CN102597236A - 癌症治疗和诊断的靶基因ercc6l - Google Patents

Abstract

本文中描述用于诊断癌症，特别是肺癌发生倾向性的客观方法。本发明提供利用ERCC6L的表达水平作为癌症的指标的诊断方法。本发明进一步提供筛选可用于治疗ERCC6L相关疾病，诸如癌症，例如肺癌的治疗性物质的方法。本发明进一步提供抑制细胞生长和治疗或缓解ERCC6L相关疾病的一种或多种症状的方法。本发明的特征还在于双链分子，以及含有该双链分子的载体和组合物。

Description

癌症治疗和诊断的靶基因ERCC6L

技术领域

优先权

本申请要求2009年8月25日提交的美国临时申请No.61/275,198的权益，通过述及将其完整内容收入本文。

技术领域

本发明涉及检测和诊断癌症的方法以及治疗和预防癌症，特别是与ERCC6L过表达有关的癌症诸如肺癌的方法。本发明还涉及筛选用于治疗和预防ERCC6L相关癌症的候选物质的方法。此外，本发明涉及降低ERCC6L基因表达的双链分子及其用途。

背景技术

肺癌是癌症的最常见形式，占每年1090万新癌症病例中的135万。它还是癌症相关疾病所致死亡的首要原因，占全世界670万癌症相关死亡中的118万(NPL 1)。在最近十年里，新开发的细胞毒剂包括帕利他赛、多西他赛、吉西他滨、和长春瑞滨已开始为具有晚期NSCLC(非小细胞肺癌)的患者提供多种治疗选项；然而，每种新方案仅能提供与基于顺铂的疗法相比适度的存活好处(NPL 2)。

最近，分子靶向剂，包括抗EGFR或抗VEGF单克隆抗体，西妥昔单抗(Erbitux)或贝伐单抗(Avastin)，和EGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂，诸如吉非替尼(Iressa)和埃罗替尼(Tarceva)，已经进行了临床应用考察和/或被批准应用于临床(NPL 3，4)。这些作用剂对复发性NSCLC表现出一定程度的活性，但是能收到存活效益的患者的数目仍然有限。同时，SCLC(小细胞肺癌)患者对一线多药化疗相应良好，尽管他们常常在短时间里复发。只有20％具有局限阶段疾病(LD)的患者能用联合用药疗法治愈，而具有广泛疾病(ED)的患者能在初始诊断之后实现5年存活的不到5％(NPL 5)。因此，迫切需要新的治疗策略，诸如开发更加选择性的且有效的针对肺癌的分子靶向剂。

在筛选用于诊断、治疗和预防人癌症的新颖分子靶的过程中，本发明人使用含有27,648种基因或表达序列标签(EST)的cDNA微阵列，偶联激光显微解剖，实施了101例肺癌的基因组范围表达谱分析，发现了用于肺癌治疗的数种候选分子靶和生物标志物(PTL 1-2，NPL 6-9)。在这些中，ERCC6L(切除修复交叉互补啮齿动物修复缺陷，互补组6样；也称作″PICH″)特别值得注意。

ERCC6L已鉴定为SNF2ATP酶家族的一个成员，它是Plk1的相互作用配偶和底物(NPL10)。一项最近的报告证明ERCC6L是检查点信号传导的一个至关重要的成分，而且结合链接着丝粒相关DNA以监测姐妹动粒之间发生的张力(NPL10)。然而，至今，尚未建立ERCC6L和癌发生之间的关系。

引用表

专利文献

[PTL 1]WO2004/031413

[PTL 2]WO2007/013665

非专利文献

[NPL 1]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.CA Cancer J Clin.2008；58：71-96.

[NPL 2]Schiller JH，Harrington D，Belani CP，et al.Eastern CooperativeOncology Group.N Engl J Med 2002；346：92-8.

[NPL 3]Dowell J，Minna JD，Kirkpatrick P.Nat Rev Drug Discov2005；4：13-4.

[NPL 4]Pal SK，Pegram M.Anticancer Drugs 2005；16：483-94.

[NPL 5]Chute JP，Chen T，Feigal E，Simon R，Johnson BE：J Clin Oncol1999；17：1794-801.

[NPL 6]Daigo Y，Nakamura Y.Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008；56：43-53.

[NPL 7]Kikuchi T，Daigo Y，Katagiri T，et al.Oncogene 2003；22：2192-205.

[NPL 8]Kakiuchi S，Daigo Y，Tsunoda T，Yano S，Sone S，Nakamura Y.MolCancer Res 2003；1：485-99.

[NPL 9]Taniwaki M，Daigo Y，Ishikawa N，et al.Int J Oncol2006；29：567-75.

[NPL 10]Baumann C，et al.Cell 2007；128：101-114.

发明概述

本发明涉及经由微阵列分析和RT-PCR的下述发现，即ERCC6L在临床肺癌组织中过表达。如本文中证明的，通过siRNA对癌细胞系中内源ERCC6L的功能性敲低导致癌细胞生长的显著阻抑，提示ERCC6L在维持癌细胞的存活力中至关重要的作用。由于ERCC6L在成体正常器官中仅极少表达，因此ERCC6L似乎是用于不良效应最小的新治疗途径的一种适宜且有前景的分子靶。

因而，本发明的一个目的是提供一种通过测定源自受试者的生物样品中ERCC6L的表达水平来在受试者中诊断或确定癌症、特别是肺癌倾向性的方法。ERCC6L的表达水平与正常对照水平相比的升高指示该受试者罹患或有风险发生癌症，特别是肺癌。在本发明的方法中，可通过适宜的探针或引物集来检测ERCC6L基因，或者，可通过抗ERCC6L抗体来检测ERCC6L蛋白。

本发明的又一个目的是提供一种试剂盒，其包括用于检测ERCC6L基因的转录或翻译产物的试剂。

本发明的又一个目的是提供用于诊断或检测癌症的试剂，其包含结合ERCC6L基因的转录产物的核酸或结合ERCC6L基因的翻译产物的抗体。

本发明的又一个目的是提供结合ERCC6L基因的转录产物的核酸或结合ERCC6L基因的翻译产物的抗体制造用于诊断或检测癌症的试剂的用途。

本发明的又一个目的是提供鉴定用于抑制过表达ERCC6L基因的细胞生长的候选物质的方法，此类物质可用于治疗和/或预防ERCC6L相关疾病，诸如癌症。本发明的方法可在体外或在体内进行，而且使用对ERCC6L多肽的结合活性、ERCC6L基因的表达水平、ERCC6L多肽的生物学活性、或在该基因产物的转录调节区控制下的报告基因的表达水平或报告基因的活性作为指标。结合ERCC6L多肽或阻抑ERCC6L表达或活性或报告基因表达或活性的物质可鉴定为用于治疗和/或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选物质。要检测的ERCC6L多肽的生物学活性优选为细胞增殖活性(细胞增殖增强活性)。ERCC6L多肽的生物学活性与在测试物质不存在时的对照水平相比的降低指示该测试物质可用于减轻/减少肺癌的症状，或治疗和/或预防肺癌癌症。

本发明的又一个目的是提供一种通过施用抑制ERCC6L基因的表达和/或ERCC6L蛋白的功能的作用剂来治疗和/或预防癌症或抑制过表达ERCC6L的癌性细胞生长的方法。优选地，该作用剂为抑制性核酸(例如反义、核酶、双链分子、适体)。该作用剂可以为用于提供双链分子的核酸分子或载体。可通过以足以抑制ERCC6L基因表达的量将双链分子导入靶细胞中来抑制该基因的表达。因此，在本发明的一个特别优选实施方案中，该方法包括对受试者施用药学有效量的针对ERCC6L基因的双链分子或编码此类分子的载体的步骤，其中该双链分子在导入表达ERCC6L基因的细胞中时抑制ERCC6L基因的表达以及细胞增殖。

本发明的又一个目的是提供一种药物组合物，其适合于治疗和/或预防ERCC6L相关癌症，其包括可药用的担载体和活性剂，包括一种或多种针对ERCC6L基因的双链分子或编码此类分子的载体。在本发明的背景中，针对ERCC6L的双链分子能够在导入表达ERCC6L基因的细胞中时抑制ERCC6L基因的表达以及抑制由此诱导的细胞增殖。在优选实施方案中，所治疗和/或预防的癌症为肺癌，包括NSCLC和SCLC。NSCLC的例子包括肺腺癌(ADC)和肺的鳞状细胞癌(SCC)。

本发明的双链分子优选包含有义链和反义链，其中该有义链包括与选自SEQ ID NO：7和8的靶序列对应的核苷酸序列，且该反义链包括与该有义链互补的序列。该分子的有义和反义链彼此杂交以形成双链分子。在导入表达ERCC6L基因的细胞中时，本发明的双链分子抑制ERCC6L基因的表达以及细胞增殖。本发明的方法和材料能够在检测到癌症的明显临床症状之前就鉴定出癌症，而且可在癌症治疗的背景下使用而没有不良效应。

本领域技术人员会理解，本发明的一个或多个方面能符合某些目的，而一个或多个其它方面能符合某些其它目的。每个目的可以不是在它的所有方面同等适用于本发明的每一个方面。因此，前述目的可视为关于本发明的任何一个的备选。本发明的这些和其它目的和特征在阅读下面的详细描述连同附图和实施例之后会变得更加清楚明白。然而，要理解，上面的发明概述和下面的详细描述都是优选实施方案，而非对本发明或本发明其它备选实施方案的限制。

附图简述

在考虑下面的附图简要描述和发明详细描述及其优选实施方案之后，本发明的各个方面和应用对熟练技术人员会变得明显：

[图1]图1展现肺癌和正常组织中的ERCC6L表达。部分A描绘半定量RT-PCR的结果，证实了NSCLC(ADC和SCC)和SCLC的临床样品中与正常肺组织相比的ERCC6L的过表达。制备每种自肺癌样品的mRNA制备的单链cDNA的适宜稀释液，使用β-肌动蛋白(ACTB)表达的水平作为数量对照。部分B描绘半定量RT-PCR的结果，证实了肺癌细胞系中ERCC6L的表达。部分C描绘ERCC6L的Northern印迹分析的结果，证明数种肺癌细胞系强表达ERCC6：而大多数正常人组织不然。部分D描绘通过抗myc检测的COS-7细胞中外源ERCC6L蛋白的亚细胞定位。细胞用DAPI共染色。

[图2]图2证明针对ERCC6L的siRNA对过表达ERCC6L的肺癌细胞的生长的影响。部分A描绘半定量RT-PCR分析的结果，确认SBC-5细胞中响应si-ERCC6L(si-#A或si-#B)但不响应对照siRNA(LUC或EGFP)而发生ERCC6L表达的敲低效应。部分B描绘用特异性siRNA或对照质粒转染的SBC-5细胞的集落形成测定的结果。部分C描绘SBC-5细胞响应于si-ERCC6L(si-#A或si-#B)、si-LUC、或si-EGFP的MTT测定的结果。所有测定在一式三份的孔中实施三次。

[图3]图3证明ERCC6L导入COS-7细胞对细胞生长的增强。部分A描绘Western印迹分析的结果，确认COS-7细胞中ERCC6L的瞬时表达。部分B描绘COS-7细胞中ERCC6L的瞬时表达中的生长促进效应。测定在一式三份的孔中实施三次。

发明详述

虽然任何与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案，但是现在描述优选的方法、装置、和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，要理解，本发明不限于本文中描述的特定大小、形状、尺度、材料、方法、方案、等，因为这些可依照常规实验和优化而变化。还要理解，该描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。

通过述及明确地将此说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开内容完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开。如果有冲突，当以本说明书，包括定义为准。另外，该等材料、方法、和实施例只是例示性的，而非意图限制。

定义：

如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非另有明确说明。在本文中与物质(例如多肽、抗体、多核苷酸、等)联用时，术语“分离的”和“纯化的”表示该物质基本上不含至少一种也可包括于天然来源中的物质。如此，分离的或纯化的抗体指基本上不含细胞材料诸如碳水化合物、脂质、或其它来自该蛋白质(抗体)所由来的细胞或组织源的污染性蛋白质的抗体，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的抗体。术语“基本上不含细胞材料”包括其中多肽与用于分离或重组生产它的细胞的细胞成分分开的多肽制备物。如此，基本上不含细胞材料的多肽包括具有少于约30％、20％、10％、或5％(按干重计)的异源蛋白质(在本文中也称作“污染性蛋白质”)的多肽制备物。当多肽重组产生时，其还优选基本上不含培养基，包括具有少于约20％、10％、或5％的蛋白质制备物体积的培养基的多肽制备物。当多肽通过化学合成产生时，其优选基本上不含化学前体或其它化学品，包括具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计)的蛋白质制备物体积的与该蛋白质合成有关的化学前体或其它化学品的多肽制备物。可例如通过在蛋白质制备物的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳及凝胶的考马斯亮蓝染色等等之后单一条带的出现来显示特定蛋白质制备物含有分离的或纯化的多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是分离的或纯化的。

“分离的”或“纯化的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术产生时可基本上不含其它细胞材料或培养基，或当化学合成时可基本上不含化学前体或其它化学品。

术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该等术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在的残基(诸如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸指由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后经过修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构(α碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。

氨基酸在本文中可以通过它们公知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号来指称。

除非另有明确陈述，术语“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可交换使用，并且与氨基酸类似，以普遍接受的单字母代码来表示。类似于氨基酸，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核酸、或核酸分子可包含DNA、RNA或其组合。

除非另有定义，术语“癌症”指过表达ERCC6L基因的癌症。过表达ERCC6L的癌症的例子包括但不限于肺癌，包括SCLC和NSCLC。NSCLC包括但不限于腺癌(ADC)和鳞状细胞癌(SCC)。

如本文中使用的，术语“双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括例如短干扰RNA(siRNA；例如双链核糖核苷酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干扰DNA/RNA(siD/R-NA；例如DNA和RNA的双链嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合物(shD/R-NA))。在本文中，“双链分子”也称作“双链核酸”、“双链核酸分子”、“双链多核苷酸”和“双链多核苷酸分子”。

ERCC6L基因或ERCC6L蛋白：

本发明部分基于下述发现，编码ERCC6L的基因在癌症中与非癌性组织相比过表达。

ERCC6L多核苷酸的核苷酸序列和ERCC6L多肽的氨基酸序列是本领域技术人员知道的，而且得自例如web网站诸如GenBank^TM上的基因数据库。ERCC6L多核苷酸的一个例示性核苷酸序列显示于SEQ ID NO：9，而ERCC6L多肽的一个例示性氨基酸序列显示于SEQ ID NO：10。也可例如经GenBank登录号BC11486或NM_017669获得序列数据。技术人员会认识到，ERCC6L序列不必限于这些序列，而且变体(例如功能性等同物和等位变体)也可用于本发明，如下所述。

依照本发明的一个方面，认为功能性等同物也是“ERCC6L多肽”。在本文中，蛋白(例如ERCC6L多肽)的“功能性等同物”为具有与该蛋白等同的生物学活性的多肽。也就是，任何保留ERCC6L蛋白的生物学能力的多肽可用作本发明中的此类功能性等同物。此类功能性等同物包括那些对ERCC6L蛋白的天然存在氨基酸序列替代、删除、添加、或插入一个或多个氨基酸的。或者，多肽可包含与相应蛋白的序列具有至少约80％同源性(也称作序列同一性)，更优选至少约90％至95％同一性，常常为约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，多肽可以由在严格条件下与ERCC6L基因的天然存在核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。

本发明的多肽可在氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的有无、或形式方面有变化，取决于用于产生它的细胞或宿主，或使用的纯化方法。无论如何，只要它具有与本发明的人ERCC6L蛋白的功能等同的功能，它就在本发明的范围内。

短语“严格(杂交)条件”指下述条件，在该条件下，核酸分子会与其靶序列杂交，通常在核酸复杂混合物中，但没有与其它序列的可检测的杂交。严格条件取决于序列，而且在不同情况中会有所变化。较长的序列在较高的温度特异性杂交。对于核酸杂交详尽指导可见于Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地，严格条件选择为在限定的离子强度和pH，比特定序列的热熔点(T_m)低约5-10℃。T_m是如下的温度(在限定的离子强度、pH、和核酸浓度下)，其中50％的与靶互补的探针在平衡时与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在T_m，在平衡时50％的探针被占据)。严格条件也可以通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选背景杂交的10倍。例示性的严格杂交条件包括如下：50％甲酰胺、5x SSC、和1％SDS，在42℃温育，或5x SSC、1％SDS、在65℃温育，用0.2x SSC和0.1％SDS在50℃清洗。

在本发明的背景中，用于分离编码与人ERCC6L蛋白在功能上等同的多肽的DNA的杂交条件可由本领域技术人员常规选择。例如，可如下进行杂交：在68摄氏度用“Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)进行30分钟或更长的预杂交，添加经过标记的探针，并在68摄氏度温育1小时或更长。下面的清洗步骤可在例如低严格度条件中进行。一种例示性的低严格度条件可包括42℃、2x SSC、0.1％SDS，优选50℃、2x SSC、0.1％SDS。常常优选使用高严格条件。一种例示性的高严格条件可包括在室温在2x SSC、0.1％SDS中清洗3次各20分钟，然后在1x SSC、0.1％SDS中在37摄氏度清洗3次各20分钟，并在1x SSC、0.1％SDS中在50摄氏度清洗2次各20分钟。然而，数种因素，诸如温度和盐浓度，可影响杂交的严格度，而且本领域技术人员可选择合适的因素以达到所需的严格度。

一般而言，蛋白中一个、两个或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白的功能。事实上，已知突变的或经过修饰的蛋白(即包含通过替代、删除、插入和/或添加而修饰一个、两个或更多个氨基酸残基的氨基酸序列的肽)保留原始的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；Zollerand Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。因而，本领域技术人员会认识到，对氨基酸序列进行个别添加、删除、插入、或替代，这改变单个氨基酸或少数氨基酸，或者被认为是“保守修饰”的那些修饰——其中蛋白的改变产生具有相似功能的蛋白，这些都是本发明的背景中可接受的。因此，在一个实施方案中，本发明的肽可具有在ERCC6L序列中添加、插入、删除、和/或替代一个、两个或甚至更多个氨基酸的氨基酸序列。

只要保持蛋白的活性，氨基酸突变的数目不受特别限制。然而，一般优选改变氨基酸序列的5％或更少。因而，在一个优选的实施方案中，在此类突变体中要突变的氨基酸数目一般为30个氨基酸或更少，优选20个氨基酸或更少，更优选10个氨基酸或更少，更优选6个氨基酸或更少，更优选3个或4个氨基酸或更少。

要突变的氨基酸残基优选突变为氨基酸侧链特性保持的另一种氨基酸(称为保守性氨基酸替代的过程)。氨基酸侧链特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下列共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含有羟基基团的侧链(S，T，Y)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；含有碱的侧链(R，K，H)；和含有芳香族的侧链(H，F，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本领域是公知的。例如，下列8个组各种包含彼此构成保守性替代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins 1984)。

此类保守性修饰多肽包括在本发明的ERCC6L蛋白中。然而，本发明并不仅限于此，而且ERCC6L蛋白包括非保守性修饰，只要ERCC6L蛋白的至少一种生物学活性得以保留即可。另外，经过修饰的蛋白并不排除多态变体、种间同源物、和那些由这些蛋白的等位基因编码者。

此外，本发明的ERCC6L基因涵盖编码ERCC6L蛋白的此类功能性等同物的多核苷酸。在杂交之外，可以利用基因扩增方法来分离编码与ERCC6L蛋白功能等同的多肽的多核苷酸，例如聚合酶链式反应(PCR)方法，使用基于蛋白编码DNA的序列信息(SEQ ID NO：9)合成的引物。分别构成人类ERCC6L基因和蛋白的功能性等同物的多核苷酸和多肽通常与其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”通常指40％或更高的同源性，优选60％或更高，更优选80％或更高，甚至更优选90％至95％或更高，甚至更优选96％、97％、98％、99％或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循“Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)”中的算法来确定。

诊断癌症的方法：

发现ERCC6L基因的表达在肺癌中特异性的提高(图1A、B)。Northern印迹分析显示了ERCC6L在正常组织中不表达，但是在肺癌细胞系中强表达(图1C)。因而，本文鉴定出的ERCC6L基因及其转录与翻译产物可以作为标志用于诊断癌症诸如肺癌，而且，通过测量样品中ERCC6L的表达进行。可通过在源自受试者的样品与正常样品之间比较ERCC6L基因的表达水平来诊断或检测癌症。更特别地，本发明提供了通过确定受试者中ERCC6L表达水平检测、诊断和/或确定癌症，更特别的是ERCC6L相关癌症的存在或其发生的倾向性的方法。

因而，本发明提供了一种用于检测或诊断受试者中癌症的方法，所述方法包括测定源自受试者的生物样品中ERCC6L基因表达水平的步骤，其中所述水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示样品中存在或怀疑存在癌细胞，继而提示受试者患有或有风险发生癌症。

ERCC6L基因的表达水平可通过任何已知方法来测定，其例子包括：

(a)检测ERCC6L基因的mRNA；

(b)检测由ERCC6L基因编码的蛋白质；和

(c)检测由ERCC6L基因编码的蛋白质的生物学活性。

在优选的实施方案中，要通过本方法诊断的癌症是肺癌，包括NSCLC和SCLC。NSCLC包括肺的腺癌(ADC)和肺的鳞状细胞癌(SCC)。

依照本发明，可以提供用于检查受试者状况的中间结果。此类中间结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它从业人员诊断受试者患有疾病。因此，本发明考虑ERCC6L作为用于癌症的诊断标志物的用途。

或者，本发明可用于检测或鉴定源自受试者的组织中的癌性细胞，此类细胞特征在于所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示组织中癌细胞的存在或怀疑。ERCC6L表达结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它保健从业人员诊断受试者患有疾病。换言之，本发明可以给医生提供有用信息来诊断受试者患有疾病。例如，依照本发明，当关于自受试者获得的组织中癌细胞的存在有疑问时，通过考虑ERCC6L基因的表达水平，加上疾病的不同方面，包括组织病理学、血液中的已知肿瘤标志物的水平、和受试者的临床过程等，能做出临床决策。例如，一些公知的血液中的诊断性肺肿瘤标志物为IAP、ACT、BFP、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CEA、KMO-1、NSE、SCC、SP1、Span-1、TPA、CSLEX、SLX、STN和CYFRA。就是说，在本发明的这个具体实施方案中，基因表达分析的结果作为中间结果，用于进一步诊断受试者的疾病状态。

本发明特别感兴趣的是了下述[1]到[10]的方法：

[1]一种在受试者中检测或诊断癌症的方法，包括测定源自受试者的生物样品中ERCC6L基因的表达水平，其中所述水平较之所述基因正常对照水平的提高指示所述受试者患有或有风险形成癌症；

[2][1]的方法，其中所述表达水平比正常对照水平高至少10％；

[3][1]的方法，其中所述表达水平通过选自下组的方法检测：

(a)检测ERCC6L基因的mRNA；

(b)检测由ERCC6L基因编码的蛋白质；

(c)检测由ERCC6L基因编码的蛋白质的活性；

[4][1]的方法，其中所述癌症为肺癌。

[5][3]的方法，其中所述表达水平是通过检测探针与基因的基因转录物杂交来确定的；

[6][3]的方法，其中所述表达水平是通过检测抗体与基因编码的蛋白的结合作为所述基因的表达水平来确定的；

[7][1]的方法，其中所述生物样品包括活检样品、痰或血液。

[8][1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含上皮细胞。

[9][1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含癌细胞。

[10][1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含癌性上皮细胞。

本发明的诊断癌症的方法在下面更加详细的加以叙述。需用本方法诊断的患者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如，人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。

为实施诊断，优选从要诊断的受试者采集生物样品。任何生物学材料均可作为生物样品用于测定，只要其包括目标的ERCC6L转录或翻译产物。所述生物样品包括，但不仅限于，想要诊断或怀疑患有癌症的身体组织与体液，例如活检样品，血液，痰与尿液。生物样品优选含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，较优选癌性上皮细胞或源自怀疑为肿瘤的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织或体液中纯化所述细胞，并将其用为生物样品。在一个优选的实施方案中，生物样品可包括自要诊断的受试者获得的肺细胞或肺组织。

根据本发明，测定在所述源自患者的生物样品中ERCC6L的表达水平。表达水平可在转录产物(核酸)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，ERCC6L的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测包括ERCC6L在内的多个基因(例如，多种癌症特异性基因)的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用ERCC6L的序列信息制备上述探针。举例而言，ERCC6L的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，例如染料、荧光或同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生了杂交的标记物的强度来检测。

进一步，ERCC6L的转录产物可通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制备。举例而言，用于实施例的引物(SEQ ID NO：1和2)可用于通过RT-PCR或Northern印迹的检测，但本发明并不仅限于此。

具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件与低严格条件下与ERCC6L的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下发生。一般地，严格条件的温度应选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，用于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。

或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以测定ERCC6L蛋白的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段保留对ERCC6L蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。

作为另一种基于ERCC6L的翻译产物检测其基因的方法，可利用针对ERCC6L蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。意即，观察到强染色表明所述蛋白质存在量增加，且同时表明ERCC6L的高表达水平。

另外，除ERCC6L基因的表达水平外，还可测定其它癌相关基因，例如，已知在癌症中有差异表达的基因的表达水平，以提高所述诊断的可靠性。对于包括ERCC6L基因的癌标志基因而言，如果该癌标志基因在生物样品中的表达水平较其相应的癌标志基因的对照水平增加了例如10％，25％或50％的话，或增加到超过1.1倍，超过1.5倍，超过2.0倍，超过5.0倍，超过10倍或者更多，则认为其表达水平增加。

对照水平可以与测试生物样品同时确定，使用先前从疾病状态(患癌或未患癌)已知的患者收集和保存的样品。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的ERCC6L基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中ERCC6L基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中ERCC6L基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2S.D.或平均值±3S.D.的范围可以用作标准值。

在本发明的背景中，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平是从癌性生物样品确定的，则称作“癌对照水平”。

当ERCC6L基因的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似，则受试者可诊断为正罹患或有危险罹患癌症。进一步，当比较多种癌相关基因的表达水平时，样品与癌性参照之间基因表达模式的相似性表明受试者正罹患或有危险罹患癌症。

测试生物样品的表达水平与对照水平间的差异可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸(例如管家基因)的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，β-肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。

在本发明中，揭示了ERCC6L不仅是有用的诊断标志物，而且还是癌症治疗的合适靶物。因此，可通过本发明来实现靶向ERCC6L的癌症治疗。在本发明中，靶向ERCC6L的癌症治疗指阻抑或抑制癌细胞中的ERCC6L活性和/或表达。任何抗ERCC6L剂可用于靶向ERCC6L的癌症治疗。在本发明中，抗ERCC6L剂包括下述物质或活性组分：

(a)本发明的双链分子，

(b)编码它的DNA，和

(c)编码它的载体。

因而，在一个优选的实施方案中，本发明提供下述方法：(i)诊断受试者是否具有要用抗ERCC6L剂治疗的癌症，和/或(ii)为靶向ERCC6L的癌症治疗选择受试者，该方法包括下述步骤：

(a)测定自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中ERCC6L的表达水平；

(b)将ERCC6L的表达水平与正常对照水平比较；

(c)如果ERCC6L的表达水平与正常对照水平相比升高的话，将该受试者诊断为具有要治疗的癌症；并

(d)如果在步骤(c)中将该受试者诊断为具有要治疗的癌症的话，选择该受试者进行癌症治疗。

或者，此类方法包括下述步骤：

(a)测定自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中ERCC6L的表达水平；

(b)将ERCC6L的表达水平与癌性对照水平比较；

(c)如果ERCC6L的表达水平与癌性对照水平相似或等同的话，将该受试者诊断为具有要治疗的癌症；并

(d)如果在步骤(c)中将该受试者诊断为具有要治疗的癌症的话，选择该受试者进行癌症治疗。

诊断癌症的试剂盒：

本发明还提供了诊断癌症的试剂盒，其亦可用于评价和/或监测癌症疗法功效。本发明还提供用于确定罹患可用本发明双链分子或编码它的载体来治疗的癌症的受试者的试剂盒，其也可用于评估和/或监测此类癌症治疗的效果。优选地，要用本试剂盒诊断癌症是肺癌，包括NSCLC和SCLC。更优选地，所述试剂盒包含至少一种在源自受试者的生物样品中检测ERCC6L基因表达的试剂，所述试剂可选自下组：

(a)检测ERCC6L基因的mRNA的试剂；

(b)检测ERCC6L的蛋白质的试剂；

(c)检测ERCC6L的蛋白质的生物学活性的试剂。

适于检测ERCC6L基因mRNA的试剂包括特异性结合或识别ERCC6LmRNA的核酸，诸如具有与ERCC6L mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对ERCC6L mRNA特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸。如果需要，检测ERCC6L mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测ERCC6L mRNA的试剂。

另一方面，适于检测ERCC6L蛋白质的试剂包括针对ERCC6L蛋白质的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv等等)均可用于检测，只要所述片段保留与ERCC6L蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及抗体与其靶结合的检测在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测ERCC6L蛋白质的试剂。

进一步，所述生物学活性可通过，例如，测量所述生物样品中由于ERCC6L蛋白质表达而导致的细胞增殖活性来确定。举例而言，可在源自受试者的生物样品的存在下培养所述细胞，然后通过检测增殖的速度，或测量细胞周期或集落形成活性，可确定所述生物样品的生物学活性。如需要，检测ERCC6L mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测ERCC6L蛋白质生物学活性的试剂。

所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。进一步，所述试剂盒可包括固体基质以及用于将探针与ERCC6L基因结合的试剂或针对ERCC6L蛋白质的抗体，用于培养细胞的培养基与容器，阳性与阴性对照试剂，以及用于检测针对ERCC6L蛋白质的抗体的第二抗体。举例而言，从患有或没有癌症的受试者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤纸、针头、注射器和带有使用说明书的装箱单(例如，书面的、磁带、CD-ROM、URL等等)。这些试剂之类的可在标上标签的容器中提供。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可从多种材料制得，例如玻璃或塑料。

作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对ERCC6L mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质上，例如多孔条，以形成至少一个检测位置。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位置，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位置。此外，对照位置可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位置上量较大而在接下来的位置上量较小。在加入样品之后，显示可检测信号位置的数量提供了在样品中存在的ERCC6L mRNA量的定量指征。所述检测位置可具有任何合适可检测的形状，并通常是横跨测试条宽度的条状或点状。

本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照和/或阴性对照样品，和/或ERCC6L标准样品。本发明的所述阳性对照样品可通过收集ERCC6L阳性样品来制备。此类ERCC6L阳性样品可例如自已建立的肺癌细胞系获得，包括肺的腺癌细胞(ADC)系诸如A427、NCI-H1781、A549、LC319等等；肺的鳞状细胞癌(SCC)细胞系诸如NCI-H26、EBC-1、NCI-H520、NCI-H2170等等；和SCLC细胞系诸如DMS114、DMS273、SBC-3、SBC-5、H196、H446等等。或者，ERCC6L阳性样品可自临床肺癌组织获得，包括肺的腺癌组织、肺的鳞状细胞癌组织和SCLC组织。或者，阳性对照样品可通过确定截留值并制备含有量超过截留值的ERCC6L mRNA或蛋白的样品来制备。在本文中，短语“截留值”指在正常范围和癌性范围之间区分的值。例如，本领域技术人员可使用接受者运行特征(ROC)曲线来确定截留值。本试剂盒可包括含有截留值量的ERCC6L mRNA或多肽的ERCC6L标准样品。相反，阴性对照样品可自非癌性细胞系或非癌性组织诸如正常肺组织制备，或者可以通过制备含有少于截留值的ERCC6L mRNA或蛋白的样品来制备。

或者，本发明提供试剂制备用于诊断癌症的诊断试剂的用途。在一些实施方案中，该试剂可选自下组：

(a)用于检测ERCC6L基因的mRNA的试剂；

(b)用于检测ERCC6L蛋白的试剂；和

(c)用于检测ERCC6L蛋白的生物学活性的试剂。

具体地，此类试剂是与ERCC6L多核苷酸杂交的寡核苷酸或与ERCC6L多肽结合的抗体。

抗癌物质的筛选：

通过本发明，证明了ERCC6L涉及癌细胞生长。因而，阻抑ERCC6L基因的表达水平和/或ERCC6L多肽的生物学活性的物质预期可用于治疗和/或预防癌症。可使用ERCC6L基因、由该基因编码的多肽、或该基因的转录调节区来筛选此类物质。如此，本发明还提供使用ERCC6L基因、ERCC6L多肽、或该基因的转录调节区筛选用于治疗和/或预防癌症的候选物质的方法。

在本发明的背景中，待通过本筛选方法鉴定的物质可以是任何化合物或包含数种化合物的组合物。而且，根据本发明筛选方法暴露于细胞或蛋白的测试物质可以是单种物质或多种物质的组合。当在方法中使用物质组合时，各物质可以顺次或同时加以接触。

通过本筛选方法筛选的物质可以是用于治疗和/或预防癌症和/或抑制癌细胞生长的合适候选物质。在本发明中，所述癌症优选特征在于与ERCC6L过表达的关联。因而，所筛选的物质可优选应用于与ERCC6L过表达有关或有关联的癌症。在优选的实施方案中，所述与ERCC6L过表达有关或有关联的癌症是肺癌，包括NSCLC和SCLC。NSCLC包括但不限于肺的腺癌(ADC)和肺的鳞状细胞癌(SCC)。

任何测试物质，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸构建体，例如反义RNA、siRNA、核酶以及适体等等)以及天然化合物，均可用于本发明的筛选方法中。也可使用本领域熟知的很多组合文库方法中的任何途径来获得本发明的测试物质，包括(1)生物文库，(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallel solid phaseor solution phase libraries)，(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文库法，以及(5)使用亲和色谱选择的合成文库法。使用亲和色谱选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文库(Lam，AnticancerDrug Des 1997，12：145-67)。合成分子文库方法的例子可在现有技术中找到(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13；Erb et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1994，91：11422-6；Zuckermann et al.，J Med Chem 37：2678-85，1994；Cho et al.，Science 1993，261：1303-5；Carell et al.，Angew Chem Int EdEngl 1994，33：2059；Carell et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2061；Gallop et al.，J Med Chem 1994，37：1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(参见Houghten，Bio/Techniques 1992，13：412-21)或珠子上(Lam，Nature 1991，354：82-4)、芯片上(Fodor，Nature 1993，364：555-6)、细菌上(美国专利5,223,409)、孢子上(美国专利5,571,698；5,403,484与5,223,409)、质粒上(Cullet al.，Proc Natl Acad Sci USA 1992，89：1865-9)或噬菌体上(Scott and Smith，Science 1990，249：386-90；Devlin，Science 1990，249：404-6；Cwirla et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Felici，J Mol Biol 1991，222：301-10；美国专利申请2002103360)。

通过本发明任一筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的物质，包括在通过本发明筛选方法鉴定的物质之内。

此外，当通过本筛选方法获得的候选物质是蛋白质时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以确定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定该编码蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白的DNA。可以对所得的DNA确认其在制备治疗或预防癌症的候选物质中的有用性。

在本文描述筛选中使用的测试样品亦可为特异性结合ERCC6L蛋白或其缺乏原蛋白的体内生物学活性的部分肽的抗体。

尽管测试物质文库的构建是本领域众所周知的，在下文中还是进一步提供了鉴定测试物质和构建用于本筛选方法的这些测试物质的文库的指导。

(i)分子建模：

对具有目标性质的物质的分子结构和/或对ERCC6L蛋白的分子结构的知识为人们构建测试物质文库提供了便利。预筛选适于进一步评估的受试物质的方法之一，利用对受试物质与其靶标的相互作用进行计算机建模。计算机建模技术为选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新物质的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于来源于选定分子的x-射线晶体分析或NMR成像的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新物质如何连接靶分子，以及实验操作物质和靶分子的结构以完善结合特异性提供了可能。为了预测当分子和物质之一或二者都发生细小改变时分子-物质相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。

上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation，Waltham，Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。利用QUANTA可进行分子相互行为的互动性构建、修饰、可视化和分析。

关于与特异蛋白相互作用的药物的计算机建模主题已经发表了多篇文献，其例子包括Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988，97：159-66；Ripka，New Scientist 1988，54-8；McKinlay&Rossmann，Annu Rev PharmacolToxiciol 1989，29：111-22；Perry&Davies，Prog Clin Biol Res 1989，291：189-93；Lewis&Dean，Proc R Soc Lond 1989，236：125-40，141-62；以及关于核酸组分模型受体的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111：1082-90。

其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga，Ontario，Canada的BioDesign，Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix，Inc公司、Cambridge，Ontario的Hypercube，Inc.等公司获取。见例如DesJarlais et al.，J Med Chem1988，31：722-9；Meng et al.，J Computer Chem 1992，13：505-24；Meng et al.，Proteins 1993，17：266-78；Shoichet et al.，Science 1993，259：1445-50。

一旦鉴定出推定的抑制剂，可使用组合化学技术基于鉴定出的推定抑制剂的化学结构构建任何数量的变体，如下所述。对于所得的推定抑制剂，或“测试物质”文库，可使用本发明的方法筛选，以鉴定适于治疗和/或预防癌症和/或预防癌症术后复发的物质，特别是所述癌症是肺癌的情况。

(ii)组合化学合成：

测试物质的组合文库可以作为合理药物设计程序的一部分来制备，合理药物设计程序涉及有关已知抑制剂中存在的核心结构的知识。这种策略使得文库可以保持合理的规模，便于进行高通量筛选。或者，可通过简单地合成构成文库的分子家族的所有排列，来构建简单的，特别是短的、聚合物性的分子文库。后一种方法的一个实例是由所有长度为6个氨基酸组成的肽文库。这种肽文库包含所有6氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。

组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见例如美国专利5,010,175；Furka，Int J Pept Prot Res 1991，37：487-93；Houghten et al.，Nature1991，354：84-6)。也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被编码的肽(例如WO93/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)，苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美国专利5,288,514)，diversomer如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWittet al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13)，插烯化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：9217-8)，小化合物文库的模拟物有机合成(analogous organic synthese)(Chenet al.，J.Amer Chem Soc 1994，116：2661)，寡聚氨基甲酸盐(Cho et al.，Science1993，261：1303)，和/或肽酰膦酸酯(peptidylphosphonates)(Campbell et al.，JOrg Chem 1994，59：658)，核酸文库(见Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology 1995补充；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA)，肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughan et al.，Nature Biotechnology 1996，14(3)：309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(见例如Liang et al.，Science1996，274：1520-22；美国专利5,593,853)，和有机小分子文库(见例如苯并二氮卓，Gordon EM.Curr Opin Biotechnol.1995 Dec 1；6(6)：624-31；类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫杂氮杂环己烷(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓，5,288,514；等)。

用于制备组合文库的设备是可商购的(见例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433AApplied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，有多种组合文库本身也是商业可得的(见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等等)。

(iii)其它候选物：

另一种手段是使用重组细菌噬菌体来产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott&Smith，Science 1990，249：386-90；Cwirla et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1990，87：6378-82；Devlin et al.，Science 1990，249：404-6)，可以构建非常大的文库(例如106-108个化学实体)。再一种手段主要使用化学方法，其实例包括Geysen方法(Geysen et al.，Molecular Immunology 1986，23：709-15；Geysen et al.，J Immunologic Method 1987，102：259-74)和Fodor等的方法(Science 1991，251：767-73)。Furka等(14th International Congress ofBiochemistry 1988，Volume#5，Abstract FR：013；Furka，Int J Peptide Protein Res1991，37：487-93)，Houghten(美国专利4,631,211)和Rutter等(美国专利5,010,175)记载了产生肽混合物的方法，可以将这些肽作为激动剂或拮抗剂加以测试。

适体是由紧密结合特定分子靶的核酸构成的大分子。Tuerk和Gold(Science.249：505-510(1990))披露了SELEX(通过指数式富集进行的配体系统性进化)方法来选择适体。在SELEX方法中，核酸分子的大型文库{例如10¹⁵种不同分子)可用于筛选。

I.基于蛋白质的筛选方法

本发明提供了使用ERCC6L多肽筛选可用于治疗和/或预防癌症的候选物质的方法。在本筛选方法的背景中，要使用的ERCC6L多肽可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、结合至载体的形式或融合有其它多肽的融合蛋白。另外，ERCC6L多肽可以是重组多肽、自然界来源的蛋白质或其部分肽。

除了天然存在的ERCC6L多肽外，该多肽的功能性等同物可包括在用于本筛选的ERCC6L多肽中，只要经过修饰的肽保留初始多肽的至少一种生物学活性即可。ERCC6L多肽的生物学活性的例子包括但不限于细胞增殖活性、螺旋酶活性、ATP酶活性和Plk1结合活性。此类功能性等同物的优选例描述于上文题为“ERCC6L基因和ERCC6L蛋白”的节。例如，此类功能性等同物的优选例包括含有ERCC6L多肽螺旋酶域的多肽(例如SEQ ID NO：10的61至631)。

所述多肽可进一步连接其他物质，只要连接工艺和连接的物质不干扰初始多肽和/或片段的生物学活性即可。可利用的物质包括例如：肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然和合成聚合物等。可进行这些类型的修饰以赋予该多肽及片段别的功能或使其稳定。用于本发明方法的多肽可作为天然存在蛋白质通过常规纯化方法获得自自然界，或基于所选择的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，可用于合成的常规肽合成法包括：

1)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；

2)The Proteins，Vol.2，Academic Press，New York，1976；

3)Peptide Synthesis(日语)，Maruzen Co.，1975；

4)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日语)，Maruzen Co.，1985；

5)Development of Pharmaceuticals(第二卷)(日语)，Vol.14(peptide synthesis)，Hirokawa，1991；

6)WO99/67288；和

7)Barany G.&Merrifield R.B.，Peptides Vol.2，“Solid Phase Peptide Synthesis”，Academic Press，New York，1980，100-118。

或者，可通过采用用于产生多肽的任何已知基因工程方法来获得该多肽(例如Morrison J.，J Bacteriology 1977，132：349-51；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology(Wu等人编辑)1983，101：347-62)。例如，首先制备以可表达形式(例如位于包含启动子的调节序列的下游)包含编码目标蛋白质的多核苷酸的适合的载体，然后转化入合适的宿主细胞，接着培养宿主细胞以产生蛋白质。更具体的说，通过将编码ERCC6L多肽的基因插入用于表达外来基因的载体诸如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS或pCD8，在宿主(例如动物)细胞等中表达该基因。启动子可用于表达。可使用任何常用的启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(编)，GeneticEngineering，vol.3.Academic Press，London，1982，83-141)、EF-α启动子(Kimet al.，Gene 1990，91：217-23)、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 1991，108：193)、RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152：684-704)、SRα启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 1988，8：466)、CMV立即早期启动子(Seed etal.，Proc Natl Acad Sci USA 1987，84：3365-9)、SV40晚期启动子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982，1：385-94)、腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，MolCell Biol 1989，9：946)、HSV TK启动子等。可根据任何常规方法将载体导入宿主细胞以表达ERCC6L多肽，例如电穿孔法(Chu et al.，Nucleic Acids Res1987，15：1311-26)、磷酸钙法(Chen et al.，Mol Cell Biol 1987，7：2745-52)、DEAE右旋糖苷法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 1984，12：5707-17；Sussmanet al.，Mol Cell Biol 1985，4：1641-3)、脂转染法(Derijard B，Cell 1994，7：1025-37；Lamb et al.，Nature Genetics 1993，5：22-30；Rabindran et al.，Science1993，259：230-4)等。

还可使用体外翻译系统在体外产生ERCC6L多肽。

(i)ERCC6L结合物质的筛选：

在本发明的背景中，在肺癌中检测出ERCC6L基因的过表达，尽管在正常器官中没有表达(图1)。因而，本发明提供了使用ERCC6L基因和由其编码的蛋白来筛选结合ERCC6L多肽的物质的方法。由于癌症中ERCC6L的表达，与ERCC6L多肽结合的物质期待可阻抑癌细胞的增殖，并因此对治疗和/或预防癌症是有用的。因此，本发明亦提供了使用ERCC6L多肽筛选阻抑癌细胞增殖的候选物质的方法，以及筛选治疗或预防癌症的候选物质的方法。特别地，此筛选方法的一个实施方案包括以下步骤：

(a)将测试物质与ERCC6L多肽接触；

(b)检测所述多肽与所述测试物质之间的结合活性；和

(c)选择结合所述多肽的测试物质。

或者，依照本发明，也可评估或估计测试物质对治疗和/或预防癌症的潜在治疗效果。在一些实施方案中，本发明提供用于评估或估计测试物质对治疗和/或预防癌症和/或抑制与ERCC6L过表达相关的癌症的治疗效果的方法，该方法包括下述步骤：

(a)使测试物质与由ERCC6L多核苷酸编码的多肽接触；

(b)检测所述多肽和所述测试物质之间的结合活性；并

(c)将潜在治疗效果与测试物质关联起来，其中当物质结合所述多肽时显示潜在治疗效果。

在本发明的背景中，治疗效果可以与测试物质和ERCC6L蛋白的结合活性关联起来。例如，当某种测试物质结合ERCC6L蛋白时，可将所述测试物质鉴定或选择为具有要求的治疗效果的候选物质。或者，当某种测试物质不结合ERCC6L蛋白时，可将所述测试药剂鉴定为没有显著治疗效果。

本发明的方法将在下面更加详细的加以描述。

需用于筛选的ERCC6L多肽可为重组多肽，或者是来自自然界的蛋白质，或其部分肽。与测试物质接触的多肽可以是，例如，纯化的多肽、可溶蛋白质、与载体结合的形式、或者与其它多肽融合的融合蛋白。

在优选的实施方案中，本发明使用的测试物质可以是蛋白质，诸如抗体或合成化学化合物。作为筛选与ERCC6L多肽结合的物质的方法，可使用本领域技术人员公知的多种方法。上述筛选可通过，例如，免疫沉淀方法进行。

在使用免疫沉淀方法时，优选ERCC6L多肽包含抗体识别位点。要用于本筛选方法的ERCC6L多肽可如上所述来制备。

或者，对于由ERCC6L基因编码的多肽，可以把特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入该多肽的N或C端，从而将该多肽表达为包含该表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。能够利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP)形成的融合蛋白的载体是可商购的。另外，还报道了如下的融合蛋白，其通过导入仅由数个到十二个(adozen)氨基酸构成的小型表位加以制备，使融合不会改变ERCC6L多肽的性质。可以使用例如多组氨酸(His-标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、E-标签(单克隆噬菌体上的表位)等表位，和识别它们的单克隆抗体作为筛选与ERCC6L多肽结合的蛋白质的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))

在免疫沉淀中，将这些抗体添加到用合适去垢剂制备的细胞裂解物中而形成免疫复合体。免疫复合体由ERCC6L多肽、包含与该多肽结合的能力的多肽、和抗体组成。除了使用针对上述表位的抗体之外，还可以使用针对ERCC6L多肽的抗体进行免疫沉淀，这样的抗体可以如上文所述制备。免疫复合体可以被沉淀，例如当抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过蛋白A sepharose或蛋白G sepharose将其沉淀。如果将由ERCC6L基因编码的多肽制备成与表位(例如GST)的融合蛋白，则可以使用特异结合这些表位的物质，例如谷胱甘肽-sepharose 4B，按照与使用针对ERCC6L多肽的抗体的相同的方式来形成免疫复合体。

可遵循或根据，例如，文献中的方法来实施免疫沉淀(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。

普遍使用SDS-PAGE分析经免疫沉淀的蛋白，使用合适浓度的凝胶，可以利用结合蛋白的分子量来分析该蛋白。由于与ERCC6L多肽结合的蛋白难以通过考马斯兰染色或银染色等普通染色方法检测到，可以通过如下的方法提高蛋白的检测灵敏度：在含有放射性同位素³⁵S-甲硫氨酸或³⁵S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白，并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，可以直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶上纯化出靶蛋白并测定其序列。

作为利用ERCC6L多肽来筛选结合该多肽的蛋白的方法，可以使用例如West-Western印迹分析法(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))。特别地，与ERCC6L多肽结合的蛋白可以通过如下方法获得，从预期表达结合ERCC6L多肽的蛋白质的培养细胞利用噬菌体载体(例如ZAP)制备cDNA文库，在LB琼脂糖上表达蛋白，将表达出的蛋白固定在滤膜上，使纯化并且标记的ERCC6L多肽与上述滤膜反应，并依照标记物来检测表达与ERCC6L多肽结合的蛋白的噬菌斑。本发明的多肽可以利用生物素与抗生物素蛋白间的结合，或者利用特异结合ERCC6L多肽或与ERCC6L多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗体，来进行标记。也可以使用利用放射性同位素或荧光等的方法。

或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献见“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields andSternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。

在双杂交系统中，使本发明的多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，使该文库在被表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后，将cDNA文库导入到上述酵母细胞中，并从检测到的阳性克隆(当酵母细胞中表达出可与本发明多肽结合的蛋白时，两者的结合激活报告基因，使阳性克隆可检测)分离源自该文库的cDNA。通过将上面分离的cDNA导入到大肠杆菌中并表达该蛋白，可制备由该cDNA编码的蛋白。作为报告基因，除了HIS3基因之外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。

也可以用亲和色谱来筛选与ERCC6L多肽结合的物质。例如，可以把ERCC6L多肽固定在亲和柱的载体上，而将含有测试物质的组合物施加到该柱上。这里的组合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物、抗体文库等。在加载测试物质之后，冲洗柱子，从而可以收集得到结合于ERCC6L多肽的物质。当测试物质是蛋白质时，对所得蛋白质的氨基酸序列进行分析，根据该序列合成寡DNA，并用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库，从而获得编码该蛋白的DNA。

利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合物质的装置。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽(例如BIAcore，Pharmacia)，以表面等离子体共振信号的形式对ERCC6L多肽与测试物质间的相互作用进行实时的观察。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，就有可能对ERCC6L多肽与测试物质间的结合进行评估。

用于筛选当固定的ERCC6L多肽暴露于合成化学物质或天然物质文库或随机噬菌体肽展示文库时发生结合的分子的方法，以及使用基于组合化学技术的高通量筛选方法(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature 384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))，以不仅分离与ERCC6L蛋白结合的蛋白质，而且分离与ERCC6L蛋白结合的物质(包括激动剂和拮抗剂)的方法，是本领域技术人员众所周知的。

(ii)阻抑ERCC6L生物学活性的物质的筛选：

在本发明的背景中，ERCC6L蛋白特征在于具有促进癌细胞的细胞增殖的活性(图3)。本发明提供了利用此生物学活性作为指标，筛选可阻抑表达ERCC6L的癌细胞增殖的物质的方法，以及筛选用于治疗和/或预防癌症，特别是ERCC6-L相关癌症，诸如肺癌的物质的方法。因此，本发明提供了使用由ERCC6L基因编码的多肽来筛选治疗和/或预防癌症的候选物质的方法，其包括下列步骤：

(a)将测试物质与由ERCC6L多核苷酸编码的多肽(ERCC6L多肽)或其片段接触；

(b)检测步骤(a)所述多肽或片段的生物学活性；并

(c)选择与测试物质不存在时该多肽的生物学活性相比，阻抑由ERCC6L多核苷酸编码的多肽(ERCC6L多肽)或片段的生物学活性的测试物质。

依照本发明，可评估测试物质阻抑ERCC6L的生物学活性(例如细胞增殖活性)或候选物质治疗和/或预防癌症的治疗效果。因此，本发明亦提供了使用ERCC6L多肽或其片段来筛选阻抑ERCC6L的生物学活性的候选物质或用于治疗和/或预防癌症的候选物质的方法，其包括以下步骤：

a)将测试物质与ERCC6L多肽或其功能性片段接触；并

b)检测步骤a)的所述多肽或片段的生物学活性；并

c)将b)的生物学活性与所述测试物质的治疗效果关联起来。

或者，在一些实施方案中，本发明提供一种用于评估或估计测试物质治疗和/或预防癌症和/或抑制与ERCC6L过表达有关的癌症生长的治疗效果的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将测试物质与ERCC6L多肽或其功能性片段接触；

(b)检测步骤(a)所述多肽或片段的生物学活性；并

(c)将潜在治疗效果与测试物质关联起来，其中当较之测试物质不存在下检测到的由ERCC6L基因的多核苷酸编码的多肽的生物学活性，该物质阻抑所述多肽的生物学活性时显示潜在治疗效果。

此类癌症包括肺癌。

在本发明的背景中，治疗效果可以与ERCC6L多肽或其功能性片段的生物学活性关联起来。例如，当与某种测试物质不存在下检测到的水平相比该测试物质阻抑或抑制ERCC6L多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试物质鉴定或选择为具有治疗效果的候选物质。或者，当与某种测试物质不存在时检测到的水平相比该测试药剂或化合物不阻抑或抑制ERCC6L多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试物质鉴定为没有显著治疗效果的物质。本发明所述方法将在下面更加详细的加以描述。

任何ERCC6L多肽均可用于筛选，只要它们阻抑ERCC6L蛋白的生物学活性即可。这样的生物学活性包括ERCC6L蛋白的细胞增殖活性(在本文中也称作“细胞增殖增强活性”或“细胞增殖促进活性”)、螺旋酶活性、ATP酶活性和Plk1结合活性。举例而言，可使用ERCC6L蛋白，亦可使用与这些蛋白功能上等价的多肽。上述多肽可由细胞内源或外源地表达。

在另一个方面，本发明还提供遵循上文“筛选”一节中描述的方法进行的筛选方法，此类方法包括下述步骤：

a)使测试物质与ERCC6L多肽或其片段接触；

b)检测所述多肽或片段和所述测试物质之间的结合；

c)选择与所述多肽结合的测试物质；

d)使步骤c)中选择的测试物质与ERCC6L多肽或其片段接触；

e)将所述多肽或片段的生物学活性与在所述物质不存在下检测到的生物学活性比较；并

f)选择阻抑所述多肽的生物学活性的物质作为用于治疗或预防肺癌的候选物质。

通过本筛选分离的物质是ERCC6L基因编码的多肽的拮抗剂的候选者。术语“拮抗剂”是指通过结合多肽而抑制多肽功能的分子。该术语还指可降低或抑制编码ERCC6L的基因的表达的分子。而且，通过本筛选分离的物质是如下物质的候选物，所述物质抑制ERCC6L多肽与分子(包括DNA和蛋白)的体内相互作用。

当本方法中要检测的生物学活性是细胞增殖时，可以通过例如如下方法进行检测：制备表达ERCC6L多肽的细胞，在测试物质的存在下培养细胞，确定细胞增殖速度，测量细胞周期等，以及通过测量存活细胞或集落形成能力，例如图3所示。选择降低表达ERCC6L的细胞的增殖速度的物质作为治疗或预防癌症的候选物质。

更具体而言，该方法包括以下步骤：

(a)使测试物质与过表达ERCC6L的细胞接触；

(b)测量细胞增殖活性；并

(c)选择与测试物质不存在下的细胞增殖活性相比降低细胞增殖活性的测试物质。

在优选的实施方案中，本发明的方法可进一步包括以下步骤：

(d)选择对很少或不表达ERCC6L的细胞没有影响的测试物质。

短语“阻抑生物学活性”在此定义为较之不存在所述物质时，对ERCC6L生物学活性的优选至少10％的阻抑，更优选至少25％、50％或75％的阻抑，且最优选至少90％的阻抑。

在优选的实施方案中，使用不表达ERCC6L多肽的对照细胞。因而，本发明还提供了使用ERCC6L多肽或其片段来筛选抑制细胞生长的候选物质或用于治疗和/或预防ERCC6L相关疾病的候选物质的方法，包括下列步骤：

a)在测试物质存在下培养表达ERCC6L多肽或其功能性片段的细胞和不表达ERCC6L多肽或其功能性片段的对照细胞；

b)检测表达所述蛋白的细胞和对照细胞的生物学活性；并

c)选择与对照细胞中及所述测试物质不存在下检出的增殖相比抑制表达所述蛋白的细胞中的生物学活性的测试物质。如本文中揭示的，阻抑ERCC6L的生物学活性则降低细胞生长。如此，通过筛选抑制ERCC6L生物学活性的候选物质，可鉴定出可用于治疗和/或预防癌症的候选物质。可通过二次和/或更进一步筛选来评估这些候选物质治疗或预防癌症的潜力以鉴定用于癌症的治疗性物质、化合物或作用剂。例如，当抑制ERCC6L蛋白生物学活性的物质也抑制癌症的活性时，可得出此类物质具有ERCC6L特异性治疗效果的结论。

II.改变ERCC6L表达的物质的筛选：

在本发明的背景中，通过siRNA降低ERCC6L表达导致对癌细胞增殖的抑制(图2ABC)。因而，本发明提供了筛选抑制ERCC6L表达的物质的方法。抑制ERCC6L表达的物质可望能够阻抑癌细胞增殖，并因此对治疗或预防癌症，特别是ERCC6L相关癌症，诸如肺癌有用。因此，本发明亦提供了筛选阻抑癌细胞增殖的物质的方法，以及筛选治疗或预防癌症的候选物质的方法。在本发明的背景中，上述筛选可包括，例如，下列步骤：

(a)将测试物质与表达ERCC6L的细胞接触；

(b)选择与对照相比降低ERCC6L表达水平的测试物质。

在本发明的背景中，此类筛选方法可包括例如下述步骤：

a)将测试物质与表达ERCC6L基因的细胞接触；

b)检测ERCC6L基因的表达水平；并

c)将b)的表达水平与所述测试物质的治疗效果关联起来。

在本发明的背景中，治疗效果可以与ERCC6L基因表达水平关联起来。例如，当与某种测试物质不存在下检测到的水平相比该测试物质降低ERCC6L基因的表达水平时，可将所述测试物质鉴定或选择为具有治疗效果的候选物质。或者，当与某种测试物质不存在下检测到的水平相比该测试物质不降低ERCC6L基因表达水平时，可将所述测试物质鉴定为没有显著治疗效果的物质。

下面将更加详细地描述本发明的方法。

表达ERCC6L的细胞包括，例如，自肺癌建立的细胞系或经ERCC6L表达载体转染的细胞系；任何这样的细胞可用于上述本发明的筛选。可用本领域技术人员众所周知的方法，例如，RT-PCR、Northern印迹分析、Western印迹分析、免疫染色与流式细胞分析来估计表达水平。在此定义的短语“降低表达水平”优选为较之在所述物质不存在时的表达水平，至少使ERCC6L表达水平降低至少10％，更优选降低至少25％、50％或75％，最优选降低至少95％的水平。本文中的物质包括化学化合物、双链核苷酸等等。下面会描述双链核苷酸的制备。在筛选方法中，可选择降低ERCC6L表达水平的物质作为候选物质用来治疗或预防癌症。

或者，本发明的所述筛选方法可包括下列步骤：

(a)将测试物质与导入了包含ERCC6L转录调控区域与在该转录调控区域控制下表达的报道基因的载体的细胞接触；

(b)测量所述报道基因的表达或活性；并

(c)选择降低所述报道基因的表达或活性的测试物质。

合适的报道基因和宿主细胞在本领域是众所周知的。例示性报道基因包括但不限于萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、Laz与beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)，而宿主细胞为COS7、HEK293、HeLa等。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与ERCC6L基因转录调控区域连接来制备。本文所述的ERCC6L基因转录调控区域是从转录起始位点至至少500bp上游的区域，优选1000bp，更优选5000或10000bp上游。含有所述转录调控区域的核苷酸片段可从基因组文库中分离出来，或可通过PCR扩增。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与所述基因的转录调控区域连接来制备。鉴别转录调控区域的方法，以及其测定法规程都是众所周知的(Molecular Cloning，第三版，第17章，2001，Cold Springs Harbor LaboratoryPress)。

将含有所述报道构建体的载体转导入宿主细胞，且用本领域众所周知的方法检测报道基因的表达或活性(例如，使用照度计(luminometer)、吸收光谱仪、流式细胞仪等等)。在此定义的“降低表达或活性”优选较之在所述测试物质不存在时，报道基因的表达或活性优选地被降低至少10％，更优选地，降低25％、50％或75％，最优选地，降低至少95％。

或者，在一些实施方案中，本发明还提供一种用于评估或估计测试物质治疗或预防癌症或抑制与ERCC6L过表达有关的癌症的治疗效果的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使测试物质与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含ERCC6L的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因；

(b)测量所述报道基因的表达水平或活性；并

(c)将潜在治疗效果与测试物质关联起来，其中当测试物质降低所述报道基因的表达水平或活性时显示潜在治疗效果。

依照本发明，可评估测试物质抑制细胞生长或候选物质治疗或预防ERCC6L相关疾病的治疗效果。因此，本发明还提供用于筛选阻抑癌细胞增殖的候选物质的方法，及筛选用于治疗或预防ERCC6L相关疾病的候选物质的方法。

依照另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括以下步骤：

(a)使测试物质与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含ERCC6L基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因；

(b)检测所述报道基因的表达水平或活性；并

(c)将(b)的表达水平与测试物质的治疗效果关联起来。

在本发明中，治疗效果可以与所述报道基因的表达水平或活性关联起来。例如，当与某种测试物质不存在下检测到的水平相比该测试物质降低所述报道基因的表达水平或活性时，可将所述测试物质鉴定或选择为具有治疗效果的候选物质。或者，当与某种测试物质不存在下检测到的水平相比该测试物质不降低所述报道基因的表达水平或活性时，可将所述测试物质鉴定为没有显著治疗效果的物质。

通过筛选(i)结合ERCC6L多肽；(ii)阻抑/降低ERCC6L多肽的生物学活性(例如细胞增殖活性)；或(iii)降低ERCC6L基因的表达水平的候选物质，可鉴定出有可能治疗或预防癌症(例如肺癌)的候选物质。可通过二次和/或更进一步筛选这些候选物质来评估治疗效果以鉴定用于癌症的治疗性物质。例如，当与ERCC6L多肽结合的物质抑制癌症的上述活性时，可得出此类物质具有ERCC6L特异性治疗效果的结论。

双链分子：

如本文中使用的，术语“分离的双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，而且包括例如短干扰RNA(siRNA；例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干扰DNA/RNA(siD/R-NA；例如DNA和RNA的双链嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合物(shD/R-NA))。

如本文中使用的，“靶序列”是基因的mRNA或cDNA序列内的下述核苷酸序列，如果将本发明的双链核酸分子导入表达该基因的细胞内的话，会导致整个mRNA的翻译受到阻抑。对于基因的mRNA或cDNA序列内的某个核苷酸序列，若包含与靶序列对应的序列的双链多核苷酸抑制表达该基因的细胞中该基因的表达，则可确定为靶序列。阻抑基因表达的双链多核苷酸可以由靶序列和长度为2至5个核苷酸的3’突出端(例如uu)的组成。

当靶序列通过cDNA序列来显示时，使用双链cDNA的有义链序列(即将mRNA序列转换成DNA序列而得到的序列)来限定靶序列。双链分子包含有义链(其具有与靶序列对应的序列)和反义链(具有与靶序列互补的序列)，而且该反义链与该有义链在互补序列处杂交以形成双链分子。

在本文中，短语“与…对应”表示依照构成双链分子有义链的核酸的种类来转换靶序列。例如，当靶序列以DNA序列显示且双链分子的有义链具有RNA区时，将该RNA区内的碱基“t”替换为碱基“u”。另一方面，当靶序列以RNA序列显示且双链分子的有义链具有DNA区时，将该DNA区内的碱基“u”替换为“t”。在本发明的背景中，靶序列主要以DNA显示。换言之，本发明还提供如下的双链分子，其靶序列包括或限于以DNA显示的SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8，但可以替换为RNA。

还有，对于双链分子的反义链，与靶序列互补的序列可依照构成反义链的核酸的种类来限定。

除与靶序列对应的序列及其互补序列之外，双链分子还可具有一个或两个长度为2至5个核苷酸的3’突出端(例如uu)和/或连接有义链和反义链的环序列以形成发夹结构。

本文中使用的术语“siRNA“指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括ERCC6L有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、ERCC6L反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。

本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。所述两条链的核苷酸序列可不仅包含选自靶基因序列中蛋白质编码序列的“有义”或“反义”RNA，亦可包括具有选自所述靶基因非编码区域的核苷酸序列的RNA分子。

在本说明书中使用的术语“shRNA”是指：具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链．ntervening single-strand)”

在本说明书中使用的术语“siD/R-NA”是指包含RNA和DNA二者的双链多核苷酸分子，包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，其阻止靶mRNA的翻译。在本说明书中，杂合体表示这样的分子，其中由DNA组成的多核苷酸和由RNA组成的多核苷酸相互杂交形成双链分子；而嵌合体表示组成所述双链分子的链中的一条或两条可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞的常规技术。所述siD/R-NA包括ERCC6L有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、ERCC6L反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。siD/R-NA可以这样构建，使单个转录物同时具有来自靶基因的有义核酸序列和互补反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。

在本文中使用的术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，所述两个分子包含彼此互补的序列并且已经藉由所述互补序列退火在一起而形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅仅包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包含具有选自靶基因非编码区的核苷酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个由RNA和DNA二者组成(嵌合体分子)，或者一个分子由RNA组成而另一个由DNA组成(杂合双链)。

在本文中使用的术语“shD/R-NA”是指具有茎-环结构的siD/R-NA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使它们之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。本说明书中使用的“分离的核酸”是指：从本来的环境(例如自然出现时的自然环境)中被取出，与其自然状态相比发生了合成性的改变的核酸。在本发明的背景中，分离的核酸包括DNA、RNA和它们的衍生物。

与靶mRNA杂交的针对ERCC6L的双链分子通过与正常单链mRNA基因转录物结合，干扰其翻译，抑制蛋白质表达，来降低或抑制由ERCC6L基因编码的ERCC6L蛋白的产生。如本文中证明的，数种癌细胞系中ERCC6L的表达通过dsRNA得到抑制(图2)。因此，本发明提供了能够在导入表达ERCC6L基因的细胞后抑制该基因表达的分离双链分子。所述双链分子的靶序列可通过siRNA设计算法来设计，

例如下述的。ERCC6L靶序列的例子包括例如SEQ ID NO：7和8的核苷酸。

本发明中特别感兴趣的是下列双链分子[1]至[18]：

[1]一种分离的双链分子，它当被导入细胞后，抑制ERCC6L的体内表达和细胞增殖，所述分子包括有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成所述双链分子；

[2][1]中所述的双链分子，其中所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与靶序列SEQ ID NO：7或8匹配；

[3][2]中所述的双链分子，其中所述有义链包括对应于靶序列SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列；

[4][3]中所述的双链分子，其中有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子具有少于约100个核苷酸对的长度；

[5][4]中所述的双链分子，其中有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子具有少于约75个核苷酸对的长度；

[6][5]中所述的双链分子，其中有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子具有少于约50个核苷酸对的长度；

[7][6]中所述的双链分子，其中有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子具有少于约25个核苷酸对的长度；

[8][7]中所述的双链分子，其中有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子具有约19到约25个核苷酸对的长度；

[9][1]中所述的双链分子，其由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；

[10][9]中所述的双链分子，其具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与靶序列SEQ ID NO：7或8对应的序列的有义链，[B]为由3个～23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与靶序列互补的序列的反义链；

[11][1]中所述的双链分子，其由RNA构成；

[12][1]中所述的双链分子，其由DNA和RNA构成；

[13][12]中所述的双链分子，其中所述分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；

[14][13]中所述的双链分子，其中所述有义链与反义链分别由DNA与RNA构成；

[15][12]中所述的双链分子，其中所述分子为DNA与RNA的嵌合体；

[16][15]中所述的双链分子，其中反义链3’端侧翼的区域为RNA，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均为RNA；

[17][16]中所述的双链分子，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；

[18][2]中所述的双链分子，其中所述分子包含3’突出端。

本发明所述的双链分子将在下面更详细描述。设计具有抑制细胞内靶基因表达能力的双链分子的方法是已知的(见例如，美国专利No.6,506,559，本文通过提述并入其全部内容)。例如，可以从Ambion网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)访问用于设计siRNA的计算机程序。

该计算机程序可以根据如下的规程选择双链分子的靶核苷酸序列。

靶点的选择：

1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描搜寻AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3’侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶点。Tuschl等不建议针对5’和3’非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白质的结合位点，而UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。

2.将潜在靶点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列具有显著同源性的靶序列排除在考虑之外。主要使用BLAST(Altschul SF等，Nucleic Acids Res 1997 Sep 1，25(17)：3389-402)，其可见于NCBI服务器：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

3.选择合格的靶序列用于合成。通常沿着待评估的基因的长度选择几个靶序列。

使用上述规程，设计本发明的用于ERCC6L基因的分离的双链分子的靶序列为SEQ ID NO：7和8。

分别对以上述靶序列为目标的双链分子检查其阻抑表达靶基因细胞生长的能力。因此，本发明提供用于ERCC6L基因的以SEQ ID NO：7和8的序列为靶标的双链分子。本发明的双链分子可以针对一种靶ERCC6L基因序列或者可以针对多种靶ERCC6L基因序列。

靶向上文所述ERCC6L基因靶序列的本发明双链分子包括含有靶序列的核酸序列和/或与靶序列互补的序列的分离的多核苷酸。靶向ERCC6L基因的多核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO：7或8的序列和/或与这些核苷酸互补的序列的多核苷酸；然而，本发明并不仅限于这个例子，且上述核酸序列中次要修饰是可以接受的，只要所述经修饰分子保留阻抑ERCC6L基因表达的能力。本文中，短语“次要修饰”当用于和核酸序列相关时表示对所述序列替换、缺失、添加或插入一个、两个或数个核酸。

在一个实施方案中，双链分子由两条多核苷酸构成，一条多核苷酸具有与靶序列对应的序列，即有义链，而另一条多核苷酸具有与靶序列互补的序列，即反义链。有义链多核苷酸和反义链多核苷酸彼此杂交以形成双链分子。此类双链分子的例子包括dsRNA和dsD/R-NA。

在另一个实施方案中，双链分子由一条多核苷酸构成，其具有与靶序列对应的序列(即有义链)和与靶序列互补的序列(即反义链)二者。一般地，有义链和反义链通过间插链连接，且彼此杂交以形成发夹环结构。此类双链分子的例子包括shRNA和shD/R-NA。

换言之，本发明的双链分子包含有义链多核苷酸(其具有靶序列的核苷酸序列)和反义链多核苷酸(其具有与靶序列互补的核苷酸序列)，而且这两种多核苷酸彼此杂交以形成双链分子。在包含所述各多核苷酸的双链分子中，两条链任一或二者的多核苷酸的一部分可以是RNA，而且当靶序列用DNA序列来限定时，靶序列及其互补序列内的核苷酸“t”用“u”替换。

在本发明的一个实施方案中，本发明的此类双链分子包含茎-环结构，其由有义链和反义链构成。有义链和反义链可通过环连接。因而，本发明还提供包含单一多核苷酸的双链分子，该多核苷酸含有有义链和反义链二者，该有义链和反义链通过间插单链连接或侧翼为间插单链。

在本发明中，靶向ERCC6L基因的双链分子可具有选自SEQ ID NO：7或8的序列作为靶序列。因而，本发明的双链分子的优选例包括多核苷酸及其互补序列，和具有与SEQ ID NO：7和8对应的序列及其互补序列的多核苷酸。

在本发明的背景中，术语“数个”当用于核酸替换、缺失、添加和/或插入时可意指3-7个，优选3-5个，更优选3-4个，进一步更优选是3个核酸残基。

根据本发明，本发明的双链分子可用实施例中使用的方法检测其能力。在本文中下述的实施例中，在体外对包含ERCC6L基因的mRNA不同部分的有义链或其互补的反义链的双链分子测验其在癌细胞系中降低ERCC6L基因产物产生的能力。进一步，例如，较之在没有候选分子情况下培养的细胞，在与候选双链分子接触的细胞中ERCC6L基因产物的减少可由，例如，使用在实施例1“半定量逆转录RT-PCR”项中的针对ERCC6L mRNA的引物的RT-PCR来加以检测。然后，可对在体外基于细胞的分析中减少ERCC6L基因产物的序列检测其针对细胞生长的抑制作用。然后可对在体外基于细胞的分析中抑制细胞生长的序列使用患癌症动物检测其体内的相应能力，以证实ERCC6L基因产物的产生降低与癌细胞生长降低，所述动物的例子包括裸小鼠异种移植模型。

当所述分离多核苷酸是RNA及其衍生物时，核苷酸序列中的“t”应替换为“u”。本文中使用的术语“互补”指多核苷酸中核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，且术语结合意指两个多核苷酸间物理的或化学的相互作用。当所述多核苷酸包含修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯酶联接时，这些多核苷酸亦可以同样地发生相互结合。一般而言，互补多核苷酸序列在合适条件下杂交以形成包含很少或没有错配的稳定双链体。进一步，本发明中所述分离多核苷酸的有义链与反义链可通过杂交形成双链分子或发夹环结构。在优选实施方案中，上述双链体在每10个匹配中包含不超过一个错配。在特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，这样的双链体不包含错配。

对ERCC6L所述多核苷酸长度优选少于7006个核苷酸。举例而言，对所述的基因，多核苷酸长度小于500、200、100、75、50或25个核苷酸。本发明中所述分离多核苷酸对形成针对ERCC6L基因的双链分子，或制备编码双链分子的模板DNA是有用的。当所述多核苷酸用于形成双链分子时，所述多核苷酸可长于19个核苷酸，优选长于21个核苷酸，且更加优选长度在约19与25个核苷酸之间。

因而，本发明提供了包含有义链和反义链的双链分子，其中有义链是与靶序列对应的核苷酸序列。在优选的实施方案中，有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为19至25个核苷酸对的双链分子。

当将双链分子导入细胞中时，双链分子充当RISC复合物识别mRNA中同源序列的向导。被识别的靶RNA受到Dicer核酸酶活性切割和降解，由此双链分子最终降低或抑制由该RNA编码的多肽的生成(表达)。因此，本发明的双链分子可通过其生成在严格条件下与ERCC6L基因的mRNA特异性杂交单链的能力来定义。在本文中，mRNA中与自双链分子生成的单链杂交的部分称作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本发明的背景中，“靶序列”的核苷酸序列不仅可使用mRNA的RNA序列来显示，而且还可以使用自mRNA合成的cDNA的DNA序列来显示。

本发明中所述双链分子可包含一个或更多修饰核苷酸和/或非磷酸二酯连接。本领域众所周知的化学修饰具有增加所述双链分子的稳定性、可用性和/或细胞摄入的能力。一般技术人员明白本发明分子可包含的其它类型的化学修饰(WO03/070744；WO2005/045037)。在一个实施方案中，可使用修饰以提供改善的抗降解性或改善的摄入。上述修饰的例子包括但不仅限于，硫代磷酸酯联接、2’-O-甲基核糖核苷酸(特别是在双链分子的有义链上)、2’-脱氧-氟代核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5’-C-甲基核苷酸以及倒转脱氧脱碱基残基的掺入(US20060122137)。

另一个实施方案中，可以使用修饰来增强双链分子的稳定性或增加寻靶效率。这样的修饰包括但不限于双链分子两条互补链之间的化学交联、双链分子一条链的3’或5’末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰、2-氟代修饰的核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸(WO2004/029212)。在另一个实施方案中，修饰可以用于增加或减少针对靶mRNA中和/或互补双链分子链中互补核苷酸的亲和力(WO2005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮(7-deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一个实施方案中，当双链分子是具有3’突出端的双链分子时，可以把3’-末端核苷酸的突出核苷酸替换成脱氧核糖核苷酸(Elbashir SM等，Genes Dev 2001 Jan 15，15(2)：188-200)。关于进一步的细节，可以利用公开文献如US20060234970。本发明不限于这些实例，可以将任何已知化学修饰应用于本发明的双链分子，只要所得分子保留抑制靶基因表达的能力。

此外，本发明的双链分子可以包含DNA和RNA二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。具体而言，由DNA链与RNA链形成的杂合多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸表现出提高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA链(多核苷酸)组成的杂合型双链分子、或在任一单链(多核苷酸)或两条单链(多核苷酸)上同时包含DNA和RNA的嵌合型双链分子，诸如此类，来增强所述双链分子的稳定性。

DNA链和RNA链的杂合体可以是这样的，其中有义链是DNA而反义链是RNA，或者相反，只要它在导入表达靶基因的细胞中后能够抑制该基因表达。优选地，有义链多核苷酸是DNA而反义链多核苷酸是RNA。同样，嵌合型双链分子可以是这样的，其中有义链和反义链均由DNA和RNA组成，或者有义链或反义链中的任一条由DNA和RNA组成，只要在导入表达靶基因的细胞中时，所述双链分子具有抑制该基因表达的活性即可。为了提高双链分子的稳定性，分子中优选包含尽可能多的DNA；而为了诱导靶基因的表达抑制，要求分子在一定范围内是RNA，以充分地诱导表达抑制。

作为嵌合型双链分子的一个优选实例，双链分子的上游部分区域(即位于有义链或反义链内的靶序列或其互补序列之侧翼的区域)为RNA。优选地，所述上游部分区表示有义链的5’侧(5’端)和反义链的3’侧(3’端)。或者，将位于有义链5’末端侧翼或者反义链3’末端侧翼的区域称为上游部分区域。就是说，在优选实施方案中，反义链3’末端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’末端侧翼的区域和反义链3’末端侧翼的区域均由RNA组成。例如，本发明的嵌合型或杂合型双链分子包含以下组合。

有义链：

5’-[---DNA---]-3’

3’-(RNA)-[DNA]-5’

：反义链，

有义链：

5’-(RNA)-[DNA]-3’

3’-(RNA)-[DNA]-5’

：反义链，和

有义链：

5’-(RNA)-[DNA]-3’

3’-(---RNA---)-5’

：反义链。

上游部分区优选是由9-13个核苷酸组成的域，从双链分子的有义链或反义链内的靶序列或其互补序列的末端算起。此外，这种嵌合型双链分子的优选实例包括这样的实例：链长为19-21个核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半区(对于有义链为5’侧区域而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在这样的嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比反义链整体为RNA时强得多(US20050004064)。

在本发明的背景中，双链分子可以形成发夹结构，例如短发夹RNA(shRNA)以及由DNA与RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成紧密的发夹转弯，可以用来通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA在单一链上包含有义靶标序列和反义靶标序列，其中所述序列被环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA进一步与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。这种复合物结合并切割与所述dsRNA或dsD/R-NA的靶标序列匹配的mRNA。

为了形成发夹环结构，可以在有义序列与反义序列之间设置由任意核苷酸序列构成的环序列。因此，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的双链分子。式中，[A]为有义链，包含与靶序列对应的核苷酸序列；[B]为间插单链；[A′]为反义链，包含与靶序列互补的序列。靶序列可以选自例如用于ERCC6L的SEQ ID NO：7和8。

本发明不限于这些实例，在双链分子保持抑制作为靶标的ERCC6L基因的表达的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在这些实例的基础上修饰而得到的序列。区域[A]与[A′]杂交而形成由区域[B]构成的环。间插单链部分[B]、即环序列，长度优选可以为3～23个核苷酸。例如，环序列可以选自由以下的序列组成的组(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al.，Nature 2002Jul 25，418(6896)：435-8，Epub 2002 Jun 26)：

CCC、CCACC或CCACACC：Jacque JM et al.，Nature 2002 Jul 25，418(6896)：435-8，Epub 2002 Jun 26；

UUCG：Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May，20(5)：500-5；Fruscoloni Pet al.，Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18，100(4)：1639-44，Epub 2003 Feb10；和

UUCAAGAGA：Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun，4(6)：457-67。

优选的具有本发明的发夹环结构的双链分子实例如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自由AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA组成的组；但本发明不限于此：

CUGCACAACCAACUCUUUG-[B]-CAAAGAGUUGGUUGUGCAG

(对于靶序列SEQ ID NO：7)。

AUGUUAAUCAAUAACUGGC-[B]-GCCAGUUAUUGAUUAACAU

(对于靶序列SEQ ID NO：8)。

此外，为了增强双链分子的抑制活性，可以将数个核苷酸添加到靶序列的有义链和/或反义链的3’末端，作为3’突出端。构成3’突出端的核苷酸的优选例包括但不限于“t”和“u”。添加的核苷酸的数目为至少2个，通常为2-10个，优选为2-5个。添加的核苷酸在双链分子的反义链的3’末端形成单链。在双链分子由单一多核苷酸组成以形成发夹环结构的情况中，可以将3’突出端添加至单一多核苷酸的3’末端。

对于双链分子的制备方法没有特殊限制，但优选采用本技术领域公知的化学合成方法。根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后采用适当的方法使它们退火到一起，来获得双链分子。退火的具体例子包括其中将合成的单链多核苷酸以优选至少约3∶7、更优选约4∶6、最优选基本上等摩尔量(即约5∶5的摩尔比)的摩尔比混合。然后，将混合物加热到双链分子解离的温度，再缓慢冷却。经退火的双链多核苷酸可以采用本技术领域公知的常用方法来纯化。纯化方法的例子包括：利用琼脂糖凝胶电泳的方法，或者其中任选地除去剩余的单链多核苷酸(例如利用适当的酶进行降解)的方法。

所述位于ERCC6L序列侧翼的调控序列可为相同或不同的，以使得它们的表达能够独立地，或者以时间性或空间性方式被调控。所述双链分子可通过将ERCC6L基因模板克隆入载体(例如含有来自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III转录单元或人类H1RNA启动子的载体)以在胞内进行转录。

或者，双链分子可在胞内转录，即将其编码序列克隆入含有与编码区相邻的指导双链分子在适当细胞中表达的调节序列(例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA poly III转录单元或人H1RNA启动子)的载体中。双链分子的编码序列侧翼的调节序列可以相同或不同，使得它们的表达可独立调控，或者以时间或空间方式调控。下面会描述能够生成双链分子的载体的详情。

含有本发明双链分子的载体：

如上所述，本发明包括含有一种或多种本文所述的双链分子的载体、以及包含该载体的细胞。本发明中特别感兴趣的是下列载体[1]至[10]。

[1]一种载体，它编码当被导入细胞后，抑制ERCC6L的体内表达和细胞增殖的双链分子，其中所述分子包含有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成所述双链分子。

[2][1]中所述的载体，它编码对mRNA作用的双链分子，所述mRNA与靶序列SEQ ID NO：7或8匹配；

[3][1]中所述的载体，其中有义链包括对应于靶序列SEQ ID NO：7或8的序列；

[4][3]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度小于约100个核苷酸对的双链分子；

[5][4]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度小于约75个核苷酸对的双链分子；

[6][5]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度小于约50个核苷酸对的双链分子；

[7][6]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度小于约25个核苷酸对的双链分子；

[8][7]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为约19个至约25个核苷酸对的双链分子；

[9][1]中所述的载体，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；和

[10][9]中所述的载体，它编码具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′的双链分子，其中，[A]为包含与靶序列SEQ ID NO：7或8对应的序列的有义链，[B]为由3个至23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与靶序列互补的序列的反义链；

本发明的载体优选编码处于可表达的形式的本发明的双链分子。在本说明书中，术语“处于可表达的形式”，是指该载体当被导入细胞中时，将表达该分子。在优选的实施方案中，载体包含双链分子表达所必需的调节元件。本发明的这种载体可以用于产生本发明的双链分子，也可以直接用作癌症治疗的活性成分。

本发明的载体可通过下述方法生成：例如，将ERCC6L序列克隆入表达载体中，使调控序列可操作性地连接于ERCC6L序列，以允许两条链的表达(通过DNA分子的转录)(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May，20(5)：500-5)。例如，与mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如位于克隆DNA的3’末端侧翼的启动子序列)转录，对mRNA而言为有义链RNA分子由第二启动子(例如位于克隆DNA的5’末端侧翼的启动子序列)转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默该基因的双链分子构建体。或者，使用分别编码双链分子之有义链和反义链的两个载体构建体来分别表达有义链和反义链，随后形成双链分子构建体。而且，克隆的序列可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，即，载体的单一转录物同时包含靶基因的有义序列和互补反义序列二者。

也可以配置本发明的载体使得其实现在靶细胞的基因组中的稳定插入(关于同源重组盒载体的说明，参见Thomas KR&Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12)。可以参考例如：Wolff等，Science 1990，247：1465-8；美国专利第5,580,859号、第5,589,466号、第5,804,566号、第5,739,118号、第5,736,524号、第5,679,647号和WO 98/04720。基于DNA的输送技术的例子包括：“裸DNA”、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导型)输送、阳离子脂质复合体、和粒子介导型投递(“基因枪”)或压力介导型输送(例如参照美国专利第5,922,687号)。

本发明的载体包括，例如，病毒载体或细菌载体。表达载体的例子包括牛痘或鸡痘等减毒病毒宿主(参照美国专利第4,722,848号)。该策略涉及例如使用牛痘病毒作为载体来表达编码双链分子的核苷酸序列。重组牛痘病毒在被导入表达靶基因的细胞时即表达该分子并由此抑制细胞的增殖。可使用的载体的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG载体在Stover等，Nature 1991，351：456-60中有记载。其它多种多样的载体可用于双链分子的治疗性施用与生产，例子包括腺病毒载体和腺随伴病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。可以参照例如Shata等，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock等，J Leukoc Biol 2000，68：793-806；以及Hipp等，In Vivo 2000，14：571-85。

使用本发明双链分子抑制或降低癌细胞生长及治疗癌症的方法：

在本发明中，测试针对ERCC6L的dsRNA抑制细胞生长的能力。针对ERCC6L的dsRNA(图2B，C)有效敲低了该基因在数种癌细胞系中的表达，这与对细胞增殖的阻抑一致。

因而，本发明提供了抑制癌细胞生长的方法，所述方法通过抑制ERCC6L的表达来诱导ERCC6L基因的功能障碍。ERCC6L基因表达可通过任何上文所述特异性靶向ERCC6L基因的本发明双链分子来抑制。

上述本发明双链分子及载体抑制癌性细胞的细胞生长的能力提示其可用于治疗癌症，诸如肺癌的方法。因此，发明提供通过施用针对ERCC6L基因的双链分子或表达所述分子的载体来治疗罹患癌症患者而无不良作用的方法，因为正常器官中几乎检测不到ERCC6L基因(图1C)。

本发明中特别感兴趣的是下列[1]至[32]的方法：

[1]一种用于抑制癌细胞生长或治疗癌症的方法，其中所述癌细胞或癌症表达至少一种ERCC6L基因，该方法包括施用至少一种抑制过表达ERCC6L基因的细胞中该基因表达和细胞增殖的分离的双链分子或编码该双链分子的载体的步骤，其中该双链分子包含有义链及其互补反义链，它们彼此杂交以形成该双链分子；

[2][1]的方法，其中所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与靶序列SEQID NO：7或8匹配；

[3][2]的方法，其中有义链包含与靶序列SEQ ID NO：7或8对应的序列；

[4][1]的方法，其中要治疗的癌症是肺癌；

[5][3]的方法，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度小于大约100个核苷酸对；

[6][5]的方法，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度小于大约75个核苷酸对；

[7][6]的方法，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度小于大约50个核苷酸对；

[8][7]的方法，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度小于大约25个核苷酸对；

[9][8]的方法，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度为大约19个至大约25个核苷酸对；

[10][1]的方法，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；

[11][10]的方法，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与靶序列SEQ ID NO：7或8对应的序列的有义链，[B]为由3个～23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与靶序列互补的序列的反义链；

[12][1]的方法，其中所述双链分子是RNA；

[13][1]的方法，其中所述双链分子包含DNA和RNA；

[14][13]的方法，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；

[15][14]的方法，其中所述有义与反义链多核苷酸分别由DNA与RNA构成；

[16][13]的方法，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体；

[17][16]的方法，其中反义链3’端侧翼的区域由RNA构成，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均由RNA构成；

[18][17]的方法，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；

[19][1]的方法，其中所述双链分子包含3’突出端；

[20][1]的方法，其中所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和可药用的担载体。

[21][1]的方法，其中所述双链分子由载体编码；

[22][21]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与靶序列SEQ ID NO：7或8匹配；

[23][22]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链包含与选自SEQ ID NO：7和8的靶序列对应的序列；

[24][23]的方法，其中要治疗的癌症是肺癌；

[25][23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约100个核苷酸对；

[26][25]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约75个核苷酸对；

[27][26]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约50个核苷酸对；

[28][27]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约25个核苷酸对；

[29][28]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度为大约19个至大约25个核苷酸对；

[30][21]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；

[31][30]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与靶序列SEQ ID NO：7或8对应的序列的有义链，[B]为由3个至23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与靶序列互补的序列的反义链；

[32][21]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和可药用的担载体。

本发明方法将在下面更加详细的加以描述。

可通过将细胞与针对ERCC6L基因的双链分子、表达该分子的载体或包含同样分子的组合物接触来抑制表达ERCC6L基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞，以较低速率增殖或具有降低的存活力。细胞生长可通过本领域已知技术测定，例如使用MTT细胞增殖测定。任何种类的细胞的生长均可根据本方法进行阻抑，只要所述细胞表达或过表达本发明所述双链分子的靶基因。可作为例子的细胞包括肺癌细胞。

因此，对于正罹患或有风险发生与ERCC6L有关的疾病的患者，可通过施用本发明的双链分子、表达所述分子的至少一种载体或包含所述分子的组合物进行治疗。举例而言，罹患癌症的患者可根据本发明的方法进行治疗。癌症类型可通过根据所诊断的特定类型肿瘤的标准方法来进行鉴定。更优选地，用本发明所述方法治疗的患者是用这样的方法选出的：在来自患者的活检中通过RT-PCR或免疫测定法检测ERCC6L的表达。优选地，在本发明的治疗之前，对于来自受试者的所述活检标本通过本领域所知的方法，例如，免疫组织化学分析或RT-PCR，证实ERCC6L基因的过表达。

根据本发明的方法，为抑制细胞生长并藉此治疗癌症，通过施用多种所述双链分子(或表达多种所述双链分子的载体或含有多种所述双链分子的组合物)，每个所述分子可具有不同结构，但作用于与相同ERCC6L靶序列匹配的mRNA。或者，多种双链分子可作用于与相同基因的不同靶序列匹配的mRNA。或者，例如，本方法可利用针对ERCC6L的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

为抑制细胞生长，本发明的双链分子可直接以可实现该分子与对应mRNA转录物结合的形式导入细胞。另外，如上所述，编码双链分子的DNA可作为载体导入细胞。为将双链分子和载体导入细胞，可使用转染增强剂，例如FuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)与Nucleofector(Wako pure Chemical)。

当治疗导致临床效益，诸如ERCC6L基因表达的减少、受试者中癌症的尺寸、患病率(prevalence)、或转移潜力的降低，可以认为该治疗是“有效”的。当预防性地适用治疗时，“有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。有效性结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来加以确定。

就本发明的方法和组合物可用于“预防”和“防范”的背景而言，此类术语在本文中可互换使用，指降低缘于疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病的进展与症状的出现、以及通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来降低已建立的疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范可包括旨在减轻特定病症的严重性(例如降低肿瘤的增殖和转移等)的广泛的预防性疗法。

治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和阻抑癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防，包括10％、20％、30％或更多降低，或病情稳定。

应理解，本发明的所述双链分子降解亚化学计量的ERCC6L mRNA。虽不愿拘于任何理论，认为本发明的所述双链分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，与常规的癌症疗法相比，本发明中为实施治疗效应而需要输送到癌症的位置或其附近的双链分子要少得多。

本领域技术人员在考虑了受试者的体重、年龄、性别、疾病类型、症状及其它条件、施用途径、以及是局部施用还是全身施用等因素的基础上，能够容易地确定本发明的双链分子的有效量。一般而言，本发明双链分子的有效量是在癌症部位或其附近胞间浓度为大约1纳摩尔(nM)到约100nM，优选大约2nM到大约50nM，更优选大约2.5nM到大约10nM。考虑可使用更多或更少量的双链分子。本领域一般技术人员可方便地及常规地确定特定情况下所需的确切剂量。

本发明的方法可用于抑制表达ERCC6L基因的癌症，例如肺癌的生长或转移。具体而言，含有ERCC6L基因的靶序列(例如SEQ ID NO：7和8)的双链分子特别优选用来治疗癌症。

为了治疗癌症，还可以将本发明的双链分子与不同于所述双链分子的药物组合物组合来施用于受试者。或者，本发明的双链分子还可以与其它旨在用于癌症治疗的治疗方法组合来施用于受试者。举例而言，本发明所述双链分子可与现在用于治疗癌症或预防癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法，外科手术，以及使用化疗剂，如顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)等的治疗)组合施用。

在本发明的方法中，双链分子可以裸双链分子的形式、以与投递试剂相组合的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。

用于与本发明的双链分子组合施用的合适的投递试剂包括Mirus TransitTKO亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。一种优选的投递试剂是脂质体。

脂质体能够帮助将双链分子投递至特定的组织如肺肿瘤组织中，还能够增加双链分子的血中半衰期。适合在本发明的背景中使用的脂质体可以是由常规的囊泡形成性脂质(vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂，以及甾醇，诸如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，如期望的脂质体大小以及在血流中的脂质体的半衰期等。有多种制备脂质体的方法是公知的，例如Szoka等，Ann RevBiophys Bioeng 1980，9：467；美国专利第4,235,871号；第4,501,728号；第4,837,028号；第5,019,369号；将上述文献的全部内容援引并入本说明书。

优选地，封装本发明的双链分子的脂质体包含能够将脂质体输送至癌症部位的配体分子。优选的配体是与肿瘤或血管内皮细胞中常见的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原结合的单克隆抗体。

特别优选地，封装本发明的双链分子的脂质体经过了修饰以免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除，例如，由于其结构的表面结合有调理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制部分和配体。

用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如在本说明书中所使用的，例如，当调理作用抑制部分化学地或物理地搭接在脂质体膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)插入膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，该表层显著地减少巨噬-单核细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(”RES”)对脂质体的摄入；在例如美国专利第4,920,016号中对此有记载，后者的全部公开内容援引并入本说明书。因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制部分修饰过的脂质体能够保留在血液循环中的时间显著更长。出于以上理由，这样的脂质体有时也被称为“隐形”(stealth)脂质体。

已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管系统供给的组织中。因此，在以这样的微血管系统缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率地蓄积。参见Gabizon等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18：6949-53。此外，RES的摄入的减少阻止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的本发明的脂质体能够将本发明的双链分子输送至肿瘤细胞。

适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选为分子量约500～约40,000道尔顿、更优选约2,000～约20,000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM₁。PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通过与碳酸的衍生物反应而生成了羧基结合的羧基化多糖类或寡糖。

优选地，调理作用抑制部分为PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。调理作用抑制部分可以通过许多公知技术中的任何一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na(CN)BH₃和混合溶剂，如60℃的四氢呋喃与水的30：12比例混合物。

上文讨论了表达本发明的双链分子的载体。这样的表达至少一种本发明的双链分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂组合施用，所述合适的投递试剂包括Mirus Transit LT1亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体。将表达本发明的双链分子的重组病毒载体输送到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。

本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、或鼻内递送。

合适的非消化道施用途径包括膀胱内和血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。

本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。优选的是将双链分子直接注射到癌症部位或其附近的组织中。特别优选的是将双链分子多次注射到癌症部位或其附近的组织中。

本领域技术人员可以容易地确定用于对给定受试者施用本发明双链分子的合适剂量方案。例如，双链分子可以一次性施用给受试者，例如以单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或其附近。或者，双链分子可以在约3～约28日、更优选约7～约10日的期间内每日一次或二次地施用给受试者。在优选的剂量方案中，双链分子可以在7日期间内一日一次地注射到癌症部位或其附近。当剂量方案要求多次施用时，应该理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量，可以包含在整个剂量方案中施用的该双链分子的总量。

在本发明中，可以用至少一种选自下组的活性成分来治疗过表达ERCC6L的癌症：

(a)本发明的双链分子，

(b)编码它们的DNA，和

(c)编码它们的载体。

所述癌症包括但不限于肺癌。因而，在施用本发明的双链分子作为活性成分之前，优选确认要治疗的癌细胞或组织中ERCC6L的表达水平是否与相同器官的正常细胞相比升高。如此，在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗(过)表达ERCC6L的癌症的方法，该方法包括下列步骤：

i)检测自具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中ERCC6L的表达水平；

ii)将所述ERCC6L表达水平与正常对照比较；并

iii)对具有与正常对照相比过表达ERCC6L的癌症的受试者施用至少一种选自下组的成分：

(a)本发明的双链分子，

(b)编码它们的DNA，和

(c)编码它们的载体。

或者，本发明还提供了一种药物组合物，其包含至少一种选自下组的成分，用于施用于具有过表达ERCC6L的癌症的受试者：

(a)本发明的双链分子，

(b)编码它们的DNA，和

(c)编码它们的载体。

换言之，本发明进一步提供了一种用于鉴定要用下述各项治疗的受试者的方法：

(a)本发明的双链分子，

(b)编码它们的DNA，或

(c)编码它们的载体，

该方法可包括测定源自受试者的癌细胞或组织中ERCC6L的表达水平的步骤，其中所述水平与该基因正常对照相比的升高指示该受试者具有可治疗的癌症。

下面会更加详细地描述本发明治疗癌症的方法。

要用本方法治疗的受试者优选为哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不仅限于例如人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛。

根据本发明，测定在自受试者获得的癌细胞或组织中ERCC6L的表达水平。使用本领域已知方法，可在转录(核酸)产物水平上确定表达水平。举例而言，ERCC6L的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测ERCC6L的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用ERCC6L的序列信息制备上述探针。举例而言，ERCC6L的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生了杂交的标记物的强度检测。

进一步，ERCC6L的转录产物(例如SEQ ID NO：9)可通过基于扩增的检测方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制备。

具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与ERCC6L的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，而且在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下观察到。一般地，严格条件的温度选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件会是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，对于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。

或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定观察到的蛋白(SEQ ID NO：10)的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，其使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv等)均可用于检测，只要该片段或经修饰抗体保留对ERCC6L蛋白的结合能力即可。制备这些种类的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。

作为另一种基于ERCC6L的翻译产物检测ERCC6L基因表达水平的方法，可利用针对ERCC6L蛋白的抗体通过免疫组织化学分析测量染色的强度。意即，在此测量中，强染色表明所述蛋白质的存在/水平增加，且同时表明ERCC6L基因的高表达水平。

对于靶基因(例如ERCC6L基因)在癌细胞中的表达水平而言，如果该水平较之靶基因的对照水平(例如在正常细胞中的水平)增加了例如10％、25％或50％，或增加到超过1.1倍、超过1.5倍、超过2.0倍、超过5.0倍、超过10.0倍或者更多的话，可以确定该水平是增加的。

对照水平可以与癌细胞同时确定，使用先前从疾病状态(癌性或非癌性)已知的受试者收集和保存的样品。另外，自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞可用作正常对照。或者，对照水平可以借助统计方法，基于通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的ERCC6L基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达样式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中ERCC6L基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的生物样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中ERCC6L基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2S.D.或平均值±3S.D.的范围可以用作标准值。

在本发明的背景中，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，若对照水平从癌性生物样品确定，则它称作“癌性对照水平”。

若ERCC6L基因的表达水平相比于正常对照水平提高了或与癌性对照水平相似/等同，则可诊断受试者为具有要治疗的癌症。

包含本发明双链分子的组合物：

除上述外，本发明亦提供了包含本发明的双链分子或编码该分子的载体的药物组合物。本发明中特别感兴趣的是下述[1]至[32]的组合物：

[1]一种用于抑制癌细胞生长或治疗癌症的组合物，其中所述癌症和癌细胞表达ERCC6L基因，该组合物包括至少一种抑制ERCC6L基因表达和细胞增殖的分离的双链分子或编码该双链分子的载体，且其中该分子包含有义链及其互补反义链，它们彼此杂交以形成该双链分子；

[2][1]中的组合物，其中所述双链分子作用于mRNA，所述mRNA与靶序列SEQ ID NO：7或8匹配；

[3][2]的组合物，其中所述双链分子，其中有义链包含与靶序列SEQ ID NO：7或8相应的序列。

[4][1]的组合物，其中要治疗的癌症是肺癌；

[5][3]的组合物，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度小于大约100个核苷酸对；

[6][5]的组合物，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度小于大约75个核苷酸对；

[7][6]的组合物，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度小于大约50个核苷酸对；

[8][7]的组合物，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度小于大约25个核苷酸对；

[9][8]的组合物，其中所述双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成双链分子，该双链分子长度为大约19个到大约25个核苷酸对；

[10][1]的组合物，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；

[11][10]的组合物，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与靶序列SEQ ID NO：7或8对应的序列的有义链序列，[B]为由3个～23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与靶序列互补的序列的反义链；

[12][1]的组合物，其中所述双链分子是RNA；

[13][1]的组合物，其中所述双链分子是DNA和/或RNA；

[14][13]的组合物，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；

[15][14]的组合物，其中所述有义链多核苷酸与反义链多核苷酸分别由DNA与RNA组成；

[16][13]的组合物，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体；

[17][14]的组合物，其中反义链3’端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均由RNA组成；

[18][17]的组合物，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；

[19][1]的组合物，其中所述双链分子包含3’突出端；

[20][1]的组合物，其中所述组合物包括转染增强剂和可药用的担载体。

[21][1]的组合物，其中所述双链分子由载体编码并包含于组合物中；

[22][21]中的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子作用于mRNA，所述mRNA与靶序列SEQ ID NO：7或8匹配；

[23][22]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链包含与靶序列SEQ ID NO：7或8相应的序列；

[24][21]至[23]任一的组合物，其中要治疗的癌症是肺癌；

[25][23]的组合物，其中由所述载体编码的双链分子长度小于大约100个核苷酸；

[26][25]的组合物，其中由所述载体编码的双链分子长度小于大约75个核苷酸；

[27][26]的组合物，其中由所述载体编码的双链分子长度小于大约50个核苷酸；

[28][27]的组合物，其中由所述载体编码的双链分子长度小于大约25个核苷酸；

[29][28]的组合物，其中由所述载体编码的双链分子长度为大约19个至大约25个核苷酸；

[30][21]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链二者；

[31][30]的组合物，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与靶序列SEQ ID NO：7或8对应的序列的有义链，[B]为由3个～23个核苷酸构成的间插单链，[A′]为包含与靶序列互补的序列的反义链；和

[32][21]的组合物，其中所述组合物包含转染增强剂和可药用的担载体。

本发明合适的组合物将在下面更加详述地加以描述。

本发明的所述双链分子优选在施用于受试者之前根据本领域众所周知的技术配制为药物组合物。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。本文中所使用的“药物组合物”包括适用于人类与兽医用的组合物。制备本发明药物组合物的方法属于本领域一般技术，例如，描述于Remington’s Pharmaceutical Science，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1985)，其全部公开内容通过引用包含于本文中。

本发明的药物组合物包含本发明的双链分子或编码它的载体(例如，以重量计为0.1％到90％)，或所述分子的可药用盐，与生理上可接受的载体介质混合。制药学上可接受的载体介质优选水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸及类似物。

根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，其中每一种分子可针对相同靶序列或ERCC6L的不同靶序列。举例而言，所述组合物可包含针对ERCC6L的双链分子。或者，例如，所述组合物可包含针对ERCC6L的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

而且，本组合物可以包含编码1个或多个双链分子的载体。例如，所述载体可以编码1种、2种或数种本双链分子。或者，本组合物可以包含多种载体，而各载体编码不同的双链分子。

而且，本双链分子可以作为脂质体的形式包含在本组合物中。脂质体的详细内容可以参照题为“使用双链分子治疗癌症的方法”的小节。

本发明的药物组合物中还可以包含传统的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和pH调节剂。合适的添加剂包括：生理学生物相容性的缓冲剂(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体；例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95％，优选25-75％的本发明的一种或多种双链分子。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以包含0.01-20重量％、优选1-10重量％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。

除上述之外，本组合物中还可以包含其它药学活性成分，只要它们不抑制本发明双链分子的体内功能。例如，上述组合物中可以包含常规用于癌症治疗的化疗药物。

在另一个实施方案中，本发明提供本发明的双链核酸分子在制备用于治疗以表达ERCC6L基因为特征的癌症的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及下述双链核酸分子在制备用于治疗表达ERCC6L基因的癌症的药物组合物中的用途：该分子在细胞内抑制ERCC6L基因的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以序列SEQ ID NO：7或8为靶标。

本发明进一步提供在治疗表达ERCC6L基因的癌症中使用的本发明双链核酸分子。

或者，本发明还提供生产用于治疗以表达ERCC6L基因为特征的癌症的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将药学或者生理学可接受的载体与作为活性成分的下述双链核酸分子一起制剂化的步骤，其中所述双链核酸分子抑制过表达ERCC6L基因的细胞内该基因的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以序列SEQ ID NO：7或8为靶标。

在另一个实施方案中，本发明提供生产用于治疗以表达ERCC6L基因为特征的癌症的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将活性成分与药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤，其中所述活性成分是这样的双链核酸分子，其在过表达ERCC6L基因的细胞中抑制ERCC6L的表达，该分子包含有义链与与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链核酸分子，并以序列SEQ ID NO：7或8为靶标。

下面，本发明将参考实施例进行更加详细的介绍。然而，下面的材料、方法和实施例仅仅是举例说明本发明的多个方面，并不意图对本发明的范围进行限制。因此，与这里所述相似或等价的方法和材料也可以用于实施或测试本发明。

除非特别定义，否则这里使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所共同理解的相同的意思。下面描述了合适的方法和材料，虽然与在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于实践或测试本发明。本文通过提述并入本文中提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献的全部内容。如果有冲突，当以本说明书包括定义在内为准。此外，所述材料、方法和实施例均只是例示的目的，而不意在构成限制。

实施例

本发明将于下列实施例中进一步加以描述，其并不对权利要求中描述的本发明范围进行限定。

实施例1：通用方法

肺癌细胞系和组织样品。

此项研究中使用的人肺癌细胞系如下：肺腺癌A427，NCI-H1781，A549，和LC319；肺鳞状细胞癌(SCC)NCI-H226，EBC-1，NCI-H520，和NCI-H2170；和SCLC DMS114，DMS273，SBC-3，SBC-5，H196，和H446。所有细胞在补充有10％FCS的适宜培养基中以单层培养并在含5％CO₂的增湿空气的气氛中于37℃维持。人小气道上皮细胞(SAEC)在购自Cambrex Bio Science，Inc的经过优化的培养基中培养。原发性肺癌组织样品在知情同意下获得，如先前所述(Kikuchi T，et al.Oncogene 2003；22：2192-205.，Taniwaki M et al.Int JOncol 2006；29：567-75.)。此项研究和所有临床材料的使用得到了各个科研伦理委员会批准。

半定量逆转录-PCR。

使用该TRIzol试剂(Life Technologies，Inc.)依照制造商的方案自培养的细胞提取总RNA。用DNA酶I(Nippon Gene)处理提取的RNA并使用寡(dT)引物和SuperScript II进行逆转录。用下述合成ERCC6L特异性引物或作为内部对照的β-肌动蛋白(ACTB)特异性引物进行半定量逆转录-PCR(RT-PCR)实验：ERCC6L，5’-AAAAATCCAG GAGGCCCTAA-3’(SEQ ID NO：1)和5’-AGATCTTTCTTGCCTTAAGCCTG-3’(SEQ ID NO：2)；ACTB，5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’(SEQ ID NO：3)和5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’(SEQ ID NO：4)。优化PCR反应循环数以确保产物强度在扩增的线性期内。

Northern印迹分析。

将人多组织印迹(BD Biosciences Clontech)与ERCC6L的³²P标记的PCR产物杂交。使用上文所述引物通过RT-PCR制备ERCC6L的cDNA探针。预杂交、杂交、和清洗依照供应商的推荐进行。将印迹于室温用增强BAS屏(Bio-Rad)放射自显影30小时。

免疫荧光分析。

将细胞涂布在玻璃盖玻片(Becton Dickinson Labware)上，用4％低聚甲醛固定，并通过用含0.1％Triton X-100的PBS于室温处理3分钟使得其可通透。用CASBLOCK(ZYMED)于室温封闭非特异性结合10分钟。然后把细胞与作为一抗的在含有3％BSA的PBS中稀释的小鼠单克隆抗myc抗体一起于室温温育60分钟。用PBS清洗后，细胞用Alexa Fluor 488缀合的二抗(Molecular Probes)于室温染色60分钟。再次用PBS清洗后，每个标本用含有4’，6’-二脒-2’-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的Vectashield(VectorLaboratories，Inc.)封固并用Spectral Confocal Scanning Systems(TSC SP2AOBS：Leica Microsystems)显现。

RNA干扰测定法。

本发明人先前建立了基于载体的RNA干扰系统，psiH1BX3.0，其设计成在哺乳动物细胞中合成小干扰RNA(siRNA)(Suzuki C et al.Cancer Res2003；63：7038-41.)。使用30微升LipofectAMINE 2000(Invitrogen)将10微克siRNA表达载体转染入肺癌细胞系SBC-5中。将经过转染的细胞在适宜浓度的遗传霉素(G418)存在下培养7天；通过吉姆萨染色对集落数目计数；并在处理后7天通过溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑测定法评估细胞存活力。简言之，将细胞计数试剂盒-8溶液(Doiindo)以1/10体积的浓度添加至每个盘，并将平板于37℃再温育2小时。然后用Microplate Reader 550(Bio-Rad)测量490nm的和作为参照的630nm的吸光度。为了确认对ERCC6L mRNA表达的阻抑，依照标准方案用下述合成ERCC6L特异性引物进行半定量RT-PCR实验。用于RNA干扰的合成寡核苷酸的靶序列如下：对照1(萤光素酶/LUC：萤火虫(Photinus pyralis)萤光素酶基因)，5’-CGTACGCGGAATACTTCGA-3’(SEQ ID NO：5)；对照2(EGFP：基因，水母(Aequorea victoria)GFP的突变体)，5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ ID NO：6)；siRNA-ERCC6L-#A，5’-CTGCACAACCAACTCTTTG-3’(SEQ ID NO：7)；siRNA-ERCC6L-#B，5’-ATGTTAATCAATAACTGGC-3’(SEQ ID NO：8)。

Western印迹。

细胞用含有蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem)的放射免疫沉淀测定缓冲液[50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150mmol/L NaCl，1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS]裂解。将蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶来分开并电印迹到Hybond-ECL硝酸纤维素膜(GE Healthcare Bio-Sciences)上。将印迹与小鼠单克隆抗myc抗体一起温育。使用缀合有辣根过氧化物酶的二抗(GE Healthcare Bio-Sciences)来检测抗原-抗体复合物。通过增强型化学发光Western印迹检测试剂(GE Healthcare Bio-Sciences)来显现蛋白质条带。

细胞生长测定。

将ERCC6L的完整编码序列克隆入pcDNA3.1myc-His质粒载体(Invitrogen)的适宜位点。将用表达带myc-His标签的ERCC6L的质粒或用模拟质粒转染的COS-7细胞在含有10％FCS的DMEM中在适宜浓度的遗传霉素(G418)存在下培养8天。通过MTT测定来评价细胞存活力；简言之，将细胞计数试剂盒-8溶液(DOJINDO)以1/10体积的浓度添加至每个盘，并将平板于37℃再温育12小时。然后用Microplate Reader 550(BIO-RAD)测量作为参照的450nm的吸光度。

实施例2：肺肿瘤和正常组织中的ERCC6L表达。

为了搜索用于开发肺癌的治疗剂和/或诊断性生物标志物的新靶分子，首先通过cDNA微阵列分析筛选在101份肺癌样品的过半数中显示3倍或更高的表达水平的基因(Daigo Y，et al.Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008；56：43-53.；Kikuchi T，et al.Oncogene 2003；22：2192-205.；Kakiuchi S，et al.Mol CancerRes 2003；1：485-99.；Kakiuchi S，et al.Hum Mol Genet 2004；13：3029-43.；Kikuchi T，et al.Int J Oncol 2006；28：799-805.；Taniwaki M，et al.Int J Oncol2006；29：567-75.)。

在筛选的27,648种基因中，在绝大多数检查的肺癌中鉴定出ERCC6L过表达，并通过半定量RT-PCR实验确认了它在10/15份另外的肺癌组织中和13/14种肺癌细胞系中的的反式激活(图1A和1B)。Northern印迹分析显示了ERCC6L在正常组织中不表达，但是在肺癌细胞系中强表达(图1C)。实施了免疫荧光分析来检查外源ERCC6L在COS-7细胞中的亚细胞定位。ERCC6L主要在细胞质中检测到，而在细胞核中微弱检出(图1D)。

实施例3：针对ERCC6L的siRNA对肺癌细胞生长的抑制。

为了评估ERCC6L对于肺癌细胞的生长或存活是否是必需的，构建了表达针对ERCC6L的siRNA的质粒(si-ERCC6L-#A和-#B)以及对照质粒(用于萤光素酶(LUC)和EGFP的siRNA)并将它们转染入强表达ERCC6L的SBC-5和A549细胞中。用si-ERCC6L-#A或-#B转染的细胞中的ERCC6L-mRNA水平与用任一对照siRNA转染的细胞相比显著降低(图2A)。观察到可存活细胞数的显著降低(图2B和2C)。

实施例4：ERCC6L的生长促进效应。

为了披露ERCC6L在肿瘤发生中的潜在作用，制备了设计成表达ERCC6L的质粒(pcDNA3.1/myc-His A载体)或模拟载体来测定ERCC6L对哺乳动物细胞生长的影响，使用几乎不表达内源ERCC6L的COS-7细胞生成了瞬时转染子。瞬时表达外源ERCC6L的细胞揭示了与模拟转染的细胞相比显著的生长促进(图3A和3B)。

讨论

近来，用于癌症治疗的新分子靶的鉴定和表征的加快使相当大的兴趣聚焦于新型抗癌剂的开发(Daigo Y，et al.Gen Thorac Cardiovasc Surg2008；56：43-53.；Kikuchi T，et al.Oncogene 2003；22：2192-205.；Kakiuchi S，et al.Mol Cancer Res 2003；1：485-99.；Kakiuchi S，et al.Hum Mol Genet2004；13：3029-43.；Kikuchi T，et al.Int J Oncol 2006；28：799-805.；Taniwaki M，et al.Int J Oncol 2006；29：567-75.)。

迄今，众多靶向疗法正在对肺癌进行调查，但是有响应的肿瘤类型的范围以及治疗的有效性仍然非常有限。由于它的作用机制明确，分子靶向性药物预期对恶性细胞具有高度的特异性，而且不良效应最低。作为针对该目的的一种途径，一种有希望的策略是将在癌细胞中过表达的有效鉴定基因的基因组范围表达分析的力量与借助RNAi技术的功能丧失效应高通量筛选结合起来(Suzuki C，et al.Cancer Res 2003；63：7038-41.；Ishikawa N，et al.ClinCancer Res 2004；10：8363-70.；Kato T，et al.Cancer Res 2005；65：5638-46.；Furukawa C，et al.Cancer Res 2005；65：7102-10.；Ishikawa N，et al.Cancer Res2005；65：9176-84.；Suzuki C，et al.Cancer Res 2005；65：11314-25.；Ishikawa N，et al.Cancer Sci 2006；97：737-45.；Takahashi K，et al.Cancer Res2006；66：9408-19.；Hayama S，et al.Cancer Res 2006；66：10339-48.)。

使用这种组合手段，已经证明ERCC6L在临床肺癌症样品和细胞系中频繁过表达，且其基因产物在肺癌细胞的生长和进展中发挥不可缺少的作用。

在本发明中，用特异性siRNA处理肺癌细胞以敲低ERCC6L表达，导致对癌细胞生长的阻抑。本发明人还显示了别的证据来支持这种途径在癌发生中的意义；例如，在体外，ERCC6L的表达导致对细胞生长的显著促进。获得的结果强烈提示ERCC6L有可能是肺癌细胞的重要生长因子，尽管许多癌细胞中ERCC6L表达水平升高背后的分子机制仍然有待澄清。因为ERCC6L应当归类为癌症特异性抗原之一，所以通过分子靶向剂选择性抑制ERCC6L活性将会是一种有希望的治疗策略，预期其可具有强的抗癌症生物学活性，并且不良事件的风险最低。

总之，ERCC6L的激活对癌细胞的生长具有特异性的功能作用。数据强烈暗示设计特异性靶向ERCC6L的致瘤活性的新抗癌药物用于治疗肺癌患者的可能性。

工业应用性

本文中提供的数据增加对癌症的综合理解，便于开发新颖诊断策略，并为鉴定治疗药和预防剂的分子靶提供线索。此类信息有助于更加深刻地理解肿瘤发生，并为开发用于诊断、治疗、和最终预防癌症的新颖策略提供指标。

特别地，本文中描述的使用激光捕捉解剖和基因组范围cDNA微阵列的组合的癌症的基因表达分析鉴定出ERCC6L为在癌症中与正常器官相比显著升高的基因。因此，它可用于癌症预防和治疗的背景。例如，鉴于它的差异表达，ERCC6L可方便地作为分子诊断标志物用于鉴定和检测癌症，特别是肺癌。因而，ERCC6L基因及由其编码的蛋白可用于癌症的诊断试剂盒和测定法。

本发明进一步证明细胞生长可受到特异性靶向ERCC6L基因的双链核酸分子阻抑。因此，该双链核酸分子可用于开发抗癌药物。另外，ERCC6L多肽是用于开发抗癌药物的有用靶标。例如，阻断ERCC6L蛋白的表达或阻止其活性的物质可在治疗上用作抗癌剂，特别是用于治疗肺癌的抗癌剂。

通过述及将本文中引用的所有出版物、数据库、序列、专利、和专利申请收入本文。

虽然已经详细地且参照其具体实施方案描述本发明，要理解，前面的描述在性质上是例示性的和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。通过常规实验，本领域技术人员会容易地认识到可以在其中进行各种改变和修改，不偏离本发明的精神和范围。如此，本发明意图不受上文描述限定，而是由所附权利要求及其等同方案限定。

Claims (27)

1.一种在受试者中检测或诊断癌症或发生癌症的倾向性的方法，包括测定源自受试者的生物样品中ERCC6L基因的表达水平的步骤，其中所述水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示所述受试者罹患或有风险发生癌症，其中该表达水平是通过选自下组的任何一种方法测定的：

(a)检测ERCC6L基因的mRNA；

(b)检测由ERCC6L基因编码的蛋白质；和

(c)检测由ERCC6L基因编码的蛋白质的生物学活性。

2.权利要求1的方法，其中所述升高比所述正常对照水平高至少10％。

3.权利要求1的方法，其中所述源自受试者的生物样品为活检样品。

4.权利要求1的方法，其中所述癌症为肺癌。

5.一种用于诊断癌症的试剂盒，其包含选自下组的试剂：

(a)用于检测ERCC6L基因的mRNA的试剂；

(b)用于检测由ERCC6L基因编码的蛋白质的试剂；和

(c)用于检测由ERCC6L基因编码的蛋白质的生物学活性的试剂。

6.权利要求5的试剂盒，其中该试剂为针对ERCC6L的基因转录物的探针或引物组，或针对由ERCC6L基因编码的蛋白质的抗体。

7.一种筛选用于治疗和/或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选物质的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)使测试物质与ERCC6L多肽或其片段接触；

(b)检测该多肽或该片段和该测试物质之间的结合活性；并

(c)选择结合该多肽或该片段的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质。

8.一种筛选用于治疗和/或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选物质的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)使测试物质与表达ERCC6L基因的细胞接触；

(b)检测步骤(a)的细胞中ERCC6L基因的表达水平；并

(c)选择与在该测试物质不存在时检测到的ERCC6L基因的表达水平相比降低步骤(b)中检测到的表达水平的测试物质。

9.一种筛选用于治疗和/或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选物质的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)使测试物质与ERCC6L多肽或其片段接触；

(b)检测步骤(a)的该多肽或该片段的生物学活性；并

(c)选择与在该测试物质不存在时检测到的生物学活性相比阻抑步骤(b)中检测到的该多肽或该片段的生物学活性的测试物质。

10.权利要求9的方法，其中该生物学活性为细胞增殖活性。

11.一种筛选用于治疗和/或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选物质的方法，所述方法包括下述步骤：

a)使测试物质与其中导入有载体的细胞接触，该载体包含ERCC6L基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因，

b)测量步骤(a)中所述报告基因的表达或活性；并

c)选择与在该测试物质不存在时的表达和/或活性水平相比降低步骤(b)中检测到的所述报告基因的表达和/或活性水平的物质。

12.权利要求7、8、9和11中任一项的方法，其中所述癌症为肺癌。

13.一种分离的双链分子，其包含有义链及与之互补的反义链，其中所述链彼此杂交以形成该双链分子，其中该有义链包含与选自SEQ ID NO：7和8的靶序列对应的核苷酸序列，且其中所述双链分子在导入表达ERCC6L基因的细胞中时抑制该基因的表达以及细胞增殖。

14.权利要求13的双链分子，其中所述有义链与反义链在所述靶序列处杂交以形成该双链分子，该双链分子的长度为19-25个碱基对。

15.权利要求13的双链分子，其中该双链分子在所述有义链和/或所述反义链的3’端具有一个或两个3’突出端。

16.权利要求13的双链分子，其中所述双链分子为单一多核苷酸，该单一多核苷酸包含经由单链核苷酸序列连接的所述有义链和所述反义链。

17.权利要求16的双链分子，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]为有义链；[B]为由约3至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；且[A’]为反义链。

18.权利要求17的双链分子，其中[A]包含与选自SEQ ID NO：7和8的核苷酸序列对应的核苷酸序列。

19.一种载体，其编码权利要求13至18中任一项的双链分子。

20.一种在受试者中治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的针对ERCC6L基因的双链分子或编码该双链分子的载体、以及可药用的担载体的步骤，其中该双链分子在导入表达ERCC6L基因的细胞中时抑制ERCC6L基因的表达以及细胞增殖。

21.权利要求20的方法，其中该双链分子为权利要求13的双链分子。

22.权利要求20的方法，其中该载体为权利要求19的载体。

23.权利要求20的方法，其中要治疗的癌症为肺癌。

24.一种用于治疗和/或预防癌症的组合物，所述组合物包含药学有效量的针对ERCC6L基因的双链分子或编码该双链分子的载体，以及可药用的担载体，其中该双链分子在导入表达ERCC6L基因的细胞中时抑制ERCC6L基因的表达以及细胞增殖。

25.权利要求24的组合物，其中该双链分子为权利要求13的双链分子。

26.权利要求24的组合物，其中所述载体为权利要求19的载体。

27.权利要求24的组合物，其中要治疗的癌症为肺癌。

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