CN102197133A - C12orf48作为用于癌症治疗和诊断的靶基因 - Google Patents

Abstract

本文中描述了诊断发生胰腺癌和前列腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)和去势抗性前列腺癌的倾向性的客观方法。在一个实施方案中，诊断方法涉及使用靶向C12ORF48基因的siRNA来测定C12ORF48表达水平的步骤。本发明特征还在于产品，诸如siRNA的产物，以及含有它们的组合物。本发明进一步提供筛选在治疗C12ORF48相关疾病，诸如癌症，例如胰腺癌和前列腺癌中有用的治疗剂的方法，以及抑制细胞生长和治疗或减轻一种或多种疾病症状的方法。本发明特征还在于双链分子等产品以及含有它们的载体和组合物。

Description

C12ORF48作为用于癌症治疗和诊断的靶基因

优先权

本申请要求2008年8月28日提交的美国临时申请No.61/190,529的权益，通过本文中述及收录其完整内容。

技术领域

本发明涉及检测和诊断发生癌症，特别是胰腺癌和前列腺癌，例如胰腺导管腺癌和去势抗性前列腺癌的倾向性的方法。本发明还涉及筛选用于治疗和预防与C12ORF48过表达有关的癌症，特别是胰腺癌和前列腺癌，例如胰腺导管腺癌和去势抗性前列腺癌的候选化合物的方法。此外，本发明涉及降低C12ORF48基因表达的双链分子及其用途。特别地，本发明涉及C12ORF48。

背景技术

胰腺导管腺癌(PDAC)是西方世界癌症死亡的第四位原因，而且在常见恶性肿瘤中其显示最差的死亡率，5年存活率只有5％(DiMagno EP，et al.，Gastroenterogy 1999；117：1464-84，Zervos EE，et al.，Cancer Control2004；11：23-31)。在2007年，估计在美国诊断出37,170例新的胰腺癌，而且大致相等数目的死亡要归于胰腺癌(Jemal A，et al.，CA Cancer J Clin2007；57：43-66)。大多数PDAC患者在晚期被诊断出，当前没有晚期的有效疗法。虽然只进行手术切除提供了少许治愈可能，80-90％接受治愈性手术的PDAC患者死于他们的播散性或转移性疾病(DiMagno EP，et al.，Gastroenterogy 1999；117：1464-84，Zervos EE，et al.，Cancer Control2004；11：23-31)。手术和化疗(包括5-FU或吉西他滨)，结合或不结合无放射，的最新进展能改善患者的生活质量(DiMagno EP，et al.，Gastroenterogy1999；117：1464-84，Zervos EE，et al.，Cancer Control 2004；11：23-31)，但是那些治疗对PDAC患者的长期存活效果非常有限，原因在于它们极度攻击性和化学耐药性的性质。因此，大多数患者的管理聚焦于姑息性措施(DiMagno EP，etal.，Gastroenterogy 1999；117：1464-84，Zervos EE，et al.，Cancer Control2004；11：23-31)。

另一方面，前列腺癌(PC)在美国和欧洲是男性中的最常见恶性肿瘤及癌症相关死亡的第二位原因(Jemal A，et al.，CA Cancer J Clin 2007；57：43-66)。PC的发病率在大多数发达国家正在显著升高，原因在于西式饮食的流行和老年人群的爆发增长(Gronberg H，Lancet 2003；361：859-64，Hsing AW，et al.，Epidemiol Rev 2001；23：3-13)。使用血清前列腺特异性抗原(PSA)的筛选导致PC早期检出的显著改善，而且导致具有通过手术和/或放射疗法可治愈的局部疾病的患者比例升高(Gronberg H，Lancet 2003；361：859-64，Hsing AW，et al.，Epidemiol Rev 2001；23：3-13)。然而，20-30％的这些PC患者仍然遭受该疾病复发(Scher HI，et al.，J Clin Oncol 2006；23：8253-61)。雄激素/雄激素受体(AR)信号传导途径在PC发生和进展中发挥中心作用，而且PC生长通常是雄激素依赖性的(Hsing AW，et al.，Epidemiol Rev 2001；23：3-13，Scher HI，et al.，J ClinOncol 2006；23：8253-61)。因此，大多数具有复发或晚期疾病的患者对通过手术或药物去势来遏制睾丸雄激素生成的雄激素消融疗法响应较好。然而，他们终将获得对雄激素消融疗法(去势)的耐受性和更加攻击性的表型，称作去势抗性前列腺癌(CRPC)，对这种癌症的选项很有限，如多西他赛加泼尼松(Tannock IF，et al.，N Engl J Med 2004；351：1502-12)，尽管它们仍然能提供对CRPC的最低限度效果。因此，非常需要鉴定CRPC的分子靶及开发新的CRPC疗法来靶向那些分子。

为了克服这两种疾病的令人担忧的现状，迫切需要开发针对优良分子靶的新分子疗法。朝着这个方向，先前使用由超过30,000种基因组成的基因组范围cDNA微阵列，结合尽可能多地富集癌细胞群的激光微束显微解剖，生成了PDAC细胞(Nakamura T，et al.，Oncogene 2004；23：2385-400)和CRPC细胞(Tamura K，et al.，Cancer Res 2007；67：5117-25，WO2008/102906)的详细表达谱。

引用表

专利文献

[PTL 1]WO2008/102906

非专利文献

[NPL 1]DiMagno EP，et al.，Gastroenterogy 1999；117：1464-84

[NPL 2]Zervos EE，et al.，Cancer Control 2004；11：23-31

[NPL 3]Jemal A，et al.，CA Cancer J Clin 2007；57：43-66

[NPL 4]Gronberg H，Lancet 2003；361：859-64

[NPL 5]HsingAW，et al.，Epidemiol Rev 2001；23：3-13

[NPL 6]Scher HI，et al.，J Clin Oncol 2006；23：8253-61

[NPL 7]Tannock IF，et al.，N Engl J Med 2004；351：1502-12

[NPL 8]Nakamura T，et al.，Oncogene 2004；23：2385-400

[NPL 9]Tamura K，et al.，Cancer Res 2007；67：5117-25

发明概述

本发明涉及经由微阵列分析和RT-PCR得到的发现，即C12ORF48在多种癌细胞中过表达。如本文中证明的，癌细胞系中通过siRNA实现的内源C12ORF48功能性敲低导致对癌细胞生长的显著阻抑，提示它在维持癌细胞存活力中的至关重要作用。由于C12ORF48在成年正常器官中几乎不表达，它看起来是具有最低限度的不良作用的新治疗途径的一种适宜和有希望的分子靶。

因而，本发明的一个目的是提供在受试者中诊断或确定对癌症，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)和去势抗性前列腺癌(CRPC)的倾向性的方法，其通过测定源自受试者的生物样品，诸如活检中的C12ORF48表达水平来进行。与正常对照水平相比C12ORF48表达水平的升高指示受试者患有或有风险发生癌症，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)和去势抗性前列腺癌(CRPC)。在本发明的方法中，可通过适宜探针来检测C12ORF48基因，或者，可通过抗C12ORF48抗体来检测C12ORF48蛋白。

本发明的另一个目的是提供鉴定抑制C12ORF48基因的表达或其基因产物的活性的药剂的方法。另外，本发明提供了鉴定用于治疗和/或预防C12ORF48相关疾病，诸如癌症，例如胰腺癌和前列腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)和去势抗性前列腺癌(CRPC)的候选药剂或者抑制这些细胞生长的候选药剂的方法。本发明的方法可以在体外或在体内进行。与测试药剂不存在下的相比C12ORF48基因的表达水平和/或其基因产物的生物学活性的降低指示该测试药剂是C12ORF48基因的抑制剂，且由此可用于抑制过表达C12ORF48基因的细胞，诸如癌性细胞，例如胰腺癌细胞或前列腺癌细胞，特别是PDAC和CRPC的细胞的生长。候选药剂可用于减轻胰腺癌或前列腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)或去势抗性前列腺癌(CRPC)的症状。

本发明的又一个目的是提供抑制过表达C12ORF48基因的癌性细胞生长的方法，其通过施用抑制C12ORF48基因表达和/或C12ORF48蛋白功能的药剂来进行。优选地，药剂是抑制性核酸(例如反义、核酶、双链分子)。药剂可以是核酸分子或用于提供双链分子的载体。基因的表达可通过以足以抑制C12ORF48基因表达的量将双链分子导入靶细胞来抑制。本发明还提供了用于在受试者中抑制过表达C12ORF48基因的癌性细胞生长的方法，例如，在治疗性或预防性方法的语境中，用于患有胰腺癌或前列腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)或去势抗性前列腺癌(CRPC)的患者。

本发明的又一个目的是提供适合于治疗和/或预防胰腺癌或前列腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)或去势抗性前列腺癌的药物组合物，此类组合物包含药学可接受载体和活性剂，包括一种或多种本发明双链分子或编码它们的载体。本发明的双链分子在导入细胞中时能够抑制C12ORF48基因表达和抑制过表达C12ORF48基因的癌性细胞生长。此类分子的例子包括那些靶向与SEQ ID NO：10第595-613位核苷酸(SEQ ID NO：5)，第1133-1151位核苷酸(SEQ ID NO：7)或第1310-1328位核苷酸(SEQ ID NO：8)对应的序列。本发明的此类分子包含有义链和反义链，其中有义链包含包括靶序列的序列，且其中反义链包含与有义链互补的序列。所述分子的有义和反义链彼此杂交形成双链分子。

本发明的又一个目的是提供用于诊断胰腺癌或前列腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)或去势抗性前列腺癌(CRPC)的检测试剂和/或试剂盒，此类试剂或试剂盒包含抗C12ORF48抗体。

本领域的技术人员会理解，本发明的一个或多个方面可以满足某些目的，而一个或多个其它方面可以满足某些其它目的。每一个目的可能不在全部方面均同等地适用于本发明的每一个方面。因此，前述目的可以择一地适用于本发明的任何一个方面。在联系附图和实施例阅读下面的详细说明时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，前面的发明概要和后面的详细说明都仅仅提出了优选的实施方案，并不对本发明或本发明的其它可替换实施方案构成限制。

附图简述

本领域技术人员在考虑了下文的附图简述和本发明的详细描述及其优选实施方案后，将更明了本发明的不同方面和应用：

图1，图1证明了PDAC细胞和CRPC细胞中的C12ORF48过表达。(A)部分描绘了半定量RT-PCR的结果，证明了与同样经过显微解剖的正常胰腺导管细胞(“N.P.”)、整个正常胰腺组织(“胰腺”)、和重要器官(“心”、“肺”、“肝”、和“肾”)相比，C12ORF48在显微解剖的PDAC细胞中过表达(第1-9道，左边至右边)。ACTB表达充当定量对照。(B)部分描绘了半定量RT-PCR的结果，证明了与同样经显微解剖的正常前列腺上皮细胞(“NPro”)、整个正常前列腺组织、脑和重要器官(“心”、“肺”、“肝”、和“肾”)相比，C12ORF48在显微解剖的CRPC细胞中过表达(第2-6道，左边至右边)。ACTB表达充当定量对照。(C)部分描绘了C12ORF48表达的多组织Northern印迹分析的结果，证明了在人成年器官中，C12ORF48显示出在睾丸中表达。(D)部分描绘了C12ORF48表达的Northern印迹分析的结果，证明了数种PDAC细胞系(KLM-1、PK-59、PK-45P、和SUIT2)强烈表达C12ORF48，而其它正常成年器官不表达C12ORF48。(E)部分描绘了C12ORF48表达的Northern印迹分析的结果，显示了大多数前列腺癌细胞系强烈表达C12ORF48。

图2，图2证明了C12ORF48-siRNA对癌细胞生长的影响。(A)部分描绘了RT-PCR的结果，证明了在PDAC细胞系MiaPaCa2(左边)和PK-59(右边)中，si#595、si#1133、和si#1310对C12ORF48表达的敲低效果，但是si#851或阴性对照siEGFP没有效果。ACTB用于对RNA定量。(B)部分描绘了用所示的针对C12ORF48的siRNA表达载体(si#595、si#1133、si#851、si#1310、或阴性对照siEGFP)转染的MiaPaCa2(左边)和PK-59(右边)细胞各自进行MTT测定的结果。将与遗传霉素一起温育6天后的每一个平均值及表示SD(标准偏差)的误差棒绘图。Y轴表示490nm和作为参照的630nm处的吸光度，是用微量板读数仪测量的。这些实验是一式三份进行的。(C)部分描绘了经所示针对C12ORF48的siRNA表达载体(si#595、si#1133、si#851、si#1310、或阴性对照siEGFP)分别转染的MiaPaCa2(左边)和PK-59(右边)细胞的集落形成测定法的结果。与遗传霉素一起温育2周后通过0.1％结晶紫染色来显现细胞。

图3，图3证明了C12ORF48蛋白定位在核中。(A)部分描绘了使用抗HA标签抗体的Western印迹分析的结果，证明了外源C12ORF48在COS7细胞中过表达。(B)部分描绘了免疫细胞化学分析的结果，显示了外源C12ORF48蛋白定位在核中。绿色信号显示抗HA染色的C12ORF48蛋白，而DAPI染色(蓝色)呈现细胞中的核。(C)部分描绘了使用抗C12ORF48抗体的Western印迹分析的结果，检测PDAC细胞系中的内源C12ORF48。C12ORF48在PDAC细胞系KLM1、SUIT2和PK-1中高度表达，而在非癌性细胞系(HEK-293和COS7)中几乎检测不到。β-肌动蛋白充当上样对照。(D)部分描绘了使用抗C12ORF48抗体的免疫组织化学研究的结果。在PDAC细胞的核中观察到C12ORF48的强烈阳性染色(C1x40，C2x40)。在正常胰腺组织中，腺泡细胞和正常导管上皮细胞显示没有或很少的染色(Nx40)。总计，62份PDAC组织中的33份(53％)显示出C12ORF48的阳性染色。

图4，图4证明了C12ORF48与PARP1的相互作用。(A)部分描绘了SDS-PAGE凝胶的银染色的结果，显示了在HECK293细胞中110kDa条带与C12ORF48-Flag差异性地免疫共沉淀。LC-MS/MS分析鉴定出PARP1蛋白是与此110kDa条带对应的蛋白。(B)部分描绘了使用抗PARP1抗体的Western印迹分析的结果，证明了在HECK293细胞中PARP1蛋白与C12ORF48-Flag免疫共沉淀。(C)部分描绘了Flag-C12ORF48表达载体和/或PARP1-Myc表达载体共转染入HEK293细胞的结果。含有Flag-C12ORF48和/或PARP1-Myc的蛋白复合物用c-Myc抗体来免疫沉淀。使用抗Flag抗体的Western印迹指示当两种表达载体共转染时Flag-C12ORF48与PARP1-Myc免疫共沉淀。

图5，图5证明了用于敲低C12ORF48或PARP1的siRNA双链体诱导凋亡。(A)部分描绘了FACS分析的结果，检测出与经对照siRNA转染的细胞(27％)相比，经C12ORF48-siRNA转染的KLM-1细胞中subG1群体的比例升高(65％)。(B)部分描绘了检测FACS分析的结果，检测出与经对照siRNA转染的细胞(40％)相比，经PARP1-siRNA转染的KLM-1细胞中subG1群体的比例升高(79％)。

图6，图6证明了C12ORF48在体外正调节PARP1的自修饰。在有或无纯化的重组C12ORF48蛋白存在下，通过[³²P]NAD⁺掺入来测量PARP1自修饰，并通过SDS-PAGE来显现。第1道，单独的纯化的重组的带His标签的C12ORF48蛋白；第2道，带His标签的C12ORF48和PARP1蛋白二者；第3道，单独的PARP1蛋白。与C12ORF48蛋白不存在下相比，由[³²P]NAD⁺掺入反映的PARP1自修饰在C12ORF48蛋白存在下强烈增强。

图7，图7证明了C12ORF48敲低能降低癌细胞提取物中的PARP1活性。(A)部分描绘了使用抗C12ORF48(上部)和抗PARP1(下部)抗体的Western印迹分析的结果，证明了C12ORF48/PARP1 siRNA在KLM-1细胞中的敲低效果。(B)部分描绘了基于生物素化ADP-核糖掺入到组蛋白H1蛋白上的比色PARP测定法的结果，显示了与对照-siRNA相比，经C12ORF48-siRNA或PARP1-siRNA转染的KLM-1细胞提取物中PARP1对聚(ADP-核糖基)化组蛋白H1的活性分别降低了59.2％和55.5％。(C)部分描绘了使用抗C12ORF48(上部)和抗PARP1(下部)抗体的Western印迹分析的结果，证明了C12ORF48/PARP1 siRNA在SUIT-2细胞中的敲低效果。(D)部分描绘了比色PARP测定法的结果，显示了与对照-siRNA相比，经C12ORF48-siRNA或PARP1-siRNA转染的SUIT2细胞提取物中PARP1对聚(ADP-核糖基)化组蛋白H1的活性分别降低了65.2％和47.1％。(E)部分描绘了在进行PAGE后使用抗pADPr抗体对Western印迹检测PARP1酶促反应产物(标示为PAR)。在C12ORF48或PARP1敲低的细胞提取物中PARP1活性显著降低。

图8，图8证明了C12ORF48过表达能增强细胞提取物中的PARP1活性。(A)部分描绘了分别在转染C12ORF48表达载体后12、24、和48小时收集细胞，并使用抗C12ORF48多克隆抗体检测C12ORF48蛋白的表达。(B)部分描绘了使用PARP测定法来测量细胞提取物中的PARP1活性。与C12ORF48表达一致，HEK293细胞提取物中的PARP1活性也增强了(P＜0.0001，对模拟转染)。

实施方案的描述

尽管与本文描述相似或等价的任何方法和材料可用于实践或测试本发明实施方式，在此仍描述了优选方法、装置、与材料。然而，在描述本发明的材料与方法之前，应理解本发明并不限于本文中的特定大小、形状、尺度、材料、方法、方案等，因其可根据常规实验与优化而有变化。亦应理解本描述所用的命名法仅以描述特定版本或实施例为目的，并非意欲限定本发明的范围，所述范围仅由权利要求所限定。

通过本文中的述及而具体收录本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的整个公开内容。然而，本文中无一处要解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开。

当存在冲突时，应以本说明书所述为准，包括定义在内。另外，材料、方法、和实施例仅仅是例示性的，而非意图是限制性的。

定义

除非另有明确说明，本文中用语“一和/种”、“该”和“所述”指的是“至少一个/种”。

在本文中，术语“分离的”和“纯化的”当与物质(例如多肽、抗体、多核苷酸等)联用时，表示该物质基本上不含至少一种可包括于天然来源中的其他物质。因此，分离的或纯化的抗体指基本上不含细胞物质诸如碳水化合物、脂质或其他来自该蛋白质(抗体)来源的细胞或组织的污染性蛋白质的抗体，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的抗体。术语“基本上不含细胞物质”包括其中多肽与来自其被分离或重组产生的细胞的细胞组分相分离的所述多肽制备物。因此，基本上不含细胞物质的多肽包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的异源蛋白质(在此也称为“污染性蛋白质”)的多肽制备物。当多肽重组产生时，其还优选基本上不含培养基，包括具有少于约20％、10％或5％蛋白质制备物体积的培养基的多肽制备物。当多肽通过化学合成产生时，其优选基本上不含化学前体或其他化学品，包括具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计)的与该蛋白质合成有关的化学前体或其他化学品的多肽制备物。可例如通过在蛋白质制备物的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳及凝胶的考马斯亮蓝染色等之后单一条带的出现来显示特定蛋白质制备物含有分离的或纯化的多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是分离的或纯化的。

“分离的”或“纯化的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术产生时可基本上不含其他细胞物质或培养基，或当化学合成时可基本上不含化学前体或其他化学品。在一个优选的实施方案中，编码本发明抗体的核酸分子是分离的或纯化的。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可交换用于指氨基酸残基聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为修饰的残基或非天然存在的残基，诸如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸多聚体，以及天然存在的氨基酸多聚体。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指除具有修饰的R基或修饰的骨架之外，具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(连接氢原子、羧基、氨基和R基的α碳原子)的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指具有与一般氨基酸不同的结构、但具有类似的功能的化学化合物。

在此，氨基酸可以用它们普遍知道的、IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号表示。

除非另有明确陈述，术语“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，并且与氨基酸类似，以普遍接受的单字母代码来指称。类似于氨基酸，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸、或核酸分子可由DNA、RNA或其组合构成。

除非另有定义，术语“癌症”指过表达C12ORF48基因的癌症。过表达C12ORF48的癌症的例子包括但不限于胰腺癌和前列腺癌，更特别的是胰腺导管腺癌和去势抗性前列腺癌。

C12ORF48基因或C12ORF48蛋白

本发明部分基于下述发现，即与非癌性组织相比，编码C12ORF48的基因在胰腺导管腺癌(PDAC)中过表达。C12ORF48的cDNA长3,189个核苷酸。C12ORF48的核酸和多肽序列分别示于SEQ ID NO：10和11。另外的序列数据亦可通过下述登录号获取：

C12ORF48：NM_017915

依照本发明的一个方面，功能等同物亦认为是“C12ORF48多肽”。在本文中，蛋白的“功能等同物”为具有与该蛋白等同的生物学活性的多肽。也就是说，任何保留C12ORF48蛋白多肽的生物学能力的多肽均可用作本发明中的此类功能等同物。此类功能等同物包括那些对C12ORF48蛋白的天然存在氨基酸序列替代、删除、添加、或插入一个或多个氨基酸者。或者，多肽可包含与相应蛋白的序列具有至少约80％同源性(也称作序列同一性)，更优选与参照序列具有至少约90％至95％同一性，甚至更优选96％至99％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，多肽可以由在严格条件下与C12ORF48基因的天然存在核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。

本发明的多肽可在其氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的有无、或形式等方面有变化，这取决于用于产生它的细胞或宿主，或使用的纯化方法。无论如何，只要它具有与本发明的人类C12ORF48蛋白的功能等同的功能，它就在本发明的范围内。

短语“严格(杂交)条件”指这样的条件，在该条件下，核酸分子会与其靶序列杂交，通常在核酸复杂混合物中，而没有与其它序列的可检测的杂交。严格条件取决于序列，而且在不同情况中会有所变化。较长的序列在更高温度特异性杂交。对于核酸杂交的详尽指导可见于Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地说，严格条件选择为在限定的离子强度pH，比特定序列的热熔点(T_m)低大约5-10℃。T_m是这样的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度下，在平衡时有50％的与靶互补的探针与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在T_m，在平衡时50％的探针被占据)。严格条件还可以通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选背景杂交的10倍。例示性的严格杂交条件包括如下：50％甲酰胺、5x SSC、和1％SDS，在42℃温育，或5x SSC、1％SDS、在65℃温育，用0.2x SSC和0.1％SDS在50℃清洗。

在本发明的语境中，用于分离编码与人类C12ORF48蛋白功能等同的多肽的DNA的杂交条件可由本领域技术人员常规选择。例如，可用下述步骤进行杂交：在68摄氏度用“Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)进行30分钟或更长时间的预杂交，添加经过标记的探针，并在68摄氏度温育一小时或更长时间。下面的清洗步骤可在例如低严格度条件下进行。一种例示性的低严格度条件可包括42℃、2xSSC、0.1％SDS，优选50℃、2xSSC与0.1％SDS。经常优选使用高严格条件。一种例示性的高严格条件可包括在室温在2xSSC、0.1％SDS中清洗3次各20分钟，然后在1xSSC、0.1％SDS中在37摄氏度清洗3次各20分钟，并在1xSSC、0.1％SDS中在50摄氏度清洗2次各20分钟。然而，数种因素，诸如温度和盐浓度，可影响杂交的严格度，而且本领域技术人员可选择合适的因素以达到所需的严格度。

一般地说，蛋白中一个、两个或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白的功能。事实上，已知突变的或经过修饰的蛋白(即由如下氨基酸序列构成的肽，其中已通过替代、删除、插入和/或添加修饰了一个、两个或更多个氨基酸残基)保留原始的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。因而，本领域技术人员会认识到，对氨基酸序列进行改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别添加、删除、插入、或替代，或者被认为是“保守修饰”的那些修饰，其中蛋白的改变产生具有相似功能的蛋白，这些都是本发明的语境中可接受的。如此，在一个实施方案中，本发明的肽可具有如下的氨基酸序列，其中添加、插入、删除、和/或替代C12ORF48序列中的一个、两个或甚至更多个氨基酸。

只要保持蛋白的活性，氨基酸突变的数目不受特别限制。然而，一般优选改变氨基酸序列的5％或更少。因而，在一个优选的实施方案中，在此类突变体中要突变的氨基酸数目一般为30个氨基酸或更少，优选20个氨基酸或更少，更优选10个氨基酸或更少，更优选5或6个氨基酸或更少，甚至更优选3或4个氨基酸或更少。

要突变的氨基酸残基优选突变为保持氨基酸侧链特性的另一种氨基酸(称为保守性氨基酸替代的过程)。氨基酸侧链特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下列共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含有羟基基团的侧链(S，T，Y)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；含有碱的侧链(R，K，H)；和含有芳香族的侧链(H，F，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本领域是公知的。例如，下列8个组分别包含彼此构成保守性替代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins 1984)。

此类保守性修饰多肽包括在本发明的C12ORF48蛋白中。然而，本发明并不仅限于此，而且C12ORF48蛋白包括非保守性修饰，只要C12ORF48蛋白的至少一种生物学活性得以保留即可。另外，经过修饰的蛋白并不排除多态变体、种间同源物、和那些由这些蛋白的等位基因编码者。

此外，本发明的C12ORF48基因涵盖编码C12ORF48蛋白的此类功能等同物的多核苷酸。除了杂交之外，还可以利用基因扩增方法来分离编码与C12ORF48蛋白功能等同的多肽的多核苷酸，例如通过聚合酶链式反应(PCR)方法，使用基于蛋白编码DNA(SEQ ID NO：10)的序列信息合成的引物。分别与人类C12ORF48基因和蛋白的功能等同的多核苷酸和多肽通常与其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”通常指40％或更高的同源性，优选60％或更高，更优选80％或更高，甚至更优选90％至95％或更高，甚至更优选96％至99％或更高。特定的多核苷酸或多肽的同源性可遵循“Wilburand Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)”中的算法来确定。

诊断癌症的方法

发现C12ORF48的表达在胰腺癌和前列腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)和去势抗性前列腺癌(CRPC)中特异性的提高(图1)。因而，本文鉴定出的C12ORF48基因及其转录与翻译产物可以作为标志用于诊断癌症诸如胰腺癌和前列腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)和去势抗性前列腺癌(CRPC)，而且，通过测量样品中C12ORF48的表达可诊断那些癌症。更特别地，本发明提供了通过确定受试者中C12ORF48表达水平来检测、诊断和/或确定癌症，更特别的是PDAC或CRPC的存在或其发生的倾向性的方法。在本发明的语境中，术语“癌症”指可用本方法诊断的胰腺癌和前列腺癌，包括PDAC和CRPC。

根据本发明，可提供用于检查受试者状况的中间结果。所述中间结果可与其它信息结合起来以协助医生、护士或其它从业人员确定患者罹患所述疾病。就是说，本发明提供用于检查癌症的诊断标志C12ORF48。

或者，本发明提供了一种用于检测或鉴定源自受试者的胰腺或前列腺组织样品中癌细胞的方法，所述方法包括测定源自受试者的生物样品中C12ORF48基因表达水平的步骤，其中所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示组织中存在或怀疑存在癌细胞。

此类结果可以与别的信息结合来帮助医生、护士、或其它保健从业人员诊断受试者患有疾病。换言之，本发明可以给医生提供有用信息来诊断受试者患有疾病。例如，依照本发明，当关于自受试者获得的组织中癌细胞的存在有疑问时，可通过考虑C12ORF48基因的表达水平，结合疾病的其他不同方面，包括组织病理学、血液中的已知肿瘤标志物的水平、和受试者的临床过程等，来做出临床决策。例如，一些公知的血液中的诊断性胰腺肿瘤标志物为BFP，CA19-9，CA72-4，CA125，CA130，CEA，DUPAN-2，IAP，KMO-1，NCC-ST-439，NSE，sICAMe-1，SLX，Span-1，STN，TPA，YH-206和弹性蛋白酶1。或者，血液中的诊断性前列腺肿瘤标志物诸如BFP，IAP，α-巨球蛋白，PAP，PIPC，PSAγ-Sm和TPA也是公知的。就是说，在本发明的这个具体实施方案中，基因表达分析的结果作为中间结果，用于进一步诊断受试者的疾病状态。

本发明特别感兴趣的是下述[1]到[10]的方法：

[1]一种在受试者中检测或诊断癌症的方法，包括测定源自受试者的生物样品中C12ORF48的表达水平，其中所述水平较之该基因的正常对照水平的提高指示受试者患有或有风险发生癌症；

[2][1]的方法，其中所述表达水平比正常对照水平高至少10％；

[3][1]的方法，其中所述表达水平通过选自下组的方法检测：

(a)检测包含C12ORF48的序列的mRNA；

(b)检测包含C12ORF48的氨基酸序列的蛋白质；

(c)检测包含C12ORF48的氨基酸序列的蛋白质的生物学活性；

[4][1]的方法，其中所述癌症为胰腺癌或前列腺癌。

[5][4]的方法，其中所述胰腺癌为胰腺导管腺癌(PDAC)。

[6][4]的方法，其中所述前列腺癌为去势抗性前列腺癌(CRPC)。

[7][3]的方法，其中所述表达水平是通过检测探针与所述基因的基因转录物的杂交而确定的；

[8][3]的方法，其中确定所述表达水平是通过检测抗体与所述基因编码的蛋白的结合作为所述基因的表达水平；

[9][1]的方法，其中所述生物样品包括活检物、痰或血液。

[10][1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含上皮细胞。

[11][1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含癌细胞。和

[12][1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含癌性上皮细胞。

本发明的诊断癌症的方法将在下面更加详细的加以叙述。

要用本方法诊断的受试者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如，人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。

为实施诊断，优选从要诊断的受试者采集生物样品。任何生物学材料均可作为生物样品用于测定，只要其包含目标的C12ORF48转录或翻译产物。所述生物样品包括，但不仅限于，想要诊断癌症或怀疑患有癌症的身体组织，以及体液，例如活检物，血液，痰和尿液。生物样品优选含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，更优选癌性上皮细胞或源自怀疑为癌性的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，并将其作为生物样品。

根据本发明，测定源自患者的生物样品中C12ORF48的表达水平。表达水平可在转录产物(核酸)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，C12ORF48的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对于检测包括C12ORF48在内的多个基因(例如多种癌症特异性基因)的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用C12ORF48的序列信息制备上述探针。举例而言，C12ORF48的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，这样的标记物例如染料、荧光或同位素，且所述基因的表达水平可以作为所述杂交标签的强度来检测。

进一步，C12ORF48的转录产物可通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因可用的序列信息制备。举例而言，用于实施例的引物SEQ ID NO：3和4可用于通过RT-PCR或Northern印迹的检测，但本发明并不仅限于此。

具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与C12ORF48的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长的序列与较短的序列相比在更高的温度下发生特异杂交。一般地，严格条件的温度应选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是这样的温度，(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度下，在平衡状态有50％的与靶序列互补的探针与靶序列杂交。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，对于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。

或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定C12ORF48蛋白的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段保留对C12ORF48蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。

作为另一种基于C12ORF48的翻译产物检测其基因的方法，可利用针对C12ORF48蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。即，观察到强染色表明所述蛋白质的存在量增加，且同时表明C12ORF48基因的高表达水平。

另外，除C12ORF48基因的表达水平外，亦可确定其它癌症相关基因的表达水平，例如，亦可确定已知在癌症中有差异表达的基因的表达水平，以提高所述诊断的准确性。

就包括C12ORF48基因的癌症标志基因，其于生物样品中的表达水平可认为是增加的，如果其较之相应的癌症标志基因的对照水平增加了，例如10％，25％或50％的话，或增加到超过1.1倍，超过1.5倍，超过2.0倍，超过5.0倍，超过10倍或者更多。

对照水平可以与测试生物样品同时确定，使用先前从疾病状态(患癌或未患癌)已知的受试者收集和保存的样品。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的C12ORF48基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中C12ORF48基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中C12ORF48基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围可以用作标准值。

在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平是从癌性生物样品确定的，则称作“癌对照水平”。

当C12ORF48基因的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似，则受试者可诊断为正罹患或有风险发生癌症。进一步，当比较多种癌症相关基因的表达水平时，样品与癌性参照之间基因表达模式的相似性表明受试者正罹患或有风险发生癌症。

测试生物样品的表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌性或非癌性状态改变的对照核酸，例如管家基因，的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，β-肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。

诊断癌症的试剂盒

本发明提供了诊断癌症的试剂盒，其亦可用于评价癌症预后和/或监测癌症疗法的功效。优选地，所述癌症为胰腺癌或前列腺癌。更特别地，所述试剂盒优选包含至少一种用于在源自受试者的生物样品中检测C12ORF48基因表达的试剂，所述试剂可选自下组：

(a)检测C12ORF48基因的mRNA的试剂；

(b)检测C12ORF48的蛋白质的试剂；和

(c)检测C12ORF48的蛋白质的生物学活性的试剂。

适于检测C12ORF48基因mRNA的试剂包括特异性结合或识别C12ORF48mRNA的核酸，诸如具有与C12ORF48mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对C12ORF48mRNA为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸。如果需要，检测C12ORF48mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测C12ORF48mRNA的试剂。

另一方面，适于检测C12ORF48蛋白质的试剂包括针对C12ORF48蛋白质的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，所述抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv等等)均可用作所述试剂，只要所述片段保留与C12ORF48蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。此外，所述抗体可以使用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物和标记抗体及检测抗体与其靶的结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测C12ORF48蛋白质的试剂。

进一步，所述生物学活性可通过，例如，测量所述生物样品中由于表达的C12ORF48蛋白质导致的细胞增殖活性来确定。举例而言，可在源自受试者的生物样品的存在下培养所述细胞，然后可通过检测增殖的速度，或测量细胞周期或集落形成能力，来确定所述生物样品的生物学活性。如需要，检测C12ORF48mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测C12ORF48蛋白质生物学活性的试剂。

所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。进一步，所述试剂盒可包括固体基质以及用于结合针对C12ORF48基因的探针或针对C12ORF48蛋白质的抗体的试剂，用于培养细胞的培养基与容器，阳性与阴性对照试剂，以及用于检测针对C12ORF48蛋白质的抗体的第二抗体。举例而言，从患有或没有癌症的受试者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业和用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤纸、针头、注射器和带有使用说明书的装箱单(例如，书面的、磁带、CD-ROM等等)。这些试剂等可装在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。可用来制造所述容器的材料有多种，例如玻璃或塑料。

作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对C12ORF48mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质上，例如多孔条，以形成至少一个检测位点。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位点，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位点。此外，对照位点可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位点可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位点上量较大而在接下来的位点上量较小。在加入测试样品之后，显示可检测信号位点的数目提供了在样品中存在的C12ORF48mRNA量的定量指征。所述检测位点可布置成任何合适可检测的形状，通常是横跨测试条宽度的条状或点状。

本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照样品或C12ORF48标准样品。本发明的所述阳性对照样品可通过收集C12ORF48阳性样品，随后测定其C12ORF48水平来制备。此外，可将纯化的C12ORF48蛋白或多核苷酸添加到不表达C12ORF48的细胞中以形成所述阳性样品或C12ORF48标准品。在本发明中，纯化的C12ORF48可以是重组蛋白。例如，阳性对照样品的C12ORF48水平大于截留值。

抗癌化合物的筛选：

在本发明的语境中，待通过本筛选方法鉴定的药剂包括任何化合物或包含数种化合物的组合物。而且，根据本发明筛选方法暴露于细胞或蛋白的测试剂可以是单个化合物或化合物的组合。当在方法中使用化合物组合时，化合物可以顺次或同时加以接触。

任何测试剂，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸构建体，例如反义RNA、siRNA、核酶、适体等等)以及天然化合物，均可用于本发明的筛选方法中。也可使用本领域熟知的很多组合文库方法中的任何途径来获得本发明的测试剂，包括(1)生物文库，(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallel solid phase orsolution phase libraries)，(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文库法，以及(5)使用亲和色谱选择的合成文库法。使用亲和色谱选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer DrugDes.12：145-67)。合成分子文库方法的例子可在本领域找到(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13；Erb et al.，Proc Natl Acad Sci USA1994，91：11422-6；Zuckermann et al.，J Med Chem 37：2678-85，1994；Cho et al.，Science 1993，261：1303-5；Carell et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2059；Carell et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2061；Gallop et al.，J MedChem 1994，37：1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(参见Houghten，Bio/Techniques 1992，13：412-21)或珠子上(Lam，Nature 1991，354：82-4)、芯片上(Fodor，Nature 1993，364：555-6)、细菌上(美国专利5,223,409)、孢子上(美国专利5,571,698；5,403,484与5,223,409)、质粒上(Cull et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1992，89：1865-9)或噬菌体上(Scott and Smith，Science1990，249：386-90；Devlin，Science 1990，249：404-6；Cwirla et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1990，87：6378-82；Felici，J Mol Biol 1991，222：301-10；美国专利申请2002103360)。

通过本发明任何筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的化合物，包括在通过本发明筛选方法鉴定出的药剂之内。

此外，当所筛选的测试剂是蛋白质时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以确定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定编码蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白的DNA。对于所得的DNA，确认其在制备治疗或预防癌症的候选物测试剂中的有用性。

在本文描述的筛选中有用的测试样品亦可为特异性结合C12ORF48蛋白或其缺乏原蛋白的体内生物学活性的部分肽的抗体。

尽管测试剂文库的构建是本领域众所周知的，在下文中还是进一步提供了为本筛选方法鉴定测试剂和构建这些治疗剂文库的指导。

(i)分子建模

对已知具有目标性质的化合物的分子结构和/或对C12ORF48的分子结构的知识为人们构建测试剂文库提供了便利。预筛选适于进一步评估的受试药剂的一种途径利用了对受试药剂与其靶标的相互作用的计算机建模。

计算机建模技术为选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于来源于选定分子的x-射线晶体分析或NMR成像的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以完善结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合物中一方或双方发生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。

上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation，Waltham，Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。利用QUANTA可进行分子相互行为的互动性构建、修饰、可视化、和分析。

关于与特异蛋白相互作用的药物的计算机建模已经发表了多篇文献，例子包括Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988，97：159-66；Ripka，New Scientist 1988，54-8；McKinlay & Rossmann，Annu Rev Pharmacol Toxiciol1989，29：111-22；Perry & Davies，Prog Clin Biol Res 1989，291：189-93；Lewis& Dean，Proc R Soc Lond 1989，236：125-40，141-62；以及综述关于核酸组分模型受体的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111：1082-90。

其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga，Ontario，Canada的BioDesign，Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix，Inc公司、Cambridge，Ontario的Hypercube，Inc.等公司获取。见例如DesJarlais et al.，J Med Chem1988，31：722-9；Meng et al.，J Computer Chem 1992，13：505-24；Meng et al.，Proteins 1993，17：266-78；Shoichet et al.，Science 1993，259：1445-50。

一旦鉴定出推定的抑制剂，可使用组合化学技术基于鉴定出的推定抑制剂的化学结果构建任何数量的变体，如下所述。对于所得的推定抑制剂，或“测试剂”的文库，可使用本发明的方法筛选，以鉴定适合于治疗和/或预防癌症和/或预防癌症术后复发的测试剂，特别地其中，诸如胰腺癌和前列腺癌。

(ii)组合化学合成

测试剂的组合文库的制备可以作为涉及有关已知化合物中存在的核心结构的知识的合理药物设计程序的一部分来进行。这种策略使得文库可以保持合理的规模，从而便于高通量筛选，或者，可通过简单地合成构成文库的分子家族的所有排列，构建简单的、特别是短的聚合物分子文库。后一种方法的一个实例是全部由长度为6个氨基酸组成的肽文库。这种肽文库包含所有6氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。

组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见例如美国专利5,010,175；Furka，Int J Pept Prot Res 1991，37：487-93；Houghten et al.，Nature1991，354：84-6)。也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于：肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被编码的肽(例如WO93/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)，苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美国专利5,288,514)，diversomer如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWittet al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13)，插烯化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：9217-8)，小化合物文库的模拟物有机合成(analogous organic synthese)(Chenet al.，J.Amer Chem Soc 1994，116：2661)，寡聚氨基甲酸盐(Cho et al.，Science1993，261：1303)，和/或肽酰膦酸酯(peptidylphosphonates)(Campbell et al.，JOrg Chem 1994，59：658)，核酸文库(见Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology 1995 supplement；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA)，肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughan et al.，NatureBiotechnology 1996，14(3)：309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(见例如Liang et al.，Science 1996，274：1520-22；美国专利5,593,853)，和有机小分子文库(见例如苯并二氮卓，Gordon EM.Curr Opin Biotechnol.1995 Dec1；6(6)：624-31；类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫杂氮杂环己烷(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓，5,288,514；等)。

用于制备组合文库的设备是可商购的(见例如357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433AApplied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，有多种组合文库本身也是商业可得的(见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等等)。

(iii)其它候选物

另一种手段是使用重组细菌噬菌体来产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott & Smith，Science 1990，249：386-90；Cwirla et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1990，87：6378-82；Devlin et al.，Science 1990，249：404-6)，可以构建非常大的文库(例如106-108个化学实体)。再一种手段主要使用化学方法，其实例包括Geysen方法(Geysen et al.，Molecular Immunology 1986，23：709-15；Geysen et al.，J Immunologic Method 1987，102：259-74)和Fodor等的方法(Science 1991，251：767-73)。Furka等(14th International Congress ofBiochemistry 1988，Volume#5，Abstract FR：013；Furka，Int J Peptide Protein Res1991，37：487-93)，Houghten(美国专利4,631,211)和Rutter等(美国专利5,010,175)记载了产生肽混合物的方法，可以将这些肽作为激动剂或拮抗剂加以测试。

适体是由紧密结合特定分子靶的核酸构成的大分子。Tuerk和Gold(Science.249：505-510(1990))披露了SELEX(通过指数式富集进行的配体系统性进化)方法来选择适体。在SELEX方法中，核酸分子的大型文库(例如10¹⁵种不同分子)可用于筛选。

C12ORF48结合化合物的筛选

在本发明的语境中，在胰腺癌和前列腺癌中检测出C12ORF48的过表达，虽然在正常器官中无表达(图1)。因而，，本发明提供了使用C12ORF48基因，及所述基因编码的蛋白来筛选结合C12ORF48的化合物的方法。由于癌症中C12ORF48的表达，与C12ORF48结合的化合物期待可阻抑癌细胞的增殖，因此对治疗或预防癌症是有用的。因此，本发明亦提供了使用C12ORF48多肽筛选阻抑癌细胞增殖的化合物的方法，以及筛选治疗或预防癌症的化合物的方法，其中所述癌症是胰腺癌或前列腺癌。该筛选方法的一个实施方案包括以下步骤：

(a)将测试化合物与C12ORF48的多核苷酸所编码的多肽接触；

(b)检测所述多肽与所述测试化合物之间的结合活性；和

(c)选择结合所述多肽的测试化合物。

在本发明的语境中，治疗效果可以与测试药剂或化合物同C12ORF48蛋白的结合水平关联起来。例如，当某种测试药剂或化合物结合C12ORF48蛋白时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有所需治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当某种测试药剂或化合物不结合C12ORF48蛋白时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。

本发明的方法将在下面更加详细的加以描述。

用于筛选的C12ORF48多肽可为重组多肽，或者是来自自然界的蛋白质，或其部分肽。与测试化合物接触的多肽可以是，例如，纯化的多肽、可溶蛋白质、与载体结合的形式、或者与其它多肽融合的融合蛋白。

作为使用C12ORF48多肽来筛选蛋白质，例如与C12ORF48多肽结合的蛋白质的方法，可使用本领域技术人员众所周知的许多方法。上述筛选可通过，例如，免疫沉淀方法，尤其是如下述的方式进行。通过将编码C12ORF48多肽的基因插入外源基因表达载体，例如pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS与pCD8，在宿主(例如，动物)细胞等中表达该基因。

为此表达所用的启动子可为任何通常可使用的启动子，包括，例如，SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.AcademicPress，London，83-141(1982))、EF-alpha启动子(Kim et al.，Gene 91：217-23(1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193(1991))、RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SR alpha启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8：466(1988))、CMV立即早期启动子(Seed andAruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9：946(1989))、HSV TK启动子等等。

将所述导入宿主细胞以表达外源基因可根据任何方法实施，例如电穿孔方法((Chu et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))、磷酸钙方法(Chenand Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))、DEAE葡聚糖方法(Lopata etal.，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol4：1641-3(1984))、Lipofectin方法(Derijard B.，Cell 76：1025-37(1994)；Lamb etal.，Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran et al.，Science 259：230-4(1993))等等。

对于由C12ORF48基因编码的多肽，可以把特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入该多肽的N或C端，从而将该多肽表达为包含该表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。能够利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP)形成的融合蛋白的载体可以从商业渠道获得。另外，也可以使用如下的融合蛋白，其通过导入仅由数个到十二个(a dozen)氨基酸构成的小型表位加以制备，使融合不会改变C12ORF48多肽的性质。可以使用例如多组氨酸(His-标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、E-标签(单克隆噬菌体上的表位)等表位，和识别它们的单克隆抗体作为筛选与C12ORF48多肽结合的蛋白质的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))

在免疫沉淀中，将这些抗体添加到用合适去垢剂制备的细胞裂解物中而形成免疫复合体。免疫复合体由C12ORF48多肽、具有与该多肽结合能力的多肽、和抗体组成。除了使用针对上述表位的抗体之外，还可以使用针对C12ORF48多肽的抗体进行免疫沉淀，这样的抗体可以如下文所述制备。免疫复合体可以被沉淀，例如当抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过蛋白Asepharose或蛋白G sepharose将其沉淀。如果将由C12ORF48基因编码的多肽制备成与表位(例如GST)的融合蛋白，则可以使用特异结合这些表位的物质，例如谷胱甘肽-sepharose 4B，按照与使用针对C12ORF48的抗体的相同的方式来形成免疫复合体。

可遵循或根据，例如，文献中的方法来实施免疫沉淀(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。

普遍使用SDS-PAGE分析经免疫沉淀的蛋白，使用合适浓度的凝胶，可以利用结合蛋白的分子量来分析该蛋白。由于与C12ORF48多肽结合的蛋白难以通过考马斯兰染色或银染色等普通染色方法检测到，可以通过如下的方法提高蛋白的检测灵敏度：在含有放射性同位素³⁵S-甲硫氨酸或³⁵S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白，并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，可以直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶上纯化出靶蛋白并测定其序列。

可以使用West-Western印迹分析法作为利用C12ORF48多肽来筛选结合所述多肽的蛋白的方法(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))。特别地，与C12ORF48多肽结合的蛋白可以通过如下方法获得，利用噬菌体载体(例如ZAP)从预期表达结合C12ORF48多肽的蛋白的培养细胞制备cDNA文库，在LB琼脂糖上表达蛋白，将表达出的蛋白固定在滤膜上，使纯化并且标记的C12ORF48多肽与上述滤膜反应，并依照标记物来检测表达与C12ORF48多肽结合的蛋白的噬菌斑。本发明的多肽可以利用生物素与抗生物素蛋白间的结合，或者利用特异结合C12ORF48多肽或与C12ORF48多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗体，来进行标记。也可以使用利用放射性同位素或荧光等的方法。

或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献见“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。

在双杂交系统中，例如，使本发明多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，使该文库在被表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后，将cDNA文库导入到上述酵母细胞中，并从检测到的阳性克隆(当酵母细胞表达可与本发明多肽结合的蛋白时，两者的结合可激活报告基因，使阳性克隆可检测)中分离源自该文库的cDNA。通过将上面分离的cDNA导入到大肠杆菌中并表达该蛋白，可制备由该cDNA编码的蛋白。作为报告基因，除了HIS3基因之外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。

也可以用亲和色谱来筛选与C12ORF48基因编码的多肽结合的化合物。例如，可以把本发明多肽固定在亲和柱的载体上，而将含有能够结合本发明多肽的蛋白的测试化合物施加到该柱上。这里的测试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在加载测试化合物之后，冲洗柱子，从而可以制备得到结合于本发明多肽的化合物。当测试化合物是蛋白质时，对所得蛋白质的氨基酸序列进行分析，根据该序列合成寡DNA，并用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库，从而获得编码该蛋白的DNA。

利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合化合物的装置。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽(例如BIAcore，Pharmacia)，以表面等离子体共振信号的形式对本发明多肽与测试化合物间的相互作用进行实时的观察。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，有可能对本发明多肽与测试化合物间的结合进行评估。

用于筛选当固定的C12ORF48多肽暴露于合成化合物或天然物质文库或随机噬菌体多肽展示文库时发生结合的分子的方法，以及使用基于组合化学技术的高通量筛选方法(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature 384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))，不仅分离与C12ORF48蛋白结合的蛋白质，而且分离与C12ORF48蛋白结合的化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法，是本领域技术人员众所周知的。

阻抑C12ORF48生物学活性的化合物的筛选

在本发明的语境中，C12ORF48蛋白特征在于具有促进癌细胞的细胞增殖的活性(图2)。使用这种生物学活性作为指标，本发明提供了筛选可阻抑表达C12ORF48的癌细胞增殖的化合物的方法，以及筛选用于治疗或预防癌症的化合物的方法，其中所述癌症特别包括胰腺癌和前列腺癌。因此，本发明提供了使用C12ORF48基因编码的多肽筛选治疗或预防癌症的化合物的方法，其包括下列步骤：

(a)将测试化合物与C12ORF48的多核苷酸编码的多肽接触；

(b)检测(a)所述多肽的生物学活性；

(c)选择较之测试化合物不存在时，阻抑由C12ORF48基因编码的多肽的生物学活性的测试化合物。

依照本发明，可评估测试化合物阻抑细胞增殖促进的活性或者候选化合物治疗或预防涉及C12ORF48的癌症(例如胰腺癌和前列腺癌)的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑细胞增殖的候选化合物或者用于治疗或预防涉及C12ORF48的癌症的候选化合物的方法，其使用C12ORF48多肽或其片段，包括以下步骤：

(a)将测试化合物与C12ORF48多肽或其功能性片段接触；

(b)检测步骤(a)的所述多肽或片段的生物学活性；并

(c)将(b)的生物学活性与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。

在本发明的语境中，治疗效果可以与C12ORF48多肽或其功能性片段的生物学活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物阻抑或抑制C12ORF48多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不阻抑或抑制C12ORF48多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。

本发明所述方法将在下面更加详细的加以描述。

任何多肽均可用于筛选，只要它们阻抑C12ORF48蛋白的生物学活性即可。这样的生物学活性包括C12ORF48蛋白的细胞增殖活性。举例而言，可使用C12ORF48蛋白，亦可使用与这些蛋白功能上等价的多肽。上述多肽可由细胞内源或外源地表达。

通过本筛选分离的化合物是C12ORF48基因编码多肽的拮抗剂的候选物。术语“拮抗剂”是指可以通过结合多肽而抑制多肽功能的分子。此术语还指可降低或抑制编码C12ORF48的基因的表达的分子。而且，通过本筛选分离的化合物是如下化合物的候选物，所述化合物抑制C12ORF48多肽与分子(包括DNA和蛋白)的体内相互作用。

当本方法中要检测的生物学活性是细胞增殖时，可以通过例如如下方法进行检测：制备表达C12ORF48多肽的细胞，在测试化合物的存在下培养细胞，确定细胞增殖速度，测量细胞周期等，以及通过测量存活细胞或集落形成能力，例如图2所示。选择降低表达C12ORF48的细胞的增殖速度的化合物作为治疗或预防胰腺癌和前列腺癌的候选化合物。

更具体而言，该方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物与过表达C12ORF48的细胞接触；

(b)测量细胞增殖活性；并

(c)选择与测试化合物不存在下的细胞增殖活性相比降低细胞增殖活性的测试化合物。

在优选的实施方案中，本发明的方法可进一步包括以下步骤：

(d)选择对不或很少表达C12ORF48的细胞没有影响的测试化合物。

短语“阻抑或降低生物学活性”在此定义为较之不存在所述化合物时，对C12ORF48生物学活性优选至少10％的阻抑，较优选至少25％、50％或75％的阻抑，且最优选至少90％的阻抑。

使用C12ORF48和PARP1的结合作为指标的筛选

在本发明中，确认了C12ORF48蛋白与PARP1蛋白相互作用(图4)。如此，抑制C12ORF48蛋白和PARP1蛋白之间结合的化合物可使用C12ORF48蛋白和PARP1蛋白的此类结合作为指标来筛选。因此，本发明提供了使用C12ORF48蛋白和PARP1蛋白的此类结合作为指标来筛选用于抑制C12ORF48蛋白和PARP1蛋白之间结合的化合物的方法。另外，本发明亦提供筛选用于抑制或降低表达C12ORF48的癌细胞例如胰腺癌细胞和前列腺癌细胞生长的化合物和用于治疗或预防癌症例如胰腺癌或前列腺癌的化合物的方法。

具体地，本发明提供了下列方法[1]到[5]：

[1]一种筛选破坏C12ORF48多肽和PARP1多肽之间结合的药剂或化合物的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)使C12ORF48多肽或其功能等同物与PARP1多肽或其功能等同物在测试药剂或化合物存在下接触；

(b)检测所述多肽之间的结合；

(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与在测试药剂或化合物不存在下检测到的结合水平；并

(d)选择降低或抑制所述结合水平的测试药剂或化合物。

[2]一种筛选可用于治疗或预防癌症的药剂或化合物的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)使C12ORF48多肽或其功能等同物与PARP1多肽或其功能等同物在测试药剂或化合物存在下接触；

(b)检测所述多肽之间的结合；

(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与在测试药剂或化合物的不存在下检测到的结合水平；并

(d)选择降低或抑制所述结合水平的测试药剂或化合物。

[3][1]或[2]的方法，其中C12ORF48的功能等同物包含PARP1结合域。

[4][1]或[2]的方法，其中PARP1的功能等同物包含C12ORF48结合域。

[5][1]的方法，其中所述癌症选自下组：胰腺癌和前列腺癌。

依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防C12ORF48相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑癌细胞增殖的候选药剂或化合物或者用于治疗或预防癌症的候选药剂或化合物的方法。

更具体地，所述方法包括下列步骤：

(a)使C12ORF48多肽或其功能等同物与PARP1多肽或其功能等同物在测试药剂或化合物存在下接触；

(b)检测所述多肽之间的结合水平；并

(c)比较C12ORF48和PARP1蛋白的结合水平与在测试药剂或化合物的存在下检测到的结合水平；并

(d)将c)的结合水平与测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。

在本发明的语境中，C12ORF48或PARP1多肽的功能等同物分别是具有与C12ORF48多肽(SEQ ID NO：11)或PARP1(SEQ ID NO：13)多肽等同的生物学活性的多肽。

作为对调控，例如抑制C12ORF48与PARP1的结合的化合物的筛选方法，可使用本领域技术人员公知的多种方法。

用于筛选的多肽可为重组多肽，或者是来自自然来源的蛋白质，或其部分肽。任何上述测试化合物可用于筛选。

作为使用C12ORF48或PARP1多肽或其功能性等同物筛选蛋白，例如结合多肽的蛋白的方法，可使用本领域技术人员公知的多种方法。此类筛选可使用例如免疫沉淀、West-Western印迹分析(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))、利用细胞的双杂交系统(″MATCHMAKER Two-Hybrid system″，″Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit″，″MATCHMAKERone-Hybrid system″(Clontech)；″HybriZAP Two-Hybrid Vector System″(Stratagene)；参考文献见″Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)″，″Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)″)、亲和层析和使用表面等离振子共振现象的生物传感器来进行。可使用任何上述测试化合物。在一些实施方案中，此方法进一步包括检测候选化合物与C12ORF48蛋白或PARP1蛋白结合，或检测C12ORF48蛋白与或PARP1蛋白结合水平的步骤。表达C12ORF48蛋白和/或PARP1蛋白的细胞包括例如自癌症，例如肺癌建立的细胞系，此类细胞可用于上述本发明筛选，只要细胞表达这两种基因。或者，细胞可以用C12ORF48和PARP1蛋白的表达载体二者或任一转染，从而表达这两种基因。C12ORF48蛋白与PARP1蛋白的结合可使用抗C12ORF48抗体和PARP1抗体通过免疫沉淀测定法来检测(图4)。

阻抑PARP1生物学活性的化合物的筛选

在本发明的语境中，确认了PARP1活性在C12ORF48敲低中显著降低(图7E)。使用这种活性作为指标，本发明提供了筛选可阻抑表达C12ORF48和PARP1的癌细胞增殖的化合物的方法，以及筛选用于治疗或预防癌症的化合物的方法，其中所述癌症特别包括胰腺癌和前列腺癌。因此，本发明提供了使用由C12ORF48基因编码的多肽筛选治疗或预防癌症的化合物的方法，其包括下列步骤：

(a)将测试化合物与C12ORF48的多核苷酸编码的多肽在PARP1的多核苷酸编码的多肽存在下接触；

(b)检测PARP1的多核苷酸编码的多肽的生物学活性；

(c)选择较之测试化合物不存在时该多肽的生物学活性，阻抑由PARP1的多核苷酸编码的多肽的生物学活性的测试化合物。

依照本发明，可评估测试化合物阻抑PARP1的自修饰活性或者候选化合物治疗或预防涉及C12ORF48的癌症(例如胰腺癌和前列腺癌)的治疗效果。

因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑自修饰活性的候选化合物或者用于治疗或预防涉及C12ORF48的癌症的候选化合物的方法，其使用C12ORF48多肽或其片段和PARP1多肽或其片段，包括以下步骤：

a)将测试化合物与C12ORF48多肽或其功能性片段在PARP1多肽或其功能性片段的存在下接触；并

b)检测步骤(a)的PARP1多肽或片段的生物学活性；并

c)将b)的生物学活性与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。

在本发明的语境中，治疗效果可以与由C12ORF48增强的PARP1多肽或其功能性片段的自修饰活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物阻抑或抑制PARP1多肽或其功能性片段的自修饰活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不阻抑或抑制PARP1多肽或其功能性片段的自修饰活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。

本发明所述方法将在下面更加详细的加以描述。

任何多肽均可用于筛选，只要它们阻抑PARP1蛋白的自修饰活性即可。例如，可以使用C12ORF48蛋白和PARP1蛋白，而且亦可使用与这些蛋白功能上等价的多肽。上述多肽可由细胞内源或外源地表达。

通过本筛选分离的化合物是C12ORF48基因编码的多肽的拮抗剂的候选物。术语“拮抗剂”是指可以通过结合多肽而抑制多肽功能的分子。此术语还指可降低或抑制编码C12ORF48的基因的表达的分子。而且，通过本筛选分离的化合物是抑制C12ORF48多肽与PARP1的体内相互作用的化合物的候选者。

当本方法中要检测的生物学活性是自调控时，可以通过例如如下方法进行检测：制备表达C12ORF48和PARP1多肽的细胞，在测试化合物的存在下培养细胞，确定PARP1的自调控，测量细胞周期等，以及通过测量存活细胞或集落形成能力。选择这样的化合物作为治疗或预防胰腺癌和前列腺癌的候选化合物：其降低表达C12ORF48的细胞的PARP1自调控。

更具体而言，该方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物与过表达C12ORF48和PARP1的细胞接触；

(b)测量PARP1的自调控活性；并

(c)选择与测试化合物不存在下的细胞增殖活性相比降低自调控活性的测试化合物。

在优选的实施方案中，本发明的方法可进一步包括以下步骤：

(d)选择对不或很少表达C12ORF48的细胞没有影响的测试化合物。

短语“阻抑或降低自调控”在此定义为较之不存在所述化合物时，对C12ORF48生物学活性的优选至少10％的阻抑，较优选至少25％、50％或75％的阻抑，且最优选至少90％的阻抑。

改变C12ORF48表达的化合物的筛选

在本发明中，通过siRNA减少C12ORF48表达导致癌细胞增殖的抑制(图2)。因而，本发明提供了筛选抑制C12ORF48表达的化合物的方法。抑制C12ORF48表达的化合物可望能够阻抑癌细胞增殖，并因此对治疗或预防癌症，诸如胰腺癌和前列腺癌有用。因此，本发明亦提供了筛选阻抑癌细胞增殖的化合物的方法，以及筛选治疗或预防癌症的化合物的方法。在本发明的语境下，上述筛选可包括，例如，下列步骤：

(a)将候选化合物与表达C12ORF48的细胞接触；并

(b)选择与对照相比减少C12ORF48表达水平的候选化合物。

依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防C12ORF48相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防C12ORF48相关疾病的候选药剂或化合物的方法。

在本发明的语境中，此类筛选可包括例如以下步骤：

a)使测试药剂或化合物与表达C12ORF48基因的细胞接触；

b)检测C12ORF48基因的表达水平；并

c)将b)的表达水平与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。

在本发明的语境中，治疗效果可以与C12ORF48基因的表达水平关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物降低C12ORF48基因的表达水平时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不降低C12ORF48基因的表达水平时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。

本发明的方法将在下面更加详细的加以描述。

表达C12ORF48的细胞包括，例如，自胰腺癌和前列腺癌建立的细胞系或经C12ORF48表达载体转染的细胞系；任何这样的细胞均可用于上述本发明的筛选。可用本领域技术人员众所周知的方法，例如，RT-PCR、Northern印迹分析、Western印迹分析、免疫染色与流式细胞分析来估计表达水平。在此定义的“降低表达水平”优选为较之在所述化合物不存在时的表达水平，至少使C12ORF48表达水平降低至少10％，较优选降低至少25％、50％或75％，最优选降低至少95％的水平。在此的化合物包括化学化合物、双链核苷酸等等。在前面描述了双链核苷酸的制备。在筛选方法中，降低C12ORF48表达水平的化合物可选择作为治疗或预防胰腺癌和前列腺癌的候选化合物。

或者，本发明的所述筛选方法可包括下列步骤：

(a)将候选化合物与导入了包含C12ORF48转录调控区域与在该转录调控区域控制下表达的报道基因的载体的细胞接触；

(b)测量所述报道基因的表达或活性；并

(c)选择降低所述报道基因表达或活性的候选化合物。

依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防C12ORF48相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防C12ORF48相关疾病的候选药剂或化合物的方法。

在本发明的语境中，此类筛选包括例如以下步骤：

a)使测试药剂或化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含C12ORF48基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因；

b)检测所述报道基因的表达或活性；并

c)将b)的表达水平与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。

在本发明的语境中，治疗效果可以与所述报道基因的表达或活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物降低所述报道基因的表达或活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不降低所述报道基因的表达或活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。

合适的报道基因和宿主细胞在本领域是众所周知的。例示性的报道基因包括但不限于萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、Laz与beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)，而宿主细胞为COS7、HEK293、HeLa等。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与C12ORF48转录调控区域连接来制备。本文所述的C12ORF48转录调控区域为从转录起始位点开始至少500bp上游的区域，优选1000bp，较优选5000或10000bp上游。含有所述转录调控区域的核苷酸片段可从基因组文库中分离出来，或可通过PCR扩增。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与这些基因中任一的转录调控区域连接来制备。识别转录调控区域的方法，以及其测定法规程都是众所周知的(Molecular Cloning，第三版，第17章，2001，Cold Springs HarborLaboratory Press)。

用含有所述报道构建体的载体感染宿主细胞，且用本领域众所周知的方法检测报道基因的表达或活性(例如，使用照度计(luminometer)、吸收光谱仪、流式细胞仪等等)。在此定义的“降低表达或活性”优选较之在所述化合物不存在时，报道基因的表达或活性优选地被降低至少10％，更优选地，至少降低25％、50％或75％，最优选地，降低至少95％。

在本发明的背景中，可鉴定出具有治疗或预防癌症的潜力的候选化合物。这些候选化合物的治疗潜力可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定用于癌症的治疗剂。例如，当结合C12ORF48蛋白的化合物抑制癌症的上文所述活性时，可得出结论此类化合物具有C12ORF48特异性治疗效果。

双链分子

本文中使用的术语“分离的双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括，例如，小干扰RNA(siRNA，例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))与小干扰DNA/RNA(siD/R-NA，例如DNA与RNA的双链嵌合体(dsD/R-NA)或DNA与RNA的小发夹嵌合体(shD/R-NA))。

本文中使用的术语“siRNA“指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括C12ORF48有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、C12ORF48反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。

本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。所述两条链的核苷酸序列可不仅包含选自靶基因序列中蛋白质编码序列的“有义”或“反义”RNA，亦可包括具有选自所述靶基因非编码区域的核苷酸序列的RNA分子。

在本说明书中使用的术语“shRNA”是指：具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)”

在本说明书中使用的术语“siD/R-NA”是指：由RNA和DNA二者组成的双链多核苷酸分子，包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，其阻止靶mRNA的翻译。在本说明书中，杂合体表示这样的分子，其中由DNA组成的多核苷酸和由RNA组成的多核苷酸相互杂交形成双链分子；而嵌合体表示组成所述双链分子的链中的一条或两条可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞的常规技术。所述siD/R-NA包括C12ORF48有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、C12ORF48反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。siD/R-NA可以这样构建，使单个转录物同时具有来自靶基因的有义核酸序列和互补反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。

在本文中使用的术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，所述两个分子包含彼此互补的序列并且已经藉由所述互补序列退火在一起而形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅仅包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包含具有选自靶基因非编码区的核苷酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个由RNA和DNA二者组成(嵌合体分子)，或者一个分子由RNA组成而另一个由DNA组成(杂合双链)。

在本文中使用的术语“shD/R-NA”是指：具有茎-环结构的siD/R-NA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使这些区域之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。

本说明书中使用的“分离的核酸”是指：从本来的环境(例如自然出现时的自然环境)中被取出，与其自然状态相比发生了合成性的改变的核酸。在本发明的语境中，分离的核酸的例子包括DNA、RNA和它们的衍生物。

与靶mRNA杂交的针对C12ORF48的双链分子通过与正常为单链的mRNA基因转录物结合，干扰其翻译，抑制蛋白质表达，来降低或抑制由C12ORF48基因编码的C12ORF48蛋白的产生。如本文中证明的，在胰腺癌细胞系中C12ORF48的表达被dsRNA抑制(图2)。因而，本发明提供了有能力在导入表达C12ORF48基因的细胞后抑制该基因表达的分离双链分子。所述双链分子的靶序列可通过siRNA设计算法来设计，例如下述的。

C12ORF48靶序列的例子包括例如核苷酸诸如

SEQ ID NO：5(位于SEQ ID NO：10的595-613nt)

SEQ ID NO：7(位于SEQ ID NO：10的1133-1151nt)

SEQ ID NO：8(位于SEQ ID NO：10的1310-1328nt)

SEQ ID NO：14(位于SEQ ID NO：10的606-624nt)

同样，与靶mRNA杂交的针对PARP1的双链分子通过与正常为单链的mRNA基因转录物结合，干扰其翻译，抑制蛋白质表达，来降低或抑制由PARP1基因编码的PARP1蛋白的产生。如本文中证明的，在胰腺癌细胞系中PARP1的表达被dsRNA抑制(图7)。因而，本发明提供了有能力在导入表达PARP1基因的细胞后抑制该基因表达的分离双链分子。所述双链分子的靶序列可通过siRNA设计算法来设计，例如下述的。

PARP1靶序列的例子包括例如核苷酸诸如

SEQ ID NO：15(位于SEQ ID NO：12的2685-2703nt)

本发明中特别感兴趣的是下列双链分子[1]至[18]：

[1]一种分离的双链分子，它当被导入细胞后，抑制C12ORF48或PARP1的体内表达及细胞增殖，所述分子包含有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成所述双链分子；

[2][1]中所述的双链分子，其中所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配：SEQ ID NO：5(位于SEQ ID NO：10的595-613nt)，SEQ ID NO：7(位于SEQ ID NO：10的1133-1151nt)，SEQ ID NO：8(位于SEQ ID NO：10的1310-1328nt)，SEQ ID NO：14(位于SEQ ID NO：10的606-624nt)与SEQ ID NO：15(位于SEQ ID NO：12的2685-2703nt)；

[3][2]中所述的双链分子，其中所述有义链包含对应于选自下组的靶序列的序列：SEQ ID NO：5、7、8、14和15；

[4][3]中所述的双链分子，具有少于约100个核苷酸的长度；

[5][4]中所述的双链分子，具有少于约75个核苷酸的长度；

[6][5]中所述的双链分子，具有少于约50个核苷酸的长度；

[7][6]中所述的双链分子，具有少于约25个核苷酸的长度；

[8][7]中所述的双链分子，具有约19到约25个核苷酸的长度；

[9][1]中所述的双链分子，其由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；

[10][9]中所述的双链分子，其具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个～23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与[A]互补的序列的反义链；

[11][1]中所述的双链分子，其由RNA构成；

[12][1]中所述的双链分子，其由DNA和RNA构成；

[13][12]中所述的双链分子，其中所述分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；

[14][13]中所述的双链分子，其中所述有义链与反义链分别由DNA与RNA构成；

[15][12]中所述的双链分子，其中所述分子为DNA与RNA的嵌合体；

[16][15]中所述的双链分子，其中反义链3’端侧翼的区域为RNA，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均为RNA；

[17][16]中所述的双链分子，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；

[18][2]中所述的双链分子，其中所述分子包含3’突出端；

本发明所述的双链分子将在下面更详细描述：

设计具有抑制细胞内靶基因表达能力的双链分子的方法是已知的(见例如，美国专利No.6,506,559，本文引用其全部内容作为参考)。例如，可以从Ambion网站(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)获得用于设计siRNA的计算机程序。

该计算机程序根据如下的方案选择双链分子的靶核苷酸序列。

靶点的选择

1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描搜寻AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3’侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶点。Tuschl等建议避免针对5’和3’非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白质的结合位点，而且UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。

2.将潜在靶位点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列显著同源的靶序列排除在考虑之外。主要使用BLAST(Altschul SF等，Nucleic Acids Res 1997 Sep 1，25(17)：3389-402)，其可见于NCBI服务器：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

3.选择合格的靶序列用于合成。通常沿着待评估的基因的长度选择几个靶序列。

使用上述规程，设计本发明中分离双链分子的靶序列为下述

对C12ORF48基因，SEQ ID NO：5、7、8和14，及

对PARP1，SEQ ID NO：15。

分别对以上述靶序列为目标的双链分子检查其阻抑表达靶基因细胞生长的能力。因此，本发明提供以选自下组的任何序列为靶标的双链分子：

对于C12ORF48基因，SEQ ID NO：5(位于SEQ ID NO：10的595-613nt)、SEQ ID NO：7(位于SEQ ID NO：10的1133-1151nt)、SEQ ID NO：8(位于SEQID NO：10的1310-1328nt)和SEQ ID NO：14(位于SEQ ID NO：10的606-624nt)，及对于PARP1，SEQ ID NO：15(位于SEQ ID NO：12的2685-2703nt)。

本发明的双链分子可以靶向单个C12ORF48或PARP1基因序列，或可以靶向多个C12ORF48或PARP1基因。

以上述靶序列C12ORF48或PARP1基因为靶标的本发明的双链分子包括含有靶序列和/或靶序列之互补序列的任何核酸序列的分离多核苷酸。以C12ORF48或PARP1基因为靶标的多核苷酸的例子包括那些含有序列SEQ IDNO：5、7、8、14和15和/或这些核苷酸的互补序列的多核苷酸。然而，本发明并不仅限于这些例子，且上述核酸序列中次要修饰是可以接受的，只要所述经修饰分子保留阻抑C12ORF48或PARP1基因表达的能力。本文中，短语“次要修饰”当用于和核酸序列相关时表示对所述序列替换、缺失、添加或插入一个、两个或数个核酸。

在本发明的语境下，术语“数个”当用于核酸替换、缺失、添加和/或插入时可意指3-7个，优选3-5个，较优选3-4个，最优选是3个核酸残基。

根据本发明，本发明的双链分子可用实施例中使用的方法检测其能力。在本文中下述的实施例中，根据标准方法在体外对包含C12ORF48或PARP1基因的mRNA不同部分的有义链或其互补的反义链的双链分子测验其在胰腺癌细胞系(例如使用MiaPaCa2，PK59，KLM1和SUIT2)中降低C12ORF48或PARP1基因产物产生的能力。进一步，例如，较之在缺乏候选分子情况下培养的细胞，在与候选双链分子接触的细胞中C12ORF48或PARP1基因产物的减少可由，例如，使用在实施例“半定量RT-PCR”项中针对C12ORF48或PARP1mRNA的引物的RT-PCR来加以检测。然后可对在体外基于细胞的测定中减少C12ORF48或PARP1基因产物之产生的序列检测其针对细胞生长的抑制作用。然后可对在体外基于细胞的分析中抑制细胞生长的序列使用患癌症动物检测其体内的能力，以证实C12ORF48或PARP1基因产物的产生降低与癌细胞生长降低，所述动物的例子包括裸鼠异种移植模型。

当所述分离多核苷酸是RNA及其衍生物时，核苷酸序列中的“t”应替换为“u”。本文中使用的术语“互补”指多核苷酸中核苷酸单元的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，且术语结合意指两个多核苷酸间物理的或化学的相互作用。当所述多核苷酸包含修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯酶联接时，这些多核苷酸亦可以同样地发生相互结合。一般而言，互补多核苷酸序列在合适条件下杂交以形成包含很少或没有错配的稳定双链体。进一步，本发明中所述分离多核苷酸的有义链与反义链可通过杂交形成双链分子或发夹环结构。在优选实施方案中，上述双链体在每10个匹配中包含不超过一个错配。在特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，该双链体不包含错配。

对C12ORF48所述多核苷酸长度优选少于3,189个核苷酸，而对PARP1所述多核苷酸长度优选少于4,001个核苷酸。举例而言，对所述的所有基因，多核苷酸长度小于500、200、100、75、50或25个核苷酸。本发明中所述分离多核苷酸对形成针对C12ORF48或PARP1基因的双链分子，或制备编码双链分子的模板DNA是有用的。当所述多核苷酸用于形成双链分子时，所述多核苷酸可长于19个核苷酸，优选长于21个核苷酸，且更加优选长度在约19与25个核苷酸之间。因而，本发明提供了包含有义链和反义链的双链分子，其中有义链包括与靶序列对应的核苷酸序列。在优选的实施方案中，有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为19至25个核苷酸对的双链分子。

本发明中所述双链分子可包含一个或更多修饰核苷酸和/或非磷酸二酯连接。本领域众所周知的化学修饰具有增加所述双链分子的稳定性、可用性和/或细胞摄入的能力。一般技术人员明白本发明分子可包含的其它类型的化学修饰(WO03/070744；WO2005/045037)。在一个实施方案中，可使用修饰以提供改善的抗降解性或改善的摄入。上述修饰的例子包括但不仅限于，硫代磷酸酯联接、2’-O-甲基核糖核苷酸(特别是在双链分子的有义链上)、2’-脱氧-氟代核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5’-C-甲基核苷酸以及倒转脱氧脱碱基残基的掺入(US20060122137)。

另一个实施方案中，可以使用修饰来增强双链核酸分子的稳定性或增加寻靶效率。这样的修饰包括双链核酸分子两条互补链之间的化学交联、双链核酸分子一条链的3’或5’末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰、2-氟代修饰的核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸(WO2004/029212)。在另一个实施方案中，修饰可以用于增加或减少针对靶mRNA中和/或互补双链分子链中互补核苷酸的亲和力(WO2005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶取代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮(7-deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一个实施方案中，当双链核酸分子是具有3’突出端的双链分子时，可以把3’-末端核苷酸的突出核苷酸替换成脱氧核糖核苷酸(Elbashir SM等，Genes Dev2001 Jan 15，15(2)：188-200)。关于进一步的细节，可以利用公开文献如US20060234970。本发明不限于这些实例，可以将任何已知化学修饰应用于本发明的双链核酸分子，只要所得分子保留抑制靶基因表达的能力。

此外，本发明的双链核酸分子可以包含DNA和RNA二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。具体而言，由DNA链与RNA链形成的杂合多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸表现出提高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA链(多核苷酸)组成的杂合型双链分子、或在任一单链(多核苷酸)或两条单链(多核苷酸)上同时包含DNA和RNA的嵌合型双链分子，诸如此类，来增强所述双链分子的稳定性。

DNA链和RNA链的杂合体可以是这样的杂合体，其中有义链是DNA而反义链是RNA，或者相反，只要它在导入表达靶基因的细胞中后能够抑制靶基因表达。优选地，有义链多核苷酸是DNA而反义链多核苷酸是RNA。同样，嵌合型双链分子可以是其中的有义链和反义链均由DNA和RNA组成，或者有义链或反义链中的任一条由DNA和RNA组成，只要在导入表达靶基因的细胞中时，所述双链分子具有抑制该基因表达的活性即可。为了提高双链分子的稳定性，分子中优选包含尽可能多的DNA；而为了诱导靶基因的表达抑制，要求分子在一定范围内是RNA，以充分地诱导表达抑制。

作为嵌合型双链分子的一个优选实例，双链分子的上游部分区域(即位于有义链或反义链内的靶序列或其互补序列之侧翼的区域)为RNA。优选地，所述上游部分区表示有义链的5’侧(5’端)和反义链的3’侧(3’端)。或者，将位于有义链5’末端侧翼或者反义链3’末端侧翼的区域称为上游部分区域。就是说，在优选实施方案中，反义链3’末端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’末端侧翼的区域和反义链3’末端侧翼的区域均由RNA组成。例如，本发明的嵌合型或杂合型双链核酸分子包含以下组合。

有义链：

5’-[---DNA---]-3’

3’-(RNA)-[DNA]-5’

：反义链，

有义链：

5’-(RNA)-[DNA]-3’

3’-(RNA)-[DNA]-5’

：反义链，和

有义链：

5’-(RNA)-[DNA]-3’

3’-(---RNA--)-5’

：反义链。

上游部分区优选是由9-13个核苷酸组成的域，从双链分子的有义链或反义链内的靶序列或其互补序列的末端算起。此外，这种嵌合型双链核酸分子的优选实例包括这样的实例：链长为19-21个核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半区(对于有义链为5’侧区域而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在这样的嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比反义链整体为RNA时强得多(US20050004064)。

在本发明的语境中，双链分子可以形成发夹结构，例如短发夹RNA(shRNA)以及由DNA与RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成紧密的发夹转弯，可以用来通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA在单一链上包含有义靶标序列和反义靶标序列，其中所述序列被环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA进一步与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合。这种复合物结合并切割与所述dsRNA或dsD/R-NA的靶标序列匹配的mRNA。

为了形成发夹环结构，可以在有义序列与反义序列之间设置由任意核苷酸序列构成的环序列。因此，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的双链分子。式中，[A]为有义链，包含与靶序列对应的序列；[B]为间插单链；[A′]为反义链，包含[A]的互补序列。靶序列例如可以选自以下的组：对C12ORF48，SEQ ID NO：5、7、8和14，而对PARP1，SEQ ID NO：15。

本发明不限于这些实例，在双链分子保持抑制作为靶标的C12ORF48或PARP1基因的表达的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在这些实例的基础上修饰而得到的序列。区域[A]与[A′]杂交而形成由区域[B]构成的环。间插单链部分[B]、即环序列，长度优选可以为3～23个核苷酸。例如，环序列可以选自由以下的序列组成的组(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al.，Nature 2002Jul 25，418(6896)：435-8，Epub 2002 Jun 26)：

CCC、CCACC或CCACACC：Jacque JM et al.，Nature 2002 Jul 25，418(6896)：435-8，Epub 2002 Jun 26；

UUCG：Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May，20(5)：500-5；Fruscoloni Pet al.，Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18，100(4)：1639-44，Epub 2003 Feb10；

UUCAAGAGA：Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun，4(6)：457-67。

优选的具有本发明的发夹环结构的双链分子实例如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自由AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA组成的组；但本发明不限于此：

5′-CACAGUAUCUCCUAGUCAA-[B]-UUGACUAGGAGAUACUGUG-3′(对靶序列SEQ ID NO：5)；

5′-GUUGCUCAGGAUUUGGAUU-[B]-AAUCCAAAUCCUGAGCAAC-3′(对靶序列SEQ ID NO：7)；

5′-CUAGUCAACUACUGGAUUU-[B]-AAAUCCAGUAGUUGACUAG-3′(对靶序列SEQ ID NO：14)；

5′-

GAUAGAGCGUGAAGGCGAA-[B]-UUCGCCUUCACGCUCUAUC-3′(对靶序列SEQ ID NO：15)；

此外，为了增强双链核酸分子的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加到靶序列的反义链的3’末端，作为3’突出端。添加的“u”的数目为至少2个，通常为2-10个，优选为2-5个。添加的“u”在双链分子的反义链的3’末端形成单链。

对于双链核酸分子的制备方法没有特殊限制，但优选采用本技术领域公知的化学合成方法。根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后采用适当的方法使它们退火到一起，来获得双链分子。退火的具体例子包括：将合成的单链多核苷酸以优选至少约3∶7、更优选约4∶6、最优选基本上等摩尔量(即约5∶5的摩尔比)的摩尔比混合。然后，将混合物加热到双链核酸分子解离的温度，再缓慢冷却。经退火的双链多核苷酸可以采用本技术领域公知的常用方法来纯化。纯化方法的例子包括：利用琼脂糖凝胶电泳的方法，或者其中任选地除去剩余的单链多核苷酸(例如利用适当的酶进行降解)的方法。

所述位于C12ORF48或PARP1序列侧翼的调控序列可为相同或不同的，以使得它们的表达能够独立地，或者以时间性或空间性方式被调控。所述双链分子可通过将C12ORF48或PARP1基因模板克隆入载体(例如含有来自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III转录单元或人类H1 RNA启动子的载体)以在胞内进行转录。

含有本发明双链分子的载体

本发明还包括含有一种或多种本文所述的双链核酸分子的载体、以及包含该载体的细胞。

本发明特别感兴趣的是下列载体[1]至[10]。

[1]一种载体，它编码当被导入细胞后，抑制C12ORF48或PARP1的体内表达及细胞增殖的双链分子，所述分子包含有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成所述双链分子。

[2][1]中所述的载体，它编码对mRNA作用的双链分子，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配：SEQ ID NO：5(位于SEQ ID NO：10的595-613nt)，SEQ ID NO：7(位于SEQ ID NO：10的1133-1151nt)，SEQ ID NO：8(位于SEQID NO：10的1310-1328nt)，SEQ ID NO：14(位于SEQ ID NO：10的606-624nt)和SEQ ID NO：15(位于SEQ ID NO：12的2685-2703nt)；

[3][1]中所述的载体，其中有义链包括对应于选自下组的靶序列的序列：SEQ ID NO：5、7、8、14和15；

[4][3]中所述的载体，它编码长度小于约100个核苷酸的双链分子；

[5][4]中所述的载体，它编码长度小于约75个核苷酸的双链分子；

[6][5]中所述的载体，它编码长度小于约50个核苷酸的双链分子；

[7][6]中所述的载体，它编码长度小于约25个核苷酸的双链分子；

[8][7]中所述的载体，它编码长度为约19个至约25个核苷酸的双链分子；

[9][1]中所述的载体，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；和

[10][9]中所述的载体，它编码具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′的双链分子，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：5、7和8中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个至23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含[A]的互补序列的反义链；

本发明的载体优选编码处于可表达的形式的本发明的双链核酸分子。在本说明书中，术语“处于可表达的形式”，是指该载体当被导入细胞中时，将表达该分子。在优选的实施方案中，载体包含双链分子表达所必需的调节元件。本发明的这种载体可以用于产生本发明的双链分子，也可以直接用作癌症治疗的活性成分。

本发明的载体可通过下述方法生成：例如，将C12ORF48序列克隆入表达载体中，使调控序列可操作性地连接于C12ORF48序列，以允许两条链的表达(通过DNA分子的转录)(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May，20(5)：500-5)。例如，与mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如位于被克隆的DNA的3’末端侧翼的启动子序列)转录，对mRNA而言为有义链RNA分子由第二启动子(例如位于被克隆的DNA的5’末端侧翼的启动子序列)转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默该基因的双链分子构建体。或者，使用分别编码双链分子之有义链和反义链的两个载体构建体来分别表达有义链和反义链，随后形成双链分子构建体。而且，克隆的序列可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，即，载体的单一转录物同时包含靶基因的有义序列和互补反义序列二者。

也可以配置本发明的载体使得其实现在靶细胞的基因组中的稳定插入(关于同源重组盒载体的说明，参见Thomas KR & Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12)。可以参考例如：Wolff等，Science 1990，247：1465-8；美国专利第5,580,859号、第5,589,466号、第5,804,566号、第5,739,118号、第5,736,524号、第5,679,647号和WO 98/04720。基于DNA的输送技术的例子包括：“裸DNA”、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导型)输送、阳离子脂质复合体、和粒子介导型投递(“基因枪”)或压力介导型输送(例如参照美国专利第5,922,687号)。

本发明的载体包括，例如，病毒性载体或细菌性载体。表达载体的例子包括牛痘或鸡痘等减毒病毒宿主(参照美国专利第4,722,848号)。该策略涉及例如使用牛痘病毒作为载体来表达编码双链分子的核苷酸序列。重组牛痘病毒在被导入表达靶基因的细胞时即表达该分子并由此抑制细胞的增殖。可使用的载体的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG载体在Stover等，Nature1991，351：456-60中有记载。其它多种多样的载体可用于双链分子的治疗性施用与生产，例子包括腺病毒载体和腺随伴病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。可以参照例如Shata等，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock等，J Leukoc Biol 2000，68：793-806；以及Hipp等，In Vivo 2000，14：571-85。

使用本发明双链分子抑制或降低癌细胞生长及治疗癌症的方法

在本发明中，测试了针对C12ORF48的四种不同dsRNA和针对PARP1的一种dsRNA抑制细胞生长的能力。所述四种针对C12ORF48的dsRNA(图2和7)和针对PARP1的dsRNA(图7)有效地敲低(knock down)了胰腺癌细胞系中所述基因的表达，同时亦发生了细胞增殖的阻抑。

因而，本发明提供了抑制细胞生长，即胰腺癌和前列腺癌细胞生长的方法，所述方法通过分别经抑制C12ORF48或PARP1的表达来诱导C12ORF48或PARP1基因的功能障碍。C12ORF48或PARP1基因表达可通过任何特异性地靶定C12ORF48或PARP1基因的前述本发明双链分子或可表达任何所述双链分子的本发明载体来抑制。

上述本发明双链分子及载体抑制癌性细胞的细胞生长的能力提示它们可用于治疗癌症的方法。因此，本发明提供通过施用针对C12ORF48或PARP1基因的双链分子或表达所述分子的载体来治疗罹患胰腺癌和前列腺癌患者而无不良作用的方法，因为所述基因在正常器官中几乎检测不到(图1)。

本发明特别感兴趣的是下列[1]至[36]的方法：

[1]一种用于抑制癌细胞生长和治疗癌症的方法，其中所述癌细胞或所述癌症表达至少一种C12ORF48基因，该方法包括施用至少一种在过表达C12ORF48基因的癌细胞中抑制C12ORF48表达及细胞增殖的分离的双链分子的步骤，其中所述双链分子包含有义链和与其互补的反义链，所述链彼此杂交以形成双链分子；

[2][1]的方法，其中所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配：对于C12ORF48基因，SEQ ID NO：5(位于SEQ ID NO：10的595-613nt)、SEQ ID NO：7(位于SEQ ID NO：10的1133-1151nt)、SEQ ID NO：8(位于SEQ ID NO：10的1310-1328nt)和SEQ ID NO：14(位于SEQ ID NO：10的606-624nt)，及对于PARP1，SEQ ID NO：15(位于SEQ ID NO：12的2685-2703nt)；

[3][2]的方法，其中有义链包含与选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15的靶序列对应的序列；

[4][1]的方法，其中治疗的癌症是胰腺癌和/或前列腺癌；

[5][4]的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)，而前列腺癌是去势抗性前列腺癌(CRPC)；

[6][1]的方法，其中施用多种双链分子；

[7][3]的方法，其中所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；

[8][7]的方法，其中所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；

[9][8]的方法，其中所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；

[10][9]的方法，其中所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；

[11][10]的方法，其中所述双链分子长度在大约19个与大约25个核苷酸之间；

[12][1]的方法，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；

[13][12]的方法，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个～23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含[A]的互补序列的反义链；

[14][1]的方法，其中所述双链分子是RNA；

[15][1]的方法，其中所述双链分子包含DNA和RNA；

[16][15]的方法，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；

[17][16]的方法，其中所述有义与反义链多核苷酸分别由DNA与RNA构成；

[18][15]的方法，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体；

[19][18]的方法，其中反义链3’端侧翼的区域为RNA，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均为RNA；

[20][19]的方法，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；

[21][1]的方法，其中所述双链分子包含3’突出端；

[22][1]的方法，其中所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和药学上可接受的载体。

[23][1]的方法，其中所述双链分子由载体编码；

[24][23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配：对于C12ORF48基因，SEQ ID NO：5(位于SEQ ID NO：10的595-613nt)、SEQ ID NO：7(位于SEQ ID NO：10的1133-1151nt)、SEQ ID NO：8(位于SEQ ID NO：10的1310-1328nt)和SEQ IDNO：14(位于SEQ ID NO：10的606-624nt)，及对于PARP1，SEQ ID NO：15(位于SEQ ID NO：12的2685-2703nt)；

[25][24]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链包含与选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15的靶序列对应的序列；

[26][23]的方法，其中要治疗的癌症是胰腺癌和/或前列腺癌；

[27][26]的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)，而前列腺癌是去势抗性前列腺癌(CRPC)；

[28][23]的方法，其中施用多种双链分子；

[29][25]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；

[30][29]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；

[31][30]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；

[32][31]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；

[33][32]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度在大约19个与大约25个核苷酸之间；

[34][23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；

[35][34]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个至23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含[A]的互补序列的反义链；和

[36][23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和药学上可接受的载体。

本发明方法将在下面更加详细的加以描述。

可通过将细胞与针对C12ORF48基因的双链分子、表达该分子的载体或包含同样分子的组合物接触来抑制表达C12ORF48基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞，以较低速率增殖或具有降低的存活力。细胞生长可通过本领域已知技术测定，例如使用MTT细胞增殖测定。

任何细胞的生长均可根据本方法进行阻抑，只要所述细胞表达或过表达本发明所述双链分子的靶基因。可作为例子的细胞包括胰腺癌或前列腺癌细胞，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)或去势抗性前列腺癌(CRPC)。

因此，对于正罹患或有危险罹患涉及C12ORF48的疾病的患者，可通过施用至少一种本发明双链分子、表达至少一种所述分子的载体或包含至少一种所述分子的组合物进行治疗。举例而言，罹患胰腺癌或前列腺癌的患者可根据本发明的方法进行治疗。癌症类型可通过根据所诊断的特定类型肿瘤的标准方法进行鉴定。优选地，用本发明所述方法治疗的患者是用这样的方法选出的：在来自患者的活检物中通过RT-PCR或免疫测定法检测C12ORF48的表达。优选地，在本发明的治疗之前，对于来自受试者的活检标本通过本领域所知的方法，例如，免疫组织化学分析或RT-PCR，证实C12ORF48基因的过表达。

根据本发明的方法，为抑制癌细胞生长并藉此治疗癌症，通过施用多种所述双链分子(或表达同样分子的载体或含有同样分子的组合物)，每个所述分子可具有不同结构，但作用于与C12ORF48或PARP1的相同靶序列匹配的mRNA。或者，多种双链分子可作用于与相同基因内的不同靶序列匹配的mRNA。或者，举例而言，所述方法可使用针对C12ORF48或PARP1的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

为抑制细胞生长，本发明的双链分子可直接以可实现该分子与对应mRNA转录物结合的形式导入细胞。另外，如上所述，编码双链分子的DNA可作为载体导入细胞。为将双链分子和载体导入细胞，可使用转染增强剂，例如FuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)与Nucleofector(Wako pure Chemical)。

当治疗导致临床效益，诸如受试者中C12ORF48基因表达的减少、癌症的尺寸、患病率(prevalence)、转移潜力的降低等，则可以认为该治疗是“有效”的。当预防性地适用治疗时，“有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来确定有效性。

以本发明的方法和组合物有用于“预防”和“防范”的语境为限，这些术语在本文中可互换使用，指降低源自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病的进展与症状的出现、以及通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来降低已建立的疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范可包括旨在减轻特定病症的严重性(例如降低肿瘤的增殖和转移等)的广泛的预防性疗法。

治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，构成有效治疗和/或预防的症状减轻或改善包括10％、20％、30％或更多降低，或病情稳定。

应理解，本发明的所述双链分子降解亚化学计量的C12ORF48或PARP1mRNA。虽不愿拘于任何理论，认为本发明的所述双链分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，与常规的癌症疗法相比，本发明为实施治疗效应而需要输送到癌症的位置或其附近的双链分子要少得多。

本领域技术人员在考虑了受试者的体重、年龄、性别、疾病类型、症状及其它条件、施用途径、以及是局部施用还是全身施用等因素的基础上，能够容易地确定本发明的双链分子的有效量。一般而言，本发明双链分子的有效量是在癌症部位或其附近胞内浓度为大约1纳摩尔(nM)到约100nM，优选大约2nM到大约50nM，更优选大约2.5nM到大约10nM。考虑可施用更多或更少量的双链分子。本领域一般技术人员可方便地及常规地确定特定情况下所需的确切剂量。

为了治疗癌症，还可以将本发明的双链分子与不同于所述双链核酸分子的药剂组合来施用于受试者。或者，本发明的双链核酸分子还可以与其它旨在用于癌症治疗的治疗方法组合来施用于患者。举例而言，本发明所述双链分子可与现在用于治疗癌症或预防癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法，外科手术，以及使用化疗剂，如顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)等的治疗)组合施用。

在本发明的方法中，双链分子可以以裸双链分子的形式、与投递试剂相组合的形式、或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。

用于与本发明的双链核酸分子组合施用的合适的投递试剂包括MirusTransit TKO脂溶性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。一种优选的投递试剂是脂质体。

脂质体能够帮助将双链分子投递至特定的组织如胰腺或前列腺肿瘤组织中，还能够增加双链分子的血中半衰期。适合在本发明的语境中使用的脂质体可以是由常规的囊泡形成性脂质(vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂，以及甾醇，诸如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，如期望的脂质体大小以及在血流中的脂质体的半衰期等。有多种制备脂质体的方法是公知的，例如Szoka等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9：467；美国专利第4,235,871号；第4,501,728号；第4,837,028号；第5,019,369号；它们全部援引并入本说明书。

优选地，包被本发明的双链分子的脂质体包含能够将脂质体输送至癌症部位的配体分子。优选的配体是与肿瘤或血管内皮细胞中常见的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原结合的单克隆抗体

特别优选地，包被本发明的双链分子的脂质体经过了修饰以免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除，例如，由于其结构的表面结合有调理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制部分和配体。

用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如在本说明书中所使用的，例如，当调理作用抑制部分化学地或物理地搭接在脂质体膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)插入膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，该表层显著地减少巨噬-单核细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(”RES”)对脂质体的摄入；在例如美国专利第4,920,016号中对此有记载，后者的全部公开内容援引并入本说明书。因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制部分修饰过的脂质体能够保留在循环中的时间显著更长。出于以上理由，这样的脂质体有时也被称为“隐形”(stealth)脂质体。

已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管系统供给的组织中。因此，在以这样的微血管系统缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率地蓄积。参见Gabizon等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18：6949-53。此外，由于RES的摄入的减少，防止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的本发明的脂质体能够将本发明的双链分子输送至肿瘤细胞。

适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选为分子量约500～约40,000道尔顿、更优选约2,000～约20,000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalcohol)，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM₁。PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通过与碳酸的衍生物反应而生成了羧基结合的羧基化多糖类或寡糖。

优选地，调理作用抑制部分为PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。

调理作用抑制部分可以通过许多公知技术中的任何一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na(CN)BH₃和混合溶剂，如60℃的四氢呋喃与水的30∶12比例混合物。

上文讨论了表达本发明的双链分子的载体。这样的表达至少一种本发明的双链分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂组合施用，所述合适的投递试剂包括Mirus Transit LT1亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体。将表达本发明的双链核酸分子的重组病毒载体输送到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。

本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链核酸分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。

合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、与鼻内递送。

合适的非消化道施用途径包括膀胱内和血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。

本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。优选的是将药剂直接注射到癌症部位或其附近的组织中。特别优选的是将药剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。

本领域技术人员可以容易地确定对给定的受试者施用本发明的双链分子的合适的剂量方案。例如，双链分子可以一次性施用给受试者，例如以单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或其附近。或者，可以在约3～约28日、更优选约7～约10日的期间内将双链分子每日一次或二次地施用给受试者。在优选的剂量方案中，双链分子可以在7日期间内一日一次地注射到癌症部位或其附近。当剂量方案包括多次施用时，应该理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量，可以包含在整个剂量方案中施用的该双链分子的总量。

包含本发明双链分子的组合物

除上述外，本发明亦提供了包含至少一种本发明的双链分子或编码该分子的载体的药物组合物。本发明特别感兴趣的是下述[1]至[36]的组合物：

[1]一种用于抑制癌细胞生长并治疗癌症的组合物，其中所述癌症与癌细胞表达至少一种C12ORF48或PARP1基因，所述组合物包括至少一种分离的抑制C12ORF48或PARP1表达以及细胞增殖的双链分子，且其中该分子包括有义链和与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链分子；

[2][1]中的组合物，其中所述双链分子作用于mRNA，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配：对于C12ORF48基因，SEQ ID NO：5(位于SEQ ID NO：10的595-613nt)、SEQ ID NO：7(位于SEQ ID NO：10的1133-1151nt)、SEQ IDNO：8(位于SEQ ID NO：10的1310-1328nt)和SEQ ID NO：14(位于SEQ IDNO：10的606-624nt)，及对于PARP1，SEQ ID NO：15(位于SEQ ID NO：12的2685-2703nt)；

[3][2]的组合物，其中所述双链分子，其中有义链包含与选自下组的靶序列相应的序列：SEQ ID NO：5、7、8、14和15；

[4][1]的组合物，其中需治疗的癌症是胰腺癌和/或前列腺癌；

[5][4]的组合物，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)，而前列腺癌是去势抗性前列腺癌(CRPC)；

[6][1]的组合物，其中所述组合物包含多种所述双链分子；

[7][3]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；

[8][7]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；

[9][8]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；

[10][9]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；

[11][10]的组合物，其中所述双链分子长度在大约19个与大约25个核苷酸之间；

[12][1]的组合物，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；

[13][12]的组合物，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15中的靶序列对应的序列的有义链序列，[B]为由3个～23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与[A]互补的序列的反义链；

[14][1]的组合物，其中所述双链分子是RNA；

[15][1]的组合物，其中所述双链分子是DNA和/或RNA；

[16][15]的组合物，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；

[17][16]的组合物，其中所述有义链多核苷酸与反义链多核苷酸分别由DNA与RNA组成；

[18][15]的组合物，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体；

[19][18]的组合物，其中反义链3’端侧翼的区域由RNA构成，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均由RNA构成；

[20][19]的组合物，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；

[21][1]的组合物，其中所述双链分子包含3’突出端；

[22][1]的组合物，其中所述组合物包括转染增强剂和药学上可接受的载体。

[23][1]的组合物，其中所述双链分子由载体编码并包含于组合物中；

[24][23]中的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子作用于mRNA，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配：对于C12ORF48基因，SEQ IDNO：5(位于SEQ ID NO：10的595-613nt)、SEQ ID NO：7(位于SEQ ID NO：10的1133-1151nt)、SEQ ID NO：8(位于SEQ ID NO：10的1310-1328nt)和SEQ IDNO：14(位于SEQ ID NO：10的606-624nt)，及对于PARP1，SEQ ID NO：15(位于SEQ ID NO：12的2685-2703nt)；

[25][24]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链包含与选自下组的靶序列相应的序列：SEQ ID NO：5、7、8、14和15；

[26][23]的组合物，其中需治疗的癌症是胰腺癌或前列腺癌；

[27][26]的组合物，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)，而前列腺癌是去势抗性前列腺癌(CRPC)；

[28][23]的组合物，其中施用多种所述双链分子；

[29][25]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；

[30][29]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；

[31][30]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；

[32][31]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；

[33][32]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度在大约19个与大约25个核苷酸之间；

[34][23]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链二者；

[35][23]的组合物，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个～23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与[A]互补的序列的反义链；和

[36][23]的组合物，其中所述组合物包含转染增强剂和药学上可接受的载体。

本发明合适的组合物将在下面更加详述地加以描述。

本发明的所述双链分子优选在施用于受试者之前根据本领域众所周知的技术配制为药物组合物。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。本文中所使用的“药物配制剂”包括适用于人类与兽医用的配制剂。制备本发明药物组合物的方法属于本领域一般技术，例如，描述于Remington′sPharmaceutical Science，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1985)，其全部公开内容通过引用包含于本文中。

本发明的药物配制剂包含至少一种本发明的双链分子或编码它们的载体(例如，以重量计0.1％到90％)，或所述分子的生理学上可接受的盐，与生理上可接受的载体介质混合。生理学上可接受的载体介质优选水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸及类似物。

根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，其中每一个均可针对C12ORF48或PARP1的相同或不同的靶序列。举例而言，所述组合物可包含针对C12ORF48或PARP1的双链分子。或者，例如，所述组合物可包含针对C12ORF48或PARP1的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

而且，本组合物可以包含编码1个或多个双链分子的载体。例如，所述载体可以编码1种、2种或数种本双链核酸分子。或者，本组合物可以包含多种载体，而各载体编码不同的双链分子。

而且，本双链核酸分子可以作为脂质体的形式包含在本组合物中。脂质体的具体情况可以参照“使用双链分子治疗癌症的方法”项。

本发明的药物组合物中还可以包含常规的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和pH调节剂。合适的添加剂包括：生理学生物相容性的缓冲剂(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。

对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体：例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95％，优选25-75％的本发明的一种或多种双链分子。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以包含0.01-20重量％、优选1-10重量％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。

除上述之外，本组合物中还可以包含其它药学活性成分，只要它们不抑制本发明双链分子的体内功能。例如，上述组合物中可以包含常规用于治疗癌症的化疗药物。

在其它实施方案中，本发明提供本发明的双链核酸分子在制备用于治疗以表达C12ORF48为特征的胰腺癌和前列腺癌的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及下述双链核酸分子在制备用于治疗表达C12ORF48的胰腺癌和前列腺癌的药物组合物中的用途：该分子在细胞内抑制C12ORF48或PARP1基因的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15的序列为靶标。

本发明还提供生产用于治疗以表达C12ORF48为特征的胰腺癌或前列腺癌的药物组合物的方法或工艺。该方法或工艺包括将药学或者生理学可接受的载体与作为活性成分的下述双链核酸分子一起制剂化的步骤，其中所述双链核酸分子抑制过表达C12ORF48或PARP1基因的细胞内C12ORF48或PARP1的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15的序列为靶标。

在另一个实施方案中，本发明提供生产用于治疗以表达C12ORF48为特征的胰腺癌和前列腺癌的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将活性成分与药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤，其中所述活性成分是这样的双链核酸分子，其在过表达C12ORF48或PARP1基因的细胞中抑制C12ORF48或PARP1的表达，该分子包含有义链与与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链核酸分子，并以选自SEQ ID NO：5、7、8、14和15的序列为靶标。

本发明的样态在下述实施例中加以描述，它们并无意对权利要求中描述的本发明范围进行限定。

除非另行定义，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域一般技术人员通常理解的意义相同。下面描述了合适的方法和材料，虽然与在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于实践或测试本发明。

实施例

本发明将于下列实施例中进一步加以描述，其并不对权利要求中描述的本发明范围构成限定。

通用方法

1.细胞系

PDAC细胞系KLM-1，SUIT-2，KP-1N，PK-1，PK-45P和PK-59来自日本东北大学的生物医学研究细胞资源中心(Cell Resource Center for BiomedicalResearch，Tohoku University，Sendai，Japan)。MIAPaCa-2和Panc-1购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD)。COS7细胞和PC细胞系LNCaP，22Rv1，PC-3和DU-145也购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)，而LNCaP衍生的CRPC细胞系C4-2B购自ViroMed Laboratories(Minnetonka，MN)。KLM-1，SUIT-2，PK-1，PK-45P，PK-59和Panc-1在RPMI1640(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培养，而COS7，MIAPaCa-2，LNCaP，C4-2B，22Rv1，PC-3，和DU-145在Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(Sigma-Aldrich)中培养，培养基均含有10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma-Aldrich)。细胞保持在37摄氏度下含5％CO₂的湿润空气中。

2.半定量RT-PCR

来自冷冻PDAC或CAPC组织的癌细胞和正常上皮细胞的纯化如前人记载(Nakamura T，et al.，Oncogene 2004；23：2385-400，Tamura K，et al.，CancerRes 2007；67：5117-25)。使用基于T7的体外转录(Epicentre Technologies，Madison，WI)对来自纯化的癌细胞和正常上皮细胞的RNA进行两轮RNA扩增。使用Trizol试剂(Invitrogen)依照制造商的推荐自人癌细胞系提取总RNA。将提取的RNA用DNA酶I(Roche Diagnostic，Mannheim，Germany)处理，并使用寡(dT)引物及Superscript II逆转录酶(Invitrogen)逆转录成单链cDNA。准备适宜稀释度的每种单链cDNA以进行后续PCR扩增，监测β-肌动蛋白(ACTB)作为定量对照。引物序列组为

用于ACTB的5′-TTGGCTTGACTCAGGATTTA-3′(SEQ ID NO：1)和

反向5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3′(SEQ ID NO：2)，

用于C12ORF48的5′-CTCAGCTGGGAAAGCTACAGAT-3′(SEQ ID NO：3)和5′-CATGCCAGGTAGTTCTTCCATC-3′(SEQ ID NO：4)。所有反应均包括初始变性94摄氏度2分钟，接着是23个循环(对于ACTB)、28个循环(对于C12ORF48)的94摄氏度30秒、58摄氏度30秒、和72摄氏度1分钟，在GeneAmpPCR系统9700(PE Applied Biosystems，Foster，CA)上进行。

3.Northern印迹分析

将来自七种PDAC细胞系(KLM-1，PK-59，PK-45P，MIAPaCa-2，Panc-1，PK-1，和SUIT-2)和七种成年正常组织(心，肺，肝，肾，脑，睾丸，和胰，来自BD Bioscience，Palo Alto，CA)的1ug polyA+RNA印迹到膜上。对于前列腺癌，将来自五种PC细胞系(22Rv1，LNCaP，C4-2B，DU145，和PC-3)和六种成年正常组织(心，肺，肝，肾，脑，和前列腺，来自BD Bioscience，Palo Alto，CA)的1ug polyA+RNA印迹到膜上。将这些Northern印迹膜和人MTN印迹膜(多组织Northern印迹，BD Bioscience)与32P标记的GABRP探针(其使用Mega Label试剂盒(GE Healthcare，Piscataway，NJ)标记)杂交16小时。使用上文所述用于C12ORF48的引物，制备C12ORF48的探针cDNA，其为305-bp PCR产物。预杂交、杂交、和清洗依照制造商的指示来实施。将印迹于-80摄氏度放射自显影10天。

4.对C12ORF48特异性的小干扰RNA(siRNA)表达载体

为了敲低PDAC细胞中的内源C12ORF48表达，使用psiU6BX3.0载体来表达针对靶基因的短发夹RNA，如先前所述(Tamura K，et al.，Cancer Res2007；67：5117-25)。将U6启动子克隆到基因特异性序列(来自靶转录物的19-nt序列，以短间隔序列TTCAAGAGA与该序列的反向互补物分开)上游，有五个胸苷作为终止信号及neo盒用于遗传霉素(Sigma-Aldrich)选择。C12ORF48的靶序列为5′-CACAGTATCTCCTAGTCAA-3′(#595)(SEQ ID NO：5)、5′-CATGCTGCTCGAGAGAAAC-3′(#851)(SEQ ID NO：6)、5′-GTTGCTCAGGATTTGGATT-3′(#1133)(SEQ ID NO：7)、5′-GCAGCTAATGCTCCTACCA-3′(#1310)(SEQ ID NO：8)，和5′-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3′(siEGFP)(SEQ ID NO：9)作为阴性对照。

将人PDAC细胞系PK-59和MiaPaCa2涂布到10-cm皿上，并使用FuGENE6(Roche)依照制造商的指令用这些siRNA表达载体转染，接着用150ug/ml(对于PK-59)或800ug/ml(对于MiaPaCa2)遗传霉素(GIBCO)进行选择。7天后自10-cm皿收获细胞以使用上述引物通过RT-PCR分析对C12ORF48的敲低效果。在含有遗传霉素的适宜培养基中培养2周后，将细胞用100％甲醇固定，用0.1％结晶紫-H₂O染色，进行集落形成测定。在MTT测定中，在转染后6天使用细胞计数试剂盒-8(DOJINDO，Kumamoto，Japan)测量细胞存活力。用微量板读数仪550(Bio-Rad，Hercules，CA)测量490nm和作为参照的630nm处的吸光度。

5.免疫细胞化学

使用Fugene(Roche)依照制造商的推荐规程用带HA标签的C12ORF48表达载体转染COS7细胞，并在处理后72小时将细胞用4％多聚甲醛固定，并用含0.1％Triton X-100的PBS于室温透化1分钟。通过用含有3％BSA的PBS于室温处理30分钟来封闭非特异性结合。将细胞与在含有1％BSA的PBS中稀释(1∶1,000)的家兔抗HA抗体(3F10，Roche)一起温育于室温60分钟。用PBS清洗后，将细胞用缀合有FITC的二抗(Santa Cruz)于室温染色60分钟。用PBS清洗后，将标本用含有4′，6′-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的VECTASHIELD(VECTOR Laboratories，Inc，Burlingame，CA)封固，并用Spectral ConfocalScanning Systems(Leica，Bensheim，Germany)显现。

6.对C12ORF48蛋白特异性的抗体的生成和免疫组织化学染色

质粒设计成使用pET21a(+)载体以与N端的T7标签和C端的组氨酸(His)标签符合读码框的方式(Novagen，Madison，WI，USA)表达两种C12ORF48片段(密码子1-150和328-498)。在大肠杆菌BL21 codon-plus菌株(Stratagene，LaJolla，CA，USA)中表达这两种重组蛋白，并使用Ni-NTA树脂琼脂糖(Qiagen，Valencia，CA，USA)依照供应商的方案来纯化。将纯化的重组蛋白混合在一起，然后用于免疫家兔。随后使用Affigel 15凝胶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)依照供应商的指令在抗原亲和柱上纯化免疫血清。从手术标本(在恰当的知情同意下在大阪癌症和心血管疾病医学中心切除)获得来自PDAC的常规组织切片。将切片脱石蜡，并于108摄氏度在柠檬酸盐缓冲液pH6.0中高压灭菌15分钟。通过在过氧化物酶封闭试剂(Dako Cytomation，Carpinteria，CA，USA)中温育30分钟来淬灭内源过氧化物酶活性。在为了封闭而在胎牛血清中温育后，将切片与家兔抗C12ORF48多克隆抗体(1∶2500稀释)一起于室温温育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗后，用过氧化物酶标记的抗家兔免疫球蛋白(Envision kit；Dako Cytomation)实施免疫检测。最后，用3，3′-二氨基联苯胺对反应物显色。使用苏木精实施复染色。

7.C12ORF48相互作用蛋白的免疫沉淀和质谱分析

使用FuGENE6(Roche)将pCAGGSn3xFlag-C12ORF48-HA或空pCAGGSn3FH模拟转染入HEK293细胞。转染后48小时，收集细胞并在溶胞缓冲液(50mmol/L Tris-HCl[pH 8.0]，0.4％NP-40，150mmol/L NaCl，蛋白酶抑制剂混合物集III[Calbiochem，San Diego，CA，USA])中裂解。将细胞提取物与60ul CL-4B Sepharose(Sigma)一起于4摄氏度温育1小时，以将其预澄清。离心后，将上清液与30ul抗FLAG M₂-琼脂糖(Sigma)一起于4摄氏度温育1小时。然后通过以8,000rpm离心2分钟来收集珠子，并用1mL免疫沉淀缓冲液清洗5次。将蛋白质在5％至20％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)中分开，并用银染色试剂盒染色。切出在经C12ORF48转染的细胞提取物中特异性出现的蛋白质条带，并通过液体层析-质谱(LC-MS/MS)分析来分析。

将切出的条带在含50mM碳酸氢铵(Sigma)的10mM三(2-羧乙基)膦(Sigma)中于37摄氏度还原30分钟，并在含50mM碳酸氢铵的50mM碘乙酰胺(Sigma)中在黑暗中于25摄氏度烷基化45分钟。添加猪胰蛋白酶(Promega，SanLuis Obispo，CA)至最终的酶对蛋白质比为1∶20。消化于37摄氏度进行16小时。将所得肽混合物在100umx150mm HiQ-Sil C18W-3柱(KYA Technologies，Tokyo，Japan)上分开，使用0.1％三氟乙酸(TFA)中5.4至29.2％乙腈的30分钟线性梯度，总流速300nl/min。将洗脱的肽与基质溶液(4mg/ml α-氰基-4-羟基-肉桂酸(SIGMA)，0.08mg/ml柠檬酸铵，在70％乙腈，0.1％TFA中)自动混合，并通过MaP(KYA Technologies)点到MALDI靶盘上。在4800 PlusMALDI/TOF/TOF分析仪(Applied Biosystems/MDS Sciex)上实施质谱分析。由Protein Pilot 2.0.1版软件(Applied Biosystems/MDS Sciex)生成MS/MS峰表，并输出至本地MASCOT搜索引擎2.2.03版(Matrix Science)以进行蛋白质数据库搜索。

为了确认C12ORF48与PARP1蛋白之间的相互作用，将Flag-C12ORF48表达载体和/或PARP1-Myc表达载体共转染入HEK 293细胞中。如上所述裂解经过转染的细胞，并用c-Myc抗体(Santa Cruz)进行免疫沉淀。使用抗Flag抗体(Sigma)和c-Myc抗体对共沉淀的蛋白质进行免疫印迹。

8.流式细胞术

KLM-1细胞分别用C12ORF48 siRNA双链体(5′-CUAGUCAACUACUGGAUUU-3′)(SEQ ID NO：14)、PARP1 siRNA双链体(5′-GAUAGAGCGUGAAGGCGAA-3′)(SEQ ID NO：15)、和siEGFP双链体(5′-GAAGCAGCACGACUUCUUC-3′)(SEQ ID NO：9)(作为阴性对照)转染。处理后72小时，将细胞用胰蛋白酶处理，收集，用含70％乙醇的PBS于4摄氏度固定，在PBS中漂洗2次，并与含有0.5mg经煮沸的RNA酶的500ul PBS一起于37摄氏度温育30分钟。将细胞在含有25ug碘化丙锭的500ul PBS中染色。借助流式细胞仪(Beckman Coulter)自至少2x10⁴个细胞测定每种群体中sub-G1核(凋亡细胞)的百分比。

9.体外PARP-1自身多(ADP-核糖基)化测定

如先前所述(10)实施体外PARP1自修饰测定。简言之，将200ng纯化的C12ORF48重组蛋白和25ng重组人PARP1(Alexis)在结合缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM DTT)加10ug/ml经超声处理的DNA中于37摄氏度温育10分钟。反应通过添加5uCi(0.25uM)³²P标记的NAD+来启动，并于37摄氏度再温育10分钟。用SDS样品缓冲液终止反应后，将蛋白质通过8％SDS-PAGE凝胶来分级。多(ADP-核糖基)化蛋白通过放射自显影来显现。

10.细胞提取物中的PARP活性

KLM-1和SUIT-2用C12ORF48-siRNA、PARP1-siRNA、或siEGFP(作为对照)转染，并在转染后72小时收集。使用抗C12ORF48抗体和抗PARP1抗体(TREVIGEN，Gaithersburg，MD)的Western印迹分析确认了它们的表达对KLM-1和SUIT-2细胞的敲低效果。使用通用比色PARP测定试剂盒(TREVIGEN)基于生物素化ADP-核糖在组蛋白H1蛋白上的掺入来测定细胞提取物中的PARP1活性。将细胞提取物加载到经组蛋白和生物素化多ADP-核糖包被的96孔板中，容许温育1小时，用strep-HRP处理，并在分光光度计中于450nm读数。还使用抗多(ADP-核糖)(PAR)小鼠单克隆亲和纯化抗体(TREVIGEN)来确认PARP1酶活性。将25ug细胞提取物或5ng重组人PARP1(TREVIGEN)在结合缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM DTT)加10ug/ml经超声处理的DNA和200uM NAD+(Sigma)中于37摄氏度温育20分钟。

结果

PDAC细胞和PC细胞中C12ORF48的过表达

在我们通过对PDAC细胞(Nakamura T，et al.，Oncogene 2004；23：2385-400)和CRPC细胞(Tamura K，et al.，Cancer Res 2007；67：5117-25)的基因组范围cDNA微阵列分析筛选的数十种反式激活的基因中，本发明人聚焦于C12ORF48。通过RT-PCR在9种显微解剖的PDAC细胞群中的5种(图1A)和5种显微解剖的CRPC细胞群中的2种(图1B)中确认了C12ORF48过表达。使用C12ORF48 cDNA片段作为探针的Northern印迹分析只在睾丸中鉴定出约4-kb的转录物，但是在任何其它器官(包括肺、心、肝、肾、和脑)中没有观察到表达(图1C)。还检查了多种PDCA细胞系(图1D)和前列腺癌细胞系(图1E)中的C12ORF48表达，而且明显发现了它们在被检查的多种PDAC或前列腺癌细胞系中的表达。

C12ORF48-siRNA对癌细胞生长的影响

为了调查C12ORF48表达在癌细胞中的生物学意义，构建了四种对C12ORF48转录物特异性的siRNA表达载体，并转染入内源表达高水平C12ORF48的PDAC细胞系MiaPaCa2或PK-59细胞。当转染si#595(靶序列：SEQ ID NO：5)、si#1133(靶序列：SEQ ID NO：7)、和si#1310(靶序列：SEQ IDNO：8)时通过RT-PCR观察到敲低效果，但是在si#851(靶序列：SEQ ID NO：6)或阴性对照siEGFP(靶序列：SEQ ID NO：9)的情况中没有(图2A左边)。使用MiaPaCa2的集落形成和MTT测定法(图2B，2C左边)揭示了与没有观察到敲低效果的si#851和siEGFP相比，经si#595、si#1133、和si#1310转染的细胞数显著减少。当将这些siRNA表达载体转染入PK-59细胞时获得了相似的结果(图2A，B和C，右边)。

C12ORF48蛋白定位在核中

C12ORF48蛋白没有任何预测的重要基序或域，但是计算机(in silico)分析预测它定位在核中。为了确认它的细胞内定位，将C12ORF48表达载体转染入COS7细胞中(图3A)，并使用抗HA标签抗体实施了免疫细胞化学分析。如图3B所示，免疫细胞化学分析清楚地显示了外源C12ORF48蛋白定位在核中，这提示它牵涉染色质或DNA结构。为了检查它在蛋白水平的表达，我们生成了对C12ORF48蛋白特异性的多克隆抗体，并实施了Western印迹分析，在我们检查的所有PDAC细胞系中的大多数中检测到内源C12ORF48(图3C)。PDAC细胞系中的C12ORF48表达高于非癌性细胞系(HEK-293和COS7)。还使用临床PDAC组织切片实施了免疫组织化学分析，发现了它在PDAC细胞的核中的强烈阳性染色(图3D中的小图C1-C2)，而在正常胰组织中没有检测到染色或检测到很有限的染色(图3D中的N)。总的来说，62份PDAC组织中的33份(53％)显示出C12ORF48的阳性染色。

PARP1作为C12ORF48相互作用蛋白的鉴定

由于完全不知道C12ORF48的生物学功能，通过免疫沉淀和质谱分析来搜索与C12ORF48相互作用的蛋白质。提取经C12ORF48-Flag-表达载体或空载体(模拟对照)转染的HEK293细胞的溶胞物，并用抗Flag M₂-琼脂糖进行免疫沉淀。将免疫沉淀的蛋白复合物在SDS-PAGE凝胶上进行银染色。在经带Flag标签的C12ORF48质粒转染的细胞溶胞物的共沉淀物中观察到大约110kD的蛋白，但是在模拟对照质粒中没有(图4A)，我们提取了此110kD条带供LC-MS/MS分析。质谱分析将PARP1鉴定为与C12ORF48相互作用的候选蛋白。此结果得到了使用抗PARP1抗体的Western印迹分析的确认(图4B)。另外，为了确认它们的物理相互作用，将带Myc标签的PARP1表达载体和/或带Flag标签的C12ORF48表达载体转染入HECK293中，相反地，使用抗Myc抗体实施免疫沉淀，然后使用抗Flag抗体对沉淀物进行免疫印迹。结果显示C12ORF48与PARP1共沉淀(图4C)。

寡C12ORF48-siRNA双链体或寡PARP1-siRNA双链体对凋亡的诱导

FACS分析检测到，与经对照siRNA转染的细胞相比，经C12ORF48-siRNA(图5A)或PARP1-siRNA(图5B)转染的KLM-1细胞中有更大比例的subG1群体。当在其它PDAC SUIT-2细胞中敲低它们时也观察到相似的结果(数据未显示)。

C12ORF48能在体外正调节PARP1的自修饰

PARP1能多(ADP-核糖基)化的主要蛋白是PARP1自身。为了调查PARP1和C12ORF48之间相互作用的功能后果，在有或无纯化的C12ORF48蛋白存在下，通过[³²P]NAD+掺入来测量PARP1自修饰，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来显现。如图6所示，与C12ORF48蛋白不存在下相比，PARP1自修饰在C12ORF48蛋白存在下显著增强。

C12ORF48能调节癌细胞提取物中的PARP1活性

为了调查癌细胞中C12ORF48对PARP1的活性的功能意义，使用比色PARP测定法基于生物素化ADP-核糖到组蛋白H1蛋白上的掺入来检查经C12ORF48-siRNA、PARP1-siRNA、和对照siRNA转染的细胞提取物中的PARP1活性。首先，确认了将针对C12ORF48或PARP1的siRNA双链体转染入KLM-1细胞中降低了它们的蛋白表达(图7A)。比色PARP测定法发现了经C12ORF48-siRNA或PARP1-siRNA转染的KLM-1细胞提取物中PARP1多(ADP-核糖基)化组蛋白H1的活性与对照-siRNA相比分别降低了59.2％和55.5％(图7B)。还观察到C12ORF48或PARP1敲低的其它PDAC细胞系SUIT-2细胞中的PARP1活性分别降低了65.2％和47.1％(图7C，D)。另外，使用抗多(ADP-核糖)(PAR)抗体的Western印迹分析也确认了C12ORF48或PARP1敲低的细胞提取物中的PARP1活性显著降低(图7E)。这些发现指示C12ORF48能调节PARP1对组蛋白H1和其它靶蛋白(包括PARP1自身)的多-(ADP-核糖基)化活性。接下来，在HEK293细胞中过表达C12ORF48，并通过比色PARP测定法检查PARP活性。以时间依赖性方式诱导外源C12ORF48表达(图8A)，与C12ORF48表达一致，HECK293细胞提取物中的PARP1活性也以时间依赖性方式得到增强(图7B，P＜0.0001，相对模拟转染)。总之，我们的发现提示C12ORF48在体内和在体外都能够正调节PARP1酶活性。

讨论

在本发明中，经由微阵列分析鉴定出一种新的靶基因即C12ORF48在PDAC细胞和CRPC细胞中过表达，而且通过RT-PCR确认了它在PDAC细胞和CRPC细胞中的过表达。由于它的表达在成年正常器官中限于睾丸，C12ORF48看来是具有最低限度的不良作用的新治疗途径的一种适宜和有希望的分子靶。另外，胰腺癌细胞系中siRNA对内源C12ORF48的功能性敲低导致对胰腺癌细胞生长的显著阻抑，提示它在维持癌细胞存活力中的至关重要作用。

本发明人发现C12ORF48能与多(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP1)相互作用。PARP1，仅次于组蛋白的最丰富的核蛋白，拥有催化ADP-核糖单元作为ADP-核糖的单体、寡聚体、或多聚体形式自供体NAD+分子转移至靶蛋白的内在酶活性。PARP1介导染色质松弛及激活可诱导基因的转录。迄今为止，众所周知PARP1在DNA修复、细胞死亡途径、染色体重塑、等等中发挥至关重要作用。然而，关于PARP1在基因组完整性得到维持的生理条件下的染色质依赖性基因调节活性知道的相当少。

这些结果还一起提示C12ORF48和PARP1都是核蛋白。C12ORF48能在体外正调节PARP1自修饰。另外，阻抑C12ORF48蛋白能降低癌细胞提取物中的PARP1活性，不仅降低多(ADP-核糖基)化组蛋白H1的活性，而且降低对其它靶(包括PARP1自身)的。另外，发明人还调查了C12ORF48的过表达能增强细胞提取物中的PARP1活性活性。所有这些数据暗示C12ORF48可能经由调节PARP1活性而涉及DNA修复、转录调节、染色质修饰、和细胞信号传导。

工业应用性

在此描述的利用激光捕捉解剖与基因组范围eDNA微阵列的组合进行的癌症基因表达分析已将C12ORF48鉴定为用于癌症预防和治疗的靶基因。根据其差异表达，本发明确认了C12ORF48作为用于鉴定和检测癌症，特别是胰腺和前列腺癌的分子诊断标志物的效用。

本文所提供的数据增加了对癌症的全面了解，促进了新诊断策略的开发，并提供了鉴定治疗性药物和预防性药剂的分子靶的线索。这些信息有助于更深刻的了解肿瘤发生，并提供了开发用于诊断、治疗和最终预防癌症的新策略的指标。

以提述方式完整收入本文中所引用的所有专利、专利申请和出版物。

此外，尽管本发明已经参考具体实施方案进行了详细描述，应当了解，上文描述本质上是例示性和解释性的，意图例示本发明及其优选实施方案。通过常规实验，本领域技术人员将容易的认识到可以在不背离本发明的精神和范围的前提下对本发明进行多种改变和修饰。如此，本发明意图以所附权利要求及其等同方案来进行限定，而非上文描述。

Claims (35)

1.一种检测或诊断受试者中的癌症的方法，包括测定源自受试者的生物样品中C12ORF48基因的表达水平，其中所述水平与基因的正常对照水平相比的升高指示受试者患有或有风险发生癌症，其中所述表达水平是通过选自下组的任一方法测定的：

(a)检测C12ORF48基因的mRNA，

(b)检测由C12ORF48基因编码的蛋白；和

(c)检测由C12ORF48基因编码的蛋白的生物学活性。

2.权利要求1的方法，其中所述升高是比所述正常对照水平高至少10％。

3.权利要求1的方法，其中源自患者的生物样品为活检物。

4.权利要求1的方法，其中癌症选自下组：胰腺癌和前列腺癌。

5.权利要求4的方法，其中胰腺癌为胰腺导管腺癌，而前列腺癌为去势抗性前列腺癌。

6.一种用于诊断癌症的试剂盒，其包括选自下组的试剂：

(a)用于检测C12ORF48基因的mRNA的试剂；

(b)用于检测由C12ORF48基因编码的蛋白的试剂；和

(c)用于检测由C12ORF48基因编码的蛋白的生物学活性的试剂。

7.权利要求6的试剂盒，其中所述试剂是针对所述基因的基因转录物的探针。

8.权利要求6的试剂盒，其中所述试剂是针对由所述基因编码的蛋白的抗体。

9.一种筛选用于治疗或预防与C12ORF48基因过表达有关的癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，该方法包括下列步骤：

(a)使测试化合物与由C12ORF48基因编码的多肽接触；

(b)检测所述多肽与测试化合物之间的结合活性；并

(c)选择结合所述多肽的化合物。

10.一种筛选用于治疗或预防与C12ORF48或PARP1基因过表达有关的癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，该方法包括下列步骤：

(a)使测试化合物与表达C12ORF48基因的细胞接触；并

(b)选择降低C12ORF48基因的表达水平的化合物。

11.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，该方法包括下列步骤：

(a)使测试化合物与由C12ORF48编码的多肽接触；

(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；并

(c)选择与在所述测试化合物不存在下检测到的生物学活性相比遏制多肽的生物学活性的化合物。

12.权利要求11的方法，其中所述生物学活性为细胞增殖活性。

13.一种筛选用于治疗或预防与C12ORF48基因过表达有关的癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，该方法包括下列步骤：

(a)使测试化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含C12ORF48基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因；

(b)测量所述报道基因的表达或活性；并

(c)选择与在所述测试化合物不存在下的水平相比降低所述报道基因的表达或活性水平的化合物。

14.权利要求9、10、11和13中任一项的方法，其中癌症选自下组：胰腺癌和前列腺癌。

15.权利要求14的方法，其中胰腺癌为胰腺导管腺癌，而前列腺癌为去势抗性前列腺癌。

16.一种包含有义链和反义链的双链分子，其中有义链包含与由SEQ ID NO：5，7，8，14或15组成的靶序列对应的核苷酸序列，且其中反义链包含与有义链互补的核苷酸序列，其中有义链和反义链彼此杂交以形成该双链分子，且其中该双链分子在导入表达C12ORF48基因的细胞中时抑制该基因的表达。

17.权利要求16的双链分子，其中双链分子是长度为约19个至约25个核苷酸的寡核苷酸。

18.权利要求17的双链分子，其中双链分子为单一核苷酸转录物，包含经单链核苷酸序列连接的有义链和反义链。

19.权利要求18的双链分子，其中多核苷酸具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中[A]为包含SEQ ID NO：5，7，8，14或15的核苷酸序列；[B]为由约3个至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；而[A′]为与[A]互补的核苷酸序列。

20.一种载体，其包含包括有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中的任一或二者，其中有义链核酸包含SEQ ID NO：5，7，8，14或15的核苷酸序列，且其中反义链包含与有义链互补的核苷酸序列，其中有义链和反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中载体在导入表达C12ORF48基因的细胞中时抑制该基因的表达。

21.权利要求20的载体，其中多核苷酸是长度为约19个至约25个核苷酸的寡核苷酸。

22.权利要求20的载体，其中双链分子为单一核苷酸转录物，包含经单链核苷酸序列连接的有义链和反义链。

23.权利要求22的载体，其中多核苷酸具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中[A]为包含SEQ ID NO：5，7，8，14或15的核苷酸序列；[B]为由约3个至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；而[A′]为与[A]互补的核苷酸序列。

24.一种在受试者中治疗或预防与C12ORF48基因过表达有关的癌症的方法，包括对受试者施用药学有效量的针对C12ORF48的双链分子或包含双链分子的载体以及药学可接受载体，该双链分子接触表达C12ORF48基因的细胞时抑制细胞增殖。

25.权利要求24的方法，其中双链分子为权利要求16的双链分子，其中载体为权利要求20的载体。

26.权利要求24的方法，其中癌症选自下组：胰腺癌和前列腺癌。

27.权利要求26的方法，其中胰腺癌为胰腺导管腺癌，而前列腺癌为去势抗性前列腺癌。

28.一种用于治疗或预防与C12ORF48基因过表达有关的癌症的组合物，其包含药学有效量的针对C12ORF48的双链分子或包含所述双链分子的载体和药学可接受载体，该双链分子接触表达C12ORF48基因的细胞时抑制细胞增殖。

29.权利要求28的组合物，其中双链分子为权利要求16的双链分子，其中载体为权利要求20的载体。

30.权利要求28的组合物，其中癌症选自下组：胰腺癌和前列腺癌。

31.权利要求30的组合物，其中胰腺癌为胰腺导管腺癌，而前列腺癌为去势抗性前列腺癌。

32.一种筛选抑制C12ORF48多肽与PARP1多肽之间的结合的候选化合物的方法，该方法包括下列步骤：

(a)使C12ORF48多肽或其功能等同物与PARP1多肽或其功能等同物在测试剂的存在下接触；

(b)检测多肽间的结合；

(c)比较在步骤(b)检测到的结合水平与在测试剂不存在下检测到的结合水平；并

(d)选择与步骤(c)中在测试剂不存在下检测到的结合水平相比降低或抑制所述结合水平的测试剂。

33.权利要求32的方法，其中C12ORF48的功能等同物包含PARP1结合域。

34.一种使用由C12ORF48基因编码的多肽来筛选用于治疗或预防癌症的化合物的方法，包括下列步骤：

(a)使测试化合物与由C12ORF48的多核苷酸编码的多肽在由多核苷酸PARP1编码的多肽存在下接触；

(b)检测由PARP1的多核苷酸编码的多肽的生物学活性；并

(c)选择与在测试化合物不存在下检测到的该多肽的生物学活性相比遏制由PARP1的多核苷酸编码的多肽的生物学活性的测试化合物。

35.权利要求34的方法，其中所述生物学活性为自修饰活性。

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