ES2613808T3 - Péptido derivado de ERAP1 y uso del mismo - Google Patents

Péptido derivado de ERAP1 y uso del mismo Download PDF

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ES2613808T3 ES12820786.7T ES12820786T ES2613808T3 ES 2613808 T3 ES2613808 T3 ES 2613808T3 ES 12820786 T ES12820786 T ES 12820786T ES 2613808 T3 ES2613808 T3 ES 2613808T3
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Takuya Tsunoda
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Abstract

Un péptido que inhibe la unión de polipéptido ERAP1 al polipéptido PHB2, que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en cualquiera de los siguientes (a) y (b): (a) una secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 31; y (b) una secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 31 en la que uno, dos, o varios residuos de aminoácidos distintos de glutamina en la posición 1, ácido aspártico en la posición 5, y glutamina en la posición 9, están sustituidos con otros residuos de aminoácidos.

Description

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DESCRIPCION
Peptido derivado de ERAP1 y uso del mismo Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un peptido derivado de ERAP1 y al uso terapeutico del mismo.
Antecedentes de la tecnica
El cancer de mama es el cancer de mas alta incidencia en las mujeres japonesas. El cancer de mama a menudo depende de las hormonas (estrogeno: E2). La proliferacion del cancer de mama se promueve a traves de la activacion de un receptor hormonal (receptor de estrogenos: ER). Como mecanismos para la proliferacion del cancer de mama mediante la activacion del RE, se han publicado dos mecanismos diferentes: un mecanismo en el que el RE funciona como un regulador transcripcional (activacion genomica); y un mecanismo en el que el RE participa en la activacion de la cascada de fosforilacion intracelular como un RE tipo membrana localizado en la membrana celular (activacion no genomica) (documentos no de patente 1 a 3). Sin embargo, todavfa hay muchos puntos poco claros para el mecanismo molecular de la propia activacion del RE.
Ademas, la tasa de supervivencia de los pacientes con cancer de mama mejora notablemente mediante el uso del tamoxifeno (TAM), como un antiestrogeno en la terapia adyuvante postoperatoria o en el tratamiento estandar del cancer de mama avanzado o recidivante. Sin embargo, alrededor del 30% del cancer de mama RE-positivo es refractario al TAM. Asimismo, de acuerdo con los tratamientos estandar, el TAM se administra durante 5 anos en las terapias adyuvantes postoperatorias. Por lo tanto, existe un serio problema por el que el uso prolongado de TAM hace que las celulas de cancer de mama se hagan resistentes a TAM (documentos no de patente 1 a 3). Como mecanismo de esta refractariedad o resistencia al TAM, hay varios mecanismos comunicados; tales como la acelerada sensibilidad a los estrogenos, y la interferencia de receptores de membrana, tales como EGFR, HER2 e IGFR con una ruta de senal del factor de crecimiento (documentos no de patente 1 a 3). Sin embargo, todavfa hay muchos puntos poco claros sobre el mecanismo refractario o de resistencia a TAM. Ademas, en los ultimos anos, los inhibidores de aromatasa o las preparaciones de agonistas de LH-RH tambien se utilizan en el tratamiento del cancer de mama. Sin embargo, estos medicamentos inhiben la produccion de estrogenos. Por lo tanto, se presentan efectos secundarios, tales como una disminucion en la densidad osea debido a una disminucion en el nivel de estrogenos. Como se describio anteriormente, los problemas urgentes son la elucidacion del mecanismo de la actividad regulada por RE del cancer de mama dependiente de E2 y el desarrollo de un nuevo agente terapeutico para el cancer de mama dependiente de E2.
Los presentes inventores han identificado hasta el momento una nueva protema regulada por la actividad del receptor de estrogenos 1 (ERAP1) (tambien conocida como BIG3) que se ha observado que es altamente expresada espedficamente en el cancer de mama a alta frecuencia, a traves de un analisis global de la expresion genica en el cancer de mama utilizando un microarray de cDNA (Documento de Patente 1 y Documento no de patente 4). Los resultados, que se describen a continuacion, se obtienen mediante un analisis detallado de las funciones de ERAP1. A saber, ERAP1 se une a la protema PHB2/REA (prohibitina 2/represor de la actividad de estrogenos), un represor de la activacion de RE en el citoplasma, que bloquea la translocacion nuclear dependiente de E2 de PHB2/REA. Por lo tanto, ERAP1 puede conducir a la activacion constitutiva de RE en las celulas del cancer de mama mediante la inhibicion de la funcion de supresion de la actividad de REa de PHB2/REA (Documento de patente 1 y Documento no de Patente 4)
Documentos de la tecnica relacionada Documentos de patente Documento de Patente 1: WO 2008/018642 Documentos no de patente
Documento de no patente 1: Osborne CK, Schiff R. J Clin Oncol. 2005; 23: 1616-1622.
Documento de no patente 2: Yager JD, Davidson NE. N Engl J Med. 2006; 354: 270-82.
Documento de no patente 3: Johnston SR. Clin Cancer Res. 2010;16: 1979-1987.
Documento de no patente 4: Kim JW, Akiyama M, ParkJH, et al. Cancer Sci. 2009; 100: 1468-1478.
Sumario de la invencion Problemas a resolver por la invencion
Un problema a ser resuelto por la presente invencion es proporcionar un peptido util para el tratamiento del cancer de mama y similares, y la aplicacion del peptido a la terapia del cancer de mama.
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Soluciones a los problemas
Los presentes inventores han encontrado que un fragmento de peptido de ERAP1 (peptido ERAP1) que comprende un sitio de union a PHB2 inhibe la union de ERAP1 a PHB2 para causar la translocacion nuclear de PHB2, lo que provoca la supresion de la activacion transcripcional de rE por PHB2. Ademas, los presentes inventores han confirmado que PHB2 se disocia de ERAP1 y se une a RE en la membrana celular, y suprime la activacion de la ruta de Akt, la activacion de la ruta MAPK, y la fosforilacion del RE nuclear. Por lo tanto, los presentes inventores han confirmado que el peptido ERAP1 suprime tanto la ruta de activacion genomica como la ruta de activacion no genomica de RE. Ademas, los presentes inventores han confirmado que el peptido ERAP1 tambien suprime la regulacion a la baja por la degradacion de protemas de RE por la via de la ubiquitina-proteasoma, que es esencial para la activacion transcripcional del RE. A saber, los presentes inventores han confirmado que el peptido ERAP1 suprime por completo la activacion transcripcional de RE. Ademas, los presentes inventores han confirmado que el peptido ERAP1 tiene un efecto antitumoral en el cancer de mama dependiente de estrogenos. A saber, el peptido ERAP1 suprime la proliferacion celular dependiente de estrogenos de las celulas de cancer de mama ER-positivas. Ademas, el peptido ERAP1 tambien exhibe efectos antitumorales en pruebas con ratones ortotopicamente trasplantados con celulas de cancer de mama. Ademas, los presentes inventores han encontrado que el peptido ERAPI tambien tiene un efecto de supresion sobre la proliferacion de celulas no dependiente de estrogenos de las celulas de cancer de mama positivas para el receptor de estrogeno. Ademas, los presentes inventores han encontrado que el peptido ERAP1 suprime la proliferacion celular de las celulas de cancer de mama resistentes a tamoxifeno. Ademas, los presentes inventores han confirmado que el uso concomitante del peptido ERAP1 y el tamoxifeno tienen un efecto antitumoral mayor que el uso individual de los mismos.
Ademas, los presentes inventores han encontrado que la fosforilacion en Ser39 de PHB2 es importante para la supresion de la proliferacion celular dependiente de estrogenos. Los presentes inventores han confirmado que la fosforilacion en Ser39 de PHB2 es debida a la desfosforilacion del PP1a que esta unido indirectamente a traves de ERAP1. Ademas, los presentes inventores han confirmado que la actividad de la fosfatasa de PP1a esta regulada por la fosforilacion de ERAP1 por PKA y PKB. Estos resultados muestran que la union de ERAP1 a PKA, PKB, o PP1a juega un papel importante en la proliferacion celular dependiente de estrogenos.
Ademas, los presentes inventores han confirmado que el peptido ERAP1 tambien suprime la proliferacion de celulas de cancer de mama negativo para el receptor de estrogenos.
La presente invencion se basa en los hallazgos descritos anteriormente, y es como se define en las reivindicaciones adjuntas a esta descripcion.
Efectos de la invencion
Segun la presente invencion, se proporciona un peptido ERAP1 util para tratar y/o prevenir el cancer, en particular el cancer positivo para receptor de estrogenos. De acuerdo con el peptido ERAP1 de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica para tratar o prevenir el cancer, mas espedficamente el cancer positivo para el receptor de estrogenos. Los canceres en los que el peptido ERAP1 de la presente invencion pueden ejercer efectos deseados incluyen el cancer de mama dependiente de estrogenos. La presente invencion proporciona una tecnica terapeutica con un nuevo mecanismo para el cancer de mama dependiente de estrogenos para el que se ha deseado una nueva tecnica terapeutica.
Ademas, de acuerdo con la presente descripcion, se proporciona un metodo para el cribado de un material candidato para un farmaco util para tratar y/o prevenir el cancer, en particular el cancer positivo para el receptor de estrogenos.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1-1 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 transcelular se une a PHB2, e inhibe la interaccion entre ERAP1 y PHB2. (A) es un diagrama esquematico que ilustra tres clones del fragmento Flag-ERAPI del que o bien se suprime uno de ERAP1 humano como una region terminal del mismo. (B) es un diagrama que ilustra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se identifico la region de union a PHB2 de ERAP1. Celulas COS-7 fueron transfectadas con cualquiera de los constructos ERAP1 mostrados en la figura (ERAP1 de longitud completa, ERAPI1-434, ERAPI435-2.177, y ERAPI1468-2177) junto con el constructo PHB2. Las celulas se lisaron despues de 48 horas de la transfeccion. Entonces, el ERAP1 marcado con Flag se inmunoprecipito a partir del lisado celular con el anticuerpo anti-Flag. La protema inmunoprecipitada y el lisado celular (de entrada) se sometieron a analisis de inmunotransferencia (IB) utilizando los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 1-2 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 transcelular se une a PHB2, e inhibe la interaccion entre ERAP1 y PHB2. (C) es un diagrama esquematico que ilustra el clon del fragmento Flag-ERAP1 de ERAP11-434 y dos clones del fragmento Flag-ERAP1 del que la region terminal C de ERAP11-434 esta suprimida. (D) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por la cual se identifico la region de union a PHB2 en ERAP11-434. Celulas COS-7 fueron transfectadas con cualquiera de los constructos de ERAP1 que se muestra en (C) (ERAP11- 434, ERAP1 1-250, ERAP1 1-100) junto con el constructo PHB2. Las celulas se lisaron despues de 48 horas de la transfeccion. Entonces, el ERAP1 marcado con Flag se inmunoprecipito a partir del lisado celular con el anticuerpo
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anti-Flag. La protema inmunoprecipitada y el lisado celular (de entrada) se sometieron a analisis de inmunotransferencia (IB) utilizando los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 1-3 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 transcelular se une a PHB2, e inhibe la interaccion entre ERAP1 y PHB2. (E) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que la variante de ERAPI-delecionada inhibe la interaccion entre ERAP1 y PHB2. Celulas COS-7 fueron transfectadas con ERAP1 de Flag-longitud completa, un constructo de HA-PHB2, y una construccion de la variante ERAPI-delecionada (AERAP1: ERAPI1-434) en las concentraciones mostradas en la figura. Las celulas se lisaron despues de 48 horas de la transfeccion. Entonces, el PHB2 marcado con HA se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con el anticuerpo anti-HA. La protema inmunoprecipitada y el lisado celular (de entrada) se sometieron a analisis de inmunotransferencia utilizando los anticuerpos que se muestran en la figura. (F) muestra los resultados del ensayo de la luciferasa por el que se evaluo el efecto de inhibicion de la variante de ERAPI-delecionada en la actividad transcripcional de ERa. Celulas COS-7 se transfectaron con AERAP1, ERAP1 de longitud completa, PHB2, ERa y cada plasmido de un vector de ERE-luciferasa. Al mismo tiempo, las celulas se estimularon con E2 1 |iM durante 48 horas. Los datos muestran los multiplos cuando el valor para las celulas no tratadas fue designado como 1, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01.
La figura 1-4 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 transcelular se une a PHB2, e inhibe la interaccion entre ERAP1 y PHB2. (G) muestra el sitio de interaccion estimado con el software PISVER y la secuencia de la construccion ERAP1 mutante. (+) en el software PISVER muestra un residuo de aminoacido que tiene 0,39 o mas del umbral predeterminado, y los residuos de aminoacidos de cara en negrita representan residuos de aminoacidos que mostraron la puntuacion mas alta (> 0,6) con respecto a la interaccion entre ERAP1 y PHB2. (H) muestra los sitios de union PHB2-deducidos (Q165, D169, Q173) en la estructura tridimensional estimada de ERAP1. (I) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la region de union de PHB2-en ERAP1.
La figura 1-5 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 transcelular se une a PHB2, e inhibe la interaccion entre ERAP1 y PHB2. (J) muestra las secuencias del peptido ERAP-1, el peptido ERAP1-codificado y el peptido ERAP1-mutante. (K) es un diagrama que ilustra los efectos de inhibicion del peptido ERAP1 en la interaccion ERAP1-PHB2 en celulas MCF-7 (panel superior) y celulas KPL-3C (panel inferior). Las celulas MCF-7 o celulas KPL- 3C se trataron con 10 |iM de peptido ERAP1 (Pep), el peptido ERAP1-codificado (Scr) o el peptido ERAP1-mutante (Mut). Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. El lisado celular de estas celulas se inmunoprecipito con anticuerpos o IgG de conejo normal como se muestra en la figura. A continuacion, se realizo la inmunotransferencia con un anticuerpo anti-ERAP1 o un anticuerpo anti-PHB2.
La figura 2 es un diagrama que ilustra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la union del peptido ERAP1 a PHB2. El lisado celular de las celulas COS-7 transfectadas temporalmente con el plasmido ERAP1 marcado con Flag se incubo durante 1 hora junto con protema PHB2 recombinante 6xHis-marcado (10 |ig) y peptido ERAP1, el peptido ERAP1-codificado, o el peptido ERAP1-mutante en cada concentracion que se muestra en la figura. Entonces, His-PHB2 se sometio a desplegamiento con Ni-NTA agarosa (Ni-resina).
La figura 3-1 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con peptido ERAP1 promueve la translocacion nuclear de PHB2. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se detectan las localizaciones de ERAP1 y PHB2. Fueron estimuladas celulas MCF-7 durante 24 horas con peptido ERAP1 10 |iM y/o E2 10 nM. Las celulas se fraccionaron en las mitocondrias, el citoplasma y en fracciones nucleares por centrifugacion por gravedad espedfica. Despues, cada fraccion se sometio a analisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-ERAP1 y un anticuerpo anti-PHB2. PRDX3, a/p-Tublin (Tublin) y lamin B son marcadores de las mitocondrias, citoplasma, y de las fracciones nucleares, respectivamente (panel superior). El contenido de protema de cada fraccion se evaluo con gel de SDS-PAGE tenido con Coomassie (panel inferior). (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se detecta la localizacion intracelular de PHB2. Las celulas KPL-3C se trataron durante 24 horas con peptido ERAP1 10 |iM marcado con HA y/o E2 10 nM. Entonces, las celulas se fraccionaron en citoplasma y fracciones nucleares por centrifugacion por gravedad espedfica. Despues, cada fraccion se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa, un anticuerpo anti-ERAP1 o un anticuerpo anti-PHB2. Entonces, la inmunotransferencia se realizo con cada anticuerpo que se muestra en la figura (un anticuerpo anti-ERAP1, un anticuerpo anti-REa, un anticuerpo anti-PHB2 y un anticuerpo anti-HA (peptido)). a/p-tubulina (tubulina) y Lamin B son marcadores para fracciones del citoplasma y nucleares, respectivamente.
La figura 3-2 es un diagrama que ilustra el efecto de promocion de la translocacion nuclear de PHB2 y el efecto de supresion de la activacion transcripcional de RE por el tratamiento con peptido ERAP1. (C) ilustra imagenes representativas de las celulas inmunes tenidas, que muestra la localizacion de peptido ERAP1 (peptido ERAP1 HA- marcado) y PHB2. Las celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 HA-marcado 10 |iM durante 24 horas en presencia o en ausencia de E2 10 nM. Despues de la inmovilizacion, las celulas se sometieron a tincion por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-HA, un anticuerpo anti-PHB2 y DAPI (para discriminar el nucleo). La flecha indica el peptido ERAP1 nuclear-translocado. (D) muestra los resultados del ensayo de la luciferasa por el que se evaluo el efecto de inhibicion de peptido ERAP1. Las celulas MCF-7 transfectadas temporalmente con un vector indicador de ERE-luciferasa fueron tratadas con un peptido ERAP1 marcado con HA en las concentraciones que se muestran en la figura. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas.
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TAM indica el tratamiento con tamoxifeno. Los datos muestran la relacion cuando el valor para las celulas no tratadas fue designado como 1, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01; ***P <0,001.
La figura 3-3 es un diagrama que ilustra los resultados del ensayo de la luciferasa por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1. Las celulas MCF-7 transfectadas temporalmente con un vector indicador ERE- luciferasa (E) o un vector indicador AP-1-luciferasa (F) fueron tratadas con el peptido ERAP1, el peptido codificado o el peptido mutante a las concentraciones mostradas en la figura. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. TAM indica el tratamiento con tamoxifeno. Los datos muestran la relacion cuando el valor para las celulas no tratadas fue designado como 1, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. ***P <0,001; NS, no significativo.
La figura 3-4 es un diagrama que ilustra el efecto de supresion de la activacion transcripcional de RE por tratamiento con peptido ERAP1 y de la reconstitucion de un complejo de remodelacion de la cromatina. (G) muestra los resultados del ensayo de la luciferasa por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1. Las celulas KPL-3C transfectadas temporalmente con un vector indicador ERE-luciferasa fueron tratadas con el peptido ERAP1 en las concentraciones mostradas en la figura. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. TAM indica el tratamiento con tamoxifeno. Los datos muestran la relacion cuando el valor para las celulas no tratadas fue designado como 1, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01; ***P <0,001. (H) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual la reconstitucion del complejo de remodelacion de la cromatina por la adicion del peptido ERAP1 fue examinado. Las celulas KPL-3C se trataron durante 24 horas con el peptido ERAP1 y/o E2. Entonces, la fraccion nuclear se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa o un anticuerpo anti-PHB2. Posteriormente, el inmunoprecipitado se sometio a analisis de inmunotransferencia utilizando los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 4-1 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 promueve la translocacion nuclear de PHB2. (A) El panel superior muestra imagenes representativas de las celulas inmunes tenidas, que muestra la localizacion intracelular de PHB2. Celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 10 |iM o peptido ERAP1-codificado. Posteriormente, las celulas fueron tratadas con E2 10 nM. Despues de la inmovilizacion, las celulas se sometieron a tincion de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-pHB2 y DAPI (para discriminar el nucleo). La flecha muestra el PHB2 nuclear translocado. El panel inferior muestra los datos de analisis estadfstico de la intensidad de la senal de PHB2 en el nucleo. Los datos muestran la relacion cuando el valor para las celulas no tratadas fue designado como 1, y muestran la media ± SE de cuatro experimentos independientes. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.
La figura 4-2 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 promueve la translocacion nuclear de PHB2. (B) es un diagrama que ilustra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se detecto la localizacion intracelular de PHB2. Las celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 o el peptido ERAP1-codificado. Posteriormente inmediatamente, las celulas fueron tratadas con e2 10 nM. Las celulas se fraccionaron en el citoplasma y las fracciones nucleares despues de 1 hora o 24 horas. Cada fraccion se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa, un anticuerpo anti-ERAP1 o un anticuerpo PHB2. Ademas, la inmunotransferencia se realizo con cada anticuerpo que se muestra en la figura con respecto a la muestra obtenida. a/p-Tublin (tubulina) y Lamin B son marcadores de las fracciones del citoplasma y nucleares, respectivamente.
La figura 4-3 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 promueve la translocacion nuclear de PHB2. (C) y (D) son figuras que muestran los resultados del ensayo de luciferasa por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la actividad transcripcional de ERa. Celulas MCF-7 transfectadas temporalmente con un vector indicador de ERE-luciferasa (C) o un vector indicador de AP-1-luciferasa (D) fueron tratadas con el peptido ERAP1 a las concentraciones mostradas en la figura o con tamoxifeno 10 nM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Los datos muestran la relacion cuando el valor para las celulas no tratadas fue designado como 1, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01; ***P <0,001.
La figura 4-4 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 promueve la translocacion nuclear de PHB2. (E) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra la conversion del complejo de remodelacion de cromatina por el peptido ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o e2 10 nM durante 24 horas. Entonces, la fraccion nuclear se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa o un anticuerpo anti-PHB2. Posteriormente, el inmunoprecipitado se sometio a analisis de inmunotransferencia utilizando los anticuerpos que se muestran en la figura. (F) muestra los resultados del ensayo de desacetilacion de un complejo de remodelacion de cromatina formado por tratamiento con peptido ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 durante 24 horas. A continuacion, el lisado celular se inmunoprecipito con anticuerpo anti-PHB2. Posteriormente, la actividad de HDAC en el inmunoprecipitado se midio con un kit disponible en el mercado. El extracto nuclear de las celulas HeLa y PBS se utilizo como control positivo (P) y como control negativo (N), respectivamente. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes.
La figura 4-5 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 promueve la translocacion nuclear de PHB2. (G) muestra el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en la desregulacion del REa dependiente de E2. El tratamiento se
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realizo con el peptido ERAP1 y/o E2 para los diferentes tiempos que se muestran en la figura. Entonces, el nivel de protema y el nivel de ARNm para la expresion de REa fueron obtenidos por transferencia Western (panel superior: Protema) y RT-PCR semi-cuantitativa (panel inferior: ARNm), respectivamente. La p-actina es un control de carga para cada uno. (H) muestra los efectos del peptido ERAP1 en la poliubiquitinacion de REa. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 en presencia de MG-132 1 |iM durante 1 hora. A continuacion, el lisado celular se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa. Entonces, el analisis de inmunotransferencia se realizo usando los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 5 es un diagrama que ilustra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluaron los efectos del peptido ERAP1 en la regulacion a la baja por poliubiquitinacion de REa y la descomposicion del proteasoma. El panel superior y el panel inferior muestran los resultados obtenidos por los procedimientos descritos a continuacion. Es decir, las celulas KPL-3C fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 10 nM durante 1 hora. Entonces, el nivel de protema y el nivel de ARNm de REa se examinaron mediante transferencia Western y RT-PCR semi-cuantitativa. Los resultados del mismo se muestran en el panel superior. La p-actina es un control de carga. Luego, las celulas KPL-3C fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 en presencia de MG-132 1 |iM durante 1 hora. A continuacion, el lisado celular se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa. Posteriormente, el analisis de inmunotransferencia se realizo usando los anticuerpos que se muestran en la figura. Los resultados del mismo se muestran en el panel inferior.
La figura 6-1 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la proliferacion de celulas dependiente de REa de lmeas celulares de cancer de mama. (A) y (B) muestran los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en la proliferacion celular dependiente de E2. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 (A, B), el peptido ERAP1-codificado (B) o el peptido ERAP1-mutante (B). Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM para los diferentes tiempos que se muestran en la figura (A) o durante 24 horas (B). Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. ***P <0,001; NS, no significativo. (C) muestra los resultados del ensayo de MTT que muestra que la peptido ERAP1 no tuvo efecto sobre la proliferacion de celulas epiteliales mamarias REa/ERAP1-negativo, MCF-10A. Las celulas se trataron durante 24 horas con el peptido ERAP1 en las concentraciones mostradas en la figura, y se evaluo la proliferacion celular.
La figura 6-2 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la proliferacion de celulas dependientes de REa de lmeas celulares de cancer de mama. (D) muestra los resultados del analisis de FACS que muestra los efectos del peptido ERAP1 sobre el ciclo celular. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM o tamoxifeno 10 nM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Despues de la inmovilizacion, las celulas se tineron con yoduro de propidio, y se analizaron por citometna de flujo.
La figura 6-3 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la proliferacion de celulas dependientes de REa de lmeas celulares de cancer de mama. (E) muestra los resultados de la PCR en tiempo real por el que se evaluaron los efectos del peptido ERAP1 en la expresion genica. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 segun se describio anteriormente. Despues de la extraccion de RNA y la smtesis de ADNc, se evaluo la expresion de genes. Los datos muestran la relacion cuando el valor a 0 horas fue designado como 1,0, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01; ***P <0,001.
La figura 7-1 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la proliferacion de celulas dependientes de REa de lmeas celulares de cancer de mama. (A) muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la proliferacion de las celulas KPL-3C. Celulas KPL- 3C fueron tratadas con el peptido ERAP1, el peptido codificado o el peptido mutante. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. ***P <0,001; NS, no significativo. (B) muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el tratamiento a largo plazo con el peptido ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 a las concentraciones mostradas en la figura. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM. Despues, se anadio el peptido ERAP1 cada dfa durante cuatro dfas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. La flecha indica la adicion del peptido ERAP1.
La figura 7-2 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la proliferacion de celulas dependiente de REa de lmeas celulares de cancer de mama. (C) muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la proliferacion celular de lmeas celulares de cancer de mama REa/ERAP1-positivo. Varias lmeas de celulas de cancer de mama REa/ERAP1-positivo mostradas en la figura se trataron con 10 |iM del peptido ERAP1 o el peptido codificado o tamoxifeno 10 nM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01; ***P <0,001.
La figura 7-3 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la proliferacion de celulas dependientes de REa de lmeas celulares de cancer de mama. (D) muestra los resultados del ensayo de MTT y el ensayo de luciferasa por el que se puso a prueba la estabilidad del peptido ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM (cuadrado blanco).
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Despues, se anadio el peptido ERAP1 10 |iM cada d^a durante cuatro d^as (cuadrados en negro). Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes.
La figura 7-4 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la proliferacion de celulas dependientes de REa de lmeas celulares de cancer de mama. (E) muestra los resultados del analisis de FACS que muestran los efectos del peptido ERAP1 sobre el ciclo celular. Celulas KPL-3C se trataron con peptido ERAP1 10 |iM o tamoxifeno 10 nM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Despues de la inmovilizacion, las celulas se tineron con yoduro de propidio, y se analizaron por citometna de flujo.
La figura 8-1 es un diagrama que ilustra el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en la expresion genica del gen diana RE. (A) muestra los resultados de la RT-PCR cuantitativa mediante la cual se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en el gen diana RE. Celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 10 mM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM para los tiempos mostrados en la figura. Despues de la extraccion de ARN y siguiente a la smtesis de ADNc, la expresion de los genes que se muestra en la figura se evaluo con RT-PCR cuantitativa.
La figura 8-2 es un diagrama que ilustra el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en la expresion genica del gen diana RE. (B) muestra los resultados de la RT-PCR cuantitativa que muestra los efectos del peptido ERAP1 en la expresion genica. Celulas KPL-3C fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 durante 24 horas. Despues de la extraccion de ARN y siguiente a la smtesis de ADNc, se evaluo la expresion de los genes. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.
La figura 9-1 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la ruta de activacion no genomica. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra las expresiones de los receptores de la membrana de los respectivos factores de crecimiento. El lisado celular de las lmeas celulares de cancer de mama ER-positiva que se muestran en la figura se sometio a analisis de inmunotransferencia utilizando los anticuerpos que se muestran en la figura. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluaron los efectos del peptido ERAP1 en la interaccion entre REa y IGF-1Rp en celulas KPL-3C. Celulas KPL-3C fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 durante 24 horas. Entonces, la fraccion nuclear se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa. Posteriormente, el analisis de inmunotransferencia se realizo usando los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 9-2 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprime la ruta de activacion no genomica. (C a E) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la fosforilacion inducida por E2. Las celulas KpL-3C (C y D) o celulas BT-474 (E) fueron tratadas con el peptido ERAP1. Luego, inmediatamente, las celulas fueron tratadas con E2 10 nM para los tiempos mostrados en la figura. A continuacion, los niveles de fosforilacion de Akt (C), MAPK (C) y REa (D y E) fueron evaluados con transferencia Western. Los niveles de fosforilacion relativos se cuantificaron mediante analisis de densitometna, y se calculo la relacion con el valor a 0 horas para las celulas no tratadas. Estos datos descritos anteriormente son ejemplos representativos de dos experimentos independientes.
La figura 10-1 muestra que el peptido ERAP1 regula la ruta de activacion no genomica inducida por E2 a traves de IGF-1Rp y Shc. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en la interaccion de ER-IGF-1Rp. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Entonces, la fraccion de citoplasma se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, se realizo el analisis de inmunotransferencia usando los anticuerpos que se muestran en la figura. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en la interaccion de ERa-PI3K. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Entonces, la fraccion de citoplasma se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa o anticuerpo anti-PHB2. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, el analisis de inmunotransferencia se realizo usando los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 10-2 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 regula la ruta de activacion no genomica inducida por E2 a traves de IGF-1Rp y Shc. (C) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la fosforilacion inducida por E2. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 para los tiempos mostrados en la figura. A continuacion, los niveles de fosforilacion de Akt y MAPK se evaluaron mediante transferencia Western usando los anticuerpos que se muestran en la figura. (D) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en las interacciones de ERa-IGF-1Rp, ERa-PI3K, ERa-EGFR y ERa-Her2 en celulas BT-474. Celulas BT-474 fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2 durante 24 horas. Entonces, la fraccion de citoplasma se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, el analisis de inmunotransferencia se realizo usando los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 10-3 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 regula la ruta de activacion no genomica inducida por E2 a traves de IGF-1Rp y Shc. (E) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la fosforilacion inducida por E2. Celulas BT-474 fueron
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tratadas con el peptido ERAP1. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM para los tiempos mostrados en la figura. A continuacion, los niveles de fosforilacion de Akt y MAPK se evaluaron mediante transferencia Western. (F) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la fosforilacion de REa inducida por E2. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 o el peptido ERAPI-codificado. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM para los tiempos mostrados en la figura. Entonces, el nivel de fosforilacion de REa se evaluo mediante transferencia de Western usando los anticuerpos que se muestran en la figura. Los niveles de fosforilacion relativos se cuantificaron mediante analisis de densitometna, y se calculo la relacion con el valor a 0 horas en las celulas no tratadas. Estos datos descritos anteriormente son ejemplos representativos de tres experimentos independientes.
La figura 11-1 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 inhibe la proliferacion tumoral en un raton ortotopicamente transplantado con cancer de mama humano. (A) y (B) muestran la influencia del peptido ERAP1 en el volumen del tumor. Celulas KPL-3 fueron trasplantadas por via subcutanea en el cuerpo graso de la mama de raton desnudo BALB/c. La prueba de tratamiento (5 individuos/grupo) se inicio (dfa 0) cuando el volumen del tumor en ausencia de E2 alcanzo aproximadamente 50-80 mm3. El peptido ERAP1 (14, 35 y 70 mg/kg), el peptido codificado (14, 35 y 70 mg/kg) o tamoxifeno (4 mg/kg) se administro cada dfa mediante inyeccion intraperitoneal a un raton canceroso ortotopicamente transplantado con tumor KPL-3C. Al mismo tiempo, se administro E2 (6 |ig/dfa) por via subcutanea cada dfa. (A) muestra los resultados de la medida del tamano del tumor durante 2 semanas. (B) muestra el volumen medio del tumor en el dfa 11 despues del tratamiento con el peptido ERAP1.
La figura 11-2 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 inhibe la proliferacion tumoral en un raton ortotopicamente transplantado con cancer de mama humano. (C) muestra ejemplos representativos del tumor KPL- 3C heterotransplantado (panel superior) y el raton (panel inferior) que se muestra en la figura el dfa 14 despues del tratamiento.
La figura 11-3 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 inhibe la proliferacion tumoral en un raton ortotopicamente transplantado con cancer de mama humano. (D) muestra el cambio del peso corporal medio del raton tratados con el peptido ERAP1. (E) muestra los resultados de RT-PCR cuantitativa mediante la cual se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en el nivel de expresion de los genes diana de REa representativos en el tumor. El raton fue sometido a eutanasia el dfa 14, y se elimino el tumor, y el nivel de expresion de los genes aguas abajo en cada tumor se obtuvo por RT-PCR cuantitativa. Los datos muestran la relacion cuando el nivel de la expresion de los genes en el grupo no tratado fue designado como 1, y se muestra la media ± SE de cinco ratones. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.
La figura 11-4 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 inhibe la proliferacion tumoral en un raton ortotopicamente transplantado con cancer de mama humano. (F) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluaron los efectos del peptido ERAP1 en los niveles de fosforilacion de diferentes protemas de senal en los tumores.
La figura 12 es un diagrama que ilustra la influencia del peptido ERAP1-codificado en el volumen del tumor. El peptido ERAP1-codificado (14, 35 y 70 mg/kg) se administro cada dfa mediante inyeccion intraperitoneal a un raton canceroso ortotopicamente transplantado con tumor KPL-3C.
La figura 13-1 es un diagrama que ilustra la regulacion de retroalimentacion positiva de la activacion transcripcional de ERAP 1. (A) muestra los resultados de la RT-PCR cuantitativa en la que se evaluo la sobre regulacion de ERAP1 por la estimulacion de E2. Celulas MCF-7 se estimularon con E2 10 nM para los tiempos mostrados en la figura, y la expresion de ERAP1 se evaluo mediante RT-PCR cuantitativa en el ARNm. Cada muestra se normalizo con el contenido de ARNm de p2-MG, y el nivel de expresion relativa de ERAP1 fue representado por la relacion cuando el valor a 0 horas para las celulas no tratadas fue designado como 1. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. ***P <0,001. (B) muestra los resultados de la RT-PCR cuantitativa y las inmunotransferencias por las que se evaluo la influencia de tamoxifeno en la expresion de ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con tamoxifeno (TAM) en las concentraciones mostradas en la figura. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas, y el nivel de ARNm y el nivel de protema de ERAP1 fueron obtenidos por RT-PCR cuantitativa (panel izquierdo) y transferencia Western (panel derecho). En la RT-PCR cuantitativa, los datos se estandarizaron con el contenido de p2-MG, y se muestra con la relacion cuando el valor para las celulas no tratadas fue designado como 1. En el analisis de transferencia Western, p-actina se utilizo como control de carga.
La figura 13-2 es un diagrama que ilustra la regulacion de retroalimentacion positiva de la activacion transcripcional de ERAP. (C) muestra los resultados del ensayo de la luciferasa por el cual se evaluo la activacion transcripcional de ERAP1 a traves de la secuencia de ERE en el intron. Celulas MCF-7 se transfectaron con un vector indicador de luciferasa que comprende una construccion que contiene el motivo conservado-ERE (TCCAGTTGCATTGACCTGA) (SEQ ID NO: 56) situado en el intron 1 del gen ERAP1, un constructo que consiste en la secuencia aguas arriba que no contiene el motivo ERE, o una construccion que consiste en la secuencia aguas abajo que no contiene el motivo ERE (panel inferior). A continuacion, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas, y se midio la actividad de luciferasa. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. ***P <0,001. (D) muestra los resultados del ensayo ChIP mediante el cual se evaluo la activacion transcripcional de ERAP1 a traves
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de la secuencia de ERE estimada en el intron 1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM o el peptido codificado. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Se preparo la cromatina, y se inmunoprecipitaron con los anticuerpos que se muestran en la figura. El analisis de inmunoprecipitacion de la cromatina se realizo usando cebadores espedficos para la region de ERE en el intron de ERAP1. (E) muestra los resultados de la PCR a tiempo real por la que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la expresion de ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM para los tiempos mostrados en la figura. Despues de la extraccion de RNA y siguiente a la smtesis de ADNc, la expresion de ERAP1 se evaluo con la PCR a tiempo real. Los datos muestran la relacion cuando el valor a 0 horas para las celulas no tratadas fue designado como 1, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01; ***P <0,001.
La figura 14 es un diagrama que ilustra el efecto de supresion del peptido ERAP1 en las celulas MCF-7 resistentes a tamoxifeno. (A) muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la proliferacion de las celulas MCF-7 resistentes a tamoxifeno. Las celulas MCF-7 resistentes a tamoxifeno fueron tratadas con el peptido ERAP1 a cada concentracion (0, 5 y 10 mM). Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. *P <0,05; **P <0,01. (B) muestra los resultados de la transferencia Western en la que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 en las fosforilaciones de Akt y MAPK (panel superior) y REa (S104/106, S118, S167, S305 y Y537) (panel inferior) en celulas MCF-7 resistentes a tamoxifeno (Tam-R mCF7) y celulas MCF- 7 (MCF-7wt), que son las celulas originales, en presencia y en ausencia de E2.
La figura 15 es un diagrama que ilustra los efectos del peptido ERAP1 sobre las funciones celulares E2- independientes. (A) muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la proliferacion de celulas MCF-7. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 en cada concentracion (1, 3, 5 y 10 mM) o tamoxifeno 10 nM como un control positivo durante 24 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. *P <0,05; **P <0,01. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluaron los efectos del peptido ERAP1 en la interaccion entre REa y IGF-1Rp o Shc. Celulas MCF-7 fueron estimuladas con tratamiento con peptido ERAP1 10 |iM solo, tratamiento con E2 10 nM, o tratamiento con peptido ERAP1 10 |iM y de inmediato E2 10 nM durante 24 horas, y la fraccion de citoplasma se aislo de cada una de las celulas tratadas. Entonces, la fraccion de citoplasma se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, el analisis de transferencia Western se realizo utilizando los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 16 es un diagrama que ilustra la influencia del peptido ERAP1 sobre la proliferacion de celulas de cancer de mama Independientes de E2. La figura 16 muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la proliferacion de lmeas celulares de cancer de mama ERa-positivas (MCF-7, KPL-3C, ZR-75-1 y T47D). Cada una de las celulas se trato con peptido ERAP1 10 mM durante 24 horas (MCF-7), durante 48 horas (KPL-3C) o durante 96 horas (ZR-75-1 y T47D). Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. *P <0,05; **P <0,01.
La figura 17 es un diagrama que ilustra la influencia de la cafda de ERAP1 en el efecto de supresion sobre la proliferacion de celulas de cancer de mama por el tamoxifeno. (A) muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el efecto de inhibicion de tamoxifeno cuando ERAP1 fue deplecionado por el metodo de siRNA. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. *P <0,05; **P <0,01. (B) muestra los resultados del ensayo de luciferasa de ERE por el que se evaluo el efecto de inhibicion de tamoxifeno cuando ERAP1 fue deplecionado por el metodo de siRNA. Los datos muestran la relacion cuando el valor del si-control para las celulas no tratadas fue designado como 1, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes.
La figura 18 es un diagrama que ilustra la influencia del uso concomitante del peptido ERAP1 y el tamoxifeno sobre la proliferacion de tumor en un raton trasplantado con cancer de mama humano. Celulas KPL-3 fueron trasplantadas por via subcutanea en el cuerpo graso de la mama de raton desnudo BALB/c. La prueba de tratamiento (5 individuos/grupo) se inicio (dfa 0) cuando el volumen del tumor alcanzo alrededor de 50 a 80 mm3, en ausencia de E2. (A) muestra ejemplos representativos de tumor ortotopicamente transplantado con KPL-3C (panel superior) y de raton (panel inferior) en el dfa 14 despues de la iniciacion de prueba. (B) muestra el volumen medio del tumor en el dfa 14 despues de la iniciacion de prueba.
La figura 19 es un diagrama que ilustra los resultados del analisis FACS que muestra los efectos del uso concomitante del peptido ERAP1 y el tamoxifeno sobre el ciclo celular.
La figura 20 es un diagrama que ilustra los resultados de las evaluaciones de la influencia de la diferencia de la secuencia en el efecto de supresion de la proliferacion celular dependiente de E2. El panel superior muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluo el efecto de inhibicion de 2 clases de los peptidos (el peptido ERAP1 y el peptido ERAP1-2) sobre la proliferacion de celulas MCF-7 dependientes de E2. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 o peptido ERAP1-2 en las concentraciones mostradas en la figura. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 durante 24 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. *P <0,05; ***P <0,001. El panel inferior muestra las secuencias del peptido ERAP1 y
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el peptido ERAP1-2. La secuencia adjunta muestra la region para la interaccion con PHB2 que se estima por el software PISVER.
La figura 21 es un diagrama que ilustra que PHB2 se trans-localiza en el nucleo por la estimulacion de E2 en lmeas celulares de cancer de mama ERAPI-negativas, celulas HCC1395. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se detecto la localizacion de PHB2. Celulas HCC1395 fueron tratadas con peptido ERAP1 5 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 1 |iM durante 24 horas. Las celulas se fraccionaron en el citoplasma y las fracciones nucleares por centrifugacion con gravedad espedfica. Despues, cada fraccion se sometio a analisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-PHB2. Lamin y tubulina son marcadores de las fracciones del citoplasma y nucleares, respectivamente. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se examino la reconstitucion del complejo de cromatina centrado en el ERa. Celulas HCC1395 fueron tratadas con peptido ERAP1 5 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 1 |iM durante 24 horas. Entonces, la fraccion nuclear se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, el inmunoprecipitado se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. (C) muestra los resultados del ensayo de MTT por el que se evaluaron los efectos del peptido ERAP1 sobre la proliferacion de celulas HCC1395 de lmeas celulares de cancer de mama ERAPI-negativas. Celulas HCC1395 fueron tratadas con el peptido ERAP1 en las concentraciones mostradas en la figura. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 96 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. *P <0,05; NS, no significativo.
La figura 22 es un diagrama que ilustra que la fosforilacion de serina PHB2 regula la actividad transcripcional de ERa. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la influencia del tratamiento con el peptido ERAP1 en la fosforilacion de PHB2 unido a ERa. Celulas MCF-7 y celulas HCC1395 fueron tratadas con peptido ERAP1 5 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 1 |iM durante 24 horas. Entonces, la fraccion nuclear de cada celula se inmunoprecipito con anticuerpo anti-REa. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, el analisis de inmunotransferencia se realizo usando los anticuerpos que se muestran en la figura y el anticuerpo de fosforilacion. (B) muestra los resultados del ensayo de la luciferasa por el cual se evaluo la regulacion de la activacion transcripcional de REa por el residuo de serina en la posicion 39 de PHB2. Celulas COS-7 transfectadas temporalmente con PHB2 (o vectores de mutacion de PHB2, S39A y S39G), REa, vector ERE-luciferasa, y cada plasmido de pRL-TK como un estandar interno se estimularon con E2 1 |iM durante 48 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01.
La figura 23 es un diagrama que ilustra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra expresiones de ERAP1, PHB2, y RE1a en lmeas celulares de cancer de mama humano. Los lisados celulares de las lmeas celulares de cancer de mama humano y celulas epiteliales mamarias (MCF-10A) que se muestran en la figura se sometieron a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 24 es un diagrama que ilustra las expresiones de ERAP1 en espedmenes de cancer de mama humano extirpados. (A) muestra los resultados de la tincion de tejidos inmune en los que se evaluo la expresion de ERAP1 para los espedmenes de cancer de mama extirpados. El panel superior ilustra imagenes representativas de los tejidos inmunes tenidos en espedmenes de cancer de mama extirpados embebidos en parafina que muestran la expresion de ERAP1. El juicio de la capacidad de tincion de parte del cancer por inmunotincion se realizo tal que se determino negativo en el caso de que el tejido de cancer no se tinera en absoluto (negativo: 24 casos, 23%), un caso en el que el citoplasma fue ligeramente tenido se determino debil positivo (debil: 59 casos, 57%), y un caso en el que el tejido canceroso fue casi uniformemente fuertemente tenido se determino como positivo fuerte (fuerte: 20 casos, 19%). El panel inferior es una curva de la supervivencia sin recafda construida para la correlacion entre la expresion de ERAP1 y el penodo de supervivencia sin recafda con el metodo de Kaplan-Meier cuando los respectivos casos fueron clasificados de debil (casos negativos y casos positivos debiles) y fuerte (casos positivos fuertes). (B) muestra las imagenes representativas de tincion de los tejidos inmunes en las que se evaluo la expresion de PHB2 para los espedmenes de cancer de mama extirpados.
La figura 25 es un diagrama que ilustra los resultados de las evaluaciones para la influencia de la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA en la actividad transcripcional de REa. (A) muestra los resultados del ensayo de la luciferasa por el que se evaluo el efecto de inhibicion de PHB2/REA (Ser39) para la fosforilacion en la actividad transcripcional de REa. Celulas HEK293T fueron transfectadas temporalmente con REA de longitud completa (WT) y una construccion en la que Ser en la posicion 39 se muto a Ala o Glu (S39A y S39E), junto con un vector indicador de ERE-luciferasa y una construccion de REa. Las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia de la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA. Celulas HEK293T fueron transfectadas con un constructo de PHB2/REA (WT, S39A y S39E). Despues de 48 horas, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, las celulas se lisaron. Entonces, el PHB2/REA HA-marcado se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con el anticuerpo anti-HA. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, la protema inmunoprecipitada se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos son ejemplos representativos de dos experimentos independientes. (C) muestra que Ser39 de PHB2/REA suprime la ruta de activacion no genomica. Celulas HEK293T fueron transfectadas con un constructo PHB2/REA (WT, S39A y S39E). Despues de 48 horas, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A
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continuacion, el lisado celular se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos son ejemplos representativos de dos experimentos independientes.
La figura 26-1 es un diagrama que ilustra los resultados de las evaluaciones para la fosforilacion en Ser39 translocado nuclear de PHB2/REA. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo la fosforilacion del PHB2/REA nuclear translocado (Ser39) por el peptido ERAP1 transcelular. Celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Las celulas se fraccionaron en las fracciones del citoplasma y nucleares por centrifugacion por gravedad espedfica. Despues, cada fraccion se inmunoprecipito con anticuerpo anti-PHB2/REA. A continuacion, las celulas se lisaron. Entonces, la proterna inmunoprecipitada y el lisado de celulas se sometieron a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia sucesivo por el que se evaluo la fosforilacion de serina de PHB2/REA separados por el tratamiento con el peptido ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon temporalmente con E2 10 nM. Cada lisado celular se sometio a analisis de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-PHB2/REA y un anticuerpo anti-fosforilacion PHB2/REA (S39). (C) muestra imagenes de inmunotincion de celulas representativas que muestran la fosforilacion de REA (S39). Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 y A-fosfatasa (400 U) en presencia de E2 10 nM durante 24 horas. Despues de la inmovilizacion, las celulas se sometieron atincion de inmunofluorescencia.
La figura 26-2 es un diagrama que ilustra los resultados de las evaluaciones para la fosforilacion en el Ser39 nuclear-translocado de PHB2/REA. (D) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la fosforilacion de PHB2/REA (Ser39) nuclear-translocado por la supresion para la expresion de ERAP1. Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de ERAP1 por el metodo de siRNA se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Entonces, las celulas se fraccionaron en la fraccion de citoplasma (C) y en la fraccion nuclear (N) por centrifugacion por gravedad espedfica. Despues, cada fraccion se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. (E) muestra los resultados de la PCR a tiempo real por la que se evaluaron las expresiones de los genes aguas abajo de REa por la supresion para la expresion de ERAP1. Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de ERAP1 por el metodo de siRNA se trataron con peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Despues de la extraccion con ARN y la siguiente srntesis de ADNc, las expresiones de genes agua debajo de REa (ERAP1, CCND1, TFF1 y c- Myc) fueron evaluadas con la PCR a tiempo real. Los datos muestran la relacion cuando el valor para las celulas no tratadas fue designado como 1,0, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01, ***P <0,001.
La figura 27 es un diagrama que ilustra el efecto de inhibicion del peptido ERAP1 sobre la proliferacion de tumor en un raton ortotopicamente transplantado con cancer de mama humano. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que la fosforilacion de PHB2/REA (Ser39) se evaluo en el tumor trasplantado de un raton ortotopicamente transplantado con cancer de mama humano al que se administro el peptido ERAP1. Celulas KPL-3 fueron trasplantadas por via subcutanea en el cuerpo graso de la mama de un raton desnudo BALB/c. La prueba de tratamiento (5 individuos/grupo) se inicio (dfa 0) cuando el volumen del tumor alcanzo alrededor de 50-80 mm3, en ausencia de E2. Para un raton canceroso ortotopicamente transplantado con tumor KPL-3C, el peptido ERAP1 (peptido: 14 mg/kg) o el peptido ERAP1-codificado (Peptido scr: 14 mg/kg) se administro cada dfa mediante inyeccion intraperitoneal. Al mismo tiempo, se administro E2 (6 |ig/dfa) por via subcutanea cada dfa. En el dfa 14, el raton fue sacrificado, y se elimino el tumor, y la fosforilacion de PHB2/REA (S39) en cada tumor se evaluo con analisis de inmunotransferencia. (B) muestra los resultados de las evaluaciones para el volumen del tumor en un raton trasplantado con cancer de mama resistente a tamoxifeno al que se administro el peptido ERAP1. Las celulas MCF7 resistentes a tamoxifeno (Tam-R MCF-7) se trasplantaron por via subcutanea en el cuerpo graso de la mama de un raton desnudo BALB/c, y la prueba de tratamiento (5 individuos/grupo) se inicio (dfa 0) cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 50-80 mm3, en presencia de tamoxifeno (37 ng/dfa, 1,85 |ig/kg). Para un raton canceroso ortotopicamente transplantado con tumor Tam-R MCF-7, el peptido ERAP1 (peptido: 3,5, 7 y 14 mg/kg) o el peptido ERAP1-codificado (Peptido scr: 14 mg/kg) se administro cada dfa por inyeccion intraperitoneal. Al mismo tiempo, se administro E2 (6 |ig/dfa) por via subcutanea cada dfa. El tumor Tam-R MCF-7 heterotransplantado en el dfa 21 y el volumen medio del tumor ± SE (n = 5) se muestran. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
La figura 28-1 es un diagrama que ilustra que ERAP1 y PP1a interaction entre si (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra la union de ERAP1 a PP1a. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, las celulas se lisaron. Entonces, ERAP1 se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con el anticuerpo anti-ERAP1. Ademas, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos son ejemplos representativos de tres experimentos independientes. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual la region de union de PP1a se confirmo en ERAP1. Celulas HEK293T fueron transfectadas con un constructo de ERAP1 (APP1a) en el que 1228-1232 aa (KAVSF), es decir, el motivo de union de PP1a deducido se elimino, y una construccion de REa. Despues de 48 horas, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, las celulas se lisaron. Entonces, ERAP1 marcado con FLAG se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con anticuerpo anti-
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FLAG. Ademas, la protema inmunoprecipitada se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos son ejemplos representativos de dos experimentos independientes.
La figura 28-2 es un diagrama que ilustra que ERAP1 y PP1a interactuan entre sf. (C) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que ERAP1, PHB2/REA y REa forman un complejo por la supresion de la expresion de PP1a. Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de PP1a por el metodo de siRNA se trataron con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Las celulas se fraccionaron en las fracciones del citoplasma y nucleares por centrifugacion por gravedad espedfica. Despues, cada fraccion se inmunoprecipito con anticuerpo anti-RE. A continuacion, las celulas se lisaron. Entonces, la protema inmunoprecipitada y el lisado de celulas se sometieron a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. (D) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que PP1a se une indirectamente a PHB2/REA a traves de ERAP1. Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de ERAP1 por el metodo de siRNA se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Entonces, las celulas se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-PHB2/REA y un anticuerpo IgG. A continuacion, las celulas se lisaron. Entonces, la protema inmunoprecipitada y el lisado de celulas se sometieron a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 29 es un diagrama que ilustra que la inhibicion de la union de ERAP1 a PP1a induce la fosforilacion de PHB2/REA (S39). (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la influencia de la supresion de la expresion de PP1a sobre la fosforilacion de PHB2/REA (Ser39). Celulas MCF-7 en las que la expresion de PP1a fue suprimida por el metodo de siRNA se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, las celulas se lisaron. Entonces, ERAP1 se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con el anticuerpo anti-ERAP1. Ademas, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos son ejemplos representativos de tres experimentos independientes. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que la fosforilacion de PHB2/REA (Ser39) en celulas tratadas con ERAP1, en las que se elimina la region de union de PP1a, fue evaluada. Celulas HEK293T fueron transfectadas con el constructo ERAP1 (1228-1232 aa)-eliminado del motivo de union de PP1a (APP1a), y una construccion de REa. Despues de 48 horas, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Las celulas se lisaron, y luego PHB2/REA se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con el anticuerpo anti-PHB2/REA. Ademas, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos son ejemplos representativos de dos experimentos independientes. (C) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el que la fosforilacion de PHB2/REA (Ser39) se evaluo en las celulas tratadas con el peptido de inhibicion de union ERAP1-PP1a. Celulas MCF-7 fueron tratadas con 50 y 100 |iM del peptido de inhibicion. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Estos lisados celulares se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-ERAP1. Ademas, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 30-1 es un diagrama que ilustra que la fosforilacion de ERAP1 induce la actividad de fosfatasa de PP1a. (A) muestra los resultados de la prueba de siRNA que muestran que ERAP1 regula negativamente la actividad de PP1a. Se lisaron las celulas MCF-7 en las que la expresion de ERAP1 o PP1a fue suprimida por el metodo de siRNA. Entonces, se calculo la actividad de fosfatasa del lisado celular obtenido. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. ***P <0,001. (B) muestra los resultados del analisis de actividad de la fosfatasa y el analisis de inmunotransferencia por el que se evaluo el efecto de inhibicion de ERAP1 sobre la actividad de PP1a. Celulas HEK293T fueron transfectadas con un constructo de ERAP1 (0,5, 1,0 y 2,0 |ig) o el constructo de ERAP1 eliminada la region de union de PP1a (APP1a: 2,0 |ig), y se lisaron. A continuacion, el lisado celular se inmunoprecipito con el anticuerpo anti-PP1a. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, se realizaron el analisis de la actividad de la fosfatasa (panel superior) y el analisis de inmunotransferencia (panel inferior). La actividad de fosfatasa muestra la media ± Se de tres experimentos independientes. **P <0,01, ***P <0,001.
La figura 30-2 es un diagrama que ilustra que la fosforilacion de ERAP1 induce la actividad de fosfatasa de PP1a. (C) muestra los resultados del ensayo de fosfatasa que muestra que la estimulacion de estrogenos induce la actividad de PP1a. Celulas MCF-7 se estimularon con E2 10 nM de 6, 12 o 24 horas. Entonces, se calculo la actividad de fosfatasa del lisado celular. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. ***P <0,001. (D) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la fosforilacion de ERAP1 por la estimulacion de estrogenos. Celulas MCF-7 se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, el lisado celular se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos anti-fosforilacion que se muestran en la figura. Los datos son ejemplos representativos de tres experimentos independientes. (E) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra la union de ERAP1 para PKA y PKB. Celulas MCF-7 se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, las celulas se lisaron. A continuacion, el lisado celular se inmunoprecipito con el anticuerpo anti-ERAP1 y un anticuerpo IgG. Ademas, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos son ejemplos representativos de tres experimentos independientes.
La figura 31-1 es un diagrama que ilustra que la fosforilacion de ERAP1 por PKA y PKB regula la fosforilacion de PHB2/REA (S39) a traves de la actividad de PP1a. (A) muestra los resultados del ensayo de fosfatasa mostrando
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que PKA y PKB causan la actividad de PP1a. Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de PKA o PKB, o ambos de PKA y PKB por el metodo de siRNA se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Entonces, la solucion del lisado de celulas se inmunoprecipito con el anticuerpo anti-ERAPI. Ademas, se calculo la actividad de la fosfatasa de la muestra obtenida. Los datos muestran la media ± SE de tres experimented independientes. **P <0,01, ***P <0,001. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que PKA y PKB causa la fosforilacion de ERAP1. Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de PKA o PKB, o ambos de PKA y PKB por el metodo de siRNA, fueron tratados con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, el lisado celular se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos muestran la relacion cuando el valor de la fosforilacion por la estimulacion de E2 en las celulas tratadas con siControl fue designado como 1.0, y son ejemplos representativos de tres experimentos independientes. (C) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestran que la inhibicion de la actividad de PKA por H-89 regula la fosforilacion de ERAP1 y PHB2/REA. Celulas MCF-7 fueron tratadas con H-89 durante 30 minutos y se lavaron con PBS. A continuacion, las celulas se trataron con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, el lisado celular se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 31-2 es un diagrama que ilustra que la fosforilacion de ERAP1 por PKA y PKB regula la fosforilacion de PHB2/REA (S39) a traves de la actividad de PP1a. (D) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que la fosforilacion de serina de ERAP1 es suprimida por la inhibicion de la actividad de PKA y que la fosforilacion de PHB2/REA (S39) es causada. Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de PKA mediante el metodo de siRNA se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Ademas, celulas MCF-7 se trataron con H-89 durante 30 minutos y se lavaron con PBS. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, el lisado celular se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. (E) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestran que la inhibicion de la actividad de PKA provoca la fosforilacion de PHB2/REA (S39). Celulas MCF-7 fueron tratadas con H-89 y acido ocadaico durante 30 minutos y se lavaron con PBS. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, el lisado celular se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. (F) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que el PKCa provoca la fosforilacion de REA (S39). Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de PKCa por el metodo de siRNA se trataron con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Las celulas se fraccionaron en las fracciones del citoplasma y nucleares por centrifugacion por gravedad espedfica. Despues, cada fraccion se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos muestran la relacion cuando el valor de la fosforilacion de REA de las celulas tratadas con siControl y tratadas con peptido ERAP1 fue designado como 1,0.
La figura 32 es un diagrama ilustrativo de que PP1a es un gen diana de REa. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la sobre regulacion de PP1a por la estimulacion de E2. Celulas MCF-7 y celulas BT-474 se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas, y el nivel de protema de PP1a se evaluo por analisis de transferencia Western. Los datos fueron normalizados con p-actina. (B) muestra los resultados de la PCR a tiempo real por el cual se evaluo la sobre regulacion de PP1a por la estimulacion de E2. Celulas MCF-7, celulas ZR-75-1, celulas T47D y celulas BT-474 se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas, y el nivel de ARNm de PP1a se obtuvo con la PCR a tiempo real. Los datos estan normalizados con el contenido de p2-MG, y muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. **P <0,01, ***P <0,001. (C) muestra el motivo conservado-ERE situado en el 5' aguas arriba y el intron 2 del gen PP1a estimado por el software Genomatix (Genomatix Software, Munich, Alemania). (D) muestra los resultados del chip de ensayo mediante el cual se evaluo la trans-activacion de PP1a a traves de la secuencia de ERE de 5' aguas arriba y el intron 2. Celulas MCF-7 se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas, y a continuacion, la cromatina se preparo, y se inmunoprecipito con los anticuerpos que se muestran en la figura. El analisis de inmunoprecipitacion de la cromatina se realizo usando cebadores espedficos para la region ERE de 5' aguas arriba y el intron 2 de PP1a. (E) muestra los resultados del ensayo de luciferasa por el cual se evaluo la trans-activacion de PP1a a traves de la secuencia de ERE en el gen PP1a. Celulas HEK293T fueron transfectadas con un vector indicador de luciferasa que consta de una construccion que comprende el motivo conservado-ERE situado en el 5' aguas arriba y el intron 2 del gen PP1a (el panel inferior: 5'-ERE y 5'- y el intron 2- ERE). A continuacion, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas, y se midio la actividad de luciferasa. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. ***P <0,001.
La figura 33 es un diagrama que ilustra que el tratamiento con el peptido ERAP1 suprimfa la aceleracion de las expresiones de protemas y genes por la estimulacion de estrogenos. (A) muestra los resultados del analisis estadfstico de proteomas en las celulas tratadas con el peptido ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM (peptido) y el peptido ERAP1-codificado (Peptido scr). Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 1 hora. Posteriormente, la solucion del lisado de celulas obtenida se digirio con tripsina y se sometio a 2DICAL. Los datos se calcularon como la relacion con el valor a 0 horas, y cada proteoma se analizo estadfsticamente con el diagrama de caja. *P <0,05. (B) muestra los resultados del analisis estadfstico de la transcriptoma en las celulas tratadas con el peptido ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 5, 10 y 15 horas. A continuacion, se realizaron la extraccion de ARN y luego la smtesis de Cy3-ARNc y el Cy3-ARNc se sometio a los microarrays.
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Los datos se analizaron estadfsticamente por el software GeneSpring, y se calculo la relacion con el valor en 0 horas. **P <0,01.
La figura 34 es un diagrama que ilustra que el peptido ERAP1 se une espedficamente a PHB2/REA. (A) muestra los resultados de las evaluaciones para la union del peptido de ERAP1 a PHB2/REA por Biacore. La protema PHB2/REA recombinante 6xHis-marcada se inmovilizo sobre un chip sensor, y despues se hizo reaccionar con un peptido ERAP1 HA-marcado a las concentraciones mostradas en la figura, y la constante de velocidad de disociacion (Kd) se calculo a partir de la curva del sensograma. (B) muestra los resultados de las evaluaciones para la union de PHB2/REA al peptido ERAP1 por el metodo de espectroscopia por correlacion de fluorescencia. El peptido ERAP1 (peptido) 10 nM marcado con FITC, el peptido ERAPI-codificado (Peptido scr) FITC-marcado y la protema PHB2/REA recombinante 6xHis-marcada en las diversas concentraciones que se muestran en la figura se hicieron reaccionar durante 1 hora. A continuacion, se midio la fluorescencia FITC de la muestra.
La figura 35 es un diagrama que ilustra los resultados del analisis de inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal anti-ERAP1. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que ERAP1 se detecto espedficamente con el anticuerpo purificado anti-ERAP1. Se lisaron las celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de ERAP1 por el metodo de siRNA. Entonces, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal contra un antfgeno de ERAP1 humano (459-572 aa). (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la coprecipitacion de PHB2/REA por el anticuerpo purificado anti-ERAP1. Los lisados de celulas MCF-7 (M) y celulas T47D (T) se inmunoprecipitaron con el anticuerpo purificado anti-ERAP1. Ademas, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura.
La figura 36 es un diagrama que ilustra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que un anticuerpo PHB2/REA (S39) anti-fosforilacion detecta espedficamente la fosforilacion de Ser39 de PHB/REA. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. El lisado celular obtenido se sometio a analisis de inmunotransferencia con un anticuerpo PHB2/REA (S39) anti-fosforilacion, un anticuerpo de serina anti-fosforilacion y un anticuerpo anti- PHB/REA.
La figura 37 es un diagrama que ilustra los resultados de las evaluaciones de la estabilidad del peptido ERAP1 y la influencia del peptido ERAP1 en el E2 celular. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se evaluo la estabilidad del peptido ERAP1. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 marcado con HA 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon temporalmente con E2 10 nM. A continuacion, el lisado celular se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos estan normalizados con p-actina, y muestran la relacion cuando el valor en 1 hora (n = 1, 3) o a las 3 horas (n = 2) se designa como 100. (B) muestra los resultados de las evaluaciones para la influencia del peptido ERAP1 en la concentracion de E2 celular. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 mM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon temporalmente con E2 10 nM. El lisado celular se centrifugo, y luego el sobrenadante y un precipitado lisado con metanol se mezclaron (concentracion final de metanol: 10%), y la concentracion de E2 celular se midio con un kit disponible comercialmente (kit ELISA de 17p-estradiol, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes.
La figura 38 es un diagrama que ilustra los resultados del analisis de inmunotransferencia por el cual se identifico un aminoacido en ERAP1 que se une a PHB. Celulas COS-7 se transfectaron con el constructo de PHB2 junto con uno cualquiera de ERAP1 (1-434 aa), un mutante de alanina de Q165, D169 y Q173, un mutante de alanina de Q165 (Q165A), un mutante de alanina de D169 (D169A), un mutante de alanina de Q173 (Q173A) o un mutante de alanina de Q165 y D169 (Q165A, D169A). Las celulas se lisaron despues de 48 horas de la transfeccion. Entonces, las celulas se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-FLAG y un anticuerpo anti-HA. La protema inmunoprecipitada y el lisado de celulas se sometieron a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Los datos muestran la relacion cuando la banda de coprecipitacion con ERAP1 (1-434 aa) se designa como 100.
La figura 39 es un diagrama que ilustra que la fosforilacion de ERAP1 por PKA y PKB regula la fosforilacion de PHB2/REA (S39) a traves de la actividad de PP1a en las celulas KPL-3C. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que PP1a regula la fosforilacion de la serina de PHB2/REA. Celulas KPL-3C suprimidas para la expresion de ERAP1 y PP1a por el metodo de siRNA se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, las celulas se lisaron. ERAP1 se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con el anticuerpo anti-ERAP1. Ademas, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. (B) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que PKA y PKB causan la fosforilacion de ERAP1. Celulas KPL-3C suprimidas para la expresion de PKA y PKB por el metodo de siRNA se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, las celulas se lisaron. Entonces, ERAP1 se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con el anticuerpo anti-ERAP1. Ademas, la muestra obtenida se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. (C) muestra los resultados del ensayo de fosfatasa que muestra que PKA y PKB causan la actividad de PP1a. Celulas KPL-3C suprimidas para la expresion de ERAP1, PP1a, PKA y PKB por el metodo de siRNA se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. A continuacion, el lisado celular se inmunoprecipito con anticuerpo anti-ERAP1. Ademas,
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con respecto a la muestra obtenida, se calculo la actividad de fosfatasa. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes.
La figura 40 es un diagrama que ilustra los resultados de ensayo de MTT por el cual se evaluo el efecto de supresion de la proliferacion del peptido ERAP1 en lmeas celulares de cancer de mama REa negativas, celulas SK-BR-3. Celulas SK-BR-3 fueron tratadas con el peptido ERAP1 (peptido) o el peptido ERAPI-codificado (Peptido scr) durante 24 horas o durante 48 horas. Los datos muestran la media ± SE de tres experimentos independientes. *P <0,05, ***P <0,001.
La figura 41-1 es un diagrama que ilustra que la produccion de ROS en las mitocondrias por la estimulacion con E2 se induce a traves de ERAP1. (A) muestra los resultados del analisis de inmunotransferencia que muestra que ERAP1 fue localizado en las mitocondrias. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Las celulas se fraccionaron en la fraccion de mitocondrias (M), la fraccion del citoplasma (C) y la fraccion nuclear (N) por centrifugacion por gravedad espedfica. Despues, cada fraccion se sometio a analisis de inmunotransferencia con los anticuerpos que se muestran en la figura. Lamin B, a/p-tubulina (tubulina) y PRDX3 son marcadores para la fraccion nuclear, la fraccion de citoplasma y la fraccion de mitocondrias, respectivamente.
La figura 41-2 es un diagrama que ilustra que la produccion de ROS en la mitocondria por la estimulacion con E2 se induce a traves de ERAP1. (B) muestra los resultados de las evaluaciones para la produccion de ROS mediante ERAP1 en la mitocondria. Celulas MCF-7, y las celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de ERAP1, y celulas HCC1395 fueron tratadas con DHR123 10 |iM durante 15 minutos. Las celulas se lavaron, y despues se estimularon con peptido ERAP1 10 |iM y E2 10 nM durante 24 horas, y se analizaron por citometna de flujo. Las celulas tratadas con H2O21 mM durante 24 horas se utilizaron como control positivo. Los datos son ejemplos representativos de dos experimentos independientes.
Modos de llevar a cabo la invencion
Definiciones
Aunque cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se puedan utilizar en la practica o prueba de las realizaciones de la presente invencion, se describen ahora los metodos, dispositivos y materiales preferidos. Sin embargo, antes de que se describan los presentes materiales y metodos, se ha de entender que la presente invencion no se limita a los tamanos, formas, dimensiones, materiales, metodologfas, protocolos, y similares particulares que se describen en el presente documento, ya que estos pueden variar de acuerdo con la experimentacion de rutina y la optimizacion. Es de entenderse tambien que la terminologfa usada en la descripcion es para el proposito de describir las versiones o realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invencion que se limitara solo por las reivindicaciones adjuntas.
Nada en este documento debe interpretarse como una admision de que la invencion no tiene derecho a preceder dicha descripcion en virtud de la invencion anterior.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por cualquier experto ordinario en la tecnica a la que pertenece esta invencion. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecera.
Las palabras "un", "uno", "una", y "el" y "la" como se usan en este documento significa "al menos uno" a menos que se indique otra cosa espedficamente.
Los terminos "aislado" y "purificado" que se utilizan en relacion con una sustancia (por ejemplo, peptido o polinucleotido) indican que la sustancia esta sustancialmente libre de al menos una sustancia que puede incluir otra cosa en la fuente natural. Por lo tanto, un peptido aislado o purificado se refiere a peptidos que estan sustancialmente libres de materiales celulares tales como carbohidratos, lfpidos, u otras protemas contaminantes de la fuente de las celulas o el tejido del que se obtiene el peptido o sustancialmente libre de precursores qrnmicos u otras sustancias qrnmicas de cuando se sintetizan qmmicamente. La expresion "sustancialmente libre de materiales de la celula" incluye preparaciones de un peptido en el que el peptido se separa de los componentes celulares de las celulas de las que se afsla o se produce recombinantemente.
Por lo tanto, un peptido que esta sustancialmente libre de materiales celulares incluye preparaciones de un peptido que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de protema heterologa. Cuando el peptido se produce de forma recombinante, la preparacion tambien esta sustancialmente libre de medio de cultivo, e incluye preparaciones de un polipeptido con medio de cultivo contaminante que es menor que aproximadamente 20%, 10%, o 5% del volumen de la preparacion del peptido en algunas realizaciones. Cuando el polipeptido se produce por smtesis qrnmica, la preparacion esta sustancialmente libre de precursores qrnmicos u otras sustancias qrnmicas, e incluye preparaciones de un peptido con precursores qrnmicos u otras sustancias qrnmicas que participan en la smtesis del peptido que es menor que aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) del volumen de la preparacion de peptidos en algunas realizaciones. En las realizaciones preferidas, el peptido de la presente invencion es aislado o purificado.
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Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se utilizan en este documento de forma intercambiable para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos. Estos terminos se aplican a polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos son residuos modificados o residuos de origen no natural, por ejemplo, mimeticos qmmicos artificiales de un aminoacido correspondiente de origen natural, asf como a polfmeros de origen natural de aminoacidos.
El termino "aminoacido" se usa en este documento para referirse a aminoacidos de origen natural y sinteticos, asf como a analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que funcionan de manera similar a los aminoacidos de origen natural. Aminoacidos de origen natural pueden ser aquellos codificados por el codigo genetico, asf como los modificados despues de la traduccion en las celulas (por ejemplo, hidroxiprolina, acido Y-carboxiglutamico, y O- fosfoserina). La expresion "analogo de aminoacido" se utiliza en este documento para referirse a compuestos que tienen la misma estructura qmmica basica (un carbono a unido a un hidrogeno, un grupo carboxi, un grupo amino, y un grupo R) como un aminoacido de origen natural, pero tienen un grupo R modificado o esqueletos modificados (por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfoxido, metionina metil sulfonio). La expresion "mimetico de aminoacido" se utiliza en este documento para referirse a compuestos qmmicos que tienen diferentes estructuras, pero funciones similares, respecto a los aminoacidos generales.
Los aminoacidos pueden ser referidos en este documento con sus comunmente conocidos sfmbolos de tres letras o los sfmbolos de una letra recomendados por la Comision de Nomenclatura Bioqmmica IUPAC-IUB.
Los terminos "polinucleotido" y "acido nucleico" se usan en este documento de forma intercambiable para referirse a un polfmero de nucleotidos. Estos terminos incluyen tanto polfmeros de acido nucleico de origen natural como polfmeros de acido nucleico no naturales. Los nucleotidos se conocen por sus codigos de una sola letra comunmente aceptables como los aminoacidos.
El termino "tratamiento" en el contexto de la presente invencion significa la mejora de al menos un smtoma generado por una enfermedad objetivo o la supresion para el progreso de los smtomas. Ejemplo del "tratamiento del cancer" incluye la inhibicion de la proliferacion de celulas cancerosas, la regresion del cancer, la mejora detectable, el alivio o la supresion para el progreso de los smtomas implicados con el cancer, y la supresion de la metastasis.
El termino "prevencion" en el contexto de la presente invencion significa la evitacion, la supresion o el retraso de la generacion de una enfermedad objetivo. La prevencion se puede realizar en los niveles de prevencion primaria, secundaria y terciaria. La prevencion primaria es evitar la aparicion de una enfermedad, y los niveles secundario y terciario de la prevencion incluyen actividades con el fin de recuperar las funciones y la disminucion de las complicaciones asociadas con una enfermedad, por lo tanto para evitar el progreso de la enfermedad y la aparicion de los smtomas, y disminuir las influencias adversas de la enfermedad ya establecida. Los ejemplos de la "prevencion del cancer" incluyen la evitacion o el retraso del brote de cancer, la supresion o el retraso del progreso de los smtomas de un primer paso, y la supresion de la metastasis despues de la cirugfa.
En este documento, la expresion "polipeptido ERAP1" se refiere a un polipeptido codificado por el gen de ERAP1 (protema regulada por la actividad del receptor de estrogenos 1). Mas espedficamente, el "polipeptido ERAP1" se refiere a una protema ERAP1 humana, un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 35 (GeneBank n° de entrada BAH83562.1). Sin embargo, en la presente invencion, el polipeptido ERAP1 no se limita al mismo, sino que tambien incluye isoformas y mutantes del mismo. "ERAP1" tambien se refiere a "BIG3 (protema de intercambio de nucleotidos de guanina Brefeldina A-inhibida 3)", "A7322", o "KIAA1244". En este documento, el "polipeptido ERAP1" tambien se describe como "ERAP1". Un ejemplo de una secuencia de bases representativa de la secuencia del gen de ERAP1 humana se muestra en SEQ ID NO: 34 (GeneBank n° de entrada AB252196.1).
En este documento, la expresion "polipeptido PHB2" se refiere a un polipeptido codificado por el gen PHB2 (prohibitin2). Mas espedficamente, "polipeptido PHB2" se refiere a un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID nO: 37 (GeneBank n° de entrada NP_001138303.1), que es la protema PHB2 humana. Sin embargo, en la presente invencion, el polipeptido PHB2 no se limita al mismo, sino que tambien incluye isoformas y mutantes del mismo. "PHB2" tambien se refiere como "REA (represor de la actividad de estrogenos)". En este documento, "polipeptido PHB2" tambien se describe como "PHB2" o "PHB2/REA". Un ejemplo de una secuencia de bases representativa del gen PHB2 humana se muestra en SEQ ID NO: 36 (GeneBank n° de entrada NM_001144831.1).
En este documento, la expresion "polipeptido PP1a" se refiere a un polipeptido codificado por el gen de PPPCA (protema fosfatasa 1, subunidad catalftica, alfa isoenzima). Mas espedficamente, "polipeptido PP1a" se refiere a un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 72, 74 o 76 (GeneBank n° de entrada NP_001008709, NP_002699.1 o NP_996756.1), que es la protema PP1a humana. Sin embargo, en la presente invencion, el polipeptido PP1a no se limita al mismo, sino que tambien incluye isoformas y mutantes del mismo. En este documento, "polipeptido PP1a" tambien se describe como "PP1a". Los ejemplos representativos de la secuencia de bases del gen Ppla humano se muestran en SEQ ID NOs: 71, 73 y 75 (GeneBank numeros de entrada NM_001008709, NM_002708.3 y NM_206873.1).
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En este documento, la expresion "polipeptido PKA" se refiere a un polipeptido codificado por el gen de PRKACA (protema quinasa, dependiente de AmPc, catalftica, alfa). Mas espedficamente, el "polipeptido PKA" se refiere a un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 78 o 80 (GeneBank n° de entrada NP_o02721.1 o NP_997401.1), que es una protema humana PKA (protema quinasa A). Sin embargo, en la presente invencion, el polipeptido PKA no se limita al mismo, sino que tambien incluye isoformas y mutantes del mismo. En este documento, el "polipeptido PKA" tambien se describe como "PKA". Los ejemplos representativos de la secuencia de bases del gen de PKA humano se muestran en SEQ ID NOs: 77 y 79 (GeneBank numeros de entrada NM_002730.3 y NM_207518.1).
En este documento, la expresion "polipeptido PKB" se refiere a un polipeptido codificado por el gen de AKT1 (homologo del oncogen viral murino de timoma de v-akt 1). Mas espedficamente, el "polipeptido PKB" se refiere a la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 82, 84 o 86 (GeneBank n° de entrada NP_001014431, NP_001014432 o NP_005154), que es la protema humana PKB (protema quinasa B). Sin embargo, en la presente invencion, el polipeptido PKB no se limita al mismo, sino que tambien incluye isoformas y mutantes del mismo. "Polipeptido PKB" tambien se refiere a "PKB". Los ejemplos representativos de la secuencia de bases del gen de PKB humano se muestra en SEQ ID NOs: 81, 83 y 85 (GeneBank numeros de entrada NM_001014431, NM_001014432 y NM_005163).
La expresion "receptor de estrogenos" que se utiliza en este documento incluye tanto al receptor de estrogenos a (RE) como al receptor de estrogenos p (REp). REa y REp son codificados por los genes ESR1 y el gen ESR2, respectivamente. La secuencia de bases representativa del gen de ESR1 humano y la secuencia de aminoacidos de REa humano se muestran en SEQ ID NO: 38 (GeneBank No. de entrada NM_000125.3) y SEQ ID NO: 39 (GeneBank No. de entrada NP_000116.2), respectivamente. Ademas, la secuencia de bases representativa del gen de ESR2 humano y la secuencia de aminoacidos de ERp humano se muestran en SEQ ID NO: 40 (GeneBank No. de entrada NM_o01437.2) y SEQ ID NO: 41 (GeneBank No. de entrada NP_001428.1), respectivamente. Sin embargo, en la presente invencion, la secuencia de bases y la secuencia de aminoacidos del receptor de estrogenos no estan limitados a las mismas, sino que incluyen isoformas y mutantes de las mismas. En las realizaciones preferidas, el receptor de estrogenos es REa. Se ha informado de que cualquiera de REa y ERp esta regulado por el polipeptido PHB2 con respecto a la activacion de la transcripcion (Montano MM, et al, Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 6947-52).
En este documento, la expresion "positivo para el receptor de estrogenos", que se usa con respecto a una celula o un cancer, significa que una celula, o celulas cancengenas que constituyen un cancer, expresan un receptor de estrogenos. Si una celula o cancer es positivo para el receptor de estrogenos se puede confirmar o no mediante un metodo conocido tal como el metodo ELISA y el metodo de tincion inmunohistoqmmica. Ademas, en el presente documento, la expresion "negativo para el receptor de estrogenos", que se usa con respecto a una celula o un cancer, significa que una celula, o celulas cancengenas que constituyen un cancer, no expresan un receptor de estrogenos.
1. Peptido ERAP1
La presente invencion proporciona un peptido que inhibe la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, que comprende un sitio de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. El peptido de la presente invencion en el presente documento tambien se describe como "peptido ERAP1".
El peptido de la presente invencion tiene una capacidad para unirse al polipeptido PHB2 comprendiendo un sitio de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. Como consecuencia, el peptido de la presente invencion inhibe de forma competitiva la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. El peptido ERAP1 de la presente invencion puede ser una sal con tal de que tenga la accion de inhibir la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. Por ejemplo, el peptido ERAP1 de la presente invencion puede ser una sal con un acido (por ejemplo, acido inorganico o acido organico) o una base (por ejemplo, metal alcalino, metal alcalino-terreo, o amina). Ejemplos de la sal con un acido incluyen sales con un acido inorganico (por ejemplo, acido clorlddrico, acido fosforico, acido bromddrico, acido sulfurico, o acido acetico) y sales con un acido organico (por ejemplo, acido acetico, acido formico, acido propionico, acido fumarico, acido maleico, acido sucdnico, acido tartarico, acido dtrico, acido malico, acido oxalico, acido benzoico, acido metanosulfonico, acido bencenosulfonico, o meglumina acido). Ejemplos de la sal con una base incluyen sales con sodio, potasio, calcio y amonio. Los ejemplos preferidos de la sal del peptido de la presente invencion incluyen la sal de acido acetico, sal de acido clorddrico, sal de acido de meglumina, y la sal de amonio.
El sitio de union al polipeptido PHB2 en el polipeptido ERAP1 significa un residuo de aminoacido que esta implicado en la union al polipeptido PHB2 en la secuencia de aminoacidos que constituye el polipeptido ERAP1. Ejemplos de tales residuos de aminoacidos incluyen la glutamina en la posicion 165, el acido aspartico en la posicion 169, y la glutamina en la posicion 173 en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 33. El peptido de la presente invencion es un peptido que inhibe la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, que comprende la glutamina en la posicion 165, el acido aspartico en la posicion 169 y la glutamina en la posicion 173 en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 33. Ademas, en el presente documento, el numero de residuos de aminoacidos particulares en la secuencia de aminoacidos representa el numero de los residuos de aminoacidos contados a partir del extremo N-terminal.
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En las realizaciones mas preferidas, el peptido de la presente invencion incluye la secuencia de aminoacidos desde la glutamina en la posicion 165 a la glutamina en la posicion 173 en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 33 (QMLSDLTLQ (SEQ ID NO: 31)). Los ejemplos de tal peptido incluyen el peptido ERAP1 (QMLSDLTLQLRQR (SEQ ID NO: 27)) y el peptido ERAP1-2 (ATLSQMLSDLTLQ (SEQ ID NO: 30)) que se describe en los Ejemplos de la memoria descriptiva. Por lo tanto, los ejemplos preferidos del peptido de la presente invencion incluyen peptidos que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada de un grupo que consiste en (a) a (c) que se describe a continuacion:
(a) la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 31/QMLSDLTLQ;
(b) la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 27/QMLSDLTLQLRQR; y
(c) la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 30/ATLSQMLSDLTLQ.
Sin embargo, el peptido de la presente invencion no esta limitado al mismo, y la secuencia de aminoacidos que constituye el peptido no esta particularmente limitada si la secuencia de aminoacidos comprende un sitio de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, y tiene una actividad de union de inhibicion del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, y es como se define en las reivindicaciones.
Se sabe que la alteracion de uno o mas aminoacidos en un peptido generalmente no tiene ninguna influencia sobre
las funciones del peptido. En la practica, se sabe que un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos en la que
uno o mas residuos de aminoacidos son alterados por sustitucion, delecion, insercion y/o adicion, mantiene las actividades biologicas del peptido original (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland et al, Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)) . Por lo tanto, el peptido de la presente invencion incluye peptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos seleccionada de un grupo que consiste en de (a') a (c') que se describe a continuacion, y que tienen una actividad de inhibir la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2:
(a') la secuencia de aminoacidos en la que uno, dos o varios residuos de aminoacidos, ademas de la glutamina en la posicion 1/Q, el acido aspartico en la posicion 5/D y la glutamina en la posicion 9/Q estan sustituidos con otros residuos de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 31;
(b') la secuencia de aminoacidos en la que uno, dos o varios residuos de aminoacidos, ademas de la glutamina en la posicion 1/Q, el acido aspartico en la posicion 5/D y la glutamina en la posicion 9/Q estan sustituidos con otros residuos de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 27; y
(c') la secuencia de aminoacidos en la que uno, dos o varios residuos de aminoacidos, ademas de la glutamina en la posicion 5/Q, el acido aspartico en la posicion 9/D y la glutamina en la posicion 13/Q estan sustituidos con otros residuos de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 30.
Los residuos de aminoacidos sustituidos en los anteriormente mencionados de (a') a (c') pueden ser cualquier residuo de aminoacido, siempre y cuando sea mantenida la capacidad de inhibir la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. Los residuos de aminoacidos sustituidos pueden ser determinados mediante la estimacion de los residuos de aminoacidos que no estan implicados en la union al peptido PHB2 utilizando un metodo de calculo tal como PSIVER. Por ejemplo, los residuos de aminoacidos estimados como "-" en la Fig. 1G se pueden seleccionar preferiblemente como un residuo candidato para la sustitucion. El numero de los residuos de aminoacidos sustituidos no esta particularmente limitado tambien, siempre que se mantenga la capacidad de inhibir la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, y uno, dos o varios residuos de aminoacidos puedan ser sustituidos. El termino "varios" es preferiblemente seis, cinco, cuatro o tres.
Por ejemplo, el peptido ERAP1 que se define en (a') es un peptido que tiene una actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, y comprende una secuencia de aminoacidos en la que uno, dos o varios residuos de aminoacidos estan sustituidos con otros residuos de aminoacidos, ademas de la glutamina en la posicion 1/Q, el acido aspartico en la posicion 5/D y la glutamina en la posicion 9/Q en la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 31. (a') abarca un peptido que inhibe la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. Este peptido es, por ejemplo, un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos en la que todos los residuos de tres aminoacidos que se describen a continuacion se conservan, y residuos de aminoacidos en las otras posiciones estan sustituidos en una secuencia de aminoacidos sucesiva que comprende 165-173 (SEQ ID NO: 31) en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 35.
La glutamina en la posicion 165/Q,
el acido aspartico en la posicion 169/D y
la glutamina en la posicion 173/Q de la SEQ ID NO: 35
En las realizaciones preferidas, la sustitucion de residuos de aminoacidos aceptables en otras posiciones que los tres aminoacidos antes mencionados, es comunmente 10 o menos, o 8 o menos, por ejemplo, 7 o menos,
preferiblemente 6 o menos, mas preferiblemente 5 o menos, en particular preferiblemente 3 o menos. Los ejemplos de tal peptido ERAP1 incluyen un peptido que esta constituido por los aminoacidos de 30 residuos o menos, o 20 residuos o menos, tipicamente 19 residuos o menos, preferiblemente 18 residuos o menos, y mas preferiblemente
17 residuos o menos.
5 En general, se reconoce que la sustitucion para otros residuos de aminoacidos por la que las propiedades de la cadena lateral de aminoacidos de los residuos del aminoacido original se conservan, tiende a no tener ninguna influencia sobre las funciones del peptido inicial. Dicha sustitucion se refiere a menudo como "sustitucion conservadora" o "alteracion conservadora". Por lo tanto, la sustitucion en los anteriormente mencionados de (a') a (c') se realiza preferiblemente por la sustitucion conservadora.
10 Las tablas de sustitucion conservadoras que muestran aminoacidos funcionalmente similares son bien conocidas en la tecnica. Los ejemplos de la propiedad de una cadena lateral de aminoacido que se conserva deseablemente incluyen aminoacidos hidrofobos (A, I, L, M, F, P, W, Y y V), aminoacidos hidrofilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S y T), cadenas laterales alifaticas (G, A, V, L, I y P), cadenas laterales que contienen un grupo hidroxilo (S, T e Y), cadenas laterales que contienen atomos de azufre (C y M); cadenas laterales que contienen acido carboxflico y amida (D, N, 15 E y Q), cadenas laterales que contienen bases (R, K y H), y grupos funcionales de cadenas laterales que contienen aromaticos (H, F, Y y W) o cadenas laterales que tienen caractensticas del grupo funcional en comun. Ademas, los 8 grupos descritos a continuacion comprenden los aminoacidos que son reconocidos por ser mutuamente conservadoramente sustituidos, respectivamente, en la tecnica:
1) alanina (A) y glicina (G);
20 2) acido aspartico (D) y acido glutamico (E);
3) asparagina (N) y glutamina (Q);
4) arginina (R) y lisina (K);
5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M) y valina (V);
6) fenil alanina (F), tirosina (Y) y triptofano (W);
25 7) serina (S) y treonina (T); y
8) cistema (C) y metionina (M) (vease, por ejemplo, Creighton, Proteins, 1984).
Sin embargo, la sustitucion en los anteriormente mencionados de (a') a (c') no esta limitada a ello, y puede ser sustitucion no conservativa siempre que la actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2 se mantenga.
30 El peptido de la presente invencion puede comprender residuos de aminoacidos ademas del sitio de union al polipeptido PHB2 en el polipeptido ERAP1 siempre que se mantenga la actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. Por ejemplo, el fragmento del polipeptido ERAP1 que comprende el sitio de union al polipeptido PHB2 en el polipeptido ERAP1 es adecuado como el peptido de la presente invencion. Por lo tanto, el fragmento del polipeptido ERAP1 (SEQ ID NO: 35) que comprende la secuencia de aminoacidos del acido 35 glutamico en la posicion 165 al acido glutamico en la posicion 173 y la secuencia de los alrededores es un ejemplo preferible del peptido de la presente invencion.
Por ejemplo, los ejemplos del peptido ERAP1 de la presente invencion pueden incluir peptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 31 (9 residuos), y esta constituida por aminoacidos de, por ejemplo, 30 residuos o menos, o 20 residuos o menos, tfpicamente 19 residuos o menos, preferiblemente 18 residuos o menos, 40 mas preferiblemente 17 residuos o menos. Ejemplos de tales peptidos pueden incluir peptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 31 (9 residuos) y la secuencia de aminoacidos seleccionada entre las secuencias de aminoacidos de longitud completa que constituyen el polipeptido ERAP1, y estan constituidas por aminoacidos de 30 residuos o menos, o 20 residuos o menos, tfpicamente de 19 residuos o menos, preferiblemente
18 residuos o menos, mas preferiblemente 17 residuos o menos.
45 En las realizaciones preferidas de la presente invencion, los aminoacidos que se anaden a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 31 pueden ser 0 (es decir, la secuencia de aminoacidos que consiste en SEQ ID NO: 31), o 1, o 2 o secuencias de aminoacidos mas sucesivas que se seleccionan a partir de secuencias de aminoacidos de longitud completa que constituyen el polipeptido ERAP1 (SEQ ID NO: 35). La secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 31 es una secuencia de aminoacidos que comprende la glutamina en la posicion 165/Q, el acido aspartico en 50 la posicion 169/D y la glutamina en la posicion 173/Q de la secuencia de aminoacidos de longitud completa que constituye el polipeptido ERAP1 (SEQ ID NO: 35). Por lo tanto, en las realizaciones preferidas de la presente invencion, los residuos de aminoacidos o secuencias de aminoacidos que se agregan a la SEQ ID NO: 31 pueden seleccionarse de secuencias de aminoacidos adyacentes a 165-173 en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 35. En otras palabras, el peptido ERAP1 de la presente invencion es preferiblemente un peptido que comprende la
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secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 31/QMLSDLTLQ, y que consiste en una secuencia de aminoacidos sucesivos seleccionada de las secuencias de aminoacidos que consisten en ATLS + QMLSDLTLQ + LRQR (correspondiente a una region cubierta por la SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 30).
El peptido de la presente invencion tiene de manera deseable, ya sea una o ambas de las propiedades (i) y (ii) que se describen a continuacion, ademas de la actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2:
(i) la propiedad de promover la translocacion nuclear del polipeptido PHB2 en las celulas positivas para el receptor de estrogenos en el que se expresa el polipeptido ERAP1; y
(ii) la propiedad de promover la union de los receptores de estrogenos presentes en el nucleo y/o en la membrana celular con el polipeptido PHB2 en las celulas positivas para el receptor de estrogenos en el que se expresa el polipeptido ErApI.
Al tener ya sea una o ambas de las propiedades (i) y (ii) mencionadas anteriormente, el peptido de la presente invencion suprime la activacion de los receptores de estrogeno en la celula ERAPI-expresada. Como consecuencia, el peptido de la presente invencion conduce a la supresion de la proliferacion celular de las celulas positivas para el receptor de estrogenos. Las propiedades anteriormente mencionadas (i) y (ii) del peptido ERAP1 se pueden evaluar de acuerdo con los metodos descritos en los Ejemplos descritos mas adelante.
El polipeptido PHB2 es conocido por ser un co-regulador selectivo para los receptores de estrogenos, y suprime la activacion transcripcional de los receptores de estrogenos por la interaccion con el receptor de estrogeno (Kasashima K, J Biol Chem 2006; 281: 36401-10). Por otra parte, el polipeptido ERAP1 perturba la translocacion nuclear del polipeptido PHB2, e inhibe la interaccion entre el polipeptido pHB2 y el receptor de estrogenos en el nucleo mediante la union al polipeptido PHB2 (Figs. 3A, 3B, 4A y 4B). Ademas, el polipeptido ERAP1 perturba la union del receptor de estrogenos presente en la membrana celular con el polipeptido PHB2 (Figs. 3A, 3B y 4B). Como consecuencias de estas acciones, en celulas en las que se expresa en exceso el polipeptido ERAP1, la supresion para la activacion de los receptores de estrogenos por el polipeptido PHB2 no funciona suficientemente, y la aceleracion de la proliferacion celular es inducida.
El peptido de la presente invencion se caracteriza por un punto, que el peptido de la presente invencion inhibe la union de forma competitiva del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, y por lo tanto recupera la funcion de la supresion de la activacion del receptor de estrogenos del polipeptido pHB2 inhibida por la union al polipeptido ERAP1. Por lo tanto, el peptido de la presente invencion deseablemente no perturba la translocacion nuclear del polipeptido PHB2, y no perturba la union del receptor de estrogenos para el polipeptido PHB2. Como se describio anteriormente, el fragmento del polipeptido ERAPI que comprende el sitio de union al polipeptido PHB2 es adecuado como el peptido de la presente invencion. Sin embargo, un peptido cerca de la longitud completa del polipeptido ERAP1 es probable que perturbe la translocacion nuclear del polipeptido PHB2, o que perturbe la union del polipeptido PHB2 al receptor de estrogenos aunque el grado no sea tanto como el del polipeptido ERAP1. Por consiguiente, la secuencia parcial de aminoacidos del polipeptido ERAP1 contenida en el peptido de la presente invencion preferiblemente tiene 100 residuos o menos, mas preferiblemente 80 residuos o menos, y mas preferiblemente 70 residuos o menos. En las realizaciones mas preferidas, la secuencia de aminoacidos parcial del polipeptido ERAP1 contenida en el peptido de la presente invencion tiene 50 residuos o menos, 40 residuos o menos, 30 residuos o menos, 25 residuos o menos, o 20 residuos o menos.
Ademas, el peptido de la presente invencion puede comprender otras secuencias de aminoacidos que la secuencia de aminoacidos derivada del polipeptido ERAP1 siempre que se mantenga la actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. Tambien en este caso, el peptido de la presente invencion, deseablemente no perturba la translocacion nuclear del polipeptido PHB2, y la union del polipeptido PHB2 al receptor de estrogenos. Por lo tanto, el peptido de la presente invencion es preferiblemente un peptido de 100 residuos o menos, 80 residuos o menos, o 70 residuos o menos. En las realizaciones mas preferidas, el peptido de la presente invencion es un peptido de 50 residuos o menos, 40 residuos o menos, o 30 restos o menos. Los ejemplos preferidos de la secuencia de aminoacidos contenida en el peptido de la presente invencion incluyen secuencias de aminoacidos que constituyen el peptido transcelular que se describe mas adelante, y secuencias de engarce para la union a otras sustancias, pero no se limita a las mismas.
Ademas, el peptido de la presente invencion se puede modificar por otras sustancias. En este documento, el termino "modificado", que se usa con respecto a un peptido, se refiere a que otra sustancia se une al peptido directamente o indirectamente. Ejemplos de la otra sustancia que modifica el peptido de la presente invencion incluyen peptidos, lfpidos, sacaridos, y polfmeros naturales o sinteticos, pero no se limitan a los mismos. El peptido de la presente invencion puede tener cualquier modificacion, siempre que se mantenga la actividad de la inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. Ademas, el peptido de la presente invencion puede impartir una funcion adicional por la modificacion. Los ejemplos de la funcion adicional incluyen la propiedad de direccionamiento de la diana, la estabilidad y la permeabilidad de la membrana celular, pero no se limitan a las mismas.
Los ejemplos preferidos de la modificacion en la presente invencion incluyen la introduccion de una sustancia permeable a la membrana celular. La estructura intracelular esta blindada comunmente del medio externo por una membrana celular. Por lo tanto, es diffcil introducir eficazmente una sustancia extracelular dentro de una celula. Sin embargo, una cierta sustancia puede tener permeabilidad de la membrana celular, y se puede introducir en una 5 celula sin ser bloqueada por la membrana celular. A una sustancia que no tiene permeabilidad con la membrana celular se le puede impartir la permeabilidad de la membrana celular al ser modificada con una sustancia que tiene permeabilidad de la membrana celular (sustancia permeable a la membrana celular). Por lo tanto, el peptido de la presente invencion puede modificarse con una sustancia permeable a la membrana celular por medio de la cual se introduce eficazmente en la celula. Ademas, en este documento, "permeabilidad de la membrana celular" se refiere a 10 la propiedad de penetrar la membrana celular de un mairnfero para entrar en el citoplasma. Ademas, "sustancia permeable a la membrana celular " se refiere a una sustancia que tiene "permeabilidad con la membrana celular".
Ejemplos de sustancia permeable a la membrana celular incluyen liposomas de fusion de membrana, y peptidos permeables a la membrana celular, pero no se limitan a los mismos. Por ejemplo, el liposoma de fusion de membrana se fusiona con una membrana celular, por medio del cual libera el contenido dentro de la celula. El 15 liposoma de fusion de membrana se puede preparar, por ejemplo, mediante la modificacion de la superficie del liposoma con una sustancia que tiene la propiedad de fusion de membrana. Ejemplos de liposomas de fusion de membranas incluyen los liposomas sensibles al pH (Yuba E, et al., J. Control. Release, 149, 72-80 (2011)), liposoma de fusion de membrana del virus Sendai (documento WO97/016171), liposoma modificado con un peptido permeable a la membrana celular, y similares. El peptido de la presente invencion puede estar encerrado en el 20 liposoma de fusion de membrana para ser introducido efectivamente en la celula. El recinto del peptido en el liposoma de fusion de membrana tambien se engloba en la "modificacion" del peptido en la presente invencion.
Con respecto al peptido permeable de la membrana celular, diversos peptidos de origen natural o sintetizados artificialmente han sido publicados hasta el momento (Joliot A. & Prochiantz A., Nat Cell Biol. 2004; 6: 189-96). Ejemplos del peptido permeable a la membrana celular incluyen los peptidos descritos a continuacion, pero no se 25 limitan a los mismos.
Poliarginina (Matsushita et al., (2003) J. Neurosci.; 21, 6000-7.);
Tat/RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 42). (Frankel et al, (1988) Cell 55, 1189-1193, Green & Loewenstein (1988) Cell 55, 1179-118);
Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 57) (Derossi et al, (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-50);
30 Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO: 43) (Park et al, (2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 824550);
Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 44) (Pooga et al, (1998) FASEB J. 12, 67-77);
MAP (peptido modelo anfipotico)/KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 45). (Oehlke et al, (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414,127-39);
35 K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 46) (Lin et al, (1995) J. Biol. Chem. 270, 14255-8);
Ku70/VPMLK (SEQ ID NO: 47) (Sawada et al, (2003) Nature Cell Biol. 5,352-7);
Ku70/PMLKE (SEQ ID NO: 48) (Sawada et al, (2003) Nature Cell Biol. 5,352-7);
Prion/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP (SEQ ID NO: 49) (Lundberg et al, (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90);
40 PVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 50) (Elmquist et al, (2001) Exp. Cell Res. 269,237-44);
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 51) (Morris et al., (2001) Nature Biotechnol. 19, 1173-6);
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO: 52) (Rousselle et al., (2000) Mol. Pharmacol. 57, 679-86);
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY (SEQ ID NO: 53). (Gao et al., (2002) Bioorg. Med. Chem. 10,4057-65); y
HN-1/TSPLNIHNGQKL (SEQ ID NO: 54); (Hong y Clayman (2000) Cancer Res. 60, 6551-6).
45 La poliarginina mencionada anteriormente puede estar constituida a partir de cualquier numero de residuos de arginina. Por ejemplo, la poliarginina se puede constituir a partir de 5 a 20 residuos de arginina. El numero de los residuos de arginina que constituyen la poliarginina no esta particularmente limitado siempre que la actividad de los presentes peptidos de inhibir la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2 no se altere, pero, en general, una poliarginina que consta de 11 residuos de arginina (SEQ ID NO: 55) se utiliza a menudo.
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El peptido de la presente invencion modificado con la sustancia permeable a la membrana celular puede ser representado por la formula general que se describe a continuacion:
[R] - [D]
En la formula, [R] representa una sustancia permeable a la membrana celular, y [D] representa "un peptido que inhibe la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, que comprende el sitio de union al polipeptido PHB2 en el polipeptido ERAPI". En la formula general mencionada anteriormente, [R] y [D] pueden estar directamente relacionadas, o indirectamente vinculadas a traves de un enlazador y similares. Cuando [R] y [D] estan vinculadas indirectamente, un peptido, un compuesto que tiene multiples grupos funcionales, o similar, puede usarse como enlazador. Por ejemplo, cuando [R] es un peptido permeable a la membrana de la celula, los ejemplos preferidos del enlazador incluyen enlazadores que consisten en residuos de glicina. El numero de los residuos de glicina que constituyen el enlazador no esta particularmente limitado, pero preferiblemente de 1 a 10 residuos, mas preferiblemente de 2 a 7 residuos, y aun mas preferiblemente de 3 a 5 residuos. Ademas, la sustancia permeable a la membrana celular puede ser indirectamente ligada al "peptido que comprende el sitio de union al polipeptido PHB2 en el polipeptido ERAP1 e inhibe la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2" al ser unido a la superficie de micropartfculas. [R] puede estar vinculado a cualquier posicion de [D]. Los ejemplos de la posicion ligada a [R] incluyen el extremo N-terminal o C-terminal de [D], y las cadenas laterales de los residuos de aminoacidos que constituyen [D]. Preferiblemente, [R] esta directamente ligado al extremo N-terminal o C-terminal de [D], o indirectamente unido a traves de un enlazador. Por otra parte, varias moleculas [R] pueden estar ligadas a una molecula [D]. En este caso, la molecula [R] se puede introducir en varias posiciones diferentes de la molecula [D]. Como alternativa, [D] se puede modificar con multiples [R] vinculadas entre sf
Ademas, se sabe en la tecnica que varios mimeticos de aminoacidos particularmente utiles o aminoacidos no naturales se introducen con el fin de mejorar la estabilidad in vivo del peptido. Por lo tanto, este tipo de mimeticos de aminoacidos o aminoacidos no naturales pueden ser introducidos con el fin de mejorar la estabilidad in vivo del peptido de la presente invencion. La estabilidad del peptido se puede confirmar mediante varios medios de cultivo biologicos tales como peptidasa, asf como plasma sangumeo humano y suero (por ejemplo, vease Coos Verhoef et al. (1986) Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11: 291-302).
El peptido de la presente invencion se caracteriza por un punto de tener una actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2. Tanto si el peptido construido tiene una actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2 como si no puede confirmarse mediante la comparacion de los niveles de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2 en presencia y en ausencia del peptido. Es decir, cuando el nivel de union en presencia del peptido es menor que el nivel de union en ausencia del peptido, el peptido puede ser determinado que tiene "actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2".
La medicion para el nivel de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2 se puede realizar usando diversos metodos conocidos. Por ejemplo, los metodos incluyen la inmunoprecipitacion utilizando un anticuerpo anti-ERAP1 o un anticuerpo anti-PHB2, cromatograffa de afinidad, y un biosensor utilizando fenomenos de resonancia de plasmon de superficie.
Como un metodo espedfico, por ejemplo, el polipeptido ERAP1 y el polipeptido PHB2 se incuban en presencia y en ausencia del peptido de prueba. A continuacion, la solucion de reaccion se inmunoprecipita con anticuerpo anti- ERAP1 o anticuerpo anti-PHB2. Ademas, se lleva a cabo analisis de transferencia de Western del inmunoprecipitado. El nivel de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2 se puede confirmar mediante la deteccion de al menos uno de los niveles de polipeptido PHB2 inmunoprecipitado con el anticuerpo anti-ERAP1 o el nivel del polipeptido ERAP1 inmunoprecipitado con el anticuerpo anti-PHB2. El polipeptido ERAP1 y el polipeptido PHB2 usados en este documento se pueden preparar por alguna tecnica de ingeniena genetica conocida. Ademas, el lisado celular de celulas productoras de estos polipeptidos puede ser tambien utilizado. Como celulas productoras de estos polipeptidos, pueden ser usadas las lmeas celulares que se describen en los Ejemplos de la memoria descriptiva.
Alternativamente, pueden ser usados los metodos que se describen en los Ejemplos de la memoria descriptiva. Espedficamente, en presencia y en ausencia del peptido de prueba, se cultivan las celulas positivas para el receptor de estrogenos. Entonces, las celulas se lisan con un tampon de lisis apropiado. Despues, se pueden realizar la inmunoprecipitacion y el analisis de transferencia Western usando el lisado de celulas de manera similar a como se describe anteriormente.
Un peptido que se ha confirmado que tiene "actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2" por cualquiera de los metodos mencionados anteriormente se determina como un peptido que tiene "actividad de inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2".
Ademas, el peptido de la presente invencion puede tener ya sea una o ambas de las propiedades (i) y (ii) que se describen a continuacion como una propiedad deseable:
(i) la propiedad de promover la translocacion nuclear del polipeptido PHB2 en las celulas positivas para el receptor de estrogenos en las que se expresa el polipeptido ERAP1; y
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(ii) la propiedad de promover la union de los receptores de estrogenos presentes en el nucleo y/o en la membrana celular con el polipeptido PHB2 en las celulas positivas para el receptor de estrogenos en las que se expresa el polipeptido ERAP1.
Tenga o no el peptido de la presente invencion la propiedad mencionada anteriormente puede ser confirmado mediante la comparacion de (i) el nivel de translocacion nuclear del polipeptido PHB2, y/o (ii) el nivel de la union del receptor de estrogeno al polipeptido PHB2 en presencia y en ausencia del peptido de la presente invencion. Es decir, cuando el nivel en la presencia del peptido de la presente invencion es mas alto que el nivel en ausencia del peptido de la presente invencion, el peptido de la presente invencion puede ser determinado que tiene las propiedades (i) y/o (ii) mencionadas anteriormente.
Como metodo espedfico, por ejemplo, puede ser utilizado el metodo que se describe en los ejemplos de la memoria descriptiva. Espedficamente, cuando se investiga la propiedad del punto (i) anteriormente mencionado, las celulas positivas para el receptor de estrogeno son estimuladas con estradiol durante 24 horas con adicion o sin adicion del peptido de la presente invencion. Entonces, las celulas se fraccionan mediante centrifugacion por gravedad espedfica. Despues, el polipeptido PHB2 presente en la fraccion nuclear se detecta mediante analisis de transferencia de Western y similar. Cuando el nivel de polipeptido del polipeptido PHB2 detectado en la fraccion nuclear aumenta en un caso en el que se anade el peptido de la presente invencion en comparacion con un caso en el que no se anade el peptido de la presente invencion, se determina que el peptido de la presente invencion tiene la propiedad (i) anteriormente mencionada. Ademas, el nivel del polipeptido PHB2 presente en el nucleo puede ser tambien detectado por la tincion inmunoqmmica como se describe en los Ejemplos de la memoria descriptiva.
Cuando se investigaba la propiedad (ii) anteriormente mencionada, las celulas positivas para el receptor de estrogeno se estimularon con estradiol durante 24 horas, con adicion o sin adicion del peptido de la presente invencion. Entonces, las celulas se fraccionaron mediante centrifugacion por gravedad espedfica. Entonces, las fracciones del citoplasma y nucleares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-receptor de estrogeno o el anticuerpo anti-PHB2. Ademas, se lleva a cabo el analisis de transferencia Western del inmunoprecipitado. Como consecuencia, cuando el nivel de union del receptor de estrogenos para el polipeptido PHB2 aumenta en la fraccion del citoplasma y/o la fraccion nuclear en un caso en el que se anade el peptido de la presente invencion en comparacion con un caso en que el peptido de la presente invencion no se anade, se determina que el peptido de la presente invencion tiene la propiedad (ii) mencionada anteriormente.
El peptido de la presente invencion se puede fabricar usando algun metodo bien conocido por cualquier experto normal en la tecnica. Por ejemplo, el peptido de la presente invencion se puede obtener por smtesis qmmica basada en la secuencia de aminoacidos. El metodo para sintetizar qmmicamente el peptido se conoce y el peptido de la presente invencion puede ser sintetizado qmmicamente basado en una secuencia de aminoacidos seleccionada como el peptido de la presente invencion por cualquier experto normal en la tecnica. El metodo para sintetizar qmmicamente el peptido se describe en, por ejemplo, los documentos que se describen a continuacion;
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Proteins, vol. 2, Academic Press, Nueva York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975;
(iv) Fundamentals and Experiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985;
(v) Development of Pharmaceuticals (segundo volumen) (en japones), vol. 14 (Peptide Synthesis), Hirokawa, 1991;
(vi) El documento WO99/67288; y
(vii) Barany G. & Merrifield R. B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.
Ademas, el peptido de la presente invencion se puede obtener por tecnicas de ingeniena genetica (por ejemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Por ejemplo, un polinucleotido que codifica el peptido de la presente invencion se inserta en un vector de expresion apropiado, y el vector se introduce en una celula huesped apropiada para preparar una celula transformada. Entonces, las celulas huesped se cultivan para producir el peptido de la presente invencion, y el extracto celular se prepara. En la purificacion del presente peptido a partir del extracto celular, puede ser utilizada alguna tecnica estandar para la purificacion de protemas. Por ejemplo, el presente peptido puede ser purificado mediante la seleccion y la combinacion de cromatograffa en columna, filtracion por filtros, ultrafiltracion apropiadamente, desplazamiento salino, precipitacion con disolventes, extraccion con disolventes, destilacion, inmunoprecipitacion, electroforesis en gel de amida SDS-poliacnlico, electroforesis de punto isoelectrico, dialisis y recristalizacion. Ademas, el peptido de la presente invencion puede ser tambien sintetizado por un sistema de traduccion in vitro en el que los elementos necesarios para la smtesis de protemas se reconstituyen in vitro.
Cuando se utiliza una tecnica de ingeniena genetica, el peptido de la presente invencion puede tambien expresarse como una protema de fusion con otro peptido. Un polinucleotido que codifica el peptido de la presente invencion y un polinucleotido que codifica el otro peptido se unen para convertirse en un esqueleto interno, se inserta en un vector de expresion apropiado, el vector se introduce en una celula huesped apropiada, y se preparan las celulas 5 transformadas. Entonces, las celulas huesped se cultivan para producir una protema de fusion del peptido de la presente invencion con el otro peptido, y el extracto celular se prepara. La purificacion de la protema de fusion a partir del extracto de celulas se puede realizar, por ejemplo, mediante la captura de la protema de fusion con una cromatograffa de afinidad utilizando una columna a la que se une una sustancia que tiene afinidad para la protema de fusion. Ademas, si el peptido de la presente invencion y el otro peptido estan unidos de antemano a traves de una 10 secuencia de engarce que se puede cortar por una enzima tal como peptidasa, proteasa y proteasoma, la protema de fusion capturada en la columna se puede tratar con estas enzimas para separar el peptido de la presente invencion a partir de la columna. Ejemplos del otro peptido que se puede utilizar en la formacion de la protema de fusion incluyen los peptidos que se describen a continuacion, pero no se limita a los mismos:
FLAG (Hopp et al, (1988) Biotechnology 6, 1204-1210.);
15 6xHis o 10xHis que consta de residuos de histidina (His);
hemaglutinina de la gripe (HA);
fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP; fragmento de VIH p18;
marcador T7; marcador HSV;
marcador E; fragmento de antigeno SV40 T;
20 marcador lck;
fragmento de a-tubulina; marcador B; fragmento de la protema C;
GST (glutation-S-transferasa);
HA (hemaglutinina de la gripe);
25 region constante de inmunoglobulina;
13-galactosidasa; y;
MBP (protema de union a maltosa).
2. Polinucleotido que codifica el peptido de la presente invencion, vector, y celula huesped
La presente invencion tambien proporciona un polinucleotido que codifica el peptido de la presente invencion. 30 Ademas, la presente invencion tambien proporciona un vector que comprende el polinucleotido, y una celula huesped que comprende el vector. El polinucleotido, el vector, y la celula huesped se pueden utilizar para la fabricacion del peptido de la presente invencion.
El polinucleotido de la presente invencion puede fabricarse por cualquier metodo conocido para cualquier experto normal en la tecnica. Por ejemplo, el polinucleotido de la presente invencion se pueden sintetizar usando tecnicas en 35 fase solida tales como las descritas en Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; y Matthes et al, EMBO J 1984, 3: 801-5. Ademas, el polinucleotido de la presente invencion se puede preparar tambien utilizando alguna tecnica de ingeniena genetica. Por ejemplo, se construye un cebador a partir de una secuencia de bases parcial del gen ERAP1 que codifica la secuencia de aminoacidos seleccionada como el peptido de la presente invencion (SEQ ID NO: 34), y se realiza la PCR de transcripcion inversa usando el ARNm extrafdo de las celulas que 40 expresan el polipeptido ERAP1 como plantilla. Esto permite la amplificacion del polinucleotido de la presente invencion.
El polinucleotido de la presente invencion se inserta en un vector de expresion apropiado, y el vector puede ser introducido en una celula huesped apropiada, para producir el peptido de la presente invencion en la celula huesped.
Por ejemplo, cuando se selecciona Escherichia coli como la celula huesped, y se amplifica el vector en una gran 45 cantidad en la Escherichia coli (por ejemplo, JM109, DH5a, HB101 o xL1Blue), el vector debe tener "ori" para la amplificacion en Escherichia coli, y un gen marcador para la seleccion de la Escherichia coli transformada (por ejemplo, un gen resistente a un farmaco seleccionado por un farmaco tal como ampicilina, tetraciclina, kanamicina y cloranfenicol). Por ejemplo, puede ser utilizado un vector de la serie M13, un vector de la serie pUC, pBR322, pBluescript, o pCR-Script. Cuando se utiliza un vector para la produccion del peptido de la presente invencion, un 50 vector de expresion es especialmente util. Por ejemplo, un vector de expresion para la expresion en Escherichia coli
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debe tener las caractensticas mencionadas anteriormente para la amplificacion en Escherichia coli. Cuando se utiliza como celula huesped una Escherichia coli tal como JM109, DH5a, HB101 o XLIBlue, el vector debe tener un promotor que pueda expresar eficazmente el gen deseado en Escherichia coli, por ejemplo, el promotor lacZ (Ward, et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), el promotor araB (Better, et al, Science 240 1041-3 (1988), o el promotor T7. Ademas, el vector tambien puede comprender una secuencia senal para la secrecion del polipeptido. Un ejemplo de la secuencia senal que controla la secrecion del polipeptido al periplasma de Escherichia coli es la secuencia senal pelB (Lei, et al, J Bacteriol 169: 4379-83 (1987)). Ejemplos de medios para introducir el vector en una celula huesped diana incluyen un metodo de cloruro de calcio y un metodo de electroporacion.
Ademas de Escherichia coli, por ejemplo, los vectores utiles incluyen vectores de expresion derivados de celulas de mairnferos (por ejemplo, pcDNA3 (Invitrogen) y pEGF-BOS (Mizushima S., Nucleic Acids Res 18 (17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8) , vectores de expresion derivados de celulas de insecto (por ejemplo, "sistema de expresion de vaculovirus Bac-to-BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), vectores de expresion de origen vegetal (por ejemplo, pMH1, PMH2) vectores de expresion derivados de virus de animales (por ejemplo, pVHS, PMV, pAdexLcw), vectores de expresion derivados de retrovirus (por ejemplo, pZIpneo), vectores de expresion derivados de levadura (por ejemplo, "kit de expresion de Pichia" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01), y vectores de expresion derivados de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608, pKTH50).
Con el fin de expresar un vector en celulas animales tales como celulas CHO, celulas COS o celulas NIH3T3, el vector debe tener un promotor necesario para la expresion en este tipo de celulas, por ejemplo, el promotor de SV40 (Mulligan, et al., Nature 277: 108-14 (1979)), el promotor MMLV-LTR, el promotor EF1a (Mizushima, et al, Nucleic Acids Res. 18: 5322 (1990)), o el promotor CMV. Ademas, el vector tiene preferiblemente un gen marcador para la seleccion de un transformante (por ejemplo, un gen resistente a farmaco seleccionado por un farmaco (por ejemplo, neomicina, G418)). Los ejemplos de vectores conocidos que tienen estas caractensticas incluyen pMAM, pDR2, PBK-RSV, PBK-CMV, pOPRSV y pOP13.
Ademas, el polinucleotido de la presente invencion se puede insertar en un vector apropiado, y se introduce en una celula diana para la produccion del peptido de la presente invencion en una celula diana. El peptido de la presente invencion producido en la celula diana inhibe la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, e induce la supresion para la proliferacion celular de la celula diana. En este caso, un vector en el que se inserta el polinucleotido de la presente invencion, puede ser un vector para insertar de forma estable el polinucleotido de la presente invencion en el genoma de la celula diana (por ejemplo, vease Thomas KR y Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 con respecto a la descripcion de un vector casete recombinante homologo). Por ejemplo, vease Wolff et al, Science 1990, 247: 1465-8; Patente de Estados Unidos N° 5.580.895; Patente de Estados Unidos No. 5.589.466; Patente de Estados Unidos N° 5.804.566; Patente de Estados Unidos N° 5.739.118; Patente de Estados Unidos N° 5.736.524; Patente de Estados Unidos No. 5.679.647; y documento WO98/04720.
Ademas, el polinucleotido de la presente invencion puede ser tambien insertado en un vector de expresion tal como un vector viral o un vector bacteriano. Los ejemplos del vector de expresion incluyen huespedes de virus atenuados tales como el de la viruela de las vacas o la varicela aviar (por ejemplo, vease la Patente de Estados Unidos N° 4.722.858). Otros ejemplos del vector que se pueden usar incluyen, bacilo de Calmette Guerin (BCG) (Stover et al, Nature 1991, 351: 456-60). Otros ejemplos son los vectores de adenovirus y vectores de virus adeno - asociados, vectores de retrovirus, vectores de Salmonella typhi, vectores de la toxina del antrax destoxicados, etc. (Shata et al, Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al, J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; e Hipp et al, In Vivo 2000, 14: 57185.).
3. Composicion farmaceutica que comprende el peptido o el polinucleotido de la presente invencion y el uso de los mismos
La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende el peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido de la presente invencion.
El peptido de la presente invencion inhibe la union de polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, y por lo tanto induce la supresion de la activacion de los receptores de estrogenos por el polipeptido PHB2. Como consecuencia, el peptido de la presente invencion conduce a la supresion de la proliferacion celular en las celulas positivas para el receptor de estrogeno. Asf, la composicion farmaceutica de la presente invencion es util para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades proliferativas celulares, debido a la activacion de los receptores de estrogenos. Ejemplos de tales enfermedades proliferativas celulas incluyen los canceres.
Se sabe que el cancer de mama en particular entre los canceres esta profundamente relacionado con la activacion de los receptores de estrogenos. El polipeptido ERAP1 es un nuevo factor de regulacion para la activacion de los receptores de estrogenos, y se expresa en alta frecuencia en muchas muestras de cancer de mama y celulas de cancer de mama. Por otra parte, se ha confirmado que casi no se reconoce la expresion en tejidos normales (Kim JW, Akiyama M, Park JH, et al. Cancer Sci. 2009; 100: 1468-1478). Por lo tanto, se considera que la funcion de la supresion del polipeptido PHB2 en la activacion de los receptores de estrogenos es inhibida por la expresion del polipeptido ERAP1 en el cancer de mama, y como consecuencia, se promueve la proliferacion de celulas de cancer de mama. De acuerdo con ello, la composicion farmaceutica de la presente invencion es particularmente adecuada
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para tratar y/o prevenir el cancer de mama. Ademas, la composicion farmaceutica de la presente invencion es particularmente util para el cancer de mama que es positivo para el receptor de estrogeno, y en el que el polipeptido ERAP1 se expresa entre los canceres de mama. Sin embargo, la composicion farmaceutica de la presente invencion no se limita al cancer de mama, sino que la composicion farmaceutica de la presente invencion puede utilizarse para un cancer que sea positivo para el receptor de estrogeno, y en el que se exprese el polipeptido ERAP1. Los ejemplos de canceres positivos para los receptores de estrogeno, ademas del cancer de mama, incluyen el cancer de utero, cancer de ovario, cancer de prostata (Nelles JL, et al., Expert Rev Endocrinol Metab. 2011 Mayo; 6 (3): 437-451), cancer de pulmon (en particular el cancer de pulmon de celulas no pequenas) (Stabile LP, et al, Cancer Res.. 2005 15 de Feb; 65 (4): 1459-1470; Marquez-Garban DC, et al., Steroides. 2007 Feb; 72 (2): 135-43), etc., pero no se limitan a los mismos.
Ademas, el peptido de la presente invencion tiene efecto de supresion no solo sobre la proliferacion celular dependiente de estrogenos en las celulas positivas para el receptor de estrogeno, sino tambien en la proliferacion de celulas independientes de estrogenos (Ejemplo 3). Entre los canceres de mama positivos para el receptor de estrogeno, del 60 al 70% es cancer de mama dependiente de estrogenos, y el resto es cancer de mama independiente de estrogenos. El cancer de mama independiente de estrogenos es refractario o resistente con respecto a los agentes de terapia hormonal convencionales, tales como el tamoxifeno y los inhibidores de aromatasa, y no puede ser tratado con el agente de la terapia hormonal convencional. Se considera que en tales cancer de mama independientes de estrogenos, el receptor de estrogeno esta activado por otros factores diferentes a los estrogenos (por ejemplo, el factor de crecimiento (EGF, IFGF, etc.), la mutacion de los receptores de estrogenos, la fosforilacion del receptor de estrogenos, etc.), y se promueve la proliferacion celular. El peptido de la presente invencion tambien tiene un efecto de supresion sobre la proliferacion celular independiente de estrogenos del cancer de mama positivo para el receptor de estrogeno, y por lo tanto la composicion farmaceutica de la presente invencion tambien se puede aplicar al tratamiento y/o prevencion del cancer de mama independiente de estrogenos o positivo para el receptor de estrogeno.
Ademas, se confirmo que el peptido de la presente invencion tiene efecto de supresion de proliferacion celular tambien con respecto a las celulas de cancer de mama negativas para el receptor de estrogeno (Fig. 40). Por lo tanto, la composicion farmaceutica de la presente invencion tambien se puede aplicar al tratamiento y/o la prevencion de cancer de mama negativo para el receptor de estrogeno.
Ademas, el peptido de la presente invencion suprime de manera efectiva la proliferacion celular de celulas de cancer de mama resistentes al tamoxifeno (Ejemplo 2 y el Ejemplo 8). El tamoxifeno es un antiestrogeno y es considerado que suprime la proliferacion celular dependiente de estrogenos por la union al receptor de estrogeno en competencia con los estrogenos. El tamoxifeno es ampliamente utilizado en la terapia adyuvante postoperatoria o tratamiento estandar del cancer de mama avanzado/recafda, pero alrededor del 30% del cancer de mama positivo para el receptor de estrogeno es refractario al tamoxifeno. Ademas, mediante el uso a largo plazo, el cancer de mama puede volverse resistente al tamoxifeno. El peptido de la presente invencion tiene un efecto de supresion de la proliferacion celular de celulas de cancer de mama resistentes al tamoxifeno y, por lo tanto, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede aplicar adecuadamente a dicho cancer de mama resistente al tamoxifeno.
Ademas, cuando se utilizo el peptido de la presente invencion en combinacion con tamoxifeno, el efecto de supresion de la proliferacion celular en las celulas positivas para el receptor de estrogeno, y el efecto antitumoral in vivo se promovieron notablemente (Ejemplo 4). Como se describio anteriormente, el tamoxifeno es un antiestrogeno, y tiene un mecanismo diferente para ejercer el efecto de supresion de la proliferacion celular en comparacion con el peptido de la presente invencion. Por lo tanto, se considera que el uso concomitante de tamoxifeno con el peptido de la presente invencion potencia los efectos terapeuticos de tamoxifeno en el cancer. Asf, la composicion farmaceutica de la presente invencion se utiliza adecuadamente en el tratamiento y/o la prevencion del cancer como uso concomitante con tamoxifeno con el proposito de potenciar los efectos terapeuticos del tamoxifeno en el cancer. Ademas, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede ser utilizada tambien de forma concomitante con otros agentes de terapia hormonal distintos al tamoxifeno. En este documento, la expresion "agente de terapia hormonal" se refiere a un medicamento que suprime la proliferacion celular dependiente de estrogenos mediante la supresion de las acciones de los estrogenos o la produccion de estrogenos in vivo. Ejemplos del agente de terapia hormonal incluyen un inhibidor de aromatasa, una preparacion del agonista de LH-RH, y una preparacion de progesterona, pero no se limitan a los mismos. Estos agentes de terapia hormonal convencional tienen diferentes mecanismos para inducir el tratamiento del cancer en comparacion con el peptido de la presente invencion, y de este modo del uso concomitante con la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede esperar una potenciacion de los efectos terapeuticos de los mismos sobre el cancer.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona, por ejemplo, las composiciones farmaceuticas descritas en (1) a (7) a continuacion:
(1) Una composicion farmaceutica que comprende al menos un ingrediente seleccionado de un grupo que consiste en un peptido de la presente invencion, un polinucleotido que codifica el peptido, y una sal farmaceuticamente aceptable del peptido;
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(2) La composicion farmaceutica descrita en (1) para tratar y/o prevenir el cancer;
(3) La composicion farmaceutica descrita en (2), en donde el cancer es un cancer de mama;
(4) La composicion farmaceutica descrita en (1) o (2), en el que el cancer es positivo para el receptor de estrogenos;
(5) La composicion farmaceutica descrita en (4), en el que el cancer es resistente al tamoxifeno;
(6) Una composicion farmaceutica que comprende un peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido para potenciar los efectos terapeuticos de un agente de terapia hormonal en el cancer; y
(7) Una composicion farmaceutica que comprende el peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido para la supresion de la activacion de los receptores de estrogenos en celulas positivas para el receptor de estrogenos.
Ejemplos de la sal farmaceuticamente aceptable del peptido de la presente invencion, que se pueden utilizar en la presente invencion, incluyen sales con un acido farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, acido inorganico o acido organico) o una base (por ejemplo, metal alcalino, metal alcalino-terreo o amina). Los ejemplos de las realizaciones preferidas incluyen sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables. Ejemplos de tales sales incluyen sales con un acido inorganico (por ejemplo, acido clorhndrico, acido fosforico, acido bromhHdrico, acido sulfurico, o acido acetico), o sales con un acido organico (por ejemplo, acido acetico, acido formico, acido propionico, acido fumarico, acido maleico, acido succmico, acido tartarico, acido cftrico, acido malico, acido oxalico, acido benzoico, acido metanosulfonico, acido bencenosulfonico, o acido de meglumina). Los ejemplos preferidos de la sal farmaceuticamente aceptable del peptido de la presente invencion incluyen la sal de acido acetico, sal de acido clorhndrico, sal de acido de meglumina, y la sal de amonio.
Ademas, la presente invencion proporciona el uso del peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido en la fabricacion de la composicion farmaceutica descrita en una cualquiera de los puntos (1) a (7) anteriormente mencionados. Ademas, la presente invencion proporciona ademas un metodo o proceso para la fabricacion de la composicion farmaceutica descrita en uno cualquiera de los puntos (1) a (7) anteriormente mencionados. El metodo o proceso incluye una etapa de la prescripcion de un vehnculo farmaceuticamente aceptable y el peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido como ingrediente activo. Ademas, la presente invencion proporciona un metodo o proceso para la fabricacion de la composicion farmaceutica descrita en uno cualquiera de los puntos (1) a (7) anteriormente mencionados. El metodo o proceso comprende una etapa de mezclar un ingrediente activo con un vehfculo farmaceuticamente aceptable, en donde este ingrediente activo es el peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido. Ademas, la presente invencion proporciona el peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido para uso en el tratamiento de cancer, la potenciacion de los efectos terapeuticos de un agente de terapia hormonal en el cancer, o la supresion de la activacion del receptor de estrogeno en celulas positivas para el receptor de estrogeno.
Ademas, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar y/o prevenir una enfermedad proliferativa celular debida a la activacion de los receptores de estrogenos, que comprende una etapa de administrar el peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido a un sujeto. Los ejemplos de la enfermedad proliferativa celular tratada y/o prevenida por el metodo de la presente descripcion incluyen el cancer. El cancer adecuado para la aplicacion del metodo de la presente descripcion es similar a los descritos anteriormente para la composicion farmaceutica de la presente invencion. A saber, el metodo de la presente descripcion se aplica preferentemente al cancer que es positivo para el receptor de estrogeno, y en el que se expresa el polipeptido ERAP1. Ademas, la presente descripcion proporciona un procedimiento para suprimir la activacion de los receptores de estrogenos, que comprende una etapa de poner el peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido en contacto con celulas positivas para el receptor de estrogeno.
La composicion farmaceutica de la presente invencion se administra preferiblemente a seres humanos, pero se puede administrar a otros mamfferos, por ejemplo, un raton, una rata, un cobaya, un conejo, un gato, un perro, una oveja, un cerdo, una vaca, un mono, un babuino, y un chimpance.
La composicion farmaceutica de la presente invencion contiene una cantidad farmaceuticamente eficaz del peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido como ingrediente activo. La "cantidad farmaceuticamente eficaz" es una cantidad suficiente para lograr el proposito de la composicion farmaceutica de la presente invencion. Por ejemplo, cuando la composicion farmaceutica de la presente invencion es una composicion farmaceutica para tratar y/o prevenir el cancer, un ejemplo de la cantidad farmaceuticamente eficaz puede ser una cantidad de induccion de la supresion para la velocidad de proliferacion del cancer, supresion de la capacidad metastasica, extension del tiempo de vida, supresion o retraso de la generacion de cancer, o alivio de diversos smtomas clmicos implicados en el cancer cuando se administra a un paciente. La supresion de la velocidad de proliferacion del cancer puede ser la supresion, por ejemplo, en aproximadamente 5% o mas en comparacion con el caso en que no se administra la composicion farmaceutica de la presente invencion. La supresion de la velocidad de proliferacion del cancer puede ser preferiblemente de aproximadamente 10% o mas, 20% o mas, 30% o mas, 40% o mas, 50% o mas, 75% o mas, 80% o mas, 90% o mas, o 100% o mas.
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Ademas, cuando la composicion farmaceutica de la presente invencion es una composicion farmaceutica para potenciar los efectos terapeuticos de un agente de terapia hormonal sobre el cancer, un ejemplo de la cantidad farmaceuticamente eficaz puede ser una cantidad de induccion de la potenciacion de los efectos terapeuticos de un agente de terapia hormonal en el cancer cuando se administra a un paciente en comparacion con el caso en que no se administra la composicion farmaceutica de la presente invencion. Los efectos terapeuticos del agente de terapia hormonal en el cancer que se pueden comparar pueden ser, por ejemplo, la supresion de la velocidad la proliferacion del cancer, la supresion de la capacidad metastasica, la extension del tiempo de vida, la supresion o el retraso de la generacion de cancer, o el alivio de diversos smtomas clmicos implicados en el cancer. Por ejemplo, la cantidad farmaceuticamente eficaz puede ser una cantidad para potenciar el efecto de supresion de la velocidad de proliferacion del cancer mediante un agente de terapia hormonal en aproximadamente 5% o mas en comparacion con el caso en que no se administre la composicion farmaceutica de la presente invencion. La potenciacion del efecto de supresion de la velocidad de proliferacion del cancer mediante un agente de terapia hormonal puede ser preferiblemente de aproximadamente l0% o mas, 20% o mas, 30% o mas, 40% o mas, 50% o mas, 75% o mas, 80% o mas, 90% o mas, o 100% o mas.
Ademas, cuando la composicion farmaceutica de la presente invencion es una composicion farmaceutica para la supresion de la activacion de los receptores de estrogenos de las celulas positivas para el receptor de estrogeno, un ejemplo de la cantidad farmaceuticamente eficaz puede ser una cantidad que induzca la supresion de la activacion del receptor de estrogenos en las celulas positivas para el receptor de estrogeno cuando se administra a un paciente, en comparacion con el caso en que no se administre la composicion farmaceutica de la presente invencion. La supresion de la activacion de los receptores de estrogenos puede ser confirmada, por ejemplo, mediante la deteccion de la supresion para el nivel de expresion de un gen diana para la activacion transcripcional por los receptores de estrogeno (gen que tiene un elemento responsable de estrogeno (ERE)), la supresion para el nivel de fosforilacion del receptor de estrogeno, la supresion para el nivel de fosforilacion de una molecula senal tal como IGF-1Rp, Shc, Akt, PI3K y MAPK, y similares. Por ejemplo, la cantidad farmaceuticamente eficaz puede ser una cantidad que suprima cualquiera de los niveles ejemplificados anteriormente en aproximadamente un 5% o mas, en comparacion con el caso en que no se administre la composicion farmaceutica de la presente invencion. La supresion de cualquiera de los niveles ejemplificados anteriormente puede ser preferentemente aproximadamente de 10% o mas, 20% o mas, 30% o mas, 40% o mas, 50% o mas, 75% o mas, 80% o mas, 90 % o mas, o 100% o mas.
La cantidad farmaceuticamente eficaz puede depender de muchos factores, incluyendo la edad y el sexo del sujeto, el proposito de la administracion, la gravedad de la enfermedad y la via de administracion. Sin embargo, la determinacion de la cantidad farmaceuticamente eficaz en la composicion farmaceutica de la presente invencion puede realizarse de manera suficiente por cualquier experto normal en la tecnica. Por ejemplo, la cantidad farmaceuticamente eficaz en la composicion farmaceutica de la presente invencion puede ser mas o menos primero estimada a partir de un ensayo de cultivo celular y/o modelo animal. Por ejemplo, la cantidad farmaceuticamente eficaz se puede prescribir en un modelo animal a fin de alcanzar la concentracion de circulacion que cubre la IC50 (dosis por la cual el 50% de las celulas muestra efectos deseados) determinada en el cultivo celular. La cantidad farmaceuticamente eficaz puede ser tambien determinada, por ejemplo, por procedimientos farmaceuticos estandar para determinar la LD50 (dosis por la cual el 50% de una poblacion se lleva a la muerte) y ED50 (dosis por la cual se trata con eficacia el 50% de una poblacion) en un cultivo celular o animal de experimentacion. La relacion de la dosis para las acciones toxicas a la dosis para los efectos terapeuticos es el mdice terapeutico (es decir, la relacion de LD50 y ED50). En la prescripcion de un rango de dosis para uso en seres humanos, se pueden utilizar los datos obtenidos de tal ensayo de cultivo celular y ensayo en animales. La dosis de tales polipeptido y polinucleotido puede estar dentro de un intervalo de concentraciones de circulacion que casi no tenga absolutamente ninguna toxicidad, y que cubra la ED50. La dosis en este intervalo puede cambiar dependiendo de la forma de dosificacion unitaria que se utiliza y la via de administracion que se utiliza. La prescripcion exacta, la via de administracion, y la dosis pueden ser seleccionadas por cualquier medico individual en su consideracion del estado del paciente (por ejemplo, vease Fingl et al. (1975) en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p1). La dosis y el intervalo de administracion pueden ser regulados individualmente a fin de obtener la concentracion plasmatica suficiente del ingrediente activo para el mantenimiento de los efectos deseables.
En cuanto a la dosis a modo de ejemplo, por ejemplo, el peptido de la presente invencion o el polinucleotido que codifica el peptido se pueden administrar a una dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 250 mg/kg/dfa. La dosis es preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 200 mg/kg/dfa, mas preferiblemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 150 mg/kg/dfa, y aun mas preferiblemente de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 100 mg/kgMa. El intervalo de dosis para un adulto (60 kg de peso corporal) es comunmente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 17,5 g/dfa, preferiblemente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 g/dfa, y mas preferiblemente de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 3 g/dfa. La composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener el peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido en la cantidad descrita anteriormente en un comprimido u otra forma de dosificacion unitaria proporcionada como una unidad individual. Alternativamente, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener la dosis que se ha descrito anteriormente, por ejemplo, en una unidad que contenga aproximadamente de 5 mg a aproximadamente 500 mg, preferiblemente de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 500 mg como multiples preparaciones.
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La composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener opcionalmente otras sustancias terapeuticas como ingrediente activo. Por ejemplo, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener otros agentes de terapia hormonal (tamoxifeno, un inhibidor de aromatasa, una preparacion de agonista de LH-RH, una preparacion de progesterona, etc.). Como se muestra en los ejemplos, se confirmo que cuando el peptido de la presente invencion se administra junto con tamoxifeno, el efecto antitumoral aumenta en comparacion con el caso en que se administran de forma individual (Ejemplo 4). Por lo tanto, una composicion farmaceutica que comprende el peptido de la presente invencion y otro agente de terapia hormonal se ejemplifica como la realizacion preferida de la composicion farmaceutica de la presente invencion. Ademas, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener, por ejemplo, un agente anti-inflamatorio, un analgesico, un agente de terapia qmmica, y similares. Estas diversas preparaciones que se mezclan con el peptido ERAP1 se pueden mezclar en una forma de un profarmaco o en una sal farmaceuticamente aceptable.
Ademas del hecho de que la composicion farmaceutica de la presente invencion contiene otra sustancia terapeutica como tal, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar con uno o mas tipos de otras composiciones farmaceuticas, al mismo tiempo o sucesivamente. Como se ha descrito anteriormente, cuando el peptido de la presente invencion se usa en combinacion con otro agente para la terapia de hormonas, se espera un aumento del efecto antitumoral en comparacion con el caso en el que se administran de forma individual. La presente descripcion incluye los metodos descritos a continuacion como las realizaciones preferidas:
- un metodo para tratar y/o prevenir el cancer, que comprende una etapa de administrar el peptido de la presente invencion o el polinucleotido que codifica el peptido a un sujeto, y una etapa de administrar un agente de terapia hormonal a un sujeto; y
- un metodo para potenciar los efectos terapeuticos de un agente de terapia hormonal en el cancer de mama en un sujeto, que comprende las etapas (a) y (b) descritas a continuacion:
(a) una etapa de administrar un agente de terapia hormonal a un sujeto; y
(b) una etapa de administrar el peptido de la presente invencion o el polinucleotido que codifica el peptido a un sujeto.
A saber, la presente descripcion proporciona un metodo para potenciar los efectos terapeuticos de uno o ambos de un agente de terapia hormonal y un agente de terapia qmmica, que comprende una etapa de administrar el peptido ERAP1 a un sujeto al que ya sea uno o ambos de un agente de terapia hormonal y un agente de terapia qmmica se han administrado. Alternativamente, la presente invencion se refiere al uso de cualquier ingrediente seleccionado de un grupo que consiste en (a) a (c) descrito a continuacion en la fabricacion de una composicion farmaceutica para potenciar los efectos terapeuticos de uno o ambos de un agente de terapia hormonal y un agente de terapia qmmica:
(a) el peptido ERAP1 de la presente invencion;
(b) un polinucleotido que codifica el peptido; y
(c) una sal farmaceuticamente aceptable del peptido.
Ademas, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para potenciar los efectos terapeuticos de uno o ambos de un agente de terapia hormonal y un agente de terapia qmmica, que comprende cualquier ingrediente seleccionado de un grupo que consiste en los puntos (a) a (c) anteriormente mencionados y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para fabricar una composicion farmaceutica para potenciar los efectos terapeuticos de uno o ambos de un agente de terapia hormonal y un agente de terapia qmmica, que comprende una etapa de mezclar cualquier ingrediente seleccionado de un grupo que consiste en los puntos (a) a (c) anteriormente mencionados y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Una enfermedad para la cual se espera la potenciacion de los efectos terapeuticos de la presente invencion es el cancer que es positivo para el receptor de estrogeno, y en el que se expresa el polipeptido ERAP1. Ejemplos de tales canceres incluyen el cancer de mama humano.
En una realizacion de la presente invencion, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede estar contenida en un artfculo y/o kit fabricado que comprende un material util para tratar y/o prevenir el cancer. Mas espedficamente, abarcado en el kit de la presente invencion esta un kit para tratar un cancer que es positivo para el receptor de estrogeno, y en el que se expresa el polipeptido ERAP1, que comprende:
(i) uno o ambos de un agente de terapia hormonal y un agente de terapia qmmica, y
(ii) cualquier ingrediente seleccionado de un grupo que consiste en los siguientes (a) - (c):
(a) el peptido ERAP1 de la presente invencion;
(b) un polinucleotido que codifica el peptido; y
(c) una sal farmaceuticamente aceptable del peptido.
Un artfculo manufacturado puede comprender un recipiente para cualquier composicion farmaceutica de la presente invencion junto con una etiqueta. Ejemplos de recipientes apropiados incluyen una botella, un vial, y un tubo de ensayo. El recipiente puede estar formado a partir de diversos materiales tales como vidrio o plastico. La etiqueta del recipiente debe indicar que la composicion farmaceutica se utiliza en el tratamiento y/o la prevencion de una o mas 5 condiciones de una enfermedad. La etiqueta tambien puede indicar indicaciones de administracion, etc.
El kit que comprende la composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender ademas opcionalmente un segundo recipiente que aloje un diluyente farmaceuticamente aceptable, ademas del recipiente anteriormente mencionado. El kit puede contener ademas otros materiales deseados desde el punto de vista comercial y el punto de vista del usuario, que incluyan otro tampon, un diluyente, un filtro, una aguja, una jeringa, y 10 un documento adjunto que tenga instrucciones.
La composicion farmaceutica de la presente invencion se puede poner en un paquete o dispositivo dispensador, segun sea necesario, que puede comprender una o mas formas de dosificacion unitaria que comprendan un ingrediente activo. El paquete puede contener una lamina de metal o una lamina de plastico tal como un envase blister. El paquete o dispositivo dispensador puede venir adjunto con instrucciones para su administracion.
15 La composicion farmaceutica de la presente invencion puede ser tambien proporcionada como un kit con otra composicion farmaceutica util para tratar y/o prevenir el cancer. La composicion farmaceutica que se puede combinar con la composicion farmaceutica de la presente invencion en el kit incluye, por ejemplo, agentes de terapia hormonal y agentes de terapia qrnmicas, pero no se limita a los mismos. En las realizaciones preferidas, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede proporcionarse como un kit con otro agente de terapia 20 hormonal. Por lo tanto, tambien esta abarcado por la presente invencion un kit que comprende la composicion farmaceutica de la presente invencion y otro agente de terapia hormonal. Alternativamente, la presente invencion se refiere al uso de una combinacion de (i) y (ii) que se describe a continuacion en el tratamiento del cancer que es positivo para el receptor de estrogeno, y en el que el polipeptido ERAP1 se expresa en un sujeto:
(i) uno o ambos de un agente de terapia hormonal y un agente de terapia qrnmica, y
25 (ii) cualquier ingrediente seleccionado de un grupo que consiste en los siguientes puntos (a) - (c);
(a) el peptido ERAP1 de la presente invencion;
(b) un polinucleotido que codifica el peptido; y
(c) una sal farmaceuticamente aceptable del peptido.
En las realizaciones preferidas de la presente invencion, los ejemplos de cancer que pueden ser una diana para el 30 tratamiento incluyen el cancer de mama humano.
El peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el peptido se puede administrar directamente junto con un vehnculo adecuado a un sujeto, o formularse en una forma de dosificacion apropiada usando un metodo conocido para la preparacion de un medicamento. Alternativamente, una sal farmaceuticamente aceptable del peptido de la presente invencion puede tambien administrarse junto con un vehnculo adecuado a un sujeto, o se 35 puede formular para la administracion como el peptido. Por ejemplo, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede formular en una forma adecuada para la administracion oral, rectal, intranasal, local (incluyendo bucal y sublingual), vaginal, o parenteral (incluyendo intramuscular, subcutanea, e intravenosa), o la administracion por inhalacion o soplado. Por ejemplo, segun sea necesario, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar por via oral en forma de tabletas recubiertas de azucar, una capsula, un elixir, y una 40 microcapsula, o puede administrarse parenteralmente en una forma de una inyeccion que es una solucion esterilizada o suspension con agua o cualquier otro vetnculo farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede mezclar junto con un vehnculo farmaceuticamente aceptable o medio, agua esterilizada espedficamente, solucion salina fisiologica, aceite vegetal, un agente emulsionante, un agente de suspension, un agente tensioactivo, un agente estabilizante, un agente aromatizante, un 45 excipiente, un agente disolvente, un conservante, un agente de union, etc., en una forma de dosificacion unitaria que se requiere para su uso en un medicamento convencionalmente aceptado. La frase "vehnculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sustancia inerte que se utiliza como diluyente o agente disolvente para un farmaco. Por lo tanto, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender cualquier vehnculo farmaceuticamente aceptable, ademas del peptido de la presente invencion o un polinucleotido que codifica el 50 peptido.
Ejemplos de aditivos que pueden ser mezclados con una tableta y una capsula incluyen agentes de union (gelatina, almidon de mafz, goma de tragacanto y goma arabiga, etc.); excipientes (celulosa cristalina, etc.); agentes de expansion (almidon de mafz, gelatina y acido algmico, etc.); lubricantes (estearato de magnesio, etc.); edulcorantes (sacarosa, lactosa, o sacarina); y agentes aromatizantes (menta, aceite Akamono, y cereza, etc.). Cuando la forma 55 de dosificacion unitaria sea una capsula, tambien pueden abarcarse un vehnculo lfquido (aceite, etc.) adicionalmente en los ingredientes antes mencionados. Los ingredientes esterilizados para inyeccion pueden formularse usando un agente disolvente tal como agua destilada para inyeccion de acuerdo con el uso de la medicina convencional.
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Otras soluciones isotonicas incluyendo solucion salina fisiologica, as^ como adyuvantes tales como glucosa, D- sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio se pueden usar como solucion acuosa para inyeccion. Estas se pueden usar junto con agentes solubilizantes adecuados, tales como un alcohol, espedficamente etanol, un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol) y un agente tensioactivo no ionico (por ejemplo, polisorbato 80 (marca registrada) y HCO-50)).
El aceite de sesamo o aceite de soja se pueden usar como solucion oleosa, y se pueden usar junto con benzoato de bencilo o alcohol bendlico como agente solubilizante, y pueden formularse usando un tampon (tampon de fosfato y tampon de acetato de sodio, etc.); analgesicos (clorhidrato de procama, etc.); un agente estabilizante (alcohol bendlico, fenol, etc.); y un antioxidante. La solucion de inyeccion preparada se puede rellenar en una ampolla adecuada.
Una preparacion farmaceutica adecuada para la administracion oral incluye, pero no esta limitado a, una capsula, un sello, y un comprimido, que contiene una cantidad prescrita de un ingrediente activo, respectivamente. La preparacion tambien incluye un medicamento, un lfquido, un gel, un jarabe, una suspension, una pfldora, polvos, granulos, una solucion, una suspension, una emulsion, etc. El ingrediente activo se administra opcionalmente en forma de bolo, pastilla, o pasta. El comprimido y la capsula para la administracion oral pueden contener excipientes convencionales tales como un agente de union, un extensor, un lubricante, un disgregante, y un agente humectante. El excipiente apropiado incluye, en particular, diluyentes, por ejemplo, azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa, por ejemplo, almidon de mafz, almidon de trigo, almidon de arroz, almidon de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa y carboximetil celulosa de sodio, y polivinilpirrolidona (PVP). Un desintegrador tal como pirrolidona de polivinilo de reticulacion, agar, y acido algfnico o una sal del mismo, por ejemplo, alginato de sodio se puede anadir cuando sea necesario.
Un comprimido puede fabricarse por compresion o moldeo, opcionalmente junto con uno o mas tipos de ingredientes de preparacion. Un comprimido se puede preparar mediante la mezcla de un ingrediente activo en una forma libremente fluyente tal como polvos o granulos, opcionalmente con un agente aglutinante, un lubricante, un diluyente inerte, un lubricante, un agente tensioactivo o un dispersante, y comprimiendo la mezcla en una maquina apropiada. Un triturado en tableta puede fabricarse por moldeo de una mezcla de compuestos en polvo humedecido con un diluyente lfquido inerte en una maquina adecuada. Un comprimido se puede recubrir de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones lfquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, una suspension acuosa u oleosa, una solucion, una emulsion, un jarabe, o un agente elixir, o se pueden proporcionar como un producto seco para su reconstitucion con agua u otro vedculo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones kquidas pueden contener aditivos convencionales tales como un agente de suspension, un agente emulsionante, un vedculo no acuoso (aceite comestible puede ser abarcado), y un conservante.
Las preparaciones para la administracion parenteral incluyen inyecciones acuosas y no acuosas esteriles que pueden contener un antioxidante, un agente tampon, un bacteriostatico y un soluto que hace que la sangre de un sujeto receptor sea isotonica con la preparacion, y suspensiones acuosas y no acuosas esterilizadas que pueden contener un agente de suspension y un espesante. La preparacion se puede proporcionar como una carga en un recipiente, por ejemplo, una ampolla sellada o un vial en una dosis unitaria o dosis plural, y puede ser conservada en un estado liofilizado que puede ser simplemente anadido con un vedculo lfquido esterilizado, por ejemplo, solucion fisiologica y agua para inyeccion, justo antes de su uso. Alternativamente, la preparacion puede proporcionarse como una infusion continua. Una solucion de solubilizacion y suspension para inyeccion instantanea se pueden preparar a partir de polvos esterilizados, granulos, y tabletas como se describe anteriormente.
Las preparaciones para la administracion rectal incluyen supositorios que utilizan vedculos convencionales tales como manteca de cacao o polietilenglicol. Las preparaciones para administrar via intraoral, por ejemplo, administrar localmente via bucal o sublingual incluyen una pastilla que comprende un ingrediente activo en una base saborizante tal como sacarosa, y goma arabiga o goma de tragacanto, y un troche que comprende un ingrediente activo en una base tal como gelatina, glicerina, sacarosa o goma arabiga. Un aerosol lfquido o polvo dispersable o gotas se pueden utilizar con el fin de administrar por via intranasal el ingrediente activo. Las gotas pueden ser prescritas mediante una base acuosa o no acuosa que tambien contenga uno o mas tipos de dispersantes, agentes solubilizantes, o agentes de suspension.
Para la administracion por inhalacion, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede ser administrada por un inhalador, un nebulizador, un paquete a presion, u otros medios apropiados para el suministro por pulverizacion con aerosol. El paquete a presion puede comprender agentes de pulverizacion apropiados (diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono, u otros gases apropiados). Una unidad de dosificacion en el aerosol a presion puede determinarse proporcionando una valvula para suministrar una cantidad fija. Alternativamente, en la administracion por inhalacion o soplado, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede ser una forma de una composicion de polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del peptido de la presente invencion, y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidon. La composicion en polvo se puede proporcionar en una forma de dosificacion unitaria en, por ejemplo, una capsula, un cartucho, gelatina, o un envase blister, y los polvos se pueden administrar usando un inhalador o un soplador de la misma.
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Se pueden utilizar las preparaciones descritas anteriormente adaptadas para liberar de forma sostenible el peptido de la presente invencion segun sea necesario. La composicion farmaceutica de la presente invencion tambien puede contener otros ingredientes activos tales como un agente antibacteriano, un agente inmunosupresor, o un conservante.
Debe entenderse que la preparacion de la presente invencion puede comprender otras sustancias convencionales en la tecnica teniendo en cuenta la clase de preparacion, ademas de los ingredientes descritos anteriormente. Por ejemplo, una preparacion adecuada para administracion oral puede comprender un agente aromatizante.
La composicion farmaceutica de la presente invencion se administra preferiblemente por via parenteral en forma de inyeccion a fin de evitar que el ingrediente activo, es decir, el peptido o el polinucleotido sea digerido por el acido gastrico o por alguna enzima intestinal. Por ejemplo, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar mediante inyeccion intraarterial, inyeccion intravenosa, inyeccion intradermica, inyeccion subcutanea o inyeccion intra-tumoral usando algun metodo bien conocido para el experto normal en la tecnica. En las realizaciones preferidas, la composicion farmaceutica de la presente invencion se administra por inyeccion intravenosa en una forma en la que el ingrediente activo se incluye en un reactivo de entrega apropiado, tal como un liposoma. El recinto del ingrediente activo en un reactivo de suministro tal como un liposoma se puede realizar por algun metodo conocido para el experto normal en la tecnica.
Cuando el ingrediente activo es un polinucleotido que codifica el peptido de la presente invencion, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener un vector para la terapia genica en la que se inserta el polinucleotido como ingrediente activo. En este caso, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender un agente potenciador de la transfeccion apropiado con el fin de introducir el vector en la celula.
4. Metodo para determinar el pronostico del cancer
Como se muestra en los Ejemplos de la memoria descriptiva, la expresion del polipeptido ERAP1 se correlaciona significativamente con el penodo de supervivencia sin recafda de cancer de mama (Ejemplo 7). Asf, la presente descripcion tambien proporciona un metodo para determinar el pronostico de un paciente que tiene cancer usando la expresion del polipeptido ERAP1 como un mdice.
Espedficamente, la presente descripcion proporciona los metodos de [1] a [8] que se describen a continuacion:
[1] un metodo para determinar el pronostico de un paciente que tiene cancer, que comprende las etapas (a) a (c) que se describen en (A) o (B) descritos a continuacion:
(A)
(a) una etapa de detectar el nivel de expresion del gen ERAP1 en una muestra biologica recogida del sujeto;
(b) una etapa de comparar el nivel de expresion detectado en la etapa (a) con un nivel de control;
(c) una etapa de determinar el pronostico del sujeto sobre la base de la comparacion de la etapa (b);
(B)
(a) una etapa de aislar o recoger una muestra biologica derivada de un sujeto;
(b) una etapa de poner la muestra biologica derivada del sujeto en contacto con un oligonucleotido que se hibrida con el polinucleotido ERAP1, o un anticuerpo que se une al polipeptido ERAP1 para la deteccion, medicion, o la determinacion del nivel de expresion del gen ERAPI;
(c) una etapa de deteccion, medicion, o determinacion del nivel de expresion del gen ERAP1 sobre la base del contacto;
(d) una etapa de comparar el nivel de expresion detectado en la etapa (c) con un nivel de control; y
(e) una etapa de determinar el pronostico del sujeto sobre la base de la comparacion de la etapa (d);
[2] el metodo descrito en [1], en el que el nivel de control mencionado anteriormente es un buen nivel de control de pronostico, y el aumento del nivel de expresion anteriormente mencionado en comparacion con el nivel de control se determina como mal pronostico;
[3] el metodo descrito en [1] o [2], en el que el nivel de expresion antes mencionado se obtiene por medio de uno de los metodos (a) o (b) descritos a continuacion:
(a) detectar el ARNm que codifica el polipeptido ERAP1; y
(b) detectar el polipeptido ERAP1;
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[4] el metodo descrito en [3], en el que el nivel de expresion antes mencionado se obtiene por tincion inmunohistoqmmica;
[5] el metodo descrito en uno cualquiera de [1] a [4], en el que la muestra biologica antes mencionada es un especimen extirpado de cancer;
[6] el metodo descrito en uno cualquiera de [1] a [5], en el que el cancer es positivo para el receptor de estrogeno;
[7] el metodo descrito en [6], en el que el cancer es cancer de mama; y
[8] el metodo descrito en uno cualquiera de [1] a [7], en el que el pronostico a determinar es el de recafda despues de cirugfa.
En este documento, el termino "pronostico" representa una estimacion con respecto al resultado esperado de la
enfermedad, posibilidad de recuperacion de la enfermedad, y la posibilidad de recafda de la enfermedad. Por lo
tanto, se prescribe un pronostico no bueno o mal pronostico por la disminucion del tiempo de vida o la tasa de supervivencia despues del tratamiento o el aumento de la tasa de recafda despues del tratamiento o la reduccion del penodo de tiempo hasta la recafda. Por el contrario, se prescribe un buen pronostico por el aumento del tiempo de vida o la supervivencia despues del tratamiento, o la disminucion de la tasa de recafda despues del tratamiento o la extension del penodo de tiempo hasta la recafda.
En este documento, la frase "determinar el pronostico" incluye el analisis para la estimacion y la expectativa del progreso del cancer, en particular, con recafdas de cancer, propagacion de metastasis y recafdas de la enfermedad. El metodo para determinar el pronostico de la presente descripcion esta destinado a ser utilizado clmicamente en la fabricacion de conclusiones para el metodo de tratamiento, incluyendo la intervencion terapeutica, los criterios del diagnostico, por ejemplo, la clasificacion de la etapa de la enfermedad, y el control de la enfermedad y la supervision para la metastasis o recafda de la enfermedad neoplasica. En las realizaciones preferidas, el pronostico estimado por el metodo de la presente invencion puede ser la recafda despues de la cirugfa. Por lo tanto, por el metodo de la presente descripcion, se hace posible estimar la posibilidad de cancer recidivante en un paciente que ha recibido la cirugfa de extirpacion del cancer.
El cancer que se determina para el pronostico por el metodo de la presente descripcion es preferiblemente el cancer positivo para el receptor de estrogeno. Los ejemplos de cancer positivo para el receptor de estrogeno incluyen cancer de mama, cancer de utero, cancer de ovario, cancer de prostata, y cancer de pulmon (cancer de pulmon de celulas no pequenas, en particular), pero no se limitan a los mismos. En las realizaciones preferidas, el cancer determinado para el pronostico por el metodo de la presente descripcion es el cancer de mama.
La muestra biologica recogida de un paciente, que se utiliza en el metodo de la presente descripcion, no esta particularmente limitado, pero preferiblemente incluye celulas cancerosas derivadas del paciente. Los ejemplos preferidos de la muestra biologica incluyen espedmenes de cancer extirpado, extirpados por un procedimiento quirurgico o similar. Por ejemplo, cuando el cancer determinado para el pronostico es el cancer de mama, los ejemplos preferidos de la muestra biologica incluyen espedmenes de cancer de mama extirpados. La muestra biologica puede ser recogida de un paciente en diversos puntos de tiempo, incluyendo los tiempos antes, durante y despues del tratamiento. Por ejemplo, las celulas de cancer de mama derivadas de un paciente a ser determinadas para el pronostico son particularmente preferidas como muestra biologica de la presente invencion.
El "nivel de control" que se utiliza para la comparacion en el metodo de la presente descripcion puede ser el nivel de expresion del gen ERAP1 detectado antes de cualquier tipo de tratamiento, por ejemplo, en individuos o poblacion de individuos que han mostrado un buen pronostico de cancer despues del tratamiento. El nivel de control, en este caso, hace referencia en el presente documento al "nivel de control de buen pronostico". Ademas, el "nivel de control" puede ser el nivel de expresion del gen ERAP1 detectado antes de cualquier tipo de los tratamientos en individuos o poblacion de individuos que han mostrado mal pronostico del cancer despues del tratamiento. En este caso, el nivel de control se denomina en este documento "bajo nivel de control pronostico". El "nivel de control" puede ser un patron de expresion unico o patrones de expresion plurales derivados de una poblacion de referencia unica. Por lo tanto, el nivel de control se puede obtener basado en el nivel de expresion del gen ERAP1 detectado antes de cualquier tipo de los tratamientos en un paciente, o una poblacion de pacientes cuyo pronostico del cancer ha sido conocido. Alternativamente, se utiliza un valor estandar del nivel de expresion del gen ERAP1 en un grupo de pacientes cuyo pronostico se ha conocido. El valor estandar puede ser obtenido por cualquier metodo conocido en el campo tecnico. Por ejemplo, un intervalo de media ± 2S.D. o media ± 3S.D. se puede utilizar como el valor estandar.
El nivel de control se puede obtener al mismo tiempo como una muestra biologica de prueba mediante el uso de las muestras recogidas y se conserva hasta el momento a partir de un paciente o de un grupo de pacientes cuyo pronostico de cancer se ha conocido antes de cualquier tipo de tratamiento.
Alternativamente, el nivel de control se puede obtener por un metodo estadfstico sobre la base de los resultados obtenidos por analisis del nivel de expresion del gen ERAP1 en las muestras recogidas y conservadas hasta el momento a partir del grupo control. Ademas, el nivel de control puede ser una base de datos del patron de expresion
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de un grupo de pacientes recogidos hasta el momento cuyo pronostico se ha conocido. Ademas, de acuerdo con una realizacion de la presente descripcion, el nivel de expresion del gen ERAP1 en una muestra biologica derivada de un paciente puede compararse con multiples niveles de control obtenidos a partir de multiples muestras de referencia. En las realizaciones preferidas, se utiliza un nivel de control obtenido a partir de una muestra de referencia que se deriva de la mismo tipo de tejido que la muestra biologica recogida de un paciente.
En el metodo de la presente descripcion, cuando el nivel de expresion del gen ERAP1 en la muestra biologica derivada del paciente es similar a un buen nivel de control de pronostico, el pronostico del paciente se determina como bueno. Por otro lado, cuando el nivel de expresion del gen ERAP1 en la muestra biologica derivados del paciente aumenta en comparacion con el buen nivel de control de pronostico, el pronostico del paciente se determina como no bueno o malo. Ademas, cuando el nivel de expresion del gen ERAP1 en la muestra biologica derivada del paciente disminuye en comparacion con el nivel de control de un mal pronostico, el pronostico del paciente se determina como bueno. Por otro lado, cuando el nivel de expresion del gen ERAP1 en la muestra biologica derivada del paciente es similar al nivel de control de un mal pronostico, el pronostico del paciente se determina como no bueno o malo. Los ejemplos preferidos de una muestra de control de buen pronostico incluyen, por ejemplo, celulas de cancer de mama que se derivan de un paciente que ha demostrado buen pronostico despues del tratamiento. Alternativamente, los ejemplos preferidos de una muestra de control de mal pronostico incluyen celulas de cancer de mama que se derivan de un paciente que ha demostrado mal pronostico.
El nivel de expresion del gen ERAP1 en una muestra biologica se puede considerar que ha cambiado (es decir, aumenta o disminuye) cuando el nivel de expresion del gen ERAP1 es diferente del nivel de control por 1,0 veces o mas, 1,5 veces o mas, 2,0 veces o mas, 5,0 veces o mas, 10,0 veces o mas, o superior.
La diferencia del nivel de expresion entre el nivel de una muestra biologica de prueba y el nivel de control puede normalizarse por el control, por ejemplo, de los genes constitutivos. Por ejemplo, un polinucleotido cuyo nivel de expresion se sabe que no es diferente entre celulas cancerosas y celulas no cancerosas (por ejemplo, actina p, gliceraldehudo 3 fosforico acido deshidrogenasa, gen que codifica la protema P1 de ribosoma) se puede utilizar para normalizar el nivel de expresion del gen ERAP1.
El nivel de expresion se puede obtener mediante la deteccion de un producto de transcripcion (ARNm) o producto de traduccion (protema) del gen ERAP1 en una muestra biologica recogida de un paciente usando un metodo conocido en el campo tecnico.
Por ejemplo, el ARNm del gen ERAP1 se puede detectar por hibridacion, por ejemplo, por analisis de hibridacion de transferencia de Northern con una sonda que tenga una secuencia complementaria a la del ARNm. La deteccion se puede realizar en un chip o matriz. Alternativamente, un metodo de deteccion basado en la amplificacion utilizando un cebador espedfico para ARNm del gen ERAP1, por ejemplo, la reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR) se puede utilizar en la deteccion. La sonda o el cebador espedfico para el gen ERAP1 pueden ser disenados y preparados usando una tecnica convencional haciendo referencia a toda la secuencia de la secuencia de bases del gen ERAP1 (SEQ ID NO: 34). Por ejemplo, los cebadores usados en los Ejemplos (SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18) se pueden utilizar en la deteccion por RT-PCR, pero el cebador no se limita a ellos.
La sonda o el cebador usados en el metodo de la presente descripcion se hibridan con el ARNm del gen ERAP1 bajo condiciones estrictas, de moderada a rigurosas, o bajo condiciones rigurosas. En este documento, la frase "condiciones (de hibridacion) rigurosas" representa una condicion donde la sonda o el cebador se hibridan con una secuencia diana, pero no se hibridan con otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia, y vanan en diversas circunstancias. La hibridacion espedfica de una secuencia larga se observa a temperatura mas alta que la hibridacion espedfica de una secuencia corta. Generalmente, la temperatura de las condiciones rigurosas se seleccionan para que sea inferior a aproximadamente 5°C que el punto termico de fusion (Tm) de una secuencia particular en la fuerza ionica y pH prescritos. La Tm es una temperatura a la que el 50% de una sonda complementaria a una secuencia diana se hibrida con la secuencia diana en el estado de equilibrio (en la fuerza ionica prescrita, pH y concentracion de acido nucleico). Generalmente, a la Tm, la secuencia diana esta excesivamente presente, y el 50% de la sonda esta ocupado en el estado de equilibrio. Tfpicamente, para las condiciones rigurosas, la concentracion de las sales es menor que aproximadamente 1,0 M de ion sodio, tfpicamente de aproximadamente 0,01 M a 1,0 M de ion sodio (o la sal) a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para un sonda corta o cebador (por ejemplo, de 10 a 50 nucleotidos), y al menos aproximadamente 60°C para un sonda larga o cebador. Las condiciones rigurosas se pueden lograr mediante la adicion de un agente de desestabilizacion, por ejemplo, formamida.
En el metodo de la presente descripcion, un producto de traduccion del gen ERAP1 puede ser tambien detectado para obtener el nivel de expresion del gen ERAP1. Por ejemplo, se puede obtener la cantidad del polipeptido ERAP1. Los ejemplos del metodo para la obtencion de la cantidad del polipeptido ERAP1 como un producto de traduccion incluyen un metodo de inmunoensayo utilizando un anticuerpo que reconozca espedficamente el polipeptido ERAP1. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Ademas, cualquier fragmento o fragmento modificado (por ejemplo, anticuerpo quimerico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv y similares) del anticuerpo se pueden utilizar en la deteccion si el fragmento mantiene la capacidad de union al polipeptido ERAP1. Un metodo para la
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preparacion de este tipo de anticuerpo es conocido en el campo tecnico, y cualquier metodo puede ser utilizado para la preparacion de tales anticuerpos y equivalentes del mismo.
En las realizaciones preferidas, el nivel de expresion del gen ERAP1 puede obtenerse mediante tincion inmunohistoqmmica utilizando un anticuerpo para el polipeptido ERAP1. Un especimen de cancer extirpado se usa preferiblemente como muestra para la tincion inmunohistoqmmica. La abundancia del polipeptido ERAP1 que se correlaciona con el nivel de expresion del gen ERAP1 puede evaluarse mediante la observacion de la intensidad de la tincion inmunohistoqmmica. Es decir, cuando el tejido de cancer esta casi uniforme y fuertemente tenido, indica que la abundancia del polipeptido ERAP1 es alta, y que el nivel de expresion del gen ERAP1 es alto. Por ejemplo, cuando el tejido del cancer esta casi uniforme y fuertemente tenido, se determina como positivo fuerte, y el pronostico del paciente del que se recoge el tejido se puede determinar como no bueno.
Ademas, el metodo de la presente descripcion tambien puede dar resultados intermedios ademas de otros resultados de prueba para determinar el pronostico de un paciente. Tales resultados intermedios pueden ayudar a la determinacion, la decision o la prediccion del pronostico del paciente por un medico, una enfermera u otro terapeuta. Ejemplos de informacion adicional que se pueden considerar en combinacion con los resultados intermedios obtenidos por la presente invencion para determinar el pronostico incluyen los smtomas clmicos y el estado corporal del paciente.
En otras palabras, el nivel de expresion del gen ERAP1 es un marcador pronostico util para evaluar, estimar o determinar el pronostico de un sujeto afectado con cancer positivo para receptores de estrogeno (por ejemplo, cancer de mama, cancer de utero, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de pulmon (cancer de pulmon de celulas no pequenas, en particular)). Asf, la presente descripcion tambien proporciona un metodo para detectar un marcador pronostico para la evaluacion, la estimacion, o determinacion del pronostico de un sujeto afectado con cancer positivo para receptores de estrogeno, en donde el metodo comprende:
a) una etapa de detectar o medir el nivel de expresion del gen ERAP1 en una muestra biologica derivada de un sujeto, y
b) una etapa de correlacionar el nivel de expresion detectado o medido en la etapa a) con el pronostico del sujeto.
Espedficamente, de acuerdo con la presente descripcion, el aumento del nivel de expresion en comparacion con el nivel de control indica la posibilidad o sospecha de un mal pronostico (tasa de supervivencia baja).
En otra realizacion del metodo de la presente descripcion, la presente descripcion proporciona ademas un metodo para detectar el nivel de expresion del gen ERAP1 en una muestra biologica obtenida de un paciente que tiene cancer, como un marcador para determinar el pronostico de un paciente que tiene cancer. Cuando el nivel de expresion detectado del gen ERAP1 aumenta en comparacion con el nivel de control de pronostico bueno, indica que el pronostico no es bueno o es malo para el paciente.
Ademas, en otra realizacion del metodo de la presente descripcion, la presente descripcion proporciona ademas el uso de un anticuerpo que se une espedficamente a un acido nucleico complementario al ARNm del gen ERAP1 o el polipeptido ERAP1 en la fabricacion de un reactivo para determinar el pronostico de un paciente que tiene cancer.
Ademas, en otra realizacion del metodo de la presente descripcion, la presente descripcion proporciona ademas un anticuerpo que se une espedficamente a un acido nucleico complementario al ARNm del gen ERAP1 o el polipeptido ERAP1 para determinar el pronostico de un paciente que tiene cancer.
5. Kit para evaluar el pronostico de cancer
La presente descripcion proporciona un kit para evaluar o determinar el pronostico de cancer. Espedficamente, el presente kit comprende al menos un reactivo para la deteccion de la expresion del gen ERAP1 en una muestra biologica derivada de un paciente, que se selecciona del grupo que se describe a continuacion. El cancer en la presente invencion es preferiblemente un cancer positivo para el receptor de estrogeno, mas preferiblemente un cancer de mama.
(a) un reactivo para la deteccion de ARNm del gen ERAP1
(b) un reactivo para detectar la protema ERAP1
Ejemplos de un reactivo adecuado para la deteccion de ARNm del gen ERAP1 incluyen acidos nucleicos que se unen espedficamente al ARNm de ERAP1 o identifican el ARNm de ERAP1, tales como oligonucleotidos que tienen una secuencia complementaria a una porcion del ARNm de ERAP1. Ese tipo de oligonucleotidos se ilustra por cebadores y sondas espedficas para el ARNm de ERAP1. Ese tipo de oligonucleotidos se pueden preparar sobre la base de un metodo bien conocido en la tecnica. El reactivo para la deteccion del ARNm de ERAP1 se puede inmovilizar sobre un sustrato solido cuando sea necesario. Ademas, dos o mas reactivos para la deteccion del ARNm de ERAP1 pueden estar contenidos en un kit.
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La sonda o el cebador de la presente descripcion comprenden tipicamente oligonucleotidos sustancialmente purificados. El oligonucleotido comprende tipicamente una secuencia de nucleotidos de cadena sentido consecutiva de al menos aproximadamente 2.000, 1.000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, o 25 de acidos nucleicos que comprenden la secuencia ERAP1, o una secuencia de nucleotidos de cadena antisentido de acidos nucleicos que comprenden la secuencia ERAP1, o una region de una secuencia de nucleotidos que se hibrida con un mutante de origen natural de estas secuencias bajo condiciones rigurosas. Espedficamente, en las realizaciones preferidas, por ejemplo, un oligonucleotido que tiene una longitud de 5 a 50 se puede usar como cebador para amplificar el gen a detectar. Alternativamente, en un metodo de deteccion basado en la hibridacion, se puede utilizar un polinucleotido que tiene una longitud de cientos de bases (por ejemplo, de aproximadamente 100 a 200) a una longitud de miles de bases (por ejemplo, de aproximadamente 1000 a 2000) como sonda (por ejemplo, ensayo de transferencia Northern o analisis de microarray de ADN).
Por otra parte, los ejemplos del reactivo adecuado para la deteccion de la protema ERAP1 incluyen anticuerpos para la protema ERAP1. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Ademas, se puede utilizar cualquier fragmento o forma modificada (por ejemplo, anticuerpo quimerico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv y similares) del anticuerpo siempre y cuando el fragmento mantenga su capacidad de union al polipeptido ERAP1. Los metodos para preparar tal tipo de anticuerpo para la deteccion de una protema son bien conocidos en la tecnica, y tales anticuerpos y el equivalente del mismo se pueden preparar usando cualquier metodo en la presente descripcion. Ademas, el anticuerpo puede marcarse con moleculas de generacion de senal portecnicas de enlace directo o marcaje indirecto. Los marcadores, los metodos para el marcaje de anticuerpos, y los metodos para detectar la union de la diana a un anticuerpo son bien conocidos en la tecnica, y cualquier marcador y cualquier metodo se pueden usar para la presente descripcion. Ademas, pueden estar contenidos en el kit dos o mas reactivos para detectar la protema ERAP1.
El kit puede comprender uno o mas de los reactivos mencionados anteriormente. Ademas, el kit puede comprender un sustrato solido y un reactivo para la union de la sonda al gen ERAP1 o el anticuerpo a la protema ERAP1, un medio de cultivo y un recipiente para el cultivo de celulas, reactivos de control positivos y negativos, y un anticuerpo secundario para detectar anticuerpos para la protema ERAP1. Por ejemplo, una muestra de tejido obtenida de un paciente que tiene buen pronostico o mal pronostico puede servir como reactivo de control util. El kit de la presente descripcion comprende un agente tampon, un diluyente, un filtro, una aguja, una jeringa, y una caja de un paquete que contiene instrucciones (por ejemplo, documentos, cintas, CD-ROM, etc.), y puede comprender ademas otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y desde el punto de vista del usuario. Estos reactivos, etc., pueden estar contenidos en un recipiente adjunto a una etiqueta. Ejemplos de un recipiente apropiado incluyen una botella, un vial, y un tubo de ensayo. El recipiente puede estar formado a partir de diversos materiales tales como vidrio o plastico.
En una realizacion de la presente descripcion, cuando el reactivo es una sonda para el ARNm de ERAP1, el reactivo puede inmovilizarse sobre un sustrato solido tal como una tira porosa y puede ser formado al menos un sitio de deteccion. La region de medicion o deteccion de la tira porosa puede comprender multiples sitios que comprenden acidos nucleicos (sonda), respectivamente. La tira de prueba tambien puede comprender sitios para el control negativo y/o positivo. Alternativamente, el sitio de control puede estar posicionado en otra tira distinta a la tira de prueba. Opcionalmente, los diferentes sitios de deteccion pueden contener diferentes cantidades de acido nucleico inmovilizado. A saber, un primer sitio de deteccion puede contener mayor cantidad de acido nucleico inmovilizado, y los siguientes sitios pueden contener cantidades mas pequenas de acido nucleico inmovilizado. Cuando se anade una muestra de ensayo, se proporciona un mdice cuantitativo para la cantidad del ARNm de ERAP1 presente en la muestra por el numero de los sitios que presentan senal detectable. El sitio de deteccion puede estar constituido de cualquier forma detectable adecuada, y por lo general, tiene forma de rayas o de puntos en toda la anchura de la tira de prueba.
El kit de la presente descripcion puede comprender ademas una muestra de control que muestra buen pronostico, una muestra de control que muestra un mal pronostico, o ambas. La muestra de control que muestra buen pronostico puede ser, por ejemplo, una muestra derivada de un individuo o de una poblacion que tiene un buen progreso despues del tratamiento del cancer. Por otra parte, la muestra de control que muestra un mal pronostico puede ser una muestra derivada de un individuo o de una poblacion que no tiene un buen progreso despues del tratamiento del cancer.
En las realizaciones preferidas, la muestra de control que muestra un buen pronostico puede ser un tejido de cancer clmico derivado de un paciente con cancer que tiene un buen progreso despues del tratamiento del cancer. El cancer es preferentemente cancer positivo para receptores de estrogeno. Los ejemplos del cancer positivo para receptores de estrogeno incluyen cancer de mama, cancer de utero, cancer de ovario, cancer de prostata, y cancer de pulmon (cancer de pulmon de celulas no pequenas, en particular), pero no se limitan a los mismos. Alternativamente, la muestra de control que muestra un buen pronostico de la presente invencion es preferiblemente una muestra que contiene una cantidad inferior de ARNm de ERAP1 o protema que el valor de corte. El valor de corte en la presente invencion se refiere a un valor que distingue un intervalo de buen pronostico de un intervalo de mal pronostico. El valor de corte se puede determinar usando, por ejemplo, la curva caractenstica de funcionamiento del receptor (ROC). Una muestra estandar de ERAP1 de la presente descripcion puede comprender una cantidad de ARNm de ERAP1 o el polipeptido correspondiente al valor de corte.
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Por otra parte, la muestra de control que muestra un mal pronostico puede ser un tejido de cancer clmico derivado de un paciente con cancer que no tiene un buen progreso despues del tratamiento del cancer. La muestra de control que muestra un mal pronostico en la presente invencion es preferiblemente una muestra que comprende una mayor cantidad de ARNm de ERAP1 o la protema que el valor de corte.
6. Metodo para la deteccion del material candidato para tratar y/o prevenir el cancer
La presente descripcion tambien proporciona un metodo para la deteccion de un material candidato para tratar y/o prevenir el cancer.
Como se muestra en los ejemplos de la memoria descriptiva, la fosforilacion de Ser39 de PHB juega un papel importante en la funcion de suprimir la activacion de los receptores de estrogeno de PHB. Sin embargo, Ser39 fosforilado de PHB se defosforila por PP1a a traves de la union a PP1a via ERAP1 (Ejemplo 8). Como consecuencia, la funcion de suprimir la activacion de los receptores de estrogeno de PHB se reduce, y se promueve la proliferacion de celulas cancerosas. Por lo tanto, por la inhibicion de la union de ERAP1 a PP1a, la interaccion entre PP1a y PHB se inhibe. Como consecuencia, la desfosforilacion de PHB2 se puede suprimir, y por lo tanto PHB2 puede mantener su funcion de suprimir la activacion de los receptores de estrogenos. Por lo tanto, una sustancia que inhibe la union de ERAP1 a PP1a puede ser un material candidato para tratar y/o prevenir el cancer.
Ademas, como se muestra en los ejemplos de la memoria descriptiva, se confirmo que ERAP1 se fosforila por PKA y PKB, para acentuar la actividad de fosfatasa de PP1a que esta unido a ERAP1 (Ejemplo 8). Por lo tanto, la inhibicion de la union de PKA y PKB a ERAP1 inhibe la fosforilacion de ERAP1, y suprime la aceleracion de la actividad de fosfatasa de PP1a. Como consecuencia, la desfosforilacion de PHB2 se puede suprimir y, por lo tanto, PHB2 puede mantener su funcion de suprimir la activacion de los receptores de estrogenos.
De acuerdo con ello, la presente descripcion proporciona un metodo para la deteccion de un material candidato para tratar y/o prevenir el cancer mediante la inhibicion de la union del polipeptido ERAP1, y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, o el polipeptido PKB como un mdice.
Ejemplos de la sustancia de ensayo seleccionados por el metodo de deteccion de la presente descripcion incluyen cualquiera de los compuestos o composiciones que comprenden varios compuestos. Ademas, la sustancia de ensayo expuesta a una celula o protema por el metodo de deteccion de la presente descripcion puede ser un unico compuesto o una combinacion de compuestos. Cuando se utiliza una combinacion de compuestos en el metodo de deteccion de la presente invencion, los compuestos se pueden poner en contacto secuencialmente, o pueden ser puestos en contacto al mismo tiempo.
Por ejemplo, cualquier sustancia de ensayo se puede usar en el metodo de deteccion de la presente invencion, tal como un extracto celular, un sobrenadante de cultivo celular, un producto microbiologico fermentado, un extracto de organismo marino, un extracto de planta, una protema purificada o protema bruta, un peptido, un compuesto no peptfdico, un compuesto de micromolecula sintetica (incluyendo constructos de acidos nucleicos tales como ARN antisentido, siARN, ribozima, y aptamero y similares), y un compuesto de origen natural. La sustancia de ensayo de la presente descripcion esta disponible utilizando cualquier de los muchos enfoques de los metodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la tecnica. Los ejemplos de tal enfoque incluyen (1) la biblioteca biologica, (2) biblioteca de fase solida paralela espacialmente direccionable o de fase lfquida, (3) el metodo de la biblioteca sintetica que demanda deconvolucion, (4) metodo de biblioteca "un compuesto, una perla", y (5) el metodo de la biblioteca sintetica que usa la seleccion por cromatograffa de afinidad. El metodo de la biblioteca biologica que utiliza la seleccion por cromatograffa de afinidad se limita a una biblioteca de peptidos. Los otros cuatro enfoques pueden aplicarse a la biblioteca de peptidos, la biblioteca de oligomeros no peptfdicos, o la biblioteca de los compuestos de bajo peso molecular (Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67). Los ejemplos de metodos para la smtesis de la biblioteca molecular se pueden encontrar en la tecnica (DeWitt et al, Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13; Erb et al, Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422- 6; Zuckermann et al, J Med Chem 37: 2678-85, 1994; Cho et al, Science 1993, 261: 1303-5; Carell et al, Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061; Gallop et al, J Med Chem 1994, 37: 1233-1251). La biblioteca de compuestos puede ser presentada en una solucion (vease, Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21), o sobre perlas (Lam, Nature 1991, 354: 82-4), en un chip (Fodor, Nature 1993, 364: 555-6), en bacterias (patente de EE.UU. n° 5.223.409), en esporas (Patentes de Estados Unidos N° 5.571.698; N° 5.403.484 y N° 5.223.409), en un plasmido (Cull et al, Proc Natl Acad. Sci USA 1992, 89: 1865-9), o en un fago (Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90; Devlin, Science 1990, 249: 404-6; Cwirla et al, Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10; solicitud de patente de Estados Unidos N° 2002103360).
Los compuestos convertidos por anadir, delecionar y/o sustituir una parte de la estructura de los compuestos seleccionados por el metodo de deteccion de la presente descripcion estan comprendidos en la sustancia de ensayo identificada por el metodo de deteccion de la presente descripcion.
Ademas, cuando la sustancia de ensayo seleccionada sea una protema, con el fin de obtener ADN que codifica la protema, se puede determinar una secuencia completa de aminoacidos de la protema para deducir la secuencia de acido nucleico que codifica la protema. Alternativamente, el ADN que codifica la protema se puede aislar mediante el
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analisis de una secuencia parcial de aminoacidos de la protema identificada, y la preparacion como una sonda oligoDNA basada en la secuencia, y la deteccion de la biblioteca de ADNc utilizando la sonda. El ADN aislado puede ser utilizado en la preparacion de una sustancia de ensayo que es un material candidato para tratar o prevenir el cancer.
La sustancia de ensayo que se detecta en el metodo de deteccion de la presente descripcion puede ser un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o puede ser un anticuerpo que se une espedficamente a un peptido parcial que carece de la actividad biologica de la protema original en vivo. Alternativamente, la sustancia de ensayo pueden ser peptidos dominantes negativos del polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB que se unen espedficamente al sitio de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB. Alternativamente, la sustancia de ensayo pueden ser peptidos dominantes negativos del polipeptido ERAP1 que se unen espedficamente al sitio de union del polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o polipeptido PKB al polipeptido ERAP1.
La construccion de la biblioteca de la sustancia de ensayo es bien conocida en la tecnica, y otras directrices para un metodo para identificar una sustancia de ensayo para el metodo de deteccion de la presente descripcion, y la construccion de bibliotecas de sustancias de ensayo se muestran a continuacion.
(I) Modelado molecular
La construccion de la biblioteca de la sustancia de ensayo es facil a partir del conocimiento de las estructuras moleculares de los compuestos que se sabe que tienen propiedades que se desean obtener, y/o las estructuras moleculares del polipeptido ERAP1, y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB. Como un metodo para la deteccion preliminar de una sustancia de ensayo adecuada, puede ser utilizado el modelado por ordenador para la interaccion entre la sustancia de ensayo y la diana.
La tecnologfa de modelado por ordenador permite la visualizacion de la estructura atomica tridimensional de una molecula seleccionada, y el diseno razonable de un nuevo compuesto que interactua con la molecula. Una construccion de tres dimensiones depende tfpicamente del analisis cristalografico por rayos X de la molecula seleccionada o de los datos de las imagenes por RMN. La dinamica molecular demanda datos del campo de fuerza. El sistema grafico por ordenador permite la estimacion de como un nuevo compuesto se une a una molecula diana, y la operacion experimental de las estructuras del compuesto y la molecula diana sirven para perfeccionar la especificidad de la union. Con el fin de estimar como cambia la interaccion molecula-compuesto cuando se anade un pequeno cambio en uno de ellos o ambos, son necesarios un software de dinamica molecular y un ordenador del tipo de recogida de calculos. Comunmente estan unidos a una interfaz con un modo de menu facil de usar entre el programa de diseno molecular y el usuario.
Ejemplos del sistema de modelado molecular descrito anteriormente incluyen el programa CHARMM y el programa QUANTA, Polygen Corporation, Waltham y Mass. CHARMM lleva a cabo la reduccion al mmimo de energfa y las funciones de la dinamica molecular. QUANTA lleva a cabo la construccion de la estructura molecular, modelado grafico, y analisis. QUANTA permite la construccion interactiva, la alteracion, la visualizacion y el analisis del comportamiento intermolecular.
Muchos artmulos se publican sobre el tema del modelado por ordenador de medicamentos que interactuan con una protema particular. Ejemplos de los mismos incluyen Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66; Ripka, New Scientist 1988, 54-8; McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxicol 1989, 29: 111-22; Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93; Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62; y Askew et al, J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-1090, que se relaciona con un modelo de receptor de ingredientes de acido nucleico.
Otros programas de ordenador para la deteccion y que ilustran sustancias qmmicas estan disponibles de comparnas tales como Biodesign, Inc. (Pasadena, Calif.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada), y Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario). Por ejemplo, vease Desjarlais et al, J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng et al, J Chem Computer 1992, 13: 505-24; Meng et al, Proteins 1993, 17: 266-78; Shoichet et al, Science 1993, 259: 1445-1450.
Si se identifica un inhibidor deducido, se puede utilizar la tecnologfa de la qmmica combinatoria para la construccion de muchas variantes basadas en la estructura qmmica del inhibidor identificado, deducido, como se detalla a continuacion. La biblioteca de los inhibidores deducidos, o "sustancias de ensayo" obtenidas como consecuencia, se puede cribar utilizando el metodo de la presente descripcion para identificar un material candidato para tratar y/o prevenir el cancer.
(ii) Smtesis qmmica combinatoria
Una biblioteca combinatoria de sustancias de ensayo se puede fabricar como una parte de un programa de diseno de farmacos razonable, que comprende el conocimiento de la estructura del nucleo presente en un inhibidor conocido. Este enfoque permite que se mantenga un tamano moderado de la biblioteca para facilitar la deteccion a alto rendimiento. Alternativamente, simplemente por la smtesis de permutacion completa de una familia molecular que constituye la biblioteca, es posible construir una simple biblioteca, especialmente corta, de moleculas de
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poKmero. Un ejemplo de este ultimo enfoque es una biblioteca de un peptido completo que tiene 6 aminoacidos de longitud. Tal biblioteca de peptidos puede comprender todas las permutaciones de la secuencia de 6 aminoacidos. A este tipo de biblioteca se denomina biblioteca qmmica combinatoria lineal.
La fabricacion de la biblioteca por qmmica combinatoria es bien conocida para los expertos normales en la tecnica, y se puede realizar tanto por smtesis qmmica como por smtesis biologica. Ejemplos de la biblioteca qmmica combinatoria incluyen una librena de peptidos (por ejemplo, vease la Patente de EE.Uu. No. 5.010.175; Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93; Houghten et al, Nature 1991, 354: 84-6), pero no se limitan a los mismos. Pueden ser utilizadas otras tecnicas qmmicas para la fabricacion de bibliotecas de diversidad qmmica. Ejemplos de tales tecnicas qmmicas incluyen peptidos (por ejemplo, el documento WO91/19735), peptidos codificados (por ejemplo, el documento W093/20242), biooligomeros al azar (por ejemplo, el documento WO92/00091), benzodiazepinas (por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.288.514), diversomeros tales como hidantoma, benzodiazepinas y dipeptidos (DeWitt et al, Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13), polipeptido vimloga (Hagihara et al, J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568), peptidos mimeticos no peptfdicos con una estructura de glucosa (Hirschmann et al, J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8), compuestos organicos analogos de una biblioteca de compuestos de bajo peso molecular (Chen et al, J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661), oligocarbamatos (Cho et al., Science 1993, 261: 1303), y/o fosfonato de peptidilo (Campbell et al, J Org Chem 1994, 59: 658), una biblioteca de acidos nucleicos (vease Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 suplemento; Sambrook et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, EE.UU.), una biblioteca de acidos nucleicos de peptido (por ejemplo, vease la Patente de EE.UU. No. 5.539.083), una biblioteca de anticuerpos (por ejemplo, vease Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14 (3): 309-14 y el documento WO97/271), una biblioteca de hidratos de carbono (por ejemplo, vease Liang et al, Science 1996, 274: 1520-1522;. Patente de Estados Unidos No. 5.593.853), y una biblioteca de compuestos organicos de bajo peso molecular (por ejemplo, vease benzodiazepinas, Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6 (6): 624-31; isoprenoides, Patente de Estados Unidos No. 5.569.588; tiazolidinona y metatiazanona, Patente de Estados Unidos No. 5.549.974; pirrolidina, Patente de Estados Unidos No. 5.525.735 y No. 5.519.134; compuestos de morfolino, Patente de EE.UU. No. 5.506.337; benzodiazepinas, Patente de Estados Unidos No. 5.288.514 y similares), pero no se limita a los mismos.
Hay dispositivos para la preparacion de bibliotecas combinatorias comercializados (por ejemplo, vease 357 MPS, 390 MPS (Advanced Chem Tech, Louisville KY), Symphony (Rainin, Woburn, mA), 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA), 9050 Plus (Millipore, Bedford, MA)). Por otra parte, la propia biblioteca combinatoria tambien se comercializa en grandes cantidades (por ejemplo, vease ComGenex, Princeton, NJ, Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD y similares).
(iii) Otros candidatos
Otro enfoque utiliza un bacteriofago recombinante para la fabricacion de la biblioteca. Mediante el uso del "metodo de fago" (Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90; Cwirla et al, Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Devlin et al, Science 1990, 249: 404- 6), es posible construir una biblioteca muy grande (por ejemplo, de 106 a 108 sustancias qmmicas). Un segundo enfoque utiliza principalmente metodos qmmicos, por ejemplo, el metodo de Geysen (Geysen et al, Molecular Immunology 1986, 23: 709-15; Geysen et al, J Immunologic Method 1987, 102: 259-74); y el metodo de Fodor et, al. (Science 1991, 251: 767-73). Furka et, al. (14°Congreso Internacional de Bioqmmica 1988, Volumen N° 5, Resumen FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93), Houghten (Patente de Estados Unidos N° 4.631.211), y Rutter et al. (Patente de Estados Unidos No. 5.010.175) describen metodos para la fabricacion de una mezcla de peptidos que puede ser probada como agonista o antagonista.
Un aptamero es una macromolecula que consiste en acidos nucleicos, que se une fuertemente a una diana molecular particular. Tuerk y Gold (Science 249: 505-510 (1990)) describen el metodo SELEX (evolucion sistematica de ligandos por enriquecimiento exponencial) para seleccionar un aptamero. En el metodo SELEX, una gran biblioteca de moleculas de acido nucleico (por ejemplo, 1015 moleculas diferentes) se puede utilizar en la deteccion.
(vi) Metodo para la deteccion de sustancias que disminuyen el nivel de union entre el polipeptido ERAP1 y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB
Como se ha descrito anteriormente, la presente descripcion proporciona un material candidato para la supresion de la proliferacion de celulas cancerosas, o un metodo para la deteccion de un material candidato para tratar y/o prevenir el cancer mediante la inhibicion de la union entre el polipeptido ERAP1 y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB como un mdice. Un cancer al que se puede aplicar los materiales candidatos identificados por el metodo de deteccion de la presente descripcion es el cancer en el que el polipeptido ERAP1 se expresa, mas preferiblemente es un cancer positivo para el receptor de estrogeno. Ejemplos de tales canceres incluyen, por ejemplo, el cancer de mama. Ademas, por el material candidato identificado por el metodo de deteccion de la presente descripcion es posible suprimir eficazmente la proliferacion de particularmente celulas de cancer dependientes de estrogenos.
Mas espedficamente, el metodo de la presente descripcion comprende las etapas descritas a continuacion:
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(a) una etapa de poner el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo en contacto con el polipeptido PP1a, el polipeptido PKB o el polipeptido PKA, o un equivalente funcional del mismo en presencia de una sustancia de ensayo;
(b) una etapa de detectar el nivel de union entre los polipeptidos antes mencionados en (a); y
(c) una etapa de seleccionar una sustancia de ensayo que disminuye el nivel de union entre los polipeptidos mencionados anteriormente, en comparacion con el nivel de union detectado en ausencia de la sustancia de ensayo.
Por el metodo de la presente descripcion es posible evaluar el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas o efectos terapeuticos sobre el cancer de una sustancia de ensayo que se somete a la deteccion. Asf, la presente descripcion tambien proporciona un metodo para evaluar el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas o el efecto del tratamiento o la prevencion para el cancer de una sustancia de ensayo.
Mas espedficamente, el metodo mencionado anteriormente comprende las etapas descritas a continuacion:
(a) una etapa de poner el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo en contacto con el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo en presencia de una sustancia de ensayo;
(b) una etapa de detectar el nivel de union entre los polipeptidos antes mencionados en (a);
(c) una etapa de comparar el nivel de union entre los polipeptidos mencionados anteriormente detectados en (b) con el nivel de union detectado en ausencia de la sustancia de ensayo; y
(d) una etapa de correlacionar la tasa de disminucion del nivel de union entre los polipeptidos anteriormente mencionados por la sustancia de ensayo obtenida por la comparacion en (c), con el efecto de supresion sobre la proliferacion de celulas cancerosas o el efecto del tratamiento o la prevencion del cancer de la sustancia de ensayo.
Por ejemplo, cuando una sustancia de ensayo disminuye el nivel de union del polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo en comparacion con el nivel de union detectado en ausencia de la sustancia de ensayo, la sustancia de ensayo puede ser identificada o seleccionada como material candidato que tiene el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas o el efecto del tratamiento o la prevencion de cancer. Alternativamente, cuando una sustancia de ensayo no disminuye el nivel de union del polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo en comparacion con el nivel de union detectado en ausencia de la sustancia de ensayo, la sustancia de prueba puede ser identificada como una sustancia que no tiene ningun efecto significativo sobre la supresion de la proliferacion de celulas de cancer, o una sustancia que no tiene ningun efecto significativo sobre el tratamiento o la prevencion del cancer.
La expresion "equivalente funcional del polipeptido ERAP1" que se utiliza para el metodo de deteccion de la presente invencion se refiere a un mutante del polipeptido ERAP1, un polipeptido fragmento, un mutante de un polipeptido fragmento, y un polipeptido marcado del mismo y similares que mantienen la capacidad de union al polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, o el polipeptido PKB. Por lo tanto, cuando la inhibicion de la union con el polipeptido PP1a se utiliza como un mdice, el equivalente funcional del polipeptido ERAP1 es un mutante del polipeptido ERAP1, un polipeptido fragmento, un mutante de un polipeptido fragmento, y un polipeptido marcado del mismo y similares que mantienen la capacidad de union al polipeptido PP1a. Ejemplos de tales equivalentes funcionales de ERAP1 incluyen los polipeptidos que comprenden un dominio de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PP1a. Espedficamente, los ejemplos de tales equivalentes funcionales incluyen polipeptidos que comprenden la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 66, o el polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 67.
Ademas, cuando la inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 y el polipeptido PKA se utiliza como mdice, el equivalente funcional del polipeptido ERAP1 es un mutante del polipeptido ERAP1, un polipeptido fragmento, un mutante de un polipeptido fragmento, y un polipeptido marcado del mismo y similares que mantienen la capacidad de union al polipeptido de PKA. Ejemplos de tales equivalentes funcionales del polipeptido ERAP1 incluyen los polipeptidos que comprenden un dominio de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PKA. Ademas, cuando la inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 y el polipeptido PKB se utiliza como mdice, el equivalente funcional del polipeptido ERAP1 es un mutante del polipeptido ERAP1, un polipeptido fragmento, un mutante de un polipeptido fragmento, y un polipeptido marcado del mismo y similares que mantienen la capacidad de union al polipeptido PKB. Ejemplos de tales equivalentes funcionales de ERAP1 incluyen los polipeptidos que comprenden un dominio de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PKB.
Ademas, la expresion "equivalente funcional del polipeptido PP1a" que se utiliza para el metodo de deteccion de la presente invencion se refiere a un mutante del polipeptido PP1a, un polipeptido fragmento, un mutante de un polipeptido fragmento, y un polipeptido marcado de los mismos y similares que mantienen la capacidad de union al
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polipeptido ERAP1. Ejemplos de tales equivalentes funcionales del polipeptido PP1a incluyen los polipeptidos que comprenden un dominio de union del polipeptido PP1a o al polipeptido ERAP1.
Ademas, la expresion "equivalente funcional del polipeptido PKA" que se utiliza para el metodo de deteccion de la presente descripcion se refiere a un mutante del polipeptido PKA, un polipeptido fragmento, un mutante de un polipeptido fragmento, y un polipeptido marcado de los mismos y similares que mantienen la capacidad de union al polipeptido ERAP1. Ejemplos de tales equivalentes funcionales del polipeptido PKA incluyen polipeptidos que comprenden un dominio de union del polipeptido PKA al polipeptido ERAP1.
Ademas, la expresion "equivalente funcional del polipeptido PKB" que se utiliza para el metodo de deteccion de la presente descripcion se refiere a un mutante del polipeptido PKB, un polipeptido fragmento, un mutante de un polipeptido fragmento, y un polipeptido marcado de los mismos y similares que mantienen la capacidad de union al polipeptido ERAP1. Ejemplos de tales equivalentes funcionales del polipeptido PKB incluyen polipeptidos que comprenden un dominio de union del polipeptido PKB al polipeptido ERAP1.
Como se describe en el punto "1. Peptido ERAP1", la alteracion de uno, dos, o varios aminoacidos en una protema generalmente no tiene influencia en las funciones de la protema. Por lo tanto, los equivalentes funcionales del polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA y el polipeptido PKB pueden ser polipeptidos que comprendan secuencias de aminoacidos en las que se sustituyan, eliminen, inserten y/o anadan uno, dos, o varios residuos de aminoacidos, en las secuencias de aminoacidos del polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, y el polipeptido PKB, respectivamente. Estos equivalentes funcionales pueden ser los que comprendan la secuencia de aminoacidos que tengan una homologfa (tambien llamada "una identidad de secuencia") de al menos aproximadamente 80%, mas preferiblemente al menos aproximadamente de 90% a 95%, mas aun preferentemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% con respecto al polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, y el polipeptido PKB, respectivamente. El "% de homologfa" (tambien llamado "% de identidad") puede ser tipicamente calculado en base a la comparacion entre dos secuencias alineadas de manera optima. Los metodos para la comparacion de la alineacion de secuencias son muy conocidos en la tecnica. La alineacion optima de la secuencia y la comparacion se puede implementar usando un algoritmo, por ejemplo, "Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)".
El numero de mutaciones de aminoacidos no esta particularmente limitado, siempre y cuando la capacidad de union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, o el polipeptido PKB se mantenga, o siempre que la capacidad de union del polipeptido PP1a, la polipeptido PKA, o el polipeptido PKB al polipeptido ERAP1 se mantenga. Sin embargo, el numero de mutaciones de aminoacidos es generalmente preferiblemente 5% o menos de la secuencia de aminoacidos. Por lo tanto, en las realizaciones preferidas, el numero de residuos de aminoacidos mutados en los equivalentes funcionales de los polipeptidos anteriormente mencionados puede ser de 30 aminoacidos o menos, 20 aminoacidos o menos, 10 aminoacidos o menos, 5 o 6 aminoacidos o menos, o 3 o 4 aminoacidos o menos.
Ademas, cuando el tipo de mutacion de aminoacido es una "sustitucion", la sustitucion es preferiblemente una sustitucion de aminoacidos conservadora. Sin embargo, la sustitucion puede ser una sustitucion de aminoacidos no conservadora, siempre que la capacidad de union del polipeptido ERAPl al polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB se mantenga, o siempre que la capacidad de union del polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, o el polipeptido PKB al polipeptido ERAP1 se mantenga.
Alternativamente, los equivalentes funcionales del polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, y el polipeptido PKB pueden ser codificados por polinucleotidos que se hibridan, respectivamente, a los polinucleotidos naturales de cada uno del gen ERAP1, el gen PP1a, el gen de PKA, y el gen PKB bajo condiciones rigurosas.
La expresion "condiciones rigurosas (hibridacion)" significa una condicion en la que una molecula de acido nucleico tfpicamente se hibrida con una secuencia diana en una mezcla compleja de acidos nucleicos, pero que no se hibrida con otras secuencias en un grado detectable. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia, y vanan dependiendo de condiciones tales como la fuerza ionica, el pH y la concentracion de los acidos nucleicos. A medida que la secuencia es mas larga, la temperatura de hibridacion espedfica sera mayor. Una pauta general para la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridation with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridation and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Las condiciones rigurosas se seleccionan comunmente de manera que sean de aproximadamente 5 a 10°C mas baja que el punto de fusion termico (Tm) de una secuencia particular en la fuerza ionica y el pH prescritos. La Tm es una temperatura a la que el 50% de una sonda complementaria a una diana se hibrida con una secuencia diana en el estado de equilibrio (bajo una fuerza ionica prescrita, pH, y concentracion de acido nucleico) (ya que la secuencia diana esta excesivamente presente, el 50% de la sonda esta ocupada en el estado de equilibrio a la Tm). Las condiciones rigurosas se pueden realizar mediante la adicion de un agente de desestabilizacion, tal como la formamida. En la hibridacion selectiva o hibridacion espedfica, la senal positiva es al menos 2 veces la senal de hibridacion de fondo, y preferiblemente 10 veces la senal de hibridacion de fondo. Son posibles condiciones de hibridacion rigurosas ejemplares como las que se describen a continuacion: 50% de formamida, 5 x SSC, y 1% de SDS, incubacion a 42°C, o 5 x SSC, 1% de SdS, incubacion a 65°C, 0,2 x SSC y 0,1% SDS, y lavado a 50°C.
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Las condiciones de hibridacion para aislar el ADN que codifica el polipeptido funcionalmente equivalente con respecto al polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, y el polipeptido de PKB se pueden seleccionar de acuerdo con los metodos ordinarios por los expertos normales en la tecnica. Por ejemplo, la hibridacion puede llevarse a cabo mediante la realizacion de una prehibridacion durante 30 minutos o mas a 68°C usando "tampon RAPID-Hyb" (Amersham LIFE SCIENCE), anadiendo una sonda de marcado, y con calentamiento durante 1 hora o mas a 68°C. La siguiente etapa de lavado se puede realizar, por ejemplo, bajo condiciones rigurosas bajas. Los ejemplos de condiciones rigurosas bajas incluyen 42°C, 2 x SSC y 0,1% de SDS, y 50°C, 2 x SSC y 0,1% de SDS. Alternativamente, la siguiente etapa de lavado se puede realizar de manera mas adecuada bajo condiciones rigurosas altas. Los ejemplos de condiciones rigurosas altas incluyen, por ejemplo, tres lavados en 0,01% de SDS durante 20 minutos a temperatura ambiente y 2 x SSC, y luego tres lavados en 0,1% de SDS a 37°C durante 20 minutos y 1 x SSC, y dos lavados en 0,1% de DSD a 50°C durante 20 minutos y 1 x SSC. Sin embargo, varios factores tales como la temperatura y la concentracion de la sal pueden tener influencia en la rigurosidad de la hibridacion. Estos factores los pueden seleccionar apropiadamente para lograr la necesaria condicion rigurosa los expertos normales en la tecnica.
La expresion "polipeptido marcado" que se utiliza para el metodo de deteccion de la presente invencion se refiere a un polipeptido en el que se anade cualquier epttopo de un anticuerpo monoclonal que tiene especificidad clara para el extremo N-terminal o C-terminal del polipeptido. Como tal epftopo, se puede usar un sistema de epttopo- anticuerpo disponible comercialmente (Experimental Medicine 1995, 13: 85-90). Por ejemplo, se pueden usar adecuadamente como marcadores (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995) p-galactosidasa, protema unida a maltosa, glutation S-transferasa (GST), protema de fluorescencia verde (GFP), polihistidina (His-tag), agregado de la gripe HA, c-myc humano, FLAG, glicoproteina del virus de la estomatitis vesicular (VSV -GP), el gen T7 10 protema (T7-tag), glicoprotema del virus del herpes simple humano (HSV-tag), E-tag (epftopo en un fago monoclonal) y similares.
El polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA y el polipeptido de PKB, y equivalentes funcionales de los mismos pueden fabricarse utilizando metodos bien conocidos para los expertos ordinarios en la tecnica tales como los descritos en "1. Peptido ERAP1". En las realizaciones preferidas, el polipeptido anteriormente mencionado usado en el metodo de deteccion de la presente descripcion es aislado, y purificado.
Ademas, el polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA y el polipeptido de PKB, y equivalentes funcionales de los mismos que se utilizan en el metodo de deteccion de la presente descripcion pueden estar ligados a otra sustancia, siempre y cuando se mantenga la capacidad de union. Ejemplos de sustancias que se pueden unir incluyen peptidos, lfpidos, azucares y cadenas de azucar, grupos acetilo, y polfmeros de origen natural y sinteticos. La union de estas sustancias puede ser implementada para impartir funciones adicionales al polipeptido, o para la estabilizacion del polipeptido.
Como metodo para seleccionar sustancias que inhiben la union entre el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o equivalentes funcionales de los mismos, pueden ser usados los metodos bien conocidos para los expertos normales en la tecnica. Por ejemplo, dicha deteccion puede ser implementada por un sistema de ensayo in vitro. Mas espedficamente, primero, el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo se une a un soporte, y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo se anade junto con una sustancia de prueba. A continuacion, se incuba la mezcla, y despues se lava, y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo que se une al soporte se detecta o se mide. Una sustancia de ensayo que disminuye la cantidad detectada del polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo puede seleccionarse como material candidato para la supresion de la proliferacion de celulas cancerosas, y/o un material candidato para tratar y/o prevenir el cancer.
Alternativamente, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo puede ser unido a un soporte, y el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo pueden ser anadidos a ello junto con una sustancia de ensayo. En este caso, una sustancia de ensayo que disminuye la cantidad detectada del polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo puede seleccionarse como material candidato para la supresion de la proliferacion de celulas cancerosas, y/o un material candidato para tratar y/o prevenir el cancer.
Ejemplos del soporte que se pueden utilizar para la union del polipeptido antes mencionado incluyen polisacaridos insolubles, tales como agarosa, celulosa y dextrano; y resinas de smtesis tales como amida poliacnlica, poliestireno y silicona. Perlas y placas preparadas a partir de los materiales mencionados anteriormente (por ejemplo, placas de multiples pocillos, chips biosensores y similares) disponibles comercialmente pueden ser utilizados adecuadamente. Cuando se utilizan perlas, las perlas pueden rellenar una columna. Alternativamente, si se utilizan perlas magneticas conocidas en la tecnica de manera similar, los polipeptidos que se unen en las perlas pueden ser facilmente aislados por imanes.
La union del polipeptido al soporte se puede implementar mediante un metodo conocido en la tecnica tal como la union qmmica y la adsorcion ffsica. Alternativamente, el polipeptido puede estar unido al soporte a traves de un anticuerpo que reconoce espedficamente el polipeptido. Ademas, cuando el polipeptido es un polipeptido marcado, el polipeptido marcado puede unirse al soporte a traves de un anticuerpo que reconoce espedficamente al
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marcador. Ademas, la union del polipeptido al soporte puede ser tambien implementada por avidina y biotina. La union entre los polipeptidos se puede implementar en un tampon tal como un tampon fosfato o tampon Tris, siempre que el tampon no inhiba la union entre los polipeptidos.
Como un medio para detectar o cuantificar la union entre los polipeptidos, puede ser utilizado un biosensor que utilice fenomenos de resonancia de plasmones de superficie. Cuando se usa tal biosensor, la union entre los polipeptidos se puede observar a tiempo real como la senal de resonancia de plasmon superficial usando una cantidad en trazas de los polipeptidos sin el marcado (por ejemplo, BIAcore, Pharmacia). Luego, usando un biosensor tal como BIAcore, puede ser evaluada la union entre los polipeptidos.
Alternativamente, el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo se puede marcar, y el marcador se puede utilizar para detectar o medir la union entre los polipeptidos. Alternativamente, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo se pueden marcar, y el marcador se puede utilizar para detectar o medir la union entre los polipeptidos. Espedficamente, se marca uno de los polipeptidos a detectar para la union y, a continuacion, el polipeptido marcado se pone en contacto con el otro polipeptido en presencia de una sustancia de ensayo. Luego, despues del lavado, el polipeptido unido se detecta o se mide por el marcador. Una sustancia marcadora tal como un radioisotopo (por ejemplo, 3h, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, p- glucosidasa), una sustancia fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluorescema (FITC), rodamina) y biotina/avidina se pueden usar para el marcado del polipeptido en el presente metodo. Cuando el polipeptido esta marcado por un radioisotopo, la deteccion o medicion del polipeptido marcado unido puede ser implementada por centelleo lfquido. Cuando el polipeptido esta marcado por una enzima, se anade un sustrato para la enzima. Posteriormente, puede ser detectado el cambio del sustrato por la enzima, tal como el desarrollo de un color por un absorciometro y similares, por medio del cual se detecta o mide el polipeptido marcado que esta unido. Ademas, cuando se utiliza una sustancia fluorescente como marcador, el polipeptido marcado unido puede detectarse o medirse usando un fotometro de fluorescencia.
Ademas, la union entre el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo puede detectarse o medirse usando un anticuerpo para el polipeptido ERAP1, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo. Por ejemplo, el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo inmovilizado sobre un soporte se pone en contacto con el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo junto con una sustancia de ensayo. A continuacion, se incuba la mezcla. Despues, la mezcla se lava, y el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA, o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo que se une al polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo puede detectarse o medirse usando un anticuerpo para el polipeptido PP1a , el polipeptido PKA, o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo.
Alternativamente, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo se inmoviliza sobre un soporte, y se pone en contacto con el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo junto con una sustancia de ensayo. Entonces, el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo que se une al polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo puede detectarse o medirse usando un anticuerpo para el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo. Cuando se utiliza un anticuerpo en el metodo de deteccion de la presente invencion, preferiblemente, el anticuerpo esta marcado por una de las sustancias de marcado mencionadas anteriormente, y puede ser detectado o medido en base a la sustancia de marcado. Alternativamente, un anticuerpo para el polipeptido mencionado anteriormente puede ser utilizado como un anticuerpo primario que se detecta mediante un anticuerpo secundario marcado con una sustancia marcadora. Ademas, cuando se utiliza un anticuerpo, el anticuerpo que se une al polipeptido puede detectarse o medirse usando una columna de protema G o una columna de protema A.
Alternativamente, en otras realizaciones, puede ser utilizado el sistema de dos hnbridos que utiliza celulas ("sistema de dos hnbridos MATCHMAKERTM", "kit de ensayo de dos hnbridos de mairnferos MATCHMAKERTM", "sistema de un solo hnbrido MATCHMAKERTM" (Clontech); "sistema dos-hnbrido vectorial HybriZAP" (Stratagene); referencia del documento "Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)", "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)").
En el sistema de dos hnbridos, por ejemplo, el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo se fusiona con una region de union de SRF o region de union de GAL4. A continuacion, el producto resultante se expresa en celulas de levadura. El polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido pKb, o un equivalente funcional del mismo se fusiona con la region de activacion transcripcional de VP16 o gAL4. A continuacion, el producto resultante se expresa de manera similar en celulas de levadura en presencia de una sustancia de ensayo. Alternativamente, el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido pKb, o un equivalente funcional del mismo se fusiona con la region de union a SRF o la region de union a GAL4. Ademas, el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo se puede fusionar con la region de activacion transcripcional de VP16 o GAL4. La union del polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo con el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo permite la activacion de un gen indicador y la deteccion de un clon positivo. Como gen indicador pueden ser utilizados, por ejemplo, el gen Ade2, gen lacZ, gen CAT, gen de luciferasa y similares, ademas del gen HIS3.
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La expresion "disminucion del nivel de union" que se utiliza para el metodo de deteccion de la presente invencion se refiere a disminuir el nivel de union entre los polipeptidos por al menos 10% o mas, preferiblemente 25% o mas, mas preferiblemente 50% o mas, mas preferiblemente 75 %, 80%, 85%, 90% o 95% o mas en comparacion con el nivel de union detectado en ausencia de una sustancia de ensayo. Asf, cuando la sustancia de ensayo disminuye el nivel de union entre los polipeptidos en al menos un 10% o mas, la sustancia de ensayo se caracteriza como una sustancia "que disminuye el nivel de union".
El material candidato identificado o seleccionado por el metodo de deteccion de la presente descripcion puede evaluarse adicionalmente por pruebas para el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas o el efecto del tratamiento o la prevencion del cancer. Por lo tanto, el metodo de deteccion de la presente descripcion puede comprender los pasos que se describen a continuacion:
(a) una etapa de poner el polipeptido ERAP1 o un equivalente funcional del mismo en contacto con el polipeptido PP1a, el polipeptido PKA o el polipeptido PKB, o un equivalente funcional del mismo en presencia de una sustancia de ensayo;
(b) una etapa de detectar el nivel de union entre los polipeptidos antes mencionados en (a); y
(c) una etapa de seleccionar una sustancia de ensayo que disminuye el nivel de union entre los polipeptidos mencionados anteriormente, en comparacion con el nivel de union detectado en ausencia de la sustancia de ensayo;
(d) una etapa de confirmar el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas con respecto a la sustancia de ensayo seleccionada en (c); y
(e) una etapa de seleccionar la sustancia de ensayo confirmada para el efecto de supresion de la proliferacion de las celulas cancerosas en (d) como una sustancia para la supresion de la proliferacion de celulas cancerosas, o un material candidato para tratar y/o prevenir el cancer.
La confirmacion para el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas se puede realizar mediante una prueba in vitro o prueba in vivo. En las realizaciones preferidas, las celulas cancerosas que se pueden utilizar en dicha prueba in vitro y prueba in vivo son celulas cancerosas positivas para el receptor de estrogeno en las que se expresa el polipeptido ERAP1. Ejemplos de tales celulas de cancer incluyen celulas de cancer de mama positivas para el receptor de estrogeno. Ademas, el efecto de supresion de la proliferacion de celulas de cancer evaluado en el ensayo in vitro o ensayo in vivo es, preferiblemente, el efecto de supresion sobre la proliferacion celular dependiente de estrogenos.
Con respecto al material candidato identificado o seleccionado, puede ser implementado el ensayo in vitro para confirmar el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas. En este ensayo in vitro, por ejemplo, celulas cancerosas o celulas normales se cultivan en presencia del material candidato, y se mide la velocidad de proliferacion. Del mismo modo, la prueba in vitro se puede implementar para evaluar el efecto de supresion sobre la proliferacion celular dependiente de estrogenos. En este caso, las celulas cancengenas son tratadas con estrogenos, y despues se cultivan en presencia del material candidato. Alternativamente, las celulas cancerosas se cultivan en presencia de estrogenos y el material candidato. A continuacion, se mide la velocidad de proliferacion de las celulas cancerosas. La prueba in vivo puede ser implementada con respecto al material candidato identificado o seleccionado para confirmar el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas. En este ensayo in vivo, por ejemplo, un raton es trasplantado con celulas de cancer, se le administra el material candidato, y se confirma la proliferacion de las celulas cancerosas trasplantadas. Del mismo modo, el ensayo in vivo puede ser implementado para evaluar el efecto de supresion sobre la proliferacion celular dependiente de estrogenos. En este caso, al raton transplantado con las celulas cancerosas se le administra estrogenos y el material candidato al mismo tiempo o secuencialmente, y se confirma la proliferacion de las celulas cancerosas trasplantadas. Los metodos para tal ensayo in vitro y ensayo in vivo se ejemplifican en los ejemplos en la memoria descriptiva.
La expresion "confirmada para el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas" en el metodo de deteccion antes mencionado significa que la velocidad de proliferacion de las celulas de cancer se suprime en presencia de una sustancia de ensayo en al menos un 10% o mas, preferiblemente 25% o mas, mas preferiblemente 50% o mas, mas preferiblemente 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o mas, en comparacion con la velocidad de proliferacion detectada en ausencia de la sustancia de ensayo. Asf, cuando la sustancia de ensayo inhibe la velocidad de proliferacion de las celulas cancengenas en por lo menos el 10% o mas, la sustancia de ensayo se caracteriza como una sustancia "confirmada para el efecto de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas".
En lo sucesivo en este documento, la presente invencion se describira adicionalmente con detalle en referencia a los Ejemplos. Sin embargo, los materiales, los metodos, y los ejemplos descritos a continuacion son solo ejemplos de varios aspectos de la presente invencion, y el alcance de la presente invencion no se limita a ellos en absoluto. Por lo tanto, metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la memoria descriptiva pueden ser utilizados para la aplicacion o la investigacion de la presente invencion.
Ejemplos
En lo sucesivo en este documento, la presente invencion se describira adicionalmente espedficamente mediante Ejemplos. Sin embargo, el alcance tecnico de la presente invencion no se limita a estos Ejemplos.
[Ejemplo 1] Efecto sobre el cancer de mama dependiente de estrogenos
5 1. Materiales y metodos
Lmea celular y muestra clmica
Las lmeas celulares de cancer de mama humano (MCF-7, ZR-75-1, HCC1500, BT-474, YMB-1 y T47D) y COS-7 fueron adquiridas de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). KPL-1 y KPL-3C fueron proporcionados por el Dr. Junichi Kurebayashi (Escuela de Medicina de Kawasaki, Okayama, Japon) bajo un 10 acuerdo de transferencia de material. HBC4 y HBC5 fueron proporcionados por el Dr. Takao Yamori (Fundacion Japonesa para la Investigacion del Cancer, Centro para la quimioterapia del cancer, Departamento de Farmacologfa Molecular) bajo un acuerdo de transferencia de material. Todas las lmeas celulares se cultivaron en las condiciones recomendadas por cada depositante.
Tratamiento de las celulas
15 Se suspendieron celulas MCF-7 en MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) reforzado con 10% de FBS (Nichirei Biosciences, Tokio, Japon), 1% de solucion de antibiotico/antimicotica (Invitrogen), NEAA 0,1 mM (Invitrogen), piruvato de sodio 1 mM y 10 |ig/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). A continuacion, la suspension de celulas se sembro en una placa de 48 pocillos (2 * 104 celulas/200 |il), una placa de 24 pocillos (1 x 105 celulas/1 ml), una placa de 6 pocillos (5 * 105 celulas/2 ml) o placa de 10 cm (2 * 106 celulas/10 ml). Las celulas se 20 mantuvieron a 37°C en atmosfera humidificada que contema 5% de dioxido de carbono. Al dfa siguiente de la siembra, el medio de cultivo se cambio con rojo de fenol libre de DMEM/F12 (Invitrogen) reforzado con FBS, una solucion antibiotica/antimicotica, NEAA, piruvato de sodio e insulina. Despues de 24 horas, las celulas fueron tratadas con 17p estradiol 10 nM (E2, Sigma). Se anadio el peptido ERAP-1 justo antes de la estimulacion de E2 en la prueba de inhibicion.
25 Analisis de transferencia Western
Las celulas se lisaron con tampon de lisis (Tris-HCl 50 mM: pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,1% NP-40, y 0,5% de CHAPS) que contiene 0,1% de coctel inhibidor de proteasa III (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.). El lisado celular se sometio a electroforesis, se transfirio sobre una membrana de nitrocelulosa, y se bloqueo con una solucion 4% BlockAce (Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japon) durante 1 hora. La membrana se incubo en presencia de los 30 anticuerpos descritos a continuacion durante 1 hora:
Anticuerpo anti-ERAP1 (Kim JW, et al. Cancer Sci. 2009; 100: 1468-1478);
Anticuerpo anti-PHB2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido);
Anticuerpo anti-NCoR (Abcam, Cambridge, Reino Unido);
Anticuerpo REa anti-fosforilacion (Tyr537) (Abcam, Cambridge, Reino Unido);
35 Anticuerpo anti-REa (AER314) (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-SRC-1 (128E7) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-Shc (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpos anti-a/p-tubulina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-Akt (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
40 Anticuerpo anti-fosforilacion de Akt (Ser473) (587F11) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-p44/42 MAP quinasa (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-fosforilacion de p44/42 MAP quinasa (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-fosforilacion REa (Ser104/106) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
45 Anticuerpos Anti-HDAC1 (H-11) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-IGF-1Rp (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.);
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Anticuerpo p85a anti-PI3-quinasa (U13) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-Ub (P4D1) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-lamina B1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.);
Anticuerpo REa anti-fosforilacion (Ser118) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.);
Anticuerpo REa anti-fosforilacion (Ser167) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.);
Anticuerpo REa anti-fosforilacion (Ser305) (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.);
Anticuerpo Anti-p-actina (AC-15) (Sigma);
Anticuerpo anti-FLAG-tag M2 (Sigma);
Anticuerpo anti-HA-tag (Roche, Mannheim, Alemania); o
Anticuerpo anti-fosforilacion tirosina (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.).
A continuacion, la membrana se incubo en presencia de anticuerpo secundario unido a HRP (Santa Cruz Biotechnology) durante 1 hora. A continuacion, la membrana se desarrollo con el sistema de quimioluminiscencia potenciado (Ge Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). La transferencia fue escaneada utilizando un lector de imagenes LAS-3000 mini (Fujifim, Tokio, Japon).
Inmunoprecipitacion
Como se describe en el punto "Analisis de transferencia Western", las celulas se lisaron con un tampon de lisis NP- 40 al 0,1%. El lisado celular se sometio a una limpieza previa utilizando IgG normal y rec-protema G Sepharose 4B (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.) a 4°C durante 3 horas. Despues de la separacion por centrifugacion, el sobrenadante se incubo en presencia de un anticuerpo anti-ERAPI, un anticuerpo anti-PHB2 y un anticuerpo anti- REa a 4°C durante 6 horas. Entonces, el sobrenadante se incubo en presencia de rec-Protein G Sepharose 4B a 4°C durante 1 hora, para precipitar un complejo antfgeno-anticuerpo. El complejo de la protema inmunoprecipitada se lavo con tampon de lisis tres veces, y se separo por SDS-PAGE. Entonces, el analisis de Western Blot se realizo por el metodo descrito previamente (Kim JW, et al. Cancer Sci. 2009;100: 1468-1478).
Identificacion de la region de union de PHB-2 de la protema ERAP1
Con el fin de determinar la region de union de PHB2 en ERAP1, cinco constructos diferentes correspondientes a los peptidos parciales (ERAP11-434, ERAP1435-2177, ERAP11468-2177, ERAP11-250, ERAP11-100) de la protema ERAP1 se clonaron en los sitios apropiados de un vector pCAGGS marcado con Flag N-terminal. Celulas COS-7 se transfectaron con cada plasmido de FLAG-ERAP1 y HA-PHB2 utilizando el reactivo de transfeccion FuGENE6 (Roche). Despues de 48 horas de la transfeccion, las celulas se lisaron con tampon de lisis NP-40 0,1% como se describio anteriormente. El lisado celular se sometio a limpieza previa a 4°C durante 3 horas, y luego el lisado celular se incubo a 4°C durante 6 horas en presencia de agarosa anti-Flag M2 (Sigma). Entonces, la protema inmunoprecipitada o el lisado celular se sometio a electroforesis, y se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubo en presencia del anticuerpo M2 anti-FLAG-tag o el anticuerpo anti-HA-tag.
Efecto negativo dominante de la variante ERAP1 suprimida (1-434) en la union de ERAP1 y REA
La influencia de la variante ERAP1-suprimida (1-434) en la interaccion entre ERAP1 y PHB2, y la influencia de la estimulacion de E2 sobre la actividad de ERE se investigaron usando un constructo del vector de expresion (ERAP1 1-434) que consiste en los residuos de aminoacidos 1-434 de ERAP1 (SEQ ID NO: 33), que se estiman que son importantes para la interaccion entre ERAP1 y PHB2. En el ensayo de inhibicion de union, celulas COS-7 fueron transfectadas con Flag-ERAP1 junto con HA-PHB2 por el reactivo de transfeccion FuGENE6 (Roche). Despues de 48 horas, las celulas se lisaron con un tampon de lisis NP-40 0,1%. El lisado celular se sometio a limpieza previa a 4°C durante 3 horas y, a continuacion, el lisado celular se incubo a 4°C durante 6 horas en presencia de un anticuerpo anti-HA. Entonces, la protema inmunoprecipitada o el lisado celular se sometio a electroforesis, y se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubo en presencia del anticuerpo M2 antiFLAG-tag o el anticuerpo anti-HA-tag. Ademas, en la prueba de inhibicion de la actividad de ERE, se transfectaron celulas COS-7 con ERAP11-434, ERAP1, PHB2, ERa, y cada plasmido de los vectores de ERE-luciferasa por el reactivo de transfeccion FuGENE6. Al mismo tiempo, las celulas se estimularon con E2 durante 48 horas. Las celulas se recogieron, y se evaluaron las actividades de luciferasa y Renilla luciferasa usando el ensayo de indicador de Luciferasa Promega Dual (Tokio, Japon). Todos los datos se estandarizaron por la actividad de Renilla luciferasa en consideracion a la eficiencia de transfeccion.
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Peptido negativo dominante
Al amino terminal del peptido que consiste en 13 aminoacidos derivados del dominio de union de PHB2 de ERAP1 (codon 165-177: QMLsDlTLQLRQR (SEQ ID NO: 27)), una secuencia de poliarginina (11R) que consiste en 11 argininas permeables membrana celulas fue unida covalentemente. El peptido ERAP1-codificado (DRQLQLSTLQRML (SEQ ID NO: 28)) y el peptido ERAP1-mutante (AMLSALTLALRQR (SEQ ID NO: 29)) fueron sintetizados como control. Con el fin de comprobar la influencia del peptido ERAP1 11R-unido sobre la inhibicion de la formacion del complejo ERAP1-PHB2, celulas MCF-7 fueron tratadas con 10 |iM del peptido ERAP1 en presencia de E2 10 nM. Despues de 24 horas, las celulas se lisaron con un tampon de lisis NP-40 0,1%. Entonces, como se describe en el punto "Inmunoprecipitacion", el lisado celular se incubo en presencia de un anticuerpo anti-ERAP1 y un anticuerpo anti-PHB2. Entonces, la protema inmunoprecipitada o el lisado celular se sometio a electroforesis, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Por ultimo, el analisis de transferencia de Western se realizo usando un anticuerpo anti-ERAP1 o un anticuerpo anti-PHB2, y se detecto la protema ERAP1 o PHB2 inherente, respectivamente.
Tincion qmmica de celulas inmunes
Celulas MCF-7 fueron sembradas en una camara de 8 pocillos (Laboratory-Tek II Chamber Slide System, Nalgen Nunc International, Naperville, IL, EE.UU.) en 5 * 104 celulas/pocillo, y se cultivaron en condiciones libres de estrogenos durante 24 horas. Despues de las 24 horas de la exposicion a E2 y/o al peptido ERAP1, se trataron las celulas con paraformaldehudo al 4% a 4°C durante 30 minutos para fijar las celulas, y se trataron con 0,1% Triton X- 100 durante 2 minutos por medio de lo cual se hacen las celulas permeables. Entonces, las celulas se recubrieron con 3% de BSA para bloquear la hibridacion no espedfica. Despues, las celulas se incubaron adicionalmente durante 1 hora en presencia de un anticuerpo anti-PHB2. Las celulas se lavaron con PBS, y despues se incubaron en presencia de anticuerpo anti-conejo de union de Alexa 594 (Molecular Probe, Eugene, OR, EE.UU.) durante 1 hora por medio del cual se tineron las celulas. El nucleo se contra-tino con dihidrocloruro de 4,6-diamidina-2'- fenilindol (DAPI, Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). La imagen de la fluorescencia se obtuvo bajo un microscopio Olympus IX71 (Tokio, Japon).
Fraccionamiento del nucleo/citoplasma
Con el fin de evaluar la localizacion de PHB2, se trataron celulas MCF-7 tal como se describe anteriormente. Entonces, la inmunoprecipitacion se realizo utilizando un anticuerpo anti-ERAP1, un anticuerpo anti-PHB y un anticuerpo anti-REa en presencia de rec-protema G Sepharose utilizando los extractos del nucleo y el citoplasma de las celulas MCF7. Los extractos del nucleo y del citoplasma se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el reactivo de extraccion nuclear y citoplasmico NE-PER (Thermo Fisher Scientific). El contenido de protema de las fracciones de citoplasma y nucleares fueron evaluados con tincion con azul brillante de Coomassie.
Ensayo indicador de luciferasa
Para el ensayo indicador de ERE, fueron transfectadas celulas MCF-7 con el indicador de ERE (SABiosciences, Frederick, mD, EE.UU.), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Para el ensayo indicador de AP-1, fueron transfectadas celulas MCF-7 con el indicador AP-1 (promotor IL-11 de raton que comprende dos sitios en tandem AP-1 subclonados en el vector PGL2-basico), c-fos, c-Jun y PRL-TK como un estandar interno. Despues de 16 horas de la transfeccion, el medio de cultivo se cambio con un medio de cultivo de ensayo (Opti-MEM, 10% FBS, NEAA 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM y 10 |ig/ml de insulina). Despues de 24 horas de la transfeccion, las celulas fueron tratadas con E2 y/o el peptido ERAP1 durante 24 horas. Las celulas se recogieron, y se evaluaron las actividades de luciferasa y Renilla luciferasa usando el ensayo indicador de Luciferasa Promega Dual (Tokio, Japon). En consideracion a la eficiencia de la transfeccion, todos los datos se estandarizaron segun la actividad de Renilla luciferasa.
Ensayo de desacetilacion
El ensayo HDAC se realizo utilizando el Kit ensayo de actividad fluorescente de HDAC/descubrimiento de farmaco (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA, EE.Uu.), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Celulas MCF-7 fueron tratadas con E2 y/o el peptido(s) ERAP1 durante 24 horas en una placa de 6 pocillos. A continuacion, el extracto de celulas se inmunoprecipito con el anticuerpo anti-PHB2. Ademas, el extracto de celulas inmunoprecipitadas se incubo durante 30 minutos en presencia de un sustrato a 30°C. Despues de la incubacion, la reaccion se detuvo, y la fluorescencia se analizo con un fluorometro de microplaca (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Suiza).
PCR semi-cuantitativa de transcripcion inversa
La baja regulacion de REa se evaluo por PCR semi-cuantitativa de transcripcion inversa. ARN completo se extrajo utilizando el kit de purificacion RNeasy Mini (Qiagen) a partir de celulas tratadas con E2 en presencia o en ausencia del peptido ERAP1, y se sometio a transcripcion inversa en ADNc usando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen), cebador oligo dT (Invitrogen) y 25 mM de mezcla dNTP (Invitrogen). Los ARNm de REa y p-actina se
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midieron con el sistema PCR GeneAmp (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). Los cebadores son como se describen a continuacion:
ERa: 5'-GCAGGGAGAGGAGTTTGTGTG-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-TGGGAGAGGATGAGGAGGAG-3' (SEQ ID NO: 2);
P-actina: 5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' (SEQ ID NO: 3) y 5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3' (SEQ ID NO: 4).
PCR a tiempo real
Las expresiones de los genes diana de REa (pS2, ciclina D1, c-myc, SP-1, E2F1 y PGR), ERAP1 y PHB2 fueron evaluadas con PCR a tiempo real. Ademas, la cantidad de expresion de PHB2 no informado como diana de REa tambien se midio como control negativo. p2-MG se utilizo como control estandar interno. Se realizaron la extraccion del ARN completo y la siguiente smtesis de ADNc como se describio anteriormente. El ADNc se analizo con PCR a tiempo real en 500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) utilizando SYBR (marca registrada) Premezcla Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japon) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada muestra se estandarizo con el contenido de ARNm de p2-MG. Los cebadores usados para la amplificacion son como se describen a continuacion:
pS2: 5'-GGCCTCCTTAGGCAAATGTT-3' (SEQ ID NO: 5) y
5'-CCTCCTCTCTGCTCCAAAGG-3' (SEQ ID NO: 6);
ciclina D1: 5'-CAGAAGTGCGAGGAGGAGGT-3' (SEQ ID NO: 7) y
5-CGGATGGAGTTGTCGGTGT-3' (SEQ ID NO: 8);
c-myc: 5'-CGTCTCCACACATCAGCACA-3' (SEQ ID NO: 9) y
5'-GCTCCGTTTTAGCTCGTTCC-3' (SEQ ID NO: 10);
SP-1: 5-TGCTGCTCAACTCTCCTCCA-3' (SEQ ID NO: 11) y
5'-GCATCTGGGCTGTTTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 12);
E2F1: 5-TACCCCAACTCCCTCTACCC-3' (SEQ ID NO: 13) y
5-CCCACTCACCTCTCCCATCT-3' (SEQ ID NO: 14);
RPg: 5'-CCCCGAGTTAGGAGACGAGA-3' (SEQ ID NO: 15) y
5'-GCAGAGGGAGGAGAAAGTGG-3' (SEQ ID NO: 16);
ERAP1: 5-CTTGACAAGGCCTTTGGAGT-3' (SEQ ID NO: 17) y
5-CAATATGCTTTTCCCGCTTT-3' (SEQ ID NO: 18);
PHB2: 5'-GGATCTGCTTCTCCAGTTTT-3' (SEQ ID NO: 19) y
5'-ACTGAGAAATCACGCACTGT-3' (SEQ ID NO: 20);
P2-MG: 5'-AACTTAGAGGTGGGGAGCAG-3' (SEQ ID NO: 21) y
5'-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3' (SEQ ID NO: 22).
Ensayo de proliferacion celular
Usando el recuento celular Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japon), se realizo el ensayo de proliferacion celular. Se recogieron las celulas y se sembraron en 2 * 104 celulas/pocillo en una placa de 48 pocillos, y se mantuvieron a 37°C en una incubadora humidificado. En los puntos de tiempo indicados, se anadieron las celulas con una solucion de CCK-8 diluida a 1:10, y se incubaron durante 1 hora. A continuacion, se midio la absorbancia a 450 nm y se calculo el numero de celulas vivas en cada pocillo.
Ciclo celular
Las celulas se fijaron con etanol frio al 70%, y se tineron con 20 |ig/ml de yoduro de propidio (Sigma) y 1 mg/ml de ribonucleasa A (Sigma), y se analizaron con FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). El ciclo celular se evaluo utilizando el software CellQuest (BD).
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Inhibicion de la proliferacion tumoral in vivo
La suspension de celulas KPL-3C (1 * 107 celulas/raton) se mezclo con la misma cantidad de Matrigel (BD). Esta mezcla se inyecto en el cuerpo de la grasa de la mama de ratones hembra desnudos BALB/c de 6 semanas de edad (CLEA Japan, Tokyo, Japon). Los ratones se mantuvieron en una instalacion aislada esteril con un ciclo de luz de 12 horas/oscuridad l2 horas, y se alimentaron libremente con comida para roedores y agua. El tumor se hizo crecer durante 1 semana hasta que el tamano del mismo alcanzo de 50 a 80 mm3 (calculado como 1/2 * (anchura x longitud2)). Entonces, los ratones se dividieron aleatoriamente en nueve grupos de tratamiento (5 individuos/grupo): grupo sin tratamiento, 6 |ig/dfa grupo de tratamiento E2, E2 + 0,28 mg/dfa grupo de tratamiento peptido ERAP1, E2 + 0,7 mg/dfa grupo de tratamiento peptido ERAP1, E2 + 1,4 mg/dfa grupo de tratamiento peptido ERAP1, E2 + 0,28 mg/dfa grupo de tratamiento peptido codificado, E2 + 0,7 mg/dfa grupo de tratamiento peptido codificado, E2 + 1,4 mg/dfa grupo de tratamiento peptido codificado, y E2 + 83 |ig/dfa grupo de tratamiento con tamoxifeno. Los ratones fueron tratados todos los dfas con 6 |ig/dfa de solucion E2 (100 |il 2,2 * 10"4 M) en la piel del cuello. El peptido ERAP1 o el peptido codificado se administraron a los ratones a 0,28, 0,7, o 1,4 mg/dfa (14, 35, 70 mg/kg) mediante inyeccion intraperitoneal cada dfa. El tamoxifeno tambien se administro por via intraperitoneal a los ratones en una dosis de 4 mg/kg, cada dfa. El volumen del tumor se midio durante 2 semanas usando calibradores. Cuando se completo la prueba, el animal fue sacrificado, y ademas el tumor fue retirado para realizar el analisis de la expresion del gen diana ERa, y congelado con nitrogeno lfquido. Los datos in vivo se indicaron como el valor medio del volumen del tumor ± el error estandar del valor medio. El valor de p cuando se completo la prueba, se calculo mediante la prueba t de Student. Todas las pruebas se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del animalario de la Universidad de Tokushima.
Ensayo del chip
El ensayo del chip se realizo de acuerdo a las instrucciones del fabricante usando EZ-chip (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Celulas MCF-7 fueron tratadas con E2 y/o el peptido ERAP1 durante 24 horas. A continuacion, las celulas se fijaron con formaldelddo al 37%, se resuspendieron en un tampon de lisis, y se trituraron con ondas ultrasonicas en 10 segundos * 10 con Microson XL-2000 (Misonix, Farmingdale, NY, EE.uU.). El sobrenadante se preaclaro con perlas de protema G agarosa, y se recogio la entrada al 1%. La inmunoprecipitacion (por cada 1 x 106 celulas) se realizo (durante la noche, 4°C) utilizando un anticuerpo anti-ERa, un anticuerpo anti-PHB2, un anticuerpo anti- HDAC1 un anticuerpo anti-NCoR, y un anticuerpo anti-SRC-1, y la IgG normal de raton como control. El complejo ADN-protema fue retirado hacia abajo con perlas de protema G de agarosa (1 hora, 4°C) y se lavo. El inmunoprecipitado se volvio a suspender en tampon de elucion. A continuacion, la suspension obtenida se incubo a 65°C durante 5 horas con el fin de liberar la reticulacion. Entonces, el inmunoprecipitado se purifico usando la columna accesoria de purificacion. El fragmento de ADN se detecto con 25 a 28 ciclos de PCR. Como los cebadores para la region ERE del genoma ERAP1, fueron usados:
5'-GGGGTACCTTATATCACTAGTCGACA-3' (SEQ ID NO: 23) y
5'-CCGCTCGAGAGAACTAGAGCAGACAA-3' (SEQ ID NO: 24).
Analisis estadfstico
Para determinar la significacion estadfstica de la diferencia entre los grupos de ensayo, se utilizo la prueba t de Student. El valor de p <0,05 fue considerado como significativo.
Estimacion del sitio de interaccion
El sitio de interaccion de ERAP1 y PHB2 se estimo mediante PSIVER. El PSIVER (prediccion de sitios de interaccion protema-protema Server) es un metodo de calculo para la estimacion de los residuos que se unen a otras protemas usando solo las caractensticas de la secuencia (matriz de puntuacion espedfica del sitio y el area superficial de contacto con el disolvente estimada). Para el metodo de calculo, se utiliza el clasificador Naive Bayes provisto con la densidad kernel deducida, y el servidor de estimacion se abre a Internet. Se utilizo 0,390, que era el umbral predeterminado, en la presente invencion.
Protema recombinante PHB2
La secuencia parcial de PHB2 humana (residuos 77-244) se clono en los sitios NcoI y XhoI del vector de expresion pTAT6 (vease, obsequio del Dr. Marko Hyvonen, Universidad de Cambridge: Peranen J, et al., (1996). Anal Biochem. 236,371-373.) con el fin de convertirse en el armazon interno con el marcador de hexahistidina, la tiorredoxina (TrxA) y sitio de proteasa corte TEV (sitio de TEV) en el terminal amino. La protema recombinante se expreso en la lmea celular BL21 star de Escherichia coli (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se purifico utilizando el Kit Hi-Trap (GE Healthcare). Por ultimo, la protema recombinante se purifico de acuerdo con el protocolo del proveedor usando la columna de filtracion en gel Superdex 200 (GE Healthcare) con cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC).
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2. Resultados
Identificacion de la inhibicion del peptido de la union de ERAP1-PHB2/REA
Los presentes inventores llevaron a cabo los experiments descritos a continuacion con el fin de desarrollar un inhibidor dirigido de la interaccion de ERAP1 y PHB2/REA. En primer lugar, se intento determinar la region de union en ERAP1 a PHB2/REA. Tres construcciones de vectores de expresion (ERAPI1-434: aminoacidos 1-434, ERAPI435- 2177: aminoacidos 435-2177, y ERAPI1468-2177: aminoacidos 1468-2177) se fabricaron (Fig. 1A) de manera que se cubriera la longitud completa de la protema ERAP1, y la region de union se examino con el metodo de transferencia de Western usando la inmunoprecipitacion de estos. Como consecuencia, la union espedfica con PHB2/REA a traves de la region de los residuos de aminoacidos 1-434 de ERAP1 se confirmo (Fig. 1B). La posterior refinacion de la region de union realizada en ERAP1 1.434 confirmo esta union con PHB2/REA. Las construcciones del vector de expresion (ERAP11-250: aminoacidos 1-250, y ERAP1 1-100: aminoacidos 1-100) se fabricaron despues (Fig. 1C), y usando estas, la region de union se examino de manera similar con el metodo de transferencia Western- inmunoprecipitacion. Como consecuencia, la union espedfica con PHB2/REA fue confirmada a traves de la region de los residuos de aminoacidos 101-250 de ERAP1 (Fig. 1D).
A continuacion, con el fin de verificar estos resultados, fueron examinadas las influencias del constructo del vector de expresion ERAP11-434 (aminoacidos 1-434) en la union de la actividad transcripcional de ERAP1-PHB2 y ERE de REa. Celulas COS-7 fueron transfectadas con un constructo de la variante ERAP1- delecionado (AERAP1: ERAP11- 434) en las concentraciones mostradas en la Fig. 1E, junto con Flag-de cadena completa-ERAP1 y un constructo HA- PHB2. Las celulas se lisaron despues de 48 horas de la transfeccion. Entonces, PHB2 marcado con HA se inmunoprecipito a partir del lisado de celulas con el anticuerpo anti-HA. Como consecuencia, la union a ERAP1 y PHB2/REA se inhibio dependiendo de la dosis del constructo de la variante introducida ERAP1-delecionado (AERAP1: ERAP1 1-434) (Fig. 1E). Ademas, se reconocio tambien que la actividad transcripcional de ERE de REa fue suprimida por la introduccion del constructo variante ERAP1-delecionado (AERAP1: ERAP11-434) (fig. 1F).
Con el fin de determinar mas detallada la union de la secuencia de aminoacidos, el sitio estimado para la interaccion de ERAP1 se examino utilizando sistema de estimacion de interaccion protema-protema PSIVER (5), que fue desarrollado por Mizuguchi et al. del Instituto Nacional de Innovacion Biomedica. Como consecuencia, los aminoacidos 157-173 se estimaron como la region mas prometedora. Ademas, entre ellos, la glutamina en la posicion 165 (Q), el acido aspartico en la posicion 169 (D) y la glutamina en la posicion 173 mostraron la mayor puntuacion como los residuos de aminoacidos estimados para la interaccion (Fig. 1G). Ademas, a partir de la estructura esterica estimada de la region, se encontro que estos 3 residuos de aminoacidos estaban presentes en la estructura a helice, y su cadena lateral fue expuesta a la superficie de la protema en la misma direccion (Fig. 1H). Sobre la base de esta estimacion, fue fabricado un constructo del vector de expresion (mutante ERAP1) en el que estos 3 residuos de aminoacido se sustituyeron con alanina (A), y la union a PHB2/REA fue examinada con el metodo de inmunoprecipitacion-transferencia Western. Como consecuencia, se demostro que la union a PHB2/REA se inhibfa de forma espectacular mediante la sustitucion de estos 3 residuos de aminoacido (Fig. 11).
Los presentes inventores consideraron que la region en la proximidad de estos 3 residuos de aminoacido de ERAP1 es importante para la interaccion entre PHB2/REA, y se concentraron en 13 residuos de aminoacidos (residuos de aminoacidos 165-177: QMLSDLTLQLRQR (SEQ iD NO: 27)) de la estructura a helice que comprende estos 3 residuos de aminoacido. Entonces, los presentes inventores sintetizaron el peptido negativo dominante (el peptido ERAP1) en el que se anadieron 11 residuos de arginina que tienen funcion transcelular al extremo N-terminal de los 13 residuos de aminoacidos. Ademas, los presentes inventores tambien sintetizaron un peptido en el que 13 secuencias de residuos de aminoacidos se clasificaron aleatoriamente (el peptido ERAP1-codificado: DRQLQLSTLQRML (SEQ ID NO: 28)) como control, y un peptido en el que los 3 residuos de aminoacido importantes para la union fueron todos sustituidos con alanina (el peptido ERAP1-mutante: AMLSALTLALRQR (SEQ ID NO: 29)), respectivamente (Fig. 1J). Usando estos peptidos, la inhibicion de la union de ERAP1 y PHB2/REA se investigo con el metodo de inmunoprecipitacion-transferencia Western usando un anticuerpo anti-ERAP1 y un anticuerpo anti- PHB2/REA. Se encontro que cuando se anadfa el peptido ERAP1 a MCF-7 (Fig. 1K, el panel superior) y KPL-3C (Fig. 1K, el panel inferior), que son celulas de cancer de mama ER-positivas, la union de ERAP1 inherente y PHB2/REA inherente fue notablemente inhibida. Por otro lado, cuando se anadfa el peptido ERAP1- codificado o el peptido ERAP1-mutante, la inhibicion de la union de ERAP1 inherente y PHB2/REA inherente no fue reconocida en ninguna de las celulas (Fig. 1K).
A continuacion, se examino si el peptido ERAP1 inhibfa directamente la union de la protema ERAP1-PHB2/REA. La protema recombinante PHB2/REA (6xHis-PHB2/REA) a la que se anadio histidina marcada (His) preparada en un sistema de expresion para Escherichia coli, se mezclo con el lisado celular de las celulas COS7 despues de la expresion forzada de ERAP1 (Flag-ERAP1). A esta mezcla, se anadio el peptido anadido con HA marcado (ERAP1- HA-peptido) a cada concentracion. Entonces, la inhibicion de la union se examino con resina Ni desplegable y el metodo Western. Como consecuencia, ERAP1-HA-peptido directamente ligado a His-PHB2/REA, dependiendo de la concentracion. Como consecuencia, se encontro que la union de Flag-ERAP1 y His-PHB2/REA fue inhibida competitivamente (Fig. 2). Como se describio anteriormente, se encontro que el peptido ERAP inhibe directamente la union de ERAP1 y PHB2/REA, espedficamente a la secuencia.
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Se ha mostrado hasta ahora que PHB2/REA tema una funcion de supresion de la actividad transcripcional de RE con la translocacion nuclear del citoplasma (Montano MM, et al, Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 6947-52); al ser localizado en la membrana de las mitocondrias y tener una funcion de mantenimiento de la forma de la mitocondria y bio-smtesis de la mitocondria y la regulacion de la apoptosis (Kasashima K, et al., J Biol Chem. 2006; 281: 36401-10; Artal Sanz-M y N. Tavernarakis Trends Endocrinol Metab. 2009;20: 394-401); y estar relacionada con la regulacion de la cohesinas de cromatidas hermanas (Artal Sanz-M y Tavernarakis N. Trends Endocrinol Metab. 2009; 20: 394401; Tanaka H, et al., Current Biology. 2007; 17: 1356-1361), y se considera como una protema multifuncional. Por lo tanto, su localizacion intracelular todavfa esta en discusion. Como se describio anteriormente, se investigaron la localizacion de PHB2/REA inherente en celulas de cancer de mama, y el cambio de la localizacion de PHB2/REA por la estimulacion de E2 o la administracion del peptido ERAP1. Las fracciones de las mitocondrias, el citoplasma y el nucleo de las celulas de cancer de mama MCF-7 en cada condicion de tratamiento de E2, sin tratamiento o tratamiento con peptido ERAP1, se recogieron, respectivamente, y la localizacion de PHB2/REA inherente se examino con el metodo Western. Como consecuencia, la localizacion de PHB2/REA inherente fue reconocida en ambos el citoplasma y las mitocondrias, y el cambio de la localizacion no fue reconocido incluso despues del tratamiento de E2. Por otro lado, cuando E2 y el peptido ERAP1 se administraron al mismo tiempo, se reconocio una notable translocacion de PHB2/REA desde el citoplasma al nucleo. Ademas, una cierta disminucion de la cantidad de protema de PHB2/REA en la mitocondria se reconocio con la adicion del peptido ERAP1 en forma dependiente de E2, y se sugirio la translocacion de PHB2/REA de la mitocondria en el citoplasma o el nucleo (figura 3A).
A continuacion, se investigo temporalmente la translocacion de PHB2/REA desde el citoplasma al nucleo por el peptido ERAP1. La translocacion nuclear oportuna del PHB2/REA inherente en 1 hora despues de la administracion del peptido ERAP1 a las celulas MCF-7 fue reconocida, y la translocacion aumento temporalmente hasta 24 horas (Figs. 4A y 4B). Por otro lado, la translocacion nuclear de PHB2/REA no fue reconocida con el peptido ERAP1- codificado (Figs. 4A y 4B). Ademas, el peptido ERAP1 al que se anadio el marcador HA (ERAP1-HA-peptido) se sintetizo con el fin de investigar el comportamiento del peptido ERAP1, y el comportamiento se examino utilizando el peptido. Por lo tanto, se reconocio que ERAP1-HA-peptido se urna directamente a PHB2/REA y era translocado al nucleo al mismo tiempo (Figs. 3B y 3C).
Posteriormente, la influencia de la administracion del peptido ERAP1 sobre la actividad transcripcional de REa se investigo con el ensayo indicador de ERE (elemento responsable de estrogeno) y la secuencia de union de AP-1 utilizando celulas MCF-7. Como consecuencia, se confirmo que el peptido ERAP1 (o ERAP1-HA-peptido) suprime la actividad transcripcional de REa en ERE (Fig. 4C, y figuras 3D y 3E) y AP-1 (Fig. 4D y Fig. 3F), dependiendo respectivamente de la concentracion. Sin embargo, ningun cambio se reconocio en las celulas anadidas con el peptido ERAP-codificado o el peptido ERAP-mutante (Figs. 3E y 3F). Ademas, la supresion de la actividad transcripcional de ERE-ERa se reconocio de manera similar por la administracion del peptido ERAP1 tambien en KPL-3C, que es otra lmea de celulas positiva para ER (Fig. 3G). A partir de estas, se encontro que el peptido ERAP1 llevaba a la translocacion nuclear dependiente de E2 de PHB2/REA, y como consecuencia, supriirna tanto las activaciones transcripcionales clasicas (ERE) como no clasicas (AP-1) de REa.
Se ha demostrado hasta el momento que PHB2/REA suprime la transcripcion de REa al ser trasladado en el nucleo y unido a ER, formando un complejo con un factor de supresion de acoplamiento de la transcripcion NCoR; e interaccionando con una enzima de desacetilacion de histonas HDAC1 (Hurtev V, et. al., J Biol Chem. 2004; 279: 24834-43). De lo descrito anteriormente, la influencia de la administracion del peptido ERAP1 en la interaccion entre REa y estos factores de supresion de la transcripcion se investigo usando celulas MCF-7, que son celulas positivas para ER. Se ha reconocido hasta el momento que cuando se administraba E2, el REa se urna a un activador transcripcional SRC-1 (Tai H, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2000; 267: 311-6). Por otra parte, se encontro que cuando se administraba el peptido ERAP1, la union de REa y SRC-1 disminrna, mientras que RE interactuaba con PHB2/REA, y se reclutaba mas NCoR y HDAC1 para formar un complejo (Fig. 4E). De manera similar, se encontro tambien en las celulas KPL-3C que cuando se administraba el peptido ERAP1, REa reclutaba NCoR y HDAC1 para formar un complejo (Fig. 3H). Ademas, se reconocio que cuando se administraba el peptido ERAP1, la actividad de HDAC1 se aceleraba de forma dependiente de la dosis (Fig. 4F), lo que sugiere que RE reclutaba a estos factores para formar un complejo, por el que causaba la desacetilacion de histonas y como consecuencia, aglutinaba la cromatina y supriirna la actividad transcripcional de RE.
Influencia del peptido ERAP1 en el mecanismo de descomposicion de ERa
Se ha publicado en los ultimos anos que la des-regulacion de REa dependiente de estrogenos es esencial para la activacion transcripcional de REa (Nawaz Z, et al, Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 1858-1862; Lonard DM, et al., Mol Cell. 2000; 5: 939-48; Reid G, et al., Mol Cell. 2003; 11: 695-707; Tateishi Y, et al, EMBO J. 2004; 23: 4813-23). Se sabe que esto es debido a la descomposicion del REa por el sistema de ubiquitina-proteasoma, y por lo tanto es importante el mecanismo de regulacion en el ciclo de la union y la disociacion en el elemento responsable de estrogenos (ERE) de REa despues de la activacion de la transcripcion (Tai H, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2000; 267: 311-6; Nawaz Z, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96: 1858-1862; Lonard DM, et al., Mol Cell. 2000; 5: 939-48; Reid G, et al., Mol Cell. 2003; 11: 695-707). Por consiguiente, se examino la influencia del sistema de
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ubiquitina-proteasoma del peptido ERAP1 en el mecanismo de descomposicion de REa. Como se ha publicado ya, cuando se administraban estrogenos a celulas MCF-7, la disminucion en el nivel de protema de REa era reconocida despues de 1 a 3 horas.
Por otra parte, se encontro que cuando se administraba el peptido ERAP1, la disminucion del mismo se supriirna (Fig. 4G). A continuacion, se investigo la poliubiquitinacion de REa. Celulas MCF-7 fueron tratadas con E2 en presencia del inhibidor de proteasoma de 26S MG132. Como consecuencia, la disminucion de protemas de REa fue suprimida y se reconocio la poliubiquitinacion de REa. Sin embargo, cuando se administraba el peptido ERAP1, la poliubiquitinacion de REa era inhibida a pesar de la presencia de MG132, y la disminucion de RE tambien se inhibfa (Fig. 4H). Tambien en las celulas KPL-3C (positivas para ERa), la supresion de la disminucion de protemas de REa se reconoda de manera similar con la inhibicion de la poliubiquitinacion por la administracion del peptido ERAP1 en presencia de MG132 (Fig. 5). Como se describio anteriormente, se sugirio que PHB2/REA se disociaba de ERAP1 por la administracion del peptido ERAP1 y que rapidamente era translocado al nucleo, y unido directamente a ERa, por lo que se inhida la poliubiquitinacion de REa y se supriirna el ciclo de la union y la disociacion de REa en el elemento responsable de estrogeno (ERE), y finalmente conduciendo a la supresion para la activacion transcripcional. Esto podna ser debido al hecho de que PHB2/REA se une a los residuos de lisina en las posiciones 302 y 304, que se ha demostrado como el sitio de la ubiquitinacion de REa (Berry NB, et al., Mol Endocrinology. 2008; 22: 1535-1551), por lo que causa la supresion de la poliubiquitinacion en estos residuos de lisina.
Influencia del peptido ERAP1 sobre la proliferacion celular
La influencia del peptido ERAP1 sobre la proliferacion celular se investigo usando celulas MCF7 positivas para ambos REa y ERAP1. Se reconocio que la administracion del peptido ERAP1 dependiente de la dosis supriirna la proliferacion celular dependiente de E2 hasta 24 horas (Fig. 6A). Por otro lado, la administracion del peptido ERAP1- codificado o el peptido ERAP1-mutante no fue reconocido que proporcionaba el efecto de supresion de la proliferacion celular (Fig. 6B). Ademas, el IC50 del efecto de supresion para la proliferacion celular en celulas MCF-7 durante 24 horas fue 2,18 mM. Se obtuvieron resultados similares tambien en las celulas KPL-3C (Fig. 7A). Ademas, a partir de los ensayos en los que se administro el peptido ERAP1 durante cuatro dfas sucesivamente cada 24 horas, se encontro que la proliferacion de las celulas de cancer de mama dependientes de E2 era completamente suprimida con el peptido ERAP1 a concentraciones de 5 |iM y 10 |iM (Figura 7B). Sin embargo, el peptido ERAP1 no tuvo ninguna influencia sobre la proliferacion celular en absoluto en las celulas MCF-10A, que eran lmeas de celulas epiteliales normales negativas para ambos REa y ERAP1 (Fig. 6C). Posteriormente, con respecto a 7 clases de otras lmeas celulares de cancer de mama positivas para ambos REa y ERAP1 (ZR-75-1, HCC1500, BT474, YMB-1, Y47D, KPL-1, HBC4), la influencia del peptido ERAP1 10 |iM en la proliferacion de las celulas se examino de manera similar. Por lo tanto, el peptido ERAP1 mostro un notable efecto de supresion de la proliferacion dependiente de E2 en todas las celulas (Fig. 7C).
A continuacion, se investigo la estabilidad del peptido ERAP1. El efecto de la supresion de la proliferacion de celulas del peptido ERAP1 en celulas MCF-7 se midio temporalmente. Como consecuencia, un efecto de supresion completo de la proliferacion dependiente de E2 fue reconocido hasta en 24 horas (Fig. 7D, panel izquierdo). Sin embargo, se encontro que la proliferacion celular se recupero aproximadamente 1,5 veces en 48 horas, y la actividad del indicador ERE-REa tambien se recupero (Fig. 7D, panel derecho). De lo descrito anteriormente, se encontro que el peptido ERAP1 supriirna continuamente la proliferacion de las celulas de cancer de mama dependientes de E2 hasta 24 horas.
Posteriormente, se examino la influencia de la administracion del peptido ERAP1 sobre el ciclo celular. E2 y 10 |iM del peptido ERAP1 o el inhibidor anti-E2 tamoxifeno (TAM) se administraron a las celulas MCF-7, al mismo tiempo, y se realizo el analisis FACS despues de 24 horas. Como consecuencia, se observo la parada del ciclo celular en la fase G1 de la misma manera que con la administracion de TAM 10 nM (Fig. 6D). Cuando se utilizo KPL-3C, fueron reconocidos resultados similares (Fig. 7E). De lo descrito anteriormente, se encontro que el peptido ERAP1 indujo la parada de la fase G1, con lo cual causo el efecto de supresion de la proliferacion celular.
A continuacion, fue investigada la influencia del peptido ERAP1 sobre la expresion de cada gen de PS2, ciclina D1, c-Myc, SP-1, E2F1, y PGR, que se publico que estaba relacionado con la proliferacion como un gen diana de ERa. El peptido ERAP1 se anadio a celulas MCF-7, y la expresion de cada gen se examino despues de 24 horas con el metodo RT-PCR cuantitativa. Como consecuencia, se reconocio que la expresion de cualquiera de los genes se supriirna notablemente con la adicion del peptido ERAP1 (Fig. 6E). Ademas, se examino el efecto de supresion temporal para la expresion de estos genes diana. Como consecuencia, fue reconocido primero un significativo efecto de la supresion de la expresion por cualquiera de los genes 6 horas despues de la adicion del peptido (Fig. 8A). Ademas, se reconocio una notable supresion para la expresion de todos estos genes de manera similar tambien en lmea de celulas de cancer de mama positiva para ERa KPC-3C, con la adicion del peptido ERAP1 (Fig. 8B). Como se describio anteriormente, se sugirio que el peptido ERAP1 supriirna la actividad transcripcional de ERa, y, como consecuencia, suprimfa la expresion del gen diana mediante el cual se induda la supresion de la proliferacion celular.
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Se sabe que REa esta localizado en la membrana celular (o directamente bajo la membrana celular), y se ha publicado que la llamada "ruta de activacion de RE no genomica" en la que REa interacciona con los receptores del factor de crecimiento de tipo membrana IGF-1Rp (receptor del factor-1 de crecimiento tipo insulina p), HER2 y EGFR por la estimulacion E2, activa rapidamente la cascada de senales celular y promueve la proliferacion celular (Osborne CK, Schiff R. J Clin Oncol. 2005; 23: 1616-1622; Yager JD, Davidson NE. N Engl J Med. 2006; 354: 27082; Johnston SR. Clin Cancer Res. 2010; 16: 1979-1987). Antfguos resultados muestran que la administracion del peptido ERAP1 induce de manera notable la translocacion nuclear de PHB2/REA, y como consecuencia, suprime la "ruta de activacion genomica". Sin embargo, se pensaba que la mayona de PHB2/REA se disociaba de ERAP1 y se translocaba en el nucleo despues de la adicion del peptido ERAP1, pero una parte del mismo unido al REa de la membrana celular activado por estrogeno permaneda en el citoplasma como tal (Figs. 3A y 3B, y fig. 4B). De lo descrito anteriormente se examino la influencia del peptido ERAP1 en la ruta de activacion no genomica (ruta MAPK o AKT).
En primer lugar, se examinaron las influencias del peptido ERAP1 en la interaccion de IGF-1Rp y REa a traves de una molecula adaptadora publicada hasta el momento, es decir, la protema Shc (Song RX, et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 2076- 81) y en la interaccion de la protema PI3K y REa, respectivamente. Se ha reconocido que las celulas MCF-7 tienen expresiones de IGF-1Rp y de la protema PI3K (fig. 9A), y por lo tanto se anadieron estas celulas con el peptido ERAP1. Despues de 24 horas, se extrajo la fraccion del citoplasma que comprende la fraccion de la membrana celular, y la inmunoprecipitacion se llevo a cabo respectivamente con el anticuerpo anti-REa. Como consecuencia, se encontro que cuando se administraba el peptido ERAP1, PHB2/REA unido a REa, y se inhibfa la union de REa y Shc y la union de REa y IGF-1Rp, respectivamente, como consecuencia se supriirna la fosforilacion de los residuos de tirosina de IGF-1Rp y Shc, que es importante para la senal de la proliferacion celular (Fig. 10A).
Ademas, se investigo la influencia del peptido ERAP1 en la interaccion entre REa y PI3K, que es otra ruta de activacion no genomica dependiente de E2 a traves del REa tipo membrana. Se encontro que cuando se anadfa el peptido ERAP1 a las celulas MCF-7, PHB2/REA unido a REa, se inhibfa la union de REa y PI3K (Fig. 10B). Posteriormente, las influencias sobre las fosforilaciones de Akt y MAPK, que son moleculas de senalizacion aguas abajo de IGF-1Rp y PI3K, tambien se examinaron. Como consecuencia de ello, la fosforilacion de Ser473 de Akt y la fosforilacion de MAPK se inhibieron respectivamente a las 3 horas despues de la adicion del peptido ERAP1, y la supresion se mantuvo incluso despues de 24 horas (Fig. 10C). Por otra parte, no fue reconocida la union directa de PHB2/REA disociado de ERAP1 mediante la adicion del peptido ERAP1 a cada uno de Akt y MAPK (Fig. 10B). De lo descrito anteriormente se encontro que el peptido ERAP1 disociado de PHB2/REA de ERAP1, y el PHB2/REA disociado inhibfan directamente la union dependiente de E2 de IGF-1Rp y REa y la union de PI3K y ER, por lo que se inhibfa su activacion por la fosforilacion, y como consecuencia, se supriirna la activacion de las rutas de senal aguas abajo del mismo, es decir, las rutas Akt y MAPK. Se reconocio que la union de REa y Shc y la union de REa y IGF-1Rp eran inhibidas (Fig. 9B) y las activaciones de AKT y MAPK se suprimieron tambien en celulas KPL-3C en las que las protemas IGF-1Rp y PI3K eran reconocidas que se expresaban (Fig. 9C).
Ademas, utilizando celulas de cancer de mama positivas para REa BT474, en las que fueron reconocidos que todos Her2, EGFR, IGF-1Rp y PI3K se expresaban (Fig. 9A), se llevaron a cabo pruebas similares. Como consecuencia, se reconocio que todos los enlaces de REa a Her2, EGFR, IGF1-Rp y PI3K se inhibieron, respectivamente (Fig. 10D), y que las activaciones de las rutas de senal aguas abajo del mismo, es decir, las rutas Akt y MAPK, fueron suprimidas por el peptido ERAP1 (Fig. 10E). De los resultados anteriores se sugirio que el peptido ERAP1 disociado de PHB2/REA de ERAP1 y el REa de la membrana celular unido directamente y PHB2/REA de manera dependiente de E2 inhibfan la union de REa a IGF-1Rp, HER2 o EGFR y supriirna la "ruta de actividad de la senal no genomica", y finalmente induda la inhibicion de la proliferacion celular.
Influencia del peptido ERAP1 en la fosforilacion de ERa
Se ha considerado en los ultimos anos que la modificacion despues de la traduccion, en particular, la fosforilacion de REa es un factor regulador importante para varias rutas de senalizacion en la proliferacion celular (Lannigan DA. Steroids. 2002; 68: 1-9; Barone I, et al., Clin Cancer Res. 2010; 16: 2702-08; Murphy LC, et al., Endocrine-Related Cancer. 2011; 18: R1-14). Se publico que hasta el momento REa es fosforilado en muchos sitios en forma dependiente de E2. Sin embargo, se sabe que la fosforilacion de seis residuos de aminoacidos (Ser104, Ser106, Ser118, Ser167, Ser357 y Tyr537) es particularmente importante para la actividad transcripcional de REa y la union a E2 (Lannigan DA. Steroids. 2002; 68: 1-9; Barone I, et al., Clin Cancer Res. 2010; 16: 2702-08; Murphy LC, et al., Endocrine-Related Cancer. 2011; 18: R1-14). Por consiguiente, se examino la influencia del peptido ERAP1 sobre la fosforilacion de REa despues de la adicion de E2 en celulas MCF-7. La potenciacion de la fosforilacion se confirmo en todos los seis sitios de REa (Ser104, Ser106, Ser118, Ser167, Ser357 y Tyr537) de forma continua a partir de 3 horas a 24 horas despues de la adicion de E2, y cuando se administro el peptido ERAP1, las fosforilaciones en todos ellos fueron suprimidas en el mismo grado que con ninguna administracion de E2 (Fig. 10F). Sin embargo, el efecto de supresion no fue reconocido con el peptido ERAP1-codificado (fig. 10F).
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Como se describio anteriormente, se sugirio que PHB2/REA translocado en el nucleo por el peptido ERAP1 supriirna la fosforilacion dependiente de E2 de REa, con lo que se disminma la capacidad de activacion transcripcional de REa y la capacidad de union a E2, y por lo tanto se inactivaba REa. Ademas, los presentes inventores llevaron a cabo experimentos similares tambien para otras celulas de cancer de mama positivas para ER, es decir, las celulas KPL-3C (fig. 9D) y BT-474 (Fig. 9E). Como consecuencia, se encontro que tambien en estas celulas la fosforilacion dependiente de E2 en todos los sitios fue suprimida por la administracion del peptido ERAP1. Estos son los resultados obtenidos mediante la realizacion de experimentos por triplicado tres veces de forma independiente.
Investigacion para el efecto antitumoral in vivo del peptido ERAP1
A continuacion, se investigo el efecto antitumoral in vivo por el peptido ERAP1. Celulas de cancer de mama positivas para ER KPL-3C se trasplantaron ortotopicamente a la glandula mamaria de ratones desnudos. Cuando el tumor alcanzo aproximadamente 70 mm3, se administro E2 por via subcutanea y tambien se administraron por via intraperitoneal el peptido ERAP1, el peptido ERAPI-codificado o tamoxifeno (TAM), respectivamente, y se examino el efecto antitumoral. Como consecuencia, el efecto antitumoral se reconocio en el tumor del raton al que el peptido ERAP1 se administro en el mismo grado que en el raton sin administracion de E2, y en el mismo grado que en el de la administracion de TAM, en toda las dosis (Figs. 11A, 11B y 11C). Ademas, no fue reconocido cambio del peso corporal (Fig. 11D). Por el contrario, no fue reconocido ningun efecto significativo de la supresion del tumor en ninguna de las dosis en el raton al que se administro el peptido ERAPI-codificado (Figs. 11B y 11C, y fig. 12).
A continuacion, el estado de activacion del gen diana de REa se examino en el tumor de un raton al que se administro estos peptidos. Como consecuencia, las expresiones de los genes diana de REa, es decir, PS2, ciclina D1, C-Myc y SP-1 fueron completamente suprimidas en el tumor al que se administro el peptido ERAP1, mientras que la supresion de la expresion no fue reconocida en el tumor al que se administro el peptido ERAPI-codificado (Fig. 11E). Ademas, la supresion de las fosforilaciones de las rutas de senal de activacion no genomicas, es decir, Akt y MAPK, tambien se confirmo en el tumor al que se administro el peptido ERAP1 (Fig. 11F). Como se describio anteriormente, se sugirio que el peptido ERAP1 inhibfa la union de ERAP1 y PHB2/REA tambien in vivo como in vitro, induda la union de PHB2/REA y REa, y, como consecuencia, supriirna las rutas de la "activacion genomica" y la "activacion no genomica" de REa y, por lo tanto, exhibfa un efecto antitumoral.
Aceleracion de la expresion por el mecanismo de retroalimentacion positivo de ERAP1
Los presentes inventores han encontrado hasta ahora que la expresion de ERAP1 se acelera por la estimulacion de E2 (Kim JW, et al., Cancer Sci. 2009; 100: 1468-1478). A partir de esto, los presentes inventores construyeron una hipotesis de que ERAP1 era uno de los genes diana de ERa, y llevaron a cabo los experimentos descritos a continuacion. La expresion de ERAP1 en el ARNm despues de la administracion de E2 en celulas MCF-7 se examino con el metodo RT-PCR cuantitativa. Como consecuencia, se reconocio que la expresion se aceleraba en funcion del tiempo hasta 24 horas despues de la administracion de E2 (fig. 13A). Entonces, la expresion de ERAP1, cuando las celulas se trataban con un agente de tamoxifeno anti-E2 (TAM), se examino tambien con el metodo de RT-PCR cuantitativa y el metodo Western. Como consecuencia, se reconocio que la expresion de ERAP1 era suprimida dependiendo de la concentracion de TAM en ambos el nivel de ARNm y el nivel de protema (Fig. 13B). Como se describio anteriormente, se encontro que ERAP1 recibfa la regulacion de la expresion dependiente de E2 en las celulas de cancer de mama positivas para ER.
A continuacion, se realizaron busquedas con la estimacion por ordenador si ERE (elemento responsable del estrogeno, secuencia sensible a e2: AGGTCAnnnTGACCT (SEQ ID NO: 25)) esta presente en el gen ERAP1. Como consecuencia, la secuencia de ERE conservada de TCCAGTTGCATTGACCT (SEQ ID NO: 26) se confirmo en el intron 1 de 5626 pb a 5644 pb aguas abajo del punto de iniciacion de la transcripcion (Fig. 13C). Las construcciones del vector de expresion que consisten en una region que comprende esta secuencia de ERE estimada (ERE en ERAP1), solo la secuencia aguas arriba que no contiene la secuencia de ERE (ARRIBA) o solo la secuencia aguas abajo que no contiene la secuencia de ERE (ABAJO) fueron fabricados, respectivamente, y se examino la actividad del indicador de luciferasa. Como consecuencia, la aceleracion de la actividad del indicador despues de la estimulacion E2 se confirmo solo en las celulas a las que se introdujo una construccion que comprendfa la secuencia de ERE en el gen ERAP1. Posteriormente, se examino si REa se urna o no directamente a esta secuencia de ERE estimada con el metodo de inmunoprecipitacion de la cromatina (metodo ChIP) usando REa y PHB2/REA y anticuerpos para HDAC1 y NCoR que se probaron que formaban un complejo con ellos. Como consecuencia, se reconocio que ERAP1 estaba unido a la secuencia de ADN con la adicion del peptido ERAP1 en cualquier inmunoprecipitado usando los anticuerpos para cualquiera de las protemas (Fig. 13d). Sin embargo, cuando se utilizaba un anticuerpo del activador transcripcional SRC-1 en el inmunoprecipitado, la union disminma (Fig. 13D).
Como se describio anteriormente, se sugirio que ERAP1 era uno de los genes diana de REa, y que era regulado por un mecanismo de retroalimentacion positiva en la que si se induda la activacion de REa de una manera dependiente de E2, la expresion del mismo se aceleraba. A continuacion, se examino la influencia del peptido ERAP1 sobre la expresion del propio ERAP1. Como se muestra en la Fig. 13A, se reconocio que ERAP1 tema una expresion acelerada de manera dependiente de E2, pero la expresion del mismo fue suprimida temporalmente
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mediante la administracion del peptido ERAP1. De lo descrito anteriormente se encontro que el peptido ERAP1 inhi^a el mecanismo de retroalimentacion positiva de ERAP1 en las celulas de cancer de mama positivas para ERa dependientes de E2, y como consecuencia, indudan la disociacion de PHB2/REA, e inhibfan cada mecanismo de activacion de ERa, y asf indudan el efecto de supresion de la proliferacion celular.
[Ejemplo 2] Efecto de supresion del peptido ERAP1 en celulas MCF-7 resistentes al tamoxifeno
1. Materiales y metodos
Celulas MCF-7 resistentes a tamoxifeno
Como lmeas celulares MCF-7 resistentes a tamoxifeno, se ofrecieron las proporcionadas por el Dr. Satoshi Inoue (Centro de Investigacion de la Universidad de Medicina de Saitama para la Medicina Genomica) bajo un acuerdo de transferencia de material para el experimento que se describe a continuacion. El cultivo de celulas MCF-7 resistente al tamoxifeno se realizo bajo las condiciones recomendadas por el depositante. Las celulas MCF-7 resistentes a tamoxifeno se cultivaron en DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) reforzado con 10% de FBS (Nichirei Biosciences, Tokio, Japon), 1% de penicilina/estreptomicina (Nacalai tesque, Kyoto, Japon), tamoxifeno 1 |iM (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.).
Efecto de la supresion de la proliferacion del peptido ERAP1 en celulas MCF-7 resistentes a tamoxifeno
El ensayo de proliferacion celular se evaluo mediante un recuento celular Kit-8 (CCK-8 fabricado por la empresa Dojindo). En primer lugar, se sembraron celulas MCF-7 a tamoxifeno resistentes a 2 * 107pocillo en una placa de 48 pocillos en medio de cultivo DMEM/F12 que contema rojo de fenol y se pusieron en una incubadora de CO2 durante 24 horas. A continuacion, el medio de cultivo se cambio con medio de cultivo DMEM/F12 que contema 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y tamoxifeno 1 |iM y que no contema rojo de fenol, y las celulas fueron pre- cultivadas ademas durante 24 horas. Se retiro el sobrenadante, y despues se anadieron 180 |il del peptido ERAP1 en cada concentracion, y posteriormente se anadieron 20 |il de E2 100 nM (concentracion final: 10 nM), y se hizo reaccionar la mezcla durante 24 horas. La solucion de reaccion se retiro, y despues se anadieron 125 |il de solucion 10 veces diluida de CCK-8 a cada pocillo, y la reaccion de coloracion se realizo durante 1 hora en una incubadora de CO2. Entonces, se trasladaron 100 |il a una placa de 96 pocillos de cada pocillo, y se midio la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.
Investigacion para el efecto de supresion del peptido ERAP1 en la fosforilacion de Ak, MAPK y REa en celulas MCF- 7 resistentes a tamoxifeno
Celulas MCF-7 y celulas MCF-7 resistentes a tamoxifeno fueron sembradas a 1 * 105/pocillo en medio de cultivo DMEM/F12 que contema rojo de fenol en una placa de 24 pocillos y colocadas en una incubadora de CO2 durante 24 horas. A continuacion, el medio de cultivo se cambio con medio de cultivo DMEM/F12 que contema 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y tamoxifeno 1 |iM, y sin rojo de fenol, y las celulas fueron ademas pre-cultivadas durante 24 horas. Se retiro el sobrenadante, y despues se anadieron 180 |il de peptido ERAP1 100 |iM (concentracion final: 10 |iM), y posteriormente se anadieron 20 |il de E2 100 nM (concentracion final: 10 nM), y se hizo reaccionar la mezcla durante 24 horas. La solucion de reaccion se retiro, y se anadieron luego 100 |il de tampon de muestra de SDS y se lisaron las celulas. Las celulas se sometieron a tratamiento de ebullicion a 95°C durante 5 minutos, y se sometieron a electroforesis de amida poliacnlica. Las fosforilaciones de Akt y MAPK se detectaron con anticuerpos de Akt anti-fosforilacion (Ser473) (587F11) y p44/42 MAP quinasa anti-fosforilacion (Thr202/Tyr204), y se detecto la fosforilacion de REa con anticuerpos de REa anti-fosforilacion (Ser104/106), REa anti-fosforilacion (Ser118), REa anti-fosforilacion (Ser167), REa anti-fosforilacion (Ser305) y REa anti-fosforilacion (Tyr537).
2. Resultados
Se investigo la influencia del peptido ERAP1 sobre la proliferacion celular en celulas MCF7 resistentes a tamoxifeno (Tam-R MCF-7). Despues de 24 horas de la administracion del peptido ERAP1, se reconocio que el peptido ERAP1 supriirna notablemente la proliferacion celular en forma dependiente de la dosis en presencia de E2 y tamoxifeno (Fig. 14A). A continuacion, se investigaron las influencias de la "activacion de la ruta no genomica de tamoxifeno (fosforilaciones Akt y MAPK)" y la "fosforilacion de REa por el tamoxifeno" en la activacion de REa, lo que habfa sido considerado hasta ahora una de las causas de la resistencia al tamoxifeno. Cuando las celulas Tam-R MCF-7 fueron sometidas a un tratamiento con tamoxifeno solo o tratamiento concomitante de tamoxifeno y E2, se reconocio que cada uno de ellos aceleraba las fosforilaciones de Akt y MAPK (Fig. 14B, el panel superior). Por el contrario, cuando las celulas Tam-R MCF-7 eran sometidas a un tratamiento del peptido ERAP1 en cada condicion, se reconocio que las fosforilaciones de Akt y MAPK eran notablemente disminuidas de manera similar en la lmea celular MCF-7 de tipo salvaje (MCF 7wt). Ademas, se encontro que todas las fosforilaciones de REa eran tambien reducidas (Fig. 14B, el panel inferior). De lo descrito anteriormente se sugirio que el peptido ERAP1 tambien inhibfa la activacion de la ruta no genomica y la fosforilacion de REa, lo que era una de las causas del cancer de mama resistente a tamoxifeno en el cancer de mama resistente al tamoxifeno, y que, por lo tanto, podfa inducir a la supresion de la proliferacion celular.
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1. Materiales y metodos
Investigacion de los efectos del peptido ERAP1 sobre la proliferacion celular independiente de E2
Celulas MCF-7 o celulas ZR-75-1 se sembraron a 2 x 104/pocillo, y se sembraron celulas KPL-3C a 1 x 104/pocillo en una placa de 48 pocillos, y se pusieron en una incubadora de CO2 durante 24 horas. Entonces, para las celulas MCF-7, el medio de cultivo se cambio con medio de cultivo DMEM/F12 que contema 10% de FBS (Nichirei Biosciences, Tokio, Japon), 1% de solucion de antibiotico/antimicotica (Invitrogen), NEAA48 0,1 mM (Invitrogen), piruvato de sodio 1 mM y 10 |ig/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y sin rojo de fenol, y las celulas fueron ademas pre-cultivadas durante 24 horas. Por otro lado, para las celulas ZR-75-1 y las celulas KPL-3C, los medios de cultivo se cambiaron con medio de cultivo RPMI que contema 10% de FBS y 1% de solucion de
antibiotico/antimicotica y sin rojo de fenol, y las celulas se pre-cultivaron ademas durante 24 horas. Se retiro el
sobrenadante, y se anadieron luego 200 |il del peptido ERAP1 a cada concentracion o tamoxifeno como control positivo, respectivamente, y se hizo reaccionar la mezcla durante 24 horas. La solucion de reaccion se retiro, y despues se anadieron 125 |il de solucion 10 veces diluida de CCK-8 a cada pocillo, y la reaccion de coloracion se realizo durante 1 hora en una incubadora de CO2. Entonces, 100 |il de cada pocillo se trasladaron a una placa de 96 pocillos, y la absorbancia a 450 nm se midio con un lector de microplacas.
Investigacion de la influencia del peptido ERAP1 en la ruta de activacion no genomica a traves de IGF-1Rp
Celulas MCF-7 se sometieron a un tratamiento del peptido ERAP1 10 |iM solo, estimulacion con E2 10 nM solo, y co-estimulacion con el peptido ERAP1 y E2, respectivamente, y despues de 24 horas, la fraccion del citoplasma se aislo de las celulas de cada tratamiento. La fraccion de citoplasma se sometio a limpieza previa utilizando IgG normal y rec-Protein G Sepharose 4B (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.) a 4°C durante 3 horas, y se centrifugo, y luego el sobrenadante se incubo en presencia de anticuerpo anti-REa a 4°C durante 6 horas. Despues, se anadio al
sobrenadante rec-Protein G Sepharose 4B y se incubo a 4°C durante 1 hora con lo que precipito un complejo
antigeno-anticuerpo. El complejo de la protema inmunoprecipitada se lavo con tampon de lisis tres veces, y se separo por SDS-PAGE. Entonces, los anticuerpos anti-IGF-1Rp, anti-REa, anti-Shc y anti-PHB2 fueron utilizados en la deteccion de cada protema completa, y el anticuerpo anti-fosforilacion de tirosina se utilizo en la deteccion de la fosforilacion de la tirosina de cada protema mediante inmunotransferencia Western.
2. Resultados
La influencia del tratamiento del peptido ERAP1 en ausencia de E2 sobre la proliferacion celular se examino con el ensayo MTT. A saber, celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 a cada concentracion (1, 3, 5 y 10 |iM) o TAM como control positivo durante 24 horas. Como consecuencia, se reconocio el efecto de supresion de la proliferacion celular dependiente de la dosis del peptido ERAP1 (Fig. 15A).
A continuacion, se investigo el mecanismo molecular para el efecto. La influencia sobre la activacion independiente de estrogenos de la ruta no genomica de RE se examino de la misma manera que la activacion dependiente de estrogenos de la ruta no genomica. La union de REa a PHB2 en el citoplasma fue reconocida con el tratamiento con el peptido ERAP1, mientras que cada interaccion de IGF-1Rp y Shc, y REa se inhibio. Como consecuencia, se encontro que la fosforilacion de tirosina de IGF-1Rp y Shc importante para la cascada de senales tambien era suprimida (Fig. 15B). De lo descrito anteriormente se sugirio que la proliferacion independiente de E2 tambien se inhibio en las celulas MCF7 positivas para ER.
Ademas, con el fin de verificar estos resultados, el efecto de supresion de la proliferacion se examino utilizando otras lmeas celulares de cancer de mama positivas para ER. La administracion del peptido ERAP1 10 |iM se llevo a cabo cada 24 horas. Por lo tanto, un significativo efecto de supresion de la proliferacion celular se confirmo a las 48 horas en celulas KPL3, y a las 96 horas en celulas ZR75-1 (Fig. 16). De lo descrito anteriormente se encontro que el peptido ERAP-1 inhibe la union de ERAP1-PHB2 y causa el efecto de supresion de la proliferacion de celulas de cancer de mama positivas para ER independientes de E2.
[Ejemplo 4] Investigacion del efecto del uso concomitante del peptido ERAP1 y el tamoxifeno 1. Materiales y metodos
Efecto de reduccion de ERAP1 en celulas de cancer de mama
El efecto de inhibicion del tamoxifeno cuando ERAP1 era reducido por el metodo de siRNA se evaluo con el ensayo MTT. Las secuencias de si-ERAP1, y el si-control (si-EGFP) y el metodo para el experimento estaban de acuerdo con lo publicado en Kim et, al. (Cancer Science, 2009, 100; 1468-1478). Celulas MCF-7 fueron sembradas a 2 x 104/pocillo en una placa de 48 pocillos, y se estimularon con E2 1 |iM, y despues de 24 horas, se trataron con si- ERAP1 o si-control. Despues de 24 horas, las celulas se trataron con tamoxifeno 10 |iM y se evaluo el numero de celulas vivas con el ensayo MTT despues de 96 horas.
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Ademas, el efecto de inhibicion de tamoxifeno cuando ERAP1 fue reducido por el metodo de siRNA se evaluo con el ensayo de ERE-luciferasa. Celulas MCF-7 fueron sembradas a 2 * 104/pocillo en una placa de 96 pocillos y se transfectaron temporalmente con el indicador de ERE-luciferasa. A continuacion, las celulas se estimularon con E2 1 |iM, y despues de 24 horas, se trataron con si-ERAP1 o si-control. Despues de 24 horas, las celulas se trataron con 10 |iM de tamoxifeno y despues de 96 horas, se midio la actividad de ERE luciferasa.
Prueba para la inhibicion in vivo de la proliferacion del tumor
Celulas KPL-3 fueron trasplantadas por via subcutanea en el cuerpo graso de la mama de ratones desnudos BALB/c. Cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 50-80 mm3, en ausencia de E2, se inicio la prueba de tratamiento (5 individuos/grupo) (dfa 0). A los ratones portadores del heterotransplante de tumor KPL-3C se les administro el peptido ERAP1 solo (3,5, 7 y 14 mg/kg), el peptido codificado solo (l4 mg/kg), el tamoxifeno solo (4 mg/kg) o una combinacion del peptido ERAP1 (14 mg/kg) y tamoxifeno (4 mg/kg) cada dfa mediante inyeccion intraperitoneal.
Analisis del ciclo celular
Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 10 |iM y/o tamoxifeno 10 nM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Despues de la inmovilizacion, las celulas se tineron con yoduro de propidio, y se analizaron por citometna de flujo.
2. Resultados
Influencia de la reduccion de ERAP1 en el efecto de supresion de la proliferacion de celulas de cancer de mama por el tamoxifeno
Se investigo el efecto de la inhibicion del tamoxifeno cuando la expresion de ERAP1 era suprimida en celulas MCF-7 mediante el metodo de siRNA. Se confirmo que la proliferacion de celulas se supriirna mas en el caso en el que las celulas transfectadas con siERAP1 era tratadas con tamoxifeno que en el caso en el que las celulas transfectadas con Si-control se trataban con tamoxifeno (Fig. 17A). Ademas, la actividad del indicador de ERE fue examinada en ese momento. Por lo tanto, se confirmo de manera similar que la actividad del indicador era suprimida mas en el caso en el que las celulas transfectadas con siERAP1 eran tratadas con tamoxifeno (Fig. 17B). De lo descrito anteriormente se sugirio que el efecto de la supresion de la proliferacion celular sinergico puede ser inducido por la supresion de la expresion de ERAP1 y el uso concomitante del peptido ERAP1 y tamoxifeno.
Investigacion del efecto antitumoral por el uso concomitante del peptido ERAP1 y el tamoxifeno
El efecto antitumoral por el uso concomitante del peptido ERAP1 y el tamoxifeno se investigo usando un modelo de raton desnudo BALB/c a los que fueron transplantados ortotopicamente a la glandula mamaria celulas KPL-3. Con respecto a la proliferacion del cancer de mama dependiente de estrogenos, la administracion del peptido ERAP1 solo fue reconocida que tema un efecto antitumoral dependiente de la dosis (3,5, 7 y 14 mg/kg), pero en el caso de la administracion del peptido-codificado solo (14 mg/kg), el efecto no fue reconocido (Fig. 18). Se reconocio que el uso concomitante del peptido ERAP1 (14 mg/kg) y tamoxifeno (4 mg/kg) tema un efecto antitumoral mas notable (Fig. 18). El cambio del peso corporal no fue reconocido en ninguno de los metodos de administracion. De lo descrito anteriormente se encontro que el peptido ERAP1 inhibfa la senal de estrogeno de ER, y por lo tanto tambien exhibfa un notable efecto antitumoral in vivo, cuyo efecto se mejoraba aun mas por el uso concomitante con tamoxifeno.
Influencia del uso concomitante de peptido ERAP1 y el tamoxifeno sobre el ciclo celular
La influencia del uso concomitante del peptido ERAP1 y el tamoxifeno sobre el ciclo celular se examino por analisis de FACS. Cuando las celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 10 |iM solo o tamoxifeno 10 nM solo, se confirmo el aumento de celulas que se habfan detenido en la fase G1. Sin embargo, cuando se utilizaban el peptido ERAP1 10 |iM y tamoxifeno 10 nM de forma concomitante, las celulas en la fase subG1 aumentaban notablemente, siendo reconocida la muerte celular (Fig. 19). De lo descrito anteriormente se encontro que el uso concomitante del peptido ERAP1 y el tamoxifeno, que tienen diferentes mecanismos de accion, promueve notablemente el efecto antitumoral in vitro e in vivo tambien.
[Ejemplo 5] Estudio de los efectos de supresion de la proliferacion de celulas de cancer de mama de peptidos que tienen diferentes secuencias
1. Materiales y metodos
Con el fin de confirmar si un peptido con una secuencia diferente del peptido ERAP1 usado en los Ejemplos anteriormente proporcionaba efectos similares o no, el peptido ERAP1-2 (residuos de aminoacido 161-173: ATLSQMLSDlTlQ (SEQ ID NO: 30)) fue construido, el cual tema una secuencia diferente del peptido ERAP1 y estaba compuesto por los 3 residuos de aminoacido estimados como el sitio de union a PHB2/REA (Fig. 20, el panel inferior). El ensayo de proliferacion celular se evaluo utilizando el recuento de celulas Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japon). En primer lugar, fueron sembradas celulas MCF-7 a 2 * 104/pocillo en medio de cultivo
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DMEM/F12 que contema FBS al 10% y 1% de solucion de antibiotico/antimicotico y sin adicion de rojo fenol en una placa de 48 pocillos, y se situaron en una incubadora de CO2. Entonces, se anadieron 180 |il del peptido ERAP1 (165-177 residuos de aminoacidos) o el peptido ERAP1-2: (PEP-1 161-173 residuos de aminoacidos) en cada concentracion, posteriormente se anadieron 20 |il de E2 100 nM (concentracion final: 10 nM), y se hizo reaccionar la mezcla durante 24 horas. La solucion de reaccion se retiro, y despues se anadieron 125 |il de solucion 10 veces diluido CCK-8 a cada pocillo, y la reaccion de coloracion se realizo durante 1 hora en una incubadora de CO2. Entonces, 100 |il de cada pocillo fueron trasladados a una placa de 96 pocillos, y la absorbancia a 450 nm se midio con un lector de microplacas.
2. Resultados
Se reconocio que, en la misma forma que el peptido ERAP1, la administracion del peptido ERAP1-2 tambien supriirna la proliferacion celular dependiente de E2 de una manera dependiente de la dosis hasta 24 horas (Fig. 20, el panel superior). De esto, se sugirio que la peptido ERAP1-2 tambien causaba la supresion de la proliferacion celular de celulas de cancer de mama por un mecanismo similar al del peptido ERAP1 analizado en los Ejemplos anteriores. Ademas, se sugirio que la secuencia de 165-173 residuos de aminoacidos (QMLSDLTLQ (SEQ ID NO: 31)), que era la secuencia de superposicion del peptido ERAP1 y el peptido ERAP1-2, estaba implicada en la supresion de la proliferacion celular de celulas de cancer de mama.
[Ejemplo 6] Investigacion para la fosforilacion de PHB2 en lmeas de celulas de cancer de mama REa- positivas/ERAP1-negativas
1. Materiales y metodos
Fraccionamiento de nucleo/citoplasma
Con el fin de evaluar la localizacion de PHB2, celulas HCC1395 de la lmea celular de cancer de mama REa- positivas/ERAP1-negativas fueron tratadas con el peptido ERAP1 y/o E2. Despues, los extractos del citoplasma y el nucleo de las celulas HCC1395 se prepararon usando un reactivo de extraccion nuclear y citoplasmico NE-PER (Thermo Fisher Scientific).
Efectos del peptido ERAP1 en celulas HCC1395 de la lmea celular de cancer de mama REa-positivas/ERAP1- negativas
El ensayo de proliferacion de celulas HCC1395 se evaluo utilizando el recuento de celulas Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japon). En primer lugar, fueron sembradas celulas HCC1395 a 2 * 104/pocillo en medio de cultivo RPMI que contema 10% de fBs y 1% de solucion de antibiotico/antimicotico y sin adicion de rojo fenol en una placa de 48 pocillos, y se situaron en una incubadora de CO2. Despues, se anadieron 180 |il del peptido ERAP1 a cada concentracion, y posteriormente se anadieron 20 |il de E2 100 nM (concentracion final: 10 nM), y se hizo reaccionar la mezcla durante 96 horas. La solucion de reaccion se retiro, y despues se anadieron 125 |il de solucion 10 veces diluida de CCK-8 a cada pocillo, y la reaccion de coloracion se realizo durante 1 hora en una incubadora de CO2. Entonces, 100 |il de cada pocillo se trasladaron a una placa de 96 pocillos, y la absorbancia a 450 nm se midio con un lector de microplacas.
Fosforilacion de PHB2 por tratamiento del peptido ERAP1
Celulas MCF-7 y celulas HCC1395 fueron tratadas con peptido ERAP1 5 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 1 |iM durante 24 horas. Entonces, la fraccion nuclear se aislo de las celulas de cada tratamiento. La fraccion nuclear se sometio a limpieza previa a 4°C durante 3 horas utilizando IgG normal y rec-Protein G Sepharose 4B (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.), y se centrifugo, y luego el sobrenadante se incubo en presencia de un anticuerpo anti-RE a 4°C durante 6 horas. Despues, se anadio el sobrenadante con rec-Protein G Sepharose 4B y se incubo a 4°C durante 1 hora para precipitar un complejo antfgeno-anticuerpo. El complejo de la protema inmunoprecipitada se lavo con un tampon de lisis tres veces, y se separo por SDS-PAGE. Entonces, el anticuerpo anti-REa y el anticuerpo anti-PHB2 fueron utilizados en la deteccion de cada protema completa por transferencia Western, y un anticuerpo anti-fosforilacion de tirosina, un anticuerpo de serina anti-fosforilacion, y un anticuerpo de treonina anti-fosforilacion se utilizaron en la deteccion del acido fosforico de PHB2.
Influencia del residuo serina en la posicion 39 de PHB2 sobre la actividad transcripcional de REa
Usando construcciones de vectores de expresion en las que el residuo de serina en la posicion 39 de PHB2 se mutaba con alanina y acido glutamico, se investigo la influencia de la estimulacion de E2 en la actividad de ERE. Celulas COS-7 se transfectaron con PHB2 (o vector de mutacion PHB2), REa, vector ERE-luciferasa y cada plasmido de pRL-TK como un patron interno por el reactivo de transfeccion FuGENE6. Despues de 6 horas, las celulas se estimularon con E2 1 |iM durante 48 horas. Las celulas se recogieron, y se evaluaron las actividades de luciferasa y Renilla-luciferasa usando el ensayo dual indicador de luciferasa de Promega (Tokio, Japon). En consideracion a la eficiencia de la transfeccion, todos los datos se estandarizaron con la actividad de Renilla luciferasa.
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2. Resultados
De los resultados conseguidos hasta ahora se demostro la posibilidad de que ERAP1 era uno de los genes diana de REa, y que estaba regulado por un mecanismo de retroalimentacion positiva en el que si se induda la activacion de REa de una manera dependiente de E2, la expresion del mismo se aceleraba. Ademas, se confirmo que la disociacion inducida por el peptido ERAP1 de PHB2/REA a partir de ERAP1 en celulas de cancer de mama positivas para REa, como consecuencia, inhida el mecanismo de retroalimentacion positiva de ERAP1, e inhida cada mecanismo de activacion ER induciendo el efecto de supresion de la proliferacion de celulas. Sin embargo, las celulas de cancer de mama ER-positivas ERAPI-negativos tambien estaban presentes, y el mecanismo para la expresion acelerada del gen diana de RE en tales celulas no se ha encontrado. Ademas, REA/PHB2 se une directamente a RE que tienen una funcion de suprimir la activacion del mismo como se describio anteriormente. De esto, el papel de PHB2/REA como factor de supresion de RE en las celulas de cancer de mama ERAPI-negativas y ER-positivas no esta claro. En consecuencia, la translocacion nuclear de PHB2 usando celulas HCC1395 de la lmea celular de cancer de mama negativas para ERAP1 y positivas para RE se investigo primero (Fig. 21).
En celulas HCC1395, fue reconocida la translocacion nuclear de PHB2/REA unicamente con el tratamiento de E2 (fig. 21A), y ademas la union a REa en el nucleo se confirmo por el metodo de inmunoprecipitacion (Fig. 21B). Se investigo el reclutamiento de cada factor de acoplamiento de REa en el momento. Como consecuencia, los cambios cuantitativos del factor de supresion de acoplamiento NCoR y la enzima de desacetilacion HDAC1, no fueron reconocidos por la presencia o ausencia del tratamiento con E2, pero la union a REa se reconocio. Sin embargo, la union de REa con un factor de activacion de acoplamiento SRC-1 no fue reconocida en ninguna de las condiciones.
De los resultados anteriores se encontro que PHB2 se translocaba en el nucleo en forma dependiente de E2 y se urna directamente al REa nuclear, y reclutaba un factor de supresion de acoplamiento NCoR y una enzima de desacetilacion HDAC1 en celulas HCC1395 que eran celulas del cancer de mama negativas para ERAP1 y positivas para RE. Ademas, la influencia del peptido ERAP1 sobre la proliferacion celular no fue reconocida (Fig. 21C). Sin embargo, esta lmea celular HCC1395 fue reconocida por la proliferacion celular dependiente de E2 (Fig. 21C). De esto, los inventores se centraron en la modificacion posterior a la traduccion, en particular, la fosforilacion de PHB2/REA con respecto al mecanismo para PHB2/REA para dirigir REa a la inactivacion, y se considero la hipotesis de que la supresion de la actividad de REa estaba regulada por la presencia o ausencia de la fosforilacion de PHB2/REA.
Se ha informado hasta ahora que las regiones importantes para la supresion de la actividad de REa por PHB2/REA son 19-49 aminoacidos y 150-174 aminoacidos (PNAS, 1999, 96, 6947-6952). Ademas, se ha informado que PHB2/REA se fosforila en los residuos de serina en la posicion 39 y treonina en la posicion 42 en el analisis de fosforilacion completa (JBC, 283, 4699-4713, 2008). Como se describio anteriormente, los inventores se centraron en estas fosforilaciones de 39S y 42T, y realizaron el experimento descrito a continuacion.
En celulas MCF-7 de la lmea de cancer de mama ER-positivo/ERAP1-positivo, la union de PHB2 a REa en el nucleo con la administracion del peptido ERAP1 en presencia de E2 fue reconocida, y fueron reconocidas mas fosforilaciones de los residuos de tirosina y serina en la union PHB2/REA reconocida, mientras que la fosforilacion en el residuo de treonina no fue tan reconocida. Por otro lado, en celulas HCC1395, PHB2/REA fue translocado en el nucleo por el tratamiento con E2, y unido a REa, y en tal PHB2/REA, se reconocio la fosforilacion del residuo de tirosina, mientras que la fosforilacion del residuo de serina no se confirmo. Estos resultados sugieren que 39S en la region importante para la supresion de la actividad por el PHB2/REA descrito anteriormente era un sitio candidato para la fosforilacion. Luego, celulas COS-7 se transfectaron temporalmente con PHB2/REA tipo normal, una construccion del vector de expresion (S39A) en la que 39S de PHB2/REA se sustitda por alanina, o un constructo del vector de expresion (S39E) en el que 39S de PHB2/REA era sustituido con un residuo de acido glutamico que podfa hacer constitutivamente el estado similar al estado de fosforilacion, junto con REa, vector ERE-luciferasa, y cada vector de pRL-TK como un estandar interno. A continuacion, las celulas fueron tratadas con E2, y se examino la actividad del indicador ERE. Como consecuencia, la actividad de REa fue suprimida en las celulas a las que se introdujo PHB2/REAtipo normal. Por otro lado, la supresion de la actividad de REa no fue reconocida en las celulas a las que se introdujo el constructo de mutacion S39A. Ademas, tambien en el constructo de S39E, se reconocio la supresion de la actividad de REa (Fig. 22B). De lo descrito anteriormente se sugirio que la fosforilacion del residuo de serina en la posicion 39 era importante en la supresion de la actividad de REa por PHB2/REA, y en las celulas de cancer de mama positivas para ER que no tienen expresion de ERAP1, la fosforilacion fue suprimida y, por tanto, PHB2/REA se convirtio en un tipo inactivo.
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[Ejemplo 7] Expresion de ERAP1 y PHB2 en la lmea celular de cancer de mama humano y en las muestras de cancer de mama humano extirpadas
1. Materiales y metodos
Analisis para la expresion de ERAP1 en lmeas celulares de cancer de mama
Los lisados celulares de las lmeas de celulas humanas positivas para ER de cancer de mama (KPL-3L, BT-474, ZR- 75-1, YMB-1, T47D, HBC4, y KPL-1) y las celulas epiteliales mamarias (MCF-10A) se sometieron a inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-ERAPI, el anticuerpo anti-PHB2 y el anticuerpo anti-REa.
Analisis de la expresion de ERAP1 y PHB2 en muestras de cancer de mama humano extirpadas
Las expresiones de ERAP1 y PHB2/REA se evaluaron con tincion de tejidos inmune usando el anticuerpo anti- ERAPI (diluido 75 veces, 7 horas, 4°C) y el anticuerpo anti-PHB2 (diluido 300 veces, 12 horas, 4°C) para 103 casos de espedmenes de cancer de mama extirpados embebidos en parafina. La determinacion de la capacidad de tincion de la parte de cancer por inmunotincion se realizo de tal manera que en el caso de que el tejido de cancer no se tenia en absoluto entonces se determinaba como negativo, en el caso en el que el citoplasma se tenia ligeramente se determinaba como positivo debil, y en el caso en el que el tejido de cancer era casi uniformemente fuertemente tenido se determinaba como fuertemente positivo. Los resultados de esta tincion de tejidos inmunes fueron confirmados por los patologos, y se evaluo la intensidad de la tincion de cada caso de forma independiente por tres investigadores. Para conocer la correlacion entre la expresion de ERAP1 y el penodo de supervivencia sin recafdas del caso respectivo, fue preparada una curva de supervivencia sin recafdas con el metodo de Kaplan-Meier utilizando Statview J-5.0, y se evaluo con la prueba Logrank.
2. Resultados
Expresion de ERAP1 en lmeas celulares de cancer de mama
Se investigaron las expresiones de ERAP1, PHB2 y REa de lmeas celulares de cancer de mama humano positivas para RE. En los canceres de mama positivos para RE, todas las lmeas celulares, excepto la HCC1395, fueron confirmadas para la expresion de ERAp1 (figura 23 y Cancer Science, 2009; 100: 1468-1478).
Expresiones de ERAP1 y PHB2 en muestras de cancer de mama humano extirpado
La expresion de ERAP1 se evaluo por tincion de tejidos inmune en espedmenes de cancer de mama extirpados. Entre los 103 casos evaluados, era Negativo cuando el tejido canceroso no estaba tenido en absoluto; fueron 24 casos (23%); era Debil cuando el citoplasma se tenia ligeramente; fueron 59 casos (57%); y era Fuerte cuando el tejido canceroso estaba casi uniformemente fuertemente tenido; fueron 20 casos (19%) (Fig. 24A, panel superior). Por otra parte, los respectivos casos se clasificaron en Debiles (casos negativos y casos positivos debiles) y Fuertes (positivos fuerte), y se evaluaron con una curva de supervivencia sin recafdas construida para la correlacion entre la expresion de ERAP1 y el penodo de supervivencia sin recafdas con el metodo de Kaplan-Meier. Como consecuencia, se reconocio que la expresion de ERAP1 se correlacionaba significativamente con el penodo de supervivencia sin recafdas (Fig. 24A, panel inferior).
Ademas, la expresion de PHB2 se evaluo de manera similar con la tincion del tejido inmune. Como consecuencia, casi todos los casos de los espedmenes de cancer de mama extirpados investigados fueron positivos fuerte (Fuerte) (Fig. 24B).
[Ejemplo 8] Investigacion para el mecanismo de accion del peptido ERAP1 en celulas de cancer de mama humano 1. Materiales y metodos Lmeas celulares
Las lmeas de celulas humanas de cancer de mama (MCF-7, ZR-75-1, BT-474, T47D, y HCC1395) fueron adquiridas de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). KPL-3C fue proporcionada por el Dr. Junichi Kurebayashi (Escuela de Medicina de Kawasaki, Okayama, Japon) bajo un acuerdo de transferencia de material. HEK293T se adquirio de RIKEN (Ibaraki, Japon). Todas las lmeas de celulas se cultivaron en las condiciones recomendadas por cada depositante.
Tratamiento de las celulas
Las celulas MCF-7 se suspendieron en MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) reforzado con 10% de FBS (Nichirei Biosciences, Tokio, Japon), 1% de solucion antibiotica/antimicotica (Invitrogen), NEAA 0,1 mM (Invitrogen), piruvato de sodio 1 mM y 10 |ig/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). A continuacion, la suspension obtenida se sembro en una placa de 4 pocillos (1 x 10° celulas/1 ml), una placa de 6 pocillos (5 * 105 celulas/2 ml) o plato de 10 cm (2 * 106 celulas/10 ml). Las celulas se mantuvieron en una atmosfera humidificada que contema 5% de dioxido de carbono a 37°C. Al dfa siguiente de la siembra, el medio de cultivo se cambio a DMEM/F12 sin rojo de fenol
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(Invitrogen) reforzado con FBS, una solucion antibiotica/antimicotica, NEAA, piruvato de sodio e insulina. Despues de 24 horas, las celulas fueron tratadas con 17p estradiol 10 nM (E2, Sigma). En la prueba de inhibicion, se anadio el peptido ERAP1 justo antes de la estimulacion con E2.
Ensayo indicador de luciferasa
Celulas HEK293T fueron transfectadas con un indicador ERE disponible en el mercado (SABiosciences, Frederick, MD, EE.UU.) y un indicador ERE del gen PP1a (secuencia tandem formada por el motivo ERE 5' aguas arriba y el motivo ERE dek 5' aguas arriba y el intron 2) y pRL-TK como patron interno. Despues de 16 horas de la transfeccion, el medio de cultivo se cambio a un medio de cultivo de ensayo (Opti-MEM, 10% FBS). Despues de 24 horas de la transfeccion, las celulas fueron tratadas con E2 10 nM durante 24 horas. Las celulas se recogieron y las actividades de luciferasa y Renilla luciferasa fueron evaluadas con el ensayo indicador dual de luciferasa de Promega (Tokio, Japon). En consideracion a la eficiencia de la transfeccion, todos los datos se estandarizaron con la actividad de Renilla luciferasa.
Analisis de transferencia Western
Las celulas se lisaron con un tampon de lisis (Tris-HCl 50 mM: pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,1% de NP-40, 0,5% de CHAPS) que contema 0,1% de coctel inhibidor de proteasa III (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.). El lisado celular se sometio a electroforesis, y se transfirio sobre una membrana de nitrocelulosa, y se bloqueo con una solucion BlockAce 4% (Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japon) durante 1 hora. La membrana se incubo en presencia de los anticuerpos descritos a continuacion durante 1 hora:
Anticuerpos anti-p-actina (AC-15) (Sigma);
Anticuerpo purificado anti-ERAP1 (anti-hA7322 (His13)) (Sigma);
Anticuerpo anti-FLAG-tag M2 (Sigma);
Anticuerpo anti-HA-tag (Roche, Mannheim, Alemania);
Anticuerpo anti-PHB2/REA (Abcam, Cambridge, Reino Unido);
Anticuerpo anti-REa (AER314) (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-a/p-tubulina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-Akt (PKB) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-fosforilacion de Akt (Ser473) (587F11) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-p44/42 de MAP quinasa (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-fosforilacion de p44/42 MAP quinasa (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-PP2A de subunidad A (81G5) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-Lamin B (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.);
Anticuerpo anti-PKA IIa reg (C-20) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); o Anticuerpo anti-PP1 (FL-18) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.).
Alternativamente, la membrana se incubo durante la noche en presencia de los anticuerpos descritos a continuacion: Anticuerpo purificado de PHB2/REA anti-fosforilacion (Ser39) (Scrum, Tokio, Japon);
Anticuerpo anti-fosforilacion de tirosina (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.); anticuerpo anti-fosforilacion de serina (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.); o anticuerpo anti-fosforilacion de treonina (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.).
La membrana se incubo en presencia de un anticuerpo secundario unido a HRP (Santa Cruz Biotechnology) durante 1 hora. A continuacion, la membrana se desarrollo con el sistema de quimioluminiscencia (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). La transferencia se escaneo usando el lector de imagenes LAS-3000 mini (Fujifilm, Tokio, Japon).
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Inmunoprecipitacion
Como se describe en el punto "Analisis de transferencia Western", las celulas se lisaron con tampon de lisis NP-40 0,1%. El lisado celular se sometio a limpieza previa utilizando IgG normal y rec-protema G Sepharose 4B (Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.) a 4°C durante 3 hora. El lisado celular se centrifugo y el sobrenadante se incubo en presencia de un anticuerpo purificado anti-ERAPI, un anticuerpo anti-PHB2/REA, un anticuerpo anti-REa y un anticuerpo anti-FLAG-tag M2 a 4°C durante 6 horas. Entonces, el sobrenadante se incubo en presencia de rec- Protein G Sepharose 4B a 4°C durante 1 hora para precipitar un complejo antfgeno-anticuerpo. El complejo de la protema inmunoprecipitada se lavo con un tampon de lisis tres veces, y se separo por SDS-PAGE. A continuacion, se realizo el analisis de transferencia Western.
Fraccionamiento del nucleo y el citoplasma
Con el fin de evaluar la localizacion y la fosforilacion de PHB2/REA, se realizo la inmunoprecipitacion utilizando un anticuerpo anti-PHB2/REA en presencia de rec-protema G Sepharose utilizando los extractos del nucleo y el citoplasma de celulas MCF-7. Los extractos del nucleo y del citoplasma se prepararon usando el reactivo de extraccion nuclear y citoplasmatico NE-PER (Thermo Fisher Scientific).
Tincion qmmica de celulas inmunes
Celulas MCF-7 fueron sembradas en una camara de 8 pocillos (Laboratory-Tek II Chamber Slide System, Nalgen Nunc International, Naperville, IL, EE.UU.) a 5 * 104 celulas/pocillo, y se cultivaron en condiciones libres de estrogeno durante 24 horas. Celulas MCF-7 fueron expuestas a E2 10 nM con el peptido ERAP1 y A-fosfatasa. Despues de 24 horas, las celulas se trataron con paraformaldehudo al 4% a 4°C durante 30 minutos para ser fijadas, y se trataron con 0,1% Triton X-100 durante 2 minutos para hacerlas permeables. Entonces, las celulas se recubrieron con 3% de BSA para bloquear la hibridacion no espedfica. Despues, las celulas se incubaron adicionalmente durante 1 hora en presencia de anticuerpo anti-PHB2/REA y anticuerpo anti-fosforilacion PHB2/REA (Ser39). Las celulas se lavaron con PBS, y se incubaron durante 1 hora en presencia de anticuerpo anti-conejo de union de Alexa 594 y Alexa 488 (Molecular Probe, Eugene, Oregon, EE.UU.) para ser tenidas. El nucleo fue contra tenido con dihidrocloruro de 4,6-diamidina-2'-fenilindol (DAPI, Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). La imagen de fluorescencia se obtuvo bajo el microscopio Olympus IX71 (Tokio, Japon).
Inhibicion in vivo de la proliferacion del tumor
La suspension de celulas KPL-3C (1 * 107 celulas/raton) se mezclo con una cantidad igual de Matrigel (BD), y se inyecto en la grasa corporal de mama de ratones desnudos BALB/c de 6 semanas de edad (CLEA Japan, Tokio, Japon). Los ratones se mantuvieron en una instalacion aislada esteril con un periodo de ciclo de luz de 12 horas y 12 horas de periodo de oscuridad, y se alimentaron libremente con comida de roedores y agua. El tumor se cultivo mas de 1 semana hasta que el tamano del mismo alcanzo de 50 a 80 mm3 (calculado como 1/2 x (anchura x longitud2)). Entonces, los ratones se dividieron aleatoriamente en nueve grupos de tratamiento (5 individuos/grupo): grupo sin tratamiento, 6 |ig/dfa grupo de tratamiento de E2, E2 + 0,28 mg/dfa grupo de tratamiento peptido ERAP1, E2 + 0,7 mg/dfa grupo de tratamiento de peptido ERAP1, E2 + 1,4 mg/dfa grupo de tratamiento de peptido ERAP1, E2 + 0,28 mg/dfa grupo de tratamiento de peptido ERAP1-codificado, E2 + 0,7 mg/dfa grupo de tratamiento de peptido ERAP1- codificado, E2 + 1,4 mg/dfa grupo de tratamiento de peptido ERAP1-codificado y E2 + 83 mg/dfa grupo de tratamiento con tamoxifeno. Los ratones fueron tratados diariamente con 6 |ig/dfa de solucion de E2 (100 |il: 2,2 x 10-4 M) en la piel del cuello. El peptido ERAP1 o el peptido ERAP1-codificado se administraron a los ratones cada dfa mediante inyeccion intraperitoneal en 0,28, 0,7, o 1,4 mg/dfa (14, 35 y 70 mg/kg). El tamoxifeno tambien se administro intraperitonealmente a los ratones cada dfa en una dosis de 4 mg/kg. El volumen del tumor se midio durante 2 semanas usando calibradores. Cuando se completo el ensayo, los animales se sacrificaron, y el tumor se elimino con el fin de evaluar la fosforilacion de serina de PHB2/REA, y se trituraron en nitrogeno lfquido y se sometieron a transferencia Western. Todas las pruebas se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del animalario de la Universidad de Tokushima.
Actividad de fosfatasa PP1a
La actividad fosfatasa de PP1a se midio utilizando el Kit de ensayo de protema fosfatasa (AnaSpec, Fremont, CA, EE.UU.). Celulas MCF-7 fueron tratadas con E2 y el peptido ERAP1 durante 24 horas. Entonces, la solucion de lisado de celulas se inmunoprecipito con anticuerpo anti-PP1a. Posteriormente, el extracto de celulas inmunoprecipitadas se incubo con un sustrato (fosfato de p-nitrofenilo) a temperatura ambiente durante 60 minutos. A continuacion, se detuvo la reaccion, y se midio la absorbancia a 405 nm. La actividad de PP1a (mol/min) se define como una cantidad enzimatica que cataliza 1 |imol del sustrato por 1 minuto.
PCR en tiempo real
La expresion de PP1a se evaluo con PCR en tiempo real. El ARN completo se extrajo de las celulas tratadas con E2 utilizando el kit de purificacion RNeasy Mini (Qiagen), y se sometio a transcripcion inversa en ADNc usando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen), oligo dT cebador (Invitrogen) y mezcla dNTP 25 mM (Invitrogen). El cDNA se analizo con PCR en tiempo real en 500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) utilizando SYBR
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(marca registrada) Premezcla Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japon). Cada muestra se estandarizo con el contenido de ARNm de p2-MG. Los cebadores usados para la amplificacion son como se describen a continuacion; PP1a: 5'- ACTATGTGGACAGGGGCAAG-3' (SEQ ID NO: 58) y 5'-CAGGCAGTTGAAGCAGTCAG-3' (SEQ ID NO: 59), p2- MG: 5'-AACTTAGAGGTGGGGAGCAG-3' (SEQ ID NO: 21) y 5'-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3' (SEQ ID NO: 22).
Ensayo ChIP
El analisis ChIP se realizo utilizando EZ-ChIP (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Celulas MCF-7 fueron tratadas con E2 10 nM durante 24 horas, y despues se fijaron con formaldetffdo al 37%, y se resuspendieron en tampon de lisis. Posteriormente, las celulas fueron destruidas con ondas ultrasonicas en l0 segundos x10 con Microson XL-2000 (Misonix, Farmingdale, NY, EE.UU.). El sobrenadante se preaclaro con perlas de protema G agarosa, y se recogio un 1% de entrada. Se llevo a cabo la inmunoprecipitacion (por cada 1 x 1o6 celulas) (durante la noche, 4°C) usando anticuerpo anti-REa e IgG de raton, y el complejo ADN-protema anti-RE fue sacado junto con las perlas de agarosa de protema G (1 hora, 4°C), y se lavo, y luego, el inmunoprecipitado se volvio a suspender en un tampon de elucion. A continuacion, la suspension obtenida se incubo a 65°C durante 5 horas para liberar la reticulacion. Entonces, el inmunoprecipitado se purifico usando una columna de purificacion accesoria. El fragmento de ADN se detecto con 28 ciclos de PCR. Como los cebadores para la region ERE del genoma de PP1a utilizados fueron -726/-704: 5'- TCAAAAGCTAATTATGGGGC-3' (SEQ ID NO: 60) y 5'-TCAAGCGATTCTCCTGCCTCA-3' (SEQ ID NO: 61), 1851/+ 1873: 5'-GAGATCCGCGGTCTGTGCCTG-3' (SEQ ID NO: 62) y 5'-CAGGACTGCGCTCAAGGGAGG-3' (SEQ ID NO: 63), y + 1936/+ 1959: 5'-CACTGGACCCCACAGAGTTCC-3' (SEQ ID NO: 64) y 5'-
TAGTTGCTCTCGGGAGGGAAA-3' (SEQ ID NO: 65).
2DICAL
Celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 10 |iM y peptido ERAP1-codificado. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM. A continuacion, las celulas se fijaron con metanol. Se secaron las celulas bajo presion reducida, y despues se trataron con tripsina en presencia de desoxicolato de sodio 2% y urea 5 M a 37°C durante 20 horas. La protema se extrajo con acetato de etilo. Posteriormente, los extractos se secaron a presion reducida, y despues se sometieron a 2DICAL (2 Dimensional Image Converted Analysis of LCMS). 2DICAL es un metodo de analisis del proteoma en el que se obtiene temporalmente el espectro con cromatograffa de ffquidos de ultra baja velocidad y el analisis de masas es digitalizado y representado en un plano que tiene dos ejes, el de la relacion de masa y carga (m/z) y el tiempo de retencion. Los datos se calcularon como la relacion con el valor a 0 horas.
Microarrays
Celulas MCF-7 fueron tratadas con peptido ERAP1 10 |iM. Luego, inmediatamente, las celulas se estimularon con E2 10 nM. A continuacion, se realizo la extraccion del ARN. El ARNc marcado con Cy3 fue sintetizado con el kit Low Input Quick Amp Labeling (Agilent Technologies, Loveland, CO, EE.UU.) y se hibrido con un microarray a medida a 65°C durante 17 horas. El microarray se lavo. Entonces, el producto hibridado se midio con un escaner de microarrays (Agilent). Los resultados del mismo fueron digitalizados con el software de Futuro Extraction (Agilent). Los datos se analizaron estadfsticamente con el software GeneSpring (Agilent), y se calculo la relacion con el valor a las 0 horas.
Biacore
Con el fin de evaluar la union de PHB2/REA y el peptido ERAP1, se inmovilizo la protema PHB2/REA recombinante 6xHis-marcado sobre un chip sensor (CM5) por acoplamiento de amina. A continuacion, el chip se establecio con Biacore 3000 (GE Healthcare, Tokio, Japon), y se inyecto el peptido ERAP1 HA-marcado a cada concentracion. La constante de velocidad de disociacion se calculo con el software BIAevaluation (GE Healthcare).
Metodo de espectroscopia por correlacion de fluorescencia
Con el fin de evaluar la union de PHB2/REA y el peptido ERAP1, se hicieron reaccionar durante 1 hora el peptido ERAP1 10 nM FITC-marcado y el peptido ERAP1-codificado FITC-marcado, y la protema PHB2/REA recombinante 6xHis-marcado. A continuacion, la fluorescencia FITC se midio usando un dispositivo FlucDeux (MBL, Tokio, Japon), y la relacion del peptido ERAP1 unido a la protema PHB2/REA se calculo.
Purificacion del anticuerpo monoclonal anti-ERAP1
Una rata (WKY/Izm, 10 semanas de edad, hembra) se sensibilizo con una secuencia parcial de ERAP1 humana (residuos 459-572 aa). Despues de 2 semanas, los linfocitos se recogieron de los ganglios linfaticos iffacos, las celulas se fusionaron con el mieloma de raton SP2, y el hibridoma se cultivo. Los anticuerpos producidos por el hibridoma y tamizados se recogieron de las ascitis de raton, y se purificaron con cromatograffa de intercambio cationico (SP HiTrap HPcolumn).
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A fin de preparar el anticuerpo anti-fosforilacion Ser39-espedfico de PHB2/REA humano, un antigeno peptidico (C + (PEG Spacer) + YGVRE pS VFTVE) fue sintetizado y conjugado con KLH y fue utilizado para sensibilizar a un conejo cinco veces cada 2 semanas. Despues de 2 meses, se recogio la sangre entera, y se preparo el anti-suero, y el anticuerpo anti-fosforilacion PHB2/REA (S39) se purifico con afinidad por fosforilacion.
Ensayo de proliferacion celular
El ensayo de proliferacion celular se realizo a traves del Kit-8 de recuento celular (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japon). Se recogieron las celulas y se sembraron a 2 * 104 celulas/pocillo en una placa de 48 pocillos, y se mantuvieron en una incubadora humidificada (37°C). Se anadio una solucion de CCK-8 10 veces diluido en los puntos de tiempo indicados y se incubaron las celulas durante 1 hora. A continuacion, se midio la absorbancia a 450 nm y se calculo el numero de celulas vivas.
Analisis estad^stico
Para determinar la significacion estad^stica de la diferencia entre los grupos de ensayo, se utilizo la prueba t de Student. Valor de p <0,05 fue considerado como significativo.
2. Resultados
Supresion de la actividad transcripcional de REa por la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA
El hecho de que la fosforilacion del residuo de serina en la posicion 39 (Ser39) era importante para la supresion de la actividad de REa por PHB2/REA (Fig. 22) se verifico usando el anticuerpo de fosforilacion policlonal espedfico de anti-PHB2/REA-Ser39 fabricado anteriormente. Celulas HEK293T fueron transfectadas temporalmente con una construccion de vector de expresion de tipo mutacion (S39A) en el que 39S de PHB2/REA tipo normal fue sustituido por alanina (Ala), o un constructo de vector de expresion (S39E) en el que 39S fue sustituido con un residuo de acido glutamico que puede hacer constitutivamente el estado similar al estado de fosforilacion, junto con REa, vector ERE-luciferasa y cada vector de pRL-TK como estandar interno. A continuacion, las celulas fueron tratadas con E2, y se examino la actividad del indicador ERE. Como consecuencia, de la misma manera que en la Fig. 22, en las celulas en las que se introdujo PHB2/REA, se suprimio la actividad de REa tipo normal de (WT), mientras que la supresion de la actividad de REa no se reconocio en las celulas en las que se introdujo el constructo de mutacion de S39A (S39A). Ademas, tambien con el constructo S39E, se reconocio la supresion de la actividad de REa (Fig. 25A). Posteriormente, el estado de fosforilacion de PHB2/REA se examino utilizando el anticuerpo de fosforilacion anti- PHB2/REA-Ser39. Como consecuencia, la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA fue reconocida solo en las celulas en las que se introdujo el tipo normal de PHB2/REA, pero no se reconocio en las celulas en las que se introdujeron las otras construcciones (fig. 25B). Ademas, se examinaron las supresiones para la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA y la ruta de activacion de RE no genomica dependiente de E2. Por lo tanto, la disminucion de las fosforilaciones de Akt y MAPK (T201/Y204) en forma dependiente de E2 fue reconocida solo en las celulas en las que se introdujo PHB2/REA tipo normal, pero no se reconocio en las celulas en las que se introdujeron otras construcciones (Fig. 25C). De los resultados anteriores se revelo que la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA era importante para la actividad de supresion de las rutas de activacion de RE genomico y no genomico dependiente de E2 de PHB2/REA.
Estudio de la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REAtranslocado en el nucleo
A continuacion, fueron tratadas celulas MCF-7 con E2 y el peptido ERAP1, y luego se recogieron las fracciones de citoplasma y nucleares, y el estado de fosforilacion de PHB2/REA se examino. Como consecuencia, fue reconocida la translocacion de PHB2/REA al nucleo por el peptido ERAP1 para la fosforilacion de Ser39 y, ademas, de manera similar el PHB2/REA restante en el citoplasma se confirmo tambien para la fosforilacion de Ser39 (Fig. 26A). Posteriormente, se examino el cambio sucesivo de la fosforilacion del residuo de serina del PHB2/REA inherente liberado por el tratamiento con el peptido ERAP1. Como consecuencia de ello, la fosforilacion Ser dependiente de E2 de PHB2/REA fue reconocida de forma continua desde 1 hora a 24 horas despues de la administracion del peptido ERAP1 (Fig. 26B). Ademas, la localizacion del PHB2/REA inherente fosforilado tambien se examino mediante tincion de celulas inmunes. Por lo tanto, la rapida translocacion nuclear del PHB2/REA inherente fue reconocida despues de la administracion del peptido ERAP1 a celulas MCF-7, y la fosforilacion de Ser39 fue reconocida (fig. 26C). Ademas, se detecto de manera similar con anticuerpo de fosforilacion anti-Ser39 mediante la administracion del peptido ERAP1 tambien en el PHB2/REA del citoplasma. Esta senal de fluorescencia desaparecio por tratamiento con fosfatasa A, lo que indica que el PHB2/REA localizado en el nucleo y el citoplasma disociado de ERAP1 por el peptido ERAP1 eran fosforilados. Posteriormente, se examino la fosforilacion de PHB2/REA cuando ERAP1 fue destruido por siRNA espedfico de ERAP1. Como consecuencia de ello, la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA en el nucleo y el citoplasma por la supresion de la expresion ERAP1 fue reconocida (Fig. 26D). Ademas, se encontro que la aceleracion dependiente de E2 de la expresion de genes diana de REa CCND1, TFF1 y c-Myc, se supriirna significativamente en el momento (Fig. 26E). De lo descrito anteriormente se revelo que Ser39 de PHB2/REA, liberado de ERAP1, se fosforilaba en el nucleo y en el citoplasma.
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Usando tumores de ratones a los que se administraba el peptido ERAP1, se examino el estado de fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA en los tumores. Como consecuencia de ello, la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA fue confirmada en el tumor al que se administro el peptido ERAP1. Por otra parte, en el tumor al que se administro el peptido ERAPI-codificado, la fosforilacion de PHB2/REA no se reconocio como en el tumor al que solamente se administro E2 (Fig. 27A). De lo descrito anteriormente se encontro que la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA tambien era importante en la supresion de tumores in vivo.
Estudio del efecto antitumoral in vivo del peptido ERAP1 en el cancer de mama resistente al tamoxifeno
Posteriormente, utilizando un modelo de raton desnudo BALB/c en el que las lmeas celulares de cancer de mama resistentes a tamoxifeno (Tam-R MCF-7) se trasplantaron ortotopicamente a la glandula mamaria, se investigo el efecto antitumoral del peptido ERAP1. El efecto antitumoral se reconocio con la administracion del peptido ERAP1 (3,5, 7 y 14 mg/kg) sobre la proliferacion de cancer de mama dependiente de E2, pero no fue reconocido con el peptido ERAPI-codificado (14 mg/kg) (figura 27B). De lo descrito anteriormente se encontro que el peptido ERAP1 tambien exhibfa un notable efecto antitumoral in vivo en el cancer de mama resistente a tamoxifeno.
Estudio de la interaccion de ERAP1 y PP1a
Se informo a partir del estudio exploratorio de la protema de union de la enzima de desfosforilacion, PP1a (protema fosfatasa 1a), con el metodo de ensayo de eliminacion de GST in vitro que PP1a se urna a una longitud parcial de KIAA1244 (otro nombre de ERAP1) y el motivo de union de PP1a (KAVSF) se conservaba en 1228-1232 residuos de aminoacidos de ERAP1 (Chem. Biol., 16, 365, 2009). A partir de esto, en primer lugar, se verifico la interaccion de PP1a inherente y ERAP1 en celulas de cancer de mama MCF-7. Como consecuencia, la union del ERAP1 inherente y PP1a inherente fue confirmada, y la union adicional de PHB2/REA tambien fue reconocida independientemente de la presencia o ausencia de E2 (Fig. 28A). A continuacion, una construccion de ERAP1 que fue deficit del motivo de union de PP1a (FLAG-ERAP1-APP1a) fue fabricada, y la union a PP1a fue investigada. Como consecuencia, la union del constructo WT-ERAP1 y PP1a inherente fue confirmada, pero la union no fue reconocida en el constructo de ERAP1 (APP1a) en el que se habfan eliminado 1228-1232 aa (KAVSF) (fig. 28B). Entonces, se examino la influencia de la supresion de la expresion de PP1a inherente usando siRNA en la interaccion respectiva de ERAP1, PHB2/REA y REa en celulas MCF-7. Como consecuencia, de manera interesante, en la fraccion de citoplasma de las celulas MCF-7 en el que la expresion de PP1a fue suprimida, la union de ERAP1 y REa fue reconocida, pero cuando la fraccion de citoplasma se trato con el peptido ERAP1, la union de REa y PHB2/REA fue confirmada (Fig. 28C). Por otro lado, en la fraccion nuclear, la union de REa y PHB2/REA fue confirmada solo cuando la fraccion nuclear se trato con el peptido ERAP1 como se ha mostrado hasta ahora (Fig. 28C). Posteriormente, tambien se investigaron las interacciones cuando la expresion de ERAP1 era suprimida por siRNA. Como consecuencia, la interaccion de PHB2/REA y PP1a no se pudo confirmar (Fig. 28D). Como se describio anteriormente, se encontro que ERAP1 se urna directamente a PP1a y PHB2/REA, respectivamente, pero que PHB2/REA se urna indirectamente a PP1a a traves de ERAP1.
Influencia de la inhibicion de la union de ERAP1 y PP1a sobre la fosforilacion de PHB2/REA (S39)
A continuacion, se examino la influencia de la supresion de la expresion de PP1a sobre la fosforilacion de PHB2/REA (S39). Como consecuencia, se reconocio que la fosforilacion dependiente de E2 de PHB2/REA (Ser39) era acelerada notablemente en las celulas tratadas con siPP1a en comparacion con las celulas tratadas con siEGFP como control (Fig. 29A). Entonces, tambien se investigo la influencia de la expresion de la construccion ERAP1 (APP1a) en la que se habfa eliminado la region de union de PP1a sobre la fosforilacion de PHB2/REA (Ser39). Se reconocio que la fosforilacion dependiente de E2 de PHB2/REA inherente (Ser39) era claramente acelerada en celulas en las que se introdujo el constructo APP1a en comparacion con las celulas en las que se introdujo el constructo WT-ERAP1 (Fig. 29B). Posteriormente, peptido negativo dominante de ERAP1 permeable a la membrana celular (ERAP1/PP1a-peptido) que tiene el motivo de union PP1a se sintetizo, y fueron examinados los factores que influyen en la interaccion de ERAP1-PP1a cuando se introduce en celulas mCF-7 y la fosforilacion de PHB2/REA inherente (Ser39). Como consecuencia, la inhibicion dependiente de E2 de la union de ERAP1-PP1a mediante la administracion del peptido negativo dominante de ERAP1 permeable a la membrana celular se confirmo, y aun mas notable la fosforilacion de PHB2/REA inherente (Ser39) fue reconocida cuando se introdujo este peptido negativo dominante, (figura 29C). De los resultados anteriores se revelo que la inhibicion de la union de ERAP1 a PP1a inducfa la fosforilacion dependiente de E2 del PHB2/REA inherente (S39).
Influencia de la fosforilacion de ERAP1 sobre la actividad de fosfatasa PP1a
A continuacion, se investigo la relacion entre ERAP1 y la actividad fosfatasa de PP1a. La actividad de la fosfatasa se examino cuando la expresion de ERAP1 o PP1a fue suprimida por el metodo de siRNA, respectivamente, en celulas MCF-7. Por lo tanto, se confirmo que la actividad de fosfatasa aumentaba notablemente en las celulas en las que la expresion ERAP1 era suprimida (Fig. 30A). Posteriormente, con el fin de verificar este efecto de inhibicion de la actividad de fosfatasa de PP1a por ERAP1, se examino la influencia de la expresion excesiva de ERAP1 en la actividad de fosfatasa PP1a. Celulas HEK293T fueron transfectadas con el constructo ERAP1 (0,5, 1,0, 2,0 g) y el
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constructo ERAP1 (APP1a: 2,0 g) en el que se hada eliminado la region de union de PP1a. Entonces, despues de la inmunoprecipitacion con el anticuerpo anti-PP1a, se examino la actividad de fosfatasa de las celulas. Como consecuencia, se confirmo que cuando la cantidad de expresion de ERAP1 aumentaba, la actividad de PP1a disminma (Fig. 30B). A continuacion, se investigo la influencia de la estimulacion de estrogenos sobre la actividad de PP1a. Celulas MCF-7 se estimularon con E2 10 nM durante 6, 12 y 24 horas, y luego se examino la actividad de la fosfatasa. Por lo tanto, se confirmo que la actividad de fosfatasa PP1a se aceleraba con el tratamiento de E2 durante 6 horas (Fig. 30C).
De los resultados anteriores, se revelo que 1) ERAP1 era un regulador negativo que supriirna la actividad de la fosfatasa de PP1a mediante la union a PP1a, y 2) PHB2/REA desfosforilaba la fosforilacion de Ser39 mediante la union a ERAP1 que era una unidad de regulacion de PP1a. Sin embargo, estos resultados son opuestos entre sf. Por lo tanto, con el fin de resolver esta cuestion, los presentes inventores construyeron una hipotesis de que la actividad de inhibicion de ERAP1 respecto a la actividad de la fosfatasa de PP1a era inhibida por la estimulacion E2. A saber, los presentes inventores se centraron primero en la fosforilacion de ERAP1 por la estimulacion de E2. Celulas MCF-7, que eran lmeas celulares que expresaban altamente ERAP1, se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas y, a continuacion, se realizo el analisis de inmunotransferencia utilizando cada anticuerpo anti-fosforilacion. Como consecuencia, se encontro que ERAP1 se fosforilaba en los residuos de serina, treonina y tirosina de manera dependiente de E2 (Fig. 30D). Como se describio anteriormente se sugirio la posibilidad de que ERAP1 podna ser fosforilado por la estimulacion de E2 y, como consecuencia, la funcion de la supresion de PP1a de la actividad de la fosfatasa podna ser suprimida, para acelerar la actividad de la fosfatasa de PP1a.
Estudio de la regulacion de la fosforilacion de PHB2/REA (S39) por la fosforilacion de ERAP1 por PKA y PKB a traves de la actividad de PP1a
Posteriormente se investigo la fosforilacion de la quinasa ERAP1. Se informo de que las moleculas de la familia ERAP1, es decir, BIG1 y BIG2 forman un complejo con PKA y la fosfatasa de protema, para funcionar como una de las protemas AKAP (Proc Natl Acad Sci USA 2003 18 de febrero; 100 (4): 1627- 32. Proc Natl Acad Sci USA 2006 Feb 21; 103 (8): 2683-8. Genes to Cells 11, 949-959, 2006; Journal of Biological Chemistry 283, 2536-25371; Proc Natl Acad Sci USA 2007 Feb 27; 104 (9): 3201-6; Proc Natl Acad Sci USA 2009 Abr 14; 106 (15): 6158-63). A partir de este hecho, se considero la posibilidad de que ERAP1 tambien podna funcionar de manera similar como una protema AKAP similar. De acuerdo con ello, la union de ERAP1 y pKa se investigo. Celulas MCF-7 se estimularon con E2 10 nM durante 24 horas. Entonces, se examino la union con inmunoprecipitacion utilizando el anticuerpo anti-ERAP1. Como consecuencia, la union de ERAP1 inherente y PKA inherente fue reconocida (Fig. 30E). Ademas, PKB, que hada sido identificado para la union en muchas protemas AKAP, se investigo de manera similar. Como consecuencia, la union de ERAP1 inherente y PKB inherente tambien fue confirmada (Fig. 30E). A continuacion, se examino la influencia sobre la actividad de la fosfatasa PP1a cuando se supriirnan las expresiones de PKA y PKB, respectivamente por el metodo de siRNA. Por lo tanto, se confirmo que la aceleracion de la actividad de la fosfatasa dependiente de E2 se suprimfa significativamente (Fig. 31A). Posteriormente, se investigo el estado de fosforilacion de ERAP1 y PHB2/REA. En las celulas transfectadas con siEGFP como control, se reconocio la fosforilacion de los residuos de serina y treonina de ERAP1 por el tratamiento con E2. Ademas, en las celulas tratadas con el peptido ERAP1, se reconocio la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA. Por otra parte, en celulas suprimidas para la expresion de PKA, se reconocio que la fosforilacion del residuo de serina de ERAP1 desapareda independientemente de la presencia o ausencia de tratamiento con el peptido ERAP1. Ademas, la fosforilacion de ser39 de PHB2/REA despues del tratamiento con E2 tambien se confirmo (Fig. 31 B). Ademas, en las celulas suprimidas para la expresion de PKB, el cambio de la fosforilacion del residuo de serina de ERAP1 no fue reconocido. Por otro lado, para el residuo de treonina, se reconocio una notable disminucion de la fosforilacion. Por otra parte, la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA se mostro que se recuperaba por el tratamiento con E2, mientras que las fosforilaciones de la serina y treonina de ERAP1 no fueron casi influenciadas (Fig. 31B). Entonces, tambien se investigo la influencia de la inhibicion de la actividad de PKA por el compuesto H-89 del inhibidor de PKA sobre la fosforilacion de ERAP1 y PHB2/REA. Celulas MCF-7 fueron tratadas con H-89, y luego se examino la fosforilacion de ERAP1 y PHB2/REA. Como consecuencia, se reconocio que las fosforilaciones de los residuos de serina y tirosina de ERAP1 disminuyeron notablemente a 0,5 |iM, y que la fosforilacion del residuo de treonina tambien se redujo de manera dependiente de la dosis (Fig. 31C). Por el contrario, en las celulas sin tratamiento de H-89, la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA fue reconocida solo cuando las celulas se trataron con el peptido ERAP1. Por otro lado, fue reconocida una notable recuperacion en celulas que fueron estimuladas por E2 y que se trataron con H-89 (Fig. 31C). Muy destacadamente, se reconocio que cuando la union de ERAP1 y PHB2/REA era inhibida por la administracion del peptido ERAP1, la fosforilacion de Ser39 disminma dependiendo de la dosis de H-89, y en particular la fosforilacion desapareda por completo en celulas tratadas con H-89 20 |iM (Fig. 31 C). Este resultado muestra la posibilidad de la inhibicion de la fosforilacion no espedfica de H-89.
A continuacion, con el fin de investigar la especificidad de la inhibicion de PKA, se realizo la comparacion entre las influencias de la supresion para la expresion espedfica de PKA de siRNA y el tratamiento con H-89 sobre la fosforilacion de serina de ERAP1 y la fosforilacion de PHB2/REA (S39). Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de PKA mediante el metodo de siRNA, y MCF-7 tratadas con H-89, se utilizaron en la investigacion. Como consecuencia de ello, la fosforilacion del residuo de serina de ERAP1 no se reconocio en absoluto en las celulas transfectadas con siPKA, independientemente de la presencia o ausencia de la estimulacion con E2. Por otro lado,
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en las celulas tratadas con H-89, se detecto la recuperacion de la fosforilacion de ERAP1 despues del tratamiento con E2 a baja concentracion, mientras que cuando la dosis de H-89 aumentaba, se confirmaba la desaparicion de la fosforilacion (Fig. 31D). Ademas, se reconocio en las celulas tratadas con siPKA que la fosforilacion de PHB2/REA se recuperaba cuando las celulas eran tratadas con E2. Por el contrario, en las celulas tratadas con H-89, la recuperacion de la fosforilacion se confirmo como en las celulas tratadas con siPKA, cuando la concentracion de H- 89 era baja, pero cuando la dosis de H-89 aumentaba, la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA tambien disminrna (Fig. 31D). Se ha mostrado hasta ahora que H-89 tambien actua sobre otras quinasas distintas a PKA (Science signaling 1, re4, 2008), y estos resultados tambien sugieren una posibilidad de inhibicion no espedfica de quinasas distintas a PKA. Entonces, se examinaron las influencias del tratamiento del inhibidor de PP1a, acido okadaico en la fosforilacion de PHB2/REA y la fosforilacion de Akt y MAPK. Con respecto a la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA en las celulas MCF-7, se reconocio que la fosforilacion de PHB2/REA dependiente de E2 era recuperada cuando las celulas se trataron con valor de IC50 de PP1a, es decir, 20 nM de acido okadaico, pero la fosforilacion se confirmo que disminrna con 40 nM (Fig. 31E). Este fenomeno tambien sugiere la posibilidad de que el acido okadaico podna inhibir de forma no espedfica la actividad ademas de PP1a.
A continuacion, se trato la identificacion de una quinasa fosforilante de PHB2/REA. El experimento descrito a continuacion se realizo utilizando PKCa como candidato como quinasa fosforilante de PHB2/REA a partir de los resultados descritos anteriormente de que la desaparicion de la fosforilacion de PHB2/REA por tratamiento con acido okadaico 40 nM fue confirmada; y se mostro que el acido okadaico inhida la actividad de PKC; ademas la secuencia en la proximidad de Ser39 de PHB2/REA fue altamente conservada tambien para PKA y PKCa; y PKCa es altamente expresado en el cancer de mama. Celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de PKCa por el metodo de siRNA fueron tratadas con E2 y el peptido ERAP1, y luego se fraccionaron en las fracciones del citoplasma y nucleares. A continuacion, se realizo el analisis de inmunotransferencia de cada fraccion. Como consecuencia, se reconocio que la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA disminrna notablemente en el nucleo y el citoplasma de las celulas tratadas con E2 y el peptido ERAP1 (Fig. 31F). De lo descrito anteriormente se sugirio la posibilidad de que PKCa podfa fosforilar a REA (S39). De los resultados anteriores se sugirio que PKA fosforilaba el residuo de serina de ERAP1, y como consecuencia, se acelero la actividad de fosfatasa de PP1a, y por lo tanto Ser39 de la union de PHB2/REA al complejo PP1a-ERAP1 se desfosforilo.
Estudio de si PP1a es un gen diana del RE o no
Basado en el hecho de que PP1a tiene funciones como unidad de catalizador de ERAP1, los presentes inventores construyeron una hipotesis de que PP1a podfa ser tambien uno de los genes diana de REa como ERAP1 en celulas de cancer de mama, y se realizo el experimento descrito a continuacion. Lmeas celulares positivas para ER, es decir, celulas MCF-7, celulas ZR-75-1, celulas T47D y celulas BT-474 se estimularon con E2 durante 24 horas, y luego el nivel de protema y el nivel de expresion ARNm de PP1a se examinaron con Western Blot y PCR a tiempo real (Fig. 32A, B). Como consecuencia se reconocio que la expresion de PP1a se aceleraba de manera dependiente de E2 en todas las lmeas celulares, tanto en el nivel de protema (Fig. 32A) como en el nivel del ARNm (Fig. 32B). Entonces, si ERE o no (elemento responsable de estrogenos, secuencia responsable de E2: AGGTCAnnnTGACCT) estaba presente en el gen PP1a (PPP1CA), fue buscado mediante el software de Genomatix (Genomatix Software, Munich, Alemania). Como consecuencia, las secuencias ERE conservadas se confirmaron en 3 puntos (Fig. 32C). Entonces, fue examinado si REa se urna o no directamente a esta secuencia de ERE estimado con el metodo de inmunoprecipitacion de la cromatina (metodo ChIP) usando el anticuerpo de REa. Como consecuencia, la union fue reconocida en una region que comprendfa desde el punto de inicio de la traduccion (-726) a -704 y una region que comprendfa desde +1936 hasta +1959 (Fig. 32D), pero la union no fue reconocida en una region +1851 hasta +1873 (Fig. 32D). El constructo 5'-ERE que comprende esta region estimada que comprende -726 a -704, y una construccion del vector de expresion que consiste en 5'-ERE y en tandem de la region de desde +1936 hasta +1959 (5'-ERE y el intron 2 ERE) fueron fabricados, respectivamente, y la actividad del indicador de luciferasa se examino (Fig. 32E). Como consecuencia, en las celulas en las que se introdujo el constructo 5'-ERE, se reconocio que la actividad de luciferasa se aceleraba 3 veces en comparacion con el control, y ademas en 5'-ERE y el constructo intron 2 ERE, se reconocio que la actividad del indicador de luciferasa se aceleraba 5 veces. De lo descrito anteriormente se sugirio que PP1a podfa ser uno de los genes diana de REa como ERAP1, y ser regulado por un mecanismo de retroalimentacion positiva en el que si se induda la activacion de REa de una manera dependiente de E2, la expresion de la misma se aceleraba.
Influencia del tratamiento con el peptido ERAP1 en la aceleracion de la expresion de protema y genica por la estimulacion de estrogenos
De los resultados hasta el momento se demostro que el peptido ERAP1 suprimfa la ruta de activacion genomica de RE dependiente de E2 y la ruta de activacion no genomica en celulas positivas para RE. Sin embargo, solo la influencia en la conocida ruta de activacion de RE ha sido estudiada hasta ahora, pero no estaba claro que expresion de gen o protema estaba influenciada por el genoma ampliamente. En consecuencia, fueron examinadas las expresiones de ARNm y proteicas en celulas MCF-7 despues de ser administrado E2 y el peptido ERAP1 con el analisis de microarrays/proteoma. Celulas MCF-7 fueron tratadas con el peptido ERAP1 o el peptido ERAP1- codificado (Peptido scr), y se recogieron las celulas despues de 1 hora de tratamiento, y se pusieron a disposicion del experimento. Como consecuencia, de manera notable, se reconocio que muchas protemas (Fig. 33A) y ARNm
(Fig. 33B) disminman significativamente, y el genoma ampliamente por la administracion del peptido ERAP1, en comparacion con el cambio de las expresiones cuando se administraba E2 o E2+ peptido ERAPI-codificado. Ademas, como se muestra en la Tabla 1, se encontro que las expresiones de muchos genes no mostrados hasta la fecha, incluyendo genes de respuesta de estrogeno conocidos y genes diana RE, fueron suprimidas simplemente 1 5 hora despues del tratamiento con el peptido ERAP1, y que las funciones de estos genes fueron de amplio espectro (Tablas 1 y 2). De los resultados anteriores, se encontro que la administracion del peptido ERAP1, que podfa inducir la funcion de supresion de PHB2/REA, supriirna las rutas de senal E2 desconocidas, ademas de la conocida ruta de senal E2.
Gen dependiente de estrogenos, cuya expresion es suprimida porel tratamiento con el peptido ERAP1
Ref. seq
Simbolo del gen Nivel de cambio Ref. seq Simbolo del gen Nivel de cambio Ref. seq Simbolo del gen Nivel de cambio Ref. seq Simbolo del gen Nivel de cambio
NM_020169
LXN 11.09 NM_001353 AKR1C1 7.79 N.002395 ME1 6.91 NM_133374 ZNF618 6.39
NM_020311
CXCR7 10.15 NM_018479 ECHDC1 7.73 NM_004363 CEACAM5 6.84 NM_001444 FABP5 6.38
NM_000067
CA2 9.87 NM_021073 BMP5 7.72 NM_00132 CTNND2 6.83 NM_003739 AKR1C3 6.37
XM_003119804
LOC100508679 9.85 NM_207355 POTEB 7.70 NM_006528 TFPI2 6.82 NM_004816 FAM189A2 6.33
NM_000101
CYBA 9.51 NM_032756 HPDL 7.68 NM_174981 POTED 6.82 NM_032883 TOX2 6.29
NM_033512
TSPYL5 9.50 NM_0032 90 TPM4 7.60 NM_030801 MAGED4B 6.80 NM_014646 LPIN2 6.27
NM_006806
BTG3 9.06 NM_001080506 TMEM150C 7.57 NM_173556 CCDC83 6.76 NM_173515 CNKSR3 6.27
NM_173551
ANKS6 9.00 NM_003506 FZD6 7.54 NM_003881 WISP2 6.73 NM_058173 MUCH 6.13
NM_002402
MEST 8.84 NM_031935 HMCN1 7.54 NM_020672 S100A14 6.73 NM_001740 CALB2 6.05
NM_007231
SLC6A14 8.73 NM_001039966 GPER 7.51 NR_015377 LOC654433 6.72 NM_005434 MALL 6.05
NM_015916
CALHM2 8.63 NM_015976 SNX7 7.48 NM_013453 SPANXA1 6.68 NM_001818 AKR1C4 6.00
NM_018665
DDX43 8.53 NM_001753 CAV1 7.44 NM_144586 LYPD1 6.66 NM_00101964 KLK6 5.98
NR_001564
XIST 8.53 NM_138711 PPARG 7.30 NM_178505 TMEM26 6.66 NM_000361 THBD 5.97
NM_144584
C1 or f59 8.43 NR_026869 NCRNA00052 7.27 NM_001233 CAV2 6.63 NM_138441 C6orf150 5.95
NM_001719
BMP7 8.40 NM_0058 56 RAMP3 7.25 NM_019076 UGT1A8 6.60 NM_000304 PMP22 5.93
Ref. seq
Simbolo del gen Nivel de cambio Ref. seq Simbolo del gen Nivel de cambio Ref. seq Simbolo del gen Nivel de cambio Ref. seq Simbolo del gen Nivel de cambio
NM_001008539
SLC7A2 8.32 NM_015668 RGS22 7.22 NM_020436 SALL4 6.60 NM_021116 ADCY1 5.92
NM_002239
KCNJ3 8.31 NM_001145077 LRRC10B 7.17 NR_002728 KCNQ10T1 6.60 NM_017679 BCAS3 5.92
NM_144947
KLK11 8.08 NM_017770 ELOVL2 7.14 NM_001080507 OOEP 6.57 NM_000624 SERPINA5 5.87
NM_006317
BASP1 8.01 NM_004321 KIF1A 7.12 NM_001010853 PM20D2 6.56 NM_005855 RAMP1 5.82
NM_145168
SDR42E1 8.01 NR_003245 HAR1B 7.11 NM_145664 SPANXB2 6.55 NM_025113 C13orf18 5.79
NM_001017372
SLC27A6 8.00 AK092688 LOC732272 7.09 NR_024418 LOC389332 6.52 NM_001072 UGT1A6 5.78
NM_000853
GSTT1 7.93 NM_144967 ARHGAP36 7.08 NM_005634 SOX3 6.52 NM_020815 PCDH10 5.78
NM_207308
NUP210L 7.84 NM_1446 01 CMTM3 7.06 NM_001008495 TMEM64 6.46 NM_006207 PDGFRL 5.77
NM_004586
RPS6KA3 7.84 NM_005668 ST8SIA4 6.99 NM_004982 KCNJ8 6.44 NM_020134 DPYSL5 5.76
NM_004734
DCLK1 7.84 NM_002356 MARCKS 6.99 NM_017422 CALML5 6.39 NM_003264 TLR2 5.74
Nivel de cambio: nivel de expresion del gen con la estimulacion de E2 solo/ nivel de expresion del gen con la estimulacion de E2 + tratamiento con el peptido
La Tabla 1 muestra los genes dependientes de estrogenos de los cuales la expresion fue suprimida por el tratamiento con el peptido ERAP1. Se enumeran los 100 genes principales cuya expresion fue fuertemente acelerada por la estimulacion de estrogenos en comparacion con los de 0 horas, y que fue suprimida por el peptido ERAP1.
5 [Tabla 2] Analisis GO del gen dependiente de estrogenos cuya expresion se suprimio por el tratamiento con el peptido ErAPI
Termino GO
T) < Q) O Termino GO Valor P
Respuesta a estfmulos de estrogenos
0,001 Respuesta a farmacos 0,013
Respuesta a estfmulos hormonales
0,002 Respuesta a estfmulos extracelulares 0,018
Respuesta a sustancias organicas
0,002 Transporte de acido monocarboxflico 0,019
Homeostasis de los lfpidos
0,002 Regulacion del tamano del vaso sangumeo 0,023
Regulacion de la ruta de senalizacion de la protema del receptor acoplada a protema G
0,002 Regulacion del tamano del tubo 0,025
Respuesta al estfmulo de la hormona esteroide
0,002 Respuesta a estfmulos abioticos 0,025
Respuesta a estfmulos endogenos
0,003 Proceso vascular en el sistema circulatorio 0,028
Respuesta a nutrientes
0,004 Transporte de lfpidos 0,030
Transporte de acidos carboxflicos
0,005 Organizacion de balsas de la membrana 0,030
Transporte de acidos organicos
0,005 Polimerizacion de microtubulos 0,032
Regulacion negativa de la proliferacion celular
0,007 Localizacion de lfpidos 0,037
Formacion de balsas de membrana
0,009 Respuesta a vitaminas 0,037
Circulacion sangumea
0,011 Ensamblaje del complejo de protema celular 0,038
Proceso del sistema circulatorio
0,011 Transporte de acidos biliares y la sal de bilis 0,040
Respuesta a niveles de nutrientes
0,013 Regulacion positiva de la ruta de senalizacion de la protema receptora acoplada a la protema G 0,046
Homeostasis de esteroles
0,013
La Tabla 2 muestra el analisis GO del gen dependiente de estrogenos cuya expresion fue suprimida por el tratamiento con el peptido ERAP1. El gen cuya expresion se vio fuertemente acelerada por la estimulacion de 10 estrogenos en comparacion con los de 0 horas, y suprimida por el peptido ERAP1, se sometio a analisis GO. Los datos fueron tratados estadfsticamente con la prueba exacta de Fisher.
Estudio de la union espedfica del peptido ERAP1 a PHB2/REA
Se demostro en el Ejemplo 1 que el peptido ERAP1 se une espedficamente a PHB2/REA, y en este ejemplo, se obtuvo el valor de Kd (la constante de velocidad de disociacion) como un mdice bioqmmico para la interaccion de los 15 dos. En primer lugar, fue examinada la union del peptido ERAP1 y PHB2/REA por Biacore. La protema PHB2/REA recombinante marcada con 6xHis se inmovilizo sobre un chip sensor. Entonces, el peptido ERAP1 marcado con HA a las concentraciones mostradas en la Fig. 34A se hizo reaccionar y, a continuacion el valor de Kd se calculo a partir de la curva del sensograma. Como consecuencia, el valor de Kd del peptido ERAP1 fue 18,9 |iM (Fig. 34A). Entonces, el valor de Kd de PHB2/REA se midio por el metodo de espectroscopia por correlacion de fluorescencia. 20 Se hicieron reaccionar el peptido ERAP1 marcados con FITC 10 nM, el peptido ERAP1-codificado FITC-marcado (Peptido scr), y la protema PHB2/REA recombinante 6xHis-marcado durante 1 hora, y luego se midio la fluorescencia FITC. Como consecuencia, el valor de Kd de la protema recombinante PHB2/REA fue de 14,4 |iM (Fig. 34B).
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Fabricacion del anticuerpo monoclonal anti-ERAPI
Se realizo la fabricacion del anticuerpo monoclonal anti-ERAPI. En primer lugar, se realizo la confirmacion de la especificidad del anticuerpo monoclonal purificado anti-ERAP1. Con el uso de celulas MCF-7 suprimidas para la expresion de ERAP1 por el metodo de siRNA, se realizo el analisis de inmunotransferencia con anticuerpo purificado anti-ERAPI. Como consecuencia, el anticuerpo anti-ERAPI purificado no fue reconocido para la banda no espedfica, y se detecto la banda ERAP1-espedfica (Fig. 35A). Posteriormente, se examino si el anticuerpo purificado anti-ERAPI podfa ser inmunoprecipitado o no. Los lisados de celulas MCF-7 (M) y celulas T47D (T) se inmunoprecipitaron con el anticuerpo purificado anti-ERAPI, y la coprecipitacion de la protema de union PHB2/REA fue reconocida (Fig. 35B). De lo descrito anteriormente se encontro que el anticuerpo monoclonal anti-ERAPI establecido esta vez podfa reconocer a ERAP1 espedficamente, y ser inmunoprecipitado.
Construccion del anticuerpo de PHB2/REA (S39) anti-fosforilacion
Se realizo la fabricacion de anticuerpo policlonal que reconoce espedficamente a Ser39 de PHB2/REA. La lmea celular de cancer de mama MCF-7 positiva para ER se trato con E2, y solo cuando se administro el peptido ERAP1, se detecto la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA por el anticuerpo fabricado anti-fosforilacion PHB2/REA (S39) (Fig. 36). De los resultados anteriores se sugirio que la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA se desfosforilo cuando PHB2/REA se urna a ERAP1, y la union de PHB2/REA y ERAP1 fue inhibida por el peptido ERAP1, y cuando PHB2/REA fue liberado de ERAP1, PHB2/REA fue fosforilado en Ser39.
La estabilidad del peptido ERAP1 y su influencia en el E2 celular
Se investigaron la estabilidad del peptido ERAP1 y su influencia en el E2 celular. En primer lugar, celulas MCF-7 fueron tratadas con E2 y el peptido ERAP1 HA-marcado, y luego se llevo a cabo el analisis de inmunotransferencia. Como consecuencia se encontro que el porcentaje residual del peptido ERAP1 era del 84%, en promedio, 24 horas despues de la administracion, y 56%, 58% y 54% despues de 30, 36 y 48 horas, respectivamente, y la semivida del peptido ERAP1 era generalmente de aproximadamente 30 horas (Fig. 37A). A continuacion, se investigo la influencia del peptido ERAP1 en la concentracion de E2 celular. Celulas MCF-7 fueron tratadas con E2 10 nM y el peptido ERAP1 10 |iM, y luego se recogio el lisado celular temporalmente, y se midio la concentracion de E2 celular. Como consecuencia, un valor maximo de aproximadamente 10 nM se muestra a las 6 horas despues de la administracion, que disminuyo a aproximadamente 80% despues de 48 horas (Fig. 37B).
Participacion de aminoacidos particulares de ERAP1 en la union a PHB2/REA
Se mostro en el Ejemplo 1 que tres aminoacidos, es decir, Q165, D169 y Q173 de ERAP1 eran importantes para la union a PHB2/REA. Por lo tanto, se investigo que aminoacido de entre estos tres aminoacidos era el mas importante para la union. Celulas COS-7 fueron transfectadas con cualquiera del constructo PHB2/REA y ERAP1-WT tipo normal (1-434 aa), un mutante de alanina de Q165, D169 y Q173 (mutante), un mutante de alanina de Q165 (Q165A), un mutante de alanina de D169 (D169A), un mutante de alanina de Q173 (Q173A), y un mutante de alanina de Q165 y D169 (Q165A, D169A). Luego, despues de 48 horas, se recogieron las celulas, y se realizaron la inmunoprecipitacion y el analisis de inmunotransferencia. Como consecuencia, la mas alta inhibicion de la union a PHB2/REA fue reconocida en el experimento usando el constructo mutante D169 (22% con IP de anticuerpo antiFLAG, y 0% con IP de anticuerpo anti-HA). Ademas, la siguiente inhibicion de la union mas alta fue reconocida cuando se utilizo el constructo mutante Q165 (60% con IP de anticuerpo anti-FLAG, 24% con IP de anticuerpo antiHA) (Fig. 38A). Posteriormente, con el fin de verificar estos resultados, se realizo un experimento similar con el mutante de alanina de Q165 y D169 (Q165A, D169A). Por lo tanto, el grado equivalente de la inhibicion de la union se confirmo en comparacion con el caso en el que se utilizo una construccion en la que todos los aminoacidos se mutaron con Ala, (Mutante: Q165A, D169A = 2%: 12%) (Fig. 38B). De lo descrito anteriormente se encontro que el rango de los aminoacidos que eran importantes para la union a PHB2/REA entre estos 3 aminoacidos era D169> Q165> Q173 y Q165 y D169 ocuparon el 90% de esta union.
Influencia de la fosforilacion de ERAP1 por PKA y PKB en la fosforilacion de PHB2/REA (S39) a traves de la regulacion de la actividad de PP1a (celulas KPL-3C)
A continuacion, en la misma forma que las celulas MCF-7 descritas anteriormente, los estados de fosforilacion de ERAP1 y PHB2/REA se investigaron en la lmea de celulas de cancer de mama KPL-3C positiva para ER. Primero, las celulas KPL-3C, en las que la expresion de ERAP1 o PP1a era suprimida por siRNA, se estimularon con E2 durante 24 horas, y luego ERAP1 y PHB2/REA se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-ERAP1 o anticuerpo anti- PHB2/REA. Ademas, con respecto a la muestra obtenida, se realizo el analisis de inmunotransferencia. En las celulas transfectadas con ARNsi de control, la fosforilacion de la serina y la treonina de ERAP1 por tratamiento con E2, y la desfosforilacion de Ser39 de PHB2/REA fueron reconocidas. Sin embargo, en las celulas suprimidas para la expresion de PP1a, ERAP1 no tuvo ninguna influencia sobre la fosforilacion de la serina y la treonina, pero la recuperacion de la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA se confirmo despues del tratamiento con E2 (Fig. 39A). Luego, con celulas KPL-3C suprimidas para la expresion de PKA con siRNA, la desaparicion de la fosforilacion del residuo de serina de ERAP1 fue reconocida, pero tambien la recuperacion de la fosforilacion del residuo de serina de Ser39 de PHB2/REA fue reconocida (Fig. 39B). Por otro lado, cuando se suprimio la expresion de PKB, no se
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reconocio la influencia sobre la fosforilacion del residuo de serina o el residuo de treonina de ERAP1. Por otro lado, la recuperacion de la fosforilacion de Ser39 de PHB2/REA fue reconocida en la misma forma que la supresion de la expresion de PKA (Fig. 39B). Posteriormente, en las celulas KPL-3C, tambien se investigo la influencia de la supresion de la expresion de PP1a, PKA, PKB o ERAP1 por siRNA en la actividad de la fosfatasa de PP1a. Como consecuencia, se confirmo que si la expresion de ERAP1 era suprimida, la actividad fosfatasa de PP1a se aceleraba independientemente de la presencia o ausencia de E2. Por otra parte, se reconocio que si se supriirnan las expresiones de PP1a, PKA y PKB, respectivamente, la actividad de la fosfatasa de PP1a disminma. De los resultados anteriores se sugirio que tambien en la lmea celular de cancer de mama positivo para RE KPL-3C, ERAP1 promovfa la aceleracion de la actividad de la fosfatasa de PP1a a traves de la fosforilacion del residuo de serina por PKA en la misma forma que las celulas MCF-7 y, como consecuencia, causaba la desfosforilacion de Ser39 de PHB2/REA.
Supresion de la proliferacion de lmeas celulares de cancer de mama negativas para REa por el peptido ERAP1
Se investigo el efecto de supresion de la proliferacion del peptido ERAP1 en lmeas celulares de cancer de mama negativas para REa. Las lmeas celulares de cancer de mama negativas para REa, las celulas SK-BR-3, fueron tratadas con el peptido ERAP1 o el peptido ERAPI-codificado (Peptido scr). A las 24 horas y 48 horas despues del tratamiento, se examino la influencia sobre la proliferacion celular. Como consecuencia se reconocio que el peptido ERAP1 tema un efecto de supresion de la proliferacion celular de manera dependiente de la dosis tanto a las 24 horas como a las 48 horas despues del tratamiento, aunque el grado del efecto fue menor en comparacion con el efecto de supresion del peptido ERAP1 en lmeas celulares positivas para ER (Fig. 40). A partir de lo descrito anteriormente, se reconocio que peptido ERAP1 tema un efecto de supresion de la proliferacion tambien en el cancer de mama negativo para RE y positivo para ERAP1.
Estudio de la produccion de ROS en las mitocondrias inducida por la estimulacion de E2 a traves ERAP1
Se realizo una investigacion para la localizacion de ERAP1 en las lmeas celulares de cancer de mama positivas para ER, celulas MCF-7. En el Ejemplo 1, se demostro que ERAP1 inherente en las celulas de cancer de mama se localizaba principalmente en el citoplasma, pero una localizacion en las mitocondrias tambien fue reconocida. Ademas, PHB2/REA, que es la protema de union de ERAP1, tambien se reconoce que se localiza en las mitocondrias. Por lo tanto, los presentes inventores se centraron en las funciones de ERAP1 en la mitocondria. En primer lugar, se investigaron las localizaciones de ERAP1 y PHB2/REA. Celulas MCF-7 fueron tratadas con E2 y el peptido ERAP1. A continuacion, las celulas se centrifugaron por gravedad espedfica para fraccionar en la fraccion de mitocondrias (M), la fraccion de citoplasma (C) y la fraccion nuclear (N). A continuacion, se realizo el analisis de inmunotransferencia de cada fraccion. Como consecuencia, se reconocio una alta localizacion de ERAP1 en las fracciones del citoplasma y de las mitocondrias. Por otra parte, se encontro que PHB2/REA tambien se localizaba de manera similar en las mitocondrias, y se translocaba al nucleo cuando el peptido ERAP1 se administraba (Fig. 41A). Posteriormente, con la consideracion de los papeles de ERAP1 y PHB2/REA en las mitocondrias, se investigo la produccion de ROS (especies reactivas de oxfgeno) en las mitocondrias a traves de ERAP1. Celulas MCF-7, celulas MCF-7 en las que se suprimio la expresion de ERAP1, y celulas HCC1395 fueron tratadas con DHR123 durante 15 minutos, y despues se estimularon con el peptido ERAP1 10 |iM y E2 durante 24 horas, y se analizaron por citometna de flujo. Como consecuencia, se observo en las celulas MCF-7 que la generacion de ROS era notablemente suprimida por la administracion del peptido ERAP1 en las celulas transfectadas con ARNsi de control. Sin embargo, se reconocio en las celulas en las que se suprimio la expresion de ERAP1 que la administracion del peptido ERAP1 no tuvo influencia en la generacion de ROS. Ademas, la observacion se realizo mediante lmeas de cancer de mama de celulas ER-positivo/ERAPI-negativo (celulas HCC1395) como control positivo. Sin embargo, no hubo ninguna deteccion significativa (Fig. 41B). Como se describio anteriormente, se sugirio que la produccion de ROS en las mitocondrias por la estimulacion de E2 en las mitocondrias de las celulas de cancer de mama era inducida a traves de ERAP1, y suprimida por el peptido ERAP1.
Aplicabilidad industrial
El peptido ERAP1 proporcionado por la presente invencion es util para el tratamiento del cancer. Mas espedficamente, el peptido de la presente invencion se puede esperar que tenga efectos terapeuticos por nuevos mecanismos en los canceres que sean positivos para el receptor de estrogeno, y en el que se exprese el polipeptido ERAP1. El peptido ERAP1 de la presente invencion esta especialmente dirigido a ERAP1, que es una protema que se expresa altamente y espedficamente en el cancer positivo para receptores de estrogeno. Por lo tanto, se espera que el peptido de la presente invencion tenga leves efectos secundarios. Ademas, se espera que el peptido de la presente invencion tenga efectos terapeuticos tambien en el cancer de mama resistente al tamoxifeno. Ademas, el peptido ERAP1 de la presente invencion por sf mismo suprime la proliferacion de celulas cancerosas, y ademas, tiene acciones de potenciar los efectos terapeuticos de los agentes de terapia hormonal o agentes de quimioterapia. Por lo tanto, el peptido ERAP1 de la presente invencion se puede utilizar en combinacion con otros agentes de terapia hormonal o agentes de quimioterapia, y por lo tanto se espera que proporcione un tratamiento mas eficaz del cancer. La presente descripcion tambien puede proporcionar un metodo de deteccion de un farmaco candidato para el tratamiento y/o la prevencion del cancer, que utiliza la inhibicion de la union del polipeptido ERAP1 al polipeptido PP1a, polipeptido PKA, o polipeptido PKB como un mdice, para contribuir al desarrollo de una nueva estrategia de tratamiento del cancer.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Un peptido que inhibe la union de polipeptido ERAP1 al polipeptido PHB2, que comprende una secuencia de aminoacidos descrita en cualquiera de los siguientes (a) y (b):
    (a) una secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 31; y
    (b) una secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 31 en la que uno, dos, o varios residuos de aminoacidos distintos de glutamina en la posicion 1, acido aspartico en la posicion 5, y glutamina en la posicion 9, estan sustituidos con otros residuos de aminoacidos.
  2. 2. El peptido de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de un grupo que consiste en (a) a (d) descrito a continuacion:
    (a) una secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 27;
    (b) una secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 27 en la que uno, dos o varios residuos de aminoacidos distintos de glutamina en la posicion 1, acido aspartico en la posicion 5 y glutamina en la posicion 9 estan sustituidos con otros residuos de aminoacidos;
    (c) una secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 30; y
    (d) una secuencia de aminoacidos descrita en SEQ ID NO: 30 en la que uno, dos o varios residuos de aminoacidos distintos de glutamina en la posicion 5, acido aspartico en la posicion 9 y glutamina en la posicion 13, estan sustituidos con otros residuos de aminoacidos ademas.
  3. 3. El peptido de acuerdo con reivindicacion 1 o 2, en el que el aminoacido consiste en 50 o menos residuos de aminoacidos.
  4. 4. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el peptido es modificado por una sustancia permeable de la membrana celular.
  5. 5. El peptido de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el peptido es modificado por una sustancia permeable de la membrana celular.
  6. 6. Un polinucleotido que codifica el peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
  7. 7. Un vector que comprende el polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6.
  8. 8. Una composicion farmaceutica que comprende el peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un polinucleotido que codifica el peptido.
  9. 9. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 8 para uso en el tratamiento y/o la prevencion del cancer.
  10. 10. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que el cancer es positivo para el receptor de estrogeno.
  11. 11. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10, en la que el cancer es un cancer de mama.
  12. 12. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 10 o 11, en la que el cancer es resistente al tamoxifeno.
  13. 13. Una composicion farmaceutica para:
    (a) potenciar los efectos terapeuticos de un agente de terapia hormonal en el cancer; o
    (b) suprimir la activacion del receptor de estrogeno en celulas positivas para el receptor de estrogeno, en donde la composicion farmaceutica comprende el peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un polinucleotido que codifica el peptido.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010143083A1 (en) 2009-06-09 2010-12-16 Koninklijke Philips Electronics N.V. Disposable spo2 grips
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
EP3406626A4 (en) * 2016-01-19 2020-02-19 Tokushima University PEPTIDE FOR CANCER TREATMENT, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CN107177666A (zh) * 2017-05-15 2017-09-19 中国医学科学院北京协和医院 基因作为生物标志物在结肠腺癌中的应用
CN111148752B (zh) * 2017-07-19 2024-01-16 国立大学法人德岛大学 肽衍生物和包含其的药物组合物
JPWO2020111167A1 (ja) * 2018-11-30 2021-10-28 国立大学法人徳島大学 Ｂｉｇ３−ｐｈｂ２相互作用阻害ｐｈｂ２由来ペプチドを含む乳がん治療薬
CA3214833A1 (en) * 2021-04-06 2022-10-13 Bpgbio, Inc. Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
CN114927165B (zh) * 2022-07-20 2022-12-02 深圳大学 泛素化位点的识别方法、装置、系统和存储介质

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US4631211A (en) 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
GB8516611D0 (en) 1985-07-01 1985-08-07 Du Pont Canada Fire-retardant sheet material
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
GEP20001968B (en) 1992-01-21 2000-03-05 Glaxo Spa Arilthio Compounds as Antibacterial and Antiviral Agents
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5804566A (en) 1993-08-26 1998-09-08 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5977322A (en) 1995-06-14 1999-11-02 The Regents Of The University Of California High affinity human antibodies to tumor antigens
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
AU7335396A (en) 1995-11-01 1997-05-22 Dnavec Research Inc. Membrane-fusible liposome with the use of recombinant sendai virus
JP2000516090A (ja) 1996-07-26 2000-12-05 スローン―ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 遺伝子的免疫化のための方法と試薬
EP1090924B8 (en) 1998-06-25 2007-11-21 Green Peptide Co., Ltd. Tumor antigen peptides originating in cyclophilin b
US20020103360A1 (en) 1998-09-01 2002-08-01 Yang Pan Novel protein related to melanoma-inhibiting protein and uses thereof
US7998695B2 (en) 2005-02-10 2011-08-16 Oncotherapy Science, Inc. Method of diagnosing bladder cancer
KR20090064378A (ko) 2006-08-10 2009-06-18 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤 유방암 관련 유전자 및 폴리펩티드
US20080107668A1 (en) * 2006-08-30 2008-05-08 Immunotope, Inc. Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer

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