ES2865378T3 - Vacunas contra el cáncer de ovario - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica para su uso en un método de tratamiento y/o de prevención de un tumor de cáncer de ovario, que expresa AMHR2, a través de la inducción de una respuesta inmunitaria contra el receptor de la hormona antimulleriana de tipo II (AMHR2) en un sujeto, en donde: (a) la composición inmunogénica comprende un polipéptido AMHR2, que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos, que son al menos un 80 % idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2: en donde la secuencia de AMHR2 se establece en el SEQ ID NO: 1; (b) la composición inmunogénica provoca una respuesta inmunitaria específica para una proteína AMHR2, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1; y (c) la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra células de cáncer de ovario, que expresan AMHR2 en el sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas contra el cáncer de ovario
Antecedentes
El cáncer de ovario epitelial (EOC, por sus siglas en inglés) es la principal causa de muerte por neoplasias malignas ginecológicas en Estados Unidos. Aproximadamente el 60 % de los cánceres de ovario se diagnostican en etapas tardías y, aunque las respuestas iniciales al tratamiento de referencia actual son altas, la mayoría de las pacientes tienen reaparición de la enfermedad, lo que da como resultado una tasa de supervivencia general (SG) a cinco años ligeramente superior al 45 %.
La inducción de la inmunidad contra los tumores de ovario mediante vacunación es un enfoque prometedor, cuya eficacia potencial está respaldada por el aumento de la SG observada en pacientes cuyos tumores de ovario están infiltrados por linfocitos T. Se han intentado estrategias de vacunación terapéutica contra el cáncer de ovario utilizando homogeneizado de tumor completo o determinados antígenos asociados a tumores, tal como el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), el antígeno de cáncer de testículo 1 (CTAG1B o NY-ESO-1) y el antígeno de cáncer 25 (CA-125), pero únicamente han proporcionado resultados terapéuticos modestos (Zhang et al., Journal of Medicine 348:203-213 (2003); Kandalaft et al., Journal of Clinical Oncology 29:925-933 (2011); Bookman et al., Journal of Clinical Oncology 21:283-290 (2003); Odunsi et al., Cancer Research 63:6076-6083 (2004); y Rosen et al., Gynecologic Oncology 99:267-277 (2005).
Kersual et al. MABS vol.6 n.° 5, páginas 1314-1326 (2014) describe el tratamiento del cáncer de ovario con anticuerpos dirigidos hacia el dominio extracelular del receptor de tipo II humano de la sustancia inhibidora mulleriana.
Por lo tanto, considerando la alta tasa de reaparición del cáncer de ovario y la baja tasa de supervivencia a cinco años, existe una gran necesidad de nuevas composiciones y métodos para el tratamiento y la prevención del cáncer de ovario.
Sumario
La invención proporciona una composición inmunogénica para su uso en un método de tratamiento y/o de prevención de un tumor de cáncer de ovario que expresa AMHR2 a través de la inducción de una respuesta inmunitaria contra el receptor de la hormona antimulleriana, de tipo II (AMHR2) en un sujeto, en donde:
(a) la composición inmunogénica comprende un polipéptido AMHR2 que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son al menos un 80 % idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2; en donde la secuencia de AMHR2 se establece en el SEQ ID NO: 1;
(b) la composición inmunogénica provoca una respuesta inmunitaria específica para una proteína AMHR2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1; y
(c) la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra células de cáncer de ovario que expresan AMHR2 en el sujeto.
En una realización, la respuesta inmunitaria comprende además la inducción de una respuesta de linfocitos B contra células de cáncer de ovario que expresan AMHR2 en el sujeto. En una realización, la respuesta de linfocitos B comprende una respuesta de anticuerpos IgG específicos de AMHR2 en el sujeto.
En una realización, los al menos 100 aminoácidos consecutivos son al menos un 85 %, preferentemente al menos un 90 %, y más preferentemente al menos un 95 % idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2.
En una realización, los al menos 100 aminoácidos consecutivos son idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2, preferentemente en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de AMHR2.
En una realización, la composición inmunogénica comprende un adyuvante, preferentemente en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en Adyuvante 65, a-GalCer, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, fosfato cálcico, péptido de p-glucano, ADN CpG, GM-CSF, GPI-0100, IFA, IFN-y, IL-17, lípido A, lipopolisacárido, Lipovant, Montanide, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina, Pam3CSK4, poli-IC, quil A, dimicolato de trehalosa y zimosán.
En una realización, el adyuvante es uno que induce una respuesta inmunitaria mixta de tipo 1/tipo 17.
En una realización, el tumor de cáncer de ovario que expresa AMHR2 es un tumor de cáncer de ovario primario.
En una realización, el tumor de cáncer de ovario que expresa AMHR2 es un tumor de cáncer de ovario metastásico.
En una realización, el tumor de cáncer de ovario que expresa AMHR2 es un tumor de cáncer de ovario epitelial (EOC).
En una realización, la composición inmunogénica es para la administración al sujeto en múltiples dosis.
En una realización, el sujeto se ha sometido a una cirugía para extirpar al menos parte de un tumor de cáncer de ovario.
En una realización, el polipéptido AMHR2 comprende una o más sustituciones conservativas, pero sigue provocando una respuesta inmunitaria específica para una proteína AMHR2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 tiene tres grupos. El grupo (A) es una representación esquemática de AMHR2 de longitud completa que muestra los dominios extracelular, transmembrana y citoplasmático con una variante de AMHR2-CD etiquetada con 6xHis carboxiterminal. El grupo (B) representa un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie que muestra la expresión de AMHR2-CD en AMHR2-CD no inducido, inducido con IPTG y purificado por afinidad con Ni-NTA. El grupo (C) representa una transferencia Western anti-His de un gel SDS-PAGE que muestra la expresión de AMHR2-CD en AMHR2-CD no inducido, inducido con IPTG y purificado por afinidad con Ni-NTA. La figura 2 tiene seis grupos y muestra datos resultantes de la inmunización de ratones C57BL/6 hembra con AMHR2-CD en CFA, y se cultivaron LNC o esplenocitos in vitro para la evaluación de la proliferación y la producción de citocinas. El grupo (A) demuestra que las LNC cebadas durante 10 días mostraron notables respuestas proliferativas de recuerdo específicas de antígeno a AMHR2-CD en varios registros de concentración de antígeno. El grupo (B) muestra que una respuesta a AMHR2-CD estaba provocada por linfocitos T CD4+ pero no por linfocitos T CD8+ purificados por separación con perlas magnéticas. El grupo (C) muestra que las respuestas proliferativas a AMHR2-CD se inhibieron de manera notable en presencia de anticuerpo contra CD4, pero no en presencia de CD8 o de anticuerpos de control de isotipo. El grupo (D) muestra que cuatro semanas después de la inmunización, los esplenocitos se reactivaron con inmunógeno y el análisis ELISA de sobrenadantes de cultivo de 72 horas mostró que las respuestas de recuerdo a AMHR2-CD implicaban un fenotipo proinflamatorio con producción elevada de IFNy y producción mínima de IL-2, IL-4 e IL-5. El grupo (E)muestra que la producción de IFNy por esplenocitos se provocó a partir de linfocitos T CD4 purificados, pero no a partir de linfocitos T CD8+ purificados. El grupo (F) muestra que dos meses después de la inmunización, los niveles séricos de IgG específica de AMHR2-CD eran detectables incluso a títulos superiores a una dilución 1:50.000. Se sustituyó PBS por sueros diluidos en el control de PBS. Las barras de error muestran ± DT.
La figura 3 tiene tres grupos y muestra datos relacionados con la inflamación ovárica transitoria benigna después de la inmunización con AMHR2-CD. El grupo (A) muestra que la expresión relativa del gen de IFNy en ovario se elevó 4 semanas después de la inmunización con AMHR2-CD, pero no después de la inmunización con CFA solo. A las ocho semanas de la inmunización, la expresión relativa del gen de IFNy en ovario fue similar en ambos grupos de ratones inmunizados. El grupo (B) muestra que la expresión transitoria de bajo nivel de IFNy en los ovarios de ratones inmunizados con AMHR2-CD no se asociaba a ningún efecto detectable sobre la función ovárica, según se determinó mediante la evaluación de la fertilidad definida por la producción de crías durante cuatro ciclos de apareamiento secuenciales en ratones C57BL/6 hembra inmunizados con AMHR2-CD y en ratones de control inmunizados con CFA solo. El grupo (C) muestra que la expresión del gen AMHR2 se limitó a los ovarios y la as células tumorales de ovario ID8 y no se detectó en el útero normal, estómago, bazo, corazón, pulmón, riñón e hígado. Las barras de error muestran ± DT.
La figura 4 tiene siete grupos y muestra datos relacionados con la inhibición del crecimiento tumoral en ratones inmunizados con AMHR2-CD. Como se representa en las figuras (A), (B) y (C), respectivamente, el crecimiento de tumores ID8 se inhibió en ratones vacunados de manera profiláctica 5 días, 7 días o 1 día antes de la inoculación de células tumorales. El grupo (D) muestra que la vacunación con AMHR2-CD dio como resultado una carga tumoral global significativamente disminuida medida por el peso tumoral final al finalizar los experimentos en ratones vacunados 7 días y 1 día antes de la inoculación de ID8. El grupo (E) muestra que la vacunación terapéutica con AMHR2-CD 60 días después de la inoculación de tumores ID8 inhibió significativamente el crecimiento de tumores ID8 establecidos, palpables y en crecimiento. El grupo (F) muestra que la vacunación profiláctica de ratones transgénicos TgM1SIIR-TAg hembra a las 6-7 semanas de edad con AMHR2-CD dio como resultado una inhibición muy significativa en el crecimiento de EOC autóctono. El grupo (G) muestra que la vacunación profiláctica con AMHR2-CD de ratones transgénicos TgM1SIIR-TAg hembras a las 6-7 semanas de edad dio como resultado un aumento medio de la SG del 41,7 % muy significativo en comparación con los ratones de control vacunados con CFA solo. Los asteriscos indican significación estadística. Las barras de error muestran ± DT.
Lafigura 5 tiene tres grupos y muestra datos relacionados con el análisis de tumores. En el grupo (A), las flechas indican infiltración de linfocitos T CD3+ en un tumor ID8 de ratones vacunados con AMHR2-CD en imágenes de menor resolución (arriba) y de mayor resolución (abajo). Los infiltrados inflamatorios de linfocitos T CD3+ nunca se observaron en ratones de control vacunados con CFA solo. El grupo (B) representa un análisis por citometría de flujo de TIL seleccionados en la población de linfocitos T CD3+ que mostró un aumento pronunciado en los porcentajes de linfocitos T CD4+ pero no de linfocitos T CD8+ en infiltrados tumorales de ratones vacunados con AMHR2-CD en comparación con ratones de control inmunizados con CFA solo. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos que arrojaron resultados similares. El grupo (C) muestra que los tumores de ratones inmunizados con AMHR2-CD mostraron de manera sistemática un aumento de la expresión génica relativa para CD4, IFNy, TNFa e IL-2 pero no para CD8. Los asteriscos indican significación estadística. Las barras de error muestran ± DT.
La figura 6 tiene cinco grupos y muestra datos relacionados con la transferencia pasiva de protección inmunitaria contra el crecimiento tumoral con linfocitos T CD4+. Los ratones receptores se inocularon con células tumorales ID8 el día después de la transferencia celular. El crecimiento de tumores ID8 se inhibió en ratones transferidos con LNC específicas de AMHR2-CD (grupo (A )) y esplenocitos (grupo (B)). El grupo (C) muestra que a los 190 días después de la transferencia e inoculación de esplenocitos, los pesos tumorales medios fueron menores en los receptores de esplenocitos específicos de AMHR2-CD en comparación con los receptores de esplenocitos específicos de OVA. Los grupos (D) y (E) muestran, respectivamente, que la transferencia de linfocitos T CD4+ específicos de AMHR2-CD purificado, pero no de linfocitos B B220+ inhibió el crecimiento de tumores ID8. Los asteriscos indican significación estadística. Las barras de error muestran ± EE.
La figura 7 muestra la expresión del gen AMHR2 en tejidos humanos normales. También se examinaron otros veinticinco tejidos humanos normales y no mostraron expresión de AMHR2 por encima de los niveles de fondo. La figura 8 tiene cinco grupos y muestra la expresión del gen AMHR2 en tejidos humanos.
El grupo (A) muestra que el dominio extracelular de AMHR2 se expresa en el ovario, pero no en otros tejidos que expresan AMHR2. El grupo (B) muestra que utilizando pares de cebadores específicos para AMHR2-CD y AMHR2-e D, el análisis de qRT-PCR de tejidos humanos confirma los hallazgos del atlas de proteínas humanas al indicar que AMHR2-ED se expresa exclusivamente en el ovario humano y no en las glándulas suprarrenales o el páncreas humanos. El grupo (C) muestra que la expresión ovárica de AMHR2 humano disminuye con la edad y esta disminución es particularmente evidente con respecto a AMHR2-ED, que se expresa a niveles significativamente más bajos en el ovario posmenopáusico (edad media, 64 años) en comparación con el ovario premenopáusico (edad media, 31 años). Una disminución significativa similar en la expresión del gen AMHR2-ED se produce en los ovarios de ratones mayores (9 meses de edad). El grupo (D) muestra que la disminución con la edad en la expresión ovárica de AMHR2 contrasta con el alto nivel de expresión génica de los dominios tanto AMHR2-CD como AMHR2-ED en EOC humano. El grupo (E) muestra que esta alta expresión del gen AMHR2 en EOC humano se acompaña de niveles altos correspondientes de proteína AMHR2 detectable determinados por análisis de transferencia Western en los 16 tumores de EOC humanos examinados utilizando un anticuerpo policlonal específico para AMHR2-ED con inmunotinción de p-actina que sirve como control endógeno. En todos los casos, las barras de error indican ± DT y los asteriscos indican significación.
La figura 9 tiene dos grupos y muestra la expresión del dominio extracelular de AMHR2 en EOC humanos. El grupo (A) muestra utilizando pares de cebadores específicos para AMHR2-ED, el análisis cuantitativo de RT-PCR en tiempo real muestra la expresión de AMHR2-ED en ovarios humanos normales (n = 7) pero no en las glándulas suprarrenales humanas normales (n = 3). El grupo (B) muestra un análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal específico para el dominio extracelular de AMHR2, muestra la detección de la proteína AMHR2-ED en los cinco EOC humanos examinados. La proteína de longitud completa se detectó solamente en uno de los cinco tumores examinados, lo que sugiere que la señalización de AMHR2 puede estar alterada en muchos EOC debido a posibles eliminaciones de regiones del dominio cinasa citoplasmático. Se utilizó como control un anticuerpo específico para p-actina.
La figura 10 tiene ocho grupos. El grupo (A) es una representación esquemática de AMHR2 de ratón de longitud completa (superior) así como de la variante de AMHR2-ED truncada etiquetada con HIS de 140 aminoácidos seleccionada para la producción como inmunógeno recombinante. El grupo (B) muestra una transferencia Western anti-His de gel de SDS-PAGE que muestra la expresión de AMHR2-ED purificado por afinidad con Ni-NTA en dos dosis cargadas (izquierda) y tinción con azul de Coomasie del mismo (derecha). El grupo (C) muestra un mes después de la vacunación con AMHR2-ED de ratones C57BL/6 hembra de ocho semanas de edad; el análisis ELISPOT mostró frecuencias elevadas de linfocitos T específicos de antígeno en esplenocitos que producen IFNy e IL-17 pero no IL-5. El grupo (D) muestra IFNy y el grupo (E) muestra que la respuesta proinflamatoria de IL-17 a AMHR2-ED se debió predominantemente a los linfocitos T CD4+ que respondieron, pero también incorporó una respuesta notable de los linfocitos T CD8+. El grupo (F) muestra que la vacunación con AMHR2-ED indujo una respuesta sustancial de anticuerpos IgG en suero contra AMHR2-ED que fue detectable a diluciones de hasta 1/50.000 y el grupo (G) muestra predominantemente los isotipos IgG1 e IgG2b implicados. El grupo (H) muestra que la inmunogenicidad de AMHR2-ED no se limitó a los ratones C57BL/6 ya que las hembras que representan otros tres haplotipos H-2 divergentes mostraron altas frecuencias específicas de antígeno de linfocitos T productores de IFNy. En todos los casos, las barras de error indican ± DT.
La figura 11 tiene cinco grupos y muestra que AMHR2-ED es altamente inmunogénico.
El grupo (A) muestra que los esplenocitos de ratones inmunizados con AMHR2-ED mostraron respuestas proliferativas de recuerdo específicas de antígeno a AMHR2-ED, pero no a p-caseína recombinante de ratón, un antígeno de control que no tiene nada que ver generado y purificado de una manera similar a AMHR2-ED. El grupo (B) muestra que los esplenocitos de ratones inmunizados con CFA no respondieron ni a AMHR2-ED ni a p-caseína. El grupo (C) representa un análisis ELISA de sobrenadantes de cultivo, que muestra la producción activada por AMHR2-ED de altos niveles de citocinas proinflamatorias, IFNy e IL-17, y producción mínima de la citocina reguladora de tipo 2, IL-5. El grupo (D) muestra que los esplenocitos de ratones inmunizados con AMHR2-ED demuestran frecuencias significativamente altas de linfocitos T proinflamatorios de tipo 1 (~1/4.000 linfocitos; p < 0,0001) y de tipo 17 ~1/20.000 linfocitos; p <0,02) pero frecuencias mínimas de linfocitos T reguladores de tipo 2 que expresan IL-5. El grupo (E) muestra que cuatro meses después de la inmunización con AMHR2-EC, los títulos séricos de IgG específica de AMHR2-ED fueron significativamente detectables a títulos superiores a 1/50.000 diluciones (p <0,001).
La figura 12 tiene cinco grupos y muestra que AMHR2-ED activa de manera predominante una respuesta de linfocitos T CD4+. Los esplenocitos y los linfocitos T CD4+ pero no CD8+ purificados aislados un mes después de la inmunización de ratones transgénicos TgMlSIIR-TAg hembra con AMHR2-ED mostraron una inducción específica de antígeno importante de linfocitos T proinflamatorios de tipo 1 (grupo (A )) y de tipo 17 (grupo (B)). El análisis inmunohistoquímico de EOC autóctono tomado de ratones hembra TgMISIIR-Tag de 7 meses de edad que se inmunizaron a las 6 semanas de edad con AMHR2-ED mostró una infiltración predominante de linfocitos T Cd 3+ (grupo (C)) y linfocitos T CD4+ (grupo (D)), pero no de linfocitos T CD8+ (grupo (E)).
La figura 13 tiene tres grupos y muestra inflamación ovárica transitoria después de la inmunización con AMHR2-ED. El análisis de RT-PCR en tiempo real de los ovarios tomado cuatro semanas (grupo (A )) pero no 8 semanas (grupo (B)) después de la inmunización con AMHR2-ED mostró expresión de la citocina inflamatoria IL-1p. La expresión de IFNy no se elevó en el momento posterior a la inmunización. A las cuatro semanas (grupo (C)) después de la vacunación con AMHR2-ED de ratones C57BL/6 hembra de 9 meses de edad, el análisis de qRT-PCR no mostró una expresión génica en ovario elevada bien para IL-1p o IFNy.
La figura 14 tiene dos grupos y muestra que la fertilidad de los ratones no se vio afectada por la inmunización con AMHR2-ED. No se detectaron diferencias significativas en el número medio de crías por camada (grupo (A)) o el peso medio de las crías al nacer (grupo (B)) entre ratones inmunizados con AMHR2-ED en CFA o ratones de control inmunizados con CFA solo.
La figura 15 tiene ocho grupos y muestra que la vacuna AMHR2-ED inhibe el crecimiento de tumores ováricos autóctonos y trasplantables. El grupo (A) muestra que la vacunación profiláctica con AMHR2-ED de ratones transgénicos TgMlSIIR-TAg hembra a las 6-7 semanas de edad dio como resultado una inhibición muy significativa del crecimiento de EOC autóctono (p < 0,0001). El grupo (B) muestra que la vacunación profiláctica con AMHR2-ED de ratones transgénicos TgMlSIIR-TAg hembra a las 6-7 semanas de edad dio como resultado un aumento del 42 % en la supervivencia general en comparación con los ratones de control vacunados con CFA solo (media de 193,7 ±34,5 días frente a una media de 135 ±13,89 días ). Se produjo una inhibición significativa similar en el crecimiento de tumores EOC TgMISIIR trasplantables en ratones vacunados en el grupo de 7 días (C) o grupo de 15 días (D) antes de la inoculación con 3x106 células de carcinoma de ovario de ratón (MOVCAR, por sus siglas en inglés) (p < 0,001). El grupo (E) muestra que la vacunación profiláctica con AMHR2-ED de ratones transgénicos TgMISIIR-TAg (DR26) de 6-7 semanas de edad retrasó significativamente la aparición y el crecimiento de tumores de EOC autóctonos. El grupo (F) muestra que la inhibición del crecimiento de tumores autóctonos dio como resultado un aumento de la supervivencia global del 42 % muy significativo. El grupo (G) muestra que la vacunación con AMHR2-ED también fue eficaz para proporcionar una inmunoterapia significativa contra EOC en ratones transgénicos TgMISIIR-TAg (DR26) con tumores autóctonos establecidos. El grupo (H) muestra un análisis inmunohistoquímico de tumores de EOC autóctonos de ratones TgMISIIR-TAg (DR26) vacunados con AMHR2-ED que mostraron sistemáticamente infiltraciones importantes de linfocitos T CD3+ (grupo superior izquierdo) y linfocitos T CD4+ (grupo superior medio) con linfocitos T CD8+ ocasionales (parte superior derecha grupo) indicado por flechas. Los tumores de EOC inmunoteñidos correspondientes de ratones de control vacunados con CFA solo, no mostraron de manera sistemática infiltrados de linfocitos T detectables (grupos inferiores). En todos los casos, las barras de error indican ± DT y los asteriscos indican significación.
La figura 16 tiene dos grupos y muestra la inhibición del crecimiento de tumores de EOC después de la transferencia de linfocitos T CD4+ y linfocitos T B220+ sensibilizados con AMHR2-ED. La inhibición del crecimiento de EOC con MOVCAR se produjo después de la transferencia de linfocitos T CD4+ (grupo (A )) o linfocitos B B220+ (grupo (B)) de ratones inmunizados con AMHR2-ED. Los asteriscos indican significación.
La figura 17 tiene dos grupos y muestra una mayor supervivencia general después de la transferencia de linfocitos T CD4+ y linfocitos B B220+ sensibilizados con AMHR2-ED. Aumento de la supervivencia general en ratones portadores de tumores MOVCAR que recibieron linfocitos T CD4+, grupo (A), o linfocitos B B220+, grupo B (B) de ratones inmunizados con AMHR2-ED.
La figura 18 muestra inhibición del crecimiento tumoral y potenciación de la supervivencia general después de la transferencia de linfocitos T CD4+ sensibilizados con AMHR2-ED y sueros. La inhibición del crecimiento de los tumores de EOC ID8-VEGF se produjo en ratones que recibieron linfocitos T CD4+ (grupo superior izquierdo) o sueros (grupo inferior izquierdo) de ratones inmunizados con AMHR2-ED. Se produjo una mayor supervivencia general en ratones que recibieron linfocitos T CD4+ (grupo superior derecho) o sueros (grupo inferior derecho) de ratones inmunizados con AMHR2-ED.
La figura 19 es la secuencia de aminoácidos de la variante de proteína AMHR2-CD humana más larga (SEQ ID NO: 1). El dominio extracelular (AMHR2-ED, por sus siglas en inglés) se indica en negrita y el dominio citoplasmático (AMHR2-CD, por sus siglas en inglés) se indica en cursiva.
La figura 20 tiene seis grupos y muestra la transferencia pasiva de inmunidad tumoral con linfocitos T CD4+, linfocitos B B220+ e IgG purificada. El grupo (A) muestra que la transferencia de linfocitos T CD4+ sensibilizados con AMHR2-ED a ratones TgMISIIR-TAg hembra (bajo) un día antes de la inoculación de MOVCAR dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y el grupo (B) muestra una supervivencia global mejorada en comparación con los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ sensibilizados con ovoalbúmina. El grupo (C) muestra que la transferencia de linfocitos B B220+ sensibilizados con AMHR2-ED a ratones hembra TgMISIIR-TAg (bajo) un día antes de la inoculación de MOVCAR dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y el grupo (D) muestra una supervivencia general potenciada en comparación con los ratones que recibieron linfocitos B B220+ de ratones inmunizados con ovoalbúmina. El grupo (E) muestra la transferencia de IgG purificada por afinidad de ratones inmunizados con AMHR2-ED a ratones TgMISIIR-TAg hembra (bajo) un día antes de la inoculación de MOVCAR que dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y el grupo (F) muestra una supervivencia global potenciada en comparación con los ratones que recibieron IgG purificada por afinidad de ratones inmunizados con ovoalbúmina. En todos los casos, las barras de error indican ± DT y los asteriscos indican significación.
Descripción detallada
General
En el presente documento se proporcionan métodos, kits y composiciones para el tratamiento y/o prevención del cáncer de ovario mediante la inducción de una respuesta inmunitaria contra al receptor de la hormona antimulleriana, de tipo II (AMHR2).
AMHR2 es un receptor serina/treonina cinasa homólogo a los receptores de tipo II de la familia del factor de crecimiento transformante beta (TGFp). El gen AMHR2 humano contiene 11 exones con siete variantes conocidas con corte y empalme de manera alternativa que producen tres proteínas codificadas conocidas, una variante adicional con características de codificación de proteínas y tres transcritos no codificantes sin marcos de lectura abiertos. En mujeres adultas, el transcrito codificante de proteína humana más largo para una proteína de 573 aminoácidos de longitud (SEQ ID NO: 1; figura 19) normalmente se expresa solamente en el ovario y comprende un dominio extracelular de 127 aminoácidos (AMHR2-ED), un dominio transmembrana de 26 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 403 aminoácidos (AMHR2-CD). La señalización de AMHR2 provoca la regresión de los conductos de Müller durante el desarrollo masculino y regula el desarrollo de ovocitos y la producción de folículos en hembras adultas, proporcionando, de este modo, un control sustancial de la reserva ovárica y la fertilidad. AMHR2 se expresa en la gran mayoría de EOC humanos, incluyendo el 90 % de los EOC primarios, 78 % de las neoplasias malignas limítrofes, 77­ 86 % de los tumores de ovario no EOC y 56 % de la ascitis maligna de cánceres de ovario de grado III-IV. En tejidos normales, la expresión de AMHR2-CD se limita de manera predominante a los ovarios. Si bien parte de la expresión de AMHR2-CD también se produce en una pequeña cantidad de tejidos humanos adicionales, AMHR2-ED se expresa exclusivamente en el ovario. Es más, la expresión ovárica de AMHR2-CD y AMHR2-ED se reduce en ovarios postmenopáusicos.
Como se describe en el presente documento, la vacunación con polipéptidos AMHR2 y/o la transferencia adoptiva de linfocitos sensibilizados con AMHR2 proporciona una inmunoterapia eficaz contra el cáncer de ovario sin producir complicaciones autoinmunitarias extensas. La inmunización de un modelo en ratones para cáncer de ovario con polipéptidos AMHR2 de ratón recombinantes que contienen bien una secuencia de 399 aminoácidos del dominio citoplásmico (AMHR2-CD) o una secuencia de 140 aminoácidos del dominio extracelular (AMHR2-ED) dio como resultado una importante respuesta de linfocitos T proinflamatorios acompañada de títulos de anticuerpos IgG extremadamente altos. La vacunación con polipéptidos AMHR2-CD y AMHR2-ED proporcionó profilaxis y terapia mediadas por linfocitos T significativas contra el cáncer de ovario y medió una profilaxis significativa contra el desarrollo de tumores de cáncer de ovario autóctonos en los modelos de cáncer de ovario en ratones. Por otra parte, la protección contra el crecimiento tumoral estuvo acompañada de síntomas autoinmunitarios mínimos, sin efectos detectables sobre la fertilidad en el transcurso de varios ciclos de apareamiento posteriores. Estos datos indican que la vacunación dirigida contra AMHR2-CD y/o AMHR2-ED proporciona una terapia segura y eficaz contra el cáncer de ovario.
La divulgación técnica detallada que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la invención per se tal como se define en las reivindicaciones. Se apreciará que la divulgación técnica adicional proporcionada no es parte de la invención que está definida exclusivamente por las reivindicaciones, sino más bien se sitúa en un contexto técnico más amplio.
En el presente documento se proporciona un método para tratar un tumor de cáncer de ovario. (p.ej, un cáncer de ovario primario o metastásico, tal como un tumor de cáncer de ovario epitelial) en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano femenino) que comprende administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende un polipéptido (es decir, un "polipéptido AMHR2") que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína AMHR2 (p. ej., al menos una porción del SEQ ID NO: 1), un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2, una célula presentadora de antígenos que presenta un epítopo de AMHR2 y/o un linfocito sensibilizado con AMHR2 (por ejemplo, un linfocito T y/o un linfocito B). En un ejemplo, el tumor de cáncer de ovario puede expresar AMHR2. En un ejemplo, la administración de la composición inmunogénica puede inducir una respuesta inmunitaria contra el tumor de cáncer de ovario en el sujeto (p. ej., una respuesta inmunitaria de linfocitos T, tal como una respuesta inmunitaria de tipo 1 y/o tipo 17 y/o una respuesta inmunitaria de linfocitos B, tal como una respuesta de IgG). En un ejemplo, al sujeto se le pueden administrar múltiples dosis de la composición inmunogénica (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5 o 6 dosis). En un ejemplo, el sujeto puede haberse sometido a una cirugía para extirpar al menos parte del tumor de cáncer de ovario. En un ejemplo, el método puede comprender además la etapa de extirpar quirúrgicamente al menos parte del tumor de cáncer de ovario.
En el presente documento se proporciona un método para prevenir el cáncer de ovario y/o prevenir la reaparición del cáncer de ovario en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano femenino) que comprende administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende un polipéptido (es decir, un "polipéptido AMHR2") que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína AMHR2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2, una célula presentadora de antígenos que presenta un epítopo de AMHR2 y/o un linfocito sensibilizado con AMHR2 (por ejemplo, un linfocito T y/o un linfocito B). En un ejemplo, la administración de la composición inmunogénica puede inducir una respuesta inmunitaria contra el AMHR2 en el sujeto (p. ej., una respuesta inmunitaria de linfocitos T, tal como una respuesta inmunitaria de tipo 1 y/o tipo 17 y/o una respuesta inmunitaria de linfocitos B, tal como una respuesta de IgG). En un ejemplo, al sujeto se le pueden administrar múltiples dosis de la composición inmunogénica (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5 o 6 dosis). En un ejemplo, el sujeto puede haberse sometido a una cirugía para extirpar al menos parte de un tumor de cáncer de ovario, p. ej., un tumor de cáncer de ovario que expresa AMHR2, tal como un tumor de cáncer de ovario primario o metastásico). En un ejemplo, el tumor puede ser un tumor de cáncer de ovario epitelial. En un ejemplo, el método puede comprender además la etapa de extirpar quirúrgicamente al menos parte del tumor de cáncer de ovario.
En los métodos proporcionados en el presente documento, la composición inmunogénica puede comprender un adyuvante. Por ejemplo, el adyuvante puede ser adyuvante 65, a-GalCer, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, fosfato cálcico, péptido de p-glucano, ADN CpG, GM-CSF, GPI-0100, IF A, IFN-y, IL-17, lípido A, lipopolisacárido, Lipovant, Montanide, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina, Pam3CSK4, poli-IC, quil A, dimicolato de trehalosa o zimosán. En un ejemplo, el adyuvante puede ser uno que induzca una respuesta inmunitaria mixta de tipo 1/tipo 17.
En los métodos proporcionados en el presente documento, el método puede comprender además la etapa de determinar si un tumor de cáncer de ovario en el sujeto y/o del sujeto expresa AMHR2. En un ejemplo, los métodos pueden incluir la etapa de analizar una muestra de tumor obtenida del sujeto para determinar la expresión de AMHR2. En un ejemplo, la expresión de AMHR2 se puede determinar detectando la presencia de la proteína AMHR2 en la muestra de tumor (por ejemplo, mediante FACS, microscopia de fluorescencia, transferencia Western, etc.). En un ejemplo, la proteína AMHR2 puede detectarse poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo marcado de forma detectable (por ejemplo, un anticuerpo marcado directa o indirectamente con un residuo fluorescente). En un ejemplo, la expresión de AMHR2 puede determinarse detectando la presencia de ARNm de AMHR2 (p. ej., mediante RT-PCr , transferencia northern, etc.). En un ejemplo, el ARNm de AMHR2 puede detectarse poniendo en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico marcada de forma detectable (por ejemplo, una sonda marcada directa o indirectamente con un residuo fluorescente). En un ejemplo, el método puede comprender obtener la muestra del sujeto (por ejemplo, mediante biopsia tumoral).
En los métodos proporcionados en el presente documento, el método puede comprender además la etapa de determinar si la administración de la composición inmunogénica induce una respuesta inmunitaria contra el tumor de cáncer de ovario y/o AMHR2 en el sujeto. En un ejemplo, la respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria de linfocitos T (por ejemplo, una respuesta inmunitaria mixta de tipo 1/tipo 17). En un ejemplo, la respuesta inmunitaria puede detectarse detectando la presencia de citocinas (por ejemplo, IFN-y y/o IL-17) en una muestra de un paciente (por ejemplo, una muestra de suero de un paciente). En un ejemplo, las citocinas pueden detectarse poniendo en contacto la muestra, directa o indirectamente, con, anticuerpos marcados de forma detectable específicos para las citocinas que se van a detectar. En un ejemplo, las citocinas pueden detectarse realizando un ensayo ELISA. En un ejemplo, la respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria de linfocitos B. En un ejemplo, la respuesta inmunitaria de linfocitos B puede detectarse detectando la presencia de anticuerpos anti-AMHR2, p. ej., anticuerpos IgG anti-AMHR2) en una muestra de un paciente (por ejemplo, una muestra de suero).
Los métodos proporcionados en el presente documento pueden comprender además la etapa de administrar un agente adicional al sujeto. En un ejemplo, el agente adicional puede ser un agente anticanceroso. Por ejemplo, el agente anticanceroso puede ser paclitaxel, cisplatino, topotecán, gemcitabina, bleomicina, etopósido, carboplatino, docetaxel, doxorrubicina, topotecán, ciclofosfamida, trabectedina, olaparib, tamoxifeno, letrozol o bevacizumab. En un ejemplo, el agente anticanceroso puede ser un inhibidor de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de CTLA4, tal como un anticuerpo anti-CTLA4 (p. ej., ipilimumab (BMS), tremelimumab (AstraZeneca) y/o KAHR-102 (Kahr Medical)). Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., nivolumab (BMS), pembrolizumab/lambrolizumab (Merck), pidilizumab (Curetech), AMP-224 (GSK), AMP-514 (AstraZeneca), STI-A1110 (Sorrento) y/o TSR-042 (Tesaro). Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de PD-L1 y/o PD-L2, tal como un anticuerpo anti-PD-L1 y/o anti-PD-L2 (p. ej., RG-7446 (Roche), BMS-936559 (BMS), MEDI-4736 (AstraZeneca), MSB-0020718C (Merck), AUR-012 (Pierre Fabre Med), STI-A1010 (Sorrento)).
En los métodos proporcionados en el presente documento, el sujeto humano femenino puede estar predispuesto al cáncer de ovario. En un ejemplo, el genoma del sujeto puede comprender una mutación BRCA1 o BRCA2 que predispone al sujeto al cáncer de ovario. En un ejemplo, el sujeto puede tener antecedentes familiares de cáncer de ovario. En un ejemplo, el sujeto puede ser una mujer humana postmenopáusica.
En el presente documento se proporciona un kit y/o una composición (por ejemplo, una composición inmunogénica) para prevenir y/o tratar el cáncer de ovario en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano femenino), comprendiendo el kit o composición un polipéptido (es decir, un "polipéptido AMHR2") que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína AMHR2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2, una célula presentadora de antígenos que presenta un epítopo de AMHR2 y/o un linfocito sensibilizado con AMHR2 (por ejemplo, un linfocito T y/o un linfocito B). En un ejemplo, el kit puede comprender múltiples dosis del polipéptido, ácido nucleico, célula presentadora de antígenos y/o linfocito. En un ejemplo, el kit puede comprender además instrucciones de uso.
En un ejemplo, los kits y composiciones proporcionados en el presente documento pueden comprender además un adyuvante. Por ejemplo, el adyuvante puede ser adyuvante 65, a-GalCer, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, fosfato cálcico, péptido de p-glucano, ADN CpG, GM-CSF, GPI-0100, IF A, IFN-y, IL-17, lípido A, lipopolisacárido, Lipovant, Montanide, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina, Pam3CSK4, quil A, dimicolato de trehalosa o zimosán. En un ejemplo, el adyuvante puede ser uno que induzca una respuesta inmunitaria mixta de tipo 1/tipo 17.
En un ejemplo, en los kits o composiciones proporcionados en el presente documento, el kit o composición puede comprender además un agente adicional (por ejemplo, un agente anticanceroso). Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel, cisplatino, topotecán, gemcitabina, bleomicina, etopósido, carboplatino, docetaxel, doxorrubicina, topotecán, ciclofosfamida, trabectedina, olaparib, tamoxifeno, letrozol y bevacizumab.
En un ejemplo, el agente anticanceroso puede ser un inhibidor de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de CTLA4, tal como un anticuerpo anti-CTLA4 (p. ej., ipilimumab (BMS), tremelimumab (AstraZeneca) y/o KAHR-102 (Kahr Medical)). Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., nivolumab (BMS), pembrolizumab/lambrolizumab (Merck), pidilizumab (Curetech), AMP-224 (GSK), AMP-514 (AstraZeneca), STI-A1110 (Sorrento) y/o TSR-042 (Tesaro). Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de PD-L1 y/o PD-L2, tal como un anticuerpo anti-PD-LI y/o anti-PD-L2 (p. ej., RG-7446 (Roche), BMS-936559 (BMS), MEDI-4736 (AstraZeneca), MSB-0020718C (Merck), AUR-012 (Pierre Fabre Med), STI-A1010 (Sorrento)).
Definiciones
Por conveniencia, algunos términos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se recogen aquí.
En el presente documento, los artículos "un" y "uno(a)" se utilizan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Como se usa en el presente documento, el término "administrar" significa proporcionar un agente o composición farmacéutica a un sujeto, e incluye, pero sin limitación, administrado por un profesional médico y administrado por él mismo.
La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere en el presente documento a cualquier respuesta a un antígeno o determinante antigénico por parte del sistema inmunitario. Las respuestas inmunitarias ilustrativas incluyen respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, producción de anticuerpos específicos de antígeno (neutralizantes o de otro tipo)) y respuestas inmunitarias mediadas por células (por ejemplo, proliferación de linfocitos). Las respuestas inmunitarias inflamatorias de tipo 1 se caracterizan por la producción de citocinas de tipo 1, tal como IFNy. Las respuestas inmunitarias inflamatorias de tipo 2 se caracterizan por la expresión de citocinas de tipo 2, tal como IL-4 o IL-5. Las respuestas inmunitarias inflamatorias de tipo 17 se caracterizan por la expresión de citocinas de tipo 17, y en particular de IL-17. En algunos ejemplos, se puede generar una respuesta inmunitaria mixta. Por ejemplo, en algunos casos se genera una respuesta inmunitaria inflamatoria mixta de tipo 1/tipo 17 que se caracteriza por la expresión tanto de IFNy como de lL-17.
Como se usa en el presente documento, "porcentaje de identidad" entre secuencias de aminoácidos es sinónimo de "porcentaje de homología", que se puede determinar utilizando el algoritmo de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268, 1990), modificado por Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877, 1993). El algoritmo indicado está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul. et al. J. Mol. Biol. 215, 403­ 410, 1990). Se realizan búsquedas de nucleótidos por BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra=12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un polinucleótido descrito en el presente documento. Las búsquedas de proteínas por BLAST se realizan con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra=3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a un polipéptido de referencia. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros por defecto de los programas correspondientes (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
La expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga, diluyente, excipiente o material de encapsulación de disolventes líquidos o sólidos, implicado en portar o transportar el compuesto objeto de un órgano o parte del organismo, a otro órgano o parte del organismo.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" como se usa en el presente documento significa la cantidad de un agente que es eficaz para producir el efecto terapéutico deseado en al menos una subpoblación de células en un sujeto con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico.
"Tratar" una enfermedad en un sujeto o "tratar" un sujeto que tiene una enfermedad se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmacéutico, p. ej., la administración de un fármaco, de manera que al menos se reduce o evita que empeore un síntoma de la enfermedad.
Receptor de la hormona anti-Mulleriana II (AMHR2)
En el presente documento se proporcionan métodos, kits y composiciones para el tratamiento y/o prevención del cáncer de ovario mediante la inducción de una respuesta inmunitaria contra al receptor de la hormona antimulleriana, de tipo II (AMHR2) mediante la administración de un polipéptido AMHR2 (por ejemplo, un polipéptido que contiene AMHR2-ED o un fragmento inmunogénico del mismo, o AMHR2-CD o un fragmento inmunogénico del mismo) o un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2.
El gen AMHR2 humano contiene 11 exones con siete variantes conocidas con corte y empalme de manera alternativa que producen tres proteínas codificadas conocidas, una variante adicional con características de codificación de proteínas y tres transcritos no codificantes sin marcos de lectura abiertos. En mujeres adultas, el transcrito codificante de proteína humana más largo para una proteína de 573 aminoácidos de longitud normalmente se expresa solamente en el ovario y comprende un dominio extracelular de 127 aminoácidos, un dominio transmembrana de 26 aminoácidos y un dominio citoplásmico de 403 aminoácidos (figura 19). La señalización de AMHR2 provoca la regresión de los conductos de Müller durante el desarrollo masculino y regula el desarrollo de ovocitos y la producción de folículos en hembras adultas, proporcionando, de este modo, un control sustancial de la reserva ovárica y la fertilidad. Las secuencias de ARNm de las tres isoformas de AMHR2 que codifican proteínas se proporcionan en los números de referencia de NCBI NM_020547.2, NM_001164690.1 y NM_001164690.1, que codifican proteínas que tienen secuencias de aminoácidos proporcionadas en los números de referencia de NCBi NP_065434.1, NP_001158162.1 y NP_001158163.1, respectivamente. En el presente documento se proporcionan polipéptidos AMHR2 y/o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos AMHR2. Los polipéptidos AMHR2 son polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de una proteína AMHR2, el AMHR2-ED, el AMHR2-CD y/o una porción de la secuencia de aminoácidos de AMHR2 de longitud suficiente para provocar una respuesta inmunitaria específica de AMHR2. En un ejemplo, el polipéptido AMHR2 también puede incluir aminoácidos que no corresponden a la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de AMHR2 y una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína o polipéptido no de AMHR2). En un ejemplo, el polipéptido AMHR2 puede incluir solamente la secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína AMHR2 o un fragmento de la misma.
Por ejemplo, en los métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento, el polipéptido AMHR2 puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de la proteína AMHR2. En un ejemplo, los aminoácidos consecutivos pueden ser idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio citoplásmico de AMHR2. En un ejemplo, los aminoácidos consecutivos pueden ser idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2
Por ejemplo, en los métodos proporcionados en el presente documento, el polipéptido AMHR2 puede tener una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de la proteína AMHR2. En un ejemplo, los aminoácidos consecutivos pueden ser idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio citoplásmico de AMHR2. En un ejemplo, los aminoácidos consecutivos pueden ser idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2
Por ejemplo, en los métodos proporcionados en el presente documento, el polipéptido AMHR2 puede tener una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de la proteína AMHR2. En un ejemplo, los aminoácidos consecutivos pueden ser idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio citoplásmico de AMHR2. En un ejemplo, los aminoácidos consecutivos pueden ser idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2
Por ejemplo, en los métodos proporcionados en el presente documento, el polipéptido AMHR2 puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 aminoácidos consecutivos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 77 %, 98 % o 99 % idénticos a una secuencia de aminoácidos en una proteína AMHR2. En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede estar en el dominio citoplasmático de una proteína AMHR2. En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede estar en el dominio extracelular de una proteína AMHR2.
Por ejemplo, en los métodos proporcionados en el presente documento, el polipéptido AMHR2 puede tener una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 aminoácidos consecutivos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 77 %, 98 % o 99 % idénticos a una secuencia de aminoácidos en una proteína AMHR2. En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede estar en el dominio citoplasmático de una proteína AMHR2. En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede estar en el dominio extracelular de una proteína AMHR2.
Por ejemplo, en los métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento, el polipéptido AMHR2 puede tener una secuencia de aminoácidos que consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 aminoácidos consecutivos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 77 %, 98 % o 99 % idénticos a una secuencia de aminoácidos en una proteína AMHR2. En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede estar en el dominio citoplasmático de una proteína AMHR2. En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede estar en el dominio extracelular de una proteína AMHR2.
En un ejemplo, en los métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento, el polipéptido AMHR2 puede no comprender una secuencia de aminoácidos idéntica al dominio extracelular de AMHR2. Por ejemplo, el polipéptido AMHR2 puede no comprender una secuencia de aminoácidos idéntica al dominio transmembrana de AMHR2. Por ejemplo, el polipéptido AMHR2 puede no comprender una secuencia de aminoácidos idéntica al dominio citoplasmático de AMHR2
Como es bien conocido por los expertos en la materia, los polipéptidos que tienen similitudes de secuencia sustanciales pueden causar una reacción inmunitaria idéntica o muy similar en un animal hospedador. En consecuencia, un derivado, equivalente, variante, fragmento o mutante de la proteína AMHR2 o fragmento de la misma también puede ser adecuado para los métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento.
En el presente documento se proporcionan variaciones o derivados de los polipéptidos AMHR2. El polipéptido alterado puede tener una secuencia de aminoácidos alterada, por ejemplo, por sustitución conservativa, sin embargo, todavía provocar respuestas inmunitarias que reaccionan con el antígeno proteico inalterado y se consideran equivalentes funcionales. Como se usa en el presente documento, la expresión "sustitución conservativa" indica la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto biológicamente similar. Es bien conocido en la técnica que los aminoácidos dentro del mismo grupo conservativo normalmente pueden sustituirse entre sí sin afectar sustancialmente la función de una proteína. Por ejemplo, el derivado, equivalentes, variantes o mutantes del dominio de unión a ligando de un polipéptido AMHR2 pueden ser polipéptidos que son al menos un 85 % homólogos a una secuencia de la proteína AMHR2 o un fragmento de la misma. Por ejemplo, la homología puede ser al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 %.
Se proporciona en el presente documento un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2 descrito en el presente documento, tal como una molécula de ADN que codifica un polipéptido AMHR2. En un ejemplo, la composición puede comprender un vector de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido AMHR2. En un ejemplo, el ácido nucleico de AMHR2 puede incluir elementos reguladores necesarios para la expresión del marco de lectura abierto. Dichos elementos pueden incluir, por ejemplo, un promotor, un codón de inicio, un codón de parada y una señal de poliadenilación. Además, se pueden incluir potenciadores. Estos elementos pueden unirse operativamente a una secuencia que codifica el polipéptido AMHR2.
Ejemplos de promotores incluyen, pero sin limitación, promotores de Virus de simio 40 (SV40, por sus siglas en inglés), promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV, por sus siglas en inglés), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), tal como el promotor de repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés) del VIH, virus de Moloney, citomegalovirus (CMV) tal como el promotor temprano inmediato de CMV, virus Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés), virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés) así como promotores de genes humanos tal como la actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y metalotioneína humana. Ejemplos de señales de poliadenilación adecuadas incluyen, pero sin limitación, señales de poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación de LTR.
Además de los elementos reguladores necesarios para la expresión, también se pueden incluir otros elementos en la molécula de ácido nucleico. Dichos elementos adicionales incluyen potenciadores. Los potenciadores incluyen los promotores descritos en el presente documento anteriormente. Los potenciadores/promotores preferidos incluyen, por ejemplo, actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y potenciadores víricos tal como los del CMV, RSV y EBV.
En un ejemplo, el ácido nucleico puede incorporarse operativamente en un vector portador o de suministro. Los vectores de suministro útiles incluyen, pero sin limitación, microcápsulas biodegradables, complejos inmunoestimulantes (ISCOM, por sus siglas en inglés) o liposomas, y transportadores vivos atenuados modificados genéticamente, tales como virus o bacterias.
En un ejemplo, el vector puede ser un vector vírico, tal como lentivirus, retrovirus, virus del herpes, adenovirus, virus adenoasociados, virus vaccinia, baculovirus, viruela aviar, viruela Av, vaccinia Ankara modificada (MVA, por sus siglas en inglés) y otros virus recombinantes. Por ejemplo, se puede usar un vector del virus vaccinia para infectar células dendríticas.
Composiciones farmacéuticas
En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas (por ejemplo, una composición de vacuna) que comprenden un polipéptido AMHR2 descrito en el presente documento y/o un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2 descrito en el presente documento. En un ejemplo, la composición puede comprender un transportador farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, la composición puede incluir una combinación de múltiples p. ej., dos o más) polipéptidos o ácidos nucleicos de AMHR2 descritos en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden formularse especialmente para administración en forma sólida o líquida, incluyendo aquellas adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, empapadores (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, p. ej., aquellos dirigidos a absorción bucal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; o (2) administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural en forma de, por ejemplo, una solución o suspensión estéril o una formulación de liberación sostenida.
Los métodos para preparar estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de asociar un polipéptido AMHR2 y/o ácido nucleico descrito en el presente documento con el transportador y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima un agente descrito en el presente documento con transportadores líquidos o transportadores sólidos finamente divididos o ambos y a continuación, si es necesario, dando forma al producto.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral comprenden polipéptidos y/o ácidos nucleicos de AMHR2 descritos en el presente documento en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables o polvos estériles que se pueden reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener azúcares, alcoholes, antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspensión o espesantes.
Ejemplos de transportadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas incluyen el agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, los agentes proporcionados en el presente documento, que pueden usarse en forma hidratada adecuada y/o las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento, se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
En un ejemplo, la composición farmacéutica descrita, cuando se administra a un sujeto, puede provocar una respuesta inmunitaria contra una célula que expresa AMHR2. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser útiles como composiciones de vacuna para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del cáncer de ovario.
En un ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender además un adyuvante fisiológicamente aceptable. En un ejemplo, el adyuvante empleado proporciona una mayor inmunogenicidad de la composición farmacéutica. El adyuvante puede ser uno que proporcione una liberación lenta de antígeno (p. ej., el adyuvante puede ser un liposoma), o puede ser un adyuvante que sea inmunogénico por sí mismo funcionando, de este modo, sinérgicamente con los antígenos (p. ej., antígenos presentes en el polipéptido AMHR2). Por ejemplo, el adyuvante puede ser un adyuvante conocido u otra sustancia que promueva la captación de antígenos, reclute células del sistema inmunitario en el sitio de administración o facilite la activación inmunitaria de las células linfoides que responden. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitación, moléculas inmunomoduladoras (p. ej., citocinas), emulsiones de aceite y agua, hidróxido de aluminio, glucano, sulfato de dextrano, óxido de hierro, alginato de sodio, bacto-adyuvante, polímeros sintéticos tales como poliaminoácidos y copolímeros de aminoácidos, saponina, aceite de parafina y dipéptido de muramilo. Por ejemplo, el adyuvante puede ser adyuvante 65, a-GalCer, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, fosfato cálcico, péptido de p-glucano, ADN CpG, GM-CSF, GPI-0100, IFA, IFN-y, IL-17, lípido A, lipopolisacárido, Lipovant, Montanide, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina, Pam3CSK4, quil A, dimicolato de trehalosa o zimosán. Por ejemplo, el adyuvante puede ser uno que induzca una respuesta inmunitaria mixta de tipo 1/tipo 17.
Por ejemplo, el adyuvante puede ser una molécula inmunomoduladora. Por ejemplo, la molécula inmunomoduladora puede ser una proteína citocina, quimiocina, agente inmunoestimulador recombinantes o ácido nucleico que codifica citocinas, quimiocinas o agentes inmunoestimuladores diseñados para potenciar la respuesta inmunitaria.
Ejemplos de citocinas inmunomoduladoras incluyen interferones (p. ej., IFNa, IFNp e IFNy), interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17 e IL-20), factores de necrosis tumoral (p. ej., TNFa y TNPp), eritropoyetina (EPO), ligando de FLT-3, gIp10, TCA-3, MCP-1, MIF, MIP-1 alfa, MIP-ip, Rantes, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos(G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), así como fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores.
En un ejemplo, una quimiocina inmunomoduladora que se une a un receptor de quimiocinas, es decir, un receptor de quimiocina CXC, CC, C o CX3C, también se puede incluir en las composiciones proporcionadas en el presente documento. Ejemplos de quimiocinas incluyen, pero sin limitación, Mipla, Mip-1p, Mip-3a (Larc), Mip-3p, Rantes, Hcc-1, Mpif-1, Mpif-2, Mcp-1, Mcp-2, Mcp-3, Mcp-4, Mcp-5, Eotaxina, Tarc, Elc, l309, IL-8, Gcp-2 Gro-a, Gro-p, Gro-Y, Nap-2, Ena-78, Gcp-2, Ip-10, Mig, I-Tac, Sdf-1 y Bca-1 (Blc), así como fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores.
En un ejemplo, las composiciones proporcionadas en el presente documento también pueden comprender uno o más agentes diferentes tales como, pero sin limitación, agentes quimioterapéuticos, inmunoterapéuticos, inmunomoduladores y/o antiangiogénicos.
Por ejemplo, el uno o más de agentes diferentes pueden ser un agente quimioterapéutico, de origen natural o sintético, por ejemplo, como se describe en "Cancer Chemotherapeutic Agents", American Chemical Society, 1995, W. O. Foye Ed.
Por ejemplo, el agente quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en antagonistas de receptores de molécula pequeña tal como vatalanib, SU 11248 o AZD-6474, antagonistas de EGFR o HER2 tal como gefitinib, erlotinib, CI-1033 o herceptin, anticuerpos tales como bevacizumab, cetuximab, rituximab, fármacos alquilantes de ADN tal como cisplatino, oxaliplatino o carboplatino, antraciclinas tal como doxorrubicina o epirrubicina, un antimetabolito tal como 5-FU, pemetrexed, gemcitabina o capecitabina, una camptotecina tal como irinotecán o topotecán, un fármaco contra el cáncer tal como paclitaxel o docetaxel, una epipodofilotoxina tal como etopósido o tenipósido, un inhibidor del proteasoma tal como bortezomib o fármacos antiinflamatorios tal como celecoxib o rofecoxib, opcionalmente en forma de sales farmacéuticamente aceptables, en forma de hidratos y/o solvatos y opcionalmente en forma de isómeros ópticos individuales, mezclas de enantiómeros individuales o racematos de los mismos.
Por ejemplo, el agente quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en un antagonista de receptores de VEGF de molécula pequeña, tal como vatalanib (PTK-787/ZK222584), SU-5416, SU-6668, SU-11248, SU-14813, AZD-6474, AZD-2171, CP-547632, CEP-7055, AG-013736, IM-842 o GW-786034, un antagonista dual de EGFR/HER2 tal como gefitinib, erlotinib, CI-1033 o GW-2016, un antagonista de EGFR tal como iressa (ZD-1839), tarceva (OSI-774), PKI-166, EKB-569, HKI-272 o herceptin, un antagonista de la proteína cinasa activada por mitógenos tal como BAY-43-9006 o BAY-57-9006, un derivado de quinazolina tal como 4-[(3-cloro-4-fluorofenilamino]-6-{[4-(N,N-dimetilamino)-1-oxo-2-buten-1-il] amino}-7-((S)-tetrahidrofuran-3-iloxi)quinazolina o 4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-6-{[4 (homomorfolin-4-il)-1-oxo-2-buten-1-il] amino}-7-[(S)-(tetrahidrofuran-3-il)oxi] -quinazolina, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, un antagonista de receptores proteína cinasa que no se clasifica dentro de las moléculas pequeñas sintéticas tal como atrasentan, rituximab, cetuximab, Avastin.TM. (bevacizumab), IMC-1C11, erbitux (C-225), DC-101, EMD-72000, vitaxina, imatinib, un inhibidor de proteínas tirosina cinasa que es una proteína de fusión tal como VEGFtrap, un agente alquilante o un compuesto de platino tal como melfalán, ciclofosfamida, oxazafosforina, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino, tetraplatino, iproplatino, mitomicina, estreptozocina, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), busulfán, ifosfamida, estreptozocina, tiotepa, clorambucilo, una mostaza nitrogenada tal como mecloretamina, un compuesto de etilenimina, un alquilsulfonato, daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), doxorrubicina liposómica (doxil), epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, amsacrina, dactinomicina, distamicina o un derivado de la misma, netropsina, pibenzimol, mitomicina, CC-1065, una duocarmicina, mitramicina, cromomicina, olivomicina, una ftalanilida tal como propamidina o estilbamidina, una antramicina, una aziridina, una nitrosourea o un derivado de la misma, un análogo o antagonista de pirimidina o purina o un inhibidor de la nucleósido difosfato reductasa tal como citarabina, 5-fluorouracilo (5-FU), pemetrexed, tegafur/uracilo, mostaza de uracilo, fludarabina, gemcitabina, capecitabina, mercaptopurina, cladribina, tioguanina, metotrexato, pentostatina, hidroxiurea o ácido fólico, una fleomicina, una bleomicina o un derivado o sal de la misma, CHPP, BZPP, MTPP, BAPP, liblomicina, una acridina o un derivado de la misma, una rifamicina, una actinomicina, adramicina, una camptotecina tal como irinotecán (camptosar) o topotecán, una amsacrina o un análogo de la misma, una carboxamida tricíclica, un inhibidor de histona desacetilasa tal como SAHA, MD-275, tricostatina A, CBHA, LAQ824, o ácido valproico, un fármaco contra el cáncer de plantas tal como paclitaxel (taxol), docetaxel o taxotere, un alcaloide de la vinca tal como navelbina, vinblastina, vincristina, vindesina o vinorelbina, un alcaloide de tropolona tal como colchicina o un derivado de la misma, un macrólido tal como maitansina, una ansamitocina o rizoxina, un péptido antimitótico tal como fomopsina o dolastatina, una epipodofilotoxina o un derivado de podofilotoxina tal como etopósido o tenipósido, una esteganacina, un derivado de carbamato antimitótico tal como combretastatina o anfetinilo, procarbazina, un inhibidor del proteasoma tal como bortezomib, una enzima tal como asparaginasa, asparaginasa pegilada (pegaspargasa) o un inhibidor de timidinfosforilasa, un gestágeno o un estrógeno tal como estramustina (T-66) o megestrol, un antiandrógeno, tale como flutamida, casodex, anandron o acetato de ciproterona, un inhibidor de aromatasa tal como aminoglutetimida, anastrozol, formestano o letrozol, un análogo de GNrH tal como leuprorelina, buserelina, goserelina o triptorelina, un antiestrógeno tal como tamoxifeno o su sal citrato, droloxifeno, trioxifeno, raloxifeno o zindoxifeno, un derivado de 17 beta-estradiol tal como ICI 164.384 o ICI 182.780, aminoglutetimida, formestano, fadrozol, finasterida, ketoconazol, un antagonista de LH-RH tal como leuprolida, un esteroide tal como prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, budenósido, fluocortolona o triamcinolona, un interferón tal como interferón beta, una interleucina tal como IL-10 o IL-12, un anti-TNF alfa, anticuerpo tal como etanercept, un fármaco inmunomodulador tal como talidomida, sus enantiómeros R y S y sus derivados, o revimid (CC-5013), un antagonista de los leucotrienos, mitomicina C, una aziridoquinona tal como BMY-42355, AZQ o EO-9, un 2-nitroimidazol tal como misonidazol, NLP-1 o NLA-1, una nitroacridina, una nitroquinolina, una nitropirazoloacridina, un nitro aromático de "doble función" tal como RSU-1069 o RB-6145, CB-1954, un N-óxido de mostaza nitrogenada tal como nitromina, un complejo metálico de una mostaza nitrogenada, un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD25, un agente de inducción de tolerancia, un bifosfonato o derivado del mismo tal como el ácido minodrónico o sus derivados (YM-529, Ono-5920, YH-529), ácido zoledrónico monohidrato, ibandronato sódico hidrato o clodronato disódico, un nitroimidazol tal como metronidazol, misonidazol, benznidazol o nimorazol, un compuesto de nitroarilo tal como RSU-1069, un nitroxilo o N-óxido tal como SR-4233, un análogo de pirimidina halogenado tal como bromodesoxiuridina, yododesoxiuridina, un tiofosfato tal como WR-272 1, un fármaco fotoquímicamente activado tal como porfímero, fotofrina, un derivado de benzoporfirina, un derivado de feofórbido, merocianina 540 (MC-540) o tin etioporpurina, un ARN o ADN antiplantilla o antisentido tal como oblimersen, un fármaco inflamatorio no esteroideo tal como ácido acetilsalicílico, mesalazina, ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, indoprofeno, pirprofeno, carprofeno, oxaprozina, pranoprofeno, miroprofeno, tioxaprofeno, suprofeno, alminoprofeno, ácido tiaprofénico, fluprofeno, indometacina, sulindaco, tolmetina, zomepiraco, nabumetona, diclofenaco, fenclofenaco, alclofenaco, bromfenaco, ibufenaco, aceclofenaco, acemetacina, fentiazaco, clidanaco, etodolaco, oxpinaco, ácido mefenámico, ácido meclofenámico, ácido flufenámico, ácido niflumínico, ácido tolfenámico, diflunisal, flufenisal, piroxicam, tenoxicam, iomoxicam, nimesulida, meloxicam, celecoxib, rofecoxib, o una sal farmacéuticamente aceptable de un fármaco inflamatorio no esteroideo, un antibiótico citotóxico, un anticuerpo dirigido a las moléculas de superficie de las células cancerosas, tal como apolizumab o 1D09C3, un inhibidor de metaloproteinasas tal como TIMP-1 o TIMP-2, cinc, un inhibidor de oncogenes tal como P53 y Rb, un complejo de elementos de tierras raras tal como los complejos heterocíclicos de lantánidos, un agente fotoquimioterapéutico tal como PUVA, un inhibidor del complejo de factores de transcripción ESX/DRIP130/Sur-2, un inhibidor de la expresión de HER-2, tales tal como la geldanamicina moduladora de la proteína de choque térmico HSP90 y su derivado 17-alilamino-geldanamicina o 17-AAG, o un agente terapéutico seleccionado de IM-842, tetratiomolibdato, escualamina, combrestatina A4, TNP-470, marimastat, neovastat, bicalutamida, abarelix, oregovomab, mitumomab, TLK-286, alemtuzumab, ibritumomab, temozolomida, denileucina diftitox, aldesleucina, dacarbazina, floxuridina, plicamicina, mitotano, pipobromán, plicamicina, tamoxifeno y testolactona. Los compuestos preferidos incluyen antagonistas del receptor de VEGF de molécula pequeña, tal como vatalanib (PTK-787/ZK222584), SU-5416, SU-6668, SU-11248, SU-14813, AZD-6474, antagonistas de EGFR/HER2 tal como CI-1033 o GW-2016, un antagonista de EGFR tal como iressa (gefitinib, ZD-1839), tarceva (erlotinib, OSI-774), PKI-166, EKB-569, HKI-272 o herceptin, un antagonista de la proteína cinasa activada por mitógenos tal como BAY-43-9006 o BAY-57-9006, atrasentán, rituximab, cetuximab, Avastin.TM. (bevacizumab), IMC-1C11, erbitux (C-225), DC-101, EMD-72000, vitaxina, imatinib, un agente alquilante o un compuesto de platino tal como melfalán, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino, daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), doxorrubicina liposómica (doxil), epirrubicina, idarrubicina, un análogo o antagonista de pirimidina o purina o un inhibidor de la nucleósido difosfato reductasa tal como citarabina, 5-fluorouracilo (5-FU), pemetrexed, tegafur/uracilo, gemcitabina, capecitabina, mercaptopurina, metotrexato, un fármaco contra el cáncer tal como paclitaxel (taxol) o docetaxel, un alcaloide de la vinca tal como navelbina, vinblastina, vincristina, vindesina o vinorelbina, un péptido antimitótico tal como dolastatina, una epipodofilotoxina o un derivado de podofilotoxina tal como etopósido o tenipósido, un fármaco inflamatorio no esteroideo tal como el meloxicam, celecoxib, rofecoxib, un anticuerpo dirigido a las moléculas de superficie de células cancerosas tal como apolizumab o ID09C3 o la geldanamicina moduladora de la proteína de choque térmico HSP90 y su derivado 17-alilaminogeldanamicina o 17-AAG.
Por ejemplo, el agente quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en compuestos que interactúan con o se unen a tubulina, antagonistas sintéticos del receptor de VEGF de molécula pequeña, antagonistas del receptor del factor de crecimiento de molécula pequeña, inhibidores del receptor de EGF y/o receptor de VEGF y/o receptores de integrina o cualquier otro receptor de proteína tirosina cinasa que no se clasifique dentro de las moléculas pequeñas sintéticas, inhibidores dirigidos al receptor de EGF y/o receptor de VEGF y/o receptores de integrina o cualquier otro receptor de proteína tirosina cinasa, que son proteínas de fusión, compuestos que interactúan con ácidos nucleicos y que se clasifican como agentes alquilantes o compuestos de platino, compuestos que interactúan con los ácidos nucleicos y que se clasifican como antraciclinas, como intercaladores de ADN o como agentes de reticulación de ADN, incluyendo compuestos de unión al surco menor de ADN, antimetabolitos, de origen natural, antibióticos de tipo bleomicina semisintéticos o sintéticos, inhibidores de las enzimas que transcriben el ADN, y especialmente los inhibidores de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II, agentes modificadores de la cromatina, inhibidores de la mitosis, agentes antimitóticos, inhibidores del ciclo celular, inhibidores de proteasoma, enzimas, hormonas, antagonistas de hormonas, inhibidores de hormonas, inhibidores de la biosíntesis de esteroides, esteroides, citocinas, citotoxinas selectivas en hipoxia, inhibidores de citocinas, linfocinas, anticuerpos dirigidos contra citocinas, agentes de inducción de tolerancia oral y parenteral, agentes de apoyo, sensibilizadores y protectores de radiación química, fármacos activados fotoquímicamente, poli u oligonucleótidos sintéticos, opcionalmente modificado so conjugados, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, antibióticos citotóxicos, anticuerpos dirigidos a las moléculas de superficie de las células cancerosas, anticuerpos dirigidos a factores de crecimiento o sus receptores, inhibidores de metaloproteinasas, metales, inhibidores de oncogenes, inhibidores de la transcripción génica o de la traducción de ARN o expresión de proteínas, complejos de elementos de tierras raras y agentes fotoquimioterapéuticos.
En otros ejemplos, el agente quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en paclitaxel (taxol), docetaxel, un alcaloide de la vinca tal como navelbina, vinblastina, vincristina, vindesina o vinorelbina, un agente alquilante o un compuesto de platino tal como melfalán, ciclofosfamida, oxazafosforina, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino, tetraplatino, iproplatino, mitomicina, estreptozocina, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), busulfán, ifosfamida, estreptozocina, tiotepa, clorambucilo, una mostaza nitrogenada tal como mecloretamina, un fármaco inmunomodulador tal como talidomida, sus enantiómeros R y S y sus derivados, o revimid (CC-5013)), un compuesto de etilenimina, un alquilsulfonato, daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), doxorrubicina liposómica (doxil), epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, amsacrina, dactinomicina, distamicina o un derivado de la misma, netropsina, pibenzimol, mitomicina, CC-1065, una duocarmicina, mitramicina, cromomicina, olivomicina, una ftalanilida tal como propamidina o estilbamidina, una antramicina, una aziridina, una nitrosourea o un derivado de la misma, un análogo o antagonista de pirimidina o purina o un inhibidor de la nucleósido difosfato reductasa tal como citarabina, 5-fluorouracilo (5-FU), mostaza de uracilo, fludarabina, gemcitabina, capecitabina, mercaptopurina, cladribina, tioguanina, metotrexato, pentostatina, hidroxiurea o ácido fólico, una acridina o un derivado de la misma, una rifamicina, una actinomicina, adramicina, una camptotecina tal como irinotecán (camptosar) o topotecán, una amsacrina o un análogo de la misma, una carboxamida tricíclica, un inhibidor de histona desacetilasa tal como SAHA, MD-275, tricostatina A, CBHA, LAQ824, o ácido valproico, un inhibidor del proteasoma tal como bortezomib, un antagonista del receptor de VEGF de molécula pequeña, tal como vatalanib (PTK-787/ZK222584), SU-5416, SU-6668, SU-11248, SU-14813, AZD-6474, AZD-2171, CP-547632, CEP-7055, AG-013736, IM-842 o GW-786034, un antagonista de la proteína cinasa activada por mitógenos tal como BAY-43-9006 o BAY-57-9006, un antagonista dual de EGFR/HER2 tal como gefitinib, erlotinib, CI-1033 o GW-2016, un antagonista de EGFR tal como iressa (ZD-1839), tarceva (OSI-774), PKI-166, EKB-569, HKI-272 o herceptin, un derivado de quinazolina tal como 4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-6-{[4-(N,N-dimetilamino)-1-oxo-2-buten-1-il]amino}-7-((S)-tetrahidrofuran-3-iloxi)quinazolina o 4-[(3-cloro-4-fluoro-fenil)amino]-6-{[4 (homomorfolin-4-il)-1-oxo-2-buten-1-il]amino}-7-[(S)-(tetrahidrofuran-3-il)oxi]-quinazolina, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, un inhibidor del complejo de factores de transcripción ESX/DRIP130/Sur-2, un inhibidor de la expresión de HER-2, tal como la geldanamicina moduladora de la proteína de choque térmico HSP90 y su derivado 17-alilaminogeldanamicina o 17-AAG, un antagonista de receptores proteína cinasa que no se clasifica dentro de las moléculas pequeñas sintéticas tal como atrasentan, rituximab, cetuximab, Avastin.TM. (bevacizumab), IMC-1C11, erbitux (C-225), DC-101, EMD-72000, vitaxina, imatinib y un anticuerpo dirigido a las moléculas de superficie de las células cancerosas, tal como apolizumab o 1D09C3.
En un ejemplo, el agente anticanceroso puede ser un inhibidor de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de CTLA4, tal como un anticuerpo anti-CTLA4 (p. ej., ipilimumab (BMS), tremelimumab (AstraZeneca) y/o KAHR-102 (Kahr Medical)). Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., nivolumab (BMS), pembrolizumab/lambrolizumab (Merck), pidilizumab (Curetech), AMP-224 (GSK), AMP-514 (AstraZeneca), STI-A1110 (Sorrento) y/o TSR-042 (Tesaro). Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede ser un inhibidor de PD-L1 y/o PD-L2, tal como un anticuerpo anti-PD-L1 y/o anti-PD-L2 (p. ej., RG-7446 (Roche), BMS-936559 (BMS), MEDI-4736 (AstraZeneca), MSB-0020718C (Merck), AUR-012 (Pierre Fabre Med), STI-A1010 (Sorrento)).
En un ejemplo, la composición puede comprender un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2 descrito en el presente documento, tal como una molécula de ADN que codifica un polipéptido AMHR2. En un ejemplo, la composición puede comprender un vector de expresión que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido AMHR2.
Cuando la célula los capta (por ejemplo, miocito, una célula presentadora de antígenos (APC) tal como una célula dendrítica, macrófago, etc.), una molécula de ADN puede estar presente en la célula como una molécula extracromosómica y/o puede integrarse en el cromosoma. El ADN se puede introducir en las células en forma de plásmido que puede permanecer como material genético separado. Como alternativa, los ADN lineales que pueden integrarse en el cromosoma pueden introducirse en la célula. Opcionalmente, cuando se introduce ADN en una célula, se pueden añadir reactivos que promueven la integración del ADN en los cromosomas.
Métodos terapéuticos
En el presente documento se proporcionan métodos para tratar o prevenir el cáncer de ovario y/o para inducir una respuesta inmunitaria contra un tumor de cáncer de ovario o AMHR2. En un ejemplo, el método puede comprender administrar a un sujeto una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En un ejemplo, el tumor de cáncer de ovario puede ser un tumor primario. En un ejemplo, el tumor de cáncer de ovario puede ser un tumor metastásico. En un ejemplo, el tumor de cáncer de ovario puede ser un tumor de cáncer de ovario epitelial (EOC). En un ejemplo, el tumor de cáncer de ovario puede expresar AMHR2
Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar cualquier sujeto que lo necesite. Como se usa en el presente documento, un "sujeto que lo necesite" incluye cualquier sujeto que tenga cáncer de ovario, que ha tenido cáncer de ovario y/o que está predispuesto al cáncer de ovario. Por ejemplo, el sujeto puede tener un tumor de cáncer de ovario (por ejemplo, un tumor de cáncer de ovario que expresa AMHR2). En un ejemplo, el sujeto puede haberse sometido a una cirugía para extirpar al menos parte de un tumor de cáncer de ovario. En un ejemplo, el sujeto puede estar predispuesto al cáncer de ovario debido a tener una mutación BRCA1 o BRCA2 en su genoma que predispone al sujeto al cáncer de ovario. En un ejemplo, el sujeto puede tener antecedentes familiares de cáncer de ovario.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden administrarse mediante cualquier vía de administración adecuada, incluso por vía oral y parenteral. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse generalmente (por ejemplo, mediante administración oral o parenteral).
La dosis del agente objeto se puede determinar con referencia a las concentraciones plasmáticas del agente. Por ejemplo, se puede utilizar la concentración plasmática máxima (Cmáx) y el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo desde el tiempo 0 al infinito (AUC (0-4)). Las dosis incluyen aquellas que producen los valores anteriores para Cmáx y AUC (0-4) y otras dosis que dan como resultado valores mayores o menores para esos parámetros.
Los niveles reales de dosificación de los principios activos en las composiciones farmacéuticas pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de varios factores que incluyen la actividad del agente particular empleado, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción o metabolismo del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, sexo, peso, afección, estado de salud general y anamnesis previa del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Un médico o veterinario que tenga experiencia en la materia puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica necesaria. Por ejemplo, el médico o el veterinario podría prescribir y/o administrar dosis de los agentes empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores que los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta conseguir el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un agente descrito en el presente documento será aquella cantidad del agente que sea la dosis eficaz más baja para producir un efecto terapéutico. Tal dosis eficaz generalmente dependerá de los factores descritos anteriormente.
En el presente documento se proporciona un método para provocar en un sujeto una respuesta inmunitaria a una célula que expresa AMHR2 (p. ej., una célula tumoral de cáncer de ovario). El método comprende: administrar al sujeto una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en donde la composición farmacéuticamente aceptable, cuando se administra al sujeto, provoca una respuesta inmunitaria a la célula que expresa AMHR2
Generalmente, la respuesta inmunitaria puede incluir una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria mediada por células, o ambas.
Puede determinarse una respuesta humoral mediante un inmunoensayo convencional para los niveles de anticuerpos en una muestra de suero del sujeto que recibe la composición farmacéutica. Una respuesta inmunitaria celular es una respuesta que implica los linfocitos T y se puede determinar in vitro o in vivo. Por ejemplo, se puede determinar una respuesta inmunitaria celular general como la actividad proliferativa de linfocitos T en células (por ejemplo, leucocitos de sangre periférica (PBL, por sus siglas en inglés)) extraídas del sujeto en un momento adecuado después de la administración de una composición farmacéuticamente aceptable. Después de la incubación de, por ejemplo, PBMC con un estimulador durante un período adecuado, puede determinarse la incorporación de [3H] timidina. El subconjunto de linfocitos T que prolifera se puede determinar mediante citometría de flujo.
Los métodos proporcionados en el presente documento pueden incluir la administración a mamíferos tanto humanos como no humanos. También se contemplan aplicaciones veterinarias. Por ejemplo, el sujeto puede ser cualquier organismo femenino vivo en el que pueda desencadenarse una respuesta inmunitaria. Ejemplos de sujetos incluyen, sin limitación, seres humanos, ganado, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de las mismas.
En un ejemplo, el sujeto puede tener antecedentes de cáncer de ovario y se le ha administrado otro modo de terapia. La otra terapia puede haber incluido, por ejemplo, resección quirúrgica, radioterapia, quimioterapia y otros modos de inmunoterapia mediante los cuales, como resultado de la otra terapia, el sujeto no presenta un tumor clínicamente medible. Sin embargo, el sujeto puede ser uno que se haya determinado que está en riesgo de reaparición o progresión del cáncer, ya sea cerca del sitio del sito del tumor original o por metástasis. Estos sujetos pueden clasificarse además como sujetos de alto riesgo y de bajo riesgo. La subdivisión se puede realizar en función de las características observadas antes o después del tratamiento inicial. Estas características se conocen en la técnica clínica y se definen adecuadamente para cada cáncer diferente. Las características típicas de los subgrupos de alto riesgo son aquellas en las que el tumor ha invadido tejidos vecinos o que muestran afectación de los ganglios linfáticos. Por lo tanto, por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede administrarse al sujeto para provocar una respuesta anticancerosa principalmente como medida profiláctica contra la reaparición.
La composición farmacéutica se puede administrar en cualquier momento que sea apropiado. Por ejemplo, la administración se puede realizar antes o durante la terapia tradicional de un sujeto que tiene un tumor de cáncer de ovario y continuar después de que el tumor se vuelva clínicamente indetectable. La administración también puede continuarse en un sujeto que muestre signos de reaparición.
La composición farmacéutica se puede administrar en una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz. La administración de la composición farmacéutica al sujeto se puede llevar a cabo utilizando procedimientos conocidos, y en dosis y durante períodos de tiempo suficientes para lograr el efecto deseado.
La composición farmacéutica se puede administrar al sujeto en cualquier sitio adecuado, por ejemplo, un sitio que está distal o próximo a un tumor primario. La vía de administración puede ser parenteral, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intranasal, intravenosa (incluso a través de un catéter permanente), a través de un vaso linfático aferente, o por cualquier otra vía adecuada en vista de la enfermedad neoplásica que se está tratando y del estado del sujeto. Preferentemente, la dosis se administrará en una cantidad y durante un período de tiempo eficaz para lograr la respuesta deseada, ya sea provocando la respuesta inmunitaria o el tratamiento profiláctico o terapéutico de la enfermedad neoplásica y/o síntomas asociados a la misma.
La composición farmacéuticamente aceptable se puede administrar después de, antes de o simultáneamente con otras terapias, incluidas las terapias que también provocan una respuesta inmunitaria en el sujeto. Por ejemplo, el sujeto puede tratarse previa o simultáneamente con quimioterapia, radioterapia y otras formas de inmunoterapia, tales otras terapias se proporcionan preferentemente de tal manera que no interfieran con la inmunogenicidad de las composiciones descritas en el presente documento.
La administración puede ser programada correctamente por el asistente (p. ej., médico, veterinario), y puede depender de la afección clínica del sujeto, también se contemplan o administran los objetivos de la administración y/u otras terapias. En un ejemplo, se puede administrar una dosis inicial y controlar al sujeto para determinar una respuesta inmunitaria y/o clínica. Los medios adecuados de control inmunológico incluyen el uso de linfocitos de sangre periférica (PBL) del paciente como que responden y células neoplásicas como estimuladores. Una reacción inmunitaria también se puede determinar mediante una respuesta inflamatoria retardada en el lugar de la administración. Se pueden administrar una o más dosis posteriores a la dosis inicial, según corresponda, normalmente una vez al mes, quincenalmente, o preferentemente semanalmente, hasta lograr el efecto deseado. Posteriormente, se pueden administrar dosis de refuerzo o de mantenimiento adicionales según sea necesario, particularmente cuando el beneficio inmunitario o clínico parece disminuir.
Terapia celular
Un polipéptido AMHR2 descrito en el presente documento, o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido AMHR2, se puede utilizar en composiciones y métodos para proporcionar células presentadoras de antígenos sensibilizadas con AMHR2, y/o linfocitos específicos de AMHR2 generados con estas células presentadoras de antígenos. En un ejemplo, tales células presentadoras de antígenos y/o linfocitos pueden usarse en el tratamiento o prevención del cáncer de ovario.
En el presente documento se proporcionan métodos para preparar células presentadoras de antígeno sensibilizadas con AMHR2 al poner en contacto células presentadoras de antígenos con un polipéptido AMHR2 descrito en el presente documento, o con ácidos nucleicos que codifican al menos un polipéptido AMHR2, in vitro en una condición suficiente para que el al menos un polipéptido AMHR2 sea presentado por las células presentadoras de antígenos.
En un ejemplo, el polipéptido AMHR2, o ácido nucleico que codifica el polipéptido AMHR2, se puede poner en contacto con una composición homogénea, sustancialmente homogénea o heterogénea que comprende células presentadoras de antígenos. Por ejemplo, la composición puede incluir, pero sin limitación, sangre completa, sangre fresca, o fracciones de la misma tal como, pero sin limitación, células mononucleares de sangre periférica, fracciones de placa leucocitaria de sangre total, glóbulos rojos empaquetados, sangre irradiada, células dendríticas, monocitos, macrófagos, neutrófilos, linfocitos, linfocitos citolíticos naturales y linfocitos T citotóxicos. Si, opcionalmente, se utilizan precursores de células presentadoras de antígenos, los precursores se pueden cultivar en condiciones de cultivo adecuadas suficientes para diferenciar los precursores en células presentadoras de antígenos. Por ejemplo, las células presentadoras de antígenos (o los precursores de las mismas) pueden seleccionarse de monocitos, macrófagos, células de linaje mieloide, linfocitos B, células dendríticas o células de Langerhans.
La cantidad del polipéptido AMHR2, o del ácido nucleico que codifica el polipéptido AMHR2, para ponerse en contacto con células presentadoras de antígenos puede determinarse por un experto en la materia mediante experimentación habitual. Generalmente, las células presentadoras de antígenos se ponen en contacto con el polipéptido AMHR2, o con el ácido nucleico que codifica el polipéptido AMHR2, durante un período de tiempo suficiente para que las células presenten las formas procesadas de los antígenos para la modulación de los linfocitos T. Por ejemplo, las células presentadoras de antígenos se pueden incubar en presencia del polipéptido AMHR2 o del ácido nucleico que codifica el polipéptido AMHR2, durante menos de una semana, de manera ilustrativa, durante aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 48 horas, de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 6 minutos a aproximadamente 8 horas, de aproximadamente 8 minutos a aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 3 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 horas, o de aproximadamente 40 minutos a aproximadamente 1 hora. El tiempo y la cantidad del polipéptido AMHR2, o del ácido nucleico que codifica el polipéptido AMHR2, necesarios para que las células presentadoras de antígenos procesen y presenten los antígenos se pueden determinar, por ejemplo, utilizando métodos de persecución por pulsos en donde el contacto va seguido de un período de lavado y exposición a un sistema de lectura, por ejemplo, linfocitos T reactivos a antígeno.
Por ejemplo, se puede usar cualquier método apropiado para el suministro de antígenos a la vía de procesamiento endógena de las células presentadoras de antígenos. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, métodos que implican liposomas sensibles al pH, acoplamiento de antígenos a adyuvantes, suministro de células apoptóticas, pulsación de células en células dendríticas, suministro de partículas similares a virus quiméricos recombinantes (VLP, por sus siglas en inglés) que comprenden antígeno para la ruta de procesamiento del MHC de clase I de una línea de células dendríticas.
En un ejemplo, el polipéptido AMHR2 solubilizado puede incubarse con células presentadoras de antígenos. En un ejemplo, el polipéptido AMHR2 se puede acoplar a una citolisina para potenciar la transferencia de los antígenos al citosol de una célula presentadora de antígenos para su suministro a la vía del MHC de clase I. Ejemplos de citolisinas incluyen compuestos de saponina tales tal como complejos inmunoestimulantes que contienen saponina (ISCOM5), toxinas formadoras de poros (por ejemplo, una toxina alfa) y citolisinas naturales de bacterias grampositivas tales tal como listeriolisina O (LLO), estreptolisina O (SLO) y perfringolisina O (PFO).
En un ejemplo, pueden aislarse células presentadoras de antígenos, tales tal como células dendríticas y macrófagos. de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y transfectarse con polinucleótidos mediante métodos conocidos en la técnica para introducir un ácido nucleico que codifica el polipéptido AMHR2 en la célula presentadora de antígenos. Los reactivos y métodos de transfección son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, el ARN que codifica el polipéptido AMHR2 puede proporcionarse en un medio adecuado y combinarse con un lípido (por ejemplo, un lípido catiónico) antes del contacto con las células presentadoras de antígenos. Ejemplos no limitantes de tales lípidos incluyen LIPOFECTIN™ y LIPOFECTAMINE™. A continuación, el complejo polinucleótido-lípido resultante se puede poner en contacto con células presentadoras de antígenos. Como alternativa, el polinucleótido se puede introducir en células presentadoras de antígenos utilizando técnicas tales como electroporación o transfección con fosfato cálcico. Las células presentadoras de antígenos cargadas con polinucleótidos se pueden usar para estimular la proliferación de linfocitos T (p. ej., linfocitos T citotóxicos). in vivo o ex vivo. En un ejemplo, el linfocito T expandido ex vivo se puede administrar a un sujeto en un método de inmunoterapia adoptiva.
Se proporciona en el presente documento una composición que comprende células presentadoras de antígenos que se han puesto en contacto in vitro con un polipéptido AMHR2, o con un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2, en condiciones suficientes para que las células presentadoras de antígenos presenten un epítopo de AMHR2.
En el presente documento se proporciona un método para preparar linfocitos específicos para AMHR2. El método comprende poner en contacto linfocitos con las células presentadoras de antígenos descritas anteriormente en condiciones suficientes para producir un linfocito específico de AMHR2 capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra una célula que expresa AMHR2. Por lo tanto, las células presentadoras de antígenos también se pueden usar para proporcionar linfocitos, incluidos los linfocitos T y los linfocitos B, para provocar una respuesta inmunitaria contra la célula que expresa AMHR2
En un ejemplo, una preparación de linfocitos T puede ponerse en contacto con las células presentadoras de antígenos descritas anteriormente durante un período de tiempo, (por ejemplo, al menos aproximadamente 24 horas) para sensibilizar los linfocitos T a un epítopo AMHR2 presentado por las células presentadoras de antígenos.
En un ejemplo, una población de células presentadoras de antígenos puede cultivarse junto con una población heterogénea de linfocitos T de sangre periférica junto con un polipéptido AMHR2 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido AMHR2. Las células pueden cultivarse conjuntamente durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para que los epítopos de AMHR2 incluidos en los polipéptidos AMHR2 se presenten por las células presentadoras de antígenos y las células presentadoras de antígenos sensibilicen una población de linfocitos T para responder a las células. que expresan un AMHR2. En el presente documento se proporcionan linfocitos T y linfocitos B que están preparados para responder a las células que expresan un AMHR2
Los linfocitos T se pueden obtener de cualquier fuente adecuada, tal como sangre periférica, bazo y ganglios linfáticos. Los linfocitos T pueden usarse como preparaciones en bruto o como preparaciones parcialmente purificadas o sustancialmente purificadas, que se pueden obtener mediante técnicas convencionales que incluyen, pero sin limitación, métodos que implican técnicas inmunomagnéticas o de citometría de flujo que utilizan anticuerpos.
En el presente documento se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende las células presentadoras de antígenos o los linfocitos descritos anteriormente, y un transportador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, la composición puede comprender además un adyuvante como se describe anteriormente.
En el presente documento se proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria a la célula que expresa AMHR2, comprendiendo el método administrar al sujeto las células presentadoras de antígenos o los linfocitos descritos anteriormente en cantidades eficaces suficientes para provocar la respuesta inmunitaria. En el presente documento se proporciona un método para el tratamiento o la profilaxis del cáncer de ovario, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de las células presentadoras de antígenos o los linfocitos descritos anteriormente. Por ejemplo, las células presentadoras de antígenos o los linfocitos pueden administrarse sistémicamente, preferentemente por inyección. Como alternativa, se pueden administrar localmente en lugar de sistémicamente, por ejemplo, mediante inyección directamente en el tejido (p. ej., en el tejido próximo a un tumor de cáncer de ovario, tal como en el tejido ovárico), preferentemente en una formulación de depósito o de liberación sostenida.
En un ejemplo, las células presentadoras de antígenos sensibilizadas con antígeno descritas en el presente documento y los linfocitos T específicos de antígeno generados con estas células presentadoras de antígenos pueden usarse como compuestos activos en composiciones inmunomoduladoras para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer de ovario. Por ejemplo, las células presentadoras de antígenos sensibilizadas con AMHR2 descritas en el presente documento pueden usarse para generar linfocitos T CD8+, linfocitos T CD4+ y/o linfocitos B para transferencia adoptiva al sujeto. Por lo tanto, por ejemplo, los linfocitos específicos de AMHR2 se pueden transferir de forma adoptiva con fines terapéuticos en sujetos que padecen cáncer de ovario.
En un ejemplo, las células presentadoras de antígenos y/o los linfocitos descritos en el presente documento se pueden administrar a un sujeto, ya sea por sí mismos o en combinación, para provocar una respuesta inmunitaria, particularmente para provocar una respuesta inmunitaria a las células que expresan un AMHR2. En un ejemplo, las células presentadoras de antígenos y/o linfocitos pueden derivar del sujeto (es decir, células autólogas) o de un sujeto diferente que es coincidente o no coincidente en el MHC con el sujeto (por ejemplo, alogénico).
Por ejemplo, se pueden llevar a cabo administraciones únicas o múltiples de las células presentadoras de antígenos y los linfocitos, siendo el número de células y el tratamiento seleccionados por el cuidador (por ejemplo, el médico). En un ejemplo, las células presentadoras de antígenos y/o los linfocitos se pueden administrar en un transportador farmacéuticamente aceptable. Los transportadores adecuados pueden ser el medio de crecimiento en el que se cultivaron las células o cualquier medio de tamponamiento adecuado, tal como solución salina tamponada con fosfato. Las células se pueden administrar solas o como terapia adjunta junto con otras terapias.
Ejemplos
Procedimientos Experimentales
Generación de polipéptidos AMHR2 de ratón recombinantes.
El ARNm total se extrajo de los ovarios de ratones C57BL/6 hembras de 8 semanas de edad. Se usaron pares de cebadores diseñados para amplificar la secuencia de AMHR2 1-140 o 170-568 para generar ADNc que codifica el dominio extracelular completo de 140 aminoácidos o el dominio citoplasmático completo de 399 aminoácidos del AMHR2 de ratón mediante RT-PCR. Para optimizar el plegamiento de proteínas y potenciar el rendimiento general, se hicieron sustituciones de secuencias de codones naturales (Dapcel, Cleveland, OH), y el ADNc optimizado se insertó en el sitio NdeI-Bam HI de pET-3a (Novagen, Darmstadt, Alemania) proporcionando así una proteína recombinante etiquetada con 6xHis carboxiterminal (figuras 1A y 10A). Se transformaron E. coli con plásmidos que contenían estos insertos. Se seleccionaron colonias de alto nivel de expresión después de la inducción con isopropiltiogalactopirronidasa (IPTG; Amresco, Solon OH) y se secuenciaron para confirmar la orientación y alineación adecuadas. Los polipéptidos AMHR2 etiquetados con 6xHis se purificaron en condiciones de desnaturalización utilizando cromatografía de afinidad con níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) (Qiagen Sciences, Germantown, MD).
Los polipéptidos AMHR2 purificados se sometieron a electroforesis en geles SDS-PAGE desnaturalizantes (Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfirieron a una membrana de PVDF de inmunotransferencia (Bio-Rad). La detección inmunitaria del polipéptido AMHR2 se realizó utilizando el sistema de quimioluminiscencia potenciado (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) con anticuerpo de His conjugado con HRP (Qiagen). Antes de su uso, los polipéptidos AMHR2 etiquetados con 6xHis se purificaron mediante HPLC de fase inversa para producir una proteína sin endotoxina. Los niveles de endotoxina fueron < 0,05 unidades de endotoxina (< 5 pg) por mg de proteína recombinante.
Ratones e inmunización.
Los ratones C57BL/6 hembra sirvieron como receptores de tumores ID8. Los ratones se obtuvieron comercialmente (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a las seis semanas de edad y se inmunizaron a las 7-10 semanas de edad por inyección subcutánea en los flancos abdominales con 100 pg de AMHR2-CD o AMHR2-ED de ratón recombinantes en 200 pl de una emulsión de volúmenes iguales de agua y adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés; Difco, Detroit, E) que contenía 400 pg de Mycobacteria tuberculosis. Se mantuvieron ratones transgénicos TgMlSIIR-TAg (línea DR26) cruzando ratones TgMISIIR-TAg (H-2b) macho con hembras C57BL/6 singénicas de tipo silvestre(Jackson Laboratory). Se inmunizaron ratones TgMISIIR-TAg a las 6-7 semanas de edad con 100 pg de AMHR2-CD o AMHR2-ED de ratón recombinante en CFA como se describe anteriormente. Para determinar los fenotipos de fertilidad, se aparearon ratones C57BL/6 hembra vacunados de prueba y de control de la misma edad con los mismos machos C57BL/6.
Inoculación y medición de tumores.
Las células ID8 se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos de 75 o 225 cm2 (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey) en DMEM (Mediatech Cellgro, Manassas, VA) que contenía suero fetal bovino al 4 % (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT), penicilina/estreptomicina al 1 % v/v (Invitrogen, Carlsbad, CA) y un complemento de medios de selenito de sodio-transferrina-insulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) hasta que las células se volvieron confluentes en un 70-80 %. Las células se recogieron mediante tripsinización y se lavaron dos veces con PBS. Se inocularon ratones C57BL/6 hembra por vía subcutánea en el flanco dorsal izquierdo con 5x106 células ID8. El crecimiento de los tumores ID8 se evaluó regularmente utilizando un calibre Vernier para medir la longitud x la anchura. El criterio de valoración del crecimiento tumoral se determinó mediante una medición en cualquier dirección de 17 mm.
Obtención de imágenes y medición de tumores ováricos autóctonos in vivo.
El crecimiento del tumor de ovario bilateral en ratones transgénicos hembra se midió mensualmente mediante ultrasonido utilizando el sistema de obtención de microimágenes Vevo 770 de alta resolución. in vivo para animales pequeños (VisualSonics, Toronto, Canadá). Se obtuvieron imágenes en tiempo real del abdomen utilizando la sonda/cabezal de exploración de baja frecuencia RMV704 y gel conductor acuoso después de eliminar el vello de la región abdominal. La anestesia para la inmovilización se administró utilizando un cono nasal con flujo continuo de isoflurano al 1-2% vol/vol durante el período de adquisición de imágenes que duró menos de 30 minutos, y el suministro de oxígeno se mantuvo de forma continua. La sonda/cabezal de exploración se movió sobre el área abdominal muy suavemente después de aplicar gel conductor acuoso. Las mediciones y el cálculo del área tumoral se realizaron utilizando la herramienta de medición B-Mode del programa informático Vevo que permite una evaluación 2-D del tamaño del tumor ovárico. in vivo con la configuración de la región poligonal de interés (VisualSonics). Se ha demostrado que la medición del tamaño del tumor sólido mediante sonografía en modo B se correlaciona bien con la medición histopatológica.
RT-PCR.
Los tejidos se extirparon y se almacenaron congelados en RNA-Later (Life Technologies, Grand Island, NY). El ARN se extrajo de cada tejido mediante homogeneización en reactivo TRIZOL (Invitrogen) o se adquirió comercialmente (OriGene Technologies, Rockville, MD; e ILS Biotech, Chestertown, MD). Se generó ADNc a partir de ARN en masa utilizando Superscript III (Invitrogen). La expresión génica se cuantificó mediante qRT-PCR utilizando la mezcla de PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) con cebadores específicos de genes (Tabla 1). La expresión génica relativa se evaluó mediante la normalización de cada nivel de expresión génica de prueba a los niveles de expresión de p-actina en cada tejido individual. La expresión génica se determinó mediante RT-PCR convencional utilizando cebadores específicos de AMHR2 y p-actina (Tabla 1). Después de la amplificación a través de 30 ciclos, los productos de PCR se separaron en geles de agarosa (2 % en tampón TBE 1) y se visualizaron bajo luz ultravioleta después de teñir con bromuro de etidio. La expresión transgénica en la descendencia de ratones TgMlSIIR-TAg se determinó mediante amplificación por PCR de un fragmento de 773 pb de SV40-TAg utilizando pares de cebadores como se describe previamente (Tabla 1). El ADN de la secuencia completa de 140 aminoácidos del dominio extracelular de AMHR2 de ratón se amplificó mediante RT-PCR a partir de tejidos de ovario de ratón utilizando pares de cebadores específicos de AMHR2 (Tabla 1).
Tabla 1. Pares de cebadores utilizados para la clonación, qRT-PCR, Detección de transgén y para RT-PCR convencional
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Análisis por citometría de flujo de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL, por sus siglas en inglés).
Se aislaron TIL de tumores ID8 mediante digestión de tumor triturado durante 30 minutos a 37 °C en HBSS que contenía 50 KU de DNasa I (Sigma-Aldrich) y 0,2 mg/ml de colagenasa II (Life Technologies) seguido de centrifugación en gradiente discontinuo. Los TIL parcialmente purificados se trataron con anticuerpo de receptor de Fcy III/II (BD Biosciences) en PBS que contenía BSA al 0,5 % y azida sódica al 0,05 % y se tiñeron dos veces con anti-CD3 de ratón conjugado con FITC y anti-CD4 de ratón conjugado con PE o anti-CD8 de ratón conjugado con PE (BD Biosciences). La población de linfocitos T CD3+ se seleccionó y analizó para determinar los porcentajes de linfocitos CD4+ y CD8+. Los datos recopilados sobre 30.000 eventos totales se analizaron utilizando el programa informático FlowJo (BD Biosciences).
Transferencia pasiva de inmunidad tumoral.
Diez días después de la inmunización de ratones C57BL/6 hembra con polipéptido AMHR2 o inmunógeno de control (ovoalbúmina; Sigma-Aldrich), se activaron LNC a 5x106 células/ml in vitro con 20 |jg/ml de inmunógeno en presencia de IL-12 (10 ng/ml) e IL-18 (10 ng/ml; Peprotech, Rocky Hill, NJ) en placas Falcon de fondo plano de 24 pocillos (BD Biosciences) en un volumen total de 2,0 ml/pocillo en DMEM complementado como se describe anteriormente. Después de 3 días de reestimulación, se inyectaron 2x107 LNC completas activadas por vía intraperitoneal en receptoras hembra sin tratamiento previo irradiadas con y subletalmente (5 Gy). Como alternativa, se inmunizaron ratones C57BL/6 hembra bien con polipéptido AMHR2 o con OVA, y cuatro semanas después, se inyectaron tres grupos de células por vía intraperitoneal en receptoras hembra sin tratamiento previo irradiadas subletalmente con y (5 Gy), incluyendo 7,5x107 esplenocitos completos reactivados con inmunógeno, IL-12 e IL-18 como se describe anteriormente, 2x107 linfocitos T CD4+ reactivados de manera similar purificados a partir de esplenocitos completos mediante separación con perlas magnéticas y 2x107 linfocitos B B220+ no reactivados también purificados a partir de esplenocitos completos mediante separación con perlas magnéticas. En todos los casos, los hospedadores se inocularon por vía subcutánea el día después de la transferencia celular con 5x106 células ID8 y el crecimiento tumoral se evaluó regularmente como se describe anteriormente. Las purezas de las células enriquecidas se determinaron mediante análisis por citometría de flujo utilizando el programa informático CellQuest (BD Biosciences) y se encontró de manera sistemática que eran > 90 %.
Análisis bioestadístico.
Las diferencias entre los niveles de expresión de ARNm y los pesos tumorales medios se compararon mediante el método de la prueba t de Student. Las diferencias entre las curvas de crecimiento tumoral se compararon mediante ANOVA unidireccional no ponderado, y las diferencias en las curvas de supervivencia de los ratones se compararon usando la prueba de rango logarítmico.
Ejemplo 1: Generación de AMHR2-CD de ratón recombinante
Se expresó el dominio hidrófilo más largo de AMHR2 de ratón que consiste en la secuencia 170-568 que comprende los 399 aminoácidos del dominio citoplasmático completo (figura 1A). La proteína carboxiterminal etiquetada con 6xHis purificada por afinidad con Ni-NTA migró como una proteína de ~ 44 kD como se determinó por tinción con azul de Coomassie de un gel SDS-PAGE (figura IB), y por inmunotinción de transferencia Western utilizando anticuerpo específico de His conjugado con HRP (figura 1C).
Ejemplo 2: Inmunogenicidad de AMHR2-CD
Diez días después de la inmunización con AMHR2-CD de ratones C57BL/6 hembra, LNC mostró proliferación en una forma de respuesta a la dosis a AMHR2-CD, pero no a la cochlina humana recombinante, una proteína de control generada y purificada de una manera similar a AMHR2-CD (figura 2A). Esta proliferación específica de antígeno por LNC se provocó a partir de linfocitos T CD4+ purificados, pero no de linfocitos T CD8+ purificados (figura 2B) y se inhibió mediante el tratamiento de cultivos con anticuerpos específicos de CD4 pero no específicos de CD8 (figura 2C). Cuatro semanas después de la inmunización, el análisis ELISA de sobrenadantes de esplenocitos estimulados por inmunógenos mostró una respuesta proinflamatoria predominante a AMHR2-CD con alta producción de IFNy y con relativamente baja producción de IL-2, IL-4 e IL-5 (figura 2D). La purificación de subconjuntos de linfocitos T de toda la población de esplenocitos mostró que los linfocitos CD4+ pero no CD8+ produjeron el IFNy en respuesta a AMHR2-CD (figura 2E). Dos meses después de la inmunización, los niveles séricos de IgG específica de AMHR2-CD eran detectables incluso con títulos que superaban una dilución de 1:50.000 (figura 2F).
Ejemplo 3: Inflamación ovárica transitoria benigna después de la inmunización con AMHR2-CD
A continuación, se examinó el potencial de la inmunización con AMHR2-CD para inducir autoinmunidad ovárica. Cuatro y ocho semanas después de la inmunización con AMHR2-CD de ratones C57BL/6 hembra, la expresión del gen de IFNy ovárico se midió mediante qRT-PCR. La expresión del gen de IFNy ovárica relativa se elevó modestamente 4 semanas después de la inmunización con AMHR2-CD, pero no después de la inmunización con CFA solo (figura 3A). Ocho semanas después de la inmunización, la expresión relativa del gen de IFNy en ovario fue similar en ambos grupos de ratones inmunizados. De manera más destacable, la expresión del gen de IFNy transitoriamente elevada observada en ratones inmunizados con AMHR2-CD a las 4 semanas fue solo 3 veces mayor que en ratones de control con CFA. No se observaron infiltrados de linfocitos T CD3+ en los ovarios mediante análisis inmunohistoquímico a las 4, 8 y 12 semanas después de la inmunización con AMHR2-CD. La baja expresión transitoria de IFNy en los ovarios de ratones inmunizados con AMHR2-CD no se asoció con ningún efecto detectable sobre la función ovárica como lo indica la fertilidad de los ratones durante cuatro ciclos secuenciales de apareamiento durante los cuales no se produjeron diferencias significativas (P> 0,60) en el número de crías generado por camada entre ratones inmunizados con AMHR2-CD y CFA (figura 3C). La expresión del gen AMHR2 se detectó fácilmente en los ovarios y en las células tumorales de ovario ID8 y no se detectó en niveles apreciables en el útero, estómago, bazo, corazón, pulmón, riñón e hígado de ratones normales (figura 3C).
Ejemplo 4: inhibición del crecimiento tumoral en ratones inmunizados con AMHR2-CD
A continuación, se determinó si la vacunación con AMHR2-CD inhibiría el crecimiento de tumores ID8 trasplantables en ratones C57BL/6 hembra. El crecimiento de tumores ID8 se inhibió en ratones vacunados profilácticamente durante 15 días (figura 4A; P < 0,001), 7 días (figura 4V; P <0,001) o 1 día (figura 4C; P <0,05) antes de la inoculación de células tumorales de ovario ID8. Además, la vacunación con AMHR2-CD dio como resultado una carga tumoral global significativamente menor medida por el peso final del tumor ID8 al finalizar los experimentos en ratones vacunados 7 días (P <0,01) y 1 día (P <0,05) antes de la inoculación de ID8 (figura 4D). La vacunación con AMHR2-CD también fue eficaz como terapia contra el EOC. La vacunación con AMHR2-CD 60 días después de la inoculación de tumores ID8 inhibió significativamente el crecimiento de tumores ID8 establecidos, palpables (P <0,05; figura 4E). La vacunación con AMHR2-CD inhibió significativamente el crecimiento de e Oc autóctonos que se desarrollan espontáneamente en ratones transgénicos TgMlSIIR-TAg (P <0,0001; figura 4F). Por otra parte, esta inhibición del crecimiento tumoral estuvo acompañada de un aumento de la supervivencia general (SG) muy significativo en comparación con los ratones de control vacunados con CFAP <0,0005; figura 4G). Esta mayor esperanza de vida en ratones vacunados con AMHR2-CD (media 191,25 días ± 22,95) en comparación con los ratones de control vacunados con CFA (media 135 días ± 13,89) representa un aumento del 41,7 % en la SG.
Al finalizar los experimentos, los tumores se analizaron en busca de infiltrados inflamatorios. El análisis inmunohistoquímico mostró de manera sistemática una infiltración extensa de linfocitos T CD3+ en tumores de ratones vacunados con AMHR2-CD (figura 5A). No se observaron infiltrados en tumores de ratones inmunizados con CFA solo. El análisis por citometría de flujo de TIL mostró un aumento pronunciado de linfocitos T CD4+ en tumores de ratones vacunados con AMHR2-CD en comparación con ratones de control inmunizados con CFA solo (40,7 % frente a 11,7 %; figura 5b). No se produjeron aumentos sustanciales de linfocitos T CD8+ en los tumores en los ratones inmunizados con AMHR2-CD en comparación con los ratones de control inmunizados con CFA (10,5 % frente a 7,4 %, respectivamente). A continuación, se analizó el ARN tumoral para determinar la expresión génica de factores proinflamatorios mediante qRT-PCR. En comparación con los tumores de ratones de control inmunizados con CFA, los tumores de ratones inmunizados con AMHR2-CD mostraron de manera sistemática una expresión génica relativa significativamente aumentada (P <0,05 en todos los casos) para CD4, IFNy, TNFa e IL-2 pero no para CD8 (figura 5C). Estos datos indican la inducción de un medio inmunitario proinflamatorio dentro del tumor ID8 después de la inmunización con AMHR2-CD.
Ejemplo 5: Transferencia pasiva de inmunidad tumoral con linfocitos CD4+
Todos los ratones receptores se inocularon con células de tumor ID8 el día después de la transferencia celular. El crecimiento tumoral se inhibió significativamente en ratones transferidos con LNC (P = 0,04; figura 6A) y esplenocitos (P <0,01 específicos de AMHR2-CD; figura 6B) en comparación con ratones que recibieron LNC específicas de OVA. A los 190 días después de la transferencia de esplenocitos sensibilizados y la inoculación del tumor, los pesos tumorales medios fueron significativamente más bajos en los receptores de esplenocitos específicos de AMHR2-CD en comparación con los receptores de esplenocitos específicos de OVA (P <0,05; figura 6C). La transferencia de linfocitos T CD4+ específicos de AMHR2-CD purificados a partir de esplenocitos sensibilizados de 4 semanas dieron como resultado una inhibición significativa del crecimiento de tumores ID8 en comparación con la transferencia de linfocitos T CD4+ específicos de OVA purificados (P <0,0004; figura 6D) mientras que la transferencia de linfocitos B B220+ sensibilizados con AMHR2-CD purificados a partir de esplenocitos sensibilizados durante 4 semanas no inhibieron significativamente el crecimiento de tumores ID8 en comparación con la transferencia de linfocitos B B220+ sensibilizados con OVA (P = 0,07; figura 6D). Por lo tanto, los linfocitos T CD4+ proinflamatorios específicos de AMHR2-CD son suficientes para transferir protección inmunitaria contra el crecimiento de EOC.
Ejemplo 6: Expresión en tejido de AMHR2 humano
Se examinó la base de datos del atlas de proteínas humanas para determinar la expresión relativa del gen AMHR2 en treinta tejidos humanos. Como se observa en la figura 7, se observó que la expresión del gen AMHR2 estaba por encima del fondo en solo cinco de los treinta tejidos, observando la expresión más alta en el ovario.
Hay varias variantes de AMHR2 de corte y empalme conocidas, codificando las diversas variantes de corte y empalme diferentes porciones de AMHR2. A continuación, se examinó el atlas de proteínas humanas para determinar el nivel de expresión de los diferentes exones de AMHR2 en los cinco tejidos en los que se observó la expresión del gen AMHR2. Como se observa en la figura 8, la expresión de los exones que codifican el dominio extracelular de AMHR2 se limitó exclusivamente al ovario. Se utilizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para mostrar que la expresión de AMHR2-ED está limitada al ovario humano normal y no se expresa en las glándulas suprarrenales o el páncreas humanos (figura 8B). Además, como se observa en la figura 8D, los ovarios postmenopáusicos humanos (media 64 años; intervalo 52-95 años) y los ovarios de ratones mayores (nueve meses de edad) tienen niveles bajos de expresión de AMHR2-ED en comparación, respectivamente, con los ovarios humanos premenopáusicos (media 31 años; intervalo 27-45 años) y con los ovarios de ratones jóvenes (6 semanas de edad). Por otra parte, todos los tumores de EOC humanos que se examinaron mostraron un alto nivel de expresión de ambos transcritos de AMHR2-ED (según se evaluó por qRT-PCR; figura 8E) y proteína (según se evaluó mediante análisis de transferencia Western; figura 8F). Por lo tanto, los niveles de expresión de ambos dominios disminuyen con la edad en ovarios normales, reduciendo la probabilidad de incluso ooforitis transitoria en la vacunación de mujeres postmenopáusicas con polipéptidos AMHR2.
Se utilizó RT-PCR en tiempo real para confirmar que el dominio extracelular de AMHR2 se expresaba en ovario humano normal, pero no en el dominio extracelular (figura 9A).
A continuación, se probó si el dominio extracelular de AMHR2 se expresaba en EOC. Cuando se probaron cinco EOC mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo específico para el dominio extracelular de AMHR2, la expresión del dominio extracelular se observó en todas las muestras (figura 9B).
Ejemplo 7: Generación de AMHR2-ED de ratón recombinante
Se expresó el dominio extracelular de AMHR2 de ratón compuesto por los 140 aminoácidos aminoterminales de la proteína AMHR2 (figura 10A). La proteína carboxiterminal etiquetada con 6xHis purificada por afinidad con Ni-NTA migró como una proteína de -17 kD como se determinó por tinción con azul de Coomassie de un gel SDS-PAGE y por inmunotinción de transferencia Western utilizando anticuerpo específico de His conjugado con HRP (figura 10B). Un mes después de la vacunación con AMHR2-ED de ratones C57BL/6 hembra jóvenes de 6 semanas de edad, el análisis ELISPOT mostró frecuencias elevadas de linfocitos T específicas de antígeno productores de IFNy en esplenocitos a una media de 1 por cada 3.831 esplenocitos, e IL-17 a una media de 1 por 21.739 esplenocitos, pero no IL-5 (figura 10C).
Los linfocitos T proinflamatorios que respondían a AMHR2-ED eran predominantemente linfocitos T CD4+ pero también incluían linfocitos T CD8+ que producían IFNy (figura 10D) e IL-17 (figura 10E). Cuatro meses después de la vacunación con AMHR2-ED, las respuestas de anticuerpos IgG en suero contra AMHR2-ED fueron detectables a diluciones de hasta 1/50.000 (figura 10F) y consistieron de forma predominante en isotipos IgG1 e IgG2b (figura 10G). AMHR2-ED fue altamente inmunogénico en varias cepas de ratones que mostraban haplotipos del complejo mayor de histocompatibilidad completamente divergentes, incluyendo C57BL/6 (H-2b), BALB/c (H-2d), A/J (H-2a) y FVBN/J (H-2q) en los que los esplenocitos secretores de IFNy alcanzaron frecuencias un mes después de la vacunación con medias de 1 por 4.310, 1 por 4.425, 1 por 8.772 y 1 por 10.000, respectivamente (figura 10H).
Ejemplo 8: inmunogenicidad de AMHR2-ED
La inmunogenicidad de AMHR2-ED se determinó mediante la inmunización de ratones transgénicos TgMlSIIR-TAg (línea DR26) hembra con AMHR2-ED en CFA. Cuatro semanas después de la inmunización, los esplenocitos de AMHR2-ED mostraron respuestas proliferativas de recuerdo específicas de antígeno a AMHR2-ED, pero no a pcaseína de ratón recombinante, un antígeno de control que no tiene nada que ver generado y purificado de una manera similar a AMHR2-ED (figura 11A). Por el contrario, los esplenocitos de ratones inmunizados con CFA no respondieron ni a AMHR2-ED ni a p-caseína (figura 11B). El análisis ELISA de los sobrenadantes de cultivo mostró una producción activada por AMHR2-ED de niveles altos de las citocinas proinflamatorias IFNy e IL-17, y una producción mínima de la citocina reguladora de tipo 2, IL-5 (figura 11C). Los esplenocitos de ratones inmunizados con AMHR2-ED mostraron frecuencias significativamente altas de linfocitos T proinflamatorios de tipo 1 (-1/4.000 linfocitos; p<0,0001) y de tipo 17 (-1/20.000 linfocitos; p<0,02) pero frecuencias mínimas de linfocitos T reguladores de tipo 2 que expresan IL-5 (figura 11D). Cuatro meses después de la inmunización con AMHR2-ED, los títulos séricos de IgG específica de AMHR2-ED aún eran detectables a títulos superiores a 1/50.000 diluciones (p <0,001, figura 11E). Estos resultados indican que AMHR2-ED es altamente inmunogénico.
Para evaluar más a fondo la naturaleza de la respuesta inmunitaria generada por la vacunación con AMHR2-ED, se inmunizaron ratones transgénicos TgMlSIIR-TAg hembra con AMHR2-ED a 25 pg/ml o 50 pg/ml. Un mes después de la vacunación, se recogieron los bazos y se detectó la expresión de IFNy e IL-17. Como se observa en la figura 12A-B, los esplenocitos y los linfocitos T CD4 pero no los CD8+ purificados, aislados un mes después de la inmunización con AMHR2-ED, mostraron una inducción específica de antígeno importante de linfocitos T proinflamatorios de tipo 1 y tipo 17. El análisis inmunohistoquímico de EOC autóctono tomado de ratones TgMISIIR-Tag hembra de 7 meses de edad que se inmunizaron a las 6 semanas de edad con AMHR2-ED mostró una infiltración predominante de linfocitos T CD3+ y linfocitos T CD4+, pero no de linfocitos T CD8+ (figura 12C-D).
Ejemplo 9: La inmunización con AMHR2-ED no afecta la fertilidad
Se examinó el nivel de inflamación de los ovarios después de la inmunización con AMHR2-ED. Se recogieron ovarios de ratones cuatro semanas y 8 semanas después de la inmunización con AMHR2-ED y se analizaron por RT-PCR. Como se observa en la figura 13, los ovarios recogidos mostraron expresión de la citocina inflamatoria IL-1p a las cuatro semanas, pero no a las ocho semanas después de la inmunización. La expresión de IFNy no se elevó en ningún momento después de la inmunización. Por el contrario, no se produjo una expresión génica elevada para IL-1p o IFNy en ovarios de ratones C57BL/6 hembra de 9 meses de edad 4 semanas después de la vacunación con AMHR2-ED (figura 13C).
A continuación, se examinó la fertilidad de los ratones inmunizados con AMHR2-ED. Como se observa en la figura 14, la función ovárica medida por la fertilidad durante cuatro ciclos de apareamiento no se vio afectada por la inmunización con AMHR2-ED. Específicamente, no se detectaron diferencias significativas en el número medio de crías por camada o en los pesos medios de las crías al nacer entre los ratones inmunizados con AMHR2-ED en CFA o los ratones de control inmunizados con CFA solo.
Ejemplo 10: La inmunización con AMHR2-ED inhibe el crecimiento de tumores de cáncer de ovario
Se probó la capacidad de la vacunación con AMHR2-ED para inhibir el crecimiento de tumores ováricos autóctonos y trasplantables. Como se observa en la figura 15A-B, la vacunación profiláctica con AMHR2-EC de ratones transgénicos TgMlSIIR-TAg hembra a las 6-7 semanas de edad dio como resultado una inhibición altamente significativa en el crecimiento de EOC autóctono (p <0,0001) y un 42 % más de supervivencia general en comparación con los ratones de control vacunados con CFA solo (media 193,7 ± 34,5 días frente a media 135 ± 13,89 días). Se produjo una inhibición significativa similar en el crecimiento de tumores de EOC TgMISIIR trasplantables en ratones vacunados bien 7 o 15 días antes de la inoculación con 3x106 células de carcinoma de ovario de ratón (MOVCAR) (p <0,001; figura 15C-D).
De manera similar, la vacunación profiláctica con AMHR2-ED de ratones transgénicos TgMISIIR-TAg (DR26) de 6-7 semanas de edad retrasó significativamente la aparición y el crecimiento de EOC autóctono en comparación con los ratones de control vacunados con CFA solo (P <0,001; figura 15E). Esta inhibición en la aparición y el crecimiento de EOC autóctono dio como resultado un aumento de la supervivencia general del 42 % altamente significativo (P <0,0001) en comparación con los ratones de control vacunados con CFA solo (media de 194 ± 35 días frente a una media de 135 ± 14 días, respectivamente; figura 15F). La vacunación con AMHR2-ED también fue eficaz para proporcionar una inmunoterapia altamente significativa contra el EOC en ratones transgénicos TgMISIIR-TAg (DR26) con EOC autóctono en crecimiento establecido (P <0,0001; figura 15G). El análisis inmunohistoquímico de EOC autóctono de ratones TgMISIIR-TAg (DR26) vacunados con AMHR2 mostró de manera sistemática infiltrados importantes de linfocitos T CD3+ (figura 15H, grupo superior izquierdo) y linfocitos T CD4+ (figura 15H, grupo superior medio) con linfocitos T CD8+ ocasionales (figura 15H, grupo superior derecho). El EOC inmunoteñido correspondiente de los ratones de control vacunados con CFA solo, no mostró de manera sistemática infiltrados de linfocitos T detectables (figura 3f, grupos inferiores).
Ejemplo 11: La transferencia de linfocitos T y linfocitos B sensibilizados con AMHR2-ED inhibe el crecimiento de tumores de cáncer de ovario
Se probó el efecto de la transferencia de linfocitos T CD4+ y de linfocitos B B220+ sensibilizados con AMHR2-ED sobre el crecimiento de tumores de EOC. Como se observa en la figura 16, la inhibición del crecimiento de EOC con MOVCAR se produjo después de la transferencia de linfocitos T CD4+ o linfocitos B B220+ de ratones inmunizados con AMHR2-ED. Es más, como se observa en la figura 17, la transferencia de linfocitos T CD4+ o linfocitos B220+ de ratones inmunizados con AMHR2-ED también aumentó la supervivencia general en ratones portadores de tumores MOVCAR que recibieron células. La transferencia de células a receptores sin tratamiento previo y la inoculación de EOC con MOVCAR se produjeron con un día de diferencia entre sí. Adicionalmente, como se observa en la figura 18, la inhibición del crecimiento de los tumores de EOC ID8-VEGF se produjo en ratones que recibieron linfocitos T CD4+ (grupo superior izquierdo) o sueros (grupo inferior izquierdo) de ratones inmunizados con AMHR2-ED. Se produjo una mayor supervivencia general en ratones que recibieron linfocitos T CD4+ (grupo superior derecho) o sueros (grupo inferior derecho) de ratones inmunizados con AMHR2-ED. La transferencia de células a receptores sin tratamiento previo y la inoculación de EOC con ID8-VEGF se produjeron con un día de diferencia entre sí. Los asteriscos indican significación.
Ejemplo 12: Transferencia pasiva de inmunidad tumoral con linfocitos T CD4+, linfocitos B B220+ e IgG
Se probó la identidad de la población inmunitaria que explicaba la inhibición del crecimiento de tumores de EOC. Se encontró que la transferencia de linfocitos T CD4+ sensibilizados con AMHR2-ED a ratones TgMISIIR-TAg hembra (inferior) un día antes de la inoculación de MOVCAR dio como resultado una inhibición altamente significativa del crecimiento tumoral (P <0,0001; figura 20A) y supervivencia general mejorada (P <0,006; figura 20B) en comparación con ratones que recibieron linfocitos T CD4+ sensibilizados con ovoalbúmina. Por otra parte, la transferencia de linfocitos B B220+ sensibilizados con AMHR2-ED a ratones TgMISIIR-TAg hembra (inferior) un día antes de la inoculación de MOVCAR también medió una inhibición significativa del crecimiento tumoral (P <0,0001; figura 20C) y supervivencia general mejorada (P <0,009; figura 20D) en comparación con ratones que recibieron linfocitos B B220+ de ratones inmunizados con ovoalbúmina. Además, la transferencia de IgG purificada por afinidad de ratones inmunizados con AMHR2-ED a ratones TgMISIIR-TAg hembra (inferior) un día antes de la inoculación de MOVCAR dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral (P <0,0001; figura 20E) y supervivencia general mejorada (P <0,002; figura 20F) en comparación con ratones que recibieron IgG purificada por afinidad de ratones inmunizados con ovoalbúmina.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica para su uso en un método de tratamiento y/o de prevención de un tumor de cáncer de ovario, que expresa AMHR2, a través de la inducción de una respuesta inmunitaria contra el receptor de la hormona antimulleriana de tipo II (AMHR2) en un sujeto, en donde:
(a) la composición inmunogénica comprende un polipéptido AMHR2, que comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos, que son al menos un 80 % idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2: en donde la secuencia de AMHR2 se establece en el SEQ ID NO: 1;
(b) la composición inmunogénica provoca una respuesta inmunitaria específica para una proteína AMHR2, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1; y
(c) la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra células de cáncer de ovario, que expresan AMHR2 en el sujeto.
2. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la respuesta inmunitaria comprende además la inducción de una respuesta de linfocitos B contra células de cáncer de ovario, que expresan Am Hr 2 en el sujeto.
3. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la respuesta de linfocitos B comprende una respuesta de anticuerpos IgG específicos de AMHR2 en el sujeto.
4. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que los al menos 100 aminoácidos consecutivos son al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, y más preferentemente al menos un 95 % idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2.
5. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la que los al menos 100 aminoácidos consecutivos son idénticos a una secuencia de aminoácidos en el dominio extracelular de AMHR2, preferentemente, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de AMHR2.
6. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición inmunogénica comprende un adyuvante, preferentemente en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en: Adyuvante 65, a-GalCer, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, fosfato cálcico, péptido de p-glucano, ADN CpG, g M-CSF, GPI-0100, IFA, IFN-y, IL-17, lípido A, lipopolisacárido, Lipovant, Montanide, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina, Pam3CSK4, poli-IC, quil A, dimicolato de trehalosa y zimosán.
7. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el adyuvante es uno que induce una respuesta inmunitaria mixta de tipo 1/tipo 17.
8. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el tumor de cáncer de ovario, que expresa AMHR2, es un tumor de cáncer de ovario primario.
9. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el tumor de cáncer de ovario, que expresa AMHR2, es un tumor de cáncer de ovario metastásico.
10. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el tumor de cáncer de ovario, que expresa AMHR2, es un tumor de cáncer de ovario epitelial (EOC).
11. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la composición inmunogénica es para la administración al sujeto en múltiples dosis.
12. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el sujeto se ha sometido a una cirugía para extirpar al menos parte de un tumor de cáncer de ovario.
13. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el polipéptido AMHR2 comprende una o más sustituciones conservativas, pero sigue provocando una respuesta inmunitaria específica para una proteína AMHR2, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1.
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