PT1855707E - Péptidos de epítopo derivados de receptor de factor de crescimento endotelial vascular 1 e vacinas contendo estes péptidos - Google Patents

Description

ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Péptidos de epitopo derivados de receptor de factor de crescimento endotelial vascular 1 e vacinas contendo estes péptidos"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a péptidos que são extremamente eficazes como vacinas para o cancro, e a fármacos para tratamento e prevenção de tumores, que contêm estes péptidos.

ANTECEDENTES DO INVENTO 0 crescimento de tumores está geralmente limitado a 1~2 mm3 na ausência de um fornecimento de sangue vascularizado, e a angiogénese tem um papel crítico na invasão, crescimento e metástase de tumores (Folkman, J. (2002) Semin. Oncol. 29: 15-8., Folkman, J. (1996) Nat. Med. 2: 167-8., Kerbel e

Folkman, (2002). Nature Rev. Câncer. 2: 727-39., Brown et al., (1995) Hum. Pathol. 26: 86-91., Eberhard et al., (2000) Câncer Res. 60: 1388-93.). Foi também mostrado que a inibição da angiogénese do tumor está associada à supressão da progressão do tumor. De modo a conseguir a supressão da angiogénese, vários investigadores têm examinado estratégias terapêuticas dirigidas ao factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e ao receptor de VEGF (VEGFR) , que desempenham papéis críticos na regulação do processo de angiogénese. Estes estudos têm mostrado que o crescimento do tumor pode ser suprimido com sucesso in vitro e in vivo utilizando anticorpos monoclonais, receptores recombinantes ou inibidores da transdução de sinal (El-Mousawi et al., (2003) J. Biol. Chem. 278: 46681-91., Stefanik et al., (2001) J. Neurooncol. 55: 91-100., Wood et al., (2000) Câncer Res. 60: 2178-89., Luttun et al., (2002) Nat. Med. 8: 831-40.,

Lyden et al., (2001) Nat. Med. 7: 1194-201., Lu et al., (2001) Câncer Res. 61: 7002-8.). No entanto, estas estratégias requerem administração frequente ou contínua dos reagentes com níveis de dose relativamente elevados, o que pode estar associado a inconvenientes e a efeitos adversos significativos. 2 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ Ο VEGF liga-se a dois receptores de tirosina-quinase relacionados, VEGFR1 (Flt-1) e VEGFR2 (KDR), que são fortemente expressos em células endoteliais em tecido de tumor mas não em tecido normal (Risau, W. (1997) Nature. 386: 671-4., Ferrara e Davis-Smyth, (1997) Endor. Rev. 18: 4-25., Shibuya et al., (1999) Curr. Topics. Microbiol. Immunol. 237: 59-83., Plate et al., (1994) Int. J. Câncer. 59: 520-9.). O VEGFR1 foi o primeiro receptor de VEGF a ser identificado (Shibuya et al., (1990) Oncogene 5: 519-24.), e interage com VEGF (VEGF-A) e com dois outros membros da família VEGF, VEGF-B (Olofsson et ai., (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 2576-81.) e factor de crescimento de placenta (P1GF) (Maglione et ai., 1991. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9267-71.) . Ao deslocar VEGF de VEGFR1, é de esperar que o P1GF disponibilize mais VEGF para se ligar e activar VEGFR2 e desse modo potenciar a angiogénese conduzida por VEGF (Park et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 25646-54.). Outros estudos mostraram que existe um sinergismo entre VEGF e P1GF In vivo, especialmente durante situações patológicas, como evidenciado por tumorigénese enfraquecida e derrame vascular em ratinhos P1GF-/- (Carmeliet et al., (2001) Nat. Med. 7: 575-83.).

Na US2005/0175624 Al, foram realizadas análises de computador para prever a utilidade de fragmentos de VEGFR1 em imunoterapia. Porém, nenhum destes fragmentos mostrou induzir uma resposta imunitária.

Relatos recentes mostraram que a vacinação utilizando ADNc ou proteína recombinante de VEGFR2 de ratinho está associada a efeitos antitumor significativos em modelos de tumor em ratinho (Li et al., (2002) J. Exp. Med. 195: 1575-84., Niethammer et al., (2002) Nat. Med. 8: 1369-75.). Mas estes resultados não podem garantir directamente a aplicação clínica desta estratégia, uma vez que estes utilizaram o homólogo de ratinho de VEGFR2 humano em sistemas de ratinho, que são considerados significativamente diferentes do correspondente humano. 3 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Abreviaturas utilizadas no presente pedido: CTL, linfócito T citotóxico VEGF, factor de crescimento endotelial vascular P1GF, factor de crescimento de placenta VEGFR1, receptor 1 de factor de crescimento endotelial vascular VEGFR2, receptor 2 de factor de crescimento endotelial vascular TGM, ratinhos transgénicos TAA, antigénio associado a tumor i.d., injecção intradérmica s.c., injecção subcutânea IFA, adjuvante de FREUND incompleto

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona péptidos que induzem células T citotóxicas contra células endoteliais expressando endogenamente VEGFR1. 0 presente invento proporciona particularmente: 1. Um péptido com menos de 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, onde o péptido possui indutibilidade de células T citotóxicas.

2. Um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, onde o péptido consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, onde 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos ou acrescentados e onde o péptido não é NLTATLAVNV. 3. Uma composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese ou tumores, onde a composição compreende um ou mais péptidos seleccionados entre o grupo consistindo de: (a) um péptido com menos de 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 ou 13, onde o péptido possui indutibilidade de células T citotóxicas; e 4 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

(b) um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, onde o péptido consiste da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 ou 13, onde 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos ou acrescentados; ou um polinucleótido codificando o referido péptido. 4. Uma vacina para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese, onde a vacina compreende um ou mais péptidos seleccionados entre o grupo consistindo de: (a) um péptido com menos de 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 ou 13, onde o péptido possui indutibilidade de células T citotóxicas;

(b) um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, onde o péptido consiste da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 ou 13, onde 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos ou acrescentados; e (c) um péptido consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; ou um polinucleótido codificando o referido péptido como o ingrediente activo. 5. Uma composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese, onde a composição compreende um ou mais péptidos seleccionados entre o grupo consistindo de: (a) um péptido com menos de 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, onde o péptido possui indutibilidade de células T citotóxicas; e (b) um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, onde o péptido consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, onde 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos ou acrescentados.

Os péptidos aqui descritos compreendem uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 1, 2, 13 ou uma sequência onde 1, 2 ou vários aminoácidos estão substituídos ou acrescentados. Em certas concretizações, o segundo aminoácido a partir do terminal N é leucina ou metionina. Em algumas concretizações, o aminoácido C-terminal é valina ou leucina. 5 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ Ο presente invento proporciona adicionalmente composições farmacêuticas para utilização no tratamento ou prevenção de tumores, onde a composição compreende os péptidos do invento. 0 presente invento proporciona exossomas que apresentam sobre a sua superfície um complexo compreendendo o péptido deste invento e um antigénio de HLA. Em algumas concretizações, o antigénio de HLA é HLA-A24 (e.g., HLA A2402) ou HLA-AO2 (HLA-0201). São também descritos métodos para induzir células de apresentação de antigénio possuindo elevada indutibilidade de células T citotóxicas e métodos para induzir células T citotóxicas compreendendo administrar os péptidos do invento a um paciente. Em algumas concretizações, os métodos podem compreender transferir um gene compreendendo um polinucleótido codificando o péptido do invento para células de apresentação de antigénio. 0 invento descreve células T citotóxicas isoladas e células de apresentação de antigénio que são induzidas pelos métodos aqui descritos. 0 presente invento descreve células de apresentação de antigénio, que compreendem um complexo formado entre um antigénio de HLA e o péptido aqui descrito. 0 presente invento proporciona também vacinas para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese, onde a vacina compreende o péptido do invento como o ingrediente activo. A vacina do invento pode ser destinada para administração a um sujeito cujo antigénio de HLA é HLA-A24 ou HLA-A02. Em algumas concretizações, a vacina pode ser utilizada para suprimir o crescimento e/ou a metástase de tumores malignos. São também aqui descritos métodos de tratamento ou prevenção de tumores num sujeito compreendendo administrar ao referido sujeito uma vacina compreendendo um péptido aqui descrito ou um fragmento imunologicamente activo, ou um polinucleótido codificando o péptido. São também aqui descritos métodos de tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese num sujeito 6 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ compreendendo a administração de uma vacina do invento. Em algumas concretizações, a doença mediada por angiogénese é retinopatia diabética, artrite reumatóide crónica, psoriase ou aterosclerose.

Deve ser entendido que tanto o resumo anterior do invento como a descrição detalhada seguinte são de uma concretização preferida, e não restritivos do invento ou de outras concretizações alternativas do invento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um gráfico mostrando o estabelecimento de clones de CTL restringidos a HLA-A*0201 utilizando candidatos de epitopo derivados de VEGFR1. A citotoxicidade de cada clone de CTL contra células T2 pulsou a ligação de cada péptido de epitopo com HLA-A*0201. Utilizaram-se células T2 para respostas de CTL na presença ou ausência de cada péptido. Os clones de CTL mostraram citotoxicidades especificas contra as células alvo pulsadas com os péptidos correspondentes. A razão E/T indica efector/célula alvo. A Figura 2 é um gráfico mostrando o estabelecimento de clones de CTL restringidos a HLA-A*2402 utilizando candidatos epitópicos derivados de VEGFR1. Utilizaram-se células A24-LCL para respostas de CTL restringidas a HLA-A*2402 na presença ou ausência da ligação de cada péptido com HLA-A*2402. Os clones de CTL mostraram citotoxicidades especificas contra as células-alvo pulsadas com os péptidos correspondentes. A razão E/T indica efector/célula alvo. A Figura 3 é um gráfico mostrando a citotoxicidade contra células expressando VEGFR1 endogenamente. 0 clone de CTL HLA-A*2402 foi examinado quanto à citotoxicidade contra células expressando VEGFR1 (AGl-Gl-Flt-1) e controlo (AG1-G1) com um ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas. Estes clones de CTL mostraram as citotoxicidades contra AGl-Gl-Flt-1, mas não contra AG1-G1. A razão E/T indica efector/célula alvo. A Figura 4 é um gráfico mostrando os resultados da resposta de CTL in vivo associada à vacinação utilizando péptidos de epitopo de VEGFR1 por ensaio ELISPOT de IFN-γ. 7 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ Péptidos conjugados com IFA foram injectados i.d. em TGM A2/Kb ao dia 0 e ao dia 11. Ao dia 21, utilizaram-se esplenócitos dos ratinhos vacinados como as células respondentes, e utilizaram-se células T2 pulsadas com ou sem péptidos como as células estimuladoras para o ensaio ELISPOT. A produção especifica de IFN-γ para o péptido correspondente foi observada nos ratinhos vacinados com péptidos VEGFR1-1087, -770, -417. (razão E/T ratio: x20). A Figura 5 é um gráfico mostrando os resultados da inibição in vivo de angiogénese induzida por tumor. As respostas angiogénicas induzidas por células MC38 em TGM A2/Kb. Os ratinhos foram vacinados duas vezes com HBSS, IFA sozinho, e péptido de VEGFR1 conjugado com IFA (VEGFR1-1087, -770, -417). As diferenças foram visíveis macroscopicamente nas câmaras implantadas removidas da fáscia s.c. de ratinhos vacinados. Quantificação de vasos recém-formados na resposta angiogénica. Foi observada inibição significativa de angiogénese induzida por tumor em ratinhos vacinados com péptidos VEGFR1-1087, -770, -417. A barra de erro indica s.e. A Figura 6 é um gráfico mostrando os resultados do efeito antitumor in vivo. TGM A2/Kb foram inoculados i.d. com células MCA205. Foram vacinados com HBSS, IFA sozinho e IFA conjugado com péptidos VEGFR1-1087, -770, -417, 4 dias e 11 dias mais tarde (a seta indicada). Observou-se supressão significativa de crescimento do tumor com a vacinação utilizando péptidos VEGFR1-1087, -770 conjugados com IFA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

As palavras "um", "uma", "o" e "a" como aqui utilizadas significam "pelo menos um" a não ser que indicado especificamente. A angiogénese tem mostrado ser um mecanismo crítico para a progressão de tumores. Múltiplos estudos têm sugerido que o crescimento do tumor pode ser suprimido se a angiogénese do tumor puder ser inibida utilizando vários tipos de agentes antiangiogénicos. No presente invento, examinámos a possibilidade do desenvolvimento de uma nova imunoterapia dirigida a VEGFR1. Identificámos os epítopos de péptido de 8 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ VEGFR1 a partir de HLA-A2 e A24, e estabelecemos com sucesso clones de CTL com potente citotoxicidade contra células endoteliais expressando endogenamente VEGFR1. Em ratinhos transgénicos A2/Kb, a vacinação utilizando estes péptidos de epitopo in vivo estava associada a supressão significativa de crescimento do tumor num modelo terapêutico. Num ensaio antiangiogénese, a angiogénese induzida pelo tumor foi significativamente suprimida com a vacinação. Estes resultados in vitro e in vivo sugerem fortemente que o VEGFR1 poderá ser um alvo promissor, e suportam a justificação definitiva do desenvolvimento clinico de imunoterapia antiangiogénica contra vários tipos de cancros.

No presente invento, examinámos a eficácia desta nova imunoterapia em sistemas estreitamente relacionados com cenários clínicos. Identificámos os péptidos de epitopo de VEGFR1 humano restringidos a HLA-A*0201 e A*2402 (Rammensee et al., 1995. Immunogenetics. 41: 178-228.) e mostrámos que CTLs induzidos com estes péptidos têm citotoxicidade potente e específica, não apenas contra células alvo pulsadas com péptido mas também contra células alvo expressando endogenamente VEGFR1, de um modo restringido a HLA de classe I. Adicionalmente, examinámos os efeitos antitumor in vivo da vacinação com estes péptidos de epitopo utilizando um modelo de ratinho único que pode ser transferido directamente para o cenário clínico. O nosso sistema modelo utiliza ratinhos transgénicos A2/Kb (TGM), que mostraram ser úteis para a análise de epítopos de CTL humanos. Existe uma concordância de aproximadamente 71% entre humanos e TGM A2/Kb no reportório de CTL (Wentworth et ai., (1996) Eur. J. Immunol. 26: 97-101.). Para construir sistemas de tumor, transplantámos células de tumor de ratinho singénico que foram induzidas quimicamente em ratinhos C57BL/6 (H-2Kb) não expressando moléculas HLA-A*0201. Este sistema de tumor, combinando TGM A2/Kb e a linha de células de ratinho H-2Kb, oferece um cenário único. Dado que as células endoteliais em TGM A2/Kb expressam a molécula HLA-A*0201, os CTLs induzidos por vacinação utilizando péptidos de epitopo de VEGFR1 reconhecem células endoteliais que expressam ambas as moléculas HLA-A*0201 e VEGFR1. Assim, efeitos antitumor in vivo de uma vacina antiangiogénica podem ser avaliados de um modo relacionado com HLA-A*0201. No entanto, estes não 9 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ reconhecem células de tumor mesmo se estas expressarem VEGFR1 porque estas não expressam HLA-A*0201. Neste modelo de tumor in vivo, a vacinação utilizando estes péptidos de epítopo estava associada com supressão significativa do crescimento do tumor. Num ensaio antiangiogénese, a angiogénese induzida por tumor foi significativamente suprimida com vacinação utilizando estes péptidos de epítopo. Estes resultados mostram que a vacinação utilizando péptidos de epítopo derivados de VEGFR1 induz uma resposta imunitária antitumor. A identificação dos antigénios associados ao tumor (TAAs) possibilitou o desenvolvimento clínico de vacinas para 0 cancro baseadas em péptidos, que poderiam induzir CTLs e a lise de células de tumor de um modo restringido a HLA classe 1 (Bruggen et al., (1991) Science. 254: 1643-7., Boon et al., (1996) J. Exp. Med. 183: 725-9., Rosenberg et al., (1998)

Nat. Med. 4: 321-7., Butterfield et al., (1999) Câncer Res. 59: 3134-42.). Múltiplos ensaios clínicos utilizando péptidos TAA reportaram que foram observadas regressões de tumor nos pacientes de melanoma (Rosenberg et al., (1998) Nat. Med. 4: 321-7. Nestle et al., (1998) Nat. Med. 4: 328-32., Thurner et al., (1999) J. Exp. Med. 190: 1669-78., Belli et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20: 4169-80., Coulie et al., (2002) Immunol. Rev. 188: 33-42.). Foi sugerido que a eficácia clínica poderia ser conseguida por perda ou regulação descendente de moléculas de HLA classe I nas células de tumor (Cormier et al., (1998) Int. J. Câncer. 75: 517-24., Paschen et al., (2003) Int. J. Câncer. 103: 759-67., Fonteneau et al., (1997) J. Immunol. 159: 2831-9. Reynolds et al., (1998) J. Immunol. 161: 6970-6.). Estimou-se que a frequência de tumores mostrando alguma alteração na expressão de moléculas de HLA classe I era superior a 40% (Cormier et al., (1998) Int. J. Câncer. 75: 517-24., Paschen et al., (2003) Int. J. Câncer. 103: 759-67.). Assim, uma parte significativa das células de tumor poder-se-ia escapar dos CTLs específicos para o epítopo da classe I, mesmo se os CTLs pudessem ser induzidos com sucesso por uma vacina para o cancro dirigida às próprias células de tumor. O desenvolvimento de vacinas eficazes contra células endoteliais envolvidas em angiogénese do tumor é uma abordagem alternativa. As células endoteliais são geneticamente estáveis, não exibem regulação descendente de moléculas de HLA classe I, e estão criticamente envolvidas na 10 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ progressão de uma variedade de tumores. Para além disso, os CTLs poderiam directamente causar danos nas células endoteliais sem penetrar em qualquer outro tecido, e a lise, mesmo de pequenos números de células endoteliais na vasculatura do tumor, pode resultar na destruição da integridade dos vasos conduzindo a inibição de grandes números de células de tumor (Folkman, J. (1995) Nat. Med. 1: 27-31.). Por conseguinte, as células endoteliais são um bom alvo para a imunoterapia do cancro. Para especificamente e eficientemente prevenir a angiogénese do tumor com resposta de CTL, é necessário seleccionar o alvo apropriado entre as moléculas relacionadas com a angiogénese. O VEGF liga-se a dois receptores de tirosina-quinase, VEGFR1 (Flt-1) e VEGFR2 (KDR), que são fortemente expressos em células endoteliais em tecido de tumor mas não em tecido normal (Risau, W. (1997) Nature. 386: 671-4., Shibuya et al., (1999) Curr. Topics. Microbiol. Immunol. 237: 59-83., Plate et al., (1994) Int. J. Câncer. 59: 520-9.). A supressão destes receptores mostrou efeitos antitumor incluindo anticorpo neutralizante, receptores recombinantes ou inibidores de quinase (El-Mousawi et al., (2003) J. Biol. Chem. 278: 46681-91., Stefanik et al., (2001) J. Neurooncol. 55: 91-100., Wood et al., (2000) Câncer Res. 60: 2178-89., Luttun et al., (2002) Nat. Med. 8: 831-40., Lyden et al., (2001) Nat. Med. 7: 1194-201., Lu et al., (2001) Câncer Res. 61: 7002-8.). Anticorpos neutralizantes anti-VEGFRl atenuaram eficientemente o crescimento do tumor e a neovascularização de um modo dependente da dose (Luttun et al., (2002) Nat. Med. 8: 831-40.). Adicionalmente, o tratamento de combinação com reagentes bloqueando ambos os receptores VEGFR1 e VEGFR2, ou a utilização de um anticorpo bifuncional ("diacorpo") contra VEGFR1 e VEGFR2, como tais estratégias, resultaram numa inibição mais forte do crescimento dos vasos do que a monoterapia com um único anticorpo ou com o anticorpo parental monofuncional (Lyden et al., (2001) Nat. Med. 7: 1194-201., Lu et al., (2001) Câncer Res. 61: 7002-8.).

No presente invento, utilizando os nossos novos sistemas modelo in vitro e in vivo, demonstrámos que uma imunoterapia dirigida à angiogénese induzida por tumor é eficaz. Primeiramente, identificámos os péptidos de epítopo de VEGFR1 11 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ restringidos a HLA-A*0201 e A*2402 que são alelos de HLA reconhecidos frequentemente (Rammensee et al., (1995) Immunogenetics. 41: 178-228.). Os CTLs foram induzidos com sucesso com estes péptidos, e mostraram actividades citotóxicas potentes, não apenas contra células alvo pulsadas com péptido mas também contra células expressando VEGFR1 endogenamente. As nossas constatações demonstraram claramente que o VEGFR1 de humano é imunogénico no sistema humano.

Depois, demonstrámos efeitos antitumor in vivo utilizando múltiplas linhas de células de tumor e TGM A2/Kb, um bom sistema modelo para avaliar respostas imunitárias em humanos contra células de tumor com a perda de expressão de HLA classe I. Foi mostrado que existe aproximadamente 71% de concordância entre o reportório de CTL de humanos e de TGM A2/Kb (Wentworth et al., (1996) Eur. J. Immunol. 26: 97-101.). Assim, os CTLs induzidos por vacinação utilizando péptidos de epitopo podiam reconhecer células endoteliais, que são derivadas de TGM A2/Kb e expressam VEGFR1 e HLA-A*0201, mas não reconhecem as células de tumor que não possuem quaisquer moléculas de MHC classe I "humanas". Utilizando este sistema modelo de tumor único, observou-se inibição significativa do crescimento do tumor com vacinação utilizando estes péptidos de epitopo. Esta vacina baseada em péptido estava também associada a supressão significativa de tumores antes da vacinação. Estes resultados mostram que a nossa estratégia de vacinação é eficaz mesmo para tumores com défice de HLA, que é considerado um dos mecanismos de escape dos tumores. Mostrámos também num ensaio DAS que a angiogénese induzida por tumor foi significativamente inibida com vacinação utilizando estes péptidos de epitopo. Este resultado mostra que a inibição da angiogénese do tumor pode ser conseguida com vacinação com péptidos dirigidos à molécula expressa em células endoteliais vasculares induzidas pelo tumor.

Estes resultados, in vitro e in vivo, mostram que o VEGFR1 é um alvo útil de terapia imunológica utilizando imunidade celular e suportam a justificação definitiva do desenvolvimento clinico desta estratégia contra uma vasta gama de cancros. 12 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

No que se refere aos antigénios HLA, os dados aqui apresentados mostram que as utilizações do tipo A-24 ou do tipo A-02 (que se dizem ser altamente expressas entre os Japoneses) são favoráveis para obter resultados eficazes. As utilizações de subtipos tais como A-2402 e A-0201 são mesmo mais preferíveis. Contudo, na clínica, o tipo de antigénio de HLA do paciente requerendo tratamento é investigado previamente, o que possibilita a selecção apropriada de péptidos possuindo níveis elevados de afinidade de ligação para este antigénio, ou possuindo indutibilidade de células T citotóxicas (CTL) por apresentação de antigénio. Adicionalmente, de modo a obter péptidos exibindo elevada afinidade de ligação e indutibilidade de CTL, pode ser realizada a substituição ou adição de 1, 2 ou vários aminoácidos com base na sequência de aminoácidos do péptido parcial de VEGFR1 de ocorrência natural. Aqui, o termo "vários" significa 5 ou menos, ou preferivelmente 3 ou menos. Adicionalmente, para além dos péptidos que são exibidos naturalmente, uma vez que a regularidade das sequências de péptidos exibidas por ligação a antigénios de HLA já é conhecida (Kubo R.T., et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24.; Rammensee H.G., et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A., et al., (1994) J. Immunol. 155:4307-12.), modificações baseadas nesta regularidade podem ser realizadas nos péptidos obtidos. Por exemplo, péptidos exibindo elevada afinidade de ligação por HLA-24 têm o seu segundo aminoácido a partir do terminal N substituído por fenilalanina, tirosina, metionina ou triptofano, e péptidos cujo aminoácido no terminal C está substituído por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano ou metionina podem também ser utilizados favoravelmente. Por outro lado, péptidos exibindo elevada afinidade de ligação por HLA-0201 têm o seu segundo aminoácido a partir do terminal N substituído por leucina ou metionina, e péptidos cujo aminoácido C-terminal está substituído por valina ou leucina podem ser utilizados favoravelmente. Adicionalmente, podem ser adicionados 1 a 2 aminoácidos ao terminal N e/ou ao terminal C do péptido. como

Contudo, quando a sequência peptídica é idêntica a uma porção da sequência de aminoácidos de uma proteína endógena ou exógena possuindo uma função diferente, podem ser induzidos efeitos secundários tais como perturbações 13 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ autoimunes ou sintomas alérgicos contra substâncias especificas, e por conseguinte, preferivelmente, situações nas quais a sequência corresponde à sequência de aminoácidos de outra proteina são evitadas realizando uma pesquisa de homologia utilizando bases de dados disponíveis. Adicionalmente, se for claro a partir das pesquisas de homologia que não existem péptidos mesmo com uma diferença de 1 ou 2 aminoácidos, não existe qualquer perigo de modificações da sequência de aminoácidos acima mencionadas, para aumentar a afinidade de ligação com antigénios de HLA e/ou aumentar a indutibilidade de CTL, causarem estes problemas.

Ainda que seja de esperar que péptidos possuindo elevada afinidade de ligação pelos antigénios de HLA como descritos acima sejam altamente eficazes como vacinas para o cancro, os péptidos candidatos, que são seleccionados de acordo com a presença de elevada afinidade de ligação como indicador, têm de ser examinados quanto à presença efectiva de indutibilidade de CTL. A confirmação da indutibilidade de CTL é conseguida por indução de células de apresentação de antigénio transportando antigénios de MHC de humano (por exemplo, linfócitos B, macrófagos e células dendriticas), ou mais especificamente células dendriticas derivadas de leucócitos mononucleares de sangue periférico humano, e após estimulação com os péptidos, mistura com células CD8 positivas, e depois medição da actividade citotóxica contra as células alvo. Como sistema de reacção, podem-se utilizar animais transgénicos que foram produzidos para expressar um antigénio de HLA humano (por exemplo, os descritos em BenMohamed et al., (2000) Hum. Immunol.; 61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkout.). Por exemplo, as células alvo podem ser radio-marcadas com 51Cr e outros, e a actividade citotóxica pode ser calculada a partir da radioactividade libertada a partir das células alvo. Alternativamente, pode ser examinada por medição do IFN-γ produzido e libertado por CTL na presença de células de apresentação de antigénio que transportam péptidos imobilizados, e visualização da zona de inibição sobre os meios utilizando anticorpos monoclonais anti-IFN-γ. 14 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Como resultado de se examinar a indutibilidade de CTL dos péptidos como acima descrito, os que possuíam elevada afinidade de ligação por um antigénio de HLA não tiveram necessariamente indutibilidade elevada. Além disso, nonapéptidos ou decapéptidos seleccionados entre os péptidos compreendendo as sequências de aminoácidos indicadas por VLLWEIFSL (SEQ ID NO: 1), TLFWLLLTL (SEQ ID NO: 2), NLTATLIVNV (SEQ ID NO: 13), SYGVLLWEIF (SEQ ID NO: 32) exibiram indutibilidade de CTL particularmente elevada. O presente invento descreve também péptidos possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, e compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 1, 2 ou 13, nas quais 1, 2 ou vários aminoácidos estão substituídos ou acrescentados. As sequências de aminoácidos compreendendo 9 ou 10 aminoácidos indicadas pelas SEQ ID NOS: 1, 2 ou 13 nas quais 1, 2 ou vários aminoácidos estão substituídos ou acrescentados podem ter indutibilidade de CTL desde que não correspondam à sequência de aminoácidos de outras proteínas. Em particular, uma substituição de aminoácido para leucina ou metionina no segundo aminoácido a partir do terminal N, e para valina ou leucina no aminoácido C-terminal, e uma adição de aminoácidos de 1 a 2 aminoácidos no terminal N e/ou no terminal C são exemplos favoráveis. Um perito na especialidade reconhecerá que, nos métodos do invento, para além de substituições e adições de aminoácidos, podem-se também utilizar fragmentos imunologicamente activos dos péptidos. São conhecidos na especialidade métodos para determinar fragmentos activos. Clones de CTL obtidos por estimulação por estes péptidos modificados podem reconhecer os péptidos originais e causar danos. Péptidos aqui descritos podem ser preparados utilizando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, os péptidos podem ser preparados sinteticamente, por tecnologia de ADN recombinante ou por síntese química. Péptidos aqui descritos podem ser sintetizados individualmente ou como polipéptidos mais longos compreendendo dois ou mais péptidos. O péptido pode ser isolado í.e., substancialmente isento de outras proteínas da célula hospedeira de ocorrência natural e seus fragmentos. 15 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Os péptidos podem conter modificações tais como glicosilação, oxidação da cadeia lateral ou fosforilação; desde que as modificações não destruam a actividade biológica dos péptidos como aqui descrito. Outras modificações incluem incorporação de D-aminoácidos ou de outros miméticos de aminoácido que podem ser utilizados, por exemplo, para aumentar a meia-vida dos péptidos no soro.

Os péptidos aqui descritos podem ser preparados numa combinação, que compreende 1 ou mais péptidos aqui descritos, para utilização como uma vacina para o cancro que pode induzir CTL in vivo ou ex vivo. Os péptidos podem estar num cocktail ou podem ser conjugados uns com os outros utilizando técnicas padrão. Por exemplo, os péptidos podem ser expressos como uma única sequência de polipéptido. Os péptidos na combinação podem ser o mesmo ou diferentes. Por administração dos péptidos deste invento, os péptidos podem ser apresentados com uma elevada densidade sobre os antigénios de HLA de células de apresentação de antigénio e depois são induzidos os CTL, que reagem especificamente contra o complexo formado entre o péptido exibido e o antigénio de HLA, e é induzida uma resposta imunitária forte contra células endoteliais vasculares nas células de tumor. Alternativamente, podem ser obtidas células de apresentação de antigénio, que possuem os péptidos aqui descritos imobilizados sobre a sua superfície celular, removendo células dentríticas a partir dos sujeitos, estas são estimuladas ex vivo pelos péptidos deste invento, os CTL são induzidos nos sujeitos por readministração destas células aos sujeitos, e como resultado, a agressividade contra as células alvo pode ser aumentada.

Mais especificamente, o presente invento descreve composições imunogénicas para tratamento de tumores ou prevenção da proliferação, metástases, e outros, de tumores. As composições podem compreender 1 ou mais péptidos aqui descritos. Os péptidos nas composições podem ser o mesmo ou diferentes. Além disso, a angiogénese do lado patológico está estreitamente ligada a tumores, bem como a doenças tais como retinopatia diabética, artrite reumatóide crónica, psoríase e aterosclerose, e também a metástase de tumores sólidos (Folkman, J., (1995) Nature Med. 1:27-31; Bicknell et al., 16 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ (1996) Curr. Opin. Oncol. 8:60-5.)· Deste modo, os péptidos aqui descritos podem ser utilizados para tratamento de tumores, doenças mediadas por angiogénese tais como retinopatia diabética, artrite reumatóide crónica, psoriase, e aterosclerose, bem como metástase de tumores sólidos.

Constatou-se que os péptidos aqui descritos inibem a formação de vasos sanguíneos tortuosos, que são morfologicamente diferentes de vasos sanguíneos normais e que são formados em tecidos de tumor maligno, e resultados da análise de cicatrização de feridas e de fertilidade em ratinhos vacinados confirmaram que não existem quaisquer efeitos adversos sobre a angiogénese fisiológica normal. Adicionalmente, quando a citotoxicidade contra células endoteliais não proliferativas ou proliferativas foi testada in vitro utilizando clones de CTL que reconhecem os péptidos aqui descritos, verificou-se que estes clones exibiam uma actividade mais forte contra células endoteliais proliferativas do que contra células endoteliais não proliferativas. Mais especificamente, funcionam muito especificamente para perturbações nas quais se observam células endoteliais proliferativas, e particularmente para o cancro. A estimulação in vivo e in vitro de células dendríticas pelos péptidos aqui descritos pode ser realizada facilmente por exposição das células a uma elevada concentração dos péptidos tal que estes péptidos troquem com péptidos que estavam originalmente imobilizados sobre as células. Por conseguinte, os péptidos aqui utilizados têm de ter pelo menos um certo nível de afinidade de ligação pelos antigénios de HLA.

Os péptidos aqui descritos podem ser administrados directamente ou como uma composição farmacêutica que foi formulada por métodos de formulação convencionais. Nestes casos, para além dos péptidos aqui descritos, podem ser incluídos transportadores, excipientes e outros, que são habitualmente utilizados para fármacos, conforme apropriado, sem limitações particulares. As composições imunogénicas aqui descritas podem ser utilizadas para tratamento e prevenção de vários tumores tais como cancro gástrico, cancro duodenal, 17 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro da próstata e tumor do cérebro. Os péptidos descritos visam as células endoteliais de vasos sanguíneos recém-formados em tecidos de tumor, e não visam as próprias células de tumor e, por conseguinte, uma ampla variedade de tumores tornam-se alvos de tratamento, e não existem quaisquer limitações particulares à sua utilização.

Composições imunogénicas para tratamento e/ou prevenção de tumores, que compreendem os péptidos aqui descritos como os ingredientes activos, podem ser administradas com um adjuvante tal que a imunidade celular seja estabelecida eficazmente, ou podem ser administrados com outros ingredientes activos tais como agentes antitumor, e podem ser administrados por formulação em grânulos. Um adjuvante que pode ser aplicado inclui aqueles descritos na literatura (Johnson A.G. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89.). Exemplos de adjuvantes incluem, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio ou alúmen. Para além disso, podem ser convenientemente utilizadas formulações de lipossomas, formulações granulares nas quais o fármaco está ligado a pérolas de alguns ym de diâmetro, e formulações nas quais um lipido está ligado ao fármaco. 0 método de administração pode ser oral, intradérmico, subcutâneo, injecção intravenosa ou outro, e é possivel administração sistémica ou administração local à vizinhança do tumor alvo. A dose dos péptidos aqui descritos pode ser ajustada apropriadamente de acordo com a doença a ser tratada, idade do paciente, peso, método de administração e outros, e é habitualmente 0,001 mg a 1000 mg, preferivelmente 0,01 mg a 100 mg, mais preferivelmente 0,1 mg a 10 mg, e é preferivelmente administrada uma vez durante alguns dias até alguns meses. Um perito na especialidade pode apropriadamente seleccionar a dose adequada.

Alternativamente, o presente invento proporciona vesiculas intracelulares denominadas exossomas, que apresentam complexos formados entre os péptidos deste invento e os antigénios de HLA sobre a sua superficie. Os exossomas podem ser preparados, por exemplo utilizando os métodos descritos em detalhe na Tradução Japonesa Publicada da Publicação Internacional N.os Hei 11-510507 e 2000-512161, e são preferivelmente preparados utilizando células de 18 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ apresentação de antigénio obtidas a partir de sujeitos que são alvos de tratamento e/ou prevenção. Os exossomas deste invento podem ser inoculados como vacinas para o cancro, similarmente aos péptidos deste invento. 0 tipo de antigénios de HLA utilizados tem de corresponder ao do sujeito requerendo tratamento e/ou prevenção. Por exemplo, para um Japonês, HLA-A24 ou HLA-A02, particularmente HLA-A2402 ou HLA-0201, podem ser apropriados.

Em algumas concretizações, as composições de vacinas aqui descritas podem compreender um componente que induz linfócitos T citotóxicos. Foram identificados lípidos como agentes capazes de induzir CTL in vivo contra antigénios virais. Por exemplo, residuos de ácido palmitico podem ser ligados aos grupos ε- e α-amino de um residuo lisina e depois ligados a um péptido imunogénico do invento. 0 péptido com lípido pode depois ser administrado directamente numa micela ou particula, incorporado num lipossoma ou emulsionado num adjuvante. Como outro exemplo de indução por lípido de respostas de CTL, podem-se utilizar lipoproteínas de E. coli, tais como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilseril-serina (P3CSS) para induzir CTL, quando ligadas covalentemente a um péptido apropriado (ver, e.g., Deres, et al., (1989) Nature 342:561-4.).

As composições imunogénicas aqui descritas podem compreender ácidos nucleicos codificando os péptidos imunogénicos aqui revelados. Ver, e.g., Wolff et al., (1990) Science 247:1465-8; Patentes dos E.U.A. N.os 5 580 859, 5 589 466, 5 804 566, 5 739 118, 5 736 524, 5 679 647, e WO 98/04720. Exemplos de tecnologias de entrega baseadas em ADN incluem "ADN nu", entrega facilitada (mediada por bupivicaína, polímeros, péptidos), complexos de lípidos catiónicos e entrega mediada por partículas ("arma de genes") ou mediada por pressão (ver, e.g., Patente dos E.U.A. N.° 5 922 687) .

Os péptidos imunogénicos aqui descritos podem também ser expressos por vectores virais ou bacterianos. Exemplos de vectores de expressão incluem hospedeiros virais atenuados, tais como vacínia ou varíola aviária. Esta abordagem envolve 19 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ a utilização de virus vacinia, e.g., como um vector para expressar sequências de nucleótidos que codificam o péptido. Por introdução num hospedeiro, o virus vacinia recombinante expressa o péptido imunogénico, e desse modo induz uma resposta imunitária. Vectores de vacinia e métodos úteis em protocolos de imunização estão descritos em e.g. Patente dos E.U.A. N.° 4 722 848. Outro vector é o BCG (Bacilo de Calmette-Guerin). Vectores de BCG são descritos em Stover, et al., (1991) Nature 351:456-60. Será evidente uma ampla variedade de outros vectores úteis para administração terapêutica ou imunização e.g., vectores de adenovirus e de virus adeno-associados, vectores retrovirais, vectores de Salmonella typhi ou vector de toxina de antraz tornado não tóxico. Ver, e.g., Shata, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock, et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; e Hipp, et al., (2000) In vivo 14:571-85. São também aqui descritos métodos para induzir células de apresentação de antigénio utilizando os péptidos aqui descritos. As células de apresentação de antigénio podem ser induzidas por indução de células dendriticas a partir de monócitos de sangue periférico e depois contacto destes (estimulação) com os péptidos aqui descritos in vitro ou in vivo. Quando os péptidos aqui descritos são administrados aos sujeitos, células de apresentação de antigénio, que possuem os péptidos aqui descritos imobilizados a estas, são induzidas no corpo do sujeito. Alternativamente, após imobilizar os péptidos aqui descritos às células de apresentação de antigénio, as células podem ser administradas ao sujeito como uma vacina. É também aqui descrito um método para induzir células de apresentação de antigénio possuindo um nivel elevado de indutibilidade de células T citotóxicas, método que compreende o passo de transferir genes compreendendo polinucleótidos que codificam os péptidos aqui descritos para células de apresentação de antigénio in vitro. Os genes introduzidos podem estar na forma de ADN ou ARN. Para o método de introdução, sem limitações particulares, podem-se utilizar vários métodos convencionalmente utilizados neste campo, tais como lipofecção, electroporação e o método do fosfato de cálcio. Mais especificamente, pode ser realizado 20 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ como descrito em Reeves M.E., et al., (1996) Câncer Res., 56:5672-7./ Butterfield L.H., et al, (1998) J. Immunol., 161:5607-13.; Boczkowski D., et al., (1996) J. Exp. Med., 184:465-72.; Tradução Japonesa Publicada da Publicação Internacional N.° 2000-509281. Por transferência do gene para as células de apresentação de antigénio, o gene sofre transcrição, tradução e outras, na célula, e depois a proteina obtida é processada e ligada a MHC Classe I ou Classe II, e prossegue através de um percurso de apresentação para apresentar péptidos parciais.

Além disso, são aqui descritos métodos para induzir CTL utilizando os péptidos aqui descritos. Quando os péptidos aqui descritos são administrados a um sujeito, os CTLs são induzidos no corpo do sujeito, e é reforçada a resistência do sistema imunitário dirigido às células endoteliais angiogénicas nos tecidos do tumor. Alternativamente, podem ser utilizados para um método terapêutico ex vivo, no qual células de apresentação de antigénio derivadas de sujeito e células CD8-positivas, ou leucócitos mononucleares de sangue periférico, são postos em contacto (estimulados) com os péptidos aqui descritos in vitro e, após indução de CTL, as células são devolvidas ao sujeito.

Para além disso, o presente invento descreve células T citotóxicas isoladas que são induzidas utilizando os péptidos aqui descritos. As células T citotóxicas, que foram induzidas por estimulação a partir de células de apresentação de antigénio que apresentam os péptidos aqui descritos, são preferivelmente derivadas de sujeitos que são alvos de tratamento e/ou prevenção, e podem ser administradas por si só ou em combinação com outros fármacos, incluindo os péptidos aqui descritos ou exossomas, para o propósito de efeitos antitumor. As células T citotóxicas obtidas actuam especificamente contra células alvo apresentando os péptidos aqui descritos ou preferivelmente os mesmos péptidos utilizados para indução. As células alvo podem ser células que expressam VEGFRl endogenamente, ou células que estão transfectadas com um gene que codifica VEGFRl, e as células que apresentam os péptidos aqui descritos sobre a superficie celular, devido a estimulação por estes péptidos, podem também tornar-se alvos de ataque. 21 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ São também aqui descritas células de apresentação de antigénio que compreendem a apresentação de complexos formados entre antigénios de HLA e os péptidos aqui descritos. As células de apresentação de antigénio que são obtidas por contacto dos péptidos aqui descritos ou dos nucleótidos codificando os péptidos aqui descritos são preferivelmente derivadas de sujeitos que são os alvos de tratamento e/ou prevenção, e podem ser administradas como vacinas por si só ou em combinação com outros fármacos incluindo os péptidos aqui descritos, exossomas ou células T citotóxicas.

No presente invento, o termo "vacina" (também referido como uma composição imunogénica) refere-se a uma substância que tem a função de induzir imunidade contra células endoteliais de tumor para suprimir tumores após inoculação em animais.

Como aqui descrito, polipéptidos compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 1, 2, 13 foram sugeridos como péptidos de epitopo restringidos a HLA-A02 e a SEQ ID NO: 32 foi sugerida como péptidos de epitopo restringidos a HLA-A24 que podem induzir uma resposta imunitária potente e especifica contra células endoteliais de tumor expressando VEGFR1. Assim, o presente invento abrange também um método para induzir imunidade antitumor utilizando polipéptidos compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 1, 2, 13, 32. Em geral, a imunidade antitumor inclui respostas imunitárias como se segue: • indução de linfócitos citotóxicos contra células endoteliais em tumores, • indução de anticorpos que reconhecem células endoteliais em tumores, e • indução da produção de citoquina antitumor.

Deste modo, quando uma certa proteína induz qualquer uma destas respostas imunitárias após inoculação num animal, decide-se que a proteína tem um efeito de indução de imunidade antitumor. A indução da imunidade antitumor por uma proteína pode ser detectada observando in vivo ou in vitro a 22 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ resposta do sistema imunitário no hospedeiro contra a proteína.

Por exemplo, é bem conhecido um método para detectar a indução de linfócitos T citotóxicos. Uma substância estranha que entra no corpo vivo é apresentada a células T e a células B pela acção de células de apresentação de antigénio (APCs). As células T que respondem ao antigénio apresentado pela APC de um modo específico do antigénio diferenciam-se em células T citotóxicas (ou linfócitos T citotóxicos; CTLs) devido à estimulação pelo antigénio, e depois proliferam (isto é referido como activação de células T) . Por conseguinte, a indução de CTL por um certo péptido pode ser avaliada por apresentação do péptido a uma célula T por APC, e detecção da indução de CTL. Adicionalmente, as APCs têm o efeito de activar células T CD4+, células T CD8+, macrófagos, eosinófilos e células NK. Uma vez que as células T CD4+ são também importantes na imunidade antitumor, a acção de indução de imunidade antitumor do péptido pode ser avaliada utilizando o efeito de activação destas células como indicador. É bem conhecido na especialidade um método para avaliar a acção de indução de CTL utilizando células dendríticas (DCs) como APC. A DC é uma APC representativa possuindo a mais forte acção de indução de CTL entre as APCs. Neste método, o polipéptido de teste é inicialmente posto em contacto com uma DC e depois esta DC é posta em contacto com células T. A detecção de células T possuindo efeitos citotóxicos contra as células de interesse após o contacto com DC mostra que o polipéptido de teste tem uma actividade para induzir as células T citotóxicas. A actividade de CTL contra tumores pode ser detectada, por exemplo, utilizando a lise de células de tumor marcadas com 51Cr como o indicador. Alternativamente, é também bem conhecido o método de avaliação do grau de danificação de células de tumor utilizando a actividade de incorporação de 3H-timidina ou de libertação de LDH (lactose-desidrogenase) como o indicador. À parte de DC, podem também ser utilizadas como a APC células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). É reportado que a indução de CTL é melhorada cultivando PBMC na 23 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ presença de GM-CSF e IL-4. Similarmente, foi mostrado que os CTL são induzidos cultivando PBMC na presença de hemocianina de lapa Fissurella (KLH) e IL-7.

Os polipéptidos de teste que confirmaram possuir actividade de indução de CTL por estes métodos são polipéptidos possuindo efeito de activação de DC e actividade de indução de CTL subsequente. Por consequinte, polipéptidos que induzem CTL contra células endoteliais de tumor são úteis como vacinas contra tumores. Além disso, APCs que adquiriram a capacidade para induzir CTL contra células endoteliais de tumor por contacto com os polipéptidos são úteis como vacinas contra tumores. Adicionalmente, CTL que adquiriram citotoxicidade devido à apresentação dos antigénios de polipéptidos por APC podem também ser utilizados como vacinas contra tumores. Estes métodos terapêuticos para tumores utilizando imunidade antitumor devida a APC e CTL são referidos como imunoterapia celular.

Geralmente, quando se utiliza um polipéptido para imunoterapia celular, é conhecido que a eficiência da indução de CTL aumenta por combinação de uma pluralidade de polipéptidos possuindo diferentes estruturas e contacto destes com DC. Deste modo, quando se estimulam DC com fragmentos de proteína, é vantajoso utilizar uma mistura de múltiplos tipos de fragmentos.

Alternativamente, a indução de imunidade antitumor por um polipéptido pode ser confirmada observando a indução da produção de anticorpos contra tumores. Por exemplo, quando anticorpos contra um polipéptido são induzidos num animal de laboratório imunizado com o polipéptido, e quando cultivados, a proliferação ou metástase de células de tumor é suprimida por esses anticorpos, pode-se determinar que o polipéptido tem uma capacidade para induzir imunidade antitumor. É também aqui descrito um método de tratamento ou prevenção de tumores num sujeito compreendendo administrar ao referido sujeito uma vacina compreendendo um polipéptido codificado por um ácido nucleico seleccionado entre o grupo consistindo de VEGFR1 ou um fragmento imunologicamente activo do referido polipéptido, ou um polinucleótido codificando o 24 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ polipéptido ou ο seu fragmento. A administração do polipéptido induz uma imunidade antitumor num sujeito. Assim, é aqui adicionalmente descrito um método para induzir imunidade antitumor. 0 polipéptido ou os seus fragmentos imunologicamente activos podem ser úteis como vacinas contra tumores. Em alguns casos as proteínas ou seus fragmentos podem ser administrados numa forma ligada ao receptor de células T (TCR) ou apresentada sobre uma célula de apresentação de antigénio (APC), tal como um macrófago, célula dendrítica (DC) ou células B. Devido à forte capacidade de apresentação de antigénio das DC, a utilização de DC é muito preferível entre as APCs. A imunidade antitumor é induzida por administração da vacina aqui descrita e a indução de imunidade antitumor possibilita o tratamento e prevenção de tumores. A terapia contra ou a prevenção do aparecimento de tumores inclui quaisquer dos passos, tais como inibição do crescimento de células de tumor, involução de células de tumor e supressão da ocorrência de células de tumor. A diminuição na mortalidade de indivíduos possuindo tumores, a diminuição dos marcadores de tumores no sangue, o alívio de sintomas detectáveis que acompanham os tumores, e outros, estão também incluídos na terapia ou prevenção de tumores. Estes efeitos terapêuticos e preventivos são preferivelmente significativos em termos estatísticos, por exemplo, em observação, com um nível de significância de 5% ou menos, onde o efeito terapêutico ou preventivo de uma vacina contra tumores é comparado com um controlo sem administração de vacina. Por exemplo, para análises estatísticas podem-se utilizar o teste t de Student, o teste U de Mann-Whitney ou a ANOVA. A proteína acima mencionada possuindo actividade imunológica, ou um polinucleótido ou vector codificando a proteína, podem ser combinados com um adjuvante. Um adjuvante refere-se a um composto que melhora a resposta imunitária contra a proteína quando administrado em conjunto (ou sucessivamente) com a proteína possuindo actividade imunológica. Exemplos de adjuvantes incluem toxina da cólera, toxina de salmonela, alúmen e outros, mas não estão limitados a estes. Adicionalmente, a vacina aqui descrita pode ser combinada apropriadamente com um transportador 25 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ farmaceuticamente aceitável. Exemplos destes transportadores são água esterilizada, solução salina fisiológica, tampão de fosfato, fluido de cultura e outros. Para além disso, a vacina pode conter, conforme necessário, estabilizadores, suspensões, conservantes, tensioactivos e outros. A vacina é administrada sistemicamente ou localmente. A administração de vacina pode ser realizada por uma única administração ou reforçada por múltiplas administrações.

Quando se utilizam APC ou CTL como a vacina aqui descrita, tumores podem ser tratados ou prevenidos, por exemplo, pelo método ex vivo. Mais especificamente, recolhem-se PBMCs do sujeito que está a receber tratamento ou prevenção, põem-se as células em contacto com o polipéptido ex vivo, e após a indução de APC ou CTL, as células podem ser administradas ao sujeito. As APC podem também ser induzidas por introdução de um vector codificando o polipéptido em PBMCs ex vivo. As APC ou os CTL induzidos in vitro podem ser clonados antes da administração. Por clonagem e crescimento das células possuindo elevada actividade de danificação de células alvo, a imunoterapia celular pode ser realizada mais eficazmente. Adicionalmente, APC e CTL isolados deste modo podem ser utilizados para imunoterapia celular não apenas contra indivíduos de quem as células são derivadas, mas também contra tipos de doenças similares noutros indivíduos.

Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar o presente invento e para ajudar uma pessoa competente na preparação e utilização dos mesmos. Os exemplos não pretendem de modo algum limitar de outro modo o âmbito do invento. A não ser que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa competente na especialidade à qual este invento pertence. Ainda que métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou ensaios do presente invento, descrevem-se a seguir métodos e materiais adequados. 26 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

EXEMPLOS Ο presente invento é ilustrado em detalhe pelos Exemplos seguintes, mas não está restringido a estes Exemplos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Linhas de células A linha de células T2 foi generosamente fornecida pelo Dr. H. Shiku (Mie Escola Universitária de Medicina). As linhas de células AGl-Gl-Flt-1 e AGl-Gl-Neo foram gentilmente fornecidas pelo Dr. M. Shibuya (Instituto de Ciência Médica, Universidade de Tóquio). A linha de células AG1-G1 foi estabelecida a partir de hemangioma benigno de humano e a AGl-Gl-Flt-1 foi gerada infectando a linha de células AG1-G1 com o vector de plasmideo BCMGS transportando ADNc de VEGFR1. A MCA205, uma linha de células de fibrossarcoma murino induzido por metilcolantreno, foi uma oferta generosa do Dr. S.A. Rosenberg (National Câncer Institute, Bethesda, MD). A B16, um melanoma murino, e a MC38, um adenocarcinoma do cólon de murino foram compradas na ATCC. Péptidos sintéticos

Os candidates de péptidos de epitopo derivados de VEGFR1 restringidos a HLA-A*0201 (A2) e -A*2402 (A24) foram seleccionados com base nas afinidades de ligação aos HLAs correspondentes. As afinidades de ligação foram previstas com recurso ao sitio da internet da Biolnformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) (Kuzushima et al., (2003) Blood. 101: 1460-8., Parker et al., (1994) J. Immunol. 152: 163- 75.). Estes péptidos candidatos foram sintetizados pela Sawady Technology, Japão de acordo com o método de sintese de fase sólida e purificados por HPLC de fase reversa. A pureza (>95%) e a identidade dos péptidos foram determinadas por HPLC analitica e análise de espectrometria de massa, respectivamente. Os péptidos utilizados no presente invento estão listados nas Tabelas 1 e 2. O péptido CEA (DVLYGPDTPI (SEQ ID NO: 41)) foi utilizado como um controlo positivo para o modelo de ratinho in vivo. 27 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Os péptidos de CMV (A02; NLVPMVATV (SEQ ID NO: 42), A24; QYDPVAALF (SEQ ID NO: 43) ) foram utilizados como controlos positivos para indução de CTL de humano in vitro (Solache et al., (1999) J. Immunol. 163: 5512-8., Kuzushima et al., (2001) Blood. 98: 1872-81.).

Animais

Os TGM A2/Kb, cujo MHC classe I consiste do dominio al e a2 de HLA-A*0201 e do dominio a3 de H-2Kb de ratinho, foram preparados como descrito noutro local (Wentworth et al., (1996) Eur. J. Immunol. 26: 97-101.). Os animais foram mantidos na instalação para animais isenta de patogénios específicos do Instituto de Ciência Médica, Universidade de Tóquio, e todos os protocolos para experiências com animais foram aprovados pela comissão de ética do nosso instituto.

Geração de linhas e de clones de CTL

Utilizaram-se células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos para induzir respostas de CTL contra péptidos apresentados sobre HLA como anteriormente descrito (Nukaya et al., (1999) Int. J. Câncer. 80: 92-7., Tsai et al., (1997) J. Immunol. 158: 1796-802., Nakahara et al., (2003) Câncer Res. 63: 4112-8.). Resumidamente, as PBMCs foram obtidas partir dos voluntários saudáveis com HLAs correspondentes e cultivadas na presença de GM-CSF (fornecido pela Kirin Brewery Company, Japão) e IL-4 (Genzyme/Techne, Minneapolis). Após cultura durante 5 dias, adicionou-se OK-432 (Chugai Pharmaceutical Corporation, Japão) à cultura para obter DCs maduros (Nakahara et al., (2003) Câncer Res. 63: 4112-8.). Ao dia 7, as DCs maduras geradas foram pulsadas com cada péptido para estimulação de células T. Utilizando estas DCs pulsadas com péptido de cada vez, as células T CD8+ autólogas foram estimuladas por três vezes aos dias 0, 7 e 14, e depois testaram-se as células linfóides resultantes quanto às suas actividades citotóxicas ao dia 21.

Para gerar clones de CTL, plaquearam-se linhas de CTL estabelecidas em placas de 96 poços a 0,3, 1 e 3 células por poço com PBMCs alogénicas e A3-LCL como células 28 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ estimuladoras. Testaram-se as actividades citotóxicas dos clones de CTL resultantes ao 14.° dia.

Ensaio de citotoxicidade

As actividades citotóxicas foram medidas utilizando um ensaio padrão de libertação de 51Cr de 4 horas. As células T2 e A24-LCL foram utilizadas como células alvo pulsadas com péptidos candidatos. Calculou-se a lise especifica em percentagem como se segue: % de lise especifica = [(libertação experimental - libertação

espontânea)/(libertação máxima -libertação espontânea)]xlOO

Imunogenicidade de péptidos de epítopo em TGM A2/Kb

Para indução dos CTLs específicos de péptido, a imunização foi administrada utilizando 200 μΐ de mistura de vacina, que contém 100 yg de um péptido restringido a HLA-A2 e 100 μΐ de IFA por ratinho. A vacina foi injectada intradermicamente no flanco direito para a primeira imunização ao dia 0 e no outro flanco para a segunda ao dia 11. Ao dia 21, utilizaram-se esplenócitos dos ratinhos vacinados como as células responsoras, e utilizaram-se células T2 pulsadas com ou sem péptidos como as células estimuladoras para ensaio ELISPOT.

Ensaio de angiogénese in vivo

Examinámos os efeitos da vacinação com péptido utilizando o ensaio do saco de ar dorsal (DAS) que foi desenhado para medir a angiogénese in vivo induzida por células de tumor como anteriormente descrito (Oikawa et al., (1997) Anticancer Res.17: 1881-6.). Resumidamente, os TGM A2/Kb foram vacinados duas vezes com um intervalo de 1 semana no flanco esquerdo utilizando os péptidos correspondentes conjugados com IFA como anteriormente descrito com algumas modificações (Schuler et al., (1997) J. Exp. Med. 186: 1183- 7., Song et al., (1997) J. Exp. Med. 186: 1247-56., Specht et al., (1997) J. Exp. Med. 186: 1213-21.). Encheu-se uma câmara 29 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Millipore (Millipore Corporation, Bedford, MA) com PBS contendo células MC38 (lxlO6 células) e implantou-se no dorso de ratinhos anestesiados ao dia 0. Removeram-se as câmaras implantadas das fáscias s.c. ao dia 6 e depois colocaram-se anéis negros nos locais expostos a um contacto directo com a câmara. A resposta angiogénica foi avaliada com fotografias tiradas com um microscópio de dissecção. A extensão de angiogénese foi determinada com o número de vasos sanguineos recém-formados de >3mm de comprimento e pontuada semi-quantitativamente utilizando um índice variando de 0 (nenhum) a 5 (muitos).

Efeitos antitumor in vivo

Examinámos os efeitos antitumor desta vacinação com um modelo terapêutico. As lxlO5 células MCA205 ou as 5xl05 células B16 foram injectadas i.d. no flanco direito ao dia 0, e a vacinação foi realizada ao dia 4 e ao dia 14 utilizando os péptidos correspondentes conjugados com IFA.

Análise estatística

Cada experiência foi realizada em triplicado para confirmar a reprodutibilidade dos resultados, e mostram-se os resultados representativos. Utilizou-se o teste t de Student para examinar a significância dos dados, quando aplicável. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando o valor de P foi inferior a 0,05.

RESULTADOS Péptidos de ligação de HLA classe I previstos a partir de proteína VEGFR1

Os candidatos de péptidos de epítopo derivados de VEGFR1 restringidos a HLA-A*0201 (A2) e -A*2402 (A24) foram seleccionados com base nas afinidades de ligação aos HLAs correspondentes. As afinidades de ligação foram previstas com recurso ao sítio da internet da Biolnformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS). 30 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Software de previsão da ligação de péptido HLA: (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)

Kuzushima, K., et al., (2003) Blood. 101: 1460-8.

Parker, K.C., et al., (1994) J. Immunol. 152: 163-75.

Estabelecimento de clones de CTL utilizando candidatos epitópicos derivados de VEGFR1

Testámos primeiro a imunogenicidade de VEGFR1 para determinar os péptidos de epitopo. Péptidos candidatos a epitopo foram seleccionados pela ordem das pontuações de ligação reflectindo a afinidade de ligação do péptido às moléculas de HLA classe I (Tabela 1, Tabela 2).

Tabela 1 Péptidos previstos de ligação a HLA-A*0201 a partir da proteína VEGFR1

Posição de início Sequência (9-mero) SEQ ID NO: Afinidade de ligação Posição de início Sequência (10-mero) SEQ ID NO: Afinidade de ligação 1087 VLLWEIFSL 1 1793 1153 KLGDLLQANV 11 998 770 TLFWLLLTL 2 182 1029 LLSENNWKI 12 167 1028 ILLSENNW 3 179 417 NLTATLIVNV 13 160 766 CVAATLFWL 4 137 1094 SLGGSPYPGV 14 104 874 ALMTELKIL 5 75 1104 QMDEDFCSRL 15 96 861 KMLKEGATA 6 47 1086 GVLLWEIFSL 16 92 875 LMTELKILT 7 38 797 IIMDPDEVPL 17 76 881 ILTHIGHHL 8 36 1004 FQVARGMEFL 18 62 1027 NILLSENNV 9 35 220 YLTHRQTNTI 19 48 220 YLTHRQTNT 10 34 590 ILLRTVNNRT 20 47

Tabela 2 Péptidos previstos de ligação a HLA-A*2402 a partir da proteína VEGFR1

Posição de início Sequência (9-mero) SEQ ID NO: Afinidade de ligação Posição de início Sequência (10-mero) SEQ ID NO: Afinidade de ligação 913 KYGNLSNYL 21 576 919 NYLKSKRDLF 31 150 919 NYLKSKRDL 22 300 1084 SYGVLLWEIF 32 120 871 EYKALMTEL 23 264 1001 SYSFQVARGM 33 35 1212 RYVNAFKFM 24 90 880 KILTHIGHHL 34 17 1084 SYGVLLWEI 25 66 1003 SFQVARGMEF 35 17 31 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Posição de início Sequência (9-raero) SEQ ID NO: Afinidade de ligação Posição de início Sequência (10-mero) SEQ ID NO: Afinidade de ligação 1146 RFAELVEKL 26 64 1212 RYYNAFKFMS 36 15 821 EFARERLKL 27 22 700 KIQQEPGIIL 37 12 754 KSNLELITL 28 12 873 KALMTELKIL 38 12 819 KWEFARERL 29 12 1149 ELVEKLGDLL 39 9 814 PYDASKWEF 30 11 1079 KSDVWSYGVL 40 8

Gerámos CTLs utilizando estes péptidos e PBMCs doados por voluntários saudáveis com HLA-A*0201 e HLA-A*2402 como descrito em "Materiais e Métodos", e foram estabelecidas com sucesso clones de CTL.

Estes clones de CTL mostraram citotoxicidade especifica contra as células alvo pulsadas com os péptidos correspondentes (Fig. 1, Fig. 2).

Examinámos também a capacidade de clones de CTL estabelecidos induzidos com estes péptidos para lisar as células alvo expressando também endogenamente VEGFR1. O clone de CTL HLA-A*2402 foi examinado quanto à citotoxicidade contra células expressando VEGFR1 (AGl-Gl-Flt-1) e controlo (AG1-G1) com um ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas. Estes clones de CTL mostraram as citotoxicidades contra AGl-Gl-Flt-1, mas não contra AG1-G1 (Fig. 3). A citotoxicidade foi significativamente bloqueada com mAbs contra CD8 e HLA classe I, mas não foi bloqueada utilizando mAbs contra CD4 nem HLA classe II (dados não mostrados).

Antiangiogénese e efeitos antitumor in vivo associados à vacinação utilizando péptidos de epitopo de VEGFR1.

Testámos os efeitos antiangiogénese e os efeitos antitumor in vivo da vacinação com péptidos de epitopo de VEGFR1 utilizando TGM A2/Kb.

Em primeiro lugar, avaliámos a imunogenicidade dos péptidos de epitopo para TGM A2/Kb para examinar a produção especifica de IFN-γ dos CTLs induzidos com estes péptidos por 32 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ um ensaio ELISPOT (Fig. 4) . 0 péptido conjugado com IFA foi injectado s.c. em TGM A2/Kb ao dia 0 e ao dia 11. Ao dia 21, colheram-se esplenócitos dos ratinhos vacinados e utilizaram-se como as células responsoras, e utilizaram-se células T2 pulsadas com ou sem péptidos como as células estimuladoras para o ensaio ELISPOT. A produção especifica de IFN-γ para o péptido correspondente foi observada nos ratinhos vacinados com péptidos VEGFR1-1087, -770, -417. Neste ensaio ELISPOT utilizando o sistema TGM A2/Kb, observaram-se resultados positivos para os péptidos de epitopo identificados utilizando PBMCs humanas.

Examinámos se a vacinação utilizando péptido derivado de VEGFRl suprime a angiogénese induzida por tumor. Para confirmar os efeitos da vacinação com péptido na angiogénese induzida por células de tumor, utilizámos o ensaio do saco de ar dorsal (ensaio DAS) que visualiza a extensão de neovascularização in vivo. Neste ensaio semi-quantitativo, observou-se uma inibição significativa da angiogénese nos ratinhos vacinados com péptidos VEGFR1-1087, -770, -417 (Fig. 5) . A vacinação utilizando o péptido de epitopo mostrou um forte efeito antitumor no modelo terapêutico. As MCA205, uma linha de células de fibrossarcoma murino induzido por metilcolantreno, foram injectados i.d. em TGM A2/Kb ao dia 0, e a vacinação foi realizada ao dia 4 e ao dia 14 após desafio com tumor utilizando péptidos VEGFR1-1087, -770, -417 conjugados com IFA (Fig. 6). Observou-se uma supressão significativa do crescimento do tumor com a vacinação utilizando péptidos VEGFR1-1087, -770 conjugados com IFA. Adicionalmente, observaram-se inibições significativas do crescimento do tumor em várias células de tumor (dados não mostrados).

Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos antitumor induzidos com a vacinação utilizando os péptidos derivados de VEGFRl poderão ser mediados pela inibição da angiogénese de tumor. Assim, a vacinação com péptidos de epitopo derivados de VEGFRl poderá afectar o crescimento das células de tumor através dos efeitos sobre as células endoteliais expressando VEGFRl dos vasos que suportam o 33 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ crescimento do tumor in vivo neste sistema de tumor em TGM A2/Kb.

DISCUSSÃO A identificação dos antigénios associados ao tumor (TAAs) possibilitou o desenvolvimento clinico de uma vacina para o cancro baseada em péptido, que podia induzir CTLs e lisar células de tumor de um modo restringido a HLA classe I (Bruggen et al., (1991) Science. 254: 1643-7., Boon et al., (1996) J. Exp. Med. 183: 725-9., Rosenberg et al., (1998)

Nat. Med. 4: 321-7., Butterfield et al., (1999) Câncer Res. 59: 3134-42.). Até agora, múltiplos ensaios clinicos utilizando péptidos de TAA noticiaram que foram observadas regressões de tumor em aproximadamente 20% dos pacientes de melanoma. No entanto, uma resposta completa raramente foi reportada (Rosenberg et al., (1998) Nat. Med. 4: 321-7.

Nestle et al., (1998) Nat. Med. 4: 328-32., Thurner et al., (1999) J. Exp. Med. 190: 1669-78., Belli et al., (2002)

Parmiani. J. Clin. Oncol. 20: 4169-80., Coulie et al., (2002) Immunol. Rev. 188: 33-42.). Uma das possíveis razões da modesta eficácia clínica poderia ser a perda ou a regulação descendente de moléculas de HLA classe I nas células de tumor (Cormier et al., (1998) Int. J. Câncer. 75: 517-24., Paschen et al, (2003) Int. J. Câncer. 103: 759-67., Fonteneau et al., (1997) . J. Immuol. 159: 2831-9., Reynolds et al., (1998) J.

Immunol. 161: 6970-6.). A frequência de tumores exibindo alguma alteração na expressão de moléculas de HLA classe I foi estimada como sendo superior a 40% (Cormier et al., (1998) Int. J. Câncer. 75: 517-24., Paschen et al., (2003)

Int. J. Câncer. 103: 759-67.). Assim, uma porção significativa de células de tumor podia-se escapar dos CTLs específicos do epítopo classe I, mesmo se os CTLs pudessem ser induzidos com sucesso por uma vacina para o cancro dirigida às próprias células de tumor. Estes problemas podem ser ultrapassados com o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a angiogénese do tumor, uma vez que as células endoteliais são geneticamente estáveis, não exibem regulação descendente de moléculas de HLA classe I, e estão envolvidas de modo crítico na progressão de uma variedade de tumores. Para além disso, os CTLs podiam directamente causar dano às células endoteliais sem penetrar em qualquer outro tecido, e 34 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ a lise, mesmo de pequenos números de células endoteliais na vasculatura do tumor resultará em destruição da integridade dos vasos conduzindo a inibição de grandes números de células de tumor (Folkman, J. (1995) Nat. Med. 1: 27-31.). Deste modo, as células endoteliais são um bom alvo para imunoterapia do cancro. Para especificamente e eficientemente prevenir a angiogénese de tumores com resposta de CTL, tem de ser seleccionado um alvo apropriado entre as moléculas relacionadas com a angiogénese.

Os resultados aqui apresentados, in vitro e in vivo, demonstram que o VEGFR1 pode ser utilizado como alvo de terapia imunológica utilizando imunidade celular e suportam a justificação definitiva do desenvolvimento clinico desta estratégia contra uma vasta gama de cancros.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL 0 presente invento proporciona novos péptidos, que induzem células T citotóxicas visando células endoteliais formadas numa vasta gama de tecidos de tumor, e são extremamente eficazes como vacinas para o cancro. O presente invento proporciona também composições imunogénicas compreendendo estes péptidos para tratamento e prevenção de tumores.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> THE UNIVERSITY OF ΤΟΚΥΟ ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> PÉPTIDOS DE EPÍTOPO DERIVADOS DE RECEPTOR DE FACTOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR 1 E VACINAS CONTENDO ESTES PÉPTIDOS"

<130> ONC-A0415P <150> US 60/657 527 <151> 2005-02-28 <160> 45 35 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ <17Ο> Patentln version 3. 1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 1

Vai Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 2

Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 3

Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Vai Vai 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 36 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 4

Cys Vai Ala Ala Thr Leu Phe Trp Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 5

Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys Ile Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 6

Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 7

Leu Met Thr Glu Leu Lys Ile Leu Thr 1 5 37 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 8

Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 9

Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Vai 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 10

Tyr Leu Thr His Arg Gin Thr Asn Thr 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial 38 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 11

Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gin Ala Asn Vai 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 12

Leu Leu Ser Glu Asn Asn Vai Vai Lys Ile 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 13

Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Vai Asn Vai 15 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 14

Ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Vai 1 5 10 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ 39 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 Ο 0> 15

Gin Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 O 0> 16

Gly Vai Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 17

Ile Ile Met Asp Pro Asp Glu Vai Pro Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente 40 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ <400> 18

Phe Gin Vai Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 19

Tyr Leu Thr His Arg Gin Thr Asn Thr Ile 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 20

Ile Leu Leu Arg Thr Vai Asn Asn Arg Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 21

Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu 1 5 <210> 22 41 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ <211> 9

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 22

Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 23

Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 24

Arg Tyr Vai Asn Ala Phe Lys Phe Met 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente 42 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ <4 Ο Ο> 25

Ser Tyr Gly Vai Leu Leu Trp Glu Ile 1 s <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 26

Arg Phe Ala Glu Leu Vai Glu Lys Leu 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 27

Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 28

Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ 43 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4Ο0> 29

Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 30

Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 31

Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 32 44 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Ser Tyr Gly Vai Leu Leu Trp Glu Ile Phe 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 33

Ser Tyr Ser Phe Gin Vai Ala Arg Gly Met 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 34

Lys Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 35

Ser Phe Gin Vai Ala Arg Gly Met Glu Phe 1 5 10

<210> 36 <211> 10 <212> PRT ΕΡ 1 855 707/ΡΤ 45 <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4Ο0> 36

Arg Tyr Vai Asn Ala Phe Lys Phe Met Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 37

Lys Ile Gin Gin Glu Pro Gly Ile Ile Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <4 0 0> 38

Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys Ile Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 39 46 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Glu Leu Vai Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 40

Lys Ser Asp Vai Trp Ser Tyr Gly Vai Leu 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 41

Asp Vai Leu Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Ile 1 5 10 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente <400> 42

Asn Leu Vai Pro Met Vai Ala Thr Vai 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 47 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ <22 0> <223> Uma sequência de péptido sintetizada artificialmente. <400> 43

Gin Tyr Asp Pro Vai Ala Ala Leu Phe 1 5 <210> 44 <211> 5777

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gcggacactc ctctcggctc ctccccggca gcggcggcgg ctcggagcgg gctccggggc 60 tcgggtgcag cggccagcgg gcctggcggc gaggattacc cggggaagtg gttgtctcct 120 ggctggagcc gcgagacggg cgctcagggc gcggggccgg cggcggcgaa cgagaggacg 180 gaotctggcg gecgggtcgt tggccggggg agcgcgggca ccgggcgagc aggccgcgtc 240 gcgctcacca tggtcagcta ctgggscacc ggggtcctgc tgtgcgcgct gctcagctgt 300 ctgcttctca caggatctag ttcaggttca aaattaaaag atcctgaact gagtttaaaa 360 ggcacccagc acatcatgca agcaggccag acactgcatc tccaatgcag gggggaagca 420 gcccataaat ggtctttgcc tgaaatggtg agtaaggaaa gcgaaaggct gagcataact 480 aaatctgcct gtggaagaaa tggcaaacaa ttctgcagta ctttaacctt gaacacagct 540 caagcaaacc acactggctt ctacagctgc aaatatctag ctgtacctac ttcaaagaag 600 aaggaaacag aatctgcaat ctatatattt attagtgata caggtagacc tttcgtagag 660 atgtacagtg aaatccccga aattatacac atgactgaag gaagggagct cgtcattccc 720 tgccgggtta cgtcacctaa catcactgtt actttaaaaa agtttccact tgacactttg 780 atccctgatg gaaaacgcat aatctgggac agtagaaagg gcttcatcat atcaaatgca 840 acgtacaaag aaatagggct tctgacctgt gaagcaacag tcaatgggca tttgtataag 900 acaaactatc tcacacatcg acaaaccaat acaatcatag atgtccaaat aagcacacca 960 cgcccagtca aatfacttag aggccatact cttgtcctca attgtactgc taccactccc 1020 48 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ ttgaacacga gagttcaaat gacctggagt taccctgatg aaaaaaataa gagagcttcc 1080 gtaaggcgac gaattgacca aagcaattcc catgccaaca tattctacag tgttcttact 1140 attgacaaaa tgcagaacaa agacaaagga ctttatactt gtcgtgtaag gagtggacca 1200 tcattcaaat ctgttaacac ctcagtgcat atatatgata aagcattcat cactgtgaaa 1260 catcgaaaac agcaggtgct tgaaaccgta gctggcaagc ggtcttaccg gctctctatg 1320 aaagtgaagg catttccctc gccggaagtt gtatggttaa aagatgggtt acctgcgact 1380 gagaaatctg ctcgctattt gactcgtggc tactcgttaa ttatcaagga cgtaactgaa 1440 gaggatgcag ggaattatac aatcttgctg agcataaaac agtcaaatgt gtttaaaaac 1500 ctcactgcca ctctaattgt caatgtgaaa ccccagattt acgaaaaggc cgtgtcatcg 1560 tttccagacc cggctctcta cccactgggc agcagacaaa tcctgacttg taccgcatat 1620 ggtatccotc aacctacaat caagtggttc tggcacccct gtaaccataa tcattccgaa 1680 gcaaggtgtg acttttgttc caataatgaa gagtccttta tcctggatgc tgacagcaac 1740 atgggaaaca gaattgagag catcactcag cgcatggcaa taatagaagg aaagaataag 1800 atggctagca ccttggttgt ggctgactct agaatttctg gaatctacat ttgcatagct 1860 tccaataaag ttgggactgt gggaagaaac ataagctttt atatcacaga tgtgccaaat 1920 gggtttcatg ttaacttgga aaaaatgccg acggaaggag aggacctgaa actgtcttgc 1980 acagttaaca agttcttata cagagacgtt acttggattt tactgcggac agttaataac 2040 agaacaatgc actacagtat tagcaagcaa aaaatggcca tcactaagga gcactccatc 2100 actcttaatc ttaccatcat gaatgtttcc etgcaagatt caggcaccta tgcctgcaga 2160 gccaggaatg tatacacagg ggaagaaatc ctccagaaga aagaaattac aatcagagat 2220 49

ΕΡ 1 855 707/PT caggaagcac catacctcct gcgaaacctc agtgatcaca cagtggccat cagcagttcc 2280 accactttag actgtcatgc taatggtgtc cccgagcctc agatcacttg gtttaaaaac 2340 aaccacaaaa tacaacaaga gcctggaatt attttaggac caggaagcag cacgctgttt 2400 attgaaagag tcacagaaga ggatgaaggt gtctatcact gcaaagccac caaccagaag 2460 ggctctgtgg aaagttcagc atacctcact gttcaaggaa cctcggacaa gtctaatctg 2520 gagctgatca ctctaacatg cacctgtgtg gctgcgactc tcttctggct cctattaacc 2580 ctccttatcc gaaaaatgaa aaggtcttct tctgaaataa agactgacta cctatcaatt 2640 ataatggacc cagatgaagt tcctttggat gagcagtgtg agcggctccc ttatgatgcc 2700 agcaagtggg agtttgcccg ggagagactt aaactgggca aatcacttgg aagaggggct 2760 tttggaaaag tggttcaagc atcagcattt ggcattaaga aatcacctac gtgccggact 2820 gtggctgtga aaatgctgaa agagggggcc acggccagcg agtacaaagc tctgátgact 2880 gagctaaaaa tcttgaccca cattggccac catctgaacg tggttaacct gctgggagcc 2940 tgcaccaagc aaggagggcc tctgatggtg attgttgaat actgcaaata tggaaatc.tc 3000 tccaactacc tcaagagcaa acgtgactta ttttttctca acaaggatgc agcactacac 3060 atggagccta agaaagaaaa aatggagcca ggcctggaac aaggcaagaa accaagacta 3120 gatagcgtca ccagcagcga aagctttgcg agctccggct ttcaggaaga taaaagtctg 3180 agtgatgttg aggaagagga ggattctgac ggtttctaca aggagcccat cactatggaa 3240 gatctgattt cttacagttt tcaagtggcc agaggcatgg agttcctgtc ttccagaaag 3300 tgcattcatc gggacctggc agcgagaaac attcttttat ctgagaacaa cgtggtgaag 3360 atttgtgatt ttggccttgc ccgggatatt tataagaacc ccgattatgt gagaaaagga 3420 gatactcgac ttcctctgaa atggatggct cccgaatcta tctttgacaa aatctacagc 3480 50 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ accaagagcg acgtgtggtc ttacggagta ttgctgtggg aaatcttctc cttaggtggg 3540 tctccatacc caggagtaca aatggatgag gacttttgca gtcgcctgag ggaaggcatg 3600 aggatgagag ctcctgagta ctctactcct gaaatctatc agatcatgct ggactgctgg 3660 cacagagacc caaaagaaag gccaagattt gcagaacttg tggaaaaact aggtgatttg 3720 cttcaagcaa atgtacaaca ggatggtaaa gactacatcc caatcaatgc catactgaca 3780 ggaaatagtg ggtttacata ctcaactcct gccttctctg aggacttctt caaggaaagt 3840 atttcagctc cgaagtttaa ttcaggaagc tctgatgatg tcagatatgt aaatgctttc 3900 aagttcatga gcctggaaag aatcaaaacc tttgaagaac ttttaccgaa tgccacctcc 3960 atgtttgatg actaccaggg cgacagcagc actctgttgg cctctcccat gctgaagcgc 4020 ttcacctgga ctgacagcaa acccaaggcc tcgctcaaga ttgacttgag agtaaccagt 4080 aaaagtaagg agtcggggct gtctgatgtc agcaggccca gtttctgcca ttccagctgt 4140 gggcacgtca gcgaaggcaa gcgcaggttc acctacgacc acgctgagct ggaaaggaaa 4200 atcgcgtgct gctccccgcc cccagactac aactcggtgg tcctgtactc caccccaccc 4260 atctagagtt tgacacgaag ccttatttct agaagcacat gtgtatttat acccccagga 4320 aactagcttt tgccagtatt atgcatatat aagtttacac ctttatcttt ccatgggagc 4380 cagctgct.tt ttgtgatttt tttaatagtg cttttttttt ttgactaaca agaatgtaac 4440 tccagataga gaaatagtga caagtgaaga acactactgc taaatcctca tgttactcag 4500 tgttagagaa atccttccta aacccaatga cttccctgct ccaacccccg ccacctcagg 4560 gcacgcagga ccagtttgat tgaggagctg cactgatcac ccaatgcatc acgtacccca 4620 ctgggccagc cctgcagccc aaaacccagg gcaacaagcc cgttagcccc aggggatcac 4680 51 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ tggctggcct gagcaacatc tcgggagtcc tctagcaggc ctaagacatg tgaggaggaa 4740 aaggaaaaaa agcaaaaagc aagggagaaa agagaaaccg ggagaaggca tgagaaagaa 4800 tttgagacgc accatgtggg cacggagggg gacggggctc agcaatgcca tttcagtggc 4860 ttcccagctc tgacccttct acatttgagg gcccagccag gagcagatgg acagcgatga 4920 ggggacattt tctggattct gggaggeaag aaaaggacaa atatcttttt tggaactaaa 4980 gcaaatttta gacctttacc tatggaagtg gttctatgtc cattctcatt cgtggcatgt 5040 tttgatttgt agcactgagg gtggcactca actctgagcc catacttttg gctcctctag 5100 taagatgcac tgaaaactta gccagagtta ggttgtctcc aggccatgat ggccttacac 5160 tgaaaatgtc acattctatt ttgggtatta atatatagtc cagacactta actcaatttc 5220 tíggtattat tctgttttgc acagttagtt gtgaaagaaa gctgagaaga atgaaaatgc 5280 agtcctgagg agagttttct ccatatcaaa acgagggctg atggaggaaa aaggtcaata 5340 aggtcaaggg aagaccccgt etetatacea accaaaccaa ttcaccaaca cagttgggac 5400 ccaaaacaca ggaagtcagt cacgtttcct tttcatttaa tggggattcc actatctcac 5460 actaatctga aaggatgtgg aagagcatta gctggcgcat attaagcact ttaagctcct 5520 tgagtaaaaa ggtggtatgt aatttatgca aggtatttct ccagttggga ctcaggatat 5580 tagttaatga gccatcacta gaagaaaagc ccattttcaa ctgctttgaa acttgcctgg 5640 ggtctgagca tgatgggaat agggagacag ggtaggaaag ggcgcctact cttcagggtc 5700 taaagatcaa gtgggccttg gatcgctaag ctggctctgt ttgâtgctat ttatgcaagt 5760 tagggtctat gtattta 5777

<210> 45 <211> 1338 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 52 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Met Vai Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Vai Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30 Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gin His Ile Met Gin Ala Gly Gin Thr 35 40 45 Leu His Leu Gin Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Met Vai Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80 Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gin Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Gin Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Vai 100 105 110 Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile 115 120 125 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Vai Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 130 135 140 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Vai Ile Pro Cys Arg Vai 145 150 155 160 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Vai Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Ile Ile Ser Asn' Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 53 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ 195 200 205

Ala Thr Vai Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220

Gin Thr Asn Thr Ile Ile Asp Vai Gin Ile Ser Thr Pro Arg Pro Vai 225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Vai Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255

Pro Leu Asn Thr Arg Vai Gin Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270

Asn Lys Arg Ala Ser Vai Arg Arg Arg Ile Asp Gin Ser Asn Ser His 275 280 285

Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Vai Leu Thr Ile Asp Lys Met Gin Asn Lys 290 295 300

Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Vai Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320

Ser Vai Asn Thr Ser Vai His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Vai 325 330 335

Lys His Arg Lys Gin Gin Vai Leu Glu Thr Vai Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350

Tyr Arg Leu Ser Met Lys Vai Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Vai Vai 355 360 365

Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu 370 375 380

Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Vai Thr Glu Glu Asp Ala 385 390 395 400

Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gin Ser Asn Vai Phe Lys 405 410 415 54 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Vai Asn Vai Lys Pro Gin Ile Tyr Glu 420 425 430 Lys Ala Vai Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser 435 440 445 Arg Gin Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gin Pro Thr Ile 450 455 460 Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys 465 470 475 480 Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser 485 490 495 Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gin Arg Met Ala Ile Ile 500 505 510 Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Vai Vai Ala Asp Ser Arg 515 520 525 Ile Ser Gly lie Tyr lie Cys Ile Ala Ser Asn Lys Vai Gly Thr Vai 530 535 540 Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Ásp Vai Pro Asn Gly Phe His 545 550 555 560 Vai Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser 565 570 575 Cys Thr Vai Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Vai Thr Trp Ile Leu Leu 580 585 590 Arg Thr Vai Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gin Lys 595 600 605 Met Ala lie Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met 610 615 620 Asn Vai Ser Leu Gin Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn 625 630 635 640 55 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Vai Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gin Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg 645 650 655 Asp Gin Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Vai 660 665 670 Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Vai Pro 675 680 685 Glu Pro Gin Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gin Gin Glu 690 695 700 Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg 705 710 715 720 Vai Thr Glu Glu Asp Glu Gly Vai Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gin 725 730 735 Lys Gly Ser Vai Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Vai Gin Gly Thr Ser 740 745 750 Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr Cys Thr Cys Vai Ala 755 760 765 Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ile Arg Lys Met Lys 770 775 780 Arg Ser Ser Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp 785 790 795 800 Pro Asp Glu Vai Pro Leu Asp Glu Gin Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 815 Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser 820 825 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Vai Vai Gin Ala Ser Ala Phe Gly 835 840 845

Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Vai Ala Vai Lys Met Leu Lys 56 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ 850 855 860

Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 865 870 875 880 Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Vai Vai Asn Leu Leu Gly 885 890 895 Ala Cys Thr Lys Gin Gly Gly Pro Leu Met Vai Ile Vai Glu Tyr Cys 900 905 910 Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 915 920 925 Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 930 935 940 Met Glu Pro Gly Leu Glu Gin Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Vai 945 950 955 960 Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gin Glu Asp Lys Ser 965 970 975 Leu Ser Asp Vai Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990

Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gin Vai Ala Arg 995 1000 1005

Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu 1010 1015 1020

Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Vai Vai Lys Ile 1025 1030 1035

Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr 1040 1045 1050

Vai Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro 1055 1060 1065 57 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Glu Ser Ile Phe Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Vai Trp 1070 1075 1080 Ser Tyr Gly Vai Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser 1085 1090 1095 Pro Tyr Pro Gly Vai Gin Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu 1100 1105 1110 Arg Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu 1115 1120 1125 Ile Tyr Gin Ile Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu 1130 1135 1140 Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Vai Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu 1145 1150 1155 Gin Ala Asn Vai Gin Gin Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Pro Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala 1175 1180 1185 Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala Pro Lys Phe 1190 1195 1200 Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Vai Arg Tyr Vai Asn Ala Phe Lys 1205 1210 1215 Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro 1220 1225 1230 Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gin Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245 Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser 1250 1255 1260 Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Vai Thr Ser Lys 1265 1270 1275 58 ΕΡ 1 855 707/ΡΤ

Ser Lys Glu Ser Gly Leu Ser Asp Vai Ser Arg Pro Ser Phe Cys 1280 1285 1290

His Ser Ser Cys Gly His Vai Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr 1295 1300 1305

Tyr Asp His Ala Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro 1310 1315 1320

Pro Pro Asp Tyr Asn Ser Vai Vai Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile 1325 1330 1335

Lisboa, 2012-05-17

Claims (16)

1. ΕΡ 1 855 707/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido com menos de 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, onde o péptido possui indutibilidade de células T citotóxicas.
2. 2. Péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, onde o péptido consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, onde 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos ou acrescentados e onde o péptido não é NLTATLAVNV.
3. 3. Péptido da reivindicação 2, onde o segundo aminoácido a partir do terminal N é leucina ou metionina.
4. 4. Péptido da reivindicação 2 ou 3, onde o aminoácido C-terminal é valina ou leucina.
5. 5. Composição farmacêutica compreendendo um ou mais péptidos da reivindicação 1 ou 2.
6. 6. Composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese ou tumores, onde a composição compreende um ou mais péptidos seleccionados entre o grupo consistindo de: (a) um péptido com menos de 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 ou 13, onde o péptido possui indutibilidade de células T citotóxicas; e (b) um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, onde o péptido consiste da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 ou 13, onde 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos ou acrescentados; ou um polinucleótido codificando o referido péptido.
7. 7. Utilização de um péptido como definido na reivindicação 6 ou de um polinucleótido codificando o referido péptido para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de tumores ou de uma doença mediada por angiogénese. ΕΡ 1 855 707/ΡΤ 2/3
8. 8. Exossoma que apresenta sobre a sua superfície um complexo compreendendo um péptido como definido na reivindicação 6 e um antigénio de HLA.
9. 9. Exossoma da reivindicação 8, onde o antigénio de HLA é HLA-AO2.
10. 10. Exossoma da reivindicação 9, onde o antigénio de HLA é HLA-0201.
11. 11. Célula de apresentação de antigénio, que compreende um complexo formado entre um antigénio de HLA e um péptido como definido na reivindicação 6.
12. 12. Vacina para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese, onde a vacina compreende um ou mais péptidos seleccionados entre o grupo consistindo de: (a) um péptido com menos de 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 ou 13, onde o péptido possui indutibilidade de células T citotóxicas; (b) um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, onde o péptido consiste da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 ou 13, onde 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos ou acrescentados; e (c) um péptido consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; ou um polinucleótido codificando o referido péptido como o ingrediente activo.
13. 13. Vacina para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese de acordo com a reivindicação 12 para utilização na administração a um sujeito cujo antigénio de HLA é HLA-A02.
14. 14. Composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese, onde a composição compreende um ou mais péptidos seleccionados entre o grupo consistindo de: (a) um péptido com menos de 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, onde o péptido possui indutibilidade de células T citotóxicas; e ΕΡ 1 855 707/ΡΤ 3/3 (b) um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, onde o péptido consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, onde 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos ou acrescentados.
15. 15. Utilização da reivindicação 7, onde a doença mediada por angiogénese é seleccionada entre o grupo consistindo de retinopatia diabética, artrite reumatóide crónica, psoríase, e aterosclerose.
16. 16. Vacina para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese de acordo com a reivindicação 12 ou a composição para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por angiogénese de acordo com a reivindicação 6 ou 14, onde a doença mediada por angiogénese é seleccionada entre o grupo consistindo de retinopatia diabética, artrite reumatóide crónica, psoríase, e aterosclerose. Lisboa, 2012-05-17