JP2012518387A - がんの治療および診断の標的遺伝子としてのjarid1b - Google Patents
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Abstract
本発明は、がんにおいてJARID1B遺伝子が果たす役割に関連し、JARID1B遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含む組成物を投与することによってがんを治療するための方法を特徴とする。本発明はまた、JARID1Bの発現を検出することによってがんを診断するための方法も特徴とする。そのために、JARID1Bはがんに対する血清学的バイオマーカーとして役立つ。また、がん細胞におけるJARID1Bの発現またはJARID1Bの発現に起因する細胞増殖を指針として用いて、がんを治療もしくは予防するため、またはがん細胞増殖を阻害するための候補剤を同定する方法も開示する。
Description
優先権
本出願は、2009年2月23日に出願された米国特許仮出願第61/208,432号の恩典を主張し、その全内容が、参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2009年2月23日に出願された米国特許仮出願第61/208,432号の恩典を主張し、その全内容が、参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本発明は生物科学の分野に関し、より具体的には、がん研究、がん診断およびがん治療法の分野に関する。特に、本発明は、がんを検出および診断するための方法、ならびにがんを治療および予防するための方法に関する。さらに本発明は、がんの治療および/または予防のための候補化合物をスクリーニングするための方法に関する。
本発明は生物科学の分野に関し、より具体的には、がん研究、がん診断およびがん治療法の分野に関する。特に、本発明は、がんを検出および診断するための方法、ならびにがんを治療および予防するための方法に関する。さらに本発明は、がんの治療および/または予防のための候補化合物をスクリーニングするための方法に関する。
がんは主要死因の1つであり、世界中で毎年数百万人もの人々ががんのために死亡している。がんの症例数は世界的に増加している。がんの治療は基本的に、外科手術、放射線療法および化学療法によって行われる。しかし、これらの治療の有効性は依然として限定的である。その上、これらの治療は有害作用を引き起こすことがあるため、多くのがん患者が治療後に身体的衰弱を来す。
膀胱癌は2番目に多い泌尿生殖器腫瘍であり、世界中で毎年およそ357,000例の新たな症例が発生している(非特許文献1)。膀胱癌のおよそ3分の1は、診断時点で浸潤性または転移性の疾患であると推測される(非特許文献1〜3)。世界の多くの地域では浸潤性膀胱癌に対する根治的膀胱切除術が未だに標準治療であるが、そのような患者の半数近くは切除術後2年以内に転移を発症し、その後、この疾患のために死亡する。過去20年間にわたり、CMV(シスプラチン、メトトレキサートおよびビンブラスチン)またはM−VAC(メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチン)といったシスプラチンに基づく併用化学療法レジメンが、進行期膀胱癌の患者に対して主に適用されている(非特許文献3〜6)。しかし、全体的な予後は依然として極めて不良であり、これらの併用化学療法によって引き起こされる有害反応は非常に重篤である(非特許文献7)。したがって、膀胱癌に対する新たな分子標的薬の開発が切実に望まれている。
肺癌は世界中のがんによる死亡の主因であり、非小細胞肺癌(NSCLC)が症例の80%近くを占める(非特許文献8)。肺癌の発生および進行に関連する遺伝学的変化は数多く報告されているが、その正確な分子機序は依然として不明である(非特許文献9)。過去10年間に、いくつかの新たに開発された化学療法剤、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビンおよびビノレルビンにより、進行期肺癌患者の治療に関する複数の選択肢が提供され始めている;しかし、シスプラチンに基づく治療法と比較して、そのような各レジメンがもたらす生存度への恩恵はごくわずかに過ぎない(非特許文献10、11)。それ故、分子標的薬などの新規な治療戦略が強く待ち望まれている。
膀胱癌は2番目に多い泌尿生殖器腫瘍であり、世界中で毎年およそ357,000例の新たな症例が発生している(非特許文献1)。膀胱癌のおよそ3分の1は、診断時点で浸潤性または転移性の疾患であると推測される(非特許文献1〜3)。世界の多くの地域では浸潤性膀胱癌に対する根治的膀胱切除術が未だに標準治療であるが、そのような患者の半数近くは切除術後2年以内に転移を発症し、その後、この疾患のために死亡する。過去20年間にわたり、CMV(シスプラチン、メトトレキサートおよびビンブラスチン)またはM−VAC(メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチン)といったシスプラチンに基づく併用化学療法レジメンが、進行期膀胱癌の患者に対して主に適用されている(非特許文献3〜6)。しかし、全体的な予後は依然として極めて不良であり、これらの併用化学療法によって引き起こされる有害反応は非常に重篤である(非特許文献7)。したがって、膀胱癌に対する新たな分子標的薬の開発が切実に望まれている。
肺癌は世界中のがんによる死亡の主因であり、非小細胞肺癌(NSCLC)が症例の80%近くを占める(非特許文献8)。肺癌の発生および進行に関連する遺伝学的変化は数多く報告されているが、その正確な分子機序は依然として不明である(非特許文献9)。過去10年間に、いくつかの新たに開発された化学療法剤、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビンおよびビノレルビンにより、進行期肺癌患者の治療に関する複数の選択肢が提供され始めている;しかし、シスプラチンに基づく治療法と比較して、そのような各レジメンがもたらす生存度への恩恵はごくわずかに過ぎない(非特許文献10、11)。それ故、分子標的薬などの新規な治療戦略が強く待ち望まれている。
ヒストンのメチル化はクロマチンの動的構造を調節する上で重要な役割を果たす。開放型および閉鎖型のクロマチンの正確な協調および組織化が、DNAの複製、修復、組換えおよび転写といった正常な細胞プロセスのためには極めて重要である。最近まで、ヒストンのメチル化は静的修飾とみなされてきたが、ヒストンデメチラーゼ酵素の同定により、ヒストンのメチル化は動的に調節されていることが判明した(非特許文献12、13)。ヒストンデメチラーゼは修飾それ自体を調節するだけでなく、修飾クロマチンに対するエフェクタータンパク質の結合に拮抗することによって間接的にも機能する。このことはJHDM3A/JMJD2Aによって例証されており、これはHP1が認識するH3K9メチル化の目印を除去することによってクロマチンからHP1を除き、HP1による周囲のクロマチンへのH3K9メチル化の広がりを防止する(非特許文献14〜16)。酵母からヒトに至る広範なタンパク質ファミリーがJmjCドメインを含んでおり、これは最近、ヒストンデメチラーゼのシグネチャーモチーフとして特徴決定された(非特許文献17)。転写調節におけるヒストンデメチラーゼの顕著な役割に関する知見は増加しているにもかかわらず、特にヒト疾患に関して、それらの生理的機能の理解は依然として限定的である。
本発明者らは以前、ヒストンメチルトランスフェラーゼの1つであるSMYD3がそのメチルトランスフェラーゼ活性を通じて細胞増殖を刺激し、ヒトの発がんにおいて重要な役割を果たすことを示した(特許文献1、非特許文献18〜22)。ヒストンメチルトランスフェラーゼがヒト細胞における悪性化に寄与することは、他の研究によっても示されている(非特許文献24〜26)。
本発明者らは以前、ヒストンメチルトランスフェラーゼの1つであるSMYD3がそのメチルトランスフェラーゼ活性を通じて細胞増殖を刺激し、ヒトの発がんにおいて重要な役割を果たすことを示した(特許文献1、非特許文献18〜22)。ヒストンメチルトランスフェラーゼがヒト細胞における悪性化に寄与することは、他の研究によっても示されている(非特許文献24〜26)。
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本発明の目的は、がん、例えば急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、特に膀胱癌および肺癌に対する新規な診断戦略および治療戦略を提供することである。
本発明は、JARIDファミリーに属するH3K4デメチラーゼであるJARID1B(jumonji, AT rich interactive domain 1B)遺伝子の発現レベルが、膀胱癌および肺癌を含む多くの種類のがんにおいて、正常組織と比較してアップレギュレートされているという発見に基づく。本発明者らはさらに、JARID1B遺伝子を標的とする低分子干渉RNA(siRNA)ががん性細胞の増殖に及ぼす影響についても検討し、そのようなsiRNAががん性細胞の増殖を阻害する能力を有することを確認した。したがって本発明は、がんマーカーとしてのJARID1Bの使用、JARID1B遺伝子を標的とする二本鎖分子、JARID1B遺伝子を標的とするがんを診断または治療する方法、ならびにがんを治療するために有用な候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法に関する。
本発明は、JARIDファミリーに属するH3K4デメチラーゼであるJARID1B(jumonji, AT rich interactive domain 1B)遺伝子の発現レベルが、膀胱癌および肺癌を含む多くの種類のがんにおいて、正常組織と比較してアップレギュレートされているという発見に基づく。本発明者らはさらに、JARID1B遺伝子を標的とする低分子干渉RNA(siRNA)ががん性細胞の増殖に及ぼす影響についても検討し、そのようなsiRNAががん性細胞の増殖を阻害する能力を有することを確認した。したがって本発明は、がんマーカーとしてのJARID1Bの使用、JARID1B遺伝子を標的とする二本鎖分子、JARID1B遺伝子を標的とするがんを診断または治療する方法、ならびにがんを治療するために有用な候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法に関する。
本発明の1つの局面は、がんを診断するための方法であって、該方法は(a)対象由来の生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現レベルを測定する段階、および(b)該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階(a)で測定された発現レベルの増大を、がんの存在と関連付ける段階、を含む。本方法の1つの態様において、診断されるがんは、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌であり、より好ましくは膀胱癌および肺癌である。生物試料は、例えば、生検試料、喀痰、血液、リンパ液、胸水または尿などを対象から採取することによって調製することができる。
別の局面において、本発明は、がんマーカーとしてのJARID1B遺伝子産物の使用を提供する。例えば、細胞、組織、血液または他の体液などの生物試料において、JARID1B遺伝子に由来するmRNAまたはポリペプチドが、非がん性試料と比較して過剰量で検出される場合、該生物試料にはがん性細胞が混入していると判定することができる。
別の局面において、本発明は、がんマーカーとしてのJARID1B遺伝子産物の使用を提供する。例えば、細胞、組織、血液または他の体液などの生物試料において、JARID1B遺伝子に由来するmRNAまたはポリペプチドが、非がん性試料と比較して過剰量で検出される場合、該生物試料にはがん性細胞が混入していると判定することができる。
本発明の別の局面は、JARID1B遺伝子を標的とする単離された二本鎖分子であって、該二本鎖分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖はSEQ ID NO:21または30に対応する核酸配列を標的配列として含む。該二本鎖分子は、JARID1B遺伝子を過剰発現している可能性のあるがん性細胞に導入されると、JARID1B遺伝子の発現だけでなく細胞増殖も阻害する。したがって該二本鎖分子は、JARID1B遺伝子の過剰発現と関連するがんを治療するために有用でありうる。
いくつかの態様において、該二本鎖分子は約19〜約25ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、該二本鎖分子は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端のいずれかまたは両方に、数個のヌクレオチドからなる1つまたは2つの3'オーバーハングを有する。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖核酸配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる。
本発明の二本鎖分子は、それをコードするベクターから、該ベクターを細胞に導入することによって産生させることができる。したがって、本発明はまた、該二本鎖分子をコードするベクター、ならびに単離された分子も範囲に含む。
本発明の単離された二本鎖分子およびベクターは、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、より好ましくは膀胱癌および肺癌を治療するのに適している。
いくつかの態様において、該二本鎖分子は約19〜約25ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、該二本鎖分子は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端のいずれかまたは両方に、数個のヌクレオチドからなる1つまたは2つの3'オーバーハングを有する。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖核酸配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる。
本発明の二本鎖分子は、それをコードするベクターから、該ベクターを細胞に導入することによって産生させることができる。したがって、本発明はまた、該二本鎖分子をコードするベクター、ならびに単離された分子も範囲に含む。
本発明の単離された二本鎖分子およびベクターは、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、より好ましくは膀胱癌および肺癌を治療するのに適している。
本発明の別の局面は、がん細胞増殖を阻害するための方法、および同じく、がんを治療または予防するための方法である。本発明の方法は、JARID1B遺伝子を標的とする単離された二本鎖分子またはそれをコードするベクターを対象に投与する段階を含む。二本鎖分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖はJARID1B遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含む。
いくつかの態様において、JARID1B遺伝子の核酸配列はSEQ ID NO:1の配列である。より好ましくは、該二本鎖分子は約19〜約25ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、センス鎖および/またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方が、数個のヌクレオチドからなる3'オーバーハングを有する。より好ましくは、JARID1B遺伝子断片の核酸配列は、SEQ ID NO:21または30の核酸配列である。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチド分子からなる。
いくつかの態様において、JARID1B遺伝子の核酸配列はSEQ ID NO:1の配列である。より好ましくは、該二本鎖分子は約19〜約25ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、センス鎖および/またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方が、数個のヌクレオチドからなる3'オーバーハングを有する。より好ましくは、JARID1B遺伝子断片の核酸配列は、SEQ ID NO:21または30の核酸配列である。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチド分子からなる。
好ましくは、本方法は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、より好ましくは膀胱癌および肺癌に対して適用することができる。
本発明の別の局面は、がん細胞増殖を阻害するための、およびがんを治療または予防するための、組成物である。本組成物は、JARID1B遺伝子を標的とする単離された二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含む。該二本鎖分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖は、JARID1B遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含む。
いくつかの態様において、JARID1B遺伝子の核酸配列はSEQ ID NO:1の配列である。より好ましくは、該二本鎖分子は約19〜約25ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、センス鎖および/またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方は、数個のヌクレオチドからなる3'オーバーハングを有する。より好ましくは、JARID1B遺伝子断片の核酸配列は、SEQ ID NO:21または30の核酸配列である。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる。
本組成物は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、好ましくは膀胱癌および肺癌などのがんのリスクを有する対象に投与することにより、がんを治療するために用いることができる。
本発明の別の局面は、がん細胞増殖を阻害するための、およびがんを治療または予防するための、組成物である。本組成物は、JARID1B遺伝子を標的とする単離された二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含む。該二本鎖分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖は、JARID1B遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含む。
いくつかの態様において、JARID1B遺伝子の核酸配列はSEQ ID NO:1の配列である。より好ましくは、該二本鎖分子は約19〜約25ヌクレオチド長を有する。より好ましくは、センス鎖および/またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方は、数個のヌクレオチドからなる3'オーバーハングを有する。より好ましくは、JARID1B遺伝子断片の核酸配列は、SEQ ID NO:21または30の核酸配列である。別の態様において、該二本鎖分子は、介在性の一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる。
本組成物は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、好ましくは膀胱癌および肺癌などのがんのリスクを有する対象に投与することにより、がんを治療するために用いることができる。
本発明の別の局面は、がん細胞増殖を阻害するための化合物をスクリーニングする方法である。該スクリーニング法によって同定された化合物は、がんを治療または予防するための候補化合物となりうる。そのような候補化合物は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、好ましくは膀胱癌および肺癌を治療するのに適している可能性がある。
1つの態様において、本スクリーニング法は、(a)試験剤または試験化合物をJARID1Bポリペプチドと接触させる段階、(b)該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合活性を検出する段階、および(c)該ポリペプチドと結合する試験剤または試験化合物を候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。
1つの態様において、本スクリーニング法は、(a)試験剤または試験化合物をJARID1Bポリペプチドと接触させる段階、(b)該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合活性を検出する段階、および(c)該ポリペプチドと結合する試験剤または試験化合物を候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。
別の態様において、本スクリーニング法は、(a)試験剤または試験化合物をJARID1Bポリペプチドと接触させる段階、(b)該ポリペプチドの生物活性を検出する段階、および(c)試験剤または試験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して、該ポリペプチドまたは断片の生物活性を抑制する該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。本発明において、生物活性は、細胞増殖活性、アポトーシス誘導活性、およびヒストンH3脱メチル化活性の群から選択される。
別の態様において、本スクリーニング法は、(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階、(b)JARID1B遺伝子の発現レベルを測定する段階、および(c)試験剤または試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、JARID1B遺伝子の発現レベルを低下させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。JARID1B遺伝子の発現レベルは、JARID1B遺伝子からの転写産物または翻訳産物を測定することによって直接的に決定することもでき、下流遺伝子、E2F1およびE2F2などの下流遺伝子の発現レベルを測定することによって間接的に決定することもできる。
別の態様において、本スクリーニング法は、(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階、(b)JARID1B遺伝子の発現レベルを測定する段階、および(c)試験剤または試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、JARID1B遺伝子の発現レベルを低下させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。JARID1B遺伝子の発現レベルは、JARID1B遺伝子からの転写産物または翻訳産物を測定することによって直接的に決定することもでき、下流遺伝子、E2F1およびE2F2などの下流遺伝子の発現レベルを測定することによって間接的に決定することもできる。
別の態様において、本スクリーニング法は、(a)試験剤または試験化合物を、JARID1Bの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階、および(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。
好ましくは、上記スクリーニング法によって選択された候補剤または候補化合物を、がん細胞と接触させること、および次にがん細胞増殖を阻害する候補剤または候補化合物を選択することにより、さらにスクリーニングする。本発明の1つまたは複数の局面はある目的を達成できるが、一方、1つまたは複数の他の局面は他の目的を達成できることが、当業者には理解されるであろう。各目的は、そのすべての点において、本発明のあらゆる局面に対して等しく適用されるわけではない。このように、前述の目的は、本発明のいずれか1つの局面に関して択一的に捉えることができる。本発明の上記および他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面および以下の実施例と併せて読むことにより、より十分に明らかになると考えられる。しかし、前記の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様であり、本発明または本発明の他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
好ましくは、上記スクリーニング法によって選択された候補剤または候補化合物を、がん細胞と接触させること、および次にがん細胞増殖を阻害する候補剤または候補化合物を選択することにより、さらにスクリーニングする。本発明の1つまたは複数の局面はある目的を達成できるが、一方、1つまたは複数の他の局面は他の目的を達成できることが、当業者には理解されるであろう。各目的は、そのすべての点において、本発明のあらゆる局面に対して等しく適用されるわけではない。このように、前述の目的は、本発明のいずれか1つの局面に関して択一的に捉えることができる。本発明の上記および他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面および以下の実施例と併せて読むことにより、より十分に明らかになると考えられる。しかし、前記の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様であり、本発明または本発明の他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
態様の説明
本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の態様の実施または試験に用いることができるが、ここでは例示的な方法および材料について説明する。しかし、本発明は規定の実験および最適化に応じて変更されうるので、本明細書に記載された特定の分子、組成物、方法論またはプロトコールに限定されないことが理解されるべきである。また、説明に用いられる専門用語は特定の型または態様を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図していないことも理解されるべきである。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。しかし、矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先する。したがって、本発明の文脈においては、以下の定義が適用される:
本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の態様の実施または試験に用いることができるが、ここでは例示的な方法および材料について説明する。しかし、本発明は規定の実験および最適化に応じて変更されうるので、本明細書に記載された特定の分子、組成物、方法論またはプロトコールに限定されないことが理解されるべきである。また、説明に用いられる専門用語は特定の型または態様を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図していないことも理解されるべきである。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。しかし、矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先する。したがって、本発明の文脈においては、以下の定義が適用される:
定義:
「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、本明細書で用いる場合、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に用いられ、かつ、別に特記する場合を除き、それらの一般に認められている一文字記号で呼ばれる。これらの用語は、1つまたは複数の核酸がエステル結合によって連結された核酸(ヌクレオチド)ポリマーに、適用される。核酸ポリマーはDNA、RNAまたはそれらの組み合わせで構成されてよく、天然および非天然の核酸ポリマー両方を包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーならびに、1つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣物である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
別に定義する場合を除き、「がん」という用語は、JARID1B遺伝子を過剰発現しているがんを指す。JARID1B遺伝子を過剰発現しているがんの例には、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌、より好ましくは膀胱癌および肺癌が非限定的に含まれる。
「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、本明細書で用いる場合、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に用いられ、かつ、別に特記する場合を除き、それらの一般に認められている一文字記号で呼ばれる。これらの用語は、1つまたは複数の核酸がエステル結合によって連結された核酸(ヌクレオチド)ポリマーに、適用される。核酸ポリマーはDNA、RNAまたはそれらの組み合わせで構成されてよく、天然および非天然の核酸ポリマー両方を包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーならびに、1つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣物である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
別に定義する場合を除き、「がん」という用語は、JARID1B遺伝子を過剰発現しているがんを指す。JARID1B遺伝子を過剰発現しているがんの例には、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌、より好ましくは膀胱癌および肺癌が非限定的に含まれる。
JARID1B遺伝子:
JARID1Bは、Plu1とも呼ばれ、ヒトにおいてパラロガスなJARID−ファミリー遺伝子の1つによってコードされる(Kortschak RD et al. Trends Biochem Sci 2000;25: 294-9、Wilsker D. et al. Genomics 2005;86: 242-51)。これは、JmjCドメインに加えて、JmjNドメイン、Bright/Aridドメイン、C5H2Cジンクフィンガー、およびいくつかのPHDドメインを含む、転写調節因子に共通する他のドメインも含む。JARIDファミリーの4つのメンバーはすべて、H3K4デメチラーゼ活性を有する(Christensen J. et al. Cell 2007;128: 1063-76、Iwase S. et al. Cell 2007;128: 1077-88, Klose RJ et al. Cell 2007;128: 889-900、Lee MG et al. Cell 2007;128: 877-87、Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12)。機能的に重複している可能性はあるものの、各メンバーは、異なる染色体領域への動員および異なる酵素活性を通じて、異なる生物学的プロセスに関与するようである(Klose RJ et al. Nat Rev Genet 2006;7: 715-27)。
JARID1B遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列がそれぞれSEQ ID NO:1および2に示されているが、これらに限定されるわけではない。
さらに、配列データを、例えば、それぞれアクセッション番号NM_006618およびNP_006609を介して入手することもできる。
JARID1Bは、Plu1とも呼ばれ、ヒトにおいてパラロガスなJARID−ファミリー遺伝子の1つによってコードされる(Kortschak RD et al. Trends Biochem Sci 2000;25: 294-9、Wilsker D. et al. Genomics 2005;86: 242-51)。これは、JmjCドメインに加えて、JmjNドメイン、Bright/Aridドメイン、C5H2Cジンクフィンガー、およびいくつかのPHDドメインを含む、転写調節因子に共通する他のドメインも含む。JARIDファミリーの4つのメンバーはすべて、H3K4デメチラーゼ活性を有する(Christensen J. et al. Cell 2007;128: 1063-76、Iwase S. et al. Cell 2007;128: 1077-88, Klose RJ et al. Cell 2007;128: 889-900、Lee MG et al. Cell 2007;128: 877-87、Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12)。機能的に重複している可能性はあるものの、各メンバーは、異なる染色体領域への動員および異なる酵素活性を通じて、異なる生物学的プロセスに関与するようである(Klose RJ et al. Nat Rev Genet 2006;7: 715-27)。
JARID1B遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列がそれぞれSEQ ID NO:1および2に示されているが、これらに限定されるわけではない。
さらに、配列データを、例えば、それぞれアクセッション番号NM_006618およびNP_006609を介して入手することもできる。
本発明の1つの局面によれば、機能的等価物も「JARID1Bポリペプチド」であるとみなされる。本明細書において、JARID1Bタンパク質の「機能的等価物」とは、JARID1Bタンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドのことである。すなわち、JARID1Bタンパク質の生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的等価物として用いることができる。例えば、機能的等価物には、JARID1Bタンパク質と類似した細胞増殖活性、抗アポトーシス活性、デメチラーゼ活性、またはE2F1発現およびE2F2発現の促進活性を有するポリペプチドが含まれる。
一般的に、タンパク質中の1つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている。実際、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の1つもしくは複数の置換、欠失、挿入、および/もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984);Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982);Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。
一般的に、タンパク質中の1つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている。実際、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の1つもしくは複数の置換、欠失、挿入、および/もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984);Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982);Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。
JARID1Bタンパク質の活性が維持されている限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の20%またはそれ未満、より好ましくはアミノ酸配列の10%またはそれ未満、より好ましくはアミノ酸配列の5%またはそれ未満を変更することが一般的に好ましい。したがって、好ましい態様において、このような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般的に、30アミノ酸またはそれ未満、好ましくは20アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは10アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは6アミノ酸またはそれ未満、およびさらにより好ましくは3アミノ酸またはそれ未満である。
「保存的改変」という語句は、変異されるアミノ酸残基が、アミノ酸側鎖の特性が保存された別のアミノ酸に好ましくは変異される改変を指す。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、および共通して以下の官能基または特徴を有する側鎖である:脂肪族側鎖(G、A、V、L、I、P);ヒドロキシル基を含有する側鎖(S、T、Y);硫黄原子を含有する側鎖(C、M);カルボン酸およびアミドを含有する側鎖(D、N、E、Q);塩基を含有する側鎖(R、K、H);および芳香族を含有する側鎖(H、F、Y、W)。機能的に類似したアミノ酸を規定する保存的置換表は当技術分野で周知である。例えば、以下の8つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する:
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
このように保存的に修飾されたポリペプチドが本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、タンパク質は、少なくともJARID1Bタンパク質の生物活性が保持されている限り、非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質は、多型変異体、種間ホモログ、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によりコードされるものも含む。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
このように保存的に修飾されたポリペプチドが本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、タンパク質は、少なくともJARID1Bタンパク質の生物活性が保持されている限り、非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質は、多型変異体、種間ホモログ、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によりコードされるものも含む。
本発明のポリペプチドは、これを産生させるために用いた細胞もしくは宿主または使用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異を有しうる。しかしながらこれは、JARID1Bタンパク質と同等の機能を有する限り、本発明の範囲内に含まれる。
他の態様において、本発明のポリペプチドは、JARID1B遺伝子の天然ヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされることができる。「ストリンジェントな条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度 pHにおける特定の配列の融解温度(Tm)よりも約5〜10℃低くなるように選択される。Tmとは、(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度のもとで)標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である(Tmにおいて標的配列が過剰に存在する場合、プローブの50%が平衡状態で占められる)。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、以下のものが含まれる:50%ホルムアミド、5×SSC、および1%SDS、42℃でのインキュベーション、または、5×SSC、1%SDS、65℃でのインキュベーション、ならびに0.2×SSCおよび0.1%SDS、50℃での洗浄。
本発明の文脈において、JARID1Bタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって規定通り選択され得る。例えば、「Rapid−hyb緩衝液」(Amersham LIFE SCIENCE)を用いて68℃で30分間またはそれ以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、68℃で1時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。それに続く洗浄工程は、例えば低ストリンジェント条件下で行い得る。例示的な低ストリンジェント条件には、42℃、2×SSC、0.1%SDS、好ましくは50℃、2×SSC、0.1%SDSが含まれ得る。高ストリンジェント条件の使用が好ましいことが多い。例示的な高ストリンジェント条件には、2×SSC、0.01%SDSにおける室温で20分間の洗浄を3回行った後に、1×SSC、0.1%SDSにおける37℃で20分間の洗浄を3回行い、1×SSC、0.1%SDSにおける50℃で20分間の洗浄を2回行うことが含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
さらに、本発明の遺伝子は、タンパク質のそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを包含する。上記の配列情報に基づき合成されたプライマーを用いて、JARID1Bタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加え、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を利用することができる。
ヒトの遺伝子およびタンパク質とそれぞれ機能的に等価なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性(「配列同一性」とも称される)を有する。「高い相同性」(または高い配列同一性)とは典型的に、40%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%、93%、95%、97%、またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。
ヒトの遺伝子およびタンパク質とそれぞれ機能的に等価なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性(「配列同一性」とも称される)を有する。「高い相同性」(または高い配列同一性)とは典型的に、40%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%、93%、95%、97%、またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。
がんマーカーとしてのJARID1Bの使用:
JARID1B遺伝子の発現は、表3に示されたようなさまざまな種類のがん組織において特異的に上昇していることが見出された。したがって、JARID1Bはさまざまな種類のがんにおけるがんマーカーとして有用である。最近、JARID1B遺伝子は乳癌および前立腺癌において過剰発現することが報告された(Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12、Xiang Y. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104: 19226-31)。しかし、1つの種類のがんにおける遺伝子発現プロファイルは一般に他の種類のがんのものとは異なるため、JARID1Bが他のがんのがんマーカーとして有用であるか否かは不明であった。急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌におけるJARID1B遺伝子の過剰発現を明らかにしたのは本発明が初めてである。したがって本発明は、そのようながんにおけるがんマーカーとしてのJARID1Bの使用を提供する。
本発明によれば、JARID1B遺伝子の過剰発現を検出することにより、生物試料ががん性細胞を含み、その結果がん性細胞由来の産物を含むと判定することができる。すなわち、本発明は、生物試料にがん性細胞またはがん性産物が混入しているか否かを判定するための方法を提供し、該方法は、該生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現レベルを定量する段階、および該発現レベルを、がんを有さないことが判明している非がん性試料における発現レベルと比較する段階を含む。
JARID1B遺伝子の発現は、表3に示されたようなさまざまな種類のがん組織において特異的に上昇していることが見出された。したがって、JARID1Bはさまざまな種類のがんにおけるがんマーカーとして有用である。最近、JARID1B遺伝子は乳癌および前立腺癌において過剰発現することが報告された(Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12、Xiang Y. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104: 19226-31)。しかし、1つの種類のがんにおける遺伝子発現プロファイルは一般に他の種類のがんのものとは異なるため、JARID1Bが他のがんのがんマーカーとして有用であるか否かは不明であった。急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌におけるJARID1B遺伝子の過剰発現を明らかにしたのは本発明が初めてである。したがって本発明は、そのようながんにおけるがんマーカーとしてのJARID1Bの使用を提供する。
本発明によれば、JARID1B遺伝子の過剰発現を検出することにより、生物試料ががん性細胞を含み、その結果がん性細胞由来の産物を含むと判定することができる。すなわち、本発明は、生物試料にがん性細胞またはがん性産物が混入しているか否かを判定するための方法を提供し、該方法は、該生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現レベルを定量する段階、および該発現レベルを、がんを有さないことが判明している非がん性試料における発現レベルと比較する段階を含む。
本明細書で用いる場合、「生物試料」という用語は、生物体全体、または、その組織、細胞もしくは構成部分(例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血(amniotic cord blood)、尿、膣液、および精液を非限定的に含む体液)のサブセットを指す。「生物試料」とはさらに、生物体全体、またはその細胞、組織もしくは構成部分のサブセット、またはそれらの画分もしくは部分から調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物または組織培養物も指す。さらに、「生物試料」とは、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含む、生物体を増殖させた栄養ブロスまたはゲルなどの培地も指す。
例示的な生物試料には、血液、喀痰、胸水または尿などの生検標本、体組織および体液が非限定的に含まれる。好ましくは生物試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性であると疑われる組織に由来する上皮細胞を含む、細胞群を含む。さらに、必要に応じて、得られた体組織および体液から細胞を精製した後、生物試料として用いてもよい。しかしながら、目的となるJARID1Bの転写産物または翻訳産物を含む限り、いかなる生物材料も判定のための生物試料として用いることができる。
例示的な生物試料には、血液、喀痰、胸水または尿などの生検標本、体組織および体液が非限定的に含まれる。好ましくは生物試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性であると疑われる組織に由来する上皮細胞を含む、細胞群を含む。さらに、必要に応じて、得られた体組織および体液から細胞を精製した後、生物試料として用いてもよい。しかしながら、目的となるJARID1Bの転写産物または翻訳産物を含む限り、いかなる生物材料も判定のための生物試料として用いることができる。
例えば、本発明によれば、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌を含むがんを診断することができる。または、本発明は、生物試料におけるこれらのがんのがん細胞を検出するための方法も提供する。これらのがんを診断するため、またはがん細胞を検出するために、診断または検出される対象から採取した以下の臓器に由来する生物試料を、生物試料として用いることができる:
リンパ球、またはリンパ球を含む血液試料:急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、
膀胱:膀胱癌、
子宮頸部:子宮頸癌、
肺:肺癌、および
腎臓:腎細胞癌。
JARID1B遺伝子の発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いてJARID1BのmRNA、タンパク質または活性を検出することによって定量することができる。これらの方法の詳細は、「がんを診断するための方法」で後述される。
本方法は、生物材料の利用、がん診断、がん治療法などに対する有用な情報を提供することができる。
リンパ球、またはリンパ球を含む血液試料:急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、
膀胱:膀胱癌、
子宮頸部:子宮頸癌、
肺:肺癌、および
腎臓:腎細胞癌。
JARID1B遺伝子の発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いてJARID1BのmRNA、タンパク質または活性を検出することによって定量することができる。これらの方法の詳細は、「がんを診断するための方法」で後述される。
本方法は、生物材料の利用、がん診断、がん治療法などに対する有用な情報を提供することができる。
がんを診断するための方法:
本発明はまた、JARID1B遺伝子の発現レベルを利用する、がん細胞を検出するためまたはがんを診断するための方法も提供する。本方法は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌を診断するのに適している。
本発明に従って、対象の状態を試験するための中間的な結果が与えられ得る。対象が疾患を患っていると、医師、看護師、または他の実施者が診断するのを補助するために、そのような中間的な結果をさらなる情報と組み合わせてもよい。代替的に本発明は、対象由来の生物試料においてがん性細胞を検出するため、および対象が疾患を患っていると診断するのに有用な情報を医師に与えるために、使用され得る。
あるいは本発明は、対象由来の生物試料中のがん細胞を検出または同定するための方法を提供し、該方法は、対象由来の生物試料中のJARID1B遺伝子の発現レベルを測定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることにより、組織中にがん細胞が存在することまたはその疑いがあることが示される。
本発明はまた、JARID1B遺伝子の発現レベルを利用する、がん細胞を検出するためまたはがんを診断するための方法も提供する。本方法は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌を診断するのに適している。
本発明に従って、対象の状態を試験するための中間的な結果が与えられ得る。対象が疾患を患っていると、医師、看護師、または他の実施者が診断するのを補助するために、そのような中間的な結果をさらなる情報と組み合わせてもよい。代替的に本発明は、対象由来の生物試料においてがん性細胞を検出するため、および対象が疾患を患っていると診断するのに有用な情報を医師に与えるために、使用され得る。
あるいは本発明は、対象由来の生物試料中のがん細胞を検出または同定するための方法を提供し、該方法は、対象由来の生物試料中のJARID1B遺伝子の発現レベルを測定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることにより、組織中にがん細胞が存在することまたはその疑いがあることが示される。
対象が疾患に罹患していると診断する際の医師、看護師、または他の医療従事者を支援するために、このような結果を付加的な情報と組み合わせることができる。換言すれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば本発明によると、対象から得られた組織中にがん細胞の存在が疑われる場合には、JARID1B遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、公知の血中腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む疾患の様々な局面を考慮することによって、医療従事者は臨床判断を下すことができる。例えば、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、または腎細胞癌の周知の血中診断マーカーの一部は以下である。
急性骨髄性白血病;WT1
膀胱癌;SCC、TPA、またはIAP
乳癌;BCA225、TPA、CEA、IAP、またはCA15−3
慢性骨髄性白血病;BCR−ABL
子宮頸癌;SCC、TPA、またはCA125
肺癌;AP、ACT、BFP、CA19−9、CA50、CA72−4、CA130、CEA、KMO−1、NSE、SCC、SP1、Span−1、TPA、CSLEX、SLX、STN、およびCYFRA
前立腺癌;PSA、またはPAP
腎細胞癌;IAP
急性骨髄性白血病;WT1
膀胱癌;SCC、TPA、またはIAP
乳癌;BCA225、TPA、CEA、IAP、またはCA15−3
慢性骨髄性白血病;BCR−ABL
子宮頸癌;SCC、TPA、またはCA125
肺癌;AP、ACT、BFP、CA19−9、CA50、CA72−4、CA130、CEA、KMO−1、NSE、SCC、SP1、Span−1、TPA、CSLEX、SLX、STN、およびCYFRA
前立腺癌;PSA、またはPAP
腎細胞癌;IAP
すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間的な結果として役立つ。
別の態様において、本発明は、がんの診断マーカーを検出するための方法を提供し、該方法は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、または腎細胞癌の診断マーカーとして、対象由来の生物試料中のJARID1B遺伝子の発現を検出する段階を含む。
本方法は、
(a)対象由来の生物試料において、JARID1B遺伝子の発現レベルを測定する段階;および
(b)該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階(a)で測定した発現レベルの増大を、がん性細胞の存在と関連付ける段階
を含む。
本方法によって診断される対象は好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
別の態様において、本発明は、がんの診断マーカーを検出するための方法を提供し、該方法は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、または腎細胞癌の診断マーカーとして、対象由来の生物試料中のJARID1B遺伝子の発現を検出する段階を含む。
本方法は、
(a)対象由来の生物試料において、JARID1B遺伝子の発現レベルを測定する段階;および
(b)該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階(a)で測定した発現レベルの増大を、がん性細胞の存在と関連付ける段階
を含む。
本方法によって診断される対象は好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
本発明に従って、対象由来の生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写産物レベルとして測定することができる。例えば、JARID1BのmRNAを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法(例えばノーザンハイブリダイゼーション)によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。JARID1B遺伝子を含む複数の遺伝子(例えば様々ながん特異的遺伝子)の発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、JARID1B遺伝子の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。そのような配列情報は、ウェブ上の配列データベース、例えばGeneBank(商標)より得ることができるが、これに限定されるわけではない。例えば、JARID1B遺伝子の例示的な配列は、これに限定されるわけではないが、SEQ ID NO:1(GenBankアクセッション番号:NM_006618)に示されている。プローブは通常、JARID1B遺伝子配列の少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個のヌクレオチドを含む。JARID1B遺伝子のこれらの断片に加えて、JARID1B遺伝子のcDNAをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、JARID1B遺伝子の転写産物を、プライマーを用いて増幅に基づく検出法(例えばRT−PCR)によって定量してもよい。そのようなプライマーは、JARID1B遺伝子の配列情報に基づいて調製することもできる。例えば、実施例で使用されるプライマー(SEQ ID NO:7、8、9、および10)は、RT−PCRまたはノーザンブロット分析による検出に用いられ得るが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、JARID1BのmRNAとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度のもとで)標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Tmにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの50%が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、pH 7.0〜8.3において塩濃度がナトリウムイオン約1.0 M未満、典型的にはナトリウムイオン(または他の塩)約0.01〜1.0 Mであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば、10〜50ヌクレオチド)に関しては少なくとも約30℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、JARID1BのmRNAとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度のもとで)標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Tmにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの50%が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、pH 7.0〜8.3において塩濃度がナトリウムイオン約1.0 M未満、典型的にはナトリウムイオン(または他の塩)約0.01〜1.0 Mであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば、10〜50ヌクレオチド)に関しては少なくとも約30℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、JARID1Bタンパク質の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、JARID1Bタンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または変異体(例えばキメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)を検出に使用することができる。該タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
JARID1B遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、JARID1Bタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を観察してもよい。即ち、強い染色が観察されることは、タンパク質の存在量の増大を示すと同時に、JARID1B遺伝子の高い発現レベルを示す。
さらに、ヒストン脱メチル化などのJARID1Bタンパク質の生物活性を測定することによって、JARID1Bタンパク質の量を決定することができる。上記の通り、JARID1Bは、ヒストンH3リシン4のメチル基を特異的に除去しうるリシンデメチラーゼファミリーの1つとして特徴づけされている(Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12)。このため、ヒストン脱メチル化活性は、その生物活性に基づくJARID1Bタンパク質の定量のために有用である。ヒストン脱メチル化レベルは、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。JARID1Bタンパク質の定量のためにヒストン脱メチル化活性を利用する場合には、対象の組織または細胞から調製したホモジネート、溶解物または抽出物を生物試料として用いることが好ましいが、これらに限定されるわけではない。生物試料をメチル化ヒストンとともにインキュベーションした後、例えばヒストン脱メチル化に起因するホルムアルデヒドもしくは過酸化水素の放出を検出することによって、またはメチル化ヒストンに対する抗体を用いて残留メチル化ヒストンを検出することによって、脱メチル化レベルを推定する。ヒストン脱メチル化アッセイのために、EpiQuik Global Histone Methylation Assay Kit(Epigentek Group Inc.)などのいくつかの市販の製品を利用してもよい。
さらに、ヒストン脱メチル化などのJARID1Bタンパク質の生物活性を測定することによって、JARID1Bタンパク質の量を決定することができる。上記の通り、JARID1Bは、ヒストンH3リシン4のメチル基を特異的に除去しうるリシンデメチラーゼファミリーの1つとして特徴づけされている(Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12)。このため、ヒストン脱メチル化活性は、その生物活性に基づくJARID1Bタンパク質の定量のために有用である。ヒストン脱メチル化レベルは、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。JARID1Bタンパク質の定量のためにヒストン脱メチル化活性を利用する場合には、対象の組織または細胞から調製したホモジネート、溶解物または抽出物を生物試料として用いることが好ましいが、これらに限定されるわけではない。生物試料をメチル化ヒストンとともにインキュベーションした後、例えばヒストン脱メチル化に起因するホルムアルデヒドもしくは過酸化水素の放出を検出することによって、またはメチル化ヒストンに対する抗体を用いて残留メチル化ヒストンを検出することによって、脱メチル化レベルを推定する。ヒストン脱メチル化アッセイのために、EpiQuik Global Histone Methylation Assay Kit(Epigentek Group Inc.)などのいくつかの市販の製品を利用してもよい。
または、JARID1Bタンパク質の生物活性として、細胞増殖活性を利用してもよい。本発明によれば、JARID1B遺伝子の発現の阻害は、膀胱癌細胞および肺癌細胞における細胞増殖につながり、したがって、JARID1Bタンパク質は細胞増殖を促進すると推測される。JARID1Bタンパク質の細胞増殖活性を決定するために、生物試料の存在下で細胞を培養した後、増殖速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該生物試料の細胞増殖活性を決定することができる。
さらに、診断の精度を向上させるために、JARID1B遺伝子の発現レベルに加えて、他のがん関連遺伝子、例えばがんにおいて差次的に発現されることが知られている遺伝子の発現レベルを測定してもよい。生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現レベルの増大は、対照レベルとの比較によって検出することができる。
さらに、診断の精度を向上させるために、JARID1B遺伝子の発現レベルに加えて、他のがん関連遺伝子、例えばがんにおいて差次的に発現されることが知られている遺伝子の発現レベルを測定してもよい。生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現レベルの増大は、対照レベルとの比較によって検出することができる。
疾患状態(がん性または非がん性)が既知である対象(複数可)から以前に採取して保存していた試料(複数可)を使用することによって、試験される生物試料と同時に対照レベルを決定してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたJARID1B遺伝子の発現レベル(複数可)を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであることもできる。さらに、本発明の一局面によれば、生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。患者由来の生物試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるJARID1B遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±2S.D.または平均±3S.D.の範囲を標準値として使用することができる。
本発明の文脈において、がん性でないことが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、がん性生物試料から決定した場合、対照レベルは「がん性対照レベル」と称する。
JARID1B遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、生物試料はがん性細胞を含む可能性があり、これは、対象ががんを患っているかまたはその発症リスクを有し得ることを示す。
本発明の文脈において、がん性でないことが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、がん性生物試料から決定した場合、対照レベルは「がん性対照レベル」と称する。
JARID1B遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、生物試料はがん性細胞を含む可能性があり、これは、対象ががんを患っているかまたはその発症リスクを有し得ることを示す。
試験される生物試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違を、細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて発現レベルが変わらない対照遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して、正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、βアクチン、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質P1が、非限定的に含まれる。
生物試料における発現レベルは、正常対照レベルよりも、例えば10%、25%、もしくは50%増大していれば;または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、3.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上増大していれば、増大したとみなすことができる。一方、生物試料における発現レベルは、がん性対照レベルとの相違が10%以内、25%以内、または50%以内であれば、増大したとみなすことができる。
生物試料における発現レベルは、正常対照レベルよりも、例えば10%、25%、もしくは50%増大していれば;または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、3.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上増大していれば、増大したとみなすことができる。一方、生物試料における発現レベルは、がん性対照レベルとの相違が10%以内、25%以内、または50%以内であれば、増大したとみなすことができる。
がんを検出するためのキット:
本発明は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌などのがんを検出するためのキットを提供する。本試薬は生物試料におけるがん性細胞を検出するために用いることができ、がんの診断のために有用でありうる。
具体的には、本試薬は生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現を検出することができ、該試薬は以下の群より選択されうる:
(a)JARID1B遺伝子のmRNAを検出するための試薬;および
(b)JARID1Bタンパク質を検出するための試薬。
(c)JARID1Bタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
JARID1B遺伝子のmRNAの検出に適した試薬には、JARID1B mRNAと特異的に結合するかそれを同定するオリゴヌクレオチド、例えばJARID1B mRNAの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、JARID1B mRNAに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、例えば「がんを診断するための方法」に記載されたような当技術分野で周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、JARID1B mRNAを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。
本発明は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌などのがんを検出するためのキットを提供する。本試薬は生物試料におけるがん性細胞を検出するために用いることができ、がんの診断のために有用でありうる。
具体的には、本試薬は生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現を検出することができ、該試薬は以下の群より選択されうる:
(a)JARID1B遺伝子のmRNAを検出するための試薬;および
(b)JARID1Bタンパク質を検出するための試薬。
(c)JARID1Bタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
JARID1B遺伝子のmRNAの検出に適した試薬には、JARID1B mRNAと特異的に結合するかそれを同定するオリゴヌクレオチド、例えばJARID1B mRNAの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、JARID1B mRNAに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、例えば「がんを診断するための方法」に記載されたような当技術分野で周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、JARID1B mRNAを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。
一方、JARID1Bタンパク質の検出に適した試薬には、JARID1Bタンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、JARID1Bタンパク質に対する結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または変異体(例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fvなど)も試薬として用いることができる。JARID1Bタンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、かつ本発明において、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するためにいかなる方法を用いてもよい。さらに、直接的な連結または間接的な標識技術を介して、抗体をシグナル生成分子で標識してもよい。標識、ならびに、抗体を標識するための方法、およびその標的に対する抗体の結合を検出するための方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために用いることができる。必要に応じて、JARID1Bタンパク質を検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。
さらに、JARID1Bタンパク質を、JARID1Bタンパク質の生物活性として検出することができる。ヒストン脱メチル化活性および細胞増殖活性は、JARID1Bタンパク質の例示的な生物活性である。生物試料におけるヒストン脱メチル化活性は、メチル化ヒストンを該生物試料とともにインキュベーションした後に、メチル化ヒストンに対する抗体を用いて残留メチル化ヒストンを検出することによって、決定することができる。したがって、本キットはメチル化ヒストンおよび抗メチル化ヒストン抗体を含んでもよい。さもなくば本キットは、ヒストン脱メチル化によって放出されたホルムアルデヒドを検出するための、標識されたメチル基を有するメチル化ヒストンを含んでもよい。一方、生物試料における細胞増殖活性は、生物試料の存在下で細胞を培養した後、増殖速度を検出することによって、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、決定することができる。したがって、本キットは、細胞の培養のための培地および容器を含むことができる。
さらに、JARID1Bタンパク質を、JARID1Bタンパク質の生物活性として検出することができる。ヒストン脱メチル化活性および細胞増殖活性は、JARID1Bタンパク質の例示的な生物活性である。生物試料におけるヒストン脱メチル化活性は、メチル化ヒストンを該生物試料とともにインキュベーションした後に、メチル化ヒストンに対する抗体を用いて残留メチル化ヒストンを検出することによって、決定することができる。したがって、本キットはメチル化ヒストンおよび抗メチル化ヒストン抗体を含んでもよい。さもなくば本キットは、ヒストン脱メチル化によって放出されたホルムアルデヒドを検出するための、標識されたメチル基を有するメチル化ヒストンを含んでもよい。一方、生物試料における細胞増殖活性は、生物試料の存在下で細胞を培養した後、増殖速度を検出することによって、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、決定することができる。したがって、本キットは、細胞の培養のための培地および容器を含むことができる。
本キットは、前述の試薬を二種類以上含んでもよい。本キットは、JARID1B遺伝子に対するプローブまたはJARID1Bに対する抗体を結合させるための固体マトリックスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性の対照試薬、ならびに、JARID1Bタンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでもよい。本発明のキットはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび、使用説明書を載せた添付文書(例えば、書面、テープ、CD−ROMなど)を含む、商業的な観点および利用者の観点から望まれる他の材料を含んでもよい。これらの試薬などは、ラベルを付けた容器中に含めることができる。適した容器には、瓶、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。
本発明の1つの態様として、試薬がJARID1B mRNAに対するプローブである場合には、少なくとも1つの検出部位を形成するために、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックス上に固定化してもよい。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれがオリゴヌクレオチド(プローブ)を含む複数の部位を含んでもよい。試験ストリップはまた、陰性対照および/または陽性対照用の部位を含んでもよい。あるいは、対照部位を、試験ストリップから隔てられたストリップ上に配置してもよい。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化オリゴヌクレオチドを含んでもよい、すなわち、第1の検出部位ではより多い量であり、以降の部位ではそれより少ない量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するJARID1B mRNA量の定量的指標が得られる。検出部位は好適に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、試験ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明の1つの態様として、試薬がJARID1B mRNAに対するプローブである場合には、少なくとも1つの検出部位を形成するために、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックス上に固定化してもよい。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれがオリゴヌクレオチド(プローブ)を含む複数の部位を含んでもよい。試験ストリップはまた、陰性対照および/または陽性対照用の部位を含んでもよい。あるいは、対照部位を、試験ストリップから隔てられたストリップ上に配置してもよい。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化オリゴヌクレオチドを含んでもよい、すなわち、第1の検出部位ではより多い量であり、以降の部位ではそれより少ない量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するJARID1B mRNA量の定量的指標が得られる。検出部位は好適に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、試験ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはJARID1B標準試料を含んでもよい。本発明の陽性対照試料は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌に由来する細胞などのjARID1B陽性試料を採取した後、それらのJARID1Bレベルを分析することによって、調製され得る。あるいは、精製されたJARID1Bタンパク質またはJARID1B遺伝子を細胞にトランスフェクトして、陽性試料またはJARID1Bの標準物質を形成させてもよい。
別の態様において、本発明のキットはさらに陰性対照試料を含んでもよい。本発明の陰性対照試料は、非がん性細胞などの、JARID1Bを発現しない細胞または組織である。
別の態様において、本発明のキットはさらに陰性対照試料を含んでもよい。本発明の陰性対照試料は、非がん性細胞などの、JARID1Bを発現しない細胞または組織である。
二本鎖分子:
本明細書で用いる場合、「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、これには例えば、低分子干渉RNA(siRNA;例えば、二本鎖リボ核酸(dsRNA)または低分子ヘアピンRNA(shRNA))および低分子干渉DNA/RNA(siD/R−NA;例えば、DNAとRNAの二本鎖キメラ(dsD/R−NA)またはDNAとRNAの低分子ヘアピンキメラ(shD/R−NA))が含まれる。
本明細書で用いる場合、標的配列のセンス鎖とは、ある遺伝子のmRNA配列またはcDNA配列の内部のヌクレオチド配列であり、これは本発明の二本鎖核酸分子が該遺伝子を発現している細胞内に導入された場合にそのmRNA全体の翻訳の抑制をもたらしうる。遺伝子のmRNA配列またはcDNA配列の内部のヌクレオチド配列は、標的配列に対応する配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドが、該遺伝子を発現している細胞において該遺伝子の発現を阻害する場合、該標的配列であると判定され得る。遺伝子発現を抑制する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的配列と2〜5ヌクレオチド長を有する3'オーバーハング(例えば、uu)とからなってよい。
本明細書で使用される「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨害する二本鎖RNA分子を指す。RNAが転写される鋳型をDNAとした技術を含む、siRNAを細胞に導入する標準的な技術を用いる。siRNAには、標的遺伝子のセンス核酸配列の一部(「センス鎖」とも称される)、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列の一部(「アンチセンス鎖」とも称される)、またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、siRNAを構築してもよい。siRNAはdsRNAまたはshRNAのいずれかであり得る。
本明細書で用いる場合、「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、これには例えば、低分子干渉RNA(siRNA;例えば、二本鎖リボ核酸(dsRNA)または低分子ヘアピンRNA(shRNA))および低分子干渉DNA/RNA(siD/R−NA;例えば、DNAとRNAの二本鎖キメラ(dsD/R−NA)またはDNAとRNAの低分子ヘアピンキメラ(shD/R−NA))が含まれる。
本明細書で用いる場合、標的配列のセンス鎖とは、ある遺伝子のmRNA配列またはcDNA配列の内部のヌクレオチド配列であり、これは本発明の二本鎖核酸分子が該遺伝子を発現している細胞内に導入された場合にそのmRNA全体の翻訳の抑制をもたらしうる。遺伝子のmRNA配列またはcDNA配列の内部のヌクレオチド配列は、標的配列に対応する配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドが、該遺伝子を発現している細胞において該遺伝子の発現を阻害する場合、該標的配列であると判定され得る。遺伝子発現を抑制する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的配列と2〜5ヌクレオチド長を有する3'オーバーハング(例えば、uu)とからなってよい。
本明細書で使用される「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨害する二本鎖RNA分子を指す。RNAが転写される鋳型をDNAとした技術を含む、siRNAを細胞に導入する標準的な技術を用いる。siRNAには、標的遺伝子のセンス核酸配列の一部(「センス鎖」とも称される)、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列の一部(「アンチセンス鎖」とも称される)、またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、siRNAを構築してもよい。siRNAはdsRNAまたはshRNAのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「dsRNA」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖RNA分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、2つのRNA分子の構築物を指す。2本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」RNAだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するRNA分子も含み得る。
本明細書で使用される「shRNA」という用語は、互いに対して相補的である第1の領域および第2の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するsiRNAを指す。領域の相補性および配向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第1の領域および第2の領域がループ領域によって連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)間の塩基対形成の欠失によって生じる。shRNAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で使用される「shRNA」という用語は、互いに対して相補的である第1の領域および第2の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するsiRNAを指す。領域の相補性および配向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第1の領域および第2の領域がループ領域によって連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)間の塩基対形成の欠失によって生じる。shRNAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で使用される「siD/R−NA」という用語は、RNAとDNAの両方からなる二本鎖核酸分子を指し、RNAとDNAのハイブリッドおよびキメラを含み、標的mRNAの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、DNAからなるポリヌクレオチドとRNAからなるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がRNAおよびDNAを含有し得るものを示す。siD/R−NAを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。siD/R−NAには、標的遺伝子のセンス核酸配列の一部(「センス鎖」とも称される)、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列の一部(「アンチセンス鎖」とも称される)またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、siD/R−NAを構築してもよい。siD/R−NAはdsD/R−NAまたはshD/R−NAのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「dsD/R−NA」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、2つの分子の構築物を指す。2つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」核酸配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。dsD/R−NAを構築する2つの分子の一方または両方がRNAおよびDNAの両方から構成される(キメラ分子)か、あるいは代替的に、一方の分子がRNAから構成され、もう一方がDNAから構成される(ハイブリッド二本鎖)。
本明細書で使用される「dsD/R−NA」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、2つの分子の構築物を指す。2つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」核酸配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。dsD/R−NAを構築する2つの分子の一方または両方がRNAおよびDNAの両方から構成される(キメラ分子)か、あるいは代替的に、一方の分子がRNAから構成され、もう一方がDNAから構成される(ハイブリッド二本鎖)。
本明細書で使用される「shD/R−NA」という用語は、互いに対して相補的である第1の領域および第2の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するsiD/R−NAを指す。領域の相補性および配向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第1の領域および第2の領域がループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)間の塩基対形成の欠失によって生じる。shD/R−NAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、その元の環境(例えば、天然由来である場合には天然の環境)から取り出され、かつしたがって総合的にその天然状態から改変された状態である。
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、その元の環境(例えば、天然由来である場合には天然の環境)から取り出され、かつしたがって総合的にその天然状態から改変された状態である。
JARID1B遺伝子に対する二本鎖分子は、JARID1B mRNAとハイブリダイズする分子であり、該遺伝子の正常な一本鎖mRNA転写物と会合し、それによって翻訳に干渉し、したがってJARID1Bタンパク質の発現を阻害することによって、該タンパク質の産生を低下させるかまたは阻害する。本明細書において実証されているように、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株におけるJARID1B遺伝子の発現はdsRNAによって阻害され(図7B、F)、その結果として、該細胞株の増殖は抑制された(図7C、G)。
したがって本発明は、JARID1B遺伝子を発現している細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現ならびに細胞増殖を阻害することができる、単離された二本鎖分子を提供する。本発明の二本鎖分子は、JARID1B遺伝子の過剰発現に関連するがん細胞増殖を阻害するために有用であり、したがって、がんを治療するための新規方法を提供しうる。例えば、本発明の二本鎖分子は、JARID1B遺伝子の過剰発現が観察された(表3)、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんへの適用に適している。より好ましくは、膀胱癌および肺癌が本発明の二本鎖分子に適している。
したがって本発明は、JARID1B遺伝子を発現している細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現ならびに細胞増殖を阻害することができる、単離された二本鎖分子を提供する。本発明の二本鎖分子は、JARID1B遺伝子の過剰発現に関連するがん細胞増殖を阻害するために有用であり、したがって、がんを治療するための新規方法を提供しうる。例えば、本発明の二本鎖分子は、JARID1B遺伝子の過剰発現が観察された(表3)、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんへの適用に適している。より好ましくは、膀胱癌および肺癌が本発明の二本鎖分子に適している。
細胞内の標的遺伝子発現を阻害する能力をもつ二本鎖分子を設計する方法が知られている(例えば、その全体が本明細書中で参照により組み入れられる、国際公開公報第2004/048566号および米国特許第6,506,559号を参照されたい)。例えば、siRNAを設計するためのコンピュータプログラムは、Ambionのウェブサイトから入手可能である(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
標的部位の選択:
1.転写産物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAとその3'側に隣接する19ヌクレオチドとの出現を記録する。Tuschl et al.は、5'非翻訳領域(UTR)および3'非翻訳領域および開始コドン近傍(75塩基以内)の領域に対してsiRNAを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体が、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
2.潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラット等)とを比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるNCBIサーバー上のBLASTを用いる(Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17): 3389-402)。
3.合成用の的確な標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って標的配列をいくつか選択して評価するのが一般的である。
上記の設計方法を用い、本発明の単離された二本鎖分子の標的配列を、SEQ ID NO:21および30として設計した。上述の標的配列を標的とする二本鎖分子を、JARID1B遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力に関して調べた。したがって、本発明の例示的な二本鎖分子は、標的配列としてSEQ ID NO:21または30に対応する核酸配列を含む。しかしながら、本発明の二本鎖分子がJARID1Bの発現および細胞増殖を阻害する能力を保持している限り、JARID1B由来の任意の配列を、該二本鎖分子のための標的配列とすることができる。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
標的部位の選択:
1.転写産物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAとその3'側に隣接する19ヌクレオチドとの出現を記録する。Tuschl et al.は、5'非翻訳領域(UTR)および3'非翻訳領域および開始コドン近傍(75塩基以内)の領域に対してsiRNAを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体が、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
2.潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラット等)とを比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるNCBIサーバー上のBLASTを用いる(Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17): 3389-402)。
3.合成用の的確な標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って標的配列をいくつか選択して評価するのが一般的である。
上記の設計方法を用い、本発明の単離された二本鎖分子の標的配列を、SEQ ID NO:21および30として設計した。上述の標的配列を標的とする二本鎖分子を、JARID1B遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力に関して調べた。したがって、本発明の例示的な二本鎖分子は、標的配列としてSEQ ID NO:21または30に対応する核酸配列を含む。しかしながら、本発明の二本鎖分子がJARID1Bの発現および細胞増殖を阻害する能力を保持している限り、JARID1B由来の任意の配列を、該二本鎖分子のための標的配列とすることができる。
本発明の二本鎖分子は単一の標的配列に対する指向性を有してもよい。
本発明の二本鎖分子には、標的配列の核酸配列および/または標的配列に相補的な配列のいずれかを含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。本発明の二本鎖分子に対するポリヌクレオチドの例として、SEQ ID NO:21もしくは30に対応する核酸配列および/または該配列に相補的な配列を含むものが挙げられる。しかしながら本発明はこれらの例に限定されず、改変された分子がJARID1B遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上述の核酸配列における軽微な改変が許容可能である。本明細書において核酸配列に関連して用いられる「軽微な改変」という語句は、該配列に対する1つ、2つまたはいくつかの核酸の置換、欠失、付加または挿入を示す。本発明の文脈において、核酸の置換、欠失、付加および/または挿入に適用される「いくつかの」という用語は、3〜7個の、好ましくは3〜5個の、より好ましくは3〜4個の、さらにより好ましくは3個の核酸残基を意味しうる。
本発明の二本鎖分子には、標的配列の核酸配列および/または標的配列に相補的な配列のいずれかを含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。本発明の二本鎖分子に対するポリヌクレオチドの例として、SEQ ID NO:21もしくは30に対応する核酸配列および/または該配列に相補的な配列を含むものが挙げられる。しかしながら本発明はこれらの例に限定されず、改変された分子がJARID1B遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上述の核酸配列における軽微な改変が許容可能である。本明細書において核酸配列に関連して用いられる「軽微な改変」という語句は、該配列に対する1つ、2つまたはいくつかの核酸の置換、欠失、付加または挿入を示す。本発明の文脈において、核酸の置換、欠失、付加および/または挿入に適用される「いくつかの」という用語は、3〜7個の、好ましくは3〜5個の、より好ましくは3〜4個の、さらにより好ましくは3個の核酸残基を意味しうる。
本発明の二本鎖分子に対する単離されたポリヌクレオチドがRNAまたはその誘導体からなる場合、ヌクレオチド配列において塩基「t」は「u」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、2つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび/または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合し得る。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。1つの好ましい態様において、このような二重鎖は10個のマッチあたりわずか1個のミスマッチしか含有しない。特に好ましい態様では、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。
JARID1B遺伝子については、二本鎖分子が6393ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、二本鎖分子は、500ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、または25ヌクレオチド長未満である。さらに、二本鎖分子のセンス鎖は19ヌクレオチドより長くてよく、好ましくは21ヌクレオチドより長く、より好ましくは約19〜25ヌクレオチド長である。したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
JARID1B遺伝子については、二本鎖分子が6393ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、二本鎖分子は、500ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、または25ヌクレオチド長未満である。さらに、二本鎖分子のセンス鎖は19ヌクレオチドより長くてよく、好ましくは21ヌクレオチドより長く、より好ましくは約19〜25ヌクレオチド長である。したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、19〜25ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。例えば、JARID1B遺伝子のmRNAの一部のセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖分子を、標準的な方法に従い、膀胱癌および肺癌の細胞株(例えば、膀胱癌については253J、253J−BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER、UMUC3、EJ28、RT4、T24、およびSW780;肺癌についてはSBC5、A549、H2170、LC319、およびRERF−LC−AI)におけるJARID1B mRNAの産生を低減させる能力に関してインビトロで試験した。さらに例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べて、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるJARID1B mRNAの低減は、例えば、実施例1「定量的リアルタイムRT−PCR」の項で言及されたJARID1B mRNAに対するプライマーを用いたRT−PCRにより検出することができる。インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてJARID1B mRNAの産生を低減する配列を、次に、細胞増殖に対するこれらの阻害効果に関して試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列を、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いてこれらのインビボでの能力に関して試験し、JARID1B mRNAの産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認することができる。
二本鎖分子は、該二本鎖分子を細胞に導入した場合にRISC複合体のmRNAにおける相同配列を同定するための案内として役立つ。同定された標的RNAはダイサーのヌクレアーゼ活性によって切断および分解され、これにより該二本鎖分子は最終的に、該RNAによってコードされるポリペプチドの産生(発現)を低下させるかまたは阻害する。したがって、本発明の二本鎖分子は、JARID1B遺伝子のmRNAとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成できる能力によって定義することができる。本明細書において、二本鎖分子から生成された一本鎖とハイブリダイズするmRNAの部分は「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と称される。本発明において、「標的配列」のヌクレオチド配列は、mRNAのRNA配列を用いてだけでなく、該mRNAから合成されたcDNAのDNA配列を用いても示すことができる。
本発明の二本鎖分子は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび/または非リン酸化ジエステル結合を含有し得る。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および/または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう(国際公開公報第03/070744号、国際公開公報第2005/045037号)。一態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、2'−O−メチルリボヌクレオチド(特に二本鎖分子のセンス鎖上で)、2'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、2'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基(universal base)」ヌクレオチド、5'−C−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基(inverted deoxybasic residue)の組み込み(US20060122137)が、非限定的に含まれる。
本発明の二本鎖分子は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび/または非リン酸化ジエステル結合を含有し得る。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および/または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう(国際公開公報第03/070744号、国際公開公報第2005/045037号)。一態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、2'−O−メチルリボヌクレオチド(特に二本鎖分子のセンス鎖上で)、2'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、2'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基(universal base)」ヌクレオチド、5'−C−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基(inverted deoxybasic residue)の組み込み(US20060122137)が、非限定的に含まれる。
別の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的化効率を増大させるために修飾を用いることができる。そのような修飾の例には、二本鎖分子の相補鎖2つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の3'末端または5'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および/または骨格修飾、2−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび2'−デオキシリボヌクレオチドが含まれる(国際公開公報第2004/029212号)が、これらに限定されるわけではない。別の態様において、標的mRNAにおけるおよび/または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる(国際公開公報第2005/044976号)。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを2−チオピリミジン、5−アルキニルピリミジン、5−メチルピリミジン、または5−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを7−デアザプリン、7−アルキルプリン、または7−アルケニルプリンに置換することができる。
別の好ましい態様において、本発明の二本鎖分子は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端のいずれかまたは両方において数個のヌクレオチドからなる3'オーバーハングを有する。該二本鎖分子が3'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、3'突出ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換してもよい(Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200)。好ましくは、本発明の二本鎖分子の3'オーバーハングは2個のデオキシリボヌクレオチド「t」からなる。例えば、3'オーバーハングを有する本発明の二本鎖分子の例示的な配列は、センス鎖がSEQ ID NO:19または28に、アンチセンス鎖がSEQ ID NO:20または29に示されており、これらは、SEQ ID NO:21または30に対応する標的配列と2個のデオキシリボヌクレオチド「t」からなる3'オーバーハング配列とを含む。さらなる詳細については、US20060234970などの公開文献が入手可能である。
本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
別の好ましい態様において、本発明の二本鎖分子は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端のいずれかまたは両方において数個のヌクレオチドからなる3'オーバーハングを有する。該二本鎖分子が3'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、3'突出ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換してもよい(Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200)。好ましくは、本発明の二本鎖分子の3'オーバーハングは2個のデオキシリボヌクレオチド「t」からなる。例えば、3'オーバーハングを有する本発明の二本鎖分子の例示的な配列は、センス鎖がSEQ ID NO:19または28に、アンチセンス鎖がSEQ ID NO:20または29に示されており、これらは、SEQ ID NO:21または30に対応する標的配列と2個のデオキシリボヌクレオチド「t」からなる3'オーバーハング配列とを含む。さらなる詳細については、US20060234970などの公開文献が入手可能である。
本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
さらに、本発明の二本鎖分子はDNAおよびRNAの両方を含み得る(例えばdsD/R−NAまたはshD/R−NA)。特に、DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはDNA−RNAキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。DNAとRNAとの混合、即ちDNA鎖(ポリヌクレオチド)とRNA鎖(ポリヌクレオチド)とからなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖(ポリヌクレオチド)の一方または両方にDNAおよびRNAの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成してもよい。
DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がDNAでありアンチセンス鎖がRNAであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはDNAであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはRNAである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がDNAおよびRNAからなってもよく、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がDNAおよびRNAからなってもよい。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのDNAを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がRNAであることが必要である。
DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がDNAでありアンチセンス鎖がRNAであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはDNAであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはRNAである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がDNAおよびRNAからなってもよく、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がDNAおよびRNAからなってもよい。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのDNAを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がRNAであることが必要である。
キメラ型二本鎖分子の好ましい例として、二本鎖分子の上流部分領域(即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域)はRNAである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の5'側(5'末端)およびアンチセンス鎖の3'側(3'末端)を示す。あるいは、センス鎖の5'末端に隣接する領域および/またはアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域を、上流部分領域と称する。即ち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、または、センス鎖の5'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域との両方がRNAからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖:
5'−[−−−DNA−−−]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5'
:アンチセンス鎖、
センス鎖:
5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5'
:アンチセンス鎖、および
センス鎖:
5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(−−−RNA−−−)−5'
:アンチセンス鎖。
センス鎖:
5'−[−−−DNA−−−]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5'
:アンチセンス鎖、
センス鎖:
5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5'
:アンチセンス鎖、および
センス鎖:
5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(−−−RNA−−−)−5'
:アンチセンス鎖。
好ましくは上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて9〜13ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例には、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域(センス鎖では5'側領域およびアンチセンス鎖では3'側領域)がRNAでありかつもう半分がDNAである、19〜21ヌクレオチド鎖長を有するものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がRNAである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる(US20050004064)。
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンRNA(shRNA)および、DNAとRNAからなるショートヘアピン(shD/R−NA)を形成してもよい。shRNAまたはshD/R−NAは、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、RNAの配列またはRNAとDNAの混合物の配列である。shRNAまたはshD/R−NAは、単一ポリヌクレオチド上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてdsRNAまたはdsD/R−NAとなり、続いてRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)と結合する。この複合体は、dsRNAまたはdsD/R−NAの標的配列に一致するmRNAと結合し、これを切断する。
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンRNA(shRNA)および、DNAとRNAからなるショートヘアピン(shD/R−NA)を形成してもよい。shRNAまたはshD/R−NAは、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、RNAの配列またはRNAとDNAの混合物の配列である。shRNAまたはshD/R−NAは、単一ポリヌクレオチド上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてdsRNAまたはdsD/R−NAとなり、続いてRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)と結合する。この複合体は、dsRNAまたはdsD/R−NAの標的配列に一致するmRNAと結合し、これを切断する。
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は介在一本鎖であり、[A']は[A]に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は例えば、SEQ ID NO:21または30に対応する配列であり得る。
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、[B]は介在一本鎖であり、[A']は[A]に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は例えば、SEQ ID NO:21または30に対応する配列であり得る。
本発明はこれらの例には限定されず、[A]における標的配列は、JARID1B遺伝子の発現を抑制する能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であってもよい。領域[A]は領域[A']とハイブリダイズし、領域[B]からなるループを形成する。介在一本鎖部分[B]、即ちループ配列は、好ましくは3〜23ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中から選択することができる(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。さらに、23個のヌクレオチドからなるループ配列は活性siRNAも提供する(Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26):
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG:Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10;および
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
ヘアピンループ構造を有する本発明の二本鎖分子の好ましい例を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACCおよびUUCAAGAGAの中から選択することができるが、本発明の好ましい例はこれらに限定されない:
CAGUGAAUGAGCUCCGGCA(SEQ ID NO:31)−[B]−UGCCGGAGCUCAUUCACUG(SEQ ID NO:32)
(標的配列SEQ ID NO:21)。
本発明の別の好ましい例は以下である:
GGAAUAUGGAGCUGACAUU(SEQ ID NO:33)−[B]−AAUGUCAGCUCCAUAUUCC(SEQ ID NO:34)
(標的配列SEQ ID NO:30)。
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG:Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10;および
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
ヘアピンループ構造を有する本発明の二本鎖分子の好ましい例を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACCおよびUUCAAGAGAの中から選択することができるが、本発明の好ましい例はこれらに限定されない:
CAGUGAAUGAGCUCCGGCA(SEQ ID NO:31)−[B]−UGCCGGAGCUCAUUCACUG(SEQ ID NO:32)
(標的配列SEQ ID NO:21)。
本発明の別の好ましい例は以下である:
GGAAUAUGGAGCUGACAUU(SEQ ID NO:33)−[B]−AAUGUCAGCUCCAUAUUCC(SEQ ID NO:34)
(標的配列SEQ ID NO:30)。
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、数個のヌクレオチドを3'オーバーハングとして標的配列のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端に付加することができる。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも2個、一般に2〜10個、好ましくは2〜3個である。ヌクレオチドの種類は限定されないが、好ましくは「u」または「t」である。付加されるヌクレオチドは二本鎖分子のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端で一本鎖を形成する。
二本鎖分子がヘアピンループ構造を有する場合、アンチセンス鎖の3'末端に3'オーバーハングが付加される。そのような二本鎖分子の好ましい例には以下が含まれるが、これらに限定されるわけではない:
CAGUGAAUGAGCUCCGGCA(SEQ ID NO:31)−[B]−UGCCGGAGCUCAUUCACUGTT(SEQ ID NO:20)
(標的配列SEQ ID NO:21)および
GGAAUAUGGAGCUGACAUU(SEQ ID NO:33)−[B]−AAUGUCAGCUCCAUAUUCCTT(SEQ ID NO:29)
(標的配列SEQ ID NO:30)。
二本鎖分子がヘアピンループ構造を有する場合、アンチセンス鎖の3'末端に3'オーバーハングが付加される。そのような二本鎖分子の好ましい例には以下が含まれるが、これらに限定されるわけではない:
CAGUGAAUGAGCUCCGGCA(SEQ ID NO:31)−[B]−UGCCGGAGCUCAUUCACUGTT(SEQ ID NO:20)
(標的配列SEQ ID NO:21)および
GGAAUAUGGAGCUGACAUU(SEQ ID NO:33)−[B]−AAUGUCAGCUCCAUAUUCCTT(SEQ ID NO:29)
(標的配列SEQ ID NO:30)。
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することが好ましい。化学合成法に従って、一本鎖のセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する特定の例には、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約3:7のモル比で、より好ましくは約4:6のモル比で、最も好ましくは実質的に等モル量(即ち約5:5のモル比)で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例には、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が含まれる。
その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、JARID1B配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。JARID1B遺伝子鋳型を、例えば低分子核RNA(snRNA)U6由来のRNAポリIII転写ユニットまたはヒトH1 RNAプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。
その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、JARID1B配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。JARID1B遺伝子鋳型を、例えば低分子核RNA(snRNA)U6由来のRNAポリIII転写ユニットまたはヒトH1 RNAプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。
本発明の二本鎖分子をコードするベクター:
本明細書に記載の1つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする核酸配列を含むことが好ましい。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、またはがんを治療するための有効成分として直接用いることができる。
本明細書に記載の1つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする核酸配列を含むことが好ましい。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、またはがんを治療するための有効成分として直接用いることができる。
あるいは本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を有するポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターを提供し、ここで該センス鎖核酸がSEQ ID NO:21または30のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターは、JARID1Bを発現している細胞に導入されると、該遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、本ポリヌクレオチドは、約19〜25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列に由来する連続したヌクレオチド)である。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する単一のヌクレオチド転写産物を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは、一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]はSEQ ID NO:21または30を含むヌクレオチド配列であり;[B]は約3〜約23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A']は[A]に相補的なヌクレオチド配列である。
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]はSEQ ID NO:21または30を含むヌクレオチド配列であり;[B]は約3〜約23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A']は[A]に相補的なヌクレオチド配列である。
本発明のベクターは、例えば、調節配列が(DNA分子の転写によって)両方の鎖の発現を可能にする様式で機能的にJARID1B配列に連結されるように、JARID1B配列を発現ベクターにクローニングすることによって作製することができる(Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5)。例えば、mRNAに対するアンチセンス鎖であるRNA分子が第1のプロモーター(例えばクローニングされるDNAの3'末端に隣接するプロモーター配列)によって転写され、該mRNAに対するセンス鎖であるRNA分子が第2のプロモーター(例えば該クローニングされるDNAの5'末端に隣接するプロモーター配列)によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする2つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造(例えばヘアピン)を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように包含されてもよい(例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい)。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第5,580,859号、同第5,589,466号、同第5,804,566号、同第5,739,118号、同第5,736,524号、同第5,679,647号、および国際公開公報第98/04720号を参照されたい。DNAベースの送達技術の例には、「ネイキッドDNA」、促進性(ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに媒介される)送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性の送達が挙含まれる(例えば米国特許第5,922,687号を参照されたい)。
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように包含されてもよい(例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい)。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第5,580,859号、同第5,589,466号、同第5,804,566号、同第5,739,118号、同第5,736,524号、同第5,679,647号、および国際公開公報第98/04720号を参照されたい。DNAベースの送達技術の例には、「ネイキッドDNA」、促進性(ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに媒介される)送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性の送達が挙含まれる(例えば米国特許第5,922,687号を参照されたい)。
本発明のベクターは、例えばウイルス性または細菌性のベクターを含む。発現ベクターの例には、牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる(例えば米国特許第4,722,848号を参照されたい)。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例にはカルメット・ゲラン桿菌(Bacille Calmette Guerin;BCG)が含まれる。BCGベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例には、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌(Salmonella typhi)ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が含まれる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
本発明の二本鎖分子を用いた、がん細胞増殖を阻害するかまたは低下させる方法およびがんを治療する方法:
本発明において、細胞増殖を阻害する能力に関して、dsRNAを試験した。dsRNAは、細胞増殖の抑制と同時に、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株における遺伝子発現を効果的にノックダウンした(図7)。
したがって本発明は、JARID1B遺伝子発現の阻害を介してJARID1B遺伝子の機能不全を誘導することによって、細胞増殖、すなわちがん細胞増殖を阻害するための方法を提供する。本発明によれば、JARID1B遺伝子の発現は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌において特異的に上昇していた(表3)。したがって、本発明の方法は、そのようながんにおける細胞増殖を阻害するのに有用である可能性がある。JARID1B遺伝子の発現は、JARID1B遺伝子を特異的に標的とする前述の本発明の二本鎖分子のいずれかによって、または該二本鎖分子のいずれかを発現することのできる本発明のベクターによって、阻害することができる。例えば、SEQ ID NO:21または30に相当する核酸配列を標的配列として含む二本鎖分子を、好ましくは、本方法のために用いることができる。
がん細胞の細胞増殖を阻害する本発明の二本鎖分子およびベクターのそのような能力により、上記がんを治療するための方法に関してこれらが使用可能であることが明らかに示される。したがって本発明は、JARID1B遺伝子に対する二本鎖分子または該分子を発現するベクターを投与することによって、がんを有する患者を治療するための方法を提供する。
本発明において、細胞増殖を阻害する能力に関して、dsRNAを試験した。dsRNAは、細胞増殖の抑制と同時に、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株における遺伝子発現を効果的にノックダウンした(図7)。
したがって本発明は、JARID1B遺伝子発現の阻害を介してJARID1B遺伝子の機能不全を誘導することによって、細胞増殖、すなわちがん細胞増殖を阻害するための方法を提供する。本発明によれば、JARID1B遺伝子の発現は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌において特異的に上昇していた(表3)。したがって、本発明の方法は、そのようながんにおける細胞増殖を阻害するのに有用である可能性がある。JARID1B遺伝子の発現は、JARID1B遺伝子を特異的に標的とする前述の本発明の二本鎖分子のいずれかによって、または該二本鎖分子のいずれかを発現することのできる本発明のベクターによって、阻害することができる。例えば、SEQ ID NO:21または30に相当する核酸配列を標的配列として含む二本鎖分子を、好ましくは、本方法のために用いることができる。
がん細胞の細胞増殖を阻害する本発明の二本鎖分子およびベクターのそのような能力により、上記がんを治療するための方法に関してこれらが使用可能であることが明らかに示される。したがって本発明は、JARID1B遺伝子に対する二本鎖分子または該分子を発現するベクターを投与することによって、がんを有する患者を治療するための方法を提供する。
JARID1B遺伝子を発現している細胞の増殖は、該細胞を、JARID1B遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはそれを含む組成物と接触させることによって阻害してもよい。該細胞を、トランスフェクション剤とさらに接触させてもよい。適切なトランスフェクション剤は当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、分子に曝露されていない細胞と比較して、細胞がより低い速度で増殖すること、またはその生存度が低下していることを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の方法により、例えば、MTT細胞増殖アッセイを用いて測定することができる。
JARID1B遺伝子を発現または過剰発現する限り、任意の種類の細胞の増殖を、本発明に従って抑制することができる。例示的な細胞には、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、特に膀胱癌および肺癌が含まれる。
したがって、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つ、該分子の少なくとも1つを発現する少なくとも1つのベクター、または該分子の少なくとも1つを含む少なくとも1つの組成物を投与することによって、JARID1Bに関連する疾患に罹患しているかまたはその発症リスクを有する患者を治療することができる。例えば、肺癌または膀胱癌の患者が本方法に従って治療されうる。がんの種類は、診断される特定の種類の腫瘍に応じた標準的な方法によって同定することができる。例えば肺癌は、肺癌マーカーとしてのCEA、CYFRAなどを用いて、または胸部X腺検査および/もしくは喀痰細胞診によって診断することができる。膀胱癌は、尿分析、X線分析または膀胱鏡検査によって診断することができる。より好ましくは、患者から採取した試料におけるJARID1Bの発現レベルをRT−PCRおよびイムノアッセイなどの従来の方法を用いて検出することにより、本発明の方法によって治療される患者を選択してもよい。好ましくは、本発明の治療の前に、当技術分野において公知の方法、例えば免疫組織化学分析またはRT−PCRを用いて、対象由来の生検標本をJARID1B遺伝子の過剰発現に関して確認する。
JARID1B遺伝子を発現または過剰発現する限り、任意の種類の細胞の増殖を、本発明に従って抑制することができる。例示的な細胞には、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌、特に膀胱癌および肺癌が含まれる。
したがって、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つ、該分子の少なくとも1つを発現する少なくとも1つのベクター、または該分子の少なくとも1つを含む少なくとも1つの組成物を投与することによって、JARID1Bに関連する疾患に罹患しているかまたはその発症リスクを有する患者を治療することができる。例えば、肺癌または膀胱癌の患者が本方法に従って治療されうる。がんの種類は、診断される特定の種類の腫瘍に応じた標準的な方法によって同定することができる。例えば肺癌は、肺癌マーカーとしてのCEA、CYFRAなどを用いて、または胸部X腺検査および/もしくは喀痰細胞診によって診断することができる。膀胱癌は、尿分析、X線分析または膀胱鏡検査によって診断することができる。より好ましくは、患者から採取した試料におけるJARID1Bの発現レベルをRT−PCRおよびイムノアッセイなどの従来の方法を用いて検出することにより、本発明の方法によって治療される患者を選択してもよい。好ましくは、本発明の治療の前に、当技術分野において公知の方法、例えば免疫組織化学分析またはRT−PCRを用いて、対象由来の生検標本をJARID1B遺伝子の過剰発現に関して確認する。
本発明の方法によると、JARID1B遺伝子に対する複数種の二本鎖分子(またはそれらを発現するベクターもしくはそれらを含む組成物)を投与に用いることができる。
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子に対応するmRNA転写産物との結合を達成するための形態で細胞内に直接導入してもよい。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするDNAを、ベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞内に導入するために、FuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)およびNucleofector(和光純薬工業株式会社)などのトランスフェクション増強剤を利用してもよい。
JARID1B遺伝子発現の低減または対象におけるがんのサイズ、有病率もしくは転移能の低下などの臨床的利点がもたらされる場合、治療は「有効」であると見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成を遅らせる若しくは妨害すること、またはがんの臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性(Efficaciousness)は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子に対応するmRNA転写産物との結合を達成するための形態で細胞内に直接導入してもよい。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするDNAを、ベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞内に導入するために、FuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)およびNucleofector(和光純薬工業株式会社)などのトランスフェクション増強剤を利用してもよい。
JARID1B遺伝子発現の低減または対象におけるがんのサイズ、有病率もしくは転移能の低下などの臨床的利点がもたらされる場合、治療は「有効」であると見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成を遅らせる若しくは妨害すること、またはがんの臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性(Efficaciousness)は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でJARID1B mRNAを分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的mRNAの分解を引き起こすと考えられる。したがって、標準的ながん治療に比べて、治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くに送達されねばならない二本鎖分子は、有意に少ない。
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態;投与経路;ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかなどの要素を考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、がん部位またはその近傍での細胞間濃度約1ナノモル(nM)〜約100nM、好ましくは約2nM〜約50nM、より好ましくは約2.5nM〜約10nMである。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要とされる正確な投与量は、当業者によって容易かつ規定通りに決定され得る。
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態;投与経路;ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかなどの要素を考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、がん部位またはその近傍での細胞間濃度約1ナノモル(nM)〜約100nM、好ましくは約2nM〜約50nM、より好ましくは約2.5nM〜約10nMである。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要とされる正確な投与量は、当業者によって容易かつ規定通りに決定され得る。
本発明の方法を用いて、JARID1B遺伝子を発現しているがん;例えば急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、および腎細胞癌、特に膀胱癌および肺癌の増殖または転移を阻害することができる。具体的には、SEQ ID NO:21または30に相当する標的配列を含む二本鎖分子が、肺癌の治療のために特に好ましい。
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、がんを治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんの治療またはがん転移の予防に現在利用されている治療法(例えば放射線療法、外科的手術、および化学療法剤を用いた治療)と組み合わせて投与することができる。
本方法において、二本鎖分子を、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬には、Mirus Transit TKO脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン(例えばポリリシン)またはリポソームが含まれる。好ましい送達試薬はリポソームである。
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、がんを治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんの治療またはがん転移の予防に現在利用されている治療法(例えば放射線療法、外科的手術、および化学療法剤を用いた治療)と組み合わせて投与することができる。
本方法において、二本鎖分子を、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬には、Mirus Transit TKO脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン(例えばポリリシン)またはリポソームが含まれる。好ましい送達試薬はリポソームである。
リポソームは、網膜組織または腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子の送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明の方法における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質および、コレステロールなどのステロールを含む。一般に脂質の選択は、所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要素を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、および同第5,019,369号(その開示全体が参照により本明細書に引用される)に記載されたような様々な方法が知られている。
一部の態様において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に多く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が、好ましい。
加えて、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾することができる。一つの態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,920,016号に記載されるように、マクロファージ−単球系(「MMS」)および網内系(「RES」)によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
加えて、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾することができる。一つの態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,920,016号に記載されるように、マクロファージ−単球系(「MMS」)および網内系(「RES」)によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性(leaky)」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、RESによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは分子量が約500ダルトン〜約40000ダルトン、より好ましくは約2000ダルトン〜約20000ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール(PPG)誘導体;例えばメトキシPEGまたはPPG、およびステアリン酸PEGまたはステアリン酸PPG;ポリアクリルアミドまたはポリN−ビニルピロリドンなどの、合成ポリマー;直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン;ポリアクリル酸;多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドGM1などのガングリオシドが含まれる。PEG、メトキシPEGもしくはメトキシPPGのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、PEGと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン;アミノ化多糖またはオリゴ糖(直鎖または分岐鎖);あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは分子量が約500ダルトン〜約40000ダルトン、より好ましくは約2000ダルトン〜約20000ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール(PPG)誘導体;例えばメトキシPEGまたはPPG、およびステアリン酸PEGまたはステアリン酸PPG;ポリアクリルアミドまたはポリN−ビニルピロリドンなどの、合成ポリマー;直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン;ポリアクリル酸;多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドGM1などのガングリオシドが含まれる。PEG、メトキシPEGもしくはメトキシPPGのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、PEGと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン;アミノ化多糖またはオリゴ糖(直鎖または分岐鎖);あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
好ましくは、オプソニン化阻害部分はPEG、PPG、またはその誘導体である。PEGまたはPEG誘導体で修飾されたリポソームは「PEG化リポソーム」と呼ばれることもある。
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか1つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、PEGのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Na(CN)BH3および溶媒混合物、例えば比率30:12のテトラヒドロフランと水を用いる60℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも1つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Mirus Transit LT1脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン(例えばポリリシン)またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野内である。
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか1つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、PEGのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Na(CN)BH3および溶媒混合物、例えば比率30:12のテトラヒドロフランと水を用いる60℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも1つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Mirus Transit LT1脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン(例えばポリリシン)またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野内である。
本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子をがん部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
好適な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。
好適な非経口投与経路には、静脈内投与(例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入);組織周囲および組織内注射(例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射);皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着(例えば浸透圧ポンプによる);例えばカテーテルもしくは他の留置装置(placement device)(例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント)によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用;ならびに吸入が含まれる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍で行われることが好ましい。
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。組織内への剤の直接注射は、がん部位またはその近傍が好ましい。がん部位またはその近傍の組織への剤の複数回注射が特に好ましい。
好適な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。
好適な非経口投与経路には、静脈内投与(例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入);組織周囲および組織内注射(例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射);皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着(例えば浸透圧ポンプによる);例えばカテーテルもしくは他の留置装置(placement device)(例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント)によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用;ならびに吸入が含まれる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍で行われることが好ましい。
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。組織内への剤の直接注射は、がん部位またはその近傍が好ましい。がん部位またはその近傍の組織への剤の複数回注射が特に好ましい。
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えばがん部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約3日〜約28日、より好ましくは約7日〜約10日の期間にわたり、1日1回または2回、対象に投与することができる。好ましい投与レジメンでは、二本鎖分子を7日間、1日1回、がん部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
本発明の二本鎖分子を含む組成物:
上記に加えて、本発明はまた、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つまたはそれをコードするベクターを含む医薬組成物も提供する。該医薬組成物は、JARID1B遺伝子の発現を阻害してその結果がん細胞増殖を抑制し、したがってこれらは、JARID1B遺伝子の過剰発現に関連するがん、例えば、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌を治療または予防するために有用であり得る。好ましくは、該医薬組成物を、膀胱癌および肺癌を治療または予防するために用いることができる。
JARID1B遺伝子を標的とする本発明の任意の二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードする本発明の任意のベクターを、本発明の組成物に関して用いることができる。二本鎖分子およびベクターの詳細については上述している。好ましくは、二本鎖分子は、SEQ ID NO:21または30に相当する核酸配列を標的配列として含む。
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で既知の技術に従って、対象に投与する前に医薬組成物として製剤化することが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用される「医薬組成物」とは、ヒトおよび獣医学的用途のための組成物を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載のように、当技術分野の技術の範囲内である。
上記に加えて、本発明はまた、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つまたはそれをコードするベクターを含む医薬組成物も提供する。該医薬組成物は、JARID1B遺伝子の発現を阻害してその結果がん細胞増殖を抑制し、したがってこれらは、JARID1B遺伝子の過剰発現に関連するがん、例えば、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌を治療または予防するために有用であり得る。好ましくは、該医薬組成物を、膀胱癌および肺癌を治療または予防するために用いることができる。
JARID1B遺伝子を標的とする本発明の任意の二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードする本発明の任意のベクターを、本発明の組成物に関して用いることができる。二本鎖分子およびベクターの詳細については上述している。好ましくは、二本鎖分子は、SEQ ID NO:21または30に相当する核酸配列を標的配列として含む。
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で既知の技術に従って、対象に投与する前に医薬組成物として製剤化することが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用される「医薬組成物」とは、ヒトおよび獣医学的用途のための組成物を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載のように、当技術分野の技術の範囲内である。
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合した、本発明の二本鎖分子の少なくとも1つまたはこれをコードするベクター(例えば0.1重量%〜90重量%)、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は例えば、水、緩衝水、生理食塩水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸等である。
本発明によれば、本組成物は複数種の二本鎖分子を含有してもよく、該分子のそれぞれが、JARID1B遺伝子に指向性を有し得る。
さらに本発明の組成物は、1つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有してもよい。例えば該ベクターは、1種類または2種類の二本鎖分子をコードしてもよい。代替的に本発明の組成物は複数種のベクターを含有してもよく、該ベクターのそれぞれが別々の二本鎖分子をコードする。
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明においてリポソーム内に含有され得る。リポソームの詳細については上述されている。
本発明によれば、本組成物は複数種の二本鎖分子を含有してもよく、該分子のそれぞれが、JARID1B遺伝子に指向性を有し得る。
さらに本発明の組成物は、1つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有してもよい。例えば該ベクターは、1種類または2種類の二本鎖分子をコードしてもよい。代替的に本発明の組成物は複数種のベクターを含有してもよく、該ベクターのそれぞれが別々の二本鎖分子をコードする。
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明においてリポソーム内に含有され得る。リポソームの詳細については上述されている。
本発明の医薬組成物はまた、従来の医薬賦形剤および/または添加剤も含み得る。好適な医薬賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液およびpH調整剤が含まれる。好適な添加剤には、生理学的に生体適合性がある緩衝液(例えば塩酸トロメタミン)、(例えばDTPAまたはDTPA−ビスアミドなどの)キレート剤(chelant)の添加またはカルシウムキレート錯体(例えばカルシウムDTPA、CaNaDTPA−ビスアミド)、あるいは任意でカルシウム塩またはナトリウム塩の添加(例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム)が含まれる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
固体組成物については、従来の非毒性固体担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記で列挙された任意の担体および賦形剤と、10%〜95%、好ましくは25%〜75%の1つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含むことができる。エアロゾル(吸入)投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソーム内に封入された、0.01重量%〜20重量%、好ましくは1重量%〜10重量%の1つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含むことができる。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達用のレシチンを含むことができる。
固体組成物については、従来の非毒性固体担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記で列挙された任意の担体および賦形剤と、10%〜95%、好ましくは25%〜75%の1つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含むことができる。エアロゾル(吸入)投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソーム内に封入された、0.01重量%〜20重量%、好ましくは1重量%〜10重量%の1つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含むことができる。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達用のレシチンを含むことができる。
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性な成分を含有してもよい。例えば本組成物は、がんを治療するのに従来使用される化学療法剤を含有してもよい。
別の態様において、本発明はまた、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがん、特に膀胱癌および肺癌を治療するための医薬組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、細胞におけるJARID1B遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、該分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む。細胞に導入された場合にJARID1Bの発現および細胞増殖を阻害する能力を有する限り、任意の本発明の二本鎖分子をこの使用のために提供することができる。SEQ ID NO:21または30に相当する標的配列を含む二本鎖分子は、本発明の使用に適している。
別の態様において、本発明はまた、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがん、特に膀胱癌および肺癌を治療するための医薬組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、細胞におけるJARID1B遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、該分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含む。細胞に導入された場合にJARID1Bの発現および細胞増殖を阻害する能力を有する限り、任意の本発明の二本鎖分子をこの使用のために提供することができる。SEQ ID NO:21または30に相当する標的配列を含む二本鎖分子は、本発明の使用に適している。
あるいは本発明は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんの治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、該方法またはプロセスは、薬学的または生理的に許容される担体を、有効成分としての本発明の二本鎖分子とともに製剤化する段階を含む。SEQ ID NO:21または30に相当する標的配列を含む二本鎖分子は、本発明の方法またはプロセスに適している。
別の態様において、本発明はまた、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんの治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、該方法またはプロセスは、有効成分を薬学的または生理的に許容される担体と混合する段階を含み、該有効成分は、本発明の二本鎖分子である。SEQ ID NO:21または30に相当する標的配列を含む二本鎖分子は、本発明の方法またはプロセスに適している。
別の態様において、本発明はまた、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんの治療用の医薬組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、該方法またはプロセスは、有効成分を薬学的または生理的に許容される担体と混合する段階を含み、該有効成分は、本発明の二本鎖分子である。SEQ ID NO:21または30に相当する標的配列を含む二本鎖分子は、本発明の方法またはプロセスに適している。
本発明において、JARID1Bを過剰発現しているがんを、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分によって治療することができる。
がんには、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌が非限定的に含まれる。したがって、有効成分を含む医薬組成物の投与の前に、治療されるがん性細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して増大しているか否かを確認することが好ましい。したがって、1つの態様において、本発明は、JARID1Bを(過剰)発現しているがんを治療するための方法を提供し、該方法は、
i)治療されるがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルを測定する段階;
ii)JARID1Bの該発現レベルを正常対照と比較する段階;ならびに
iii)正常対照と比較してJARID1Bを過剰発現しているがんを有する対象に対して、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を投与する段階
を含んでもよい。
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分によって治療することができる。
がんには、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌が非限定的に含まれる。したがって、有効成分を含む医薬組成物の投与の前に、治療されるがん性細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して増大しているか否かを確認することが好ましい。したがって、1つの態様において、本発明は、JARID1Bを(過剰)発現しているがんを治療するための方法を提供し、該方法は、
i)治療されるがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルを測定する段階;
ii)JARID1Bの該発現レベルを正常対照と比較する段階;ならびに
iii)正常対照と比較してJARID1Bを過剰発現しているがんを有する対象に対して、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を投与する段階
を含んでもよい。
あるいは本発明は、JARID1Bを過剰発現しているがんを有する対象への投与に用いるための、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む医薬組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター
によって治療されうるがんを有することが示される。
本発明のがん治療法を、以下により詳細に説明する。
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、および
(c)それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む医薬組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、
(a)本発明の二本鎖分子、
(b)それをコードするDNA、または
(c)それをコードするベクター
によって治療されうるがんを有することが示される。
本発明のがん治療法を、以下により詳細に説明する。
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが非限定的に含まれる。
本発明に従って、対象から採取したがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写(核酸)産物レベルとして測定することができる。例えば、JARID1BのmRNAを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法(例えばノーザンハイブリダイゼーション)によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。JARID1Bの発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、JARID1Bの配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、JARID1BのcDNAをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光物質、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、JARID1B(例えばSEQ ID NO:1)の転写産物を、プライマーを用いて増幅に基づく検出法(例えばRT−PCR)によって定量してもよい。そのようなプライマーは、該遺伝子についての入手可能な配列情報に基づいて調製してもよい。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、JARID1BのmRNAとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度のもとで)その標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Tmにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの50%が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、pH 7.0〜8.3において塩濃度がナトリウムイオン約1.0 M未満、典型的にはナトリウムイオン(または他の塩)約0.01〜1.0 Mであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば、10〜50ヌクレオチド)に関しては少なくとも約30℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、JARID1BのmRNAとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度のもとで)その標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Tmにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの50%が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、pH 7.0〜8.3において塩濃度がナトリウムイオン約1.0 M未満、典型的にはナトリウムイオン(または他の塩)約0.01〜1.0 Mであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば、10〜50ヌクレオチド)に関しては少なくとも約30℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、JARID1Bタンパク質(SEQ ID NO:2)の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾抗体がJARID1Bタンパク質との結合能を保持している限り、該断片または修飾(例えばキメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)を検出に使用することができる。該タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
JARID1B遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、JARID1Bタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を測定してもよい。即ちこの測定において、強い染色は、タンパク質の存在量/レベルの増大を示すと同時に、JARID1B遺伝子の高い発現レベルを示す。
JARID1B遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、JARID1Bタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を測定してもよい。即ちこの測定において、強い染色は、タンパク質の存在量/レベルの増大を示すと同時に、JARID1B遺伝子の高い発現レベルを示す。
がん細胞における標的遺伝子、例えばJARID1B遺伝子の発現レベルは、該標的遺伝子の対照レベル(例えば、正常細胞におけるレベル)よりも、例えば10%、25%、もしくは50%増大していれば;または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上に増大していれば、増大したと判定することができる。
疾患状態(がん性または非がん性)が既知である対象(複数可)から以前に採取して保存していた試料(複数可)を使用することによって、がん細胞と同時に対照レベルを決定してもよい。さらに、治療されるがんを有する臓器の非がん性領域から採取した正常細胞を正常対照として使用してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたJARID1B遺伝子の発現レベル(複数可)を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースに由来することもできる。その上、本発明の一局面によれば、生物試料におけるJARID1B遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。対象由来の生物試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるJARID1B遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±2S.D.または平均±3S.D.の範囲を標準値として使用することができる。
本発明の文脈において、非がん性であることが既知である生物試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、がん性生物試料から決定した場合、対照レベルは「がん性対照レベル」と称する。
JARID1B遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している/同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断される。
より具体的には、本発明は、(i)治療されるべきがんを対象が有する否かを診断し、かつ/または(ii)がん治療のための対象を選択する方法を提供し、該方法は、
a)治療されるべきがんを有することが疑われる対象から入手したがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルを測定する段階;
b)JARID1Bの該発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
c)JARID1Bの発現レベルが該正常対照レベルと比較して増大しているならば、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において対象が治療されるべきがんを有すると診断されたならば、該対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
あるいは、そのような方法は、
a)治療されるべきがんを有することが疑われる対象から入手したがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルを測定する段階;
b)JARID1Bの該発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
c)JARID1Bの発現レベルが該がん性対照レベルと類似しているかまたは同等であるならば、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において対象が治療されるべきがんを有すると診断されたならば、該対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
JARID1B遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似している/同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断される。
より具体的には、本発明は、(i)治療されるべきがんを対象が有する否かを診断し、かつ/または(ii)がん治療のための対象を選択する方法を提供し、該方法は、
a)治療されるべきがんを有することが疑われる対象から入手したがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルを測定する段階;
b)JARID1Bの該発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
c)JARID1Bの発現レベルが該正常対照レベルと比較して増大しているならば、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において対象が治療されるべきがんを有すると診断されたならば、該対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
あるいは、そのような方法は、
a)治療されるべきがんを有することが疑われる対象から入手したがん細胞または組織におけるJARID1Bの発現レベルを測定する段階;
b)JARID1Bの該発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
c)JARID1Bの発現レベルが該がん性対照レベルと類似しているかまたは同等であるならば、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において対象が治療されるべきがんを有すると診断されたならば、該対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
本発明はまた、本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターによって治療することのできるがんに罹患している対象を決定するためのキットも提供し、該キットはまた、がん治療の有効性の評価および/またはモニタリングにおいても有用であり得る。好ましくは、該がんには、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、または腎細胞癌が非限定的に含まれる。より具体的には、本キットは、対象由来のがん細胞におけるJARID1B遺伝子の発現を検出するための少なくとも一つの試薬を含むことが好ましく、該試薬は以下の群より選択されうる:
(a)JARID1B遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)JARID1Bタンパク質を検出するための試薬;および
(c)JARID1Bタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
JARID1B遺伝子のmRNAの検出に適した試薬には、JARID1B mRNAと特異的に結合するかそれを同定する核酸、例えばJARID1B mRNAの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、JARID1B mRNAに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、JARID1B mRNAを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、JARID1B mRNAを検出するための二種類以上の試薬を本キットに含めてもよい。
(a)JARID1B遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)JARID1Bタンパク質を検出するための試薬;および
(c)JARID1Bタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
JARID1B遺伝子のmRNAの検出に適した試薬には、JARID1B mRNAと特異的に結合するかそれを同定する核酸、例えばJARID1B mRNAの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、JARID1B mRNAに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、JARID1B mRNAを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化してもよい。さらに、JARID1B mRNAを検出するための二種類以上の試薬を本キットに含めてもよい。
一方、JARID1Bタンパク質の検出に適した試薬には、JARID1Bタンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾抗体がJARID1Bタンパク質に対する結合能を保持している限り、該断片または修飾(例えば、キメラ抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fvなど)も試薬として用いることができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、かつ本発明において、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するためにいかなる方法を用いてもよい。さらに、直接的な連結または間接的な標識技術を介して、抗体をシグナル生成分子で標識してもよい。標識、ならびに、抗体を標識するための方法、およびその標的に対する抗体の結合を検出するための方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために用いることができる。さらに、JARID1Bタンパク質を検出するための二種類以上の試薬を本キットに含めてもよい。
キットは、前述の試薬を二種類以上含んでもよい。例えば、がんを有さない対象または癌に罹患している対象から採取した組織試料は、有用な対照試薬として役立ちうる。本発明のキットはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび、使用説明書を載せた添付文書(例えば、書面、テープ、CD−ROMなど)を含む、商業的な観点および利用者の観点から望まれる他の材料を含んでもよい。これらの試薬などは、ラベルを付けた容器中で保持することができる。適した容器には、瓶、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。
キットは、前述の試薬を二種類以上含んでもよい。例えば、がんを有さない対象または癌に罹患している対象から採取した組織試料は、有用な対照試薬として役立ちうる。本発明のキットはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび、使用説明書を載せた添付文書(例えば、書面、テープ、CD−ROMなど)を含む、商業的な観点および利用者の観点から望まれる他の材料を含んでもよい。これらの試薬などは、ラベルを付けた容器中で保持することができる。適した容器には、瓶、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。
本発明の1つの態様において、試薬がJARID1B mRNAに対するプローブである場合には、少なくとも1つの検出部位を形成するために、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックス上に固定化してもよい。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが核酸(プローブ)を含む複数の部位を含んでもよい。試験ストリップはまた、陰性対照および/または陽性対照用の部位を含んでもよい。あるいは、対照部位を、試験ストリップから隔てられたストリップ上に配置してもよい。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含んでもよい、すなわち、第1の検出部位ではより多い量であり、以後の部位ではそれより少ない量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するJARID1B mRNA量の定量的指標が得られる。検出部位は好適に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、試験ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはJARID1B標準試料を含んでもよい。本発明の陽性対照試料は、JARID1B陽性試料を採取した後、それらのJARID1Bレベルを分析することによって、調製され得る。または、精製されたJARID1Bタンパク質またはポリヌクレオチドを、JARID1Bを発現しない細胞に添加して、陽性試料またはJARID1B標準試料を形成させてもよい。本発明において、精製されたJARID1Bは組換えタンパク質であってもよい。陽性対照試料のJARID1Bレベルは、例えばカットオフ値を上回ってもよい。
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはJARID1B標準試料を含んでもよい。本発明の陽性対照試料は、JARID1B陽性試料を採取した後、それらのJARID1Bレベルを分析することによって、調製され得る。または、精製されたJARID1Bタンパク質またはポリヌクレオチドを、JARID1Bを発現しない細胞に添加して、陽性試料またはJARID1B標準試料を形成させてもよい。本発明において、精製されたJARID1Bは組換えタンパク質であってもよい。陽性対照試料のJARID1Bレベルは、例えばカットオフ値を上回ってもよい。
抗がん化合物のスクリーニング:
本発明は、がん細胞、例えば急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌の増殖を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本スクリーニング方法は、JARID1B遺伝子またはタンパク質を標的とすることによって実施できる。本方法によってスクリーニングされた化合物は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんを治療するための優れた候補化合物であり得る。特に、JARID1B遺伝子発現の阻害は膀胱癌および肺癌における細胞増殖の抑制を導くことが確認された(図7)。したがって、本方法によってスクリーニングされた化合物は好ましくは、膀胱癌および肺癌を治療するために用いることができる。
本発明は、がん細胞、例えば急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌の増殖を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本スクリーニング方法は、JARID1B遺伝子またはタンパク質を標的とすることによって実施できる。本方法によってスクリーニングされた化合物は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌などのがんを治療するための優れた候補化合物であり得る。特に、JARID1B遺伝子発現の阻害は膀胱癌および肺癌における細胞増殖の抑制を導くことが確認された(図7)。したがって、本方法によってスクリーニングされた化合物は好ましくは、膀胱癌および肺癌を治療するために用いることができる。
スクリーニング用の剤または化合物:
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される剤または化合物は、複数の化合物を含む任意の化合物または組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤または試験化合物は、単一の化合物であってもよく、化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合、該化合物を連続的にまたは同時に接触させることができる。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験剤または試験化合物、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物(核酸構築物、例えばアンチセンスRNA、siRNA、リボザイム、およびアプタマー等または抗体を含む)、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験剤または試験化合物は、(1)生物学的ライブラリ法、(2)空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、(3)逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、(4)「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および(5)アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の4つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67)。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51)。化合物のライブラリは、溶液中(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい)、または、ビーズ(Lam, Nature 1991, 354: 82-4)、チップ(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、および同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9)、もしくはファージ(Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第2002103360号)の表面に提供され得る。
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される剤または化合物は、複数の化合物を含む任意の化合物または組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤または試験化合物は、単一の化合物であってもよく、化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合、該化合物を連続的にまたは同時に接触させることができる。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験剤または試験化合物、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物(核酸構築物、例えばアンチセンスRNA、siRNA、リボザイム、およびアプタマー等または抗体を含む)、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験剤または試験化合物は、(1)生物学的ライブラリ法、(2)空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、(3)逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、(4)「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および(5)アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の4つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67)。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51)。化合物のライブラリは、溶液中(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい)、または、ビーズ(Lam, Nature 1991, 354: 82-4)、チップ(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、および同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9)、もしくはファージ(Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第2002103360号)の表面に提供され得る。
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた化合物の構造の一部が付加、欠失、および/または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる剤または化合物に含まれる。
さらに、スクリーニングした試験剤または試験化合物がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするDNAを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴDNAをプローブとして調製し、該プローブを用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするDNAを得ることができる。得られたDNAを、がんを治療または予防するための候補である試験剤の調製における有用性について確認する。
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤または試験化合物とは、JARID1Bタンパク質または元のタンパク質の生物活性が欠如したその部分ペプチドにインビボで特異的に結合する、抗体でもあり得る。
試験剤または試験化合物のライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験剤の同定およびそのような剤または化合物のライブラリの構築についてのさらなるガイダンスを提供する。
さらに、スクリーニングした試験剤または試験化合物がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするDNAを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴDNAをプローブとして調製し、該プローブを用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするDNAを得ることができる。得られたDNAを、がんを治療または予防するための候補である試験剤の調製における有用性について確認する。
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤または試験化合物とは、JARID1Bタンパク質または元のタンパク質の生物活性が欠如したその部分ペプチドにインビボで特異的に結合する、抗体でもあり得る。
試験剤または試験化合物のライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験剤の同定およびそのような剤または化合物のライブラリの構築についてのさらなるガイダンスを提供する。
(i)分子モデリング:
試験剤または試験化合物のライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である化合物の分子構造、および/または、阻害される標的分子の、すなわちJARID1Bタンパク質の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験剤または試験化合物を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤とJARID1Bタンパク質との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のX線結晶解析またはNMRイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該化合物および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−化合物間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型(computationally intensive)コンピュータが必要である。
試験剤または試験化合物のライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である化合物の分子構造、および/または、阻害される標的分子の、すなわちJARID1Bタンパク質の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験剤または試験化合物を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤とJARID1Bタンパク質との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のX線結晶解析またはNMRイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該化合物および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−化合物間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型(computationally intensive)コンピュータが必要である。
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、CHARMmプログラムおよびQUANTAプログラム(Polygen Corporation,Waltham,Mass)が含まれる。CHARMmは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。QUANTAは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。QUANTAにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。
多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.(Pasadena,Calif.)、Allelix, Inc(Mississauga,Ontario,Canada)、およびHypercube, Inc.(Cambridge,Ontario)等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
後述のように、推定インヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターまたは「試験剤」のライブラリを、本方法を用いてスクリーニングし、がんを治療または予防する試験剤または試験化合物を同定してもよい。
多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.(Pasadena,Calif.)、Allelix, Inc(Mississauga,Ontario,Canada)、およびHypercube, Inc.(Cambridge,Ontario)等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
後述のように、推定インヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターまたは「試験剤」のライブラリを、本方法を用いてスクリーニングし、がんを治療または予防する試験剤または試験化合物を同定してもよい。
(ii)コンビナトリアル化学合成:
試験剤または試験化合物のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を必要とする合理的薬物設計プログラムの一部として作製してもよい。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが6アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは6アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成してもよい。コンビナトリアル化学ライブラリには、ペプチドライブラリ(例えば米国特許第5,010,175号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい)が非限定的に含まれる。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド(例えば国際公開公報第91/19735号)、コード化ペプチド(例えば国際公開公報第93/20242号)、ランダムバイオオリゴマー(random bio-oligomer)(例えば国際公開公報第92/00091号)、ベンゾジアゼピン(例えば米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド等のダイバーソマー(diversomer)(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13)、ビニローグ(vinylogous)ポリペプチド(Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568)、グルコース骨格を有する非ペプチド性(nonpeptidal)ペプチド模倣体(Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8)、低分子化合物ライブラリの類似有機合成(Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661)、オリゴカルバメート(oligocarbamate)(Cho et al., Science 1993, 261: 1303)、および/またはペプチジルホスホネート(peptidylphosphonate)(Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658)、核酸ライブラリ(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリ(例えば米国特許第5,539,083号を参照されたい)、抗体ライブラリ(例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願PCT/US96/10287号を参照されたい)、糖質ライブラリ(例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第5,593,853号を参照されたい)、ならびに有機低分子ライブラリ(例えば、ベンゾジアゼピン(Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.)、イソプレノイド(米国特許第5,569,588号)、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン(metathiazanone)(米国特許第5,549,974号)、ピロリジン(米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号)、モルホリノ化合物(米国特許第5,506,337号)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)等を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
試験剤または試験化合物のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を必要とする合理的薬物設計プログラムの一部として作製してもよい。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが6アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは6アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成してもよい。コンビナトリアル化学ライブラリには、ペプチドライブラリ(例えば米国特許第5,010,175号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい)が非限定的に含まれる。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド(例えば国際公開公報第91/19735号)、コード化ペプチド(例えば国際公開公報第93/20242号)、ランダムバイオオリゴマー(random bio-oligomer)(例えば国際公開公報第92/00091号)、ベンゾジアゼピン(例えば米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド等のダイバーソマー(diversomer)(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13)、ビニローグ(vinylogous)ポリペプチド(Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568)、グルコース骨格を有する非ペプチド性(nonpeptidal)ペプチド模倣体(Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8)、低分子化合物ライブラリの類似有機合成(Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661)、オリゴカルバメート(oligocarbamate)(Cho et al., Science 1993, 261: 1303)、および/またはペプチジルホスホネート(peptidylphosphonate)(Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658)、核酸ライブラリ(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリ(例えば米国特許第5,539,083号を参照されたい)、抗体ライブラリ(例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願PCT/US96/10287号を参照されたい)、糖質ライブラリ(例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第5,593,853号を参照されたい)、ならびに有機低分子ライブラリ(例えば、ベンゾジアゼピン(Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.)、イソプレノイド(米国特許第5,569,588号)、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン(metathiazanone)(米国特許第5,549,974号)、ピロリジン(米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号)、モルホリノ化合物(米国特許第5,506,337号)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)等を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
(iii)ファージディスプレイ:
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる(例えば106個〜108個の化学物質)。第2のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74)、およびFodor et al.の方法(Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten(米国特許第4,631,211号)、およびRutter et al.(米国特許第5,010,175号)は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている(例えば、357 MPS、390 MPS(Advanced Chem Tech,Louisville KY)、Symphony(Rainin,Woburn,MA)、433A(Applied Biosystems,Foster City,CA)、9050 Plus(Millipore,Bedford,MA)を参照されたい)。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている(例えば、ComGenex(Princeton,N.J.)、Tripos, Inc.(St. Louis,MO)、3D Pharmaceuticals(Exton,PA)、Martek Biosciences(Columbia,MD)等を参照されたい)。
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる(例えば106個〜108個の化学物質)。第2のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74)、およびFodor et al.の方法(Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten(米国特許第4,631,211号)、およびRutter et al.(米国特許第5,010,175号)は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている(例えば、357 MPS、390 MPS(Advanced Chem Tech,Louisville KY)、Symphony(Rainin,Woburn,MA)、433A(Applied Biosystems,Foster City,CA)、9050 Plus(Millipore,Bedford,MA)を参照されたい)。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている(例えば、ComGenex(Princeton,N.J.)、Tripos, Inc.(St. Louis,MO)、3D Pharmaceuticals(Exton,PA)、Martek Biosciences(Columbia,MD)等を参照されたい)。
JARID1Bに結合する剤または化合物のスクリーニング:
本発明において、正常器官での発現と比べて、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、および腎細胞癌ではJARID1Bの過剰発現が検出された(表3)。したがって本発明は、JARID1Bタンパク質に結合する剤をスクリーニングする方法を提供する。そのようながんにおけるJARID1B遺伝子の発現により、JARID1Bタンパク質に結合する剤または化合物は、がん細胞の増殖を抑制することおよびしたがってがんを治療または予防するのに有用であることが予想される。したがって本発明はまた、JARID1Bポリペプチドを用いて、がん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングする方法、および肺癌を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。具体的には、このスクリーニング法の1つの態様は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子に由来するJARID1Bポリペプチドと接触させる段階;
(b)該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合活性を検出する段階;および
(c)該ポリペプチドに結合する試験剤または試験化合物を候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはJARID1B関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を、評価することができる。したがって本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、および、がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明において、正常器官での発現と比べて、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、および腎細胞癌ではJARID1Bの過剰発現が検出された(表3)。したがって本発明は、JARID1Bタンパク質に結合する剤をスクリーニングする方法を提供する。そのようながんにおけるJARID1B遺伝子の発現により、JARID1Bタンパク質に結合する剤または化合物は、がん細胞の増殖を抑制することおよびしたがってがんを治療または予防するのに有用であることが予想される。したがって本発明はまた、JARID1Bポリペプチドを用いて、がん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングする方法、および肺癌を治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。具体的には、このスクリーニング法の1つの態様は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子に由来するJARID1Bポリペプチドと接触させる段階;
(b)該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合活性を検出する段階;および
(c)該ポリペプチドに結合する試験剤または試験化合物を候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはJARID1B関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を、評価することができる。したがって本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、および、がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
より具体的には、本方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子に由来するJARID1Bポリペプチドと;
(b)該ポリペプチドと該試験または試験化合物との間の結合レベルを検出する段階;
(c)(b)の結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出した結合レベルと比較する段階;および
(d)(c)の結合レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
本発明において、治療効果は、JARID1Bポリペプチドの結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物がJARID1Bポリペプチドに結合する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。代替的に、試験剤または試験化合物がJARID1Bポリペプチドに結合しない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子に由来するJARID1Bポリペプチドと;
(b)該ポリペプチドと該試験または試験化合物との間の結合レベルを検出する段階;
(c)(b)の結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出した結合レベルと比較する段階;および
(d)(c)の結合レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
本発明において、治療効果は、JARID1Bポリペプチドの結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物がJARID1Bポリペプチドに結合する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。代替的に、試験剤または試験化合物がJARID1Bポリペプチドに結合しない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法に使用されるJARID1Bポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパクもしくはその部分ペプチドであり得る。試験剤または試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
例えば、JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは例えば、特に以下の様式の、免疫沈降法によって実施することができる。JARID1Bポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばpSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGSおよびpCD8に挿入することによって、該遺伝子を宿主(例えば、動物)細胞等において発現させる。
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばSV40初期プロモーター(Rigby in Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141(1982))、EF−αプロモーター(Kim et al., Gene 91: 217-23(1990))、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 108: 193(1991))、RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987))、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988))、CMV前初期プロモーター(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987))、SV40後期プロモーター(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982))、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989))、HSV TKプロモーター等が含まれる。
本発明のスクリーニング方法に使用されるJARID1Bポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパクもしくはその部分ペプチドであり得る。試験剤または試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
例えば、JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは例えば、特に以下の様式の、免疫沈降法によって実施することができる。JARID1Bポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばpSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGSおよびpCD8に挿入することによって、該遺伝子を宿主(例えば、動物)細胞等において発現させる。
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばSV40初期プロモーター(Rigby in Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141(1982))、EF−αプロモーター(Kim et al., Gene 91: 217-23(1990))、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 108: 193(1991))、RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987))、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988))、CMV前初期プロモーター(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987))、SV40後期プロモーター(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982))、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989))、HSV TKプロモーター等が含まれる。
外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法(Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987))、リン酸カルシウム法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987))、DEAEデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984))、リポフェクチン法(Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993))等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。
JARID1B遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を該ポリペプチドのN末端またはC末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってJARID1Bポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜12アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン(Hisタグ)、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc−myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV−GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSVタグ)、Eタグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)等のエピトープ、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、JARID1Bポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。
JARID1B遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を該ポリペプチドのN末端またはC末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってJARID1Bポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜12アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン(Hisタグ)、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc−myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV−GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSVタグ)、Eタグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)等のエピトープ、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、JARID1Bポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、JARID1Bポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、JARID1Bポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもできる。抗体がマウスIgG抗体である場合、例えばプロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。JARID1B遺伝子によってコードされるポリペプチドを、GSTなどのエピトープとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、JARID1Bポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース4Bを用いて形成することができる。
免疫沈降は、例えば文献(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
SDS−PAGEは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。JARID1Bポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、放射性同位体、35S−メチオニンまたは35S−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
免疫沈降は、例えば文献(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
SDS−PAGEは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。JARID1Bポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、放射性同位体、35S−メチオニンまたは35S−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
JARID1Bポリペプチドを用いて該ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウェスト−ウェスタンブロット解析(Skolnik et al., Cell 65: 83-90(1991))を使用することができる。具体的には、ファージベクター(例えばZAP)を用いて、JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞からcDNAライブラリを調製する段階、LB−アガロース上で該タンパク質を発現させる段階、発現した該タンパク質をフィルター上に固定する段階、精製および標識したJARID1Bポリペプチドを上記のフィルターと反応させる段階、ならびに、標識に従って、JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを検出することによって、JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、またはJARID1Bポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはJARID1Bポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド(例えばGST)を利用することによって、標識してもよい。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用してもよい。
あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい(「MATCHMAKER Two−Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two−Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one−Hybrid system」(Clontech)、「HybriZAP Two−Hybrid Vector System」(Stratagene)、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612(1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92(1994)」を参照されたい)。
ツーハイブリッドシステムにおいて、JARID1Bポリペプチドを、SRF結合領域またはGAL4結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらVP16またはGAL4の転写活性化領域と融合するように、cDNAライブラリを調製する。次に、該cDNAライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン(JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる)から、該ライブラリに由来するcDNAを単離する。上記で単離されたcDNAを大腸菌に導入する段階および該タンパク質を発現させる段階によって、該cDNAによってコードされたタンパク質を調製することができる。HIS3遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい(「MATCHMAKER Two−Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two−Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one−Hybrid system」(Clontech)、「HybriZAP Two−Hybrid Vector System」(Stratagene)、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612(1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92(1994)」を参照されたい)。
ツーハイブリッドシステムにおいて、JARID1Bポリペプチドを、SRF結合領域またはGAL4結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらVP16またはGAL4の転写活性化領域と融合するように、cDNAライブラリを調製する。次に、該cDNAライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン(JARID1Bポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる)から、該ライブラリに由来するcDNAを単離する。上記で単離されたcDNAを大腸菌に導入する段階および該タンパク質を発現させる段階によって、該cDNAによってコードされたタンパク質を調製することができる。HIS3遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
JARID1B遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する剤または化合物を、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、JARID1Bポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化してもよく、JARID1Bポリペプチドと結合可能なタンパク質を含有する試験剤または試験化合物を該カラムにアプライする。本明細書における試験剤または試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験剤をロードした後、カラムを洗浄し、JARID1Bポリペプチドと結合した剤を調製することができる。試験剤または試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴDNAを合成し、プローブとして該オリゴDNAを用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするDNAを得る。
表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサが、本発明において結合した剤を検出または定量するための手段として使用され得る。そのようなバイオセンサを使用する場合、JARID1Bポリペプチドと試験剤との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えばBIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreなどのバイオセンサを用いて、JARID1Bポリペプチドと試験剤または試験化合物との結合を評価することが可能である。
表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサが、本発明において結合した剤を検出または定量するための手段として使用され得る。そのようなバイオセンサを使用する場合、JARID1Bポリペプチドと試験剤との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えばBIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreなどのバイオセンサを用いて、JARID1Bポリペプチドと試験剤または試験化合物との結合を評価することが可能である。
JARID1Bタンパク質と結合するタンパク質だけでなく化学物質(アゴニストおよびアンタゴニストを含む)も単離するための、固定化JARID1Bポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンクまたはランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法(Wrighton et al., Science 273: 458-64(1996)、Verdine, Nature 384: 11-13(1996)、Hogan, Nature 384: 17-9(1996))は、当業者に既知である。
本発明において、JARID1Bの発現を抑制することにより、細胞増殖が低下することが明示される。したがって、JARID1Bポリペプチドと結合する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
本発明において、JARID1Bの発現を抑制することにより、細胞増殖が低下することが明示される。したがって、JARID1Bポリペプチドと結合する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
JARID1Bの生物活性を抑制する剤または化合物のスクリーニング:
JARID1Bタンパク質はヒストンH3脱メチル化活性を有しており(Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12)、本発明によれば、該タンパク質は、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現を促進する活性(図9)、細胞増殖を促進する活性(図7C)または抗アポトーシス活性(図7E)を有する。これらの生物活性を利用して、本発明は、JARID1B遺伝子の過剰発現に関連するがん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングするための方法、および、そのようながんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。したがって本発明は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子に由来するポリペプチドと接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;および
(c)該生物活性を、試験剤または試験化合物の非存在下における生物活性と比較して抑制する該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む方法を提供する。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはJARID1B関連がんを治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、JARID1Bポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補剤もしくは候補化合物、またはJARID1B関連がんを治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1Bポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階;および
b)段階(a)のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階;および
c)b)の生物活性を試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
JARID1Bタンパク質はヒストンH3脱メチル化活性を有しており(Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12)、本発明によれば、該タンパク質は、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現を促進する活性(図9)、細胞増殖を促進する活性(図7C)または抗アポトーシス活性(図7E)を有する。これらの生物活性を利用して、本発明は、JARID1B遺伝子の過剰発現に関連するがん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングするための方法、および、そのようながんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法を提供する。したがって本発明は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子に由来するポリペプチドと接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;および
(c)該生物活性を、試験剤または試験化合物の非存在下における生物活性と比較して抑制する該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む方法を提供する。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはJARID1B関連がんを治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、JARID1Bポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補剤もしくは候補化合物、またはJARID1B関連がんを治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1Bポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階;および
b)段階(a)のポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する段階;および
c)b)の生物活性を試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
本発明において、治療効果はJARID1Bポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、JARID1Bポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制または阻害する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、JARID1Bポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
本発明の方法を、以下でより詳細に説明する。
JARID1Bタンパク質の生物活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングのために用いることができる。そのような生物活性には、ヒストンH3脱メチル化活性、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現を促進する活性、細胞増殖活性ならびに抗アポトーシス活性が含まれる。例えば、JARID1Bタンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に等価なポリペプチドを用いることもできる。そのようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現されうる。
本発明の方法を、以下でより詳細に説明する。
JARID1Bタンパク質の生物活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングのために用いることができる。そのような生物活性には、ヒストンH3脱メチル化活性、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現を促進する活性、細胞増殖活性ならびに抗アポトーシス活性が含まれる。例えば、JARID1Bタンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に等価なポリペプチドを用いることもできる。そのようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現されうる。
別の局面において、本発明はまた、「JARID1Bに結合する剤または化合物のスクリーニング」に記載された方法に続くスクリーニング方法も提供し、該方法は、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子に由来するJARID1Bポリペプチドと接触させる段階;
b)該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合を検出する段階;
c)該ポリペプチドと結合する試験剤または試験化合物を選択する段階;
d)段階c)において選択された試験剤または試験化合物を、JARID1Bポリペプチドと接触させる段階;
e)該ポリペプチドの生物活性を、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較する段階;および
f)該ポリペプチドの生物活性を抑制する試験剤または試験化合物を、がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
このスクリーニングにより単離された剤または化合物は、JARID1B遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、JARID1B遺伝子の発現を減少させるまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された剤または化合物は、JARID1Bポリペプチドと分子(DNAおよびタンパク質を含む)とのインビボでの相互作用を阻害する剤または化合物の候補である。
本発明の方法において検出されるべき生物活性が細胞増殖である場合には、例えば、JARID1Bポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養して、細胞増殖速度を決定、細胞周期等を測定、および生存細胞またはコロニー形成活性を測定することによって、それを検出することができる。JARID1Bを発現した細胞の増殖速度を減少させる化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する。
a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子に由来するJARID1Bポリペプチドと接触させる段階;
b)該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合を検出する段階;
c)該ポリペプチドと結合する試験剤または試験化合物を選択する段階;
d)段階c)において選択された試験剤または試験化合物を、JARID1Bポリペプチドと接触させる段階;
e)該ポリペプチドの生物活性を、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較する段階;および
f)該ポリペプチドの生物活性を抑制する試験剤または試験化合物を、がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
このスクリーニングにより単離された剤または化合物は、JARID1B遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、JARID1B遺伝子の発現を減少させるまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された剤または化合物は、JARID1Bポリペプチドと分子(DNAおよびタンパク質を含む)とのインビボでの相互作用を阻害する剤または化合物の候補である。
本発明の方法において検出されるべき生物活性が細胞増殖である場合には、例えば、JARID1Bポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養して、細胞増殖速度を決定、細胞周期等を測定、および生存細胞またはコロニー形成活性を測定することによって、それを検出することができる。JARID1Bを発現した細胞の増殖速度を減少させる化合物を、がんを治療または予防するための候補化合物として選択する。
より具体的には、本方法は、
(a)試験化合物を、JARID1Bを過剰発現している細胞と接触させる段階;
(b)細胞増殖活性を測定する段階;および
(c)試験化合物の非存在下における細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を減少させる該試験化合物を選択する段階
を含む。
好ましい態様において、本発明の方法は以下の段階をさらに含み得る:
(d)JARID1Bをほとんどまたは全く発現しない細胞に対して全く影響を与えない試験化合物を選択する段階
を含む。
本方法において検出される生物活性が抗アポトーシス活性である場合、さまざまな市販のキットを用いるサブG1細胞数の測定、TUNEL法またはLM−PCR法などの当業者によって行われる通常の方法により、決定することができる。例えば、サブG1細胞数は、FACSを用いることによって決定することができる。またアポトーシスは、付属のマニュアルに従ったApotag Direct(oncor)を用いるTUNEL法またはApoAlert LM−PCRラダーアッセイキット(Clontech)を用いるLM−PCRによって調べることもできる。
(a)試験化合物を、JARID1Bを過剰発現している細胞と接触させる段階;
(b)細胞増殖活性を測定する段階;および
(c)試験化合物の非存在下における細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を減少させる該試験化合物を選択する段階
を含む。
好ましい態様において、本発明の方法は以下の段階をさらに含み得る:
(d)JARID1Bをほとんどまたは全く発現しない細胞に対して全く影響を与えない試験化合物を選択する段階
を含む。
本方法において検出される生物活性が抗アポトーシス活性である場合、さまざまな市販のキットを用いるサブG1細胞数の測定、TUNEL法またはLM−PCR法などの当業者によって行われる通常の方法により、決定することができる。例えば、サブG1細胞数は、FACSを用いることによって決定することができる。またアポトーシスは、付属のマニュアルに従ったApotag Direct(oncor)を用いるTUNEL法またはApoAlert LM−PCRラダーアッセイキット(Clontech)を用いるLM−PCRによって調べることもできる。
本発明の方法において検出される生物活性が脱メチル化活性である場合には、JARID1Bポリペプチドを、基質(例えば、トリ−またはジ−メチル化リシン4を含むヒストンH3)と、該基質の脱メチル化に適した条件下で接触させて、基質の脱メチル化レベルを検出することによって、測定することができる。
より具体的には、本方法は、
(a)JARID1Bポリペプチドを、脱メチル化される基質と、試験剤または試験化合物の存在下、該基質の脱メチル化を可能にする条件下で接触させる段階;
(b)該基質のメチル化レベルを検出する段階;および
(c)該基質のメチル化レベルを、試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して増大させる試験剤または試験化合物を、候補剤として選択する段階
を含む。
好ましくは、JARID1Bポリペプチドによって脱メチル化される基質は、ヒストンH3または、ヒストンH3のトリメチル化リシン4もしくはジメチル化リシン4を含むその断片である。
より具体的には、本方法は、
(a)JARID1Bポリペプチドを、脱メチル化される基質と、試験剤または試験化合物の存在下、該基質の脱メチル化を可能にする条件下で接触させる段階;
(b)該基質のメチル化レベルを検出する段階;および
(c)該基質のメチル化レベルを、試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して増大させる試験剤または試験化合物を、候補剤として選択する段階
を含む。
好ましくは、JARID1Bポリペプチドによって脱メチル化される基質は、ヒストンH3または、ヒストンH3のトリメチル化リシン4もしくはジメチル化リシン4を含むその断片である。
本発明において、JARID1Bポリペプチドの脱メチル化活性は、当技術分野において公知の方法によって測定することができる。例えば、JARID1Bポリペプチドを、標識されたメチル化部位を有する基質とともに、脱メチル化に適した条件下でインキュベーションすることができる。例えば、第4のアミノ酸残基にトリ−もしくはジ−[メチル−14C]−リシン、またはトリ−もしくはジ−[メチル−3H]−リシンを有するヒストンH3ペプチドを、脱メチル化のための基質として好ましく用いることができる。脱メチル化活性は、インキュベーション後の基質における放射活性に基づいて測定することができる(すなわち、基質における放射活性が高ければ高いほど、JARID1Bポリペプチドの脱メチル化活性がより低いことが示される)。基質における放射活性は、例えば、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって検出することができる。または、インキュベーションの後に、ゲル濾過および免疫沈降などの従来法によって基質をJARID1Bから分離させて、基質における放射活性を当技術分野において周知の方法によって測定することもできる。基質におけるメチル基と結合できる他の適した標識、例えば発色性および蛍光性の標識など、ならびにこれらの標識を検出する方法は、当技術分野において公知である。
あるいは、JARID1Bポリペプチドの脱メチル化活性を、質量分析法を用いて、またはメチル化基質を選択的に認識する試薬を用いて測定してもよい。例えば、メチル化基質に対する抗体を、そのような試薬として好ましく用いることができる。そのような抗体を用いる任意の免疫学的手法を、基質のメチル化レベルの検出のために用いることができる。例えば、基質がメチル化ヒストンである場合には、メチル化ヒストン(例えば、トリ−またはジ−メチル化リシン4を含むヒストンH3)に対する抗体を、好ましく用いることができる。そのような抗体は市販されている(例えば、Abcam Ltd.)。例えば、メチル化基質を認識する抗体を用いるELISAまたはイムノブロット法を、本発明のために用いることができる。
さらに、脱メチル化活性を検出する本方法は、JARID1B遺伝子を発現している細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養し、細胞におけるヒストンのメチル化レベルを、例えばヒストンのメチル化領域と特異的に結合する抗体を用いることによって決定することにより、実施できる。
より具体的には、本方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)ヒストンH3リシン4のメチル化レベルを検出する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、メチル化レベルを上昇させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
さらに、脱メチル化活性を検出する本方法は、JARID1B遺伝子を発現している細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養し、細胞におけるヒストンのメチル化レベルを、例えばヒストンのメチル化領域と特異的に結合する抗体を用いることによって決定することにより、実施できる。
より具体的には、本方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)ヒストンH3リシン4のメチル化レベルを検出する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、メチル化レベルを上昇させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
あるいは、検出される生物活性が、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現を促進する活性である場合には、例えば、実施例1に示されているE2Fレポーターアッセイを用いて測定することができる。この方法に関しては、試験化合物を、がん細胞などのJARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる。
より具体的には、本方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを測定する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
E2F1遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列は、それぞれSEQ ID NO:35および36に示されているが、これらに限定されるわけではない。さらに、配列データは、例えば、それぞれアクセッション番号NM_005225.2およびNP_005216.1で入手することもできる。
E2F2遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列も、それぞれSEQ ID NO:37および38に示されているが、これらに限定されるわけではない。さらに、配列データは、例えば、それぞれアクセッション番号NM_004091.2およびNP_004082.1で入手することもできる。
より具体的には、本方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを測定する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含む。
E2F1遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列は、それぞれSEQ ID NO:35および36に示されているが、これらに限定されるわけではない。さらに、配列データは、例えば、それぞれアクセッション番号NM_005225.2およびNP_005216.1で入手することもできる。
E2F2遺伝子の例示的な核酸配列およびポリペプチド配列も、それぞれSEQ ID NO:37および38に示されているが、これらに限定されるわけではない。さらに、配列データは、例えば、それぞれアクセッション番号NM_004091.2およびNP_004082.1で入手することもできる。
JARID1B遺伝子を発現している細胞には、例えば、がんから樹立された細胞株(例えば、膀胱癌については5637、253J、253J−BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBERおよびUMUC3、肺癌についてはSBC5またはH2170およびLC319)ならびに臨床的がん組織から精製された細胞が含まれ、そのような細胞を本スクリーニング方法のために用いることができる。E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルの測定は、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の転写調節領域および該調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含むベクターを、試験剤または試験化合物と接触させる前または後の細胞に導入し、その後、該レポーター遺伝子の発現レベルを検出することによって実施することができる。E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の転写調節領域は当技術分野において周知である(例えば、Araki et al. Oncogene 2003, 22: 7632-41、Pilon et al. Mol Cell Biol 2008, 28: 7394-401)。レポーター遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、イソギンチャクモドキ(Discosoma sp.)赤色蛍光タンパク質(DsRed)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、lacZ、およびβ−グルクロニダーゼ(GUS)などであってよい。これらに加えて、Cignal(商標)E2F Reporter Assay Kit(SuperArray Bioscience Corporation)などのいくつかの市販の製品を、E2Fレポーターアッセイに利用することもできる。代替的に、RT−PCR、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、ELISAアッセイおよびフローサイトメトリー分析といった当技術分野において周知の方法を用いてこれらの遺伝子の転写産物または翻訳産物を直接検出することによって、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現レベルを測定してもよい。
本発明において、所与のタンパク質と機能的に等価なポリペプチドを調製するための方法は当業者に周知であり、これには、タンパク質に突然変異を導入する既知の方法が含まれる。一般的に、タンパク質中の1つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている(Mark DF et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Wang A et al., Science 1984, 224:1431-3; Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13)。実際、変異タンパク質または改変タンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の1つもしくは複数の置換、欠失、挿入、および/もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984);Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982);Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明の文脈において意図されることを認識するであろう。
本明細書において定義される「生物活性の抑制」とは、剤または化合物の非存在下と比較した、JARID1Bの生物活性の好ましくは少なくとも10%の抑制、より好ましくは少なくとも25%、50%、または75%の抑制、および最も好ましくは90%の抑制である。
本明細書において定義される「生物活性の抑制」とは、剤または化合物の非存在下と比較した、JARID1Bの生物活性の好ましくは少なくとも10%の抑制、より好ましくは少なくとも25%、50%、または75%の抑制、および最も好ましくは90%の抑制である。
本発明において、JARID1Bの発現を抑制することにより、細胞増殖が減少することが明らかとなる。したがって、JARID1Bポリペプチドの生物活性を阻害する候補化合物をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次スクリーニングおよび/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、JARID1Bタンパク質に結合する化合物が、がんの上記活性を阻害する場合には、そのような化合物がJARID1B特異的治療効果を有すると結論づけることができる。
好ましい態様においては、JARID1Bポリペプチドを発現しない対照細胞を用いる。したがって本発明はまた、JARID1Bポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質またはJARID1Bと関連するがんを治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
a)JARID1Bポリペプチドまたはその機能的断片を発現している細胞、およびJARID1Bポリペプチドもその機能的断片も発現しない対照細胞を、試験物質の存在下で培養する段階;
b)該タンパク質を発現している細胞および対照細胞の生物活性を検出する段階;ならびに
c)対照細胞においておよび前記試験物質の非存在下で検出される増殖と比較して、該タンパク質を発現している細胞における生物活性を阻害する試験化合物を選択する段階
を含む。
好ましい態様においては、JARID1Bポリペプチドを発現しない対照細胞を用いる。したがって本発明はまた、JARID1Bポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質またはJARID1Bと関連するがんを治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は、
a)JARID1Bポリペプチドまたはその機能的断片を発現している細胞、およびJARID1Bポリペプチドもその機能的断片も発現しない対照細胞を、試験物質の存在下で培養する段階;
b)該タンパク質を発現している細胞および対照細胞の生物活性を検出する段階;ならびに
c)対照細胞においておよび前記試験物質の非存在下で検出される増殖と比較して、該タンパク質を発現している細胞における生物活性を阻害する試験化合物を選択する段階
を含む。
JARID1Bの発現を変化させる剤または化合物のスクリーニング:
本発明において、siRNAによるJARID1B遺伝子の発現の低下は、がん細胞増殖の阻害を引き起こす(図7)。したがって本発明は、JARID1B遺伝子の発現を阻害する剤または化合物のスクリーニング法を提供する。JARID1B遺伝子の発現を阻害する剤または化合物は、がん細胞の増殖を抑制すると予想され、それ故にがんを治療または予防するために有用である。したがって本発明は、がん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための剤または化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明によると、JARID1B遺伝子の発現は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌において上昇することが確認された。したがって、本方法によってスクリーニングされた剤または化合物は、これらのがんを治療するのに適している可能性がある。より具体的には、JARID1B遺伝子の発現を阻害する化合物が膀胱癌および肺癌における細胞増殖を阻害することが確認されている(図7)ため、膀胱癌および肺癌は、本方法によってスクリーニングされる剤または化合物の好適な標的である。
本発明において、siRNAによるJARID1B遺伝子の発現の低下は、がん細胞増殖の阻害を引き起こす(図7)。したがって本発明は、JARID1B遺伝子の発現を阻害する剤または化合物のスクリーニング法を提供する。JARID1B遺伝子の発現を阻害する剤または化合物は、がん細胞の増殖を抑制すると予想され、それ故にがんを治療または予防するために有用である。したがって本発明は、がん細胞の増殖を抑制する剤または化合物をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための剤または化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明によると、JARID1B遺伝子の発現は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌において上昇することが確認された。したがって、本方法によってスクリーニングされた剤または化合物は、これらのがんを治療するのに適している可能性がある。より具体的には、JARID1B遺伝子の発現を阻害する化合物が膀胱癌および肺癌における細胞増殖を阻害することが確認されている(図7)ため、膀胱癌および肺癌は、本方法によってスクリーニングされる剤または化合物の好適な標的である。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)JARID1B遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、JARID1B遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤または試験化合物の治療効果、あるいはJARID1B関連がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびJARID1Bと関連するがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
b)JARID1B遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
c)b)の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含んでもよい。
本発明において、治療効果をJARID1B遺伝子の発現レベルと関連付けることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、JARID1B遺伝子の発現レベルを該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して減少させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。または、試験剤または試験化合物が、JARID1B遺伝子の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)JARID1B遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、JARID1B遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤または試験化合物の治療効果、あるいはJARID1B関連がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびJARID1Bと関連するがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
b)JARID1B遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
c)b)の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含んでもよい。
本発明において、治療効果をJARID1B遺伝子の発現レベルと関連付けることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、JARID1B遺伝子の発現レベルを該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して減少させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。または、試験剤または試験化合物が、JARID1B遺伝子の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して低下させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
JARID1B遺伝子を発現する細胞には、例えば、がんから樹立された細胞株(例えば、膀胱癌については5637、253J、253J−BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER、およびUMUC3、肺癌についてはSBC5またはH2170およびLC319)および臨床がん組織から精製した細胞が含まれ、そのような細胞を、本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばRT−PCR、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、またはフローサイトメトリー解析によって評価することができる。本明細書において定義される「発現レベルを減少させる」とは、剤または化合物の非存在下における発現レベルと比較した、JARID1B遺伝子の発現レベルの好ましくは少なくとも10%の減少、より好ましくは少なくとも25%、50%、または75%のレベル減少、および最も好ましくは95%のレベル減少である。本明細書における剤または化合物には化学物質、二本鎖分子等が含まれる。二本鎖分子の調製は、上記で記載されている。スクリーニング法において、JARID1B遺伝子の発現レベルを減少させる試験剤または試験化合物は、がん細胞増殖を阻害するために使用される剤または化合物として選択することができ、かつしたがって、がんの治療または予防のための候補剤または候補化合物であることが予想され得る。
本発明において、JARID1Bの発現の抑制が細胞増殖を減少させることが明らかになる。したがって、JARID1Bポリペプチドの生物活性を阻害する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
JARID1B遺伝子を発現する細胞には、例えば、がんから樹立された細胞株(例えば、膀胱癌については5637、253J、253J−BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER、およびUMUC3、肺癌についてはSBC5またはH2170およびLC319)および臨床がん組織から精製した細胞が含まれ、そのような細胞を、本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばRT−PCR、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、またはフローサイトメトリー解析によって評価することができる。本明細書において定義される「発現レベルを減少させる」とは、剤または化合物の非存在下における発現レベルと比較した、JARID1B遺伝子の発現レベルの好ましくは少なくとも10%の減少、より好ましくは少なくとも25%、50%、または75%のレベル減少、および最も好ましくは95%のレベル減少である。本明細書における剤または化合物には化学物質、二本鎖分子等が含まれる。二本鎖分子の調製は、上記で記載されている。スクリーニング法において、JARID1B遺伝子の発現レベルを減少させる試験剤または試験化合物は、がん細胞増殖を阻害するために使用される剤または化合物として選択することができ、かつしたがって、がんの治療または予防のための候補剤または候補化合物であることが予想され得る。
本発明において、JARID1Bの発現の抑制が細胞増殖を減少させることが明らかになる。したがって、JARID1Bポリペプチドの生物活性を阻害する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
さらに、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現がJARID1B遺伝子発現の阻害によって抑制されることが本発明において確認されたので、JARID1B遺伝子の発現レベルを、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルとして検出することができる。E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現レベルの測定は、前述のE2Fレポーターアッセイによって、またはE2F1遺伝子もしくはE2F2遺伝子の転写産物もしくは翻訳産物を検出することによって決定することができる。
具体的には、本スクリーニング方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを測定する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
好ましい態様において、本発明の方法は、
(d)JARID1Bをほとんど発現しない対照細胞に対する影響を全く有さない試験剤または試験化合物を選択する段階
をさらに含んでもよい。
本発明によると、JARID1Bの発現を抑制することにより細胞増殖が減少することが明らかになる。さらに、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現がJARID1B遺伝子発現の阻害によって抑制されたことも明らかになる。したがって、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびJARID1Bと関連するがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
b)E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
c)b)の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含んでもよい。
具体的には、本スクリーニング方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを測定する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルと比較して、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを減少させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
好ましい態様において、本発明の方法は、
(d)JARID1Bをほとんど発現しない対照細胞に対する影響を全く有さない試験剤または試験化合物を選択する段階
をさらに含んでもよい。
本発明によると、JARID1Bの発現を抑制することにより細胞増殖が減少することが明らかになる。さらに、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現がJARID1B遺伝子発現の阻害によって抑制されたことも明らかになる。したがって、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびJARID1Bと関連するがんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
b)E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
c)b)の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含んでもよい。
本発明において、治療効果をE2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルと関連付けることができる。例えば、試験剤または試験化合物が、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して減少させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。または、試験剤または試験化合物が、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して減少させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有しない剤または化合物として同定することができる。
上記の段階は、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現を促進する活性を、「JARID1Bの生物活性を抑制する剤または化合物のスクリーニング」に記載されたJARID1Bポリペプチドの生物活性として用いる方法と同じである。しかし、本方法では、JARID1B遺伝子の発現レベルに注目する。JARID1B遺伝子の発現レベルの検出のためにE2Fレポーターアッセイを用いる場合には、E2Fレポーターベクターを、試験剤または試験化合物と接触させる前または後の細胞に導入してもよい。
上記の段階は、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現を促進する活性を、「JARID1Bの生物活性を抑制する剤または化合物のスクリーニング」に記載されたJARID1Bポリペプチドの生物活性として用いる方法と同じである。しかし、本方法では、JARID1B遺伝子の発現レベルに注目する。JARID1B遺伝子の発現レベルの検出のためにE2Fレポーターアッセイを用いる場合には、E2Fレポーターベクターを、試験剤または試験化合物と接触させる前または後の細胞に導入してもよい。
本発明において、JARID1Bの発現を抑制することにより細胞増殖が減少することが明らかになる。さらに、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現がJARID1B遺伝子発現の阻害によって抑制されたことが明らかになる。したがって、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを阻害する候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1Bの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を減少させる該試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、
(a)試験剤または試験化合物を、JARID1Bの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階;
(b)該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階;および
(c)試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を減少させる該試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階
を含んでもよい。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは試験化合物の治療効果、またはJARID1B関連がんを治療もしくは予防するための候補剤もしくは候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法、およびJARID1B関連がんを治療または予防するための候補剤または候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。
別の局面によると、本発明は、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階;
b)該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する段階;ならびに
c)b)の発現レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む、方法を提供する。
別の局面によると、本発明は、
a)試験剤または試験化合物を、JARID1B遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる段階;
b)該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する段階;ならびに
c)b)の発現レベルを該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む、方法を提供する。
本発明において、治療効果はレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を減少させる場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または試験化合物が、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を減少させない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、イソギンチャクモドキ赤色蛍光タンパク質(DsRed)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、lacZ、およびβ−グルクロニダーゼ(GUS)であり、宿主細胞はCOS7、HEK293、HeLa等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をJARID1B遺伝子の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるJARID1B遺伝子の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも500 bp上流まで、好ましくは1000 bpまで、より好ましくは5000または10000 bp上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはPCRによって増幅することができる。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか1つの転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。例えば、JARID1Bの転写調節領域は、Catteau et al. Int J Oncol. 2004, 25: 5-16で報告された。
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、イソギンチャクモドキ赤色蛍光タンパク質(DsRed)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、lacZ、およびβ−グルクロニダーゼ(GUS)であり、宿主細胞はCOS7、HEK293、HeLa等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をJARID1B遺伝子の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるJARID1B遺伝子の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも500 bp上流まで、好ましくは1000 bpまで、より好ましくは5000または10000 bp上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはPCRによって増幅することができる。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか1つの転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。例えば、JARID1Bの転写調節領域は、Catteau et al. Int J Oncol. 2004, 25: 5-16で報告された。
前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に感染させ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により(例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて)検出する。本明細書において定義される「発現または活性を減少させる」とは、化合物非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の好ましくは少なくとも10%の低下、より好ましくは少なくとも25%、50%、または75%の低下、および最も好ましくは95%の低下である。
本発明において、JARID1Bの発現を抑制することにより細胞増殖が低下することが明らかになる。したがって、前記レポーター遺伝子の発現または活性について候補化合物をスクリーニングすることによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
本発明において、JARID1Bの発現を抑制することにより細胞増殖が低下することが明らかになる。したがって、前記レポーター遺伝子の発現または活性について候補化合物をスクリーニングすることによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
E2F1およびE2F2の発現を変化させるための方法:
本発明によれば、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現は、JARID1B遺伝子発現の阻害によって抑制された(図9)。これは、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子が、JARID1Bタンパク質によって影響を受ける下流遺伝子の候補であることを示している。
E2F転写因子は網膜芽腫(RB)タンパク質経路の下流エフェクターであり、基本的な細胞周期制御の多くの局面に関与している(Botz J. et al. Mol Cell Biol 1996;16: 3401-9、DeGregori J. et al. Genes Dev 1995;9: 2873-87、Johnson DG et al. Nature 1993;365: 349-52、Muller H. et al. Biochim Biophys Acta 2000;1470: M1-12)。E2F因子の結合部位は、cdk2および4、サイクリンA、DおよびE、DNAポリメラーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼならびにPCNAを含む、細胞周期およびDNA合成を制御する多数の遺伝子で同定されている(Yamasaki L. Results Probl Cell Differ 1998;22: 199-227)。重要なことに、RB−E2Fカスケードにおける変異が、広範なさまざまな腫瘍実体において見出されている(Dimova DK et al. Oncogene 2005;24: 2810-26、Nevins JR. Hum Mol Genet 2001;10: 699-703)。これらの変化の大部分はRBまたはE2F転写因子の上流調節因子に影響を及ぼす一方で、E2Fファミリー自体の調節不全が発がんに決定的に関与しているという証拠も増えつつある。実際に、卵巣がんでは、増殖促進性のE2F1転写因子および特にE2F2転写因子が、健常対照組織と比較して過剰発現されていた(Reimer D. et al. Clin Cancer Res 2007;13: 144-51)。加えて、これらの細胞周期促進性転写因子の調節不全は、さまざまな腫瘍における予後指標としても記載されている(Ebihara Y. et al. Dis Esophagus 2004;17: 150-4、Foster CS et al. Oncogene 2004;23: 5871-9、Gorgoulis VG et al. J Pathol 2002;198: 142-56、Mega S. et al. Dis Esophagus 2005;18: 109-13、Oeggerli M. et al. Oncogene 2004;23: 5616-23)。したがって、増殖促進性E2F転写因子の過剰発現は、生存不良に寄与する、腫瘍の有意な増殖優位性(growth advantage)に寄与し得ると考えられる。本発明においては、膀胱腫瘍組織におけるE2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の両方の発現レベルが、非腫瘍性組織よりも有意に高い。E2F/RB経路の調節不全は種々の組織におけるヒト発がんと密接に関連している可能性があり、JARID1Bはこの経路の調節解除を通じて悪性化に寄与していると考えられる。
したがって、本発明はまた、JARID1B遺伝子発現またはJARID1Bタンパク質活性を調節することによって、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現レベルを変化させるための方法も提供する。E2F1およびE2F2の調節不全は発がんに関係しているので、本方法は新たながん療法の開発に寄与するであろう。
本発明によれば、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現は、JARID1B遺伝子発現の阻害によって抑制された(図9)。これは、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子が、JARID1Bタンパク質によって影響を受ける下流遺伝子の候補であることを示している。
E2F転写因子は網膜芽腫(RB)タンパク質経路の下流エフェクターであり、基本的な細胞周期制御の多くの局面に関与している(Botz J. et al. Mol Cell Biol 1996;16: 3401-9、DeGregori J. et al. Genes Dev 1995;9: 2873-87、Johnson DG et al. Nature 1993;365: 349-52、Muller H. et al. Biochim Biophys Acta 2000;1470: M1-12)。E2F因子の結合部位は、cdk2および4、サイクリンA、DおよびE、DNAポリメラーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼならびにPCNAを含む、細胞周期およびDNA合成を制御する多数の遺伝子で同定されている(Yamasaki L. Results Probl Cell Differ 1998;22: 199-227)。重要なことに、RB−E2Fカスケードにおける変異が、広範なさまざまな腫瘍実体において見出されている(Dimova DK et al. Oncogene 2005;24: 2810-26、Nevins JR. Hum Mol Genet 2001;10: 699-703)。これらの変化の大部分はRBまたはE2F転写因子の上流調節因子に影響を及ぼす一方で、E2Fファミリー自体の調節不全が発がんに決定的に関与しているという証拠も増えつつある。実際に、卵巣がんでは、増殖促進性のE2F1転写因子および特にE2F2転写因子が、健常対照組織と比較して過剰発現されていた(Reimer D. et al. Clin Cancer Res 2007;13: 144-51)。加えて、これらの細胞周期促進性転写因子の調節不全は、さまざまな腫瘍における予後指標としても記載されている(Ebihara Y. et al. Dis Esophagus 2004;17: 150-4、Foster CS et al. Oncogene 2004;23: 5871-9、Gorgoulis VG et al. J Pathol 2002;198: 142-56、Mega S. et al. Dis Esophagus 2005;18: 109-13、Oeggerli M. et al. Oncogene 2004;23: 5616-23)。したがって、増殖促進性E2F転写因子の過剰発現は、生存不良に寄与する、腫瘍の有意な増殖優位性(growth advantage)に寄与し得ると考えられる。本発明においては、膀胱腫瘍組織におけるE2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の両方の発現レベルが、非腫瘍性組織よりも有意に高い。E2F/RB経路の調節不全は種々の組織におけるヒト発がんと密接に関連している可能性があり、JARID1Bはこの経路の調節解除を通じて悪性化に寄与していると考えられる。
したがって、本発明はまた、JARID1B遺伝子発現またはJARID1Bタンパク質活性を調節することによって、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現レベルを変化させるための方法も提供する。E2F1およびE2F2の調節不全は発がんに関係しているので、本方法は新たながん療法の開発に寄与するであろう。
本発明の文脈において、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現レベルを変化させるための方法は、細胞においてJARID1B遺伝子の発現レベルまたはJARID1Bタンパク質の活性を変化させる段階を含む。そのような段階は、JARID1B遺伝子発現またはJARID1Bタンパク質活性を調整する化合物を細胞に投与することによって行われる。そのような化合物は、JARID1B遺伝子発現またはJARID1Bタンパク質に対するインヒビターまたはアクチベータであってよく、好ましくは、前述のスクリーニング方法によってスクリーニングされたインヒビターであってよい。例えば、JARID1B遺伝子を標的とするアンチセンスRNAもしくは二本鎖分子、またはJARID1Bタンパク質に対する抗体を、本方法のために用いることができる。二本鎖分子を本方法のために用いる場合には、本発明の二本鎖分子を利用することができる。好ましくは、そのような二本鎖分子は、SEQ ID NO:21または30に対応する標的配列を含む。
別の態様において、本発明はまた、JARID1B遺伝子発現またはJARID1Bタンパク質活性を調整する化合物を含む、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現を変化させるための組成物も提供する。そのような組成物は、JARID1B遺伝子発現またはJARID1Bタンパク質活性を阻害または促進する少なくとも1つの化合物を含む。好ましくは、本組成物は、JARID1B遺伝子発現を阻害する本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含み、より好ましくは、SEQ ID NO:21または30に対応する標的配列を含む二本鎖分子を含む。
本発明において、JARID1Bの発現を抑制することにより細胞増殖が減少することが明らかになる。さらに、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現がJARID1B遺伝子発現の阻害によって抑制されたことも明らかになる。したがって、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを変化させる候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
別の態様において、本発明はまた、JARID1B遺伝子発現またはJARID1Bタンパク質活性を調整する化合物を含む、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現を変化させるための組成物も提供する。そのような組成物は、JARID1B遺伝子発現またはJARID1Bタンパク質活性を阻害または促進する少なくとも1つの化合物を含む。好ましくは、本組成物は、JARID1B遺伝子発現を阻害する本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターを含み、より好ましくは、SEQ ID NO:21または30に対応する標的配列を含む二本鎖分子を含む。
本発明において、JARID1Bの発現を抑制することにより細胞増殖が減少することが明らかになる。さらに、E2F1遺伝子およびE2F2遺伝子の発現がJARID1B遺伝子発現の阻害によって抑制されたことも明らかになる。したがって、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現レベルを変化させる候補化合物のスクリーニングによって、がんを治療または予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤または治療化合物を同定するための二次および/またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
本発明の局面を以下の実施例において説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いられる技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。好適な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いられる技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。好適な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
方法の概要
組織試料およびRNAの調製
原発性尿路上皮癌の外科手術標本123例を、膀胱切除術または経尿道的膀胱腫瘍切除術(TUR−Bt)のいずれかの際に採取し、液体窒素中で急速凍結させた。正常膀胱尿路上皮組織の標本23例は、悪性腫瘍のエビデンスのない患者における、肉眼で見て正常な膀胱尿路上皮の領域から採取した。この研究のための組織の使用は、ケンブリッッジ州のCambridge shire Local Research Ethics Committeeによる承認を受けた。合計30例の30μm切片をRNA抽出のためにホモジナイズし、RNA抽出に用いた組織に隣接する2つの7μm「サンドイッチ」切片を切り出し、染色して、独立したコンサルタントである泌尿器組織病理学者(urohistopathologist)が細胞充実度および腫瘍グレードを評価した。さらに、切片を炎症細胞浸潤の程度に応じてグレード分類した(軽度、中等度、および顕著)。顕著な炎症細胞浸潤を示す試料は除外した(Wallard MJ et al. British journal of cancer 2006;94: 569-77)。
TRI Reagent(商標)(Sigma、Dorset、UK)を製造元のプロトコールに従って用いて、全RNAを抽出した。DNaseの段階を含むRNeasy Minikit(商標)(QIAGEN、Crawley、UK)を用いて、RNAの純度を最適化した。Agilent 2100(商標)全RNAバイオアナリシスを行った。各試料由来の1μlの再懸濁RNAを、RNA 6000 Nano Lab Chip(商標)にアプライして、製造元の指示に従って処理した。チップおよび試薬すべての供給元は、Agilent Technologies(商標)(West Lothian、UK)であった。
組織試料およびRNAの調製
原発性尿路上皮癌の外科手術標本123例を、膀胱切除術または経尿道的膀胱腫瘍切除術(TUR−Bt)のいずれかの際に採取し、液体窒素中で急速凍結させた。正常膀胱尿路上皮組織の標本23例は、悪性腫瘍のエビデンスのない患者における、肉眼で見て正常な膀胱尿路上皮の領域から採取した。この研究のための組織の使用は、ケンブリッッジ州のCambridge shire Local Research Ethics Committeeによる承認を受けた。合計30例の30μm切片をRNA抽出のためにホモジナイズし、RNA抽出に用いた組織に隣接する2つの7μm「サンドイッチ」切片を切り出し、染色して、独立したコンサルタントである泌尿器組織病理学者(urohistopathologist)が細胞充実度および腫瘍グレードを評価した。さらに、切片を炎症細胞浸潤の程度に応じてグレード分類した(軽度、中等度、および顕著)。顕著な炎症細胞浸潤を示す試料は除外した(Wallard MJ et al. British journal of cancer 2006;94: 569-77)。
TRI Reagent(商標)(Sigma、Dorset、UK)を製造元のプロトコールに従って用いて、全RNAを抽出した。DNaseの段階を含むRNeasy Minikit(商標)(QIAGEN、Crawley、UK)を用いて、RNAの純度を最適化した。Agilent 2100(商標)全RNAバイオアナリシスを行った。各試料由来の1μlの再懸濁RNAを、RNA 6000 Nano Lab Chip(商標)にアプライして、製造元の指示に従って処理した。チップおよび試薬すべての供給元は、Agilent Technologies(商標)(West Lothian、UK)であった。
逆転写
全RNA濃度を、NanoDrop(商標)ND1000分光光度計(Nyxor Biotech、Paris、France)を用いて測定した。製造元の指示に従って2μgのランダムヘキサマー(Amersham)およびSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen、Paisley、UK)を20μl反応で用い、1μgの全RNAを逆転写させた。続いてcDNAをPCR等級の水で1:100に希釈して、−20℃で保存した。
全RNA濃度を、NanoDrop(商標)ND1000分光光度計(Nyxor Biotech、Paris、France)を用いて測定した。製造元の指示に従って2μgのランダムヘキサマー(Amersham)およびSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen、Paisley、UK)を20μl反応で用い、1μgの全RNAを逆転写させた。続いてcDNAをPCR等級の水で1:100に希釈して、−20℃で保存した。
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのための組織を、上記で概説した手順に従って、前向きに採取した。7μm厚の連続切片5つを各組織から切り出し、Histogene(商標)染色溶液(Arcturus、California、USA)を製造元のプロトコールに従って用いて染色した。PixCell IIレーザーキャプチャー顕微鏡(商標)(Arcturus、CA、USA)を用いるマイクロダイセクションのために、その直後にスライドを転写した。この技術では、低出力赤外レーザーを用いて、関心対象の細胞を覆う熱可塑性フィルムを融解させて、細胞をこれに付着させる。
各組織における間質区画および上皮/腫瘍区画の両方からおよそ10000個の細胞をマイクロダイセクションに供した。RNeasy Micro Kit(QIAGEN、Crawley、UK)を用いてRNAを抽出した。混入を防ぐために、癌、または腫瘍の顕著な炎症領域を含む間質、または顕著な炎症細胞浸潤を含む間質は、除外した。
上記の通りに全RNAを逆転写させ、qRT−PCRを行った。このような少量の試料からのRNAの収量が少ないことを考慮して、NanoDrop(商標)定量は実施しなかったが、内在性18S CT値に対する補正を完全な出発RNAの量の正確な基準として用いた。転写物分析をJARID1B遺伝子に関して行った。
マイクロダイセクションの精度を確認するために、ビメンチンおよびウロプラキンに対するプライマーおよびプローブを用いるqRT−PCTを、製造元の指示に従って行った(Assays on demand、Applied Biosystems、Warrington、UK)。ビメンチンは主として間葉組織内で発現されるものであり、これを間質マーカーとして用いた。ウロプラキンは尿路上皮分化のマーカーであり、上皮由来腫瘍の最大90%で保存されている(Olsburgh J. et al. The Journal of pathology 2003;199: 41-9)。
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのための組織を、上記で概説した手順に従って、前向きに採取した。7μm厚の連続切片5つを各組織から切り出し、Histogene(商標)染色溶液(Arcturus、California、USA)を製造元のプロトコールに従って用いて染色した。PixCell IIレーザーキャプチャー顕微鏡(商標)(Arcturus、CA、USA)を用いるマイクロダイセクションのために、その直後にスライドを転写した。この技術では、低出力赤外レーザーを用いて、関心対象の細胞を覆う熱可塑性フィルムを融解させて、細胞をこれに付着させる。
各組織における間質区画および上皮/腫瘍区画の両方からおよそ10000個の細胞をマイクロダイセクションに供した。RNeasy Micro Kit(QIAGEN、Crawley、UK)を用いてRNAを抽出した。混入を防ぐために、癌、または腫瘍の顕著な炎症領域を含む間質、または顕著な炎症細胞浸潤を含む間質は、除外した。
上記の通りに全RNAを逆転写させ、qRT−PCRを行った。このような少量の試料からのRNAの収量が少ないことを考慮して、NanoDrop(商標)定量は実施しなかったが、内在性18S CT値に対する補正を完全な出発RNAの量の正確な基準として用いた。転写物分析をJARID1B遺伝子に関して行った。
マイクロダイセクションの精度を確認するために、ビメンチンおよびウロプラキンに対するプライマーおよびプローブを用いるqRT−PCTを、製造元の指示に従って行った(Assays on demand、Applied Biosystems、Warrington、UK)。ビメンチンは主として間葉組織内で発現されるものであり、これを間質マーカーとして用いた。ウロプラキンは尿路上皮分化のマーカーであり、上皮由来腫瘍の最大90%で保存されている(Olsburgh J. et al. The Journal of pathology 2003;199: 41-9)。
細胞培養
細胞株はすべて、適切な培地中で単層で増殖させた:253J、253J−BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER、UMUC3膀胱癌細胞およびSBC5小細胞肺癌細胞についてはイーグルの最小必須培地(EMEM);5637膀胱癌細胞およびA549、H2170およびLC319非小細胞肺癌細胞についてはRPMI1640培地;EJ28膀胱癌細胞およびRERF−LC−AI非小細胞肺癌細胞についてはダルベッコ変法イーグル培地(DMEM);RT4およびT24膀胱癌細胞についてはマッコイの5A培地;SW780細胞についてはライボビッツのL−15培地とし、10%ウシ胎仔血清および1%抗生物質/抗真菌剤溶液(Sigma)を加えた。細胞はすべて、5% CO2を含むか(253J、253J−BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER、UMUC3、SBC5、5637、A549 H2170、LC319、EJ28、RERF−LC−AI、RT4およびT24)またはCO2を含まない(SW780)加湿空気中にて37℃で維持した。製造元のプロトコールに従ってFuGENE6(ROCHE、Basel、Switzerland)を用いて、細胞をトランスフェクションした。
細胞株はすべて、適切な培地中で単層で増殖させた:253J、253J−BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER、UMUC3膀胱癌細胞およびSBC5小細胞肺癌細胞についてはイーグルの最小必須培地(EMEM);5637膀胱癌細胞およびA549、H2170およびLC319非小細胞肺癌細胞についてはRPMI1640培地;EJ28膀胱癌細胞およびRERF−LC−AI非小細胞肺癌細胞についてはダルベッコ変法イーグル培地(DMEM);RT4およびT24膀胱癌細胞についてはマッコイの5A培地;SW780細胞についてはライボビッツのL−15培地とし、10%ウシ胎仔血清および1%抗生物質/抗真菌剤溶液(Sigma)を加えた。細胞はすべて、5% CO2を含むか(253J、253J−BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER、UMUC3、SBC5、5637、A549 H2170、LC319、EJ28、RERF−LC−AI、RT4およびT24)またはCO2を含まない(SW780)加湿空気中にて37℃で維持した。製造元のプロトコールに従ってFuGENE6(ROCHE、Basel、Switzerland)を用いて、細胞をトランスフェクションした。
cDNAマイクロアレイを用いた、がんにおける発現プロファイリング
本発明者らは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)のUniGeneデータベースから選択した36,864種のcDNAまたはESRを有する、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイを確立した。このマイクロアレイシステムは、本質的には以前に記載した通りに構築した(Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22: 2192-205、Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9、Nakamura T. et al. Oncogene 2004;23: 2385-400)。手短に述べると、さまざまなヒト臓器から単離したポリ(A)+ RNAをテンプレートとして用いるRT−PCRによってcDNAを増幅した;アンプリコンの長さは200〜1,100bpの範囲にわたり、いかなる反復配列もポリ(A)配列も有さなかった。多くの型の腫瘍および対応する非腫瘍性組織を、以前に記載した通りに8μm切片として調製した(Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9)。EZ切出しシステム(SL Microtest GmbH、Germany)を製造元のプロトコールに従って用いて、合計30,000〜40,000個のがん細胞または非がん性細胞を選択的に採取した。全RNAの抽出、T7に基づく増幅およびプローブの標識は、以前に記載した通りに行った(Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9)。続いて、各がん性組織および非がん性組織に由来し、2倍に増幅されたRNA(aRNA)の2.5μgアリコートの測定単位を、それぞれCy3−dCTPまたはCy5−dCTPで標識した。
本発明者らは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)のUniGeneデータベースから選択した36,864種のcDNAまたはESRを有する、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイを確立した。このマイクロアレイシステムは、本質的には以前に記載した通りに構築した(Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22: 2192-205、Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9、Nakamura T. et al. Oncogene 2004;23: 2385-400)。手短に述べると、さまざまなヒト臓器から単離したポリ(A)+ RNAをテンプレートとして用いるRT−PCRによってcDNAを増幅した;アンプリコンの長さは200〜1,100bpの範囲にわたり、いかなる反復配列もポリ(A)配列も有さなかった。多くの型の腫瘍および対応する非腫瘍性組織を、以前に記載した通りに8μm切片として調製した(Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9)。EZ切出しシステム(SL Microtest GmbH、Germany)を製造元のプロトコールに従って用いて、合計30,000〜40,000個のがん細胞または非がん性細胞を選択的に採取した。全RNAの抽出、T7に基づく増幅およびプローブの標識は、以前に記載した通りに行った(Kitahara O. et al. Cancer Res 2001;61: 3544-9)。続いて、各がん性組織および非がん性組織に由来し、2倍に増幅されたRNA(aRNA)の2.5μgアリコートの測定単位を、それぞれCy3−dCTPまたはCy5−dCTPで標識した。
定量的リアルタイムPCR
上記の通りに、123例の膀胱癌組織および23例の正常膀胱組織をCambridge Addenbrooke's Hospitalにおいて調製した。定量的RT−PCR反応のために、いずれもヒトのGAPDH(ハウスキーピング遺伝子)、SDH(ハウスキーピング遺伝子)、JARID1B、E2F1およびE2F2に対する特異的プライマーを以下の通りに設計した:
GAPDH−フォワード
5' GCAAATTCCATGGCACCGTC 3'(SEQ ID NO:3);
GAPDH−リバース
5' TCGCCCCACTTGATTTTGG 3'(SEQ ID NO:4);
SDH−フォワード
5' TGGGAACAAGAGGGCATCTG 3'(SEQ ID NO:5);
SDH−リバース
5' CCACCACTGCATCAAATTCATG3'(SEQ ID NO:6);
JARID1B−フォワード−1
5' ATTGCCTCAAAGGAATTTGGCAGTG3'(SEQ ID NO:7);
JARID1B−リバース−1
5' CATCACTGGCATGTTGTTCAAATTC 3'(SEQ ID NO:8);
JARID1B−フォワード−2
5' TGTCACAGTGGAATATGGAGCTGAC 3'(SEQ ID NO:9);および
JARID1B−リバース−2
5' GCCACTATCAAGATACTCCTCTTCC 3'(SEQ ID NO:10);
E2F1−フォワード
5' GCTGGACCACCTGATGAATATC 3'(SEQ ID NO:11);
E2F1−リバース
5' TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG 3'(SEQ ID NO:12);
E2F2−フォワード
5' TGGCAACTTTAAGGAGCAGACAG 3'(SEQ ID NO:13);
E2F2−リバース
5' GGGCACAGGTAGACTTCGATGG 3'(SEQ ID NO:14)。
製造元のプロトコールに従ってABI prism 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems、Warrington、UK)を用いて、PCR反応を行った。50% SYBR GREEN universal PCR Master Mix without UNG(Applied Biosystems、Warrington、UK)、各50nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに2μlの逆転写されたcDNAを適用した。増幅条件は、まず95℃で5分間、次に、95℃で10秒間、55℃で1分間、および72℃で10秒間からなるサイクル45回とした。続いて、反応物を95℃で15秒間、65℃で1分間加熱して融解曲線を作成し、10秒間で50℃まで冷却させた。標的遺伝子の増幅のための反応条件は上記の通りとし、5ngの逆転写されたRNAに相当する量を各反応に用いた。mRNAレベルはGAPDHおよびSDHの発現に対して正規化した。
上記の通りに、123例の膀胱癌組織および23例の正常膀胱組織をCambridge Addenbrooke's Hospitalにおいて調製した。定量的RT−PCR反応のために、いずれもヒトのGAPDH(ハウスキーピング遺伝子)、SDH(ハウスキーピング遺伝子)、JARID1B、E2F1およびE2F2に対する特異的プライマーを以下の通りに設計した:
GAPDH−フォワード
5' GCAAATTCCATGGCACCGTC 3'(SEQ ID NO:3);
GAPDH−リバース
5' TCGCCCCACTTGATTTTGG 3'(SEQ ID NO:4);
SDH−フォワード
5' TGGGAACAAGAGGGCATCTG 3'(SEQ ID NO:5);
SDH−リバース
5' CCACCACTGCATCAAATTCATG3'(SEQ ID NO:6);
JARID1B−フォワード−1
5' ATTGCCTCAAAGGAATTTGGCAGTG3'(SEQ ID NO:7);
JARID1B−リバース−1
5' CATCACTGGCATGTTGTTCAAATTC 3'(SEQ ID NO:8);
JARID1B−フォワード−2
5' TGTCACAGTGGAATATGGAGCTGAC 3'(SEQ ID NO:9);および
JARID1B−リバース−2
5' GCCACTATCAAGATACTCCTCTTCC 3'(SEQ ID NO:10);
E2F1−フォワード
5' GCTGGACCACCTGATGAATATC 3'(SEQ ID NO:11);
E2F1−リバース
5' TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG 3'(SEQ ID NO:12);
E2F2−フォワード
5' TGGCAACTTTAAGGAGCAGACAG 3'(SEQ ID NO:13);
E2F2−リバース
5' GGGCACAGGTAGACTTCGATGG 3'(SEQ ID NO:14)。
製造元のプロトコールに従ってABI prism 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems、Warrington、UK)を用いて、PCR反応を行った。50% SYBR GREEN universal PCR Master Mix without UNG(Applied Biosystems、Warrington、UK)、各50nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに2μlの逆転写されたcDNAを適用した。増幅条件は、まず95℃で5分間、次に、95℃で10秒間、55℃で1分間、および72℃で10秒間からなるサイクル45回とした。続いて、反応物を95℃で15秒間、65℃で1分間加熱して融解曲線を作成し、10秒間で50℃まで冷却させた。標的遺伝子の増幅のための反応条件は上記の通りとし、5ngの逆転写されたRNAに相当する量を各反応に用いた。mRNAレベルはGAPDHおよびSDHの発現に対して正規化した。
免疫細胞化学
A549(非小細胞肺癌)細胞またはSBC5(小細胞肺癌)細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含むPBS(−)で20分間固定し、0.1% Triton X−100を含むPBS(−)によって室温で2分間かけて透過性にした。引き続いて、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするために、細胞を室温で1時間、3%ウシ血清アルブミンを含むPBS(−)で覆い、続いて希釈比1:100のマウス抗JARID1B抗体(1G10、Abnova)とともにインキュベーションした。PBS(−)で洗浄した後に、細胞を、1:1000希釈したAlexa594結合抗マウス二次抗体(Molecular Probe)によって染色した。核は4',6'−ジアミジン−2'−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)で対比染色した。蛍光画像をTCS SP2 AOBS顕微鏡(Leica)によって得た。
A549(非小細胞肺癌)細胞またはSBC5(小細胞肺癌)細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含むPBS(−)で20分間固定し、0.1% Triton X−100を含むPBS(−)によって室温で2分間かけて透過性にした。引き続いて、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするために、細胞を室温で1時間、3%ウシ血清アルブミンを含むPBS(−)で覆い、続いて希釈比1:100のマウス抗JARID1B抗体(1G10、Abnova)とともにインキュベーションした。PBS(−)で洗浄した後に、細胞を、1:1000希釈したAlexa594結合抗マウス二次抗体(Molecular Probe)によって染色した。核は4',6'−ジアミジン−2'−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)で対比染色した。蛍光画像をTCS SP2 AOBS顕微鏡(Leica)によって得た。
免疫組織化学染色
ヒト膀胱癌および肺癌の切片をVECTASTAIN(商標)ABC KIT(VECTOR LABORATORIES、CA、USA)によって染色した。手短に述べると、キシレンで脱パラフィン処理し脱水した切片の内在性ペルオキシダーゼ活性を、0.3% H2O2/メタノールによる処理によって阻害させた。切片を3% BSAとともに加湿チャンバー内で周囲温度にて30分間インキュベーションした後に、マウスモノクローナル抗JARID1B(クローン1G10、Abnova)抗体の1:100希釈物と共に4℃で一晩インキュベーションすることによって、非特異的結合を遮断した。切片をPBS(−)で2回洗浄し、1% BSAを含むPBS(−)中の5μg/μlのヤギ抗マウスビオチン化IgGとともに周囲温度で30分間インキュベーションした後、ABC試薬ともに30分間インキュベーションした。特異的な免疫染色を3,3'−ジアミノベンジジンによって可視化した。段階的なアルコール〜キシレン洗浄によってスライドを脱水させて、カバーガラス上にマウントした。核の対比染色のためにヘマトキシリンを用いた。
ヒト膀胱癌および肺癌の切片をVECTASTAIN(商標)ABC KIT(VECTOR LABORATORIES、CA、USA)によって染色した。手短に述べると、キシレンで脱パラフィン処理し脱水した切片の内在性ペルオキシダーゼ活性を、0.3% H2O2/メタノールによる処理によって阻害させた。切片を3% BSAとともに加湿チャンバー内で周囲温度にて30分間インキュベーションした後に、マウスモノクローナル抗JARID1B(クローン1G10、Abnova)抗体の1:100希釈物と共に4℃で一晩インキュベーションすることによって、非特異的結合を遮断した。切片をPBS(−)で2回洗浄し、1% BSAを含むPBS(−)中の5μg/μlのヤギ抗マウスビオチン化IgGとともに周囲温度で30分間インキュベーションした後、ABC試薬ともに30分間インキュベーションした。特異的な免疫染色を3,3'−ジアミノベンジジンによって可視化した。段階的なアルコール〜キシレン洗浄によってスライドを脱水させて、カバーガラス上にマウントした。核の対比染色のためにヘマトキシリンを用いた。
ウエスタンブロット法
RIPA様緩衝液中にて細胞から全タンパク質抽出物を調製した。全タンパク質(50μg)をニトロセルロース膜に転写した。抗JARID1B(クローン1G10、AbnovaまたはHPA027179、Atlas Antibodies AB)、抗E2F1抗体(KH−95、Santa Cruz Biotechnology)および抗E2F2抗体(L−20、Santa Cruz Biotechnology)を用いて、膜を分析した。抗アクチン(I−19、Santa Cruz Biotechnology)をローディング対照として用いた。
RIPA様緩衝液中にて細胞から全タンパク質抽出物を調製した。全タンパク質(50μg)をニトロセルロース膜に転写した。抗JARID1B(クローン1G10、AbnovaまたはHPA027179、Atlas Antibodies AB)、抗E2F1抗体(KH−95、Santa Cruz Biotechnology)および抗E2F2抗体(L−20、Santa Cruz Biotechnology)を用いて、膜を分析した。抗アクチン(I−19、Santa Cruz Biotechnology)をローディング対照として用いた。
siRNAによるトランスフェクション
ヒトJARID1B転写物を標的とさせるためのsiRNAオリゴヌクレオチド二重鎖はSIGMA Genosysから購入した。siEGFP、siFFLuc、および、3種類の異なるオリゴヌクレオチド二重鎖の混合物であるsiNegative control(siNC)を、対照siRNAとして用いた。これらのsiRNA配列は以下の通りに示される。
siEGFPセンス
5' GCAGCACGACUUCUUCAAGTT 3'(SEQ ID NO:15);
siEGFPアンチセンス
5' CUUGAAGAAGUCGUGCUGCTT 3'(SEQ ID NO:16);
siFFLucセンス
5' GUGCGCUGCUGGUGCCAACTT 3'(SEQ ID NO:17);
siFFLucアンチセンス
5' GUUGGCACCAGCAGCGCACTT 3'(SEQ ID NO:18);
siNegative control Target#1センス
5' AUCCGCGCGAUAGUACGUA 3'(SEQ ID NO:22);
siNegative control Target#1アンチセンス
5' UACGUACUAUCGCGCGGAU 3'(SEQ ID NO:23);
siNegative control Target#2センス
5' UUACGCGUAGCGUAAUACG 3'(SEQ ID NO:24);
siNegative control Target#2アンチセンス
5' CGUAUUACGCUACGCGUAA 3'(SEQ ID NO:25);
siNegative control Target#3センス
5' UAUUCGCGCGUAUAGCGGU 3'(SEQ ID NO:26);
siNegative control Target#3アンチセンス
5' ACCGCUAUACGCGCGAAUA 3'(SEQ ID NO:27);
JARID1B#1センス
5' CAGUGAAUGAGCUCCGGCATT 3'(SEQ ID NO:19);
JARID1B#1アンチセンス
5' UGCCGGAGCUCAUUCACUGTT 3'(SEQ ID NO:20);
JARID1B#2センス
5' GGAAUAUGGAGCUGACAUUTT 3'(SEQ ID NO:28);および
JARID1B#2アンチセンス
5' AAUGUCAGCUCCAUAUUCCTT 3'(SEQ ID NO:29)。
リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いて72時間にわたり膀胱癌細胞株および肺癌細胞株にこれらのsiRNA二重鎖(最終濃度100nM)をトランスフェクトし、Cell Countingキット8(DOJINDO Laboratories)を用いて細胞生存率を調べた。
ヒトJARID1B転写物を標的とさせるためのsiRNAオリゴヌクレオチド二重鎖はSIGMA Genosysから購入した。siEGFP、siFFLuc、および、3種類の異なるオリゴヌクレオチド二重鎖の混合物であるsiNegative control(siNC)を、対照siRNAとして用いた。これらのsiRNA配列は以下の通りに示される。
siEGFPセンス
5' GCAGCACGACUUCUUCAAGTT 3'(SEQ ID NO:15);
siEGFPアンチセンス
5' CUUGAAGAAGUCGUGCUGCTT 3'(SEQ ID NO:16);
siFFLucセンス
5' GUGCGCUGCUGGUGCCAACTT 3'(SEQ ID NO:17);
siFFLucアンチセンス
5' GUUGGCACCAGCAGCGCACTT 3'(SEQ ID NO:18);
siNegative control Target#1センス
5' AUCCGCGCGAUAGUACGUA 3'(SEQ ID NO:22);
siNegative control Target#1アンチセンス
5' UACGUACUAUCGCGCGGAU 3'(SEQ ID NO:23);
siNegative control Target#2センス
5' UUACGCGUAGCGUAAUACG 3'(SEQ ID NO:24);
siNegative control Target#2アンチセンス
5' CGUAUUACGCUACGCGUAA 3'(SEQ ID NO:25);
siNegative control Target#3センス
5' UAUUCGCGCGUAUAGCGGU 3'(SEQ ID NO:26);
siNegative control Target#3アンチセンス
5' ACCGCUAUACGCGCGAAUA 3'(SEQ ID NO:27);
JARID1B#1センス
5' CAGUGAAUGAGCUCCGGCATT 3'(SEQ ID NO:19);
JARID1B#1アンチセンス
5' UGCCGGAGCUCAUUCACUGTT 3'(SEQ ID NO:20);
JARID1B#2センス
5' GGAAUAUGGAGCUGACAUUTT 3'(SEQ ID NO:28);および
JARID1B#2アンチセンス
5' AAUGUCAGCUCCAUAUUCCTT 3'(SEQ ID NO:29)。
リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を用いて72時間にわたり膀胱癌細胞株および肺癌細胞株にこれらのsiRNA二重鎖(最終濃度100nM)をトランスフェクトし、Cell Countingキット8(DOJINDO Laboratories)を用いて細胞生存率を調べた。
フローサイトメトリーアッセイ(FACS)
細胞周期進行に対するJARID1B発現の影響を調べるために、SBC5細胞をsiJARID1Bまたは対照siRNA(siEGFPおよびsiFFLuc)で処理し、CO2インキュベーター内にて37℃で72時間培養した。1×105個の細胞をトリプシン処理によって回収し、製造元(Cayman Chemical)の指示に従ってヨウ化プロピジウムで染色した。Windows用ソフトウエアのMultiCycle(BECKMAN COULTER)を用いるFACScan(BECKMAN COULTER)により、詳細な細胞周期の状態に関して細胞を分析した。細胞周期がG0/G1期、S期およびG2/M期である細胞、ならびに任意のサブG1群のパーセンテージを、ゲートしていない少なくとも20,000個の細胞から決定した。
細胞周期進行に対するJARID1B発現の影響を調べるために、SBC5細胞をsiJARID1Bまたは対照siRNA(siEGFPおよびsiFFLuc)で処理し、CO2インキュベーター内にて37℃で72時間培養した。1×105個の細胞をトリプシン処理によって回収し、製造元(Cayman Chemical)の指示に従ってヨウ化プロピジウムで染色した。Windows用ソフトウエアのMultiCycle(BECKMAN COULTER)を用いるFACScan(BECKMAN COULTER)により、詳細な細胞周期の状態に関して細胞を分析した。細胞周期がG0/G1期、S期およびG2/M期である細胞、ならびに任意のサブG1群のパーセンテージを、ゲートしていない少なくとも20,000個の細胞から決定した。
下流遺伝子の分類のためのマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび統計分析
精製した全RNAを標識し、Affymetrix GeneChip U133 Plus 2.0オリゴヌクレオチドアレイ(Affymetrix、Santa Clara、CA)上に、製造元の指示に従ってハイブリダイズさせた。
各アレイに関して全体的にトリムされた平均シグナル強度値(global trimmed mean signal intensity value)を500に調整することによって決定された倍率を用いて、Affymetrix GCOSソフトウェア(バージョン1.1.1)においてハイブリダイゼーションシグナルの調整を行い、それらをGeneSpringバージョン6.2(Silicon Genetics)にインポートした。続いて、シグナル強度の中心を各チップの50パーセンタイル値に配置し、個々の各遺伝子については、生じうる技術的バイアスを最小限に抑えるためにまず特定の各サブセットの強度の中央値に配置した上で、続いて全試料セットに対して配置した。さらなる分析の後に、あらゆる反復ハイブリダイゼーションの強度は平均化した。すべての試料においてGCOSソフトウェアにより「存在(present)」または「限界(marginal)」と表示された遺伝子のみを、さらなる分析のために用いた。差次的に発現される遺伝子を、Wilcoxon−Mann−Whitneyノンパラメトリック検定(P<0.05)を用いて同定した。Benjamini−Hochberg偽発見率(false discovery rate)による多重検定補正を、適用可能な場合は常に適用した。同定された各遺伝子セットに関する試料間の相関を評価するために、各比較に対して階層的クラスター分析を行った。
代替的に、プローブシグナル強度をRMA法および分位数正規化法(Quantile normalization method)(RおよびBioconductorを用いる)によって正規化した。次に、実験間変動に起因するシグナル強度のゆらぎを推定した。各実験を反復し(1および2)、中点値をlog2((強度1+強度2)/2)=5、7、9、11、13および15とする強度範囲セットそれぞれについて、log2(強度2/強度1)の標準偏差(stdev)を算出した。強度変動は、式stdev(log2(強度2/強度1))=a*(log2((強度1+強度2)/2))+bを用いてモデル化し、最小二乗法を用いてパラメーターaおよびbを推定した。これらの値を用いて、強度のゆらぎの標準偏差を算出した。続いて、各プローブのシグナル強度をsiJARID1B(EXP)と対照(EGFP/FFLuc)(CONT)の間で比較し、以下のz−スコアを算出することにより、アップ/ダウンレギュレーションに関して検定した:log2(強度EXP/強度CONT)/(a*(log2((強度EXP+強度CONT)/2))+b)。反復セットに関して得られたP値を乗算して、各プローブの最終的なP値を算出した。これらの手順を、以下の各比較のそれぞれに対して適用した:EGFP対siJARID1B、FFLuc対siJARID1B、およびEGFP対FFLuc。アップ/ダウンレギュレートされた遺伝子セットは、以下の基準を同時に満たすものとして決定した:(1)EGFP対siJARID1Bに関してBenjamini−Hochberg偽発見率(FDR)<=0.05である、(2)FFLuc対siJARID1Bに関してFDR<=0.05であり、かつ調節の向きが(1)と同じである、ならびに(3)EGFP対FFLucが(1)および(2)とは反対の向きであるか、またはEGFP対FFLucに関してP>0.05である。最後に、アップ/ダウンレギュレートされる遺伝子セットと各GOカテゴリーとの間の重複の確率を、ランダムにサンプリングした別の遺伝子リストに対して比較して算出する超幾何分布検定を用いて、経路分析を行った。この検定を、Gene Ontologyデータベースによって定義された「生物学的プロセス」(857種のカテゴリー)の各カテゴリーにおいて、同定されたアップ/ダウンレギュレートされる遺伝子に適用し、これらが有意に濃縮されている(FDR<=0.05)か否かを調べた。
精製した全RNAを標識し、Affymetrix GeneChip U133 Plus 2.0オリゴヌクレオチドアレイ(Affymetrix、Santa Clara、CA)上に、製造元の指示に従ってハイブリダイズさせた。
各アレイに関して全体的にトリムされた平均シグナル強度値(global trimmed mean signal intensity value)を500に調整することによって決定された倍率を用いて、Affymetrix GCOSソフトウェア(バージョン1.1.1)においてハイブリダイゼーションシグナルの調整を行い、それらをGeneSpringバージョン6.2(Silicon Genetics)にインポートした。続いて、シグナル強度の中心を各チップの50パーセンタイル値に配置し、個々の各遺伝子については、生じうる技術的バイアスを最小限に抑えるためにまず特定の各サブセットの強度の中央値に配置した上で、続いて全試料セットに対して配置した。さらなる分析の後に、あらゆる反復ハイブリダイゼーションの強度は平均化した。すべての試料においてGCOSソフトウェアにより「存在(present)」または「限界(marginal)」と表示された遺伝子のみを、さらなる分析のために用いた。差次的に発現される遺伝子を、Wilcoxon−Mann−Whitneyノンパラメトリック検定(P<0.05)を用いて同定した。Benjamini−Hochberg偽発見率(false discovery rate)による多重検定補正を、適用可能な場合は常に適用した。同定された各遺伝子セットに関する試料間の相関を評価するために、各比較に対して階層的クラスター分析を行った。
代替的に、プローブシグナル強度をRMA法および分位数正規化法(Quantile normalization method)(RおよびBioconductorを用いる)によって正規化した。次に、実験間変動に起因するシグナル強度のゆらぎを推定した。各実験を反復し(1および2)、中点値をlog2((強度1+強度2)/2)=5、7、9、11、13および15とする強度範囲セットそれぞれについて、log2(強度2/強度1)の標準偏差(stdev)を算出した。強度変動は、式stdev(log2(強度2/強度1))=a*(log2((強度1+強度2)/2))+bを用いてモデル化し、最小二乗法を用いてパラメーターaおよびbを推定した。これらの値を用いて、強度のゆらぎの標準偏差を算出した。続いて、各プローブのシグナル強度をsiJARID1B(EXP)と対照(EGFP/FFLuc)(CONT)の間で比較し、以下のz−スコアを算出することにより、アップ/ダウンレギュレーションに関して検定した:log2(強度EXP/強度CONT)/(a*(log2((強度EXP+強度CONT)/2))+b)。反復セットに関して得られたP値を乗算して、各プローブの最終的なP値を算出した。これらの手順を、以下の各比較のそれぞれに対して適用した:EGFP対siJARID1B、FFLuc対siJARID1B、およびEGFP対FFLuc。アップ/ダウンレギュレートされた遺伝子セットは、以下の基準を同時に満たすものとして決定した:(1)EGFP対siJARID1Bに関してBenjamini−Hochberg偽発見率(FDR)<=0.05である、(2)FFLuc対siJARID1Bに関してFDR<=0.05であり、かつ調節の向きが(1)と同じである、ならびに(3)EGFP対FFLucが(1)および(2)とは反対の向きであるか、またはEGFP対FFLucに関してP>0.05である。最後に、アップ/ダウンレギュレートされる遺伝子セットと各GOカテゴリーとの間の重複の確率を、ランダムにサンプリングした別の遺伝子リストに対して比較して算出する超幾何分布検定を用いて、経路分析を行った。この検定を、Gene Ontologyデータベースによって定義された「生物学的プロセス」(857種のカテゴリー)の各カテゴリーにおいて、同定されたアップ/ダウンレギュレートされる遺伝子に適用し、これらが有意に濃縮されている(FDR<=0.05)か否かを調べた。
E2Fレポーターアッセイ
E2Fの転写活性を、Cignal(商標)E2F Reporter Assay Kit(SuperArray Bioscience Corporation)によって分析した。A549細胞およびSBC5細胞をsiRNA(siJARID1B、siEGFPおよびsiFFLuc)で処理し、24時間にわたって培養した。siRNAで処理した細胞に対して、最小(m)CMVプロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子とE2F転写応答エレメント(TRE)のタンデムリピートとをコードするE2F応答性ルシフェラーゼ構築物、陰性対照、または陽性対照をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、Dual−Luciferase Reporter Assay System(Promega)を用いて二重ルシフェラーゼアッセイを行い、内部正規化のためにRenillaレポーターを用いて、プロモーター活性値を任意単位として表した。実験は3回行い、スチューデントのt検定を統計分析として用いた。
E2Fの転写活性を、Cignal(商標)E2F Reporter Assay Kit(SuperArray Bioscience Corporation)によって分析した。A549細胞およびSBC5細胞をsiRNA(siJARID1B、siEGFPおよびsiFFLuc)で処理し、24時間にわたって培養した。siRNAで処理した細胞に対して、最小(m)CMVプロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子とE2F転写応答エレメント(TRE)のタンデムリピートとをコードするE2F応答性ルシフェラーゼ構築物、陰性対照、または陽性対照をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、Dual−Luciferase Reporter Assay System(Promega)を用いて二重ルシフェラーゼアッセイを行い、内部正規化のためにRenillaレポーターを用いて、プロモーター活性値を任意単位として表した。実験は3回行い、スチューデントのt検定を統計分析として用いた。
JARID1B発現は臨床的がん組織においてアップレギュレートされている
まず、5種のヒストンデメチラーゼ遺伝子であるJARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1DおよびJARID2の発現レベルを臨床的膀胱癌試料の小規模サブセットで検討し、JARID1B遺伝子のみについて正常細胞とがん細胞の間で発現レベルにおける有意差を認めた(データは示さず)。JmjCヒストンデメチラーゼの発現レベルが悪性腫瘍においてどの程度変化しているかを検証するために、5種のヒストンデメチラーゼ遺伝子であるJARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1DおよびJARID2の発現レベルを臨床的膀胱癌試料の小規模サブセットにおいて定量的リアルタイムPCRを用いて試験し、JARID1B遺伝子のみについて正常細胞とがん細胞の間で発現レベルにおける有意差を認めた(データは示さず)。したがって、123例の膀胱癌試料および23例の正常対照試料(英国人)を分析し(図1AおよびB)、正常組織と比較して、腫瘍細胞におけるJARID1Bの有意な過剰発現が観察された(P<0.0001、マン・ホイットニーのU検定、図1B、表1)。
まず、5種のヒストンデメチラーゼ遺伝子であるJARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1DおよびJARID2の発現レベルを臨床的膀胱癌試料の小規模サブセットで検討し、JARID1B遺伝子のみについて正常細胞とがん細胞の間で発現レベルにおける有意差を認めた(データは示さず)。JmjCヒストンデメチラーゼの発現レベルが悪性腫瘍においてどの程度変化しているかを検証するために、5種のヒストンデメチラーゼ遺伝子であるJARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1DおよびJARID2の発現レベルを臨床的膀胱癌試料の小規模サブセットにおいて定量的リアルタイムPCRを用いて試験し、JARID1B遺伝子のみについて正常細胞とがん細胞の間で発現レベルにおける有意差を認めた(データは示さず)。したがって、123例の膀胱癌試料および23例の正常対照試料(英国人)を分析し(図1AおよびB)、正常組織と比較して、腫瘍細胞におけるJARID1Bの有意な過剰発現が観察された(P<0.0001、マン・ホイットニーのU検定、図1B、表1)。
異なる病期およびグレードの間では、発現レベルにおける有意差は観察されなかった(図1Aおよび表1、2)。このことは、JARID1B発現が膀胱癌発生の初期に有意にアップレギュレートされ、該疾患の進行期においても高いままに保たれることを示唆する。転移の状態、性別、喫煙歴および再発状態による腫瘍の下位分類では、JARID1Bの発現レベルにおける有意差は同定されなかった(表2)。
続いて、日本人の膀胱癌対象に由来する多数の臨床試料におけるJARID1Bの発現パターンをcDNAマイクロアレイによって分析し(図1C、1D、表3)、その有意な過剰発現を確認した(P<0.0001、マン・ホイットニーのU検定)。
膀胱組織におけるJARID1Bタンパク質の発現レベルを評価するために、抗JARID1B特異抗体を用いる免疫組織化学分析を行った(図1E)。強いJARID1B染色が主として悪性細胞の核内で観察されたが、非新腫瘍性組織では有意な染色は観察されなかった。この結果をさらに確認するために、28例の膀胱組織切片を用いる組織マイクロアレイ実験を実施したところ(図2および表4)、6例では強い染色が観察され、13例では中程度または弱い染色が観察された。さらに、JARID1Bタンパク質発現レベルと臨床病理学的特徴との間に有意な関係は検出されず、これはリアルタイムPCRの結果に合致した。
膀胱組織に加えて、肺組織においてJARID1Bの発現レベルを試験した(図3、4)。cDNAマイクロアレイ実験によりJARID1B発現は、対応する非腫瘍性組織と比較して、肺腫瘍組織においても高度に上昇していることが示された(図3A〜C)。重要なことに、JARID1B発現の上昇は非小細胞肺癌および小細胞肺癌の両方で観察され、これは、JARID1B過剰発現が肺癌発生に幅広く関与することを示す。続いて、免疫組織化学的検査によって、肺組織におけるJARID1Bタンパク質発現レベルを試験した(図3D)。がん組織では強いJARID1B染色が観察され、非腫瘍性組織では有意な染色は観察されなかった。さまざまな種類の肺腫瘍組織におけるJARID1Bタンパク質発現レベルを評価するために、組織マイクロアレイ実験を実施した(図4および表5)。試験した62例の腫瘍組織切片のうち、54例では強い染色が観察され、9例では中程度または弱い染色が観察された。
加えて、日本人対象に由来する多数の臨床試料のマイクロアレイ発現分析データも試験し、対応する非腫瘍性組織と比較して、JARID1B発現は急性骨髄性白血病、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌および腎細胞癌(RCC)、前立腺癌においても有意にアップレギュレートされていることが見出されたが、このことは、これが多くの種類のヒトがんに関与している可能性を示すものである(図5および表6)。
興味深いことに、抗JARID1B抗体を用いた免疫細胞化学染色により、アフィジコリンを用いて細胞を同期させた後にその細胞内局在が変化することが示された。細胞周期解放から4時間後の、G0/G1期およびS期初期では、該タンパク質は主として核内に局在していた(図6上)。その後、細胞周期解放から12時間後の、S期およびG2/M期では、該タンパク質は核および細胞質の両方に局在していた(図6下)。したがって、JARID1Bの細胞内局在は細胞周期の状態に応じて変化し、かつこの酵素は、細胞質ならびに核において生理的役割を果たしている可能性があると考えられる。
興味深いことに、抗JARID1B抗体を用いた免疫細胞化学染色により、アフィジコリンを用いて細胞を同期させた後にその細胞内局在が変化することが示された。細胞周期解放から4時間後の、G0/G1期およびS期初期では、該タンパク質は主として核内に局在していた(図6上)。その後、細胞周期解放から12時間後の、S期およびG2/M期では、該タンパク質は核および細胞質の両方に局在していた(図6下)。したがって、JARID1Bの細胞内局在は細胞周期の状態に応じて変化し、かつこの酵素は、細胞質ならびに核において生理的役割を果たしている可能性があると考えられる。
JARID1Bはがん細胞の増殖調節に影響を与える
ヒト発がんにおけるJARID1Bの役割を調べるために、JARID1Bの発現を特異的に抑制するためのsiRNAオリゴヌクレオチド二重鎖(siJARID1B#1、配列は前述)を、2種の陰性対照(siEGFPおよびsiFFLuc)とともに調製した。JARID1Bの発現を、トランスフェクトを行っていない17例の膀胱癌細胞株または肺癌細胞株において検査した(図7A)。続いて、siRNAを、JARID1Bを中程度に発現しているSW780細胞およびA549細胞にトランスフェクトした。siJARID1B#1を含む細胞におけるJARID1Bの発現は、対照と比較して、SW780およびA549の両方において有意に抑制された(図7B)。3種の膀胱癌細胞株(RT4、SW780、UMUC3)、2種の非小肺癌細胞株(LC319、RERF−LC−AI)および1種の小細胞肺癌細胞株(SBC5)において、siRNAによる処理後に細胞増殖アッセイを行った。すべての例において、癌細胞の増殖は、siJARID1B#1による処理後に有意に抑制された(図7C)。
癌細胞においてJARID1B−ノックダウンによって誘導される増殖抑制の機序を評価するために、siRNAによる処理後の癌細胞の細胞周期状態をフローサイトメトリーによって分析した(図7D)。サブG1期にある細胞の数は、siJARID1B#1による処理後に顕著に増加した。このことは、JARID1Bの抑制に応答したアポトーシスの誘導を示唆する。siRNAをトランスフェクトした細胞の詳細な分析により、対照−siRNAで処理した癌細胞よりも、siJARID1B#1で処理した細胞において、サブG1期にある癌細胞の割合が有意に高いことが示されている(それぞれP=0.0055[siEGFP、siJARID1B#1]およびP=0.0042[siFFLuc、siJARID1B#1]、図7E)。加えて、siJARID1Bで処理した、S期後期およびG2/M期の細胞の割合は、対照siRNAで処理した細胞よりも有意に低かった。したがって、JARID1Bは癌細胞の増殖において非常に重要な役割を果たしている可能性があり、JARID1Bのノックダウンによってアポトーシスが誘導され得る。
ヒト発がんにおけるJARID1Bの役割を調べるために、JARID1Bの発現を特異的に抑制するためのsiRNAオリゴヌクレオチド二重鎖(siJARID1B#1、配列は前述)を、2種の陰性対照(siEGFPおよびsiFFLuc)とともに調製した。JARID1Bの発現を、トランスフェクトを行っていない17例の膀胱癌細胞株または肺癌細胞株において検査した(図7A)。続いて、siRNAを、JARID1Bを中程度に発現しているSW780細胞およびA549細胞にトランスフェクトした。siJARID1B#1を含む細胞におけるJARID1Bの発現は、対照と比較して、SW780およびA549の両方において有意に抑制された(図7B)。3種の膀胱癌細胞株(RT4、SW780、UMUC3)、2種の非小肺癌細胞株(LC319、RERF−LC−AI)および1種の小細胞肺癌細胞株(SBC5)において、siRNAによる処理後に細胞増殖アッセイを行った。すべての例において、癌細胞の増殖は、siJARID1B#1による処理後に有意に抑制された(図7C)。
癌細胞においてJARID1B−ノックダウンによって誘導される増殖抑制の機序を評価するために、siRNAによる処理後の癌細胞の細胞周期状態をフローサイトメトリーによって分析した(図7D)。サブG1期にある細胞の数は、siJARID1B#1による処理後に顕著に増加した。このことは、JARID1Bの抑制に応答したアポトーシスの誘導を示唆する。siRNAをトランスフェクトした細胞の詳細な分析により、対照−siRNAで処理した癌細胞よりも、siJARID1B#1で処理した細胞において、サブG1期にある癌細胞の割合が有意に高いことが示されている(それぞれP=0.0055[siEGFP、siJARID1B#1]およびP=0.0042[siFFLuc、siJARID1B#1]、図7E)。加えて、siJARID1Bで処理した、S期後期およびG2/M期の細胞の割合は、対照siRNAで処理した細胞よりも有意に低かった。したがって、JARID1Bは癌細胞の増殖において非常に重要な役割を果たしている可能性があり、JARID1Bのノックダウンによってアポトーシスが誘導され得る。
さらに、JARID1Bに対する2種の独立したsiRNA(siJARID1B#1および#2)、および2種の対照siRNA(siEGFPおよびsiNC)を用いるノックダウン実験を行った。これらのsiRNAを、JARID1Bが高度に発現されているSW780細胞、A549細胞およびSBC5細胞にトランスフェクトした(図7A)。JARID1Bを標的とする2種の無関係なsiRNAをトランスフェクトした細胞におけるJARID1Bの発現レベルは、対照siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して有意に抑制された(図7F)。同じsiRNAを用いて細胞増殖アッセイを行い、2種の膀胱癌細胞株(SW780およびRT4)および3種の肺癌細胞株(A549、LC319およびSBC5)では、JARID1Bを標的とする2種の独立したsiRNAによる有意な増殖抑制が観察されたが、対照siRNAを用いた場合には全く影響が認められなかった(図7G)。
マイクロアレイ発現分析による下流遺伝子の同定
JARID1Bの下流遺伝子、およびJARID1Bによって誘導されるシグナル経路を同定するためにマイクロアレイ発現分析を行った。siJARID1B#1およびsiJARID1B#2による処理の24時間後にSW780細胞およびA549細胞から全RNAを単離し、AffymetrixのHG−U133 Plus 2.0 Arrayを用いて、対照siRNA(siEGFPおよびsiFFLuc)で処理した細胞と比較したこれらの細胞の発現プロファイルを分析した。その結果、有意にアップ/ダウンレギュレートされる遺伝子のセットが同定された。さらに、Gene Ontologyデータベースを参照してシグナル経路分析を行い(表7)、JARID1Bが細胞周期の調節プロセスと密接に関連している可能性を見出した。興味深いことに、siJARID1Bによる処理により、E2F1およびE2F2の有意なダウンレギュレーションが観察された(いずれもP<0.0001)(図8)。そのため、JARID1B発現と、細胞周期の鍵となる調節経路であるE2F/RB経路との間の機能的関係を分析した。
JARID1Bの下流遺伝子、およびJARID1Bによって誘導されるシグナル経路を同定するためにマイクロアレイ発現分析を行った。siJARID1B#1およびsiJARID1B#2による処理の24時間後にSW780細胞およびA549細胞から全RNAを単離し、AffymetrixのHG−U133 Plus 2.0 Arrayを用いて、対照siRNA(siEGFPおよびsiFFLuc)で処理した細胞と比較したこれらの細胞の発現プロファイルを分析した。その結果、有意にアップ/ダウンレギュレートされる遺伝子のセットが同定された。さらに、Gene Ontologyデータベースを参照してシグナル経路分析を行い(表7)、JARID1Bが細胞周期の調節プロセスと密接に関連している可能性を見出した。興味深いことに、siJARID1Bによる処理により、E2F1およびE2F2の有意なダウンレギュレーションが観察された(いずれもP<0.0001)(図8)。そのため、JARID1B発現と、細胞周期の鍵となる調節経路であるE2F/RB経路との間の機能的関係を分析した。
siRNAで処理した3種の異なる癌細胞株であるSW780、SBC5およびA549において、E2F1およびE2F2の発現のダウンレギュレーションが、定量的リアルタイムPCRによって観察された(図9A、9B)。さらに、JARID1Bが過剰発現した臨床腫瘍組織においては、E2F1およびE2F2両方の発現レベルが非腫瘍性組織よりも高いことが見出された(それぞれP=0.0009およびP=0.0002)。このデータは、JARID1Bの発現上昇と相関して、E2F1およびE2F2の両方が腫瘍組織において高度に発現された可能性を示す(スピアマンの順位相関係数:それぞれr=0.666(E2F1)およびr=0.756(E2F2))(図9C)。
JARID1BによるE2Fの転写調節についてより詳細に確認するために、E2F応答性ルシフェラーゼ構築物を用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った(図9D)。対照(siEGFP)またはsiJARID1Bによる処理後の癌細胞株に、この構築物を形質転換により導入した。A549細胞およびSBC5細胞のいずれにおいても、E2Fに駆動される転写活性はsiJARID1B#1による処理後に有意に抑制された。さらに、E2F1およびE2F2両方の発現の抑制を、JARID1Bを標的とする2種の無関係なsiRNAによる処理後のA549細胞およびSBC5細胞においてタンパク質レベルで確認した(図9E)。これらの結果により、E2F転写因子によって調節される転写活性がJARID1Bのノックダウン後に抑制されうることが明らかであり、そして、この経路の崩壊が、本発明者らが観察した細胞周期変化の原因である可能性がある。
これらの結果は、JARID1Bが、ヒトの発がんにおいてE2F/RB経路を通じた細胞周期調節の重要因子の1つとして働きうることを示す。
JARID1BによるE2Fの転写調節についてより詳細に確認するために、E2F応答性ルシフェラーゼ構築物を用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った(図9D)。対照(siEGFP)またはsiJARID1Bによる処理後の癌細胞株に、この構築物を形質転換により導入した。A549細胞およびSBC5細胞のいずれにおいても、E2Fに駆動される転写活性はsiJARID1B#1による処理後に有意に抑制された。さらに、E2F1およびE2F2両方の発現の抑制を、JARID1Bを標的とする2種の無関係なsiRNAによる処理後のA549細胞およびSBC5細胞においてタンパク質レベルで確認した(図9E)。これらの結果により、E2F転写因子によって調節される転写活性がJARID1Bのノックダウン後に抑制されうることが明らかであり、そして、この経路の崩壊が、本発明者らが観察した細胞周期変化の原因である可能性がある。
これらの結果は、JARID1Bが、ヒトの発がんにおいてE2F/RB経路を通じた細胞周期調節の重要因子の1つとして働きうることを示す。
考察
メチル化、アセチル化、リン酸化およびユビキチン化を含む、クロマチンのヒストン修飾は、クロマチン構造の調節を通じて、転写の活性化および抑制のパターン形成の際に決定的な役割を果たす。JARID1Bは、ヒストンH3リシン4のメチル基を特異的に除去するリシンデメチラーゼファミリーに属する(Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12)。本発明では、膀胱癌および肺癌、ならびにさまざまな他の種類のがんにおけるJARID1Bの有意なアップレギュレーションが、定量的RT−PCR、免疫組織化学的検査およびマイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイルを用いて実証された。
重要な臓器における有意なJARID1B染色は、免疫組織化学分析では観察されなかった(図1E、3D、10)。したがって、対応する非腫瘍性組織と比較した、任意の腫瘍におけるJARID1Bの異常な過剰発現によって、これはがん検出のための、および治療標的としての理想的な分子標的となる。既に、古典的HDACの合成インヒビターは後成的研究におけるツールとして広く用いられており、その多くがインビトロでがん細胞における増殖抑制効果を示し、かつ初期臨床試験にも用いられている(Jones PA et al. Cell 2007, 128:683-692;Paris M et al. J Med Chem 2008, 51:1505-1529)。加えて、ヒストンメチルトランスフェラーゼインヒビターおよびデメチラーゼインヒビターも最近いくつか報告されている(Greiner D et al. Nat Chem Biol 2005, 1:143-145;Huang Y et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104:8023-8028;Kubicek S et al. Mol Cell 2007, 25:473-481)。
メチル化、アセチル化、リン酸化およびユビキチン化を含む、クロマチンのヒストン修飾は、クロマチン構造の調節を通じて、転写の活性化および抑制のパターン形成の際に決定的な役割を果たす。JARID1Bは、ヒストンH3リシン4のメチル基を特異的に除去するリシンデメチラーゼファミリーに属する(Yamane K. et al. Mol Cell 2007;25: 801-12)。本発明では、膀胱癌および肺癌、ならびにさまざまな他の種類のがんにおけるJARID1Bの有意なアップレギュレーションが、定量的RT−PCR、免疫組織化学的検査およびマイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイルを用いて実証された。
重要な臓器における有意なJARID1B染色は、免疫組織化学分析では観察されなかった(図1E、3D、10)。したがって、対応する非腫瘍性組織と比較した、任意の腫瘍におけるJARID1Bの異常な過剰発現によって、これはがん検出のための、および治療標的としての理想的な分子標的となる。既に、古典的HDACの合成インヒビターは後成的研究におけるツールとして広く用いられており、その多くがインビトロでがん細胞における増殖抑制効果を示し、かつ初期臨床試験にも用いられている(Jones PA et al. Cell 2007, 128:683-692;Paris M et al. J Med Chem 2008, 51:1505-1529)。加えて、ヒストンメチルトランスフェラーゼインヒビターおよびデメチラーゼインヒビターも最近いくつか報告されている(Greiner D et al. Nat Chem Biol 2005, 1:143-145;Huang Y et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104:8023-8028;Kubicek S et al. Mol Cell 2007, 25:473-481)。
E2F1およびE2F2はJARID1Bによって調節される下流モジュレーターであることが実証された。siRNA処理と組み合わせたルシフェラーゼレポーターアッセイにより、JARID1BとE2Fエレメントの間の分子間相互作用を裏づける間接的な証拠が得られた。E2F転写因子は網膜芽腫(RB)タンパク質経路の下流エフェクターであり、基本的な細胞周期制御の多くの局面に関与する(Botz J et al. Mol Cell Biol 1996, 16:3401-3409;DeGregori J et al. Genes Dev 1995, 9:2873-2887;Johnson DG et al: Nature 1993, 365:349-352;Muller H et al. Biochim Biophys Acta 2000, 1470:M1-12)。E2F因子の結合部位は、cdk2および4、サイクリンA、DおよびE、DNAポリメラーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、UHRF1、ならびにPCNAを含む、細胞周期およびDNA合成を制御する多数の遺伝子で同定されている(Unoki M et al. Oncogene 2004, 23:7601-7610;Yamasaki L. Results Probl Cell Differ 1998, 22:199-227)。重要なことに、RB−E2Fカスケードにおける変異は、多種多様な種類の腫瘍で見出されている(Dimova DK et al. Oncogene 2005, 24:2810-2826;Nevins JR. Hum Mol Genet 2001, 10:699-703)。これらの変化の大部分はRBまたはE2F転写因子の上流調節因子に影響を及ぼし、かつ、E2Fファミリーそれ自体の調節不全が発がんに決定的に関与するという証拠も増えつつある。実際に、卵巣癌では、増殖促進性のE2F1転写因子およびE2F2転写因子が、健常対照組織と比較して過剰発現されていた(Reimer D et al. Clin Cancer Res 2007, 13:144-151)。それらの調節不全は、さまざまな腫瘍に対する予後指標として提唱されている(Ebihara Y et al. Dis Esophagus 2004, 17:150-154;Foster CS et al. Oncogene 2004, 23:5871-5879;Gorgoulis VG et al. J Pathol 2002, 198:142-156;Mega S et al. Dis Esophagus 2005, 18:109-113;Oeggerli M et al. Oncogene 2004, 23:5616-5623)。増殖を促進するE2F転写因子の過剰発現が、腫瘍、特に予後不良な腫瘍に有意な増殖優位性を与えると議論されている。本研究において、本発明者らは、膀胱腫瘍組織におけるE2F1およびE2F2両方の発現レベルが非腫瘍性組織よりも有意に高いことを実証したが、これはおそらくJARID1Bの異常な転写調節に起因するものである。Gene Ontologyに基づく詳細な経路分析により(表7)、いくつかの細胞周期プロセスにおけるJARID1Bの関与が明らかになった。
マイクロアレイデータによれば、他のいくつかの遺伝子がJARID1Bによってアップレギュレートされうると考えられる。H3K4のメチル化が真性クロマチンのマーカーとなることから、JARID1Bの主な機能の1つは、そのデメチラーゼ活性を通じた転写抑制であると考えられている(Yamane K et al. Mol Cell 2007, 25:801-812)。マイクロアレイデータからは、JARID1Bがその下流遺伝子の転写を活性化できると考えられる機序として3つを提唱することができる。(i)JARID1Bによって直接調節される転写因子を通じて、転写を間接的に活性化する;(ii)JARID1Bがタンパク質−タンパク質相互作用を通じて、下流候補の発現をトランス活性化する。例えば、JARID1Bはアンドロゲン受容体と会合して、その転写活性を高める(Xiang Y et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104:19226-19231)。JARID1Bはその結合パートナー次第で、遺伝子発現のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方を行う可能性がある。(iii)JARID1Bが未知の基質を脱メチル化する。同様に、LSD1は当初はH3K4特異的デメチラーゼであると報告され(Shi Y et al. Cell 2004, 119:941-953)、後にヒストンH3リシン9およびp53を脱メチル化することが見出された(Huang J et al. Nature 2007, 449:105-108;Metzger E et al. Nature 2005, 437:436-439)。興味深いことに、JARID1Bは一部の細胞周期時期には細胞質に局在することが見出されており(図11、12)、このことにより、それが細胞質中の未知の基質を脱メチル化し、次に細胞周期の進行に影響を及ぼすという可能性が提起される。いくつかのがん細胞株を用いて得られた結果は、がん細胞の増殖におけるJARID1Bの関与を強く支持している。
本明細書において実証されたように、JARID1B遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって細胞増殖が抑制される。したがって、この新規な二本鎖分子は抗がん医薬として有用である。例えば、JARID1Bタンパク質の発現を阻止し、かつ/またはその活性を妨げる剤は、抗がん剤として、特に急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌の治療のための、特に膀胱癌および肺癌の治療のための抗がん剤としての、治療的有用性を有する。
JARID1Bの発現は、正常臓器と比較して、がんにおいて顕著に上昇している。したがって、JARID1B遺伝子またはタンパク質は、がんの診断マーカーとして好都合に用いることができる。
さらに、JARID1Bポリペプチドは抗がん医薬の開発のための有用な標的である。例えば、JARID1Bポリペプチドと結合するかまたはJARID1B遺伝子の発現を阻止するかまたはその活性を妨げる剤は、抗がん剤として、特に急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌の治療のための抗がん剤として治療的有用性を有する可能性がある。
本明細書において引用された刊行物、データベース、配列、特許および特許出願はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明を詳細に、その具体的な態様を参照しながら説明してきたが、その境界および範囲が添付の特許請求の範囲によって設定されている本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および改変を加えることができることは、当業者には明らかであろう。
JARID1Bの発現は、正常臓器と比較して、がんにおいて顕著に上昇している。したがって、JARID1B遺伝子またはタンパク質は、がんの診断マーカーとして好都合に用いることができる。
さらに、JARID1Bポリペプチドは抗がん医薬の開発のための有用な標的である。例えば、JARID1Bポリペプチドと結合するかまたはJARID1B遺伝子の発現を阻止するかまたはその活性を妨げる剤は、抗がん剤として、特に急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌の治療のための抗がん剤として治療的有用性を有する可能性がある。
本明細書において引用された刊行物、データベース、配列、特許および特許出願はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明を詳細に、その具体的な態様を参照しながら説明してきたが、その境界および範囲が添付の特許請求の範囲によって設定されている本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および改変を加えることができることは、当業者には明らかであろう。
Claims (28)
- がんを検出または診断するための方法であって、
(a)対象由来の生物試料における、jumonji, AT rich interactive domain 1B(JARID1B)遺伝子の発現レベルを、
(i)JARID1B遺伝子のmRNAを検出すること;
(ii)JARID1Bタンパク質を検出すること;および
(iii)JARID1Bタンパク質の生物活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか1つによって決定する段階;ならびに
(b)該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階(a)で測定された発現レベルの増大を、がんの存在と関連付ける段階
を含む、方法。 - 前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記対象由来の生物試料が、生検試料、喀痰、血液、胸水または尿を含む、請求項1記載の方法。
- (a)JARID1B遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)JARID1Bタンパク質を検出するための試薬;および
(c)JARID1Bタンパク質の生物活性を検出するための試薬
からなる群より選択される試薬を含む、がんを診断するためのキット。 - 前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、請求項4記載のキット。
- 単離された二本鎖分子であって、該分子がJARID1B遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がSEQ ID NO:21または30に対応する核酸配列を含み、該分子が約19〜約25ヌクレオチド長を有する、分子。
- センス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'末端のいずれかまたは両方に、2〜10ヌクレオチドからなる1つまたは2つの3'オーバーハングを有する、請求項6記載の二本鎖分子。
- 介在性の一本鎖核酸配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる、請求項6記載の二本鎖分子。
- 一般式
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有し、[A]がセンス鎖であり、[B]が3〜23ヌクレオチドからなる介在一本鎖核酸配列であり、かつ[A']が[A]に対する相補的配列を含むアンチセンス鎖である、請求項8記載の二本鎖分子。 - 請求項6〜9のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードする、ベクター。
- センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がSEQ ID NO:21または30のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該ベクターが、JARID1B遺伝子を発現している細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
- 単離された二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを対象に投与する段階を含む、がんを治療または予防するための方法であって、該分子がJARID1B遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がJARID1B遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含み、該分子が約19〜約25ヌクレオチド長を有する、方法。
- 前記二本鎖分子が、請求項6〜9のいずれか一項記載の二本鎖分子である、請求項12記載の方法。
- 前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌からなる群より選択される、請求項12または13記載の方法。
- 単離された二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを含む、がんを治療または予防するための組成物であって、該分子がJARID1B遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がJARID1B遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含み、該分子が約19〜約25ヌクレオチド長を有する、組成物。
- 前記二本鎖分子が請求項6〜9のいずれか一項記載の二本鎖分子である、請求項15記載の組成物。
- 前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、請求項15または16記載の組成物。
- がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
(a)試験剤をJARID1Bポリペプチドと接触させる段階;
(b)該ポリペプチドと試験剤との間の結合活性を検出する段階;および
(c)該ポリペプチドと結合する試験剤を候補剤として選択する段階
を含む、方法。 - がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
(a)試験剤をJARID1Bポリペプチドと接触させる段階;
(b)該ポリペプチドの生物活性を検出する段階;および
(c)試験剤の非存在下で検出される生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制する該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。 - 前記生物活性が、細胞増殖活性、抗アポトーシス活性、E2F1遺伝子またはE2F2遺伝子の発現の促進活性、および脱メチル化活性からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
- がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
(a)試験剤の存在下で、JARID1Bポリペプチドを、脱メチル化される基質と、該基質の脱メチル化に適した条件下で接触させる段階;
(b)該基質のメチル化レベルを検出する段階;および
(c)試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、該基質のメチル化レベルを増大させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。 - 前記基質がメチル化ヒストンH3である、請求項21記載の方法。
- 前記メチル化レベルをヒストンH3のリシン4で検出する、請求項21記載の方法。
- がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
(a)試験剤を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)該細胞におけるヒストンH3のメチル化レベルを検出する段階:および
(c)試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、ヒストンH3のメチル化レベルを増大させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。 - 前記メチル化レベルをヒストンH3のリシン4で検出する、請求項24記載の方法。
- がんを治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
(a)試験剤を、JARID1B遺伝子を発現している細胞と接触させる段階;
(b)JARID1B遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(c)試験剤の非存在下で検出される発現レベルと比較して、JARID1B遺伝子の発現レベルを低下させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。 - がんを治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
(a)試験剤を、JARID1Bの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;ならびに
(c)試験剤の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。 - 前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、請求項18〜27のいずれか一項記載の方法。
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