CN107177666A - 基因作为生物标志物在结肠腺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基因作为生物标志物在结肠腺癌中的应用,本发明首次发现ARFGEF3基因在结肠腺癌患者中表达上调且下调ARFGEF3的表达水平可以改变结肠腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭,提示可将ARFGEF3用于开发早期诊断结肠腺癌的产品、治疗结肠腺癌的药物,本发明为精准医疗的推行提供了理论和实验基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及基因作为生物标志物在结肠腺癌中的应用,具体的涉及ARFGEF3作为生物标志物在结肠腺癌中的应用。
背景技术
结肠癌是西欧、北美等发达国家最常见的恶性肿瘤,也是我国九大常见恶性肿瘤之一,在我国其发病率呈现逐年上升的趋势。在我国,因结肠癌死亡者,男性居恶性肿瘤死亡的第5位,女性居第6位。据临床资料显示,结肠癌患者术后,大概有40%到50%的患者会因为复发或者恶化而导致死亡。结肠腺癌是结肠癌中最常见的一种,其发生发展涉及环境、基因、细胞类型、细胞信号通路、组织器官、免疫系统的调节等多个复杂的病理过程。
结肠腺癌起病隐匿,不易发现,大多患者就诊时已到中晚期,失去了最佳手术时机。有报道表明,早期结肠腺癌患者术后5年生存率约为90%,而晚期患者仅为15%。因而,早发现早诊断是肿瘤获得有效治疗的关键。临床上结肠腺癌的诊断主要依赖于实验室检查如大便隐血(FOBT)试验、细胞学诊断、组织病理学检查、血清癌胚抗原(CEA)测定等,纤维结肠镜检查,影像学诊断如结肠气钡双重造影、CT扫描、MRI、超声切面显像诊断、核素诊断,肠镜是结肠腺癌诊断最可靠的方法,但具有侵入性、费用昂贵,患者依从性差;CT和超声检查不易发现较小病变,对结肠腺癌的早期诊断受到一定限制;CEA是临床广泛应用的血清标志物,其敏感性和特异性较低,主要用于结肠腺癌患者的治疗监测。
近年来,随着分子生物学的不断发展,一些新的生物标志物已经出现,不仅对结肠腺癌的病理诊断提供了很大的帮助,并为其预后判断、治疗方案的选择提供了更全面的依据,在一定程度上发挥了独特的作用。进一步寻找与结肠腺癌相关的癌基因和抑癌基因作为评价其生物学行为的辅助指标和作为靶向治疗的靶点对于研究结肠腺癌具有重要的意义,同时也为精准医疗的实现提供了支持。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的之一,提供一种诊断产品,为实现结肠腺癌的早期诊断提供基础。
本发明的目的之二,提供一种用于结肠腺癌临床诊断和治疗以及机制研究的分子标志物。
本发明的目的之三,提供一种治疗手段和药物组合物,通过降低靶向分子的表达水平,实现结肠腺癌的精准分子治疗。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了检测ARFGEF3表达水平的试剂在制备诊断早期结肠腺癌的产品中的应用,其中,ARFGEF3在结肠腺癌患者中表达水平上调。
进一步,所述试剂选自:
特异性识别ARFGEF3的探针;或
特异性扩增ARFGEF3的引物;或
特异性结合ARFGEF3编码的蛋白的抗体或配体。
在本发明的具体实施例中,所述试剂是特异性扩增ARFGEF3的引物,引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种诊断结肠腺癌的产品,所述产品能够通过检测样本中ARFGEF3的表达水平来诊断早期结肠腺癌。所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、血清、血浆、唾液、尿、腹水、囊肿液、淋巴液等)、粪便等。为了一些应用,可使用培养的细胞或其它组织制备物。优选的,所述样本为组织、血液。
进一步,所述产品包括芯片、制剂或试剂盒;其中,所述基因芯片包括固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于ARFGEF3所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体,以及固定在固相载体上的ARFGEF3编码的蛋白的特异性抗体或配体。
本发明提供了ARFGEF3在筛选预防或治疗结肠腺癌潜在物质中的应用。
本发明提供了一种筛选预防或治疗结肠腺癌的潜在物质的方法,所述方法包括:
用候选物质处理表达或含有ARFGEF3基因或其编码的蛋白的体系;和
检测所述体系中ARFGEF3基因或其编码的蛋白的表达或活性;
其中,若所述候选物质可降低ARFGEF3基因的表达水平(优选显著降低,如低20%以上,较佳的低50%以上;更佳的低80%以上),则表明该候选物质是预防或治疗结肠腺癌的潜在物质。所述体系选自:细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
所述候选物质包括(但不限于):针对ARFGEF3基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。
在本发明中,所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验,以从候选物质中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗结肠腺癌有用的物质。
本发明提供了ARFGEF3在制备治疗结肠腺癌的药物组合物中的应用。
进一步,所述药物组合物包括ARFGEF3功能性表达的抑制剂,所述抑制剂选自:以ARFGEF3为靶序列、且能够抑制ARFGEF3基因表达的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物;或特异性与ARFGEF3编码的蛋白结合的结合分子(如能够抑制ARFGEF3蛋白活性的抗体或配体)。
优选的,所述的抑制剂为siRNA。在本发明的具体实施例中,siRNA的序列如SEQIDNO.9、SEQ IDNO.10所示。
进一步,所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明提供了一种治疗结肠腺癌的药物组合物,所述药物组合物包括:
ARFGEF3功能性表达的抑制剂;和
药学上可接受的载体。
进一步,所述ARFGEF3功能性表达的抑制剂选自:核酸抑制物,蛋白抑制剂,蛋白水解酶,蛋白结合分子,其能够在蛋白或基因水平上下调ARFGEF3基因或其编码的蛋白的表达或活性。
药学上可接受的载体包括(但不限于)缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。
附图说明
图1是利用QPCR检测ARFGEF3在结肠腺癌患者中的表达情况图;
图2是利用QPCR检测siRNA沉默结肠腺癌细胞中ARFGEF3基因图;
图3是利用蛋白免疫检测siRNA对结肠腺癌细胞中ARFGEF3蛋白的影响图;
图4是利用MTT法检测ARFGEF3对结肠腺癌细胞增殖的影响图;
图5是利用Transwell小室检测ARFGEF3对结肠腺癌细胞迁移的影响图;
图6是Transwell小室检测ARFGEF3对结肠腺癌细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究,通过高通量转录组测序方法,检测结肠腺癌标本中基因在结肠腺癌癌组织和癌旁组织中的表达水平,发现其中具有明显表达差异的基因,探讨其与结肠腺癌的发生之间的关系,从而为结肠腺癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选,本发明首次发现了结肠腺癌中ARFGEF3显著性上调。实验证明,siRNA干扰沉默ARFGEF3,能够有效地抑制结肠腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,提示ARFGEF3可作为靶向基因应用于结肠腺癌的诊疗中,为结肠腺癌的个性化治疗提供了新途径。
ARFGEF3基因
ARFGEF3基因位于6号染色体上,一种代表性的人ARFGEF3基因包括与目前国际公共核苷酸序列数据库GeneBank中ARFGEF3基因(NC_000006.12)所示。在本发明中,ARFGEF3基因包括野生型、突变型或其片段。
本发明的人ARFGEF3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本领域技术人员将认识到,本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失),在至少大约60%的核苷酸碱基、通常至少大约70%、更通常至少大约80%、优选至少大约90%、及更优选至少大约95-98%核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性,则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。
或者,当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时,则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时,存在杂交选择性。典型地,当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55%相同性、优选至少大约65%、更优选至少大约75%及最优选至少大约90%相同性时,发生选择性杂交。如本文所述,同源对比的长度可以是较长的序列节段,在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸,更通常为至少大约24个核苷酸,典型为至少大约28个核苷酸,更典型为至少大约32个核苷酸,及优选至少大约36或更多个核苷酸。
因此,本发明的多核苷酸与GeneBank所示的ARFGEF3的核苷酸序列优选具有至少70%、更优选至少75%、更优选至少85%、更优选至少90%同源性。更优选地,存在至少95%、更优选至少98%同源性。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解,测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在表达水平上检测生物标志物的表达水平。
检测技术
本发明的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测,这些技术包括但不限于:核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术、免疫技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到,由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击,因此在测序前通常将RNA逆表达成DNA。
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如,ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于:聚合酶链式反应(PCR)、逆表达聚合酶链式反应(RT-PCR)、表达介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到,某些扩增技术(例如,PCR)需要在扩增前将RNA逆表达成DNA(例如,RT-PCR),而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如,TMA和NASBA)。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环,以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数;TMA的表达介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝,其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝;LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸;其他扩增方法包括例如:通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增;使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增;基于表达的扩增方法;以及自我维持的序列扩增。
合适的免疫法包括夹心免疫测定,例如夹心ELISA,其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测;放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
根据本发明的免疫法可基于,例如,以下方法中的任一种。
免疫沉淀法是最简单的免疫测定方法;这种方法测量沉淀物的量,在试剂抗体已与样本一起孵育并与其中存在的靶抗原反应以形成不溶性团聚体之后形成所述沉淀。免疫沉淀反应可以是定性的或是定量的。
在颗粒免疫测定中,多种抗体与该颗粒连接,且所述颗粒能够同时结合很多抗原分子。这大大地加速了可见反应的速度。这允许生物标志物的快速且灵敏的检测。
在免疫比浊法(immunonephelometry)中,抗体和生物标志物上的靶抗原的相互作用引起免疫复合物的形成,所述免疫复合物太小而不能沉淀。但是,这些复合物将散射入射光,这可使用比浊计来测量。可在反应的几分钟之内测定抗原(即生物标志物)的浓度。
放射免疫测定(RIA)法使用放射性同位素例如I125来标记抗原或抗体。所使用的同位素发射γ射线,通常在除去非结合的(游离的)放射性标记之后测量所述射线。与其它的免疫测定相比较,RIA的主要优势在于更高的灵敏度、容易的信号检测和确认的、快速的测定。主要的劣势在于由放射物的使用引起的健康和安全风险和与维护许可放射物安全和处理程序相关的时间和费用。出于该原因,在常规临床实验室实践中,RIA已很大程度上被酶免疫测定所取代。
酶免疫测定(EIA)发展为放射免疫测定(RIA)的替代物。这些方法使用酶来标记抗体或靶抗原。EIA的灵敏度接近RIA的灵敏度,且不存在由放射性同位素引起的危险。用于检测的最广泛使用的EIA方法之一是酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA方法可使用两种抗体,其一对于靶抗原是特异性的,而另一与酶偶联,酶底物的添加引起化学发光信号或荧光信号的产生。
荧光免疫测定(FIA)指使用荧光标记或酶标记的免疫测定,所述荧光标记或酶标记作用在底物上以形成荧光产物。荧光测量固有地比比色(分光光度法的)测量更加灵敏。因此,FIA方法具有比利用吸收(光密度)测量的EIA方法更高的分析灵敏度。
化学发光免疫测定使用化学发光标记,当其被化学能激发时产生光;使用光检测器测量发射。
因此,可使用熟知的方法进行根据本发明的免疫法。在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。
芯片、试剂盒
在本发明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片;所述基因芯片包括固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于ARFGEF3所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体,以及固定在固相载体上的ARFGEF3编码的蛋白的特异性抗体或配体。
所述固相载体包括无机载体和有机载体,所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等;所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出,术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性,探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记,其范围包括引物。杂交方式,包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针,例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里,所谓“互补”,只要是杂交即可,可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选100%的同源性。这些探针可以是DNA,也可以是RNA,另外,可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid,肽核酸)、LNA(注册商标,locked nucleic acid,Bridged Nucleic Acid,交联化核酸)、ENA(注册商标,2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid,甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid,苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明的配体可包含能够特异性结合ARFGEF3的肽、抗体或其片段、或适配体或寡核苷酸。抗体可为能够特异性结合该ARFGEF3的单克隆抗体、多克隆抗体或其片段。
本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒可用于检测ARFGEF3基因或蛋白的表达水平,包含用于ARFGEF3检测和/或定量的本发明的配体、和/或芯片。任选的与试剂盒的说明书在一起。
试剂盒包括一种或多种无菌容器,这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。
本发明中试剂盒或芯片可用于检测包括ARFGEF3基因在内的多个基因(例如,与结肠腺癌相关的多个基因)的表达水平,将结肠腺癌的多个标志物同时进行检测,可大大提高结肠腺癌诊断的准确率。
抑制剂和药物组合物
基于发明人的发现,本发明提供了一种ARFGEF3的抑制剂,所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要,只要它抑制ARFGEF3基因的功能性表达即可,这些抑制剂作为对于下调ARFGEF3有用的物质,可用于预防或治疗结肠腺癌。
作为本发明的一种优选方式,所述ARFGEF3的抑制剂是一种ARFGEF3特异性的小干扰RNA分子。如本文所用,所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式,它含有一个正义链和一个反义链,这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此,举例来讲,互补的正义链和反义链是化学合成的,其后可通过退火杂交,产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时,本发明人通过大量的比对分析,从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列,并将它们分别通过转染试剂转染结肠腺癌细胞系进行验证,选出干扰效果最佳的siRNA,进一步地在细胞水平实验,结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中ARFGEF3基因的表达水平,以及结肠腺癌细胞的增殖。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成,也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒表达成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物,可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内,或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
作为本发明的另外一种优选方式,所述ARFGEF3的抑制剂是一种ARFGEF3编码蛋白的特异性抗体或配体。根据本发明的配体可包含能够特异性结合ARFGEF3的肽、抗体或其片段、或适配体或寡核苷酸。抗体可为能够特异性结合该ARFGEF3的单克隆抗体或其片段。根据本发明的配体可用可检测的标志物标记,例如发光标志物、荧光标志物或放射性标志物;替代地或另外,根据本发明的配体可用亲和标记物标记,如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或His(如6-His)标记物。
本文使用的术语“抗体”包括但不限于:多克隆抗体、单克隆抗体、双特定异性抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、片段(例如FAb、F(Ab')2、Fv、二硫键Fv、scFv、双抗体)、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体和以上任何一者的表位结合的片段。本文使用的术语“抗体”还指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即含有特异性结合抗原的抗体结合部位的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何分类(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚分类。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有有效量的所述的ARFGEF3的抑制剂,以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制结肠腺癌。任何前述的ARFGEF3的抑制剂均可用于药物组合物的制备。
如本文所用,所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体,如水、盐水、缓冲液。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。
本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等;优选的,所述给药方式是非肠道给予的。
优选的,可采用基因治疗的手段进行。比如,可直接将ARFGEF3的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者;或者,可通过一定的途径将携带ARFGEF3的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等,或siRNA或shRNA)递送到靶点上,并使之表达活性的ARFGEF3抑制剂,具体情况需视所述的抑制剂的类型而定,这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中,药物组合物包含至少一种抑制ARFGEF3基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的化疗剂,包括但不限于:微管激活剂、烷化剂、抗赘生抗代谢物、铂类化合物、DNA-烷化剂,抗肿瘤抗生素剂,抗代谢剂,微管蛋白稳定剂,微管蛋白去稳定剂,激素拮抗剂,拓扑异构酶抑制剂,蛋白激酶抑制剂,HMG-COA抑制剂,CDK抑制剂,细胞周期蛋白抑制剂,胱天蛋白酶抑制剂,金属蛋白酶抑制剂,反义核酸,三链螺旋DNA,核酸适体,和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。
可药用载体可包括但不限于:病毒、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相关的递送载剂可包括但不限于:脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆表达病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。
本发明的药物组合物还可与其他治疗结肠腺癌的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药,而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中,可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答,调整本发明药物组合物的剂量。
在本发明中,术语“包括”用于指短语“包括但不限于”,并与短语“包括但不限于”可以互换使用。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选与结肠腺癌相关的基因标志物
1、样品收集
各收集8例早期结肠腺癌患者的癌组织以及癌旁组织,所有患者手术前未接受过放疗、化疗,患者均知情同意,上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取,按说明书的具体步骤进行操作。利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μL,OD260/280介于1.8~2.2之间。
3、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
4、构建cDNA文库
利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建,具体操作按说明书进行。
5、上机测序
使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序,具体操作按说明书进行。
6、高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析,利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位,通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度,利用cuffdiff检测差异表达,当FDR<0.05时,认为mRNA显著差异表达。
7、结果
与癌旁组织相比,ARFGEF3在结肠腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。
实施例2 QPCR测序验证ARFGEF3基因的差异表达
1、对ARFGEF3基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式收集结肠腺癌组织和癌旁组织样本各60例。
2、RNA提取 步骤同实施例1。
3、QPCR检测:
(1)逆转录反应
采用25μl反应体系,每个样品取1μg总RNA作为模板RNA,在PCR管中分别加入以下组分:DEPC水,5×逆表达缓冲液,10mM dNTP,0.1mM DTT,30μM Oligo dT,200U/μl M-MLV,模板RNA。
按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆转录反应条件进行。
(2)聚合酶链式反应
设计ARFGEF3基因和管家基因GAPDH的扩增引物,由生工合成,ARFGEF3基因的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;管家基因GAPDH的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
配制以下反应体系:SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl,正反向引物(5μM)各1μl,模板cDNA 2.0μl,无酶水8.5μl,各项操作均于冰上进行。每个样本设置3个平行管,所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
扩增程序为:95℃ 60s,(95℃ 15s,60℃ 15s,72℃ 45s)×35个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物,在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图1所示,与癌旁组织相比,ARFGEF3基因在结肠腺癌组织中表达水平上调,差异具有统计学意义(P<0.05),同RNA-sep结果一致。
实施例3 ARFGEF3基因的沉默
1、细胞培养
人结肠腺癌细胞株SW480,在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养,使用含10%胎牛血清和1%P/S的培养基RPMI-1640。使用生长状态良好的细胞用于实验。
2、siRNA设计
针对ARFGEF3基因的siRNA序列:
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC):
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5),
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6);
siRNA1:
正义链:5’-AUCAGAAUCUGUUUCCAUGGA-3’(SEQ ID NO.7),
反义链:5’-CAUGGAAACAGAUUCUGAUGA-3’(SEQ ID NO.8);
siRNA2:
正义链:5’-ACUAUACCUAGAUCCAUAGGA-3’(SEQ ID NO.9),
反义链:5’-CUAUGGAUCUAGGUAUAGUGA-3’(SEQ ID NO.10);
siRNA3:
正义链为5’-UUGACAAACUUCAUAAGGCAC-3’(SEQ ID NO.11),
反义链为5’-GCCUUAUGAAGUUUGUCAAAG-3’(SEQ ID NO.12)
将细胞密度调整为按1×105/ml,在6孔细胞培养板中每孔加入2ml在37℃、5%CO2培养箱培养,当细胞汇合度达到90%时,进行转染;
在无双抗、含10%FBS的RPMI-1640培养基中,转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。
实验分为空白对照组(SW480)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1、siRNA2、siRNA3),其中阴性对照组siRNA与ARFGEF3基因的序列无同源性,浓度为20nM/孔,同时分别进行转染。
3、QPCR检测ARFGEF3基因的表达水平
3.1细胞总RNA的提取
利用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞RNA的提取,按说明书的具体步骤进行操作。
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,干扰ARFGEF3基因表达组与对照组之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示,相比SW480、转染空载siRNA-NC、siRNA1、siRNA3组,siRNA2组能够显著降低ARFGEF3的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 蛋白免疫印迹实验
采用western blot检测SW480细胞在转染干扰RNA前后细胞中ARFGEF3蛋白的差异表达,以GAPDH作为蛋白定量的内参,其中ARFGEF3多克隆抗体购自abcam公司。
1、细胞培养和转染 步骤同实施例3
2、蛋白免疫印迹检测
(1)使用裂解液(RIPA)与PMSF配置成的蛋白裂解液裂解SW480细胞;
(2)使用BCA法测定蛋白浓度,具体操作步骤参照CWBIO公司的BCA蛋白定量试剂盒上的说明进行;
(3)SDS-PAGE进行凝胶电泳。
3、统计学分析
根据凝胶图像中目的蛋白ARFGEF3条带及内参GAPDH条带的灰度值,计算出比值,得到目的蛋白的相对表达量,重复三次。
4、结果
结果如图3所示,转染siRNA2组的ARFGEF3蛋白含量显著低于空白对照组和siRNA-NC组。
实施例5 MTT法检测细胞增殖实验
1、细胞培养与转染 步骤同实施例3
2、MTT法检测细胞增殖
1)脂质体介导瞬时转染后的细胞及对照组细胞培养48h后,胰酶消化接种到96孔板中,每孔细胞数为5×103个。
2)分别在转染24h、48h、72h、96h、120h后加入10μl/孔MTT试剂,继续培养4h。
3)吸取孔内培养基,每孔加入150μl DMSO,震荡10min。
4)放入酶标仪中测定570nm波长处的OD值,绘制生长曲线。
实验分三组,分别是空白对照组、转染siRNA-NC组和转染siRNA2,每组设6个复孔。
3、结果
结果如图4所示:空白对照组同空载组无明显差异,而转染siRNA2组的细胞生长速度明显低于对照组的细胞生长速度,差异具有统计学意义(P<0.05),上述结果表明ARFGEF3的表达能够促进结肠腺癌细胞的生长。
实施例6 ARFGEF3基因对结肠腺癌细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测ARFGEF3基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养 步骤同实施例3。
2、细胞转染 步骤同实施例3。
3、步骤
1)细胞转染48h后,胰酶消化,用PBS洗细胞两次(2000rpm离心5min)收集1-5×105细胞。
2)细胞染色:加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞,加入10μl Annexin-V-FITC混匀后,加入5μl碘化丙啶(PI),混匀;室温避光孵育 5~15min。
3)流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测,结果用软件Mod Fit分析,观察凋亡细胞百分比。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用的t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果:
转染siRNA2组的细胞凋亡率为(0.121±0.003),转染siRNA-NC组的细胞凋亡率为(0.119±0.014),干扰组与对照组之间的细胞凋亡率无明显变化,表明ARFGEF3对结肠腺癌细胞的凋亡无影响。
实施例7 Transwell迁移实验检测细胞运动迁移能力
1、细胞培养 步骤同实施例3。
2、细胞转染 步骤同实施例3。
3、步骤:
(1)用无血清培养基湿润Transwell小室,于37℃下放置2h。
(2)细胞转染后48h用胰酶消化计数,将3×105个细胞用200μl无血清RPMI-1640培养液重悬,均匀接种于上室,下室中加入10%完全培养基,于37℃、5%CO2的培养箱中培养48h,取出滤膜。
(3)4%多聚甲醛固定,用苏木素液在60℃下染色60min。
(4)在光镜下,计数穿膜细胞数。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用的t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果:
如图5所示,转染siRNA2的结肠腺癌细胞穿膜数少于对照组,说明ARFGEF3促进结肠腺癌细胞SW480的迁移。
实施例8 小室迁移实验检测细胞运动侵袭能力
1、细胞培养 步骤同实施例3。
2、细胞转染 步骤同实施例3。
3、步骤:
(1)用无血清培养基湿润Transwell小室,于37℃下放置2h。
(2)滤膜上包被人工基底膜胶,并在孵箱中聚合2h。
(3)细胞转染后48h用胰酶消化计数,将1×106个细胞用200μl无血清RPMI-1640培养液重悬,均匀接种于上室,下室中加入10%完全培养基,于37℃、5%CO2的培养箱中培养48h,取出滤膜。
(4)4%多聚甲醛固定,用苏木素液在60℃下染色60min。
(5)在光镜下,计数穿膜细胞数。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用的t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果:
如图6所示,转染siRNA2的结肠腺癌细胞穿膜数少于对照组,说明ARFGEF3促进结肠腺癌细胞SW480的侵袭。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院北京协和医院 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 基因作为生物标志物在结肠腺癌中的应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcagagatg aaggagta 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggatgttgt cagtattg 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgggaaact gtggcgtgat gg 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
aucagaaucu guuuccaugg a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
cauggaaaca gauucugaug a 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
acuauaccua gauccauagg a 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
cuauggaucu agguauagug a 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
uugacaaacu ucauaaggca c 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
gccuuaugaa guuugucaaa g 21
Claims (10)
1.检测ARFGEF3表达水平的试剂在制备诊断早期结肠腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂选自:
特异性识别ARFGEF3基因的探针;或
特异性扩增ARFGEF3基因的引物;或
特异性结合ARFGEF3编码的蛋白的抗体或配体。
3.一种诊断早期结肠腺癌的产品,其特征在于,所述产品通过检测ARFGEF3表达水平来诊断早期结肠腺癌。
4.根据权利要求3所述的产品,其特征在于,所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。
5.ARFGEF3在筛选预防或治疗结肠腺癌潜在物质中的应用。
6.一种筛选预防或治疗结肠腺癌的潜在物质的方法,其特征在于,所述方法包括:
用候选物质处理表达或含有ARFGEF3基因或其编码的蛋白的体系;和
检测所述体系中ARFGEF3基因或其编码的蛋白的表达或活性;
其中,若所述候选物质可降低ARFGEF3基因的表达水平或活性,则表明该候选物质是预防或治疗结肠腺癌的潜在物质。
7.ARFGEF3在制备治疗结肠腺癌的药物组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述药物组合物包括ARFGEF3功能性表达的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
10.一种治疗结肠腺癌的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括:
ARFGEF3功能性表达的抑制剂;和
药学上可接受的载体。
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