CN102414318A - 用作癌症治疗和诊断的靶基因的jarid1b - Google Patents

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Abstract

本发明涉及JARID1B基因在癌症中发挥的作用，特征在于通过施用包含针对JARID1B基因的双链分子或编码它们的载体的组合物来治疗或预防癌症的方法。本发明的特征还在于通过检测JARID1B的表达来诊断癌症的方法。为了该目的，以JARID1B作为癌症的血清学生物标志物。还公开了鉴定用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选药剂的方法，该方法使用癌细胞中的JARID1B表达或JARID1B表达所致细胞增殖作为指标。

Description

用作癌症治疗和诊断的靶基因的JARID1B
技术领域
优先权
本申请要求2009年2月23日提交的美国临时申请No.61/208,432的权益，通过述及在此将其完整内容并入本文。
技术领域
本发明涉及生物科学领域，更具体地，涉及癌症研究、癌症诊断和癌症治疗领域。特别地，本发明涉及用于检测和诊断癌症的方法以及用于治疗和预防癌症的方法。此外，本发明涉及用于筛选用于治疗和/或预防癌症的候选化合物的方法。
背景技术
癌症是一个首要的死亡原因，全世界每年有数以百万计的人死于癌症。癌症病例的数目在全球范围内越来越多。癌症的治疗基本上通过手术、放疗和化疗来实施。然而，这些治疗的有效性仍然有限。此外，因为这些治疗有时引起不良反应，所以许多癌症患者在治疗后遭受身体虚弱。
膀胱癌是第二位最常见的生殖泌尿肿瘤，发病率为全世界每年新增大约357,000例(NPL 1)。大约三分之一的膀胱癌在诊断时怀疑是侵入性或转移性疾病(NPL 1-3)。虽然针对侵袭性膀胱癌的根治性膀胱切除术仍然是全世界许多地方的标准疗法，但是几乎一半的此类患者在膀胱切除术后两年内发生转移，并随后死于该病。在最近二十年里，基于顺铂的组合化疗方案诸如CMV(顺铂、甲氨蝶呤、和长春碱)或M-VAC(甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星、和顺铂)已经主要应用于具有晚期膀胱癌的患者(NPL 3-6)。然而，总体预后仍然很差，而且由这些组合化疗引起的不良反应非常严重(NPL 7)。因此，迫切需要开发针对膀胱癌的新分子靶药物。
肺癌是世界上癌症死亡的首要原因，而且非小细胞肺癌(NSCLC)占那些病例的几乎80％(NPL 8)。已经报告了许多与肺癌形成和进展有关的遗传改变，但是确切的分子机制仍然不清楚(NPL 9)。在最近十年里，数种新开发的化疗剂诸如帕利他赛、多西他赛、吉西他滨、和长春瑞滨已经开始为治疗具有晚期肺癌的患者提供多个选项；然而，那些方案与基于顺铂的疗法相比每提供的存活效益都非常微小(NPL 10，11)。因此，人们正在急切寻找新治疗策略，诸如分子靶向药物。
组蛋白甲基化在调节染色质动态结构中发挥重要作用。染色质开闭的精确协调和组织对于正常细胞过程诸如DNA复制、修复、重组和转录是至关重要的。直到最近，组蛋白甲基化都被认定为一种静态修饰，但是组蛋白脱甲基酶的鉴定揭示了组蛋白甲基化是受到动态调节的(NPL 12，13)。组蛋白脱甲基酶不仅调节修饰作用本身，而且还通过拮抗效应蛋白对经修饰染色质的结合来间接发挥功能。这样的例子是JHDM3A/JMJD2A，其消除受到HP1识别的H3K9甲基化标志并阻止HP1对H3K9的甲基化扩散至周围染色质，从而自染色质置换出HP1(NPL 14-16)。从酵母至人类的一个广泛的蛋白质的家族含有JmjC域，该结构域最近被表征为组蛋白脱甲基酶签名基序(NPL 17)。尽管对组蛋白脱甲基酶在转录调节中的重要作用的知识越来越多，但是对它们的生理功能的了解仍然有限，特别是在人类疾病的背景中。
本发明人先前显示了SMYD3，一种组蛋白甲基转移酶，经由它的甲基转移酶活性来刺激细胞增殖，而且在人类致癌作用中发挥重要作用(PTL 1，NPL 18-22)。其它研究也指示组蛋白甲基转移酶有助于人类细胞的恶性改变(NPL 24-26)。
引用表
专利文献
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发明概述
本发明的目的是提供针对癌症的新型诊断和治疗策略，所述癌症诸如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌，尤其是膀胱癌和肺癌。
本发明基于如下的发现，即JARID1B(jumonji，富含AT的相互作用域1B)基因，一种属于JARID家族的H3K4脱甲基酶，在包括膀胱癌和肺癌在内的许多类型的癌症中的表达水平与正常组织相比上调。本发明人进一步检查了靶向JARID1B基因的小干扰RNA(siRNA)对癌性细胞生长的影响并确认了此类siRNA具有抑制癌性细胞生长的能力。因此，本发明涉及JARID1B作为癌性标志的用途、靶向JARID1B基因的双链分子、靶向JARID1B基因的诊断或治疗癌症的方法、及筛选对治疗癌症有用的候选药剂或化合物的方法。
本发明的一个方面是用于诊断癌症的方法，包括下列步骤：(a)测定源自受试者的生物样品中JARID1B基因的表达水平，并(b)将步骤(a)中测得的表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高与癌症的存在关联起来。在该方法的一个实施方案中，要诊断的癌症是急性髓细胞性白血病、膀胱癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌和肾细胞癌，更优选膀胱癌和肺癌。所述生物样品可通过自受试者收获例如活检样品、痰、血液、淋巴、胸腔积液或尿液来制备。
在另一个方面，本发明提供了JARID1B基因产物作为癌性标志的用途。例如，如果某人检测出生物样品(诸如细胞、组织、血液或其它体液)中自JARID1B基因衍生的mRNA或多肽的量与非癌性样品相比过量的话，该生物样品可确定为污染有癌性细胞。
本发明的另一个方面是分离的靶向JARID1B基因的双链分子，其包含有义链和与其互补的反义链，其中所述链彼此杂交以形成双链分子，其中所述有义链包含与作为靶序列的SEQ ID NO：21或30对应的核酸序列。所述双链分子在导入可过表达JARID1B基因的癌性细胞中时不仅抑制JARID1B基因表达，而且还抑制细胞增殖。因此，所述双链分子可对治疗涉及JARID1B基因过表达的癌症有用。
在一些实施方案中，所述双链分子具有介于约19个和约25个核苷酸的长度。更优选地，所述双链分子在有义链和/或反义链3′端任一或二者处具有由少数核苷酸组成的一个或两个3′突出端。在另一个实施方案中，所述双链分子由单一多核苷酸组成，该单一多核苷酸包含通过间插单链核酸序列连接的有义链和反义链二者。
本发明的双链分子可以自编码它的载体生成，这通过将载体导入细胞中来实现。因此，本发明还涵盖编码所述双链分子的载体以及分离的分子。
本发明的分离的双链分子和载体适合于治疗急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌，更优选膀胱癌和肺癌。
本发明的另一个方面是用于抑制癌细胞增殖的方法，以及用于治疗或预防癌症的方法。本发明的方法包括对受试者施用分离的靶向JARID1B基因的双链分子或编码它的载体的步骤。所述双链分子包含有义链和与其互补的反义链，其中所述链彼此杂交以形成双链分子，其中所述有义链包含与JARID1B基因或其片段的核酸序列对应的核酸序列。
在一些实施方案中，JARID1B基因的核酸序列是SEQ ID NO：1的序列。更优选地，所述双链分子具有约19个-约25个核苷酸的长度。更优选地，所述有义链和/或反义链任一或二者具有由少数核苷酸组成的3′突出端。更优选地，JARID1B基因片段的核酸序列是SEQ ID NO：21或30的核酸序列。在另一个实施方案中，所述双链分子由单一多核苷酸分子组成，该单一多核苷酸分子包含通过间插单链连接的有义链和反义链二者。
优选地，本发明的方法可用于急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌，更优选膀胱癌和肺癌。
本发明的另一个方面是用于抑制癌细胞增殖及用于治疗或预防癌症的组合物。所述组合物包含分离的靶向JARID1B基因的双链分子或编码它的载体。所述双链分子包含有义链和与其互补的反义链，其中所述链彼此杂交以形成双链分子，其中所述有义链包含与JARID1B基因或其片段的核酸序列对应的核酸序列。
在一些实施方案中，JARID1B基因的核酸序列是SEQ ID NO：1的序列。更优选地，所述双链分子具有约19个-约25个核苷酸的长度。更优选地，所述有义链和/或反义链任一或二者具有由少数核苷酸组成的3′突出端。更优选地，JARID1B基因片段的核酸序列是SEQ ID NO：21或30的核酸序列。在另一个实施方案中，所述双链分子由单一多核苷酸组成，该单一多核苷酸包含通过间插单链连接的有义链和反义链二者。
所述组合物可用于治疗癌症，这通过对罹患癌症风险的受试者施用来进行，所述癌症诸如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌，优选膀胱癌和肺癌。
本发明的另一个方面是筛选用于抑制癌细胞增殖的化合物的方法。通过所述筛选方法鉴定的化合物可以是用于治疗或预防癌症的候选化合物。此类候选化合物可适合于治疗急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌，优选膀胱癌和肺癌。
在一个实施方案中，所述筛选方法包括下列步骤：(a)使测试药剂或化合物与JARID1B多肽接触，(b)检测所述多肽与所述测试药剂或化合物之间的结合，并(c)选择与所述多肽结合的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。
在另一个实施方案中，所述筛选方法包括下列步骤：(a)使测试药剂或化合物与JARID1B多肽接触，(b)检测所述多肽的生物学活性，并(c)选择与在测试药剂或化合物不存在下检出的所述多肽或片段的生物学活性相比抑制所述生物学活性的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。在本发明中，所述生物学活性选自下组：细胞增殖活性，凋亡诱导和组蛋白H3脱甲基化活性。
在另一个实施方案中，所述筛选方法包括下列步骤：(a)使测试药剂或化合物与表达JARID1B基因的细胞接触，(b)测定JARID1B基因的表达水平，并(c)选择与在测试药剂或化合物不存在下检出的表达水平相比降低JARID1B基因的表达水平的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。JARID1B基因的表达水平可通过测量来自JARID1B基因的转录或翻译产物来直接测定，以及通过测量下游基因诸如E2F1和E2F2的表达水平来间接测定。
在另一个实施方案中，所述筛选方法包括下列步骤：(a)使测试药剂或化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含JARID1B的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因，(b)测量所述报道基因的表达或活性，并(c)选择与在测试药剂或化合物不存在下的所述报道基因的表达或活性水平相比降低所述表达或活性水平的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。
优选地，对于通过上文所述的筛选方法选择的候选药剂或化合物，通过与癌细胞接触，然后选择抑制癌细胞增殖的候选药剂或化合物，来进一步进行筛选。
本领域的技术人员会理解，本发明的一个或多个方面可以满足某些目的，而一个或多个其它方面可以满足某些其它目的。每一个目的可能不在全部方面均同等地适用于本发明的每一个方面。因此，前述目的可以择一地适用于本发明的任何一个方面。在联系附图和实施例阅读下面的详细说明时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，前面的发明概要和后面的详细说明都仅仅提出了优选的实施方案，并不对本发明或本发明的其它可替换实施方案构成限制。
附图简述
图1A-C。图1描绘了英国人和日本人患者中膀胱癌中升高的JARID1B表达。A显示了正常膀胱组织和依据临床阶段分类的膀胱癌组织中使用定量实时PCR测量的JARID1B基因表达水平的散布图。B描绘了英国人病例中正常和肿瘤膀胱组织中的JARID1B基因表达。通过定量实时PCR来分析JARID1B的表达水平，并以盒须图显示结果(中值50％加盒)。相对mRNA表达显示依据GAPDH和SDH表达来标准化的数值。使用Mann-Whitney U检验来进行统计分析。C描绘了日本人患者中膀胱正常与肿瘤组织之间的表达比。通过cDNA微阵列来分析每份样品的信号强度，而表达比是肿瘤中的信号强度除以正常中的信号强度(1为正常)。
图1D-E。D描绘了日本人患者中正常与肿瘤膀胱组织之间JARID1B表达的比较。通过cDNA微阵列来分析每份样品的信号强度，并以盒须图显示结果(中值50％加盒)。使用Mann-Whitney U检验来进行统计分析。E描绘了膀胱组织中JARID1B的免疫组织化学染色。使用未免疫小鼠IgG作为一抗的替代以消除来自IgG非特异性结合或来自二抗的假阳性响应的可能性。用苏木精和曙红进行复染色。初始放大率为40倍和400倍。
图2。图2描绘了通过针对JARID1B的蛋白质表达的标准免疫组织化学来染色的各种背景的膀胱肿瘤的组织微阵列图像。用苏木精和曙红进行复染色。初始放大率为100倍、200倍和400倍。
图3A-B。图3描绘了肺癌中升高的JARID1B表达。A描绘了正常肺与非小细胞肺癌(NSCLC)组织之间的表达比。通过cDNA微阵列来分析每份样品的信号强度，而表达比是肿瘤中的信号强度除以正常中的信号强度(1为正常)。B描绘了正常肺与小细胞肺癌(SCLC)组织之间的表达比。通过cDNA微阵列来分析每份样品的信号强度，而表达比是肿瘤中的信号强度除以正常中的信号强度(1为正常)。
图3C-D。C描绘了正常与肿瘤肺组织之间的JARID1B表达的比较。通过cDNA微阵列来分析每份样品的信号强度，并以盒须图显示结果(中值50％加盒)。使用Mann-Whitney U检验来进行统计分析。D描绘了肺组织中使用小鼠单克隆抗JARID1B抗体的免疫组织化学染色图像。使用未免疫小鼠IgG作为一抗的替代来验证来自IgG非特异性结合或来自二抗的假阳性响应的可能性。用苏木精和曙红进行复染色。初始放大率为40倍和400倍。
图4。图4描绘了通过针对JARID1B的蛋白质表达的标准免疫组织化学来染色的各种背景的肺肿瘤的组织微阵列图像。在组织学图像上方显示了每个切片的临床信息。用苏木精和曙红进行复染色。初始放大率为100倍、200倍和400倍。
图5。图5描绘了日本人群中AML、宫颈癌、CML、乳腺癌和肾细胞癌中升高的JARID1B表达。比较了正常与肿瘤组织之间JARID1B的表达水平。通过cDNA微阵列来分析每份样品的信号强度，并以盒须图显示结果(中值50％加盒)。使用Mann-Whitney U检验来进行统计分析。
图6。图6描绘了通过用7.5ug/ml阿非迪霉素处理24小时进行细胞周期阻滞，然后在除去阿非迪霉素后4小时和12小时使用抗JARID1B单克隆抗体(Alexa594)、鬼笔毒环肽(F-肌动蛋白，Alexa488)和4′6′-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)进行免疫细胞化学染色的SBC5细胞。插图显示了FACS分析，证明阿非迪霉素处理后4小时(上部)和12小时(下部)细胞周期阻滞的同步释放。
图7A-E。图7描绘了膀胱和肺癌细胞的生长中JARID1B的参与。A描绘了12个膀胱癌细胞系、4个非小细胞肺癌细胞系和1个小细胞肺癌细胞系中JARID1B基因的表达样式。B描绘了定量实时PCR，显示SW780和A549细胞中靶向JARID1B的siRNA(siJARID1B#1)对JARID1B基因的内源表达的抑制。使用靶向EGFP的siRNA(siEGFP)作为对照。显示了三次独立实验的均值加/减SD。C描绘了JARID1B siRNA敲低对膀胱癌细胞系(RT4、SW780和UMUC3)和肺癌细胞系(LC319、RERF-LC-AI和SBC5)的生存力的影响。一式三份检查细胞生存力。显示了三次独立实验的均值加/减SD。使用Student氏t检验来计算P值。D描绘了用对照siRNA或靶向JARID1B基因的siRNA(siJARID1B#1)处理后72小时通过FACS分析的SBC5细胞的DNA含量。E描绘了D中的FACS结果的数值分析，通过细胞周期状态将细胞分类。与经对照siRNA处理的癌细胞相比，用siJARID1B#1处理后处于sub-G1期的癌细胞比例显著较高。显示了三次独立实验的均值加/减SD。使用Student氏t检验来计算P值。
图7F-G。F描绘了定量实时PCR的结果，显示SW780、A549和SBC5细胞中两种不同JARID1B特异性siRNA(siJARID1B#1和#2)对内源JARID1B表达的抑制。使用siEGFP和siNC作为对照。将mRNA表达水平依据GAPDH和SDH表达来标准化，且数值是相对于siEGFP的(siEGFP＝1)。显示了三次独立实验的均值加/减SD。G描绘了JARID1B siRNA敲低对膀胱癌细胞系(SW780和RT4)和肺癌细胞系(A549、LC319和SBC5)的生存力的影响。相对细胞数显示对经siEGFP处理的细胞标准化的数值。显示了三次独立实验的均值加/减SD。使用Student氏t检验来计算P值。
图8。图8描绘了敲低JARID1B表达后SW780和A549 mRNA表达谱的二维无监督分级聚类分析。选择差异表达基因进行此分析。红色显示上调的基因(左边一栏)；绿色显示下调的基因(右边两栏)。
图9。图9描绘了E2F1和E2F2作为JARID1B的下游基因的确认。A和B描绘了用靶向JARID1B(siJARID1B#1)或EGFP(对照)的siRNA处理后SW780、A549和SBC5细胞中通过定量实时PCR分析的E2F1(A)和E2F2(B)的表达水平。相对mRNA表达是任意值，但是对于每一个细胞群，将表达对GAPDH和SDH表达标准化。基于三次独立实验进行统计分析。使用Student氏t检验来计算P值。C描绘了通过实时PCR测量的E2F1和E2F2表达，它们在膀胱肿瘤组织中与非瘤膀胱组织相比显著上调，与肿瘤组织中JARID1B表达的上调成比例。分析了13份癌症和正常组织中的每一份，并使用Mann-Whitney U检验和Spearman氏秩相关系数来进行统计分析。D描绘了JARID1B基因表达的siRNA敲低对E2F的转录活性的影响。使用CignalTM E2F报道物测定试剂盒进行此测定法。显示了三次独立实验的均值加/减SD。使用Student氏t检验来计算P值。E描绘了蛋白质水平的JARID1B、E2F1和E2F2表达。对来自siJARID1B#1或siJARID1B#2处理后的A549和SBC5细胞的溶胞物用抗JARID1B、E2F1、E2F2和肌动蛋白抗体进行免疫印迹。肌动蛋白充当内部对照。
图10。图10描绘了通过JARID1B的蛋白质表达的标准免疫组织化学染色的正常心、肾和肝的图像。在没有一抗的情况下实施对照染色以消除来自二抗的假阳性响应的可能性，并用苏木精和曙红进行复染色。初始放大率为40倍和400倍。
图11。图11描绘了A549细胞中JARID1B的亚细胞定位。A549细胞。对这些细胞通过用7.5ug/ml阿非迪霉素处理24小时进行细胞周期阻滞，然后在除去阿非迪霉素后0、4、8、12和24小时使用抗JARID1B单克隆抗体(Alexa488，绿色)、鬼笔毒环肽(F-肌动蛋白，Alexa594，红色)和4′6′-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI；蓝色)进行免疫细胞化学染色。插图显示了FACS分析，证明细胞周期阻滞的同步释放，而箭头指示JARID1B的胞质定位。将A549细胞用含有4％低聚甲醛的PBS(-)固定20分钟，并用含有0.1％Triton X-100的PBS(-)于室温透化2分钟。随后，将细胞用含有3％牛血清白蛋白的PBS(-)于室温覆盖1小时以封闭非特异性杂交，然后与以1∶100比稀释度稀释的小鼠抗JARID1B抗体(1G10，Abnova)一起温育。用PBS(-)清洗后，用1∶1000稀释的缀合有Alexa594的抗小鼠二抗(Molecular Probe)对细胞染色。用4′，6′-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)对核复染色。在TCS SP2 AOBS显微镜(Leica)下获得荧光图像。
图12。图12描绘了SBC5细胞中JARID1B的亚细胞定位。对SBC5细胞通过用7.5ug/ml阿非迪霉素处理24小时进行细胞周期阻滞，然后在除去阿非迪霉素后0、4、8、12和24小时使用抗JARID1B单克隆抗体(Alexa488，绿色)、鬼笔毒环肽(F-肌动蛋白，Alexa594，红色)和4′6′-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI；蓝色)进行免疫细胞化学染色。插图显示了FACS分析，证明细胞周期阻滞的同步释放，而箭头指示JARID1B的胞质定位。
实施方案的描述
现在描述例示性的方法和材料，尽管在实施或检验本发明的实施方案时可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料。然而应理解本发明并不限于本文描述的特定分子、组合物、方法或方案，因其可根据常规实验与优化而有变化。亦应理解说明书中使用的术语仅以描述特定版本或实施方案为目的，并非意欲限定本发明的范围，所述范围仅由权利要求所限定。
除非另行定义，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域一般技术人员通常理解的意义相同。然而，若有冲突，以本说明书(包括定义)为准。因而，在本发明的语境中，适用下列定义。
定义
除非另有具体指明，如本文中使用的词语“一个”、“一种”、和“该”意思是“至少一个”。
术语“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、和“核酸分子”在本文中可互换使用，指核酸残基的多聚物，而且，除非另有具体指明，用其通常为人接受的单字母代码进行指代。所述术语适用于其中一个或更多核酸通过酯键连接的核酸(核苷酸)多聚体。所述核酸多聚体可包括DNA、RNA或其组合，而且涵盖天然出现的和非天然出现的核酸多聚体。
术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的多聚体。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是修饰残基，或非天然出现的残基，诸如对应于天然出现残基的人工化学模拟物的氨基酸多聚体，以及天然出现的氨基酸多聚体。
除非另有定义，“癌症”指过表达JARID1B基因的癌症。过表达JARID1B基因的癌症的例子包括但不限于急性髓细胞性白血病、膀胱癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌和肾细胞癌，更优选膀胱癌和肺癌。
JARID1B基因：
JARID1B，也称作Plu1，由人类中的旁系同源JARID家族基因(KortschakRD et al.Trends Biochem Sci 2000；25：294-9，Wilsker D.et al.Genomics2005；86：242-51)之一编码。除了JmjC域之外，它还含有其它与转录调节子共有的域，包括JmjN域、Bright/Arid域、C5H2C锌指、和数个PHD域。JARID家族的所有四个成员都拥有H3K4脱甲基酶活性(Christensen J.et al.Cell2007；128：1063-76，Iwase S.et al.Cell 2007；128：1077-88，Klose RJ et al.Cell2007；128：889-900，Lee MG et al.Cell 2007；128：877-87，Yamane K.et al.MolCell 2007；25：801-12)。虽然可能存在功能冗余，但是每个成员似乎经由募集至不同的染色体区和不同酶活性而参与不同的生物学过程(Klose RJ et al.Nat Rev Genet 2006；7：715-27)。
JARID1B基因的例示性核酸和多肽序列分别显示于SEQ ID NO：1和2，但不限于此。
另外，序列数据亦可通过下述登录号获取：分别为例如NM_006618和NP_006609。
依照本发明的一个方面，功能等同物亦认为是“JARID1B多肽”。在本文中，JARID1B蛋白的“功能等同物”为具有与JARID1B蛋白等同的生物学活性的多肽。也就是，任何保留JARID1B蛋白的生物学能力的多肽均可用作本发明中的此类功能等同物。例如，功能等同物包括具有与JARID1B蛋白相似的细胞增殖活性、抗凋亡活性、脱甲基酶活性或促进E2F1和E2F2表达的活性的多肽。
一般地说，已知蛋白中一个、两个或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白的功能。事实上，已知突变的或经过修饰的蛋白(即具有如下氨基酸序列，其中通过替代、删除、插入和/或添加修饰了一个、两个或更多个氨基酸残基)保留原始的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland etal.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。因而，本领域技术人员会认识到，对氨基酸序列进行改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别添加、删除、插入、或替代，或者被认为是“保守修饰”的那些修饰，其中蛋白的改变产生具有相似功能的蛋白，这些都是本发明的语境中可接受的。
只要保持JARID1B蛋白的活性，氨基酸突变的数目不受特别限制。然而，一般优选改变氨基酸序列的20％或更少，更优选氨基酸序列的10％或更少，更优选氨基酸序列的5％或更少。因而，在一个优选的实施方案中，在此类突变体中要突变的氨基酸数目一般为30个氨基酸或更少，优选20个氨基酸或更少，更优选10个氨基酸或更少，更优选6个氨基酸或更少，甚至更优选3个氨基酸或更少。
短语“保守修饰”指如下的修饰，要突变的氨基酸残基优选突变为保持氨基酸侧链特性的另一种氨基酸。氨基酸侧链特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下列共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含有羟基基团的侧链(S，T，Y)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；含有碱的侧链(R，K，H)；和含有芳香族的侧链(H，F，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本领域是公知的。例如，下列8个组各自包含彼此构成保守性替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins 1984)。
此类保守性修饰多肽包括在本发明的蛋白中。然而，本发明并不仅限于此，而且蛋白包括非保守性修饰，只要JARID1B蛋白的至少一种生物学活性得以保留即可。另外，经过修饰的蛋白并不排除多态变体、种间同源物、和那些由这些蛋白的等位基因编码者。
本发明的多肽可在氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的有无、或形式方面有变化，这取决于用于产生它的细胞或宿主，或使用的纯化方法。无论如何，只要它具有与JARID1B蛋白等同的功能，它就在本发明的范围内。
在其它实施方案中，本发明的多肽可以由在严格条件下与JARID1B基因的天然存在核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。短语“严格条件”指这样的条件，在该条件下，核酸分子会与其靶序列杂交，通常在核酸复杂混合物中，而没有与其它序列的可检测的杂交。严格条件取决于序列，而且在不同情况中会有所不同。较长的序列在更高温度特异性杂交。对于核酸杂交详尽指导可见于Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地说，严格条件选择为在限定的离子强度pH，比特定序列的热熔点(Tm)低大约5-10℃。Tm是如下的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度下在平衡时50％的与靶互补的探针与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm，在平衡时50％的探针被占据)。严格条件还可以通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选背景杂交的10倍。例示性的严格杂交条件包括如下：50％甲酰胺、5x SSC、和1％ SDS，在42℃温育，或5x SSC、1％ SDS、在65℃温育，用0.2x SSC和0.1％ SDS在50℃清洗。
在本发明的语境中，用于分离编码与JARID1B蛋白功能等同的多肽的多核苷酸的杂交条件可由本领域技术人员常规选择。例如，可用下述步骤进行杂交：在68摄氏度用“Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)进行30分钟或更长的预杂交，添加经过标记的探针，并在68摄氏度温育一小时或更长。下面的清洗步骤可在例如低严格度条件中进行。一种例示性的低严格度条件可包括42℃、2xSSC与0.1％SDS，优选50℃、2xSSC与0.1％SDS。经常优选使用高严格条件。一种例示性的高严格条件可包括在室温在2xSSC、0.1％SDS中清洗3次各20分钟，然后在1xSSC、0.1％SDS中在37摄氏度清洗3次各20分钟，并在1xSSC、0.1％SDS中在50摄氏度清洗2次各20分钟。然而，数种因素，诸如温度和盐浓度，可影响杂交的严格度，而且本领域技术人员可合适地选择所述因素以达到所需的严格度。
此外，本发明的基因涵盖编码蛋白的此类功能等同物的多核苷酸。除了杂交之外，可以利用基因扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)方法，使用基于上述信息的序列合成的引物来分离编码与JARID1B蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。
分别与人类基因和蛋白功能等同的多核苷酸和多肽通常与其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性(也称作“序列同一性”)。“高同源性”(或高序列同一性)通常指40％或更高的同源性，优选60％或更高，更优选80％或更高，甚至更优选90％、93％、95％、97％、或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循“Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)”中的算法来确定。
JARID1B作为癌性标志的用途：
发现了JARID1B基因的表达在多种类型的癌组织中特异性升高，如表3所示。因此，JARID1B可用作多种类型的癌症的癌性标志。最近，报告了JARID1B基因在乳腺癌和前列腺癌中过表达(Yamane K.et al.Mol Cell2007；25：801-12，Xiang Y.et al.Proc Natl Acad Sci U S A 2007；104：19226-31)。然而，不清楚JARID1B是否可用作其它癌症的癌性标志，因为一种类型的癌症中的基因表达谱通常不同于其它类型的癌症中的基因表达谱。只有本发明首次澄清了JARID1B基因在急性髓细胞性白血病、膀胱癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌和肾细胞癌中的过表达。如此，本发明提供了JARID1B在那些癌症中作为癌性标志的用途。
依照本发明，通过检测JARID1B基因的过表达，可确定生物样品含有癌性细胞，因此含有自癌性细胞衍生的产物。就是说，本发明提供了用于确定生物样品是否污染有癌性细胞或癌性产物的方法，其包括对生物样品中JARID1B基因的表达水平定量，并将该表达水平与已知没有癌症的非癌性样品中的表达水平比较的步骤。
如本文中使用的，术语“生物样品”指整个生物体或其组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不仅限于血液、黏液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、脐带血(amniotic cord blood)、尿液、阴道液和精液)的子集(subset)。“生物样品”进一步指从整个生物体或其细胞、组织或组成部分的子集制备的匀浆物、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物样品”指含有细胞组分(诸如蛋白质或多核苷酸)的培养基，诸如生物体已在其中繁殖的营养汤或凝胶。
例示性的生物样品包括但不限于活检标本、身体组织和体液诸如血液、痰、胸腔积液或尿液。优选地，生物样品含有这样的细胞群体，该细胞群体包括上皮细胞，更优选源自怀疑为癌性的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，并将其用为生物样品。然而，任何生物材料均可作为生物样品用于测定，只要它包括目标JARID1B转录或翻译产物。
例如，依照本发明，可诊断癌症，包括急性髓细胞性白血病、膀胱癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌和肾细胞癌。或者，本发明提供了一种用于检测生物样品中这些癌症的癌细胞的方法。为了诊断这些癌症或检测癌细胞，来源于自要诊断或检测的受试者收集的下列器官的生物样品可用作生物样品：
淋巴细胞或包括淋巴细胞的血液样品：用于急性髓细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病，
膀胱：用于膀胱癌，
宫颈：用于宫颈癌，
肺：用于肺癌，及
肾：用于肾细胞癌。
JARID1B基因的表达水平可使用本领域已知方法通过检测JARID1B的mRNA、蛋白质或活性来定量。所述方法的详情记载于下文“用于诊断癌症的方法”。
本发明的方法可提供有用的信息来利用生物材料、癌症诊断、癌症治疗等等。
用于诊断癌症的方法：
本发明还提供了利用JARID1B基因的表达水平来检测癌细胞或诊断癌症的方法。本发明的方法可适合于诊断急性髓细胞性白血病、膀胱癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌和肾细胞癌。
根据本发明，可提供用于检查受试者状况的中间结果。所述中间结果可与其它信息结合起来以协助医生、护士或其它从业人员诊断患者罹患所述疾病。或者，本发明可用于来源于患者的生物样品中检测出癌性细胞，并为医生提供对诊断罹患所述疾病的患者有用的信息。
或者，本发明提供了一种用于检测或鉴定源自受试者的生物样品中癌细胞的方法，所述方法包括测定源自受试者的生物样品中JARID1B基因表达水平的步骤，其中所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示组织中存在或怀疑存在癌细胞。
此类结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它保健从业人员诊断受试者患有疾病。换言之，本发明可以给医生提供有用信息来诊断受试者患有疾病。例如，依照本发明，当关于自受试者获得的组织中癌细胞的存在有疑问时，通过考虑JARID1B基因的表达水平，加上疾病的其他不同方面，包括组织病理学、血液中的已知肿瘤标志物的水平、和受试者的临床过程等，能做出临床决策。例如，一些公知的血液中的诊断性急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌或肾细胞癌标志物如下。
急性髓细胞性白血病；WT1
膀胱癌；SCC，TPA，或IAP
乳腺癌；BCA225，TPA，CEA，IAP，或CA15-3
慢性髓细胞性白血病；BCR-ABL
宫颈癌；SCC，TPA，或CA125
肺癌；AP，ACT，BFP，CA19-9，CA50，CA72-4，CA130，CEA，KMO-1，NSE，SCC，SP1，Span-1，TPA，CSLEX，SLX，STN和CYFRA
前列腺癌；PSA，或PAP
肾细胞癌；IAP
就是说，在本发明的这个具体实施方案中，基因表达分析的结果作为中间结果，用于进一步诊断受试者的疾病状态。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测癌症之诊断标志物的方法，所述方法包括检测源自受试者的生物样品中JARID1B基因表达作为急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌或肾细胞癌诊断标志物的步骤。
本发明的方法包括下述步骤：
(a)测定源自受试者的生物样品中JARID1B基因的表达水平；并
(b)将步骤(a)中测得的表达水平较之该基因的正常对照水平的提高与癌性细胞的存在相关联。
用本方法诊断的受试者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如，人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。
根据本发明，测定在所述源自患者的生物样品中JARID1B基因的表达水平。表达水平可在转录产物水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，JARID1B的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测多个基因(例如，多种癌症特异性基因)，包括JARID1B基因，的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用JARID1B基因的序列信息制备上述探针。此类序列信息可得自网络上的序列数据库，诸如GeneBankTM，但不限于此。举例而言，JARID1B基因的例示性序列显示于SEQ ID NO：1(GenBank登录号：NM_006618)，但不限于此。探针通常包括JARID1B基因序列的至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少200个核苷酸。除了JARID1B基因的这些片段之外，JARID1B基因的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物例如染料、荧光和同位素来标记，且所述基因的表达水平可以作为发生杂交的标记物的强度来加以检测。
进一步，JARID1B基因的转录产物可通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于JARID1B基因的序列信息制备。举例而言，用于实施例的引物(SEQ ID NO：7、8、9和10)可用于通过RT-PCR或Northern印迹的检测，但本发明并不仅限于此。
具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件与低严格条件下与JARID1B mRNA杂交。本文所用的短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下发生。一般地，严格条件的温度选择为比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，用于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。
或者，本发明的诊断可以通过检测翻译产物来进行。例如，可以确定JARID1B蛋白的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或变体(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要它们保留对JARID1B蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。
作为另一种基于JARID1B的翻译产物检测其基因的方法，可利用针对JARID1B蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。即，观察到强染色表明所述蛋白质的存在增加，且同时表明JARID1B基因的高表达水平。
另外，JARID1B蛋白的数量可通过测量JARID1B蛋白的生物学活性，诸如组蛋白脱甲基化来测定。如上文所述，JARID1B已表征为赖氨酸脱甲基酶家族之一，其能特异性消除组蛋白H3赖氨酸4的甲基(Yamane K.et al.MolCell 2007；25：801-12)。因此，组蛋白脱甲基化活性可用于基于其生物学活性来定量JARID1B蛋白。组蛋白脱甲基化水平可通过本领域公知方法来测定。当使用组蛋白脱甲基化活性来定量JARID1B蛋白时，自受试者组织或细胞制备的匀浆物、裂解物或提取物可优选用作生物样品，但不限于此。可将生物样品与甲基化的组蛋白一起温育，然后评估脱甲基化水平，例如通过检测组蛋白脱甲基化所致的甲醛或过氧化氢释放或残余甲基化组蛋白(使用针对甲基化组蛋白的抗体)来进行。一些商品化产品可供组蛋白脱甲基化测定法使用，诸如EpiQuik全局组蛋白甲基化测定试剂盒(Epigentek Group Inc.)。
或者，细胞增殖活性可用作JARID1B蛋白的生物学活性。依照本发明，抑制JARID1B基因表达导致抑制膀胱癌和肺癌细胞中的细胞生长，因此假定JARID1B蛋白促进细胞增殖。为了测定JARID1B蛋白的细胞增殖活性，在生物样品存在下培养细胞，然后通过检测增殖速度或通过测量细胞周期或集落形成活性，可测定生物样品的细胞增殖活性。
另外，除JARID1B基因的表达水平外，亦可确定其它癌症相关基因，例如已知在癌症中有差异表达的基因的表达水平，以提高所述诊断的准确性。
生物样品中JARID1B基因表达水平的升高可通过与对照水平比较来检测。
对照水平可以与测试生物样品同时确定，使用先前从疾病状态(癌性或非癌性)已知的受试者收集和保存的样品。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的JARID1B基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中JARID1B基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自患者的生物学样品的组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中JARID1B基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2 S.D.或平均值+/-3 S.D.的范围可以用作标准值。
在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平是从癌性生物样品确定的，则称作“癌性对照水平”。
当JARID1B基因的表达水平相比正常对照水平有所提高或与癌性对照水平相似，则生物样品可能含有癌性细胞，其指示受试者可能正罹患或有风险发生癌症。
受试生物学样品的表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照基因(例如管家基因)的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，β-肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。
如果在生物样品中的表达水平较之正常对照水平增加了例如10％，25％或50％的话，或增加到超过1.1倍，超过1.5倍，超过2.0倍，超过3.0倍，超过5.0倍，超过10倍或者更多，则可认为其是升高的。另一方面，若生物样品中的表达水平相对于癌性对照水平的差异在10％、25％或50％之内，则可认为是升高的。
用于检测癌症的试剂盒：
本发明提供了用于检测癌症的试剂盒，所述癌症诸如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌和肾细胞癌。本发明的试剂可用于检测生物样品中的癌性细胞，其可用于诊断癌症。
具体地，所述试剂可检测生物样品中JARID1B基因的表达，所述试剂可选自下组：
(a)用于检测JARID1B基因的mRNA的试剂；
(b)用于检测JARID1B蛋白的试剂；和
(c)用于检测JARID1B蛋白的生物学活性的试剂。
适于检测JARID1B基因的mRNA的试剂包括特异性结合或识别JARID1B mRNA的寡核苷酸，诸如具有与JARID1B mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对JARID1B mRNA为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸，例如“用于诊断癌症的方法”中所述的方法。如果需要，可将用于检测JARID1B mRNA的试剂固定化在固体基质上。
另一方面，适于检测JARID1B蛋白质的试剂包括针对JARID1B蛋白质的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或变体(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述试剂，只要它们保留与JARID1B蛋白的结合能力。为检测JARID1B蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且在本发明中可使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。如果需要，可将用于检测JARID1B蛋白的试剂固定化在固体基质上。
另外，可以将JARID1B蛋白作为JARID1B蛋白的生物学活性来检测。组蛋白脱甲基化活性和细胞增殖活性是JARID1B蛋白的例示性生物学活性。生物样品中的组蛋白脱甲基化活性可通过在将甲基化组蛋白与生物样品一起温育后使用针对甲基化组蛋白的抗体检测残余甲基化组蛋白来测定。故而，本发明的试剂盒可包括甲基化组蛋白和抗甲基化组蛋白抗体。或者，本发明的试剂盒可包括带有标记的甲基的甲基化组蛋白，以检测组蛋白脱甲基化所致的甲醛释放。另一方面，生物样品中的细胞增殖活性可通过在生物样品存在下培养细胞，然后检测增殖速度或测量细胞周期或集落形成能力来测定。是故，本发明的试剂盒可包括用于培养细胞的培养基和容器。
所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。所述试剂盒可包括用于结合针对JARID1B基因的探针或针对JARID1B蛋白的抗体的固体基质以及试剂，用于培养细胞的培养基与容器，阳性与阴性对照试剂，以及用于检测针对JARID1B蛋白质的抗体的第二抗体。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业和用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和带有使用说明的装箱单(例如，书面的、磁带、CD-ROM等等)。这些试剂等可以装在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可从多种材料制得，例如玻璃或塑料。
作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对JARID1B mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质例如多孔条上，以形成至少一个检测位点。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位点，每个都包含寡核苷酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位点可包含不同量的固定化寡核苷酸，即，在第一个检测位点上量较大而在接下来的位点上量较小。在加入测试样品之后，显示可检测信号的位点的数量提供了在样品中存在的JARID1BmRNA量的定量指征。所述检测位点可配置为具有任何合适地可检测的形状，通常是横跨测试条宽度的条状或点状。
本发明的试剂盒可进一步包括阳性对照或JARID1B标准样品。本发明的的阳性对照样品可通过收集JARID1B阳性样品诸如源自急性髓细胞性白血病、膀胱癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌和肾细胞癌的细胞，随后测定其JARID1B水平来制备。或者，可将纯化的JARID1B蛋白或JARID1B基因转染到细胞中以形成所述阳性样品或JARID1B标准品。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒可进一步包括阴性对照样品。本发明的阴性对照样品是不表达JARID1B的细胞或组织诸如非癌性细胞。
双链分子
本文中使用的术语“分离的双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，而且包括例如短干扰RNA(siRNA，例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))与短干扰DNA/RNA(siD/R-NA，例如DNA与RNA的双链嵌合体(dsD/R-NA)或DNA与RNA的小发夹嵌合体(shD/R-NA))。
如本文中使用的，靶序列的有义链是基因的mRNA或cDNA序列内的核苷酸序列，其会导致完整mRNA翻译的抑制，如果本发明的双链核酸分子被导入表达该基因的细胞内的话。对于某基因的mRNA或cDNA序列内的核苷酸序列，当包含与靶序列对应的序列的双链多核苷酸抑制该基因在表达该基因的细胞中的表达时，该核苷酸序列可确定为靶序列。抑制基因表达的双链多核苷酸可以由靶序列和长2至5个核苷酸的3′突出端(例如uu)组成。
本文中使用的术语“siRNA“指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括靶基因的有义核酸序列(亦用“有义链”指代)的一部分、靶基因反义核酸序列(亦用“反义链”指代)的一部分、或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列及与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。
本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补的序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。所述两条链的核苷酸序列可不仅包含选自靶基因序列中蛋白质编码序列的“有义”或“反义”RNA，亦可包括具有选自所述靶基因的非编码区域的核苷酸序列的RNA分子。
本文中使用的术语“shRNA”指具有茎-环结构的siRNA，所述茎-环结构包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而且所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)”
本文中使用的术语“siD/R-NA”指包含RNA和DNA二者的双链核酸分子，包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，其阻止靶mRNA的翻译。在本说明书中，杂合体表示这样的分子，其中由DNA组成的多核苷酸和由RNA组成的多核苷酸相互杂交形成双链分子；而嵌合体表示组成所述双链分子的链中的一条或两条可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞的常规技术。所述siD/R-NA包括靶基因的有义核酸序列(亦用“有义链”指代)的一部分、靶基因的反义核酸序列(亦用“反义链”指代)的一部分、或两者。siD/R-NA可以这样构建，使单个转录物同时具有来自靶基因的有义核酸序列和互补反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。
在本文中使用的术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，所述两个分子包含彼此互补的序列并且已经藉由所述互补序列退火在一起而形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅仅包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”核酸序列，还可以包含具有选自靶基因非编码区的核酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个由RNA和DNA二者组成(嵌合体分子)，或者一个分子由RNA组成而另一个由DNA组成(杂合双链)。
在本文中使用的术语“shD/R-NA”是指：具有茎-环结构的siD/R-NA，所述茎-环结构包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使它们之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，而且所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。
本说明书中使用的术语“分离的”是指：从本来的环境(例如自然出现时的自然环境)中被取出，与其自然状态相比发生了合成性的改变的状态。
针对JARID1B基因的双链分子——该分子与JARID1B mRNA杂交——通过与该基因的正常为单链的mRNA转录物结合，干扰翻译，抑制蛋白质表达，从而降低或抑制该蛋白的产生。如本文中证明的，在膀胱癌细胞系和肺癌细胞系中JARID1B基因的表达被dsRNA抑制(图7B，F)，而且因此，那些细胞系的生长受到抑制(图7C，G)。
因此本发明提供了有能力在导入表达JARID1B基因的细胞时抑制该基因表达以及细胞增殖的分离的双链分子。本发明的双链分子可用于抑制涉及JARID1B基因过表达的癌细胞增殖，因此它们可提供用于治疗癌症的新方法。例如，本发明的双链分子适合应用于观察到JARID1B基因过表达的癌症，诸如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌(表3)。更优选地，膀胱癌和肺癌适合于本发明的双链分子。
设计具有抑制细胞内靶基因表达能力的双链分子的方法是已知的(见例如，WO2004/048566和美国专利No.6,506,559，本文通过提述并入其全部内容)。例如，可以从Ambion网站(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)访问用于设计siRNA的计算机程序。
该计算机程序可以根据如下的规程选择双链分子的靶核苷酸序列。
靶点的选择：
1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描搜寻AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3’侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶点。Tuschl等建议避免针对5’和3’非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白质的结合位点，而UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。
2.将潜在靶点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列具有显著同源性的靶序列排除在考虑之外。主要使用BLAST(Altschul SF等，Nucleic Acids Res 1997 Sep 1，25(17)：3389-402)，其可见于NCBI服务器：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.选择合格的靶序列用于合成。通常沿着待评估的基因的长度选择几个靶序列。
使用上述设计方法，本发明中分离双链分子的靶序列被设计为SEQ IDNO：21和30。对以上述靶序列为目标的双链分子检查其抑制表达JARID1B基因的细胞生长的能力。因此，例示性的本发明双链分子包括与作为靶序列的SEQ ID NO：21或30对应的核酸序列。然而，任何来自JARID1B的序列均可作为本发明双链分子的靶序列，只要双链分子保留抑制JARID1B表达和细胞增殖的能力。
本发明的双链分子可以靶向单个靶序列。
本发明的双链分子包括包含靶序列和/或靶序列之互补序列的任何核酸序列的分离多核苷酸。本发明的双链分子的多核苷酸例子包括那些包含与SEQ ID NO：21或30对应的核酸序列和/或这些序列的互补序列的多核苷酸；然而，本发明并不仅限于这些例子，且上述核酸序列中的次要修饰是可以接受的，只要所述经修饰分子保留抑制JARID1B基因表达的能力。本文中，短语“次要修饰”当用于和核酸序列相关时表示对所述序列替换、缺失、添加或插入一个、两个或数个核酸。在本发明的语境下，术语“数个”当用于核酸替换、缺失、添加和/或插入时可意指3-7个，优选3-5个，更优选3-4个，进一步更优选是3个核苷酸残基。
当用于本发明双链分子的分离多核苷酸由RNA或其衍生物组成时，核苷酸序列中的碱基“t”应替换为“u”。本文中使用的术语“互补”指多核苷酸中核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，且术语“结合”意指两个多核苷酸间物理的或化学的相互作用。当所述多核苷酸包含修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯酶联接时，这些多核苷酸亦可以同样地发生相互结合。一般而言，互补多核苷酸序列在合适条件下杂交以形成包含很少或没有错配的稳定双链体。进一步，有义链和与其互补的反义链可通过杂交形成双链分子或发夹环结构。在优选实施方案中，上述双链体在每10个匹配中包含不超过一个错配。在特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，这样的双链体不包含错配。
对JARID1B基因而言所述双链分子长度优选少于6393个核苷酸。举例而言，双链分子长度小于500、200、100、75、50或25个核苷酸。进一步，所述双链分子的有义链可长于19个核苷酸，优选长于21个核苷酸，且更加优选长度在约19与25个核苷酸之间。因而，本发明提供了包含有义链和反义链的双链分子，其中有义链包括与靶序列对应的核苷酸序列。在优选的实施方案中，有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为19至25个核苷酸对的双链分子。
依照本发明，可使用实施例中利用的方法对本发明的双链分子测试其能力。例如，在体外依照标准方法对由JARID1B基因mRNA的一部分的有义链和与其互补的反义链构成的双链分子测试它们降低膀胱癌和肺癌细胞系(例如253J、253J-BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER、UMUC3、EJ28、RT4、T24和SW780，用于膀胱癌；SBC5、A549、H2170、LC319、和RERF-LC-AI，用于肺癌)中JARID1B mRNA生成的能力。另外，例如，JARID1B mRNA在与候选双链分子接触的细胞中与在候选分子不存在下培养的细胞相比的降低可例如使用JARID1B mRNA的引物通过RT-PCR来检测，如实施例1“定量实时PCR”项下所述。然后可对在体外基于细胞的测定法中降低JARID1BmRNA生成的序列测试它们对细胞生长的抑制效果。然后，对在体外基于细胞的测定法中抑制细胞生长的序列，可使用患有癌症的动物(例如裸鼠异种移植物模型)测试它们的体内能力，以确认降低的JARID1B mRNA生成和降低的癌细胞生长。
当将双链分子导入细胞中时，双链分子充当识别RISC复合物中mRNA的同源序列的向导。被识别的靶RNA受到Dicer的核酸酶活性的切割和降解，由此双链分子最终降低或抑制了由该RNA编码的多肽生成(表达)。如此，本发明的双链分子可通过其生成在严格条件下与JARID1B基因的mRNA特异性杂交的单链的能力来定义。在本文中，将mRNA中与自双链分子生成的单链杂交的部分称作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本发明中，“靶序列”的核苷酸序列不仅可使用mRNA的RNA序列来显示，而且也可以以自mRNA合成的cDNA的DNA序列来显示。
本发明中所述双链分子可包含一个或更多修饰核苷酸和/或非磷酸二酯连接。本领域众所周知的化学修饰具有增加所述双链分子的稳定性、可用性和/或细胞摄入的能力。一般技术人员明白本发明分子可包含的其它类型的化学修饰(WO03/070744；WO2005/045037)。在一个实施方案中，可使用修饰以提供改善的抗降解性或改善的摄入。上述修饰的例子包括但不仅限于，硫代磷酸酯联接、2’-O-甲基核糖核苷酸(特别是在双链分子的有义链上)、2’-脱氧-氟代核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5’-C-甲基核苷酸以及倒转脱氧脱碱基残基的掺入(US20060122137)。
另一个实施方案中，可以使用修饰来增强双链分子的稳定性或增加寻靶效率。这样的修饰包括但不限于双链分子两条互补链之间的化学交联、双链分子一条链的3’或5’末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰、2-氟代修饰的核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸(WO2004/029212)。在另一个实施方案中，修饰可以用于增加或减少针对靶mRNA中和/或互补双链分子链中互补核苷酸的亲和力(WO2005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮(7-deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一个优选实施方案中，本发明的双链分子在有义链和/或反义链3’端任一或二者处具有由少数核苷酸组成的3’突出端，当双链分子是具有3’突出端的双链分子时，可以把3’突出核苷酸替换成脱氧核糖核苷酸(Elbashir SM等，Genes Dev 2001Jan 15，15(2)：188-200)。优选地，用于本发明双链分子的3′突出端由两个脱氧核糖核苷酸″t″组成。例如，本发明具有3′突出端的双链分子的例示性序列显示于SEQ ID NO：19或28(有义链)和SEQ ID NO：20或29(反义链)，其包括与SEQ ID NO：21或30对应的靶序列和由两个脱氧核糖核苷酸″t″组成的3′突出端序列。关于进一步的细节，可以利用公开文献如US20060234970。
本发明不限于这些实例，可以将任何已知化学修饰应用于本发明的双链分子，只要所得分子保留抑制靶基因表达的能力。
此外，本发明的双链分子可以包含DNA和RNA二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。具体而言，由DNA链与RNA链形成的杂合多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸表现出提高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA链(多核苷酸)组成的杂合型双链分子、或在任一单链(多核苷酸)或两条单链(多核苷酸)上同时包含DNA和RNA的嵌合型双链分子，诸如此类，来增强所述双链分子的稳定性。
DNA链和RNA链的杂合体可以是这样的杂合体，其中有义链是DNA而反义链是RNA，或者相反，只要它在导入表达靶基因的细胞中后能够抑制该基因表达。优选地，有义链多核苷酸是DNA而反义链多核苷酸是RNA。同样，嵌合型双链分子可以是其中的有义链和反义链均由DNA和RNA组成，或者有义链或反义链中的任一条由DNA和RNA组成，只要在导入表达靶基因的细胞中时，所述双链分子具有抑制该基因表达的活性即可。为了提高双链分子的稳定性，分子中优选包含尽可能多的DNA；而为了诱导靶基因的表达抑制，要求分子在一定范围内是RNA，以充分地诱导表达抑制。
作为嵌合型双链分子的一个优选实例，双链分子的上游部分区域(即位于有义链或反义链内的靶序列或其互补序列之侧翼的区域)为RNA。优选地，所述上游部分区表示有义链的5’侧(5’端)和反义链的3’侧(3’端)。或者，将位于有义链5’末端侧翼或者反义链3’末端侧翼的区域称为上游部分区域。就是说，在优选实施方案中，反义链3’末端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’末端侧翼的区域和反义链3’末端侧翼的区域均由RNA组成。例如，本发明的嵌合型或杂合型双链分子包含以下组合。
有义链：
5’-[---DNA---]-3’
3’-(RNA)-[DNA]-5’
：反义链，
有义链：
5’-(RNA)-[DNA]-3’
3’-(RNA)-[DNA]-5’
：反义链，和
有义链：
5’-(RNA)-[DNA]-3’
3’-(---RNA---)-5’
：反义链。
上游部分区优选是由9-13个核苷酸组成的域，从双链分子的有义链或反义链内的靶序列或其互补序列的末端算起。此外，这种嵌合型双链分子的优选实例包括这样的实例：链长为19-21个核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半区(对于有义链为5’侧区域而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在这样的嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比反义链整体为RNA时强得多(US20050004064)。
在本发明中，双链分子可以形成发夹结构，例如短发夹RNA(shRNA)以及由DNA与RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成紧密的发夹转弯，可以用来通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA在单一多核苷酸上包含有义靶标序列和反义靶标序列，其中所述序列被环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA进一步与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合。这种复合物结合并切割与所述dsRNA或dsD/R-NA的靶标序列匹配的mRNA。
为了形成发夹环结构，可以在有义序列与反义序列之间设置由任意核苷酸序列构成的环序列。因此，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的双链分子。式中，[A]为有义链，包含与靶序列对应的序列；[B]为间插单链；[A′]为反义链，包含与[A]互补的序列。靶序列可以是例如与SEQ ID NO：21或30对应的序列。
本发明不限于这些实例，在双链分子保持抑制JARID1B基因的表达的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在这些实例的基础上修饰而得到的序列。区域[A]与[A′]杂交而形成由区域[B]构成的环。间插单链部分[B]、即环序列，长度优选可以为3～23个核苷酸。例如，环序列可以选自由以下的序列组成的组(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al.，Nature 2002 Jul 25，418(6896)：435-8，Epub 2002 Jun 26)：
CCC、CCACC或CCACACC：Jacque JM et al.，Nature 2002 Jul 25，418(6896)：435-8，Epub 2002 Jun 26；
UUCG：Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May，20(5)：500-5；Fruscoloni Pet al.，Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18，100(4)：1639-44，Epub 2003 Feb10；
UUCAAGAGA：Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun，4(6)：457-67。
优选的具有本发明的发夹环结构的双链分子实例如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自由AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA组成的组；但本发明的一个优选例不限于此：CAGUGAAUGAGCUCCGGCA    (SEQ ID NO：31)-[B]-UGCCGGAGCUCAUUCACUG(SEQ ID NO：32)(对靶序列SEQ IDNO：21)；
本发明的另一个优选例是：GGAAUAUGGAGCUGACAUU(SEQ ID NO：33)-[B]-AAUGUCAGCUCCAUAUUCC(SEQ ID NO：34)(对靶序列SEQ IDNO：30)。
此外，为了增强双链分子的抑制活性，可以将少数核苷酸添加到靶序列的有义链和/或反义链的3’末端，作为3’突出端。添加的核苷酸的数目为至少2个，通常为2-10个，优选为2-3个。核苷酸的种类不受限制，但优选“u”或“t”。添加的核苷酸在双链分子的有义链和/或反义链的3’末端形成单链。
当双链分子具有发夹环结构时，反义链的3′末端添加有3′突出端。此类双链分子的优选例包括但不限于：CAGUGAAUGAGCUCCGGCA(SEQ IDNO：31)-[B]-UGCCGGAGCUCAUUCACUGTT(SEQ ID NO：20)(对于靶序列SEQ ID NO：21)和GGAAUAUGGAGCUGACAUU(SEQ ID NO：33)-[B]-AAUGUCAGCUCCAUAUUCCTT(SEQ ID NO：29)(对于靶序列SEQID NO：30)。
对于双链分子的制备方法没有特殊限制，但优选采用本技术领域公知的化学合成方法。根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后采用适当的方法使它们退火到一起，来获得双链分子。退火的具体例子包括其中将合成的单链多核苷酸以优选至少约3∶7、更优选约4∶6、最优选基本上等摩尔量(即约5∶5的摩尔比)的摩尔比混合。然后，将混合物加热到双链分子解离的温度，再缓慢冷却。经退火的双链多核苷酸可以采用本技术领域公知的常用方法来纯化。纯化方法的例子包括：利用琼脂糖凝胶电泳的方法，或者其中任选地除去剩余的单链多核苷酸(例如利用适当的酶进行降解)的方法。
所述位于JARID1B序列侧翼的调控序列可为相同或不同的，以使得它们的表达能够独立地，或者以时间性或空间性方式被调控。所述双链分子可通过将JARID1B基因模板克隆入载体(例如含有来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单元或人类H1 RNA启动子的载体)以在胞内进行转录。
编码本发明双链分子的载体：
本发明还包括编码一种或多种本文所述的双链分子的载体、以及包含该载体的细胞。本发明的载体优选包含编码处于可表达形式的本发明双链分子的核酸序列。在本说明书中，术语“处于可表达的形式”，是指该载体当被导入细胞中时，将表达该分子。在优选的实施方案中，载体包含双链分子表达所必需的调节元件。本发明的这种载体可以用于产生本发明的双链分子，也可以直接用作癌症治疗的活性成分。
或者，本发明提供了如下的载体，其包括具有有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中的任一个，其中所述有义链核酸包括SEQ ID NO：21或30的核苷酸序列，而所述反义链核酸由与有义链互补的序列组成，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中所述载体在导入表达JARID1B的细胞中时抑制所述基因的表达。优选地，多核苷酸是长度为约19个至25个核苷酸的寡核苷酸(例如来自SEQ ID NO：1核苷酸序列的连续核苷酸)。更优选地，多核苷酸组合包括单一核苷酸转录物，其具有经单链核苷酸序列相连接的有义链和反义链。更优选地，多核苷酸组合具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中[A]是包括SEQ ID NO：21或30的核苷酸序列；[B]是由约3个至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；而[A′]是与[A]互补的核苷酸序列。
本发明的载体可通过下述方法生成：例如，将JARID1B序列克隆入表达载体中，使调控序列可操作性地连接于JARID1B序列，以允许两条链的表达(通过DNA分子的转录)(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May，20(5)：500-5)。例如，作为mRNA之反义链的RNA分子由第一启动子(例如位于克隆DNA的3’末端侧翼的启动子序列)转录，对mRNA而言为有义链RNA分子由第二启动子(例如位于克隆DNA的5’末端侧翼的启动子序列)转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默该基因的双链分子构建体。或者，使用分别编码双链分子之有义链和反义链的两个载体构建体来分别表达有义链和反义链，随后形成双链分子构建体。而且，克隆的序列可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，即，载体的单一转录物同时包含靶基因的有义序列和互补的反义序列二者。
也可以配置本发明的载体使得其实现在靶细胞的基因组中的稳定插入(关于同源重组盒载体的说明，参见Thomas KR & Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12)。可以参考例如：Wolff等，Science 1990，247：1465-8；美国专利第5,580,859号、第5,589,466号、第5,804,566号、第5,739,118号、第5,736,524号、第5,679,647号和WO 98/04720。基于DNA的输送技术的例子包括：“裸DNA”、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导型)输送、阳离子脂质复合体、和粒子介导型投递(“基因枪”)或压力介导型输送(例如参照美国专利第5,922,687号)。
本发明的载体包括，例如，病毒性载体或细菌性载体。表达载体的例子包括牛痘或鸡痘等减毒病毒宿主(参照美国专利第4,722,848号)。该策略涉及例如使用牛痘病毒作为载体来表达编码双链分子的核苷酸序列。重组牛痘病毒在被导入表达靶基因的细胞时即表达该分子并由此抑制细胞的增殖。可使用的载体的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG载体在Stover等，Nature1991，351：456-60中有记载。其它多种多样的载体可用于双链分子的治疗性施用与生产，例子包括腺病毒载体和腺随伴病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。可以参照例如Shata等，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock等，J Leukoc Biol 2000，68：793-806；以及Hipp等，In Vivo 2000，14：571-85。
使用本发明双链分子抑制或降低癌细胞生长及治疗癌症的方法
在本发明中，测试了dsRNA抑制细胞生长的能力。所述dsRNA有效地敲低(knock down)了膀胱癌细胞系和肺癌细胞系中基因的表达，同时亦发生了细胞增殖的抑制(图7)。
因此，本发明提供了抑制细胞生长，即癌细胞生长的方法，所述方法通过经抑制JARID1B基因的表达来诱导JARID1B基因的功能障碍来实现。依照本发明，JARID1B基因的表达在急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌中特异性升高(表3)。因此，本发明的方法可用于抑制此类癌症中的细胞生长。JARID1B基因表达可通过特异性地靶定JARID1B基因的任何前述的本发明双链分子或可表达任何所述双链分子的载体来抑制。例如，包含与作为靶序列的SEQ IDNO：21或30对应的核酸序列的双链分子可优选用于本方法。
上述本发明双链分子及载体抑制癌性细胞之细胞生长的能力证明其可用于治疗上述癌症的方法。因此，本发明提供通过施用针对JARID1B基因的双链分子或表达所述分子的载体来治疗罹患癌症患者的方法。
可通过将细胞与针对JARID1B基因的双链分子、表达该分子的载体或包含同样分子的组合物接触来抑制表达JARID1B基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞，以较低速率增殖或具有降低的存活力。细胞生长可通过本领域已知技术测定，例如使用MTT细胞增殖测定。
任何种类的细胞的生长均可根据本方法进行抑制，只要所述细胞表达或过表达JARID1B基因。可作为例子的细胞包括急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌，尤其是膀胱癌和肺癌。
因此，对于正罹患或有风险发生与JARID1B有关的疾病的患者，可通过施用至少一种本发明双链分子、表达至少一种所述分子的至少一种载体或包含至少一种所述分子的至少一种组合物进行治疗。举例而言，肺癌或膀胱癌患者可根据本发明的方法进行治疗。癌症类型可通过根据所诊断的特定类型肿瘤的标准方法来进行鉴定。例如，肺癌可通过CEA、CYFRA等等作为肺癌标志，或通过胸部X光和/或痰细胞学进行诊断。膀胱癌可以用尿液分析、X-射线分析或膀胱镜检查进行诊断。更优选地，要用本发明所述方法治疗的患者可以是用这样的方法选出的：在自患者收集的样品中使用常规方法诸如RT-PCR和免疫测定法检测JARID1B的表达水平。优选地，在本发明的治疗之前，对于来自受试者的所述活检标本使用本领域所知的方法，例如，免疫组织化学分析或RT-PCR，证实JARID1B基因的过表达。
根据本发明的方法，多种针对JARID1B基因的双链分子(或表达同样分子的载体或含有同样分子的组合物)可用于施用。
为抑制细胞生长，本发明的双链分子可直接以可实现该分子与对应的mRNA转录物结合的形式导入细胞。另外，如上所述，编码双链分子的DNA可作为载体导入细胞。为将双链分子和载体导入细胞，可使用转染增强剂，例如FuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)与Nucleofector(Wako pure Chemical)。
当治疗导致临床效益，诸如受试者中JARID1B基因表达的减少、癌症的尺寸、患病率(prevalence)、或转移潜力的降低，可以认为该治疗是“有效”的。当预防性地适用治疗时，“有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。有效性结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来加以确定。
应理解，本发明的所述双链分子是亚化学计量地降解JARID1B mRNA的。虽不愿拘于任何理论，认为本发明的所述双链分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，与常规的癌症疗法相比，为实施治疗效应而需要输送到癌症的位置或其附近的双链分子要少得多。
本领域技术人员在考虑了受试者的体重、年龄、性别、疾病类型、症状及其它条件、施用途径、以及是局部施用还是全身施用等因素的基础上，能够容易地确定本发明的双链分子的有效量。一般而言，本发明双链分子的有效量是在癌症部位或其附近胞内浓度为大约1纳摩尔(nM)到约100nM，优选大约2nM到大约50nM，更优选大约2.5nM到大约10nM。考虑可使用更多或更少量的双链分子。本领域一般技术人员可方便地及常规地确定特定情况下所需的确切剂量。
本发明的方法可用于抑制表达JARID1B基因的癌症例如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌，尤其是膀胱癌和肺癌的生长或转移。具体而言，含有与SEQ IDNO：21或30对应的靶序列的双链分子特别优选用来治疗癌症。
为了治疗癌症，还可以将本发明的双链分子与不同于所述双链分子的药剂组合来施用于受试者。或者，本发明的双链分子还可以与其它旨在用于癌症治疗的治疗方法组合来施用于受试者。举例而言，本发明所述双链分子可与现在用于治疗癌症或预防癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法，外科手术，以及使用化疗剂的治疗)组合施用。
在本发明的方法中，双链分子可以裸双链分子的形式、以与投递试剂相组合的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。
用于与本发明的双链分子组合施用的合适的投递试剂包括Mirus TransitTKO脂溶性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。一种优选的投递试剂是脂质体。
脂质体能够帮助将双链分子投递至特定的组织如视网膜或肿瘤组织中，还能够增加双链分子的血中半衰期。适合在本发明的方法中使用的脂质体是由常规的囊泡形成性脂质(vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂，以及甾醇，诸如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，如期望的脂质体大小以及在血流中的脂质体的半衰期等。有多种制备脂质体的方法是公知的，例如Szoka等，Ann RevBiophys Bioeng 1980，9：467；美国专利第4,235,871号；第4,501,728号；第4,837,028号；第5,019,369号；将上述文献的全部内容援引并入本说明书。
在一些实施方案中，包被本发明的双链分子的脂质体包含能够将脂质体输送至癌症部位的配体分子。优选的配体是与肿瘤或血管内皮细胞中普遍的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原结合的单克隆抗体
另外，包被本发明的双链分子的脂质体可以经过修饰以免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除，例如，通过使其结构的表面结合有调理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制部分和配体。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如在本说明书中所使用的，例如，当调理作用抑制部分化学地或物理地搭接在脂质体膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)插入膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，该表层显著地减少巨噬-单核细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(”RES”)对脂质体的摄入；在例如美国专利第4,920,016号中对此有记载，后者的全部公开内容援引并入本说明书。因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制部分修饰过的脂质体能够保留在血液循环中的时间显著更长。出于以上理由，这样的脂质体有时也被称为“隐形”(stealth)脂质体。
已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管系统供给的组织中。因此，在以这样的微血管系统缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率地蓄积。参见Gabizon等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18：6949-53。此外，RES的摄入的减少阻止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的本发明的脂质体能够将本发明的双链分子输送至肿瘤细胞。
适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选为分子量约500～约40,000道尔顿、更优选约2,000～约20,000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通过与碳酸的衍生物反应而生成了羧基结合的羧基化多糖类或寡糖。
优选地，调理作用抑制部分为PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
调理作用抑制部分可以通过许多公知技术中的任何一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na(CN)BH3和混合溶剂，如60℃的四氢呋喃与水的30∶12比例混合物。
上文讨论了表达本发明的双链分子的载体。这样的表达至少一种本发明的双链分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂组合施用，所述合适的投递试剂包括Mirus Transit LT1亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体。将表达本发明的双链分子的重组病毒载体输送到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。
本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。
合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、或鼻内递送。
合适的非消化道施用途径包括血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。
本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。优选的是将药剂直接注射到癌症部位或其附近的组织中。特别优选的是将药剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。
本领域技术人员可以容易地确定用于对给定受试者施用本发明双链分子的合适剂量方案。例如，双链分子可以一次性施用给受试者，例如以单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或其附近。或者，双链分子可以在约3～约28日、更优选约7～约10日的期间内每日一次或二次地施用给受试者。在优选的剂量方案中，双链分子可以在7日期间内一日一次地注射到癌症部位或其附近。当剂量方案包括多次施用时，应该理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量，可以包含在整个剂量方案中施用的该双链分子的总量。
包含本发明双链分子的组合物：
除上述外，本发明亦提供了包含至少一种本发明的双链分子或编码它的载体的药物组合物。所述药物组合物抑制JARID1B基因表达，且因此抑制癌细胞生长，因此它们可用于治疗或预防涉及JARID1B基因过表达的癌症，例如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌。优选地，所述药物组合物可用于治疗或预防膀胱癌和肺癌。
任何靶向JARID1B基因的本发明双链分子或任何编码该双链分子的本发明载体可用于本发明的组合物。上文描述了双链分子和载体的详情。优选地，双链分子包含与作为靶序列的SEQ ID NO：21或30对应的核酸序列。
本发明的所述双链分子优选在施用于受试者之前根据本领域众所周知的技术配制为药物组合物。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。本文中所使用的“药物组合物”包括适用于人类与兽医用的组合物。制备本发明药物组合物的方法属于本领域一般技术，例如，描述于Remington′s Pharmaceutical Science，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1985)，其全部公开内容通过引用包含于本文中。
本发明的药物组合物包含至少一种本发明的双链分子或编码它们的载体(例如，以重量计为0.1％到90％)，或所述分子的生理学上可接受的盐，与生理上可接受的载体介质混合。生理学上可接受的载体介质优选水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸及类似物。
根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，每一种分子均可针对JARID1B基因。
而且，本组合物可以包含编码1个或多个双链分子的载体。例如，所述载体可以编码1种或2种本发明双链分子。或者，本组合物可以包含多种载体，而各载体编码不同的双链分子。
而且，本双链分子可以包含在本本发明的脂质体中。上文描述了脂质体的详情。
本发明的药物组合物中还可以包含常规的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和pH调节剂。合适的添加剂包括：生理学生物相容性的缓冲剂(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体；例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95％，优选25-75％的本发明的一种或多种双链分子。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以包含0.01-20重量％、优选1-10重量％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。
除上述之外，本组合物中还可以包含其它药学活性成分，只要它们不抑制本双链分子的体内功能。例如，上述组合物中可以包含常规用于癌症治疗的化疗药物。
在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的双链核酸分子在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途，所述癌症诸如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌，尤其是膀胱癌和肺癌。例如，本发明涉及在细胞中抑制JARID1B基因表达的双链核酸分子的用途，该分子包含有义链和与之互补的反义链。可提供任何本发明双链分子用于此用途，只要该双链分子在导入细胞中时具有抑制JARID1B基因表达和细胞增殖的能力。包含与SEQ ID NO：21或30对应的靶序列的双链分子适合于本发明的用途。
此外，本发明还提供生产用于治疗诸如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌等癌症的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将药学或者生理学可接受的载体与作为活性成分的双链分子一起配制的步骤。包含与SEQ ID NO：21或30对应的靶序列的双链分子适合于本发明的方法或工艺。
在另一个实施方案中，本发明还提供生产用于治疗诸如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌等癌症的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将活性成分与药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤，其中所述活性成分是本发明的双链核酸分子。包含与SEQ ID NO：21或30对应的靶序列的双链分子适合于本发明的方法或工艺。
在本发明中，可以用至少一种选自下组的活性成分来治疗过表达JARID1B的癌症：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，和
(c)编码它们的载体。
所述癌症包括但不限于急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌或肾细胞癌。因而，在施用包含所述活性成分的药物组合物之前，优选确认要治疗的癌细胞或组织中JARID1B的表达水平是否与相同器官的正常细胞相比升高。如此，在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗(过)表达JARID1B的癌症的方法，该方法可包括下列步骤：
i)检测自具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中JARID1B的表达水平；
ii)将所述JARID1B表达水平与正常对照比较；并
iii)对具有与正常对照相比过表达JARID1B的癌症的受试者施用至少一种选自下组的成分：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，和
(c)编码它们的载体。
或者，本发明还提供了一种药物组合物，其包含至少一种选自下组的成分，用于施用于具有过表达JARID1B的癌症的受试者：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，和
(c)编码它们的载体。
换言之，本发明进一步提供了一种用于鉴定要用下述各项治疗的受试者的方法：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，或
(c)它们它们的载体，
该方法可包括测定源自受试者的癌细胞或组织中JARID1B的表达水平的步骤，其中所述水平与该基因正常对照相比的升高指示该受试者可用下述各项治疗的癌症：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，或
(c)编码它们的载体。
下面会更加详细地描述本发明治疗癌症的方法。
用本方法治疗的受试者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如，人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。
根据本发明，测定自受试者获得的癌细胞或组织中JARID1B的表达水平。表达水平可在转录产物(核酸)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，JARID1B的mRNA可使用探针通过杂交方法(例如，Northern杂交)定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测JARID1B的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用JARID1B的序列信息制备此类探针。举例而言，JARID1B的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物诸如染料、荧光物质或同位素来标记，且所述基因的表达水平可以作为发生杂交的标记物的强度来加以检测。
进一步，JARID1B的转录产物(例如SEQ ID NO：1)可使用引物通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR)定量。上述引物可基于所述基因已知的序列信息制备。
具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件与低严格条件下与JARID1B的mRNA杂交。本文所用的短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下发生。一般地，严格条件的温度选择为比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，用于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。
或者，本发明的诊断可以通过检测翻译产物来进行。例如，可以确定JARID1B蛋白(SEQ ID NO：2)的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段或经修饰抗体保留对JARID1B蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。
作为另一种基于JARID1B的翻译产物检测其基因的方法，可利用针对JARID1B蛋白的抗体通过免疫组织化学分析测量其染色的强度。即，在此测量中，强染色表明所述蛋白质的水平/存在增加，且同时表明JARID1B基因的高表达水平。
对于癌细胞中靶基因(例如JARID1B基因)的表达水平而言，如果测定出其较之靶基因的对照水平(例如正常细胞中的水平)增加了例如10％，25％或50％的话，或增加到超过1.1倍，超过1.5倍，超过2.0倍，超过5.0倍，超过10倍或者更多，则可认为其在癌细胞中的表达水平是增加的。
对照水平可以与癌细胞同时确定，使用先前从疾病状态(癌性或非癌性)已知的受试者收集和保存的样品。另外，自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞可用作正常对照。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的JARID1B基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是源自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中JARID1B基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的生物样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中JARID1B基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2 S.D.或平均值+/-3 S.D.的范围可以用作标准值。
在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌性对照水平”。
当JARID1B基因的表达水平与正常对照水平相比升高或者与癌性对照水平相似/等同时，该受试者可诊断为具有要治疗的癌症。
更具体地，本发明提供了(i)诊断受试者是否具有要治疗的癌症，和/或(ii)为癌症治疗选择受试者的方法，该方法包括下列步骤：
a)测定自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中JARID1B的表达水平；
b)将该JARID1B表达水平与正常对照水平比较；
c)如果JARID1B表达水平与正常对照水平相比升高的话，将该受试者诊断为具有要治疗的癌症；并
d)如果受试者在步骤c)中诊断为具有要治疗的癌症的话，选择该受试者进行癌症治疗。
或者，此类方法包括下列步骤：
a)测定自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中JARID1B的表达水平；
b)将该JARID1B表达水平与癌性对照水平比较；
c)如果该JARID1B表达水平与癌性对照水平相似或等同的话，将该受试者诊断为具有要治疗的癌症；并
d)如果受试者在步骤c)中诊断为具有要治疗的癌症的话，选择该受试者进行癌症治疗。
本发明还提供了用于确定罹患癌症的受试者是否可用本发明的双链分子或编码它们的载体来治疗的试剂盒，其也可用于评估和/或监测癌症治疗的功效。优选地，所述癌症包括但不限于急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌或肾细胞癌。更具体地，所述试剂盒优选包括至少一种在源自受试者的癌细胞中检测JARID1B基因表达的试剂，所述试剂可选自下组：
(a)检测JARID1B基因的mRNA的试剂；
(b)检测JARID1B的蛋白质的试剂；和
(c)检测JARID1B的蛋白质的生物学活性的试剂。
适于检测JARID1B基因的mRNA的试剂包括特异性结合或识别JARID1B mRNA的核酸，诸如具有与JARID1B mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这些种类的寡核苷酸的例子有对JARID1B mRNA为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这些种类的寡核苷酸。如果需要，可将用于检测JARID1B mRNA的试剂固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测JARID1B mRNA的试剂。
另一方面，适于检测JARID1B蛋白质的试剂包括针对JARID1B蛋白质的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述试剂，只要所述片段或经修饰抗体保留与JARID1B蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且在本发明中可使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测JARID1B蛋白质的试剂。
所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。举例而言，从没有癌症或罹患癌症的受试者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业和用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和带有使用说明的装箱单(例如，书面的、磁带、CD-ROM等等)。这些试剂之类的包含在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可从多种材料制得，例如玻璃或塑料。
在本发明的一个实施方案中，当所述试剂是针对JARID1B mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质例如多孔条上，以形成至少一个检测位点。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位点，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位点可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位点上量较大而在接下来的位点上量较小。在加入测试样品之后，显示可检测信号的位点的数量提供了在样品中存在的JARID1B mRNA量的定量指征。所述检测位点可配置为具有任何合适地可检测的形状，通常是横跨测试条宽度的条状或点状。
本发明的试剂盒可进一步包括阳性对照样品或JARID1B标准样品。本发明的的阳性对照样品可通过收集JARID1B阳性样品，随后测定其JARID1B水平来制备。或者，可将纯化的JARID1B蛋白或多核苷酸添加至不表达JARID1B的细胞以形成所述阳性样品或JARID1B标准样品。在本发明中，纯化的JARID1B可以是重组蛋白。阳性对照样品的JARID1B水平例如大于截留值。
筛选抗癌化合物：
本发明提供了筛选有能力抑制癌细胞生长的化合物的方法，所述癌细胞例如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌。本筛选方法可通过靶向JARID1B基因或蛋白来实施。通过本方法筛选的化合物可以是用于治疗诸如急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌等癌症的优良候选化合物。尤其是，确认了抑制JARID1B基因表达导致抑制膀胱癌和肺癌中的细胞增殖(图7)。因此，通过本方法筛选出的化合物可优选用于治疗膀胱癌和肺癌。
用于筛选的药剂或化合物：
在本发明的语境中，待通过本筛选方法鉴定的药剂或化合物可以是任何化合物或包含数种化合物的组合物。而且，根据本发明筛选方法暴露于细胞或蛋白的测试药剂或组合物可以是单个化合物或多个化合物的组合。当在方法中使用化合物组合时，化合物可以顺次或同时加以接触。
任何测试药剂或化合物，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸构建体，例如反义RNA、siRNA、核酶以及适体等等或抗体)以及天然化合物，均可用于本发明的筛选方法中。也可以从本领域熟知的很多组合文库方法中采取任何办法来获得本发明的测试药剂或化合物，这些方法包括(1)生物文库，(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)，(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物”(“one-beadone-compound”)文库法，以及(5)使用亲和色谱选择的合成文库法。使用亲和色谱选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145-67)。合成分子文库方法的例子可在本领域找到(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA1993，90：6909-13；Erb et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1994，91：11422-6；Zuckermann et al.，J Med Chem 37：2678-85，1994；Cho et al.，Science 1993，261：1303-5；Carell et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2059；Carell et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2061；Gallop et al.，J Med Chem 1994，37：1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(参见Houghten，Bio/Techniques 1992，13：412-21)或珠子上(Lam，Nature 1991，354：82-4)、芯片上(Fodor，Nature1993，364：555-6)、细菌上(美国专利5,223,409)、孢子上(美国专利5,571,698；5,403,484与5,223,409)、质粒上(Cull et al.，Proc Natl Acad Sci USA1992，89：1865-9)或噬菌体上(Scott and Smith，Science 1990，249：386-90；Devlin，Science 1990，249：404-6；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Felici，J Mol Biol 1991，222：301-10；美国专利申请2002103360)。
通过本发明任何筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的化合物，包括在通过本发明筛选方法获得的药剂或化合物之内。
此外，当所筛选的测试药剂或化合物是蛋白质时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以确定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定编码蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白的DNA。以其在制备治疗或预防癌症的候选物测试剂中的有用性为准对所得的DNA进行确认。
对本文描述筛选为有用的测试药剂或化合物亦可为特异性结合JARID1B蛋白或其缺乏原始蛋白的体内生物活性的部分肽的抗体。
尽管测试药剂或化合物文库的构建是本领域众所周知的，在下文中还是进一步提供了鉴定测试药剂和构建用于本筛选方法的这些药剂或化合物文库的指导。
(i)分子建模：
对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对待抑制靶分子即JARID1B蛋白的分子结构的知识为人们构建测试药剂或化合物文库提供了便利。预筛选适于进一步评估的测试药剂或化合物的方法之一，是对测试药剂与JARID1B蛋白的相互作用进行计算机建模。
计算机建模技术为针对选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于从选定分子的x-射线晶体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以优化结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合物之一或二者发生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。
上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation，Waltham，Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。利用QUANTA可进行分子相互行为的互动性构建、修饰、和可视化分析。
有多篇文献综述了与特异蛋白相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988，97：159-66；Ripka，NewScientist 1988，54-8；McKinlay & Rossmann，Annu Rev Pharmacol Toxiciol1989，29：111-22；Perry & Davies，Prog Clin Biol Res 1989，291：189-93；Lewis& Dean，Proc R Soc Lond 1989，236：125-40，141-62；以及综述关于核酸组分模型受体的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111：1082-90。
其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga，Ontario，Canada的BioDesign，Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix，Inc公司、Cambridge，Ontario的Hypercube，Inc.等公司获取。见例如DesJarlais et al.，J Med Chem1988，31：722-9；Meng et al.，J Computer Chem 1992，13：505-24；Meng et al.，Proteins 1993，17：266-78；Shoichet et al.，Science 1993，259：1445-50。
一旦鉴定出推定的抑制剂，可使用组合化学技术基于鉴定出的推定抑制剂的化学结果构建任何数量的变体，如下所述。对于所得的推定的抑制剂，或称“测试药剂”文库，可使用本发明的方法筛选，以鉴定治疗或预防癌症的测试药剂或化合物。
(ii)组合化学合成：
测试药剂或化合物的组合文库可以作为合理药物设计程序——其涉及有关已知化合物中存在的核心结构的知识——的一部分来制备。这种策略使得文库可以保持合理的规模，便于高通量筛选。或者，可通过简单地合成构成文库的分子家族的所有排列，构建简单的、特别是短的、聚合物性的分子文库。后一种方法的一个实例是全部由长度为6个氨基酸组成的肽文库。这种肽文库包含所有6氨基酸序列组合。这种类型的文库称作线性组合化学文库。
组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见例如美国专利5,010,175；Furka，Int J Pept Prot Res 1991，37：487-93；Houghten et al.，Nature1991，354：84-6)。也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被编码的肽(例如WO93/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)，苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美国专利5,288,514)，diversomer如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWittet al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13)，插烯化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：9217-8)，小化合物文库的模拟物有机合成(analogous organic synthese)(Chenet al.，J.Amer Chem Soc 1994，116：2661)，寡聚氨基甲酸盐(Cho et al.，Science1993，261：1303)，和/或肽酰膦酸酯(peptidylphosphonates)(Campbell et al.，JOrg Chem 1994，59：658)，核酸文库(见Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology 1995 supplement；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA)，肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughan et al.，NatureBiotechnology 1996，14(3)：309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(见例如Liang et al.，Science 1996，274：1520-22；美国专利5,593,853)，和有机小分子文库(见例如苯并二氮卓，Gordon EM.Curr Opin Biotechnol.1995 Dec1；6(6)：624-31；类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫杂氮杂环己烷(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓，5,288,514；等)。
(iii)噬菌体展示：
另一种手段是使用重组噬菌体来产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott& Smith，Science 1990，249：386-90；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Devlin et al.，Science 1990，249：404-6)，可以构建非常大的文库(例如106-108个化学实体)。再一种手段主要使用化学方法，其实例包括Geysen方法(Geysen et al.，Molecular Immunology 1986，23：709-15；Geysen et al.，JImmunologic Method 1987，102：259-74)和Fodor等的方法(Science 1991，251：767-73)。Furka等(14th International Congress of Biochemistry 1988，Volume #5，Abstract FR：013；Furka，Int J Peptide Protein Res 1991，37：487-93)，Houghten(美国专利4,631,211)和Rutter等(美国专利5,010,175)记载了产生肽混合物的方法，可以将这些肽作为激动剂或拮抗剂加以测试。
用于制备组合文库的设备是可商购的(见例如357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433AApplied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，有多种组合文库本身也是商业可得的(见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等等)。
JARID1B结合性药剂或化合物的筛选：
在本发明中，在急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌中检测到与正常器官中的表达相比的JARID1B过表达(表3)。因此，本发明提供了用于筛选结合JARID1B蛋白的药剂的方法。由于此类癌症中JARID1B的表达，与JARID1B蛋白结合的药剂或化合物可望抑制癌细胞的增殖，并因此对治疗或预防癌症是有用的。因此，本发明亦提供了用于筛选抑制癌细胞增殖的药剂或化合物的方法，以及利用JARID1B多肽筛选治疗或预防肺癌的药剂化合物的方法。具体而言，该筛选方法的一个实施方案包括以下步骤：
(a)将测试药剂或化合物与自JARID1B基因衍生的JARID1B多肽接触；
(b)检测所述多肽与所述测试药剂或化合物之间的结合活性；并
(c)选择结合所述多肽的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防JARID1B相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选抑制癌细胞生长的候选药剂或化合物的方法或者筛选用于治疗或预防癌症的候选药剂或化合物的方法。
更具体地，所述方法包括以下步骤：
(a)将测试药剂或化合物与自JARID1B基因衍生的JARID1B多肽接触；
(b)检测所述多肽与所述测试药剂或化合物之间的结合活性；
(c)将(b)的结合水平与所述测试药剂或化合物不存在下检测出的结合水平比较；并
(d)将(c)的结合水平与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与对JARID1B多肽的结合活性关联起来。例如，当某种测试药剂或化合物结合JARID1B多肽时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当某种测试药剂或化合物不结合JARID1B多肽时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
本发明的方法将在下面更加详细的加以描述。
需用于本筛选方法的JARID1B多肽可为重组多肽，或者是来自自然界的蛋白质，或其部分肽。与测试药剂或化合物接触的多肽可以是，例如，纯化的多肽、可溶蛋白质、与载体结合的形式、或者与其它多肽融合的融合蛋白。
作为筛选蛋白质，例如与JARID1B多肽结合的蛋白质的方法，可使用本领域技术人员公知的多种方法。上述筛选可通过，例如，免疫沉淀方法，尤其是如下述的方式进行。通过将编码JARID1B多肽的基因插入外源基因表达载体，例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS与pCD8，在宿主(例如，动物)细胞等中表达该基因。
为此表达所用的启动子可为任何通常可使用的启动子，包括，例如，SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.AcademicPress，London，83-141(1982))、EF-alpha启动子(Kim et al.，Gene 91：217-23(1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193(1991))、RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SR alpha启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8：466(1988))、CMV立即早期启动子(Seed andAruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9：946(1989))、HSV TK启动子等等。
将所述导入宿主细胞以表达外源基因可根据任何方法实施，例如电穿孔方法((Chu et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))、磷酸钙方法(Chenand Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))、DEAE葡聚糖方法(Lopata etal.，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol4：1641-3(1984))、Lipofectin方法(Derijard B.，Cell 76：1025-37(1994)；Lamb etal.，Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran et al.，Science 259：230-4(1993))等等。
对于由JARID1B基因编码的多肽，可以把特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入该多肽的N或C端，从而将该多肽表达为包含该表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。能够利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP)形成的融合蛋白的载体是可商购的。另外，还报道了如下的融合蛋白，其通过导入仅由数个到十二个(a dozen)氨基酸构成的小型表位加以制备，使融合不会改变JARID1B多肽的性质。可以使用例如多组氨酸(His-标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、E-标签(单克隆噬菌体上的表位)等表位，和识别它们的单克隆抗体作为筛选与JARID1B多肽结合的蛋白质的表位-抗体系统(ExperimentalMedicine 13：85-90(1995))
在免疫沉淀中，将这些抗体添加到用合适去垢剂制备的细胞裂解物中而形成免疫复合体。免疫复合体由JARID1B多肽、包含与该多肽结合的能力的多肽、和抗体组成。除了使用针对上述表位的抗体之外，还可以使用针对JARID1B多肽的抗体进行免疫沉淀。免疫复合体可以被沉淀，例如当抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过蛋白A sepharose或蛋白G sepharose将其沉淀。如果将由JARID1B基因编码的多肽制备成与表位(例如GST)的融合蛋白，则可以使用特异结合这些表位的物质，例如谷胱甘肽-sepharose 4B，按照与使用针对JARID1B多肽的抗体的相同的方式来形成免疫复合体。
可遵循或根据，例如，文献中的方法来实施免疫沉淀(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
普遍使用SDS-PAGE分析经免疫沉淀的蛋白，使用合适浓度的凝胶，可以利用结合蛋白的分子量来分析该蛋白。由于与JARID1B多肽结合的蛋白难以通过考马斯兰染色或银染色等普通染色方法检测到，可以通过如下的方法提高蛋白的检测灵敏度：在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白，并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，可以直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶上纯化出靶蛋白并测定其序列。
作为利用JARID1B多肽来筛选结合该多肽的蛋白的方法，可以使用例如West-Western印迹分析法(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))。具体地，与JARID1B多肽结合的蛋白可以通过如下方法获得，从预期表达结合JARID1B多肽的蛋白质的培养细胞利用噬菌体载体(例如ZAP)制备cDNA文库，在LB琼脂糖上表达蛋白，将表达出的蛋白固定在滤膜上，使纯化并且标记的JARID1B多肽与上述滤膜反应，并依照标记物来检测表达与JARID1B多肽结合的蛋白的噬菌斑。本发明的多肽可以利用生物素与抗生物素蛋白间的结合，或者利用特异结合JARID1B多肽的抗体或与JARID1B多肽融合的肽或多肽(例如GST)，来进行标记。也可以使用利用放射性同位素或荧光等的方法。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献见“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields andSternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。
在双杂交系统中，使JARID1B多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与JARID1B多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，使该文库在被表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后，将cDNA文库导入到上述酵母细胞中，并从检测到的阳性克隆(当酵母细胞中表达出与JARID1B多肽结合的蛋白时，两者的结合激活报道基因，使阳性克隆可检测)分离源自该文库的cDNA。通过将上面分离的cDNA导入到大肠杆菌中并表达该蛋白，可制备由该cDNA编码的蛋白。作为报道基因，除了HIS3基因之外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
也可以用亲和色谱来筛选与JARID1B基因编码的多肽结合的药剂或化合物。例如，可以把JARID1B多肽固定在亲和柱的载体上，而将含有能够结合JARID1B多肽的蛋白的测试药剂或化合物施加到该柱上。这里的测试药剂或化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在加载测试药剂之后，冲洗柱子，从而可以制备得到结合于JARID1B多肽的药剂。当测试药剂或化合物是蛋白质时，对所得蛋白质的氨基酸序列进行分析，根据该序列合成寡DNA，并用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库，从而获得编码该蛋白的DNA。
利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合药剂的装置。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽(例如BIAcore，Pharmacia)，以表面等离子体共振信号的形式对JARID1B多肽与测试药剂间的相互作用进行实时的观察。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，人们就有可能对JARID1B多肽与测试药剂或化合物间的结合进行评估。
用于筛选当固定的JARID1B多肽暴露于合成化合物或天然物质库或随机噬菌体肽展示文库时发生结合的分子的方法，以及使用基于组合化学技术的高通量筛选方法(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))，以不仅分离与JARID1B蛋白结合的蛋白质，而且分离与JARID1B蛋白结合的化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法，是本领域技术人员众所周知的。
在本发明中，揭示了抑制JARID1B表达则降低细胞生长。因此，通过筛选结合JARID1B多肽的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或进一步筛选来评估，以鉴定用于癌症的治疗性药剂或化合物。
抑制JARID1B生物学活性的药剂或化合物的筛选
JARID1B蛋白具有组蛋白H3脱甲基化活性(Yamane K.et al.Mol Cell2007；25：801-12)，而且依照本发明，该蛋白具有促进E2F1基因和E2F2基因表达的活性(图9)、促进细胞增殖活性(图7C)或抗凋亡活性(图7E)。利用这些生物学活性，本发明提供了筛选可抑制涉及JARID1B基因过表达的癌细胞增殖的药剂或化合物的方法，以及筛选用于治疗或预防此类癌症的候选药剂或化合物的方法。因此，本发明提供了一种方法，其包括下列步骤：
(a)将测试药剂或化合物与自JARID1B基因衍生的多肽接触；
(b)检测步骤(a)所述多肽的生物学活性；
(c)选择较之测试药剂或化合物不存在时的生物学活性，抑制该生物学活性的测试药剂或化合物，作为候选药剂或化合物。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防JARID1B相关癌症的治疗效果。因此，本发明亦提供了使用JARID1B多肽或其片段筛选用于抑制细胞生长的候选药剂或化合物或者用于治疗或预防JARID1B相关癌症的候选药剂或化合物的方法，其包括以下步骤：
a)将测试药剂或化合物与JARID1B多肽或其功能性片段接触；并
b)检测步骤a)的所述多肽或片段的生物学活性；并
c)将b)的生物学活性与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与JARID1B多肽或其功能性片段的生物学活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物抑制或抑制JARID1B多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不抑制或抑制JARID1B多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
本发明所述方法将在下面更加详细的加以描述。
任何多肽均可用于筛选，只要它们包含JARID1B蛋白的生物学活性即可。这样的生物学活性包括组蛋白H3脱甲基化活性、促进E2F1和E2F2基因表达的活性、细胞增殖活性和抗凋亡活性。举例而言，可使用JARID1B蛋白，亦可使用与这些蛋白功能上等价的多肽。上述多肽可由细胞内源或外源地表达。
在另一个方面，本发明还提供了一种筛选方法，其遵循“JARID1B结合药剂或化合物的筛选”中描述的方法，包括下述步骤：
a)使测试药剂或化合物与自JARID1B基因衍生的JARID1B多肽接触；
b)检测所述多肽与所述测试药剂或化合物之间的结合；
c)选择结合所述多肽的测试药剂或化合物；
d)使步骤c)中选出的测试药剂或化合物与JARID1B多肽接触；
e)将所述多肽的生物学活性与在所述测试药剂或化合物不存在下检出的生物学活性比较；并
f)选择抑制所述多肽的生物学活性的测试药剂或化合物作为用于治疗或预防癌症的候选药剂或化合物。
通过本筛选分离的药剂或化合物是JARID1B基因编码的多肽的拮抗剂的候选者。术语“拮抗剂”是指通过结合多肽而抑制多肽功能的分子。所述术语还指可降低或抑制JARID1B基因的表达的分子。而且，通过本筛选分离的药剂或化合物是如下药剂或化合物的候选物，所述药剂或化合物抑制JARID1B多肽与分子(包括DNA和蛋白)的体内相互作用。
当本方法中要检测的生物学活性是细胞增殖时，可以通过例如如下方法进行检测：制备表达JARID1B多肽的细胞，在测试化合物的存在下培养细胞，确定细胞增殖速度，测量细胞周期等，以及通过测量存活细胞或集落形成能力。选择降低表达JARID1B的细胞的增殖速度的化合物作为治疗或预防癌症的候选化合物。
更具体而言，该方法包括以下步骤：
(a)使测试化合物与过表达JARID1B的细胞接触；
(b)测量细胞增殖活性；并
(c)选择与测试化合物不存在下的细胞增殖活性相比降低细胞增殖活性的测试化合物。
在优选的实施方案中，本发明的方法可进一步包括下述步骤：
(d)选择对不表达或几乎不表达JARID1B的细胞没有影响的测试化合物。
当本方法中要检测的生物学活性是抗凋亡时，它可通过本领域技术人员实施的常规方法来测定，诸如测量sub-G1细胞的数目、TUNEL方法或LM-PCR方法，使用各种商品化试剂盒来进行。例如，sub-G1细胞的数目可使用FACS来测定。凋亡也可通过使用Apotag Direct(oncor)的TUNEL方法或使用ApoAlert LM-PCR梯形物测定试剂盒(Clontech)的LM-PCR方法依照所附手册来检查。
当本方法中要检测的生物学活性是脱甲基化活性时，它可通过在适合于底物脱甲基化的条件下使JARID1B多肽与底物(例如包含三或二甲基化赖氨酸4的组蛋白H3)接触并检测底物的脱甲基化水平来测定。
更具体地，所述方法包括下列步骤：
(a)在能够进行底物脱甲基化的条件下在测试药剂或化合物存在下使JARID1B多肽与要脱甲基化的底物接触；
(b)检测底物的甲基化水平；并
(c)选择与在测试药剂不存在下检出的甲基化水平相比提高底物甲基化水平的测试药剂或化合物作为候选药剂。
优选地，JARID1B多肽要脱甲基化的底物是包含三或二甲基化组蛋白H3赖氨酸4的组蛋白H3或其片段
在本发明中，JARID1B多肽的脱甲基化活性可通过本领域已知方法来测定。例如，可在适合于脱甲基化的条件下将JARID1B多肽与具有经标记的甲基化位点的底物一起温育。例如，在第4个氨基酸残基处具有三或二-[甲基-14C]-赖氨酸或三或二-[甲基-3H]-赖氨酸的组蛋白H3肽可优选用作脱甲基化的底物。脱甲基化活性可基于温育后底物中的放射性来测定(即底物中的放射性越高指示JARID1B多肽的脱甲基化活性越低)。底物中的放射性可例如通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影来检测。或者，在温育后，可通过常规方法诸如凝胶过滤和免疫沉淀将底物与JARID1B分开，并通过本领域公知的方法来测量底物中的放射性。其它可连接于底物中的甲基的合适标记物，诸如生色和荧光标记物，及检测这些标记物的方法是本领域已知的。
或者，JARID1B多肽的脱甲基化活性可使用质谱术或选择性识别甲基化底物的试剂来测定。例如，针对甲基化底物的抗体可优选用作此类试剂。任何使用此类抗体的免疫学技术可用于检测底物的甲基化水平。例如，当底物是甲基化组蛋白时，可优选使用针对甲基化组蛋白(例如包含三或二甲基化赖氨酸4的组蛋白H3)的抗体。此类抗体是商品化的(例如Abcam Ltd.)。例如，使用识别甲基化底物的抗体进行的ELISA或免疫印迹可用于本发明。
另外，检测脱甲基化活性的本方法可通过制备表达JARID1B基因的细胞，在测试化合物存在下培养细胞，并测定细胞中组蛋白的甲基化水平(例如通过使用特异性结合组蛋白甲基化区的抗体)来实施。
更具体地，所述方法包括下列步骤：
(a)使测试药剂或化合物与表达JARID1B基因的细胞接触；
(b)检测组蛋白H3赖氨酸4的甲基化水平；并
(c)选择与在测试药剂或化合物不存在下检出的甲基化水平相比提高甲基化水平的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。
或者，当要检测的生物学活性是促进E2F1或E2F2基因表达的活性时，它可例如通过实施例1所示的E2F报道物测定法来检测。对于此方法，使测试化合物与表达JARID1B基因的细胞，诸如癌细胞接触。
更具体地，所述方法包括下列步骤：
(a)使测试药剂或化合物与表达JARID1B基因的细胞接触；
(b)测量E2F1基因或E2F2基因的表达水平；并
(c)选择与在测试药剂或化合物不存在下的表达水平相比降低E2F1基因或E2F2基因表达水平的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。
E2F1基因的例示性核酸和多肽序列分别显示于SEQ ID NO：35和36，但不限于此。另外，序列数据亦可分别以登录号NM_005225.2和NP_005216.1获得。
E2F2基因的例示性核酸和多肽序列分别显示于SEQ ID NO：37和38，但不限于此。另外，序列数据亦可分别以登录号NM_004091.2和NP_004082.1获得。
表达JARID1B基因的细胞包括例如自癌症建立的细胞系(例如膀胱癌的5637、253J、253J-BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER和UMUC3；肺癌的SBC5或H2170和LC319)及自临床癌组织纯化的细胞，此类细胞可用于本筛选方法。E2F1基因或E2F2基因的表达水平的测量可通过在细胞与测试药剂或化合物接触之前或之后将包含E2F1基因或E2F2基因的转录调节区及在该调节区控制下的报道基因的载体导入细胞中，然后检测报道基因的表达水平来进行。E2F1基因和E2F2基因的转录调节区是本领域公知的(例如Araki etal.Oncogene 2003，22：7632-41，Pilon et al.Mol Cell Biol 2008，28：7394-401)。报道基因可以是例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosomasp.)红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、lacZ和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)等等。另外，有一些商业产品可用，诸如用于E2F报道物测定法的CignalTM E2F受体测定试剂盒(SuperArray Bioscience Corporation)。或者，E2F1基因和E2F2基因的表达水平可通过使用本领域公知技术检测这些基因的转录或翻译产物来测定，诸如RT-PCR、Northern印迹测定法、Western印迹测定法、免疫染色、ELISA测定法和流式细胞术分析。
在本发明中，用于制备与给定蛋白功能等同的多肽的方法是本领域技术人员公知的，而且包括将突变引入蛋白中的已知方法。一般地说，已知蛋白中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白的功能(Mark DF et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1984，81：5662-6；Zoller MJ & Smith M，Nucleic Acids Res 1982，10：6487-500；Wang A et al.，Science 1984，224：1431-3；Dalbadie-McFarland Get al.，Proc Natl Acad Sci USA 1982，79：6409-13)。事实上，已知突变的或经过修饰的蛋白(即具有通过在某氨基酸序列中替代、删除、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而经过修饰的氨基酸序列的蛋白)保留原始的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc NatlAcad Sci USA 79：6409-13(1982))。因而，本领域技术人员会认识到，对氨基酸序列进行改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别添加、删除、插入、或替代，或者被认为是“保守修饰”的那些修饰，其中蛋白的改变产生具有相似功能的蛋白，这些都是本发明的语境中考虑到的。
“抑制生物学活性”在此定义为较之不存在所述药剂或化合物时，对JARID1B生物学活性的优选至少10％的抑制，更优选至少25％、50％或75％的抑制，且最优选至少90％的抑制。
在本发明中，揭示了抑制JARID1B表达则降低细胞生长。因此，通过筛选抑制JARID1B多肽的生物学活性的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或进一步筛选来评估，以鉴定用于癌症的治疗性药剂或化合物。例如，当结合JARID1B蛋白的化合物抑制癌症的上文所述活性时，可得出结论，此类化合物具有JARID1B特异性治疗效果。
在优选的实施方案中，使用不表达JARID1B多肽的对照细胞。因而，本发明还提供了使用JARID1B多肽或其片段来筛选用于抑制细胞生长的候选物质或用于治疗或预防JARID1B相关癌症的候选物质的方法，包括下列步骤：
a)在测试物质存在下培养表达JARID1B多肽或其功能性片段的细胞和不表达JARID1B多肽或其功能性片段的对照细胞；
b)检测表达所述蛋白的细胞和对照细胞的生物学活性；并
c)选择与对照细胞中及所述测试物质不存在下检出的增殖相比抑制表达所述蛋白的细胞中的生物学活性的测试化合物。
改变JARID1B表达的药剂或化合物的筛选：
在本发明中，通过siRNA减少JARID1B基因表达可引起抑制癌细胞增殖(图7)。因此，本发明提供了筛选抑制JARID1B基因表达的药剂或化合物的方法。抑制JARID1B基因表达的药剂或化合物可望能够抑制癌细胞增殖，并因此对治疗或预防癌症有用。因此，本发明亦提供了筛选抑制癌细胞增殖的药剂或化合物的方法，以及筛选治疗或预防癌症的药剂或化合物的方法。
依照本发明，确认了JARID1B基因的表达在急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌中升高。因此，通过本方法筛选获得的药剂或化合物可适合于治疗这些癌症。更具体地，膀胱癌和肺癌是通过本方法筛选获得的药剂或化合物的合适靶标，因为确认了抑制JARID1B基因表达的化合物抑制那些癌症中的细胞增殖(图7)。
在本发明的语境中，此类筛选可包括例如以下步骤：
a)使测试药剂或化合物与表达JARID1B基因的细胞接触；
b)检测JARID1B基因表达水平；并
c)选择与在测试药剂或化合物不存在下的表达水平相比降低JARID1B基因表达水平的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防JARID1B相关癌症的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于抑制癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防JARID1B相关癌症的候选药剂或化合物的方法。
在本发明的语境中，此类筛选可包括例如以下步骤：
a)使测试药剂或化合物与表达JARID1B基因的细胞接触；
b)检测JARID1B基因表达水平；并
c)将b)的表达水平与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与JARID1B基因表达水平关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物降低JARID1B基因的表达水平时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不降低JARID1B基因表达水平时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
下面将更加详细地描述本发明的方法。
表达JARID1B基因的细胞包括，例如，自癌症建立的细胞系(例如膀胱癌的5637、253J、253J-BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER和UMUC3；SBC5或H2170和LC319，肺癌)和自临床癌组织纯化的细胞，此类细胞可用于上述本发明的筛选。可用本领域技术人员众所周知的方法，例如，RT-PCR、Northern印迹分析、Western印迹分析、免疫染色或流式细胞术分析来估计表达水平。在此定义的“降低表达水平”优选为较之在所述药剂或化合物不存在时的表达水平，使JARID1B基因表达水平降低至少10％，更优选降低至少25％、50％或75％，最优选降低至少95％的水平。本文中的药剂或化合物包括化学化合物、双链分子等等。在前面描述了双链分子的制备。在筛选方法中，降低JARID1B基因表达水平的测试药剂或化合物可选择用作抑制癌细胞增殖的药剂或化合物，及因此预期是治疗或预防癌症的候选药剂或化合物。
在本发明中，揭示了抑制JARID1B表达降低细胞生长。因此，通过筛选抑制JARID1B多肽的生物学活性的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定用于癌症的治疗性药剂或化合物。
另外，JARID1B基因的表达水平可作为E2F1基因或E2F2基因的表达水平来检测，因为在本发明中确认了这些基因的表达通过抑制JARID1B基因表达而受到抑制。E2F1基因和E2F2基因表达水平的测量可通过上述E2F报道物测定法或检测E2F1基因或E2F2基因的转录或翻译产物来测定。
具体地，本筛选方法可包括下列步骤：
(a)使测试药剂或化合物与表达JARID1B基因的细胞接触；
(b)测量E2F1或E2F2基因的表达水平；并
(c)选择与在测试药剂或化合物不存在下的表达水平相比降低E2F1基因或E2F2基因的表达水平的测试药剂或化合物作为候选药剂或化合物。
在优选的实施方案中，本发明的方法可包括下列步骤：
(d)选择对几乎不表达JARID1B的对照细胞没有影响的测试药剂或化合物。
依照本发明，揭示了抑制JARID1B表达降低细胞生长。另外，揭示了E2F1基因和E2F2基因的表达通过抑制JARID1B基因表达而受到抑制。因此，本发明亦提供了筛选用于抑制癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防JARID1B相关癌症的候选药剂或化合物的方法。
在本发明的语境中，此类筛选可包括例如以下步骤：
a)使测试药剂或化合物与表达JARID1B基因的细胞接触；
b)检测E2F1或E2F2基因的表达水平；并
c)将b)的表达水平与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与E2F1或E2F2基因的表达水平关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物降低E2F1或E2F2基因的表达水平时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不降低E2F1或E2F2基因的表达水平时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
上述步骤与“抑制JARID1B生物学活性的药剂或化合物的筛选”中描述的使用促进E2F1基因和E2F2基因表达的活性作为JARID1B多肽的生物学活性的方法相同。然而，在本方法中，聚焦于JARID1B基因的表达水平。当使用E2F报道物测定法来检测JARID1B基因的表达水平时，可在与测试药剂或化合物接触之前或之后将E2F报道物载体导入细胞中。
在本发明中，揭示了抑制JARID1B表达降低细胞生长。另外，揭示了E2F1基因和E2F2基因的表达通过抑制JARID1B基因表达而受到抑制。如此，通过筛选抑制E2F1或E2F2基因表达水平的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定用于癌症的治疗性药剂或化合物。
或者，本发明的所述筛选方法可包括下列步骤：
(a)将测试药剂或化合物与导入了包含JARID1B转录调控区域与在该转录调控区域控制下表达的报道基因的载体的细胞接触；
(b)测量所述报道基因的表达或活性；并
(c)选择与在测试药剂或化合物不存在下的表达或活性水平相比降低所述报道基因表达或活性的测试化合物作为候选药剂或化合物。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防JARID1B相关癌症的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于抑制癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防JARID1B相关癌症的候选药剂或化合物的方法。
依照另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括以下步骤：
a)使测试药剂或化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含JARID1B基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因；
b)检测所述报道基因的表达水平或活性；并
c)将b)的表达水平与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与所述报道基因的表达水平或活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物降低所述报道基因的表达水平或活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不降低所述报道基因的表达水平或活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
合适的报道基因和宿主细胞在本领域是众所周知的。举例而言，报道基因为萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、Laz与beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)，而宿主细胞为COS7、HEK293、HeLa等。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与JARID1B基因转录调控区域连接来制备。本文所述的JARID1B基因转录调控区域是从起始密码子开始至少500bp上游，优选1000bp，更优选5000或10000bp上游的区域。含有所述转录调控区域的核苷酸片段可从基因组文库中分离出来，或可通过PCR扩增。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与这些基因中任一的转录调控区域连接来制备。鉴别转录调控区域的方法，以及其测定法规程都是众所周知的(Molecular Cloning，第三版，第17章，2001，Cold Springs Harbor LaboratoryPress)。例如，JARID1B的转录调节区报告于Catteau et al.Int J Oncol.2004，25：5-16。
用含有所述报道构建体的载体感染宿主细胞，且用本领域众所周知的方法检测报道基因的表达或活性(例如，使用照度计(luminometer)、吸收光谱仪、流式细胞仪等等)。在此定义的“降低表达或活性”优选较之在所述化合物不存在时，报道基因的表达或活性优选地被降低至少10％，更优选地，至少降低25％、50％或75％，最优选地，降低95％。
在本发明中，揭示了抑制JARID1B表达降低细胞生长。因此，通过筛选抑制所述报道基因表达或活性的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定用于癌症的治疗性药剂或化合物。
用于改变E2F1和E2F2表达的方法：
依照本发明，E2F1基因和E2F2基因的表达通过抑制JARID1B基因表达而受到抑制(图9)。它指示E2F1基因和E2F2基因是受JARID1B蛋白影响的候选下游基因。
E2F转录因子是视网膜母细胞瘤(RB)蛋白途径的下游效应器且涉及基础细胞周期控制的多个方面(Botz J.et al.Mol Cell Biol 1996；16：3401-9，DeGregori J.et al.Genes Dev 1995；9：2873-87，Johnson DG et al.Nature1993；365：349-52，Muller H.et al.Biochim Biophys Acta 2000；1470：M1-12)。已在多种控制细胞周期和DNA合成的基因中鉴定出E2F因子的结合位点，包括cdk2和4、细胞周期蛋白A、D和E、DNA聚合酶、核糖核苷酸还原酶和PCNA(Yamasaki L.Results Probl Cell Differ 1998；22：199-227)。重要的是，在广泛的多种肿瘤实体中发现了RB-E2F级联中的突变(Dimova DK et al.Oncogene2005；24：2810-26，Nevins JR.Hum Mol Genet 2001；10：699-703)。虽然这些改变大多影响RB或E2F转录因子的上游调节物，但是越来越多的证据表明E2F家族自身的失调在致癌作用中扮演关键性的角色。事实上，在卵巢癌中，促进增殖的E2F1和尤其是E2F2转录因子与健康对照组织相比过表达(Reimer D.et al.Clin Cancer Res 2007；13：144-51)。另外，这些促进细胞周期的转录因子的失调已被描述为多种肿瘤中的预后指标(Ebihara Y.et al.Dis Esophagus2004；17：150-4，Foster CS et al.Oncogene 2004；23：5871-9，Gorgoulis VG et al.J Pathol 2002；198：142-56，Mega S.et al.Dis Esophagus 2005；18：109-13，Oeggerli M.et al.Oncogene 2004；23：5616-23)。因此，促进增殖的E2F转录因子的过表达可能会有助于显著的肿瘤生长优势，从而促成较差的存活。在本发明中，膀胱肿瘤组织中E2F1和E2F2基因二者的表达水平也比非瘤组织中的表达水平显著更高。E2F/RB途径的失调与人类多种组织中的致癌作用有密切联系，而且JARID1B可通过解除对此途径的管制来促进恶性改变。
因此，本发明还提供了通过调节JARID1B基因表达或JARID1B蛋白活性来改变E2F1基因和E2F2基因的表达水平的方法。本方法可促进新的癌症疗法的开发，因为E2F1和E2F2失调涉及致癌作用。
在本发明的语境中，用于改变E2F1基因和E2F2基因的表达水平的方法包括改变细胞中JARID1B基因的表达水平或JARID1B蛋白的活性的步骤。此类步骤通过对细胞施用调控JARID1B基因表达或JARID1B蛋白活性的化合物来实施。此类化合物可以是针对JARID1B基因表达或JARID1B蛋白的抑制剂或活化剂，优选的是通过上述筛选方法筛选获得的抑制剂。例如，靶向JARID1B基因的反义RNA或双链分子或针对JARID1B蛋白的抗体可用于本方法。当将双链分子用于本方法时，本发明的双链分子是可用的。优选地，此类双链分子包含与SEQ ID NO：21或30对应的靶序列。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于改变E2F1基因或E2F2基因表达的组合物，其包含调控JARID1B基因表达或JARID1B蛋白活性的化合物。此类组合物包含至少一种抑制或促进JARID1B基因表达或JARID1B蛋白活性的化合物。优选地，所述组合物包含抑制JARID1B基因表达的本发明的双链分子或编码它的载体，更优选地，所述双链分子包含与SEQ ID NO：21或30对应的靶序列。
在本发明中，揭示了抑制JARID1B表达则降低细胞生长。另外，揭示了E2F1基因和E2F2基因的表达通过抑制JARID1B基因表达而受到抑制。如此，通过筛选改变E2F1或E2F2基因表达水平的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。这些化合物治疗或预防癌症的潜力可通过第二和/或进一步的筛选来评估以鉴定用于癌症的治疗性药剂或化合物。
本发明的各方面在下述实施例中加以描述，它们并无意对权利要求中描述的本发明范围进行限定。
除非另行定义，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域一般技术人员通常理解的意义相同。下面描述了合适的方法和材料，虽然与在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于实践或测试本发明。
本发明将于下列实施例中进一步加以描述，其并不对权利要求中描述的本发明范围进行限定。
实施例
本发明会在下面的实施例中进一步描述，它们不限制权利要求中描述的发明范围。
实施例1
通用方法
组织样品和RNA制备
收集了123份原发性泌尿上皮癌手术标本(在膀胱切除术时或是在经尿道切除膀胱肿瘤(TUR-Bt)时收集)，并在液氮中快速冷冻。从没有恶性证据的患者中肉眼检查正常的膀胱泌尿上皮的区域收集了23份正常膀胱泌尿上皮组织标本。使用组织进行此项研究得到了剑桥郡地方科研伦理委员会的批准。将总共30张30微米切片匀浆以提取RNA，并切出2张与用于提取RNA的组织相邻的7微米“三明治”切片，染色并由独立的顾问泌尿组织病理学家评估细胞结构和肿瘤阶段。另外，依照炎性细胞浸润的程度将切片分期(低、中和显著)。排除显示显著炎性细胞浸润的样品(Wallard MJ et al.Britishjournal of cancer 2006；94：569-77)。
使用TRI试剂TM(Sigma，Dorset，UK)遵循制造商的方案来提取总RNA。使用RNeasy迷你试剂盒TM(QIAGEN，Crawley，UK)(包括DNA酶步骤)来优化RNA纯度。实施Agilent 2100TM总RNA生物分析。将来自每份样品的1ul重悬的RNA施加于RNA 6000 Nano Lab ChipTM并依照制造商的指令处理。所有芯片和试剂来自Agilent TechnologiesTM(West Lothian，UK)。
逆转录
使用NanoDropTM ND1000分光光度计(Nyxor Biotech，Paris，France)来测定总RNA浓度。依照制造商的指令在20ul反应体系中用2ug随机六聚物(Amersham)和Superscript III逆转录酶(Invitrogen，Paisley，UK)逆转录1ug总RNA。然后用PCR级水将cDNA 1∶100稀释并保存于-20℃。
激光捕捉显微解剖
预期性地(prospectively)遵循上文所述规程收集用于激光捕捉显微解剖的组织。自每个组织切出5个顺序的7um厚的切片并使用HistogeneTM染色溶液(Arcturus，California，USA)遵循制造商的方案染色。然后立即将载玻片转移用PixCell II激光捕捉显微镜TM(Arcturus，CA，USA)进行显微解剖。此技术采用低功率红外激光将热塑性膜融化在感兴趣细胞上方，使细胞附着于该膜。
自每个组织中的基质和上皮/肿瘤隔室显微解剖大约10000个细胞。使用RNeasy Micro试剂盒(QIAGEN，Crawley，UK)提取RNA。对于癌或含有肿瘤显著炎性区域的基质或含有显著炎性细胞浸润的基质的区域，避免以防止污染。
如上所述逆转录总RNA并实施qRT-PCR。鉴于从这样的小样品获得的RNA产量低，未实施NanoDropTM定量，而是使用内源18S CT值修正作为完整起始RNA量的精确度量。对JARID1B基因实施转录物分析。
为了验证显微解剖的精确性，依照制造商的指令(Assays on demand，Applied Biosystems，Warrington，UK)使用波形蛋白和Uroplakin的引物和探针实施qRT-PCT。波形蛋白主要在间充质组织中表达，并被用作基质标志。Uroplakin是泌尿上皮分化的标志，且多达90％的上皮衍生肿瘤中得到保留(Olsburgh J.et al.The Journal of pathology 2003；199：41-9)。
细胞培养
所有细胞系在适宜培养基中以单层培养：Eagle氏最低限度必需培养基(EMEM)用于253J，253J-BV，HT1197，HT1376，J82，SCaBER，UMUC3膀胱癌细胞和SBC5小细胞肺癌细胞；RPMI1640培养基用于5637膀胱癌细胞和A549，H2170和LC319非小细胞肺癌细胞；Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)用于EJ28膀胱癌细胞和RERF-LC-AI非小细胞肺癌细胞；McCoy氏5A培养基用于RT4和T24膀胱癌细胞；Leibovitz氏L-15用于SW780细胞，补充有10％胎牛血清和1％抗生素/抗霉菌溶液(Sigma)。所有细胞于37℃在潮湿空气中维持，其中含有5％ CO2(253J，253J-BV，HT1197，HT1376，J82，SCaBER，UMUC3，SBC5，5637，A549 H2170，LC319，EJ28，RERF-LC-AI，RT4和T24)或无CO2(SW780)。依照制造商的方案用FuGENE6(ROCHE，Basel，Switzerland)转染细胞。
使用cDNA微阵列测定癌症中的表达谱
本发明人用自(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)的UniGene数据库选择的36,864种cDNA或ESR建立了全基因组cDNA微阵列。此微阵列系统基本上如先前所述构建(Kikuchi T.et al.Oncogene 2003；22：2192-205，KitaharaO.et al.Cancer Res 2001；61：3544-9，Nakamura T.et al.Oncogene 2004；23：2385-400)。简言之，使用自各种人类器官分离的poly(A)+RNA作为模板通过RT-PCR扩增cDNA；扩增子的长度范围为200至1,100bp，没有重复或poly(A)序列。准备许多类型的癌症和相应的非瘤组织的8um切片，如先前所述(Kitahara O.et al.Cancer Res 2001；61：3544-9)。使用EZ切割系统(SL MicrotestGmbH，Germany)依照制造商的方案选择性收集了总共30,000-40,000个癌细胞或非癌性细胞。总RNA的提取、基于T7的扩增、和探针标记如先前所述实施(Kitahara O.et al.Cancer Res 2001；61：3544-9)。然后分别用Cy3-dCTP或Cy5-dCTP标记来自癌性和非癌性组织的经两次扩增的RNA(aRNA)的2.5-ug定量等分试样。
定量实时PCR
如上所述，在剑桥Addenbrooke医院准备了123个膀胱癌组织和23个正常膀胱组织。为了定量RT-PCR反应，用于人类GAPDH(持家基因)、SDH(持家基因)、JARID1B、E2F1和E2F2的特异性引物设计如下：
5′GCAAATTCCATGGCACCGTC 3′(SEQ ID NO：3)用于GAPDH-正向；
5′TCGCCCCACTTGATTTTGG 3′(SEQ ID NO：4)用于GAPDH-反向；
5′TGGGAACAAGAGGGCATCTG 3′(SEQ ID NO：5)用于SDH-正向；
5′CCACCACTGCATCAAATTCATG3′(SEQ ID NO：6)用于SDH-反向；
5′ATTGCCTCAAAGGAATTTGGCAGTG3′(SEQ ID NO：7)用于JARID1B-正向-1；
5′CATCACTGGCATGTTGTTCAAATTC 3′(SEQ ID NO：8)用于JARID1B-反向-1；
5′TGTCACAGTGGAATATGGAGCTGAC 3′(SEQ ID NO：9)用于JARID1B-正向-2；和
5′GCCACTATCAAGATACTCCTCTTCC 3′(SEQ ID NO：10)用于JARID1B-反向-2；
5′GCTGGACCACCTGATGAATATC 3′(SEQ ID NO：11)用于E2F1-正向；
5′TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG 3′(SEQ ID NO：12)用于E2F1-反向；
5′TGGCAACTTTAAGGAGCAGACAG 3′(SEQ ID NO：13)用于E2F2-正向；
5′GGGCACAGGTAGACTTCGATGG 3′(SEQ ID NO：14)用于E2F2-反向。
使用ABI prism 7700序列检测系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)遵循制造商的方案来实施PCR反应。应用不含UNG的50％ SYBR GREEN通用PCR主预混物(master mix)(Applied Biosystems，Warrington，UK)、正向和反向引物各50nM和2ul逆转录cDNA。扩增条件为首先5min 95℃，然后45个循环，每个的组成为10sec 95℃、1min 55℃和10sec 72℃。然后，将反应体系95℃加热15sec、65℃加热1min以绘制解链曲线，并冷却至50℃保持10sec。靶基因扩增的反应条件如上所述，而且在每个反应中使用相当于5ng逆转录RNA的量。将mRNA水平对GAPDH和SDH表达进行标准化。
免疫细胞化学
将A549(非小细胞肺癌)或SBC5(小细胞肺癌)细胞用含有4％低聚甲醛的PBS(-)固定20分钟，并用含有0.1％ Triton X-100的PBS(-)于室温透化2分钟。随后，将细胞用含有3％牛血清白蛋白的PBS(-)于室温覆盖1小时以封闭非特异性杂交，然后与以1∶100比稀释的小鼠抗JARID1B抗体(1G10，Abnova)一起温育。用PBS(-)清洗后，用1∶1000稀释的缀合有Alexa594的抗小鼠二抗(Molecular Probe)对细胞染色。用4′，6′-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)对核复染色。在TCS SP2 AOBS显微镜(Leica)下获得荧光图像。
免疫组织化学染色
用VECTASTAINTM ABC试剂盒(VECTOR LABORATORIES，CA，USA)对人膀胱和肺癌切片染色。简言之，通过0.3％ H2O2/甲醇处理来抑制经二甲苯去石蜡和脱水的切片的内源过氧化物酶活性。通过将切片与3％ BSA一起在增湿室中于环境温度温育30分钟来封闭非特异性结合，接着与1∶100稀释的小鼠单克隆抗JARID1B(克隆1G10，Abnova)抗体一起于4℃温育过夜。将切片用PBS(-)清洗两次，与5ug/ml山羊抗小鼠生物素化IgG一起在含有1％BSA的PBS(-)中于环境温度温育30分钟，然后与ABC试剂一起温育30分钟。用3，3′-二氨基联苯胺来显现特异性免疫染色。用从酒精至二甲苯的梯度清洗使载玻片脱水并用盖玻片封固。使用苏木精进行核复染色。
Western印迹
自RIPA样缓冲液中的细胞制备总蛋白提取物。将总蛋白(50ug)转移至硝酸纤维素膜。用抗JARID1B(克隆1G10，Abnova或HPA027179，AtlasAntibodies AB)、抗E2F1抗体(KH-95，Santa Cruz Biotechnology)和抗E2F2抗体(L-20，Santa Cruz Biotechnology)探查膜。使用抗肌动蛋白(I-19，Santa CruzBiotechnology)作为加载对照。
siRNA转染
靶向人JARID1B转录物的siRNA寡核苷酸双链体购自SIGMA Genosys。使用siEGFP、siFFLuc和si阴性对照(siNC)(它是三种不同寡核苷酸双链体的混合物)作为对照siRNA。siRNA序列显示如下。
5′GCAGCACGACUUCUUCAAGTT 3′(SEQ ID NO：15)用于siEGFP有义；
5′CUUGAAGAAGUCGUGCUGCTT 3′(SEQ ID NO：16)用于siEGFP反义；
5′GUGCGCUGCUGGUGCCAACTT 3′(SEQ ID NO：17)用于siFFLuc有义；
5′GUUGGCACCAGCAGCGCACTT 3′(SEQ ID NO：18)用于siFFLuc反义；
5′AUCCGCGCGAUAGUACGUA 3′(SEQ ID NO：22)用于si阴性对照靶物#1有义；
5′UACGUACUAUCGCGCGGAU 3′(SEQ ID NO：23)用于si阴性对照靶物#1反义；
5′UUACGCGUAGCGUAAUACG 3′(SEQ ID NO：24)用于si阴性对照靶物#2有义；
5′CGUAUUACGCUACGCGUAA 3′(SEQ ID NO：25)用于si阴性对照靶物#2反义；
5′UAUUCGCGCGUAUAGCGGU 3′(SEQ ID NO：26)用于si阴性对照靶物#3有义；
5′ACCGCUAUACGCGCGAAUA 3′(SEQ ID NO：27)用于si阴性对照靶物#3反义；
5′CAGUGAAUGAGCUCCGGCATT 3′(SEQ ID NO：19)用于JARID1B#1有义；
5′UGCCGGAGCUCAUUCACUGTT 3′(SEQ ID NO：20)用于JARID1B#1反义；
5′GGAAUAUGGAGCUGACAUUTT 3′(SEQ ID NO：28)用于JARID1B#2有义；和
5′AAUGUCAGCUCCAUAUUCCTT 3′(SEQ ID NO：29)用于JARID1B#2反义。
用lipofectamine2000(Invitrogen)将siRNA双链体(100nM终浓度)转染入膀胱和肺癌细胞系达72小时，并使用细胞计数试剂盒8(DOJINDOLaboratories)检查细胞生存力。
流式细胞术测定法(FACS)
为了检查JARID1B表达对细胞周期行进的影响，用siJARID1B或对照siRNA(siEGFP和siFFLuc)处理SBC5细胞，并在CO2温箱中于37℃培养72小时。通过胰蛋白酶消化来收集1X105个细胞，并遵循制造商的指令(CaymanChemical)用碘化丙锭染色。通过FACScan(BECKMAN COULTER)及MultiCycle for Windows软件(BECKMAN COULTER)对细胞分析详细的细胞周期状态。对于至少20,000个未设门的细胞，测定处于细胞周期G0/G1、S和G2/M期，及任何sub-G1群的细胞百分比。
微阵列杂交和统计分析以查明下游基因分类
标记纯化的总RNA并杂交到Affymetrix GeneChip U133 Plus 2.0寡核苷酸阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)上，依照制造商的指令进行。
在Affymetrix GCOS软件(1.1.1版)中利用通过将每个阵列的全局平衡均值信号强度值调整至500而确定的缩放因子对杂交信号进行缩放，并输入至GeneSpring 6.2版(Silicon Genetics)。然后将信号强度集中至每个芯片的第50百分位，并且对于每个个别的基因，首先集中至每个特定子集的中值强度(以使可能的技术偏倚最小化)，然后集中至整个样品集的中值强度。对任何重复杂交的强度取平均值，之后进行进一步分析。只有被GCOS软件标记为在所有样品中“存在”(present)或“微量”(marginal)的基因用于进一步分析。使用Wilcoxon-Mann-Whitney非参数检验来鉴定差异表达基因(P＜0.05)。只要适用的话，就应用Benjamini-Hochberg假发现率倍增检验修正。对每项比较进行分级聚类分析以评估每个鉴定的基因集的样品间的相关性。
或者，通过RMA和Quantile标准化方法(使用R和Bioconductor)对探针信号强度进行标准化。接着，估计实验间变异所致的信号强度波动。每个实验重复进行(1和2)，并计算中点为log2((强度1+强度2)/2)＝5，7，9，11，13，和15的一组强度范围中的每个强度范围的log2(强度2/强度1)的标准偏差(stdev)。以公式stdev(log2(强度2/强度1))＝a*(log2((强度1+强度2)/2))+b将强度变差建模，并使用最小二乘法估计参数a和b。使用这些数值，计算出强度波动的标准偏差。然后在siJARID1B(实验)和对照(EGFP/FFLuc)(对照)之间比较每种探针的信号强度，并通过计算z分数：log2(实验强度/对照强度)/(a*(log2((实验强度+对照强度)/2))+b)来检验上/下调。将重复集的所得P值相乘来计算每种探针的最终P值。将这些程序应用于每项比较：EGFP对siJARID1B，FFLuc对siJARID1B，及EGFP对FFLuc。确定了上/下调基因集是那些同时满足下列标准的基因：(1)EGFP对siJARID1B的Benjamini-Hochberg假发现率(FDR)＜＝0.05，(2)FFLuc对siJARID1B的FDR＜＝0.05且调节方向与(1)相同，以及(3)EGFP对FFLuc具有与(1)和(2)相反的方向或EGFP对FFLuc的P＞0.05。最后，使用超几何分布检验来实施途径分析，计算上/下调基因集合和每个GO范畴之间交叠的概率，与随机采样的另一基因列表比较。将该检验应用于鉴定出的上/下调基因以检验它们是否在基因本体论数据库定义的“生物学过程”(857个范畴)的每个范畴中显著富集(FDR＜＝0.05)。
E2F报道物测定法
用CignalTM E2F报道物测定试剂盒(SuperArray Bioscience Corporation)来分析E2F的转录活性。用siRNA(siJARID1B、siEGFP和siFFLuc)处理A549和SBC5细胞并培养24小时。将经siRNA处理的细胞用在最小(m)CMV启动子和E2F转录应答元件(TRE)串联重复控制下编码萤火虫萤光素酶报道基因的E2F响应性萤光素酶构建体、阴性对照、或阳性对照转染。转染24小时后，使用双重萤光素酶报道物测定系统(Promega)实施双重萤光素酶测定，并使用海肾(Renilla)报道物进行内部标准化，将启动子活性值表述为任意单位。实验一式三份进行，并使用Student氏t检验作为统计分析。
实施例2
JARID1B表达在临床癌症组织中上调
首先，在临床膀胱癌样品的一个小子集中检查五种组蛋白脱甲基酶基因，即JARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1D和JARID2的表达水平，并且只对JARID1B基因发现了正常细胞与癌细胞之间表达水平的显著差异(数据未显示)。为了验证JmjC组蛋白脱甲基酶的表达水平在恶性肿瘤中如何变化，在临床膀胱癌样品的一个小子集中使用定量实时PCR检查了五种组蛋白脱甲基酶基因，即JARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1D和JARID2的表达水平，并且只对JARID1B基因发现发现了正常细胞与癌细胞之间表达水平的显著差异(数据未显示)。因此，分析了123个膀胱癌样品和23个正常对照样品(英国人)(图1A和B)，而且观察到肿瘤细胞中与正常组织相比显著的JARID1B过表达(P＜0.0001，Mann-Whitney U检验，图1B，表1)。
[表1]
临床病理特征和JARID1B表达
Figure BDA0000101583500000701
Figure BDA0000101583500000711
Figure BDA0000101583500000721
Figure BDA0000101583500000731
在不同阶段和级别之间没有观察到表达水平的显著差异(图1A和表1、2)。这提示JARID1B表达在膀胱癌发生早期显著上调，而且在该疾病的晚期保持高位。对肿瘤依照转移状态、性别、吸烟史和复发状态进行次分类，没有鉴定出JARID1B表达水平的显著差异(表2)。
[表2]
临床膀胱组织中JARID1B表达水平的统计分析
Figure BDA0000101583500000732
然后，通过cDNA微阵列来分析源自日本膀胱癌受试者的若干临床样品中的JARID1B表达样式(图1C、1D、表3)，并确认了它显著过表达(P＜0.0001，Mann-Whitney U检验)。
[表3]
癌症组织中JARID1B的基因表达谱.这些基因的表达水平是通过cDNA微阵列分析的*.
Figure BDA0000101583500000741
*我们比较了源自相同患者的肿瘤组织与相应非瘤组织之间JARID1B的信号强度.
为了评估JARID1B在膀胱组织中的蛋白质表达水平，使用抗JARID1B特异性抗体实施了免疫组织化学分析(图1E)。主要在恶性细胞的核中观察到强JARID1B染色，但是在非瘤组织中没有观察到显著染色。为了进一步验证此结果，使用28张膀胱组织切片进行了组织微阵列实验(图2和表4)，而且在6个病例中观察到强染色，且在13个病例中观察到中等或弱染色。此外，没有检测到JARID1B蛋白表达水平与临床病理特征之间的显著相关性，这与实时PCR结果是相符的。
[表4]
组织微阵列上膀胱组织的临床病理特征
  病例号   性别   年龄   组织学   等级   TNM
  1   男性   71   鳞状细胞癌   1   T1N0M0
  2   男性   60   鳞状细胞癌   1   T2N0M0
  3   男性   76   腺癌   2   T2N0M0
  4   男性   50   腺癌   2   T2N0M0
5 男性 68   腺癌   3   T2N0M0
  6   女性   74   腺癌   3   T2N0M0
  7   男性   27   移行细胞癌   1   TisN0M0
  8   男性   50   移行细胞癌   1   T1N0M0
  9   女性   49   移行细胞癌   1   T1N0M0
  10   男性   67   移行细胞癌   1   T1N0M0
  11   女性   51   移行细胞癌   1   T1N0M0
  12   男性   57   移行细胞癌   1   T1N0M0
  13   男性   47   移行细胞癌   2   T2N0M0
  14   男性   54   移行细胞癌   2   T2N0M0
  15   男性   45   移行细胞癌   2   T1N0M0
  16   男性   74   移行细胞癌   2   T1N0M0
  17   男性   51   移行细胞癌   2   T1N0M0
  18   男性   80   移行细胞癌   2   T2N0M0
  19   女性   53   移行细胞癌   2   T1N0M0
  20   男性   37   移行细胞癌   2   T2N0M0
21 男性 55   移行细胞癌   2   T2N2MX
  22   男性   52   移行细胞癌   2   T1N0M0
  23   男性   78   移行细胞癌   3   T1N0M0
  24   男性   64   移行细胞癌   3   T3N2M1
  25   男性   70   移行细胞癌   3   T2N0M0
  26   男性   61   移行细胞癌   3   T2N0M0
  27   男性   61   移行细胞癌   3   T2N0M0
  28   男性   30   肉瘤   -   T2N0M0
除了膀胱组织之外，还检查了肺组织中的JARID1B表达水平(图3、4)。cDNA微阵列实验显示JARID1B表达在肺肿瘤组织中与相应非瘤组织相比也高度升高(图3A-C)。重要的是，在非小细胞肺癌和小细胞肺癌二者中观察到升高的JARID1B表达，指示JARID1B过表达广泛地参与肺癌发生。然后，通过免疫组织化学来检查肺组织中的JARID1B蛋白表达水平(图3D)。在癌症组织中观察到强JARID1B染色，而且在非瘤组织中没有观察到显著染色。为了评估多种类型的肺肿瘤组织中的JARID1B蛋白表达水平，进行了组织微阵列实验(图4和表5)。在检查的62张肿瘤组织切片中，在54个病例中观察到强染色，在9个病例中观察到中等或弱染色。
[表5]
组织微阵列上肺组织的临床病理特征
Figure BDA0000101583500000761
另外，检查了源自自日本人受试者的大量临床样品的微阵列表达分析数据，发现JARID1B表达也在急性髓细胞性白血病、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌和肾细胞癌(RCC)、前列腺癌中与相应非瘤组织相比显著上调，指示它可能涉及多种类型的人类癌症(图5和表6)。
有趣的是，使用抗JARID1B抗体进行的免疫细胞化学染色指示它的亚细胞定位在使用阿非迪霉素使细胞同步化后改变。在G0/G1期和早S期，细胞周期释放后4小时，该蛋白主要位于核中(图6上部)。稍后，在S和G2/M期，细胞周期释放后12小时，该蛋白位于核和胞质二者(图6下部)。因此，JARID1B的亚细胞定位相应于细胞周期状态而变化，而且此酶可能潜在地具有胞质及核中的生理作用。
[表6]
通过cDNA微阵列分析的癌组织中的JARID1B表达*
Figure BDA0000101583500000791
*我们比较了源自相同患者的肿瘤组织与相应非瘤组织之间JARID1B的信号强度。
实施例3
JARID1B影响癌细胞的生长调节
为了调查JARID1B在人类致癌作用中的作用，制备了用于特异性抑制JARID1B表达的siRNA寡核苷酸双链体(siJARID1B#1，序列上文所述)以及两种阴性对照(siEGFP和siFFLuc)。测试了17种未转染膀胱或肺癌细胞系中的JARID1B表达(图7A)。然后，将siRNA转染入中度表达JARID1B的SW780和A549细胞。在SW780和A549二者中，含有siJARID1B#1的细胞中的JARID1B表达与对照相比均受到显著抑制(图7B)。在3种膀胱癌细胞系(RT4、SW780、UMUC3)、2种非小细胞肺癌细胞系(LC319、RERF-LC-AI)和1种小细胞肺癌细胞系(SBC5)中在用siRNA处理后检查了细胞生长测定。在所有情况中，癌细胞的生长在用siJARID1B#1处理后受到显著抑制(图7C)。
为了评估癌细胞中由JARID1B敲低所诱导的生长抑制的机制，使用流式细胞术分析用siRNA处理后癌细胞的细胞周期状态(图7D)。处于sub-G1期的细胞数在用siJARID1B#1处理后显著增多。这提示响应JARID1B抑制而发生的凋亡诱导。对经siRNA转染的细胞的详细分析显示了处于sub-G1期的癌细胞的比例在经siJARID1B#1处理的细胞中比经对照siRNA处理的癌细胞显著更高(分别为P＝0.0055[siEGFP，siJARID1B#1]和P＝0.0042[siFFLuc，siJARID1B#1]，图7E)。另外，经siJARID1B处理的细胞中处于较晚S和G2/M期的比例比经对照siRNA处理的细胞显著更低。因此，JARID1B在癌细胞的增殖中可能发挥至关重要的作用，而且通过敲低JARID1B可诱导凋亡。
另外，使用针对JARID1B的两种独立的siRNA(siJARID1B#1和#2)和两种对照siRNA(siEGFP和siNC)实施了敲低实验。将这些siRNA转染入高度表达JARID1B的SW780、A549和SBC5细胞(图7A)。经靶向JARID1B的两种独立siRNA转染的细胞中JARID1B表达水平与经对照siRNA转染的细胞相比受到显著抑制(图7F)。使用相同的siRNA实施了细胞生长测定，在2种膀胱癌细胞系(SW780和RT4)和3种肺癌细胞系(A549、LC319和SBC5)中观察到靶向JARID1B的2种独立的siRNA所致的显著的生长抑制，而在使用对照siRNA时没有观察到影响(图7G)。
实施例4
通过微阵列表达分析来鉴定下游基因
实施了微阵列表达分析来鉴定JARID1B的下游基因和由JARID1B诱导的信号途径。用siJARID1B#1和siJARID1B#2处理后24小时自SW780和A549细胞分离总RNA，并使用Affymetrix的HG-U133 Plus 2.0阵列分析这些细胞的表达谱，与那些经对照siRNA(siEGFP和siFFLuc)处理的比较。结果，鉴定出一个显著上/下调的基因集合。另外，参照基因本体论数据库(表7)实施了信号途径分析，并发现JARID1B可与细胞周期调节的过程有密切联系。有趣的是，通过用siJARID1B处理，观察到E2F1和E2F2的显著下调(二者均P＜0.0001)(图8)。因此，分析了JARID1B表达与E2F/RB途径(细胞周期的一种关键调节子途径)之间的功能关系。
[表7]
基于Affymetrix微阵列数据的基因本体论途径分析
Figure BDA0000101583500000811
通过定量实时PCR在经siRNA处理的三种不同癌细胞系即SW780、SBC5和A549中观察到E2F1和E2F2表达的下调(图9A、9B)。此外，在过表达JARID1B的临床肿瘤组织中发现比非瘤组织更高的E2F1和E2F2二者的表达水平(分别为P＝0.0009和P＝0.0002)。该数据指示E2F1和E2F2二者可能在肿瘤组织中与JARID1B的升高表达相关联地高度表达(Spearman氏秩相关系数：r＝0.666(E2F1)和r＝0.756(E2F2))(图9C)。
为了更详细地验证JARID1B对E2F的转录调节，使用E2F响应性萤光素酶构建物实施了萤光素酶报道物测定法(图9D)。用对照(siEGFP)或siJARID1B处理后将构建物转化入癌细胞系。在A549和SBC5细胞二者中E2F驱动的转录活性在用siJARID1B#1处理后受到显著抑制。另外，在A549和SBC5细胞中在用两种独立的靶向JARID1B的siRNA处理后在蛋白质水平确认了E2F1和E2F2表达二者的抑制(图9E)。这些结果揭示了受E2F转录因子调节的转录活性在敲低JARID1B后可能受到抑制，而且这种对该途径的阻断可能是对我们观察到的细胞周期改变的原因。
这些结果指示JARID1B在人类致癌作用中可能作为细胞周期调节的关键因子之一经由E2F/RB途径运作。
讨论
染色质的组蛋白修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化和遍在蛋白化，藉由对染色质结构的调节在产生转录激活和抑制样式中发挥至关重要的作用。JARID1B属于赖氨酸脱甲基酶家族，其特异性消除组蛋白H3赖氨酸4的甲基(Yamane K et al.，Mol Cell 2007，25：801-812)。在本发明中，使用定量RT-PCR、免疫组织化学、和基于微阵列的基因表达谱，证明了膀胱癌和肺癌以及多种其它癌症类型中JARID1B的显著上调。
通过免疫组织化学没有在生命器官中观察到显著的JARID1B染色(图1E、3D、10)。因此，在任何肿瘤中与相应非瘤组织相比JARID1B的异常过表达使之成为癌症检测的理想分子靶及治疗靶。经典HDAC的合成抑制剂早已广泛用作发育遗传学研究的工具，而且许多已经在体外在癌细胞中显示生长抑制效果且已经用于早期临床试验(Jones PA et al.Cell 2007，128：683-692；Paris M et al.J Med Chem 2008，51：1505-1529)。另外，最近已报告了一些组蛋白甲基转移酶和脱甲基酶抑制剂(Greiner D et al.Nat Chem Biol 2005，1：143-145；Huang Y et al.Proc Natl Acad Sci U S A 2007，104：8023-8028；Kubicek S et al.Mol Cell 2007，25：473-481)。
证明了E2F1和E2F2是受JARID1B调节的下游调控物。与siRNA处理相结合的萤光素酶报道物测定法产生了支持JARID1B与E2F元件之间的分子相互作用的间接证据。E2F转录因子是视网膜母细胞瘤(RB)蛋白途径的下游效应器，且涉及基础细胞周期控制的多个方面(Botz J et al.Mol Cell Biol 1996，16：3401-3409；DeGregori J et al.Genes Dev 1995，9：2873-2887；Johnson DG etal：Nature 1993，365：349-352；Muller H et al.Biochim Biophys Acta 2000，1470：M1-12)。已在多种控制细胞周期和DNA合成的基因中鉴定出E2F因子的结合位点，包括cdk2和4、细胞周期蛋白A、D和E、DNA聚合酶、核糖核苷酸还原酶、UHRF1和PCNA(Unoki M et al.Oncogene 2004，23：7601-7610；Yamasaki L.Results Probl Cell Differ 1998，22：199-227)。重要的是，在广泛的肿瘤类型中发现了RB-E2F级联中的突变(Dimova DK et al.Oncogene 2005，24：2810-2826；Nevins JR.Hum Mol Genet 2001，10：699-703)。这些改变大多影响RB或E2F转录因子的上游调节物，而且越来越多的证据表明E2F家族自身的失调在致癌作用中扮演关键性的角色。事实上，在卵巢癌中，促进增殖的E2F1和E2F2转录因子与健康对照组织相比过表达(Reimer D et al.ClinCancer Res 2007，13：144-151)。已经有人提议将它们的失调作为多种肿瘤的预后指标(Ebihara Y et al.Dis Esophagus 2004，17：150-154；Foster CS et al.Oncogene 2004，23：5871-5879；Gorgoulis VG et al.J Pathol 2002，198：142-156；Mega S et al.Dis Esophagus 2005，18：109-113；Oeggerli M et al.Oncogene 2004，23：5616-5623)。有人争辩称促进增殖的E2F转录因子的过表达促成肿瘤(尤其那些具有较差预后的)的显著生长优势。在本研究中，我们证明了膀胱肿瘤组织中比非瘤组织显著更高的E2F1和E2F2二者的表达，这大概是由于JARID1B的异常转录调节所致。基于基因本体论的详细途径分析揭示了JARID1B涉及多个细胞周期过程(表7)。
根据微阵列数据，多种其它基因可能被JARID1B上调。JARID1B的主要功能之一被认为是经由其脱甲基酶活性的转录抑制，因为H3K4的甲基化是常染色质的一个标志(Yamane K et al.Mol Cell 2007，25：801-812)。根据所述的微阵列数据，可提出JARID1B激活其下游基因转录的三种可能机制。(i)转录经由间接受JARID1B调节的转录因子而间接地被激活；(ii)JARID1B经由蛋白质-蛋白质相互作用反式激活下游候选物的表达。例如，JARID1B与雄激素受体联合并增强其转录活性(Xiang Y et al.Proc Natl Acad Sci U S A 2007，104：19226-19231)。JARID1B可能既上调又下调基因表达，这取决于它的结合配偶。(iii)JARID1B使未知底物脱甲基。类似地，LSD1首先被报告为H3K4特异性脱甲基酶(Shi Y et al.Cell 2004，119：941-953)，后来发现它使组蛋白H3赖氨酸9和p53脱甲基(Huang J et al.Nature 2007，449：105-108；Metzger E et al.Nature 2005，437：436-439)。有趣的是，发现JARID1B在一些细胞周期阶段中定位于胞质中(图11、12)，这就产生了它可能使胞质中的未知底物脱甲基，然后影响细胞周期行进的可能性。使用数种癌细胞系获得的结果强烈支持JARID1B涉及癌细胞的生长。
工业实用性
如本文所述，特异性地靶向JARID1B基因的双链分子抑制细胞生长。因此，所述新型双链分子作为抗癌药物是有用的。举例而言，阻断JARID1B蛋白和/或阻止其活性的药剂具有抗癌药，特别是治疗急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌的抗癌药，更加特别是治疗膀胱癌和肺癌的治疗效用。
JARID1B的表达在癌症中较之正常器官显著提升。相应的，JARID1B基因或蛋白可便利地用作癌症的标志。
进一步，JARID1B多肽是对开发抗癌医药有用的靶标。举例而言，与JARID1B多肽结合或阻断JARID1B基因表达或阻止其活性的药剂可具有抗癌剂，特别是用于治疗急性髓细胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓细胞性白血病、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和肾细胞癌的抗癌剂的治疗效用。
本文引用所有的出版物、数据库、序列、专利与专利申请以引用的方式包含于本文中。
尽管已详细并参照其特定实施例描述了本发明，对于本领域技术人员显然在其中可进行多种变化与修饰而不背离本发明的精神与范围，其限界由所附的权利要求界定。
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Claims (28)

1.一种用于检测或诊断癌症的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)通过选自下组的任一方法测定源自受试者的生物样品中jumonji，富含AT的相互作用域1B(JARID1B)基因的表达水平：
(i)检测JARID1B基因的mRNA；
(ii)检测JARID1B蛋白；和
(iii)检测JARID1B蛋白的生物学活性；并
(b)将步骤(a)中测得的表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高与癌症的存在关联起来。
2.权利要求1的方法，其中所述癌症选自下组：急性髓细胞性白血病，膀胱癌，慢性髓细胞性白血病，宫颈癌，肺癌和肾细胞癌。
3.权利要求1的方法，其中所述源自受试者的生物样品包括活检样品、痰、血液、胸腔积液或尿液。
4.一种用于诊断癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包括选自下组的试剂：
(a)用于检测JARID1B基因的mRNA的试剂；
(b)用于检测JARID1B蛋白的试剂；和
(c)用于检测JARID1B蛋白的生物学活性的试剂。
5.权利要求4的试剂盒，其中所述癌症选自下组：急性髓细胞性白血病，膀胱癌，慢性髓细胞性白血病，宫颈癌，肺癌或肾细胞癌。
6.一种分离的双链分子，其中所述分子在导入表达JARID1B基因的细胞中时抑制所述基因表达，其中所述分子包含有义链和与其互补的反义链，其中所述链彼此杂交以形成双链分子，其中所述有义链包含与SEQ ID NO：21或30对应的核酸序列，其中所述分子具有约19个-约25个核苷酸的长度。
7.权利要求6的双链分子，其在有义链和/或反义链3′端任一或二者处具有由2至10个核苷酸组成的一个或两个3′突出端。
8.权利要求6的双链分子，其由单一多核苷酸组成，所述单一多核苷酸包含通过间插单链核酸序列连接的有义链和反义链。
9.权利要求8的双链分子，其具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中[A]为有义链，[B]为由3至23个核苷酸组成的间插单链核酸序列，而[A′]为包含与[A]互补的序列的反义链。
10.编码权利要求6至9中任一项的双链分子的载体。
11.包含包括有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸的组合中的任一项的载体，其中所述有义链核酸包含SEQ ID NO：21或30的核苷酸序列，而所述反义链核酸由与有义链互补的序列组成，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中所述载体在导入表达JARID1B基因的细胞中时抑制细胞增殖。
12.一种用于治疗或预防癌症的方法，其包括给受试者施用分离的双链分子或编码该双链分子的载体的步骤，其中所述分子在导入表达JARID1B基因的细胞中时抑制所述基因表达，其中所述分子包含有义链和与其互补的反义链，其中所述链彼此杂交以形成双链分子，其中所述有义链包含与JARID1B基因或其片段的核酸序列对应的核酸序列，且其中所述分子具有约19个-约25个核苷酸的长度。
13.权利要求12的方法，其中所述双链分子是权利要求6-9中任一项的双链分子。
14.权利要求12或13的方法，其中所述癌症选自下组：急性髓细胞性白血病，膀胱癌，乳腺癌，慢性髓细胞性白血病，宫颈癌，肺癌，前列腺癌和肾细胞癌。
15.一种用于治疗或预防癌症的组合物，其包含分离的双链分子或编码该双链分子的载体，其中所述分子在导入表达JARID1B基因的细胞中时抑制所述基因表达，其中所述分子包含有义链和与其互补的反义链，其中所述链彼此杂交以形成双链分子，其中所述有义链包含与JARID1B基因或其片段的核酸序列对应的核酸序列，且其中所述分子具有约19个-约25个核苷酸的长度。
16.权利要求15的组合物，其中所述双链分子是权利要求6-9中任一项的双链分子。
17.权利要求15或16的组合物，其中所述癌症选自下组：急性髓细胞性白血病，膀胱癌，乳腺癌，慢性髓细胞性白血病，宫颈癌，肺癌，前列腺癌或肾细胞癌。
18.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选药剂的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使测试药剂与JARID1B多肽接触；
(b)检测所述多肽与测试药剂之间的结合活性；并
(c)选择结合所述多肽的测试药剂作为候选药剂。
19.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选药剂的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使测试药剂与JARID1B多肽接触；
(b)检测所述多肽的生物学活性；并
(c)选择与在测试药剂不存在下检出的所述多肽的生物学活性相比遏制所述生物学活性的测试药剂作为候选药剂。
20.权利要求19的方法，其中所述生物学活性选自下组：细胞增殖活性，抗凋亡活性，促进E2F1基因或E2F2基因表达的活性，和脱甲基化活性。
21.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选药剂的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在测试药剂存在下使JARID1B多肽与要脱甲基化的底物在适合于该底物脱甲基化的条件下接触；
(b)检测所述底物的甲基化水平；并
(c)选择与在测试药剂不存在时检出的所述底物的甲基化水平相比提高所述甲基化水平的测试药剂作为候选药剂。
22.权利要求21的方法，其中所述底物是甲基化的组蛋白H3。
23.权利要求21的方法，其中在组蛋白H3的赖氨酸4处检测所述甲基化水平。
24.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选药剂的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使测试药剂与表达JARID1B基因的细胞接触；
(b)检测所述细胞中组蛋白H3的甲基化水平；并
(c)选择与在测试药剂不存在时检出的组蛋白H3甲基化水平相比提高所述甲基化水平的测试药剂作为候选药剂。
25.权利要求24的方法，其中在组蛋白H3的赖氨酸4处检测所述甲基化水平。
26.一种筛选用于治疗或预防癌症的候选药剂的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使测试药剂与表达JARID1B基因的细胞接触；
(b)检测JARID1B基因的表达水平；并
(c)选择与在测试药剂不存在时检出的JARID1B基因表达水平相比降低所述表达水平的测试药剂作为候选药剂。
27.一种筛选用于治疗或预防癌症的候选药剂的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使测试药剂与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含JARID1B的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因；
(b)测量所述报道基因的表达水平或活性；并
(c)选择与所述测试药剂不存在时的表达或活性水平相比降低所述报道基因的表达或活性水平的测试药剂作为候选药剂。
28.权利要求18-27任一项的方法，其中所述癌症选自下组：急性髓细胞性白血病，膀胱癌，乳腺癌，慢性髓细胞性白血病，宫颈癌，肺癌，前列腺癌或肾细胞癌。
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