CN102575297A - Cdc45l作为肿瘤标志物和癌症治疗靶 - Google Patents

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Abstract

本发明基于CDC45L基因和PIF1基因在癌症中过表达且牵涉癌细胞存活的发现。本发明的特征在于使用CDC45L基因和/或PIF1基因作为诊断标志物来诊断癌症或评估/确定癌症受试者预后的方法。本发明的特征还在于针对CDC45L基因或PIF1基因的双链分子，使用此类双链分子来治疗和/或预防癌症的方法或组合物。还有，公开了使用CDC45L和/或PIF1作为分子靶物来鉴定用于治疗和预防肺癌的候选化合物的方法。

Description

CDC45L作为肿瘤标志物和癌症治疗靶
优先权
本申请要求2009年8月13日提交的美国临时申请No.61/274,248的权益，通过述及将其完整内容收入本文。
发明领域
本发明涉及肺癌，更具体地，涉及肺癌的诊断和治疗。
发明背景
原发性肺癌是全世界首要的癌症死亡原因(NPL 1)。已经报告了肺癌发生中牵涉的许多遗传改变，但是精确的分子机制仍然不清楚(NPL 2)。在过去几十年里，细胞毒剂，包括帕利他赛(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、和长春瑞滨(vinorelbine)，开始为晚期NSCLC患者提供多种治疗选项，然而，与基于顺铂的疗法相比，那些方案提供有限的存活好处(NPL3)。在这些细胞毒性药物之外，开发了数种分子靶向剂，诸如针对VEGF(即贝伐单抗(bevacizumab)/抗VEGF)或EGFR(即西妥昔单抗(cetuximab)/抗EGFR)的单克隆抗体以及EGFR酪氨酸激酶的抑制剂(即吉非替尼(gefitinib)和埃罗替尼(erlotinib))，而且现在广泛用于临床实践(NPL 4-6)。每一种新方案能给有限比例的患者提供存活好处。因此，急切期待新治疗策略，诸如开发适用于绝大多数患者且毒性较小的更有效的分子靶向剂。
为了分离用于诊断、治疗、和/或预防肺癌的潜在分子靶，使用由27,648种基因或表达序列标签(EST)组成的cDNA微阵列，对通过激光显微解剖自101例肺癌组织纯化的癌细胞实施基因表达概况的基因组范围分析(NPL7-12)。为了验证各基因产物的生物学和临床病理学意义，建立了使用临床肺癌材料的肿瘤组织微阵列分析与RNA干扰(RNAi)技术和细胞生长/侵袭测定法的组合的筛选系统(NPL 13-37)。
在芽殖酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中，CDC45细胞分裂周期45-细胞(cell division cycle 45-cell，CDC45)基因是启动DNA复制所需的一种必需基因，而且它与MCM和CDC6蛋白一起形成在真核细胞中启动DNA复制必需的复合物(NPL 38)。酵母CDC45基因的人同系物，称作CDC45L，编码566个氨基酸的蛋白质且与酵母CDC45显示27.6％同一性(NPL39)。CDC45L在HeLaS3细胞中与延伸DNA聚合酶δ和-ε，及与GINS复合物的成分Psf2以及与推定的复制性DNA螺旋酶复合物的亚基MCM5和-7相互作用(NPL 40)。已经报告了癌细胞系的正在增殖的细胞群中较高水平的CDC45蛋白表达(NPL 41)。然而，尚未阐明CDC45L激活在癌症发生和进展中的作用。
另一方面，小整合频率1(petite integration frequency 1，PIF1)基因最初是在酿酒酵母中鉴定的，并归类为自酵母至人保守的SFI 5′至3′DNA螺旋酶的一个成员(NPL 42)。PIF1在酵母中的功能涉及mtDNA修复、rDNA复制和调节端粒长度(NPL 42，43)。另外，认为酵母PIF1是一种区域特异性的DNA螺旋酶，因为它在体外需要一种特定DNA结构来实现高效DNA的解开且以5′至3′方向解开DNA(NPL 43)。虽然PIF1样螺旋酶存在于多种生物体中，但是大多数研究是在酵母物种中进行的，而且关于PIF1在哺乳动物细胞中的功能及它在癌发生中的作用知道的很少。
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发明概述
在筛选用于人癌症诊断、治疗和预防的新分子靶物的过程中，结合激光显微解剖在含有27,648种基因的cDNA微阵列上实施了对267例肺癌的基因组范围表达概况分析(Kikuchi T，et al.Oncogene.2003 Apr 10；22(14)：2192-205；Kikuchi T，et al.Int J Oncol.2006Apr；28(4)：799-805；Kakiuchi S，et al.，MolCancer Res.2003May；1(7)：485-99；Kakiuchi S，et al.，Hum Mol Genet.2004Dec 15；13(24)：3029-43.Epub 2004 Oct 20；Taniwaki M，et al.，Int J Oncol.2006Sep；29(3)：567-75)。结果证明了CDC45L基因在绝大多数原发性肺癌中频繁过表达。还有，发现PIF1基因——该基因被鉴定为编码与CDC45L蛋白相互作用的蛋白质——在肺癌中过表达。另外，针对这些基因的siRNA有效遏制癌细胞增殖。这些结果提示CDC45L基因和PIF1基因会变成较好的用于癌症诊断或治疗的分子靶物。
因此，本发明涉及通常在肿瘤中上调的癌症相关基因CDC45L和PIF1，及用于为使用CDC45L和/或PIF1的癌症治疗开发分子靶向药物的策略。
在一个方面，本发明提供利用CDC45L和/或PIF1基因的表达水平作为指标来诊断癌症，例如过表达CDC45L基因和/或PIF1基因的癌症，例如肺癌的方法。在本发明的方法中，可借助适宜的引物或探针来检测CDC45L或PIF1基因的mRNA，或者可借助抗CDC45L或PIF1抗体来检测CDC45L或PIF1蛋白，以测定基因的表达水平。在一些实施方案中，CDC45L和/或PIF1介导或促进所述癌症。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一个实施方案中，所述癌症是肺腺癌(ADC)、肺鳞状细胞癌(SCC)、和肺大细胞癌(LCC)、或小细胞肺癌(SCLC)。
本发明还提供利用CDC45L的表达水平作为指标来预测癌症，例如肺癌受试者的进展的方法。
另外，本发明提供利用CDC45L和/或PIF1基因的表达水平或CDC45L和/或PIF1蛋白的生物学活性作为指标来预测癌症，例如肺癌患者的预后的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供利用对CDC45L和/或PIF1多肽的结合、CDC45L和/或PIF1基因的表达水平、或CDC45L和/或PIF1多肽的生物学活性作为指标来筛选用于治疗或预防癌症，例如肺癌的候选化合物的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供利用CDC45L多肽与PIF1多肽之间的相互作用作为指标来筛选用于治疗或预防癌症，例如肺癌的候选化合物的方法。
在又一个实施方案中，本发明提供针对CDC45L或PIF1基因，抑制该基因表达的双链分子，例如siRNA，及编码该双链分子的载体。本发明的双链分子可用于治疗或预防癌症，例如CDC45L和/或PIF1介导的、或缘于CDC45L和/或PIF1过表达的癌症，例如肺癌。
在另一个实施方案中，本发明提供在受试者中治疗或预防癌症的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的针对CDC45L基因或PIF1基因的双链分子或编码所述双链分子的载体，其中该双链分子在导入表达CDC45L基因或PIF1基因的细胞中时抑制细胞增殖以及该基因表达。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防癌症的组合物，其包含针对CDC45L或PIF1的双链分子或编码所述双链分子的载体，和药学可接受载体，其中该双链分子在导入表达CDC45L基因或PIF1基因的细胞中时抑制细胞增殖以及该基因表达。
本领域的技术人员会理解，本发明的一个或多个方面可以满足某些目的，而一个或多个其它方面可以满足某些其它目的。每一个目的可能不在全部方面均同等地适用于本发明的每一个方面。因此，前述目的可以择一地适用于本发明的任何一个方面。在联系附图和实施例阅读下面的详细说明时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，前面的发明概要和后面的详细说明都仅仅提出了优选的实施方案，并不对本发明或本发明的其它可替换实施方案构成限制。
附图简述
本领域技术人员在考虑了下文的附图简要说明及对本发明及其优选实施方案的详细说明后将清楚地得知本发明的各个方面的应用：
图1。图1描绘肺肿瘤组织和细胞系中的CDC45L表达。A，B，通过半定量RT-PCR分析检测的，1份正常肺组织和15份临床肺癌组织样品(5份肺ADC，5份肺SCC，和5份SCLC)(A)及正常气道上皮衍生细胞(SAEC)和15种肺癌细胞系(B)中的CDC45L表达。C，通过Western印迹分析检测的，6种肺癌细胞系和SAEC细胞中的CDC45L蛋白表达。D，LC319细胞中内源CDC45L蛋白的亚细胞定位。CDC45L在核中强染色，而在胞质中弱染色。
图2。图2描绘正常组织中的CDC45L表达和NSCLC患者的CDC45L过表达与较差预后的关联。A，5种正常组织(心，肺，肝，肾，和睾丸)和肺癌中CDC45L蛋白表达的免疫组织化学分析。CDC45L在睾丸和肺癌细胞中(主要在核和/或胞质中)丰富表达，但是在剩余四种正常组织中几乎检测不到它的表达。B，癌症组织中CDC45L表达的阳性和阴性染色的例子(初始放大倍数X100)。C，CDC45L蛋白表达与较差预后的关联。NSCLC患者存活的Kaplan-Meier分析(P＝0.0045，时序检验)。
图3。图3描绘针对CDC45L的siRNA对肺癌细胞的生长遏制效应。A，通过半定量RT-PCR分析，两种不同的针对CDC45L的siRNA，即si-CDC45L-#1和si-CDC45L-#2及两种对照siRNA(si-LUC和si-EGFP)对A549(左)和SBC-3(右)细胞中CDC45L表达的基因敲低效应。B，C，经si-CDC45L或对照siRNA转染的A549(左)和SBC-3(右)细胞的集落形成(B)和MTT(C)测定法。柱，三次重复测定的相对吸光度；线，SD。D，经si-CDC45L-#2或si-LUC转染的A549细胞的流式细胞术分析(转染后48小时)。
图4。图4描绘CDC45L与PIF1的相互作用。A，通过半定量RT-PCR分析，1份正常肺组织和15份临床肺癌组织样品中CDC45L和PIF1的表达分析。B，肺癌SBC-3细胞中内源CDC45L与外源PIF1的相互作用。用抗FLAG抗体对来自经带FLAG标签的PIF1表达质粒转染的SBC-3细胞的细胞溶胞物进行免疫沉淀。使用抗CDC45L抗体对免疫沉淀物进行Western印迹分析。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。C，SBC-3细胞中内源CDC45L和外源PIF1的免疫荧光染色。显现了CDC45L-Alexa488、PIF 1-Alexa594、或细胞核(4′6′-二脒-2-苯基吲哚二盐酸盐[DAPI])。观察到CDC45L和PIF1在核和胞质中的共定位。
图5。图5描绘针对PIF1的siRNA对肺癌细胞的生长遏制效应。A，通过半定量RT-PCR分析检测的，两种si-PIF1(si-PIF1-#1和si-PIF1-#2)和两种对照siRNA(si-LUC和si-EGFP)对A549(左)和SBC-3(右)细胞中PIF1表达的基因敲低效应。B，C，经si-PIF1或对照siRNA转染的A549(左)和SBC-3(右)细胞的集落形成(B)和MTT(C)测定法。柱，三次重复测定的相对吸光度；线，SD。
实施方案的描述
尽管与本文描述相似或等价的任何方法和材料可用于实践或测试本发明实施方式，在此仍描述了优选方法、装置、与材料。然而，在描述本发明的材料与方法之前，应理解本发明并不限于本文中的特定大小、形状、尺度、材料、方法、方案等，因其可根据常规实验与优化而有变化。亦应理解本描述所用的命名法仅以描述特定版本或实施例为目的，并非意欲限定本发明的范围，所述范围仅由权利要求所限定。
通过本文中的述及而具体收录本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的整个公开内容。然而，本文中无一处要解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开。
当存在冲突时，应以本说明书所述为准，包括定义在内。另外，材料、方法、和实施例仅仅是例示性的，而非意图是限制性的。
定义
除非另有明确说明，本文中用语“一个/种”、“该”和“所述”指的是“至少一个/种”。
与物质(例如多肽、抗体、多核苷酸等)联用时术语“分离的”和“纯化的”表示该物质基本上不含至少一种可包括于天然来源中的其他物质。因此，分离的或纯化的抗体指基本上不含细胞物质例如碳水化合物、脂质或其他来自该蛋白质(抗体)来源的细胞或组织的污染性蛋白质的抗体，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的抗体。术语“基本上不含细胞物质”包括其中多肽与来自其被分离或重组产生的细胞的细胞组分相分离的所述多肽制备物。
因此，基本上不含细胞物质的多肽包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的异源蛋白质(在此也称为“污染性蛋白质”)的多肽制备物。当多肽系重组产生时，在一些实施方案中，其还基本上不含培养基，包括具有少于约20％、10％或5％蛋白质制备物体积的培养基的多肽制备物。当多肽通过化学合成产生时，在一些实施方案中，其基本上不含化学前体或其他化学品，包括具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计)的与该蛋白质合成有关的化学前体或其他化学药品的多肽制备物。可例如通过在蛋白质制备物的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳及凝胶的考马斯亮蓝染色等之后单一条带的出现来显示特定蛋白质制备物含有分离的或纯化的多肽。在一个实施方案中，本发明的蛋白质(包括抗体)是分离的或纯化的。
“分离的”或“纯化的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时可基本上不含其他细胞物质或培养基，或当化学合成时可基本上不含化学前体或其他化学品。在一个实施方案中，编码本发明蛋白质的核酸分子是分离的或纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可互换地用于指氨基酸残基聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为修饰的残基或非天然存在的残基，例如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸多聚体，以及天然存在的氨基酸多聚体。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及在细胞中翻译后被修饰的那些(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸根和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指除具有修饰的R基或修饰的骨架之外，具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(连接氢原子、羧基、氨基和R基的α碳原子)的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指具有与一般氨基酸不同的结构、但具有类似的功能的化学化合物。
在此，氨基酸可以用它们普遍知道的、IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号表示。
除非另有明确陈述，术语“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可交换使用，并且与氨基酸类似，以普遍接受的单字母代码来表示。类似于氨基酸，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。基因、多核苷酸、寡核苷酸、核酸、或核酸分子可包含DNA、RNA或其组合。
如本文中使用的，术语“生物样品”指整个生物体或其组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不仅限于血液、黏液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、脐带血(amniotic cord blood)、尿液、阴道液和精液)的子集(subset)。“生物样品”进一步指从整个生物体或其细胞、组织或组成部分的子集制备的匀浆物、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物样品”指含有细胞组分(例如蛋白质或多核苷酸)的培养基，例如生物体已在其中繁殖的营养汤或凝胶。
除非另有定义，术语“癌症”指过表达CDC45L和/或PIF1基因的癌症，诸如肺癌，包括腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)、大细胞癌(LCC)、和小细胞肺癌(SCLC)。
(1)基因和多肽
人CDC45L基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：13，而且还作为GenBank登录号NM_003504.3可得。在本文中，短语“CDC45L基因”涵盖人CDC45L基因以及其它动物(包括但不限于非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛)的CDC45L基因，而且包括等位突变体和在其它动物中找到的对应于CDC45L基因的基因。
由人CDC45L基因编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：14，而且还作为GenBank登录号NM_003504.3(NP_003495.1)可得。在本发明中，由CDC45L基因编码的多肽称作“CDC45L”，而且有时称作“CDC45L多肽”或“CDC45L蛋白”。
人PIF1基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：15，而且还作为GenBank登录号NM_025049.2可得。在本文中，短语“PIF1基因”涵盖人PIF1基因以及其它动物(包括但不限于非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛)的PIF1基因，而且包括等位突变体和在其它动物中找到的对应于PIF1基因的基因。
由人PIF1基因编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：16，而且还作为GenBank登录号NM_025049.2(NP_079325.2)可得。在本发明中，由PIF 1基因编码的多肽称作“PIF1”，而且有时称作“PIF1多肽”或“PIF1蛋白”。
依照本发明的一个方面，功能性等同物也包括在CDC45L和PIF1中。在本文中，蛋白质的“功能性等同物”指具有与蛋白质等同的生物学活性的多肽。也就是，任何保留CDC45L或PIF1的至少一种生物学活性的多肽可用作本发明中的此类功能性等同物。例如，CDC45L的功能性等同物和PIF1的功能性等同物保留促进细胞增殖的活性。另外，CDC45L的生物学活性含有对PIF1的结合活性。因此，在一个优选的实施方案中，CDC45L的功能性等同物可含有PIF1结合区。还有，PIF1的生物学活性含有对CDC45L的结合活性。因此，在一个优选的实施方案中，PIF1的功能性等同物可含有CDC45L结合区。
CDC45L的功能性等同物包括那些其中对CDC45L蛋白的天然发生氨基酸序列替代、删除、添加、或插入一个或多个氨基酸，例如1-5个氨基酸，例如多至5％的氨基酸者。还有，PIF1的功能性等同物包括那些其中对PIF1蛋白的天然发生氨基酸序列替代、删除、添加、或插入一个或多个氨基酸，例如1-5个氨基酸，例如多至5％的氨基酸者。
一般地，已知蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不影响蛋白质的功能(Mark DF，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.1984Sep；81(18)：5662-6；Zoller MJ& Smith M.Nucleic Acids Res.1982Oct 25；10(20)：6487-500；Wang A，et al.，Science.1984 Jun 29；224(4656)：1431-3；Dalbadie-McFarland G，et al.，Proc NatlAcad Sci U S A.1982Nov；79(21)：6409-13)。本领域技术人员会认识到，对氨基酸序列进行改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别添加、删除、插入、或替代是“保守修饰”，其中对蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。
氨基酸侧链特性的例子有疏水性氨基酸(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)、亲水性氨基酸(精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、和具有下列共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)；含有羟基基团的侧链(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和酰胺的侧链(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；含有碱的侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)；和含有芳香族的侧链(组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。另外，提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本领域是公知的。例如，下列8个组各自包含彼此构成保守性替代的氨基酸：
(1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
(7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
(8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Thomas E.Creighton，Proteins，Publisher：New York：W.H.Freeman，c1984)。
此类保守性修饰多肽包括在本发明的CDC45L或PIF1蛋白中。然而，本发明并不仅限于此，而且CDC45L或PIF1蛋白包括非保守性修饰，只要它们保留CDC45L或PIF1蛋白的任何一种生物学活性即可。此类经修饰蛋白质中要突变的氨基酸的数目一般是10个氨基酸或更少，例如6个氨基酸或更少，例如3个氨基酸或更少。
通过添加一个或多个氨基酸而修饰的蛋白质的例子有CDC45L或PIF1蛋白的融合蛋白。融合蛋白包括CDC45L或PIF1蛋白与其它肽或蛋白质的融合物，其也可用于本发明。融合蛋白可通过本领域技术人员公知的技术来生成，例如通过连接编码CDC45L或PIF1基因的DNA与编码其它肽或蛋白质的DNA，使得框匹配，将融合DNA插入表达载体中并在宿主中表达它。对与CDC45L或PIF1蛋白融合的肽或蛋白质没有限制，只要所得融合蛋白保留CDC45L或PIF1蛋白的任何一种目标生物学活性即可。
可用作要与蛋白质融合的已知肽包括例如FLAG(Hopp TP，et al.，Biotechnology 6：1204-10(1988))、含有六个His(组氨酸)残基的6xHis、10xHis、流感凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7标签、HSV标签、E标签、SV40T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B标签、蛋白C片段、等等。可以与本发明蛋白质融合的蛋白质的例子包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)、等等。
另外，经过修饰的蛋白并不排除多态变体、种间同源物、和那些由这些蛋白的等位基因编码者。
本领域已知用于分离功能性等同物蛋白的方法包括例如杂交技术(Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，ColdSpring Harbor Lab.Press，2001)。本领域技术人员能容易地分离与编码人CDC45L蛋白的人CDC45L DNA序列(例如SEQ ID NO：13)的整个或部分具有高同源性(即序列同一性)的DNA，并自分离的DNA分离人CDC45L蛋白的功能性等同物蛋白。还有，本领域技术人员能容易地分离与编码人PIF1蛋白的人PIF1 DNA序列(例如SEQ ID NO：15)的整个或部分具有高同源性(即序列同一性)的DNA，并自分离的DNA分离人PIF1蛋白的功能性等同物蛋白。如此，用于本发明的蛋白质包括那些由在严格条件下与编码人CDC45L蛋白或人PIF1蛋白的DNA序列的整个或部分杂交的DNA编码且是人CDC45L蛋白或人PIF1蛋白功能性等同物者。这些蛋白质包括与自人或小鼠衍生的蛋白质对应的哺乳动物同源物(例如由猴、大鼠、家兔或牛基因编码的蛋白质)。在分离与编码人CDC45L基因或人PIF1基因的DNA高度同源的cDNA时，可使用肺癌组织或细胞系或来自睾丸的组织。
本领域技术人员能常规选择用于分离编码与人CDC45L基因或人PIF1基因功能等同的蛋白质的DNA的杂交条件。短语“严格(杂交)条件”指这样的条件，在该条件下，核酸分子会与其靶序列杂交，通常在核酸复杂混合物中，而没有与其它序列的可检测的杂交。严格条件取决于序列，而且在不同情况下会有所不同。较长的序列在更高温度特异性杂交。对于核酸杂交的详尽指导可见于Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地说，严格条件选择为在限定的离子强度pH，比特定序列的热熔点(Tm)低大约5-10℃。Tm是如下的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度下在平衡时50％的与靶互补的探针与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm，在平衡时50％的探针被占据)。严格条件还可以通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，例如背景杂交的10倍。
例如，可用下述步骤进行预杂交：在68摄氏度用“Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)进行30分钟或更长的预杂交，添加经过标记的探针，并在68摄氏度温育一小时或更长。下面的清洗步骤可在例如低严格度条件中进行。一种低严格度条件是例如42℃、2xSSC、0.1％SDS，例如50℃、2xSSC、0.1％SDS。在一些实施方案中，使用高严格条件。一种高严格条件是例如在室温在2xSSC、0.1％SDS中清洗3次各20分钟，然后在1xSSC、0.1％SDS中在37摄氏度清洗3次各20分钟，并在1xSSC、0.1％SDS中在50摄氏度清洗2次各20分钟。然而，数种因素，诸如温度和盐浓度，可影响杂交的严格度，而且本领域技术人员可合适地选择所述因素以达到所需的严格度。
代替杂交，可以利用基因扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)方法，使用基于编码人CDC45L(SEQ ID NO：13或15)或PIF1(SEQ ID NO：14或16)蛋白的DNA的序列信息合成的引物来分离编码与人CDC45L或PIF1基因功能等同的蛋白质的DNA，[实施例]中的半定量RT-PCR指出了引物序列的例子。
由经由上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的与人CDC45L或PIF1蛋白功能等同的蛋白质通常与人CDC或PIF1蛋白的氨基酸序列具有高同源性(也称作序列同一性)。“高同源性”(也称作“高序列同一性”)通常指两种最佳比对序列(或是多肽或是多核苷酸序列)之间的同一性程度。通常，高同源性或序列同一性指40％或更高的同源性，例如60％或更高，例如80％或更高，例如85％、90％、95％、97％、98％、99％、或更高。两种多肽或多核苷酸序列之间的同源性或同一性程度可遵循“Wilbur WJ & LipmanDJ.Proc Natl Acad Sci U S A.1993Feb；80(3)：726-30”中的算法来确定。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的别的例子是有记载的BLAST和BLAST 2.0算法(Altschul SF，et al.，J Mol Biol.1990Oct 5；215(3)：403-10；Nucleic Acids Res.1997Sep 1；25(17)：3389-402)。用于实施BLAST分析的软件是公众通过(美国)国家生物技术信息中心(在万维网上于ncbi.nlm.nih.gov/)可得的。该算法涉及首先通过鉴定检索序列中在与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足一些正值阈得分T的长度W的短词来鉴定高得分序列对(HSP)。T称作邻近词得分阈(Altschul et al，supra)。这些初始邻近命中词充当种子启动搜索以寻找含有它们的更长HSP。
然后将命中词沿每一条序列在两个方向上延伸，只要累积比对得分能增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对配对残基的奖分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用打分矩阵来计算累积得分。命中词在每个方向上的延伸在下述情况下停止：累积比对得分自其最大实现值下降数量X；由于一个或多个打负分残基比对的累积，累积得分达到零或以下；或到达任一序列的末端。
BLAST算法参数W、T、和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用词长(W)28、期望(E)10、M＝1、N＝-2、和双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用词长(W)3、期望(E)10、和BLOSUM62打分矩阵(Henikoff S & Henikoff JG.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Nov 15；89(22)：10915-9)。
可用于本发明语境的蛋白质可在氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的有无、或形式方面有变化，这取决于用于产生它的细胞或宿主，或使用的纯化方法。无论如何，只要它具有CDC45L蛋白(SEQ ID NO：14)或PIF1蛋白(SEQ ID NO：16)的任何一种生物学活性，它就可用于本发明。
本发明还涵盖CDC45L蛋白和PIF1蛋白的部分肽的使用。部分肽具有CDC45L蛋白或PIF1蛋白特有的氨基酸序列，而且由不到约400个氨基酸，通常不到约200个，常常不到约100个氨基酸，且至少约7个氨基酸，例如约8个氨基酸或更多，例如约9个氨基酸或更多组成。
用于本发明筛选的部分CDC45L肽适当含有CDC45L的至少一个结合域。另外，用于本发明筛选的部分CDC45L适当含有PIF1结合区。术语CDC45L蛋白的“功能性等同物”也涵盖此类部分肽。还有，用于本发明筛选的部分PIF1肽适当含有PIF1的至少一个结合域。另外，用于本发明筛选的部分PIF1适当含有CDC45L结合区。术语PIF1蛋白的“功能性等同物”也涵盖此类部分肽。
用于本发明方法的多肽或片段可作为天然存在蛋白质通过常规纯化方法获得自自然界，或基于所选择的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，可用于合成的常规肽合成法包括：
(1)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；
(2)The Proteins，Vol.2，Academic Press，New York，1976；
(3)Peptide Synthesis(日语)，Maruzen Co.，1975；
(4)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日语)，Maruzen Co.，1985；
(5)Development of Pharmaceuticals(第二卷)(日语)，Vol.14(peptide synthesis)，Hirokawa，1991；
(6)WO99/67288；和
(7)Barany G.& Merrifield R.B.，Peptides Vol.2，“Solid Phase Peptide Synthesis”，Academic Press，New York，1980，100-118。
或者，可采用用于产生多肽的任何已知基因工程方法来获得该蛋白质(例如Morrison DA.，et al.，J Bacteriol.1977 Oct；132(1)：349-51；Clark-Curtiss JE& Curtiss R 3rd.Methods Enzymol.1983；101：347-62)。例如，首先制备以可表达形式(例如位于包含启动子的调节序列的下游)包含编码目标蛋白质的多核苷酸的适合的载体，然后转化入合适的宿主细胞，接着培养宿主细胞以产生蛋白质。更具体的说，通过将编码CDC45L或PIF1的基因插入用于表达外来基因的载体例如pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS或pCD8，在宿主(例如动物)细胞等中表达该基因。
启动子可用于表达。可使用任何常用的启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic engineering，vol.3.Academic Press，London，1982，83-141)、EF-α启动子(Kim DW，et al.Gene.1990 Jul16；91(2)：217-23)、CAG启动子(Niwa H，et al.，Gene.1991 Dec15；108(2)：193-9)、RSV LTR启动子(Cullen BR.Methods  Enzymol.1987；152：684-704)、SRα启动子(Takebe Y，et al.，Mol Cell Biol.1988Jan；8(1)：466-72)、CMV立即早期启动子(Seed B & Aruffo A.Proc Natl AcadSci U S A.1987May；84(10)：3365-9)、SV40晚期启动子(Gheysen D & Fiers W JMol Appl Genet.1982；1(5)：385-94)、腺病毒晚期启动子(Kaufman RJ，et al.，Mol Cell Biol.1989Mar；9(3)：946-58)、HSV TK启动子等。
可根据任何方法将载体导入宿主细胞以表达CDC45L或PIF1基因，例如电穿孔法(Chu G，et al.，Necleic Acids Res.1987Feb 11；15(3)：1311-26)、磷酸钙法(Chen C & Okayama H.Mol Cell Biol.1987Aug；7(8)：2745-52)、DEAE右旋糖苷法(Lopata MA，et al.，Nucleic Acids Res.1984Jul 25；12(14)：5707-17；Sussman DJ & Milman G.Mol Cell Biol.1984 Aug；4(8)：1641-3)、脂转染法(Derijard B，et al.，Cell.1994 Mar 25；76(6)：1025-37；Lamb BT，et al.，Nat Genet.1993 Sep；5(1)：22-30；Rabindran SK，et al.，Science.1993 Jan 8；259(5092)：230-4)等。
还可采用体外翻译系统在体外产生蛋白。
在本发明的语境中，短语“CDC45L基因”涵盖编码人CDC45L或人CDC45L基因的任何功能性等同物的多核苷酸。还有，短语“PIF1基因”涵盖编码人PIF1或人PIF1基因的任何功能性等同物的多核苷酸。
CDC45L基因和PIF1基因可作为天然存在的蛋白自自然界获得，经常规克隆方法获得，或经由基于选定核苷酸序列的化学合成来获得。使用cDNA文库等等克隆基因的方法是本领域公知的。
(2)抗体
如本文中使用的，术语“抗体”意图包括与指定蛋白质或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可包括人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、与其它蛋白质或放射性标记物融合的抗体、和抗体片段。另外，本文中的抗体以最广义使用，而且明确涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。“抗体”包括所有类(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
本发明可使用针对CDC45L蛋白或PIF1蛋白的抗体。这些抗体可用于诊断肺癌。另外，本发明可使用针对CDC45L多肽或PIF多肽的部分肽的抗体。
在下文所述筛选方法中，可优选使用针对CDC45L多肽之PIF结合区或PIF1多肽之CDC45L结合区的抗体。这些抗体可用于抑制和/或阻断CDC45L多肽与PIF1多肽之间的相互作用，例如结合，而且可用于治疗和/或预防(过)表达CDC45L和/或PIF1的癌症，例如肺癌。这些抗体会通过已知方法来提供。对于用于生成本发明中使用的抗体的技术，可用于常规方法。
(3)双链分子
本文中使用的术语“双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括例如短干扰RNA(siRNA，例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))与短干扰DNA/RNA(siD/R-NA，例如DNA与RNA的双链嵌合体(dsD/R-NA)或DNA与RNA的小发夹嵌合体(shD/R-NA))。
本文中使用的术语“siRNA“指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括与靶基因的有义核酸序列对应的核糖核苷酸(亦用“有义链”指代)、与靶基因的反义核酸序列对应的核糖核苷酸(亦用“反义链”指代)、或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列及与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。
本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补的序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。在本发明中，双链RNA分子也可指siRNA或小干扰RNA分子。两条链的序列可不仅包含选自靶基因序列中蛋白质编码序列的“有义”或“反义”RNA，亦可包括具有选自所述靶基因的非编码区域的核苷酸序列的RNA分子。
如本文中使用的，本文中使用的术语“shRNA”指具有茎-环结构的siRNA，所述茎-环结构包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)”
本文中使用的术语“siD/R-NA”指包含RNA和DNA二者的双链核酸分子，包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，其阻止靶mRNA的翻译。在本说明书中，杂合体表示这样的分子，其中由DNA组成的寡核苷酸和由RNA组成的寡核苷酸相互杂交形成双链分子；而嵌合体表示组成所述双链分子的链中的一条或两条可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞的常规技术。所述siD/R-NA包括靶基因的有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、靶基因的反义核酸序列(亦用“反义链”指代)、或两者。siD/R-NA可以这样构建，使单个转录物同时具有来自靶基因的有义核酸序列和互补反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。
在本文中使用的术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，所述两个分子包含彼此互补的序列并且已经藉由所述互补序列退火在一起而形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅仅包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包含具有选自靶基因非编码区的核苷酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个由RNA和DNA二者组成(嵌合体分子)，或者一个分子由RNA组成而另一个由DNA组成(杂合双链)。
在本文中使用的术语“shD/R-NA”是指：具有茎-环结构的siD/R-NA，所述茎-环结构包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使它们之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。
(i)靶序列
如本文中使用的，术语“靶序列”是靶基因的mRNA或cDNA序列内的核苷酸序列，其会导致靶基因的完整mRNA翻译的遏制，如果靶向该序列的双链分子被导入表达该靶基因的细胞内的话。对于靶基因的mRNA或cDNA序列内的核苷酸序列，当包含与靶序列对应的序列的双链分子抑制该靶基因在表达该基因的细胞中的表达时，该核苷酸序列可确定为靶序列。遏制基因表达的双链多核苷酸可以由靶序列和3′突出端(例如uu)组成。
当靶序列由cDNA序列来显示时，使用双链cDNA的有义链，即mRNA序列转变成DNA序列的序列来限定靶序列。双链分子包含具有与靶序列对应的序列的有义链和具有靶序列的互补序列的反义链，而且反义链与有义链在互补序列处杂交以形成双链分子。
在本文中，短语“与...对应”或“对应于”表示根据构成双链分子的有义链的核酸种类来变换靶序列。例如，当靶序列以DNA序列来显示且双链分子的有义链具有RNA区时，该RNA区内的碱基“t”用碱基“u”置换。另一方面，当靶序列以RNA序列显示且双链分子的有义链具有DNA区时，该DNA区内的碱基“u”用“t”置换。例如，当靶序列以SEQ ID NO：9的RNA序列显示且双链分子的有义链具有由DNA构成的3′侧半区时，“与靶序列对应的序列”是“5′-GCAAACACCUGCTCAAGTC-3′”。
还有，对于双链分子的反义链，靶序列的互补序列可依照构成反义链的核酸种类来限定。例如，当靶序列以SEQ ID NO：9的RNA显示且双链分子的反义链具有由DNA构成的5′侧半区时，“靶序列的互补序列”是“3′-CGUUUGUGGACGAGTTCAG-5′”。
另一方面，当双链分子由RNA构成时，与SEQ ID NO：9的靶序列对应的序列是SEQ ID NO：9的RNA序列，而且与SEQ ID NO：9的靶序列对应的互补序列是“3′-CGUUUGUGGACGAGUUCAG-5′”的RNA序列。
除了与靶序列对应的序列及其互补序列之外，还双链分子可具有一个或两个长度为2-5个核苷酸的3’突出端(例如uu)和/或连接有义链和反义链以形成发夹结构的环序列。
针对CDC45L基因、与CDC45L mRNA杂交的双链分子通过结合CDC45L基因的通常呈单链的mRNA转录物，由此干扰翻译，从而抑制CDC45L蛋白表达，抑制或降低由该基因编码的CDC45L蛋白的生成。还有，通过结合PIF1基因通常是单链的mRNA转录物，由此干扰翻译，并如此抑制PIF1蛋白表达，针对PIF1基因的双链分子(该分子与PIF1 mRNA杂交)抑制或降低由该基因编码的PIF1蛋白的生成
这两种双链分子每一种都抑制癌细胞系中CDC45L基因和PIF1基因的表达(图3和图5)。
因此，本发明提供分离的双链分子，其具有在导入细胞中时抑制或降低癌细胞中CDC45L基因或PIF1基因表达的特性。双链分子的靶序列可通过下文所述siRNA设计算法来设计。
在优选的实施方案中，CDC45L的靶序列包括例如
5’-GCAAACACCUGCUCAAGUC-3’(SEQ ID NO：9)或
5’-GGACGUGGAUGCUCUGUGU-3’(SEQ ID NO：10)。
还有，在优选的实施方案中，PIF1的靶序列包括例如
5’-GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-3’(SEQ ID NO：11)或
5’-GGCAUGACCCUGGAUUGUG-3’(SEQ ID NO：12)。
换言之，本发明还提供其靶序列包含SEQ ID NO：9，10，11或12或由其组成的双链分子。
具体地，本发明提供了下列双链分子[1]至[18]：
[1]一种分离的双链分子，它当被导入细胞后，抑制CDC45L基因或PIF1基因的体内表达和细胞增殖，其中所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
[2]一种分离的双链分子，它当被导入细胞后，抑制CDC45L基因或PIF1基因的体内表达和细胞增殖，其中所述双链分子包含有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成双链，其中所述有义链包含与选自下组的靶序列对应的核苷酸序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12；
[3][1]至[2]中所述的双链分子，其中所述靶序列包含来自选自SEQ IDNO：13或15的核苷酸序列的约19个至约25个连续核苷酸；
[4][1]至[2]任一中所述的双链分子，其具有少于约100个核苷酸的长度；
[5][4]中所述的双链分子，其具有少于约75个核苷酸的长度；
[6][5]中所述的双链分子，其具有少于约50个核苷酸的长度；
[7][6]中所述的双链分子，其具有少于约25个核苷酸的长度；
[8][7]中所述的双链分子，其具有约19到约25个核苷酸的长度；
[9][1]至[8]任一中所述的双链分子，其由单一寡核苷酸组成，所述寡核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；
[10][9]中所述的双链分子，其具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的靶序列对应的核苷酸序列的有义链，[B]为间插单链，且[A′]为包含与[A]中选定的靶序列之互补序列对应的核苷酸序列的反义链；
[11][1]至[10]任一中所述的双链分子，其包含RNA。
[12][1]至[11]任一中所述的双链分子，其包含DNA和RNA。
[13][12]中所述的双链分子，其是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体。
[14][13]中所述的双链分子，其中所述有义链与反义链分别由DNA与RNA构成。
[15][12]中所述的双链分子，其为DNA与RNA的嵌合体。
[16][15]中所述的双链分子，其中有义链中靶序列的5’端区域和/或反义链中靶序列的互补序列的3’端区域由RNA组成。
[17][16]中所述的双链分子，其中所述RNA区域由9到13个核苷酸组成；和
[18][1]至[2]任一中所述的双链分子，其包含一个或两个3’突出端。
本发明所述的双链分子将在下面更详细描述。
设计具有抑制细胞内靶基因表达能力的双链分子的方法是已知的(见例如，美国专利No.6,506,559，本文通过提述并入其全部内容)。例如，可以从Ambion网站(在万维网上ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)访问用于设计siRNA的计算机程序。
该计算机程序可以根据如下的规程选择双链分子的靶核苷酸序列。
靶点的设计
1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描搜寻AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3’侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶点。Tuschl等建议避免针对5’和3’非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白质的结合位点，而UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。
2.将潜在靶点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列具有显著同源性的靶序列排除在考虑之外。主要使用BLAST(Altschul SF等，Nucleic Acids Res 1997 Sep 1，25(17)：3389-402)，其可见于NCBI服务器：万维网上ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/处。
3.选择合格的靶序列用于合成。通常沿着待评估的基因的长度选择几个靶序列。
“实施例”中为CDC45L基因设计的优选靶序列包括
5’-GCAAACACCUGCUCAAGUC-3’(SEQ ID NO：9)或
5’-GGACGUGGAUGCUCUGUGU-3’(SEQ ID NO：10)。
还有，“实施例”中为PIF1基因设计的优选靶序列包括
5’-GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-3’(SEQ ID NO：11)或
5’-GGCAUGACCCUGGAUUGUG-3’(SEQ ID NO：12)。
具体地，本发明提供靶向任一上述靶序列的双链分子，分别检查了它们抑制和降低表达靶基因的癌细胞生长的能力。表达CDC45L基因或PIF1基因的癌细胞的生长受到本发明双链分子抑制和降低(图3和图5)。
因此，本发明提供靶向选自下组的CDC45L基因靶序列的双链分子：
5’-GCAAACACCUGCUCAAGUC-3’(SEQ ID NO：9)和
5’-GGACGUGGAUGCUCUGUGU-3’(SEQ ID NO：10)。
还有，本发明提供靶向选自下组的PIF1基因靶序列的双链分子：
5’-GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-3’(SEQ ID NO：11)和
5’-GGCAUGACCCUGGAUUGUG-3’(SEQ ID NO：12)。
本发明靶向上述CDC45L或PIF1基因靶序列的双链分子包括分离的多核苷酸，其包含靶序列和/或靶序列互补序列的任一核酸序列。靶向CDC45L或PIF1基因的双链分子的例子包括寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO：9，10，11或12及其互补序列对应的序列。然而，本发明不限于这些例子，而且上述核酸序列中的次要修饰是可接受的，只要经过修饰的分子保留遏制CDC45L或PIF1基因表达的能力。在本文中，核酸序列中的“次要修饰”指一处、两处或几处对序列的核酸替代、删除、添加或插入。
在一个实施方案中，双链分子由两条多核苷酸构成，一条多核苷酸具有与靶序列对应的序列，即有义链，而另一条多肽具有与靶序列互补的序列，即反义链。有义链多核苷酸和反义链多核苷酸彼此杂交以形成双链分子。此类双链分子的例子包括dsRNA和dsD/R-NA。
在另一个实施方案中，双链分子由一条多核苷酸构成，其具有与靶序列对应的序列(即有义链)和与靶序列互补的序列(即反义链)二者。一般地，有义链和反义链通过间插链连接，并彼此杂交以形成发夹环结构。此类双链分子的例子包括shRNA和shD/R-NA。
换言之，本发明的双链分子包含具有靶序列之核苷酸序列的有义链多核苷酸和具有靶序列之互补核苷酸序列的反义链多核苷酸，而且两多核苷酸彼此杂交以形成双链分子。在包含该等多核苷酸的双链分子中，两条链任一或二者的多核苷酸的一部分可以是RNA，而且当靶序列以DNA序列来限定时，靶序列及其互补序列内的核苷酸“t”用“u”替换。
在本发明的一个实施方案中，本发明的此类双链分子包含茎-环结构，由有义链和反义链构成。有义链和反义链可以通过环连接。因而，本发明还提供包含单一多核苷酸的双链分子，单一多核苷酸含有有义链和反义链二者，它们通过间插单链连接或侧翼有间插单链。
在本发明中，靶向CDC45L基因或PIF1基因的双链分子可具有选自SEQID NO：9，10，11和12的序列作为靶序列。因而，本发明双链分子的优选例包括在与SEQ ID NO：9，10，11或12及其互补序列对应的序列处彼此杂交的的多核苷酸，和具有与SEQ ID NO：9，10，11或12及其互补序列对应的序列的多核苷酸。
依照本发明，本发明的双链分子可使用实施例中采用的方法测试其能力(见“实施例”中的RNA干扰测定法)。在实施例中，对于包含CDC45L或PIF1基因mRNA的不同部分的有义链及其互补反义链的双链分子依照标准方法在体外测试其降低癌细胞系(例如使用SBC-3和A549)中CDC45L或PIF1基因产物生成的能力。另外，例如，与候选双链分子接触的细胞中CDC45L或PIF1基因产物与在候选分子不存在时培养的细胞相比的降低可通过例如使用所述CDC45L或PIF1基因mRNA的引物进行的RT-PCR来检测(见“实施例”中(b)半定量RT-PCR)。然后在体外基于细胞的测定法中降低CDC45L或PIF1基因产物生成的序列可测试其对细胞生长的抑制效应。然后对于在体外基于细胞的测定法中抑制细胞生长的序列，可使用具有癌症的动物，例如裸鼠异种移植物模型测试其体内能力以确认CDC45L或PIF1基因产物生成的降低和癌细胞生长的降低。
当分离的多核苷酸是RNA或其衍生物时，核苷酸序列中的碱基“t”应替换为“u”。本文中使用的术语“互补”指多核苷酸中核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，且术语“结合”意指两个多核苷酸间物理的或化学的相互作用。当所述多核苷酸包含修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯酶联接时，这些多核苷酸亦可以同样地发生相互结合。一般而言，互补多核苷酸序列在合适条件下杂交以形成包含很少或没有错配的稳定双链体。进一步，本发明的分离多核苷酸的有义链和反义链可通过杂交形成双链分子或发夹环结构。在一个实施方案中，上述双链体在每10个匹配中包含不超过一个错配。在一些实施方案中，双链体的链完全互补，这样的双链体不包含错配。
本发明的多核苷酸的长度通常少于500，200，100，75，50，或25个核苷酸。本发明的分离多核苷酸可用于形成针对CDC45L或PIF1基因的双链分子或制备编码双链分子的模板DNA。当所述多核苷酸用于形成双链分子时，多核苷酸的有义链可长于19个核苷酸，例如长于21个核苷酸，例如介于约19和25个核苷酸之间。
因而，本发明提供了包含有义链和反义链的双链分子，其中有义链包括与靶序列对应的核苷酸序列。在优选的实施方案中，有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为19至25个核苷酸对的双链分子。
当将双链分子导入细胞中时，双链分子充当RISC复合物中识别mRNA的同源序列的向导。被识别的靶RNA受到Dicer核酸酶活性的切割和降解，由此双链分子最终降低或抑制由该RNA编码的多肽生成(表达)。如此，本发明的双链分子可通过其生成在严格条件下与CDC45L或PIF1基因的mRNA特异性杂交的单链的能力来定义。在本文中，mRNA中与自双链分子生成的单链杂交的部分称作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本发明中，“靶序列”的核苷酸序列不仅可使用mRNA的RNA序列来显示，而且也可以以自mRNA合成的cDNA的DNA序列来显示。
本发明中所述双链分子可包含一个或更多修饰核苷酸和/或非磷酸二酯连接。本领域众所周知的化学修饰具有增加所述双链分子的稳定性、可用性和/或细胞摄入的能力。一般技术人员明白本发明分子可包含的其它类型的化学修饰(WO03/070744；WO2005/045037)。在一个实施方案中，可使用修饰以提供改善的抗降解性或改善的摄入。上述修饰的例子包括硫代磷酸酯联接、2’-O-甲基核糖核苷酸(特别是在双链分子的有义链上)、2’-脱氧-氟代核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5’-C-甲基核苷酸以及倒转脱氧脱碱基残基的掺入(美国专利申请No.20060122137)。
另一个实施方案中，可以使用修饰来增强双链分子的稳定性或增加寻靶效率。修饰包括但不限于双链分子两条互补链之间的化学交联、双链分子一条链的3’或5’末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰、2-氟代修饰的核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸(WO2004/029212)。
在另一个实施方案中，修饰可以用于增加或减少针对靶mRNA中和/或互补双链分子链中互补核苷酸的亲和力(WO2005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮(7-deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一个实施方案中，当双链分子是具有3’突出端的双链分子时，可以把3’-末端核苷酸突出核苷酸替换成脱氧核糖核苷酸(Elbashir SM等，Genes Dev2001 Jan 15，15(2)：188-200)。关于进一步的细节，可以利用公开文献如美国专利申请No.20060234970。本发明不限于这些实例，可以将任何已知化学修饰应用于本发明的双链分子，只要所得分子保留抑制靶基因表达的能力。
此外，本发明的双链分子可以包含DNA和RNA二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。具体而言，由DNA链与RNA链形成的杂合多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸表现出提高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA链(多核苷酸)制成的杂合型双链分子、或在任一单链(多核苷酸)或两条单链(多核苷酸)上同时包含DNA和RNA的嵌合型双链分子，诸如此类，来增强所述双链分子的稳定性。DNA链和RNA连的杂合体可以是这样的杂合体，其中有义链是DNA而反义链是RNA，或者相反，只要它在导入表达靶基因的细胞中后具有抑制该基因表达的活性。
在一些实施方案中，有义链多核苷酸是DNA而反义链多核苷酸是RNA。同样，嵌合型双链分子可以具有如下的结构，其中有义链和反义链均由DNA和RNA组成，或者有义链或反义链中的任一条由DNA和RNA组成，只要在导入表达靶基因的细胞中时，所述双链分子具有抑制该基因表达的活性即可。为了提高双链分子的稳定性，在一些实施方案中，分子中包含尽可能多的DNA；而为了诱导靶基因的表达抑制，要求分子在一定范围内是RNA，以充分地诱导表达抑制。在嵌合型双链分子的一个实例中，双链分子的上游部分区域(即位于有义链或反义链内的靶序列或其互补序列之侧翼的区域)为RNA。
所述上游部分区表示有义链的5’侧(5’端)和反义链的3’侧(3’端)。就是说，在一些实施方案中，反义链3’末端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’末端侧翼的区域和反义链3’末端侧翼的区域均由RNA组成。例如，本发明的嵌合型或杂合型双链分子包含以下组合。
有义链：
5’-[DNA]-3’
3’-(RNA)-[DNA]-5’：反义链，
有义链：
5’-(RNA)-[DNA]-3’
3’-(RNA)-[DNA]-5’：反义链，和
有义链：
5’-(RNA)-[DNA]-3’
3’-(RNA)-5’：反义链。
上游部分区可以是由约9-13个核苷酸构成的域，从双链分子的有义链或反义链内的靶序列或其互补序列的末端算起。此外，这种嵌合型双链分子的实例包括这样的实例：链长为19-21个核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半区(对于有义链为5’侧区域而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在这样的嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比反义链整体为RNA时高得多(美国专利申请No.20050004064)。
在本发明中，双链分子可以形成发夹结构，例如短发夹RNA(shRNA)以及由DNA与RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成紧密的发夹转弯，可以用来通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA在单一链上包含有义靶序列和反义靶序列，其中所述序列被环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA进一步与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合。这种复合物结合并切割与所述dsRNA或dsD/R-NA的靶标序列匹配的mRNA。
为了形成发夹环结构，可以在有义序列与反义序列之间设置由任意核苷酸序列构成的环序列。因此，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的双链分子。式中，[A]为有义链，包含与靶序列对应的序列；[B]为间插单链；[A′]为反义链，包含与[A]互补的序列。靶序列可以选自下组：例如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。
本发明不限于这些实例，在双链分子保持抑制被靶定的CDC45L或PIF1基因的表达及导致表达这些基因的细胞受到抑制或减少的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在这些实例的基础上修饰而得到的序列。区域[A]与[A′]杂交而形成由区域[B]构成的环。间插单链部分[B]、即环序列，长度可以为3～23个核苷酸。例如，环序列可以选自由以下的序列组成的组(在万维网上www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html处)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al.，Nature 2002 Jul 25，418(6896)：435-8，Epub 2002 Jun 26)：
CCC、CCACC或CCACACC：Jacque JM et al.，Nature 2002 Jul 25，418(6896)：
435-8，Epub 2002Jun 26；
UUCG：Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002May，20(5)：500-5；Fruscoloni P et al.，
Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18，100(4)：1639-44，Epub 2003 Feb 10；
UUCAAGAGA：Dykxhoorn DM et al.，Nat ReV Mol Cell Biol 2003 Jun，4(6)：457-67。
具有本发明的发夹环结构的双链分子实例如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自由AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA组成的组；但本发明不限于此：
GCAAACACCUGCUCAAGUC-[B]-GACUUGAGCAGGUGUUUGC(对于SEQ ID NO：9的靶序列)；
GGACGUGGAUGCUCUGUGU-[B]-ACACAGAGCAUCCACGUCC(对于SEQ ID NO：10的靶序列)；
GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-[B]-GAAGAUGCUCUGGCCUUUC  (对于SEQ ID NO：11的靶序列)；和
GGCAUGACCCUGGAUUGUG-[B]-CACAAUCCAGGGUCAUGCC(对于SEQ ID NO：12的靶序列)。
此外，为了增强双链分子的抑制活性，可以将几个核苷酸添加到有义链和/或反义链的3’末端，作为3’突出端。添加的核苷酸的数目为至少2个，通常为2-10个，例如为2-5个。添加的核苷酸在双链分子的有义链和/或反义链的3’末端形成单链。3’突出端的核苷酸优选但不限于“u”或“t”。当双链分子具有发夹环结构时，反义链的3′末端添加有3′突出端。
对于双链分子的制备方法可采用本技术领域公知的任何化学合成方法。根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后采用适当的方法使它们退火到一起，来获得双链分子。或者，本发明的双链分子或siRNA分子也可用体外翻译来合成。在此实施方案中，编码包含靶序列及其反义的核苷酸序列的DNA在体外转录成双链分子。在退火的一个实施方案中，将合成的单链多核苷酸以至少约3∶7、例如约4∶6、例如基本上等摩尔量(即约5∶5的摩尔比)的摩尔比混合。然后，将混合物加热到双链分子解离的温度，再逐渐冷却。经退火的双链多核苷酸可以采用本技术领域公知的常用方法来纯化。纯化方法的例子包括：利用琼脂糖凝胶电泳的方法，或者其中任选地除去剩余的单链多核苷酸(例如利用适当的酶进行降解)的方法。
所述位于靶序列侧翼的调控序列可为相同或不同的，以使得它们的表达能够独立地，或者以时间性或空间性方式被调控。所述双链分子可通过将CDC45L或PIF1基因模板克隆入载体(例如含有来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单元或人类H1RNA启动子的载体)以在胞内进行转录。
或者，双链分子可胞内转录：方式是将其编码序列克隆入在该编码序列附近含有在适当细胞中指导双链分子表达的调控序列(例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA poly III转录单元或人H1 RNA启动子)的载体。双链分子的编码序列侧翼的调控序列可以相同或不同，使得它们的表达可独立地或以空间或时间方式调控。下文会描述能够生成双链分子的载体的详情。
(ii)载体
本发明还包括包含一种或多种本文所述的双链分子的载体、以及包含该载体的细胞。本发明的载体编码处于可表达形式的本发明双链分子。在本说明书中，术语“处于可表达的形式”，是指该载体当被导入细胞中时，将表达该分子。在一个实施方案中，载体包含双链分子表达所必需的调节元件。因而，在一个实施方案中，表达载体编码本发明的双链分子且适合表达双链分子。本发明的这种载体可以用于产生双链分子，也可以直接用作癌症治疗的活性成分。
或者，本发明提供了如下的载体，其包括包含有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中的任一个，其中所述有义链核酸包含与SEQ ID NO：9，10，11或12对应的核苷酸序列，而所述反义链核酸由与有义链互补的序列组成，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中所述载体在导入表达CDC45L基因或PIF1的细胞中时抑制所述基因的表达。优选地，多核苷酸是长度为约19个至25个核苷酸的寡核苷酸(例如来自SEQ IDNO：13或15核苷酸序列的连续核苷酸)。更优选地，多核苷酸组合包括单一核苷酸转录物，其包含经单链核苷酸序列相连接的有义链和反义链。更优选地，多核苷酸组合具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中[A]是包括SEQ ID NO：9，10，11或12的核苷酸序列；[B]是由约3个至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；而[A′]是与[A]互补的核苷酸序列。
本发明的载体可通过下述方法生成：例如，将包含靶序列的序列克隆入表达载体中，使调控序列可操作性地连接于该序列，以允许两条链的表达(通过DNA分子的转录)(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May，20(5)：500-5)。例如，作为mRNA之反义的RNA分子由第一启动子(例如位于克隆DNA的3’末端侧翼的启动子序列)转录，对mRNA而言为有义链RNA分子由第二启动子(例如位于克隆DNA的5’末端侧翼的启动子序列)转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默该基因的双链分子构建体。或者，使用分别编码双链分子之有义链和反义链的两个载体构建体来分别表达有义链和反义链，随后形成双链分子构建体。而且，克隆的序列可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，即，载体的单一转录物同时包含靶基因的有义序列和互补的反义序列二者。
也可以配置本发明的载体使得其实现在靶细胞的基因组中的稳定插入(关于同源重组盒载体的说明，参见Thomas KR & Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12)。可以参考例如：Wolff等，Science 1990，247：1465-8；美国专利第5,580,859号、第5,589,466号、第5,804,566号、第5,739,118号、第5,736,524号、第5,679,647号和WO 98/04720。基于DNA的输送技术的例子包括：“裸DNA”、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导型)输送、阳离子脂质复合体、和粒子介导型投递(“基因枪”)或压力介导型输送(例如参照美国专利第5,922,687号)。
本发明的载体可以是，例如，病毒载体或细菌载体。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，例如牛痘或鸡痘(参照美国专利第4,722,848号)。该策略涉及例如使用牛痘病毒作为载体来表达编码双链分子的核苷酸序列。重组牛痘病毒在被导入表达靶基因的细胞时即表达该分子并由此抑制细胞的增殖。可使用的载体的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG载体在Stover等，Nature1991，351：456-60中有记载。其它多种多样的载体可用于双链分子的治疗性施用与生产，例子包括腺病毒载体和腺随伴病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。可以参照例如Shata等，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock等，J Leukoc Biol 2000，68：793-806；以及Hipp等，In Vivo 2000，14：571-85。
(iii)使用双链分子抑制或降低癌细胞生长和治疗或预防癌症的方法
在本发明中，分别检查了针对上文所述靶序列的双链分子抑制或降低(过)表达靶基因的细胞生长的能力。本发明的双链分子抑制或降低了(过)表达CDC45L和/或PIF1基因的癌细胞生长(图3和图5)。
因而，本发明提供了抑制来自CDC45L和/或PIF1基因过表达所致的，或由CDC45L和/或PIF1基因介导的癌症的细胞之细胞生长，即癌性细胞生长的方法，所述方法通过抑制CDC45L和/或PIF1基因的表达来实施。CDC45L或PIF1基因表达可通过任何特异性地靶定CDC45L或PIF1基因表达的前述本发明双链分子或可表达任何本发明双链分子的本发明载体来抑制。
上述本发明双链分子及载体抑制癌性细胞细胞生长的能力提示其可用于治疗癌症，CDC45L和/或PIF1基因过表达所致的或由CDC45L和/或PIF1基因介导的癌症的方法。因此，本发明提供通过施用针对CDC45L或PIF1基因的双链分子即抑制性核酸或表达所述分子的载体治疗CDC45L和/或PIF1基因过表达所致或由CDC45L和/或PIF1基因介导的癌症患者的方法，所述方法无不良作用，因为所述基因在正常器官中几乎检测不到。
具体地，本发明提供下列[1]至[23]的方法：
[1]一种用于抑制或降低(过)表达CDC45L和/或PIF1基因的细胞生长的方法或治疗或预防(过)表达CDC45L和/或PIF1基因的癌症的方法，其中该方法包括对受试者施用至少一种双链分子或编码该双链分子的载体的步骤，其中所述双链分子在导入细胞中时抑制或降低所述CDC45L或PIF1基因的体内表达；
[2][1]的方法，其中所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与选自下组的靶序列享有序列同一性或互补：SEQ ID NO：9，10，11和12；
[3][1]的方法，其中所述双链分子包含有义链和与其互补的反义链，它们彼此杂交以形成双链，其中所述有义链包含与选自SEQ ID NO：9、10、11和12的靶序列对应的核苷酸序列；
[4][1]至[3]任一的方法，其中施用多种双链分子；
[5][4]的方法，其中所述多种双链分子靶向相同基因；
[6][1]至[5]任一的方法，其中所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；
[7][6]的方法，其中所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；
[8][7]的方法，其中所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；
[9][8]的方法，其中所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；
[10][1]至[9]任一的方法，其中有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度在19个与25个核苷酸对之间的双链分子；
[11][1]至[10]任一的方法，其中所述双链分子由单一寡核苷酸组成，所述寡核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链二者。
[12][11]的方法，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：9、10、11和12中的靶序列对应的核苷酸序列的有义链，[B]为间插单链，且[A′]为包含与[A]中选择的靶序列的互补序列对应的寡核苷酸的反义链。
[13][1]至[12]任一的方法，其中所述双链分子包含RNA。
[14][1]至[12]任一的方法，其中所述双链分子包含DNA和RNA二者。
[15][14]的方法，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体。
[16][15]的方法，其中所述有义与反义链多核苷酸分别由DNA与RNA构成。
[17][14]的方法，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体。
[18][17]的方法，其中有义链和反义链多核苷酸之一或二者的5’端侧翼的区域由RNA构成。
[19][18]的方法，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成。
[20][1]至[19]任一的方法，其中所述双链分子包含一个或两个3’突出端。
[21][1]至[20]任一的方法，其中所述双链分子由载体编码。
[22][21]的方法，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：9、10、11和12中的靶序列对应的核苷酸序列的有义链，[B]为间插单链，且[A′]为包含与[A]中选择的靶序列的互补序列对应的寡核苷酸的反义链。和
[23][1]至[22]任一的方法，其中所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和/或细胞渗透剂。
本发明方法将在下面更加详细的加以描述。
通过将细胞与针对CDC45L或PIF1基因的双链分子、表达该分子的载体或包含同样分子的组合物接触来抑制(过)表达CDC45L和/或PIF1基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞，以较低速率增殖或具有降低的存活率。细胞生长可通过本领域已知技术测定，例如使用MTT细胞增殖测定法。
任何种类的细胞的生长均可根据本方法进行遏制，只要所述细胞表达或过表达本发明所述双链分子的靶基因。可作为例子的细胞包括癌细胞。
因此，对于正罹患或有危险罹患涉及CDC45L和/或PIF1基因的疾病的患者，可通过施用至少一种本发明双链分子、表达至少一种所述分子的至少一种载体或包含至少一种所述分子的至少一种组合物进行治疗。举例而言，癌症患者可根据这些方法进行治疗。癌症类型可通过根据所诊断的特定类型肿瘤的标准方法进行鉴定。在一些实施方案中，用本发明所述方法治疗的患者是用这样的方法选出的：在来自患者的活检物中通过RT-PCR、杂交或免疫测定法检测CDC45L和/或PIF1基因的(过)表达。在一些实施方案中，在本发明的治疗之前，对于来自受试者的所述活检样通过本领域所知的方法，例如，免疫组织化学分析、杂交或RT-PCR，证实CDC45L和/或PIF1基因过表达(见“实施例”中半定量RT-PCR、Western印迹或免疫组织化学)。
根据本发明的方法，为抑制或降低细胞生长及由此治疗癌症，在施用多种所述双链分子(或表达同样分子的载体或含有同样分子的组合物)时，每个所述分子可针对相同基因的不同靶序列或不同基因的不同靶序列。例如，所述方法可利用针对CDC45L或PIF1基因转录物的不同双链分子。或者，例如，所述方法可利用针对自相同基因选择的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。
为抑制细胞生长，本发明的双链分子可直接以可实现该分子与对应mRNA转录物结合的形式导入细胞。另外，如上所述，编码双链分子的DNA可作为载体导入细胞。为将双链分子和载体导入细胞，可使用转染增强剂，例如FuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)与Nucleofector(Wako pure Chemical)。
当治疗导致临床效益，例如受试者中CDC45L或PIF1基因表达的减少、癌症的尺寸、患病率(prevalence)、转移潜力的降低等，可以判定该治疗是“有效”的。当预防性地适用治疗时，“有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。有效性可以结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来加以确定。
就本发明的方法和组合物用于“预防”和“防范”的语境而言，此类术语在本文中可互换使用，指降低源自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病的进展与症状的出现、以及通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来降低已建立的疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范可包括旨在减轻特定病症的严重性(例如降低肿瘤的增殖和转移等)的广泛的预防性疗法。
治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防，包括10％、20％、30％或更多降低，或病情稳定。
应理解，本发明的所述双链分子是亚化学计量地降解靶mRNA(基因转录物)的。虽不愿拘于任何理论，认为本发明的所述双链分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，与常规的癌症疗法相比，为实施治疗效应而需要输送到癌症的位置或其附近的双链分子要少得多。
本领域技术人员在考虑了受试者的体重、年龄、性别、疾病类型、症状及其它条件、施用途径、以及是局部施用还是全身施用等因素的基础上，能够容易地确定本发明的双链分子的有效量。一般而言，本发明双链分子的有效量包含在癌症部位或其附近胞内浓度为大约1纳摩尔(nM)到约100nM，例如大约2nM到大约50nM，例如大约2.5nM到大约10nM。考虑可使用更多或更少量的双链分子。
本发明的方法可用于抑制癌症，例如缘于CDC45L和/或PIF1基因过表达或由CDC45L和/或PIF1基因介导的癌症，例如肺癌的生长或转移。具体而言，针对选自SEQ ID NO：9和SEQE ID NO：10(用于CDC45L)和SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12(用于PIF1)的靶序列的双链分子可用来治疗癌症。
为了治疗癌症，例如CDC45L和/或PIF1基因促进的癌症，还可以将本发明的双链分子与不同于所述双链分子的药剂组合来施用于受试者。或者，本发明的双链分子还可以与其它旨在用于癌症治疗的治疗方法组合来施用于受试者。举例而言，本发明所述双链分子可与现在用于治疗癌症或预防癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法，外科手术，以及使用化疗剂例如顺铂、卡铂、环磷酰胺，5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素或他莫昔芬的治疗)组合施用。
在本发明的方法中，双链分子可以裸双链分子的形式、以与投递试剂相组合的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。
用于与本发明的双链分子组合施用的合适的投递试剂包括Mirus TransitTKO脂溶性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。在一个实施方案中，投递试剂是脂质体。
脂质体能够帮助将双链分子投递至特定的组织如视网膜或肿瘤组织中，还能够增加双链分子的血中半衰期。适合在本发明中使用的脂质体是由常规的囊泡形成性脂质(vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂，以及甾醇，例如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，如期望的脂质体大小以及在血流中的脂质体的半衰期等。有多种制备脂质体的方法是公知的，例如Szoka等，Ann Rev BiophysBioeng 1980，9：467；美国专利第4,235,871号；第4,501,728号；第4,837,028号；第5,019,369号；将上述文献的全部内容援引并入本说明书。
在一些实施方案中，包被本发明的双链分子的脂质体包含能够将脂质体输送至癌症部位的配体分子。可使用与肿瘤或血管内皮细胞中普遍的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原结合的单克隆抗体。
在一些实施方案中，包被本发明的双链分子的脂质体经过修饰以免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除，例如，通过使其结构的表面结合有调理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制部分和配体。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如在本说明书中所使用的，例如，当调理作用抑制部分化学地或物理地搭接在脂质体膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)插入膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，该表层显著地减少巨噬-单核细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(”RES”)对脂质体的摄入；在例如美国专利第4,920,016号中对此有记载，后者的全部公开内容援引并入本说明书。因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制部分修饰过的脂质体能够保留在血液循环中的时间显著更长。出于以上理由，这样的脂质体有时也被称为“隐形”(stealth)脂质体。
已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管系统供给的组织中。因此，在以这样的微血管系统缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率地蓄积。参见Gabizon等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18：6949-53。此外，RES的摄入的减少阻止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的本发明的脂质体能够将本发明的双链分子输送至肿瘤细胞。
适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分可以为分子量约500～约40,000道尔顿、例如约2,000～约20,000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通过与碳酸的衍生物反应而生成了羧基结合的羧基化多糖类或寡糖。
在一些实施方案中，调理作用抑制部分为PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
调理作用抑制部分可以通过许多公知技术中的任何一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na(CN)BH3和混合溶剂，如60℃的四氢呋喃与水的30∶12比例混合物。
上文讨论了表达本发明的双链分子的载体。这样的表达至少一种本发明的双链分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂组合施用，所述合适的投递试剂包括Mirus Transit LT1亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体。将表达本发明的双链分子的重组病毒载体输送到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。
本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。
合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、或鼻内递送。
合适的非消化道施用途径包括血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。在一些实施方案中，通过注射或输注可将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。
本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。可将药剂直接注射到组织或癌症部位附近。可以施行将药剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。
本领域技术人员可以容易地确定用于对给定受试者施用本发明双链分子的合适剂量方案。例如，双链分子可以一次性施用给受试者，例如以单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或其附近。或者，双链分子可以在约3～约28日、例如约7～约10日的期间内每日一次或二次地施用给受试者。在一个例示性剂量方案中，双链分子在7日期间内一日一次地注射到癌症部位或其附近。当剂量方案包括多次施用时，应该理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量可以包含在整个剂量方案中施用的该双链分子的总量。
在本发明中，可以用至少一种选自下组的活性成分来治疗过表达CDC45L和/或PIF1的癌症：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，和
(c)编码它们的载体。
所述癌症包括但不限于肺癌。因而，在施用作为活性成分的本发明双链分子之前，优选确认要治疗的癌细胞或组织中CDC45L和/或PIF1的表达水平是否与相同器官的正常细胞相比升高。如此，在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗(过)表达CDC45L和/或PIF1的癌症的方法，该方法可包括下列步骤：
i)检测自具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中CDC45L和/或PIF1的表达水平；
ii)将所述CDC45L和/或PIF1表达水平与正常对照比较；并
iii)对具有与正常对照相比过表达CDC45L和/或PIF1的癌症的受试者施用至少一种选自下组的成分：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，和
(c)编码它们的载体。
或者，本发明还提供了一种药物组合物，其包含至少一种选自下组的成分，用于施用于具有过表达CDC45L和/或PIF1的癌症的受试者：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，和
(c)编码它们的载体。
换言之，本发明进一步提供了一种用于鉴定要用下述各项治疗的受试者的方法：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，或
(c)编码它们的载体，
该方法可包括测定源自受试者的癌细胞或组织中CDC45L和/或PIF1的表达水平的步骤，其中所述水平与该基因正常对照相比的升高指示该受试者具有可用下述各项治疗的癌症：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它们的DNA，或
(c)编码它们的载体。
下面会更加详细地描述本发明治疗癌症的方法。
用本方法治疗的受试者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如，人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。
根据本发明，测定自受试者获得的癌细胞或组织中CDC45L和/或PIF1的表达水平。表达水平可在转录产物(核酸)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，CDC45L或PIF1的mRNA可使用探针通过杂交方法(例如，Northern杂交)定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测CDC45L和/或PIF1的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用CDC45L或PIF1的序列信息制备此类探针。举例而言，CDC45L或PIF1的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物诸如染料、荧光物质或同位素来标记，且所述基因的表达水平可以作为发生杂交的标记物的强度来加以检测。
进一步，CDC45L或PIF1的转录产物(例如SEQ ID NO：13或15)可使用引物通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR)定量。上述引物可基于所述基因已知的序列信息制备。
具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与CDC45L或PIF1的mRNA杂交。本文所用的短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下发生。一般地，严格条件的温度选择为比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，用于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。
或者，本发明的诊断可以通过检测翻译产物来进行。例如，可以确定CDC45L或PIF1蛋白(SEQ ID NO：14或16)的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段或经修饰抗体保留对CDC45L或PIF1蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。
作为另一种基于CDC45L和/或PIF1的翻译产物检测其基因的方法，可利用针对CDC45L或PIF1蛋白的抗体通过免疫组织化学分析测量其染色的强度。即，在此测量中，强染色表明所述蛋白质的水平/存在增加，且同时表明CDC45L或PIF1基因的高表达水平。
对于癌细胞中靶基因(即CDC45L或PIF1基因)的表达水平而言，如果测定出其较之靶基因的对照水平(例如正常细胞中的水平)增加了例如10％，25％或50％的话，或增加到超过1.1倍，超过1.5倍，超过2.0倍，超过5.0倍，超过10倍或者更多，则可认为其在癌细胞中的表达水平是增加的。
对照水平可以与癌细胞同时确定，使用先前从疾病状态(癌性或非癌性)已知的受试者收集和保存的样品。另外，自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞可用作正常对照。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的CDC45L和/或PIF1基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是源自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中CDC45L和/或PIF1基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的生物样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中CDC45L和/或PIF1基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围可以用作标准值。
在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌性对照水平”。
当CDC45L和/或PIF1基因的表达水平与正常对照水平相比升高或者与癌性对照水平相似/等同时，该受试者可诊断为具有要治疗的癌症。
(iv)组合物
另外，本发明提供了包含至少一种本发明的双链分子或编码该分子之载体的药物组合物。具体地，本发明提供下述[1]至[24]的组合物：
[1]一种用于抑制或降低表达CDC45L和/或PIF1基因的细胞生长或治疗或预防表达CDC45L和/或PIF1基因的癌症的组合物，其包括至少一种在导入细胞中时抑制或降低所述基因体内表达的双链分子或编码所述双链分子的载体。
[2][1]的组合物，其中所述双链分子作用于mRNA，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配：对于CDC45L基因，SEQ ID NO：9和10，及对于PIF1，SEQ ID NO：11和12
[3][1]的组合物，其中所述双链分子包含有义链和与其互补的反义链，它们彼此杂交以形成双链，其中所述有义链包含与选自下组的靶序列对应的核苷酸序列：SEQ ID NO：9、10、11和12；
[4][1]至[3]任一的组合物，其中需治疗的癌症是肺癌；
[5][4]的组合物，其中所述肺癌是小细胞肺癌或非小细胞肺癌；
[6][1]至[5]任一的组合物，其中所述组合物包含多种所述双链分子；
[7][6]的组合物，其中所述多种双链分子靶向相同基因；
[8][1]至[7]任一的组合物，其中所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；
[9][8]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；
[10][9]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；
[11][10]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；
[12][1]至[11]任一的组合物，其中有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度在19个与25个核苷酸对之间的双链分子；
[13][1]至[12]任一的组合物，其中所述双链分子由单一多核苷酸组成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链二者；
[14][13]的组合物，其中所述双链分子具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO：9、10、11和12中的靶序列对应的核苷酸序列的有义链，[B]为间插单链，且[A′]为包含与[A]中选择的靶序列的互补序列对应的寡核苷酸的反义链；
[15][1]至[14]任一的组合物，其中所述双链分子包含RNA；
[16][1]至[14]任一的组合物，其中所述双链分子包含DNA和RNA；
[17][16]的组合物，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；
[18][17]的组合物，其中所述有义与反义链多核苷酸分别由DNA与RNA构成；
[19][18]的组合物，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体；
[20][19]的组合物，其中有义链和反义链多核苷酸之一或二者的5’端侧翼的至少一个区域由RNA构成；
[21][20]的组合物，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；
[22][1]至[21]任一的组合物，其中所述双链分子包含一个或两个3’突出端；
[23][1]至[22]任一的组合物，其中所述双链分子由载体编码；
[24][1]至[23]任一的组合物，其还包括转染增强剂、细胞渗透剂或药学可接受载体。
本发明的方法将在下面更加详述地加以描述。
本发明的所述双链分子可以在施用于患者之前根据本领域众所周知的技术配制为药物组合物。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。本文中所使用的“药物配制剂”包括适用于人类与兽医的配制剂。制备本发明药物配制剂的方法属于本领域一般技术，例如，描述于Remington′sPharmaceutical Science，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1985)，其全部公开内容通过引用包含于本文中。
本发明的药物配制剂包含至少一种本发明的双链分子及其编码载体(例如，重量为0.1％到90％)，或所述分子的生理学上可接受的盐，与生理上可接受的载体介质混合。例示性的生理学上可接受的载体介质包括例如水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸或类似物。
根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，其中每一个均可针对CDC45L或PIF1基因的相同或不同的靶序列。举例而言，所述组合物可包含针对CDC45L或PIF1基因的双链分子。另外，例如，所述组合物可包含针对选自CDC45L和PIF1基因的靶序列的双链分子。
而且，本组合物可以包含编码1个或多个双链核酸分子的载体。例如，所述载体可以编码1种、2种或数种本双链核酸分子。或者，本组合物可以包含多种载体，而各载体编码不同的双链核酸分子。
而且，本双链核酸分子可以作为脂质体的形式包含在本组合物中。脂质体的具体情况可以参照“(iii)使用双链分子抑制或降低癌细胞生长和治疗或预防癌症的方法”项。
此外，本发明的药物组合物中还可以包含传统的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和pH调节剂。合适的添加剂包括：生理学生物相容性的缓冲液(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选的，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体。例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95％，例如25-75％的本发明的一种或多种双链分子。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以包含0.01-20重量％、例如1-10重量％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。
除上述之外，本组合物中还可以包含其它药学活性成分，只要它们不抑制本发明双链分子的体内功能。例如，上述组合物中可以包含常规用于癌症治疗的化疗药物。
本发明还提供本发明的双链核酸分子在制备用于治疗(过)表达CDC45L和/或PIF1基因的癌症的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及下述双链核酸分子在制备用于治疗(过)表达CDC45L和/或PIF1基因的癌症的药物组合物中的用途：该分子在过表达CDC45L或PIF1基因的细胞内抑制所述基因的(过)表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以SEQ ID NO：9、10、11或12的序列为靶标。
或者，本发明进一步提供用于治疗表达CDC45L和/或PIF1基因的癌症的本发明双链核酸分子。
本发明还提供生产用于治疗(过)表达CDC45L和/或PIF1基因的癌症的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将药学或者生理学可接受的载体与作为活性成分的下述双链核酸分子一起制剂化的步骤，其中所述双链核酸分子抑制过表达CDC45L或PIF1基因的细胞内所述基因的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以SEQ ID NO：9、10、11或12的序列为靶标。
本发明还提供生产用于治疗(过)表达CDC45L和/或PIF1基因的癌症的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将活性成分与药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤，其中所述活性成分是这样的双链核酸分子，其在过表达CDC45L或PIF1基因的细胞中抑制所述基因的表达，该分子包含有义链与与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链核酸分子，并以SEQ ID NO：9、10、11或12的序列为靶标。
(4)诊断CDC45L介导的癌症的方法
发现CDC45L基因的表达在肺癌组织中与相应的正常组织相比特异性的提高(图1、图2)。另外，发现PIF1基因的表达也在肺癌组织中与相应的正常肺组织相比特异性的提高(图4)。因而，本文鉴定出的基因及其转录与翻译产物可以作为标志用于诊断由CDC45L和/或PIF1基因介导的癌症，而且，通过测量源自疑似罹患癌症的患者的样品中CDC45L和/或PIF1基因的表达可诊断这些癌症。具体地，本发明提供了通过确定受试者中CDC45L和/或PIF1表达水平来诊断由CDC45L和/或PIF1介导的癌症的方法。可通过本发明方法诊断的CDC45L和/或PIF1推动的癌症包括肺癌。肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺的腺癌(ADC)、肺的鳞状细胞癌(SCC)、和肺大细胞癌(LCC)。根据本发明，可提供用于检查受试者状况的中间结果。所述中间结果可与其它信息结合起来以协助医生、护士或其它从业人员诊断患者罹患所述疾病。或者，本发明可用于检测源自受试者的组织中的癌性细胞，并给医生提供有用的信息来诊断患者罹患所述疾病。
具体地，本发明提供下述[1]到[15]的方法：
[1]一种诊断由CDC45L或PIF1介导或推动的癌症的方法，其中所述方法包括下述步骤：
(a)检测源自受试者的生物学样品中CDC45L基因和/或PIF1基因的表达水平；并
(b)将所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高与疾病联系起来；
[2]一种在受试者中检测或诊断癌症的方法，包括测定源自受试者的生物学样品中CDC45L和/或PIF1的表达水平，其中所述水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示受试者患有或有风险发生癌症，或受试者中存在癌症；
[3][1]或[2]的方法，其中所述表达水平比正常对照水平高至少10％；
[4][1]至[3]任一的方法，其中所述表达水平通过选自下组的任一方法检测：
(a)检测编码CDC45L或PIF1多肽的mRNA；
(b)检测CDC45L或PIF1多肽；和
(c)检测CDC45L或PIF1多肽的生物学活性；
[5][1]至[3]任一的方法，其中所述表达水平通过选自下组的方法检测：
(a)检测CDC45L基因的mRNA和/或PIF1基因的mRNA；
(b)检测由CDC45L基因编码的蛋白质和/或由PIF1基因编码的蛋白质；和
(c)检测由CDC45L基因编码的蛋白质和/或由PIF1基因编码的蛋白质的生物学活性；
[6][1]至[5]任一的方法，其中所述癌症缘于CDC45L或PIF1的过表达，或由CDC45L或PIF1介导或推动；
[7][1]至[6]任一的方法，其中所述癌症是肺癌；
[8][7]的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌；
[9][4]至[5]的方法，其中所述表达水平是通过检测探针与编码CDC45L或PIF1多肽的基因转录物杂交确定的；
[10][4]或[5]的方法，其中所述表达水平是通过检测针对CDC45L或PIF1多肽的抗体的结合确定的；
[11][1]至[10]任一的方法，其中所述生物学样品包括活检物、痰或血液；
[12][1]至[10]任一的方法，其中所述源自受试者的生物学样品包含上皮细胞、血清或胸腔积液；
[13][1]至[12]任一的方法，其中所述源自受试者的生物学样品包含癌细胞；
[14][1]至[13]任一的方法，其中所述源自受试者的生物学样品包含癌性上皮细胞；
[15][1]至[10]任一的方法，其中所述源自受试者的生物学样品包含肺组织。
诊断癌症的方法将在下面更加详细的加以叙述。
要用本方法诊断的患者可以为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如，人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。
在实施本发明方法时，为实施诊断，从要诊断的受试者采集生物样品。任何生物学材料均可作为生物样品用于测定，只要其包括目标的CDC45L和/或PIF1基因转录或翻译产物。所述生物样品包括，但不仅限于，身体组织与体液，例如血液，例如血清，痰，尿液，和胸腔积液。在一些实施方案中，生物样品含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，例如癌性上皮细胞或源自怀疑为癌性的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，并将其用为生物样品。
根据本发明，测定在所述患者衍生生物样品中CDC45L和/或PIF1基因的表达水平。表达水平可在转录产物(核酸)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，CDC45L或PIF1基因的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern印迹分析)使用探针定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测多个基因(例如，多种癌症特异性基因)，包括CDC45L和PIF1基因，的表达水平而言，可以使用阵列。本领域技术人员可利用CDC45L(SEQ ID NO：13；GenBank登录号NM_003504.3)或PIF1(SEQ ID NO：15；GenBank登录号NM_025049.2)的序列信息制备上述探针。举例而言，CDC45L或PIF1基因的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，例如染料、荧光和同位素，且所述基因的表达水平可以所述杂交标记物的强度检测。
进一步，CDC45L或PIF1基因的转录产物可通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制备。举例而言，用于实施例的引物(用于CDC45L的SEQ ID NO：1和2，用于PIF1的SEQ ID NO：3和4)可用于通过RT-PCR或Northern印迹的检测，但本发明并不仅限于此。
具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与CDC45L或PIF1基因的mRNA杂交。
或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定CDC45L或PIF1蛋白的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段保留对CDC45L或PIF1蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。
作为另一种基于CDC45L和/或PIF1的翻译产物检测其基因的表达水平的方法，可利用针对CDC45L或PIF1蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。意即，观察到强染色表明所述蛋白质存在量增加，且同时表明CDC45L或PIF1的高表达水平(见“实施例”中的免疫组织化学和组织微阵列分析)。
另外，除CDC45L和/或PIF1的表达水平外，亦可确定其它癌症相关基因，例如已知在癌症中有差异表达的基因的表达水平以提高所述诊断的准确性。
对于包括CDC45L和PIF1的癌症标志基因，如果其于生物样品中的表达水平较之相应的癌症标志基因的对照水平(例如正常的或非癌性的细胞中的)增加，例如10％，25％或50％，或增加到超过1.1倍，超过1.5倍，超过2.0倍，超过5.0倍，超过10倍或者更多的话，则其于生物样品中的表达水平可认为是增加的。
对照水平可以与测试生物样品同时确定，使用先前从疾病状态(患癌或未患癌)已知的患者收集和保存的样品。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的CDC45L和/或PIF1表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中CDC45L和/或PIF1的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。在一些实施方案中，使用从来自与源自患者的样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。在一些实施方案患者，使用具有已知的疾病状态的群体中CDC45L和/或PIF1表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2S.D.或平均值±3S.D.的范围可以用作标准值。
在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。例如，可诊断从与癌性器官相同的器官获得的正常组织。因而，正常肺组织可诊断为用于诊断肺癌的正常对照。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌性对照水平”。
当CDC45L和/或PIF1的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似，则受试者可诊断为正罹患或有危险罹患癌症，例如由CDC45L和/或PIF1介导的缘于CDC45L和/或PIF1过表达的癌症。进一步，当比较CDC45L和/或PIF1基因的表达水平时，样品与癌性参照之间基因表达模式的相似性表明受试者正罹患或有危险罹患癌症，例如由CDC45L和/或PIF1介导的源自CDC45L和/或PIF1过表达的癌症。此类癌症涵盖肺癌。
测试生物样品的表达水平与对照水平间的差异，可以相对于已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸，例如管家基因，的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，β-肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。
或者，本发明提供用于在受试者衍生肺组织样品中检测或鉴定癌细胞的方法，所述方法包括测定源自受试者的生物学样品中CDC45L和/或PIF1基因的表达水平的步骤，其中所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示所述组织中癌细胞的存在或怀疑。
此类结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它保健从业人员诊断受试者患有疾病。换言之，本发明可以给医生提供有用信息来诊断受试者患有疾病。例如，依照本发明，当关于自受试者获得的组织中癌细胞的存在有疑问时，通过考虑CDC45L和/或PIF1基因的表达水平，加上疾病的不同方面，包括组织病理学、血液中的已知肿瘤标志物的水平、和受试者的临床过程等，能做出临床决策。例如，一些公知的血液中的诊断性肺肿瘤标志物为IAP、ACT、BFP、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CEA、KMO-1、NSE、SCC、SP1、Span-1、TPA、CSLEX、SLX、STN和CYFRA。就是说，在本发明的这个具体实施方案中，基因表达分析的结果作为中间结果，用于进一步诊断受试者的疾病状态。
或者，本发明提供试剂制备用于诊断癌症的诊断性试剂的用途。在一些实施方案中，所述试剂可选自下组：
(a)用于检测CDC45L或PIF1基因之mRNA的试剂；
(b)用于检测CDC45L或PIF1蛋白的试剂；和
(c)用于检测CDC45L或PIF1蛋白之生物学活性的试剂。
具体地，此类试剂是与CDC45L或PIF1多核苷酸杂交的寡核苷酸，或与CDC45L或PIF1多肽结合的抗体。
换言之，本发明还提供用于诊断或检测癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包含与CDC45L基因或PIF1基因转录或翻译产物结合的试剂。
在本发明中，揭示了CDC45L或PIF1不仅是有用的诊断性标志物，而且还是癌症治疗的合适靶物。因此，靶向CDC45L或PIF1的癌症治疗可通过本发明来实现。在本发明中，靶向CDC45L或PIF1的癌症治疗指遏制或抑制癌细胞中的CDC45L或PIF1活性和/或表达。任何抗CDC45L剂或抗PIF1剂可用于靶向CDC45L或PIF1的癌症治疗。在本发明中，所述药剂可用于靶向CDC45L或PIF1的癌症治疗。在本发明中，抗CDC45L剂或抗PIF1剂包括下述物质作为活性组分：
(a)本发明的双链分子，
(b)编码它的DNA，或
(c)编码它的载体。
因而，在一个优选的实施方案中，本发明提供了(i)诊断受试者是否具有要治疗的癌症，和/或(ii)为癌症治疗选择受试者的方法，该方法包括下列步骤：
a)测定自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中CDC45L或PIF1的表达水平；
b)将该CDC45L或PIF1表达水平与正常对照水平比较；
c)如果CDC45L或PIF1表达水平与正常对照水平相比升高的话，将该受试者诊断为具有要治疗的癌症；并
d)如果受试者在步骤c)中诊断为具有要治疗的癌症的话，选择该受试者进行癌症治疗。
或者，此类方法包括下列步骤：
a)测定自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中CDC45L或PIF1的表达水平；
b)将该CDC45L或PIF1表达水平与癌性对照水平比较；
c)如果该CDC45L或PIF1表达水平与癌性对照水平相似或等同的话，将该受试者诊断为具有要治疗的癌症；并
d)如果受试者在步骤c)中诊断为具有要治疗的癌症的话，选择该受试者进行癌症治疗。
(5)评价CDC45L介导的癌症的预后的方法
本发明部分基于下列发现，即CDC45L(过)表达与具有CDC45L介导的癌症，例如肺癌的患者较差预后显著相关。因此，本发明提供确定或评价罹患癌症，例如由CDC45L介导的或缘于CDC45L过表达的癌症，例如肺癌的患者的预后的方法，所述方法在患者生物样品中检测CDC45L基因表达水平；将测得的表达水平与对照水平比较；并确定相比对照水平增加的表达水平为不良预后(不良的存活率)的指示。
在此，术语“预后“指根据病理性质与症状表明的关于所述疾病的可能结果以及从疾病中恢复的前景。相应的，较为不利的、负面的、或不良的预后定义为较低的治疗后存活期间与存活率。相反，正面的、有利的、或良好的预后定义为治疗后存活期间或存活率提高。
术语“评价预后”指预测、预告或将给定检测或测量与患者癌症的将来结果(例如，恶性化，治愈癌症的可能性、估算的存活时间及类似的)相联系。举例而言，确定CDC45L经时的表达水平使预测患者结果(例如，增加或减少恶性化，增加或减少癌症的等级，治愈癌症的可能性、存活率及类似的)成为可能。
在本发明的语境下，短语“评价(或确定)预后”意欲涵盖癌症的预测与可能性分析、进展、特别是癌症复发、转移扩散与疾病复发。目前评价预后的方法意欲用于临床以对关于治疗方法作出决定，包括治疗介入、诊断标准例如疾病的分期，以及针对肿瘤疾病的转移与复发的疾病监视和监测。
具体地，本发明提供下述方法[1]至[6]：
[1]一种评估肺癌受试者预后的方法，其中所述方法包括下述步骤：
(a)测定源自受试者的生物学样品中CDC45L的表达水平；
(b)将检测到的表达水平与对照水平比较；并
(c)基于(b)的比较来确定所述受试者的预后；
[2][1]的方法，其中所述对照水平是较好预后对照水平且相比于所述对照水平所述表达水平升高指示较差预后；
[3][1]的方法，其中所述对照水平是较差预后对照水平且所述对照水平相似表达水平指示较差预后；
[4][2]的方法，其中所述升高为比所述对照水平高至少10％；和
[5][1]至[4]任一的方法，其中所述表达水平通过选自下组的方法来测定：
(a)检测CDC45L基因的mRNA；
(b)检测由CDC45L基因编码的蛋白质；和
(c)检测由CDC45L基因编码的蛋白质的生物学活性；
[6][1]至[5]任一的方法，其中所述源自受试者的生物学样品包含肺癌组织或肺癌细胞。
本方法所用源自患者的生物样品可为任何源自患者的样品，只要CDC45L可在样品中检测出来。在一些实施方案中，所述生物样品包含肺细胞(从肺获得的细胞)。进一步，所述生物样品包括体液例如痰、血液、血清、血浆、胸腔积液等。另外，所述样品可为从组织纯化或获得的细胞。生物样品可在不同的时点自患者获取，包括治疗前，治疗中和/或治疗后。例如，自要评估的受试者获得的肺癌细胞是优选的生物学样品。
根据本发明，显示在源自患者的生物样品中CDC45L基因的表达水平越高，治疗后病情缓和、恢复和/或存活就越为不良，且不良临床后果的可能性就越高。因此，根据本方法，用作比较的“对照水平”可为，例如，在个体或个体组成的群体中任何CDC45L基因的表达水平，且所述个体或群体在治疗后显示良好或积极的癌症预后，在此称之为“良好预后对照水平”。此外，所述“对照水平”可为，例如，在个体或个体组成的群体中任何CDC45L基因的表达水平，且所述个体或群体在治疗后显示不良或消极的癌症预后，在此称之为“不良预后对照水平”。所述“对照水平”是源自单独参照群体或多种表达模式的单独表达模式。因此，所述对照水平可基于在其疾病状态(良好或不良预后)已知的癌症患者中，或癌症患者的群体中，在进行任何种类治疗之前的CDC45L基因的表达水平。在一些实施方案中，癌症为肺癌。在一些实施方案中，使用具有已知疾病状态的患者集合中的CDC45L基因的表达水平的标准值。所述标准值可通过任何本领域已知的方法获得。举例而言，平均值+/-2倍S.D.或平均值+/-3倍S.D.的范围可用作标准值。
所述对照水平可与所试生物样品通过使用之前从已知其疾病状态(良好预后或不良预后)的癌症患者(对照或对照组)在接受任何种类的治疗之前采集并储藏的样品同时确定。
或者，所述对照水平可通过统计学方法基于通过分析之前确定的从对照组采集或储藏的样品中CDC45L表达水平而获得的结合来确定。进一步，所述对照水平可为源自先前测试的细胞或患者的表达模式的数据库。另外，根据本发明的一个方面，在生物样品中CDC45L基因的表达水平可与多种对照水平比较，所述对照水平通过多种参照样品确定。在一些实施方案中，使用从与源自患者生物样品类似组织类型所得的参照样品确定的对照水平。
根据本发明，CDC45L基因的表达水平与良好预后对照水平的相似性显示所述患者较理想的预后，而相比于良好预后对照水平表达水平增加显示较不理想的、较不良的治疗后病情缓和、恢复、存活和/或临床后果的预后。另一方面，相比于不良预后对照水平CDC45L基因表达水平减少显示患者较理想的预后，而与不良预后对照水平相似的基因表达水平显示较不较理想的、较不良的治疗后病情缓和、恢复、存活和/或临床后果的预后。例如，自治疗后显示较好或较差癌症预后的受试者获得的肺癌细胞分别是较好或较差预后对照水平的优选生物学样品。
当相对对照水平表达水平变化超过1.0、1.5、2.0、5.0、10.0或更多倍时，在生物样品中CDC45L基因表达水平可认为是改变(即升高或降低)了。
所试生物样品与对照水平间表达水平的差异可相对于对照，例如持家基因，加以标准化。举例而言，已知其表达水平在癌性与非癌性细胞中不变的多核苷酸，包括那些编码β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶与核糖体蛋白P1的基因，可用于标准化CDC45L基因表达水平。
所述表达水平可通过在源自患者的生物样品中利用本领域众所周知的技术检测基因转录物的方法来确定。所述通过本方法检测的基因转录物既包括转录产物也包括翻译产物，例如mRNA与蛋白质。
举例而言，CDC45L基因的转录产物可通过杂交，例如使用CDC45L基因探针的Northern印迹杂交分析来检测。所述检测可在芯片或阵列上进行。对检测多种基因包括CDC45L的表达水平，可使用阵列。作为另一个示例，基于扩增的检测方法，例如使用对CDC45L基因有特异性的引物基于逆转录的多聚酶链式反应可用于检测(见“实施例”中(b)半定量RT-PCR)。CDC45L基因特异性探针或引物可使用常规技术参照CDC45L的全序列(SEQ ID NO：13)设计和制备。举例而言，在实施例中使用的引物(SEQ ID NO：1与2)可用于通过RT-PCR检测，但本发明并不仅限于此。
具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件与低严格条件下与CDC45L基因的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”指探针或载体会与其靶序列，但非其它序列杂交的条件。严格条件依赖于序列，且在不同情况下不同。观察到长序列较之较短序列在更高温度下特异性杂交。一般而言，严格条件的温度选为大约比特定序列在给定离子强度与pH值下的热熔解温度(Tm)低大约5摄氏度。所述Tm是50％互补于靶序列的探针与靶序列在平衡条件下杂交的温度(在给定离子强度、pH与核酸浓度下)。因为所述靶序列通常过量存在，在Tm时50％的探针在平衡时被占据。通常，严格条件是在该条件下盐浓度低于大约1.0M钠离子，通常为0.01到1.0M钠离子(或其它盐)在pH7.0到8.3处，且温度对短探针或引物(例如，10到50核苷酸)为至少30摄氏度，而对较长探针与引物为至少大约60摄氏度。严格条件亦可通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来达成。
另外，本发明的评价亦可通过检测翻译产物来进行。举例而言，可确定CDC45L蛋白的量。确定作为翻译产物的蛋白质量的方法包括使用特异性识别CDC45L蛋白的抗体的免疫测定方法。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)可用于检测，只要所述片段保留与CDC45L蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。
作为另一种基于CDC45L基因翻译产物来检测它的方法，可通过免疫组织化学分析利用针对CDC45L蛋白质的抗体观察其染色的强度。意即，观察到强染色表明CDC45L蛋白存在量增加，且同时表明CDC45L基因的高表达水平。
进一步，已知CDC45L蛋白具有细胞增殖活性。因此，CDC45L基因的表达水平可使用上述细胞增殖活性作为指标确定。举例而言，在生物样品存在下制备并培养表达CDC45L的细胞，随后通过检测增殖速度或评价细胞周期或集落形成能力，可确定所述生物样品的细胞增殖活性。
另外，除CDC45L基因的表达水平外，亦可确定其它肺细胞相关基因，例如已知在肺癌中有差异表达的基因，的表达水平，以提高所述诊断的准确性。上述其它的肺癌相关基因包括那些于WO2004/031413和WO2005/090603中描述的基因。
需根据本方法评价癌症预后的患者可以为哺乳动物，包括人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。
或者，根据本发明，除其它测试结果外，还可提供用于评价患者预后的中间结果。所述中间结果可协助医生、护士或其它从业人员评价、确定或估计患者的预后。可与本发明所得中间结果结合考虑的其它信息包括患者的临床症状和身体状况。
或者，本发明提供试剂制备用于评估癌症预后的试剂的用途。在一些实施方案中，所述试剂可选自下组：
(a)用于检测CDC45L基因之mRNA的试剂；
(b)用于检测CDC45L的试剂；和
(c)用于检测CDC45L蛋白之生物学活性的试剂。
具体地，此类试剂是与CDC45L多核苷酸杂交的寡核苷酸，或与CDC45L多肽结合的抗体。
(6)诊断癌症或评价癌症预后的试剂盒
本发明提供了诊断癌症或评价癌症预后的试剂盒。本发明还提供用于确定受试者患有可以用本发明的双链分子或编码它的载体来治疗的癌症的试剂盒，其也可用于评估和/或监测癌症治疗的功效。在一些实施方案中，所述癌症由CDC45L和/或PIF1介导，或缘于CDC45L和/或PIF1过表达，例如肺癌。具体而言，所述试剂盒包含至少一种在源自患者的生物样品中检测CDC45L或PIF1基因表达的试剂，所述试剂可选自下组：
(a)检测CDC45L或PIF1基因的mRNA的试剂；
(b)检测CDC45L或PIF1的蛋白质的试剂；
(c)检测CDC45L或PIF1的蛋白质的生物学活性的试剂。
适于检测CDC45L或PIF1基因mRNA的试剂包括特异性结合或识别CDC45L或PIF1 mRNA的核酸，例如具有与CDC45L或PIF1 mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对CDC45L或PIF 1mRNA为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸。如果需要，检测CDC45L或PIF1 mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测CDC45L或PIF1 mRNA的试剂。
探针或引物可以有具体的大小。所述大小选自下组：至少10个核苷酸，至少12个核苷酸，至少15个核苷酸，至少20个核苷酸，至少25个核苷酸，至少30个核苷酸，而且探针和引物的大小范围可以是5-10个核苷酸、10-15个核苷酸、15-20个核苷酸、20-25个核苷酸和25-30个核苷酸。
另一方面，适于检测CDC45L或PIF1蛋白质的试剂包括针对CDC45L或PIF1蛋白质的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用于检测，只要所述片段保留与CDC45L或PIF1蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测CDC45L或PIF1蛋白质的试剂。
进一步，所述生物学活性可通过，例如，测量所述生物样品中由于CDC45L或PIF1蛋白质表达而导致的细胞增殖活性来确定。举例而言，在源自患者的生物样品的存在下培养所述细胞，然后通过检测增殖的速度，或测量细胞周期或集落形成活性，可确定所述生物样品的生物学活性。如需要，检测CDC45L或PIF1 mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测CDC45L或PIF1蛋白质生物学活性的试剂。
所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。进一步，所述试剂盒可包括固体基质以及用于将探针与CDC45L或PIF1基因结合的试剂或针对CDC45L或PIF1蛋白质的抗体，用于培养细胞的培养基与容器，阳性与阴性对照试剂，以及用于检测针对CDC45L或PIF1蛋白质的抗体的第二抗体。举例而言，从具有良好预后或不良预后的患者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤纸、针头、注射器和带有使用说明书的装箱单(例如，书面的、磁带、CD-ROM等等)。这些试剂之类的可标上标签包含在容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可从多种材料制得，例如玻璃或塑料。
作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对CDC45L或PIF1 mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质上，例如多孔条，以形成至少一个检测位置。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位置，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位置。或者，对照位置可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位置上量较大而在接下来的位置上量较小。在加入样品之后，显示可检测信号位置的数量提供了在样品中存在的CDC45L或PIF1mRNA量的定量指征。所述检测位置可具有任何合适可检测的形状，并通常是横跨测试条宽度的条状或点状。
本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照或CDC45L或PIF1标准样品。本发明的所述阳性对照样品可通过收集CDC45L或PIF1阳性血液样品来制备，随后分析其CDC45L或PIF1水平。或者，可将纯化的CDC45L或PIF1蛋白或多核苷酸添加到不含CDC45L或PIF1的血清中以形成所述阳性样品，或CDC45L或PIF1标准品。在本发明中，纯化的CDC45L或PIF1可为重组蛋白。所述阳性对照样品中CDC45L或PIF1的水平，例如，是高于截止值的。
(7)筛选方法
使用CDC45L或PIF1基因、由所述基因编码的多肽或其片段、或所述基因的转录调节区，有可能筛选改变所述基因的表达或由所述基因编码的多肽的生物学活性的药剂或化合物。此类药剂或化合物可用作药物来治疗或预防癌症，特别是肺癌。如此，本发明提供使用CDC45L或PIF1基因、由所述基因编码的多肽或其片段、或所述基因的转录调节区，筛选用于治疗或预防癌症的候选药剂或化合物的方法。
通过本发明筛选方法分离的药剂或化合物是预期抑制CDC45L或PIF1基因的表达或所述基因的翻译产物的活性的物质，并因此是用于治疗或预防归于例如细胞增殖性疾病的疾病，诸如癌症(特别是肺和食管癌)的候选物。就是说，认为通过本发明方法筛选的药剂或化合物具有临床好处，而且可进一步测试其在动物模型或测试受试者中阻止癌细胞生长的能力。
(I)用于筛选的测试化合物
在本发明的语境中，待通过本筛选方法鉴定的药剂可以是任何化合物或包含数种化合物的组合物。而且，根据本发明筛选方法暴露于细胞或蛋白的测试药剂或化合物可以是单个化合物或多个化合物的组合。当在方法中使用化合物组合时，化合物可以顺次或同时加以接触。
任何测试药剂或化合物，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸构建体，例如反义DNA、siRNA、核酶等)以及天然化合物，均可用于本发明的筛选方法中。也可以从本领域熟知的很多组合文库方法中采取任何办法来获得本发明的测试药剂或化合物，这些方法包括
(1)生物文库，
(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallel solid phaseor solution phase libraries)，
(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，
(4)“一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文库法，以及
(5)使用亲和色谱选择的合成文库法。
使用亲和色谱选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145-67)。合成分子文库方法的例子可在本领域找到(DeWitt et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1993，90：6909-13；Erb et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1994，91：11422-6；Zuckermann et al.，J Med Chem 37：2678-85，1994；Cho et al.，Science1993，261：1303-5；Carell et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2059；Carellet al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994，33：2061；Gallop et al.，J Med Chem 1994，37：1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(参见Houghten，Bio/Techniques1992，13：412-21)或珠子上(Lam，Nature 1991，354：82-4)、芯片上(Fodor，Nature 1993，364：555-6)、细菌上(美国专利5,223,409)、孢子上(美国专利5,571,698；5,403,484与5,223,409)、质粒上(Cull et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1992，89：1865-9)或噬菌体上(Scott and Smith，Science 1990，249：386-90；Devlin，Science 1990，249：404-6；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Felici，J Mol Biol 1991，222：301-10；美国专利申请2002-103360)。
通过本发明任何筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的化合物，包括在通过本发明筛选方法获得的化合物之内。
此外，当所筛选的测试药剂或化合物是蛋白质时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以确定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定编码蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白的DNA。所得的DNA可用于制备用于治疗或预防癌症的候选物的测试剂或化合物。
对本文描述筛选为有用的测试药剂或化合物亦可为特异性结合CDC45L或PIF1蛋白或其缺乏结合配偶的活性的部分CDC45L或PIF1肽的抗体或非抗体结合蛋白。此类部分蛋白质或抗体可通过本文所述方法来制备(见“定义”或“抗体”(1)癌症相关基因和癌症相关蛋白，及其功能性等同物或抗体)且可测试它们阻断蛋白质与其结合配偶结合的能力。
(i)分子建模
对具有目标性质的化合物的分子结构/对待抑制靶分子的分子结构的知识为人们构建测试药剂或化合物文库提供了便利。预筛选适于进一步评估的测试药剂或化合物的方法之一，是对测试药剂/化合物与其靶物的相互作用进行计算机建模。
计算机建模技术为针对选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于从选定分子的x-射线晶体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以优化结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合物之一或二者发生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。
上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation，Waltham，Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。利用QUANTA可进行分子相互行为的互动性构建、修饰、和可视化分析。
有多篇文献综述了与特异蛋白相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988，97：159-66；Ripka，NewScientist 1988，54-8；McKinlay & Rossmann，Annu Rev Pharmacol Toxiciol1989，29：111-22；Perry & Davies，Prog Clin Biol Res 1989，291：189-93；Lewis& Dean，Proc R Soc Lond 1989，236：125-40，141-62；以及综述关于核酸组分模型受体的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111：1082-90。
其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga，Ontario，Canada的BioDesign，Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix，Inc公司、Cambridge，Ontario的Hypercube，Inc.等公司获取。见例如DesJarlais et al.，J Med Chem1988，31：722-9；Meng et al.，J Computer Chem 1992，13：505-24；Meng et al.，Proteins 1993，17：266-78；Shoichet et al.，Science 1993，259：1445-50。
一旦鉴定出CDC45L或PIF1活性的抑制剂，可使用组合化学技术基于鉴定出的抑制剂的化学结果构建任何数量的变体，如下所述。对于所得的候选抑制剂，或称“测试药剂或化合物”的文库，可使用本发明的方法筛选，以鉴定文库中破坏CDC45L或PIF1活性的测试药剂或化合物用于治疗和/或预防癌症和/或防止癌症的手术后复发。
(ii)组合化学合成
测试药剂或化合物的组合文库可以作为合理药物设计程序——其涉及有关CDC45L或PIF1活性的已知抑制剂中存在的核心结构的知识——的一部分来制备。这种策略使得文库可以保持合理的规模，便于高通量筛选。或者，可通过简单地合成构成文库的分子家族的所有排列，构建简单的、特别是短的、聚合物性的分子文库。后一种方法的一个实例是全部由长度为6个氨基酸组成的肽文库。这种肽文库包含所有6氨基酸序列组合。这种类型的文库称作线性组合化学文库。
组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见例如美国专利5,010,175；Furka，Int J Pept Prot Res 1991，37：487-93；Houghten et al.，Nature1991，354：84-6)。也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被编码的肽(例如WO93/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)，苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美国专利5,288,514)，diversomer如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWittet al.,Proc Natl Acad Sci USA 1993，90：6909-13)，插烯化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114：9217-8)，小化合物文库的模拟物有机合成(analogous organic synthese)(Chenet al.，J.Amer Chem Soc 1994，116：2661)，寡聚氨基甲酸盐(Cho et al.，Science1993，261：1303)，和/或肽酰膦酸酯(peptidylphosphonates)(Campbell et al.，JOrg Chem 1994，59：658)，核酸文库(见Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，1990-2008，John Wiley Interscience；Sambrook and Russell，MolecularCloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，2001，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA)，肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughan et al.，Nature Biotechnology 1996，14(3)：309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(见例如Liang et al.，Science 1996，274：1520-22；美国专利5,593,853)，和有机小分子文库(见例如苯并二氮卓，Gordon EM.Curr OpinBiotechnol.1995Dec 1；6(6)：624-31；类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫杂氮杂环己烷(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓，5,288,514；等)。
(iii)其它候选物
另一种手段是使用重组噬菌体来产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott& Smith，Science 1990，249：386-90；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：6378-82；Devlin et al.，Science 1990，249：404-6)，可以构建非常大的文库(例如106-108个化学实体)。再一种手段主要使用化学方法，其实例包括Geysen方法(Geysen et al.，Molecular Immunology 1986，23：709-15；Geysen et al.，JImmunologic Method 1987，102：259-74)和Fodor等的方法(Science 1991，251：767-73)。Furka等(14th International Congress of Biochemistry 1988，Volume#5，Abstract FR：013；Furka，Int J Peptide Protein Res 1991，37：487-93)，Houghten(美国专利4,631,211)和Rutter等(美国专利5,010,175)记载了产生肽混合物的方法，可以将这些肽作为激动剂或拮抗剂加以测试。
适体是由紧密结合特定分子靶的核酸构成的大分子。Tuerk和Gold(Science.249：505-510(1990))披露了SELEX(通过指数式富集进行的配体系统性进化)方法来选择适体。在SELEX方法中，核酸分子的大型文库(例如1015种不同分子)可用于筛选。
(II)筛选方法
(i)通用筛选方法
使用CDC45L或PIF1基因、由所述基因编码的蛋白质、或所述基因的转录调节区，可鉴定改变所述基因的表达或由所述基因编码的多肽的生物学活性的化合物。在本发明中，发现CDC45L和PIF1基因在癌症中过表达，并证明涉及癌细胞生长和/或存活。因此，改变这些基因的表达或由那些基因编码的多肽的生物学活性的化合物可以是癌症的候选治疗剂。
结合CDC45L或PIF1多肽的拮抗剂可抑制介导癌细胞增殖的生物学活性，因此，它们是用于治疗癌症的候选物。因此，本发明提供了通过鉴定结合CDC45L或PIF1多肽的药剂或化合物来鉴定用于治疗或预防表达CDC45L和/或PIF1的癌症的潜在候选物的方法。
作为抑制CDC45L或PIF1蛋白与其结合配偶(例如CDC45L和PIF1彼此)之间结合的筛选化合物的方法，可使用本领域技术人员公知的许多方法。例如，筛选可以作为体外测定系统，例如细胞系统进行。更具体地，首先，使CDC45L或PIF1蛋白或其结合配偶结合至支持物，并对其添加另一蛋白质以及测试化合物。例如，使CDC45L或PIF1结合至支持物，并对其添加结合配偶多肽以及测试化合物。接着，将混合物温育、清洗并检测和/或测量结合至支持物的另一蛋白质。
在本发明的语境中，“抑制两种蛋白质之间的结合”指至少降低所述蛋白质之间的结合。如此，在一些情况中，在测试药剂或化合物存在下样品中结合对的百分比与适宜(例如不用测试化合物处理或来自非癌症样品，或来自癌症样品)对照相比降低。与对照样品中的结合对相比，蛋白质结合量的降低可以是例如少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、25％、10％、5％、1％或更少(例如0％)。
可用于结合蛋白质的支持物的例子包括例如不溶性多糖，例如琼脂糖、纤维素和右旋糖酐；和合成树脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；例如，可使用自上述材料制备的商品化的珠子和板(例如多孔板、生物传感器芯片、等)。在使用珠时，可以将它们装入柱中。或者，磁珠的使用也是本领域已知的，而且能够容易地经磁力分离结合在珠子上的蛋白质。
例如，蛋白质对支持物的结合可依照常规方法来进行，例如化学键合和物理吸附。或者，可以经特异性识别蛋白质的抗体使蛋白质结合至支持物。此外，蛋白质对支持物的结合也可借助亲合素和生物素来进行。
当固定化多肽暴露于合成化学化合物、或天然物质库、或随机噬菌体肽展示库时结合的分子的筛选方法和使用高通量、基于组合化学技术(Wrightonet al.，Science 273：458-63(1996)；Verdine，Nature 384：11-3(1996))来分离结合蛋白质的蛋白质及化学化合物(包括激动剂和拮抗剂)的筛选方法是本领域技术人员公知的。
另外，在本发明的筛选方法中，遏制CDC45L或PIF之表达水平的药剂或化合物也可鉴定为癌症的候选治疗剂。多肽或其功能性等同物的表达水平可以依照本领域已知的任何方法来检测。例如，可使用报告测定法。合适的报告基因和宿主细胞是本领域公知的。筛选所需的报告构建物可通过使用CDC45L或PIF1基因的转录调节区来制备。当基因的转录调节区是本领域技术人员知道的时，报告构建物可以通过利用现有序列信息来制备。当转录调节区尚未鉴定时，可以基于基因的核苷酸序列信息自基因组文库分离含有转录调节区的核苷酸区段。具体地，筛选所需报告构建物可通过连接报告基因序列与感兴趣的CDC45L或PIF1基因转录调节区来制备。CDC45L或PIF1基因的转录调节区是起始密码子至上游至少500bp，例如1000bp，例如上游5000或10000bp的区域。含有转录调节区的核苷酸区段可以自基因组文库分离，或者可以通过PCR扩增。用于鉴定转录调节区的方法，还有测定方案是公知的(Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，Chapter 17，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
另外，在本发明的筛选方法中，抑制CDC45L或PIF蛋白之生物学活性的药剂或化合物也可鉴定为癌症的候选治疗剂。
各种低通量和高通量酶测定法形式是本领域公知的且能容易地适用于检测或测量CDC45L或PIF1多肽的生物学活性。对于高通量测定法，可以方便地在固体支持物上固定化物质。反应后，可以通过上文所述方法检测固体支持物上被多肽转化的物质。或者，可以在溶液中实施接触步骤，之后可以在固体支持物上固定化物质，并可以检测被多肽转化的物质。为了便于此类测定法，可以用链霉亲合素包被固体支持物，且可以用生物素标记物质，或者可以用针对物质的抗体包被固体支持物。熟练技术人员能根据期望的筛选通量能力确定合适测定法形式。
本发明的测定法还适合于便于高通量筛选的自动化规程。已经为溶液相化学开发了多种公知的机器人系统。这些系统包括自动化工作站，像由Takeda Chemical Industries，Ltd.(Osaka，Japan)开发的自动化合成装置和许多利用机械臂的机器人系统(Zymate II，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett Packard，Palo Alto，Calif.)，它们模拟由化学家实施的手动合成操作。任何上述装置适合用于本发明。这些装置(如果有的话)的性质和为使它们能如本文中所讨论的那样运转而执行的修改对相关领域技术人员会是显而易见的。另外，众多组合文库自身是商品化的(参见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等)。
在本发明中，揭示了CDC45L或PIF1的表达水平和/或生物学活性的遏制导致癌细胞生长的遏制。因此，当化合物或药剂遏制CDC45L或PIF1的表达和/或活性时，该遏制指示在受试者中的潜在治疗效果。在本发明中，潜在治疗效果指合理预期的临床好处。在本发明中，此类临床好处包括：
(a)降低CDC45L或PIF1基因的表达；
(b)降低受试者中癌症的大小、流行度、或转移潜力；
(c)防止癌症形成；或
(d)防止或缓解癌症的临床症状。
(ii)筛选结合CDC45L或PIF1蛋白的化合物
在本发明中，CDC45L或PIF1的过表达在癌症中检测到，但是在正常组织中没有检测到。另外，证明了由这些基因编码的多肽涉及癌细胞生长。因此，那些基因可能是癌症治疗和诊断的良好分子靶物。结合CDC45L或PIF1多肽的药剂或化合物可抑制这些多肽的生物学活性。此类化合物作为药物用于治疗或预防肺癌或作为检测剂用于诊断肺癌和评估肺癌患者预后。
具体地，本发明提供使用CDC45L或PIF1多肽来筛选可用于诊断、治疗或预防癌症的药剂或化合物的方法。此筛选方法的一个实施方案包括下述步骤：
(a)使测试药剂或化合物与选自CDC45L和PIF1蛋白或其片段的多肽接触；
(b)检测所述多肽或片段和所述测试药剂或化合物之间的结合水平；
(c)选择结合步骤(a)所述多肽或片段的测试药剂或化合物。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长的治疗效果或候选药剂或化合物治疗或预防CDC45L或PIF1相关疾病的治疗效果。因此，本发明还提供用于筛选遏制癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和用于筛选治疗或预防癌症的候选药剂或化合物的方法。
更具体地，所述方法包括下述步骤：
(a)使测试药剂或化合物与选自CDC45L和PIF1蛋白或其片段的多肽接触；
(b)检测所述多肽和所述测试药剂或化合物之间的结合水平；
(c)将b)的结合水平与测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
或者，依照本发明，还可评估或评价测试药剂或化合物治疗或预防癌症的潜在治疗效果。在一些实施方案中，本发明提供评估或评价测试物质治疗或预防与CDC45L和/或PIF1过表达有关的癌症或抑制与CDC45L和/或PIF1过表达有关的癌症的治疗效果的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使药剂或化合物与由CDC45L或PIF1的多核苷酸编码的多肽接触；
(b)检测所述多肽和所述测试药剂或化合物之间的结合活性；并
(c)将潜在治疗效果与测试药剂或化合物关联起来，其中当药剂或化合物结合多肽时显示潜在治疗效果。
在本发明中，可以将治疗效果与CDC45L或PIF1蛋白的结合水平关联起来。例如，当测试药剂或化合物结合CDC45L或PIF1蛋白时，可鉴定或选择该测试药剂或化合物作为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当测试药剂或化合物不结合CDC45L或PIF1蛋白时，可鉴定该测试药剂或化合物作为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
本发明所述方法将在下面更加详细的加以描述。需用于筛选的CDC45L或PIF1多肽可为重组多肽，或者是来自自然界的蛋白质，或其部分肽。与测试化合物接触的多肽可以是，例如，纯化的多肽、可溶蛋白质、与载体结合的形式、或者与其它多肽融合的融合蛋白。
作为使用CDC45L或PIF1多肽来筛选蛋白质，例如与CDC45L或PIF1多肽结合的蛋白质的方法，可使用本领域技术人员众所周知的方法。上述筛选可通过例如免疫沉淀方法进行。在宿主(例如，动物)细胞等中通过将编码CDC45L或PIF1多肽的基因插入外源基因表达载体，例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS与pCD8来表达所述基因。
为此表达所用的启动子可为任何通常使用的启动子，包括，例如，SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.AcademicPress，London，83-141(1982))、EF-alpha启动子(Kim et al.，Gene 91：217-23(1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193(1991))、RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SR alpha启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8：466(1988))、CMV立即早期启动子(Seed andAruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9：946(1989))、HSV TK启动子等等。
将所述导入宿主细胞以表达外源基因可根据任何方法实施，例如电穿孔方法((Chu et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))、磷酸钙方法(Chenand Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))、DEAE葡聚糖方法(Lopata etal.，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol4：1641-3(1984))、Lipofectin方法(Derijard B.，Cell 76：1025-37(1994)；Lamb etal.，Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran et al.，Science 259：230-4(1993))等等。
对于由CDC45L或PIF1基因编码的多肽，可以把特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入该多肽的N或C端，从而将该多肽表达为包含该表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。可商购的载体能够利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP)形成的融合蛋白。另外，也可以使用如下的融合蛋白，其通过导入仅由数个到十余个(adozen)氨基酸构成的小型表位加以制备，使融合不会改变CDC45L或PIF1多肽的性质。可以使用例如多组氨酸(His-标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、E-标签(多克隆噬菌体上的表位)等表位，和识别它们的单克隆抗体作为筛选与CDC45L或PIF1多肽结合的蛋白质的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))
在免疫沉淀中，将这些抗体添加到用合适去垢剂制备的细胞裂解物内形成免疫复合体。免疫复合体由CDC45L或PIF1多肽、具有与该多肽结合能力的多肽、和抗体组成。除了使用针对上述表位的抗体之外，还可以使用针对CDC45L或PIF1多肽的抗体进行免疫沉淀，这样的抗体的制备如下文所述。免疫复合体可以被沉淀，例如当抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过蛋白Asepharose或蛋白G sepharose将其沉淀。如果将由CDC45L或PIF1基因编码的多肽制备成与表位(例如GST)的融合蛋白，则可以使用特异结合这些表位的底物，例如谷胱甘肽-sepharose 4B，按照与使用针对CDC45L或PIF1的抗体的相同的方式来形成免疫复合体。
可遵循或根据，例如，文献中的方法来实施免疫沉淀(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
普遍使用SDS-PAGE分析经免疫沉淀的蛋白，使用合适浓度的凝胶，可以利用结合蛋白的分子量来分析该蛋白。由于与CDC45L或PIF1多肽结合的蛋白难以通过考马斯兰染色或银染色等普通染色方法检测到，可以通过如下的方法提高蛋白的检测灵敏度：在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白，并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，可以直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶上纯化出靶蛋白并测定其序列。
作为利用CDC45L或PIF1多肽来筛选结合这些多肽的蛋白的方法，可以使用例如West-Western印迹分析法(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))。具体地，与CDC45L或PIF1多肽结合的蛋白可以通过如下方法获得，从预期表达CDC45L或PIF1多肽的培养细胞(例如肺癌细胞系)利用噬菌体载体(例如ZAP)制备cDNA文库，在LB琼脂糖上表达蛋白，将表达出的蛋白固定在膜上，使纯化并且标记的CDC45L或PIF1多肽与上述膜反应，并依照标记来检测表达与CDC45L或PIF1多肽结合的蛋白的噬菌斑。本发明的多肽可以利用生物素与抗生物素蛋白间的结合，或者利用特异结合CDC45L或PIF1多肽或与CDC45L或PIF1多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗体，来进行标记。也可以使用利用放射性同位素或荧光等的方法。
术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中用于指任何可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测到的组合物。此类标记物包括用经标记链霉亲合素偶联物染色的生物素、磁珠子(例如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如荧光素、德州红、若丹明、绿色荧光蛋白、等等)、放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)、和量热标记物(例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶、等)珠子。教导此类标记物使用的专利包括美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,275,149；和4,366,241。检测此类标记物的手段是本领域技术人员公知的。如此，例如，放射性标记物可使用照相胶片或闪烁计数器来检测，荧光标记物可使用检测发射光的光检测仪来检测。酶标记物通常通过给酶提供底物并检测酶作用于底物产生的反应产物来检测，而量热标记物只需通过显现有色标记物来检测。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献见“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields andSternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。
在双杂交系统中，例如，使本发明的多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，从而使该文库在被表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后，将cDNA文库导入到上述酵母细胞中，并从检测到的阳性克隆(当酵母细胞表达可与本发明多肽结合的蛋白时，两者的结合可激活报告基因，使阳性克隆可检测)分离源自该文库的cDNA。通过将上面分离的cDNA导入到大肠杆菌中并表达该蛋白，可制备由该cDNA编码的蛋白。作为报告基因，除了HIS3基因之外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
也可以用亲和色谱来筛选与CDC45L或PIF1基因编码的多肽结合的化合物。例如，可以把本发明多肽固定在亲和柱的载体上，而将含有能够结合本发明多肽的蛋白的测试化合物施加到该柱上。这里的测试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在加载测试化合物之后，冲洗柱子，从而可以制备得到结合于本发明多肽的化合物。当测试化合物是蛋白质时，对所得蛋白质的氨基酸序列进行分析，根据该序列合成寡DNA，并用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库，从而获得编码该蛋白的DNA。
利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合化合物的装置。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽(例如BIAcore，Pharmacia)，以表面等离子体共振信号的形式对本发明多肽与测试化合物间的相互作用进行实时的观察。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，人们就有可能对本发明多肽与测试化合物间的结合进行评估。
用于筛选当固定的CDC45L或PIF1多肽暴露于合成化合物或天然底物文库或随机噬菌体多肽展示文库时发生结合的分子的方法，以及使用基于高通量的组合化学技术(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))，不仅分离与CDC45L或PIF1蛋白结合的蛋白质，而且分离与CDC45L或PIF1蛋白结合化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法，是本领域技术人员众所周知的。
在本发明中，揭示了遏制CDC45L或PIF1的表达水平则降低细胞生长。如此，通过筛选结合CDC45L或PIF1的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。可通过二次和/或进一步的筛选来评估这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力，以鉴定用于癌症的治疗剂。例如，当某种结合CDC45L或PIF1蛋白的化合物抑制癌症的活性时，可得出结论，该化合物具有CDC45L或PIF1特异性治疗效果。
(iii)筛选遏制CDC45L或PIF1蛋白之生物学活性的化合物
本发明还提供使用CDC45L或PIF1多肽或其片段的生物学活性作为指标筛选用于治疗或预防癌症的候选药剂或化合物的方法
具体地，本发明提供下述方法[1]至[4]：
[1]一种筛选可用于治疗或预防表达CDC45L和/或PIF1的癌症的药剂或化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使测试药剂或化合物与CDC45L或PIF1多核苷酸或其功能性等同物或片段接触；
(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；
(c)将步骤(b)中检测到的水平与在测试药剂或化合物不存在时检测到的水平比较；
(d)选择降低或抑制所述多肽之生物学活性的测试药剂或化合物。
[2][1]的方法，其中所述生物学活性是细胞增殖促进活性；
[3][1]的方法，其中所述CDC45L多肽的生物学活性是DNA复制活性或PIF1多肽结合活性；和
[4][1]的方法，其中所述PIF1多肽的生物学活性是螺旋酶活性、端粒酶抑制活性或CDC45L多肽结合活性。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长的治疗效果或候选药剂或化合物治疗或预防CDC45L和/或PIF1相关疾病，例如肺癌的治疗效果。因此，本发明还提供使用CDC45L或PIF1多肽或其片段筛选用于抑制细胞生长的候选药剂或化合物或用于治疗或预防CDC45L和/或PIF1相关疾病，例如肺癌的候选药剂或化合物的方法，包括下述步骤：
a)使测试药剂或化合物与CDC45L或PIF1多肽或其功能性片段接触；
b)检测步骤(a)的多肽或片段的生物学活性；并
c)将b)的生物学活性与测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
或者，在一些实施方案中，本发明提供评估或评价测试药剂或化合治疗或预防与CDC45L和/或PIF1过表达有关的癌症或抑制与CDC45L和/或PIF1过表达有关的癌症的治疗效果的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使测试药剂或化合物与由CDC45L或PIF1基因的多核苷酸编码的多肽接触；
(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；并
(c)将潜在治疗效果与测试药剂或化合物关联起来，其中当与在测试药剂或化合物不存在时检测到的由CDC45L或PIF1基因的多核苷酸编码的多肽的生物学活性相比，测试药剂或化合物遏制所述多肽的生物学活性时，显示潜在治疗效果。
在本发明中，可以将治疗效果与CDC45L或PIF1多肽或其功能性片段的生物学活性关联起来。例如，当与在测试药剂或化合物不存在时检测到的水平相比，测试药剂或化合物遏制或抑制CDC45L或PIF1多肽或其功能性片段的生物学活性时，可鉴定或选择该测试药剂或化合物作为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与在测试药剂或化合物不存在时检测到的水平相比，测试药剂或化合物不遏制或抑制CDC45L或PIF1多肽或其功能性片段的生物学活性时，可鉴定该测试药剂或化合物作为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
本发明方法将在下面更加详细的加以描述。
任何多肽均可用于筛选，只要它们包含CDC45L或PIF1蛋白的生物学活性。此类生物学活性包括细胞增殖活性(细胞增殖促进活性)或彼此对CDC45L或PIF1的结合活性。对于CDC45L蛋白，生物学活性包括DNA复制活性。对于PIF1蛋白，生物学活性包括螺旋酶活性和端粒酶抑制活性。例如，可使用CDC45L或PIF1蛋白，也可使用与这些蛋白质功能等同的多肽。此类多肽可以由细胞内源或外源表达。
通过此筛选分离的化合物是由CDC45L或PIF1基因编码的多肽的拮抗剂的候选物。术语“拮抗剂”指通过结合多肽来抑制其功能的分子。所述术语也指降低或抑制编码CDC45L或PIF1的基因表达的分子。此外，通过此筛选分离的化合物是抑制CDC45L或PIF1多肽与分子(包括DNA和蛋白质)体内相互作用的化合物的候选物。
在本发明中，CDC45L和PIF1蛋白具有促进癌细胞的细胞增殖的活性(图3和图5)。因此，在本发明的筛选方法中，可使用此生物学活性来筛选抑制这些蛋白质之生物学活性的化合物。此类化合物会是治疗癌症，例如肺癌的潜在候选物。
当本方法中检测的生物学活性是细胞增殖促进活性时，它可以例如如下检测，即制备表达选自CDC45L和PIF1的多肽的细胞，在测试化合物存在下培养细胞，并测定细胞增殖速度、测量细胞周期等，以及测量集落形成活性，例如MTT测定法、集落形成测定法或“实施例”中所示的FACS。
如本文中定义的，术语“遏制生物学活性”指与在化合物不存在时相比将CDC45L或PIF1的生物学活性遏制至少10％，例如遏制至少25％、50％或75％，例如遏制至少90％。
在优选的实施方案中，使用不表达CDC45L或PIF1多肽的对照细胞。因而，本发明还提供使用CDC45L或PIF1多肽或其片段筛选评估抑制细胞生长的候选物质，或对评估治疗或预防CDC45L或PIF1相关疾病，例如肺癌的候选物质的方法，包括下述步骤：
a)在测试药剂或化合物存在下培养表达CDC45L或PIF1多肽或其功能性片段的细胞和不表达CDC45L或PIF1多肽或其功能性片段的对照细胞；
b)检测表达蛋白质的细胞和对照细胞的生物学活性；并
c)选择与在对照细胞及在测试药剂或化合物不存在时检测到的增殖相比抑制表达蛋白质的细胞中的生物学活性的测试化合物。
在细胞增殖促进活性之外，当在筛选中使用CDC45L多肽或其片段时，可使用DNA复制活性或PIF1多肽结合活性作为指标。还有，当在筛选中使用PIF1多肽或其片段时，可使用螺旋酶活性、端粒酶抑制活性或CDC45L多肽结合活性作为指标。这些生物学活性可通过本领域公知方法来检测。
在本发明中，揭示了遏制CDC45L或PIF1的生物学活性则降低细胞生长。如此，通过筛选抑制CDC45L或PIF1之生物学活性的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或进一步的筛选来评估以鉴定用于癌症的治疗剂。例如，当某种抑制CDC45L或PIF1蛋白之生物学活性的化合物抑制癌症的活性时，可得出结论，该化合物具有CDC45L或PIF1特异性治疗效果。
(iv)筛选改变CDC45L或PIF1表达的化合物
在本发明中，通过对CDC45L或PIF1特异性的双链分子降低CDC45L或PIF1表达则引起对癌细胞增殖的抑制(图3和图5)。因此，可通过使用CDC45L或PIF1表达水平作为指标的筛选来鉴定可用于治疗或预防癌症的化合物。在本发明的语境中，此类筛选可包括例如下述步骤：
(a)使测试化合物与表达CDC45L和/或PIF1基因的细胞接触；
(b)检测CDC45L和/或PIF1基因的表达水平；并
(c)选择与在测试化合物不存在时检测到的表达水平相比降低CDC45L和/或PIF1基因表达水平的测试化合物。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或候选药剂或化合物治疗或预防CDC45L和/或PIF1相关疾病，例如肺癌的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选遏制癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防CDC45L和/或PIF1相关疾病，例如肺癌的候选药剂或化合物的方法。
在本发明的语境中，此类筛选可包括例如下述步骤：
a)使测试药剂或化合物与表达CDC45L和/或PIF1基因的细胞接触；
b)检测CDC45L和/或PIF1基因的表达水平；并
c)将b)的表达水平与测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
或者，依照本发明，也可以评估或评价测试药剂或化合物治疗或预防癌症的潜在治疗效果。在一些实施方案中，本发明提供了用于评估或评价测试药剂或化合物治疗或预防与CDC45L和/或PIF1过表达有关的癌症或抑制与CDC45L和/或PIF1过表达有关的癌症的治疗效果的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使测试药剂或化合物与表达CDC45L和/或PIF1基因的细胞接触；
(b)检测步骤(a)中CDC45L和/或PIF1基因的表达水平；并
(c)将潜在治疗效果与测试药剂或化合物关联起来，其中当测试药剂或化合物降低CDC45L和/或PIF1基因的表达水平时显示潜在治疗效果。
在本发明中，治疗效果可以与CDC45L或PIF1基因的表达水平关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在时检测到的水平相比，该测试药剂或化合物降低CDC45L或PIF1基因的表达水平时，所述测试药剂或化合物可鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在时检测到的水平相比，该测试药剂或化合物不降低CDC45L或PIF1基因的表达水平时，所述测试药剂或化合物可鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
本发明方法将在下面更加详细的加以描述。
表达CDC45L和/或PIF1的细胞包括例如自肺癌建立的细胞系；此类细胞可用于上述本发明筛选(例如A549和SBC-3)。表达水平可通过本领域技术人员公知的方法来评估，例如RT-PCR、Northern印迹测定法、Western印迹测定法、免疫染色、ELISA或流式细胞术分析。如本文中定义的，术语“降低表达水平”指与化合物不存在时的表达水平相比将CDC45L或PIF1的表达水平降低至少10％，例如降低至少25％、50％或75％的水平，例如降低至少95％的水平。本文中的化合物包括化学化合物、双链核苷酸、等等。上文描述了双链核苷酸的制备。在筛选方法中，降低CDC45L或PIF1表达水平的化合物可选择为要用于治疗或预防癌症，例如肺癌的候选药剂或化合物。
或者，本发明的筛选方法可包括下述步骤：
(a)使候选化合物与其中导入有载体的细胞接触，所述载体包含CDC45L或PIF1的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；
(b)测量所述报告基因的表达水平或活性；并
(c)选择降低所述报告基因之表达水平或活性的候选化合物。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或候选药剂或化合物治疗或预防CDC45L和/或PIF1相关疾病的治疗效果。因此，本发明还提供了筛选遏制癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选治疗或预防CDC45L和/或PIF1相关疾病的候选药剂或化合物的方法。
依照另一个方面，本发明提供了包括下述步骤的方法：
a)使测试药剂或化合物与其中导入有载体的细胞接触，所述载体包含CDC45L或PIF1基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；
b)检测所述报告基因的表达水平或活性；并
c)将b)的表达水平与测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
或者，在一些实施方案中，本发明还提供了用于评估或评价测试药剂或化合物治疗或预防与CDC45L或PIF1过表达有关的癌症或抑制与CDC45L或PIF1过表达有关的癌症的治疗效果的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)使测试药剂或化合物与其中导入有载体的细胞接触，所述载体包括CDC45L或PIF1的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；
(b)测量所述报告基因的表达水平或活性；并
(c)将潜在治疗效果与测试药剂或化合物关联起来，其中当测试药剂或化合物降低所述报告基因的表达水平或活性时显示潜在治疗效果。
在本发明中，治疗效果可以与所述报告基因的表达水平或活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在时检测到的水平相比，该测试药剂或化合物降低所述报告基因的表达水平或活性时，所述测试药剂或化合物可鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在时检测到的水平相比，该测试药剂或化合物不降低所述报告基因的表达水平或活性时，所述测试药剂或化合物可鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
合适的报告基因和宿主细胞是本领域公知的。例如，报告基因是萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、Discosoma sp.红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、lacZ和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，而宿主细胞是COS7、HEK293、HeLa等等。筛选所需报告构建物可通过连接报告基因序列与CX的转录调节区来制备。本文中CX的转录调节区指但不限于起始密码子至上游至少500bp，例如1000bp，例如上游5000或10000bp的区域。含有转录调节区的核苷酸区段可以自基因组文库分离，或者可以通过PCR扩增。用于鉴定转录调节区的方法，还有测定方案是公知的(Molecular Cloning third editionchapter 17，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
用含有所述报告构建物的载体感染宿主细胞，并通过本领域公知方法检测报告基因的表达或活性(例如使用照度计、吸收分光计、流式细胞仪等等)。如本文中定义的，“降低表达或活性”指与化合物不存在时相比将报告基因的表达或活性降低至少10％，例如降低至少25％、50％或75％，例如降低至少95％。
本发明会在下述实施例中进一步描述，实施例不限制本发明的范围，本发明的范围在权利要求书中描述。
在本发明中，揭示了遏制CDC45L或PIF1的表达水平则降低细胞生长。因而，通过筛选抑制CDC45L或PIF1之表达水平的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或进一步的筛选来评估以鉴定用于癌症的治疗剂。例如，当某种抑制CDC45L或PIF1蛋白之表达水平的化合物抑制癌症的活性时，可得出结论，该化合物具有CDC45L或PIF1特异性治疗效果。
(v)使用CDC45L和PIF1的结合作为指标的筛选
在本发明中，确认了CDC45L蛋白与PIF1蛋白相互作用(图4B)。因而，可使用CDC45L蛋白和PIF1蛋白的此类结合作为指标来筛选抑制CDC45L蛋白和PIF1蛋白之间结合的化合物。此类化合物可对癌症治疗具有潜在治疗效果，因为那些蛋白质涉及癌细胞生长。因此，本发明提供了使用CDC45L蛋白和PIF1蛋白的此类结合作为指标来筛选用于抑制CDC45L蛋白和PIF1蛋白之间结合的化合物的方法。另外，本发明亦提供筛选用于抑制或降低表达CDC45L和PIF1基因的癌细胞例如肺癌细胞生长的候选化合物和用于治疗或预防癌症例如肺癌的候选化合物的方法。
具体地，本发明提供了下列方法[1]到[5]：
[1]一种筛选破坏CDC45L多肽和PIF1多肽之间结合的药剂或化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使CDC45L多肽或其功能等同物与PIF1多肽或其功能等同物在测试药剂或化合物存在下接触；
(b)检测所述多肽之间的结合；
(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与在测试药剂或化合物不存在时检测到的结合水平；并
(d)选择降低或抑制所述结合水平的测试药剂或化合物。
[2]一种筛选可用于治疗或预防癌症的候选药剂或化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使CDC45L多肽或其功能等同物与PIF1多肽或其功能等同物在测试药剂或化合物存在下接触；
(b)检测所述多肽之间的结合；
(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与在测试药剂或化合物不存在时检测到的结合水平；并
(d)选择降低或抑制结合水平的测试药剂或化合物。
[3][1]或[2]的方法，其中CDC45L的功能等同物包含PIF1结合域。
[4][1]或[2]的方法，其中PIF1的功能等同物包含CDC45L结合域。
[5][1]的方法，其中所述癌症是肺癌。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防CDC45L或PIF1相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于遏制癌细胞增殖的候选药剂或化合物或者用于治疗或预防癌症的候选药剂或化合物的方法。
更具体地，所述方法包括下列步骤：
(a)使CDC45L多肽或其功能等同物与PIF1多肽或其功能等同物在测试药剂或化合物存在下接触；
(b)检测所述多肽之间的结合水平；
(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与在测试药剂或化合物的不存在时检测到的结合水平；并
(d)将c)的结合水平与测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
或者，在一些实施方案中，本发明还提供一种用于评估或估算测试药剂或化合物治疗或预防癌症或抑制癌症的治疗效果的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使CDC45L多肽或其功能等同物与PIF1多肽或其功能等同物在测试药剂或化合物存在下接触；
(b)检测所述多肽之间的结合水平；
(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与在测试药剂或化合物的不存在时检测到的结合水平；并
(d)将潜在治疗效果与测试药剂或化合物关联起来，其中当测试药剂或化合物降低结合水平时，显示出潜在治疗效果。
在本发明中，治疗效果可以与CDC45L和PIF1蛋白的结合水平关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在时检测到的水平相比，该测试药剂或化合物降低CDC45L和PIF1蛋白的结合水平时，所述测试药剂或化合物可鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在时检测到的水平相比该测试药剂或化合物不降低CDC45L和PIF1蛋白的结合水平时，所述测试药剂或化合物可鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
在本发明的语境中，CDC45L或PIF1多肽的功能等同物分别是具有与CDC45L多肽(SEQ ID NO：14)或PIF1多肽(SEQ ID NO：16)等同的生物学活性的多肽(见(1)“基因和多肽”)。更具体地，PIF1多肽的功能等同物是具有氨基酸序列SEQ ID NO：16的多肽包含CDC45L结合域的片段。还有，CDC45L多肽的功能等同物是具有氨基酸序列SEQ ID NO：14的多肽包含PIF1结合域的片段。
作为筛选抑制CDC45L结合PIF1的化合物的方法，可使用本领域技术人员公知的多种方法。此类筛选可使用例如免疫沉淀、West-Western印迹分析(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))、利用细胞的双杂交系统(″MATCHMAKER Two-Hybrid system″，″Mammalian MATCHMAKERTwo-Hybrid Assay Kit″，″MATCHMAKER one-Hybrid system′(Clontech)；″HybriZAP Two-Hybrid Vector System′(Stratagene)；参考文献见″Dalton andTreisman，Cell 68：597-612(1992)″，″Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)″)、亲和层析和使用表面等离振子共振现象的生物传感器来进行(见(i)一般筛选方法和(ii)筛选结合CDC45L或PIF1蛋白的化合物)。
可用于筛选的多肽可为重组多肽，或者是来自自然界来源的蛋白质，或其部分肽。任何上述测试化合物可用于筛选。
可使用任何上述测试化合物(见(1)用于筛选的测试化合物)。
在一些实施方案中，此方法进一步包括检测候选化合物与CDC45L蛋白或PIF1蛋白结合，或检测CDC45L蛋白与或PIF1蛋白的结合的水平的步骤。表达CDC45L蛋白和/或PIF1蛋白的细胞包括例如自癌症，例如肺癌建立的细胞系，此类细胞可用于上述本发明筛选，只要细胞表达这两种基因。或者，可以用CDC45L和PIF1蛋白的表达载体二者或任一转染细胞，从而表达这两种基因。CDC45L蛋白与PIF1蛋白的结合可使用抗CDC45L抗体和PIF1抗体通过免疫沉淀测定法来检测(图4)。
在本发明中，揭示了抑制CDC45L蛋白和PIF1蛋白之间的结合则降低细胞生长。如此，通过筛选抑制CDC45L蛋白和PIF1蛋白之间结合的候选化合物，可鉴定出有潜力治疗或预防癌症的候选化合物。可通过二次和/或进一步的筛选来评估这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力以鉴定用于癌症的治疗剂。例如，当某种抑制CDC45L蛋白和PIF1蛋白之间的结合的化合物抑制癌症的活性时，可得出该化合物具有CDC45L或PIF1特异性治疗效果的结论。
本发明会在下述实施例中加以进一步描述，它们不对权利要求中描述的本发明范围进行限定。
除非另行定义，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域一般技术人员通常理解的意义相同。下面描述了合适的方法和材料，虽然与在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于实践或测试本发明。
实施例
材料和方法
细胞系和组织样品。此项研究中使用的人肺癌细胞系如下：肺腺癌(ADC)NCI-H1781，NCI-H1373，LC319，A549，和PCI4；肺鳞状细胞癌(SCC)SK-MES-1，NCI-H2170，NCI-H520，NCI-H1703，和LU61；肺大细胞癌(LCC)LX1；和小细胞肺癌(SCLC)SBC-3，SBC-5，DMS273，和DMS114。所有细胞以单层在补充有10％胎牛血清(FCS)的适宜培养基中培养，并于37摄氏度在含5％CO2的增湿空气中维持。用作正常对照的人小气道上皮细胞(SAEC)在来自Cambrex Bio Science Inc的优化培养基(SAGM)中培养。如别处所述在知情同意下早前获得原发性肺癌样品(NPL 8，12)。临床阶段依照UICC TNM归类(Sobin L WC.TNM Classification of Malignant Tumours，6th edition.Anonymous.New York：Wiley-Liss.2002)来判断。用于组织微阵列上免疫染色的福尔马林固定的原发性肺肿瘤和邻近正常肺组织样品得自267名在北海道大学及其附属医院(日本札幌)接受根治性手术的患者(159例ADC，89例SCC，16例LCC，3例ASC；90名女性和177名男性患者；年龄中值65.0，范围26-84岁，114例pT1，125例pT2，28例pT3肿瘤尺寸；208例pN0，23例pN1，36例pN2淋巴结状态)。此项研究和所有所述临床材料的使用得到了各个科研伦理委员会的批准。
半定量RT-PCR。使用随机引物(Roche Diagnostics)和Superscript II(Invitrogen)将来自每份样品的mRNA的总共3微克的等分试样逆转录成单链cDNA。半定量RT-PCR实验用下述各组对CDC45L，PIF1特异性的合成引物或作为内部对照的β-肌动蛋白(ACTB)特异性引物进行：CDC45细胞分裂周期45样(CDC45L)，5’-CACAACCATTTTGACCTCTCAGT-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCTTCTACATCTCAAATCATGTCC-3’(SEQ ID NO：2)，PIF15′至3′DNA螺旋酶同系物(酿酒酵母)(PIF1)，5’-AGGCAGTGTCCCCTTCTGTA-3’(SEQID NO：3)和5’-CCTGAAAGGAGGGATGTTCA-3’(SEQ ID NO：4)，ACTB，5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’(SEQ ID NO：5)和5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’(SEQ ID NO：6)。优化PCR反应的周期数目以确保产物强度在扩增的线性期内。
Western印迹。裂解缓冲液：50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150mmol/LNaCl，0.5％NP40，0.5％脱氧胆酸钠，和蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem)中裂解细胞。通过Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad)来测定每份溶胞物的蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品。每个溶胞物取10微克在10-12％变性聚丙烯酰胺凝胶(带3％聚丙烯酰胺成层胶)上解析，并通过电泳转移至硝酸纤维素膜(GE Healthcare Bio-sciences)。用含5％脱脂奶粉的TBST封闭后，将膜与一抗一起于室温温育1小时。将免疫反应性蛋白质与辣根过氧化物酶缀合的二抗(GE Healthcare Bio-sciences)一起于室温温育1小时。用TBST清洗后，将反应物使用增强型化学发光试剂盒(GE HealthcareBio-sciences)来显色。商品化家兔多克隆抗CDC45L抗体购自ATLASAntibodies AB(产品目录号HPA000614)，通过使用肺癌细胞系溶胞物的Western印迹分析证明是对人CDC45L特异性的。
免疫组织化学和组织微阵列。为了调查石蜡块包埋的临床样品中的CDC45L蛋白，以下述方式使用ENVISION+Kit/HRP(pH9)(DakoCytomation)染色切片。简言之，将载玻片浸泡在靶物修复溶液中，并在高压锅中于108摄氏度煮沸15分钟以修复抗原。封闭内源过氧化物和蛋白质后，每张载玻片加3微克/ml家兔多克隆抗人CDC45L抗体(ATLAS Antibodies AB；产品目录号HPA000614)，并且将切片与作为二抗的辣根过氧化物酶标记的抗家兔IgG(Histofine Simple Stain MAX PO(G)，Nichirei)一起温育。添加底物色原体，并用苏木精对标本进行复染色。
如别处所述用267份福尔马林固定的原发性NSCLC构建肿瘤组织微阵列(Chin SF，et al.Molecular Pathology 2003；56：275-9；Callagy G，et al.Diagn MolPathol 2003；12：27-34；Callagy G，et al.J Pathol 2005；205：388-96)。采样的组织区域基于载玻片上对应H&E染色切片的目视对齐来选择。取自供体肿瘤块的三个、四个、或五个组织核心(直径，0.6mm；深度，3-4mm)用组织微阵列仪(Beecher Instruments)放置入接受石蜡块中。自每个病例打孔取一个正常组织核心，并将所得微阵列块的5微米切片用于免疫组织化学分析。由三名独立的调查者在事先不知道临床病理学数据下半定量评估CDC45L阳性。由于每个肿瘤组织核心内的染色强度大部分是均匀的，因此通过记录为阴性(肿瘤细胞中没有可察觉的染色)或阳性(肿瘤细胞的核和胞质中可察觉的褐色染色)来评估核和胞质中的CDC45L染色强度。只有所有三个调查者独立地定义病例为阳性时，才接受病例为阳性。
统计分析。统计分析使用StatView统计程序(SaS)来实施。自手术日起至NSCLC相关死亡时间或至最后一次随访观察日止的数据来计算肿瘤特异性存活曲线。为每一项有关变量和CDC45L表达计算Kaplan-Meier曲线；使用时序检验来分析患者亚组间存活时间的差异。用Cox比例风险回归模型实施单变量和多变量分析以确定临床病理学变量与癌症相关死亡率之间的关联。首先，分析死亡与可能的预后因素(包括年龄、性别、pT归类、和pN分类)之间的关联，一次考虑一个因素。其次，以反向(逐步)程序应用多变量Cox分析，其总是迫使强CDC45L表达，连同所有满足P值小于0.05的进入水平的变量进入模型。随着该模型继续添加因素，独立因素未超过P＜0.05的退出水平。
CDC45L相互作用蛋白的鉴定。通过在蛋白酶抑制剂存在下将细胞提取物在终体积2ml的免疫沉淀缓冲液(0.5％NP40，50mmol/L Tris-Hcl，150mmol/L NaCl)中与100微升蛋白G-琼脂糖珠子一起于4摄氏度温育1小时来预澄清细胞提取物。于4摄氏度以1,000rpm离心1分钟后，将上清液与家兔多克隆抗CDC45L抗体或对照正常家兔IgG一起于4摄氏度温育4小时。另外，每份上清液加30微升蛋白G-琼脂糖珠子并再温育2小时。通过以5,000rpm离心2分钟自每份样品收集珠子并用1ml免疫沉淀缓冲液清洗六次后，将珠子在50微升Laemmli样品缓冲液中重悬浮并煮沸5分钟，之后在5％至10％SDS-PAGE凝胶(BioRad)上分开蛋白质。电泳后，用银染色凝胶。切出在用抗CDC45L抗体免疫沉淀的提取物中特异性出现的蛋白质条带，用于基质辅助激光解吸附/离子化飞行时间质谱术(MALDI-TOF-MS；AXIMA-CFR plus，SHIMAZUBIOTECH)进行分析。为了确认CDC45L与PIF1之间的相互作用，如别处所述进行免疫沉淀实验(NPL18，23)。
免疫细胞化学分析。细胞涂布在玻璃盖玻片(Becton Dickinson Labware)上，用4％低聚甲醛固定，并用含0.1％Triton X-100的PBS于室温透化3分钟。通过CASBLOCK(ZYMED)于室温封闭非特异性结合10分钟。然后经细胞与在含3％BSA的PBS中稀释的一抗一起于室温温育60分钟。用PBS清洗后，细胞用FITC缀合的二抗(Santa Cruz)于室温染色60分钟。用PBS再次清洗后，每份标本用含4′，6′-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的Vectashield(VectorLaboratories，Inc.)封固并用光谱共聚焦扫描系统(TSC SP2AOBS：LeicaMicrosystems)显现。
RNAi定法。使用24微升Lipofectamine 2000(Invitrogen)遵循制造商的方案将小干扰RNA(siRNA)双链体(100nM)转染入肺癌细胞系A549和SBC-3中。转染细胞培养7天，并在转染后第7天通过吉姆萨染色计算集落数，通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定(细胞计数试剂盒-8溶液；Dojindo Laboratories)评估细胞活力。为了确认对CDC45L或PIF1表达的遏制，如上所述用对CDC45L或PIF1特异性的合成引物进行半定量RT-PCR。用于RNAi的合成寡核苷酸的靶序列如下：对照-1(LUC：来自Photinus pyralis的萤光素酶基因)，5′-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3′(SEQID NO：7)；对照-2(EGFP：增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因，维多利亚水母(Aequorea victoria)GFP的一种变体)，5′-GAAGCAGCACGACUUCUUC-3′(SEQ ID NO：8)；
si-CDC45L#1，5′-GCAAACACCUGCUCAAGUC-3′(SEQ ID NO：9)；
si-CDC45L#2，5′-GGACGUGGAUGCUCUGUGU-3′(SEQ ID NO：10)；
si-PIF1#1，5′-GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-3′(SEQ ID NO：11)；
si-PIF1#2，5′-GGCAUGACCCUGGAUUGUG-3′(SEQ ID NO：12)。
流式细胞术。A549细胞以3.5X105个细胞/100mm盘的密度分配并用siRNA寡核苷酸转染。转染后48小时用胰蛋白酶处理细胞，在PBS中收集，并在70％冷乙醇中固定30分钟。用100微克/mL RNA酶(Sigma-Aldrich)处理后，细胞用含50微克/mL碘化丙锭(Sigma-Aldrich)的PBS染色。在BectonDickinson FACScan上进行流式细胞术并通过ModFit软件(Verity SoftwareHouse，Inc.)分析。对自至少10,000个不设门细胞选择的细胞分析DNA含量。
结果
肺癌和正常组织中的CDC45L表达。为了鉴定可用于在早期检测癌症存在的新分子及基于癌细胞的生物学特征来开发新治疗，使用cDNA微阵列实施了临床肺癌的基因组范围表达概况分析(NPL7-12)。在筛选的27,648种基因或EST中，鉴定出绝大多数检查的临床肺癌样品中CDC45L转录物的表达升高(3倍或更高)。在15份肺癌组织的12份中和在所有15种肺癌细胞系中通过半定量RT-PCR实验确认了其过表达(图1A和1B)。
随后，在所有6种癌细胞系中确认了CDC45L蛋白过表达，但是通过使用抗CDC45L抗体的Western印迹分析在正常支气管上皮衍生细胞(SAEC)中没有检测到条带(图1C)。随后，实施了免疫荧光分析来检查肺癌细胞系A549中内源CDC45L的亚细胞定位，发现了它在核中的强染色和在胞质中的弱染色(图1D)。在检查的16种正常组织中，使用CDC45L cDNA作为探针的Northern印迹仅在睾丸中鉴定出2.2-kb条带(数据未显示)。另外，通过使用抗CDC45L多克隆抗体的免疫组织化学，将5种正常组织(心、肺、肝、肾、和睾丸)中的CDC45L蛋白表达水平与肺癌中的进行了比较。CDC45L在肺癌细胞和睾丸的核和胞质中丰富表达，但是它在剩余四种正常组织中的表达几乎检测不到(图2A)。
CDC45L表达与NSCLC患者不良预后的关联。为了调查CDC45L在肺部癌发生中的生物学和临床病理学意义，本发明人对含有来自267名经历手术切除的NSCLC患者的组织切片的组织微阵列进行了免疫组织化学染色。主要在肿瘤细胞的核和胞质处观察到CDC45L特异性多克隆抗体的CDC45L染色，但是在正常肺细胞中检测不到(图2B)。在267份NSCLC中，CDC45L染色在171例(64.0％)中呈阳性，在96例(36.0％)中阴线(详情显示于表1A)。然后，本发明人比较了CDC45L阳性状态与临床病理学因素，并发现了NSCLC中的CDC45L表达与高龄(＞＝65；P＝0.0417，Fisher氏确然检验；表1A)、性别男性(P＝0.0008)、非ADC组织学(P＜0.0001)、和大肿瘤尺寸(pT2-3；P＝0.0066)显著关联。具有CDC45L阳性肿瘤的NSCLC患者的存活时间中值比具有CDC45L阴性肿瘤的显著更短(P＝0.0045，时序检验；图2C)。本发明人还应用单变量分析来评估患者预后和数个因素之间的关联，包括年龄(<65对>＝65)、性别(女性对男性)、组织学类型(ADC对非ADC)、pT阶段(肿瘤尺寸；T1对T2+T3)、pN阶段(淋巴结状态；N0对N1+N2)、和CDC45L状态(阴性对阳性)(表1B)。所有参数均与不良预后显著相关。在多变量分析中，CDC45L状态没有达到作为此项研究中登记的手术治疗肺癌患者的独立预后因素的统计学显著水平(P＝0.4332)，而pT和pN阶段以及年龄则达到了，提示CDC45L表达对肺癌中这些临床病理学因素的重要性。
[表1A]
NSCLC组织中的CDC45L阳性与患者的特征之间的关联(n＝267)
Figure BDA0000152925550000791
ADC，腺癌
非ADC，鳞状细胞癌加大细胞癌和腺鳞状细胞癌
*P＜0.05(Fisher氏确然检验)
[表1B]
NSCLC患者中预后因子的Cox氏比例风险模型分析
Figure BDA0000152925550000801
ADC，腺瘤
非ADC，鳞状细胞癌加大细胞癌和腺鳞状细胞癌
*P＜0.05(Fisher氏确然检验)
CDC45L对癌细胞生长的影响。为了评估CDC45L是否对于肺癌细胞的生长和/或存活是必需的，构建了对CDC45L序列特异性的siRNA寡核苷酸，并转染入以高水平内源表达CDC45L的肺癌细胞系A549(腺癌)和SBC-3(小细胞肺癌)中。在使用si-CDC45L#1和si-CDC45L#2构建物时，通过半定量RT-PCR确认了敲低效应(图3A)。后续MTT和集落形成测定法(图3B和3C)揭示了用si-CDC45L#1和si-CDC45L#2转染的细胞中活细胞和集落数目的显著减少。为了进一步澄清此效应的机制，我们使用经si-CDC45L#2转染的A549细胞实施了流式细胞术分析，并发现了经si-CDC45L#2转染的细胞的sub-G1比例显著高于经对照siRNA(si-LUC)处理的(图3D)。这些数据提示CDC45L的敲低诱导了肺癌细胞凋亡。
PIF1作为与CDC45L相互作用的蛋白质的鉴定。为了阐明CDC45L过表达在肺部癌发生中的生物学机制，本发明人试图鉴定肺癌细胞中会与CDC45L相互作用的蛋白质。用家兔多克隆抗CDC45L抗体或家兔IgG(对照)免疫沉淀来自SBC-3细胞的细胞提取物。通过SDS-PAGE分开后，对蛋白质复合物进行银染色。切出CDC45L抗体免疫沉淀物中可见但家兔IgG免疫沉淀物中看不到的免疫沉淀物中的一条蛋白质条带，用胰蛋白酶消化，并进行质谱术分析。来自提取的蛋白质条带的肽与PIF1的肽匹配。本发明人随后通过半定量RT-PCR实验再检查原发NSCLC组织和肺癌细胞系，并发现15份NSCLC临床样品中的9份中以及所有15种检查的肺癌细胞系中的PIF1表达升高，而在正常肺组织和正常支气管上皮衍生细胞SAEC中几乎检测不到它的表达(图4A)。CDC45L基因的表达样式显示较好的与PIF1基因的表达样式的一致性，提示这两种基因有可能在肺癌细胞中共激活。为了确认肺癌细胞中CDC45L与PIF1可能的相互作用，构建了设计用来表达带FLAG标签的PIF1蛋白的质粒(pCAGGSn3FC-PIF1-FLAG)，并转染入SBC-3细胞中，然后用抗FLAG抗体免疫沉淀蛋白质。使用抗CDC45L抗体对沉淀物的Western印迹分析指示内源CDC45L与外源PIF1共沉淀(图4B)。免疫细胞化学分析确认了内源CDC45L和外源PIF1在核和胞质中的共定位(图4C)。
PIF1对癌细胞生长的影响。为了进一步评估PIF1的表达是否在肺癌细胞的生长和/或存活中发挥作用，本发明人使用针对PIF1的siRNA检查了PIF1功能在肺部癌发生中的生物学意义。针对PIF1的siRNA寡核苷酸(si-PIF1#1和-#2)转染入A549和SBC-3细胞有效遏制内源PIF1蛋白表达，而对照siRNA没有观察到影响(图5A)。与降低PIF1表达一致，A549和SBC-3细胞显示细胞活力和集落数目的显著降低(图5B和5C)。这些结果强烈支持PIF1可能也在肺癌细胞的生长和/或存活中发挥重要作用的可能性。
讨论
提供较好的存活率和较少的严重不良效应的新分子靶向抗癌药的开发是极其重要的。因此，本发明建立了一种有效系统来鉴定治疗性靶物，用于开发具有比当前疗法更有效的抗癌效果及更少的不良反应的小分子化合物(Kikuchi T.et al.Oncogene 2003；22：2192-205；Kakiuchi S.et al.Mol CancerRes 2003；1：485-99；Kakiuchi S.et al.Hum Mol Genet 2004；13：3029-43；KikuchiT.et al.Int J Oncol 2006；28：799-805；Taniwaki M.et al.Int J Oncol2006；29：567-75；Yamabuki T.et al.Int J Oncol 2006；28：1375-84)。
虽然已知CDC45L是一种复制启动蛋白，但是尚未指明它与临床癌症的关系。最近，对复制因子调节的进一步了解为可能的增殖标志物以及治疗性靶物提供了新来源。例如，丝氨酸-苏氨酸激酶CDC7在活化后磷酸化MCM蛋白，并由此募集别的因子来推动解开DNA以及结合DNA聚合酶，这对于DNA复制启动是必不可少的。用强的CDC7激酶抑制剂PHA-767491处理导致诱导多种癌细胞类型中的凋亡性细胞死亡和临床前癌症模型中的肿瘤生长抑制(Montagnoli A，et al.Nat Chem Biol 2008；4：357-65)。对于另一种选择性CDC7激酶抑制剂，即BMS-863233(其限制DNA复制起始且显示抗肿瘤活性)人们正在准备在顽固性血液学癌症患者中进行临床试验(//clinicaltrials.gov/show/NCT00838890)。此外，就生物标志物而言，对于具有各种类型的癌症(包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、脑癌、子宫癌、和肾癌)的患者，在免疫组织化学上检查MCM蛋白、CDC6、和孪蛋白(GMNN)作为预后生物标志物(Gonzalez MA et al.，Nat Rev Cancer 2005；5：135-41)。用上文实施例所示特异性siRNA处理肺癌细胞降低了CDC45L表达，然后导致凋亡。此外，实施例中经由组织微阵列实验得到的临床病理学证据证明了肿瘤表达CDC45L的NSCLC患者显示比CDC45L表达阴性患者更短的癌症特异性存活期。通过体外和体内测定法获得的结果证明了过表达的CDC45L是诱导肺癌细胞的高度恶性表型的一种重要分子。就我们所知，这是显示CDC45L表达作为癌症生物标志物的预后价值的第一项研究。
本发明还鉴定了肺癌中CDC45L和PIF1蛋白之间的相互作用。PIF1归类为自酵母至人保守的SFI 5′至3′DNA螺旋酶的一个成员，其主要被报告为酵母中的一种DNA复制因子(NPL 42，43)。在实施例中，PIF1还在绝大多数肺癌中高度反式激活，而且用特异性siRNA处理肺癌细胞导致对生长活性的遏制。这些数据指示PIF1也在肺部癌发生中发挥重要作用。
酿酒酵母PIF1螺旋酶与DNa2螺旋酶/核酸酶和DNA聚合酶δ一起在DNA复制中发挥功能(Budd ME et al.，Mol Cell Biol 2006；26：2490-500)。另一方面，CDC45L与MCM2-7复合物、GINS复合物、和DNA聚合酶δ相互作用，而且通过桥接前行性DNA聚合酶δ和ε与延伸机制中的复制性螺旋酶，在DNA复制的延伸中发挥重要作用(NPL39)。基于本文中提供的数据，靶向CDC45L-PIF1复合物以及CDC45L表达是一种遏制癌细胞增殖和/或存活的新办法。
工业实用性
本文中所描述的使用激光捕获解剖和基因组范围cDNA微阵列的组合对癌症的基因表达分析将一种特定基因鉴定为用于癌症预防和治疗的靶物。基于此差异表达基因，即CDC45L的表达，本发明为鉴定和检测癌症以及评估预后提供一种新颖分子诊断标志物。另外，确认了PIF1——这种基因的翻译产物被鉴定为与CDC45L相互作用——在癌症中过表达。因此，本发明还提供一种使用CDC45L或PIF1的新诊断策略。
另外，如本文中所描述的，CDC45L和PIF1牵涉癌细胞存活。因此，本发明还提供用于治疗和预防癌症的新颖分子靶物。它们可用于开发没有不良效应的新颖治疗性药物和预防性药剂。
本文中所描述的方法还可用于鉴定别的用于预防、诊断、和治疗癌症的分子靶物。本文中所提供的数据增加对癌症的全面了解，推动新颖诊断策略的开发，及为治疗性药物和预防性药剂鉴定分子靶物提供线索。这样的信息有助于更深刻地理解肿瘤发生，及为开发用于诊断、治疗、和最终预防癌症的新策略提供指示物。
通过述及完整收录本文中引用的所有专利、专利申请、和出版物。
另外，虽然参照其具体实施方案详细地描述了本发明，但是要理解，上面的描述本质上是例示性的和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围。如此，本发明意图并非由上文描述，而是由所附权利要求及其等同方案来限定。
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Claims (33)

1.一种在受试者中检测或诊断癌症的方法，包括测定源自受试者的生物学样品中CDC45L和/或PIF1的表达水平，其中所述水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示所述受试者罹患或有风险发生癌症或者所述受试者中存在癌症，其中通过选自下组的方法测定所述表达水平：
(a)检测CDC45L基因的mRNA和/或PIF1基因的mRNA，
(b)检测由CDC45L基因编码的蛋白质和/或由PIF1基因编码的蛋白质，和
(c)检测由CDC45L基因编码的蛋白质和/或由PIF1基因编码的蛋白质的生物学活性。
2.权利要求1的方法，其中所述升高是比所述正常对照水平高至少10％。
3.权利要求1的方法，其中所述源自受试者的生物学样品是活检样品。
4.权利要求1的方法，其中所述癌症是肺癌。
5.一种用于诊断或检测癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包含结合CDC45L基因和/或PIF1基因的转录或翻译产物的试剂。
6.一种用于评估患肺癌的受试者的预后的方法，其中所述方法包括下述步骤：
(a)检测源自受试者的生物学样品中CDC45L的表达水平；
(b)将检测到的表达水平与对照水平比较；并
(c)基于(b)的比较确定所述患者的预后。
7.权利要求6的方法，其中所述对照水平是良好预后对照水平，且所述表达水平与所述对照水平相比的升高指示不良预后。
8.权利要求7的方法，其中所述升高是比所述对照水平高至少10％。
9.权利要求6的方法，其中通过选自下组的方法测定所述表达水平：
(a)检测CDC45L基因的mRNA；
(b)检测由CDC45L基因编码的蛋白质；和
(c)检测由CDC45L基因编码的蛋白质的生物学活性。
10.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使测试化合物与CDC45L或PIF1多肽或其片段接触；
b)检测所述多肽或其片段和所述测试化合物之间的结合活性；并
c)选择结合所述多肽或其片段的测试化合物。
11.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使测试化合物与表达CDC45L基因和/或PIF1基因的细胞接触；
b)检测CDC45L基因和/或PIF基因的表达水平；并
c)选择与在所述测试化合物不存在时检测到的表达水平相比降低CDC45L基因和/或PIF1基因的表达水平的测试化合物。
12.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使测试化合物与CDC45L或PIF1多肽或其片段接触；
b)检测步骤(a)的多肽或其片段的生物学活性；并
c)选择与在所述测试化合物不存在时检测到的生物学活性相比遏制所述多肽或其片段的生物学活性的测试化合物。
13.权利要求12的方法，其中所述生物学活性是细胞增殖活性。
14.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使测试化合物与其中导入了包含CDC45L或PIF1基因的转录调节区和在转录调节区控制下表达的报告基因的载体的细胞接触；
b)测量所述报告基因的表达或活性；并
c)选择与在所述测试化合物不存在时检测到的水平相比降低所述报告基因的表达或活性水平的测试化合物。
15.一种筛选抑制CDC45L多肽和PIF1多肽之间结合的候选化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)在测试化合物存在下使CDC45L多肽或其功能性等同物与PIF1多肽或其功能性等同物接触；
(b)检测所述多肽之间的结合；
(c)将步骤(b)中检测到的结合水平与在所述测试化合物不存在时检测到的水平比较；并
(d)选择与在所述测试化合物不存在时检测到的水平相比降低或抑制结合水平的测试化合物。
16.权利要求15的方法，其中所述CDC45L多肽功能性等同物包含PIF1结合域。
17.权利要求15的方法，其中所述PIF1多肽功能性等同物包含CDC45L结合域。
18.权利要求10至17中任一项的方法，其中所述癌症是肺癌。
19.一种包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含与选自SEQID NO：9，10，11和12的靶序列对应的核苷酸序列，且所述反义链包含与所述靶序列互补的核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链彼此杂交以形成双链分子，其中所述双链分子在导入表达CDC45L基因或PIF1基因的细胞中时抑制所述基因表达。
20.权利要求19的双链分子，其中所述有义链与所述反义链在所述靶序列处杂交以形成长度为19～25个核苷酸对的双链分子。
21.权利要求19或20的双链分子，其中所述双链分子是单一多核苷酸，其包含经单链核苷酸序列相连接的所述有义链和所述反义链。
22.权利要求21的双链分子，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是与选自SEQ ID NO：9，10，11和12的靶序列对应的核苷酸序列；[B]是由约3至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；且[A’]是与[A]互补的核苷酸序列。
23.一种载体，其包括包含有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中的任一或二者，其中所述有义链核酸包含与SEQ ID NO：9，10，11或12对应的核苷酸序列，且其中所述反义链包含与所述有义链互补的核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成所述双链分子，且其中所述载体在导入表达CDC45L基因或PIF1基因的细胞中时抑制所述基因的表达。
24.载体，它们包括包含有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中的任一者，其中所述有义链核酸包含与SEQ ID NO：9，10，11或12对应的核苷酸序列，且所述反义链核酸由与所述有义链互补的序列组成，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中所述载体在导入表达CDC45L基因或PIF1基因的细胞中时抑制细胞增殖。
25.权利要求23的载体，其中所述多核苷酸是长度为约19个～约25个核苷酸的寡核苷酸。
26.权利要求23或25的载体，其中所述双链分子是单一核苷酸转录物，其包含经单链核苷酸序列相连接的所述有义链和所述反义链。
27.权利要求26的载体，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是与选自SEQ ID NO：9，10，11和12的靶序列对应的核苷酸序列；[B]是由约3至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；且[A’]是与[A]互补的核苷酸序列。
28.一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的针对CDC45L基因或PIF1基因的双链分子或编码所述双链分子的载体，其中所述双链分子在导入表达CDC45L基因或PIF1基因的细胞中时抑制细胞增殖以及所述基因的表达。
29.权利要求28的方法，其中所述双链分子是权利要求19至22中任一项的双链分子。
30.权利要求28的方法，其中所述载体是权利要求23至27中任一项的载体。
31.一种用于治疗或预防癌症的组合物，其包含药学有效量的针对CDC45L或PIF1的双链分子或编码所述双链分子的载体及药学可接受载体，其中所述双链分子在导入表达CDC45L基因或PIF1基因的细胞中时抑制细胞增殖以及所述基因表达。
32.权利要求31的组合物，其中所述双链分子是权利要求19至22中任一项的双链分子。
33.权利要求31的组合物，其中所述载体是权利要求23至27中任一项的载体。
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