CN101151280A - 免疫原性分子 - Google Patents

Abstract

本发明一般性地涉及免疫学领域，更加具体的说涉及能够刺激细胞免疫应答的分子。更加具体地，本发明提供不管受试者的HLA类型如何都能够刺激针对多肽表位的免疫应答的自身辅助免疫原性分子。本发明还涉及生产和使用所述自身辅助免疫原性分子的方法以及包括该自身辅助免疫原性分子的组合物，所述组合物可用于针对特异性多肽的对受试者的疫苗接种。

Description

免疫原性分子

技术领域

本发明一般性地涉及免疫学领域，更加具体地涉及能够刺激细胞免疫应答的分子。更加具体地，本发明提供不管受试者的HLA类型如何都能够刺激针对多肽表位的免疫应答的自身辅助(自身佐剂，self-adjuvanting)免疫原性分子。本发明还涉及生产和使用自身辅助免疫原性分子的方法以及包括该自身辅助免疫原性分子的组合物，所述组合物可用于针对特异性多肽的受试者的疫苗接种。

背景技术

本说明书中所提及的任何现有技术并非，而且不应被视为认同或以任何形式提示该现有技术形成澳大利亚公知常识的部分。

免疫疗法和接种疫苗被用于预防或治疗广泛的病症，如感染性疾病和某些肿瘤。不过，这些治疗的应用和成功部分地被刺激多面(multi-facetted)免疫应答的需求所局限。例如，为了产生和维持针对特异性抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，需要存在对相同抗原的T辅助(Th)应答。尤其是Th应答的刺激诱导由细胞产生IL-2，这又允许针对相同抗原的CTL的克隆扩增。

T细胞能够识别进行过处理并且结合存在于抗原呈递细胞(APC)表面上的主要组织相容性(MHC)分子的肽片段。MHC复合体包括两组高度多态性的细胞表面分子，称作MHC I型和MHC II型。MHC I型分子结合由APC内分子的降解而产生的肽。MHC I型/肽复合体呈现于CD8⁺T细胞上，其识别MHC I型分子和肽的特异性组合。MHC II型分子结合已被APC胞吞的蛋白质裂解后产生的肽。MHC II型/肽复合体呈现于CD4⁺Th细胞上，其识别MHC II型分子和肽的特异性组合。一般，针对特异性抗原的CD4⁺Th应答通过不同的肽来刺激，多于刺激抗原特异性CD8⁺CTL应答。

MHC分子上的肽结合裂口是在MHC折叠过程中形成的。根据单倍型，裂口内的结合口袋能够容纳不同的肽。人类I型家族包含三种主要的I型位点，称作HLA-A，HLA-B和HLA-C。还有HLA-E，-F，-G和-H，不过，这些基因远没有HLA-A，-B和-C位点的多态性高。人类II类包含三种主要位点，命名为DR，DQ和DP。I型和II类位点随后都可以进一步分成不定数目的亚类。

MHC分子是共显性表达的。这意味着在一个个体中，所有的主要基因位点都由母本和父本染色体表达。由于有三种I型位点，并且由于每一种位点都是高度多态性的，因此大多数个体将具有六种不同的I型分子。每种MHC分子都将具有稍微不同的形状，所以将呈现不同的抗原性肽。类似的方法也适用于II型MHC。乍一看，好象APC能够表达6种不同的II型分子，但是，由于杂合II型分子的存在，这可能被低估了。因此，可以理解在个体之间有关它们的HLA类型将会有高水平的变异性。

每种MHC分子都能够结合来自蛋白质的不同肽片段，并且一旦结合，那么特异性的CD8⁺CTL或CD4⁺Th就能够识别这种肽，但仅仅是在特异性HLA类型的情况下。因此，能够刺激HLA-A2型的人体内CTL应答的HIV特异性肽，可能并不能够刺激不包含其表面表达A2的细胞的人体内的应答。

当试图开发一种针对特异性病原或肿瘤的疫苗或疗法时，这种免疫系统的多样性是一种严重的障碍。通常，只施用单一的能够引起CTL应答的肽。这种疫苗接种不仅导致高度局限的免疫应答，而且还不提供有可能刺激Th应答的肽，并因此提供必要的“帮助”。另外，在病毒的疫苗接种或治疗中使用这些策略一般导致病毒基因组的进化转换，其中这种应答被致无效。递送策略也被限制，因为包含CTL表位的全长蛋白质并不有效地进入MHC I型加工途径。

所以需要开发不管受试者HLA类型如何都能够刺激免疫应答的免疫原性分子。

发明内容

在整个说明书中，除非上下文另外要求，词语“包括(包含)”，或其变型如作为动词的“包括(comprises)”或“包含(comprising)”，将被理解为暗示包含有指定的元素或完整事物或者是元素或完整事物的组，但不排除任何其它元素或完整事物或者是元素或完整事物的组。

本发明涉及无论受试者HLA类型如何都能够引起受试者中免疫应答的多肽。更加具体地，本发明提供包含天然存在的或重组的多肽的自身辅助免疫原性分子，所述多肽缀合至少一个脂或脂肪酸部分，其中所述自身辅助免疫原性分子能够刺激对于天然存在的或重组的多肽内表位特异性的免疫应答。本发明的自身辅助免疫原性分子能够引起特异性针对天然存在的或重组的多肽的免疫应答，其中免疫应答的特征是存在CD8⁺CTL和CD4⁺T辅助细胞和或B细胞，它们都对多肽有特异性。

因此，本发明一个方面涉及包含天然存在的或重组的多肽的自身辅助免疫原性分子，所述多肽缀合一个或多个脂或脂肪酸部分，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列，其包含至少一个CTL表位和一个T-辅助表位或一个CTL表位和一个B细胞表位或一个T辅助表位和一个B细胞表位或一个CTL表位，一个T辅助表位和一个B细胞表位，其中所述表位对多肽有特异性，并且其中所述自身辅助免疫原性分子引起受试者的免疫应答，而无论受试者的HLA类型如何。

在特定的方面，本发明的多肽包含至少一个CTL和一个T辅助表位，它们都能够引起对天然存在的或重组的多肽特异性的免疫应答。

在本发明的相关方面，所述多肽包含一个CTL表位和一个B细胞表位，它们都能够引起对天然存在的或重组的多肽特异性的免疫应答。

在本发明的另一方面，所述多肽包含一个T辅助表位和一个B细胞表位，它们都能够引起对天然存在的或重组的多肽特异性的免疫应答。

在优选的方面，所述多肽包含至少一个CTL表位和至少一个T辅助表位和至少一个B细胞表位，它们都能够引起对天然存在的或重组的多肽特异性的免疫应答。

在特定的实施方案中，本发明涉及包含天然存在的或重组的多肽的自身辅助免疫原性分子，所述多肽缀合一个或多个脂或脂肪酸部分，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列，其包含至少一个CTL表位和一个T-辅助表位和一个B细胞表位，其中所述表位对多肽特异性，并且其中所述自身辅助免疫原性分子引起受试者的免疫应答，而无论受试者的HLA类型如何。

此外，本发明提供包含天然存在的或重组的多肽的自身辅助免疫原性分子，所述多肽缀合一个或多个脂或脂肪酸部分，其中所述自身辅助免疫原性分子引起受试者的免疫应答，而无论受试者的HLA类型如何。

所述脂或脂肪酸部分可以缀合多肽主链内的任何氨基酸残基或结合翻译后添加的化学实体如糖部分。在优选的实施方案中，所述脂或脂肪酸部分缀合多肽的氨基酸侧链或N-末端。便利地，脂或脂肪酸部分与多肽的缀合并不显著改变多肽的天然折叠，所以允许呈现线性和构象两种表位。

在另一方面，本发明提供产生自身辅助免疫原性分子的方法，所述方法包括选择或制备天然存在的或重组的多肽，所述多肽包含这样的氨基酸序列，其包含至少一个CTL表位和一个T-辅助表位或一个CTL表位和一个B细胞表位或一个T辅助表位和一个B细胞表位或一个CTL表位，一个T辅助表位和一个B细胞表位，并将至少一个脂或脂肪酸部分缀合于多肽内的任何氨基酸残基，或结合于天然存在的或重组的多肽上的翻译后添加的化学部分，其中无论受试者HLA类型如何所述自身辅助免疫原性分子都引起受试者的免疫应答。

本发明提供包含自身辅助免疫原性分子的组合物，以及该组合物或自身辅助免疫原性分子在生产治疗或预防癌症或病原体感染的药物中的应用。

核苷酸和氨基酸序列通过序列标识号(SEQ ID NO：)来指代。SEQ IDNOs：在数字上对应于序列标识<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQID NO：2)，等。序列标识的总结在表1中提供。序列表在权利要求书后提供。

本文所用的序列标识的总结在表1中显示。

表1

序列标识

序列标识	序列
		SEQ ID NO：1	IFNγ的CTL表位
SEQ ID NO：2	IFNγ的CTL表位
		SEQ ID NO：3	IFNγ的CTL表位
SEQ ID NO：4	IFNγ的CTL表位
		SEQ ID NO：5	IFNγ的CTL表位
SEQ ID NO：6	IFNγ的CTL表位
		SEQ ID NO：7	脂部分的间隔子序列

附图说明

图1是显示水溶性的基于Pam2Cys的脂部分示意图的图示，所述脂部分具有8个赖氨酸残基作为间隔子，并且可以用作在水溶液中脂化蛋白质的组件。

图2是显示水溶性的基于Pam2Cys的脂部分示意图的图示，所述脂部分具有聚乙二醇作为间隔子并且可以用作在水溶液中偶联蛋白质的组件。

图3是显示所用的各种脂化鸡蛋白溶解酶种类和各种化学键的示意图的图示。

图4是显示BALB/c小鼠中通过胰岛素和脂化胰岛素引发的抗胰岛素抗体应答的图示。于第0和4周用在完全弗氏佐剂中乳化的胰岛素作为第一剂量和在不完全弗氏佐剂中乳化的胰岛素作为第二剂量通过皮下途径来接种小鼠。在每种情况下所用抗原的剂量都是10nmol。在脂化胰岛素的情况下再次施用两种剂量，但是这次是在PBS中。由在第4、5和6周取的血液样品制备血清，随后通过ELISA确定抗胰岛素抗体滴度。1°、2°  和3°  分别代表在第4、5和6周获得的抗体的滴度。Pam2Cys₂-胰岛素指这样的胰岛素，其中将2拷贝的脂部分Pam2Cys并入每分子的胰岛素，并且Pam2Cys3-胰岛素指这样的胰岛素，其中将3拷贝的脂部分Pam2Cys并入每分子的胰岛素。Pam2Cys-Ser-Lys₈-Cys是Pam2Cys上附着了丝氨酸残基、8个赖氨酸残基和C-末端半胱氨酸残基。这种结构代表了用来偶联胰岛素分子的可溶形式的Pam2Cys。

图5是显示在C57BL6中通过脂化鸡蛋白溶解酶(Pam2Cys-HEL)、与脂部分Pam2CysSer(Lys)8Cys共混的HEL、弗氏佐剂中的HEL、单独的HEL、单独的弗氏佐剂引发的抗体应答的图示。小鼠在第0和4周通过皮下途径接受两次剂量(30μg每剂量)的HEL，并在第4周和第6周取血。通过ELISA测定在第4周(1°)和第6周(2°)获得的血清中的抗-HEL抗体应答。

图6是显示在C57BL6和BALB/c小鼠中通过脂化鸡蛋白溶解酶(Pam2Cys-HEL)、单独的HEL、或完全弗氏佐剂中的HEL引发的抗体应答的图示。小鼠在第0和3周通过皮下途径接受两次剂量(25μg)的HEL，并在第3周和第5周取血。通过ELISA测定在第3周(1°)和第5周(2°)获得的血清中的抗-HEL抗体应答。

图7是显示在用各种形式的脂化HEL接种的C57BL6小鼠中抗-HEL抗体应答的图示。将包含单拷贝Pam2Cys(pam2Cys₁)或两拷贝Pam2Cys(Pam2Cys₂)(其通过硫醚或二硫化物附着在蛋白质上)的HEL接种入C57BL6小鼠中。用以分枝构型缀合了2拷贝Pam2Cys的HEL(见图3)接种分离组的小鼠。用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的HEL或用以1∶4的比例与Pam2CysSer-Lys₈-Cys共混的HEL来接种对照组动物。小鼠在第0和3周通过皮下途径接受两次25μg剂量的蛋白质，并在第3周和第5周取血。制备血清并通过ELISA测定抗HEL抗体应答。

图8是显示在C57BL/6和GK1.5小鼠中通过生理盐水中施用的脂化HEL(Pam2Cys-HEL)、在弗氏佐剂中施用的HEL或生理盐水中的HEL引起的抗HEL抗体应答的图示。小鼠在第0和4周接受两次剂量(25μg每剂量)的抗原，并在第4周和第6周取血。由血液制备血清并通过ELISA测定抗-HEL抗体应答。

图9是显示在C57BL6小鼠中通过用二硫键化学生产的脂化HEL(Pam2Cys₁-HEL)(图3)，在弗氏佐剂中乳化的HEL(HEL/CFA)或在明矾(Alum)中施用的HEL(HEL/明矾)诱导的抗-HEL抗体应答的图示。小鼠在第0和21天接受两次剂量(25μg每剂量)的抗原，并在第21和第31天取血。制备血清并通过ELISA测定抗-HEL抗体应答。与当在明矾中或在弗氏佐剂存在时施用未脂化HEL的应答相比，当施用脂化HEL时获得了显著的次级抗-HEL抗体应答。

图10是显示在BALB/c小鼠中通过生理盐水中脂化的HEL(Pam2Cys-HEL)或在完全弗氏佐剂中施用的HEL诱导的抗体同种型的图示。小鼠在第0和28天被皮下接种以2剂量(30μg每剂量)的在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的Pam2Cys-HEL或HEL。在接受第二次剂量的抗原后14天将动物放血，制备血清并通过ELISA测定抗-HEL抗体的同种型。

图11是显示在接种了卵清蛋白(OVA)的C57BL/6小鼠中的抗体应答。动物在第0和21天接种两剂量的皮下施用的30μg的脂化OVA(Pam2Cys-OVA)、在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的OVA或在生理盐水中的OVA。在第21天(1°)和31天(2°)将动物放血，制备血清并通过ELISA测定抗-OVA抗体应答。

图12的图表显示在C57BL6小鼠中在0天和23天用脂化OVA(Pam2Cys-OVA)或在完全弗氏佐剂中乳化的OVA注射后引起的抗体同种型。用Pam2Cys-OVA或在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的OVA的两份剂量(每份30μg)皮下接种小鼠。第33天给动物取血，制备血清并通过ELISA测定抗OVA抗体同种型。

图13的图表显示通过脂化卵清蛋白(OVA)诱导CD8⁺T细胞。在0天和7天用生理盐水中未处理的卵清蛋白或生理盐水中的Pam2Cys-OVA的两份剂量(每份30μg)皮下接种C57BL/6小鼠。用卵清蛋白CTL肽表位SIINFEKL或不相关肽刺激4小时后，在14天去除脾，通过胞内细胞因子染色检测脾细胞干扰素-γ分泌。IFN-γ通过流动分析鉴别。

图14的图表显示通过脂化多胞形的CTL诱导。用9nmol(BALB/c小鼠)或5nmol(C57BL6小鼠)皮下(尾基部)接种BALB/c和C57BL6小鼠。七天后去除脾，在下述CTL肽表位存在或缺失的情况下对脾脏细胞进行IFNγ-ELISpot测定，所述CTL肽表位是SYIPSAEKI(SEQ IDNO：4)，为H-2K^d限制型，来源于伯氏疟原虫(P.berghei)的环子孢子蛋白；或者表位是SGPSNTPPEI(SEQ ID NO：2)，为H-2D^b限制型，来源于腺病毒5EIA。结果分别显示在左右图表中。

具体实施方案

本发明应用分子，特别是天然存在或重组多肽，它们连接于脂或脂肪酸部分，用于刺激天然存在或重组多肽表位的特异免疫应答。应答发生在受试者身上，与受试者的HLA类型无关。″免疫应答″包括细胞应答或体液免疫应答或两者。在一个优选的方面，细胞免疫应答包括细胞毒性T细胞应答和T辅助细胞应答或细胞毒性T细胞应答和B细胞应答或T辅助细胞应答和B细胞应答或细胞毒性T细胞应答和T辅助细胞应答和B细胞应答.

因此，本发明的一个方面提供了包含天然存在的或重组的多肽的自身辅助免疫原性分子，所述多肽与一个或多个脂或脂肪酸部分相结合，其中天然存在的或重组的多肽包含这样的氨基酸序列，其包含至少一个CTL表位和一个T-辅助表位或一个CTL表位和一个B细胞表位或一个T辅助表位和一个B细胞表位或一个CTL表位和至少一个T辅助表位和至少一个B细胞表位，其中所述的这些表位对多肽是特异性的，并且其中所述自身辅助免疫原性分子能够刺激多肽表位的免疫应答，而无论受试者的HLA类型如何。

此处使用的″自身辅助(自身佐剂，self-adjuvanting)免疫原性分子″指无须另外的佐剂的帮助，天然存在或重组多肽刺激细胞毒性T细胞应答和/或T辅助细胞应答和/或B细胞应答的能力。

此处使用的“T辅助表位”也可被定义为“Th表位”或CD4⁺T辅助表位”，包括施用于受试者时能够增强或刺激CD4⁺T细胞应答的任何表位。优选的T辅助表位包含长度至少为大约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的氨基酸。

此处使用的“CTL表位”也可被定义为“细胞毒性T细胞表位”或“CD8⁺CTL表位”，包括施用于受试者时能够增强或刺激CD8⁺T细胞应答的任何表位。优选的CTL表位包含长度至少为大约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的氨基酸。

此处使用的“B细胞表位”是当施用于受试者时能够引起抗体产生的任何表位。优选地，B细胞表位能够引起中和抗体，更加优选地，高滴度中和抗体。优选的B细胞表位包含长度至少为大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的氨基酸。

此处使用的术语″多肽″为常规含义，即，氨基酸序列。因此，本发明的天然存在或重组多肽应该被理解为也包括肽、寡肽和蛋白质。蛋白质可以是糖基化的或非糖基化的(即包含糖类实体)和/或可以包含融合、连接、接合或者另外的结合到蛋白质上的一个范围的其他分子，如氨基酸、脂、糖类或其他肽、多肽或蛋白质。以下所指的“蛋白质”包括含有氨基酸序列的蛋白质，也包括与诸如氨基酸、脂、糖类或其他肽、多肽或蛋白质的其他分子结合的蛋白质，所指的″糖类实体″或″糖基化实体″包括合成或天然修饰的实体.

多肽长度必须包含至少一个CTL表位和一个T-辅助表位或一个CTL表位和一个B细胞表位或一个T辅助表位和一个B细胞表位或一个CTL表位和一个T辅助表位和一个B细胞表位。如上所述，术语肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义中，这些术语可交替使用，除非另有特殊指示。该术语也不表示或排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等，以及本领域已知的其他修饰，天然存在或非天然存在。多肽可以是整个蛋白，或是其中的亚序列。本发明上下文中特定的目标多肽是包含表位的氨基酸亚序列，即实质上负责多肽免疫原性和在HLA非依赖方式中能够引起免疫应答的抗原决定簇。

本发明的多肽具有免疫原性，即无须添加佐剂，它们能够特异性针对靶多肽，刺激受试者的T-细胞和/或B-细胞。可使用本领域技术人员已知技术进行免疫原性活性筛选。例如，可使用Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，USA，1988中描述的方法进行筛选。在一个说明性例子中，多肽可以固定于固体支持物上接触病人血清，从而允许血清内的抗体结合到固定多肽上。然后去掉未结合血清，使用如I¹²⁵标记的蛋白A来探测结合抗体。

此处使用的″免疫原性部分″或″表位″是本发明的免疫原性多肽的片段，它本身与识别多肽的B-细胞和/或T-细胞表面抗原受体有免疫反应(即特异性结合)。免疫原性部分一般可使用已知技术鉴别，如Paul，Fundamental Immunology，3rd ed.，243-247(Raven Press，1993)及其引用文献中的总结。这些技术包括筛选能够与抗原特异性抗体反应的多肽、抗血清和/或T-细胞系或克隆。此处使用的抗血清和抗体为“抗原特异性”，如果它们特异性结合到抗原上(即它们在ELISA或其他免疫实验中与蛋白质反应，并且检测不到与不相关蛋白反应)。可使用已知技术制备这些抗血清和抗体。

在一个优选的实施方案中，本发明的自身辅助免疫原性分子包括多肽，它的一部分与抗血清和T-细胞反应的水平在本质上不低于全长多肽的反应(例如，在ELISA和/或T-细胞反应实验中)。优选地，自身辅助免疫原性分子的免疫原性活性水平为全长多肽的至少约50％，优选至少约70％，最优选大于约90％。在一些例子中，优选的免疫原性部分将被鉴定出的免疫原性活性水平大于相应的全长多肽，例如，大于约100％或150％或更多的免疫原性活性。

本发明考虑的多肽包括至少大约5、10、15、20、25、50、或100个连续氨基酸，或者更多，包括所有的中间长度。

为了表达重组多肽，编码多肽的核苷酸序列或功能等价物可以插入到合适的表达载体，即含有转录和翻译插入编码序列的必需元件的载体。可以用本领域技术人员已知的方法来构建含有编码目标多肽的序列和合适的转录翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、和体内基因重组。这些技术在诸如Sambrook等，(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y.，和Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York.N.Y，1989中得到描述。

可以用多种表达载体/宿主系统来包含和表达多核苷酸序列。这些包括但不限于，微生物，如使用重组噬菌体转化的细菌、质粒、或黏端质粒DNA表达载体；使用酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；使用病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒、CaMV；烟草花叶病毒、TMV)或细菌表达载体(如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；动物细胞系统。

″控制元件″也指″调控序列″。表达载体中出现的这些序列是载体的非翻译区——增强子、启动子、5′和3′非翻译区-它们与宿主细胞蛋白质反应从而进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可以变化。依赖于应用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，如PBLUESCRIPT噬菌粒的杂合1acZ启动子(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRL，Gaithersburg，Md.)等等。在哺乳动物细胞系统，通常优选来自于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有多拷贝编码多肽的序列的细胞系，可以有利地使用基于SV40或EBV的载体，并带有合适的可选择的标记。

在细菌系统中，依赖于使用表达多肽的目的，可以选择多种表达载体的任何一种。例如，当需要高产量，如诱导抗体时，可以使用引导高水平表达能被纯化的融合蛋白的载体。这些载体包括但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码目标多肽的序列可以与氨基-末端Met和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基框内连接到载体中，从而产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke等，J Biol Chem 264：5503-5509，1989)；等等。也可以使用pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)表达外源多肽，与谷胱甘肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白。通常，这些融合蛋白是可溶的，可通过谷胱甘肽-琼脂糖串珠吸附，接下来在游离谷胱甘肽中洗脱，轻松从裂解细胞中纯化。这样的系统制备的蛋白质被设计成包括肝素、凝血酶、或因子XA蛋白酶切割位点，从而可以如愿从GST部分释放出目标多肽克隆。

在酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用多种载体，它们含有组成型或诱导型启动子，如α因子、醇氧化酶、和PGH。综述参见Ausubel等，supra和Grant等，Methods Enzymol153：516-544，1987。

在使用植物表达载体的例子中，编码多肽序列的表达可被多种启动子驱动。例如，CaMV病毒启动子如35S和19S启动子，它们可以单独使用或与TMV的ω引导序列(Takamatsu EMBO J 6：307-311，1987.)联合使用。或者，可使用植物启动子如RUBISCO小亚基或热休克启动子(Coruzzi等，EMBO J 3：1671-1680，1984；Broglie等，Science224：838-843，1984；Winter等，Results Probl Cell Differ17：85-105，1991)。这些构建体可通过直接DNA转化或病原介导转染导入到植物细胞。这些技术在大量通常可获得的综述中得到描述(参见，例如，Hobb s或Murry.in McGraw Hill Yearbook of Science andTechnology McGraw Hill，New York，N.Y.；pp.191-196，1992)。

也可使用昆虫系统表达目标多肽。例如，在一个这样的系统中，可以使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为载体在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusialarvae)中表达外源基因。编码多肽的序列可以克隆到病毒的非必需区，如多角体蛋白基因，并且置于多角体蛋白启动子控制下。多肽编码序列的成功插入可以使得多角体蛋白基因失活，产生缺乏衣壳蛋白的重组病毒。然后可以使用重组病毒感染，如草地贪夜蛾或粉纹夜蛾，在其中可以表达目标多肽(Engelhard等，Proc Natl Acad Sci91：3224-3227，1994)。

在哺乳动物宿主细胞中，通常可获得多种基于病毒的表达系统。例如，使用腺病毒作为表达载体的情况，编码目标多肽的序列可以连到含有晚期启动子和三联引导序列的腺病毒转录/翻译复合物上。病毒基因组非必需区E1或E3中的插入可以用来获得活性病毒，它们可以在被感染宿主细胞中表达多肽(Logan等，Proc Natl Acad Sci81：3655-3659，1984)。此外，转录增强子，如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子，可用来增强哺乳动物宿主细胞中的表达。

也可使用特异起始信号获得目标多肽编码序列更有效的翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在编码多肽序列的情况下，它的起始密码子和上游序列被插入到合适的表达载体中，而不需要加入转录或翻译控制信号。然而，如果仅仅插入编码序列或其中一部分，应该提供外源翻译控制信号包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应位于正确的阅读框，以保证全部插入的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以有多种来源，天然的或合成的。表达效率可通过加入如文献中所述的适合具体细胞系统的增强子提高(Scharf等，ResultsProbl Cell Differ 20：125-162，1994)。

此外，可基于其调节插入序列的表达或按所需方式加工所表达的蛋白的能力来选择宿主细胞菌株。多肽的这些修饰包括但不限于乙酰化作用、羧化作用、糖基化作用、磷酸化作用，脂化和酰基化。切割蛋白质“前体(prepro)”形式的翻译后加工也可用来促进正确的插入、折叠和/或功能。不同的宿主细胞，如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK 293、和WI38具有针对这些翻译后活动的特定细胞结构和独特机制，可以选择用来确保外源蛋白质的正确修饰和加工。

对于长期高效生产重组蛋白质，通常优选稳定表达。例如，稳定表达目标多肽的细胞系可以使用表达载体转化，这些表达载体可以包含病毒来源的复制和/或外源表达元件和位于相同或不同载体的可选择的标记基因。导入载体后，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。可选择的标记的目的是让选择性有抗性，它的出现使得成功表达导入序列的细胞生长和恢复。稳定转化的细胞的抗性克隆可使用适合细胞类型的组织培养技术进行增殖。

用目标多核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合细胞培养蛋白质的表达和恢复的条件下培养。重组细胞产生的蛋白质可以分泌出来或包含在胞内，视序列和/或使用的载体而定。本领域技术人员已知，含有本发明多核苷酸的表达载体可被设计成包含信号序列，所述信号序列可以引导编码多肽通过原核或真核细胞膜分泌出来。也可使用其他的重组构建体，将编码目标多肽的序列与编码能够促进可溶蛋白纯化的多肽区的核苷酸序列相连接。这样的促进纯化区域包括但不限于，金属鳌合物肽如允许在固定金属上纯化的组氨酸-色氨酸组件、允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白质A区、和FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的区域(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)。可以使用包括可切割的连接子序列，如对因子XA特异的序列以及纯化区和编码多肽之间的肠激酶(Invitrogen.San Diego，Calif.)，从而促进纯化。提供这样一个表达载体进行融合蛋白的表达，该融合蛋白含有目标多肽和在硫氧还蛋白和肠激酶切割位点前编码6个组氨酸残基的核苷酸。组氨酸残基促进IMI AC(固定金属离子亲和层析)上的纯化，如Porath等，Prot Exp Purif 3：263-281，1992所述，而肠激酶切割位点提供融合蛋白中所需多肽的纯化方法。含有融合蛋白的载体讨论提供在Kroll等，DNA Cell Biol 12：441-453，1993。

T细胞被认为对本发明的多肽特异，如果T细胞特异性增殖、分泌细胞因子或杀死多肽包被的目标细胞或表达编码多肽的基因。T细胞特异性可使用多种标准方法进行评估。例如，使用铬释放测定或增殖测定，与阴性对照比较，发现裂解和/或增殖的刺激指数超过两倍，说明了T细胞的特异性。这样的测定可如诸如Chen等，Cancer Res54：1065-1070，1994中描述的进行。或者，可用多种已知技术完成对T细胞增殖的检测。例如，可测量DNA合成的增加率检测T细胞增殖(例如，通过用氚化胸腺嘧啶脉冲标记T细胞培养物，测量氚化胸腺嘧啶掺入DNA的量)。与肿瘤多肽(100ng/ml-100μg/ml，优选200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天将典型地导致T细胞增殖至少两倍的增加。如上所述接触2-3小时应该会导致T细胞活化，正如使用标准细胞因子分析所测定的，细胞因子释放水平两倍的增加(例如，TNF或IFN-γ)说明T细胞活化(见Coligan等，Current Protocols inImmunology，vol.1，Wiley Interscience(Greene 1998))。应答肿瘤多肽、多核苷酸或表达APC的多肽而激活的T细胞可以是CD4⁺和/或CD8⁺。肿瘤多肽特异性T细胞可使用标准技术扩大。在优选的实施方案中，T细胞来源于病人、相关供体或不相关供体，并且在刺激和扩大后施用于病人。

为了治疗目的，应答特异性多肽而增殖的CD4⁺或CD8⁺T细胞可以在体外或体内扩大。有多种方法可以完成这些T细胞的体外增殖。例如，T细胞可以再次暴露给多肽，或对应于该多肽免疫原性部分的短肽，可以添加或不添加T细胞生长因子，如白介素-2，和/或合成肿瘤多肽的刺激子细胞。或者，在肿瘤多肽存在下增殖的一个或多个T细胞可以通过克隆扩展。克隆细胞的方法为本领域现有技术，包括有限稀释。

在一个优选的方面，脂或脂肪酸部分通过氨基酸残基与多肽缀合。残基可位于多肽内的任何位置，包括免疫原性表位自身。另外，脂或脂肪酸部分可以与多肽内一个以上的残基缀合。在一个优选的方面，氨基酸残基是赖氨酸残基或半胱氨酸残基或丝氨酸残基。脂或脂肪酸部分也可与翻译后加入的化学实体(如糖类)结合。

已知一些不同的脂肪酸用于脂部分。典型的脂或脂肪酸部分包括但不限于，棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基和癸酰基，或者，更通常的，任何C₂到C₃₀饱和的、单不饱和的、或多不饱和的脂肪酰基被认为是有用的。

特定的脂肪酸部分的例子，脂氨基酸N-棕榈酰基-S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸，也认为是Pam₃Cys或Pam₃Cys-OH(Wiesmuller等，Hoppe Seylers Zur Physiol Chem 364：593，1983)，其为合成的横跨革兰氏阴性细菌内外膜的布罗氏脂蛋白的N-末端部分。Pam₃Cys的结构为通式(I)：

Pam₂Cys(也被称为双棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸或S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸，Pam₃Cys的类似物，已被合成(Metzger.等，J.Pept.Sci.1：184，1995)，并且显示出对应于MALP-2的脂部分，MALP-2是从支原体中分离的巨噬细胞激活的脂肽(Sacht等，Eur J Immunol 28：4207，1998；Muhlradt等，Infect Immun66：4804，1998；Muhlrad t等，J Exp Med 185：1951，1997)。Pam₂Cys的结构为通式(II)：

与本发明自身辅助免疫原性分子缀合的脂或脂肪酸部分可以直接或间接地连接到多肽上，意味着它们或者在自身辅助免疫原性分子中紧靠(即它们未被间隔分子分开)或者被含有一个或多个含碳分子，例如一个或多个氨基酸残基的间隔子分开。多肽可以是任意长度。优选地，其长度必须包含至少一个CTL表位和一个T-辅助表位或一个CTL表位和一个B细胞表位或一个T辅助表位和一个B细胞表位或一个CTL表位，一个T辅助表位和一个B细胞表位。

优选脂部分是具有通式(III)的结构的化合物：

其中：

(i)X选自硫、氧、二硫键(-S-S-)、和亚甲基(-CH₂-)、和氨基(-NH-)；

(ii)m为1或2的整数；

(iii)n为0-5的整数；

(iv)R₁选自氢、羰基(-CO-)、和R′-CO-，其中R′选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的烯基、和具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代；

(v)R₂选自R′-CO-O-、R′-O-、R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的烯基、和具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代；和

(vi)R₃选自R′-CO-O-、R′-O-、R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的烯基、和具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代

其中每-个R₁、R₂和R₃可以相同也可以不同。

依赖于取代基，通式(III)的脂部分可以是手性分子，其中碳原子直接或间接共价结合到整体R₁并且R₂为不对称的右旋或左旋(即R或S)构型。

优选地，X为硫；m和n均为1；R₁选自氢和R′-CO-，其中R′为具有7-25个碳原子的烷基；R₂和R₃选自R′-CO-O-、R′-O-、R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′为具有7-25个碳原子烷基。

优选地，R′选自：棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基和癸醇。更加优选地，R′为棕榈酰基.

所述脂部分的每一个整体R′可以是相同也可以是不同。

在一个特别优选的实施方案中，X为硫；m和n均为1；R₁为氢或R′-CO-，其中R′为棕榈酰基；R₂和R₃均为R′-CO-O-，其中R′为棕榈酰基。这些特别优选的化合物通过上述通式(I)和通式(II)显示。

脂部分也具有下述通式(IV)：

其中：

(i)R₄选自：(i)含有约7-25个碳原子的α-酰基-脂肪酸残基；(ii)α-烷基-β-羟基-脂肪酸残基；(iii)α-烷基-β-羟基-脂肪酸残基的β-羟基酯，其中酯基团优选是含有超过8个碳原子的直链或支链；和(iv)脂氨基酸残基；和

(ii)R₅为氢或氨基酸残基的侧链。

优选地，R₄包含大约10-大约20个碳原子，更加优选地约14-约18个碳原子。

可选择地，其中R₄为脂氨基酸残基，R₄和R₅的侧链可形成共价键。例如，其中R₄包括的氨基酸选自赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、赖氨酸衍生物、鸟氨酸衍生物、谷氨酸衍生物、和门冬氨酸衍生物，然后该氨基酸或衍生物的侧链通过酰胺或酯连接共价结合到R₅。

优选地，通式IV中出现的结构为脂部分，它选自：N，N′-二酰基赖氨酸；N，N′-二酰基鸟氨酸；谷氨酸双(单烷基)酰胺或酯；门冬氨酸双(单烷基)酰胺或酯；丝氨酸的N，O-二酰基衍生物、高丝氨酸、或苏氨酸；和半胱氨酸或高半胱氨酸的N，S-二酰基衍生物。

兼性分子，特别是具有不超过Pam₃Cys(通式(I))的疏水性的分子受到优选。通式(I)、通式(II)、通式(III)或通式(IV)的脂部分在合成或合成后得到进一步修饰，通过加入一个或多个间隔分子，优选含有碳原子的间隔子，更优选一个或多个氨基酸残基。它们可以通过末端羧基经常规缩合、添加、取代或氧化反应，方便地加入到脂结构。这些间隔分子的作用是将脂部分与多肽部分分离，增强脂肽产物的免疫原性。

丝氨酸二聚体、三聚体、四聚体等为此目的特别优选。

根据该实施方案生产的典型修饰的脂氨基酸表示为通式(V)和(VI)，它们能分别通过加入丝氨酸同型二聚体，轻易地由通式(I)和(II)得到。如此例所示，为此目的，通式(I)的Pam₃Cys，或通式(II)的Pam₂Cy s能方便地被合成为通式(V)Pam₃Cys-Ser-Ser，或通式(VI)Pam₂Cys-Ser-Ser的脂氨基酸。

通式(V)：

通式(VI)：

脂部分由常规合成方法制备，例如，美国专利号5,700,910和6,024,964描述的方法，或者，Wiesmuller等，1983 supra，Zeng等，J Pept.Sci 2：66，1996；Jones 等，Xenobiotica 5：155，1975；或Metzger等，Int J Pept蛋白质 Res 38：545，1991)描述的方法。本领域技术人员能够修改这些方法来合成所需能够与多肽缀合的脂。

其他官能团如巯基、氨基氧乙酰基、乙醛可以被导入脂部分，使得脂部分更加特异地偶联到天然存在的或重组蛋白质上。

为了本发明自身辅助免疫原性分子的应用，也考虑到不同脂的组合。例如，一个或两个含肉豆蔻酰基的脂或脂氨基酸通过赖氨酸残基连接到多肽部分，可选择地通过间隔子与多肽隔开，一个或两个含棕榈酰基的脂或脂氨基酸分子连接到羧基末端赖氨酸氨基酸残基上。不排除其他组合方式。

脂或脂肪酸部分可以包含任何C₂-C₃₀饱和的、单不饱和的、或多不饱和的线性或分支脂肪酰基团，优选的脂肪酸基团选自：棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基和癸醇。在本发明中脂氨基酸是特别优选的脂部分。如此处所用，术语″脂氨基酸″指含一个或两个或三个或更多脂共价结合到氨基酸残基上的分子，如，例如，半胱氨酸或丝氨酸，赖氨酸或其类似物。在一个特别优选的实施方案中，脂氨基酸包括半胱氨酸和可选择地一个或两个或更多丝氨酸残基。

脂部分的结构对于得到的自身辅助免疫原性分子的活性并不是必须的，如此处举例，可以使用棕榈酸和/或胆固醇和/或Pam₁Cys和/或Pam₂Cys和/或Pam₃Cys。本发明清楚地考虑到将一批其他的脂部分用于自身辅助免疫原性分子中而不丧失免疫原性。因此，本发明并不被脂部分的结构限制，除非另有说明，或上下文中需要。

相似的，本发明不受对单独脂部分的要求的限制，除非另有说明或上下文中需要。还考虑到将多重脂部分加入到天然存在的或重组多肽，例如，添加到表位里的位置或两个表位之间的位置。

本发明的多肽通过现有技术已知的方法脂化。标准缩合、添加、取代或氧化。此处可以自由使用Pierce产品目录及其中的方法描述的双功能接头。如实施例所述，可以使用异双功能接头、MCS(N-琥珀酰亚胺6-马来酰亚胺己酸盐(maleimidocaproate))和SPDP(N-琥珀酰亚胺3-[2-吡啶基二硫]丙酸盐))。在使用MCS和异双功能接头的例子中，一个半胱氨酸残基被导入脂部分Pam2Cys-Ser-(Lys)8-Cys，该部分通过形成硫醚键与MCS修饰的蛋白质偶联。Pam2Cys(Lys)8-Cys也通过形成二硫键与SPDP修饰蛋白质偶联。

溴代乙酰或氯代乙酰基团也可以导入到脂部分。这两个功能基团可以偶联到巯基上，该巯基本身存在于或通过形成硫醚键被导入蛋白质。

另一优选的方法涉及采用重组或酶学或化学方法在多肽的N-末端位置上导入丝氨酸残基，然后通过氧化生成醛官能团。导入脂部分的氨氧官能团将形成肟键，生成自身辅助脂蛋白质。

另一种化学连接方法，如正交连接策略(Tam等，Biopolymers(Peptide Science)51：311-332，1999)，天然化学连接(Dawson等，Science 266：243-247，1994)表达蛋白质连接(Muir等，Proc NatlAcad Sci USA 95：6705-6710，1998)也可用于将脂部分连接到本发明的多肽上。

如本文举例说明的，提供了高度自身辅助免疫原性分子，它们能够诱导CTL和/或Th和/或B细胞应答，其中一方面的自身辅助免疫原性分子包括与多肽结合的通式(I)的Pam₃Cys，或通式(II)的Pam₂Cys。

本发明能引起免疫应答的自身辅助免疫原性分子增强的能力由它们上调未成熟树状细胞(DC)(特别是D1细胞)的MHC II类分子的表面表达能力来反映。优选地，自身辅助免疫原性分子可溶，最优选地，高度可溶。

一个方面，本发明公开了将多重脂或脂肪酸部分加入到多肽。

应该选择脂或脂肪酸部分的定位，这样脂或脂肪酸部分的结合就不会干扰CTL、T辅助细胞或B细胞表位以致限制它们引起免疫应答的能力。例如，基于脂或脂肪酸部分的选择，与表位的连接可能会在空间上阻碍表位的存在。

优选地，脂或脂肪酸部分与多肽的连接形式不会改变蛋白质的三维结构。本发明考虑到线性表位和非线性或“不具连续性”(构象的)表位的存在。构象表位包括氨基酸残基，它们在起始的一维蛋白质序列中互相分开，但又互相邻近，能接近折叠的三维变应原性蛋白质表面抗体。

在另一个实施方案中，本发明涉及本文公开的一个或多个自身辅助免疫原性分子与药学上可接受的载体的制剂，其用于单独施用于受试者，或与一个或多个其他的治疗方式联合使用。

可以理解的是，如果需要，此处公开的组合物可以联合其他试剂施用，如，其他蛋白质或多肽或多种药学活性试剂。事实上，对于可包括的其他组分实际上没有限制，只要加入的试剂不会通过接触靶细胞或宿主组织引起明显不良反应。因此，组合物可以与特定实例中需要的多种其他试剂一起递送。这种组合物可以从宿主细胞或其他生物来源中纯化，或者如此处所述化学合成。

所以，本发明的另一方面是提供药物组合物，它包含本文所述的一个或多个自身辅助免疫原性分子和生理上可接受的载体。在特定优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的自身辅助免疫原性分子，其用于预防性和治疗疫苗的应用。疫苗的制备常规性地描述于，例如，Powell和Newman，eds.，″Vaccine Design(the subunitand adjuvant approach)″Plenum Press(NY，1995)。一般的，该组合物将包含本发明的一个或多个自身辅助免疫原性分子和一个或多个免疫兴奋剂。

自身辅助免疫原性分子方便地配制于可药用的赋形剂或稀释剂中，例如，水溶剂、非水溶剂、无毒赋形剂如盐、防腐剂、缓冲液，等等。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油、可注射的有机酯如油酸乙酯。水溶剂包括水、醇/水溶液、生理盐水、胃肠外用载体如氯化钠、林格氏葡萄糖，等等。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。根据常规技术调节药物组合物中各种组分的pH和确切浓度。

本发明还包括向自身辅助免疫原性分子制剂加入外源性佐剂，即使一般不要求。这些外源性佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，例如，细胞因子、毒素、或合成化合物。典型的佐剂包括IL-1、IL-2、BCG、氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thur-MDP)、N-乙酰-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(CGP 11637，称作nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP)1983A，称作MTP-PE)、脂A、MPL和RIBI，其包含细菌中提取的三种成分，单磷酸类脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)，于2％角鲨烯/吐温80乳剂中。

可以要求将生物应答调节剂(BRM)与自身辅助免疫原性分子一同施用来下调抑制性T细胞活性。典型的BRM包括但不限于，西米替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA，USA)；吲哚美辛(IND；150mg/d)(Lederle，NJ，USA)；或低剂量环磷酰胺(CYP；75，150或300mg/m.²)(Johnson/Mead，NJ，USA)。

本发明的自身辅助免疫原性分子能够引起体内或离体的T细胞和/或B细胞应答。更加具体地，当本发明的自身辅助免疫原性分子施用于动物受试者，不需要佐剂来达到相似的CTL激活水平，它能增强对CTL表位部分的CTL记忆应答。此外，本发明的自身辅助免疫原性分子增强树状细胞的成熟和其他生物效应，包括诱导IFN-γ产生CD8⁺细胞以及清除病毒，细菌和肿瘤细胞。

因此，本发明的另一方面提供一种在受试者中增强针对诱导产生T细胞和/或B细胞表位的多肽的细胞介导的免疫性的方法，该方法包括在一定条件下施用本发明的自身辅助免疫原性分子或所述自身辅助免疫原性分子的衍生物或功能类似物变体或疫苗组合物一段时间，所述组合物包含所述自身辅助免疫原性分子或变体或衍生物，所述条件足以激活受试者的CTL和/或CTL前体和/或Th和/或B细胞。

优选地，自身辅助免疫原性分子或疫苗被预防性地施用于受试者，他们不具有寄生虫、细菌或病毒引起的潜在或显现的感染或患有癌症；或者自身辅助免疫原性分子被治疗性地施用于受试者，他们具有寄生虫、细菌或病毒引起的潜在或显现的感染或患有癌症。在本发明中，术语″激活″表示T细胞识别和溶解含有诱导T细胞表位的抗原的细胞的能力增强，或T细胞识别所述抗原的T细胞表位的能力增强，以瞬时方式或以持续方式。术语″激活″也被认为包括寄生虫、细菌或病毒引起潜在感染的激活后，T细胞群的激活；或在寄生虫、细菌或病毒的再次感染后，T细胞群的激活；或用本发明的自身辅助免疫原性分子或组合物免疫接种于先前感染的受试者后，T细胞群的激活。

本领域技术人员知晓最佳T细胞激活需要T细胞受体(TcR)对抗原/MHC的同源识别，以及共刺激，所述共刺激涉及T细胞上各种细胞表面分子与抗原呈现细胞(APC)上各种细胞表面分子的连接。优选CD28/B7、CD40L/CD40和OX40/OX40L的共刺激相互反应，但对T细胞激活不是必须的。可进行其他的共刺激途径。

为了确定CTL或前体CTL的激活或表位特异活性水平，可使用在样品中检测CD8⁺T细胞的数量的标准方法。优选的测定模式包括细胞毒性测定，例如标准铬释放测定；IFN-γ产量测定，例如ELISpot测定。这些测定模式在所附的实施例中详细描述。

也可使用MHC 1型四聚体测定，特别是针对CD8⁺T细胞的CTL表位特异性定量(Altman等，Science 274：94-96，1996；Ogg等，CurrOpin Immunol 10：393-396，1998)。为了产生四聚体，MHC分子的羧基末端，例如HLA A2重链与特异性肽表位或多表位相连，进行处理以形成四聚体复合物，其与合适的报告分子连接，优选荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白、藻蓝蛋白或别藻蓝蛋白。四聚体结构的得到可通过，例如，产生MHC-肽融合蛋白质作为生物素化分子，然后混合生物素化MHC-肽和去糖基化卵白素，后者用荧光基团标记，其摩尔比为4∶1。产生的四聚体在CD8⁺T细胞亚群上与一群特殊的CD8⁺T细胞受体结合(TcRs)，所述CD8⁺T细胞来源于其多肽为HLA限制型的受试者(如，全血液或PBMC样品)。未要求体外T细胞激活或扩大。结合后，清洗T细胞以除去未结合或非特异性结合的四聚体，用标准流式细胞计量术容易地定量特异性结合到HLA-肽四聚体的CD8⁺细胞数量，例如使用FACSCalibur流式细胞计量术(BectonDickinson)。四聚体也可连接到顺磁颗粒或磁珠上，以便除去非特异性结合报告子和细胞分选。这些颗粒能方便地从商业来源获得(例如Beckman Coulter，Inc.，San Diego，CA，USA)。四聚体染色不会杀死标记细胞；因此细胞整体得到维持供进一步分析。MHC四聚体确保准确的特异细胞免疫应答定量分析，甚至针对低于1％的CD8⁺T细胞发生的极端罕见事件(Bodinier等，Nature Med 6：707-710，2000；Ogg 等，Curr Opin Immunol 10：393-396，1998)。

样品中的CD8⁺细胞的总量也能方便地确定，如，例如，通过与抗CD8的单克隆抗体一起温育样品，CD8缀合于不同的报告分子，用以探测四聚体。这些抗体能轻易获得(如，Becton Dickinson)。使用的两个报告分子的信号相对强度能够定量测定CD8⁺细胞和四聚体-结合T细胞的总数，并能确定与四聚体结合的总T细胞的比例。

因为CD4⁺T-辅助细胞在细胞介导免疫(CMI)中以细胞因子的产生者发挥作用，如，例如IL-2，以促进CD8⁺T细胞扩大或与APC相互作用从而使其更有效激活CD8⁺T细胞，所以细胞因子的产生间接测量了T细胞的激活。因此，也可使用细胞因子测定来确定人类受试者CTL或前体CTL的激活或细胞介导免疫水平。在这些测定中，细胞因子如IL-2被探测或者细胞因子的产生被确定，作为表位-特异性活化T细胞水平的指示剂。

优选地，用于确定细胞因子或细胞因子的产生水平的细胞因子测定模式主要在Petrovsky等，J Immunol Methods 186：37-46，1995中得到描述，此处引用该测定文献。

优选地，用全血或PBMC或血沉棕黄层进行细胞因子测定。

优选地，将自身辅助免疫原性分子或衍生物或变体或疫苗组合物施用，所处的条件足以引起或增强T细胞和/或B细胞的扩大。

仍然更加优选地，在一定条件下施用自身辅助免疫原性分子或衍生物或变体或疫苗组合物一段时间，所述条件足以增强受试者的CMI。

″CMI″意思是活化和克隆扩大的CTLs为MHC-限制型和CTL表位特异性。CTLs的分类基于抗原特异性和MHC限制性(即，非特异性CTLs和抗原-特异性，MHC-限制性CTLS)。非特异性CTLs由多种细胞类型组成，包括NK细胞，并且能在免疫应答的极早时期起作用，从而降低病原载入，而抗原特异性反应仍能建立。相反，MHC-限制性CTLs晚于非特异性CTL达到最佳活性，通常在抗体产生前。抗原特异性CTLs抑制或降低病原蔓延，优选终止感染。

CTL激活、克隆扩大、或CMI能系统地或区域化定位地诱导。在区域化定位作用的情况下，优选使用适合施用于该区域的疫苗组合物。另一方面，不会迫切要求系统诱导受试者的CTL激活、扩大或CMI。

施用的自身辅助免疫原性分子的有效量可以变化，可以是单独的或在疫苗组合物中，从而引起T细胞和B细胞激活、克隆扩大或CMI，所述有效量将基于免疫原性表位的性质、给药途径、体重、年龄、性别、或免疫受试者的健康情况，和需要的免疫应答性质而变化。所有这些变量由现有识别技术经验性地决定。

自身辅助免疫原性分子可选择性地与任何合适的或需要的载体、佐剂、BRM、或可药用的赋形剂一起配制成制剂，以可注射的组合物形式方便地施用。注射可以是鼻内、肌肉、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或其他已知途径。针对静脉注射，要求包括一种或多种液体和营养补充剂。

给药的最佳剂量和优选给药途径可使用动物模型建立，如，例如，用包含自身辅助免疫原性分子的制剂注射小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、狗、马、牛、羊或猪，然后使用任何常规测定监控免疫应答。

特别优选使用HLA A2/K^b转基因小鼠，它带有嵌合人-小鼠I型MHC基因座，其组成为人HLA A*0201等位基因的α1和α2结构域和小鼠H-2K^bI型分子的α3结构域(Vitiello等，J Exp Med 173：1007，1991)，可用来体内检测对本发明组成HLA A2-限制CTL表位或疫苗组合物的自身辅助免疫原性分子的应答。

不受任何理论或作用模式限制，自身辅助免疫原性分子的生物学效果通过它们刺激和促进树突细胞成熟的能力得到发挥。就是树突细胞随后激活引流淋巴结中的CD4⁺和CD8⁺T细胞。

在相关的实施方案中，本发明提供增强受试者细胞介导免疫的方法，所述方法包括在一定条件下使离体细胞(优选从受试者中获得的树突细胞)接触有免疫活性的本发明的自身辅助免疫原性分子或衍生物或其变体或疫苗组合物一段时间，所述疫苗组合物包括所述自身辅助免疫原性分子或衍生物或变体，所述条件足以促进树突细胞成熟。所述树突细胞随后能使T细胞和/或B细胞表位特异激活。

在一个优选的实施方案中，本发明提供增强受试者细胞介导免疫的方法，所述方法包括：

(i)在一定条件下使从受试者中获得的离体树突细胞接触有免疫活性的本发明的自身辅助免疫原性分子或衍生物或其变体或疫苗组合物一段时间，所述疫苗组合物包括所述自身辅助免疫原性分子或衍生物或变体，所述条件足以促进树突细胞成熟；和

(ii)将活化的树突细胞自体导入受试者或同系基因导入另一个受试者，从而发生T细胞和/或B细胞激活。

T细胞可以是CTL或CTL前体细胞或CD4⁺T辅助细胞。

从中获得树突细胞的受试者可以是相同的受试者或与正受处理的受试者不同的受试者。正受处理的受试者可以是任何受试者，他们携带有病原(如，例如寄生虫、细菌或病毒)引起的潜在或显现的感染，或者他们需要获得针对这样的病原的疫苗接种，或需要获得这样的疫苗接种。正受处理的受试者也可以进行对所携带肿瘤的处理，或针对肿瘤发展接种疫苗。

″表位特异性活性″的意思是T细胞能如上所述被激活(即，T细胞将识别和溶解带有能产生CTL表位的病原的细胞，或者能够识别病原抗原的T细胞表位，以瞬时或持续方式)。因此，T细胞特别优选CTL前体，通过本发明的方法，它能够识别和溶解带有病原的细胞，或者能够识别病原抗原的T细胞表位，以瞬时或持续方式。

对于这样的离体应用，优选树突细胞包含于从受试者中获得的生物样品中，例如血液，PBMC或来自它们的血沉棕黄层。

本发明的另一方面提供一种提供或增强未感染受试者中对病原的免疫性的方法，包括在一定条件下将有免疫活性的本发明的自身辅助免疫原性分子或其衍生物或其变体或疫苗组合物施用于所述受试者一段时间，所述疫苗组合物包括所述自身辅助免疫原性分子或衍生物或变体，所述条件足以提供对病原以后感染的免疫记忆。

在一个相关的实施方案中，本发明提供一种增强或赋予未感染受试者对病原的免疫性的方法，包括在一定条件下使从受试者中获得的离体树突细胞接触有免疫活性的本发明的自身辅助免疫原性分子或衍生物或其变体或疫苗组合物一段时间，所述疫苗组合物包括所述自身辅助免疫原性分子或衍生物或变体，所述条件足以使T细胞和/或B细胞表位特异激活。

因此，本发明的这一方面提供对受试者预防性疫苗给药，其中所述疫苗的活性取代(即，本发明的自身辅助免疫原性分子)诱导未感染个体中经由记忆T细胞的免疫记忆。此处描述的疫苗实验设计的优选实施方案增强受试者的细胞介导免疫，应用必要的变更以诱导受试者中对病原的免疫记忆。

因此，本发明考虑到提供或增强对下述病原的免疫性：人免疫缺乏病毒(HIV)、人乳头瘤病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病病毒、埃博拉病毒、流感病毒、脑炎病毒、天花病毒、狂犬病病毒、疱疹病毒、仙台病毒、呼吸道合胞病毒、othromyxoviruses、麻疹病毒、水泡性口炎病毒、绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒和巨细胞病毒、支顶孢属、曲霉属、担子菌团属、双极霉属、芽生菌、念珠菌属、卡氏枝孢霉、Coccoidiodes immitis、耳霉属、隐球菌属、弯孢(霉)属、表皮癣菌属、甄氏外瓶霉、明脐菌属、紧密着色芽生菌、佩德罗索(氏)着色芽生菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、念珠地丝菌、荚膜组织胞浆菌荚膜变种、荚膜组织胞浆菌杜氏变种、威尼克何德霉、Lacazia loboi、柯柯豆毛色二孢、塞内加尔钓端球体、灰(色)马杜拉分支菌、足菌肿马杜拉分支菌、糠秕马拉色(氏)霉菌、小孢子菌属、罗萨梯新龟甲形菌、Onychocola canadensis、巴西芽生菌、疣状瓶霉菌、何德毛结节菌、Piedra iahortae、花斑癣、Pseudallesheriaboydii、罗梅罗(氏)刺壳孢菌、无根根霉菌、短尾帚霉、双间柱顶孢、申克孢子丝菌、发癣菌属、毛孢子菌、Zygomcete真菌、伞状犁头霉、微小根毛霉和无根根霉菌、炭疽杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌、大肠埃希杆菌、志贺(氏)痢疾菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌、破伤风梭状芽胞杆菌、白喉棒状杆菌和绿脓假单胞菌。

本发明的另一方面提供一种提供或增强受试者中对癌症的免疫性的方法，包括在一定条件下向所述受试者施用有免疫活性的本发明的自身辅助免疫原性分子或衍生物或其变体或疫苗组合物一段时间，所述疫苗组合物包括所述自身辅助免疫原性分子或衍生物或变体，所述条件足以提供对癌症的免疫记忆。

在一个相关的实施方案中，本发明提供一种增强或赋予受试者中对癌症的免疫性的方法，包括在一定条件下使从受试者中获得的离体树突细胞接触有免疫活性的本发明的自身辅助免疫原性分子或衍生物或其变体或疫苗组合物，疫苗组合物包括所述自身辅助免疫原性分子或衍生物或变体，所述条件足以使T细胞表位特异激活。

因此，本发明的这一方面提供向受试者预防性疫苗给药，其中所述疫苗的活性取代(即，本发明的自身辅助免疫原性分子)诱导个体中经由记忆T细胞的免疫记忆。此处描述的疫苗实验设计的优选实施方案增强受试者的细胞介导免疫，应用必要的变更以诱导受试者中对癌症的免疫记忆。

因此，本发明考虑到提供或增强对下述癌症的免疫性：ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌症特发性骨髓外化生、秃顶、软组织腺泡状肉瘤、直肠癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、运动失调性毛细血管扩张症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、CNS肿瘤、类癌瘤、子宫颈癌、儿童脑瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、内分泌腺癌症、子宫内膜癌、室管膜细胞瘤、食管癌、尤文肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜成神经细胞瘤、输卵管癌、范可尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠类癌瘤、生殖泌尿癌、生殖细胞肿瘤妊娠性滋养层细胞病、神经胶质瘤、妇科癌、血液学恶性肿瘤、毛细胞白血病、头与颈癌症、肝细胞癌症、遗传乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金病、人乳头瘤病毒、水泡状胎块、高钙血(特发性)综合征、咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌症，卡波氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、李弗劳明综合征、唇癌、脂肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳房癌、肾恶性横纹肌样瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌症、间皮瘤、转移癌症，口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、蕈样霉菌病、骨髓异常增生综合征、骨髓瘤、骨髓增殖性疾病、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、多发性神经纤维瘤、nijmegen破损综合症、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞(型)肺癌(nsclc)，眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、脑下垂体癌、真性红细胞增多症、前列腺癌、罕见癌症及相关疾病、肾细胞癌、视网膜成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、先天性血管萎缩性皮肤异色病、唾腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、恶性皮肤网状细胞增多综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(sclc)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤，鳞状(上皮)细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾脏-骨盆-/-输尿管)、滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌症、异地排尿、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、女阴癌、原发性巨球蛋白血症或肾母细胞瘤.

根据另一实施方案，此处描述的药物组合物除了本发明的自身辅助免疫原性分子外，还包括一种或多种免疫刺激剂。免疫刺激剂实质上指能增强或使对外源抗原产生免疫应答(抗体和/或细胞介导)的任何物质。免疫刺激剂的一个优选类型包括佐剂。很多佐剂包含的物质被设计成保护抗原以免快速代谢，如氢氧化铝或矿物油，并且还包含免疫应答的刺激剂，如类脂A，百日咳杆菌或结核分支杆菌来源蛋白质。某些佐剂从商业上获得，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)；Merck佐剂65(Merck andCompany，Inc.，Rahway，N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，Pa.)；铝盐如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝；钙盐。铁或锌；酰化酪氨酸不可溶悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球；单磷酰类脂A和quil A。也可使用细胞因子作为佐剂，如GM-CSF、白介素-2、-7、-12、和其他类似生长因子。

本发明的某一实施方案中，佐剂组合物主要诱导Th 1类型的免疫应答。高水平的Thl-类型细胞因子(例如，IFN-γ、TNF α、IL-2和IL-12)倾向于诱导对加入抗原的细胞介导免疫应答。相反，高水平的Th2-类型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于诱导体液免疫应答。应用本文提供的疫苗后，病人将能支持包括Th1-和Th2-类型的免疫应答。在一个优选的实施方案中，应答主要是Th1-类型，Th1-类型细胞因子的水平将增加到超过Th2-类型细胞因子的水平。这些细胞因子的水平可以容易地使用标准测定评估。针对细胞因子家族的综述，见Mosmann等，Ann Rev Immunol 7：145-173，1989。

本发明药物组合物中使用的其他带说明性质的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，France)、SAF(Chiron，Calif.，UnitedStates)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如，SBAS-2或SBAS-4，获得于SmithKline Beecham，Rixensart，Belgium)、Detox(Enhanzyn.RTM.)(Corixa，Hamilton，Mont.)、RC-529(Corixa，Hamilton，Mont.)和其他氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸盐(AGPs)，如悬而未决的美国专利申请号08/853,826和09/074,720中所述，此处全文引入作为参考，以及聚氧乙烯醚佐剂，如WO 99/52549A1中所述。

根据本发明的另一实施方案，本文描述的免疫组合物经由抗原呈递细胞(APCs)递送至宿主，如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和其他细胞，它们可以构建成为有效的APCs。这样的细胞可以(但不是必须)经基因修饰，从而增加呈递抗原的能力，改善T细胞应答的活化和/或维持，使本身具有抗肿瘤或抗病原作用，和/或与接受者免疫相容(即，匹配的HLA单倍型)。APCs一般可以从任何生物液体或器官中分离，包括肿瘤和瘤周组织，并且可以是自体的、同种异体的、同系基因的或异基因的细胞。

本发明使用树突细胞或其祖细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是高潜力APCs(Banchereau等，Nature 392：245-251，1998)并且已显示是有效的生理佐剂，能引起预防性或治疗性的抗肿瘤或抗病原免疫(见Timmerman等，Ann Rev Med 50：507-529，1999)。一般而言，树突细胞的鉴别可以基于它们的特有形状(原位星状，体外具可见的胞质突(树突))，它们高效率吸收、处理、呈递抗原的能力，以及它们激活衬套(nave)T细胞应答的能力。当然，树突细胞可以被构建成表达体内或离体时通常不会在树突细胞中发现的特异细胞表面受体或配体，而本发明考虑了到这种经修饰的树突细胞。作为树突细胞的替代，分泌小囊泡抗原-载入树突细胞(称为外核体)可用于疫苗中(见Zitvogel等，Nature Med 4：594-600，1998)。

树突细胞和相细胞可从外周血液、骨骼、肿瘤-浸润细胞、瘤周组织浸润细胞、淋巴结、脾、皮肤、脐带血或任何其他合适组织或液体中获得。例如，树突细胞可通过加入组合的细胞因子，如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα，来培养从外周血中收获的单核细胞，从而离体分化。或者，外周血、脐带血或骨髓中收获的CD 34阳性细胞向树突细胞的分化可通过向培养基中加入组合的GM-CSF、IL-3、TNF.α、CD40配体、LPS、f1t3配体和/或其他能诱导树突细胞分化、成熟和增殖的化合物。

树突细胞能方便地以“未成熟”和“成熟”细胞分类，它允许简单地辨别两种非常典型的表型。然而，这种命名法不应该理解为排除分化的所有可能中间阶段。未成熟树突细胞作为APC的典型特征是高效率吸收抗原和处理，其与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的典型特征是这些标记的低表达，但是负责T细胞激活的细胞表面分子高表达，如MHC I型和II型、粘连分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)。

此处描述的使用特定组合物的合适剂量和治疗方案种类繁多，包括例如，静脉内、鼻内和肌肉给药和制剂，属于现有技术，为了一般说明的目的，下面简单讨论其中一些。

在某些情况下，此处描述公开的药物组合物的递送需要胃肠道外、静脉内、肌内，或甚至腹膜内。这些途径为本领域技术人员知晓，其中一些得到进一步描述，例如美国专利号5,543,158；美国专利号5,641,515和美国专利号5,399,363。在某一实施方案中，以游离碱或药学上可接受的盐存在的活性化合物的溶液在水中制备，适宜地混合了表面活性剂，如羟丙纤维素。也可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物和油脂中制备分散液。在储藏和使用的常规条件下，这些制备一般将包括防腐剂以防止微生物生长。

适合注射使用的说明性药用形式包括无菌水溶液或分散液和用于无菌注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末(例如，见美国专利号5,466,468)。在所有情况下，必须是无菌和液体形式，从而达到轻易注射的程度。在产品制造和储存的条件下必须稳定，防止如细菌和真菌的微生物的污染活动。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，等等)、其合适的混合物和/或植物油。可以维持适当的流动性，例如，使用包被如卵磷脂，在分散液体中维持所需颗粒的大小和/或使用表面活性剂。防止微生物活动可以使用多种抗细菌和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等。在很多情况下，优选包括等渗试剂，例如，糖或氯化钠。要延长吸收注射组合物，可以使用拖延吸收的试剂于组合物中，例如单硬脂酸铝和明胶。

在一个实施方案中，为了以液体溶液形式肠胃外给药，如果必要，溶液应该经过合适的缓冲处理，最初的液体稀释通过足够的盐或葡萄糖达到等渗。这些特殊的液体溶液尤其适合静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。相应地，根据本发明的内容，可应用的无菌溶液介质为被本领域技术人员知晓。例如，一份剂量可以溶解于1ml等渗NaCl溶液中，要么加入到1000ml皮下输液，要么注射到输入的计划位置(见，例如，″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15th Edition，pages 1035-1038 and 1570-1580)。剂量的一些变化将基于处理的受试者的条件而变化。此外，为了施用于人类，制备当然优选符合无菌性、致热原性，和FDA生物标准要求的通常的安全和纯化标准。

在本发明的另一实施方案中，此处公开的组合物可以以中性或盐形式配制。说明性的药用可接受盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基基团形成)，它的形成可以结合无机酸如，例如盐酸或磷酸，也可结合有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸，等等。与游离羧基基团一起形成的盐还可以来自无机碱，如，例如，钠、钾、铵、钙，或氢氧化铁，这样的有机碱有异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等。就制剂而言，溶液将以与制剂剂量相容的方式施用，为治疗有效量。

载体进一步包括任何和所有的溶剂、分散介质、运载体、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟试剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体，等等。这些药用活性物质的介质和试剂的使用为本领域公知。除非常规介质或试剂与活性成分不相容，都会考虑到它在治疗组合物中的应用。补充活性成分也能加入到组合物中。短语“药用可接受的”指分子实体和组合物施用于人时不会产生过敏或类似不利的反应。

在某些实施方案中，药物组合物的递送可通过鼻内喷雾剂、吸入剂、和/或其他气溶剂递送载体。将基因、核苷酸和多肽组合物经由鼻内喷雾剂直接递送到肺的方法已有描述，例如，美国专利号5,756,353和美国专利号5,804,212。同样，使用鼻内微粒树脂(Takena ga等，J Controlled Release 52(1-2)：81-7，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利号5,725,871)递送药物也被药物领域公知。同样，美国专利号5,780,045描述了以聚四氟乙烯为支持介质的说明性透膜药物递送。

在本发明的另一方面，本文描述的药物组合物可用于治疗癌症或病原感染。这些方法中，将描述的药物组合物施用于受试者，代表性地为温血动物，优选人。受试者可以被或没有被癌症或病原感染折磨。因此，上述药物组合物可用于阻止癌症发展，或治疗被癌症折磨的病人，或者阻止病原感染，或者治疗病原感染。

在某些实施方案中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗依赖于体内刺激内源宿主免疫系统，使其经过施用免疫应答修饰试剂，如本文提供的自身辅助免疫原性分子，对肿瘤或病原反应。

本文描述的治疗组合物施用的途径、频率和剂量有个体差异，可以使用标准方法轻易建立。一般的，药物组合物和疫苗的施用可通过注射(例如，皮内、肌内、静脉内或皮下)或鼻内给药(例如，通过抽吸)。优选地，1-10的剂量可以在52周期间给药。优选地，6剂量，1个月间断给药，而后周期性给予加强疫苗。适合于个体病人的可以是可替代的施用方案。合适的剂量是如上所述的施用的化合物的量，它能促进抗肿瘤或抗病原免疫应答，至少是基本(即，未处理)水平的10-50％以上。这种应答的监控可通过测量病人中的抗肿瘤抗体，或者依赖于疫苗的细胞效应子细胞的产生，该溶细胞效应子细胞能体外杀死病人肿瘤细胞。与未接种的病人比较，这类疫苗在已接种病人中也能引起导致临床结果改善的免疫应答(例如，更加频繁的缓解病情，完全或部分或更长的无病生存)。一般的，对于包含一种或多种多肽的药用组合物和疫苗而言，剂量中出现的每一种多肽的量的范围为每公斤宿主大约25μg-5mg。合适的剂量多少将随着病人大小变化，但典型范围约为0.1mL-约5mL。

一般的，合适的剂量和治疗方法以足以有益于治疗和/或预防的量提供活性化合物。这种应答的监控可通过与未接种的病人比较，在治疗病人中建立改善的临床结果(例如，更加频繁的缓解病情，完全或部分或更长的无病生存)。肿瘤蛋白质中的预成(pre-existing)免疫应答的增强通常与改善的临床结果关联。这些免疫应答的评价一般可以使用标准增殖、细胞毒性测定或细胞因子测定，它们的进行可使用从治疗前后的病人中获得的样本。

为了诊断目的，本发明的自身辅助免疫原性分子能容易地进行修饰。例如，它的修饰可通过加入天然或合成的半抗原、抗生素、激素、类固醇、核苷、核苷酸、酶、酶底物、酶抑制剂、生物素、卵白素、聚乙二醇、肽的多肽部分(例如促吞噬肽、多赖氨酸)、荧光标记(例如FITC、RITC、丹酰、鲁米诺或香豆素)、生物发光标记、自旋标记、生物碱、生物胺、维生素、毒素(例如地高辛、次毒蕈环肽、鹅膏蕈碱、河豚毒素)，或合成物形式试剂。

用以下非限制性的实施例来阐明本发明更具体的细节，此处提供的小鼠实施例对于人类中等同的疾病是可接受的模型，本领域技术人员能够扩展此处出现的这些模型中的发现至人类疾病中，无须过度实验。

实施例1

材料与方法

试剂

除非另外说明，化学试剂均为分析级或相当级别。N，N’-二甲基酰胺(DMF)、哌啶、三氟乙酸(TFA)、O’-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲阳离子六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基乙胺(DIPEA)与二异丙基碳化二亚胺(DIPCDI)来自于澳大利亚墨尔本Auspep Pty公司和澳大利亚Castle Hill的Sigma-Aldrich Pty公司。二氯甲烷(DCM)和二乙醚购自于MerckPty公司(澳大利亚，Kilsyth)。苯酚和三异丙基硅烷(TIPS)来自于Aldrich(Milwaulke，WI)，三硝基苯甲磺酸(TNBSA)和二氨基嘧啶(DMAP)来自于Fluka；1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)来自于Sigma，软脂酸来自于Fluka。固体载体TentaGel S RAM和TentaGel S Am来自于德国图宾根Rapp Polymere GmbH公司。O-(N-Fmoc-2-氨乙基)-O’-(2-羧乙基)-十一烷乙撑二醇(undecaethylene glycol)(Fmoc-PEG)来自于Novabiochem，Merck Bioscience s公司(瑞士)。双异官能团连接分子N-琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺己酸盐(MCS)来自于FlukaBiochemika公司(瑞士)。鸡卵溶菌酶，卵清蛋白和β-半乳糖苷酶来自于Sigma。

能作为在水溶液中脂化蛋白的组件的水溶性的基于Pam2Cys的脂部分的合成

水溶性脂质组件的图示见图1和图2。

脂部分的合成采取常规的利用9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学的固相合成方法进行。用于多肽合成的一般程序在Jackson等人Vaccine18：355，1999文中描述。使用固相载体TentaGel S RAM。在偶联步骤中，使用四倍过量的9-芴甲氧羰基氨基酸衍生物，在偶联9-芴甲氧羰基-PEG时例外，这个步骤仅需两倍过量。

将Pam2Cys偶联到肽链上的方法参照Jones等人的Xenobiotica5：155，1975和Metzger等人的Int J Pept Protein Res 38：545，1991文中所述，使用以下的修饰方法：

I.S-(2，3-二羟丙基)半胱氨酸的合成：

将三乙胺(6g，8.2ml，58mmol)加入到在水中的L-半胱氨酸盐酸盐(3g，19mmol)和3-溴代丙烷-1，2-二醇(4.2g，2.36ml，27mmol)中，然后将均匀的溶液在室温中保持3天。将溶液在40℃真空抽干得到白色残留物，将残留物与甲醇(100ml)一起煮沸，然后离心，将得到的残留物溶于水(5ml)。将该水溶液加到300ml丙酮中，用离心分离沉淀。将沉淀通过数次水溶解、再加丙酮沉淀的方法进行纯化，得到的S-(2，3-二羟丙基)半胱氨酸为白色无定形粉末(2.4g，12.3mmol，64.7％)。

II.合成N-芴甲氧羰基-S-(2，3-二羟丙基)半胱氨酸(Fmoc-Dhc-OH)：

将S-(2，3-二羟丙基)半胱氨酸(2.45g，12.6mmol)溶于9％的碳酸钠(20ml)中。加入溶解于20ml乙腈的芴甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(3.45g，10.5mmol)溶液，将混合物搅拌两小时后用240ml水稀释，然后用乙醚萃取(25ml×3)。用浓盐酸将水相酸化至pH2，再用乙酸乙酯萃取(70ml×3)。将萃取物用水(50ml×2)和饱和NaCl溶液(50ml×2)洗涤后，用硫酸钠干燥。再通过在-20℃时于乙醚和乙酸乙酯中重结晶，可以得到无色粉末(2.8g，6.7mmol，63.8％)。

III.将Fmoc-Dhc-OH与树脂结合肽偶联：

在DCM和DMF(1∶1，v/v，3ml)中，使用HOBt(36mg，0.24mmol)和DICI(37ul，0.24mmol)在0℃下活化Fmoc-Dhc-OH(100mg，0.24mmol)5分钟。然后将混合物加到一个装有树脂结合肽(0.04mmol，0.25g氨基-肽树脂)的容器中。摇动2小时后，过滤去除溶液，将树脂用DCM和DMF(各30ml×3)洗涤。使用TNBSA试验监测反应是否完全。如果需要，可进行二次偶联。

IV.Fmoc-Dhc-肽树脂上两个羟基的十六(烷)酰化：

将软脂酸(204mg，0.8mmol)，DICI(154ul，1mmol)和DMAP(9.76mg，0.08mmol)溶解于2ml DCM和1ml DMF中。将结合有Fmoc-Dhc-肽的树脂(0.04mmol，0.25g)悬浮于该溶液中，室温震摇16小时。过滤去除溶液，树脂用DCM和DMF彻底清洗以除去残留尿素。使用2.5％的DBU(5mins×2)以完全去除9-芴甲氧羰基团。

所有树脂结合肽的肽结构可以使用试剂B(88％TFA，5％苯酚，2％TIPS，5％水)处理2小时，从固相载体上切割下来，并参照Zeng等人Vaccine 18，1031(2000)文中所描述方法使用反相色谱纯化。

分析级反相高效液相色谱(RP-HPLC)在Waters HPLC系统上进行，色谱柱使用Vydac C4柱(4.6×300mm)，流速为1ml/min，使用含0.1％TFA的水和含0.1％TFA的乙腈作为极限(limit)溶剂。所有产品在分析级RP-HPLC上呈现较大的单峰，使用Agilent 1100LC-MSD离子阱(trap)质谱仪分析，发现都为预期质量。

结构A和B的合成(图1)：

使用了TentaGel S Am树脂。将Fmoc-Cys(Trt)-OH作为第一个氨基酸偶联在树脂上，然后接着是8个Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH。对于结构A的合成，先将9-芴甲氧羰基-S-(2，3-二羟基-2-丙基)-半胱氨酸[Fmoc-Cys(Dhc)-OH]偶联至丝氨酸残基上，然后在二甲氨基吡啶(DMAP)和二异丙基碳化二亚胺存在下，使用软脂酸进行十六烷酰化，反应16小时。对于结构B的合成，将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶联于丝氨酸残基上。将二者除去后，在二甲氨基吡啶(DMAP)和二异丙基碳化二亚胺存在下，使用软脂酸进行十六烷酰化，反应16小时，然后将Fmoc基团Fmoc-Cys(Dhs)-OH偶联剂两个暴露的氨基上，在合成结束后，应除去半胱氨酸残基上的9-芴甲氧羰基，肽链从树脂上被切割下来，侧链需去保护以生成结构A和B。

结构C和D的合成(图1)；

使用了TentaGel S Am树脂。将Fmoc-Lys(Mtt)-OH作为第一个氨基酸偶联在树脂上，然后接着是8个Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH。先将Fmoc-Cys(Dhc)-OH偶联至丝氨酸残基上，然后在二甲氨基吡啶(DMAP)和二异丙基碳化二亚胺存在下，使用软脂酸进行十六烷酰化，反应16小时。在去除9-芴甲氧羰基后，使用二碳酸二叔丁酯封闭N末端氨基。Mtt基团使用1％三氟乙酸在二氯甲烷中选择性地去除。对于结构C的合成，是用溴乙酸在二异丙基碳化二亚胺(DIC)的活化下偶联至暴露的氨基上。对于结构D的合成，是用Boc-氨基羟乙酸偶联至暴露的氨基上。将肽链从树脂上切下并将侧链去保护以生成结构C和D。

这四个结构都具有8个赖氨酸，能帮助提高脂部分的水溶性。

●结构A的每个脂质组件上有一个Pam2Cys拷贝。

●结构B的每个脂质组件上有两个Pam2Cys拷贝。这个组件在可用脂化位点有限的情况下非常有用。

●结构C能够直接偶联于蛋白或重组蛋白的任何自由巯基上。

●结构D具有一个氨氧基，能与醛基形成肟键，而这种醛基能通过存在于或设计在蛋白或重组蛋白N端的丝氨酸残基的氧化而产生。

具有聚乙二醇作为间隔子的四个脂部分类似物(图2)可以按上述的方法合成，它们能用以上对结构A、B、C和D描述类似的方法用于脂化蛋白。

实施例2

合成四种不同种类的脂化HEL(溶菌酶)蛋白

四种不同的脂化HEL是通过将图1中列出的四个脂部分偶联到鸡卵溶菌酶(HEL)蛋白上制备的。图3显示了这四种脂化蛋白的示意图。

脂化HEL蛋白中的脂化1HEL(硫醚)和脂化₂HEL(硫醚)是通过使用MCS衍生HEL后再化学选择地连接结构A的巯基以在蛋白和脂质组件之间形成硫醚键而制备的。它们的区别在于脂化₂HEL(硫醚)具有两个拷贝的结构A。分枝的脂化₂HEL每个蛋白分子只具有一个脂质组件拷贝，但因为结构B的二价性质每个蛋白有两个pam2cys拷贝。这样使之更加疏水并在HPLC的洗脱延后得多。

为了制备脂化₁HEL(二硫化物)，将HEL用异(基)双功能连接剂3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)修饰，然后与结构A反应，通过在脂质组件和蛋白之间形成二硫键而生成脂化₁HEL(二硫化物)。

实施例3

脂化胰岛素免疫原性的评价

将胰岛素以下面的程序进行脂化。将10mg牛胰岛素溶入400μl含6M盐酸胍的0.5M磷酸缓冲液(pH 7.9)和400μl 0.02M磷酸缓冲液(pH 7)中。在该溶液中加入200μl含3.25mg的N-琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺己酸盐(MCS)的乙腈溶液，作用3小时后，被MCS修饰的胰岛素用半制备型HPLC加以纯化。将3.3mg MCS修饰的胰岛素和5mgPam2CysSer(Lys)8Cys溶于500μl乙腈和500μl水中。反应混合物置于室温48小时。通过半制备型HPLC两种脂化的胰岛素化合物被分离出来。使用质谱分析这些组分，显示得到了两种不同的脂化胰岛素，每个蛋白分子连接的脂部分的数量有差别。Pam2Cys₂-胰岛素每个胰岛素具有两个拷贝的Pam₂CysSer(Lys)₈Cys，而Pam2Cys₃-胰岛素则每个胰岛素具有三个拷贝的Pam₂CysSer(Lys)₈Cys。

动物研究在小鼠身上进行，将小鼠接种脂化胰岛素，并测定其抗体反应。简要地说，将四组Balb/c小鼠分别接种溶于弗氏佐剂的胰岛素(第一针使用完全佐剂，第二针使用不完全佐剂，CFA/IFA)，溶于PBS的Pam2Cys₂-胰岛素，溶于PBS的Pam2Cys₃胰岛素或溶于PBS的脂部分本身，接种时间为第0周和第4周。从第4、5、6周分别采血制得血清。血清中的抗胰岛素抗体滴度用ELISA进行测定。结果显示单次接种脂化的胰岛素蛋白就引起了强的抗胰岛素反应，其强度与接种合用CFA/IFA的胰岛素两次后引起的强度相当。在两次接种脂化胰岛素后，抗体水平也显著高于CFA/IFA组。而具有三个脂部分拷贝的脂化胰岛素具有比具有两个拷贝的胰岛素更强的免疫原性。结果见图4。

实施例4

使用脂化鸡卵溶菌酶蛋白(HEL)诱导抗体

步骤1：使用N-琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺己酸盐修饰HEL：

将15mg的HEL(Mr＝14305)溶于800μl含6M胍的缓冲液(pH＝7.75)中，并加入溶于200μl乙腈的1.30mg的N-琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺己酸盐。混合物置于室温反应30min，将产物使用HPLC进行分离。

步骤2：偶联Pam2Cys部分到MCS修饰的HEL上

3.4mg MCS修饰的HEL和1.76mg的Pam2Cys-SerLys8Cys(SEQ IDNO：7)溶解于500μl含8M脲的0.05M磷酸缓冲液pH 7.3中。混合物置于室温反应18小时，然后用HPLC分离含一个Pam2Cys拷贝的脂化HEL。

步骤3：使用脂化的鸡卵溶菌酶蛋白(HEL)诱导抗体

将C57BL6小鼠分别注射接种脂化HEL Pam2Cys1-HEL，HEL和Pam2CysSerLyy8Cys混合物，溶于CFA的HEL，溶于生理盐水和CFA的HEL。小鼠于0天和21天被给予两剂30μg的抗原，在21和34天采血制得血清。21天(1°)和34天(2°)的血清中抗HEL的抗体滴度由ELISA测定(图5)。结果显示，脂化的HEL能诱导强的抗HEL的抗体反应，其强度与注射弗氏佐剂的HEL的强度相当。相对的，当HEL与脂部分混合注射接种则没有产生特异性抗体反应。

实施例5

脂化HEL在两种不同种的小鼠中诱导抗HEL的抗体反应。

C57BL/6和BALB/c小鼠分别在0周和3周时给予25μg脂化HEL。作为对照，加入在弗氏佐剂中的HEL(第一次接种使用完全佐剂，第二次接种使用不完全佐剂)和单独溶于生理盐水的HEL按照相同的注射接种方法给予小鼠。小鼠于3周和5周取血并制成血清，抗HEL抗体反应用ELISA进行测定。结果(图6)显示，在两种小鼠中脂化的HEL都引起了强的抗HEL的抗体反应，反应强度等于(如果不强于的话)伴随弗氏佐剂给予HEL获得的情况。

使用不同的化学连接剂偶联Pam2Cys和蛋白时，脂化HEL诱导的抗体反应。

将使用不同的化学连接剂获得的四种脂化HEL(图3)用于注射接种C57BL/6小鼠。小鼠在0周与3周接受两剂注射(每剂25μg)。在0周、3周和5周采取血样制备血清。抗HEL的抗体反应用ELISA测定。另一组小鼠接受两剂HEL，分别在第一次注射用完全弗氏佐剂乳化HEL和第二次注射用不完全弗氏佐剂乳化HEL。结果(图7)显示出获得相似的特异性抗HEL抗体反应，而与所用的化学连接剂无关。

抗体的诱导是T依赖性的

对于脂化HEL诱导出来的抗体同种型特征的检测显示出该免疫反应是T细胞依赖的(图8)。为了得到T辅助细胞参与的更进一步证据，将缺失CD4⁺T细胞的GK1.5转基因小鼠注射接种脂化的HEL。作为对照，将野生型C 57BL/6小鼠平行注射接种抗原。小鼠分别在0周和4周接受两剂注射(每剂25μg)，于4周和6周采血。血清抗HEL抗体滴度由ELISA测定。结果(图8)显示对于GK1.5小鼠脂化HEL诱导很小量或不能诱导抗HEL抗体反应。而相对的，注射脂化HEL的C57BL/6小鼠中则检测到了强的抗HEL抗体反应。GK 1.5小鼠在接受两剂溶于弗氏佐剂的HEL注射后，也是有很小量或不能产生抗HEL的抗体(图8)。

对比存在脂化Alum和弗氏佐剂时对HEL的抗体反应

用脂化HELP，HEL/ALUM，HEL/CFA和HEL/生理盐水比较它们诱导抗体反应的能力。结果如图9所示，对比溶于Alum、CFA或生理盐水中的HEL，脂化HEL诱导出了较强的抗体反应。

对比由脂化HEL和加入弗氏佐剂的HEL诱导出的抗体的亚型

将BALB/c小鼠分别在0天和28天皮下注射接种两剂(每剂30μg)溶于盐水的Pam2Cys或乳化于弗氏佐剂的HEL(第一剂为完全佐剂，第二剂为不完全佐剂)。在两次抗原注射后的14天采血，制备血清并用ELISA测定抗HEL抗体的同种型(图10)。结果显示得到了两种相似的同种型。

实施例6

卵清蛋白的脂化

将6.4mg卵清蛋白溶于含8M脲的0.05M磷酸缓冲液(pH 8.3)中。向溶液中加入5mg的二硫赤藓糖醇。将溶液保持于37℃过夜。还原的卵清蛋白通过凝胶过滤色谱分离出来，色谱柱为Superdex G7510/300GL柱，使用50mM碳酸氢铵作为洗脱缓冲液(流速0.5ml/min)。将保留时间为25分钟的洗脱物质收集起来并用离心浓缩管(Viva Spin20[VIVASCIENCE]，截留分子量为10000Da，或Ultra-15[Millipore]，截留分子量为10000Da)浓缩至1ml。

自由巯基(SH)的数量按以下方法确定：在50μl还原蛋白溶液中加入50μl含10mM 5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的0.1M磷酸缓冲液(pH 8)。溶液在37℃保持10min，然后加入900μl 50mM的碳酸氢铵。在412nm处测定光密度值，将含10mM 5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的0.1M磷酸缓冲液(pH 8.0)50μl加入950μl的5mM碳酸氢铵溶液中作为空白。自由巯基的数量可按以下公式进行计算：

光密度值/13.6×20×100

将50mg的脱氧胆酸加入还原蛋白溶液中溶解。把溶解有1.3mg溴乙酰化的Pam2Cys SK8K(图1中的结构C)的200μl水慢慢加入到蛋白溶液中。加入1至3μl的10M氢氧化钠溶液调整pH至大约8.5。反应混合物保持在37℃过夜。终产物使用凝胶渗透色谱分离，色谱柱为Superdex G-7510/300GL柱，使用含0.15％w/v的脱氧胆酸的50mM的醋酸铵作为洗脱缓冲液(流速为0.5ml/min)。收集组分并用VivaSpin 20浓缩至1ml。脂化卵清蛋白的量通过UV光谱测定，使用一系列卵清蛋白溶液作为标准。

通过用脂化卵清蛋白注射小鼠并确定抗体滴度(图10和12)和细胞毒性T细胞活性来确定它的免疫原性特征(图13)。

实施例7

β-半乳糖苷酶的脂化

将4.86mg的β-半乳糖苷酶溶解于900μl 0.1M的磷酸缓冲液(pH8.0)中，并加入溶解有0.70mg N-琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺己酸盐(MCS)的乙腈溶液70μl。反应混合物在室温中保持4小时。MCS修饰的β-半乳糖苷酶使用Superdex G-7510/300GL柱分离，50mM的醋酸铵作为洗脱缓冲液，流速为0.5ml/min。收集组份、合并，并用Viva Spin 20(截留分子量为10000Da)浓缩至1ml。

为了确定结合到β-半乳糖苷酶蛋白上的马来酰亚胺基团数量，将10μl 5mM的2-巯基乙醇加入到50μl MCS修饰的β-半乳糖苷酶溶液中，混合物在37℃保持7-10分钟。然后加入50μl含10mM 5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的0.1M磷酸缓冲液(pH 8)，接着再加入890μl 0.1M磷酸缓冲液(pH 8)。测定412nm处的光密度值(A)。将10μl 5mM的2-巯基乙醇加入到50μl溶有10mM 5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的0.1M磷酸缓冲液(pH8)中，室温放置5分钟后，加入940μl 0.1M的磷酸缓冲液(pH8)，测定412nm处的光密度值(B)。结合在β-半乳糖苷酶上的马来酰亚胺基团数量按以下公式计算：

马来酰亚胺nmol数/β-半乳糖苷酶＝(A-B)/13.6×20×1000

将75mg的脱氧胆酸溶解于1ml MCS修饰的β-半乳糖苷酶中，然后缓慢加入200μl溶有1.1mg Pam2CysSK8C的水溶液。加入1-3μl的10M NaOH溶液以调整pH至8.5左右。反应混合物在37℃下过夜。终产物使用Superdex G-7510/300GL柱分离，用含0.15％的脱氧胆酸的50mM醋酸铵作为洗脱缓冲液，流速为0.5ml/min。收集分离组分并用Viva Spin 20(截留分子量为10000Da)浓缩至1ml。β-半乳糖苷酶的量由UV光谱法测定，用一系列β-半乳糖苷酶溶液作为标准参考。

在此描述的疫苗系统的效率依赖于Pam2Cys像受体2具有的对Toll的靶向作用特性。该受体在树突状细胞上呈现，能非常有效地接受和加工抗原。

实施例8

使用IFN-γ-ELISpot分析法通过脂化多抗原肽(polytope)诱

导CTL

多抗原肽具有六个不同的CTL抗原决定簇(表位)，其序列为

YPHFMPTNL  (SEQ ID NO：1)，SGPSNTPPEI  (SEQ ID NO：2)，FAPGNYPAL(SEQ ID NO：3)，SYIPSAEKI(SEQ ID NO：4)，EEGAIVGEI(SEQID NO：5)and RPQASGVYM(SEQ ID NO：6)。

1)脂化多抗原肽

a)使用N-琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺己酸盐修饰多抗原肽

多抗原肽贮液：2.13mg/ml于PBS；

N-琥珀酰亚胺基-6-马来酰亚胺己酸盐(MCS)贮液：0.92mg/ml于乙腈。

在100μul多抗原肽贮液中加入48uμl的MCS贮液(5倍过量)。在室温反应2小时。修饰后的多抗原肽用HPLC进行分离。

b)偶联Pam2Cys部分至MCS修饰的多抗原肽上；将MCS修饰的多抗原肽溶解于乙腈和PBS中，加入两倍过量的Pam2Cys-Ser-(Lys)8-Cys至该溶液。反应在室温中进行18小时。脂化的多抗原肽使用HPLC分离。

2)IFN-γ-ELISpot分析法

抗原决定簇检测为SYIPSAEKI(SEQ ID NO：4)(P.berghicircumsporazoite蛋白)

注射5nmole/鼠的剂量于BALB/c小鼠尾基部。七天后取出脾脏制备单细胞悬液(效应细胞)，使用一系列浓度的效应细胞进行IFN-γ-ELISpot检测法。效应细胞与被辐射后的自体脾细胞在有或者无CTL决定子(来自伯氏疟原虫circumsporazoite蛋白质(249-257))的环境中培养，并进行IFN-γ-ELISpot检测。结果见图14。

抗原决定簇检测为SGPSNTPPEI(SEQ ID NO：2)(h-2Db-腺病毒5EIA)

注射5nmole/鼠的剂量于C57BL6小鼠尾基部。七天后取出脾脏制备单细胞悬液(效应细胞)，使用一系列浓度的效应细胞进行IFN-γ-ELISpot检测法。效应细胞与被辐射后的自体脾细胞在有或者无CTL决定子SGPSNTPPEI(SEQ ID NO：2)的环境中培养，并进行IFN-γ-ELISpot检测。结果见图14。

实施例9

在N末端带有丝氨酸残基的重组蛋白的表达

为了偶联Pam2Cys分子到重组蛋白上，就需要成熟的蛋白分子的开端是一个丝氨酸残基而不是通常的甲硫氨酸残基(来自启始密码子)。为了做到这一点，成熟蛋白需按这种方法进行表达和纯化，这样蛋白通过正常途径转录和翻译，使用甲硫氨酸残基作为启始密码，然后将蛋白用特定的蛋白酶消化，留下丝氨酸残基作为氨基端残基。

选择的蛋白酶能够切割蛋白，使一个丝氨酸残基自然地留下来作为氨基末端的氨基酸，或者能消化蛋白，使之在酶解后可被设计在氨基末端结合一个丝氨酸残基。符合这种条件的蛋白酶包括肠激酶和Xa因子蛋白酶。这两种蛋白酶具有的切割位点不需要特定的氨基酸接在切割位点之后，但如果有某种残基存在，则不能切割。

然后选择表达载体，所述载体应能够使所选重组蛋白克隆、表达、纯化和切割。pET30(a/b/c)系列载体符合该条件。该表达载体由IPTG诱导表达，整合的多克隆位点可让被克隆的基因表达的蛋白在N-或C-末端带上His标签，所述His标签能够用于纯化，并且具有肠激酶位点以用于成熟蛋白纯化后的切割。

肠激酶切割位点两边的序列和多克隆位点必须被操作。这种操作应让编码被选蛋白的DNA框内连接在肠激酶切割位点之后，该位点有一个丝氨酸残基直接地接在下游。这样，利用pET 30载体的启动子区表达被选蛋白，在N端就具有一个组氨酸标签，其能够用于纯化，同时纯化后的蛋白能使用肠激酶进行切割。切割后，组氨酸标签被去除，成熟蛋白也将具有一个丝氨酸残基作为第一个氨基酸。

选择了两种蛋白用于测试产生的pET 30构建体。这两种蛋白为来自于鸡卵溶菌酶的卵清蛋白和单纯疱疹病毒的gB蛋白。设计寡核苷酸引物用于PCR扩增这些基因，除去跨膜结构域和信号肽，这样做是为了在纯化后得到更好水溶性的蛋白形式。蛋白的表达使用IPTG诱导，利用组氨酸标签通过镍树脂纯化蛋白。在纯化之后，使用肠激酶切剪蛋白，然后用肠激酶捕获树脂去除蛋白酶。得到的蛋白为水溶性形式，具有一个丝氨酸残基作为起始氨基酸。该蛋白即可被用于脂质的化学连接，如下所述。

实施例10

由单纯疱疹病毒克隆并表达糖蛋白B(gB)

具有N-末端丝氨酸的gB蛋白用实施例9中所描述的方法表达。

gB的脂化：将由大肠杆菌表达并在其N末端具有一个丝氨酸残基的gB使用高碘酸钠氧化，在其N末端产生一个醛官能基。氧化后的gB与脂部分D反应形成肟键。

免疫接种和病毒感染

使用溶解于生理盐水的脂化gB通过鼻内给药免疫C57BL6小鼠。进行病毒攻击时，将小鼠使用侧腹划伤或鼻内接种的方法感染HSV-KOS病毒。病毒的滴度通过融合单层Vero细胞使用标准PFU检测法确定。样品取自于肺(鼻内接种)或病毒感染位点(侧腹划伤)，匀浆，10倍系列稀释，然后测定蚀斑形成以确定原始组织中的病毒滴度。

使用四聚体染色法评价抗原决定簇特异性的CD8+阳性T细胞。H-2Kb-gB498-5-5四聚体用Jones等人J Virol 74：2414-9，2000描述的方法制备。

实施例11

卵清蛋白的克隆和表达

在N末端具有一个丝氨酸残基的卵清蛋白按实施例9中所述方法表达。

卵清蛋白的脂化

将由大肠杆菌表达并在N末端具有一个丝氨酸残基的卵清蛋白使用高碘酸钠氧化，在其N末端产生一个醛官能基。氧化后的卵清蛋白与结构D(图1)反应形成肟键。或者卵清蛋白也可采用实施例中所述的其它方法进行脂化。

CTL实验

通过皮下注射对C57BL6小鼠接种脂化卵清蛋白。使用来自于如脾、淋巴结器官的单细胞悬液进行γγ干扰素ELIspot检测。

实施例12

由脂化β-半乳糖苷酶诱导的免疫反应

在0天和7天对C57BL6小鼠注射脂化β-半乳糖苷酶，颈背部皮下给药。14天处死小鼠，取脾脏制备单细胞悬液。使用β-半乳糖苷酶肽抗原决定簇TPHPARIGL在体外刺激脾细胞，使用肽特异性IFN-γ检测测定细胞毒性淋巴细胞反应。

预期认为作为实施例3例举接种方案的结果，脾细胞制备物会表达I FN-γ产物。

在0天和7天对BALB/c小鼠注射两剂脂化β-半乳糖苷酶，同样采用颈背部皮下给药，使用肽抗原决定簇DAPIYTNVT体外刺激脾细胞也预期能表现出细胞毒性T淋巴细胞反应。

这些结果显示，脂化蛋白抗原能够诱导由不同主要组织相容性等位基因决定的细胞毒性T细胞反应。在两种动物中的抗体反应也得到预期结果，与图2中报道的对HEL的结果一致。

实施例13

HBsAg的脂化

乙型肝炎病毒小抗原(HBsAg)能用与处理胰岛素、HEL或OVA(卵清蛋白)描述的方法(实施例2，3和4)相似的方法被脂化。

由脂化HBsAg诱导的CTL反应

预期当BALB/c小鼠接种了脂化HBsAg后将表现出细胞毒性T淋巴细胞反应。取自于接种动物的脾细胞将对肽抗原决定簇IPQSLDSWWTSL反应。同时也期望具有不同MHC特异性的小鼠也会对它们各自的I型限制性肽抗原决定簇发生反应。

由脂化HBsAg诱导的抗体反应

期望不同种系的动物也在接种脂化HBsAg后诱导出抗体。

本领域技术人员可以想见本文描述的发明很容易变化和修改，特别指出的地方除外。可以理解本发明包括了所有这样的变化和修改。本发明也包括了在本说明书中涉及或展示的所有的步骤、特征、组合物和化合物，不管是单独地或是共同地，以及任两种或更多所述步骤或特征的任何和所有组合。

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序列表

<110>The Council of the Queensland Institute of Medical Research

JACKSON，David，C(US ONLY)

ZENG，Weiguang(US ONLY)

<120>免疫原性分子

<130>12723810/EJH

<150>AU 2005900571

<151>2005-02-08

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>1

Tyr Pro His Phe Met Pro Thr Asn Leu

1               5

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile

1               5                   10

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>3

Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu

1               5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>4

Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Lys Ile

1               5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>5

Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile

1               5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>6

Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met

1               5

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>7

Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys

1               5                   10

Claims (56)

1.一种自身辅助免疫原性分子，包含天然存在的或重组的多肽，其缀合一个或多个脂或脂肪酸部分，其中多肽包含这样的氨基酸序列，其包含至少一个CTL表位和一个T-辅助表位和一个B细胞表位，其中所述的这些表位对多肽是特异性的，并且其中所述自身辅助免疫原性分子引起受试者的免疫应答，而无论受试者的HLA类型如何。

2.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中脂或脂肪酸部分缀合多肽主链内的氨基酸残基或结合翻译后添加的化学实体。

3.权利要求2的自身辅助免疫原性分子，其中化学实体是糖类实体。

4.权利要求2的自身辅助免疫原性分子，其中脂或脂肪酸部分通过双功能交联剂，直接或间接缀合于脂肪酸侧链。

5.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中多肽来自病原生物体或或病毒。

6.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中多肽来自癌症细胞。

7.权利要求1、5或6的自身辅助免疫原性分子，其中多肽被修饰为携带含官能团的一个或多个分子，官能团选自氨基、能使脂或脂部分缀合的巯基羟基。

8.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中T-辅助表位为大约6-大约30个氨基酸长度。

9.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中CTL表位为大约6-大约30个氨基酸长度。

10.权利要求9的自身辅助免疫原性分子，其中CTL表位选自序列表SEQ ID NOs：1、2、3、4、5和6。

11.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中B细胞表位为大约4-大约30个氨基酸长度。

12.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中脂或脂肪酸部分缀合于赖氨酸、半胱氨酸或丝氨酸残基。

13.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中脂或脂肪酸部分选自棕榈酰基，肉豆蔻酰基，硬脂酰基和癸酰基。

14.权利要求13的自身辅助免疫原性分子，其中脂肪酸部分是脂氨基酸N-棕榈酰基-S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸。

15.权利要求13的自身辅助免疫原性分子，其中脂肪酸部分是S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸。

16.权利要求11的自身辅助免疫原性分子，其中脂部分是具有通式(III)的结构的化合物：

(III)

其中：

(vii)X选自硫、氧、二硫键(-S-S-)、和亚甲基(-CH₂-)、和氨基(-NH-)；

(viii)m为1或2的整数；

(ix)n为0-5的整数；

(x)R₁选自氢、羰基(-CO-)、和R′-CO-，其中R′选自含7-25个碳原子的烷基、含7-25个碳原子的烯基、和含7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代；

(xi)R₂选自R′-CO-O-、R′-O-、R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′选自含7-25个碳原子的烷基、含7-25个碳原子的烯基、和含7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代；和

(xii)R₃选自R′-CO-O-、R′-O-、R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′选自含7-25个碳原子的烷基、含7-25个碳原子的烯基、和含7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代

其中每一个R₁、R₂和R₃可以相同也可以不同。

17.权利要求16的自身辅助免疫原性分子，其中X为硫；m和n均为1；R₁选自氢和R′-CO-，其中R′为具有7-25个碳原子的烷基；R₂和R₃选自R′-CO-O-、R′-O-、R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′为具有7-25个碳原子烷基。

18.权利要求17的自身辅助免疫原性分子，其中R′选自棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基和癸醇。

19.权利要求18的自身辅助免疫原性分子，其中R′是棕榈酰基。

20.权利要求17或18或19的自身辅助免疫原性分子，其中所述脂部分的每一个整体R′可以是相同的或不同的。

21.权利要求16或17的自身辅助免疫原性分子，其中X为硫；m和n均为1；R₁是氢或R′CO-，其中R′是棕榈酰基；以及R₂和R₃均为R′-CO-O-，其中R′是棕榈酰基。

22.权利要求13的自身辅助免疫原性分子，其中脂部分也具有下列通式(IV)：

(IV)

其中：

(iii)R₄选自：(i)含有约7-约25个碳原子的α-酰基-脂肪酸残基；(ii)α-烷基-β-羟基-脂肪酸残基；(iii)α-烷基-β-羟基-脂肪酸残基的β-羟基酯，其中酯基团优选含有超过8个碳原子的直链或支链；和(iv)脂氨基酸残基；和

(iv)R₅为氢或氨基酸残基的侧链。

23.权利要求22的自身辅助免疫原性分子，其中R₄含有大约10-大约20个碳原子，更优选为大约14-大约18个碳原子。

24.权利要求22或23的自身辅助免疫原性分子，其中R₄是脂氨基酸残基，以致R₄和R₅的侧链可形成共价键。

25.权利要求1的自身辅助免疫原性分子，其中通式IV中出现的结构为脂部分，它选自：N，N′-二酰基赖氨酸；N，N′-二酰基鸟氨酸；谷氨酸的双(单烷基)酰胺或酯；门冬氨酸的双(单烷基)酰胺或酯；丝氨酸的N，O-二酰基衍生物、高丝氨酸、或苏氨酸；和半胱氨酸或高半胱氨酸的N，S-二酰基衍生物。

26.权利要求25的自身辅助免疫原性分子，其中脂部分在合成中或合成后阶段被进一步修饰，这是通过加入一个或多个间隔分子。

27.权利要求25的自身辅助免疫原性分子，其中免疫应答为抗体应答。

28.权利要求25的自身辅助免疫原性分子，其中免疫应答为CTL应答。

29.权利要求25的自身辅助免疫原性分子，其中免疫应答为抗体和CTL应答二者。

30.一种自身辅助免疫原性分子，包含天然存在的或重组的多肽，所述多肽缀合一个或多个脂或脂肪酸部分，其中自身辅助免疫原性分子引起受试者的免疫应答，而无论受试者的HLA类型如何。

31.一种产生自身辅助免疫原性分子的方法，所述方法包括选择或制备天然存在的或重组的多肽，该多肽包含这样的氨基酸序列，其包含至少一个CTL表位和一个T-辅助表位和一个B细胞表位，并将至少一个脂或脂肪酸部分缀合于多肽内的任何氨基酸残基，或结合于天然存在的或重组的多肽上的翻译后添加的化学部分，其中无论受试者HLA类型如何，自身辅助免疫原性分子都引起受试者的免疫应答。

32.权利要求31的方法，其中脂或脂肪酸部分缀合多肽主链内的氨基酸残基或结合翻译后添加的化学实体。

33.权利要求32的方法，其中化学实体是糖类实体。

34.权利要求32的方法，其中脂或脂肪酸部分缀合于氨基酸侧链。

35.权利要求31的方法，其中T-辅助表位为大约6-大约30个氨基酸长度。

36.权利要求31的方法，其中CTL表位为大约6-大约30个氨基酸长度。

37.权利要求36的方法，其中CTL表位选自序列表SEQ IDNOs：1、2、3、4、5或6。

38.权利要求31的方法，其中B细胞表位为大约4-大约30个氨基酸长度。

39.权利要求31的方法，其中脂或脂肪酸缀合于赖氨酸、半胱氨酸或丝氨酸残基。

40.权利要求31的方法，其中脂或脂肪酸部分选自棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基和癸酰基。

41.权利要求40的方法，其中脂肪酸部分是脂氨基酸N-棕榈酰基-S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸。

42.权利要求40的方法，其中脂肪酸部分是S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸。

43.权利要求41的方法，其中脂部分是具有通式(III)的结构的化合物：

(III)

其中：

(xiii)X选自硫、氧、二硫键(-S-S-)、和亚甲基(-CH₂-)、和氨基(-NH-)；

(xiv)m为1或2的整数；

(xv)n为0-5的整数；

(xvi)R₁选自氢、羰基(-CO-)、和R′-CO-，其中R′选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的烯基、和具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代；

(xvii)R₂选自R′-CO-O-、R′-O-、R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的烯基、和具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代；和

(xviii)R₃选自R′-CO-O-、R′-O-、R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′选自具有7-25个碳原子的烷基、具有7-25个碳原子的烯基、和具有7-25个碳原子的炔基，其中所述烷基、烯基或炔基基团可选择性地被羟基、氨基，氧基、酰基、或环烷基取代

其中每一个R₁、R₂和R₃可以相同也可以不同。

44.权利要求43的方法，其中X为硫；m和n均为1；R₁选自氢和R′-CO-，其中R′为具有7-25个碳原子的烷基；R₂和R₃选自R′-CO-O-、R′-O-、  R′-O-CO-、R′-NH-CO-、和R′-CO-NH-，其中R′为具有7-25个碳原子烷基。

45.权利要求44的方法，其中R′选自棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰和癸醇。

46.权利要求45的方法，其中R′是棕榈酰基。

47.权利要求43或44或45的方法，其中所述脂部分的每一个整体R′可以是相同的或不同的。

48.权利要求35的自身辅助免疫原性分子，其中X为硫；m和n均为1；R₁是氢或R′-CO-，其中R′是棕榈酰基；以及R₂和R₃均为R′-CO-O-，其中R′是棕榈酰基。

49.权利要求39的方法，其中脂部分也具有下列通式(IV)：

(IV)

其中：

(v)R₄选自：(i)含有约7-大约25个碳原子的α-酰基-脂肪酸残基；(ii)α-烷基-β-羟基-脂肪酸残基；(iii)α-烷基-β-羟基-脂肪酸残基的β-羟基酯，其中酯基团优选含有超过8个碳原子的直链或支链；和(iv)脂氨基酸残基；和

(vi)R₅为氢或氨基酸残基的侧链。

50.权利要求的49方法，其中R₄含有大约10-大约20个碳原子，更优选为大约14-大约18个碳原子。

51.权利要求49或50的方法，其中R₄是脂氨基酸残基，以致R₄和R₅的侧链可形成共价键。

52.权利要求31的方法，其中通式IV中出现的结构为脂部分，它选自：N，N′-二酰赖氨酸；N，N′-二酰基鸟氨酸；谷氨酸双(单烷基)酰胺或酯；门冬氨酸双(单烷基)酰胺或酯；丝氨酸的N，O-二酰基衍生物、高丝氨酸、或苏氨酸；和半胱氨酸或高半胱氨酸的N，S-二酰基衍生物。

53.权利要求52的方法，其中脂部分在合成中或合成后阶段被进一步修饰，这是通过加入一个或多个间隔分子。

54.权利要求52的方法，其中脂部分在合成中或合成后阶段被进一步修饰，这是通过加入一个或多个间隔分子，其中间隔分子是聚乙二醇。

55.权利要求52的方法，其中脂部分在合成中或合成后阶段被进一步修饰，这是通过加入一个或多个间隔分子，其中间隔分子是多赖氨酸。

56.权利要求52的方法，其中脂部分在合成中或合成后阶段被进一步修饰，这是通过加入一个或多个带有诸如氨基、巯基、溴乙酰基、氨基氧基的官能团的分子。

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