ES2364078T3 - Gen y polipéptido relacionados con el cáncer de mama. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro de cribado en busca de un compuesto para el tratamiento o la prevención del cáncer de mama, y dicho método comprende las etapas de: (a) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o una secuencia que tiene al menos una homología del 80% respecto de SEQ ID NO: 25; y (3) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (b) detectar la actividad de unión entre el polipéptido y el compuesto de ensayo; y (c) seleccionar un compuesto que se une al polipéptido.
Description
Gen y polipéptido relacionados con el cáncer de
mama.
La invención se refiere al campo de las ciencias
biológicas, y más específicamente al campo de la terapia y el
diagnóstico del cáncer. En particular, la presente invención se
refiere a polipéptidos nuevos codificados por un gen B7330N
nuevo que está relacionado con el cáncer de mama. Además, la
invención, tal como se describe en la presente memoria, se refiere
al gen B7330N nuevo. Los genes y los polipéptidos descritos
en la presente memoria se pueden usar, por ejemplo, en el
diagnóstico del cáncer de mama, como moléculas objetivo para el
desarrollo de fármacos contra la enfermedad, y para atenuar el
crecimiento celular del cáncer de mama.
El cáncer de mama, una enfermedad genéticamente
heterogénea, es la neoplasia maligna más habitual en la mujer. Cada
año se informa en todo el mundo de una estimación de aproximadamente
800.000 casos nuevos (Parkin Dm, et al., 1999, CA Cancer J
Clin 49: 33-64). La mastectomía es la primera opción
concurrente para el tratamiento de esta enfermedad. A pesar de la
eliminación quirúrgica de los tumores primarios, se puede dar la
recidiva en sitios cercanos o lejanos debido a la micrometástasis
indetectable (Saphner T, et al., 1996, J Clin Oncol, 14,
2738-46) en el momento del diagnóstico. Normalmente
se administran agentes citotóxicos como terapia adyuvante tras la
cirugía dirigidos a destruir esas células residuales o
premalignas.
El tratamiento con agentes quimioterápicos
convencionales a menudo es empírico y se basa principalmente en
parámetros tumorales histológicos, y en la ausencia de una
comprensión mecanística específica. Los fármacos dirigidos a
objetivos específicos se están convirtiendo, por lo tanto, en el
tratamiento fundamental del cáncer de mama. Se ha demostrado que el
tamoxifeno y los inhibidores de la aromatasa, dos representantes de
esta clase, tienen una gran respuesta usados como adyuvantes o
quimioprevención en pacientes con cáncer de mama metastatizado
(Fisher B, et al., (1998) J Natl Cancer Inst, 90,
1371-88; Cuzick J, et al., (2002) Lancet 360,
817-24). Sin embargo, la desventaja es que solamente
los pacientes que expresan receptores de estrógenos son sensibles a
estos fármacos. Recientemente han surgido preocupaciones
relacionadas con sus efectos secundarios, en particular con respecto
a la posibilidad de provocar cáncer endometrial por el tratamiento
con tamoxifeno a largo plazo, así como el efecto perjudicial de
fracturas óseas en las mujeres post menopáusicas en pacientes a las
que se prescribe aromatasa (Coleman RE, et al., (2004)
Oncology. 18 (5 Supl. 3), 16-20).
Debido a la aparición de los efectos secundarios
y la resistencia al fármaco, obviamente es necesario investigar
objetivos moleculares nuevos para fármacos inteligentes selectivos
basándose en los mecanismos de acción caracterizados. Para alcanzar
este objetivo, se han analizado los perfiles de expresión de 77
tumores de mama, que incluyen 8 DCISs y 69 IDCs purificados por
medio de una combinación de una microdisección con
micro-rayo láser (LMM) y una micromatriz de cADN que
representa 27.648 genes. Los datos de estos experimentos no
solamente deberían proporcionar información importante sobre la
tumorigénesis mamaria, sino que también tienen un valor inestimable
para identificar genes candidatos cuyos productos podrían servir
como marcadores de diagnóstico y/o objetivos moleculares para el
tratamiento del cáncer de mama.
Los documentos WO 02/059377 A2 y WO 2004/078035
A2 describen GALNT6 (que corresponde a B7330N) como uno de varios
genes identificados que se sobreexpresan en el cáncer de mama.
El documento
EP-A-1 621 632 que corresponde al
documento WO 2006/013474 muestra la activación lineal de GALNT6
(GALNAc) en el cáncer de mama y el tumor de mama en comparación con
las células PBMN normales.
Además, el documento WO 2004/094636 describe
siARNs dirigidos contra GALNT6. Marcos (Journal of Histochemistry
and Cytochemistry, Histochemical Society, Nueva York; 51;
761-771 (2004)) y Bennett (JBC; 274;
25362-25370 (1999)) describen anticuerpos y
cebadores que se dirigen contra el polipéptido GALNT6.
En esta invención se aisló un gen nuevo, B7330N
que se sobreexpresaba de manera significativa en las células de
cáncer de mama por medio del perfil de expresión del cáncer de mama,
y se confirmó además que B7330N se sobreexpresaba en las células de
cáncer de mama mediante análisis de RT-PCR
semicuantitativa y análisis de transferencia de Northern. Se
demostró que el tratamiento de las células de cáncer de mama con
siARNs inhibió de manera eficaz la expresión de B7330N e inhibió el
crecimiento celular/tumoral del cáncer de mama. En conjunto, se
sugiere que B7330N, también denominado GALNT6, es un nuevo
candidato molecular destacado para el desarrollo de marcadores de
diagnóstico y el desarrollo de fármacos para el cáncer de mama.
Los estudios diseñados para revelar los
mecanismos de la carcinogénesis ya han facilitado la identificación
de objetivos moleculares para los agentes antitumorales. Por
ejemplo, los inhibidores de la farnesiltransferasa (FTIs) que se
desarrollaron inicialmente para inhibir la ruta de señalización del
crecimiento relacionada con Ras, cuya activación depende de la
farnesilación postraduccional, han sido eficaces en el tratamiento
de tumores dependientes de Ras en modelos animales (Sun J, et
al., Oncogene 16:1467-73 (1998)). Se han llevado
a cabo ensayos clínicos en humanos mediante el uso de una
combinación de fármacos antineoplásicos y un anticuerpo monoclonal
anti-HER2, trastuzumab, para antagonizar el receptor
del proto-oncogén HER2/neu; y se ha alcanzado una
respuesta clínica y una supervivencia global mejoradas de las
pacientes de cáncer de mama (Molina MA, et al., Cancer Res
61:4744-4749 (2001)). Se ha desarrollado un
inhibidor de tirosina quinasa, ST1-571, que inactiva
de manera selectiva las proteínas de fusión bcr-abl,
para tratar las leucemias mielógenas crónicas en las que la
activación constitutiva de la tirosina quinasa
ber-abl desempeña un papel crucial en la
transformación de los leucocitos. Se diseñan agentes de estas clases
para inhibir la actividad oncógena de productos génicos específicos
(O'Dwyer ME y Druker BJ, Curr Opin Oncol 12:594-7
(2000)). Por lo tanto, los productos génicos activados normalmente
en las células cancerosas pueden servir como objetivos potenciales
para el desarrollo de nuevos agentes antineoplásicos.
Se ha demostrado que los linfocitos T
citotóxicos CD8+ (CTLs) reconocen epítopos peptídicos derivados de
antígenos asociados a tumores (TAAs) presentados en la molécula de
la clase I del MHC, y lisan las células tumorales. Desde el
descubrimiento de la familia MAGE como el primer ejemplo de TAAs, se
han descubierto otros muchos TAAs mediante el uso de aproximaciones
inmunológicas (Boon, Int J Cancer 54: 177-80 (1993);
Boon y van der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996);
van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7
(1991); Brichard et al., J Exp Med 178:
489-95 (1993); Kawakami et al., J Exp Med
180: 347-52 (1994)). Algunos de los TAAs
descubiertos están ahora en la fase de desarrollo clínico como
objetivos de la inmunoterapia. Los TAAs descubiertos hasta ahora
incluyen MAGE (van der Bruggen et al., Science 254:
1643-7 (1991)), gp100 (Kawakami et al., J Exp
Med 180: 347-52 (1994)), SART (Shichijo et
al., J Exp Med 187: 277-88 (1998)), y
NY-ESO-1 (Chen et al., Proc
Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997)). Por otra
parte, los productos génicos que se ha demostrado que están
sobreexpresados de manera específica en las células tumorales, se ha
demostrado que son reconocidos como objetivos que inducen respuestas
inmunitarias celulares. Tales productos génicos incluyen p53 (Umano
et al., Brit J Cancer 84: 1052-7 (2001)),
HER2/neu (Tanaka et al., Brit J Cancer 84:
94-9 (2001)), CEA (Nukaya et al., Int J
Cancer 80: 92-7 (1999)), etc.
A pesar del progreso significativo en la
investigación básica y clínica relacionada con los TAAs (Rosenberg
et al., Nature Med 4: 321-7 (1998); Mukherji
et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82
(1995); Hu et al., Cancer Res 56: 2479-83
(1996)), solamente hay disponible un número limitado de TAAs
candidatos para el tratamiento de adenocarcinomas, que incluyen el
cáncer colorrectal. Los TAAs expresados abundantemente en las
células cancerosas, y al mismo tiempo aquellos cuya expresión se
limita a las células cancerosas, serían candidatos prometedores como
objetivos inmunoterapéuticos. Además, se espera que la
identificación de nuevos TAAs que induzcan respuestas inmunitarias
antitumorales potentes y específicas estimule el uso clínico de la
estrategia de vacunación con péptidos en diversos tipos de cáncer
(Boon y van der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9
(1996); van der Bruggen et al., Science 254:
1643-7 (1991); Brichard et al., J Exp Med
178: 489-95 (1993); Kawakami et al., J Exp
Med 180: 347-52 (1994); Shichijo et al., J
Exp Med 187: 277-88 (1998); Chen et al., Proc
Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997); Harris, J Natl
Cancer Inst 88: 1442-55 (1996); Butterfield et
al., Cancer Res 59: 3134-42 (1999); Vissers
et al., Cancer Res 59: 5554-9 (1999); van der
Burg et al., J Immunol 156: 3308-14 (1996);
Tanaka et al., Cancer Res 57: 4465-8 (1997);
Fujie et al., Int J Cancer 80: 169-72 (1999);
Kikuchi et al., Int J Cancer 81: 459-66
(1999); Oiso et al., Int J Cancer 81: 387-94
(1999)).
Se ha informado reiteradamente que las células
mononucleares de sangre periférica (PBMCs) estimuladas con péptidos
de ciertos donantes sanos producen niveles significativos de
IFN-\gamma en respuesta al péptido, pero rara vez
ejercen citotoxicidad contra células tumorales de una manera
limitada a HLA-A24 o -A0201 en ensayos de liberación
de ^{51}Cr (Kawano et al., Cancer Res 60:
3550-8 (2000); Nishizaka et al., Cancer Res
60: 4830-7 (2000); Tamura et al., Jpn J
Cancer Res. 92: 762-7 (2001)). Sin embargo, tanto
HLA-A24 como HLA-A0201 son uno de
los alelos más habituales de HLA en la población japonesa, así como
en la población caucásica (Date et al., Tissue Antigens 47:
93-101 (1996); Kondo et al., J Immunol 155:
4307-12 (1995); Kubo et al., J Immunol 152:
3913-24 (1994); Imanishi et al., Proceeding
of the eleventh International Histocompatibility Workshop and
Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992); Williams
et al., Tissue Antigen 49: 129 (1997)). Así, los péptidos
antigénicos de los cánceres presentados por estos HLAs pueden ser
especialmente útiles para el tratamiento de cánceres en las
poblaciones japonesa y caucásica. Además, se sabe que la inducción
de CTL de baja afinidad in vitro resulta normalmente del uso
del péptido a concentración elevada, lo que genera un nivel elevado
de complejos péptido/MHC específicos en las células presentadoras de
antígenos (APCs), lo cual activará de manera eficaz estos CTL
(Alexander-Miller et al., Proc Natl Acad Sci
USA 93: 4102-7 (1996)).
Para aislar objetivos moleculares nuevos para
los tratamientos del cáncer de mama, se investigaron los perfiles
precisos de expresión genómica de 77 casos con cáncer de mama
premenopáusico mediante el uso de una combinación de micromatriz de
cADN y microdisección con micro-rayo láser. Entre
los genes activados, se identificó B7330N, también denominado
UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina:
polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 6
(GALNT6), que estaba sobreexpresado al triple en 27 de 77
(35%) casos de cáncer de mama de los que se pudieron obtener datos
de la expresión. La RT-PCR semicuantitativa
posterior confirmó que B7330N estaba activado en 7 de 12 muestras
clínicas de cáncer de mama y 7 de 20 líneas celulares de cáncer de
mama, en comparación con los órganos humanos normales que incluían
células ductales de mama o mama normal. Los análisis de
transferencia de Northern revelaron que el transcrito de B7330N se
expresaba solamente en líneas celulares de cáncer de mama y
placenta, páncreas, estómago, tráquea, glándula mamaria y médula
ósea humanas normales. La tinción inmunocitoquímica demuestra que
la localización subcelular de B7330N exógena apareció en forma de un
patrón granuloso en las vesículas de secreción de las células COS7.
La inducción de cADN de B7330N en las células COS7 condujo a la
secreción del producto génico en los medios de cultivo y dio como
resultado un incremento del crecimiento celular. El tratamiento de
las células de cáncer de mama con ARNs pequeños de interferencia
(siARNs) inhibió de manera eficaz la expresión de B7330N e inhibió
el crecimiento celular/tumoral de las líneas celulares de cáncer de
mama, T47D y BT-20, lo que indica que este gen
desempeña un papel clave en la proliferación del crecimiento celular
de una manera autocrina. Las pruebas combinadas indican que B7330N
representa un candidato prometedor para el desarrollo de la terapia
de selección de objetivos moleculares, y podría servir como un
marcador tumoral destacado de diagnóstico para pacientes con cáncer
de mama.
B7330N codifica una proteína de 622 aminoácidos.
Según un análisis de transferencia de Northern, se demostró que la
expresión de B7330N se limitaba a las líneas celulares de cáncer de
mama y a placenta, páncreas, estómago, tráquea, glándula mamaria y
médula ósea humanas normales.
Muchos fármacos antineoplásicos no son solamente
tóxicos para las células cancerosas, sino también para las células
que crecen normalmente. Sin embargo, los agentes que inhiben la
expresión de B7330N no pueden afectar de manera adversa a
otros órganos debido al hecho de que la expresión normal de B7330N
está limitada a la placenta, páncreas, estómago, tráquea, glándula
mamaria y médula ósea, y así se puede usar de manera conveniente
para el tratamiento o la prevención del cáncer de mama.
Así, se describe en la presente memoria un gen
aislado, B7330N, que sirve como candidato a marcador de
diagnóstico para el cáncer de mama así como de objetivo potencial
prometedor para el desarrollo de estrategias nuevas para el
diagnóstico y para el desarrollo de agentes antineoplásicos
eficaces. Además, se describe en la presente memoria un polipéptido
codificado por este gen, así como la producción y el uso del mismo.
De manera más específica, se describe en la presente memoria el
polipéptido humano nuevo, B7330N, o un equivalente funcional del
mismo, cuyas expresiones están elevadas en las células de cáncer de
mama.
El polipéptido B7330N incluye una proteína de
622 aminoácidos codificada por el marco de lectura abierto de SEQ ID
NO: 24 ó 26. El polipéptido B7330N incluye preferiblemente la
secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 25. La presente
solicitud también proporciona una proteína aislada codificada a
partir de al menos una porción de la secuencia polinucleotídica de
B7330N, o de secuencias polinucleotídicas al menos un 15% y
más preferiblemente al menos un 25% complementarias respecto de la
secuencia expuesta en SEQ ID NO: 24 ó 26.
La presente invención proporciona además un gen
humano nuevo B7330N cuya expresión está notablemente elevada
en la gran mayoría de cánceres de mama en comparación con el
epitelio ductal de mama no canceroso. El gen B7330N aislado
incluye una secuencia polinucleotídica como se describe en SEQ ID
NO: 24 ó 26. En particular, el cADN de B7330N incluye 4381 ó
4556 nucleótidos que contienen un marco de lectura abierto de 1869
nucleótidos (SEQ ID NO: 24 ó 26). La invención, tal como se describe
en la presente memoria, abarca además los polinucleótidos que
hibridan con, y que son al menos un 15% y más preferiblemente al
menos un 25% complementarios respecto a, la secuencia
polinucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 24 ó 26, hasta el punto de
que codifican una proteína B7330N o un equivalente funcional de la
misma. Los ejemplos de tales polinucleótidos son las moléculas
degeneradas y los mutantes alélicos de B7330N codificados por la
secuencia de sEq ID NO: 24 ó 26.
Tal como se usa en la presente memoria, un gen
aislado es un polinucleótido cuya estructura no es idéntica a la de
cualquier polinucleótido que se da de manera natural o a la de
cualquier fragmento de un polinucleótido genómico que se da de
manera natural que abarca más de tres genes distintos. El término,
por lo tanto, incluye, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la
secuencia de parte de una molécula de ADN genómico que se da de
manera natural en el genoma del organismo en el que se da de manera
natural; (b) un polinucleótido incorporado en un vector o en el ADN
genómico de un procariota o eucariota de manera que la molécula
resultante no es idéntica a ningún vector o ADN genómico que se da
de manera natural; (c) una molécula diferente tal como cADN, un
fragmento genómico, un fragmento producido mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción; y (d)
una secuencia nucleotídica recombinante que es parte de un gen
híbrido, es decir, un gen que codifica un polipéptido de fusión.
Por lo tanto, en un aspecto, se describe en la
presente memoria un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido o un fragmento del mismo. Preferiblemente, el
polinucleótido aislado incluye una secuencia nucleotídica que es al
menos un 60% idéntica a la secuencia nucleotídica mostrada en SEQ ID
NO: 24 ó 26. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico
aislada es al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica a la secuencia
nucleotídica mostrada en SEQ ID NO: 24 ó 26. En el caso de un
polinucleótido aislado que es más largo o equivalente en longitud a
la secuencia de referencia, p. ej., SEQ ID NO: 24 ó 26, la
comparación se realiza con la longitud completa de la secuencia de
referencia. Cuando el polinucleótido aislado es más corto que la
secuencia de referencia, p. ej., más corto que SEQ ID NO: 24 ó 26,
la comparación se realiza con un segmento de la secuencia de
referencia de la misma longitud (excluyendo cualquier bucle
necesario para el cálculo de la homología).
También se describe en la presente memoria un
método para producir una proteína transfectando o transformando una
célula hospedadora con una secuencia polinucleotídica que codifica
la proteína B7330N, y expresando la secuencia polinucleotídica.
Además, también se describen en la presente memoria vectores que
comprenden una secuencia nucleotídica que codifica la proteína
B7330N, y células hospedadoras que albergan polinucleótidos que
codifican la proteína B7330N. Tales vectores y células hospedadoras
se pueden usar para producir la proteína B7330N.
También se describe en la presente memoria un
agente de unión que reconoce de manera específica la proteína
B7330N. Por ejemplo, un agente de unión puede ser un anticuerpo
generado hacia una proteína B7330N. De manera alternativa, un
agente de unión puede ser un ligando específico para la proteína, o
un polipéptido sintético que se une de manera específica a la
proteína (véase, p. ej., el documento WO2004044011). También se
describe en la presente memoria un polinucleótido antisentido (p.
ej., ADN antisentido), ribozima, y siRNA (ARN pequeño de
interferencia) del gen B7330N.
La presente invención proporciona además un
método para diagnosticar el cáncer de mama que incluye la etapa de
determinar el nivel de expresión del gen en una muestra biológica de
un sujeto, comparar el nivel de expresión del gen B7330N con
el nivel de una muestra normal, y definir que un nivel de expresión
elevado del gen B7330N en la muestra indica que el sujeto
padece o corre el riesgo de desarrollar cáncer de mama.
Además, se describe en la presente memoria un
método para cribar en busca de un compuesto para el tratamiento o la
prevención del cáncer de mama. El método incluye poner en contacto
el polipéptido B7330N con los compuestos de ensayo, y seleccionar
los compuestos de ensayo que se unen o que inhiben la actividad
biológica del polipéptido B7330N.
Además, se describe en la presente memoria un
método para cribar en busca de un compuesto para el uso en el
tratamiento o la prevención del cáncer de mama, en el que el método
incluye poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula que
expresa el polipéptido B7330N o a la que se le ha introducido un
vector que comprende la región reguladora transcripcional de
B7330N en posición 5' respecto de un gen indicador, y
seleccionar el compuesto de ensayo que inhibe el nivel de expresión
o la actividad del gen indicador.
También se describe en la presente memoria un
método de cribado en busca de un compuesto para el uso en el
tratamiento o la prevención del cáncer de mama, en el que el método
incluye poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido
B7330N, o una célula que expresa el polipéptido B7330N, y
seleccionar el compuesto de ensayo que inhibe el nivel de
glicosilación del polipéptido B7330N. En estas realizaciones, el
nivel de glicosilación es el de la asparagina 476 del polipéptido
B7330N.
También se describe en la presente memoria una
composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o la
prevención del cáncer de mama. La composición farmacéutica puede
ser, por ejemplo, un agente antineoplásico. La composición
farmacéutica puede comprender al menos una porción de
S-oligonucleótidos antisentido, moléculas de siRNA o
ribozimas contra la secuencia polinucleotídica de B7330N mostrada y
descrita en SEQ ID NO: 24 ó 26, respectivamente. Los objetivos de
siRNA adecuados son una secuencia de SEQ ID NOs: 18 ó 22. Así, un
siRNA tal como se describe en la presente memoria comprende una
secuencia nucleotídica de SEQ ID NOs: 18 ó 22. Esto se puede
seleccionar de manera preferible como objetivo para el tratamiento o
la prevención del cáncer de mama según la invención tal como se
describe en la presente memoria. Las composiciones farmacéuticas
pueden ser también aquellas que comprenden los compuestos
seleccionados mediante los presentes métodos de cribado en busca de
compuestos para el tratamiento o la prevención de enfermedades
proliferativas celulares tales como el cáncer de mama.
El curso de acción de la composición
farmacéutica es idealmente inhibir el crecimiento de las células
cancerosas tales como las células de cáncer de mama. La composición
farmacéutica se puede aplicar a mamíferos, lo que incluye seres
humanos y animales domesticados.
La Figura 1 muestra los resultados de los
análisis mediante RT-PCR semicuantitativa y
transferencia de Northern. Expresión de B7330N en (a) células
tumorales de pacientes de cáncer de mama y tejidos humanos normales,
(b) líneas celulares de cáncer de mama; HBC4, HBC5,
HBL-100, HCC1937, MCF-7,
MDA-MB-231, SKBR3, T47D, YMB1 (panel
superior), BT-20, BT-474,
BT-549, HCC1143, HCC1500, HCC1599,
MDA-MB-157,
MDA-MB-435s,
MDA-MB-453,
OCUCB-FandZR-75-1
(panel inferior) y glándula mamaria. Análisis de transferencia de
Northern de los transcritos de B7330N en diversos tejidos humanos
(c), y líneas celulares de cáncer de mama y órganos vitales humanos
normales (d).
La Figura 2 (a) muestra la localización
subcelular de la proteína B7330N exógena. La Figura 2 (b) muestra la
expresión exógena de la proteína B7330N mediante un análisis de
transferencia de Western.
La Figura 3 (a) muestra el tratamiento con
N-glicosidasa de la proteína B7330N. La Figura 3 (b)
muestra el análisis de transferencia de Western con B7330N de tipo
natural, mutante N476A, y mutante N611A en lisados celulares. La
Figura 3 (c) muestra el efecto de la N-glicosilación
sobre la secreción de la proteína B7330N.
La Figura 4 muestra el efecto inhibidor del
crecimiento de ARNs pequeños de interferencia (siARNs) diseñados
para reducir la expresión de B7330N en células T47D y en células
BT-20. La Figura 4 (a) muestra la
RT-PCR semicuantitativa que demuestra la inhibición
de la expresión endógena de B7330N en líneas celulares de cáncer de
mama, T47d y BT-20. Se usó GAPDH como control
interno. La Figura 4 (b) muestra el ensayo de MTT que demuestra una
disminución del número de colonias mediante la eliminación de B7330N
en células T47D y en células BT-20. La Figura 4 (c)
muestra el ensayo de formación de colonias que demuestra la
disminución del número de colonias mediante la eliminación de B7330N
en células T47D y en células BT-20.
La Figura 5 muestra la detección del efecto
autocrino de B7330N. a, Los cultivos de COS7 en medio que contenía
B7330N mostraron un aumento del crecimiento celular en comparación
con las células COS7 en un medio sin B7330N. b, Disminución del
crecimiento de las células de cáncer de mama tras la exposición a
pAb anti-B7330N. Las células se expusieron durante
5 días a IgG de conejo pre-inmune o pAb
anti-HIG2, a concentraciones de 10,2 mg/mL. El
histograma muestra los valores medios de tres experimentos,
\pmDE.
La Figura 6 muestra la
homo-dimerización de las proteínas B7330N. Análisis
mediante inmunoprecipitación de células COS-7
transfectadas con Mock y
pCAGGS-B7330N-HA y
pcDNA3.1-B7330N-myc.
Figura 7. Expresión de B7330N en líneas
celulares de cáncer de mama y en cortes de tejido. a, Expresión de
la proteína B7330N endógena en líneas celulares de cáncer de mama en
comparación con la línea celular HMEC, examinada mediante análisis
de transferencia de Western con el uso de un anticuerpo
anti-B7330N purificado por afinidad. b, Dos líneas
celulares de cáncer de mama, SKBR3 y T47D se tiñeron
inmunocitoquímicamente con anticuerpo anti-B7330N
(rojo) y DAPI (azul) para distinguir el núcleo (véase la sección de
Materiales y Métodos). c, Resultados de la tinción
inmunohistoquímica de cortes de tejido de cáncer de mama (571T y
164T) mama normal (425N). La proteína B7330N endógena se tiñó
mediante el uso de un pAb anti-B7330N. La expresión
apenas se detectó en los tejidos de mama normal (425N), pero las
células cancerosas se tiñeron intensamente en el citoplasma en
todos los tejidos cancerosos investigados, que incluyen los tejidos
intraductales (164T) y papilo-tubulares (571T). Las
figuras representativas fueron a partir de la observación
microscópica con el aumento original, superior; x 100 e inferior; x
200. d, Resultados de la tinción inmunohistoquímica de los órganos
vitales normales. La proteína B7330N endógena se tiñó mediante el
uso de un pAb anti-B7330N. No se observó expresión
en el corazón, pulmón, hígado, riñón y páncreas.
Figura 8. Efecto estimulador del crecimiento de
B7330N exógena en las células NIH3T3. a, Análisis de transferencia
de Western de las células que expresaban B7330N exógena a nivel
elevado o de las transfectadas con un vector simulado. La
introducción exógena de la expresión de B7330N se validó con un
anticuerpo monoclonal anti-marcador de HA. La
\beta-actina sirvió como control de carga. b,
Crecimiento in vitro de células
NIH3T3-B7330N. Células NIH3T3 transfectadas con
WT-B7330N (WT-B7330N -1, y -2) y con
vector simulado (N7H3T3-Mock-1 y
-2), medidas mediante el ensayo de MTT.
\vskip1.000000\baselineskip
Las palabras "un", "uno" y "el",
tal como se usan en la presente memoria, significan "al menos
uno", a menos que se indique específicamente de otra manera. En
toda esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que aparecen
a continuación, a menos que el contexto lo requiera de otra manera,
se entenderá que la palabra "comprender", y las variaciones
tales como "comprende" y "que comprende", implican la
inclusión de una entidad o etapa mencionadas o grupo de entidades o
etapas, pero sin la exclusión de cualquier otra entidad o etapa o
grupo de entidades o
etapas.
etapas.
Para revelar los mecanismos del cáncer de mama e
identificar nuevos marcadores de diagnóstico y/o objetivos para
fármacos para el tratamiento y/o la prevención de estos tumores, los
presentes inventores analizaron los perfiles de expresión de genes
en el cáncer de mama mediante el uso de una micromatriz de cADN de
todo el genoma combinada con una microdisección con
micro-rayo láser. Como resultado, se identificó que
B7330N estaba sobreexpresado en las células de cáncer de
mama. Además, la inhibición de la expresión del gen B7330N
con ARNs pequeños de interferencia (siRNAs) dio como resultado una
inhibición significativa del crecimiento de las células cancerosas.
Estos hallazgos indican que B7330N otorga actividades oncógenas a
las células cancerosas, y que la inhibición de la actividad de estas
proteínas podría ser una estrategia prometedora para el tratamiento
y la prevención de enfermedades proliferativas tales como los
cánceres de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de B7330N se describe en la presente
memoria. El cADN de B7330N consiste en 4381 ó 4556 nucleótidos que
contienen un marco de lectura abierto de 1869 nucleótidos (SEQ ID
NO: 24 ó 26; Nº de acceso de GenBank AB265820). Estos marcos de
lectura abiertos codifican una proteína de 622 aminoácidos.
Así, se describen en la presente memoria los
polipéptidos sustancialmente puros codificados por estos genes que
comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, así como
los equivalentes funcionales de los mismos, hasta el punto de que
codifican una proteína B7330N. Los ejemplos de polipéptidos
funcionalmente equivalentes a B7330N incluyen, por ejemplo, las
proteínas homólogas de otros organismos que corresponden a la
proteína B7330N humana, así como los mutantes de las proteínas
B7330N humanas.
La expresión "funcionalmente equivalente",
tal como se describe en la presente memoria, significa que el
polipéptido en cuestión tiene actividad para estimular la
proliferación celular como la proteína B7330N y para conferir
actividad oncógena a las células cancerosas. El hecho de si el
polipéptido en cuestión tiene una actividad de proliferación celular
o no, se puede juzgar introduciendo el ADN que codifica el
polipéptido en cuestión en una célula, expresando el polipéptido
respectivo y detectando la estimulación de la proliferación de las
células o el incremento de la actividad de formación de colonias.
Tales células incluyen, por ejemplo, NIH3T3, COS7 y HEK293.
Los métodos de preparación de polipéptidos
funcionalmente equivalentes respecto de una proteína dada son muy
conocidos para una persona experta en la técnica, e incluyen los
métodos conocidos de introducción de mutaciones en la proteína. Por
ejemplo, un experto en la técnica puede preparar polipéptidos
funcionalmente equivalentes a la proteína B7330N humana
introduciendo una mutación adecuada en la secuencia de aminoácidos
de estas proteínas mediante mutagénesis dirigida
(Hashimoto-Gotoh et al., Gene
152:271-5 (1995); Zoller y Smith, Methods Enzymol
100: 468-500 (1983); Kramer et al., Nucleic
Acids Res. 12: 9441-56, (1984). Kramer y Fritz,
Methods Enzymol 154: 350-67 (1987); Kunkel, Proc
Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985); Kunkel, et
al., Methods Enzymol 204: 125-39 (1991)). Las
mutaciones de aminoácidos también se pueden dar en la naturaleza. El
polipéptido descrito en la presente memoria incluye las proteínas
que tienen las secuencias de aminoácidos de la proteína B7330N
humana en la que uno o más aminoácidos están mutados, con tal de que
los polipéptidos mutados resultantes sean funcionalmente
equivalentes a la proteína B7330N humana. El número de aminoácidos a
mutar en tal mutante es generalmente de 10 aminoácidos o menos,
preferiblemente 6 aminoácidos o menos, y más preferiblemente 3
aminoácidos
o menos.
o menos.
Se sabe que las proteínas mutadas o modificadas,
las proteínas que tienen secuencias de aminoácidos modificadas
mediante la sustitución, deleción, inserción y/o adición de uno o
más residuos de aminoácidos de una cierta secuencia de aminoácidos,
conservan la actividad biológica original (Mark et al., Proc
Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller y Smith,
Nucleic Acids Res 10: 6487-500 (1982);
Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci
USA 79: 6409-13 (1982)).
El residuo de aminoácido a mutar se muta
preferiblemente hasta un aminoácido diferente en el que se conservan
las propiedades de la cadena lateral del aminoácido (un proceso
conocido como sustitución conservativa de aminoácidos). Los
ejemplos de las propiedades de las cadenas laterales de los
aminoácidos son los aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y,
V), los aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), y
las cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o
características comunes: una cadena lateral alifática (G, A, V, L,
I, P); una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T, Y);
una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M); una
cadena lateral que contiene ácido carboxílico y amida (D, N, E, Q);
una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena
lateral que contiene un resto aromático (H, F, Y, W). Obsérvese que
las letras entre paréntesis indican los códigos de una letra de los
aminoácidos.
Un equivalente funcional preferible de la
proteína B7330N tal como se describe en la presente memoria conserva
un sitio de glicosilación de la misma. Por ejemplo, se confirmó que
la proteína B7330N estaba glicosilada en 476N. Por lo tanto, en las
realizaciones preferidas, un equivalente funcional de la proteína
B7330N consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende 476N o
un homólogo a 476N en una secuencia homóloga. La secuencia de
aminoácidos del equivalente funcional de una proteína B7330N en una
posición homóloga a la posición 476ª se puede determinar comparando
las secuencias de aminoácidos. No es necesario que la posición en
una proteína de interés sea la posición 476ª. Por ejemplo, en el
caso de una proteína que tiene la estructura de la proteína B7330N
que se ha modificado, por ejemplo, mediante una adición, inserción
y/o deleción de uno o más aminoácidos, la posición homóloga puede
ser una posición distinta de la posición 476ª. En tal proteína, para
determinar una posición homóloga a la posición 476ª en la proteína
B7330N, las secuencias de aminoácidos de ambas proteínas se alinean
de forma que coinciden los aminoácidos mutuos así como los
aminoácidos que tienen propiedades tan similares como sea posible,
insertando huecos adecuados en ambas secuencias de aminoácidos si es
necesario. Así, se puede determinar qué posición en una proteína de
interés corresponde a una posición homóloga a la posición 476ª de la
proteína B7330N. Los expertos en la técnica conocen dicho método, y
se puede llevar a cabo fácilmente mediante el uso de programas
informáticos disponibles comercialmente o publicados, por ejemplo,
el programa informático analítico GENETYX-MAC VER.
10 (Software), etc.
Un ejemplo de un polipéptido al cual se añaden
uno o más residuos de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de
la proteína B7330N humana es una proteína de fusión que contiene la
proteína B7330N humana. Las proteínas de fusión, las fusiones de la
proteína B7330N humana y otros péptidos o proteínas están incluidos
en la presente invención. Las proteínas de fusión se pueden hacer
mediante técnicas muy conocidas para un experto en la técnica, por
ejemplo uniendo el ADN que codifica la proteína B7330N humana de la
invención con ADN que codifica otros péptidos o proteínas, de forma
que los marcos de lectura coinciden, insertando el ADN de fusión en
un vector de expresión y expresándolo en un hospedador. No existe
limitación en cuanto a los péptidos o las proteínas fusionadas a la
proteína de la presente invención.
Los péptidos conocidos que se pueden usar como
péptidos que se fusionan a la proteína de la presente invención
incluyen, por ejemplo, FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6:
1204-10 (1988)), 6xHis que contiene seis residuos de
His (histidina), 10xHis, aglutinina de la gripe (HA), fragmento de
c-myc humana, fragmento de VSP-GP,
fragmento de p18HIV, marcador de T7, marcador de HSV, marcador de E,
fragmento del antígeno SV40T, marcador de lck, fragmento de
\alpha-tubulina, marcador de B, fragmento de la
Proteína C y similares. Los ejemplos de proteínas que se pueden
fusionar a una proteína de la invención incluyen GST
(glutation-S-transferasa),
aglutinina de la gripe (HA), región constante de inmunoglobulina,
\beta-galactosidasa, MBP (proteína de unión a
maltosa) y similares.
Se pueden preparar proteínas de fusión
fusionando ADN disponible comercialmente, que codifica los péptidos
o proteínas de fusión discutidas anteriormente, con el ADN que
codifica el polipéptido de la presente invención y expresando el
ADN fusionado preparado.
Un método alternativo conocido en la técnica
para aislar polipéptidos funcionalmente equivalentes es, por
ejemplo, el método que usa una técnica de hibridación (Sambrook
et al., Molecular Cloning 2ª ed. 9.47-9.58,
Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)). Un experto en la técnica
puede aislar fácilmente un ADN que tiene una homología elevada con
todo o parte de la secuencia de ADN que codifica la proteína B7330N
humana (es decir, SEQ ID NO: 24 ó 26), y aislar polipéptidos
funcionalmente equivalentes a la proteína B7330N humana a partir del
ADN aislado. Los polipéptidos descritos en la presente memoria
incluyen aquellos que están codificados por ADN que hibrida con todo
o parte de la secuencia de ADN que codifica la proteína B7330N
humana, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína B7330N
humana. Estos polipéptidos incluyen homólogos de mamíferos que
corresponden a la proteína derivada de seres humanos (por ejemplo,
un polipéptido codificado por un gen de mono, rata, conejo y ganado
bovino). Al aislar un cADN sumamente homólogo al ADN que codifica la
proteína B7330N humana a partir de animales, es especialmente
preferible usar tejidos de células de cáncer de mama y placenta,
páncreas, estómago, traquea, glándula mamaria y médula ósea humanas
normales.
Las condiciones de hibridación para el
aislamiento de un ADN que codifica un polipéptido funcionalmente
equivalente a la proteína B7330N humana pueden ser seleccionadas de
manera rutinaria por una persona experta en la técnica. Por ejemplo,
la hibridación se puede llevar a cabo realizando una prehibridación
a 68ºC durante 30 min o más mediante el uso del "tampón
Rapid-hyb" (Amersham LIFE SCIENCE), añadiendo una
sonda marcada, y calentando a 68ºC durante 1 hora o más. La
siguiente etapa de lavado se puede llevar a cabo, por ejemplo, en
condiciones de rigurosidad baja. Las condiciones de rigurosidad
baja son, por ejemplo, 42ºC, SSC 2x, 0,1% de SDS, o preferiblemente
50ºC, SSC 2x, 0,1% de SDS. Más preferiblemente, se usan condiciones
de rigurosidad elevada. Unas condiciones de rigurosidad elevada son,
por ejemplo, lavar 3 veces en SSC 2x, 0,01% de SDS a temperatura
ambiente durante 20 min, después lavar 3 veces en SSC 1x, 0,1% de
SDS a 37ºC durante 20 min, y lavar dos veces en SSC 1x, 0,1% de SDS
a 50ºC durante 20 min. Sin embargo, diversos factores, tales como la
temperatura y la concentración salina, pueden influir en la
rigurosidad de la hibridación, y un experto en la técnica puede
seleccionar de manera adecuada los factores para conseguir la
rigurosidad necesaria.
En lugar de la hibridación, se puede utilizar un
método de amplificación génica, por ejemplo, el método de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), para aislar un ADN que codifica un
polipéptido funcionalmente equivalente a la proteína B7330N humana,
mediante el uso de un cebador sintetizado basándose en la
información de secuencia del ADN que codifica la proteína (SEQ ID
NO: 24 ó 26).
Los polipéptidos que son funcionalmente
equivalentes a la proteína B7330N humana codificados por el ADN
aislado por medio de las técnicas de hibridación anteriores o las
técnicas de amplificación génica anteriores tienen normalmente una
homología elevada respecto de la secuencia de aminoácidos de la
proteína B7330N humana. "Homología elevada" se refiere en
general a una homología del 40% o más, preferiblemente 60% o más,
más preferiblemente 80% o más, aún más preferiblemente 85%, 90%,
93%, 95%, 98%, 99% o más entre una secuencia polipeptídica o una
secuencia polinucleotídica y una secuencia de referencia. El
porcentaje de homología (también denominado porcentaje de identidad)
se lleva a cabo generalmente entre dos secuencias alineadas de
manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para la
comparación son muy conocidos en la técnica. La alineación óptima de
secuencias y la comparación se puede llevar a cabo, p. ej., mediante
el uso del algoritmo de "Wilbur y Lipman, Proc Natl Acad Sci USA
80: 726-30 (1983)".
Un polipéptido tal como se describe en la
presente memoria tiene variaciones en la secuencia de aminoácidos,
el peso molecular, el punto isoeléctrico, la presencia o ausencia de
cadenas de hidrocarburos, o la forma, dependiendo de la célula o el
hospedador usado para producirlo o el método de purificación
utilizado. No obstante, con tal de que tenga una función equivalente
a la de la proteína B7330N descrita en la presente memoria, estará
dentro del alcance de la invención.
El polipéptido descrito en la presente memoria
se puede preparar como una proteína recombinante o una proteína
natural mediante métodos muy conocidos para los expertos en la
técnica. Se puede preparar una proteína recombinante insertando un
ADN que codifica el polipéptido descrito en la presente memoria (por
ejemplo, el ADN que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID
NO: 24 ó 26) en un vector de expresión adecuado, introduciendo el
vector en una célula hospedadora adecuada, obteniendo el extracto, y
purificando el polipéptido sometiendo el extracto a cromatografía,
p. ej., cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase
inversa, filtración en gel o cromatografía de afinidad mediante la
utilización de una columna a la que se fijan anticuerpos hacia la
proteína descrita en la presente memoria, o combinando más de una
de las columnas anteriormente mencionadas.
Además, cuando el polipéptido descrito en la
presente memoria se expresa en células hospedadoras (por ejemplo,
células animales y E. coli) en forma de una proteína de
fusión con la proteína
glutatión-S-transferasa o en forma
de una proteína recombinante complementada con múltiples histidinas,
la proteína recombinante expresada se puede purificar mediante el
uso de una columna de glutatión o una columna de níquel. De manera
alternativa, cuando el polipéptido descrito en la presente memoria
se expresa en forma de una proteína marcada con
c-myc, múltiples histidinas o FLAG, se puede
detectar y purificar mediante el uso de anticuerpos hacia
c-myc, His o FLAG, respectivamente.
Después de purificar la proteína de fusión,
también es posible excluir regiones distintas del polipéptido
objetivo cortando con trombina o factor-Xa, según
sea necesario.
\newpage
Se puede aislar una proteína natural mediante
métodos conocidos para una persona experta en la técnica, por
ejemplo, poniendo en contacto la columna de afinidad, en la que
están unidos anticuerpos que se unen a la proteína B7330N descritos
más adelante, con el extracto de tejidos o células que expresan el
polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser
anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.
También se incluyen los polipéptidos parciales
de los polipéptidos descritos en la presente memoria.
El péptido parcial tiene una secuencia de
aminoácidos específica del polipéptido de la presente invención y
consiste en al menos 7 aminoácidos, preferiblemente 8 aminoácidos o
más, y más preferiblemente 9 aminoácidos o más. El péptido parcial
se puede usar, por ejemplo, para preparar anticuerpos hacia el
polipéptido descrito en la presente memoria cribando en busca de un
compuesto que se une al polipéptido descrito en la presente memoria,
y cribando en busca de inhibidores del polipéptido descrito en la
presente memoria.
Se puede producir un péptido parcial tal como se
describe en la presente memoria mediante ingeniería genética,
mediante métodos conocidos de síntesis peptídica o digiriendo el
polipéptido de la invención con una peptidasa adecuada. Para la
síntesis peptídica, por ejemplo, se puede usar la síntesis en fase
sólida o la síntesis en fase líquida.
También se describen en la presente memoria
otros polinucleótidos que codifican los polipéptidos de B7330N
descritos anteriormente. Los polinucleótidos descritos en la
presente memoria se pueden usar para la producción in vivo o
in vitro del polipéptido descrito anteriormente, o se pueden
aplicar a la terapia génica para enfermedades que se atribuyen a una
anormalidad genética en el gen que codifica la proteína descrita en
la presente memoria. Se puede usar cualquier forma del
polinucleótido descrito en la presente memoria con tal de que
codifique el polipéptido descrito en la presente memoria, lo que
incluye mARN, ARN, cADN, ADN genómico, polinucleótidos sintetizados
químicamente. El polinucleótido descrito en la presente memoria
incluye un ADN que comprende una secuencia nucleotídica dada así
como sus secuencias degeneradas, con tal de que el ADN resultante
codifique un polipéptido como se describe en la presente
memoria.
El polinucleótido descrito en la presente
memoria se puede preparar mediante métodos conocidos para una
persona experta en la técnica. Por ejemplo, el polinucleótido
descrito en la presente memoria se puede preparar: preparando una
biblioteca de cADN a partir de células que expresan el polipéptido
de la presente invención, y llevando a cabo una hibridación mediante
el uso de una secuencia parcial del ADN de la presente invención
(por ejemplo, SEQ ID NO: 24 ó 26) como sonda. Se puede preparar una
biblioteca de cADN, por ejemplo, mediante el método descrito en
Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989); de manera alternativa, se pueden usar
bibliotecas de cADN disponibles comercialmente. También se puede
preparar un biblioteca de cADN: extrayendo los ARNs de células que
expresan el polipéptido de la presente invención, sintetizando oligo
ADNs basados en la secuencia del ADN descrito en la presente memoria
(por ejemplo, SEQ ID NO: 24 ó 26), llevando a cabo una PCR mediante
el uso de los oligo ADNs como cebadores, y amplificando los cADNs
que codifican la proteína de la presente invención.
Además, mediante la secuenciación de los
nucleótidos del cADN obtenido, se puede determinar de manera
rutinaria la región de traducción codificada por el cADN, y se puede
obtener fácilmente la secuencia de aminoácidos del polipéptido
descrito en la presente memoria. Además, cribando la biblioteca de
ADN genómico mediante el uso del cADN obtenido o de partes del mismo
como una sonda, se puede aislar el ADN genómico.
Más específicamente, primero se pueden preparar
los mARNs a partir de una célula, tejido u órgano (p. ej., una
célula de cáncer de mama y placenta, páncreas, estómago, tráquea,
glándula mamaria y médula ósea humanas normales) en los que se
expresa el polipéptido en cuestión de la invención. Se pueden usar
métodos conocidos para aislar los mARNs; por ejemplo, se puede
preparar el ARN total mediante ultracentrifugación con guanidina
(Chirgwin et al., Biochemistry 18:5294-9
(1979)) o el método AGPC (Chomczynski y Sacchi, Anal Biochem
162:156-9 (1987)). Además, se puede purificar el
mARN a partir el ARN total mediante el uso del mRNA Purification Kit
(Pharmacia) y similares. De manera alternativa, se puede purificar
directamente el mARN mediante el QuickPrep mRNA Purification Kit
(Pharmacia).
El mARN obtenido se usa para sintetizar cADN
mediante el uso de una transcriptasa inversa. Se puede sintetizar
cADN mediante el uso de un equipo disponible comercialmente, tal
como AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA
Synthesis Kit (Seikagaku Kogyo). De manera alternativa, se puede
sintetizar cADN y amplificarlo siguiendo el método
5'-RACE (Frohman et al., Proc Natl Acad Sci
USA 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky et al.,
Nucleic Acids Res. 17: 2919-32 (1989)), que usa un
cebador y, tal como se describe en la presente memoria, el equipo
5'-Ampli FINDER RACE (Clontech), y una reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
Se prepara un fragmento de ADN deseado a partir
de los productos de PCR y se liga en un vector de ADN. Los vectores
recombinantes se usan para transformar E. coli y similares, y
se prepara un vector recombinante deseado a partir de una colonia
seleccionada. La secuencia de nucleótidos del ADN deseado se puede
verificar mediante métodos convencionales, tales como la
terminación de cadenas con didesoxinucleótidos.
Se puede diseñar la secuencia nucleotídica de un
polinucleótido descrito en la presente memoria para que se exprese
de manera más eficaz teniendo en cuenta la frecuencia del uso de los
codones en el hospedador a usar para la expresión (Grantham et
al., Nucleic Acids Res. 9: 43-74 (1981)). La
secuencia del polinucleótido descrito en la presente memoria se
puede alterar mediante un equipo disponible comercialmente o
mediante un método convencional. Por ejemplo, la secuencia se puede
alterar mediante la digestión con enzimas de restricción, la
inserción de un oligonucleótido sintético o un fragmento
polinucleotídico adecuado, la adición de un espaciador, o la
inserción del codón de iniciación (ATG) y/o el codón de parada (TAA,
TGA o TAG).
\global\parskip0.870000\baselineskip
De manera específica, el polinucleótido descrito
en la presente memoria abarca el ADN que comprende la secuencia
nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26.
Además, también se describe en la presente
memoria un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con
un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:
24 ó 26, y que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente a
la proteína B7330N descrita anteriormente. Un experto en la técnica
puede elegir de manera adecuada las condiciones rigurosas. Por
ejemplo, se pueden usar condiciones de rigurosidad baja. Más
preferiblemente, se pueden usar condiciones de rigurosidad elevada.
Estas condiciones son las mismas que se describieron anteriormente.
El ADN que hibrida mencionado anteriormente es preferiblemente un
cADN o un ADN cromosómico.
También se describe en la presente memoria un
polinucleótido que es complementario al polinucleótido que codifica
la proteína B7330N humana (SEQ ID NO: 24 ó 26) o la cadena
complementaria del mismo, y que comprende al menos 15 nucleótidos.
El polinucleótido descrito en la presente memoria es preferiblemente
un polinucleótido que hibrida de manera específica con el ADN que
codifica el polipéptido B7330N descrito en la presente memoria. La
expresión "hibrida de manera específica", tal como se usa en la
presente memoria, significa que no se da de manera significativa una
hibridación cruzada con el ADN que codifica otras proteínas, en las
condiciones de hibridación habituales, preferiblemente en
condiciones de hibridación rigurosas. Tales polinucleótidos incluyen
sondas, cebadores, nucleótidos y derivados de nucleótidos (por
ejemplo, oligonucleótidos antisentido y ribozimas), que hibridan de
manera específica con el ADN que codifica el polipéptido descrito en
la presente memoria o su cadena complementaria. Además, se puede
utilizar tal polinucleótido para la preparación de un chip de
ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe en la presente memoria un
vector y una célula hospedadora en la que se introduce un
polinucleótido de la invención. Un vector como se describe en la
presente memoria es útil para mantener un polinucleótido,
especialmente un ADN, como se describe en la presente memoria en la
célula hospedadora, para expresar el polipéptido descrito en la
presente memoria, o para administrar el polinucleótido descrito en
la presente memoria para la terapia génica.
Cuando E. coli es la célula hospedadora y
el vector se amplifica y se produce en gran cantidad en E.
coli (p. ej., JM109, DH5\alpha, HB101 o XL1Blue), el vector
debería tener un "ori" para ser amplificado en E. coli y
un gen marcador para seleccionar las colonias de E. coli
transformadas (p. ej., un gen de resistencia a fármacos seleccionado
mediante un fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, kanamicina,
cloranfenicol o similares). Por ejemplo, se pueden usar los vectores
de la serie M13, los vectores de la serie pUC, pBR322, pBluescript,
pCR-Script, etc. Además, también se pueden usar
pGEM-T, pDIRECT y pT7 para subclonar y extraer el
cADN así como los vectores descritos anteriormente. Cuando se usa un
vector para producir la proteína descrita en la presente memoria, es
especialmente útil un vector de expresión. Por ejemplo, un vector de
expresión a ser expresado en E. coli debería tener las
características anteriores para ser amplificado en E. coli.
Cuando se usa E. coli, tal como JM109, DH5\alpha, HB101 o
XL1 Blue, como célula hospedadora, el vector debería tener un
promotor, por ejemplo, el promotor lacZ (Ward et al., Nature
341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7
(1992)), promotor araB (Better et al., Science 240:
1041-3 (1988)), promotor T7 o similares, que pueden
expresar de manera eficaz el gen deseado en E. coli. A este
respecto, se puede usar pGEX-5X-1
(Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP y pET (en este
caso, el hospedador es preferiblemente BL21 que expresa la ARN
polimerasa de T7), por ejemplo, en vez de los vectores anteriores.
Además, el vector puede contener también una secuencia señal para la
secreción del polipéptido. Una secuencia señal ejemplar que dirige
el polipéptido a ser secretado al periplasma de E. coli es la
secuencia señal pelB (Lei et al., J Bacteriol. 169: 4379
(1987)). Los medios para introducir los vectores en las células
hospedadoras seleccionadas como objetivo incluyen, por ejemplo, el
método de cloruro cálcico y el método de electroporación.
Además de E. coli, por ejemplo, se pueden
usar vectores de expresión derivados de mamíferos (por ejemplo,
pcDNA3 (Invitrogen) y pEF-BOS (Mizushinna S y Nagata
S., Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8),
vectores de expresión derivados de células de insecto (por ejemplo,
el "sistema de expresión de baculovirus
Bac-to-BAC" (GIBCO BRL),
pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (p. ej., pMH1,
pMH2), vectores de expresión derivados de virus animales (p. ej.,
pHSV, pMV, pAdexLcw), vectores de expresión derivados de retrovirus
(p. ej., pZIpneo), vectores de expresión derivados de levaduras (p.
ej., "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11,
SP-Q01) y vectores de expresión derivados de
Bacillus subtilis (p. ej., pPL608, pKTH50) para producir el
polipéptido descrito en la presente memoria.
Para expresar el vector en células animales,
tales como células CHO, COS o NIH3T3, el vector debería tener un
promotor necesario para la expresión en tales células, por ejemplo,
el promotor de SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108
(1979)), el promotor de MMLV-LTR, el promotor de
EF1\alpha (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322
(1990)), el promotor de CMV y similares, y preferiblemente un gen
marcador para seleccionar los transformantes (por ejemplo, un gen
de resistencia a fármacos seleccionado mediante un fármaco (p. ej.,
neomicina, G418)). Los ejemplos de vectores conocidos con estas
características incluyen, por ejemplo, pMAM, pDR2,
pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y
pOP13.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Además, se describen en la presente memoria los
métodos para la producción de un polipéptido.
Los polipéptidos se pueden preparar cultivando
una célula hospedadora que alberga un vector de expresión que
comprende un gen que codifica el polipéptido. Según las necesidades,
se pueden usar métodos para expresar un gen de manera estable y, al
mismo tiempo, para amplificar el número de copias del gen en las
células. Por ejemplo, se puede introducir un vector que comprende el
gen DHFR complementario (p. ej., pCHO I) en células CHO en las que
la ruta de síntesis de ácidos nucleicos está delecionada, y después
se amplifica mediante metotrexato (MTX). Además, en caso de
expresión transitoria de un gen, se puede usar un método en el que
un vector que comprende un origen de replicación de SV40 (pcD, etc.)
se transforma en células COS que comprenden el gen que expresa el
antígeno SV40T en el cromosoma.
Un polipéptido como se describe en la presente
memoria obtenido como se describió anteriormente se puede aislar del
interior o del exterior (tal como del medio) de las células
hospedadoras y purificarlo en forma de un polipéptido
sustancialmente homogéneo y puro. La expresión "sustancialmente
puro", tal como se usa en la presente memoria con respecto a un
polipéptido dado, significa que el polipéptido está sustancialmente
exento de otras macromoléculas biológicas. El polipéptido
sustancialmente puro es al menos un 75% (p. ej., al menos un 80, 85,
95, o 99%) puro en peso seco. La pureza se puede medir mediante
cualquier método habitual adecuado, por ejemplo mediante
cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida,
o análisis mediante HPLC. El método para el aislamiento y la
purificación del polipéptido no se limita a ningún método
específico; de hecho, se puede usar cualquier método habitual.
Por ejemplo, se puede seleccionar y combinar de
manera adecuada para aislar y purificar el polipéptido la
cromatografía en columna, filtración, ultrafiltración,
precipitación con sales, precipitación del disolvente, extracción
del disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en
gel de SDS-poliacrilamida, isoelectroenfoque,
diálisis y recristalización.
Los ejemplos de cromatografía incluyen, por
ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía
en fase inversa, cromatografía de adsorción, y similares
(Strategies for Protein Purification and Characterization: A
Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Estas cromatografías se
pueden llevar a cabo mediante cromatografía líquida, tal como HPLC
y FPLC. Así, los métodos para la preparación de polipéptidos
sumamente purificados se describieron anteriormente.
Un polipéptido descrito en la presente memoria
se puede modificar o delecionar parcialmente de manera opcional
tratándolo con una enzima de modificación de proteínas adecuada
antes o después de la purificación. Las enzimas de modificación de
proteínas útiles incluyen tripsina, quimotripsina,
lisilendopeptidasa, proteína quinasa, glucosidasa, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe en la presente memoria un
anticuerpo que se une al polipéptido de la invención. El anticuerpo
descrito en la presente memoria se puede usar en cualquier forma,
tal como los anticuerpos monoclonales o policlonales, y también
incluye el antisuero obtenido inmunizando a un animal tal como un
conejo con el polipéptido de la invención, todas las clases de
anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos humanos y
anticuerpos humanizados producidos mediante recombinación
genética.
Un polipéptido descrito en la presente memoria
usado como antígeno para obtener un anticuerpo puede derivar de
cualquier especie animal, pero preferiblemente deriva de un mamífero
tal como un ser humano, ratón, o rata, más preferiblemente de un ser
humano. Se puede obtener un polipéptido derivado de un ser humano a
partir de las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos descritas
en la presente memoria.
El polipéptido descrito en la presente memoria
para ser usado como antígeno de inmunización puede ser una proteína
completa o un péptido parcial de la proteína. Un péptido parcial
puede comprender, por ejemplo, el fragmento amino
(N)-terminal o carboxi (C)-terminal
de un polipéptido descrito en la presente memoria.
En la presente memoria, un anticuerpo se define
como una proteína que reacciona con la longitud completa o un
fragmento de un polipéptido descrito en la presente memoria.
Se puede insertar un gen que codifica un
polipéptido descrito en la presente memoria o su fragmento en un
vector de expresión conocido, que después se usa para transformar la
célula hospedadora como se describe en la presente memoria. El
polipéptido deseado o sus fragmentos se pueden recuperar del
exterior o del interior de las células hospedadoras mediante
cualquier método habitual, y se puede usar posteriormente como
antígeno. De manera alternativa, se pueden usar células completas
que expresan el polipéptido o sus lisados o un polipéptido
sintetizado químicamente como antígeno.
Se puede inmunizar cualquier animal mamífero con
el antígeno, pero preferiblemente se tiene en cuenta la
compatibilidad con las células originarias usadas para la fusión
celular. En general, se usan animales de los órdenes Rodentia,
Lagomorpha o Primates. Los animales del orden Rodentia incluyen, por
ejemplo, ratón, rata y hámster. Los animales del orden Lagomorpha
incluyen, por ejemplo, conejos. Los animales del orden Primates
incluyen, por ejemplo, un mono del parvorden Catarrhini (mono del
viejo mundo) tales como Macaca fascicularis, mono rhesus,
babuino sagrado y chimpancés.
Los métodos para la inmunización de animales con
antígenos se conocen en la técnica. La inyección intraperitoneal o
la inyección subcutánea de antígenos es un método habitual para la
inmunización de mamíferos. De manera más específica, se pueden
diluir y suspender los antígenos en una cantidad adecuada de
solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina
fisiológica, etc. Si se desea, la suspensión de antígeno se puede
mezclar con una cantidad adecuada de un adyuvante habitual, tal como
adyuvante completo de Freund, emulsionarla y después administrarla a
los animales mamíferos. Preferiblemente, esto va seguido por varias
administraciones del antígeno mezclado con una cantidad adecuada de
adyuvante incompleto de Freund cada 4 a 21 días. También se puede
usar un vehículo adecuado para la inmunización. Después de la
inmunización como se mencionó anteriormente, se examina el suero
mediante un método habitual en busca de un incremento en la cantidad
de los anticuerpos deseados.
Se pueden preparar anticuerpos policlonales
hacia los polipéptidos descritos en la presente memoria recogiendo
sangre del mamífero inmunizado en el que se ha examinado el
incremento de los anticuerpos deseados en el suero, y separando el
suero de la sangre mediante cualquier método convencional. Los
anticuerpos policlonales incluyen el suero que contiene los
anticuerpos policlonales, y también se puede aislar la fracción que
contiene los anticuerpos policlonales a partir del suero. Se puede
preparar inmunoglobulina G o M a partir de una fracción que reconoce
solamente el polipéptido descrito en la presente memoria mediante el
uso, por ejemplo, de una columna de afinidad que tiene acoplado el
polipéptido de la presente invención, y purificando esta fracción
mediante el uso de una columna de proteína A o de proteína G.
Para preparar anticuerpos monoclonales, se
recogen células inmunitarias del mamífero inmunizado con el antígeno
y se comprueba el nivel incrementado de los anticuerpos deseados en
el suero tal como se describió anteriormente, y se someten a una
fusión celular. Las células inmunitarias usadas para la fusión
celular se obtienen preferiblemente del bazo. Otras células
originarias preferidas para fusionarse con el inmunocito anterior
incluyen, por ejemplo, las células de mieloma de mamíferos, y más
preferiblemente las células de mieloma que tienen una propiedad
adquirida para la selección mediante fármacos de las células
fusionadas.
Los inmunocitos y las células de mieloma
anteriores se pueden fusionar según métodos conocidos, por ejemplo,
el método de Milstein et al. (Galfre y Milstein, Methods
Enzymol 73: 3-46 (1981)).
Los hibridomas resultantes obtenidos mediante la
fusión celular se pueden seleccionar cultivándolos en un medio de
selección estándar, tal como medio HAT (medio que contiene
hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo celular continúa
generalmente en el medio HAT durante varios días a varias semanas,
cuyo tiempo es suficiente para permitir que todas las demás células
mueran, con la excepción del hibridoma deseado (células sin
funcionar). Después, se lleva a cabo una dilución limitante estándar
para cribar y clonar una célula de hibridoma que produce el
anticuerpo deseado.
Además del método anterior, en el que se
inmuniza a un animal no humano con un antígeno para preparar un
hibridoma, se pueden inmunizar linfocitos humanos tales como los
infectados por el virus EB con un polipéptido, las células que
expresan el polipéptido o sus lisados in vitro. Después, los
linfocitos inmunizados se fusionan con células de mieloma derivadas
de humanos que son capaces de dividirse indefinidamente, tales como
U266, para producir un hibridoma que produce un anticuerpo humano
deseado que es capaz de unirse al polipéptido (solicitud de patente
japonesa publicada sin examinar nº (JP-A) Sho
63-17688).
Los hibridomas obtenidos se trasplantan
posteriormente a la cavidad abdominal de un ratón y se extrae el
líquido ascítico. Los anticuerpos monoclonales obtenidos se pueden
purificar, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato amónico,
columna de proteína A o de proteína G, cromatografía de intercambio
iónico con DEAE o una columna de afinidad a la que está acoplado el
polipéptido de la presente invención. El anticuerpo descrito en la
presente memoria se puede usar no solamente para la purificación y
la detección del polipéptido descrito en la presente memoria, sino
también como candidato a agonista y antagonista del polipéptido
descrito en la presente memoria. Además, este anticuerpo se puede
aplicar al tratamiento con anticuerpos para enfermedades
relacionadas con el polipéptido descrito en la presente memoria.
Cuando el anticuerpo obtenido se va a administrar al organismo
humano (tratamiento con anticuerpos), es preferible un anticuerpo
humano o un anticuerpo humanizado para reducir la
inmunogenicidad.
Por ejemplo, se pueden inmunizar animales
transgénicos que tienen un repertorio de genes de anticuerpos
humanos con un antígeno seleccionado de un polipéptido, células que
expresan el polipéptido o sus lisados. Las células que producen
anticuerpos se recogen después de los animales y se fusionan con
células de mieloma para obtener un hibridoma, a partir del cual se
pueden preparar anticuerpos humanos hacia el polipéptido (véanse los
documentos WO92-03918, WO94-02602,
WO94-25585, WO96-33735 y
WO96-34096).
De manera alternativa, se puede inmortalizar una
célula inmunitaria, tal como un linfocito inmunizado, que produce
anticuerpos mediante un oncogén y usarlo para preparar anticuerpos
monoclonales.
\global\parskip0.850000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales así obtenidos
también se pueden preparar de manera recombinante mediante el uso de
técnicas de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Borrebaeck y
Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino
Unido por MacMillan Publishers LTD (1990)). Por ejemplo, se puede
clonar un ADN que codifica un anticuerpo a partir de una célula
inmunitaria, tal como un hibridoma o un linfocito inmunizado que
produce el anticuerpo, insertarlo en un vector adecuado, e
introducirlo en células hospedadoras para preparar un anticuerpo
recombinante. La presente invención también proporciona anticuerpos
recombinantes preparados como se describió anteriormente.
Además, un anticuerpo descrito en la presente
memoria puede ser un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo
modificado, con tal de que se una a uno o más de los polipéptidos de
la invención. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab,
F(ab')_{2}, Fv o un Fv de cadena simple (scFv), en los que
los fragmentos Fv de las cadenas H y L están ligados mediante un
ligador adecuado (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:
5879-83 (1988)). Más específicamente, se puede
generar un fragmento de anticuerpo tratando un anticuerpo con una
enzima, tal como papaína o pepsina. De manera alternativa, se puede
construir un gen que codifica el fragmento de anticuerpo, insertarlo
en un vector de expresión y expresarlo en una célula hospedadora
adecuada (véase, por ejemplo, Co et al., J Immunol 152:
2968-76 (1994); Better y Horwitz, Methods Enzymol
178: 476-96 (1989); Pluckthun y Skerra, Methods
Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol
121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods
Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird y Walker, Trends
Biotechnol 9: 132-7 (1991)).
Se puede modificar un anticuerpo mediante la
conjugación con una diversidad de moléculas, tales como
polietilenglicol (PEG). Tales anticuerpos modificados se describen
también en la presente memoria. El anticuerpo modificado se puede
obtener modificando químicamente un anticuerpo. Estos métodos de
modificación son convencionales en este campo.
De manera alternativa, se puede obtener un
anticuerpo como el descrito en la presente memoria en forma de un
anticuerpo quimérico, entre una región variable derivada de un
anticuerpo no humano y la región constante derivada de un anticuerpo
humano, o en forma de un anticuerpo humanizado, que comprende la
región determinante de la complementariedad (CDR) derivada de un
anticuerpo no humano, la región estructural (FR) y la región
constante derivadas de un anticuerpo humano. Tales anticuerpos se
pueden preparar según las técnicas conocidas. La humanización se
puede llevar a cabo sustituyendo las CDRs o secuencias de CDR de
roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano
(véase, p. ej., Verhoeyen et al., Science
239:1534-6 (1988)). Por lo tanto, tales anticuerpos
humanizados son anticuerpos quiméricos, en los que se ha sustituido
menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia
correspondiente de una especie no humana.
También se pueden usar anticuerpos completamente
humanos que comprenden regiones variables humanas además de
regiones estructurales y constantes humanas. Tales anticuerpos se
pueden producir mediante el uso de diversos métodos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, los métodos in vitro implican el uso de
bibliotecas recombinantes de fragmentos de anticuerpos humanos
expresados en bacteriófagos (p. ej., Hoogenboom & Winter, J.
Mol. Biol. 227:381 (1992)). De manera similar, se pueden producir
anticuerpos humanos mediante la introducción de loci de
inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, p. ej., ratones
en los que los genes endógenos de inmunoglobulinas se han
inactivado parcialmente o completamente. Esta aproximación se
describe, p. ej., en las patentes de EE.UU. n0s 6.150.584,
5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425;
5.661.016.
Los anticuerpos obtenidos como se mencionó
anteriormente se pueden purificar hasta su homogeneidad. Por
ejemplo, la separación y la purificación del anticuerpo se pueden
llevar a cabo según los métodos de separación y de purificación
usados para las proteínas en general. Por ejemplo, el anticuerpo se
puede separar y aislar mediante el uso seleccionado y combinado de
manera adecuada de cromatografía en columna, tal como cromatografía
de afinidad, filtración, ultrafiltración, desalación, diálisis,
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida e
isoelectroenfoque (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y
David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero sin
limitación. Se puede usar una columna de proteína A y una columna
de proteína G como columna de afinidad. Las columnas de proteína A
ejemplares a usar incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS y Sepharose
F.F. (Pharmacia).
La cromatografía ejemplar, con excepción de la
cromatografía de afinidad incluye, por ejemplo, la cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel,
cromatografía en fase inversa, cromatografía de adsorción y
similares (Strategies for Protein Purification and Characterization:
A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Los procedimientos
cromatográficos se pueden llevar a cabo mediante cromatografía en
fase líquida, tal como HPLC y FPLC.
Por ejemplo, se puede usar la medida de la
absorbancia, el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA),
inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA) y/o
inmunofluorescencia para medir la actividad de unión al antígeno del
anticuerpo descrito en la presente memoria. En el ELISA, el
anticuerpo descrito en la presente memoria se inmoviliza en una
placa, se aplica un polipéptido de la invención a la placa, y
después se aplica una muestra que contiene un anticuerpo deseado,
tal como el sobrenadante del cultivo de las células que producen el
anticuerpo o los anticuerpos purificados. Después, se aplica un
anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y que está
marcado con una enzima, tal como fosfatasa alcalina, y la placa se
incuba. A continuación, después de lavar, se añade un sustrato para
la enzima, tal como fosfato de p-nitrofenilo, a la placa, y
se mide la absorbancia para determinar la actividad de unión al
antígeno de la muestra. Se puede usar un fragmento del polipéptido,
tal como un fragmento C-terminal o
N-terminal, como antígeno para determinar la
actividad de unión del anticuerpo. Se puede usar BIAcore (Pharmacia)
para determinar la actividad del anticuerpo descrito en la presente
memoria.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los métodos anteriores posibilitan la detección
o la medida del polipéptido de la invención exponiendo el anticuerpo
de la invención a una muestra que se supone que contiene el
polipéptido de la invención, y detectando o midiendo el complejo
inmunitario formado por el anticuerpo y el polipéptido.
Debido a que el método de detección o de medida
del polipéptido según la invención puede detectar o medir de manera
específica un polipéptido, el método puede ser útil en una
diversidad de experimentos en los que se usa el polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe en la presente memoria un
oligonucleótido antisentido que hibrida con cualquier lugar de la
secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26. Este oligonucleótido
antisentido va dirigido preferiblemente contra al menos alrededor de
15 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica de SEQ ID
NO: 24 ó 26. Se prefiere aún más el oligonucleótido antisentido
anteriormente mencionado que contiene un codón de iniciación en los
al menos 15 nucleótidos consecutivos anteriormente mencionados.
También se pueden usar derivados o productos
modificados de oligonucleótidos antisentido como oligonucleótidos
antisentido. Los ejemplos de tales productos modificados incluyen
las modificaciones de fosfonato de alquilo inferior, tales como de
tipo fosfonato de metilo o de tipo fosfonato de etilo,
modificaciones de fosforotioato y modificaciones de
fosforoamidato.
La expresión "oligonucleótidos
antisentido", tal como se usa en la presente memoria, significa
no solamente aquellos en los que los nucleótidos que corresponden a
los que constituyen una región especificada de un ADN o mARN son
totalmente complementarios, sino también aquellos que tienen un
emparejamiento incorrecto de uno o más nucleótidos, con tal de que
el ADN o el mARN y el oligonucleótido antisentido puedan hibridar de
manera específica con la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó
26.
Tales polinucleótidos están incluidos en
aquellos que tienen, en la "región de secuencia de al menos
alrededor de 15 nucleótidos consecutivos", una homología de al
menos un 70% o más, preferiblemente un 80% o más, más
preferiblemente alrededor de un 90% o más, aún más preferiblemente
alrededor de un 95% o más. Se puede usar el algoritmo indicado en
la presente memoria para determinar la homología. Se pueden usar los
algoritmos conocidos en la técnica para determinar la homología.
Además, también se pueden usar en la presente memoria derivados o
productos modificados de los oligonucleótidos antisentido como
oligonucleótidos antisentido. Los ejemplos de tales productos
modificados incluyen modificaciones de fosfonato de alquilo inferior
tales como de tipo fosfonato de metilo o de tipo fosfonato de etilo,
modificaciones de fosforotioato y modificaciones de
fosforoamiato.
Tales polinucleótidos antisentido son útiles
como sondas para el aislamiento o la detección de ADN que codifica
el polipéptido de la invención o como un cebador usado para las
amplificaciones.
Los derivados de los oligonucleótidos
antisentido de la presente invención actúan en las células que
producen el polipéptido de la invención uniéndose al ADN o al mARN
que codifica el polipéptido, inhibiendo su transcripción o su
traducción, estimulando la degradación del mARN e inhibiendo la
expresión del polipéptido de la invención, por lo que se da como
resultado la inhibición de la función del polipéptido.
También se describen en la presente memoria los
ARNs pequeños de interferencia (siARN) que comprenden una
combinación de un ácido nucleico de cadena con sentido y un ácido
nucleico de cadena antisentido de la secuencia nucleotídica de SEQ
ID NO: 24 ó 26. De manera más específica, tales siARN para la
inhibición de la expresión de B7330N incluyen aquellos que
seleccionan como objetivo la secuencia nucleotídica de SEQ ID NOs:
18 ó 22.
El término "siARNs" se refiere a una
molécula de ARN bicatenaria que impide la traducción de un mARN
seleccionado como objetivo. Se usan técnicas habituales para
introducir siARN en las células, que incluyen aquellas en las que se
usa ADN como molde para el ARN transcrito. El siARN comprende una
secuencia de ácido nucleico con sentido y una secuencia de ácido
nucleico antisentido del polinucleótido que codifica la proteína
B7330N humana (SEQ ID NO: 24 ó 26). El siARN se construye de manera
que un único transcrito (ARN bicatenario) tiene tanto la secuencia
con sentido como la secuencia antisentido complementaria del gen
seleccionado como objetivo, p. ej., una horquilla.
La unión del siARN a un transcrito que
corresponde a B7330N en la célula objetivo da como resultado una
reducción de la producción de la proteína en la célula. La longitud
del oligonucleótido es de al menos 10 nucleótidos, y puede ser tan
larga como el transcrito que se da de manera natural.
Preferiblemente, el oligonucleótido tiene una longitud menor de
alrededor de 75, alrededor de 50, alrededor de 25 nucleótidos. Lo
más preferiblemente, el oligonucleótido tiene una longitud de
alrededor de 19 a alrededor de 25 nucleótidos. Los ejemplos de
oligonucleótidos de siARN de B7330N que inhiben el crecimiento de
las células cancerosas incluyen la secuencia objetivo que contiene
SEQ ID NOs: 18 ó 22. Además, para incrementar la actividad de
inhibición del siARN, se puede añadir el nucleótido "u" al
extremo 3' de la cadena antisentido de la secuencia objetivo. El
número de "u"s a añadir es de al menos alrededor de 2, en
general alrededor de 2 a alrededor de 10, preferiblemente alrededor
de 2 a alrededor de 5. Los "u"s añadidos forman una cadena
simple en el extremo 3' de la cadena antisentido del siARN.
Un siARN de B7330N se introduce directamente en
las células en una forma que es capaz de unirse a los transcritos de
mARN. En estas realizaciones, las moléculas de siARN descritas en la
presente memoria se modifican en general como se describió
anteriormente para las moléculas antisentido. También son posibles
otras modificaciones, por ejemplo, los siARNs conjugados a
colesterol han mostrado propiedades farmacológicas mejoradas (Song
et al. Nature Med. 9:347-51 (2003)). De
manera alternativa, el ADN que codifica el siARN de B7330N está en
un vector.
Se producen vectores, por ejemplo, clonando una
secuencia objetivo de B7330N en un vector de expresión unido de
forma operable a secuencias reguladoras que flanquean la secuencia
de B7330N de tal manera que se permite la expresión (mediante la
transcripción de la molécula de ADN) de ambas cadenas (Lee, N.S.
et al., (2002) Nature Biotechnology 20 :
500-5.). Una molécula de ARN que es antisentido
respecto del mARN de B7330N es transcrita por un primer promotor (p.
ej., una secuencia promotora en 3' del ADN clonado) y una molécula
de ARN que es la cadena con sentido para el mARN de B7330N es
transcrita por un segundo promotor (p. ej., una secuencia promotora
en 5' del ADN clonado). Las cadenas con sentido y antisentido
hibridan in vivo para generar construcciones de siARN para
silenciar el gen B7330N. De manera alternativa, se utilizan dos
construcciones para crear las cadenas con sentido y antisentido de
una construcción de siARN. La B7330N clonada puede codificar una
construcción que tiene una estructura secundaria, p. ej.,
horquillas, en la que un único transcrito tiene tanto la secuencia
con sentido como la secuencia antisentido complementaria del gen
objetivo.
Además, una secuencia en bucle que consiste en
una secuencia nucleotídica arbitraria puede estar localizada entre
la secuencia con sentido y la secuencia antisentido para formar la
estructura de bucle en horquilla. Así, la presente invención
proporciona también siARN que tiene la fórmula general
5'-[A]-[B]-[A']-3', en la que [A] es una secuencia
ribonucleotídica que corresponde a una secuencia que hibrida de
manera específica a un mARN o a un cADN de un gen de B7330N. En las
realizaciones preferidas, [A] es una secuencia ribonucleotídica que
corresponde a una secuencia de los nucleótidos
417-435 de SEQ ID NO: 24 ó 623-641
de SEQ ID NO: 26 (SEQ ID NO: 18) y 1366-1384 de SEQ
ID NO: 24 ó 1572-1590 de SEQ ID NO: 26 (SEQ ID NO:
22),
[B] es una secuencia ribonucleotídica que
consiste en alrededor de 3 a alrededor de 23 nucleótidos, y [A'] es
una secuencia ribonucleotídica que consiste en la secuencia
complementaria de [A]. La secuencia del bucle puede consistir en
una secuencia arbitraria que tiene preferiblemente una longitud de 3
a 23 nucleótidos. La secuencia del bucle, por ejemplo, se puede
seleccionar del grupo que consiste en las siguientes secuencias
(http://www.ambion.com/techlib/tb/
tb_506.html). En el siARN descrito en la presente memoria, se puede añadir el nucleótido "u" al extremo 3' de [A'] para aumentar la actividad de inhibición del siARN. El número de "u"s a añadir es de al menos alrededor de 2, en general alrededor de 2 a alrededor de 10, preferiblemente alrededor de 2 a alrededor de 5. Además, una secuencia en bucle que consiste en 23 nucleótidos también proporciona un siARN activo (Jacque, J. M., et al., (2002) Nature 418: 435-8.).
tb_506.html). En el siARN descrito en la presente memoria, se puede añadir el nucleótido "u" al extremo 3' de [A'] para aumentar la actividad de inhibición del siARN. El número de "u"s a añadir es de al menos alrededor de 2, en general alrededor de 2 a alrededor de 10, preferiblemente alrededor de 2 a alrededor de 5. Además, una secuencia en bucle que consiste en 23 nucleótidos también proporciona un siARN activo (Jacque, J. M., et al., (2002) Nature 418: 435-8.).
- CCC, CCACC o CCACACC: Jacque, J. M., et al., Nature, Vol. 418: 435-8 (2002);
- UNCG: Lee, N.S., et al., (2002) Nature Biotechnology 20: 500-5.; Fruscoloni, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-44 (2003); y
- UUCAAGAGA: Dykxhoorn, D. M., et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-67 (2003).
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, más adelante se muestran los siARNs
preferibles descritos en la presente memoria que tienen una
estructura de horquilla. En la siguiente estructura, la secuencia
del bucle se puede seleccionar del grupo que consiste en CCC, UUCG,
CCACC, CCACACC, y UUCAAGAGA. La secuencia del bucle preferible es
UUCAAGAGA ("ttcaagaga" en el ADN).
- gcacuguuucaaugccuuu-[B]-aaaggcauugaaacagugc (para la secuencia objetivo de SEQ ID NO: 18)
- gagaaauccuucggugaca-[B]-ugucaccgaaggauuucuc (para la secuencia objetivo de SEQ ID NO: 22)
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias reguladoras que flanquean la
secuencia de B7330N son idénticas o son diferentes, de forma que su
expresión se puede modular de manera independiente, o de una manera
temporal o espacial. Los siARNs se transcriben de manera
intracelular clonando los moldes del gen B7330N en un vector que
contiene, p. ej., una unidad de transcripción de la ARN polimerasa
III del ARN nuclear pequeño (snRNA) U6 o del promotor de H1 RNA
humano. Para la introducción del vector en la célula, se puede usar
un agente potenciador de la transfección. FuGENE (Roche
diagnostics), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine
(Invitrogen), y Nucleo-fector (Wako pure Chemical)
son útiles como agentes potenciadores de la transfección.
La secuencia nucleotídica de los siARNs se puede
diseñar mediante el uso de un programa informático de diseño de
siARN disponible en la página de internet de Ambion
(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). Las
secuencias nucleotídicas para el siARN se seleccionan mediante el
programa informático basado en el siguiente protocolo:
\newpage
Selección de los Sitios Objetivo del siARN:
- 1.
- Comenzando con el codón de inicio AUG del transcrito en cuestión, se barre en dirección 3' en busca de secuencias de dinucleótidos AA. Se registra la existencia de cada AA y los 19 nucleótidos adyacentes en 3' como sitios objetivo potenciales del siARN. Tuschl, et al. Genes Dev 13(24): 3191-7 (1999), no recomienda diseñar siARN hacia las regiones sin traducir de 5' y 3' (UTRs) y hacia las regiones cercanas al codón de inicio (en 75 bases), ya que éstas pueden ser más ricas en sitios de unión para proteínas reguladoras. Las proteínas de unión a las UTR y/o los complejos de iniciación de la traducción pueden interferir con la unión del complejo siARN-endonucleasa.
- 2.
- Se comparan los sitios objetivo potenciales con la base de datos del genoma humano y se deja de considerar cualquier secuencia objetivo con una homología significativa a otras secuencias codificantes. La búsqueda de homología se puede llevar a cabo mediante el uso de BLAST (Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25(17):3389-402.; J Mol Biol. 1990; 215(3):403-10.), que se puede hallar en el servidor del NCBI en: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
- 3.
- Se seleccionan las secuencias objetivo clasificadas para la síntesis. En Ambion, se pueden seleccionar preferiblemente varias secuencias objetivo a lo largo de la longitud del gen para su estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron oligonucleótidos y oligonucleótidos
complementarios a diversas porciones del mARN de B7330N in
vitro en función de su capacidad de disminuir la producción de
B7330N en las células tumorales (p. ej., mediante el uso de las
líneas celulares de cáncer de mama HBL-100, HCC1937,
MCF-7, MDA-MB-435s,
YMB1, SKBR3, T47D,BT-20, BT-474,
BT-549, HCC1143, HCC1500, HCC1599,
MDA-MB-157,
MDA-MB453, OUCB-F,
ZR-75-1) según métodos habituales.
Se detecta una reducción del producto del gen B7330N en las células
que se ponen en contacto con la composición de siARN candidata en
comparación con las células cultivadas en ausencia de la composición
candidata, mediante el uso de anticuerpos específicos hacia B7330N
o de otras estrategias de detección. Las secuencias que disminuyen
la producción de B7330N en ensayos basados en células o sin células
in vitro se ensayan después en función de su efecto inhibidor
sobre el crecimiento celular. Las secuencias que inhiben el
crecimiento celular en un ensayo basado en células in vitro
se ensayan in vivo en ratas o ratones para confirmar la
producción disminuida de B7330N y el crecimiento de células
tumorales disminuido en animales con neoplasias malignas.
También se incluyen en la presente memoria las
moléculas bicatenarias que incluyen la secuencia de ácidos nucleicos
de secuencias objetivo, por ejemplo, los nucleótidos
417-435 de SEQ ID NO: 24 ó 623-641
de SEQ ID NO: 26 (SEQ ID NO: 18) y 1366-1384 de SEQ
ID NO: 24 ó 1572-1590 de SEQ ID NO: 26 (SEQ ID NO:
22). La molécula bicatenaria descrita en la presente memoria
comprende una cadena con sentido y una cadena antisentido, en la que
la cadena con sentido comprende una secuencia ribonucleotídica que
corresponde a SEQ ID NOs: 18, ó 22 y en la que la cadena antisentido
comprende una secuencia ribonucleotídica que es complementaria
respecto de dicha cadena con sentido, en la que dicha cadena con
sentido y dicha cadena antisentido hibridan entre sí para formar
dicha molécula bicatenaria, y en la que dicha molécula bicatenaria,
cuando se introduce en una célula que expresa el gen B7330N, inhibe
la expresión de dicho gen. En la presente invención, cuando el ácido
nucleico aislado es ARN o derivados del mismo, la base "t" se
debería sustituir por "u" en las secuencias nucleotídicas. Tal
como se usa en la presente memoria, el término "complementario"
se refiere al emparejamiento de bases de
Watson-Crick o de Hoogsteen entre las unidades
nucleotídicas de una molécula de ácido nucleico, y el término
"unión" significa la interacción física o química entre
dos ácidos nucleicos o compuestos, o ácidos nucleicos o compuestos asociados, o las combinaciones de los mismos.
dos ácidos nucleicos o compuestos, o ácidos nucleicos o compuestos asociados, o las combinaciones de los mismos.
Las secuencias de ácidos nucleicos
complementarias hibridan en condiciones adecuadas para formar
moléculas dobles estables que contienen pocos emparejamientos
incorrectos o ninguno. Además, la cadena con sentido y la cadena
antisentido del nucleótido aislado descrito en la presente memoria
pueden formar una estructura nucleotídica bicatenaria o de bucle en
horquilla mediante la hibridación. En una realización preferida,
tales moléculas dobles contienen no más de 1 emparejamiento
incorrecto para cada 10 emparejamientos. En especial, cuando las
cadenas de la molécula doble son completamente complementarias,
tales moléculas dobles no contienen emparejamientos incorrectos. La
molécula de ácido nucleico tiene una longitud menor de 4381
nucleótidos (para SEQ ID NO: 24) o 4556 nucleótidos (para SEQ ID NO:
26). Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico tiene una longitud
menor de 500, 200, o 75 nucleótidos. También se incluye en la
presente memoria un vector que contiene uno o más de los ácidos
nucleicos descritos en la presente memoria, y una célula que
contiene los vectores. Los ácidos nucleicos aislados descritos en la
presente memoria son útiles para el siARN contra B7330N o el ADN que
codifica el siARN. Cuando los ácidos nucleicos se usan para el siARN
o el ADN codificante del mismo, la cadena con sentido es
preferiblemente más larga de alrededor de 19 nucleótidos, y más
preferiblemente más larga de alrededor de 21 nucleótidos.
El oligonucleótido antisentido o siARN de la
invención inhibe la expresión del polipéptido de la invención, y por
lo tanto es útil para inhibir la actividad biológica del polipéptido
de la invención. Además, los inhibidores de la expresión, que
comprenden el oligonucleótido antisentido o siARN de la invención,
son útiles ya que pueden inhibir la actividad biológica del
polipéptido de la invención. Por lo tanto, una composición que
comprende el oligonucleótido antisentido o siARN de la presente
invención es útil en el tratamiento del cáncer de mama. Los ejemplos
de oligonucleótidos de siARN de B7330N que inhiben la expresión en
las células mamíferas incluyen la secuencia objetivo que contiene
las SEQ ID NOs: 18 ó 22. Además, para incrementar la actividad de
inhibición del siARN, se puede añadir el nucleótido "u" al
extremo 3' de la cadena antisentido de la secuencia objetivo. El
número de "u"s a añadir es de al menos alrededor de 2, en
general alrededor de 2 a alrededor de 10, preferiblemente alrededor
de 2 a alrededor de 5. Los "u"s añadidos forman una cadena
simple en el extremo 3' de la cadena antisentido del siARN.
Además, los inhibidores de la expresión, que
comprenden el oligonucleótido antisentido o siARN de la invención,
son útiles ya que pueden inhibir la actividad biológica del
polipéptido de la invención. Por lo tanto, una composición que
comprende el oligonucleótido antisentido o siARN descrito en la
presente memoria es útil en el tratamiento de una enfermedad
proliferativa celular tal como el cáncer de mama.
Además, se describen en la presente memoria
ribozimas que inhiben la expresión del polipéptido B7330N descrito
en la presente memoria.
En general, las ribozimas se clasifican en
ribozimas grandes y ribozimas pequeñas. Una ribozima grande se
conoce como una enzima que escinde el enlace éster fosfato de los
ácidos nucleicos. Tras la reacción con la ribozima grande, el sitio
que ha reaccionado consiste en un 5'-fosfato y un
grupo 3'-hidroxilo. Las ribozimas grandes se
clasifican adicionalmente en (1) el grupo I de ARN intrónico que
cataliza la transesterificación en el sitio de corte y empalme de
5' mediante guanosina; (2) el grupo II de ARN intrónico que cataliza
el auto-corte y empalme a través de una reacción en
dos etapas por medio de una estructura lariat; y (3) el componente
de ARN de la ribonucleasa P que escinde el precursor de tARN en el
sitio 5' por medio de hidrólisis. Por otra parte, las ribozimas
pequeñas tienen un tamaño menor (alrededor de 40 pb) en comparación
con las ribozimas grandes, escinden los ARNs para generar un grupo
5'-hidroxilo y un
2'-3'-fosfato cíclico. Las ribozimas
de tipo cabeza de martillo (Koizumi et al., FEBS Lett 228:
225 (1988)) y las ribozimas de tipo horquilla (Buzayan, Nature 323:
349 (1986); Kikuchi y Sasaki, Nucleic Acids Res 19: 6751 (1991))
están incluidas en las ribozimas pequeñas. Los métodos para el
diseño y la construcción de ribozimas se conocen en la técnica
(véase Koizumi et al., FEBS Lett 228: 228 (1988); Koizumi
et al., Nucleic Acids Res. 17: 7059 (1989); Kikuchi y Sasaki,
Nucleic Acids Res 19: 6751 (1991)). Así, las ribozimas que inhiben
la expresión de los polipéptidos descritos en la presente memoria se
pueden construir también basándose en la información de su secuencia
(SEQ ID NO: 24 ó 26) y en estos métodos convencionales.
Las ribozimas contra el gen B7330N inhiben la
expresión de la proteína B7330N sobreexpresada, y así son útiles
para inhibir la actividad biológica de la proteína. Por lo tanto,
las ribozimas son útiles en el tratamiento o la prevención del
cáncer de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se describe en la presente memoria un
método para el diagnóstico de una enfermedad proliferativa celular
tal como el cáncer de mama mediante el uso del nivel de expresión de
los genes descritos en la presente memoria como marcador de
diagnóstico. También se describe en la presente memoria un método
para la determinación de la predisposición al cáncer de mama en un
sujeto determinando el nivel de expresión de los genes de la
invención en una muestra biológica procedente de un paciente, tal
como una muestra de tejido. Una alteración, p. ej., un incremento
en el nivel de expresión de un gen en comparación con un nivel de
control normal del gen, indica que el sujeto puede padecer o que
corre el riesgo de desarrollar cáncer de mama.
Cuando se usa en la presente memoria en este
contexto, la expresión "predisposición al cáncer de mama"
abarca un estado de un sujeto que está predispuesto, que tiene
tendencia, prevalencia, inclinación o susceptibilidad al cáncer de
mama. Además, dicha expresión también abarca el hecho de que un
sujeto corra el riesgo de padecer cáncer de mama.
Este método de diagnóstico comprende las etapas
de: (a) detectar el nivel de expresión del gen B7330N de la
presente invención; y (b) relacionar una elevación del nivel de
expresión con el cáncer de mama. De forma similar, en el método para
la determinación de la predisposición al cáncer de mama se aplican
las mismas etapas que se han mencionado anteriormente.
El nivel de expresión del gen B7330N en
una muestra biológica se puede estimar cuantificando el mARN que
corresponde a, o la proteína codificada por, el gen B7330N.
Los métodos de cuantificación de mARN son conocidos para los
expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede estimar el nivel de
los mARNs que corresponden al gen B7330N mediante
transferencia de Northern o RT-PCR. Debido a que las
secuencias nucleotídicas de tamaño completo de los genes
B7330N se muestran en SEQ ID NO: 24 ó 26, cualquier experto
en la técnica puede diseñar secuencias nucleotídicas para sondas o
cebadores para cuantificar el gen B7330N.
Además, se puede analizar el nivel de expresión
del gen B7330N basándose en la actividad o la cantidad de
proteína codificada por el gen. Se muestra un método para la
determinación de la cantidad de la proteína B7330N más adelante. Por
ejemplo, los métodos mediante inmunoensayos son útiles para la
determinación de las proteínas en materiales biológicos. Se puede
usar cualquier material biológico como muestra biológica para la
determinación de la proteína o de su actividad, con tal de que el
gen marcador (gen B7330N) se exprese en la muestra de un
paciente de cáncer de mama. Por ejemplo, se puede mencionar el
epitelio ductal de mama como tal muestra biológica. No obstante,
también se pueden analizar los fluidos corporales tales como sangre
y orina. Por otra parte, se puede seleccionar un método adecuado
para la determinación de la actividad de una proteína codificada por
el gen B7330N según la actividad de la proteína a
analizar.
El nivel de expresión del gen B7330N en
una muestra biológica se estima y se compara con el de una muestra
normal (p. ej., una muestra procedente de un sujeto sano). Cuando
tal comparación demuestra que el nivel de expresión del gen objetivo
es mayor que en la muestra normal, se considera que el sujeto padece
cáncer de mama. El nivel de expresión de un gen B7330N en
la(s) muestra(s) biológica(s) de un sujeto
normal y de un sujeto a diagnosticar se puede terminar al mismo
tiempo. De manera alternativa, se pueden determinar los intervalos
normales de los niveles de expresión mediante un método estadístico
basado en los resultados obtenidos analizando el nivel de expresión
del gen en muestras recogidas previamente de un grupo de control. Se
compara un resultado obtenido mediante la comparación de la muestra
de un sujeto con el intervalo normal; cuando el resultado no se
halla dentro del intervalo normal, se considera que el sujeto padece
o corre el riesgo de desarrollar cáncer de mama.
También se describe en la presente memoria un
agente de diagnóstico para diagnosticar una enfermedad proliferativa
celular, tal como cáncer de mama. El agente de diagnóstico descrito
en la presente memoria comprende un compuesto que se une a un
polinucleótido o a un polipéptido descrito en la presente memoria.
Preferiblemente, se puede usar un oligonucleótido que hibrida con el
polinucleótido descrito en la presente memoria o un anticuerpo que
se une al polipéptido descrito en la presente memoria como tal
compuesto. De manera alternativa, se puede usar un aptámero tal como
ARN, ADN o aptámeros peptídicos.
El presente método de diagnóstico de cáncer de
mama se puede aplicar para determinar la eficacia del tratamiento
del cáncer de mama en un sujeto. Según el método, se obtiene una
muestra biológica, tal como una población celular a analizar, de un
sujeto sometido a tratamiento de cáncer de mama. El método para la
determinación se puede llevar a cabo según métodos convencionales de
diagnóstico de cáncer de mama.
Si se desea, se obtienen muestras biológicas del
sujeto en diversos momentos antes, durante o después del
tratamiento. Después se determina el nivel de expresión del gen
B7330N en la muestra biológica y se compara con un nivel de
control procedente, por ejemplo, de una población celular de
referencia que incluye células de las que se conoce el estado con
respecto al cáncer de mama (es decir, células cancerosas o células
no cancerosas). El nivel de control se determina en una muestra
biológica que no se ha expuesto al tratamiento.
Si el nivel de control procede de una muestra
biológica que no contiene células cancerosas, una similitud entre el
nivel de expresión de la muestra biológica procedente del sujeto y
el nivel de control indica que el tratamiento es eficaz. Una
diferencia entre el nivel de expresión del gen B7330N en la
muestra biológica procedente del sujeto y el nivel de control indica
un resultado clínico o pronóstico menos favorable.
El término "eficaz" se refiere a que el
tratamiento conduce a una reducción de la expresión de un gen
activado patológicamente (gen B7330N) o una disminución del
tamaño, la prevalencia o la capacidad de proliferación de las
células de cáncer de mama en un sujeto. Cuando un tratamiento se
aplica de manera profiláctica, "eficaz" indica que el
tratamiento retrasa o previene la aparición del cáncer de mama. La
determinación del cáncer de mama se puede realizar mediante el uso
de los protocolos clínicos habituales. Además, la eficacia de un
tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido
para el diagnóstico o el tratamiento del cáncer de mama.
Además, el presente método de diagnóstico del
cáncer de mama se puede aplicar también para la determinación del
pronóstico de un sujeto con cáncer de mama comparando el nivel de
expresión del gen B7330N en una muestra biológica procedente
del paciente; tal como analizando una población celular respecto de
un nivel de control. De manera alternativa, el nivel de expresión
del gen B7330N en una muestra biológica procedente de
pacientes se puede medir a lo largo de un espectro de etapas de la
enfermedad para determinar el pronóstico del paciente.
Un incremento en el nivel de expresión del gen
B7330N en comparación con un nivel de control normal indica
un pronóstico menos favorable. Una similitud en el nivel de
expresión del gen B7330N en comparación con el nivel de
control normal indica un pronóstico más favorable para el
paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el uso del gen B7330N, las
proteínas codificadas por el gen o la región reguladora
transcripcional del gen, se pueden cribar compuestos que alteran la
expresión del gen o la actividad biológica de un polipéptido
codificado por el gen. Tales compuestos se usan como productos
farmacéuticos para el uso en el tratamiento o la prevención del
cáncer de mama.
Por lo tanto, también se describe un método para
cribar en busca de un compuesto para el uso en el tratamiento o la
prevención del cáncer de mama mediante el uso del polipéptido
descrito en la presente memoria.
Este método de cribado comprende las etapas de:
(a) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido
descrito en la presente memoria; (b) detectar la actividad de unión
entre el polipéptido descrito en la presente memoria y el compuesto
de ensayo; y (c) seleccionar el compuesto que se une al polipéptido
descrito en la presente memoria. Todas las realizaciones descritas
en la presente memoria con respecto al polipéptido, al
polinucleótido, los vectores y/o las células hospedadoras descritas
en la presente memoria también están relacionadas con los métodos
de cribado descritos en la presente memoria, mutatis
mutandis, lo cual se aplica a dicho polipéptido, polinucleótido,
vectores y/o células hospedadoras.
El polipéptido descrito en la presente memoria a
usar para el cribado puede ser un polipéptido recombinante o una
proteína derivada de la naturaleza o un péptido parcial de los
mismos. El polipéptido descrito en la presente memoria para ser
puesto en contacto con un compuesto de ensayo puede ser, por
ejemplo, un polipéptido purificado, una proteína soluble, una forma
asociada a un vehículo o una proteína de fusión fusionada con otros
polipéptidos.
Como método de cribado de proteínas, por
ejemplo, que se unen al polipéptido de la presente invención
mediante el uso del polipéptido de la presente invención, se pueden
usar muchos métodos muy conocidos para un experto en la técnica. Tal
cribado se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un método de
inmunoprecipitación, específicamente, de la siguiente manera. El
gen que codifica el polipéptido descrito en la presente memoria se
expresa en las células hospedadoras (p. ej., animales), etc.,
insertando el gen en un vector de expresión para genes exógenos,
tales como pSV2neo, pcDNA I, pcDNA3.1, pCAGGS y pCD8. El promotor a
usar para la expresión puede ser cualquier promotor que se puede
usar habitualmente e incluye, por ejemplo, el promotor temprano de
SV40 (Rigby en Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3.
Academic Press, Londres, 83-141 (1982)), el promotor
de EF-\alpha (Kim et al., Gene 91:
217-23 (1990)), el promotor de CAG (Niwa et
al., Gene 108: 193 (1991)), el promotor de LTR de RSV (Cullen,
Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), el
promotor de SR\alpha (Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466
(1988)), el promotor temprano inmediato de CMV (Seed y Aruffo, Proc
Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)), el promotor
tardío de SV40 (Gheysen y Fiers, J Mol Appl Genet 1:
385-94 (1982)), el promotor tardío de adenovirus
(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946 (1989)), el promotor de
TK de HSV, etc. La introducción del gen en las células hospedadoras
para expresar un gen exógeno se puede llevar a cabo según cualquier
método, por ejemplo, el método de electroporación (Chu et
al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), el
método de fosfato cálcico (Chen y Okayama, Mol Cell Biol 7:
2745-52 (1987)), el método de
DEAE-dextrano (Lopata et al., Nucleic Acids
Res 12: 5707-17 (1984); Sussman y Milman, Mol Cell
Biol 4: 1641-3 (1984)), el método de Lipofectina
(Derijard B, Cell 76: 1025-37 (1994); Lamb et
al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran
et al., Science 259: 230-4 (1993)), etc. El
polipéptido descrito en la presente memoria se puede expresar en
forma de una proteína de fusión que comprende un sitio de
reconocimiento (epítopo) de un anticuerpo monoclonal introduciendo
el epítopo del anticuerpo monoclonal, cuya especificidad se ha
revelado, en el extremo N- o C-terminal del
polipéptido descrito en la presente memoria. Se puede usar un
sistema epítopo-anticuerpo disponible comercialmente
(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). Hay
disponibles comercialmente vectores que pueden expresar una proteína
de fusión, por ejemplo, con, \beta-galactosidasa,
proteína de unión a maltosa, glutatión
S-transferasa, proteína fluorescente verde (GFP),
etc., mediante el uso de sus múltiples sitios de clonación.
También se informa de una proteína de fusión
preparada introduciendo solamente epítopos pequeños que consisten
desde varios hasta una docena de aminoácidos, de manera que no se
cambia la propiedad del polipéptido descrito en la presente memoria
mediante la fusión. Se pueden usar epítopos, tales como
polihistidina (marcador de His), agregado de la gripe HA,
c-myc humana, FLAG, glicoproteína del virus de la
estomatitis vesicular (VSV-GP), proteína del gen 10
de T7 (marcador de T7), glicoproteína del virus herpes simplex
humano (marcador de HSV), marcador de E (un epítopo en fago
monoclonal) y similares, y anticuerpos monoclonales que los
reconocen, como sistema epítopo-anticuerpo para el
cribado de proteínas que se unen al polipéptido descrito en la
presente memoria (Experimental Medicine 13: 85-90
(1995)).
En la inmunoprecipitación, se forma un
inmunocomplejo añadiendo estos anticuerpos a un lisado celular
preparado mediante el uso de un detergente adecuado. El
inmunocomplejo consiste en el polipéptido de la presente invención,
un polipéptido que comprende la capacidad de unirse con el
polipéptido, y un anticuerpo. La inmunoprecipitación se puede llevar
a cabo también mediante el uso de anticuerpos hacia el polipéptido
de la presente invención, además de usar anticuerpos hacia los
epítopos anteriores, y dichos polipéptidos se pueden preparar como
se describió anteriormente.
Se puede precipitar un inmunocomplejo, por
ejemplo, con Sepharose-proteína A o
Sepharose-proteína G cuando el anticuerpo es un
anticuerpo IgG de ratón. Si el polipéptido de la presente invención
se prepara en forma de una proteína de fusión con un epítopo, tal
como GST, se puede formar un inmunocomplejo de la misma manera que
con el uso del anticuerpo hacia el polipéptido de la presente
invención, mediante el uso de una sustancia que se une de manera
específica a estos epítopos, tal como
glutatión-Sepharose 4B.
La inmunoprecipitación se puede llevar a cabo
siguiendo o según, por ejemplo, los métodos de la bibliografía
(Harlow y Lane, Antibodies, 511 -52, Cold Spring Harbor Laboratory
publications, Nueva York (1988)).
Se usa la SDS-PAGE normalmente
para el análisis de las proteínas inmunoprecipitadas, y la proteína
unida se puede analizar mediante el peso molecular de la proteína
con el uso de geles con una concentración adecuada. Debido a que la
proteína unida al polipéptido descrito en la presente memoria es
difícil de detectar mediante un método de tinción habitual, tal como
la tinción de Coomassie o la tinción de plata, la sensibilidad de la
detección para la proteína se puede mejorar cultivando las células
en un medio de cultivo que contiene un isótopo radiactivo,
^{35}S-metionina o
^{35}S-cisteína, marcando las proteínas en las
células, y detectando las proteínas. La proteína objetivo se puede
purificar directamente del gel de SDS-poliacrilamida
y se puede determinar su secuencia, cuando se ha revelado el peso
molecular de la proteína.
Como método para cribar proteínas que se unen al
polipéptido descrito en la presente memoria mediante el uso del
polipéptido, se puede usar, por ejemplo, el análisis de
transferencia de West-Western (Skolnik et
al., Cell 65: 83-90 (1991)). De manera
específica, se puede obtener una proteína que se une al polipéptido
descrito en la presente memoria preparando una biblioteca de cADN a
partir de células, tejidos, órganos (por ejemplo, tejidos tales como
líneas celulares de cáncer de mama y placenta, páncreas, estómago,
tráquea, glándula mamaria y médula ósea humanas normales), o células
cultivadas (p. ej., HBC4, HBC5, MCF-7,
MDA-MB-231, YMB1, SKBR3, T47D) que
se supone que expresan una proteína de unión al polipéptido de la
presente invención mediante el uso de un vector de fagos (p. ej.,
ZAP), expresando la proteína en LB-agarosa, fijando
la proteína expresada en un filtro, haciendo reaccionar el
polipéptido purificado y marcado descrito en la presente memoria con
el filtro anterior, y detectando las placas que expresan las
proteínas asociadas al polipéptido descrito en la presente memoria
según el marcador. El polipéptido descrito en la presente memoria se
puede marcar mediante la utilización de la unión entre biotina y
avidina, o utilizando un anticuerpo que se une de manera específica
al polipéptido descrito en la presente memoria, o un péptido o
polipéptido (por ejemplo, GST) que está fusionado al polipéptido
descrito en la presente memoria. También se pueden usar métodos que
utilizan radioisótopos o fluorescencia y similares.
De manera alternativa, en otra realización del
método de cribado descrito en la presente memoria, se puede usar un
sistema de doble híbrido mediante la utilización de células
("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "Mammalian
MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER
one-Hybrid system" (Clontech); "HybriZAP
Two-Hybrid Vector System" (Stratagene); las
referencias "Dalton y Treisman, Cell 68: 597-612
(1992)", "Fields y Sternglanz, Trends Genet 10:
286-92 (1994)").
En el sistema de doble híbrido, el polipéptido
descrito en la presente memoria se fusiona a la región de unión de
SRF o la región de unión de GAL4 y se expresa en células de
levadura. Se prepara una biblioteca de cADN a partir de células que
se supone que expresan una proteína de unión al polipéptido de la
invención, de manera que la biblioteca, cuando se expresa, está
fusionada a la región de activación transcripcional de VP16 o GAL4.
La biblioteca de cADN se introduce después en las células de
levadura anteriores y el cADN derivado de la biblioteca se aísla a
partir de los clones positivos detectados (cuando una proteína que
se une al polipéptido de la invención se expresa en las células de
levadura, la unión de las dos activa un gen indicador, que hace que
los clones positivos sean detectables). Se puede preparar una
proteína codificada por el cADN introduciendo el cADN aislado
anteriormente en E. coli y expresando la proteína.
Como gen indicador, por ejemplo, se puede usar
el gen Ade2, gen lacZ, gen CAT, el gen de luciferasa y similares,
además del gen HIS3.
También se puede cribar un compuesto que se une
al polipéptido descrito en la presente memoria mediante el uso de
cromatografía de afinidad. Por ejemplo, el polipéptido de la
invención se puede inmovilizar en un vehículo de una columna de
afinidad, y se aplica a la columna un compuesto de ensayo que
contiene una proteína capaz de unirse al polipéptido de la
invención. Un compuesto de ensayo en la presente memoria puede ser,
por ejemplo, extractos celulares, lisados celulares, etc. Después de
cargar el compuesto de ensayo, la columna se lava, y se pueden
preparar los compuestos unidos al polipéptido descrito en la
presente memoria.
Cuando el compuesto de ensayo es una proteína,
se analiza la secuencia de aminoácidos de la proteína obtenida, se
sintetiza un oligo ADN basado en la secuencia, y se criban las
bibliotecas de cADN mediante el uso del oligo ADN como sonda para
obtener un ADN que codifica la proteína.
Se puede usar un biosensor que utiliza el
fenómeno de resonancia de plasmones superficiales como medio para la
detención o la cuantificación del compuesto unido descrito en la
presente memoria. Cuando se usa el biosensor, la interacción entre
el polipéptido de la invención y un compuesto de ensayo se puede
observar en tiempo real como una señal de resonancia de plasmones
superficiales, mediante el uso solamente de una cantidad mínima de
polipéptido y sin marcaje (por ejemplo, BIAcore, Pharmacia). Por lo
tanto, es posible determinar la unión entre el polipéptido de la
invención y un compuesto de ensayo mediante el uso de un biosensor
tal como BIAcore.
Los expertos en la técnica conocen bien los
métodos de cribado en busca de moléculas que se unen cuando el
polipéptido inmovilizado de la presente invención se expone a
compuestos químicos sintéticos, o bancos de sustancias naturales o
una biblioteca aleatoria de expresión de péptidos en fagos, y los
métodos de cribado de alto rendimiento basados en técnicas de
química combinatoria (Wrighton et al., Science 273:
458-64 (1996); Verdine, Nature 384:
11-13 (1996), Hogan, Nature 384:
17-9 (1996)) para aislar no solamente proteínas sino
también compuestos químicos que se unen a la proteína de la presente
invención (lo que incluye los agonistas y antagonistas).
De manera alternativa, un método de cribado en
busca de un compuesto para el uso en el tratamiento o la prevención
del cáncer de mama mediante el uso del polipéptido descrito en la
presente memoria comprende las etapas siguientes:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con el polipéptido descrito en la presente memoria
- (b)
- detectar la actividad biológica del polipéptido de la etapa (a); y
- (c)
- seleccionar un compuesto que inhibe la actividad biológica del polipéptido en comparación con la actividad biológica detectada en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a que la proteína B7330N de la presente
invención tiene la actividad de estimular la proliferación de las
células de cáncer de mama, se puede cribar un compuesto que inhiba
esta actividad de esta proteína de la presente invención mediante el
uso de esta actividad como índice.
Se puede usar cualquier polipéptido para el
cribado, con tal de que comprenda la actividad biológica de la
proteína B7330N. Tal actividad biológica incluye la actividad de
proliferación celular de la proteína B7330N humana. Por ejemplo, se
puede usar una proteína B7330N humana, y se pueden usar también los
polipéptidos funcionalmente equivalentes a estas proteínas. Tales
polipéptidos pueden ser expresados de manera endógena o exógena por
las células.
La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento de una glicosilación nueva de la proteína B7330N, que
está implicada en la proliferación de las células cancerosas, tal
como se detalla más adelante. B7330N desempeña un papel en la
regulación autocrina del crecimiento celular por medio de la
activación de la transducción de señales para la proliferación
celular (Fig. 5a, 5b). En el mutante N476A en el que se sustituyó
476N (asparagina) con A (alanina), no se observó glicosilación
(Fig. 3b). La B7330N de tipo natural exógena se secretó en el medio
de cultivo, mientras la proteína N476A no se detectó en el medio de
cultivo, lo que sugiere que la glicosilación en
Asn-476 de la proteína B7330N es necesaria para la
secreción (Fig. 3c). Además, las células que expresaban el tipo
natural de B7330N crecieron mucho más rápido que las células
transfectadas con N476A (Fig. 8b). Por lo tanto, el crecimiento
celular del cáncer de mama se puede inhibir mediante la inhibición
de la glicosilación de B7330N.
Así, también se describe en la presente memoria
un método de cribado en busca de un compuesto para el uso en el
tratamiento o la prevención del cáncer de mama que module el nivel
de glicosilación de B7330N, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula que expresa el polipéptido B7330N o un equivalente funcional del mismo;
- (b)
- detectar el nivel de glicosilación del polipéptido; y
- (c)
- seleccionar un compuesto que inhibe el nivel de glicosilación del polipéptido en comparación con el nivel de glicosilación detectado en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera alternativa, un método de cribado en
busca de un compuesto para el uso en el tratamiento o la prevención
del cáncer de mama mediante el uso del polipéptido descrito en la
presente memoria comprende las etapas siguientes:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con el polipéptido B7330N o un polipéptido parcial que comprende el sitio de glicosilación del polipéptido B7330N, en unas condiciones capaces de posibilitar la glicosilación del polipéptido;
- (b)
- detectar el nivel de glicosilación del polipéptido; y
- (c)
- seleccionar un compuesto que inhibe el nivel de glicosilación del polipéptido en comparación con el nivel de glicosilación detectado en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto preferido de los métodos
anteriormente mencionados de cribado en busca de un compuesto para
el uso en el tratamiento o la prevención del cáncer de mama que
comprende, entre otros, la detección del nivel de glicosilación del
polipéptido de la presente invención, dicho nivel de glicosilación
es el de la asparagina 476 del polipéptido de la presente
invención, en particular es el nivel de glicosilación de la
asparagina 476 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o una
porción homóloga de la misma. Como se describió anteriormente, el
experto puede determinar fácilmente en un polipéptido de la presente
invención la posición que corresponde a la posición 476 de la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
Estos métodos se ponen en práctica poniendo en
contacto una célula que expresa el polipéptido B7330N o un
equivalente funcional del mismo que tiene un sitio de
glicosilación, o el propio polipéptido con uno o más compuestos
candidatos, y detectando el nivel de glicosilación del B7330N puesto
en contacto o del equivalente funcional del mismo.
Así se identifica un compuesto que modula el
nivel de glicosilación de B7330N o del equivalente funcional.
La expresión "funcionalmente equivalente"
también significa en la presente memoria que la proteína en cuestión
tiene el mismo nivel o sustancialmente el mismo nivel de
glicosilación que B7330N. En particular, la glicosilación se
cataliza en la proteína o en un aminoácido parcial de la proteína
que incluye el sitio de glicosilación. Se puede determinar en la
presente memoria si una proteína en cuestión tiene la actividad
seleccionada como objetivo. Concretamente, se puede detectar el
nivel de glicosilación de la proteína B7330N poniendo en contacto un
polipéptido con un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas para
la glicosilación de la proteína.
El nivel de glicosilación de un polipéptido
B7330N se puede determinar en la presente memoria mediante métodos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, la glicosilación del
polipéptido se puede detectar comparando el peso molecular. El peso
molecular de una proteína glicosilada es mayor que el tamaño
predicho calculado a partir de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido por la adición de la cadena de glicósido. Además, cuando
el peso molecular de la proteína glicosilada se puede reducir
mediante un tratamiento con glicosidasa, se confirma que la
diferencia del peso molecular está provocada por la adición de la
cadena de glicósido. Los métodos para la estimación del peso
molecular de una proteína son muy conocidos.
De manera alternativa, se puede usar un donante
radiomarcado de glicosilación para la detección de la adición de una
cadena de glicósido al polipéptido. La transferencia del
radiomarcador a la proteína B7330N se puede detectar, por ejemplo,
mediante electroforesis SDS-PAGE y fluorografía. De
manera alternativa, tras la reacción los péptidos B7330N se pueden
separar del donante de glicosilación mediante filtración, y la
cantidad de radiomarcador retenida en el filtro se cuantifica
mediante recuento de centelleo. Se conocen en la técnica otros
marcadores adecuados que se pueden unir al donante de glicosilación,
tales como los marcadores cromogénicos y fluorescentes, y los
métodos para detectar la transferencia de estos marcadores a la
proteína B7330N. De manera alternativa, se puede determinar el
nivel de glicosilación de B7330N mediante reactivos que reconocen de
manera selectiva el nivel glicosilado del polipéptido. Por ejemplo,
tras la incubación del polipéptido B7330N y del compuesto candidato,
en condiciones que posibilitan la glicosilación del polipéptido, se
puede detectar el nivel de glicosilación del polipéptido mediante un
método inmunológico. Se puede usar para la detección cualquier
técnica inmunológica que utilice un anticuerpo que reconozca un
polipéptido glicosilado. Por ejemplo, está disponible comercialmente
un anticuerpo hacia un polipéptido glicosilado. Se puede usar un
ELISA o una inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen un
polipéptido glicosilado para la presente invención.
En vez de usar anticuerpos, se puede detectar la
proteína glicosilada mediante el uso de reactivos que se unen de
manera selectiva a la cadena de glicósido con una afinidad elevada.
Tales reactivos se conocen en la técnica o se pueden determinar
mediante ensayos de cribado conocidos en la técnica. Por ejemplo, se
conocen bien las lectinas como sondas específicas de las cadenas de
glicósido. También están disponibles comercialmente los reactivos de
lectina conjugados con un marcador detectable, tal como fosfatasa
alcalina.
El nivel de glicosilación de un polipéptido en
una célula se puede estimar mediante la separación del lisado
celular. Por ejemplo, se puede usar un gel de
SDS-poliacrilamida como medio de separación del
polipéptido. El polipéptido separado en los geles se transfiere a
membranas de nitrocelulosa para el análisis mediante
inmunotransferencia.
El compuesto aislado mediante este cribado es un
candidato para los agonistas o antagonistas del polipéptido descrito
en la presente memoria. El término "agonista" se refiere a las
moléculas que activan la función del polipéptido de la presente
invención uniéndose a él. De forma similar, el término
"antagonista" se refiere a las moléculas que inhiben la función
del polipéptido descrito en la presente memoria uniéndose a él.
Además, un compuesto aislado mediante este cribado es un candidato
para los compuestos que inhiben la interacción in vivo del
polipéptido de la presente invención con otras moléculas (que
incluyen los ADNs y las proteínas).
Cuando la actividad biológica a detectar en el
presente método es la proliferación celular, se puede detectar, por
ejemplo, preparando células que expresan el polipéptido de la
presente invención, cultivando las células en presencia de un
compuesto de ensayo, y determinando la velocidad de la proliferación
celular, midiendo el ciclo celular y similares, así como midiendo la
actividad de formación de colonias tal como se describe en los
Ejemplos.
Se describen en la presente memoria métodos
adicionales para el cribado de compuestos para el uso en el
tratamiento o la prevención del cáncer de mama. Tal como se
discutió con detalle anteriormente, controlando los niveles de
expresión de B7330N se puede controlar el inicio y la progresión del
cáncer de mama. Así, los compuestos que se pueden usar en el
tratamiento o la prevención del cáncer de mama se pueden identificar
por medio de cribados que usan como índice los niveles de expresión
de B7330N. En el contexto descrito en la presente memoria, el
cribado puede comprender, por ejemplo, las siguientes etapas:
- a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula que expresa B7330N; y
- b)
- seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de B7330N en comparación con el nivel de expresión detectado en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células que expresan al menos uno de B7330N
incluyen, por ejemplo, las líneas celulares establecidas a partir de
cánceres de mama; tales células se pueden usar para el cribado
anteriormente mencionado de la presente invención (p. ej., HBC4,
HBC5, MCF-7,
MDA-MB-231, YMB1, SKBR3, T47D,
BT-20, HCC1500 o
MDA-MB-453, etc.). El nivel de
expresión se puede estimar mediante métodos muy conocidos para un
experto en la técnica. En el método de cribado, se puede seleccionar
un compuesto que reduce el nivel de expresión de B7330N como agente
candidato a ser usado para el tratamiento o la prevención del cáncer
de mama.
De manera alternativa, el método de cribado
descrito en la presente memoria puede comprender las etapas
siguientes:
- a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula en la que se ha introducido un vector que comprende la región reguladora transcripcional de un gen marcador y un gen indicador que se expresa bajo el control de la región reguladora transcripcional, en el que el gen marcador es B7330N,
- b)
- medir el nivel de expresión o actividad de dicho gen indicador; y
- c)
- seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión o actividad de dicho gen indicador en comparación con un nivel de control detectado en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes indicadores adecuados y las células
hospedadoras se conocen bien en la técnica. La construcción
indicadora necesaria para el cribado se puede preparar mediante el
uso de la región reguladora transcripcional de un gen marcador.
Cuando la región reguladora transcripcional de un gen marcador es
conocida para los expertos en la técnica, se puede preparar una
construcción indicadora mediante el uso de la información de la
secuencia previa. Cuando la región reguladora transcripcional de un
gen marcador permanece sin identificar, se puede aislar un segmento
nucleotídico que contiene la región reguladora transcripcional a
partir de una biblioteca genómica basándose en la información de la
secuencia nucleotídica del gen marcador.
Los ejemplos de soportes que se pueden usar para
unir proteínas incluyen polisacáridos insolubles, tales como
agarosa, celulosa y dextrano; y resinas sintéticas, tales como
poliacrilamida, poliestireno y silicona; se pueden usar
preferiblemente esferas y placas disponibles comercialmente (p. ej.,
placas multi-pocillo, chip biosensor, etc.)
preparadas a partir de los materiales anteriores. Cuando se usan
esferas, se pueden rellenar en una columna.
La unión de una proteína a un soporte se puede
llevar a cabo según métodos rutinarios, tales como la unión química
y la adsorción física. De manera alternativa, una proteína se puede
unir a un soporte por medio de anticuerpos que reconocen
específicamente la proteína. Además, la unión de una proteína a un
soporte también se puede llevar a cabo por medio de avidina y
biotina.
La unión entre proteínas se lleva a cabo en un
tampón, por ejemplo, pero sin limitación, tampón fosfato y tampón
Tris, con tal de que el tampón no inhiba la unión entre las
proteínas.
Se puede usar un biosensor que usa el fenómeno
de resonancia de plasmones superficiales como medio para detectar o
cuantificar la proteína unida descrita en la presente memoria.
Cuando se usa tal biosensor, la interacción entre las proteínas se
puede observar en tiempo real como una señal de resonancia de
plasmones superficiales, mediante el uso solamente de una cantidad
muy pequeña de polipéptido y sin marcaje (por ejemplo, BIAcore,
Pharmacia).
De manera alternativa, se puede marcar el
polipéptido B7330N, y el marcador de la proteína unida se puede usar
para detectar o medir la proteína unida. De manera específica,
después de pre-marcar una de las proteínas, la
proteína marcada se pone en contacto con la otra proteína en
presencia de un compuesto de ensayo, y después las proteínas unidas
se detectan o se miden según el marcador después de lavar.
Se pueden usar sustancias de marcaje tales como
radioisótopos (p. ej., ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{33}P,
^{35}S, ^{125}I, ^{131}I), enzimas (p. ej., fosfatasa
alcalina, peroxidasa de rábano,
\beta-galactosidasa,
\beta-glucosidasa), sustancias fluorescentes (p.
ej., isotiocianato de fluoresceína (FTTC), rodamina) y
biotina/avidina, para el marcaje de una proteína en el presente
método. Cuando la proteína se marca con un radioisótopo, la
detección o la medida se puede llevar a cabo mediante centelleo
líquido. De manera alternativa, las proteínas marcadas con enzimas
se pueden detectar o medir añadiendo un sustrato de la enzima para
detectar el cambio enzimático del sustrato, tal como la generación
de color, con un colorímetro. Además, en caso de que se use una
sustancia fluorescente como marcador, la proteína unida se puede
detectar o medir mediante el uso de un fluorímetro.
En caso de usar un anticuerpo en el presente
cribado, el anticuerpo se marca preferiblemente con una de las
sustancias de marcaje mencionadas anteriormente, y se detecta o se
mide basándose en la sustancia marcadora. De manera alternativa, se
puede usar el anticuerpo hacia el polipéptido B7330N o actina como
anticuerpo primario, a ser detectado con un anticuerpo secundario
que está marcado con una sustancia marcadora. Además, el anticuerpo
unido a la proteína en el cribado de la presente invención se puede
detectar o medir mediante el uso de una columna de proteína G o de
proteína A.
Se puede usar cualquier compuesto de ensayo, por
ejemplo, extractos celulares, sobrenadantes de cultivos celulares,
productos de fermentación de microorganismos, extractos de
organismos marinos, extractos de plantas, proteínas purificadas o
en bruto, péptidos, compuestos no peptídicos, compuestos
micromoleculares sintéticos y compuestos naturales, en los métodos
de cribado de la presente invención. El compuesto de ensayo descrito
en la presente memoria se puede obtener también mediante el uso de
cualquiera de las numerosas aproximaciones de métodos de bibliotecas
combinatorias conocidos en la técnica, que incluyen (1) bibliotecas
biológicas, (2) bibliotecas en fase sólida o fase de disolución
paralelas direccionables espacialmente, (3) métodos de bibliotecas
sintéticas que requieren deconvolución, (4) el método de biblioteca
de "una-esfera un-compuesto" y
(5) métodos de bibliotecas sintéticas que usan una selección
mediante cromatografía de afinidad. Los métodos de bibliotecas
biológicas que usan la selección mediante cromatografía de afinidad
se limita a las bibliotecas peptídicas, mientras las otras cuatro
aproximaciones son aplicables a bibliotecas de compuestos
peptídicos, oligómeros no peptídicos o de moléculas pequeñas (Lam
(1997) Anticancer Drug Des. 12: 145). Los ejemplos de métodos para
la síntesis de bibliotecas moleculares se pueden hallar en la
técnica (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422;
Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et
al. (1993) Science 261: 1303; Carell et al. (1994) Angew.
Chem. Int Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med.
Chem. 37: 1233). Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar
en disolución (véase Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412) o en
esferas (Lam (1991) Nature 354: 82), chips (Fodor (1993) Nature 364:
555), bacterias (pat. de EE.UU. no 5.223.409), esporas (pat. de
EE.UU. no 5.571.698:5.403.484, y 5.223.409), plásmidos (Cull et
al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865) o fagos (Scott y
Smith (1990) Science 249: 386; Devlin (1990) Science 249: 404;
Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378;
Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301; solicitud de pat. de EE.UU.
2002103360).
Un compuesto aislado mediante los métodos de
cribado descritos en la presente memoria es un candidato para los
fármacos que inhiben la actividad del polipéptido descrito en la
presente memoria, para el uso en el tratamiento o la prevención de
enfermedades atribuidas, por ejemplo, a enfermedades proliferativas
celulares, tales como el cáncer de mama. Un compuesto en el que una
parte de la estructura del compuesto obtenido mediante los presentes
métodos de cribado descritos en la presente memoria se convierte
mediante adición, deleción y/o sustitución, está incluido en los
compuestos obtenidos mediante los métodos de cribado descritos en la
presente memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen composiciones farmacéuticas
para el uso en el tratamiento o la prevención del cáncer de mama,
que comprenden cualquiera de los compuestos seleccionados mediante
los métodos de cribado descritos anteriormente.
Cuando se administra un compuesto aislado
mediante los métodos de cribado descritos en la presente memoria en
forma de una composición farmacéutica para seres humanos u otros
mamíferos, tales como ratones, ratas, conejillos de indias, conejos,
gatos, perros, ovejas, cerdos, ganado bovino, monos, babuinos,
chimpancés, para el tratamiento de una enfermedad proliferativa
celular (p. ej., cáncer de mama), el compuesto aislado se puede
administrar directamente o se puede formular en una forma
farmacéutica mediante el uso de métodos de preparación conocidos de
composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, según sea necesario, los
fármacos se pueden tomar oralmente, en forma de comprimidos
revestidos con carbohidratos, cápsulas, elixires y microcápsulas; o
de manera no oral, en forma de inyecciones de soluciones o
suspensiones estériles con agua o cualquier otro líquido
farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, los compuestos se pueden
mezclar con vehículos o medios farmacológicamente aceptables,
específicamente agua esterilizada, solución salina fisiológica,
aceite vegetal, emulsionantes, agentes de suspensión, tensoactivos,
estabilizantes, agentes aromatizantes, excipientes, vehículos,
conservantes, aglutinantes y similares, en una forma de dosis
unitaria necesaria para la aplicación de fármacos aceptada en
general. La cantidad de ingredientes activos en estas preparaciones
constituye una dosis adecuada dentro del intervalo indicado
obtenido.
Los ejemplos de aditivos que se pueden mezclar
para producir comprimidos y cápsulas son los aglutinantes tales como
gelatina, almidón de maíz, goma de tragacanto y goma arábiga;
excipientes tales como celulosa cristalina; agentes dilatadores
tales como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico; lubricantes
tales como estearato magnésico; edulcorantes tales como sacarosa,
lactosa o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta, aceite
de Gaultheria adenothrix y cereza. Cuando la forma
farmacéutica unitaria es una cápsula, también se puede incluir un
vehículo líquido, tal como un aceite, en los ingredientes
anteriores. Los compuestos estériles para inyecciones se pueden
formular siguiendo las aplicaciones con fármacos normales mediante
el uso de vehículos tales como agua destilada usada para las
inyecciones.
Se puede usar solución salina fisiológica,
glucosa y otros líquidos isotónicos que incluyen adyuvantes, tales
como D-sorbitol, D-manosa,
D-manitol y cloruro sódico, como soluciones acuosas
para las inyecciones. Estos se pueden usar junto con solubilizantes
adecuados, tales como alcohol, específicamente etanol, polialcoholes
tales como propilen glicol y polietilen glicol, tensoactivos no
iónicos, tales como Polisorbato 80 (TM) y
HCO-50.
Se puede usar aceite de sésamo o aceite de soja
como líquido oleaginoso, y se puede usar junto con benzoato de
bencilo o alcohol bencílico como solubilizantes, y se puede formular
con un tampón, tal como tampón de fosfato y tampón de acetato
sódico; un analgésico, tal como hidrocloruro de procaína; un
estabilizante, tal como alcohol bencílico, fenol; y un
antioxidante. La inyección preparada se puede rellenar en una
ampolla adecuada.
Se pueden usar métodos muy conocidos para un
experto en la técnica para administrar el compuesto farmacéutico
inventivo a los pacientes, por ejemplo en forma de inyecciones
intraarteriales, intravenosas, percutáneas y también en forma de
administraciones intranasales, intramusculares u orales. La dosis y
el método de administración varían según el peso corporal y la edad
del paciente, y según el método de administración; no obstante, un
experto en la técnica puede seleccionarlos de manera rutinaria. Si
dicho compuesto es codificable mediante un ADN, se puede insertar el
ADN en un vector para terapia génica, y se administra el vector para
llevar a cabo la terapia. La dosis y el método de administración
varían según el peso corporal, la edad, y los síntomas del paciente,
pero un experto en la técnica puede seleccionarlos de manera
rutinaria.
Por ejemplo, aunque existen algunas diferencias
dependiendo de los síntomas, la dosis de un compuesto que se une al
polipéptido de la presente invención y que regula su actividad es de
alrededor de 0,1 mg a alrededor de 100 mg por día, preferiblemente
alrededor de 1,0 mg a alrededor de 50 mg por día, y más
preferiblemente alrededor de 1,0 mg a alrededor de 20 mg por día, al
administrarlo de manera oral a un adulto normal (60 kg de peso).
Cuando se administra de manera parenteral, en
forma de una inyección a un adulto normal (60 kg de peso), aunque
existen algunas diferencias dependiendo del paciente, el órgano
seleccionado como objetivo, los síntomas y el método de
administración, es conveniente inyectar de manera intravenosa una
dosis de alrededor de 0,01 mg a alrededor de 30 mg por día,
preferiblemente alrededor de 0,1 a alrededor de 20 mg por día, y más
preferiblemente alrededor de 0,1 a alrededor de 10 mg por día.
Además, en el caso de otros animales, también es posible administrar
una cantidad convertida respecto de 60 kg de peso corporal.
Además, se describen en la presente memoria
composiciones farmacéuticas para el uso en el tratamiento o la
prevención del cáncer de mama que comprenden ingredientes activos
que inhiben la expresión del gen B7330N. Tales ingredientes activos
incluyen los polinucleótidos antisentido, siARNs o ribozimas hacia
el gen B7330N o los derivados, tales como los vectores de
expresión, de los polinucleótidos antisentido, siARNs o
ribozimas.
Estos ingredientes activos se pueden incorporar
en una preparación externa, tal como un linimento o un emplasto,
mezclándolos con un material base adecuado que es inactivo respecto
de los derivados. Además, según sea necesario, se pueden formular
en comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, cápsulas de liposomas,
inyecciones, disoluciones, gotas nasales y agentes liofilizados
mediante la adición de excipientes, agentes isotónicos,
solubilizantes, estabilizantes, conservantes, analgésicos y
similares. Estos se pueden preparar según los métodos
convencionales.
El ingrediente activo se proporciona al paciente
aplicándolo directamente en el sitio enfermo o inyectándolo en un
vaso sanguíneo de manera que alcance el sitio enfermo. También se
puede usar un medio de montaje para incrementar la duración y la
permeabilidad a las membranas. Los ejemplos de medios de montaje
incluyen los liposomas,
poli-L-lisina, lípidos, colesterol,
lipofectina o los derivados de los mismos.
Las dosis de tales composiciones de la presente
invención se pueden ajustar de manera adecuada según el estado del
paciente, y se pueden usar en las cantidades deseadas. Por ejemplo,
se puede administrar un intervalo de dosis de 0,1 a 100 mg/kg,
preferiblemente 0,1 a 50 mg/kg.
También se describe en la presente memoria una
composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o la
prevención del cáncer de mama que comprende un anticuerpo hacia un
polipéptido codificado por el gen B7330N o fragmentos del
anticuerpo que se unen al polipéptido.
Aunque existen algunas diferencias dependiendo
de los síntomas, la dosis de un anticuerpo o de los fragmentos del
mismo para el tratamiento o la prevención del cáncer de mama es de
alrededor de 0,1 mg a alrededor de 100 mg por día, preferiblemente
alrededor de 1,0 mg a alrededor de 50 mg por día, y más
preferiblemente alrededor de 1,0 mg a alrededor de 20 mg por día,
cuando se administra de manera oral a un adulto normal (60 kg de
peso).
Cuando se administra de manera parenteral, en
forma de una inyección a un adulto normal (60 kg de peso), aunque
existen algunas diferencias dependiendo del estado del paciente, los
síntomas de la enfermedad y el método de administración, es
conveniente inyectar de manera intravenosa una dosis de alrededor de
0,01 mg a alrededor de 30 mg por día, preferiblemente alrededor de
0,1 a alrededor de 20 mg por día, y más preferiblemente alrededor de
0,1 a alrededor de 10 mg por día. Además, en el caso de otros
animales, también es posible administrar una cantidad convertida
respecto de 60 kg de peso corporal.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en la presente memoria los
compuestos terapéuticos para el uso en el tratamiento o la
prevención del cáncer de mama en un sujeto. Los compuestos
terapéuticos se administran de manera profiláctica o terapéutica a
un sujeto que padece o que corre el riesgo de (o que es susceptible
a) desarrollar cáncer de mama. Tales sujetos se identifican mediante
el uso de métodos clínicos habituales o detectando un nivel de
expresión o actividad anormal de B7330N. La administración
profiláctica se da antes de la aparición de síntomas clínicos
manifiestos de la enfermedad, de forma que se previene o, de manera
alternativa, se retrasa la progresión de una enfermedad o
trastorno.
El método terapéutico incluye la disminución de
la expresión o la función del gen B7330N. En estos métodos,
el sujeto se trata con una cantidad eficaz de un compuesto, que
disminuye el gen sobreexpresado (gen B7330N) en el sujeto. La
administración puede ser sistémica o local. Los compuestos
terapéuticos incluyen los compuestos que disminuyen el nivel de
expresión de tal gen que existe de manera endógena en las células
cancerosas de mama (es decir, los compuestos que inhiben la
expresión del gen sobreexpresado). La administración de tales
compuestos terapéuticos contrarresta el efecto del gen anormalmente
sobreexpresado en las células del sujeto, y se supone que mejora el
estado clínico del sujeto. Tales compuestos se pueden obtener
mediante el método de cribado descrito anteriormente.
La expresión del gen B7330N se puede
inhibir también de cualquiera de varias maneras conocidas en la
técnica, que incluyen la administración al sujeto de un ácido
nucleico que inhibe o antagoniza la expresión del gen. Se pueden
usar oligonucleótidos antisentido, siARN o ribozimas que interrumpen
la expresión del gen para inhibir la expresión del gen. Los
oligonucleótidos antisentido, siARN o ribozimas que se pueden usar
para inhibir la expresión del gen B7330N se describieron
anteriormente en la presente memoria.
Como se indicó anteriormente, se pueden usar
oligonucleótidos antisentido que corresponden a la secuencia
nucleotídica del gen B7330N para reducir el nivel de
expresión del gen B7330N. De manera específica, los
oligonucleótidos antisentido descritos en la presente memoria
pueden actuar uniéndose a cualquiera de los polipéptidos codificados
por el gen B7330N, o a los mARNs correspondientes, por lo que
inhiben la transcripción o la traducción del gen, favorecen la
degradación de los mARNs, y/o inhiben la expresión de las proteínas
codificadas por el gen, y finalmente inhiben la función de las
proteínas B7330N.
Los oligonucleótidos antisentido y los derivados
de los mismos se pueden incorporar en una preparación externa, tal
como un linimento o un emplasto, mezclándolos con un material base
adecuado que es inactivo respecto del derivado, y usarlos en el
método para el uso en el tratamiento o la prevención del cáncer de
mama descrito en la presente memoria.
Los ácidos nucleicos que inhiben un producto
génico del gen sobreexpresado también incluyen los ARNs pequeños de
interferencia (siARN), que comprenden una combinación de una cadena
con sentido de ácido nucleico y una cadena antisentido de ácido
nucleico de la secuencia nucleotídica codificada por el gen
B7330N. Se pueden usar técnicas habituales de introducción de
siARN en células en el tratamiento o la prevención de la presente
invención, lo que incluye aquellas en las que el ADN es un molde a
partir del cual se transcribe el ARN. El siARN se construye de
manera que un único transcrito tiene tanto las secuencias con
sentido como las secuencias antisentido complementarias del gen
seleccionado como objetivo, por ejemplo, una horquilla, para inhibir
la expresión del gen en una célula con una expresión activada del
gen B7330N. La unión del siARN al transcrito del gen
B7330N en la célula seleccionada como objetivo da como
resultado una reducción de la producción de la proteína B7330N en la
célula.
Los ácidos nucleicos que inhiben un producto
génico del gen sobreexpresado incluyen también las ribozimas hacia
el gen sobreexpresado (gen B7330N).
Además, se describe en la presente memoria un
anticuerpo hacia el polipéptido descrito en la presente memoria para
el uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad
proliferativa celular, tal como el cáncer de mama, en el que se
administra una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo
hacia el polipéptido descrito en la presente memoria. Debido a que
la expresión de la proteína B7330N está activada en las células de
cáncer de mama y la inhibición de la expresión de estas proteínas
conduce a una disminución de la actividad de proliferación celular,
se espera que las enfermedades proliferativas celulares se puedan
tratar o prevenir mediante la unión del anticuerpo a estas
proteínas.
Así, se administra un anticuerpo hacia el
polipéptido descrito en la presente memoria a una dosis suficiente
para reducir la actividad de la proteína descrita en la presente
memoria que está en el intervalo de 0,1 a alrededor de 250 mg/kg por
día. El intervalo de dosis para seres humanos adultos es
generalmente de alrededor de 5 mg a alrededor de 17,5 g/día,
preferiblemente de alrededor de 5 mg a alrededor de 10 g/día, y lo
más preferiblemente de alrededor de 100 mg a alrededor de 3
g/día.
De manera alternativa, se puede usar un
anticuerpo que se une a un marcador de la superficie celular
específico de las células tumorales como herramienta para la
administración de fármacos. Por ejemplo, se administra el anticuerpo
conjugado a un agente citotóxico a una dosis suficiente para
lesionar las células tumorales.
Otro aspecto descrito en la presente memoria
comprende el agente que inhibe la glicosilación de la asparagina 476
de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido descrito en la
presente memoria, en particular la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido de SEQ ID NO: 25 para el uso en el tratamiento o la
prevención del cáncer de mama. También se describe en la presente
memoria una composición farmacéutica que comprende la proteína
B7330N o un fragmento inmunológicamente activo de la misma, o un
polinucleótido que codifica la proteína o un fragmento de la misma
para el uso en la inducción de inmunidad antitumoral. La proteína
B7330N o los fragmentos inmunológicamente activos de la misma son
útiles como vacunas contra enfermedades proliferativas celulares
tales como el cáncer de mama. En algunos casos, las proteínas o los
fragmentos de las mismas se pueden administrar en una forma asociada
al receptor de células T (TCR) o se pueden presentar mediante una
célula presentadora de antígenos (APC), tal como macrófagos, células
dendríticas (DC), o células B. Debido a la intensa capacidad de
presentación de antígenos de las DC, es más preferible el uso de DC
entre las APCs.
La vacuna contra una enfermedad proliferativa
celular descrita en la presente memoria se refiere a una sustancia
que tiene la función de inducir una actividad antitumoral tras la
inoculación en animales. En general, la inmunidad antitumoral
incluye respuestas inmunitarias tales como las siguientes:
- -
- inducción de linfocitos citotóxicos contra tumores,
- -
- inducción de anticuerpos que reconocen tumores, y
- -
- inducción de la producción de citocinas antitumorales.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, cuando cierta proteína induce
cualquiera de estas respuestas inmunitarias tras la inoculación en
un animal, se decide que la proteína tiene un efecto inductor de
inmunidad antitumoral. La inducción de la inmunidad antitumoral
mediante una proteína se puede detectar observando in vivo o
in vitro la respuesta del sistema inmunitario en el
hospedador contra la proteína.
Por ejemplo, se conoce bien un método para la
detección de la inducción de linfocitos T citotóxicos. Una sustancia
exógena que entra en un organismo vivo se presenta a las células T y
a las células B mediante la acción de las células presentadoras de
antígenos (APCs). Las células T que responden al antígeno presentado
por las APC de una manera específica del antígeno se diferencian en
células T citotóxicas (o linfocitos T citotóxicos; CTLs) debido a la
estimulación por el antígeno, y después proliferan (esto se denomina
activación de las células T). Por lo tanto, la inducción de los CTL
mediante un péptido dado se puede estudiar presentando el péptido a
las células T mediante APC, y detectando la inducción de CTL.
Además, las APC tienen el efecto de activar las células T CD4+,
células T CD8+, macrófagos, eosinófilos, y células NK. Debido a que
las células T CD4+ y las células T CD8+ son importantes también en
la inmunogenicidad antitumoral, la acción de inducción de la
inmunidad antitumoral del péptido se puede estudiar mediante el uso
del efecto de activación de estas células como indicador.
Se conoce bien en la técnica un método para el
estudio de la acción de inducción de CTL mediante el uso de células
dendríticas (DCs) como APC. DC es una APC representativa que tiene
la acción de inducción de CTL más intensa entre las APCs. En este
método, el polipéptido de ensayo se pone en contacto inicialmente
con DC, y después estas DC se ponen en contacto con las células T.
La detección de las células T que tienen efectos citotóxicos contra
las células de interés tras el contacto con DC demuestra que el
polipéptido de ensayo tiene una actividad de inducción de las
células T citotóxicas. La actividad de CTL contra los tumores se
puede detectar, por ejemplo, mediante el uso de la lisis de células
tumorales marcadas con ^{51}Cr como indicador. De manera
alternativa, también se conoce bien el método de determinación del
grado de daño en las células tumorales mediante el uso de la
actividad de captación de ^{3}H-timidina o de
liberación de LDH (lactosa deshidrogenasa) como indicador.
Aparte de las DC, también se pueden usar células
mononucleares de sangre periférica (PBMCs) como APC. Se ha informado
de que la inducción de los CTL se puede incrementar cultivando PBMC
en presencia de GM-CSF e IL-4. De
manera similar, se ha demostrado que los CTL se inducen cultivando
PBMC en presencia de hemocianina de lapa californiana (KLH) e
IL-7.
Los polipéptidos de ensayo que se confirma que
poseen actividad de inducción de CTL mediante estos métodos son
polipéptidos que tienen un efecto de activación de DC y una
actividad inductora de CTL posterior. Por lo tanto, los polipéptidos
que inducen CTL contra las células tumorales son útiles como vacunas
contra los tumores. Además, las APC que adquieren la capacidad de
inducir CTL contra los tumores al entrar en contacto con los
polipéptidos son útiles como vacunas contra los tumores. Además, los
CTL que adquieren citotoxicidad debido a la presentación de los
antígenos polipeptídicos por las APC también se pueden usar como
vacunas contra los tumores. Tales métodos terapéuticos para tumores
mediante el uso de la inmunidad antitumoral debida a APC y CTL se
denomina inmunoterapia celular.
En general, cuando se usa un polipéptido para la
inmunoterapia celular, se sabe que la eficacia de la inducción de
CTL se incrementa combinando una diversidad de polipéptidos que
tienen estructuras diferentes y poniéndolos en contacto con DC. Por
lo tanto, cuando se estimulan DC con fragmentos de proteínas, es
ventajoso usar una mezcla de múltiples tipos de fragmentos.
De manera alternativa, la inducción de la
inmunidad antitumoral mediante un polipéptido se puede confirmar
observando la inducción de la producción de anticuerpos hacia los
tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos hacia un
polipéptido en un animal de laboratorio inmunizado con el
polipéptido y cuando se inhibe el crecimiento de las células
tumorales mediante estos anticuerpos, se puede determinar que el
polipéptido tiene la capacidad de inducir inmunidad antitumoral.
La inmunidad antitumoral se induce mediante la
administración de la vacuna de esta invención, y la inducción de la
inmunidad antitumoral posibilita el tratamiento y la prevención de
enfermedades proliferativas celulares, tales como el cáncer de mama.
La terapia contra el cáncer o la prevención del inicio del cáncer
incluye cualquier etapa, tal como la inhibición del crecimiento de
las células cancerosas, la involución del cáncer y la eliminación de
la aparición del cáncer. También están incluidos como efecto de la
terapia o la prevención del cáncer la disminución de la mortalidad
de los individuos que tienen cáncer, la disminución de los
marcadores tumorales en la sangre, el alivio de los síntomas
detectables asociados al cáncer y similares. Tales efectos
terapéuticos y preventivos son preferiblemente significativos
estadísticamente. Por ejemplo, en observación, a un nivel de
significación del 5% o menos, en el que el efecto terapéutico o
preventivo de una vacuna contra una enfermedad proliferativa celular
se compara con un control sin administración de la vacuna. Por
ejemplo, se puede usar la prueba t de Student, la prueba U de
Mann-Whitney o ANOVA para el análisis
estadístico.
La proteína anteriormente mencionada que tiene
actividad inmunológica o un vector que codifica la proteína se
pueden combinar con un adyuvante. Un adyuvante se refiere a un
compuesto que aumenta la respuesta inmunitaria contra la proteína
cuando se administra junto (o sucesivamente) con la proteína que
tiene actividad inmunológica. Los ejemplos de adyuvantes incluyen la
toxina del cólera, la toxina de salmonella, alumbre y similares,
pero no se limitan a estos. Además, la vacuna de esta invención se
puede combinar de manera apropiada con un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Los ejemplos de tales vehículos son agua esterilizada,
solución salina fisiológica, tampón de fosfato, líquido de cultivo y
similares. Además, la vacuna puede contener, según sea necesario,
estabilizantes, agentes de suspensión, conservantes, tensoactivos y
similares. La vacuna se administra de manera sistémica o local. La
administración de la vacuna se puede llevar a cabo mediante una
única administración o se puede reforzar mediante administraciones
múltiples.
Cuando se usan APC o CTL como la vacuna descrita
en la presente memoria, los tumores se pueden tratar o prevenir,
por ejemplo, mediante el método ex vivo. Más específicamente,
se recogen PBMCs de un sujeto que recibe tratamiento o terapia
preventiva, las células se ponen en contacto con el polipéptido
ex vivo, y tras la inducción de APC o CTL, las células se
pueden administrar al sujeto. También se pueden inducir las APC
introduciendo un vector que codifica el polipéptido en PBMCs ex
vivo. Las APC o CTL inducidas in vitro se pueden clonar
antes de la administración. Mediante la clonación y el cultivo de
las células que tienen una actividad elevada para dañar las células
seleccionadas como objetivo, se puede llevar a cabo la inmunoterapia
celular de una manera más eficaz. Además, las APC y CTL aisladas de
esta manera se pueden usar para la inmunoterapia celular no
solamente en los individuos de los que procedían las células, sino
también contra tipos similares de tumores de otros individuos.
Además, se describe en la presente memoria una
composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o la
prevención de una enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer
de mama, que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del
polipéptido B7330N. La composición farmacéutica se puede usar para
generar inmunidad antitumoral. La expresión normal de B7330N se
limita a la placenta, páncreas, estómago, traquea, glándula mamaria
y médula ósea. Por lo tanto, la inhibición de este gen no puede
afectar de manera adversa a otros órganos. Así, los polipéptidos
B7330N son preferibles para el uso en el tratamiento de enfermedades
proliferativas celulares, especialmente el cáncer de mama. Además,
debido a que se reveló que los fragmentos peptídicos de las
proteínas expresadas específicamente en las células cancerosas
inducen una respuesta inmunitaria contra el cáncer, también se
pueden usar los fragmentos peptídicos de B7330N en una composición
farmacéutica para el uso en el tratamiento o la prevención de
enfermedades proliferativas celulares tales como el cáncer de mama.
El polipéptido o el fragmento del mismo descrito en la presente
memoria se administra a una dosis suficiente para inducir inmunidad
antitumoral, que está en el intervalo de 0,1 mg a 10 mg,
preferiblemente 0,3 mg a 5 mg, más preferiblemente 0,8 mg a 1,5 mg.
Las administraciones se repiten. Por ejemplo, se puede administrar 1
mg del péptido o del fragmento del mismo 4 veces cada dos semanas
para inducir la inmunidad antitumoral.
Además, se pueden usar polinucleótidos que
codifican B7330N o fragmentos del mismo para generar la inmunidad
antitumoral. Tales polinucleótidos se pueden incorporar en un vector
de expresión para expresar B7330N o los fragmentos del mismo en un
sujeto a tratar. Así, se describe en la presente memoria una
composición farmacéutica que comprende los polinucleótidos que
codifican B7330N o los fragmentos del mismo para el uso en la
inducción de inmunidad antitumoral, en la que dicha composición
farmacéutica se administra a un sujeto que padece o que corre el
riesgo de desarrollar enfermedades proliferativas celulares tales
como cáncer de mama.
Por supuesto, las realizaciones descritas en la
presente memoria para los métodos de tratamiento o prevención del
cáncer de mama o los métodos para la inducción de inmunidad
antitumoral, en particular inmunidad antitumoral de mama se aplican,
mutatis mutandis, al uso de cualquiera de los compuestos que
se aplican en dichos métodos de tratamiento o prevención del cáncer
de mama o en dichos métodos de inducción de inmunidad antitumoral
tal como se describen en la presente memoria para la preparación de
una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del
cáncer de mama o para la inducción de inmunidad antitumoral, en
particular inmunidad antitumoral de mama en un sujeto.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar la presente invención, y para ayudar a alguien de
experiencia habitual a hacer y usar los mismos.
A menos que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen
el mismo significado que comprende habitualmente un experto en la
técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar
métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el
presente documento en la práctica o en el ensayo de la presente
invención, los métodos y materiales adecuados se describen a
continuación. Cualquier patente, solicitud de patente y publicación
citada en la presente memoria se incorpora como referencia. Nada en
esta memoria debe ser interpretado como una admisión de que la
invención no tiene derecho a ser un precedente de tal descripción en
virtud de la invención anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se ilustra con detalle
mediante los siguientes Ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares de cáncer de mama humanas
HBL-100, HCC1937, MCF-7,
MDA-MB-435s, YMB1, SKBBR3, T47D,
BT-20, BT-474,
BT-549, HCC1143, HCC1500, HCC1599,
MDA-MB-157,
MDA-MB4S3, OUCB-F,
ZR-75-1 y COS-7 se
adquieren de la American Type Culture Collection (ATCC) y se
cultivan con las recomendaciones respectivas de su depositante. Las
líneas celulares HBC4, HBC5 y
MDA-MB-231 fueron amablemente
donadas por el Dr. Yamori de Farmacología Molecular, Centro de
Quimioterapia del Cáncer de la Fundación Japonesa para la
Investigación del Cáncer. Todas las células se cultivaron en medios
adecuados; es decir, RPMI-1640 (Sigma, St. Louis,
MO) para HBC4, HBC5, T47D, YMB1, OUCB-F,
ZR-75-1, BT-549,
HCC1143, HCC1500, HCC1599 y HCC1937 (con L-glutamina
2 mM); Medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad,
CA) para BT474, HBL100, COS7; EMEM (Sigma) con aminoácidos
esenciales 0,1 mM (Roche), piruvato sódico 1 mM (Roche), 0,01 mg/ml
de Insulina (Sigma) para BT-20 y
MCF-7; McCoy (Sigma) para SKBR3 (con
L-glutamina 1,5 mM); L-15 (Roche)
para MDA-MB-231,
MDA-MB-157,
MDA-MB453 y
MDA-MB-43Ss. Cada medio se
complementó con un 10% de suero bovino fetal (Cansera) y un 1% de
disolución de antibiótico/antimicótico (Sigma). Las células
MDA-MB-231 y
MDA-MB-435s se mantuvieron a 37ºC
en una atmósfera de aire humidificado sin CO_{2}. Las otras líneas
celulares se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera de aire
humidificado con un 5% de CO_{2}. Las muestras clínicas (cáncer de
mama y conducto mamario normal) se obtuvieron de muestras
quirúrgicas, con respecto a las cuales todos los pacientes habían
dado un consentimiento informado.
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La fabricación de portaobjetos de micromatrices
de cADN se ha descrito en otra parte (Ono K, et al., (2000)
Cancer Res., 60, 5007-11). Para cada análisis de los
perfiles de expresión se prepararon grupos duplicados de placas que
contenían 27.648 puntos de cADN, para reducir la fluctuación
experimental. Brevemente, se purificó el ARN total de cada muestra
de células microdiseccionadas con láser, y se llevó a cabo una
amplificación de ARN basada en T7 para obtener cantidades adecuadas
de ARN para los experimentos con las micromatrices. Las alícuotas
del ADN amplificado a partir de las células de cáncer de mama y de
las células ductales de mama normales se marcaron mediante
transcripción inversa con Cy5-dCTP y
Cy3-dCTP, respectivamente (Amersham Biosciences,
Buckinghamshire, R.U.). La hibridación, el lavado y la detección se
llevaron a cabo como se describió previamente (Ono K, et al.,
(2000) Cancer Res., 60, 5007-11). Para detectar los
genes que estaban activados normalmente en el cáncer de mama, se
cribaron los patrones de expresión globales de los 27.648 genes de
la micromatriz para seleccionar aquellos con tasas de expresión
>3,0 que los presentes en >50% de i) los 77 casos de cáncer de
mama premenopáusicos, ii) 69 carcinomas ductales invasivos, iii) 31
lesiones bien, iv) 14 moderadamente, o v) 24 escasamente
diferenciadas, respectivamente. Del total de 493 genes que
parecieron estar activados en las células tumorales, se concentró la
atención en uno con un número de identificación interno, B7330N,
debido a que su tasa de expresión fue mayor de 3,0 en más del 30% de
los casos de cáncer de mama informativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo el ARN total de cada población de
células capturadas con láser y después se llevó a cabo una
amplificación basada en T7 y transcripción inversa como se
describió previamente (Kitahara O, et al., (2001) Cancer
Res., 61, 3544-9). Se prepararon diluciones
adecuadas de cada cADN monocatenario para la PCR posterior
monitorizando la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) como control interno cuantitativo. Las
secuencias del cebador de PCR fueron
5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3' (SEQ ID
NO; 1) y 5'- GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ ID NO;
2) para GAPDH; y
5'-GAGTCCAGGTAAGTGAATCTGTCC-3' (SEQ
ID NO; 3) y
5'-ATTTCCACC
GAGACCTCTCATC-3' (SEQ ID NO; 4) para B7330N.
GAGACCTCTCATC-3' (SEQ ID NO; 4) para B7330N.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN total se extrajo de todas las líneas
celulares de cáncer de mama mediante el uso del equipo RNeasy
(QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el tratamiento con DNasa I (Nippon Gene, Osaka, Japón), se aisló el mARN con un equipo de purificación de mARN (Amersham Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se separó una alícuota de 1 mg de cada mARN, junto con ARNs poli A(+) aislados de mama (BioChain), pulmón, corazón, hígado, riñón, médula ósea de humanos adultos normales (BD, Clontech, Palo Alto, CA), en geles de agarosa desnaturalizante al 1% y se transfirieron a membranas de nailon (transferencias de Northern de cáncer de mama). Las transferencias de Northern de cáncer de mama y de múltiples tejidos humanos (Clontech, Palo Alto, CA) se hibridaron con los productos de PCR marcados con [\alpha^{32}P]-dCTP de B7330N preparados mediante RT-PCR (véase más adelante). La pre-hibridación, la hibridación y los lavados se llevaron a cabo según las recomendaciones del proveedor. Las transferencias se autorradiografiaron con filtros intensificadores a -80ºC durante 14 días. Se prepararon sondas específicas para B7330N (502 pb) mediante RT-PCR con el uso del siguiente grupo de cebadores; 5'-GAGTC
CAGGTAAGTGAATCTGTCC-3' (SEQ ID NO; 3) y 5'-ATTTCCACCGAGACCTCTCATC-3' (SEQ ID NO; 4) y se marcaron radiactivamente con el sistema de marcaje de ADN Megaprime (Amersham Bioscience).
(QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el tratamiento con DNasa I (Nippon Gene, Osaka, Japón), se aisló el mARN con un equipo de purificación de mARN (Amersham Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se separó una alícuota de 1 mg de cada mARN, junto con ARNs poli A(+) aislados de mama (BioChain), pulmón, corazón, hígado, riñón, médula ósea de humanos adultos normales (BD, Clontech, Palo Alto, CA), en geles de agarosa desnaturalizante al 1% y se transfirieron a membranas de nailon (transferencias de Northern de cáncer de mama). Las transferencias de Northern de cáncer de mama y de múltiples tejidos humanos (Clontech, Palo Alto, CA) se hibridaron con los productos de PCR marcados con [\alpha^{32}P]-dCTP de B7330N preparados mediante RT-PCR (véase más adelante). La pre-hibridación, la hibridación y los lavados se llevaron a cabo según las recomendaciones del proveedor. Las transferencias se autorradiografiaron con filtros intensificadores a -80ºC durante 14 días. Se prepararon sondas específicas para B7330N (502 pb) mediante RT-PCR con el uso del siguiente grupo de cebadores; 5'-GAGTC
CAGGTAAGTGAATCTGTCC-3' (SEQ ID NO; 3) y 5'-ATTTCCACCGAGACCTCTCATC-3' (SEQ ID NO; 4) y se marcaron radiactivamente con el sistema de marcaje de ADN Megaprime (Amersham Bioscience).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción de vectores de expresión de
B7330N, se amplificó la secuencia codificante completa del cADN
B7330N mediante PCR con el uso de la ADN polimerasa
KOD-Plus (Toyobo, Osaka, Japón) y los siguientes
cebadores; directo,
5'-CGGAATTCATGAGGCTCCTCCGCAG-3' (SEQ
ID NO; 5), (el subrayado indica el sitio EcoRI), inverso,
5'-CCGCTCGAGGACAAAGAGCCACAACTGATG-3'.
(SEQ ID NO; 6) (el subrayado indica el sitio XhoI). Los productos de
la PCR se insertaron en los sitios EcoRI y XhoI del vector de
expresión pCAGGS-HA. Para hacer las construcciones
de los mutantes de B7330N, se sustituyeron dos residuos de
asparagina (Asn-476 y Asn-611) que
se había predicho que eran sitios potenciales de
N-glicosilación en la proteína B7330N con residuos
de alanina mediante el uso de un equipo de mutagénesis dirigida por
PCR (Invitrogen) y los siguientes cebadores;
N476A-F, 5'-
ACAACTGCACTGTCACGCCTTTTCCTGGTACCTGC-3' (SEQ ID NO;7)
y N476A-R,
5'-GCAGG
TACCAGGAAAAGGCGTGACAGTGCAGTTGT-3' (SEQ ID NO; 8); N611A-F, 5'-CATGGCCCCCTGCGCACC
CAGTGACCCCC-3' (SEQ ID NO; 9) y N611A-R, 5'-GGGGGTCACTGGGTGCGCAGGGGGCCATG-3' (SEQ ID NO; 10). Estas construcciones (pCAGGS-B7330N-HA, pCAGGS-N476A-HA y pCAGGS-N611A-HA) se confirmaron mediante secuenciación del ADN. Para hacer una construcción para los experimentos de dimerización, se clonó la secuencia codificante completa del vector pcDNA3.1-myc-his (Invitrogen).
TACCAGGAAAAGGCGTGACAGTGCAGTTGT-3' (SEQ ID NO; 8); N611A-F, 5'-CATGGCCCCCTGCGCACC
CAGTGACCCCC-3' (SEQ ID NO; 9) y N611A-R, 5'-GGGGGTCACTGGGTGCGCAGGGGGCCATG-3' (SEQ ID NO; 10). Estas construcciones (pCAGGS-B7330N-HA, pCAGGS-N476A-HA y pCAGGS-N611A-HA) se confirmaron mediante secuenciación del ADN. Para hacer una construcción para los experimentos de dimerización, se clonó la secuencia codificante completa del vector pcDNA3.1-myc-his (Invitrogen).
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar inicialmente la localización
subcelular de B7330N exógena, se sembraron células COS7 a 1x10^{5}
por pocillo para la expresión exógena. Después de 72 horas, se
transfectó transitoriamente 1 mg de
pCAGGS-B7330N-HA en las células
COS7 mediante el uso del reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche)
según las instrucciones del fabricante, respectivamente. Después,
las células se fijaron con PBS que contenía un 4% de
paraformaldehído durante 15 min, y se permeabilizaron con PBS que
contenía un 0,1% de Triton X-100 durante 2,5 min a
4ºC. Posteriormente, las células se cubrieron con un 3% de BSA en
PBS durante 12 horas a 4ºC para bloquear la hibridación
inespecífica. A continuación, las células COS7 transfectadas con
B7330N-HA se incubaron con un anticuerpo
anti-HA de rata (Roche) a una dilución 1:1000.
Después de lavar con PBS(-), las células transfectadas se tiñeron
con un anticuerpo secundario anti-rata conjugado a
Alexa488 (Molecular Probe) a una dilución 1:1000. Se realizó una
tinción de contraste de los núcleos con dihidrocloruro de
4',6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI). Se obtuvieron imágenes fluorescentes en un microscopio TCS
SP2 AOBS (Leica, Tokio, Japón).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon plásmidos diseñados para expresar
dos fragmentos de B7336N (35-239 aa.) con un epítopo
marcado con His en su extremo N-terminal y
C-terminal mediante el uso del vector pET28
(Novagen, Madison, WI). El péptido recombinante se expresó en
Escherichia coli, cepa BL21 Codon-plus
(Stratagene, La Jolla, CA), y se purificó mediante el uso de resina
de agarosa Ni-NTA (Qiagen) según los protocolos del
proveedor. La proteína recombinante purificada se sometió a
inmunización en ratones. Los sueros inmunes se purificaron en
columnas de afinidad mediante el uso de una proteína recombinante
(35-239 aa.) según la metodología habitual. Se
usaron anticuerpos anti-B7330N purificados por
afinidad para las transferencias de Western, inmunocitotinción y
tinción inmunohistoquímica como se describe más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Para detectar la proteína B7330N endógena en
líneas celulares de cáncer de mama (HBC5,
MDA-MB-231, SKBR3, y T47D) y HMEC
(célula epitelial de glándula mamaria humana), las células se
lisaron en tampón de lisis como se describió anteriormente. La
cantidad de proteína total se estimó mediante un equipo de ensayo de
proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA) y después se
mezcló con tampón de muestras-SDS y se llevó a
ebullición antes de cargarlo en un gel de SDS-PAGE
del 10% como se describió anteriormente. Tras la electroforesis, las
proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (GE
Healthcare). Las membranas que incluían las proteínas se bloquearon
mediante una disolución de bloqueo y se incubaron con un anticuerpo
policlonal anti-B7330N para la detección de la
proteína B7330N endógena. Finalmente, la membrana se incubó con un
anticuerpo secundario conjugado a HRP y las bandas de proteína se
visualizaron mediante reactivos de detección por ECL (GE
Healthcare). Se examinó la \beta-actina para que
sirviese como control de carga.
Para examinar adicionalmente la localización
subcelular de la proteína B7330N endógena en la línea celular de
cáncer de mama, T47D, se sembraron las células a 1x10^{5} células
por pocillo (portaobjetos con cámara Lab-Tek H,
Nalgen Nunc International, Naperville, IL). Después de una
incubación de 24 horas, las células se fijaron con PBS(-) que
contenía un 4% de paraformaldehído durante 15 min, y se
permeabilizaron con PBS (-) que contenía un 0,1% de Triton
X-100 a 4ºC durante 2,5 min. Posteriormente, las
células se cubrieron con un 3% de BSA en PBS (-) a 4ºC durante 12
horas para bloquear la hibridación inespecífica, seguido por una
incubación con un anticuerpo policlonal anti-B7330N
de conejo diluido 1:1000. Después de lavar con PBS (-), las células
se tiñeron mediante un anticuerpo secundario
anti-conejo conjugado a Alexa488 (Molecular Probe,
Eugene, OR) diluido 1:1000. Se realizó una tinción de contraste de
los núcleos con dihidrocloruro de
4',6'-diamidina-2'-fenilindol
(DAPI). Se obtuvieron imágenes fluorescentes en un microscopio TCS
SP2 AOBS (Leica, Tokio, Japón).
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigaron los patrones de expresión de la
proteína B7330N en el cáncer de mama y en tejidos normales como se
describió previamente (Kitahara O, et al. Cancer Res 61,
3544-3549 (2001)) mediante el uso de un anticuerpo
policlonal anti-B7330N purificado por afinidad. Para
la investigación de los órganos normales, se adquirieron cortes de
tejidos disponibles comercialmente de corazón, pulmón, hígado, riñón
y páncreas (Biochain). Brevemente, las muestras incrustadas en
parafina se trataron con xileno y etanol, y se bloquearon mediante
un reactivo bloqueante de proteínas (Dako Cytomation, Carpinteria,
CA). Se añadió el anticuerpo anti-B7330N en una
disolución diluida de anticuerpo (1:50) y después se tiñó con
sustrato-cromógeno (DAKO liquid DAB chromogen,
DakoCytomation). Finalmente, se tiñeron las muestras de tejido con
hematoxilina para distinguir el núcleo del citoplasma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estableció un sistema de ARNi basado en
vector mediante el uso del vector de expresión de siARN psiU6BX3.0
según un informe previo (documento WO2004076623). Se preparó un
vector de expresión de siARN contra B7330N
(psiU6BX-B7330N) mediante la clonación de los
oligonucleótidos bicatenarios de la Tabla 1 en el sitio BbsI
del vector psiU6BX3.0. Se prepararon plásmidos de control
psiU6BX-Mock mediante los sitios BsiI y
HindIII del sitio de clonación múltiple del vector
psiU6BX3.0, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los subrayados indican las secuencias de siARN
específicas de B7330N.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares de cáncer de mama humano,
T47D o BT-20, se colocaron en placas de 15 cm
(4x10^{6} células/placa) y se transfectaron con 16 \mug de cada
psiU6BX-Mock como control negativo y
psiU6BX-B7330N mediante el uso del reactivo FuGENE6
según las recomendaciones del proveedor (Roche). 24 horas tras la
transfección, las células se volvieron a sembrar de nuevo para el
ensayo de formación de colonias (2x10^{6} células/placa de 10 cm),
RT-PCR (2x10^{6} células/placa de 10 cm) y el
ensayo de MTT (2x10^{6} células/pocillo). Se seleccionaron las
células que producían B7330N con medio que contenía 0,7 mg/ml o 0,6
mg/ml de neomicina (Geneticin, Invitrogen) en las células T47D o
BT-20, respectivamente. Después, se cambió el medio
cada dos días durante 3 semanas. Para estudiar el funcionamiento de
los siARN, se extrajo el ARN total de las células a los 7 días tras
la selección con neomicina, y después se confirmó el efecto de
inhibición de los siARNs mediante una RT-PCR
semicuantitativa con el uso de grupos de cebadores específicos para
B7330N y GAPDH;
5'-ATGGAAATCCCATCACCATCT-3' (SEQ ID
NO; 11) y
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ
ID NO; 2) para GAPDH como control interno, y
5'-GGATGAAACATACCCCATCA-3' (SEQ ID
NO;12) y 5'-ATGACACTAGTGCCCTTGG-3'
(SEQ ID NO; 13) para B7330N. Además, los transfectantes que
expresaban los siARNs mediante el uso de las líneas celulares T47D o
BT-20 se cultivaron durante 28 días en medios
selectivos que contenían neomicina, respectivamente. Tras la
fijación con un 4% de paraformaldehído, las células transfectadas se
tiñeron con disolución de Giemsa para determinar la formación de
colonias. Se llevaron a cabo ensayos de MTT para cuantificar la
viabilidad celular. Después de 10 días de cultivo en el medio que
contenía neomicina, se añadió una disolución de MTT (bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazolio) (Sigma) a una concentración de 0,5 mg/ml. Tras la
incubación a 37ºC durante 2,5 horas, se añadió
ácido-SDS (HCl 0,01 N/10% de SDS); la suspensión se
mezcló enérgicamente y después se incubó durante la noche a 37ºC
para disolver los cristales de color azul oscuro. Se midió la
absorbancia a 570 nm con un lector de microplacas 550 (BioRad). Para
estudiar el funcionamiento del siARN, se extrajo el ARN total de las
células 7 días tras la selección, y se llevó a cabo el ensayo de MTT
10 días tras la selección mediante el uso del equipo Cell Counting
Kit-8 (Dojindo) según el protocolo del fabricante.
La absorbancia se mide a una longitud de onda de 570 nm con un
lector de microplacas 550 (BioRad). Para el ensayo de formación de
colonias, las células se fijan con un 4% de paraformaldehído durante
15 min antes de teñirlas con una disolución de Giemsa (Merck). Cada
experimento se realiza por triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de expresión de B7330N de tamaño
completo y del mutante N476A se transfectaron en células NIH3T3
mediante el uso de FLTGENE6 como se describió anteriormente. Las
células transfectadas se incubaron en el medio de cultivo que
contenía 0,9 mg/ml de geneticina (G418) (Invitrogen). Las células
NIH3T3 clonales se subclonaron mediante dilución limitante. Se
determinó la expresión y la localización subcelular de B7330N
marcada con HA mediante análisis de transferencia de Western e
inmunocitoquímica mediante el uso de un anticuerpo monoclonal
anti-HA, respectivamente. Finalmente, se
establecieron varios clones y se denominaron
WT-B7330N y N476A-B7330N. Para
investigar el efecto estimulador del crecimiento de B7330N de tipo
natural o de N476A-B7330N, se sembraron 5000 células
de dos células WT-B7330N-NIH3T3
independientes (WT-1, y -2), dos células
independientes N476A-B7330N-NIH3T3
(N476A-1 y -2) y dos células independientes
MOCK-NIH3T3 (Mock-1 y -2), y se
contó el número de células mediante el ensayo de MTT cada día
durante 6 días. Estos experimentos se llevaron a cabo por
triplicado.
triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la expresión de la proteína B7330N
exógena en células COS7, mediante el uso de células COS7
transfectadas con pCAGGS-B7330N-HA,
pCAGGS-N476A-HA o
pCAGGS-N611A-HA y Mock como control
negativo, respectivamente. Las células se lisaron en un 0,1 % de
tampón de lisis NP-40 que contenía 50 mmol/L de
Tris-HCl (pH 8,0), 150 mmol/L de NaCl, y 0,1% de
mezcla de inhibidores de proteasas III (Calbiochem, San Diego, CA).
Los lisados celulares se separaron en geles de un 8% de
SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa, y después se incubaron con pAb
anti-HA de rata como anticuerpo primario. Tras la
incubación con IgG-HRP anti-rata de
cabra como anticuerpo secundario (Amersham Biosciences), se
visualizaron las señales con un equipo de ECL (Amersham
Biosciences). Para detectar la proteína B7330N secretada, se
mantuvieron las células COS7 transfectadas con B7330N, N476A, o
N611A en un medio exento de suero durante 48 horas tras la
transfección y después se cultivaron durante 4 días. También se
detectó la proteína B7330N en los lisados celulares y en los medios
de cultivo condensados mediante pAb anti-HA de rata
e IgG-HRP anti-rata. El pAb de
\beta-actina (dilución 1:2000) sirvió como control
de carga para las proteínas (clon AC-15,
Sigma-Aldrich, MO). Para confirmar la glicosilación
de la proteína B7330N, también se prepararon inicialmente lisados
celulares como se describió anteriormente sin incluir la mezcla de
inhibidores de proteasas III. Cada 10 ml de lisado celular se mezcló
con 10 ml de tampón de lisis y 1 U de N-glicosidasa
F (Calbiochem, San Diego, CA), y después se incubó durante 1 hora a
37ºC. La reacción se llevó a ebullición con el tampón de muestras de
SDS.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células COS7 transfectadas con B7330N se
mantuvieron en medio exento de FCS durante dos días, y después se
cultivaron las células COS7 originarias con o sin B7330N en el medio
para confirmar la estimulación autocrina del crecimiento celular
durante 4 días. El efecto de B7330N sobre el crecimiento celular se
monitorizó contando las células con un hemocitómetro y un ensayo de
MTT como se describió anteriormente. Las células (5x10^{3}
células/pocillo) se cultivaron en DMEM que contenía un 0,1% de
FCS.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto del anticuerpo
anti-B7330N sobre el crecimiento celular se
monitorizó contando las células con un hemocitómetro. Las líneas
celulares de cáncer de mama, T47D y HBL-100, se
sembraron en microplacas de 12 pocillos (5x10^{4} células/pocillo)
y se cultivaron durante 5 días en medio de McCoy 5A que contenía un
1% de FBS complementado con 10,2 \mug/mL de pAb
anti-B7330N purificado por afinidad, o con PBS(-)
como control negativo. El número de células se determinó como se
describió anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se analizaron los perfiles de expresión
de genes de células cancerosas de 77 pacientes de cáncer de mama
premenopáusico mediante el uso de una micromatriz de cADN que
representaba 27.648 genes humanos, se identificaron 493 genes que
estaban activados normalmente en las células de cáncer de mama.
Entre ellos, se centró la atención en B7330N, denominado
UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina:
polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 6,
GALNT6, que está localizado en el cromosoma 12q13 con un
transcrito de mARN de una longitud de 4381 ó 4556 bases que consiste
en 11 exones. La expresión de B7330N estaba elevada en 27 de 77
(35%) casos de cáncer de mama de los que se pudieron obtener datos
sobre la expresión. Para confirmar el patrón de expresión de este
gen en el cáncer de mama, se llevó a cabo un análisis mediante
RT-PCR semicuantitativa mediante el uso de líneas
celulares de cáncer de mama y tejidos humanos normales que incluyen
células mamarias normales. Como resultado, se descubrió que B7330N,
cuya expresión se demostró que estaba elevada en 7 de 12 muestras
clínicas de cáncer de mama (lesiones escasamente diferenciadas) en
comparación con las células ductales de mama normales y otros
tejidos normales (Fig. 1a), se sobreexpresaba en 7 de 20 líneas
celulares de cáncer de mama (Fig. 1b). Para examinar adicionalmente
el perfil de expresión de este gen, se llevaron a cabo análisis de
transferencia de Northern con múltiples tejidos humanos y líneas
celulares de cáncer de mama mediante el uso de un fragmento de cADN
de B7330N como sonda. Como resultado, se observó que un transcrito
de aproximadamente 5 kb se expresaba exclusivamente en la placenta,
páncreas, estómago y traquea humanos normales (Fig. 1c). Cuando se
examinó adicionalmente el patrón de expresión de estos transcritos
con una transferencia de Northern de cáncer de mama, se descubrió
que este transcrito estaba sobreexpresado específicamente en las
líneas celulares de cáncer de mama, en comparación con los tejidos
humanos normales que incluían glándula mamaria y médula ósea (Fig.
1d).
El gen GALNT6 codifica una proteína de
622 aminoácidos que es capaz de glicosilar el péptido de
fibronectina in vitro y que se expresa en una línea celular
de fibroblastos, lo que indica que puede estar implicado en la
síntesis de la fibronectina oncofetal. La predicción informática
mediante SMART y PFAM demuestra que GALNT6 contiene un péptido
señal, el motivo Glycos_transf_2 en los residuos 180 a 370, y el
motivo RICIN en los residuos 496 a 622.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar la caracterización de B7330N, se
investigó la localización subcelular de los productos del gen en las
células mamíferas. En primer lugar, se transfectaron de manera
transitoria plásmidos que expresaban la proteína B7330N
(pCAGGS-B7330N-HA) en células COS7,
y el análisis inmunocitoquímico con anticuerpo
anti-marcador de HA revela que la proteína B7330N
exógena apareció en forma de un patrón granuloso en las vesículas de
secreción de todas las células COS7 transfectadas durante 72 horas
tras la transfección (Fig. 2a). Después, para examinar la secreción
extracelular de B7330N, se llevó a cabo un análisis de transferencia
de Western con el uso de lisados celulares y medio de cultivo de las
células COS7 que se habían transfectado de manera transitoria con un
plásmido diseñado para expresar B7330N (véase la sección Materiales
y Métodos), y un anticuerpo hacia el marcador de HA
C-terminal detectó la secreción de la proteína en el
medio de cultivo (Fig. 2b).
Se descubrió que el peso molecular de los
productos de B7330N estimado mediante análisis de transferencia de
Western era mayor que el tamaño predicho calculado a partir de las
secuencias de cADN (Fig. 2b). Debido a que la secuencia de
aminoácidos primaria de B7330N contiene dos secuencias consenso
predichas de glicosilación asociada a N, para confirmar si estos
dos productos de B7330N mayores estaban glicosilados, se trató
inicialmente la proteína con una N-glicosilasa. Como
resultado, la proteína B7330N más grande desapareció del lisado
celular, lo que indica que esta proteína estaba glicosilada en las
células mamíferas (Fig. 3a). Posteriormente, para determinar el
sitio de glicosilación asociado a N, se establecieron construcciones
mutantes de sitios potenciales de N-glicosilación
de la proteína B7330N (véase la sección Materiales y Métodos).
Después se transfectaron estos plásmidos, de tipo natural, N476A o
N611A a células COS-7, respectivamente, y se
inmunotransfirieron con un anticuerpo anti- marcador de HA. De
manera interesante, se observó que la banda mayor de las células
transfectadas con N476A desapareció, pero con la proteína de tipo
natural y N611A no hubo cambio en los lisados celulares, lo que
indica que Asn-476 es un sitio de glicosilación
supuesto (Fig. 3b). Además, para determinar si la glicosilación era
necesaria para la secreción de B7330N, se examinó si se secretada al
medio de cultivo la proteína N476A exógena y B7330N de tipo natural
en las células COS7. De manera interesante, la B7330N de tipo
natural exógena se secretó en el medio de cultivo, mientras la
proteína N476A no se detectó en el medio de cultivo, lo que sugiere
que la glicosilación en Asn-476 de la proteína
B7330N es necesaria para la secreción (Fig. 3c).
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrolló un anticuerpo policlonal hacia
B7330N, y después se investigó la expresión endógena de la proteína
B7330N en los lisados celulares de las líneas celulares de cáncer de
mama, SKBR3, T47D y HMEC (célula epitelial mamaria humana) como
control de los experimentos mediante análisis de transferencia de
Western (Fig. 7a). Ambas líneas celulares de cáncer de mama
mostraron niveles elevados de expresión de B7330N, mientras la línea
de células epiteliales mamarias normales, HMEC no mostraron
expresión. El análisis inmunocitoquímico posterior de las líneas
celulares de cáncer de mama, T47D, mediante el uso de un anticuerpo
policlonal anti-B7330N indicó que la localización de
la proteína B7330N endógena apareció en forma de un patrón granuloso
en las vesículas de secreción en las células de cáncer de mama, al
igual que el de la proteína B7330N expresada de manera exógena (Fig.
7b). Para investigar adicionalmente la expresión de B7330N en cortes
de cáncer de mama y de tejidos normales, también se llevó a cabo la
tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo
anti-B7330N. Se identificó una tinción intensa en
el citoplasma de dos subtipos histológicos diferentes de cáncer de
mama, el carcinoma papilo-tubular (571T) y el
carcinoma intraductal (164T), pero su expresión fue difícilmente
detectable en los tejidos mamarios normales (425N) (Fig. 7c).
Además, de acuerdo con los resultados del análisis de transferencia
de Northern, no se observó expresión en corazón, pulmón, hígado,
riñón y páncreas (Fig. 7d).
\newpage
Para determinar el papel estimulador del
crecimiento de B7330N, se eliminó la expresión de B7330N endógena en
las líneas de cáncer de mama T47D y BT-20 (Fig. 4),
que han mostrado sobreexpresión de B7330N, por medio de la técnica
de ARN de interferencia (ARNi) basada en vector de mamífero (véase
la sección de Materiales y Métodos). Se examinó el nivel de
expresión de B7330N mediante experimentos de RT-PCR
semicuantitativa. Tal como se muestra en la Fig. 4a, entre las dos
construcciones de siARN del gen examinado, los siARNs específicos de
B7330N (si1 y si2) inhibieron la expresión, en comparación con las
construcciones de siARN de control (psiU6BX-Mock).
Para confirmar la inhibición del crecimiento celular con los siARNs
específicos de B7330N, se llevaron a cabo ensayos de MTT y ensayos
de formación de colonias, respectivamente (Fig. 4b, c). Como
resultado, la introducción de las construcciones de siARN de B7330N
inhibió el crecimiento de estas células de cáncer de mama, de forma
coherente con el resultado de la expresión reducida anterior de este
gen. Cada resultado se verificó mediante tres experimentos
independientes. Así, estos hallazgos indican que B7330N tiene una
función significativa en el crecimiento celular del cáncer de
mama.
Para confirmar adicionalmente el efecto
estimulador del crecimiento de B7330N, se establecieron células
derivadas de NIH3T3 que expresaron de manera estable B7330N exógena
(células
NIH3T3-WT-B7330N-1,
-2 y
NIH3T3-N476A-B7330N-1,
-2). El análisis de transferencia de Western indicó un nivel
elevado de proteína WT-B7330N y
N476A-B7330N exógena en dos clones derivados,
respectivamente (Fig. 8a). Los ensayos de MTT posteriores
demostraron que tres líneas celulares derivadas,
NIH3T3-B7330N-1 y -2, crecieron
mucho más rápido que las células transfectadas con un plásmido
simulado (células NTH3T3-Mock-1, -2
y -3), mientras las células con proteína
N476A-B7330N crecieron de manera moderada en
comparación con WT-B7330N-1, -2
(Fig. 8b), lo que indica que fue probable que la expresión de
B7330N aumentase el crecimiento celular con dependencia de la
expresión.
Además, se observó la forma
N-glicosilada en las células
WT-B7330N, mientras no se observó en las células
N476A-B7330N (Fig. 8a). Estos resultados confirmaron
que la banda mayor desapareció tras el tratamiento del ensayo de
N-glicosidasa descrito anteriormente (datos no
mostrados).
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Se preparó un medio de cultivo que contenía
proteína B7330N, derivada del medio usado para cultivar las células
COS7 que sobreexpresaban B7330N (Fig. 5a), y se cultivaron células
COS7 originarias en este medio. Este experimento que usaba B7330N
nativa reveló un crecimiento aumentado de las células COS7 (Fig.
5a). Este resultado apoya firmemente la conclusión de que B7330N,
una molécula secretora, funciona como un factor de crecimiento
autocrino que es esencial para la proliferación de las células de
cáncer de mama. Además, cuando se añadió pAb
anti-B7330N a los medios de cultivo que daban
soporte a las células de la línea celular T47D de cáncer de mama, el
crecimiento de esta línea celular se inhibió de manera significativa
en comparación con el tratamiento con PBS(-) (Fig. 5b; panel
izquierdo), aunque las células HBL-100, que no
expresan B7330N, no se vieron influidas por este tratamiento con
este pAb (Fig. 5b; panel derecho).
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Debido a que se informó de que algunas de las
glicosiltransferasas formaban un dímero en las células
(El-Battari A, et al., Glycobiology.
2003;13(12):941-53), se examinó si B7330N
también es capaz de oligomerizar con inmunoprecipitación.
Cuando se inmunoprecipitó la proteína
pCAGGS-B7330N-HA exógena con un
anticuerpo anti-HA, un análisis de transferencia de
Western con el uso de un anticuerpo anti-HA reveló
la proteína B7330N exógena en forma de una banda que correspondía al
doble de la masa molecular predicha.
Para investigar esa hipótesis, se diseñaron dos
tipos de construcciones de B7330N marcadas para examinar la
homo-oligomerización. Se
co-transfectaron
pCAGGS-B7330N-HA y
pcDNA3.1-B7330N-myc en células
COS-7 y se co-inmunoprecipitaron
mediante el uso de un anticuerpo anti-HA o
anti-myc, respectivamente. Tal como se muestra en la
Fig. 6, mediante el uso de un anticuerpo anti-myc
para captar pcDNA3.1-B7330N-myc se
dio como resultado la co-inmunoprecipitación de
pCAGGS-B7330N-HA, y mediante el uso
de un anticuerpo anti-HA para captar
pCAGGS-B7330N-HA se dio como
resultado la co-inmunoprecipitación de
pcDNA3.1-B7330N-myc. Estos hallazgos
indicaron que B7330N es capaz de constituir un complejo
homo-oligomérico únicamente en las células
vivas.
En esta invención, a través de los perfiles de
expresión precisos del cáncer de mama por medio de una micromatriz
de cADN de todo el genoma, se aislaron genes nuevos, B7330N, que se
sobreexpresaban de manera significativa en las células de cáncer de
mama, en comparación con los tejidos humanos normales.
B7330N, denominada
UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina:
polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa
6,
GALNT6, se selecciona para el estudio debido a su expresión significativamente elevada en el cáncer de mama. Se identificó que los transcritos de aproximadamente 5 kb mostraban una expresión específica del cáncer. Se demostró que el tratamiento de las células de cáncer de mama con siARN inhibió de manera eficaz la expresión de B7330N e inhibió de manera significativa el crecimiento celular/tumoral del cáncer de mama. Estos hallazgos indican que B7330N podría desempeñar un papel clave en la proliferación y el crecimiento de las células tumorales, y podría ser un objetivo prometedor para el desarrollo de fármacos antineoplásicos.
GALNT6, se selecciona para el estudio debido a su expresión significativamente elevada en el cáncer de mama. Se identificó que los transcritos de aproximadamente 5 kb mostraban una expresión específica del cáncer. Se demostró que el tratamiento de las células de cáncer de mama con siARN inhibió de manera eficaz la expresión de B7330N e inhibió de manera significativa el crecimiento celular/tumoral del cáncer de mama. Estos hallazgos indican que B7330N podría desempeñar un papel clave en la proliferación y el crecimiento de las células tumorales, y podría ser un objetivo prometedor para el desarrollo de fármacos antineoplásicos.
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En este informe, a través de los perfiles de
expresión precisos del cáncer de mama por medio de una micromatriz
de cADN de todo el genoma, se aislaron genes nuevos, B7330N, que se
sobreexpresaban de manera significativa en las células de cáncer de
mama, en comparación con los tejidos humanos normales. Además, se
demostró que el tratamiento de las células de cáncer de mama con
siARN inhibió de manera eficaz la expresión del gen objetivo,
B7330N, e inhibió de manera significativa el crecimiento
celular/tumoral del cáncer de mama. Estos hallazgos indican que
B7330N podría desempeñar un papel clave en la proliferación y el
crecimiento de las células tumorales, y podría ser un objetivo
prometedor para el desarrollo de fármacos antineoplásicos.
B7330N, denominado
UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina:
polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa
6,
GALNT6, se selecciona para el estudio debido a su expresión significativamente elevada en el cáncer de mama. Se identificó que los transcritos de aproximadamente 5 kb mostraban una expresión específica del cáncer. Se demostró que el tratamiento de las células de cáncer de mama con siARN inhibió de manera eficaz la expresión de B7330N e inhibió de manera significativa el crecimiento celular/tumoral del cáncer de mama. Estos hallazgos indican que B7330N podría desempeñar un papel clave en la proliferación y el crecimiento de las células tumorales, y podría ser un objetivo prometedor para el desarrollo de fármacos antineoplásicos.
GALNT6, se selecciona para el estudio debido a su expresión significativamente elevada en el cáncer de mama. Se identificó que los transcritos de aproximadamente 5 kb mostraban una expresión específica del cáncer. Se demostró que el tratamiento de las células de cáncer de mama con siARN inhibió de manera eficaz la expresión de B7330N e inhibió de manera significativa el crecimiento celular/tumoral del cáncer de mama. Estos hallazgos indican que B7330N podría desempeñar un papel clave en la proliferación y el crecimiento de las células tumorales, y podría ser un objetivo prometedor para el desarrollo de fármacos antineoplásicos.
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La expresión del gen humano B7330N está
elevada de manera notable en el cáncer de mama en comparación con el
epitelio ductal de mama no canceroso. Por lo tanto, este gen es útil
como marcador de diagnóstico del cáncer de mama, y las proteínas
codificadas son útiles por tanto en ensayos de diagnóstico del
cáncer de mama.
También se ha demostrado que la expresión de la
proteína nueva B7330N estimula el crecimiento celular, a la vez que
el crecimiento celular se inhibe mediante ARNs pequeños de
interferencia que corresponden al gen B7330N. Estos hallazgos
demuestran que la proteína B7330N estimula la actividad oncógena.
Así, cada una de estas nuevas oncoproteínas es un objetivo útil para
el desarrollo de productos farmacéuticos antineoplásicos. Por
ejemplo, los agentes que bloquean la expresión de B7330N, o que
impiden su actividad, tienen utilidad terapéutica como agentes
antineoplásicos, en particular agentes antineoplásicos para el
tratamiento de los cánceres de mama. Los ejemplos de tales agentes
incluyen los oligonucleótidos antisentido, los ARNs pequeños de
interferencia, y las ribozimas contra el gen B7330N, y los
anticuerpos que reconocen B7330N.
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<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.
UNIVERSIDAD DE TOKIO
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<120> GEN Y POLIPÉPTIDO RELACIONADOS CON
EL CÁNCER DE MAMA
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> ONC-A0514P
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<150> 60/703.658
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
29-07-2005
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 27
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Una secuencia cebadora sintetizada
artificialmente para RT-PCR
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<223> Una secuencia cebadora sintetizada
artificialmente para RT-PCR
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artificialmente para RT-PCR
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artificialmente para RT-PCR
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<223> Una secuencia cebadora sintetizada
artificialmente para RT-PCR
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artificialmente para RT-PCR
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artificialmente para PCR
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artificialmente para PCR
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artificialmente para PCR
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artificialmente para PCR
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<223> Una secuencia cebadora sintetizada
artificialmente para RT-PCR
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<223> Una secuencia cebadora sintetizada
artificialmente para RT-PCR
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<223> Una secuencia cebadora sintetizada
artificialmente para RT-PCR
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<223> Un oligonucleótido sintetizado
artificialmente para la construcción de un vector de expresión de
siARN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Un oligonucleótido sintetizado
artificialmente para la construcción de un vector de expresión de
siARN
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<213> Artificial
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<223> Un oligonucleótido sintetizado
artificialmente para la construcción de un vector de expresión de
siARN
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<223> Un oligonucleótido sintetizado
artificialmente para la construcción de un vector de expresión de
siARN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia objetivo para siARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcactgtttc aatgccttt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> diseño de horquilla de siARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcactgtttc aatgcctttt tcaagagaaa aggcattgaa acagtgc
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un oligonucleótido sintetizado
artificialmente para la construcción de un vector de expresión de
siARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccgagaaa tccttcggtg acattcaaga gatgtcaccg aaggatttct c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un oligonucleótido sintetizado
artificialmente para la construcción de un vector de expresión de
siARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaagagaaa tccttcggtg acatctcttg aatgtcaccg aaggatttct c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia objetivo para siARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaaatcct tcggtgaca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> diseño de horquilla de siARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaaatcct tcggtgacat tcaagagatg tcaccgaagg atttctc
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1866)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 622
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (207)..(2072)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 622
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Un método in vitro de cribado en busca
de un compuesto para el tratamiento o la prevención del cáncer de
mama, y dicho método comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (2)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o una secuencia que tiene al menos una homología del 80% respecto de SEQ ID NO: 25; y
- (3)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (b)
- detectar la actividad de unión entre el polipéptido y el compuesto de ensayo; y
- (c)
- seleccionar un compuesto que se une al polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método in vitro de cribado en busca
de un compuesto para el tratamiento o la prevención del cáncer de
mama, y dicho método comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (2)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o una secuencia que tiene al menos una homología del 80% respecto de SEQ ID NO: 25; y
- (3)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (b)
- detectar la actividad biológica del polipéptido de la etapa (a); y
- (c)
- seleccionar un compuesto que inhibe la actividad biológica del polipéptido en comparación con la actividad biológica detectada en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
3 El método de la reivindicación 2, en el que la
actividad biológica es una actividad de proliferación celular.
4. Un método in vitro de cribado en busca
de un compuesto para el tratamiento o la prevención del cáncer de
mama, y dicho método comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (2)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o una secuencia que tiene al menos una homología del 80% respecto de SEQ ID NO: 25;
- (3)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y
- (4)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos parcial de SEQ ID NO: 25 que incluye el sitio de glicosilación de cualquier polipéptido de (1) a (3);
- (b)
- detectar el nivel de glicosilación del polipéptido; y
- (c)
- seleccionar un compuesto que inhibe el nivel de glicosilación del polipéptido en comparación con el nivel de glicosilación detectado en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
5. El método de la reivindicación 4, en el que
el nivel de glicosilación es el de la asparagina 476 de la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o una posición homóloga a la
misma.
6. Un método in vitro de cribado en busca
de un compuesto para el tratamiento o la prevención del cáncer de
mama, y dicho método comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula que expresa un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (2)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o una secuencia que tiene al menos una homología del 80% respecto de SEQ ID NO: 25;
- (3)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y
- (4)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos parcial de SEQ ID NO: 25 que incluye el sitio de glicosilación de cualquier polipéptido de (1) a (3); y
- (b)
- seleccionar un compuesto que inhibe el nivel de glicosilación del polipéptido en comparación con el nivel de glicosilación detectado en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método de la reivindicación 6, en el que
el nivel de glicosilación es el de la asparagina 476 de la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o una posición homóloga a la
misma.
8. Un método in vitro de cribado en busca
de un compuesto para el tratamiento o la prevención del cáncer de
mama, y dicho método comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula que expresa un polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26; y
- (b)
- seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de un polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26 en comparación con el nivel de expresión detectado en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El método de la reivindicación 8, en el que
la célula es una célula de cáncer de mama.
10. Un método in vitro de cribado en
busca de un compuesto para el tratamiento o la prevención del cáncer
de mama, y dicho método comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula en la que se ha introducido un vector que comprende la región reguladora transcripcional de un gen marcador y un gen indicador que se expresa bajo el control de la región reguladora transcripcional, en el que el gen marcador comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26,
- (b)
- medir el nivel de expresión o actividad de dicho gen indicador; y
- (c)
- seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión o actividad de dicho gen indicador en comparación con el nivel de expresión o actividad de dicho gen indicador detectado en ausencia del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Una composición para el uso en el
tratamiento o la prevención del cáncer de mama, y dicha composición
comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un
polinucleótido antisentido o un ARN pequeño de interferencia contra
un polinucleótido y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el
que el polinucleótido codifica un polipéptido seleccionado del
grupo que consiste en:
- (a)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, delecionados, insertados y/o añadidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y
- (c)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
\vskip1.000000\baselineskip
12. La composición de la reivindicación 11, en
la que dicho ARN pequeño de interferencia comprende la secuencia
nucleotídica que corresponde a la secuencia nucleotídica de SEQ ID
NOs: 18 ó 22 como secuencia objetivo.
13. La composición de la reivindicación 12, en
la que dicho siARN tiene la fórmula general
5'-[A]-[B]-[A']-3', en la que [A] es una secuencia
ribonucleotídica que corresponde a la secuencia nucleotídica de SEQ
ID NOs: 18 ó 22,
- [B]
- es una secuencia ribonucleotídica que consiste en 3 a 23 nucleótidos, y
- [A']
- es una secuencia ribonucleotídica que consiste en la secuencia complementaria de [A].
\vskip1.000000\baselineskip
14. La composición de la reivindicación 11, en
la que dicha composición comprende un agente potenciador de la
transfección.
15. Una composición para el uso en el
tratamiento o la prevención del cáncer de mama, y dicha composición
comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo
hacia un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
- (a)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, delecionados, insertados y/o añadidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y
- (c)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
\vskip1.000000\baselineskip
16. El uso de una cantidad farmacéuticamente
eficaz de un polinucleótido antisentido, o ARN pequeño de
interferencia contra un polinucleótido que codifica un polipéptido
seleccionado del grupo que consiste en:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (2)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, delecionados, insertados y/o añadidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y
- (3)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
17. El uso de la reivindicación 16, en el que
dicho siARN comprende la secuencia nucleotídica que corresponde a la
secuencia nucleotídica de SEQ ID NOs: 18 ó 22 como secuencia
objetivo.
18. El uso de la reivindicación 17, en el que
dicho siARN tiene la fórmula general
5'-[A]-[B]-[A']-3', en la que [A] es una secuencia
ribonucleotídica que corresponde a la secuencia nucleotídica de SEQ
ID NOs: 18 ó 22,
- [B]
- es una secuencia ribonucleotídica que consiste en 3 a 23 nucleótidos, y
- [A']
- es una secuencia ribonucleotídica que consiste en la secuencia complementaria de [A].
\vskip1.000000\baselineskip
19. El uso de la reivindicación 16, en el que
dicha composición comprende un agente potenciador de la
transfección.
\newpage
20. El uso de una cantidad farmacéuticamente
eficaz de un anticuerpo hacia un polipéptido seleccionado del grupo
que consiste en:
- (a)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, delecionados, insertados y/o añadidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; y
- (c)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
21. El uso de una cantidad farmacéuticamente
eficaz de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en
(a)-(c), o un polinucleótido que codifica el polipéptido:
- (a)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o un fragmento de la misma;
- (b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, delecionados, insertados y/o añadidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, delecionados, insertados y/o añadidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (c)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o un fragmento de la misma para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
22. El uso de un polipéptido que consiste en la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o un fragmento del misma,
un polinucleótido que codifica el polipéptido o un vector que
comprende el polinucleótido para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer de mama,
en el que el polipéptido induce inmunidad
anti-tumoral.
23. El uso de una célula presentadora de
antígenos, que presenta un polipéptido que consiste en la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o un fragmento de la misma para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la
prevención del cáncer de mama, en el que el polipéptido induce
inmunidad anti-tumoral.
24. Una composición farmacéutica para el uso en
el tratamiento o la prevención del cáncer de mama, y dicha
composición comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un
polipéptido seleccionado del grupo de (a)-(c), o un polinucleótido
que codifica el polipéptido:
- (a)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o un fragmento de la misma;
- (b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, delecionados, insertados y/o añadidos, y que tiene una actividad biológica equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;
- (c)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que consiste en la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 24 ó 26, en el que el polipéptido tiene una actividad biológica equivalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o un fragmento de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
25. La composición farmacéutica de la
reivindicación 24, en la que el polinucleótido se incorpora en un
vector de expresión.
26. Una molécula bicatenaria que comprende una
cadena con sentido y una cadena antisentido, en la que la cadena
antisentido comprende una secuencia ribonucleotídica que es
complementaria respecto de dicha cadena con sentido, en la que dicha
cadena con sentido y dicha cadena antisentido hibridan entre sí para
formar dicha molécula bicatenaria, y en la que dicha molécula
bicatenaria, cuando se introduce en una célula que expresa el
polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID
NOs: 24 ó 26, inhibe la expresión de dicho gen, en la que la
secuencia objetivo de la cadena con sentido consiste en SEQ ID NO:
18 ó 22.
27. La molécula bicatenaria de la reivindicación
26, en la que un único transcrito ribonucleotídico comprende la
cadena con sentido y la cadena antisentido, y dicha molécula
bicatenaria comprende además una secuencia ribonucleotídica
monocatenaria que une dicha cadena con sentido y dicha cadena
antisentido.
28. Un vector que codifica la molécula
bicatenaria de la reivindicación 26.
29. El vector de la reivindicación 28, en el que
el vector codifica un transcrito que tiene una estructura
secundaria, en el que el transcrito comprende la cadena con sentido
y la cadena antisentido.
30. El vector de la reivindicación 28, en el que
el transcrito comprende además una secuencia ribonucleotídica
monocatenaria que une dicha cadena con sentido y dicha cadena
antisentido.
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