要求3所述化合物，其由8-20个核苷酸组成。

5.根据权利要求4所述化合物，其由12-20个核苷酸组成。

6.根据权利要求5所述化合物，其由12、13、14、15、16、17、18、19或者20个核苷酸组成。

7.根据权利要求6所述化合物，其由14、15、16、17或者18个核苷酸组成。

8.根据权利要求5所述化合物，其由15-17个核苷酸组成。

9.根据权利要求8所述化合物，其由15、16或者17个核苷酸组成。

10.根据权利要求8所述化合物，其由15个核苷酸组成。

11.根据权利要求9所述化合物，其由16个核苷酸组成。

12.根据权利要求9所述化合物，其由17个核苷酸组成。

13.根据前述任一项权利要求所述化合物，其包含至少10个核苷酸或者核苷酸类似物的子序列。

14.根据前述任一项权利要求所述化合物，其包含至少12个核苷酸或者核苷酸类似物的子序列。

15.根据前述任一项权利要求所述化合物，其包含至少14个核苷酸或者核苷酸类似物的子序列。

16.根据权利要求1-13的任一项所述化合物，其包含10、11、12、13、14、15或者16个核苷酸或者核苷酸类似物的子序列。

17.根据权利要求1-16的任一项所述化合物，其中所述核苷酸包含由磷酸基团、硫代磷酸基团和硼代磷酸基团构成的组中选择的连接基团，核苷间连接可以是：-O-P(O)₂-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-S-P(O)₂-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)₂-O-、-O-P(O)₂-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)₂-S-、-O-PO(R^H)-O-、O-PO(OCH₃)-O-、-O-PO(NR^H)-O-、-O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-、-O-PO(BH₃)-O-、-O-PO(NHR^H)-O-、-O-P(O)₂-NR^H-、-NR^H-P(O)₂-O-、-NR^H-CO-O-、-NR^H-CO-NR^H-、-O-CO-O-、-O-CO-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-、-O-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-CO-NR^H-CH₂-、-CH₂-NR^H-CO-、-O-CH₂-CH₂-S-、-S-CH₂-CH₂-O-、-S-CH₂-CH₂-S-、-CH₂-SO₂-CH₂-、-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-CO、-CH₂-NCH₃-O-CH₂-，其中R^H选自氢和C₁-C₄烷基。

18.根据权利要求1-17的任一项所述化合物，其中所述核苷酸包含从由磷酸基团、硫代磷酸基团和硼代磷酸基团构成的组中选择的连接基团。

19.根据权利要求18所述化合物，其中所述连接基团是磷酸基团。

20.根据权利要求17所述化合物，其中所述连接基团是硫代磷酸基团。

21.根据权利要求20所述化合物，其中所有核苷酸包含硫代磷酸基团。

22.根据前述任一项权利要求所述化合物，其中至少一个核苷酸被相应的核苷酸类似物代替。

23.根据权利要求22所述化合物，其包含1-50个核苷酸类似物。

24.根据权利要求23所述化合物，其包含2-45个核苷酸类似物。

25.根据权利要求24所述化合物，其包含3-40个核苷酸类似物。

26.根据权利要求25所述化合物，其包含4-35个核苷酸类似物。

27.根据权利要求26所述化合物，其包含5-30个核苷酸类似物。

28.根据权利要求27所述化合物，其包含6-25个核苷酸类似物。

29.根据权利要求28所述化合物，其包含6-20个核苷酸类似物。

30.根据权利要求29所述化合物，其包含6-12个核苷酸类似物。

31.根据权利要求30所述化合物，其包含8-12个核苷酸类似物。

32.根据权利要求30所述化合物，其包含6、7、8、9、10、11或者12个核苷酸类似物。

33.根据权利要求31所述化合物，其包含6-10个核苷酸类似物。

34.根据权利要求33所述化合物，其包含6、7、8、9或者10个核苷酸类似物。

35.根据权利要求34所述化合物，其包含7、8或者9个核苷酸类似物。

36.根据权利要求35所述化合物，其包含8个核苷酸类似物。

37.根据权利要求22-36任一项所述化合物，其中所有核苷酸都被相应的核苷酸类似物代替。

38.根据权利要求22-36任一项所述化合物，其包含位于3’末端的核苷酸。

40.根据权利要求22-39任一项所述化合物，其中至少一个所述核苷酸类似物是下述分子式表示的锚定核酸(LNA)：

其中Z和Z^*是独立缺失的，选自核苷间连接、末端基团或者保护基团；X和Y独立地从由O、S、NR、CH₂、CH(如果是双键的一部分)、CH₂-O、CH₂-S、CH₂-NR、CH₂-CH₂、CH₂-CH(如果是双键的一部分)和CH＝CH构成的组中选择，其中R是氢或者C₁-C₄烷基。

41.根据权利要求40所述化合物，其中X是O，Y选自由O、S和NR构成的组。

42.根据权利要求41所述化合物，其中X是O，Y选自由O、S和NH构成的组。

43.根据权利要求42所述化合物，其中X是O，Y是O。

44.根据权利要求40-46任一项所述化合物，其中所述LNA是β-D或者α-L形式的，优选是β-D形式的。

45.根据权利要求40-44任一项所述化合物，其中所述核苷酸类似物包括从由-O-P(O)₂-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-S-P(O)₂-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)₂-O-、-O-P(O)₂-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)₂-S-、-O-PO(R^H)-O-、O-PO(OCH₃)-O-、-O-PO(NR^H)-O-、-O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-、-O-PO(BH₃)-O-、-O-PO(NHR^H)-O-、-O-P(O)₂-NR^H-、-NR^H-P(O)₂-O-、-NR^H-CO-O-、-NR^H-CO-NR^H-、-O-CO-O-、-O-CO-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-、-O-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-CO-NR^H-CH₂-、-CH₂-NR^H-CO-、-O-CH₂-CH₂-S-、-S-CH₂-CH₂-O-、-S-CH₂-CH₂-S-、-CH₂-SO₂-CH₂-、-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-CO、-CH₂-NCH₃-O-CH₂-构成的组中选择的连接基团，其中R^H从氢和C₁-C₄烷基中选择。

46.根据权利要求45所述化合物，其中所述核苷酸和/或者核苷酸类似物通过磷酸基团相互连接。

47.根据权利要求45所述化合物，其中所述核苷酸和/或者核苷酸类似物通过一种硫代磷酸基团相互连接。

48.根据权利要求47所述化合物，其中所述核苷酸和/或者核苷酸类似物通过硫代磷酸基团相互连接，X是O，Y是O，并且所述LNA是β-D形式的。

49.根据权利要求45-48任一项所述化合物，其中所述子序列包含一段2-6个权利要求40-44任一项所述LNAs，其后是一段4-12个核苷酸，然后接着是一段2-6个权利要求40-44任一项所述LNAs。

50.根据权利要求49所述化合物，其中所述子序列包含一段4个权利要求40-44任一项所述LNAs，其后是一段8个核苷酸，然后接着是一段4个权利要求40-44任一项所述LNAs。

51.根据权利要求48所述化合物，其中所述子序列包含一段2-6个权利要求40-44任一项所述LNAs，其后是一段4-12个核苷酸，然后接着是一段2-5个权利要求40-44任一项所述LNAs，随后是单核苷酸。

52.根据权利要求51所述化合物，其中所述子序列包含一段4个权利要求40-44任一项所述LNAs，其后是一段8个核苷酸，然后接着是一段3个权利要求40-44任一项所述LNAs，随后是单核苷酸。

53.根据权利要求51或52所述化合物，其所述单核苷位于3’末端。

54.根据权利要求49-53任一项所述化合物，其中所述核苷和/或者LNAs通过连接基团相互连接，所述连接基团选自由磷酸基团、硫代磷酸基团和硼代磷酸基团构成的组。

55.根据权利要求54所述化合物，其中所述核苷和/或者所述LNAs通过磷酸基团连接。

56.根据权利要求54所述化合物，其中所述核苷和/或者所述LNAs通过硫代磷酸基团连接。

57.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：2a。

58.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：3a。

59.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：4a。

60.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：5a。

61.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：6a。

62.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：7a。

63.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：8a。

64.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：9a。

65.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：10a。

66.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：11a。

67.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：12a。

68.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：13a。

69.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：14a。

70.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：15a。

57.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：117a。

57.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：118a。

58.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：119a。

59.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：120a。

60.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：121a。

61.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：122a。

62.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：123a。

63.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：124a。

64.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：125a。

65.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：126a。

66.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：127a。

67.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：128a。

68.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：129a。

69.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：130a。

70.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：131a。

71.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：132a。

72.根据权利要求56所述化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：133a。

73.根据权利要求57-72任一项所述化合物，其中3’末端LNA是被相应的天然核苷代替。

74.一种化合物，其由SEQ ID NO：2a组成。

75.一种化合物，其由SEQ ID NO：3a组成。

76.一种化合物，其由SEQ ID NO：4a组成。

77.一种化合物，其由SEQ ID NO：5a组成。

78.一种化合物，其由SEQ ID NO：6a组成。

79.一种化合物，其由SEQ ID NO：7a组成。

80.一种化合物，其由SEQ ID NO：8a组成。

81.一种化合物，其由SEQ ID NO：9a组成。

82.一种化合物，其由SEQ ID NO：10a组成。

83.一种化合物，其由SEQ ID NO：11a组成。

84.一种化合物，其由SEQ ID NO：12a组成。

85.一种化合物，其由SEQ ID NO：13a组成。

86.一种化合物，其由SEQ ID NO：14a组成。

87.一种化合物，其由SEQ ID NO：15a组成。

88.一种化合物，其由SEQ ID NO：117a组成。

89.一种化合物，其由SEQ ID NO：118a组成。

90.一种化合物，其由SEQ ID NO：119a组成。

91.一种化合物，其由SEQ ID NO：120a组成。

92.一种化合物，其由SEQ ID NO：121a组成。

93.一种化合物，其由SEQ ID NO：122a组成。

94.一种化合物，其由SEQ ID NO：123a组成。

95.一种化合物，其由SEQ ID NO：124a组成。

96.一种化合物，其由SEQ ID NO：125a组成。

97.一种化合物，其由SEQ ID NO：126a组成。

98.一种化合物，其由SEQ ID NO：127a组成。

99.一种化合物，其由SEQ ID NO：128a组成。

100.一种化合物，其由SEQ ID NO：129a组成。

101.一种化合物，其由SEQ ID NO：130a组成。

102.一种化合物，其由SEQ ID NO：131a组成。

103.一种化合物，其由SEQ ID NO：132a组成。

104.一种化合物，其由SEQ ID NO：133a组成。

105.根据权利要求74-104任一项所述化合物，其中3’末端LNA被相应的核苷酸代替。

106.一种结合物，其包含根据权利要求1-73任一项所述化合物和至少一个与所述化合物共价连接的非核苷酸或者非多聚核苷酸成分。

107.一种药物组合物，其包含权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述的结合物，以及药物上可以接受的稀释剂、载体或者佐剂。

108.根据权利要求107所述药物组合物，其进一步包含至少一种化学治疗试剂(反义寡聚物和化学药物的同样的药物组合物，这是组合治疗)。

109.根据权利要求108所述药物组合物，其中所述化学治疗化合物通常从由肾上腺皮质甾类，例如强的松、地塞米松或者氟美松；六甲蜜胺(六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(乙基)；氨苯哌啶酮(氨鲁米特)；胺苯丫啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄性激素，例如睾丸激素；天冬酰胺酶(爱施巴)；结核预防注射液；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(平阳霉素)；白消安(马勒兰)；卡铂(伯尔定)；卡氯芥(BCNU，BiCNU)；瘤可宁(苯丁酸氮芥)；氯去氧腺苷(2-CDA，克拉利宾，leustatin)；顺氯氨铂(顺铂)；阿糖胞苷(赛德萨)；甲嗪咪唑胺(DTIC)；更生霉素(放线菌素D-D，更新霉素)；道诺霉素(cerubidine)；多西他赛(泰素帝)；亚德里亚霉素(阿霉素)；表阿霉素；雌莫司汀(emcyt)；雌性激素例如：己烯雌酚(DES)；足叶乙甙(VP-16，鬼臼叉甙，依托泊苷)；氟阿糖腺苷(福达华)；氟他米特(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他宾(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；依达比星(去甲氧基柔红霉素)；异环磷酰胺；白介素-2(proleukin，aldesleukin)；干扰素α(intron A，roferon A)；依立替康(伊立替康)；亮丙瑞林(lupron)；左旋四咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；氮芥(mechlorathamine，nitrogenmustard)；美法仑(左旋溶内瘤素)；巯嘌呤(巯基嘌呤，6-MP)；甲氨蝶呤(mexate)；丝裂霉素-C(mutamucin)；米托蒽醌(novantrone)；奥曲肽(善得定)；喷司他丁(2-脱氧咖啡霉素，nipent)；普卡霉素(光神霉素，光辉霉素)；甲基苄肼(matulane)；链氮霉素；三苯氧胺(诺瓦得士)；紫杉醇(paclitaxel)；替尼泊甙(vumon，VM-26)；塞替派；拓扑替康(hycamtin)；维甲酸(vesanoid，全反式维A酸)；长春碱(valban)；长春新碱(oncovin)和长春瑞滨(去甲长春碱)构成的组中选择。

110.用作药物的权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物。

111.权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

112.根据权利要求111所述应用，其中所述癌症是实体瘤。

113.根据权利要求111或者112所述应用，其中所述癌症是恶性肿瘤。

114.根据权利要求113所述应用，其中所述恶性肿瘤是从由恶性黑色素瘤、基细胞瘤、卵巢瘤、乳瘤、非小细胞肺癌、肾细胞瘤、膀胱瘤、复发性浅层膀胱癌、胃瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、子宫颈癌、子宫颈发育不良、喉乳头状瘤病、结肠癌、直肠癌和良性肿瘤构成的组中选择。

115.根据权利要求114所述应用，其中所述恶性肿瘤是从由恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳瘤、结肠癌、肾细胞瘤构成的组中选择。

116.根据权利要求115所述应用，其中所述恶性黑色素瘤从由浅层蔓延黑色素瘤、结节状黑色素瘤、斑点恶性黑色素瘤、肢体末端黑色素瘤、无黑色素性黑素瘤和结缔组织黑色素瘤构成的组中选择。

117.根据权利要求111或者112所述应用，其中所述癌症是恶性毒瘤。

118.根据117所述应用，其中所述恶性毒瘤从由骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤构成的组中选择。

119.根据权利要求111或者112的应用，其中所述癌症是神经胶质瘤。

120.一种治疗癌症的方法，所述方法包括对需要治疗的患者使用权利要求1-105任一项所述化合物、权利要求106所述结合物或者权利要求107-109任一项所述药物组合物。

121.根据权利要求120所述方法，其中所述的癌症是实体瘤。

122.根据权利要求120所述方法，其中所述癌症是恶性肿瘤。

123.根据权利要求122所述方法，其中所述恶性肿瘤是从由恶性黑色素瘤、基细胞瘤、卵巢瘤、乳瘤、非小细胞肺癌、肾细胞瘤、膀胱瘤、复发性浅层膀胱癌、胃瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、子宫颈癌、子宫颈发育不良、喉乳头状瘤病、结肠癌、直肠癌和良性肿瘤构成的组中选择。

124.根据权利要求123所述方法，其中所述恶性肿瘤是从由恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳瘤、结肠癌、肾细胞瘤构成的组中选择。

125.根据权利要求124所述方法，其中所述恶性黑色素瘤从由浅层蔓延黑色素瘤、结节状黑色素瘤、斑点恶性黑色素瘤、肢体末端黑色素瘤、无黑色素性黑素瘤和结缔组织黑色素瘤构成的组中选择。

126.根据权利要求120所述方法，其中所述癌症是恶性毒瘤。

127.根据126所述方法，其中所述恶性毒瘤从由骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤构成的组中选择。

128.根据权利要求120或者121所述方法，其中所述癌症是神经胶质瘤。

129.在权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物在制备治疗关节硬化、牛皮癣、糖尿病性视网膜炎、类风湿性关节炎、哮喘、疣和过敏性皮炎药物中的应用。

130.权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物在制备治疗癌症的药物中的应用，所述药物进一步包含化学治疗试剂，该化学治疗试剂从由肾上腺皮质甾类，例如强的松、地塞米松或者氟美松；六甲蜜胺(六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(乙基)；氨苯哌啶酮(氨鲁米特)；胺苯丫啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄性激素，例如睾丸激素；天冬酰胺酶(爱施巴)；结核预防注射液；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(平阳霉素)；白消安(马勒兰)；卡铂(伯尔定)；卡氯芥(BCNU，BiCNU)；瘤可宁(苯丁酸氮芥)；氯去氧腺苷(2-CDA，克拉利宾，leustatin)；顺氯氨铂(顺铂)；阿糖胞苷(赛德萨)；甲嗪咪唑胺(DTIC)；更生霉素(放线菌素D-D，更新霉素)；道诺霉素(cerubidine)；多西他赛(泰素帝)；亚德里亚霉素(阿霉素)；表阿霉素；雌莫司汀(emcyt)；雌性激素例如：己烯雌酚(DES)；足叶乙甙(VP-16，鬼臼叉甙，依托泊苷)；氟阿糖腺苷(福达华)；氟他米特(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他宾(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；依达比星(去甲氧基柔红霉素)；异环磷酰胺；白介素-2(proleukin，aldesleukin)；干扰素α(intron A，roferon A)；依立替康(伊立替康)；亮丙瑞林(lupron)；左旋四咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；氮芥(mechlorathamine，nitrogen mustard)；美法仑(左旋溶内瘤素)；巯嘌呤(巯基嘌呤，6-MP)；甲氨蝶呤(mexate)；丝裂霉素-C(mutamucin)；米托蒽醌(novantrone)；奥曲肽(善得定)；喷司他丁(2-脱氧咖啡霉素，nipent)；普卡霉素(光神霉素，光辉霉素)；甲基苄肼(matulane)；链氮霉素；三苯氧胺(诺瓦得士)；紫杉醇(paclitaxel)；替尼泊甙(vumon，VM-26)；塞替派；拓扑替康(hycamtin)；维甲酸(vesanoid，全反式维A酸)；长春碱(valban)；长春新碱(oncovin)和长春瑞滨(去甲长春碱)构成的组中选择。

131.根据权利要求130的应用，其中化学治疗药物选自紫杉烷类，例如：红豆杉醇、紫杉醇或者紫杉萜。

132.在权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物在制备治疗癌症的药物中的应用，其中所述治疗进一步包含给予进一步的化学治疗试剂，化学治疗试剂从由肾上腺皮质甾类，例如强的松、地塞米松或者氟美松；六甲蜜胺(六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(乙基)；氨苯哌啶酮(氨鲁米特)；胺苯丫啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄性激素，例如睾丸激素；天冬酰胺酶(爱施巴)；结核预防注射液；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(平阳霉素)；白消安(马勒兰)；卡铂(伯尔定)；卡氯芥(BCNU，BiCNU)；瘤可宁(苯丁酸氮芥)；氯去氧腺苷(2-CDA，克拉利宾，leustatin)；顺氯氨铂(顺铂)；阿糖胞苷(赛德萨)；甲嗪咪唑胺(DTIC)；更生霉素(放线菌素D-D，更新霉素)；道诺霉素(cerubidine)；多西他赛(泰素帝)；亚德里亚霉素(阿霉素)；表阿霉素；雌莫司汀(emcyt)；雌性激素例如：己烯雌酚(DES)；足叶乙甙(VP-16，鬼臼叉甙，依托泊苷)；氟阿糖腺苷(福达华)；氟他米特(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他宾(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；依达比星(去甲氧基柔红霉素)；异环磷酰胺；白介素-2(proleukin，aldesleukin)；干扰素α(intron A，roferon A)；依立替康(伊立替康)；亮丙瑞林(lupron)；左旋四咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；氮芥(mechlorathamine，nitrogen mustard)；美法仑(左旋溶内瘤素)；巯嘌呤(巯基嘌呤，6-MP)；甲氨蝶呤(mexate)；丝裂霉素-C(mutamucin)；米托蒽醌(novantrone)；奥曲肽(善得定)；喷司他丁(2-脱氧咖啡霉素，nipent)；普卡霉素(光神霉素，光辉霉素)；甲基苄肼(matulane)；链氮霉素；三苯氧胺(诺瓦得士)；紫杉醇(paclitaxel)；替尼泊甙(vumon，VM-26)；塞替派；拓扑替康(hycamtin)；维甲酸(vesanoid，全反式维A酸)；长春碱(valban)；长春新碱(oncovin)和长春瑞滨(去甲长春碱)构成的组中选择。

133.根据权利要求132的应用，其中所述治疗进一步包含给予进一步的化学治疗试剂，该化学治疗试剂选自紫杉烷类，例如：红豆杉醇、紫杉醇或者紫杉萜。

134.一种治疗癌症的方法，所述方法包含对需要的病人使用权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物或者权利要求107-109任一项所述药物组合物，并进一步包含给予化学治疗试剂，该化学治疗试剂从由肾上腺皮质甾类，例如强的松、地塞米松或者氟美松；六甲蜜胺(六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(乙基)；氨苯哌啶酮(氨鲁米特)；胺苯丫啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄性激素，例如睾丸激素；天冬酰胺酶(爱施巴)；结核预防注射液；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(平阳霉素)；白消安(马勒兰)；卡铂(伯尔定)；卡氯芥(BCNU，BiCNU)；瘤可宁(苯丁酸氮芥)；氯去氧腺苷(2-CDA，克拉利宾，leustatin)；顺氯氨铂(顺铂)；阿糖胞苷(赛德萨)；甲嗪咪唑胺(DTIC)；更生霉素(放线菌素D-D，更新霉素)；道诺霉素(cerubidine)；多西他赛(泰素帝)；亚德里亚霉素(阿霉素)；表阿霉素；雌莫司汀(emcyt)；雌性激素例如：己烯雌酚(DES)；足叶乙甙(VP-16，鬼臼叉甙，依托泊苷)；氟阿糖腺苷(福达华)；氟他米特(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他宾(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；依达比星(去甲氧基柔红霉素)；异环磷酰胺；白介素-2(proleukin，aldesleukin)；干扰素α(intron A，roferon A)；依立替康(伊立替康)；亮丙瑞林(lupron)；左旋四咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；氮芥(mechlorathamine，nitrogenmustard)；美法仑(左旋溶内瘤素)；巯嘌呤(巯基嘌呤，6-MP)；甲氨蝶呤(mexate)；丝裂霉素-C(mutamucin)；米托蒽醌(novantrone)；奥曲肽(善得定)；喷司他丁(2-脱氧咖啡霉素，nipent)；普卡霉素(光神霉素，光辉霉素)；甲基苄肼(matulane)；链氮霉素；三苯氧胺(诺瓦得士)；紫杉醇(paclitaxel)；替尼泊甙(vumon，VM-26)；塞替派；拓扑替康(hycamtin)；维甲酸(vesanoid，全反式维A酸)；长春碱(valban)；长春新碱(oncovin)和长春瑞滨(去甲长春碱)构成的组中选择。

135.一种治疗癌症的方法，所述方法包含对需要的病人使用权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物或者权利要求107-109任一项所述药物组合物，并进一步包含给予化学治疗试剂，该化学治疗试剂选自紫杉烷类，例如：红豆杉醇、紫杉醇或者紫杉萜。

136.一种治疗遭受非正常血管生成引起的疾病折磨或者对其敏感的哺乳动物的方法，包括：对哺乳动物使用治疗有效量的针对生物素的寡聚核苷酸，该寡聚核苷酸包含一个或者多个LNA单元。

137.一种阻止或者限制凋亡要求的方法，其包括给予权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物或者权利要求107-109任一项所述药物组合物。

138.一种阻止细胞增殖的方法，其包括给予权利要求1-105任一项所述化合物或者权利要求106所述结合物或者权利要求107-109任一项所述药物组合物。