CN101278060A - 作为乳腺癌标志的基因galnt6和针对基因galnt6的小干扰rna - Google Patents

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Abstract

本申请提供新的人类基因GALNT6，其在乳腺癌中表达明显增加。该基因及由该基因编码的多肽可以例如，在乳腺癌的诊断中用作开发针对该疾病的药物的靶分子，例如siRNAs，以及用于减弱乳腺癌的细胞生长。

Description

作为乳腺癌标志的基因GALNT6和针对基因GALNT6的小干扰RNA
本申请要求2005年7月29日提交的美国临时专利申请流水号60,703,658的权益，在此将其全部内容引证并入本文。
技术领域
本发明涉及生物科学领域，具体而言本发明涉及癌症治疗和诊断领域。特别是本发明涉及由新基因B7330N编码的乳腺癌相关新多肽。进而，本发明涉及新基因B7330N。本发明的基因和多肽，例如可以用于乳腺癌的诊断中，作为抗病药物开发的靶标分子，以及用于减弱乳腺癌的细胞生长。
背景技术
乳腺癌是一种遗传上异质的疾病(genetically heterogeneous disease)，它是在女性中最为常见的恶性肿瘤。全世界每年报道的推测的新发病例约为800,000例(Parkin DM.等，(1999)CA Cancer J Clin 49：33-64)。目前，对于该疾病的治疗，在同时并用的选择方案中，乳房切除术是首选的治疗方案。然而，即便手术切除了原发性肿瘤，由于诊断时存在不能检出的微小转移(Saphner T.等，(1996)J Clin Oncol 14，2738-2746)，在局部或远端部位复发。为了杀死这样的残留细胞或癌前细胞，通常在手术后作为辅助疗法施用细胞毒剂。
使用传统的化学治疗剂的治疗常常依赖于经验，其主要是基于组织学的肿瘤参数，而缺乏对具体机制的认识。因而，靶向性药物正逐渐成为针对乳腺癌的基本治疗。他莫昔芬(Tamoxifen)和芳香酶抑制剂是此类药物的2个代表，将其作为辅剂或化学预防剂适用于患有转移性乳腺癌的患者，获得了良好的反应(Fisher B.等(1998)J Natl Cancer Inst 90，1371-88；Cuzick J(2002)Lancet 360，817-24)。然而，其缺点是：只有表达雌激素受体的患者才对这些药物敏感。最近，人们对其副作用的关注程度有所提高，这些副作用明显集中在长期的他莫昔芬治疗引发子宫内膜癌的可能性和对接受芳香酶治疗的绝经后女性中骨折的有害作用(Coleman RE(2004)Oncology.18(5 Suppl 3)，16-20)。
因为副作用和耐药性的产生，基于特征明确的作用机制探索和鉴定选择性智能(smart)药物的新分子靶标，现在已经十分必要。为了实现该目标，本发明人解析了包括8例DCIS和69例IDC的77例乳腺肿瘤的表达模式(expression profile)，其中通过激光微束显微解剖(laser microbeammicrodissection，LMM)和相当于27648个基因的cDNA微阵列的组合进行纯化。由这些实验获得的数据，不仅应当是提供了乳腺肿瘤形成相关的重要信息，而且对于候选基因的鉴定是非常重要的，所述候选基因的产物可作为诊断标记和/或与乳腺癌治疗相关的分子靶标起作用。
在本发明中，本发明人通过乳腺癌的表达模式分离了在乳腺癌细胞中显著过高表达的新基因B7330N，而且，进一步通过半定量RT-PCR和Northern印迹分析确认了B7330N在乳腺癌细胞中是过高表达的。本发明人发现，采用siRNA治疗乳腺癌细胞可以有效抑制B7330N的表达，显著抑制乳腺癌的细胞/肿瘤生长。总之，本发明人提出，B7330N，又称GALNT6，是用于诊断标记和乳腺癌药物开发的卓越的新候选分子。
旨在揭示癌症发生机制的研究工作促进了抗肿瘤剂分子靶标的鉴定。例如，在动物模型中，法尼基转移酶抑制剂(FTI)可有效治疗Ras依赖性肿瘤(Sun J等，(1998)Oncogene 16：1467-73.)，当初开发该抑制剂的目的是为了抑制活化依赖于翻译后法尼基化的Ras相关的生长信号传导途径。类似地，使用抗癌药物、以拮抗原癌基因受体HER2/neu为目的的抗HER2单克隆抗体和trastuzumab的组合对人体进行的临床测定，改善了乳腺癌患者的临床反应和总存活(Molina MA，等，(2001)Cancer Res.；61(12)：4744-9.)。此外，已经开发出能够选择性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-571以治疗慢性髓性白血病，在所述慢性髓性白血病中，bcr-abl酪氨酸激酶的组成型活化在白细胞转化中起着至关重要的作用。这些种类的药物被设计成用于抑制具体基因产物的致癌活性(O′Dwyer ME&Druker BJ.(2000)CurrOpin Oncol.；12(6)：594-7)。因此，在癌细胞中通常上调的基因产物显然可以成为开发新抗癌剂的潜力靶标。
已证实，CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)能识别MHC I类分子上呈递的肿瘤相关抗原(TAA)的表位肽并裂解肿瘤细胞。自发现首例TAA即MAGE家族以来，采用免疫学手段已经发现了很多其它的TAA(Boon，(1993)Int JCancer 54：177-80；Boon and van der Bruggen，(1996)J Exp Med 183：725-9；van der Bruggen等，(1991)Science 254：1643-7；Brichard V等，(1993)J ExpMed 178：489-95；Kawakami Y等，(1994)J Exp Med 180：347-52.)。目前，正作为免疫疗法的靶标对一些新发现的TAA进行临床开发。迄今为止所发现的TAA包括MAGE(van der Bruggen等，(1991)Science 254：1643-7)，gp100(Kawakami Y等，(1994)J Exp Med 180：347-52)，SART(Shichijo S等，(1998)J Exp Med 187：277-88)和NY-ESO-1(Chen YT等，(1997)Proc Natl Acad SciUSA 94：1914-8)。另一方面，经证实在肿瘤细胞中特异性过高表达的基因产物可以作为诱导细胞免疫应答的靶标被识别。这样的基因产物包括p53(Umano Y等，(2001)Brit J Cancer 84：1052-7)，HER2/neu(Tanaka H等，(2001)Brit J Cancer 84：94-9)，CEA(Nukaya I等，(1999)Int J Cancer 80：92-7)等。
尽管已在与TAA有关的基础和临床研究中取得显著进步(RosenbergSA等，(1998)Nature Med 4：321-7.；Mukherji B等，(1995)Proc Natl Acad SciUSA 92：8078-82.；Hu X等，(1996)Cancer Res 56：2479-83.)，但目前可以使用的能治疗腺癌、包括结肠直肠癌的候选TAA的数目仍然很有限。在癌细胞中大量表达且其表达局限于癌细胞中的TAA被认为是理想的候选免疫治疗靶标。此外，鉴定能诱导有效而特异性的抗肿瘤免疫应答的新型TAA有望促进在临床上针对多种类型的癌症使用肽接种策略(Boon and van derBruggen，(1996)J Exp Med 183：725-9.；van der Bruggen等，(1991)Science254：1643-7.；Brichard V等，(1993)J Exp Med 178：489-95.；Kawakami Y等，(1994)J Exp Med 180：347-52.；Shichijo S等，(1998)J Exp Med 187：277-88.；Chen YT等，(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8.；Harris CC，(1996)JNatl Cancer Inst 88：1442-5.；Butterfield LH等，(1999)Cancer Res 59：3134-42.；Vissers JL等，(1999)Cancer Res 59：5554-9.；van der Burg SH等，(1996)JImmunol 156：3308-14.；Tanaka F等，(1997)Cancer Res 57：4465-8.；Fujie T等，(1999)Int J Cancer 80：169-72.；Kikuchi M等，(1999)Int J Cancer 81：459-66.；Oiso M等，(1999)Int J Cancer 81：387-94.)。
据多篇文献报道，源自某些健康供体的经肽刺激的外周血单个核细胞(PBMC)应答于该肽而产生显著水平的IFN-α，但很少在51Cr-释放测定中以HLA-A24或A0201限制性方式对肿瘤细胞发挥细胞毒性(Kawano K等，(2000)Cancer Res 60：3550-8.；Nishizaka S等，(2000)Cancer Res 60：4830-7.；Tamura M等，(2001)Jpn J Cancer Res 92：762-7.)。然而，与在白种人群中相同，在日本人中，HLA-A24和HLA-A0201两者均是常见的HLA等位基因(Date Y等，(1996)Tissue Antigens 47：93-101.；Kondo A等，(1995)J Immunol155：4307-12.；Kubo RT等，(1994)J Immunol 152：3913-24.；Imanishi T等，(1992)Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshopand Conference Oxford University Press，Oxford，1065.；Williams F等，(1997)Tissue Antigen 49：129.)。因此，由这些HLA呈递的癌症抗原肽对于治疗日本人和白种人人群的癌症特别有用。另外，已知使用高浓度的肽通常可在体外诱导低亲和力的CTL，由此在抗原呈递细胞(APC)上产生高水平的特异性肽/MHC复合物，这些复合物将有效激活这些CTL(Alexander-Miller MA等，(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93：4102-7.)。
发明概述
为了分离用于乳腺癌治疗的新分子靶标，本发明人通过应用cDNA微阵列和激光微束显微解剖(laser microbeam microdissection，LMM)的组合，考察了77例闭经前乳腺癌病例的精确的全基因组表达模式。在上调的基因中，本发明人鉴定了B7330N，又称UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶6(UDP-N-acetyl-alpha-D-Galactosamine：polypeptideN-acetylgalactosaminyltransferase 6，GALNT6)，其在本发明人能够获得表达数据的77例乳腺癌病例中的27例(35％)中超过3倍过高表达。其后，通过半定量RT-PCR也确认：与包括乳房导管细胞或正常乳房在内的正常人器官相比较，在12例临床乳腺癌样品中的7例和20例乳腺癌细胞中的7例中B7330N是上调的。Northern印迹分析表明：B7330N转录物仅在乳腺癌细胞系以及正常的人胎盘、胰脏、胃、气管、乳腺和骨髓中表达。免疫细胞化学染色显示：外源性B7330N的亚细胞定位在COS7细胞中以分泌小泡(secretion vesicles)内的颗粒(granulous)图样出现。向COS7细胞进行B7330N cDNA的诱导，引起基因产物分泌至培养基，造成细胞生长的提高。用小干扰RNA(siRNA)处理乳腺癌细胞有效阻碍B7330N的表达，同时还抑制乳腺癌细胞系T47D和BT-20的细胞/肿瘤生长，这些事实提示该基因以其自分泌形态在细胞生长和增殖方面起重要的作用。这些证据综合提示：B7330N是用于分子靶标疗法开发的有希望的候选物质，并且可以作为乳腺癌患者相关的卓越的诊断用肿瘤标志发挥作用。
B7330N编码由622个氨基酸构成的蛋白。Northern印迹分析表明：B7330N的表达限于乳腺癌细胞系及正常的人胎盘、胰脏、胃、气管、乳腺和骨髓。
许多抗癌剂不仅对癌细胞，对正常生长的细胞也具有毒性。但是，基于B7330N的表达限于正常的人胎盘、胰脏、胃、气管、乳腺和骨髓的事实，抑制B7330N的表达的物质可能不给其它器官造成有害影响，因此可简便地用于乳腺癌的治疗或预防。
因而，本发明提供分离的基因B7330N，其是乳腺癌诊断标志的候选，同时还是开发用于诊断的新策略和有效的抗癌剂的有希望的潜在靶标。进一步，本发明在提供由该基因编码的多肽的基础上，还提供其生产和用途。更具体地，本发明提供在乳腺癌细胞中表达上升的新人类多肽B7330N或其功能等价物。
在优选的方式中，B7330N多肽包含622个氨基酸的蛋白，所述蛋白由SEQ ID NO：24或26的可读框编码。B7330N多肽优选包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。此外，本发明还提供下述分离的蛋白，其由B7330N多核苷酸序列的至少一部分编码，或者由与SEQ ID NO：24或26所示的序列至少15％、优选至少25％互补的多核苷酸序列编码。
本发明进一步提供新人类基因B7330N，其表达在大部分乳腺癌中与对应的非癌性乳房导管上皮相比显著增加。分离的B7330N基因包含SEQ IDNO：24或26记载的多核苷酸序列。特别是B7330N cDNA包含4381或4556个核苷酸(SEQ ID NO：24或26)，其中包括1869个核苷酸的可读框。本发明还包含与SEQ ID NO：24或26所示的多核苷酸序列杂交、且与其至少15％优选25％互补的多核苷酸。这样的多核苷酸的例子是由SEQ ID NO：24或26的序列编码的B7330N的简并体(degenerate)和等位基因突变体(allelicmutant)。
本说明书中，分离的基因是指一类多核苷酸，该多核苷酸的结构不与任何天然多核苷酸的结构相同、也不与任何跨越超过3个独立基因的天然基因组多核苷酸的片段相同。因此，该术语包括例如：(a)如下所述的DNA：其具有天然生物基因组中之天然基因组DNA分子的部分序列；(b)如下所述的多核苷酸：其被纳入原核生物或真核生物载体或基因组DNA中，由此产生的分子不与任何的天然载体或基因组DNA相同；(c)独立的分子，例如cDNA、基因组片段、由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制性片段；和(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因(即编码融合多肽的基因)的一部分。
因而在一个方案中，本发明提供编码本说明书记载的多肽或其片段的分离的多核苷酸。优选地，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO：24或26所示的核苷酸序列至少60％同一的核苷酸序列。更优选地，分离的核酸分子与SEQ ID NO：24或26所示的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同一。当分离的多核苷酸比参照序列(例如SEQ ID NO：24或26)长或与之等长时，其与参照序列的全长进行比较；而当分离的多核苷酸比参照序列短，例如比SEQ ID NO：24或26短时，则与参照序列中相同长度的片段(除去同源性计算所需的任何环)进行比较。
本发明还提供蛋白质的生产方法，该方法通过用编码B7330N蛋白的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞，并表达该多核苷酸序列。进一步，本发明还提供载体和宿主细胞，所述载体包含编码B7330N蛋白的核苷酸序列，所述宿主细胞含有编码B7330N蛋白的多核苷酸。这样的载体和宿主细胞可以用于生产B7330N蛋白。
本发明还提供特异性识别B7330N蛋白的结合剂。例如，结合剂可以是针对B7330N蛋白激发产生的抗体。此外，结合剂可以是该蛋白的特异性配体或与该蛋白特异性结合的合成多肽(参考例如WO2004/044011)。此外，本发明还提供B7330N基因的反义多核苷酸(例如反义DNA)、核酶和siRNA(小干扰RNA)。
本发明进一步提供乳腺癌的诊断方法，该方法包括下述步骤：确定来自受试者的生物样品中基因的表达水平；将B7330N基因的表达水平与正常样品中的表达水平进行比较；以及定义样品中B7330N基因的高表达水平表示受试者患有乳腺癌或存在罹患乳腺癌的风险。
本发明进一步提供用于乳腺癌的治疗或预防的化合物的筛选方法。该方法包括下述步骤：使受试化合物与B7330N多肽接触；并选择与B7330N多肽结合或者抑制其生物活性的受试化合物。
本发明进一步提供用于乳腺癌的治疗或预防的化合物的筛选方法。该方法包括下述步骤：使受试化合物与表达B7330N多肽的细胞或导入了在报道基因的上游含有B7330N转录调控区的载体的细胞接触；以及选择抑制报道基因的表达水平或活性的受试化合物。
本发明还提供用于乳腺癌的治疗或预防的化合物的筛选方法。该方法包括下述步骤：使受试化合物与B7330N多肽或表达B7330N多肽的细胞接触；以及选择抑制B7330N多肽的糖基化水平的受试化合物。在这些实施方案中，糖基化水平是指B7330N多肽的天冬酰胺476的糖基化水平。
本申请还提供用于治疗或预防乳腺癌的药物组合物。药物组合物可以是例如抗癌剂。药物组合物可以包含针对分别显示及记载于SEQ ID NO：24或26的B7330N多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸、siRNA分子或核酶的至少一部分。适宜的siRNA靶标是SEQ ID NO：18或22的序列。因此，本发明的siRNA含有来自SEQ ID NO：18或22的核苷酸序列。优选的，可选择其作为本发明的用于治疗或预防乳腺癌的靶标。药物组合物可以包含这样的化合物，该化合物是通过本发明的治疗或预防乳腺癌等细胞增殖性疾病的化合物的筛选方法选出的。
理想地，药物组合物的作用途径抑制乳腺癌等癌细胞的生长。药物组合物可以适用于包含人和家畜的哺乳动物。
本发明进一步提供使用由本发明提供的药物组合物治疗或预防乳腺癌的方法。
本发明进一步提供治疗或预防癌症的方法，其包括施用B7330N多肽的步骤。期望通过施用B7330N多肽诱导抗肿瘤免疫。因此，本发明还提供包含施用B7330N多肽步骤的诱导抗肿瘤免疫的方法，以及含有B7330N多肽的用于治疗或预防癌症的药物组合物。
以上的发明概要以及以下的详细说明均是优选方式，应该理解的是：这并非是对本发明或本发明的其它替代方式的限制。
附图说明
图1图1显示了半定量RT-PCR和Northern印迹分析的结果。(a)乳腺癌患者来源的肿瘤细胞和正常人组织，(b)在乳腺癌细胞系(HBC4，HBC5，HBL-100，HCC1937，MCF-7，MDA-MB-231，SKBR3，T47D，YMB1(上图)，BT-20，BT-474，BT-549，HCC1143，HCC1500，HCC1599，MDA-MB-157，MDA-MB-435s，MDA-MB-453，OCUCB-F和ZR-75-1(下图))中和乳腺中B7330N的表达。各种人组织(c)和乳腺癌细胞系及正常人生命器官(d)中的B7330N转录物的Northern印迹分析。
图2图2(a)显示了外源性B7330N蛋白的亚细胞定位。图2(b)显示了通过Western印迹分析获得的B7330N蛋白的外源表达。
图3图3(a)显示了对B7330N蛋白的N-糖苷酶(N-glycosydase)处理。图3(b)显示了细胞裂解物中野生型B7330N、N476A突变体和N611A突变体的Western印迹分析。图3(c)显示了N-糖基化对B7330N蛋白的分泌的影响。
图4显示了T47D细胞和BT-20细胞中设计为减少B7330N表达的小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效果。图4(a)显示半定量RT-PCR结果，所述半定量RT-PCR显示在乳腺癌细胞系T47D和BT-20中B7330N的内源性表达的抑制。GAPDH用作内部对照。图4(b)显示MTT测定结果，所述MTT测定显示T47D细胞和BT-20细胞中B7330N的敲低(knock down)引起集落数的减少。图4(d)显示集落形成测定结果，所述集落形成测定显示T47D细胞和BT-20细胞中B7330N的敲低引起集落数的减少。
图5显示了B7330N的自分泌作用的检测。a：与不含B7330N的培养基中的COS7细胞相比，含有B7330N的培养基中的COS7培养物的细胞生长增强。b：暴露于抗B7330N pAb后，乳腺癌细胞生长减弱。细胞暴露于浓度为10.2μg/mL的免疫前兔IgG或抗HIG2 pAb 5天。直方图显示由3次实验求得的平均值±SD。
图6显示B7330N蛋白的同源二聚体化。用模拟、pCAGGS-B7330N-HA和pcDNA3.1-B7330N-myc转染的COS-7细胞的免疫沉淀分析。
图7乳腺癌细胞系和组织切片中B7330N的表达。a：通过使用了亲和纯化抗B7330N抗体的Western印迹分析获得的乳腺癌细胞系中内源性B7330N蛋白的表达，其与HMEC细胞系进行了比较。b：使用抗B7330N抗体(红色)和DAPI(蓝色)对两种乳腺癌细胞系——SKBR3和T47D进行免疫细胞化学染色以区分细胞核(参考材料及方法部分)。c：对乳腺癌(571T和164T)和正常乳房(425N)组织切片进行免疫组织化学染色的结果。使用抗B7330N pAb对内源性B7330N蛋白进行了染色。基本上未检出来自正常乳房组织(425N)的表达，但在包括导管内组织(164T)和乳头管状(papillo-tubular)组织(571T)在内的所有被检癌组织中，癌细胞的细胞质均被强染色。代表性图片为显微镜下的观察结果，原始放大倍率，上图为x 100，下图为x 200。d：正常生命器官的免疫组织化学染色结果。使用抗B7330N pAb抗体对内源性B7330N蛋白进行了染色。在心脏、肺、肝、肾及胰脏均未发现表达。
图8NIH3T3细胞中的外源性B7330N的生长促进效果。a：高水平表达外源性B7330N的细胞或用模拟载体转染的细胞的Western印迹分析。使用抗带HA标签单克隆抗体确认了B7330N表达的外源性导入。β-肌动蛋白用作上样对照。b：NIH3T3-B7330N细胞的体外生长。WT-B7330N(WT-B7330N-#1和-#2)和模拟(NIH3T3-Mock-#1和-#2)转染的NIH3T3细胞，通过MTT测定测量。
具体实施方式
除非另有说明，本说明书中使用的词语“一个”或“一种”或“该”是指至少一个或至少一种。应该理解：在本说明书和权利要求书的范围内，除非上下文另有需要，词语“包括”、“包含”或“含有”包括示出的实体(integer)或步骤(step)、或者实体或步骤的群(group)，但也不排除其它任何实体或步骤、或者实体或步骤的群。
本发明人结合全基因组cDNA微阵列和激光微束显微解剖，分析了乳腺癌中基因的表达模式，以揭示乳腺癌的机制，并鉴定用于治疗和/或预防这些肿瘤的新诊断标记和/或药物靶标。其结果，鉴定了在乳腺癌细胞中特异性过高表达的B7330N。进一步，通过小干扰RNA(siRNA)抑制B7330N基因的表达，引起了癌细胞的显著生长抑制。这些认识提示：B7330N赋予癌细胞致癌活性，并且抑制这些蛋白活性可以成为乳腺癌等增殖性疾病的治疗和预防的有望策略。
B7330N
本发明提供B7330N基因。B7330N的cDNA由4381或4556个核苷酸构成(SEQ ID NO：24或26；GenBank Accession No.AB265820)，其中包括1869个核苷酸的可读框。该可读框编码622个氨基酸的蛋白。
因此，本发明提供由前述基因编码的、基本上纯的多肽，包括含有SEQID NO：25所示氨基酸序列的多肽，或其功能等价物，只要其编码B7330N蛋白。与B7330N功能上等价的多肽的例子包括，例如，其它生物中与人B7330N蛋白对应的同源蛋白，以及人B7330N蛋白的突变体。
在本发明中，术语“功能上等价”是指对象多肽具有如B7330N蛋白的促进细胞增殖活性及赋予癌细胞致癌活性的活性。将编码对象多肽的DNA导入细胞并表达各多肽，然后检测细胞增殖的增强或集落形成活性的提高，可以判断对象多肽是否具有细胞增殖活性。这样的细胞例如包括NIH3T3，COS7和HEK293。
与给定蛋白质功能上等价的多肽的制备方法是本领域技术人员公知的，包括向蛋白质导入突变的常规方法。例如，本领域技术人员可通过定点诱变向人B7330N蛋白的氨基酸序列中导入适当的突变，制备出与这些蛋白功能上等价的多肽(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene 152：271-5(1995)；Zollerand Smith，Methods Enzymol 100：468-500(1983)；Kramer et al.，Nucleic AcidsRes.12：9441-56(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154：350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82：488-92(1985)；Kunkel，et al.，Methods Enzymol 204：125-39(1991))。氨基酸突变也可自然发生。在获得的突变多肽与人B7330N蛋白功能上等价的前提下，本发明的多肽还包括具有一个或多个氨基酸残基发生了突变的人B7330N蛋白的氨基酸序列的蛋白质。这些突变体中发生突变的氨基酸的数目一般为10个氨基酸以下，优选为6个氨基酸以下，更优选为3个氨基酸以下。
已知突变的蛋白或修饰的蛋白，即具有在给定氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而被修饰的氨基酸序列的蛋白，保留原来的生物活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-5666(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-6500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-6413(1982))。
优选将待突变的氨基酸残基突变为保留氨基酸侧链性质的其它氨基酸(该过程即公知的保守氨基酸取代)。氨基酸侧链性质的例子包括疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)以及具有以下官能团或共有特性的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱(base)侧链(R，K，H)和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。需说明的是括号中的字母表示氨基酸的单字母符号。
在本发明中，B7330N蛋白的优选功能等价物保留了其糖基化位点。例如，已经确认B7330N蛋白在476N处发生糖基化。因此，在优选的方式中，B7330N蛋白的功能等价物由在同源序列中包含476N或与476N同源的氨基酸序列构成。通过比较氨基酸序列，可以确定B7330N蛋白的功能等价物的氨基酸序列、与第476位同源的位置。在所关注的蛋白中的位置不一定是476位。例如，如果是具有因一个或多个氨基酸残基发生取代、缺失、插入和/或添加而被修饰的B7330N蛋白的结构的蛋白，其同源位置可以是476位以外的位置。在这样的蛋白中，为了确定与B7330N蛋白中的476位同源的位置，必要时可以通过在两氨基酸序列中插入适当的空位来比对两蛋白的氨基酸序列，以使彼此的氨基酸以及具有相似性质的氨基酸尽可能一致。这样，就可以确定所关注的对象蛋白中与B7330N蛋白中的476位同源的位置的相应位置。这样的技术是本领域技术人员公知的，可以容易地使用商品化的或公开的计算机软件，例如分析软件GENETYX-MAC VER.10(Software)等进行。
在人B7330N蛋白的氨基酸序列中添加一个或多个氨基酸残基所得的多肽的例子是含有人B7330N蛋白的融合蛋白。本发明包括人B7330N蛋白与其它肽或蛋白质的融合物即融合蛋白。通过本领域技术人员公知的技术即可制备融合蛋白，例如通过将编码本发明的人B7330N蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白的DNA连接，使得读码框一致，然后将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达所述融合DNA。对于与本发明的蛋白融合的肽或蛋白没有限制。
可以用作与本发明蛋白融合的已知肽的肽包括例如FLAG(Hopp et al.，(1988)Biotechnology 6：1204-10)、含有6个His(组氨酸)残基的6×His、10×His、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B-标签、蛋白C片段等。可以与本发明的蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖-结合蛋白)等。
通过将编码上述融合肽或蛋白的可商购的DNA与编码本发明的多肽的DNA融合，并表达所制备的融合DNA，即可制备出融合蛋白。
本领域公知的分离功能等价多肽的方法有，例如，使用杂交技术的方法(Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold SpringHarbor Lab.Press)。本领域技术人员能够容易地分离出与编码人B7330N蛋白的DNA序列(即SEQ ID NO：24或26)的全部或部分具有高度同源性的DNA，并且由分离的DNA分离与人B7330N蛋白功能上等价的多肽。本发明的多肽包括由与编码人B7330N蛋白的DNA序列的全部或部分杂交的DNA编码的、功能上等价于人B7330N蛋白的多肽。这些多肽包括对应于人源蛋白的哺乳动物同源物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的多肽)。在从动物中分离与编码人B7330N蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用乳腺癌细胞以及来自正常人的胎盘、胰脏、胃、气管、乳腺和骨髓的组织。
本领域技术人员可以按常规选择用于分离编码与人B7330N蛋白功能上等价的多肽的DNA的杂交条件。例如杂交可通过如下方式进行：使用“Rapid-hyb缓冲液”(Amersham LIFE SCIENCE)于68℃预杂交30分钟或更长时间，加入标记的探针，并在68℃保温1小时或更长时间。其后的洗涤步骤，例如可以在低度严紧条件下进行。低度严紧条件为，例如42℃、2×SSC、0.1％SDS，或优选50℃、2×SSC、0.1％SDS。更优选使用高严紧条件。高严紧条件为，例如室温下用2×SSC、0.01％SDS洗涤3次、每次20分钟，然后于37℃用1×SSC、0.1％SDS洗涤3次，每次20分钟，再于50℃用1×SSC、0.1％SDS洗涤2次、每次20分钟。然而，几种因素，如温度和盐浓度会影响杂交的严紧度，本领域技术人员可适当选择这些因素以获得所需的严紧度。
可以采用基因扩增法，例如聚合酶链反应(PCR)法代替杂交来分离编码与人B7330N蛋白功能上等价的多肽的DNA，所述基因扩增法使用基于编码蛋白的DNA的序列信息(SEQ ID NO：24或26)合成的引物。
由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的、与人B7330N蛋白功能上等价的多肽一般与人B7330N蛋白的氨基酸序列具有高度同源性。本说明书中使用的术语“高度同源性”一般指多肽或多核苷酸序列与参照序列之间的同源性为40％或更高，优选为60％或更高，更优选为80％或更高，更优选85％、90％、93％、95％、98％、99％或更高。百分比同源性(又称百分比同一性)通常在两个最优比对的序列之间测定。为了进行比较而比对序列的方法是本技术领域公知的。序列的最佳比对和比较可例如使用“Wilbur and Lipman，(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30”中的算法进行。
本发明的多肽在氨基酸序列、分子量、等电点、存在或不存在糖链或形式等方面有差异，这取决于用于产生所述多肽的细胞或宿主或者采用的纯化方法。无论如何，只要该多肽具有等价于本发明的人B7330N蛋白的功能，就落入本发明的范围。
采用本领域技术人员公知的方法可以以重组蛋白或天然蛋白的形式制备本发明的多肽。采用下述方法可以制备重组蛋白：将编码本发明多肽的DNA(例如含有SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列的DNA)插入适当的表达载体，将载体导入适当的宿主细胞，获得提取物，然后对提取物进行层析以纯化多肽，所述层析包括例如离子交换层析、反相层析、凝胶过滤、或利用固定有抗本发明蛋白抗体的柱子的亲和层析，或多于一种所述柱的组合。
此外，当在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中以与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白所成的融合蛋白的形式、或者以添加了多个组氨酸的重组蛋白的形式表达本发明的多肽时，可以使用谷胱甘肽柱或镍柱纯化所表达的重组蛋白。或者，当以带c-myc、多个组氨酸或FLAG标签的蛋白的形式表达本发明的多肽时，可以分别使用针对c-myc、His或FLAG的抗体进行检测和纯化。
纯化融合蛋白之后，根据需要也可以通过用凝血酶或Xa因子切割融合蛋白来除去目的多肽之外的区域。
可以采用本领域技术人员公知的方法分离出天然蛋白，所述方法例如使后述的结合有可与B7330N蛋白结合的抗体的亲和柱与表达本发明多肽的组织或细胞的提取物接触。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还包括本发明的多肽的部分肽。部分肽具有本发明多肽特有的氨基酸序列，并由至少7个、优选至少8个或更多、更优选至少9个或更多氨基酸组成。部分肽例如可以用于制备抗本发明多肽的抗体、筛选与本发明多肽结合的化合物以及筛选本发明多肽的抑制剂。
通过基因工程、已知的肽合成法或用适当的肽酶消化本发明的多肽，均可以产生本发明的部分肽。例如，肽合成可以采取固相合成或液相合成。
本发明还提供编码上述B7330N多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以用于体内或体外产生上述本发明多肽，或者可以用于由本发明蛋白编码基因的基因异常所致疾病的基因治疗。可以使用本发明多核苷酸的任何形式，包括mRNA、RNA、cDNA、基因组DNA和化学合成的多核苷酸，只要其编码本发明的多肽。本发明的多核苷酸包括含有给定核苷酸序列及其简并序列的DNA，只要所得的DNA编码本发明多肽。
可以采用本领域技术人员公知的方法制备本发明的多核苷酸。例如可以采用以下方法制备本发明的多核苷酸：由表达本发明多肽的细胞制备cDNA文库，然后以本发明的DNA(例如SEQ ID NO：24或26)的部分序列为探针进行杂交。采用Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)中所述的方法可以制备cDNA文库；或者可以使用可商购的cDNA文库。还可以采用下述方法制备cDNA文库：从表达本发明多肽的细胞中提取RNA，基于本发明DNA的序列(例如SEQ ID NO：24或26)合成寡聚DNA，以寡聚DNA为引物进行PCR，扩增编码本发明的蛋白的cDNA。
另外，通过对所得cDNA的核苷酸进行测序，可以常规地确定由cDNA编码的翻译区，这样就可以容易地获得本发明多肽的氨基酸序列。而且，通过以所得cDNA或其部分作为探针筛选基因组DNA文库，可以分离出基因组DNA。
更具体地，可以从表达本发明的对象多肽的细胞、组织、器官(例如乳腺癌细胞以及正常人的胎盘、胰脏、胃、气管、乳腺和骨髓)中首先制备mRNA。可以采用公知的方法分离mRNA；例如，总RNA的制备可以采用胍超离心法(Chirgwin et al.，(1979)Biochemistry 18：5294-9)或AGPC法(Chomczynski and Sacchi，(1987)Anal Biochem 162：156-9)。另外，可以使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等由总RNA纯化mRNA。或者，可以使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化mRNA。
使用逆转录酶从获得的mRNA合成cDNA。可以使用可商购的试剂盒，如AMV逆转录酶cDNA第一链合成试剂盒(Seikagaku Kogyo)等合成cDNA。或者，可以使用本说明书所述引物等、5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和聚合酶链式反应(PCR)，采用5’-RACE法(Frohman et al.，ProcNatl Acad Sci USA 85：8998-9002(1988)；Belyavsky et al.，Nucleic Acids Res17：2919-2932(1989))合成和扩增cDNA。
由PCR产物制备所需DNA片段，并与载体DNA连接。使用重组载体转化大肠杆菌等，由选出的菌落制备所需的重组载体。采用常规方法，如双脱氧核苷酸链终止法验证所需DNA的核苷酸序列。
考虑待用表达宿主中密码子使用的频率，可以将本发明多核苷酸的核苷酸序列设计成能够更有效地表达的形式(Grantham et al.，Nucleic Acids Res9：43-74(1981))。可以使用可商购的试剂盒或常规方法改变本发明的多核苷酸的序列。例如，可以通过用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或适当的多核苷酸片段、添加接头或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA，TGA或TAG)的方式改变序列。
具体地说，本发明的多核苷酸包括含有SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列的DNA。
此外，本发明提供在严紧条件下与具有SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列的多核苷酸杂交、并且编码与上述的本发明B7330N蛋白功能上等价的多肽的多核苷酸。本领域技术人员可以适宜地选择合适的严紧条件。例如，可以采用低严紧条件。优选可采用高严紧条件。这些条件与前述的条件相同。上述的杂交DNA优选为cDNA或染色体DNA。
本发明还提供与编码人B7330N蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：24或26)或其互补链互补，并含有至少15个核苷酸的多核苷酸。本发明的多核苷酸优选为与编码本发明的B7330N多肽的DNA特异性杂交的多核苷酸。本文使用的术语“特异性杂交”指在通常的杂交条件下、优选在严紧的杂交条件下不与编码其它蛋白的DNA发生明显的交叉杂交(cross-hybridization)。这样的多核苷酸包括与编码本发明多肽的DNA或其互补链特异性杂交的探针、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如，反义寡核苷酸和核酶)。此外，这样的多核苷酸可以用于制备DNA芯片。
载体和宿主细胞
本发明还提供导入了本发明的多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明的载体可以用于在宿主细胞中维持本发明的多核苷酸、尤其是DNA，以表达本发明多肽，或者用于施用本发明的多核苷酸以供基因治疗。
当宿主细胞为大肠杆菌，并且在大肠杆菌(如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue)中大量扩增和制备载体时，载体应具有用于在大肠杆菌中扩增的″ori″和用于选择转化大肠杆菌的标记基因(例如通过药物，如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，与上述载体相同，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以用于亚克隆和提取cDNA。当使用载体制备本发明的蛋白时，表达载体是特别有用的。例如，在大肠杆菌中表达的表达载体须具备上述特征，以便在大肠杆菌中扩增。当将大肠杆菌，如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue用作宿主细胞时，载体应具有在大肠杆菌中有效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward et al.，Nature 341：544-546(1989)；FASEB J 6：2422-2427(1992))、araB启动子(Betteret al.，Science 240：1041-1043(1988))、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(此时，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)来替代上述载体。另外，载体也可以含有用于多肽分泌的信号序列。指导多肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列为pelB信号序列(Lei et al.，J Bacteriol 169：4379(1987))。将载体导入靶宿主细胞的方法包括例如氯化钙法和电穿孔法。
除大肠杆菌外，可以使用下述载体制备本发明多肽：例如源自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEF-BOS(Mizushima S andNagata S，(1990)Nucleic Acids Res 18(17)：5322)、pEF、pCDM8)，源自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，源自植物的表达载体(例如pMH1，pMH2)，源自动物病毒的表达载体(例如pHSV，pMV，pAdexLcw)，源自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)，源自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母(Pichia)表达试剂盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)以及源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的表达载体(如pPL608，pKTH50)。
为了在动物细胞，如CHO，COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.，Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima et al.，Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV启动子等，并优选具有用于选择转化子的标记基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
产生多肽
另外，本发明提供产生本发明多肽的方法。多肽可以通过培养携带表达载体的宿主细胞来制备，其中所述表达载体含有编码所述多肽的基因。根据需要，可以采用本方法在稳定地表达基因的同时，在扩增细胞中基因的拷贝数。例如，可以将含有互补性(complementary)DHFR基因的载体(例如pCHO I)导入核酸合成途径缺失的CHO细胞，然后利用甲氨蝶呤(MTX)扩增该载体。另外，当瞬时表达基因时，可以采用如下方法：用含有SV40复制起点的载体(pcD等)转化染色体上含有SV40T抗原表达基因的COS细胞。
按上述方法获得的本发明多肽可分离自宿主细胞的内部或外部(如培养基)，并被纯化成基本上纯的均质多肽。本说明书中使用的与给定多肽有关的术语“基本上纯的”是指多肽基本上不含有其它生物大分子。基本上纯的多肽以干重表示为至少75％(例如至少80％、85％、95％或99％)纯。可采用任何适当的标准方法来测定纯度，所述方法例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。多肽的分离和纯化方法并不局限于任何特定的方法，实际上可以采用任何标准方法。
例如，可以适当选择和组合柱层析、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和重结晶等方法，进行多肽的分离与纯化。
层析的例子包括例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1996))。这些层析可通过液相色谱，例如HPLC和FPLC来进行。因此，本发明提供通过上述方法制备的高纯度多肽。
可任选地通过在纯化前和/或纯化后用适当的蛋白修饰酶处理本发明多肽来对其进行修饰或部分缺失。有用的蛋白修饰酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。
抗体：
本发明提供与本发明多肽结合的抗体。本发明的抗体可以作为任意形式，如单克隆或多克隆抗体使用，并包括用本发明的多肽免疫动物如兔获得的抗血清、所有种类的多克隆抗体和单克隆抗体，人抗体和通过基因重组制备的人源化抗体。
作为抗原使用以获得抗体的本发明多肽，可源自任何动物物种，但优选源自哺乳动物，如人、小鼠或大鼠，更优选源自人。人源多肽可以由本发明公开的核苷酸或氨基酸序列获取。
根据本发明，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白，或者是蛋白的部分肽。部分肽可以包含例如本发明多肽的氨基(N)末端片段或羧基(C)末端片段。
在本说明书中，抗体定义为与本发明多肽的全长和/或片段反应的蛋白。
可将编码本发明多肽或其片段的基因插入已知的表达载体，然后用该载体转化如本说明书所述的宿主细胞。可通过任意标准方法从宿主细胞内或细胞外回收所需多肽或其片段，然后可将其用作抗原。此外，表达多肽的全细胞或其裂解物，或者化学合成的多肽均可用作抗原。
可以用抗原免疫任意哺乳动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常使用啮齿目(Rodentia)，兔形目(Lagomorpha)或灵长类(Primates)动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠(hamster)。兔形目动物包括例如家兔。灵长类动物包括例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(oldworld monkey))如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
用抗原免疫动物的方法是本领域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫动物的标准方法。更具体地，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，将抗原悬液与适量的标准佐剂如弗氏(Freund’s)完全佐剂混合，制成乳液，然后施用于哺乳动物。优选其后每4至21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。也可使用合适的载体进行免疫。如上述进行免疫后，用标准方法检验血清中所需的抗体量的增加。
可以按如下方法制备针对本发明多肽的多克隆抗体：从经检测其血清中所需的抗体增加的免疫哺乳动物收集血液，并通过任意常规的方法从所述血液中分离血清。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及可以从所述血清中分离含有该多克隆抗体的级分。使用例如与本发明多肽偶联的亲和柱，并进一步用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分可从仅识别本发明多肽的级分中制备免疫球蛋白G或M。
为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的哺乳动物收集免疫细胞，如上所述检查血清中所需抗体水平升高，并用于细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾。其它与上述免疫细胞融合的优选亲本细胞包括例如哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选获得了用于药物选择融合细胞的性质的骨髓瘤细胞。
根据已知的方法，如Milstein等(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 73：3-46(1981))的方法可将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞进行融合。
在标准选择培养基如HAT培养基(含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培养基)中进行培养，可以选出由细胞融合所得的杂交瘤。通常，细胞培养是在HAT培养基中连续进行数天至数周，这段时间足以使除了所需的杂交瘤细胞之外的所有其它细胞(非融合的细胞)死亡。然后，进行标准有限稀释(standard limiting dilution)筛选并克隆生产所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述以抗原免疫非人动物制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用多肽、表达多肽的细胞或其裂解物来免疫人淋巴细胞，如EB病毒感染的淋巴细胞。然后，使免疫后的淋巴细胞与能够无限分裂的源自人的骨髓瘤细胞，如U266融合，可以获得产生能与所述多肽结合的期望人抗体的杂交瘤细胞(特开昭63-17688)。
然后将获得的杂交瘤细胞移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。获得的单克隆抗体可以通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联了本发明多肽的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可以用于纯化和检测本发明多肽，还可以作为本发明多肽的激动剂和拮抗剂的候选物。此外，该抗体可以用于与本发明多肽相关的疾病的抗体治疗。当将获得的抗体施用于人体时(抗体治疗)，优选使用人抗体或人源化抗体以降低免疫原性。
例如，可以使用选自多肽、表达多肽的细胞或其裂解物的抗原来免疫具有人抗体基因库(repertory)的转基因动物。然后，从该动物收集产生抗体的细胞，将其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，从该杂交瘤可制备针对所述多肽的人抗体(参见WO92-03918，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
或者，可以通过癌基因使产生抗体的免疫细胞，如经免疫的淋巴细胞永生化(immortalize)，并用于制备单克隆抗体。
如此获得的单克隆抗体也可以利用基因工程技术重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick，(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies，MacMillanPublishers LTD于英国出版)。例如，可以从免疫细胞，如产生抗体的杂交瘤或经免疫的淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体并引入宿主细胞，从而制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。
此外，本发明的抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要其结合一种或多种本发明的多肽。例如，所述抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Hustonet al.，(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83)。更具体地，可以用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体以产生抗体片段。或者，还可以构建编码该抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见例如Co et al.，(1994)J Immunol 152：2968-76；Better and Horwitz，(1989)Methods Enzymol 178：476-96；Pluckthun and Skerra，(1989)Methods Enzymol178：497-515；Lamoyi，(1986)Methods Enzymol 121：652-63；Rousseaux et al.，(1986)Methods Enzymol 121：663-9；Bird and Walker，(1991)TrendsBiotechnol 9：132-7)。
抗体可以通过与各种分子如聚乙二醇(PEG)连接来进行修饰。本发明提供这样的修饰抗体。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰方法是本领域常规的。
可选地，可以以嵌合抗体或人源化抗体的形式获得本发明的抗体，所述嵌合抗体为源自非人抗体的可变区与源自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体，所述人源化抗体为含有源自非人抗体的互补决定区(CDR)、以及源自人抗体的框架区(FR)和恒定区的人源化抗体。所述抗体可利用已知技术制备。人源化可通过用啮齿类的CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列的方式进行(见例如Verhoeyen et al.，(1988)Science 239：1534-1536)。因而，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中实质上小于完整人可变结构域的区域已被来自非人物种的相应序列取代。
除人框架区和恒定区外还包含人可变区的完整人抗体也是可以利用的。这样的抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法包括使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如，Hoogenboom&Winter，(1992)J.Mol.Biol.227：381-8)。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，来制备人抗体。该方法描述于例如美国专利Nos.6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。
可以将如上获得的抗体纯化至均质。例如，可根据用于普通蛋白的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦，来分离抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow andDavid Lane，(1988)Cold Spring Harbor Laboratory)，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如HyperD，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除亲和层析外，例示性的层析包括例如：离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，(1996)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。可以通过液相层析，如HPLC和FPLC进行层析程序。
例如，可以采用吸光度测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光检测来测定本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在平板上，将本发明多肽施加到平板上，再施加含有所需抗体的样品，如产生抗体的细胞的培养上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并温育平板。接下来在洗涤后，在平板中加入酶底物如磷酸对硝基苯酯，测定吸光度以评价样品的抗原结合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可以用作抗原来评价抗体的结合活性。可以使用BIAcore(Pharmacia)评价本发明抗体的活性。
上述方法允许通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明多肽的样品，再检测或测定由抗体和多肽形成的免疫复合物，来检测或测定本发明的多肽。
因为本发明所述的检测或测定多肽的方法可特异性地检测或测定多肽，所以该方法可应用于使用多肽的各种实验。
反义多核苷酸、小干扰RNA及核酶
本发明包括与SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列内的任意位点杂交的反义寡核苷酸。这种反义寡核苷酸优选针对SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列中至少15个连续的核苷酸。更优选在上述至少15个连续的核苷酸中含有起始密码子的上述反义寡核苷酸。
反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可以用作反义寡核苷酸。所述修饰产物的例子包括低级烷基膦酸酯(lower alkyl phosphonate)修饰如膦酸甲酯型(methyl-phosphonate type)或膦酸乙酯型(ethyl-phosphonate-type)，硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰以及氨基磷酸酯(phosphoroamidate)修饰。
如本说明书中使用的术语“反义核酸”，不但指其中与构成DNA或mRNA一定区域的那些核苷酸对应的核苷酸为完全互补的反义核酸，还指具有一个或多个核苷酸错配的核酸，只要DNA或mRNA及反义寡核苷酸能与SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列特异性杂交。
包括这样的多核苷酸，它们在“至少15个连续核苷酸序列区域”内，具有至少约70％或更高、优选至少约80％或更高、更优选约至少90％或更高、更优选至少约95％或更高的同源性。所述同源性可使用本说明书记载的算法确定.也可使用本领域已知的算法确定同源性。此外在本发明中，所述反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可以用作反义寡核苷酸。所述修饰产物的例子包括但不限于低级烷基膦酸酯修饰如膦酸甲酯型(methyl-phosphonate type)或膦酸乙酯型(ethyl-phosphonate-type)，硫代磷酸酯修饰以及氨基磷酸酯修饰。
所述反义多核苷酸可用作分离或检测编码本发明多肽的DNA的探针，或者作为用于扩增的引物。
本发明的反义寡核苷酸衍生物通过如下方式作用于产生本发明多肽的细胞：与编码本发明多肽的DNA或mRNA结合，抑制其转录或翻译，促进mRNA降解并抑制本发明多肽的表达，由此抑制该多肽的功能。
此外，本发明还包括小干扰RNA(siRNA)，所述小干扰RNA包含SEQID NO：24或26所示核苷酸序列的有义链核酸和反义链核酸的组合。更具体地，此类用于抑制B7330N表达的siRNA包括以SEQ ID NO：18或22所述核苷酸序列为靶标的那些siRNA。
术语“siRNA”指能阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。采用标准技术，包括以DNA为RNA转录模板的技术，将siRNA导入细胞。siRNA含有编码人B7330N蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：24或26)的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA以使单一转录物(双链RNA)兼具来自靶基因的有义序列和互补的反义序列(例如为发夹结构)。
在靶细胞中，siRNA与对应于B7330N的转录物结合，导致由该细胞产生的蛋白减少。寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸，可以与天然存在的转录物等长。优选寡核苷酸的长度为少于约75、约50、约25个核苷酸。更优选寡核苷酸的长度为约19至约25个核苷酸。抑制癌细胞生长的B7330NsiRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO：18或22的靶序列。为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加到靶序列反义链的3’端。添加的“u”的数目为至少约2，通常为约2-约10，优选为约2-约5。添加的“u”在siRNA的反义链的3’端形成单链。
B7330N siRNA以能与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞。在这些实施方案中，本发明的siRNA分子一般如上文对反义分子的描述进行修饰。而其它的修饰也是可能的，例如胆固醇偶联的siRNA显示了改善的药理学性质(Song et al.Nature Med.9：347-51(2003))。或者，编码B7330N siRNA的DNA是在载体中。
例如，通过将B7330N靶序列以两条链均能表达(通过DNA分子的转录)的形式克隆到表达载体中来制备上述载体，所述表达载体具有位于该靶序列侧翼的、可操作连接的调控序列(Lee，N.S.，et al.，(2002)NatureBiotechnology 20：500-5.)。与B7330N mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如位于所克隆的DNA 3’侧的启动子序列)转录，作为B7330N mRNA的有义链的RNA分子由第二启动子(例如位于所克隆的DNA 5’侧的启动子序列)转录。所述有义链和反义链在体内杂交，从而产生用于沉默B7330N基因的siRNA构建体。或者，可以利用两个构建体生成siRNA构建体的有义链和反义链。克隆的B7330N可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，其中，单一转录物具有来自靶基因的有义序列和互补的反义序列。
此外，为了形成发夹环结构，可在有义序列和反义序列之间放置由任意核苷酸序列组成的环序列(loop sequence)。因此，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中，[A]为核糖核苷酸序列，其对应于与来自B7330N基因的mRNA或cDNA特异性杂交的序列。在优选的实施方案中，[A]为对应于下述序列的核糖核苷酸序列：SEQ ID NO：24的417～435位或SEQ ID NO：26的623～641位(SEQ ID NO：18)，以及SEQ ID NO：24的1366～1384位或SEQ ID NO：26的1572～1590位(SEQ ID NO：22)。
[B]为由约3～约23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，和
[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。所述环序列可以由长度优选为3-23个核苷酸的任意序列构成。所述突环序列，例如可以选自由如下序列组成的组(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。在本发明的siRNA中，为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加到[A’]的3’端。添加的“u”的数目为至少约2，通常为约2-约10，优选为约2-约5。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque，J.-M.，et al.，(2002)Nature 418：435-8.)。
CCC，CCACC或CCACACC：Jacque，J.-M.，et al.，Nature 418：435-8(2002)；
UUCG：Lee，N.S.，et al.，(2002)Nature Biotechnology 20：500-5.Fruscoloni，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(4)：1639-44(2003)；和
UUCAAGAGA：Dykxhoorn，D.M.，et al.，Nature Reviews Molecular CellBiology 4：457-67(2003)。
例如，具有本发明的发夹结构的优选siRNA如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自下组：CCC，UUCG，CCACC，CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环结构是UUCAAGAGA(DNA中为“ttcaagaga”)。
gcacuguuucaaugccuuu-[B]-aaaggcauugaaacagugc(针对SEQ ID NO：18的靶序列)
gagaaauccuucggugaca-[B]-ugucaccgaaggauuucuc(针对SEQ ID NO：22的靶序列)
B7330N序列侧翼的调节序列是相同的或者不同的，这样它们的表达能够独立地，或者以时间性或空间性方式被调控。通过将B7330N基因模板克隆到载体上来在细胞内转录siRNA，其中所述载体含有例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单元或人H1RNA启动子。为了将载体导入细胞，可以使用转染增强剂(transfection-enhancing agent)。FuGENE(Roche diagnostices)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(Wako pure Chemical)可以用作转染增强剂。
适当的siRNA的核苷酸序列可使用能够从Ambion网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)访问的siRNA设计计算机程序来设计。所述计算机程序基于如下规程选择核苷酸序列用于siRNA合成。
选择siRNA靶位点：
1.从目标转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描，寻找AA二核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3′侧邻近的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等在Genes Dev 13(24)：3191-7(1999)中，不推荐针对5′和3′非翻译区(UTRs)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能更为富含调控蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合。
2.将所述潜在靶位点与人基因组数据库进行比较，将任何与其它编码序列显著同源的靶序列排除在考虑之外。可采用BLAST(Altschul SF，et.al.，Nucleic Acids Res.1997；25(17)：3389-402.；J Mol Biol.1990；215(3)：403-10)进行同源性搜索，其可见于NCBI服务器：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，可优选沿待评价的基因的长度选择几个靶序列。
采用标准方法，针对与B7330N mRNA的不同部分互补的寡核苷酸和寡核苷酸，在体外检测它们降低肿瘤细胞中B7330N的产生的能力(例如使用乳腺癌细胞系HBL-100，HCC1937，MCF-7，MDA-MB-435s，YMB1，SKBR3，T47D，BT-20，BT-474，BT-549，HCC1143，HCC1500，HCC1599，MDA-MB-157，MDA-MB453，OUCB-F，ZR-75-1)。使用B7330N特异性抗体或采用其它检测策略检测到，与不存在候选siRNA组合物的情况下培养的细胞相比，与所述候选siRNA组合物接触的细胞中B7330N基因产物减少。接着，对于在体外细胞测定或无细胞测定中减少B7330N产生的序列，进一步测定它们对细胞生长的抑制作用。对于在体外细胞测定中抑制细胞生长的序列，在大鼠或小鼠中进行体内测定，以确认有恶性新生物的动物中B7330N产生的减少和肿瘤细胞生长的降低。
同样地，本发明还包括含有靶序列的核酸序列的双链分子，所述靶序列例如SEQ ID NO：24的417～435位核苷酸或SEQ ID NO：26的623～641位核苷酸(SEQ ID NO：18)，以及SEQ ID NO：24的1366～1384位核苷酸或SEQ ID NO：26的1572～1590位核苷酸(SEQ ID NO：22)。在本发明中，双链分子包括有义链和反义链，其中所述有义链包含对应于SEQ ID NO：18或22的核糖核苷酸序列，而所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双链分子，且其中所述双链分子，当被导入表达B7330N基因的细胞时，抑制所述基因的表达。在本发明中，当分离的核酸为RNA或其衍生物时，应在核苷酸序列中将碱基“t”替换为“u”。本说明书中使用的术语“互补的”指核酸分子的核苷酸单位之间形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对。而术语“结合”指两核酸或化合物、或者相关核酸或化合物、或者其组合之间的物理或化学相互作用。
互补的核酸序列在适宜条件下杂交，形成几乎不含或不含错配的稳定双链体。此外，本发明的分离核苷酸的有义链和反义链可以通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。在优选的实施方案中，这样的双链体的平均每10个配对中含有的错配不超过1个。在特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，这样的双链不含错配。核酸分子长度少于4381个核苷酸(对于SEQ ID NO：24)或4556个核苷酸(对于SEQ ID NO：26)。例如，核酸分子的长度短于500、200、75个核苷酸。本发明还包括包含一个或多个本说明书中描述的核酸的载体，以及包含所述载体的细胞。对于针对B7330N的siRNA或者编码这些siRNA的DNA而言，本发明的分离核酸是有用的。将这些核酸用于siRNA或其编码DNA时，有义链优选为长于约19个核苷酸，更优选长于约21个核苷酸。
本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明多肽的表达，因而可以用于抑制本发明多肽的生物学活性。并且，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂，在其可以用于抑制本发明多肽的生物学活性这一点上是有用的。因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗乳腺癌。在哺乳动物中抑制表达的B7330N siRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO：18或22的靶序列。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可将核苷酸“u”添加到靶序列的反义链的3’端。要添加的“u”的数目为至少约2个，通常为约2-约10个，优选为约2-约5个。添加的“u”在siRNA的反义链的3’端形成单链。
此外，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂，在其可以用于抑制本发明多肽的生物学活性这一点上是有用的。因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增殖性疾病，如乳腺癌。
此外，本发明提供抑制本发明B7330N多肽表达的核酶。
通常，核酶分为大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸的磷酸酯键的酶。与大核酶反应后，反应位点由5’-磷酸基团和3’-羟基基团组成。大核酶进一步分为(1)催化鸟苷在5’-剪接位点的转酯作用的第I组内含子RNA；(2)催化经由套索样(lariat-like)结构经过两步反应自我剪接的第II组内含子RNA；和(3)通过水解在5’位点切割tRNA前体的核糖核酸酶P的RNA组分。另一方面，小核酶与大核酶相比大小更小(约40bp)，其切割RNA产生5’-羟基和2’-3’环磷酸酯。锤头型(Hammerhead type)核酶(Koizumi et al.，FEBSLett 228：228-30(1988))和发夹型核酶(Buzayan，Nature 323：349-53(1986)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res 19：6751-5(1991))都包括在小核酶中。设计和构建核酶的方法是本领域中已知的(参见Koizumi et al.，FEBS Lett228：228-30(1988)；Koizumi et al.，Nucleic Acids Res 17：7059-71(1989)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res 19：6751-5(1991))。因而，抑制本发明多肽表达的核酶也可以根据其序列信息(SEQ ID NO：24或26)和这些常规方法来构建。
针对B7330N基因的核酶抑制过高表达的B7330N蛋白的表达，因此有用于抑制这些蛋白的生物活性。因此，这些核酶可以用于乳腺癌的治疗或预防。
乳腺癌的诊断
本发明提供以本发明基因的表达水平作为诊断标志，来诊断乳腺癌等细胞增殖性疾病的方法。此外，本发明还提供通过确定来源于患者的生物样品，例如组织样品中本发明的基因的表达水平，来确定受试者的乳腺癌倾向性(predisposition)的方法。某基因的表达水平与该基因正常对照水平相比发生变化，例如上升，说明受试者患有乳腺癌或存在罹患乳腺癌的风险。
在本发明的上下文中，“乳腺癌倾向性”包括受试者的下述状态：易患(predisposed to)乳腺癌，具有乳腺癌的倾向(tendency)、患病率(prevalence)、趋势(inclination)或易感性(susceptibility)。此外，该术语还包括受试者具有罹患乳腺癌的风险。
该诊断方法包括下述步骤：(a)检测本发明的B7330N基因的表达水平；和(b)将表达水平的上升与乳腺癌相关联。同样地，在确定乳腺癌倾向性的方法中适用与上述步骤相同的步骤。
生物样品中B7330N基因的表达水平可以通过定量B7330N基因对应的mRNA或由B7330N基因编码的蛋白来加以评估。mRNA的定量方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过Northern印迹分析或RT-PCR来评估对应于B7330N基因的mRNA的水平。B7330N基因的全长核苷酸序列示于SEQ ID NO：24或26，因此任何本领域技术人员均能够设计出用于定量B7330N基因的探针或引物的核苷酸序列。
此外，基于由B7330N基因编码的蛋白的活性或量(quantity)，也可以分析该基因的表达水平。下面示出了一种测定B7330N蛋白量的方法。例如，免疫测定法对于测定生物材料中的蛋白是十分有效的。只要乳腺癌患者的样品中表达标志基因(B7330N基因)，可以将任何生物材料用作测定蛋白或其活性的生物样品。例如，作为这样的生物样品，可以举出乳房导管上皮。而体液，如血液及尿液同样可以用于分析。另一方面，可根据待分析的蛋白的活性选择适当的方法来测定由B7330N基因编码的蛋白的活性。
对生物样品中的B7330N基因的表达水平进行评估，并与正常样品(例如来源于非患病受试者的样品)中的表达水平相比较。当这样的比较显示靶基因的表达水平比正常样品中的表达水平高，则判定该受试者患有乳腺癌。可以同时测定来自正常受试者和待诊断受试者的生物样品中B7330N基因的表达水平。或者，可以采用统计学方法，基于分析从对照组预先采集的样品中基因表达水平获得的结果，确定出表达水平的正常范围。将由受试者样品获得的结果与正常范围进行比较而获得结果，当该结果未落入正常范围时，即判定受试者患有乳腺癌或处于罹患乳腺癌的危险中。
在本发明中，还提供诊断细胞增殖性疾病如乳腺癌的诊断试剂。本发明的诊断试剂包含与本发明的多核苷酸或多肽结合的化合物。优选地，与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸，或者与本发明多肽结合的抗体可用作这样的化合物。此外，可以使用适体，例如RNA、DNA或肽适体。
本发明的乳腺癌诊断方法还可以用于评价受试者中乳腺癌治疗的有效性。根据本方法，从接受乳腺癌治疗的受试者获取生物样品，例如受试细胞群体。评价方法可以按照公知的乳腺癌诊断方法进行。
必要时，在治疗前、治疗中或治疗后的不同时间点由受试者获取生物样品。然后确定生物样品中B7330N基因的表达水平，并与对照水平相比较，所述对照水平来自例如包含乳腺癌状态(即癌性细胞或非癌性细胞)已知的细胞的参照细胞群体。对照水平在未接受所述治疗的生物样品中确定。
如果对照水平来源于不含癌性细胞的生物样品，那么受试者来源的生物样品中的表达水平与对照水平之间的相似性表示所述的治疗是有效的。B7330N基因在受试者来源的生物样品中的表达水平与对照水平之间的差异，表示临床效果或预后不理想。
术语“有效的”表示治疗引起受试者体内病理性上调的基因(B7330N基因)的表达下降，或乳腺癌细胞的大小、患病率(prevalence)或增殖潜力降低。当预防性施用所述的治疗时，术语“有效的”表明治疗延迟或防止乳腺癌的发生。乳腺癌的评价可以使用标准的临床规程进行。此外，与任何已知的诊断或治疗乳腺癌的方法相结合来确定治疗的有效性。
此外，通过将来源于患者的生物样品，如受试细胞群中B7330N基因的表达水平与对照水平进行比较，诊断乳腺癌的本方法还可用于评价乳腺癌患者的预后。或者，可在一系列疾病阶段中测定来源于患者的生物样品中B7330N基因的表达水平，以评价患者的预后。
与正常对照水平相比，B7330N基因的表达水平上升，则表示预后不理想；而B7330N基因的表达水平与正常对照水平相似，则表示患者预后良好。
化合物的筛选
可以利用B7330N基因、该基因编码的蛋白或该基因的转录调控区，来筛选改变该基因表达或该基因编码多肽的生物活性的化合物。这样的化合物可以用作治疗或预防乳腺癌的药物。
因此，本发明提供使用本发明多肽来筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法。本筛选方法的一个实施方案包括下述步骤：(a)使受试化合物与本发明多肽接触；(b)检测受试化合物与本发明多肽之间的结合活性；和(c)选择与本发明多肽结合的化合物。本说明书中记载关于本发明多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的所有实施方案，在进行必要改变后，同样适用于采用所述多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的本说明书所披露的筛选方法。
用于筛选的本发明多肽可以是重组多肽，也可以是来源于天然的蛋白，或它们的部分肽。与受试化合物相接触的本发明多肽例如可以是纯化的多肽、可溶性蛋白、与载体结合的形态或与其它多肽融合的融合蛋白。
作为蛋白的筛选方法，例如使用本发明多肽筛选与本发明多肽结合的蛋白的方法，可使用本领域技术人员公知的许多方法。这样的筛选可通过，例如免疫沉淀法，具体地以下述方式进行。通过将编码本发明多肽的基因插入外源基因表达载体，如pSV2neo，pcDNA I，pcDNA3.1，pCAGGS和pCD8，使之在宿主(例如动物)细胞等中表达。用于表达的启动子可以是通常使用的任何启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))、EF-α启动子(Kim et al.，Gene 91：217-23(1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193-9(1991))、RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SRα启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8：466-72(1988))、CMV立即早期启动子(CMV immediate early promoter)(Seed and Aruffo，Proc NatlAcad Sci USA 84：3365-9(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J MolAppl Genet 1：385-94(1982))、腺病毒晚期启动子(Adenovirus late promoter)(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9：946-58(1989))、HSV TK启动子等。可以根据任何方法将基因导入欲表达外源基因的宿主细胞，这些方法例如电穿孔法(Chu et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))、磷酸钙法(Chen andOkayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol 4：1641-3(1984))、脂质转染(Lipofectin)法(Derijard B，et al.，Cell 76：1025-37(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 5：22-30(1993)；Rabindran et al.，Science259：230-4(1993))等。通过将特异性已知的单克隆抗体的表位导入本发明多肽的N末端或C末端，可以以包含单克隆抗体的识别位点的融合蛋白的形式表达本发明多肽。可以使用可商购的表位-抗体系统(ExperimentalMedicine 13：85-90(1995))。可以利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖-结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等的融合蛋白的载体是可商购的。
还报道了这样的融合蛋白，其通过仅引入由几个到十几个氨基酸组成的小表位而制备，以免因融合而改变本发明用于筛选的多肽的特性。表位如聚组氨酸(His标签)、流感病毒聚集体(influenza aggregate)HA、人c-myc、FLAG、水泡性口膜炎病毒糖蛋白(Vesicular stomatitis virus glycoprotein)(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(human simpleherpes virus glycoprotein)(HSV标签)、E标签(单克隆噬菌体上的表位)等，以及识别它们的单克隆抗体都可以用作表位-抗体系统来筛选能结合本发明多肽的蛋白(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。
在免疫沉淀法中，向用合适的表面活性剂(detergent)制备的细胞裂解物中添加这些抗体，形成免疫复合物。所述免疫复合物由本发明多肽、包含与该多肽结合之能力的多肽，以及抗体组成。除使用抗上述表位的抗体之外，还可以使用抗本发明多肽的抗体进行免疫沉淀，所述抗体可以如上所述制备。
当所述抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过例如蛋白A Sepharose或蛋白G Sepharose沉淀免疫复合物。如果将本发明多肽制备成带有表位，如GST的融合蛋白，可使用与这些表位特异性结合的物质，例如谷胱甘肽-Sepharose4B，按照与使用抗本发明多肽的抗体时相同的方式形成免疫复合物。
免疫沉淀可以模仿或遵照例如文献(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))中的方法进行。
通常使用SDS-PAGE对免疫沉淀的蛋白进行分析，可以使用合适浓度的凝胶通过蛋白的分子量来分析结合的蛋白。由于采用常规染色法例如考马斯(Coomassie)染色或银染色难以检测与本发明多肽结合的蛋白，因而可以通过下述方法改进所述蛋白的检测灵敏度：在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，在细胞中标记蛋白，并检测蛋白。在已知蛋白的分子量时，可以从SDS-聚丙烯酰胺凝胶直接纯化目标蛋白并测定其序列。
作为使用本发明多肽来筛选与该多肽结合的蛋白的方法，可以采用例如West-Western印迹分析(Skolnik et al，Cell 65：83-90(1991))。具体地说，可以通过下述方法获得与本发明多肽结合的蛋白：使用噬菌体载体(例如ZAP)，由细胞、组织、器官(例如，乳腺癌细胞系以及正常人的胎盘、胰脏、胃、气管、乳腺和骨髓等组织)或者期望表达与本发明多肽结合的蛋白的培养细胞(例如HBC4，HBC5，MCF-7，MDA-MB-231，YMB1，SKBR3，T47D)制备cDNA文库；使该蛋白在LB-琼脂糖(LB-agarose)上表达，将表达的蛋白固定在滤膜(filter)上，再使经纯化和标记的本发明多肽与上述滤膜反应，然后根据标记来检测表达与本发明多肽结合的蛋白的噬菌斑。利用生物素与抗生物素蛋白之间的结合，或者利用与本发明多肽或融合于本发明多肽的肽或多肽(例如GST)特异性结合的抗体，均可以对本发明多肽进行标记。也可以采用使用放射性同位素或荧光等的方法。
或者，在本发明的筛选方法的另一实施方案中，可以使用利用细胞的双杂合系统(two-hybrid system)(“MATCHMAKER双杂合系统”、“哺乳动物MATCHMAKER双杂合测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂合系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂合载体系统”(Stratagene)；参照“Dalton andTreisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。
在双杂合系统中，将本发明多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合，并在酵母细胞中表达。由预期表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，使该文库在表达时与VP16或GAL4转录活化区域(transcriptional activation region)融合。然后将cDNA文库导入上述酵母细胞，并从检测为阳性的克隆分离出来源于所述文库的cDNA(当在酵母细胞中表达可与本发明多肽结合的蛋白时，两者的结合能够激活报道基因，使阳性克隆能够被检测)。通过将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达蛋白，可以制备由该cDNA编码的蛋白。
报道基因除HIS3基因外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
采用亲和层析法同样可以筛选可与本发明多肽结合的化合物。例如，可以将本发明多肽固定于亲和层析柱的载体上，并将包含能与本发明多肽结合的蛋白的受试化合物施加于该层析柱上。本说明书中的受试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在将所述受试化合物上样后，对层析柱进行洗涤，并可制备出已与本发明多肽结合的化合物。
当受试化合物是蛋白时，分析获得的蛋白的氨基酸序列，基于该序列合成寡聚DNA，以该寡聚DNA为探针筛选cDNA文库，从而获得编码所述蛋白的DNA。
在本发明中，可以将利用表面等离子体共振现象(surface plasmonresonance phenomenon)的生物传感器(biosensor)用作对结合状态的化合物进行检测或定量的手段。当使用这类生物传感器时，只使用极少量的多肽且不需标记(例如BIAcore，Pharmacia)，即通过表面等离子体共振信号实时观察本发明多肽和受试化合物之间的相互作用。因此，可以使用生物传感器诸如BIAcore来评价本发明多肽和受试化合物之间的结合。
当使固定化的本发明多肽暴露于合成化合物或天然物质库(naturalsubstance banks)或随机噬菌体肽展示文库(random phage peptide displaylibrary)时，筛选结合分子的方法，以及使用基于组合化学技术的高通量来分离与TOM34蛋白结合的蛋白质乃至化合物(包括激动剂和拮抗剂)的筛选方法(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature 384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))，是本领域技术人员公知的。
或者，本发明提供使用本发明多肽来筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使受试化合物与本发明多肽接触；
(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和
(c)选择这样的化合物：与不存在受试化合物时检出的生物活性相比，该化合物抑制所述多肽的生物活性。
本发明的B7330N蛋白具有促进乳腺癌细胞的细胞增殖的活性，因而可以使用所述活性为指标，筛选抑制本发明的该蛋白的所述活性的化合物。
只要具有B7330N蛋白的生物活性，任何多肽均可用于筛选。所述生物活性包括人B7330N蛋白的细胞增殖活性。例如，可以使用人B7330N蛋白，也可以使用与这些蛋白功能上等价的多肽。所述多肽可以由细胞内源性或外源性表达。
如下面详细描述的，本发明部分基于与癌细胞增殖相关的B7330N蛋白新型糖基化的发现。B7330N通过活化细胞增殖相关的信号传导，在细胞生长的自分泌调节中起作用(图5a和5b)。在476N(天冬酰胺)被A(丙氨酸)取代的N476A突变体中，未观察到糖基化(图3b)。外源野生型B7330N分泌到培养基中，但在培养基中却不能检测到N476A蛋白。这提示：B7330N蛋白在Asn-476处的糖基化对分泌而言是必要的(图3c)。此外，与转染了N476A的细胞相比，表达野生型B7330N的细胞的生长快得多(图8b)。因此，通过阻碍B7330N的糖基化有望抑制乳腺癌的细胞生长。
这样，本发明提供调节B7330N的糖基化水平的、用于治疗或预防乳腺癌的化合物的筛选方法，该方法包括下述步骤：
(a)使表达B7330N多肽或其功能等价物的细胞与受试化合物接触；
(b)检测所述多肽的糖基化水平；和
(c)选择这样的化合物：与不存在受试化合物时检出的糖基化水平相比，所述化合物抑制所述多肽的糖基化水平。
或者，本发明提供使用本发明的多肽来筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法，包括下列步骤：
(a)使受试化合物与B7330N多肽或者包含B7330N多肽的糖基化位点的部分多肽在能够糖基化所述肽的条件下接触；
(b)检测所述多肽的糖基化水平；和
(c)选择这样的化合物：与不存在受试化合物时检测到的糖基化水平相比，其抑制所述多肽的糖基化水平。
其中，在筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的前述方法(其包括检测本发明多肽的糖基化水平及其它)的优选方案中，所述糖基化水平为本发明多肽的天冬酰胺476的糖基化水平，特别是SEQ ID NO：25所示氨基酸序列或其同源部分中的天冬酰胺476的糖基化水平。如前述，本领域技术人员可以容易地在本发明多肽中确定与SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的476位相应的位置。
这些方法通过下述步骤实行：使表达B7330N多肽或其具有糖基化位点的功能等价物的细胞，或者多肽本身，与一种或多种候选化合物接触；并检测发生了接触的B7330N或其功能等价物的糖基化水平。
通过这些方法来鉴定调节B7330N或其功能等价物的糖基化水平的化合物。
在本发明中，术语“功能(上)等价”还意味着对象蛋白具有与B7330N相同或基本上相同的糖基化水平。具体地，包含糖基化位点的蛋白或该蛋白的部分氨基酸被催化糖基化。根据本发明，可以确定对象蛋白是否具有目标活性。即，可以采用下述方法检测B7330N蛋白的糖基化水平：在适于所述蛋白糖基化的条件下，使多肽与受试化合物接触。
在本发明中，可以采用本技术领域公知的方法确定B7330N多肽的糖基化水平。例如，可以通过比较分子量来检测多肽的糖基化。因为添加了糖苷链，糖基化蛋白的分子量比由多肽的氨基酸序列计算出的预计尺寸的分子量大。此外，如果通过糖苷酶处理可以降低糖基化蛋白的分子量，则可以确认分子量的差异是由于附加糖苷链所引起的。推测蛋白质的分子量的方法是公知的。
此外，为了检测多肽的糖苷链附加，可以使用糖基化用放射性标记供体。可以通过SDS-PAGE电泳和荧光自显影来检测放射性标记向B7330N蛋白的转移。此外，可以在反应后，通过过滤将B7330N肽从糖基化供体中分离，采用闪烁计数法测定保留在滤膜上的放射性标记的量。可以结合于糖基化供体的其它适宜标记例如生色性标记和荧光标记、以及检测这些标记向B7330N蛋白的转移的方法，是本领域技术人员公知的。此外，B7330N的糖基化水平可以通过选择性识别多肽糖基化水平的试剂来测定。例如，可以将B7330N多肽和候选化合物在可将该多肽糖基化的条件下温育，然后通过免疫学方法检测该多肽的糖基化水平。使用识别糖基化多肽的抗体的任何免疫学技术，均可用于检测。例如，抗糖基化多肽的抗体已经商品化。使用识别糖基化多肽的抗体的ELISA或免疫印迹，可以用于本发明。
除使用抗体外，还可以使用以高亲和性选择性结合糖苷链的试剂来检测糖基化蛋白。这样的试剂是本技术领域公知的，或者可以采用本技术领域公知的筛选测定进行测定。例如，公知凝集素是糖苷链特异性探针。偶联有碱性磷酸酶等可检测标记的凝集素试剂也已经商品化。
细胞中多肽的糖基化水平可以通过对细胞裂解物进行分离来推测。例如，SDS-聚丙烯酰胺凝胶可以用于多肽的分离。将在凝胶上分离的多肽转移到硝酸纤维素膜上，以进行免疫印迹分析。
通过这种筛选分离的化合物是本发明多肽的激动剂或拮抗剂的候选物。术语“激动剂”指通过与本发明多肽结合而活化其功能的分子。同样地，术语“拮抗剂”指通过与本发明多肽结合而抑制其功能的分子。而且，通过这种筛选分离的化合物是抑制本发明多肽与分子(包括DNA和蛋白)在体内的相互作用的候选化合物。
当本发明的方法中检测的生物活性为细胞增殖时，可以如实施例所述，通过例如如下方法来检测生物活性：制备表达本发明多肽的细胞，在存在受试化合物的条件下培养所述细胞，然后测定细胞增殖速度、测定细胞周期、测定集落形成活性等。
在另一个实施方案中，本发明提供筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法。如上详细描述，通过控制B7330N的表达水平，可以控制乳腺癌的发病和进展。因而，通过以B7330N的表达水平为指标进行筛选，可以鉴定能够用于治疗或预防乳腺癌的化合物。在本发明的上下文中，这样的筛选可包括例如以下步骤：
(a)使受试化合物与表达B7330N的细胞接触；和
(b)选择这样的化合物：与不存在受试化合物时检出的表达水平相比，所述化合物降低B7330N表达水平。
表达B7330N的至少一个的细胞，包括例如由乳腺癌建立的细胞系；这样的细胞可以用于本发明的上述筛选(例如HBC4，HBC5，MCF-7，MDA-MB-231，YMB1，SKBR3，T47D，BT-20，HCC1500或MDA-MB-453等)。表达水平可以采用本领域技术人员熟知的方法进行评估。在本筛选方法中，可以选择降低B7330N的表达水平的化合物作为用于治疗或预防乳腺癌的候选物质。
或者，本发明的筛选方法可以包括以下步骤：
(a)使受试化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体含有标志基因的转录调控区及在该转录调控区的调控下表达的报道基因，其中所述标记基因为B7330N；
(b)测定该报道基因的表达水平或活性；和
(c)选择这样的化合物：与不存在受试化合物时检出的对照水平相比，所述化合物降低该报道基因的表达水平或活性。
合适的报道基因和宿主细胞是本领域公知的。可以使用标志基因的转录调控区制备筛选所需的报道分子构建体。当本领域技术人员已经知道标志基因的转录调控区时，可以使用先前的序列信息来制备报道分子构建体。当标志基因的转录调控区仍未鉴定时，可以基于标志基因的核苷酸序列信息从基因组文库中分离含有转录调控区的核苷酸区段。
可用于结合蛋白的支持物(support)的实例包括不溶性多糖，如琼脂糖、纤维素和葡聚糖；及合成树脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅(silicon)；优选地，可使用由上述材料制备的可商购的珠子和板(例如多孔板，生物传感器芯片等)。使用珠子时，可以将其填入柱子。
蛋白与支持物的结合可根据常规方法进行，这些方法例如化学键合或物理吸附。或者，蛋白可通过特异性识别它的抗体而与支持物结合。此外，还可以利用抗生物素蛋白和生物素来进行蛋白与支持物的结合。
蛋白之间的结合在缓冲液中进行，缓冲液例如但不限于磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液，只要所述缓冲液不抑制蛋白之间的结合即可。
本发明中，利用表面等离子体共振现象的生物传感器可用作检测或定量已结合的蛋白的装置。当使用这样的生物传感器(例如BIAcore，Pharmacia)时，仅使用少量的多肽，而且无需标记，即可通过表面等离子体共振信号实时观察蛋白之间的相互作用。
或者，可以对B7330N多肽进行标记，结合蛋白的标记可用于检测或测定已结合的蛋白。具体地，对一种蛋白进行预标记之后，在受试化合物存在的条件下使标记的蛋白与其它蛋白接触，然后在洗涤之后根据标记检测或测定已结合的蛋白。
本发明的方法中，可以使用标记物质来标记蛋白，所述标记物质如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶)、荧光物质(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明)和生物素/抗生物素蛋白。当用放射性同位素标记蛋白时，可通过液体闪烁法(liquid scintillation)进行检测或测定。或者，可以通过加入酶的底物，用吸收光度计(absorptiometer)检测底物的酶促变化，如产生颜色，来检测或测定酶标记的蛋白。此外，将荧光物质用作标记的情况中，可利用荧光光度计检测或测定已结合的蛋白。
在本发明的筛选中使用抗体的情况下，所述抗体优选利用上述标记物质之一进行标记，并基于标记物质进行检测或测定。或者，也可以将抗B7330N多肽或肌动蛋白的抗体用作第一抗体，使用以标记物质标记的第二抗体对其进行检测。此外，本发明的筛选中与蛋白结合的抗体，可使用蛋白G或蛋白A柱加以检测或测定。
在本发明的筛选方法中可以使用任何受试化合物，这些化合物例如细胞提取物、细胞培养物上清、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物以及天然化合物。本发明的受试化合物可以使用本领域已知的组合文库法中多种方法中的任一种获得，所述方法包括(1)生物学文库，(2)空间可寻址平行固相或溶液相文库(spatially addressable parallel solid phase or solution phaselibraries)，(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物(one bead one compound)”文库法和(5)使用亲和层析选择的合成文库法。使用亲和层析选择的生物学文库法仅限于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。合成分子文库的方法的举例可见于本技术领域(DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909-13；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：11422-6；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37：2678-85；Cho et al.(1993)Science 261：1303-5；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37：1233-51)。化合物文库可存在于溶液中(参见Houghten(1992)Bio/Techniques 13：412-21)，或珠子(Lam(1991)Nature 354：82-4)，芯片(Fodor(1993)Nature 364：555-6)，细菌(美国专利5,223,409)，孢子(美国专利5,571,698；5,403,484和5,223,409)，质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-9)或噬菌体(Scott and Smith(1990)Science 249：386-90；Delvin(1990)Science 249：404-6；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-82；Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-10；美国专利申请2002103360)。
通过本发明的筛选方法分离的化合物可作为药物的候选物，所述药物抑制本发明多肽的活性，用于治疗或预防例如乳腺癌等起因于细胞增殖性疾病的疾病。此外，通过本发明的筛选方法获得的化合物还包括通过本发明的筛选方法获得的化合物中部分结构发生添加、缺失和/或取代而得的化合物。
用于治疗或预防乳腺癌的药物组合物
本发明提供用于治疗或预防乳腺癌的组合物，其含有通过本发明的筛选方法选择的任意化合物。
当通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒、黑猩猩，以治疗细胞增殖性疾病(例如乳腺癌)时，该分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成各种剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物在一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unit dose)中与药理学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、溶媒(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。这些制剂中有效成分的含量使得指定范围内合适的给药量能够构达到。
能够混合到片剂和胶囊中的添加剂的例子包括但不限于粘合剂如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶(tragacanth gum)和阿拉伯胶，赋形剂例如结晶纤维素，溶胀剂例如玉米淀粉、明胶和海藻酸(alginic acid)，润滑剂例如硬脂酸镁，增甜剂例如蔗糖、乳糖或糖精，和调味剂例如薄荷(peppermint)、红珠树(Gaultheria adenothrix)油和樱桃。当单位剂型为胶囊剂时，上述成分中还可以包括液体载体，例如油。注射用无菌组合物可以使用溶媒例如注射用蒸馏水，按照标准的药物配制方式进行配制。
生理盐水、葡萄糖以及包含辅料，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等渗液体，可用作注射用水溶液。这些可以与合适的增溶剂组合使用，所述增溶剂例如醇，具体有乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂例如Polysorbate 80(TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油是油质液体的实例，所述油质液体可以与苯甲酸苄酯或苯甲醇组合使用作为增溶剂，还可与缓冲液如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液、镇痛剂如盐酸普鲁卡因、稳定剂如苯甲醇和苯酚和抗氧化剂一起配制。制备的注射剂可以装入到合适的安瓿(ampoule)中。
可以利用本领域技术人员所公知的方法给患者施用本发明的药物组合物，例如通过动脉内、静脉内或经皮注射，以及鼻内、气管内、肌内或口服给药施用于患者。施用剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法而变化；不过，本领域技术人员能够按常规对其进行选择。如果所述化合物由DNA编码，可将该DNA插入到基因治疗载体中，并给患者施用该载体以进行治疗。施用的剂量和方法因患者的体重、年龄和症状而异，但是本领域技术人员能够合适地选择它们。
举例来说，当向普通成年人(体重60kg)口服给药时，虽然根据其症状存在一些差异，但与本发明的多肽结合并调节其活性的化合物的剂量为约0.1mg-约100mg每天，优选为约1.0mg-约50mg每天，更优选为约1.0mg-约20mg每天。
当以注射剂形式向普通成年人(体重60kg)非消化道施用时，虽然根据患者、靶器官、症状和施用方法存在一些差异，但方便的做法是静脉内注射约0.01mg-约30mg每天，优选约0.1mg-约20mg每天，更优选约0.1mg-约10mg每天的剂量。而且，在其它动物的情况下，可以按60kg体重的标准常规换算出合适的施用量。
此外，本发明提供用于治疗或预防乳腺癌的药物组合物，其包含抑制B7330N基因表达的有效成分。这样的有效成分包括针对B7330N基因的反义多核苷酸、siRNA或核酶，或者所述反义多核苷酸、siRNA或核酶的衍生物，例如表达载体。
通过与合适的基质混合，可以将这些活性成分制成外用制剂，如搽剂或罨剂，其中所述合适的基质对衍生物(derivative)是无活性的。并且根据需要，通过添加赋形剂、等渗剂(isotonic agents)、增溶剂、稳定剂、防腐剂、镇痛剂等，可以将这些活性成分配制成例如片剂、粉末、颗粒、胶囊、脂质体胶囊、注射剂、溶液、滴鼻剂和冷冻干燥剂。这些剂型可以按常规方法制备。
通过直接将活性成分施于患处(ailing site)，或通过将其输入血管以使其到达患处而将活性成分给予患者。也可使用封固剂(mounting medium)来提高持久性和膜通透性。封固剂的例子包括脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染试剂(lipofectamine)或它们的衍生物。
本发明的这种组合物的剂量可以根据患者的状况(condition)适当调整，并按所需的量使用。例如，可以施用的剂量范围为0.1-100mg/kg，优选0.1-50mg/kg。
本发明的另一实施方式为用于治疗和预防乳腺癌的组合物，该组合物含有针对B7330N基因编码多肽的抗体、或所述抗体与该多肽结合的片段。
当向普通成年人(体重60kg)口服给药时，虽然根据症状存在一些差别，但用于治疗或预防乳腺癌的抗体或其片段的剂量为约0.1mg-约100mg每天，优选为约1.0mg-约50mg每天，更优选为约1.0mg-约20mg每天。
当以注射剂形式向普通成年人(体重60kg)非消化道给药时，虽然根据患者的状况、疾病症状和给药方法而存在一些差别，但方便的做法是静脉内注射约0.01mg-约30mg每天，优选约0.1mg-约20mg每天，更优选约0.1mg-约10mg每天的剂量。同样地，在其它动物的情况下，可以按60kg体重的标准常规换算出合适的施用量。
用于治疗或预防乳腺癌的方法
本发明提供治疗或预防受试者中的乳腺癌的方法。预防性或治疗性地对患有乳腺癌或存在患乳腺癌的风险(或易感性)的受试者施用治疗用化合物。采用标准临床方法、或者通过检测B7330N的异常表达水平或活性，来鉴定这样的受试者。预防性给药在出现疾病的明显临床症状之前进行，以阻止疾病或病症或者延迟其进程。
本发明的治疗方法包括降低B7330N基因的表达或功能的步骤。在这些方法中使用有效量的化合物对受试者进行治疗，所述化合物降低受试者中过高表达的基因(B7330N基因)。给药可以是全身给药或局部给药。治疗化合物包括降低乳腺癌细胞内源性基因之表达水平的化合物(即，下调过高表达基因之表达的化合物)。施用这样的治疗化合物可以对抗受试者细胞中异常过高表达基因的影响，并预期改善受试者的临床状况。所述化合物可以通过上述的本发明的筛选方法获得。
此外，B7330N基因表达的抑制可以采用本领域已知的几种方法中的任何一种，这些方法中包括给受试者施用抑制或拮抗基因表达的核酸。也可将破坏基因表达的反义寡核苷酸、siRNA或核酶用于抑制基因表达。可用于破坏基因表达的反义寡核苷酸、siRNA或核酶如本说明书中前面的描述。
如上所述，可以使用对应于B7330N基因核苷酸序列的反义寡核苷酸来降低B7330N基因的表达水平。具体地说，本发明的反义寡核苷酸可以通过与由B7330N基因编码的多肽或与之对应的mRNA中的任何一个结合而发挥作用，从而抑制该基因的转录或翻译，促进mRNA降解和/或抑制该基因所编码的蛋白的表达，最终抑制B7330N蛋白的功能。
通过与合适的基质(base material)混合，可以将反义寡核苷酸及其衍生物制成外用制剂，如搽剂(liniment)或罨剂(poultice)，并用于本发明的治疗或预防乳腺癌的方法，其中所述合适的基质对衍生物是无活性的(inactive)。
此外，抑制过高表达基因的基因产物的核酸还包括小干扰RNA(siRNA)，所述siRNA含有编码B7330N基因之核苷酸序列的有义链核酸与反义链核酸的组合。本发明所述的治疗或预防可以使用siRNA导入细胞的标准技术，包括以DNA为RNA转录的模板的技术。构建siRNA以使单一转录物(single transcript)具有来自靶基因的有义序列和互补的反义序列，例如为发夹结构(hairpin)。
使用本方法抑制B7330N基因表达上调的细胞的基因表达。siRNA在靶细胞内与B7330N基因的转录物结合，导致该细胞B7330N蛋白产生减少。
此外，抑制过高表达基因的基因产物的核酸还包括针对过高表达基因(B7330N基因)的核酶。
此外，本发明提供使用针对本发明多肽的抗体治疗或预防乳腺癌等细胞增殖疾病的方法。根据本方法，施用药物有效量的针对本发明多肽的抗体。B7330N蛋白的表达在乳腺癌细胞中上调，并且抑制这些蛋白的表达降低细胞增殖活性，因而预计通过抗体与这些蛋白的结合可以治疗或预防细胞增殖性疾病。因此，以足以降低本发明蛋白活性的量施用针对本发明多肽的抗体，该施用量为0.1-约250mg/kg每天的范围。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选为约5mg-约10g/天，更优选为约100mg-约3g/天。
或者，与肿瘤细胞特异性细胞表面标志结合的抗体可以用作药物递送的工具。例如，以足以杀伤肿瘤细胞的量施用与细胞毒剂偶联的抗体。
本发明的另一方面为治疗或预防乳腺癌的方法，该方法包括施用药物有效量的下述物质的步骤：该物质抑制本发明多肽之氨基酸序列中天冬氨酸476的糖基化，特别是SEQ ID NO：25所示多肽的氨基酸序列中天冬氨酸476的糖基化。
本发明还涉及诱导抗肿瘤免疫的方法，该方法包括下述步骤：施用B7330N蛋白或其免疫活性片段、或者编码所述蛋白的多核苷酸或其片段。B7330N蛋白或其免疫活性片段作为针对乳腺癌等细胞增殖性疾病的疫苗是有用的。在一些情况下，该蛋白或其片段可以以结合于T细胞受体(TCR)的形式施用，或者以被抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞、树突细胞(DC)或B细胞呈递的形式施用。由于DC具有强抗原呈递能力，所以在APC中最优选使用DC。
在本发明中，针对细胞增殖性疾病的疫苗，是指具有接种于动物时诱导抗肿瘤免疫之功能的物质。一般而言，抗肿瘤免疫包括诸如以下的免疫应答：
-诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，
-诱导识别肿瘤的抗体，和
-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。
因此，当某蛋白接种于动物时诱导任一种上述免疫反应时，确定该蛋白具有诱导抗肿瘤免疫的效果。由蛋白诱导的抗肿瘤免疫可以通过在体内或体外观察宿主中免疫系统针对该蛋白的应答而加以检测。
例如，检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是公知的。进入活体的外来物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用而被呈递于T细胞和B细胞。以抗原特异性方式应答于APC所呈递抗原的T细胞由于该抗原的刺激而分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)，然后增殖(这称为T细胞活化)。因此，肽对于CTL的诱导，可以通过将该肽经由APC呈递于T细胞和检测CTL的诱导来进行评估。此外，APC具有激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜酸粒细胞(eosinophil)和NK细胞的功效。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中也是重要的，可使用这些细胞的激活效应作为指标来评价肽的抗肿瘤免疫诱导作用。
使用树突细胞(DC)作为APC评价CTL诱导作用的方法在本领域中是众所周知的。在APC中，DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，首先使受试多肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。在与DC接触后，如果检测出具有针对目标细胞的细胞毒性作用的T细胞，则表示该受试多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。CTL的抗肿瘤活性可以例如采用51Cr标记的肿瘤细胞的裂解(lysis)作为指标来进行检测。或者，采用3H-胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评价肿瘤细胞损伤程度的方法也是众所周知的。
除DC外，外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。已报道通过在存在GM-CSF和IL-4的情况下培养PBMC可增强CTL的诱导。相似地，已显示在存在钥孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7的条件下培养PBMC诱导了CTL。
通过这些方法确定为具有CTL诱导活性的受试多肽，是具有DC激活效应和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过与所述多肽接触而获得诱导针对肿瘤的CTL的能力的APC也可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗肿瘤的疫苗。利用由APC和CTL所致的抗肿瘤免疫的这些肿瘤治疗方法称为细胞免疫疗法。
一般来说，当细胞免疫疗法使用多肽时，已知组合多种具有不同结构的多肽并使其与DC接触将增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋白片段刺激DC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。
或者，多肽对抗肿瘤免疫的诱导可以通过观察针对肿瘤的抗体产生的诱导来确认。例如，当用多肽免疫的实验动物中诱导产生抗该多肽的抗体并且这些抗体抑制肿瘤细胞生长时，所述多肽可视为具有诱导抗肿瘤免疫的能力。
施用本发明的疫苗诱导抗肿瘤免疫，而该抗肿瘤免疫的诱导使治疗和预防乳腺癌等细胞增殖性疾病成为可能。抗癌治疗或对癌症发病的预防可以包括任何下述步骤：诸如癌性细胞生长的抑制，癌症的退缩(involution)以及癌发生的抑制。癌症的治疗或预防的效果还包括患癌症个体的死亡率降低、血液中肿瘤标志减少、癌症伴发的可检测症状的缓解等。所述治疗性和预防性效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中显著性水平为5％或更低，在所述观察中将疫苗针对细胞增殖性疾病的治疗性或预防性效果与未施用疫苗的对照进行比较。例如，可将Student’s t-检验，Mann-WhitneyU-检验或ANOVA用于统计学分析。
具有免疫活性的上述蛋白或编码该蛋白的载体可与佐剂组合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白共同(或相继)施用时增强针对该蛋白的免疫应答的化合物。例示性的佐剂包括但不限于霍乱毒素(cholera toxin)、沙门氏菌毒素(salmonella toxin)、明矾(alum)等。此外，本发明的疫苗可适宜地与药物可接受的载体组合。这样的载体的例子包括但不限于无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。此外，疫苗可根据需要包含稳定剂，悬浮剂(suspensions)，防腐剂，表面活性剂等。疫苗全身或局部地进行施用。疫苗施用可以通过单次给药进行，或者通过多次给药来强化(boost)。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以例如通过离体(ex vivo)方法治疗或预防肿瘤。更具体地，可以收集接受治疗或预防疗法的受试者的PBMC，使细胞与多肽在离体条件下接触，诱导APC或CTL，然后将该细胞施用于受试者。也可通过将编码多肽的载体在离体条件下导入PBMC中来诱导APC。体外诱导的APC或CTL可以在施用前进行克隆。通过克隆和培养具有高靶细胞破坏活性的细胞，可以更有效地实施细胞免疫治疗。此外，以该方式分离的APC和CTL不仅可以用于针对提供细胞的受试者进行细胞免疫治疗，还可以用于针对来自其它个体的相似类型的肿瘤进行细胞免疫治疗。
此外，本发明提供治疗或预防乳腺癌等细胞增殖性疾病的药物组合物，其包含药物有效量的B7330N多肽。该药物组合物可以用于激起抗肿瘤免疫。B7330N的正常表达限于胎盘、胰脏、胃、气管、乳腺和骨髓。因而，对这些基因的抑制不会给其它器官造成不良影响。因此，B7330N多肽优选用于治疗细胞增殖性疾病，特别是乳腺癌。而且，由于已揭示在癌细胞中特异性表达的蛋白的肽片段诱导抗癌免疫应答，因此也可以将B7330N的肽片段用于治疗或预防细胞增殖性疾病如乳腺癌的药物组合物中。本发明中，以足够诱导抗肿瘤免疫的剂量施用多肽或其片段，剂量范围为0.1mg-10mg，优选0.3mg-5mg，更优选0.8mg-1.5mg。反复进行施用。为诱导抗肿瘤免疫，例如可以每2周施用1mg肽或其片段4次。
此外，编码B7330N的多核苷酸或者它们的片段可以用于激发抗肿瘤免疫。可以将这样的多核苷酸纳入表达载体以在待治疗的受试者中表达B7330N或者它们的片段。因此，本发明包含诱导抗肿瘤免疫的方法，其中给患有细胞增殖性疾病如乳腺癌或处于发生此类疾病的危险中的受试者施用编码B7330N的多核苷酸或者它们的片段。
当然，本说明书中记载的乳腺癌的治疗或预防方法或抗肿瘤免疫的诱导方法的实施方式，在稍加必要改变后，也适用于上述乳腺癌治疗或预防方法或者抗肿瘤免疫诱导方法中所应用的任何化合物在制备药物组合物方面的用途，其中所述药物组合物用于在受试者中治疗或预防乳腺癌或者诱导抗肿瘤免疫，尤其是抗乳腺肿瘤免疫。
以下的实施例是为例示本发明以及帮助本领域技术人员实施和使用本发明而提供的。在任何情况下，这些实施例都不意味着对本发明范围的限定。
除非另外限定，本说明书中使用的全部技术术语和科学术语均与本发明所属技术领域的普通技术人员一般理解的含义相同。尽管与本说明书中的所述类似或等价的方法和材料均可用于实施或检验本发明，但以下描述了合适的方法和材料。本说明书中引用的任何专利、专利申请和出版物均并入作为参考。本说明书中的任何记载均不应解释为承认本发明不具有通过在先发明而处于上述公开之前的权利。
实施本发明的最佳方式
通过下面的实施例详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
材料和方法
乳腺癌细胞系及肿瘤标本
人乳腺癌细胞系HBL-100、HCC1937、MCF-7、MDA-MB-435s、YMB1、SKBR3、T47D、BT-20、BT-474、BT-549、HCC1143、HCC1500、HCC1599、MDA-MB-157、MDA-MB453、OUCB-F、ZR-75-1及COS-7细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，并按它们各自保藏人的建议进行培养。HBC4、HBC5和MDA-MB-231细胞系由日本财团法人癌研究会癌化学疗法中心分子药理部(Molecular Pharmacology，Cancer Chemotherapy Centre of the Japanese Foundation for Cancer Research)矢守博士惠赠。所有的细胞均在合适的培养基中进行培养，即对于HBC4、HBC5、T47D、YMB1、OUCB-F、ZR-75-1、BT-549、HCC1143、HCC1500、HCC1599和HCC1937使用RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)(添加2mM的L-谷氨酰胺)；对于BT474、HBL100和COS7使用Dulbecco改进的Eagle培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)；对于BT-20和MCF-7使用含0.1mM必需氨基酸(Roche)、1mM丙酮酸钠(Roche)、0.01mg/ml胰岛素(Sigma)的EMEM(Sigma)；对于SKBR3使用McCoy(Sigma)(添加1.5mM的L-谷氨酰胺)；对于MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB453和MDA-MB-435s使用L-15(Roche)。每种培养基都添加有10％胎牛血清(Cansera)和1％抗生素/抗真菌溶液(antibiotic/antimycotic solution)(Sigma)。于37℃，在不含CO2的湿润空气的气氛中维持MDA-MB-231和MDA-MB-435s细胞。于37℃，在含5％CO2的湿润空气的气氛中维持其它细胞系。经每位患者书面知情同意(informed consent)后，由手术标本获取了临床样品(乳腺癌和正常乳房导管)。
发明人的cDNA微阵列上编号B7330N的点表示的新人类基因的分离
cDNA微阵列载玻片的制作另有描述(Ono K，et al.，(2000)Cancer Res.，60，5007-11)。关于表达模式的各项分析，准备了一式两组含27648个cDNA点的载玻片，以减少实验性波动。简单地说，由各个激光显微解剖的细胞样品纯化总RNA，进行基于T7的RNA扩增，获得了充分量的RNA以进行微阵列实验。对于等份的由乳腺癌细胞和正常乳房导管细胞扩增获得的RNA，分别使用了Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)通过逆转录进行了标记。按以前描述的方法(Ono K，etal.，(2000)Cancer Res.，60，5007-11)进行杂交、清洗和检测。为了检测在乳腺癌中普遍上调的基因，对微阵列上的27648个基因的全面表达图式进行筛选，选择了下述基因：这些基因在超过50％的i)所有77例闭经前乳腺癌病例、ii)69例浸润性导管癌、iii)31例高度分化型病变、iv)14例中度分化型病变或v)24例低度分化型病变中，表达比均大于3.0。在肿瘤细胞中表现上调的493个基因中，本发明人着眼于机构内部编号为B7330N的基因，因为其在超过30％的乳腺癌信息病例中表达比大于3.0。
半定量RT-PCR分析
本发明人从激光捕获细胞的各群体中提取总RNA，然后按以前描述的方法进行基于T7的扩增和逆转录(Kitahara O，et al.，(2001)Cancer Res.，61，3544-9)。本发明人通过监测作为定量内部对照的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，制备了用于后续PCR的各单链cDNA的适宜的稀释物。PCR引物序列如下：
用于GAPDH：5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′(SEQ ID NO：1)和5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3′(SEQ ID NO：2)；以及
用于B7330N：5’-GAGTCCAGGTAAGTGAATCTGTCC-3’(SEQ ID NO：3)和5’-ATTTCCACCGAGACCTCTCATC-3’(SEQ ID NO：4)。
Northern印迹分析
按生产商的说明书，使用RNeasy kit(QIAGEN)从全部的乳腺癌细胞系中提取了总RNA。在用DNA酶I(Nippon Gene，Osaka，Japan)处理后，使用mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences)按生产商的说明书分离了mRNA。将1μg等份的各种mRNA以及从正常成人的乳房(BioChain)、肺、心、肝、肾、骨髓(BD，Clontech，Palo Alto，CA)分离的polyA(+)RNA，在1％变性琼脂糖凝胶上分离并转移到尼龙膜上(乳腺癌Northern印迹)。使乳腺癌Northern印迹及人类多组织Northern印迹(Human multiple-tissueNorthern blots，Clontech，Palo Alto，CA)与通过RT-PCR制备(参考下述)的[α32P]-dCTP标记B7330N PCR产物进行杂交。按供应商的推荐进行预杂交、杂交和洗涤。印迹使用增感屏(intensifying screen)在-80℃放射自显影14天。通过RT-PCR制备针对B7330N(502bp)的特异性探针，并采用megaprime DNA标记系统(Amersham Bioscience)进行了放射性标记，所述RT-PCR使用以下引物组：5’-GAGTCCAGGTAAGTGAATCTGTCC-3’(SEQ ID NO：3)和5’-ATTTCCACCGAGACCTCTCATC-3’(SEQ ID NO：4)。
B7330N表达载体的构建
为了构建B7330N表达载体，使用KOD-Plus DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)和以下引物通过PCR扩增了B7330N cDNA的完整编码序列：
正向：5’-CGGAATTCATGAGGCTCCTCCGCAG-3′(SEQ ID NO；5)，(下划线为EcoR I位点)，
反向：5’-CCGCTCGAGGACAAAGAGCCACAACTGATG-3′(SEQ IDNO；6)(下划线为Xho I位点)。
将PCR产物插入pCAGGS-HA表达载体的EcoR I位点和Xho I位点。为了构建B7330N变体，本发明人使用PCR定点突变试剂盒(PCR site-directmutagenesis kit，Invitrogen)和以下引物，将B7330N蛋白中两个被预测为潜在N-糖基化位点的天冬酰胺残基(Asn-476和Asn-611)替换为丙氨酸残基，所使用的引物如下：
N476A-F：5’-ACAACTGCACTGTCACGCCTTTTCCTGGTACCTGC-3′(SEQID NO；7)和
N476A-R：5’-GCAGGTACCAGGAAAAGGCGTGACAGTGCAGTTGT-3′(SEQ ID NO；8)；
N611A-F：5’-CATGGCCCCCTGCGCACCCAGTGACCCCC-3′(SEQ ID NO；9)和
N611A-R：5’-GGGGGTCACTGGGTGCGCAGGGGGCCATG-3′(SEQ ID NO；10)。
通过DNA序列测定确认了这些构建体(pCAGGS-B7330N-HA，pCAGGS-N476A-HA和pCAGGS-N611A-HA)。为了制备用于二聚体化实验的构建体，将B7330N的完整编码序列克隆到了pcDNA3.1-myc-his载体(Invitrogen)中。
免疫细胞化学染色
首先，为考察外源性B7330N的亚细胞定位，本发明人以1×105个细胞每孔接种了COS7细胞，用于外源性表达。72小时后，使用FuGENE 6转染试剂(Roche)按生产商的说明书分别用1μg的pCAGGS-B7330N-HA瞬时转染COS7细胞。然后，使用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞15分钟，并用含0.1％Triton X-100的PBS于4℃处理2.5分钟以使细胞可通透。接下来，用含3％BSA的PBS于4℃覆盖细胞12小时，以封闭非特异性杂交。接着，将用B7330N-HA转染的COS7细胞与1∶1000稀释的大鼠抗HA抗体(Roche)一起温育。用PBS(-)清洗后，将转染细胞用1∶1000稀释的Alexa488-偶联抗大鼠第二抗体(Molecular Probe)进行了染色。用4′，6′-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸(DAPI)对细胞核进行了复染。在TCS SP2 AOBS显微镜(Leica，Tokyo，Japan)下获取了荧光影像。
抗B7330N的特异性多克隆抗体的制备
使用pET28载体(Novagen，Madison，WI)制备了设计成表达N末端和C末端带His标签表位的两个B7330N片段(35-239a.a.)的载体。在大肠杆菌BL21 codon-plus菌株(Stratagene，La Jolla，CA)中表达重组肽，按供应商的规程使用Ni-NTA树脂琼脂糖(Qiagen)对其进行了纯化。将纯化的重组蛋白接种于兔。按标准方法使用重组蛋白(35-239a.a.)在亲和柱上纯化了免疫血清。亲和纯化的抗B7330N抗体用于下面的Western印迹、免疫细胞染色和免疫组织化学染色。
乳腺癌细胞系中内源性B7330N的表达
为了在乳腺癌细胞系(HBC5，MDA-MB-231，SKBR3和T47D)和HMEC(人乳腺上皮细胞)中检测内源性B7330N蛋白，按前述在裂解缓冲液中裂解了细胞。使用蛋白测试试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)估计了总蛋白量，其后与SDS-样品缓冲液混合，煮沸，上样于前述的10％SDS-PAGE凝胶。电泳后，将蛋白印迹在硝酸纤维素膜(GE Healthcare)上。用封闭液(blockingsolution)封闭含蛋白的膜，将其与抗B7330N多克隆抗体一起温育，来检测内源性B7330N蛋白。最后，将膜与HRP偶联第二抗体一起温育，使用ECL检测试剂(GE Healthcare)使蛋白条带可视化。还考察了β-肌动蛋白作为上样对照(loading control)。
为了进一步考察乳腺癌细胞系T47D中内源性B7330N蛋白的亚细胞定位，本发明人以1×105个细胞每孔(Lab-Tek II腔式载玻片，Nalgen NuncInternational，Naperville，IL)接种了细胞。温育24小时后，使用含4％多聚甲醛的PBS(-)固定细胞15分钟，并用含0.1％Triton X-100的PBS(-)于4℃处理2.5分钟以使细胞可通透。接下来，用3％BSA的PBS(-)于4℃覆盖细胞12小时，以封闭非特异性杂交，接着，与1∶1000稀释的兔抗B7330N多克隆抗体一起温育。用PBS(-)清洗后，将细胞用1∶1000稀释的Alexa488-偶联抗兔第二抗体(Molecular Probe，Eugene，OR)进行了染色。用4′，6′-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸(DAPI)对细胞核进行了复染。在TCS SP2 AOBS显微镜(Leica，Tokyo，Japan)下获取了荧光影像。
免疫组织化学染色
按以前描述的方法(Kitahara O，et al.Cancer Res 61，3544-3549(2001).)，使用亲和纯化的抗B7330N多克隆抗体考察了乳腺癌及正常组织中的B7330N蛋白表达图式。为了考察正常器官，本发明人购买了心脏、肺、肝脏、肾脏及胰脏的商品化组织切片(Biochain)。简单地说，用二甲苯和乙醇处理石蜡包埋的标本，用蛋白封闭试剂(Dako Cytomation，Carpinteria，CA)进行了封闭。加入含抗B7330N抗体的抗体稀释溶液(1∶50)，用基质-色原(substrate-chromogen)(DAKO liquid DAB chromogen，DakoCytomation)进行了染色。最后，用苏木精染色组织标本，以将细胞核与细胞质区分开来。
使用psiU6BX3.0构建B7330N特异性的siRNA表达载体
本发明人按照以前的报道(WO2004076623)，使用psiU6BX3.0siRNA表达载体建立了基于载体的RNAi系统。通过将表1中的双链寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0载体中的BbsI位点，制备了针对B7330N的siRNA表达载体(psiU6BX-B7330N)。通过psiU6BX3.0载体的多克隆位点中的BsiI和HindIII，分别制备了对照质粒psiU6BX-模拟。
表1.插入siRNA表达载体的双链寡核苷酸的序列
Figure A20068003636400591
下划线表示B7330N特异性的siRNA序列。
B7330N特异性siRNA的基因沉默效应
将人乳腺癌细胞系T47D或BT-20铺在15-cm皿上(4×106细胞/皿)，使用FuGENE6(Roche)试剂，按供应商的推荐，转染了psiU6BX-B7330N和作为阴性对照的psiU6BX-模拟各16μg。转染24小时后，再接种(re-seeded)细胞以用于集落形成测定(2×106细胞/10cm皿)、RT-PCR(2×106细胞/10cm皿)和MTT测定(2×106细胞/孔)。对于T47D或BT-20细胞，本发明人分别使用含0.7mg/ml或0.6mg/ml新霉素(Geneticin，Invitrogen)的培养基选择了B7330N导入细胞。其后，在三周内，本发明人每2天更换一次培养基。为了评价siRNA的功能，于新霉素选择后的第7天从细胞中提取了总RNA，然后，通过半定量RT-PCR确认了siRNA的基因敲低(knockdown)效应，所述半定量RT-PCR使用以下针对B7330N和GAPDH的特异性引物组：
对于内部对照GAPDH：5’-ATGGAAATCCCATCACCATCT-3’(SEQ IDNO：11)和5’-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3’(SEQ ID NO：2)；
对于B7330N：5’-GGATGAAACATACCCCATCA-3’(SEQ ID NO：12)和5’-ATGACACTAGTGCCCTTGG-3’(SEQ ID NO：13)。而且，使用T47D或BT-20细胞系表达siRNA的转染子在含新霉素的选择培养基中生长了28天。用4％多聚甲醛固定后，用Giemsa溶液(Giemsa solution)对转染细胞进行了染色以评价集落形成。进行了MTT测定以定量细胞的生存力。在含有新霉素的培养基中培养10天后，以0.5mg/ml的浓度加入MTT溶液(3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)(Sigma)。37℃保温2.5小时后，加入酸-SDS(0.01N HCl/10％SDS)；剧烈混合悬浮液，然后于37℃保温过夜以溶解深蓝色的晶体。用Microplate Reader 550(BioRad)测定了570nm处的吸光度。为了评价siRNA的功能，在进行选择7天后从细胞中提取总RNA，在进行选择10天后，使用Cell Counting Kit-8(Dojindo)，按照生产商的说明书进行了MTT测定。用Microplate Reader 550(BioRad)测定570nm波长处的吸光度。对于集落形成测定，用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，然后用Giemsa溶液(Merck)染色。各实验一式三次进行。
稳定表达B7330N的NIH3T3细胞的建立
使用FUGENE6，如上述那样用全长B7330N及N476A突变表达载体转染NIH3T3细胞。转染的细胞在含0.9mg/ml遗传霉素(G418)(Invitrogen)的培养基中温育。采用有限稀释法对克隆的NIH3T3细胞进行亚克隆。使用抗HA单克隆抗体，通过western印迹分析和免疫细胞化学分别检查带HA标签的B7330N的表达和亚细胞定位。最终建立了数个克隆，命名为野生型-B7330N和N476A-B7330N。为了考察野生型B7330N或N476A-B7330N的生长促进作用，我们为彼此独立的两株野生型-B7330N-NIH3T3(野生型-1和-2)、彼此独立的两株细胞N476A-B7330N-NIH3T3(N476A-1和-2)以及彼此独立的两株模拟-NIH3T3(模拟-1和-2)各接种了5000个细胞，在6天中，每天采用MTT测定对细胞进行计数。实验一式三组。
外源性B7330N的western印迹分析
本发明人使用pCAGGS-B7330N-HA、pCAGGS-N476A-HA或pCAGGS-N611A-HA转染的COS7细胞，以及作为阴性对照的模拟，分别考察了COS7细胞中外源性B7330N蛋白的表达。在含50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、150mmol/L NaCl和0.1％蛋白酶抑制剂合剂III(protease cocktailinhibitor III)(Calbiochem，San Diego，CA)的0.1％NP-40裂解缓冲液中裂解细胞。在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞裂解物，并转移至硝酸纤维素膜上，然后与作为第一抗体的大鼠抗HA pAb一起温育。再与作为第二抗体的绵羊抗大鼠IgG-HRP(Amersham Biosciences)一起温育，然后用ECL试剂盒(Amersham Biosciences)使信号可视化。为了检测分泌的B7330N蛋白，在转染后，将用B7330N-、N476A-、或N611A转染的COS7细胞在无血清培养基中维持48小时，然后培养4天。同样地，利用大鼠抗HA-pAb和抗大鼠IgG-HRP检测了细胞裂解物和浓缩培养基中的B7330N蛋白。β肌动蛋白pAb(1∶2000稀释)用作蛋白上样对照(克隆AC-15，Sigma-Aldrich，MO)。为了确证B7330N蛋白的糖基化，最初亦按上述配制了细胞裂解物，只是其中不含蛋白酶抑制剂合剂III。将细胞裂解物各10μl与裂解缓冲液10μl和1U的N-糖苷酶F(Calbiochem，San Diego，CA)混合，然后于37℃温育1小时。将反应物与SDS样品缓冲液一起煮沸。
自分泌测定
将B7330N转染的COS7细胞于不含FCS的培养基中维持2天，然后将亲本COS7细胞在含有或不含B7330N的培养基中培养了4天，以确证细胞生长的自分泌刺激。采用细胞计数监测了B7330N对细胞生长的效应，所述细胞计数通过血细胞计数器和如前述的MTT测定进行。在含0.1％FCS的DMEM中培养细胞(5×103细胞/孔)。
抗B7330N抗体的中和效应
使用血细胞计数器，通过细胞计数监测了抗B7330N抗体对细胞生长的效应。将乳腺癌细胞系T47D和HBL-100接种于12孔微量培养板(5×104细胞/孔)，在McCoy’s 5A培养基中培养5天，所述McCoy’s 5A培养基中含1％FBS，并添加了10.2μg/mL亲和纯化的抗B7330N pAb或者作为阴性对照的PBS(-)。按上述方法测定了细胞数。
结果
作为乳腺癌细胞内表达上调基因的、指称为UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺： 多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶6的B7330N的鉴定
本发明人使用展示27648种人类基因的cDNA微阵列分析了来自77例闭经前乳腺癌患者的癌细胞的基因表达模式，鉴定了在乳腺癌细胞中普遍上调的493个基因。其中，本发明人着眼于被指称为UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶6(GALNT6)的B7330N，该基因位于染色体12q13，其mRNA转录物由11个外显子构成，长度为4381或4556个碱基。在77例可获得表达数据的乳腺癌病例的27例(35％)中，B7330N的表达是升高的。为了确认该基因在乳腺癌中的表达图式，本发明人使用乳腺癌细胞系及包含正常乳房细胞的正常人组织进行了半定量RT-PCR分析。结果，本发明人发现：与正常乳房导管细胞及其它正常组织相比，B7330N在12例临床乳腺癌标本(低度分化型病变)的7例中显示表达升高(图1a)，并且在20例乳腺癌细胞系的7例中是过高表达的(图1b)。为了进一步考察该基因的表达图式，本发明人以B7330N的cDNA片段为探针，对多种人类组织和乳腺癌细胞系进行了northern印迹分析。结果，本发明人确认了约5kb的转录物的表达仅限于正常人的胎盘、胰脏、胃及气管(图1c)。本发明人使用乳腺癌northern印迹进一步考察了这些转录物的表达图式，结果发现，与包括乳腺和骨髓的正常人组织相比，其在乳腺癌细胞系中特异性过高表达(图1d)。
GALNT6基因编码可在体外糖基化纤连蛋白的622个氨基酸的蛋白，其在成纤维细胞系中表达，表明其可能参与癌胚性纤连蛋白的合成。SMART和PFAM计算机预测显示：GALNT6包含信号肽、处于180～370位残基的Glycos_transf_2基序，和处于496～622位残基的RICIN基序。
外源性B7330N的表达
为了进一步考察B7330N的性质，本发明人考察了这些基因产物在哺乳动物细胞内的亚细胞定位。首先，本发明人将表达B7330N蛋白的质粒(pCAGGS-B7330N-HA)瞬时转染入COS7细胞中，使用抗HA标签抗体的免疫细胞化学分析显示：在转染后72小时内，外源性B7330N蛋白以分泌小泡中的颗粒状(granulous pattern)的形式呈现于所有被转染的COS7细胞内(图2a)。接着，为了验证B7330N的细胞外分泌，本发明人使用瞬时转染了设计为表达B7330N的质粒(参照材料和方法部分)的COS7细胞的细胞裂解物和培养基，进行了western印迹分析，C末端HA标签抗体检测出了蛋白质向培养基中的分泌(图2b)。
我们发现通过western印迹分析估计的B7330N产物的分子量比由cDNA序列计算出的预测分子量大(图2b)。由于B7330N的一级氨基酸序列包含两个预测的N-连接糖基化共有序列，为了确认这两个较大的B7330N产物是否是糖基化的，本发明人首先用N-糖苷酶处理了蛋白。结果，最大的B7330N蛋白从细胞裂解物中消失，这说明该蛋白在哺乳动物细胞内是糖基化的(图3a)。接着，为了确定N-连接的糖基化位点，本发明人建立了B7330N蛋白的潜在N-糖基化位点的突变构建体(参照材料和方法部分)。然后，本发明人分别用这些质粒，野生型、N476A或N611A转染了COS7细胞，使用抗HA-标签抗体进行了免疫印迹。有趣的是，本发明人观察到：N476A转染细胞的最大的条带消失，而野生型和N611A的细胞裂解物却没有变化，这表示Asn-476是推测的糖基化位点(图3b)。进一步，为了确定对于B7330N分泌而言糖基化是否是必要的，本发明人考察了COS7细胞中的外源性N476A和野生型B7330N蛋白是否分泌到培养基中。有趣的是，外源性野生型B7330N分泌到培养基中，但在培养基中却检测不出N476A蛋白，这提示：B7330N蛋白在Asn-476处的糖基化是分泌所必需的(图3c)。
乳腺癌细胞中内源性B7330N的表达
本发明人制备了针对B7330N的多克隆抗体，采用Western印迹分析考察了来源于乳腺癌细胞系SKBR3、T47D以及作为实验对照的HMEC(人哺乳动物上皮细胞)的细胞裂解物中B7330N蛋白的内源性表达(图7a)。两个乳腺癌细胞系均显示高水平的B7330N表达，而正常的乳腺上皮细胞系HMEC细胞未显示表达。接着，使用抗B7330N多克隆抗体进行了乳腺癌细胞系T47D的免疫细胞化学分析，结果显示，与外源性表达的B7330N蛋白相同，内源性B7330N蛋白的定位也是呈现乳腺癌细胞内分泌小泡中的颗粒状物的形式(图7b)。为了进一步考察乳腺癌及正常组织切片中的B7330N表达，本发明人同样地使用抗B7330N抗体进行了免疫组织化学染色。本发明人在乳腺癌的两种不同的组织学亚型即乳头管状癌(571T)和导管内癌(164T)的细胞质中鉴定出了强染色，但这种表达在正常乳房组织(425N)中基本上未检出(图7c)。此外，在心脏、肺、肝脏、肾脏和胰脏中均未观察到表达，这与Northern印迹分析结果相一致(图7d)。
设计为降低B7330N的表达的小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效果
为评价B7330N的生长促进作用，本发明人通过基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术(参见材料与方法)在显示B7330N过高表达的乳腺癌细胞系T47D和BT-20中敲低了内源性B7330N的表达(图4)。本发明人通过半定量RT-PCR实验考察了B7330N的表达水平。如图4a所示，在被考察基因的两个siRNA构建体中，B7330N特异性siRNA(si1和si2)与对照siRNA构建体(psiU6BX-模拟)相比抑制了表达。为确认B7330N特异性siRNA的细胞生长抑制，本发明人分别进行了MTT测定和集落形成测定(图4b、c)。结果，导入B7330N siRNA构建体抑制了这些乳腺癌细胞的生长，这与上述该基因表达下降的结果相一致。每个结果均得到了3次独立实验的验证的。因而，本发明人的发现提示，B7330N在乳腺癌的细胞增殖中具有重要功能。
为了进一步确认B7330N的生长促进效果，本发明人建立了稳定表达外源性B7330N的NIH3T3衍生细胞(NIH3T3-野生型-B7330N-1，-2和NIH3T3-N476A-B7330N-1，-2细胞)。Western印迹分析显示：两个衍生克隆中分别显示高水平的外源性野生型B7330N蛋白和N476A-B7330N蛋白(图8a)。其后的MTT测定显示：三个衍生细胞系，NIH3T3-B7330N-1和-2的生长明显快于用模拟质粒转染的细胞(NIH3T3-模拟-1，-2和-3细胞)，而另一方面，与野生型-B7330N-1，-2相比，N476A-B7330N蛋白细胞的生长是适度的(图8b)。这显示：B7330N表达可能表达依赖性地增强细胞生长。
进一步，本发明人在野生型-B7330N细胞中观察到了N-糖基化形式，但在N476A-B7330N中却没有观察到N-糖基化(图8a)。通过这些结果可以确认：在上述N-糖苷酶测定的处理后，较大的条带消失(数据未示出)。
B7330N生长增强的自分泌性
本发明人从用于培养B7330N过高表达性COS7细胞的培养基制备了含B7330N蛋白的培养基(图5a)，并在该培养基中培养了亲本COS7细胞。使用天然B7330N的这一实验，揭示了COS7细胞生长的增强(图5)，该结果强力支持了本发明人的以下结论：B7330N这种分泌分子作为乳腺癌细胞增殖中不可或缺的自分泌生长因子起作用。而且，当向支持乳腺癌细胞系T47D细胞的培养基中加入抗B7330N pAb抗体时，与用PBS(-)处理相比，该细胞系的生长受到显著抑制(图5b；左图)，而不表达B7330N的HBL-100细胞不受该pAb处理的影响(图5b；右图)。
B7330N的二聚体化
有报导指出：一些糖基转移酶在细胞内形成二聚体(El-Battari A，et al.，Glycobiology.2003；13(12)：941-53)，因此，本发明人通过免疫沉淀考察了B7330N是否也可以寡聚化。
当用抗HA抗体免疫沉淀了外源性pCAGGS-B7330N-HA蛋白时，使用抗HA抗体的western印迹分析显示，外源性B7330N蛋白呈现为与2倍于预想分子量对应的条带。
为了研究该假说，本发明人设计了两种带不同标签的B7330N构建体，来考察同源寡聚化。用pCAGGS-B7330N-HA和pcDNA3.1-B7330N-myc共转染COS-7细胞，并分别使用抗HA或抗myc抗体进行共免疫沉淀。如图6所示，当使用抗myc抗体来沉降(pull down)pcDNA3.1-B7330N-myc时，引起了pCAGGS-B7330N-HA的共免疫沉淀；而当使用抗HA抗体来沉降pCAGGS-B7330N-HA时，引起了pcDNA3.1-B7330N-myc的共免疫沉淀。这些发现显示：B7330N仅在活体细胞中可以构建同源寡聚复合体。
在本发明中，利用通过全基因组cDNA微阵列得到的乳腺癌精确表达模式，本发明人分离了新基因B7330N，与正常人组织相比，该基因在乳腺癌细胞中显著过高表达。
被指称为UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶6(GALNT6)的B7330N在乳腺癌中的表达显著提高，因此选择该基因用于研究。经本发明人鉴定：约5kb的转录物显示癌特异性表达。本发明人证实了用siRNA处理乳腺癌细胞可以有效抑制B7330N的表达，并可以显著抑制乳腺癌的细胞/肿瘤生长。这些发现提示：B7330N可能在肿瘤细胞的生长增殖中发挥重要作用，也可能是抗癌剂研发的有希望的靶标。
讨论
在本文中，利用通过全基因组cDNA微阵列得到的乳腺癌精确表达模式，本发明人分离了新基因B7330N，与正常人组织相比，该基因在乳腺癌细胞中显著过高表达。并且，本发明人进一步证实了用siRNA处理乳腺癌细胞有效抑制了靶基因B7330N的表达，并显著抑制了乳腺癌的细胞/肿瘤生长。这些发现提示：B7330N可能在肿瘤细胞的生长增殖中发挥重要作用，可以成为抗癌剂研发的有希望的靶标。
被指称为UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶6(GALNT6)的B7330N在乳腺癌中的表达显著提高，因此选择该基因用于研究。经本发明人鉴定：约5kb的转录物显示癌特异性表达。本发明人证实了用siRNA处理乳腺癌细胞可以有效抑制B7330N的表达，并可以显著抑制乳腺癌的细胞/肿瘤生长。这些发现提示：B7330N可能在肿瘤细胞的生长增殖中发挥重要作用，也可能是抗癌剂研发的有希望的靶标。
工业实用性
与非癌性的乳房导管上皮相比，人基因B7330N的表达在乳腺癌中明显增强。因而，该基因作为乳腺癌的诊断标志是有用的，而其编码的蛋白在乳腺癌的诊断测定中是有用的。
此外，本发明人还证明，新蛋白B7330N的表达促进细胞生长，而对应于B7330N基因的小干扰RNA抑制细胞生长。这些发现显示：B7330N蛋白刺激致癌活性。因此，这些新癌蛋白中的每一个均是用于开发抗癌药物的有用的靶标。例如，阻断B7330N表达或者抑制其活性的物质具有作为抗癌剂，特别是用于治疗乳腺癌的抗癌剂的治疗用途。这样的物质的例子包括针对B7330N基因的反义寡核苷酸、小干扰RNA和核酶，以及识别B7330N的抗体。
尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员将容易地认识到，可对本发明进行各种变化和修改而不背离本发明的精神和范围。
序列表
<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)
<120>作为乳腺癌标志的基因GALNT6和针对基因GALNT6的小干扰RNA
<130>ONC-A0514P
<150>60/703,658
<151>2005-07-29
<160>27
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>1
cgaccacttt gtcaagctca                                                  20
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>2
ggttgagcac agggtacttt att                                              23
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>3
gagtccaggt aagtgaatct gtcc                                             24
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>4
atttccaccg agacctctca tc                                               22
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>5
cggaattcat gaggctcctc cgcag                                            25
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>6
ccgctcgagg acaaagagcc acaactgatg                                       30
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成引物序列
<400>7
acaactgcac tgtcacgcct tttcctggta cctgc                                 35
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成引物序列
<400>8
gcaggtacca ggaaaaggcg tgacagtgca gttgt                                 35
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成引物序列
<400>9
catggccccc tgcgcaccca gtgaccccc                                        29
<210>10
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成引物序列
<400>10
gggggtcact gggtgcgcag ggggccatg                                        29
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>11
atggaaatcc catcaccatc t                                                21
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>12
ggatgaaaca taccccatca                                                  20
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>13
atgacactag tgcccttgg                                                   19
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸
<400>14
caccgtgtct tcaagcttga agacta                                           26
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸
<400>15
aaaatagtct tcaagcttga agacac                                           26
<210>16
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸
<400>16
caccgcactg tttcaatgcc tttttcaaga gaaaaggcat tgaaacagtg c               51
<210>17
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸
<400>17
aaaagcactg tttcaatgcc ttttctcttg aaaaaggcat tgaaacagtg c               51
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>siRNA靶序列
<400>18
gcactgtttc aatgccttt                                                   19
<210>19
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>siRNA发夹设计
<400>19
gcactgtttc aatgcctttt tcaagagaaa aggcattgaa acagtgc                    47
<210>20
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸
<400>20
caccgagaaa tccttcggtg acattcaaga gatgtcaccg aaggatttct c               51
<210>21
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸
<400>21
aaaagagaaa tccttcggtg acatctcttg aatgtcaccg aaggatttct c               51
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>siRNA靶序列
<400>22
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<210>23
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>siRNA发夹设计
<400>23
gagaaatcct tcggtgacat tcaagagatg tcaccgaagg atttctc                    47
<210>24
<211>4381
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1866)
<400>24
atg agg ctc ctc cgc aga cgc cac atg ccc ctg cgc ctg gcc atg gtg    48
Met Arg Leu Leu Arg Arg Arg His Met Pro Leu Arg Leu Ala Met Val
1               5                   10                  15
ggc tgc gcc ttt gtg ctc ttc ctc ttc ctc ctg cat agg gat gtg agc    96
Gly Cys Ala Phe Val Leu Phe Leu Phe Leu Leu His Arg Asp Val Ser
            20                  25                  30
agc aga gag gag gcc aca gag aag ccg tgg ctg aag tcc ctg gtg agc    144
Ser Arg Glu Glu Ala Thr Glu Lys Pro Trp Leu Lys Ser Leu Val Ser
        35                  40                  45
cgg aag gat cac gtc ctg gac ctc atg ctg gag gcc atg aac aac ctt    192
Arg Lys Asp His Val Leu Asp Leu Met Leu Glu Ala Met Asn Asn Leu
    50                  55                  60
aga gat tca atg ccc aag ctc caa atc agg gct cca gaa gcc cag cag    240
Arg Asp Ser Met Pro Lys Leu Gln Ile Arg Ala Pro Glu Ala Gln Gln
65                  70                  75                  80
act ctg ttc tcc ata aac cag tcc tgc ctc cct ggg ttc tat acc cca    288
Thr Leu Phe Ser Ile Asn Gln Ser Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Thr Pro
                85                  90                  95
gct gaa ctg aag ccc ttc tgg gaa cgg cca cca cag gac ccc aat gcc    336
Ala Glu Leu Lys Pro Phe Trp Glu Arg Pro Pro Gln Asp Pro Asn Ala
            100                 105                 110
cct ggg gca gat gga aaa gca ttt cag aag agc aag tgg acc ccc ctg    384
Pro Gly Ala Asp Gly Lys Ala Phe Gln Lys Ser Lys Trp Thr Pro Leu
        115                 120                 125
gag acc cag gaa aag gaa gaa ggc tat aag aag cac tgt ttc aat gcc    432
Glu Thr Gln Glu Lys Glu Glu Gly Tyr Lys Lys His Cys Phe Asn Ala
    130                 135                 140
ttt gcc agc gac cgg atc tcc ctg cag agg tcc ctg ggg cca gac acc    480
Phe Ala Ser Asp Arg Ile Ser Leu Gln Arg Ser Leu Gly Pro Asp Thr
145                 150                 155                 160
cga cca cct gag tgt gtg gac cag aag ttc cgg cgc tgc ccc cca ctg    528
Arg Pro Pro Glu Cys Val Asp Gln Lys Phe Arg Arg Cys Pro Pro Leu
                165                 170                 175
gcc acc acc agc gtg atc att gtg ttc cac aac gaa gcc tgg tcc aca    576
Ala Thr Thr Ser Val Ile Ile Val Phe His Asn Glu Ala Trp Ser Thr
            180                 185                 190
ctg ctg cga aca gtg tac agc gtc cta cac acc acc cct gcc atc ttg    624
Leu Leu Arg Thr Val Tyr Ser Val Leu His Thr Thr Pro Ala Ile Leu
        195                 200                 205
ctc aag gag atc ata ctg gtg gat gat gcc agc aca gag gag cac cta     672
Leu Lys Glu Ile Ile Leu Val Asp Asp Ala Ser Thr Glu Glu His Leu
    210                 215                 220
aag gag aag ctg gag cag tac gtg aag cag ctg cag gtg gtg agg gtg     720
Lys Glu Lys Leu Glu Gln Tyr Val Lys Gln Leu Gln Val Val Arg Val
225                 230                 235                 240
gtg cgg cag gag gag cgg aag ggg ctg atc acc gcc cgg ctg ctg ggg     768
Val Arg Gln Glu Glu Arg Lys Gly Leu Ile Thr Ala Arg Leu Leu Gly
                245                 250                 255
gcc agc gtg gca cag gcg gag gtg ctc acg ttc ctg gat gcc cac tgt     816
Ala Ser Val Ala Gln Ala Glu Val Leu Thr Phe Leu Asp Ala His Cys
            260                 265                 270
gag tgc ttc cac ggc tgg ctg gag ccc ctc ctg gct cga atc gct gag     864
Glu Cys Phe His Gly Trp Leu Glu Pro Leu Leu Ala Arg Ile Ala Glu
        275                 280                 285
gac aag aca gtg gtg gtg agc cca gac atc gtc acc atc gac ctt aat     912
Asp Lys Thr Val Val Val Ser Pro Asp Ile Val Thr Ile Asp Leu Asn
    290                 295                 300
act ttt gag ttc gcc aag ccc gtc cag agg ggc aga gtc cat agc cga     960
Thr Phe Glu Phe Ala Lys Pro Val Gln Arg Gly Arg Val His Ser Arg
305                 310                 315                 320
ggc aac ttt gac tgg agc ctg acc ttc ggc tgg gaa aca ctt cct cca    1008
Gly Asn Phe Asp Trp Ser Leu Thr Phe Gly Trp Glu Thr Leu Pro Pro
                325                 330                 335
cat gag aag cag agg cgc aag gat gaa acc tac ccc atc aaa tcc ccg    1056
His Glu Lys Gln Arg Arg Lys Asp Glu Thr Tyr Pro Ile Lys Ser Pro
            340                 345                 350
acg ttt gct ggt ggc ctc ttc tcc atc tcc aag tcc tac ttt gag cac    1104
Thr Phe Ala Gly Gly Leu Phe Ser Ile Ser Lys Ser Tyr Phe Glu His
        355                 360                 365
atc ggt acc tat gat aat cag atg gag atc tgg gga ggg gag aac gtg    1152
Ile Gly Thr Tyr Asp Asn Gln Met Glu Ile Trp Gly Gly Glu Asn Val
    370                 375                 380
gaa atg tcc ttc cgg gtg tgg cag tgt ggg ggc cag ctg gag atc atc    1200
Glu Met Ser Phe Arg Val Trp Gln Cys Gly Gly Gln Leu Glu Ile Ile
385                 390                 395                 400
ccc tgc tct gtc gta ggc cat gtg ttc cgg acc aag agc ccc cac acc    1248
Pro Cys Ser Val Val Gly His Val Phe Arg Thr Lys Ser Pro His Thr
                405                 410                 415
ttc ccc aag ggc act agt gtc att gct cgc aat caa gtg cgc ctg gca    1296
Phe Pro Lys Gly Thr Ser Val Ile Ala Arg Asn Gln Val Arg Leu Ala
            420                 425                 430
gag gtc tgg atg gac agc tac aag aag att ttc tat agg aga aat ctg    1344
Glu Val Trp Met Asp Ser Tyr Lys Lys Ile Phe Tyr Arg Arg Asn Leu
        435                 440                 445
cag gca gca aag atg gcc caa gag aaa tcc ttc ggt gac att tcg gaa    1392
Gln Ala Ala Lys Met Ala Gln Glu Lys Ser Phe Gly Asp Ile Ser Glu
    450                 455                 460
cga ctg cag ctg agg gaa caa ctg cac tgt cac aac ttt tcc tgg tac    1440
Arg Leu Gln Leu Arg Glu Gln Leu His Cys His Asn Phe Ser Trp Tyr
465                 470                 475                 480
ctg cac aat gtc tac cca gag atg ttt gtt cct gac ctg acg ccc acc    1488
Leu His Asn Val Tyr Pro Glu Met Phe Val Pro Asp Leu Thr Pro Thr
                485                 490                 495
ttc tat ggt gcc atc aag aac ctc ggc acc aac caa tgc ctg gat gtg    1536
Phe Tyr Gly Ala Ile Lys Asn Leu Gly Thr Asn Gln Cys Leu Asp Val
            500                 505                 510
ggt gag aac aac cgc ggg ggg aag ccc ctc atc atg tac tcc tgc cac    1584
Gly Glu Asn Asn Arg Gly Gly Lys Pro Leu Ile Met Tyr Ser Cys His
        515                 520                 525
ggc ctt ggc ggc aac cag tac ttt gag tac aca act cag agg gac ctt    1632
Gly Leu Gly Gly Asn Gln Tyr Phe Glu Tyr Thr Thr Gln Arg Asp Leu
    530                 535                 540
cgc cac aac atc gca aag cag ctg tgt cta cat gtc agc aag ggt gct    1680
Arg His Asn Ile Ala Lys Gln Leu Cys Leu His Val Ser Lys Gly Ala
545                 550                 555                 560
ctg ggc ctt ggg agc tgt cac ttc act ggc aag aat agc cag gtc ccc    1728
Leu Gly Leu Gly Ser Cys His Phe Thr Gly Lys Asn Ser Gln Val Pro
                565                 570                 575
aag gac gag gaa tgg gaa ttg gcc cag gat cag ctc atc agg aac tca    1776
Lys Asp Glu Glu Trp Glu Leu Ala Gln Asp Gln Leu Ile Arg Asn Ser
            580                 585                 590
gga tct ggt acc tgc ctg aca tcc cag gac aaa aag cca gcc atg gcc    1824
Gly Ser Gly Thr Cys Leu Thr Ser Gln Asp Lys Lys Pro Ala Met Ala
        595                 600                 605
ccc tgc aat ccc agt gac ccc cat cag ttg tgg ctc ttt gtc            1866
Pro Cys Asn Pro Ser Asp Pro His Gln Leu Trp Leu Phe Val
    610                 615                 620
taggacccag atcatcccca gagagagccc ccacaagctc ctcaggaaac aggattgctg    1926
atgtctggga acctgatcac cagcttctct ggaggccgta aagatggatt tctaaaccca    1986
ctgggtggca aggcaggacc ttcctaatcc ttgcaacaac attgggccca ttttctttcc    2046
ttcacaccga tggaagagac cattaggaca tatatttagc ctagcgtttt cctgttctag    2106
aaatagaggc tcccaaagta gggaaggcag ctgggggagg gttcagggca gcaatgctga    2166
gttcaagaaa agtacttcag gctgggcaca gtggctcatg cctgaaatcc tagcactttg    2226
ggaagacaat gtgggagaat ggcttgagcc caggagttca agaccggcct gagcaacata    2286
gtgaggatcc catctctacg cccaccctcc ccccggcaaa aaaaaaaagc tgggtatggt    2346
ggcttatgcc tgtagtcgca gctactcaga aggctgaggt gggaggattg cttgttcccc    2406
ggaggttgaa gctacagtga gccttgattg tgtcactgca ctccagcctg ggcaacaggt    2466
aagactctgt ctcaaaaaaa aacaaaaaag aagaagaaaa gtacttctac agccatgtcc    2526
tattccttga tcatccaaag cacctgcaga gtccagtgaa atgatatatt ctggctgggc    2586
acagtggctc acacctgtaa tcctagcact ttgggaggcc aaggcaggtg gatcacctga    2646
ggtcagaagt ttgaaaccag cctggactac atggtgaaac tccatctcta ctaaaagtac    2706
aaaaattagc tgggcatgat ggcacgcacc tgcagtccca gctacttggg aggctgaggc    2766
aggagaatca ctcgaaccca ggaggcagag gttgcagtga gccaagacag caccattgca    2826
ccccagcctg agcaacaaga gcgaaactcc atctcaggaa aaaaaaaaaa aaaaaaagta    2886
tattctaaca gacagatcag aggtctaaga gatcctccct tgctattatt acctgaagtc    2946
tgtagaactg tttacagata tctccttgac aggtgtcctt tatcttactt tatctgtaca    3006
gtaatcctgt gagaaagaca ggacagaaac cactgtgcct attttacaga tacgaaaact    3066
gagacacagg taaaggggct tgtctgtagt cccatagcta gcagatggct ggagccaaga    3126
ctgaggctcg ttcttcaatg ctgagccagg gctccttccg ctgcaccaca agaacgctag    3186
accactcgcc accagccttc tcattccctc ttcctccatt ctaatcattt ctagctggct    3246
ggcctccaca gagcatagga aaacagccag ggccgggcac ggtggctcat gcctgtaatc    3306
tcaacactct gggaggccga gccgggtgga taacctgagg tcaggaattc gagaccagcc    3366
tggccaacat ggtaaaaccc catctctact aaaaatataa aaattagcca ggcatggtgg    3426
cgcacacctg taatcccagc tactcaagag gctgaggcag gagaattgct taaatctggg    3486
aggcggaagt tgcagtgagc caagatcgcg ccactgaact ccagcctagg caacaagagc    3546
aaaactccat ctccaaaaaa aagaaaggaa aaacagggcc aggtagccat tgtggagaga    3606
gcacacttag gaatcctggg atgttagtgt taaaagaaag ctcctggagc cagtgattct    3666
caggtttgtc ccagaaccct tttttctaag ccccatataa aaggtagatt aaaaaaacaa    3726
agtagcatga gtgaaattga gagagggaca ggtaatgcct tccagcccct aacttctaac    3786
aatctggaag cacaacgtga aaatcacgta gcccaaccct atcattttca tattatgaaa    3846
ctgagtccag gtaagtgaat ctgtccaagg tcacccagca aggtatcagt agccctgagg    3906
gtaaggactc tgataaggct cgggagggtc ctggaaagcc tgaggcggca ggaagagtgt    3966
gcagagttga gcgtgtctgg aaggctgatc cactgctggg cccacatcaa agcccccatg 4026
gggagcagac ccgactgcac atggctcttt tgctggaaga agagcatggc tgcgcagagg 4086
actaaaattt catctgggaa ggcttctttt gactgtcagt agcaggatgt caccagatga 4146
gggtgctatg ggaccacagc tgtctttgtt cccattgcaa ctcaaccctg cgggaggccg 4206
cctacatccc tgagagcctt ctggagccta cagaggagac attggccagc caaaaggaaa 4266
ggagtggcca gggtacgacc tggagtaggg aagggaaaaa gttcccggaa agaagagaat 4326
tggatgagag gtctcagtgg aaataaaggt tttctggcat tggtcaagga aactc      4381
<210>25
<211>622
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>25
Met Arg Leu Leu Arg Arg Arg His Met Pro Leu Arg Leu Ala Met Val
1               5                   10                  15
Gly Cys Ala Phe Val Leu Phe Leu Phe Leu Leu His Arg Asp Val Ser
            20                  25                  30
Ser Arg Glu Glu Ala Thr Glu Lys Pro Trp Leu Lys Ser Leu Val Ser
        35                  40                  45
Arg Lys Asp His Val Leu Asp Leu Met Leu Glu Ala Met Asn Asn Leu
    50                  55                  60
Arg Asp Ser Met Pro Lys Leu Gln Ile Arg Ala Pro Glu Ala Gln Gln
65                  70                  75                  80
Thr Leu Phe Ser Ile Asn Gln Ser Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Thr Pro
                85                  90                  95
Ala Glu Leu Lys Pro Phe Trp Glu Arg Pro Pro Gln Asp Pro Asn Ala
            100                 105                 110
Pro Gly Ala Asp Gly Lys Ala Phe Gln Lys Ser Lys Trp Thr Pro Leu
        115                 120                 125
Glu Thr Gln Glu Lys Glu Glu Gly Tyr Lys Lys His Cys Phe Asn Ala
    130                 135                 140
Phe Ala Ser Asp Arg Ile Ser Leu Gln Arg Ser Leu Gly Pro Asp Thr
145                 150                 155                 160
Arg Pro Pro Glu Cys Val Asp Gln Lys Phe Arg Arg Cys Pro Pro Leu
                165                 170                 175
Ala Thr Thr Ser Val Ile Ile Val Phe His Asn Glu Ala Trp Ser Thr
            180                 185                 190
Leu Leu Arg Thr Val Tyr Ser Val Leu His Thr Thr Pro Ala Ile Leu
        195                 200                 205
Leu Lys Glu Ile Ile Leu Val Asp Asp Ala Ser Thr Glu Glu His Leu
    210                 215                 220
Lys Glu Lys Leu Glu Gln Tyr Val Lys Gln Leu Gln Val Val Arg Val
225                 230                 235                 240
Val Arg Gln Glu Glu Arg Lys Gly Leu Ile Thr Ala Arg Leu Leu Gly
                245                 250                 255
Ala Ser Val Ala Gln Ala Glu Val Leu Thr Phe Leu Asp Ala His Cys
            260                 265                 270
Glu Cys Phe His Gly Trp Leu Glu Pro Leu Leu Ala Arg Ile Ala Glu
        275                 280                 285
Asp Lys Thr Val Val Val Ser Pro Asp Ile Val Thr Ile Asp Leu Asn
    290                 295                 300
Thr Phe Glu Phe Ala Lys Pro Val Gln Arg Gly Arg Val His Ser Arg
305                 310                 315                 320
Gly Asn Phe Asp Trp Ser Leu Thr Phe Gly Trp Glu Thr Leu Pro Pro
                325                 330                 335
His Glu Lys Gln Arg Arg Lys Asp Glu Thr Tyr Pro Ile Lys Ser Pro
            340                 345                 350
Thr Phe Ala Gly Gly Leu Phe Ser Ile Ser Lys Ser Tyr Phe Glu His
        355                 360                 365
Ile Gly Thr Tyr Asp Asn Gln Met Glu Ile Trp Gly Gly Glu Asn Val
    370                 375                 380
Glu Met Ser Phe Arg Val Trp Gln Cys Gly Gly Gln Leu Glu Ile Ile
385                 390                 395                 400
Pro Cys Ser Val Val Gly His Val Phe Arg Thr Lys Ser Pro His Thr
                405                 410                 415
Phe Pro Lys Gly Thr Ser Val Ile Ala Arg Asn Gln Val Arg Leu Ala
            420                 425                 430
Glu Val Trp Met Asp Ser Tyr Lys Lys Ile Phe Tyr Arg Arg Asn Leu
        435                 440                 445
Gln Ala Ala Lys Met Ala Gln Glu Lys Ser Phe Gly Asp Ile Ser Glu
    450                 455                 460
Arg Leu Gln Leu Arg Glu Gln Leu His Cys His Asn Phe Ser Trp Tyr
465                 470                 475                 480
Leu His Asn Val Tyr Pro Glu Met Phe Val Pro Asp Leu Thr Pro Thr
                485                 490                 495
Phe Tyr Gly Ala Ile Lys Asn Leu Gly Thr Asn Gln Cys Leu Asp Val
            500                 505                 510
Gly Glu Asn Asn Arg Gly Gly Lys Pro Leu Ile Met Tyr Ser Cys His
        515                 520                 525
Gly Leu Gly Gly Asn Gln Tyr Phe Glu Tyr Thr Thr Gln Arg Asp Leu
    530                 535                 540
Arg His Asn Ile Ala Lys Gln Leu Cys Leu His Val Ser Lys Gly Ala
545                 550                 555                 560
Leu Gly Leu Gly Ser Cys His Phe Thr Gly Lys Asn Ser Gln Val Pro
                565                 570                 575
Lys Asp Glu Glu Trp Glu Leu Ala Gln Asp Gln Leu Ile Arg Asn Ser
            580                 585                 590
Gly Ser Gly Thr Cys Leu Thr Ser Gln Asp Lys Lys Pro Ala Met Ala
        595                 600                 605
Pro Cys Asn Pro Ser Asp Pro His Gln Leu Trp Leu Phe Val
    610                 615                 620
<210>26
<211>4556
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(207)..(2072)
<400>26
aacaggccct gctgtgaggg accacgaggc agtgccagga tgaaagagtt ggagtaacct     60
aggtgattct gagtgaatca gtcaggaggc cttcctggag ggggctgagg ccccagcttg    120
tggccaccac aacgtatcaa gctatctcca gggttgggct caggactcag agctgacgca    180
gctggggtgc cccttggttc tggagg atg agg ctc ctc cgc aga cgc cac atg     233
                             Met Arg Leu Leu Arg Arg Arg His Met
                             1               5
ccc ctg cgc ctg gcc atg gtg ggc tgc gcc ttt gtg ctc ttc ctc ttc      281
Pro Leu Arg Leu Ala Met Val Gly Cys Ala Phe Val Leu Phe Leu Phe
10                  15                  20                  25
ctc ctg cat agg gat gtg agc agc aga gag gag gcc aca gag aag ccg      329
Leu Leu His Arg Asp Val Ser Ser Arg Glu Glu Ala Thr Glu Lys Pro
                30                  35                  40
tgg ctg aag tcc ctg gtg agc cgg aag gat cac gtc ctg gac ctc atg      377
Trp Leu Lys Ser Leu Val Ser Arg Lys Asp His Val Leu Asp Leu Met
            45                  50                  55
ctg gag gcc atg aac aac ctt aga gat tca atg ccc aag ctc caa atc      425
Leu Glu Ala Met Asn Asn Leu Arg Asp Ser Met Pro Lys Leu Gln Ile
        60                  65                  70
agg gct cca gaa gcc cag cag act ctg ttc tcc ata aac cag tcc tgc      473
Arg Ala Pro Glu Ala Gln Gln Thr Leu Phe Ser Ile Asn Gln Ser Cys
    75                  80                  85
ctc cct ggg ttc tat acc cca gct gaa ctg aag ccc ttc tgg gaa cgg      521
Leu Pro Gly Phe Tyr Thr Pro Ala Glu Leu Lys Pro Phe Trp Glu Arg
90                  95                  100                 105
cca cca cag gac ccc aat gcc cct ggg gca gat gga aaa gca ttt cag     569
Pro Pro Gln Asp Pro Asn Ala Pro Gly Ala Asp Gly Lys Ala Phe Gln
                110                 115                 120
aag agc aag tgg acc ccc ctg gag acc cag gaa aag gaa gaa ggc tat     617
Lys Ser Lys Trp Thr Pro Leu Glu Thr Gln Glu Lys Glu Glu Gly Tyr
            125                 130                 135
aag aag cac tgt ttc aat gcc ttt gcc agc gac cgg atc tcc ctg cag     665
Lys Lys His Cys Phe Asn Ala Phe Ala Ser Asp Arg Ile Ser Leu Gln
        140                 145                 150
agg tcc ctg ggg cca gac acc cga cca cct gag tgt gtg gac cag aag     713
Arg Ser Leu Gly Pro Asp Thr Arg Pro Pro Glu Cys Val Asp Gln Lys
    155                 160                 165
ttc cgg cgc tgc ccc cca ctg gcc acc acc agc gtg atc att gtg ttc     761
Phe Arg Arg Cys Pro Pro Leu Ala Thr Thr Ser Val Ile Ile Val Phe
170                 175                 180                 185
cac aac gaa gcc tgg tcc aca ctg ctg cga aca gtg tac agc gtc cta     809
His Asn Glu Ala Trp Ser Thr Leu Leu Arg Thr Val Tyr Ser Val Leu
                190                 195                 200
cac acc acc cct gcc atc ttg ctc aag gag atc ata ctg gtg gat gat     857
His Thr Thr Pro Ala Ile Leu Leu Lys Glu Ile Ile Leu Val Asp Asp
            205                 210                 215
gcc agc aca gag gag cac cta aag gag aag ctg gag cag tac gtg aag     905
Ala Ser Thr Glu Glu His Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Tyr Val Lys
        220                 225                 230
cag ctg cag gtg gtg agg gtg gtg cgg cag gag gag cgg aag ggg ttg     953
Gln Leu Gln Val Val Arg Val Val Arg Gln Glu Glu Arg Lys Gly Leu
    235                 240                 245
atc acc gcc cgg ctg ctg ggg gcc agc gtg gca cag gcg gag gtg ctc    1001
Ile Thr Ala Arg Leu Leu Gly Ala Ser Val Ala Gln Ala Glu Val Leu
250                 255                 260                 265
acg ttc ctg gat gcc cac tgt gag tgc ttc cac ggc tgg ctg gag ccc    1049
Thr Phe Leu Asp Ala His Cys Glu Cys Phe His Gly Trp Leu Glu Pro
                270                 275                 280
ctc ctg gct cga atc gct gag gac aag aca gtg gtg gtg agc cca gac    1097
Leu Leu Ala Arg Ile Ala Glu Asp Lys Thr Val Val Val Ser Pro Asp
            285                 290                 295
atc gtc acc atc gac ctt aat act ttt gag ttc gcc aag ccc gtc cag    1145
Ile Val Thr Ile Asp Leu Asn Thr Phe Glu Phe Ala Lys Pro Val Gln
        300                 305                 310
agg ggc aga gtc cat agc cga ggc aac ttt gac tgg agc ctg acc ttc    1193
Arg Gly Arg Val His Ser Arg Gly Asn Phe Asp Trp Ser Leu Thr Phe
    315                 320                 325
ggc tgg gaa aca ctt cct cca cat gag aag cag agg cgc aag gat gaa    1241
Gly Trp Glu Thr Leu Pro Pro His Glu Lys Gln Arg Arg Lys Asp Glu
330                 335                 340                 345
aca tac ccc atc aaa tcc ccg acg ttt gct ggt ggc ctc ttc tcc atc    1289
Thr Tyr Pro Ile Lys Ser Pro Thr Phe Ala Gly Gly Leu Phe Ser Ile
                350                 355                 360
ccc aag tcc tac ttt gag cac atc ggt acc tat gat aat cag atg gag    1337
Pro Lys Ser Tyr Phe Glu His Ile Gly Thr Tyr Asp Asn Gln Met Glu
            365                 370                 375
atc tgg gga ggg gag aac gtg gaa atg tcc ttc cgg gtg tgg cag tgt    1385
Ile Trp Gly Gly Glu Asn Val Glu Met Ser Phe Arg Val Trp Gln Cys
        380                 385                 390
ggg ggc cag ctg gag atc atc ccc tgc tct gtc gta ggc cat gtg ttc    1433
Gly Gly Gln Leu Glu Ile Ile Pro Cys Ser Val Val Gly His Val Phe
    395                 400                 405
cgg acc aag agc ccc cac acc ttc ccc aag ggc act agt gtc att gct    1481
Arg Thr Lys Ser Pro His Thr Phe Pro Lys Gly Thr Ser Val Ile Ala
410                 415                 420                 425
cgc aat caa gtg cgc ctg gca gag gtc tgg atg gac agc tac aag aag    1529
Arg Asn Gln Val Arg Leu Ala Glu Val Trp Met Asp Ser Tyr Lys Lys
                430                 435                 440
att ttc tat agg aga aat ctg cag gca gca aag atg gcc caa gag aaa    1577
Ile Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Gln Ala Ala Lys Met Ala Gln Glu Lys
            445                 450                 455
tcc ttc ggt gac att tcg gaa cga ctg cag ctg agg gaa caa ctg cac    1625
Ser Phe Gly Asp Ile Ser Glu Arg Leu Gln Leu Arg Glu Gln Leu His
        460                 465                 470
tgt cac aac ttt tcc tgg tac ctg cac aat gtc tac cca gag atg ttt    1673
Cys His Asn Phe Ser Trp Tyr Leu His Asn Val Tyr Pro Glu Met Phe
    475                 480                 485
gtt cct gac ctg acg ccc acc ttc tat ggt gcc atc aag aac ctc ggc    1721
Val Pro Asp Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Gly Ala Ile Lys Asn Leu Gly
490                 495                 500                 505
acc aac caa tgc ctg gat gtg ggt gag aac aac cgc ggg ggg aag ccc    1769
Thr Asn Gln Cys Leu Asp Val Gly Glu Asn Asn Arg Gly Gly Lys Pro
                510                 515                 520
ctc atc atg tac tcc tgc cac ggc ctt ggc ggc aac cag tac ttt gag    1817
Leu Ile Met Tyr Ser Cys His Gly Leu Gly Gly Asn Gln Tyr Phe Glu
            525                 530                 535
tac aca act cag agg gac ctt cgc cac aac atc gca aag cag ctg tgt    1865
Tyr Thr Thr Gln Arg Asp Leu Arg His Asn Ile Ala Lys Gln Leu Cys
        540                 545                 550
cta cat gtc agc aag ggt gct ctg ggc ctt ggg agc tgt cac ttc act    1913
Leu His Val Ser Lys Gly Ala Leu Gly Leu Gly Ser Cys His Phe Thr
    555                 560                 565
ggc aag aat agc cag gtc ccc aag gac gag gaa tgg gaa ttg gcc cag    1961
Gly Lys Asn Ser Gln Val Pro Lys Asp Glu Glu Trp Glu Leu Ala Gln
570                 575                 580                 585
gat cag ctc atc agg aac tca gga tct ggt acc tgc ctg aca tcc cag    2009
Asp Gln Leu Ile Arg Asn Ser Gly Ser Gly Thr Cys Leu Thr Ser Gln
                590                 595                 600
gac aaa aag cca gcc atg gcc ccc tgc aat ccc agt gac ccc cat cag    2057
Asp Lys Lys Pro Ala Met Ala Pro Cys Asn Pro Ser Asp Pro His Gln
            605                 610                 615
ttg tgg ctc ttt gtc taggacccag atcatcccca gagagagccc ccacaagctc    2112
Leu Trp Leu Phe Val
        620
ctcaggaaac aggattgctg atgtctggga acctgatcac cagcttctct ggaggccgta    2172
aagatggatt tctaaaccca ctgggtggca aggcaggacc ttcctaatcc ttgcaacaac    2232
attgggccca ttttctttcc ttcacaccga tggaagagac cattaggaca tatatttagc    2292
ctagcgtttt cctgttctag aaatagaggc tcccaaagta gggaaggcag ctgggggagg    2352
gttcagggca gcaatgctga gttcaagaaa agtacttcag gctgggcaca gtggctcatg    2412
cctgaaatcc tagcactttg ggaagacaat gtgggagaat ggcttgagcc caggagttca    2472
agaccggcct gagcaacata gtgaggatcc catctctacg cccaccctcc ccccggcaaa    2532
aaaaaaagct gggtatggtg gcttatgcct gtagtcgcag ctactcagaa ggctgaggtg    2592
ggaggattgc ttgttccccg gaggttgaag ctacagtgag ccttgattgt gtcactgcac    2652
tccagcctgg gcaacaggta agactctgtc tcaaaaaaaa aacaaaaaag aagaagaaaa    2712
gtacttctac agccatgtcc tattccttga tcatccaaag cacctgcaga gtccagtgaa    2772
atgatatatt ctggctgggc acagtggctc acacctgtaa tcctagcact ttgggaggcc    2832
aaggcaggtg gatcacctga ggtcagaagt ttgaaaccag cctggactac atggtgaaac    2892
tccatctcta ctaaaagtac aaaaattagc tgggcatgat ggcacgcacc tgcagtccca    2952
gctacttggg aggctgaggc aggagaatca ctcgaaccca ggaggcagag gttgcagtga    3012
gccaagacag caccattgca ccccagcctg agcaacaaga gcgaaactcc atctcaggaa    3072
aaaaaaaaaa aaaaaaagta tattctaaca gacagatcag aggtctaaga gatcctccct    3132
tgctattatt acctgaagtc tgtagaactg tttacagata tctccttgac aggtgtcctt    3192
tatcttactt tatctgtaca gtaatcctgt gagaaagaca ggacagaaac cactgtgcct    3252
attttacaga tacgaaaact gagacacagg taaaggggct tgtctgtagt cccatagcta    3312
gcagatggct ggagccaaga ctgaggctcg ttcttcaatg ctgagccagg gctccttccg    3372
ctgcaccaca agaacgctag accactcgcc accagccttc tcattccctc ttcctccatt    3432
ctaatcattt ctagctggct ggcctccaca gagcatagga aaacagccag ggccgggcac    3492
ggtggctcat gcctgtaatc tcaacactct gggaggccga gccgggtgga taacctgagg    3552
tcaggaattc gagaccagcc tggccaacat ggtaaaaccc catctctact aaaaatataa    3612
aaattagcca ggcatggtgg cgcacacctg taatcccagc tactcaagag gctgaggcag    3672
gagaattgct taaatctggg aggcggaagt tgcagtgagc caagatcgcg ccactgaact    3732
ccagcctagg caacaagagc aaaactccat ctccaaaaaa aagaaaggaa aaacagggcc    3792
aggtagccat tgtggagaga gcacacttag gaatcctggg atgttagtgt taaaagaaag    3852
ctcctggagc cagtgattct caggtttgtc ccagaaccct tttttctaag ccccatataa    3912
aaggtagatt aaaaaaacaa agtagcatga gtgaaattga gagagggaca ggtaatgcct    3972
tccagcccct aacttctaac aatctggaag cacaacgtga aaatcacgta gcccaaccct    4032
atcattttca tattatgaaa ctgagtccag gtaagtgaat ctgtccaagg tcacccagca    4092
aggtatcagt agccctgagg gtaaggactc tgataaggct cgggagggtc ctggaaagcc    4152
tgaggcggca ggaagagtgt gcagagttga gcgtgtctgg aaggctgatc cactgctggg    4212
cccacatcaa agcccccatg gggagcagac ccgactgcac atggctcttt tgctggaaga    4272
agagcatggc tgcgcagagg actaaaattt catctgggaa ggcttctttt gactgtcagt    4332
agcaggatgt caccagatga gggtgctatg ggaccacagc tgtctttgtt cccattgcaa    4392
ctcaaccctg cgggaggccg cctacatccc tgagagcctt ctggagccta cagaggagac    4452
attggccagc caaaaggaaa ggagtggcca gggtacgacc tggagtaggg aagggaaaaa    4512
gttcccggaa agaagagaat tggatgagag gtctcagtgg aaat                     4556
<210>27
<211>622
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>27
Met Arg Leu Leu Arg Arg Arg His Met Pro Leu Arg Leu Ala Met Val
1               5                   10                  15
Gly Cys Ala Phe Val Leu Phe Leu Phe Leu Leu His Arg Asp Val Ser
            20                  25                  30
Ser Arg Glu Glu Ala Thr Glu Lys Pro Trp Leu Lys Ser Leu Val Ser
        35                  40                  45
Arg Lys Asp His Val Leu Asp Leu Met Leu Glu Ala Met Asn Asn Leu
    50                  55                  60
Arg Asp Ser Met Pro Lys Leu Gln Ile Arg Ala Pro Glu Ala Gln Gln
65                  70                  75                  80
Thr Leu Phe Ser Ile Asn Gln Ser Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Thr Pro
                85                  90                  95
Ala Glu Leu Lys Pro Phe Trp Glu Arg Pro Pro Gln Asp Pro Asn Ala
            100                 105                 110
Pro Gly Ala Asp Gly Lys Ala Phe Gln Lys Ser Lys Trp Thr Pro Leu
        115                 120                 125
Glu Thr Gln Glu Lys Glu Glu Gly Tyr Lys Lys His Cys Phe Asn Ala
    130                 135                 140
Phe Ala Ser Asp Arg Ile Ser Leu Gln Arg Ser Leu Gly Pro Asp Thr
145                 150                 155                 160
Arg Pro Pro Glu Cys Val Asp Gln Lys Phe Arg Arg Cys Pro Pro Leu
                165                 170                 175
Ala Thr Thr Ser Val Ile Ile Val Phe His Asn Glu Ala Trp Ser Thr
            180                 185                 190
Leu Leu Arg Thr Val Tyr Ser Val Leu His Thr Thr Pro Ala Ile Leu
        195                 200                 205
Leu Lys Glu Ile Ile Leu Val Asp Asp Ala Ser Thr Glu Glu His Leu
    210                 215                 220
Lys Glu Lys Leu Glu Gln Tyr Val Lys Gln Leu Gln Val Val Arg Val
225                 230                 235                 240
Val Arg Gln Glu Glu Arg Lys Gly Leu Ile Thr Ala Arg Leu Leu Gly
                245                 250                 255
Ala Ser Val Ala Gln Ala Glu Val Leu Thr Phe Leu Asp Ala His Cys
            260                 265                 270
Glu Cys Phe His Gly Trp Leu Glu Pro Leu Leu Ala Arg Ile Ala Glu
        275                 280                 285
Asp Lys Thr Val Val Val Ser Pro Asp Ile Val Thr Ile Asp Leu Asn
    290                 295                 300
Thr Phe Glu Phe Ala Lys Pro Val Gln Arg Gly Arg Val His Ser Arg
305                 310                 315                 320
Gly Asn Phe Asp Trp Ser Leu Thr Phe Gly Trp Glu Thr Leu Pro Pro
                325                 330                 335
His Glu Lys Gln Arg Arg Lys Asp Glu Thr Tyr Pro Ile Lys Ser Pro
            340                 345                 350
Thr Phe Ala Gly Gly Leu Phe Ser Ile Pro Lys Ser Tyr Phe Glu His
        355                 360                 365
Ile Gly Thr Tyr Asp Asn Gln Met Glu Ile Trp Gly Gly Glu Asn Val
    370                 375                 380
Glu Met Ser Phe Arg Val Trp Gln Cys Gly Gly Gln Leu Glu Ile Ile
385                 390                 395                 400
Pro Cys Ser Val Val Gly His Val Phe Arg Thr Lys Ser Pro His Thr
                405                 410                 415
Phe Pro Lys Gly Thr Ser Val Ile Ala Arg Asn Gln Val Arg Leu Ala
            420                 425                 430
Glu Val Trp Met Asp Ser Tyr Lys Lys Ile Phe Tyr Arg Arg Asn Leu
        435                 440                 445
Gln Ala Ala Lys Met Ala Gln Glu Lys Ser Phe Gly Asp Ile Ser Glu
    450                 455                 460
Arg Leu Gln Leu Arg Glu Gln Leu His Cys His Asn Phe Ser Trp Tyr
465                 470                 475                 480
Leu His Asn Val Tyr Pro Glu Met Phe Val Pro Asp Leu Thr Pro Thr
                485                 490                 495
Phe Tyr Gly Ala Ile Lys Asn Leu Gly Thr Asn Gln Cys Leu Asp Val
            500                 505                 510
Gly Glu Asn Asn Arg Gly Gly Lys Pro Leu Ile Met Tyr Ser Cys His
        515                 520                 525
Gly Leu Gly Gly Asn Gln Tyr Phe Glu Tyr Thr Thr Gln Arg Asp Leu
    530                 535                 540
Arg His Asn Ile Ala Lys Gln Leu Cys Leu His Val Ser Lys Gly Ala
545                 550                 555                 560
Leu Gly Leu Gly Ser Cys His Phe Thr Gly Lys Asn Ser Gln Val Pro
                565                 570                 575
Lys Asp Glu Glu Trp Glu Leu Ala Gln Asp Gln Leu Ile Arg Asn Ser
            580                 585                 590
Gly Ser Gly Thr Cys Leu Thr Ser Gln Asp Lys Lys Pro Ala Met Ala
        595                 600                 605
Pro Cys Asn Pro Ser Asp Pro His Gln Leu Trp Leu Phe Val
    610                 615                 620

Claims (39)

1. 乳腺癌的诊断方法，该方法包括下述步骤：
(a)检测生物样品中编码SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的基因的表达水平；和
(b)将表达水平的上升与该疾病相关联。
2. 权利要求1的方法，其中，采用选自下组的任何一种方法检测所述表达水平：
(a)检测编码SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的mRNA；
(b)检测包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的蛋白质；和
(c)检测包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的蛋白质的生物活性。
3. 用于治疗或预防乳腺癌的化合物的筛选方法，该方法包括下述步骤：
(a)使受试化合物与选自下组的多肽接触：
(1)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽；
(2)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：25具有至少约80％同源性的序列的多肽，
(3)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ IDNO：25所示氨基酸序列构成的多肽等价的生物活性，
(b)检测受试化合物与多肽之间的结合活性；和
(c)选择与多肽结合的化合物。
4. 用于治疗或预防乳腺癌的化合物的筛选方法，该方法包括下述步骤：
(a)使受试化合物与选自下组的多肽接触：
(1)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽，
(2)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：25具有至少约80％同源性的序列的多肽，
(3)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽等价的生物活性；
(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和
(c)选择与不存在该受试化合物时检出的生物活性相比，抑制所述多肽的生物活性的化合物。
5. 权利要求4的方法，其中，所述生物活性为细胞增殖活性。
6. 用于治疗或预防乳腺癌的化合物的筛选方法，该方法包括下述步骤：
(a)使受试化合物与选自下组的多肽接触；
(1)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽；
(2)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：25具有至少约80％同源性的序列的多肽；
(3)由在严紧条件与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽等价的生物活性；
(4)包含SEQ ID NO：25的部分氨基酸序列的多肽，该多肽包含(1)～(3)中任一多肽的糖基化位点，
(b)检测所述多肽的糖基化水平；和
(c)选择这样的化合物：与不存在该受试化合物时检出的糖基化水平相比，该化合物抑制多肽的糖基化水平。
7. 权利要求6的方法，其中所述糖基化水平为SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的天冬酰胺476或其同源位置的糖基化水平。
8. 用于治疗或预防乳腺癌的化合物的筛选方法，该方法包括下述步骤：
(a)使表达选自下组的多肽的细胞与受试化合物接触：
(1)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽；
(2)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：25具有至少约80％同源性的序列的多肽；
(3)由在严紧条件与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽等价的生物活性；
(4)包含SEQ ID NO：25的部分氨基酸序列的多肽，该多肽包含(1)～(3)中任一多肽的糖基化位点，和
(b)选择这样的化合物：与不存在该受试化合物时检出的糖基化水平相比，该化合物抑制多肽的糖基化水平。
9. 权利要求8的方法，其中所述糖基化水平为SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的天冬酰胺476或其同源位置的糖基化水平。
10. 用于治疗或预防乳腺癌的化合物的筛选方法，该方法包括下述步骤：
(a)使表达包含SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列的多核苷酸的细胞与受试化合物接触；和
(b)选择这样的化合物：与不存在该受试化合物时检出的表达水平相比，所述化合物降低包含SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列的多核苷酸的表达水平。
11. 权利要求10的方法，其中所述细胞为乳腺癌细胞。
12.用于治疗或预防乳腺癌的化合物的筛选方法，该方法包括下述步骤：
(a)使导入了载体的细胞与受试化合物接触，其中所述载体含有标志基因的转录调控区和在该转录调控区的调控下表达的报道基因，所述标记基因包含SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列；
(b)测定所述报道基因的表达水平或活性；和
(c)选择这样的化合物：与不存在该受试化合物时检出的所述报道基因的表达水平或活性相比，该化合物降低所述报道基因的表达水平或活性。
13. 用于治疗或预防乳腺癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的针对多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA，以及药物可接受的载体，其中所述多核苷酸编码选自下组的多肽
(a)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽；
(b)包含其中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或添加的SEQ ID NO：25所示氨基酸序列，并且具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的蛋白等价的生物活性的多肽；
(c)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽等价的生物活性；
作为活性成分，以及药物可接受的载体。
14. 权利要求13的组合物，其中所述小干扰RNA含有SEQ ID NO：18或22所示的核苷酸序列作为靶序列。
15. 权利要求14的组合物，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]为对应于SEQ ID NO：18或22所示核苷酸序列的核糖核苷酸序列，
[B]为由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列，且
[A’]为由[A]的互补序列构成的核糖核苷酸序列。
16. 权利要求13的组合物，所述组合物包含转染增强剂。
17. 用于治疗或预防乳腺癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的针对选自下组的多肽的抗体作为活性成分，并且含有药物可接受的载体：
(a)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽；
(b)包含其中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或添加的SEQ ID NO：25所示氨基酸序列，并且具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的蛋白等价的生物活性的多肽；和
(c)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽等价的生物活性。
18. 用于治疗或预防乳腺癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的通过权利要求3-12任一项的方法选择的化合物作为活性成分，并含有药物可接受的载体。
19. 用于治疗或预防乳腺癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的抑制SEQ ID NO：25所示氨基酸序列中天冬酰胺476的糖基化的物质作为活性成分，并且含有药物可接受的载体。
20. 用于治疗或预防乳腺癌的方法，该方法包括施用药物有效量的反义多核苷酸或小干扰RNA的步骤，所述反义多核苷酸或小干扰RNA针对编码选自下组的多肽的多核苷酸：
(1)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽；
(2)包含其中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或添加的SEQ ID NO：25所示氨基酸序列，并且具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的蛋白等价的生物活性的多肽；和
(3)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽等价的生物活性。
21. 权利要求20的方法，其中所述siRNA含有SEQ ID NO：18或22所示的核苷酸序列作为靶序列。
22. 权利要求21的方法，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中：
[A]为对应于SEQ ID NO：18或22所示核苷酸序列的核糖核苷酸序列，
[B]为由3-23个核苷酸构成的核糖核苷酸序列，且
[A’]为由[A]的互补序列构成的核糖核苷酸序列。
23. 权利要求20的方法，其中所述组合物包含转染增强剂。
24. 用于治疗或预防乳腺癌的方法，该方法包括施用药物有效量的抗体的步骤，所述抗体针对选自下组的多肽：
(a)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽；
(b)包含其中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或添加的SEQ ID NO：25所示氨基酸序列，并且具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的蛋白等价的生物活性的多肽；和
(c)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽等价的生物活性。
25. 用于治疗或预防乳腺癌的方法，该方法包括施用药物有效量的通过权利要求3-12任一项的方法选择的化合物的步骤。
26. 用于治疗或预防乳腺癌的方法，该方法包括施用药物有效量的抑制SEQ ID NO：25所示氨基酸序列中天冬酰胺476之糖基化的物质的步骤。
27. 用于治疗或预防乳腺癌的方法，所述方法包括施用药物有效量的选自由(a)-(c)构成的组的多肽或编码该多肽的多核苷酸的步骤：
(a)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽或其片段；
(b)如下所述的多肽：其包含其中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或添加的SEQ ID NO：25所示氨基酸序列，并且具有与由其中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或增加的SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的蛋白等价的生物活性，并且具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的蛋白等价的生物活性；
(c)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中所述多肽与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽具有等价的生物活性，或所述多肽的片段。
28. 用于诱导抗肿瘤免疫的方法，该方法包括使选自由(a)-(c)构成的组的多肽与抗原呈递细胞接触，或者将编码该多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体导入抗原呈递细胞的步骤：
(a)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽，或其片段；
(b)包含其中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或添加的SEQ ID NO：25所示氨基酸序列，并且具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的蛋白等价的生物活性的多肽；和
(c)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中所述多肽与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽具有等价的生物活性，或所述多肽的片段。
29. 权利要求28的用于诱导抗肿瘤免疫的方法，其中该方法还包括给受试者施用抗原呈递细胞的步骤。
30. 用于治疗或预防乳腺癌的药物组合物，其包含药物有效量的选自由(a)-(c)构成的组的多肽或编码该多肽的多核苷酸作为有效成分，并且包含药物可接受的载体：
(a)包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽，或其片段；
(b)包含其中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或添加的SEQ ID NO：25所示氨基酸序列，并且具有与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的蛋白等价的生物活性的多肽；
(c)由在严紧条件下与由SEQ ID NO：24或26所示核苷酸序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中所述多肽与由SEQ ID NO：25所示氨基酸序列构成的多肽具有等价的生物活性，或所述多肽的片段。
31. 权利要求30的药物组合物，其中所述多核苷酸被纳入表达载体中。
32. 一种诊断试剂，其包含：与编码包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸杂交的寡核苷酸，或与包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的多肽结合的抗体。
33. 一种双链分子，包含有义链和反义链，其中所述有义链含有对应于SEQ ID NO：18或22的核糖核苷酸序列，且其中反义链含有与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双链分子；而且其中该双链分子当被导入表达B7330N基因的细胞时，抑制所述基因的表达。
34. 权利要求33的双链分子，所述有义链含有来自SEQ ID NO：24的约19-约25个连续的核苷酸。
35. 权利要求33的双链分子，所述有义链由对应于SEQ ID NO：18或22的核糖核苷酸序列构成。
36. 权利要求33的双链分子，其中单一核糖核苷酸转录物包含有义链和反义链，双链分子还包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。
37. 一种载体，其编码权利要求33的双链分子。
38. 权利要求37的载体，该载体编码具有二级结构的转录物，其中所述转录物包含有义链和反义链。
39. 权利要求37的载体，其中，所述转录物进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。
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