JP2012501168A - 腫瘍マーカー及び癌に対する治療標的としてのtbc1d7 - Google Patents
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Abstract
本発明は、癌、特に肺癌もしくは食道癌、又は発癌においてTBC1D7遺伝子によって果たされる役割に関し、癌、特に肺癌又は食道癌をTBC1D7遺伝子の1つ又は複数に対する二本鎖分子、又はそのような二本鎖分子を含む組成物、ベクターもしくは細胞を投与することによって治療及び/又は予防するための方法を特徴とする。本発明はまた、TBC1D7の中から選択された1つ又は複数の過剰発現遺伝子を用いた、肺の診断、又は肺癌、特にNSCLCもしくはSCLC又は食道癌を有する患者の予後の評価/判定のための方法も特徴とする。その目的のために、TBC1D7は肺癌又は食道癌に関する新規バイオマーカーとして役立つ可能性がある。また、肺癌又は食道癌におけるTBC1D7のうち1つ又は複数の過剰発現に及ぼすそれらの影響を指標として用いて、肺癌又は食道癌を治療又は予防するための化合物を同定する方法も開示する。
Description
優先権
本出願は、2008年8月28日に出願された、米国特許仮出願第61/190,522号の恩典を主張し、その内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2008年8月28日に出願された、米国特許仮出願第61/190,522号の恩典を主張し、その内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本発明は、肺癌、より詳細にはその診断及び治療に関する。
本発明は、肺癌、より詳細にはその診断及び治療に関する。
肺癌は世界で最も一般的な癌の1つであり、非小細胞肺癌(NSCLC)はそれらの症例の80%を占める(Greenlee RT et al. CA Cancer J Clin 2001;51: 15-36 (非特許文献1))。肺癌発生に関与する多くの遺伝子変化が報告されているが、正確な分子的機序は依然としてはっきりしていない(G. Eur J Cancer. 2001 Oct;37 Suppl 7:S63-73 (非特許文献2))。この20〜30年の間に、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン及びビノレルビンを含む、新たに開発された細胞傷害性薬剤が登場し、進行性NSCLCの患者に多数の治療上の選択肢をもたらしたが、それらのレジメンは、シスプラチンをベースとする治療法と比較して、限られた延命効果をもたらすに過ぎない(Schiller JH. et al. N Engl J Med 2002;346:92-8 (非特許文献3))。食道扁平上皮癌(ESCC)は消化管の最も致死性の高い悪性腫瘍の1つであり、肺癌の5年全生存率はわずか15%に過ぎない(Shimada H, et al., Surgery. 2003 May;133(5):486-94 (非特許文献4))。食道癌の最も高い発生率は、カスピ海東岸部から中国中央部に広がる「アジア食道癌ベルト(Asian esophageal cancer belt)」と呼ばれる地域で報告されている(Mosavi-Jarrahi A & Mohagheghi MA. Asian Pac J Cancer Prev. 2006 Jul-Sep;7(3):375-80 (非特許文献5))。肺癌及び食道癌の発症及び/又は進行に関与する多くの遺伝子変化が報告されているが、正確な分子的機序は依然としてはっきりしていない(Sozzi G. Eur J Cancer. 2001 Oct;37 Suppl 7:S63-73 (非特許文献2))。
これらの細胞傷害性薬剤に加えて、VEGFに対するモノクローナル抗体(すなわち、ベバシズマブ/抗VEGF)又はEGFRに対するモノクローナル抗体(すなわち、セツキシマブ/抗EGFR)、さらにはEGFRチロシンキナーゼの阻害薬(すなわち、ゲフィチニブ及びエルロチニブ)などのいくつかの分子標的薬も開発され、診療に適用されている(Thatcher N. et al. Lancet 2005;366:1527-37. (非特許文献6), Shepherd FA. et al. N Engl J Med 2005;353:123-32 (非特許文献7))。新たなレジメンのそれぞれは、限られた患者のサブセットに延命効果を与えることしかできない。このため、患者の大多数に適用可能であって毒性がより少ない、より有効な分子標的薬の開発といった新たな治療戦略が切望されている。
cDNAマイクロアレイを用いた数千種もの遺伝子の発現レベルのゲノムワイド解析は、新たな治療薬及び診断薬の開発のための優れた候補標的となる、発癌経路に関与する未知の分子を同定するための有効なアプローチである(Daigo Y and Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53 (非特許文献8))。本発明者らは、27,648種の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイ上でのレーザーマイクロダイセクションによって腫瘍細胞集団を精製した101例の肺癌症例及び19例のESCC症例のゲノムワイド発現プロファイル解析、ならびにそれらと31件の正常ヒト組織(27件の成人臓器及び4件の胎児臓器)の発現プロファイルデータとの比較により、肺癌の診断及び/又は治療のために有望な多数の分子標的を単離した(Kikuchi T. et al. Oncogene 2003;22:2192-205. (非特許文献9), Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99. (非特許文献10), Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43. (非特許文献11), Kikuchi T. et al. Int J Oncol v2006;28:799-805. (非特許文献12), Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75. (非特許文献13), Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84 (非特許文献14)。各々の遺伝子産物の生物学的及び臨床病理学的な意義を検証するために、本発明者らは、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ分析とRNA干渉(RNAi)手法との組み合わせによるスクリーニングシステムを確立した(Suzuki C. et al. Cancer Res 2003;63:7038-41. (非特許文献15), Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19. (非特許文献16), Mizukami Y. et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54. (非特許文献17), Suzuki C. et al. Cancer Res 2003;63:7038-41. (非特許文献18), Ishikawa N. et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70. (非特許文献19), Kato T. et al. Cancer Res 2005;65:5638-46. (非特許文献20), Furukawa C. et al. Cancer Res 2005;65:7102-10. (非特許文献21), Ishikawa N. et al. Cancer Res 2005;65:9176-84. (非特許文献22), Suzuki C. et al. Cancer Res 2005;65:11314-25. (非特許文献23), Ishikawa N. et al. Cancer Sci 2006;97:737-45. (非特許文献24), Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19. (非特許文献25), Hayama S. et al. Cancer Res 2006;66:10339-48. (非特許文献26), Kato T. et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42. (非特許文献27), Suzuki C. et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51. (非特許文献28), Yamabuki T. et al. Cancer Res 2007;67:2517-25. (非特許文献29), Hayama S. et al. Cancer Res 2007;67:4113-22. (非特許文献30), Kato T. et al. Cancer Res 2007;67:8544-53. (非特許文献31), Taniwaki M. et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31. (非特許文献32), Ishikawa N. et al. Cancer Res 2007;67:11601-11. (非特許文献33), Mano Y. et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13. (非特許文献34), Suda T. et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8. (非特許文献35), Kato T. et al. Clin Cancer Res Res 2008;14:2363-70. (非特許文献36), Mizukami Y. et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54 (非特許文献37))。これらの系統的な研究の過程で、TBC1ドメインファミリー、メンバー7(TBC1D7)が、肺癌及びESCCの大多数で過剰発現されていることが見いだされた。
ヒトTBC1D7は293アミノ酸からなり、およそ200個のアミノ酸残基で構成される推定TBCドメインを有する。TBCドメインは真核生物の間で保存されており、ヒトゲノムはこのドメインを有する少なくとも50種のタンパク質をコードすると予想されている(Richardson PM and Zon LI. Oncogene 1995;11: 1139-48. (非特許文献38), Bernards A. Biochim Biophys Acta. 2003;1603: 47-82 (非特許文献39))。TBCドメインはYpt/Rab様低分子量Gタンパク質に対するGTPアーゼ活性化の役割(GAP)を有すると考えられている(Bernards A. Biochim Biophys Acta. 2003;1603: 47-82 (非特許文献39), Neuwald AF. Trends Biochem Sci. 1997;22: 243-4 (非特許文献40))。GAPは、Gタンパク質についての本来は緩徐なGTPアーゼ活性を強化して、それらの不活性化を引き起こし、そうすることで各々のGタンパク質によって制御される細胞経路をモジュレートする。Ypt/RabファミリーのGTPアーゼには、サッカロミセス-セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)では11個の遺伝子が含まれ、ヒト遺伝子は少なくとも60個あり、Rasスーパーファミリーの最大の部門となっている(Bernards A. Biochim Biophys Acta. 2003-5805-3370;1603: 47-82 (非特許文献39))。これらのタンパク質は小胞輸送を含む細胞過程において決定的な役割を果たしており、小胞-標的膜認識、ドッキング及び膜融合において特に重要である(Chavrier P and Goud B. Curr Opin Cell Biol. 1999;11:466-75 (非特許文献41))。高等真核生物では、TBCドメインは、細胞周期及び発癌と関連のあるタンパク質(例えば、RN-TRE、TRE2、PRC17)中に存在する(Neuwald AF. Trends Biochem Sci. 1997;22:243-4 (非特許文献40), L. Pei. et al. Cancer Res. 2002;62:5420-24 (非特許文献42))。TBC1D7は、一次線毛形成においてコグネイトGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)としてRab17に対して作用する(Yoshimura S. et al. J Cell Biol. 2007;178: 363-9 (非特許文献43))。Rab17は細胞極性化の間に誘導されること、及び極性化上皮細胞におけるアピカルソーティングエンドソーム(apical sorting endosomes)の機能に関与することが以前に報告されている(Lutcke A. et al. J Cell Biol. 1993;121:553-64. (非特許文献44), Zacchi P. et al. J Cell Biol. 1998;140:1039-53 (非特許文献45))。
Greenlee RT et al. CA Cancer J Clin 2001; 51: 15-36
Sozzi G. Eur J Cancer 2001; 37 Suppl 7:S63-73
Schiller JH. et al. N Engl J Med 2002;346:92-8
Shimada H, et al., Surgery. 2003 May;133(5):486-94
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Suzuki C. et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51
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Hayama S. et al. Cancer Res 2007;67:4113-22
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Zacchi P. et al. J Cell Biol. 1998; 140:1039-53
ヒトの癌の診断、治療及び予防のための新規分子標的に関するスクリーニングの過程で、レーザーマイクロダイセクションと組み合わせて、101件の肺癌のゲノムワイド発現プロファイル解析を、27,648種の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイ上で行った(Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22(14):2192-205.;Kikuchi T, et al. Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805;Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1(7):485-99;Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13(24):3029-43. Epub 2004 Oct 20;Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29(3):567-75.)。その結果、TBC1ドメインファミリー、メンバー7(TBC1D7)をコードする遺伝子が、原発性肺癌の大多数において高い頻度で過剰発現していることが実証されている。
本発明は、腫瘍において一般的にアップレギュレートされる癌関連遺伝子TBC1D7、及びTBC1D7を用いた癌治療用の分子標的薬の開発のための戦略に関する。
1つの局面において、本発明は、癌、例えば、TBC1D7によって媒介される癌、例えば肺癌及び/又は食道癌を、TBC1D7の発現レベル又は生物活性を指標(index)として用いて診断するための方法を提供する。本発明はまた、患者における癌、例えば肺癌及び/又は食道癌の治療法の進展を、TBC1D7の発現レベル又は生物活性を指標として用いて予測するための方法も提供する。さらに、本発明は、癌、例えば肺癌及び/又は食道癌の患者の予後を、TBC1D7の発現レベル又は生物活性を指標として用いて予測するための方法も提供する。いくつかの態様において、癌はTBC1D7によって媒介又は促進される。いくつかの態様において、癌は肺癌及び/又は食道癌である。
もう1つの態様において、本発明は、癌、例えば、TBC1D7によって媒介される癌、例えば肺癌及び/又は食道癌を治療又は予防するための薬剤を、TBC1D7の発現レベル又は生物活性を指標として用いてスクリーニングするための方法を提供する。特に、本発明は、TBC1D7を発現する癌、例えば肺癌及び/又は食道癌を治療又は予防するための薬剤を、TBC1D7ポリペプチドと14-3-3ζ(zeta)ポリペプチドとの間、TBC1D7ポリペプチドとRAB17ポリペプチドとの間、又はTBC1D7ポリペプチドとTSC1ポリペプチドとの間の相互作用を指標として用いてスクリーニングするための方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によってスクリーニングされた、TBC1D7に対する二本鎖分子、例えばsiRNAを提供する。本発明の二本鎖分子は、癌、例えば、TBC1D7によって媒介されるか又はTBC1D7の過剰発現に起因する癌、例えば肺癌及び/又は食道癌を治療又は予防するために有用である。したがって、本発明はさらに、癌性細胞を、本発明の方法によってスクリーニングされた薬剤、例えばsiRNAと接触させる段階を含む、癌を治療するための方法に関する。
本発明のさまざまな局面及び応用例は、図面の簡単な説明、ならびにそれに続く本発明の詳細な説明及びその好ましい態様の考察により、当業者には明らかになるであろう。
図1は、肺癌及び食道癌におけるTBC1D7の発現を示している。A、半定量的RT-PCRによって調べた臨床肺癌及び食道癌の組織におけるTBC1D7の発現。B、肺癌及び食道癌の細胞株におけるTBC1D7の発現。C、ウエスタンブロット法によって調べた肺癌細胞株におけるTBC1D7タンパク質の発現。D、肺癌LC319細胞における内因性TBC1D7タンパク質の発現及び細胞内局在。E、16件の正常な成人ヒト組織におけるTBC1D7転写物のノーザンブロット分析。強いシグナルが精巣で観察された。F、5種の正常組織(心臓、肺、肝臓、腎臓及び精巣)及び肺癌のそれらの組織におけるTBC1D7タンパク質発現の免疫組織化学分析。TBC1D7は、精巣(主として一次精母細胞の核及び/又は細胞質)及び肺癌において大量に発現されたが、残りの4種の正常組織ではその発現はほとんど検出されなかった。
図2は、正常組織におけるTBC1D7の発現、及びNSCLC患者についてのTBC1D7過剰発現と予後不良との関連を示している。TBC1D7発現と予後不良との関連。上のパネル、癌組織におけるTBC1D7発現の陽性染色及び陰性染色の例(元の倍率は100倍)。下のパネル、NSCLCの患者の生存に関するカプラン・マイヤー分析(ログランク検定によりP=0.0124)。
図3は、TBC1D7の成長促進効果を示している。A、TBC1D7に対するsiRNAによる肺癌細胞株LC319(左)及びA549(右)の成長の阻害。上のパネル、RT-PCRによって分析した、2種類のsi-TBC1D7(si-TBC1D7-#1及びsi-TBC1D7-#2)及び2種の対照siRNA(si-EGFP及びsi-LUC)によるLC319細胞及びA549細胞におけるTBC1D7タンパク質発現の遺伝子ノックダウン作用。中央及び下のパネル、si-TBC1D7又は対照siRNAでトランスフェクトしたLC319細胞及びA549細胞のコロニー形成アッセイ及びMTTアッセイ。カラム、3回の反復アッセイの相対的吸光度;バー、SD。B、si-TBC1D7で処理したNSCLC細胞のフローサイトメトリー分析。LC319細胞をsi-TBC1D7-#1又はsi-EGFPでトランスフェクトし、トランスフェクションから48、72及び96時間後にフローサイトメトリーのために収集した。C、TBC1D7の過剰発現による哺乳動物細胞の成長の促進。TBC1D7を安定的に発現するCOS-7細胞の成長性を示しているアッセイ。TBC1D7を安定的に発現するCOS-7細胞の成長を、モックベクターでトランスフェクトした対照細胞と比較したMTTアッセイ。D、TBC1D7過剰発現による哺乳動物細胞の浸潤の促進。TBC1D7を安定的に発現するCOS-7細胞の浸潤性を示しているアッセイ。TBC1D7を安定的に発現する浸潤COS-7細胞の数は、対照細胞のそれに比較して増加した。E、TBC1D7過剰発現によって引き起こされたCOS-7細胞のインビボ腫瘍形成。COS-7-TBC1D7#A細胞を個別に移植した4匹のマウスはすべて、TBC1D7タンパク質の過剰発現が免疫組織化学分析によって確認された腫瘍を有していた。対照的に、COS-7-Mock-#A細胞を移植された4匹の無関係なマウスでは、60日間の観察の間に視認しうる腫瘍は形成されなかった。F、細胞移植から60日後の移植された腫瘍におけるTBC1D7発現の免疫組織化学的評価(元の倍率は40倍及び200倍)。
図4は、TBC1D7と結合タンパク質との相互作用を示している。A、COS-7細胞における外因性TBC1D7と内因性14-3-3ζタンパク質との相互作用。抗flag M2アガロース、及びflag-TBC1D7を一過性に発現するCOS-7細胞からの抽出物を用いて免疫沈降法を実施した。免疫沈降物を、内因性14-3-3を検出するためのウエスタンブロット分析に供した。B、COS-7細胞における外因性TBC1D7と外因性RAB17タンパク質との相互作用。抗flag M2アガロース、ならびにflag-TBC1D7及び/又はMyc-RAB17を一過性に発現するCOS-7細胞からの抽出物を用いて免疫沈降法を実施した。免疫沈降物を、外因性RAB17を検出するためのにウエスタンブロット分析に供した。IB、免疫ブロット法;IP、免疫沈降法。C、肺癌細胞におけるTSC1及びTBC1D7の発現。上のパネル、半定量的RT-PCRによって調べた肺癌細胞株におけるTSC1及びTBC1D7の発現。下のパネル、ウエスタンブロット法によって調べた肺癌細胞株におけるTSC1及びTBC1D7タンパク質の発現。D、E及びF、TBC1D7タンパク質を安定化するTBC1D7相互作用性タンパク質TSC1の同定、ならびにTBC1D7及びTSC1の同時発現による哺乳動物細胞における成長活性の促進。D、肺癌細胞における内因性TBC1D7と内因性TSC1タンパク質との相互作用。抗TSC1抗体、ならびにTBC1D7及びTSC1の両方を発現するLC319細胞からの抽出物を用いて免疫沈降法を実施した。免疫沈降物を、内因性TBC1D7を検出するためのウエスタンブロット分析に供した。IB、免疫ブロット法;IP、免疫沈降法。E、TBC1D7遺伝子及びタンパク質のレベルに対するTSC1発現の影響。左のパネル、si-TSC1でトランスフェクトしたLC319細胞における半定量的RT-PCR分析及びウエスタンブロット分析によって検出した、TSC1及びTBC1D7の転写物及びタンパク質のレベル。右のパネル、半定量的RT-PCR分析及びウエスタンブロット分析によって検出した、TSC1発現ベクターでトランスフェクトしたLC319細胞におけるTSC1及びTBC1D7の転写物及びタンパク質のレベル。F、最初にsi-TSC1でトランスフェクトし、引き続いてsiRNAトランスフェクションから24時間後にTSC1発現ベクターでトランスフェクトしたLC319細胞における、ウエスタンブロット分析によって検出した内因性TSC1及びTBC1D7タンパク質のレベル。TSC1に対するsiRNAのトランスフェクションによって引き起こされたTBC1D7タンパク質レベルの低下は、外因性TSC1の追加的な過剰発現によって補償された。
図5は、TBC1D7におけるTSC1相互作用性領域の同定、及びTBC1D7のドミナントネガティブペプチドによる肺癌細胞の成長の阻害を示している。A、左のパネル、末端領域の一方又は両方を欠く、6種のN末端Flagタグ付加TBC1D7部分的タンパク質構築物の模式図。右のパネル、LC319細胞を用いた免疫沈降実験による、TSC1と結合するTBC1D7中の領域の同定。TBCドメイン内の中心領域に対応するTBC1D7112-171構築物がTSC1相互作用性領域であることが示された。B、左上のパネル、TBC1D7112-171を範囲に含む、TBC1D7中のTSC1相互作用性領域に対応する3種のTBC1D7の細胞透過性ペプチドの模式図。B、右上のパネル、11R-TBC152-171ペプチドで処理したLC319細胞における免疫沈降アッセイによって検出した、内因性TSC1と内因性TBC1D7タンパク質との間の複合体形成の低下。C、TBC1D7タンパク質及びTSC1タンパク質の両方を発現するLC319細胞に導入した11R-TBC152-171ペプチドの成長抑制効果を示しているMTTアッセイ。バー、3回の反復アッセイのSD。D、左のパネル、ウエスタンブロット分析によって調べた、肺癌細胞株LC319及び正常ヒト肺線維芽細胞由来のCCD19Lu細胞におけるTBC1D7タンパク質及びTSC1タンパク質の発現。右のパネル、TBC1D7タンパク質をほとんど発現しないCCD19Lu細胞での11R-TBC152-171ペプチドのオフターゲット(off-target)効果が起こらないことを示しているMTTアッセイ。
図6は、肺癌LC319細胞におけるmTORC1経路に対するTSC1発現の影響を示している。TBC1D7タンパク質のレベル、ならびにmTORC1の下流分子であるリボソームタンパク質S6(rpS6)のリン酸化のレベルに対するTSC1過剰発現(左のパネル)及びTSC1ノックダウン(右のパネル)の影響。
単語「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、本明細書中で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも1つの」を意味する。
物質(例えばポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等)に対して使用される「単離(isolated)」及び「精製(purified)」という用語は、物質が、天然源に包含され得る少なくとも1つの物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離又は精製抗体は、細胞材料、例えば炭水化物、脂質若しくは細胞由来の他の夾雑タンパク質又はタンパク質(抗体)の由来となる組織源を実質的に含まないか、又は化学合成の際の化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない抗体を表す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドの調製を含み、このポリペプチドは、該ポリペプチドが細胞から単離又は組換え生成される細胞の細胞成分から分離される。
したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、異種タンパク質(本明細書で「夾雑タンパク質」とも称される)を約30%、20%、10%、又は5%(乾燥重量)未満しか有しないポリペプチド調製物を含む。ポリペプチドが組換え生成されると、幾つかの実施形態では、培養培地も実質的に含まず、これにはタンパク質調製物の体積の約20%、10%、又は5%未満の培養培地しか有しないポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって生成されると、幾つかの実施形態では、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まず、これにはタンパク質調製物の体積の約30%、20%、10%、5%(乾燥重量)未満のタンパク質の合成に関与する化学前駆体又は他の化学物質を有するポリペプチド調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が単離又は精製ポリペプチドを含有することは例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の単一バンドの出現と、ゲルのクマシーブリリアントブルー染色等によって示され得る。一実施形態では、本発明の抗体を含むタンパク質が単離又は精製される。
「単離」又は「精製」核酸分子、例えばcDNA分子は、組換え技法によって生成される場合、他の細胞材料若しくは培養培地を実質的に含まない可能性があるか、又は化学合成する場合、化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。一実施形態では、本発明のタンパク質をコードする核酸分子が単離又は精製される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は本明細書中でアミノ酸残基の重合体を指すのに互換可能に使用される。該用語は天然アミノ酸重合体に加えて、1つ又は複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、又は対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣体(chemical mimetic)のように天然に存在しない残基であるアミノ酸重合体にも適用される。
「アミノ酸」という用語は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を表す。天然アミノ酸は、遺伝子コードでコードされるもの、並びに細胞における翻訳後に修飾されるもの(例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びO−ホスホセリン)である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造(水素、カルボキシ基、アミノ基及びR基と結合したα炭素)を有するが、修飾R基又は修飾骨格(例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチルメチオニンスルホニウム)を有する化合物を表す。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、一般的なアミノ酸と同様に機能する化学物質を表す。
本明細書では、アミノ酸は一般的に知られる3文字記号、又はIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionで推奨される1文字記号で表すことができる。特に指定のない限り、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」という用語は本明細書中で互換可能に使用され、一般的に許容される1文字コードで表されるアミノ酸と同様のものである。アミノ酸と同様に、これらの用語は、天然及び非天然の核酸ポリマーの両方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸又は核酸分子はDNA、RNA又はそれらの組合せから成り得る。
本明細書中で使用される場合、「生物試料」という用語は生物体全体又はその組織、細胞又は構成部分(例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血(amniotic cord blood)、尿、膣液、及び精液を含む(これらに限定されない)体液)のサブセットを指す。「生物試料」はさらに、生物体全体又はその細胞、組織又は構成部分のサブセット、又はその画分若しくは一部分から調製されるホモジネート、可溶化物、抽出物、細胞培養物、又は組織培養物を指す。最後に、「生物試料」は、タンパク質又はポリヌクレオチド等の細胞成分を含有する、生物を繁殖させたニュートリエントブロス又はゲル等の培地を指す。
ヒトTBC1D7遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号1に示し、またGenBankアクセッション番号NM_016495としても利用可能である。本明細書で、「TBC1D7遺伝子」という語句は、ヒトTBC1D7遺伝子と、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシを含む(がこれらに限定されない)他の動物のTBC1D7遺伝子とを包含し、対立遺伝子突然変異体と、TBC1D7遺伝子に対応するものとして他の動物で見出された遺伝子とを含む。ヒトTBC1D7遺伝子でコードされたアミノ酸配列は配列番号2として示し、またGenBankアクセッション番号NP_057579.1としても利用可能である。本発明では、TBC1D7遺伝子でコードされたポリペプチドは、「TBC1D7」とも称され、「TBC1D7ポリペプチド」又は「TBC1D7タンパク質」と称されることもある。
本発明の一態様によれば、機能的等価物もTBC1D7に含まれる。本明細書では、タンパク質の「機能的等価物」は、タンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。即ち、TBC1D7の少なくとも1つの生物活性を保持する任意のポリペプチドを、このような本発明の機能的等価物として使用することができる。例えば、TBC1D7の機能的等価物は、細胞増殖の促進活性及び浸潤活性を保持する。さらに、TBC1D7の生物活性は、RAB17(GenBankアクセッション番号: NM_022449.2、配列番号12)、14-3-3ζ(GenBankアクセッション番号:NM_003406、配列番号14)又は、TSC1(GenBankアクセッション番号:NM_001143964.1、配列番号45)に対する結合活性を含有する。TBC1D7の機能的等価物は、RAB17結合領域、14-3-3ζ結合領域、及び/又はTSC1結合領域(例えば、TBC152-171:配列番号28)を含有し得る。
TBC1D7の機能的等価物としては、TBC1D7タンパク質の天然アミノ酸配列に、1つ又は複数のアミノ酸、例えば1個〜5個のアミノ酸(例えば最大5%のアミノ酸)が置換、欠失、付加又は挿入されるものが挙げられる。代替的に、機能的等価物は、そのタンパク質の配列に対して少なくとも約80%相同性(又は配列同一性としても参照される)を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得、より好ましくは、配列番号:2に対して、少なくとも約90%から95%相同性を有し、多くの場合、約96%、97%、98%、又は99%相同性を有する。
概して、タンパク質において1つ又は複数のアミノ酸の修飾は、タンパク質の機能に影響を与えないことが知られている(Mark DF, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Sep;81(18):5662-6、Zoller MJ & Smith M. Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-500、Wang A, et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-3、Dalbadie-McFarland G, et.al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Nov;79(21):6409-13)。当業者は、単一アミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を改変する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入又は置換は、タンパク質の改変によって同様の機能を有するタンパク質が生じる「保存的修飾」であることを認識している。
アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸(アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、バリン)、親水性アミノ酸(アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、セリン、スレオニン)、及び共通して以下の官能基又は特徴を有する側鎖:脂肪族側鎖(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン(praline));側鎖(セリン、スレオニン、チロシン)を含有するヒドロキシル基;側鎖(C、M)を含有する硫黄原子;側鎖(アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン)を含有するカルボン酸及びアミド;側鎖(アルギニン、リシン、ヒスチジン)を含有する塩基;及び側鎖(ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン)を含有する芳香族基である。さらに、機能的に同様のアミノ酸を規定する保存的置換表は当該技術分野で既知である。例えば、以下の8つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する:
(1)アラニン(A)、グリシン(G);
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
(7)セリン(S)、スレオニン(T);及び
(8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Thomas E. Creighton, Proteins Publisher: New York: W.H. Freeman, c1984を参照されたい)。
(1)アラニン(A)、グリシン(G);
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
(7)セリン(S)、スレオニン(T);及び
(8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Thomas E. Creighton, Proteins Publisher: New York: W.H. Freeman, c1984を参照されたい)。
このように保存的に修飾されたポリペプチドがTBC1D7タンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、TBC1D7タンパク質は、TBC1D7タンパク質の生物活性のいずれか1つを保持していれば非保存的修飾を含む。このような修飾タンパク質で突然変異するアミノ酸の数は概して、10アミノ酸以下、例えば6アミノ酸以下、例えば3アミノ酸以下である。
1つ又は複数のアミノ酸残基の付加によって修飾されたタンパク質の例は、TBC1D7タンパク質の融合タンパク質である。融合タンパク質には、TBC1D7タンパク質と、他のペプチド又はタンパク質との融合体が含まれ、これは本発明にも使用することができる。当業者にとって既知の技法、例えばフレームが一致するように、TBC1D7遺伝子をコードするDNAを、他のペプチド又はタンパク質をコードするDNAと連結させ、融合DNAを発現ベクターに挿入し、それを宿主で発現させることによって融合タンパク質を作製することができる。得られた融合タンパク質がTBC1D7タンパク質の対象となる生物活性のいずれか1つを保持していれば、TBC1D7タンパク質に融合するペプチド又はタンパク質には制限がない。
TBC1D7タンパク質に融合するペプチドとして使用することができる既知のペプチドとしては例えば、FLAG(Hopp TP, et al., Biotechnology 6: 1204-10(1988))、6つのHis(ヒスチジン)残基を含有する6×His、10×His、インフルエンザアグルチニン(HA)、ヒトc−myc断片、VSP−GP断片、p18HIV断片、T7−タグ、HSV−タグ、E−タグ、SV40T抗原断片、lckタグ、αチューブリン断片、B−タグ、プロテインC断片等が挙げられる。本発明のタンパク質に融合することができるタンパク質の例としては、GST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)、インフルエンザ凝集素(HA)、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP(マルトース結合タンパク質)等が挙げられる。
さらに、修飾タンパク質には、多型変異体、種間相同体、これらのタンパク質の対立遺伝子でコードされるものは除外されない。
機能的に同等なタンパク質を単離する、当該技術分野で既知の方法としては例えば、ハイブリダイゼーション技法(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)が挙げられる。当業者は、ヒトTBC1D7タンパク質をコードするヒトTBC1D7 DNA配列(例えば配列番号1)の全体又は一部と高い相同性(即ち配列同一性)があるDNAを容易に単離することができ、また単離DNAからヒトTBC1D7タンパク質に対して機能的に同等なタンパク質を単離することができる。したがって、本発明に使用されるタンパク質は、ヒトTBC1D7タンパク質をコードするDNA配列の全体又は一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでコードされるものを含み、ヒトTBC1D7タンパク質と機能的に同等である。これらのタンパク質としては、ヒト又はマウス由来のタンパク質(例えば、サル、ラット、ウサギ又はウシの遺伝子でコードされるタンパク質)に対応する哺乳動物相同体が挙げられる。単離の際には、肺癌若しくは食道癌の組織若しくは細胞株、又は精巣の組織由来のヒトTBC1D7遺伝子をコードするDNAに高い相同性があるcDNAを使用することができる。
ヒトTBC1D7遺伝子と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、当業者によって定常的に選択され得る。「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、核酸分子が、典型的に核酸の混成物において、その標的配列とハイブリダイズする(が他の配列とは検出可能なハイブリダイズはしない)条件を表す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況下で異なる。配列が長くなれば、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)に見られる。概して、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、pHで特定の配列のために、熱融解点(Tm)より約5℃〜10℃低く選択される。Tmは、(規定のイオン強度、pH及び核酸濃度で)標的に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在するので、Tmで、プローブの50%が平衡状態で占められる)。ストリンジェントな条件は、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも2倍、例えばバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。
例えば、ハイブリダイゼーションは、「Rapid−hyb緩衝液」(Amersham LIFE SCIENCE)を用いて、68℃で、30分以上、前ハイブリダイゼーションを行ない、標識プローブを添加して、68℃で1時間以上温めることによって実施することができる。以下の洗浄工程は、例えば低いストリンジェント条件で実施することができる。低いストリンジェント条件は例えば、42℃、2×SSC、0.1% SDS、例えば50℃、2×SSC、0.1% SDSである。幾つかの実施形態では、高いストリンジェント条件を用いる。高いストリンジェント条件は例えば、室温で20分間、2×SSC、0.01% SDSにおける3回の洗浄、その後の37℃で20分間、1×SSC、0.1% SDSにおける3回の洗浄、及び50℃で20分間、1×SSC、0.1% SDSにおける2回の洗浄である。しかしながら、幾つかの因子、例えば温度及び塩濃度は、ハイブリダイゼーションの緊縮度(stringency)に影響を与える可能性があり、当業者は、必要な緊縮度を達成するために因子を好適に選択することができる。
ヒトTBC1D7タンパク質(配列番号2)をコードするDNA(配列番号1)の配列情報に基づき合成されたプライマーを用いて、ヒトTBC1D7遺伝子と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離するために、ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を利用することができる。プライマー配列の例は、実施例1における(b)半定量RT−PCRで示す。
上記のハイブリダイゼーション技法又は遺伝子増幅技法によって単離したDNAでコードされるヒトTBC1D7タンパク質と機能的に同等なタンパク質は通常、ヒトTBC1D7タンパク質のアミノ酸配列に対して高い相同性(配列同一性とも称される)を有する。「高い相同性」(「高い配列同一性」とも称される)は典型的に、2つの最適にアラインメントした配列(ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列のいずれか)間の同一性の程度を表す。典型的に、高い相同性又は配列同一性は、40%以上、例えば60%以上、例えば80%以上、例えば85%、90%、95%、98%、99%又はそれ以上の相同性を表す。2つのポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列との間の相同性又は同一性の程度は、アルゴリズムに従って求めることができる(Wilbur WJ & Lipman DJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Feb; 80(3):726-30)。
配列同一性及び配列相同性の割合を求めるのに好適なアルゴリズムの付加的な例はBLAST及びBLAST2.0アルゴリズムであり、これには以下で記載がある(Altschul SF, et al., J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10、Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1 ;25(17):3389-402)。BLAST解析を実施するソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)で公的に利用可能である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。アルゴリズムは、クエリ(query)配列におけるショートワード(short words:短いワード)(データベース配列において同じ長さのワードとアラインメントすると、幾つかの正の値の閾値スコアTに一致するか又はこれを満たす)の長さWを同定することによって、値が高い配列対(HSP)を初めに同定することを伴う。Tは近傍ワードのスコア閾値として表される(Altschul et al、同上)。これらの初期近傍ワードヒット(word hit)は、それらを含有するより長いHSPを見つけるために、検索を開始する足掛かり(seed:シード)として作用する。
それから、ワードヒットは、累積アラインメントスコア(cumulative alignment score)が増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。パラメータM(マッチ残基対に対するリワード(reward)スコア、常に0より大きい)とパラメータN(ミスマッチ残基に対するペナルティスコア、常に0未満)をヌクレオチド配列に用いて累積スコアをを算出する。アミノ酸配列では、累積スコアを算出するために、スコアリングマトリクスを用いる。累積アラインメントスコアが、最大到達値から量Xだけ低下するか、1つ又は複数の負のスコアの残基アラインメントの集積のために累積スコアが0以下になるか、又はいずれかの配列の末端に達すると、各方向でのワードヒットの延長が停止する。
BLASTアルゴリズムパラメータW、T及びXはアラインメントの感度及び速度を求める。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列では)は、ワードサイズ(W)が28、期待値(E)が10、M=1、N=−2及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列では、BLASTPプログラムは、ワードサイズ(W)が3、期待値(E)が10及びBLOSUM62スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する(Henikoff S & Henikoff JG. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15;89(22):10915-9)。
本発明に関して有用なタンパク質は、生成に使用する細胞若しくは宿主、又は利用する精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無又は形態を変えることができる。それにもかかわらず、タンパク質がTBC1D7タンパク質(配列番号2)の生物活性のいずれか1つを有していれば、そのタンパク質は本発明において有用である。
本発明は、TBC1D7タンパク質の部分ペプチドの使用も包含する。部分ペプチドは、TBC1D7タンパク質のタンパク質に特異的なアミノ酸配列を有し、約400アミノ酸未満、通常約200アミノ酸未満及び多くは約100アミノ酸未満で、少なくとも約7アミノ酸、例えば約8アミノ酸以上、例えば約9アミノ酸以上から成る。
好適には、本発明のスクリーニングに使用する部分ペプチドは少なくとも、TBC1D7の結合ドメインを含有する。さらに、好適には、本発明のスクリーニングに使用する部分TBC1D7ペプチドは、14-3-3ζ結合領域、RAB17結合領域を含有する。かかる部分ペプチドは、TBC1D7タンパク質の「機能的等価物」という語句によっても包含される。
本方法に使用するポリペプチド又は断片は、選択アミノ酸配列に基づき、従来の精製法によって又は化学合成を通じて自然界から天然タンパク質として得ることができる。例えば、合成に利用することができる従来のペプチド合成法としては、
(1)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966、
(2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976、
(3)ペプチド合成(日本語版)、丸善株式会社、1975、
(4)ペプチド合成の基礎と実験(日本語版)、丸善株式会社、1985、
(5)続医薬品の開発(日本語版)、第14巻(ペプチド合成)、株式会社廣川書店、1991、
(6)国際公開第99/67288号パンフレット、及び
(7)Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118
が挙げられる。
(1)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966、
(2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976、
(3)ペプチド合成(日本語版)、丸善株式会社、1975、
(4)ペプチド合成の基礎と実験(日本語版)、丸善株式会社、1985、
(5)続医薬品の開発(日本語版)、第14巻(ペプチド合成)、株式会社廣川書店、1991、
(6)国際公開第99/67288号パンフレット、及び
(7)Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118
が挙げられる。
代替的に、タンパク質は、ポリペプチドを生成する任意の既知の遺伝子組換え法を利用して得ることができる(例えばMorrison DA., et al., J Bacteriol. 1977 Oct;132(1):349-51、Clark-Curtiss JE & Curtiss R 3rd. Methods Enzymol. 1983;101:347-62)。例えば、発現形態で対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む好適なベクター(例えばプロモーターを含む下流の調節配列)を調製し、好適な宿主細胞に形質転換した後、宿主細胞を培養してタンパク質を生成した。より具体的には、TBC1D7ポリペプチドをコードする遺伝子は、外来遺伝子、例えばpSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS、又はpCD8を発現するために、遺伝子をベクターに挿入することによって、宿主(例えば動物)細胞等で発現する。
プロモーターを発現に使用することができる。例えば、SV40初期プロモーター(Rigby in Williamson(ed.) Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141)、EF−αプロモーター(Kim DW, et al. Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23)、CAGプロモーター(Niwa H, et al., Gene. 1991 Dec 15;108(2):193-9)、RSV LTRプロモーター(Cullen BR. Methods Enzymol. 1987; 152:684-704)、SRαプロモーター(Takebe Y, et al., Mol Cell Biol. 1988 Jan; 8(1):466-72)、CMV前初期プロモーター(Seed B & Aruffo A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May;84(10):3365-9)、SV40後期プロモーター(Gheysen D & Fiers W. J Mol Appl Genet. 1982; 1(5):385-94)、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman RJ, et al., Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3):946-58)、HSV TKプロモーター等を含む、一般的に使用される任意のプロモーターを用いることができる。
TBC1D7遺伝子を発現するために、任意の方法、例えば電気穿孔法(Chu G, et al., Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11;15(3): 1311-26)、リン酸カルシウム法(Chen C & Okayama H. Mol Cell Biol. 1987 Aug;7(8):2745-52)、DEAEデキストラン法(Lopata MA, et al., Nucleic Acids Res. 1984 Jul 25;12(14):5707-17、Sussman DJ & Milman G. Mol Cell Biol. 1984 Aug;4(8): 1641-3)、リポフェクチン法(Derijard B, et al., Cell. 1994 Mar 25;76(6):1025-37、Lamb BT, et al., Nat Genet. 1993 Sep;5(1):22-30、Rabindran SK, et al., Science. 1993 Jan 8;259(5092):230-4)等に従って、ベクターの宿主細胞への導入を実施することができる。
TBC1D7タンパク質は、インビトロ利用(adopting)系とインビトロ翻訳系とで生成することもできる。本発明に関して、「TBC1D7遺伝子」という語句は、ヒトTBC1D7タンパク質、又はヒトTBC1D7タンパク質の機能的等価物のいずれかをコードするポリヌクレオチドを包含する。
TBC1D7遺伝子は、選択ヌクレオチド配列に基づき、従来のクローニング法によって又は化学合成を通じて自然界から天然タンパク質として得ることができる。cDNAライブラリ等を用いて遺伝子をクローニングする方法は当該技術分野で既知である。
(2)抗体
「抗体」という用語は本明細書中で使用される場合、指定のタンパク質又はそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリン及びその断片を含むことが意図される。抗体はヒト抗体、霊長類化(primatized)抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質、又は放射性標識と融合させた抗体、及び抗体断片を含み得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷抗体から形成される多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は全てのクラス(例えばIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM)を示す。
「抗体」という用語は本明細書中で使用される場合、指定のタンパク質又はそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリン及びその断片を含むことが意図される。抗体はヒト抗体、霊長類化(primatized)抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質、又は放射性標識と融合させた抗体、及び抗体断片を含み得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷抗体から形成される多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は全てのクラス(例えばIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM)を示す。
本発明は、TBC1D7タンパク質に対する抗体を用いる。これらの抗体は、肺癌又は食道癌を診断するのに有用であり得る。さらに、本発明には、TBC1D7ポリペプチドに対する抗体又はそれらの部分ペプチドに対する抗体、特にTBC1D7ポリペプチドのRAB17結合領域、TBC1D7ポリペプチドの14-3-3ζ結合領域又は、TBC1D7ポリペプチドのTSC1結合領域(例えば、配列番号28)に対する抗体を用いる。
これらの抗体は、TBC1D7ポリペプチドとRAB17ポリペプチドとの間の相互作用(例えば結合)、TBC1D7ポリペプチドと14-3-3ζポリペプチドとの間の相互作用(例えば結合)又は、TBC1D7ポリペプチドとTSC1ポリペプチドとの間の相互作用(例えば結合)を阻害及び/又は阻止するのに有用であり得ると共に、TBC1D7を(過剰)発現する癌、例えば肺癌又は食道癌を治療及び/又は予防するのに有用であり得る。代替的に、RAB17ポリペプチド、14-3-3ζポリペプチドもしくはTSC1ポリペプチド又はこれらの部分ペプチド、例えばこれらのTBC1D7結合領域(配列番号28等)に対する抗体も用いられる。これらの抗体は既知の方法によって与えられる。本発明に従って用いられる抗体を生成する例示的な技法が記載されている。
(i)ポリクローナル抗体:
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射により生じさせるのが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する共役)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOC12、又はR’N=C=NR(式中、R及びRは異なるアルキル基である)を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射により生じさせるのが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する共役)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOC12、又はR’N=C=NR(式中、R及びRは異なるアルキル基である)を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
例えば100μg又は5μgのタンパク質又は複合体(それぞれウサギ又はマウスの場合)を3倍量の完全フロインドアジュバントと合わせ、この溶液を複数の部位で皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性のある複合体、又は誘導体に対して免疫化する。1ヵ月後、ペプチド又は複合体の初期量の1/5〜1/10量を完全フロインドアジュバントに加え、複数の部位で皮下注射することにより動物を追加免疫する。7日〜14日後、動物から採血し、血清を抗体力価について検定する。力価が平衡に達するまで動物を追加免疫する。同じ抗原の異なるタンパク質を共役させた複合体及び/又は異なる架橋試薬による複合体で動物を追加免疫するのが好ましい。
複合体は、融合タンパク質(protein fusion)として、組換え細胞培養物においても作製することができる。また、ミョウバン等の凝集剤が、免疫反応を増強するのに適切に使用される。
(ii)モノクローナル抗体:
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団内に含有される個々の抗体が、起こり得る自然発生突然変異(若干存在し得る)以外は同一である集団から得ることができる。したがって、「モノクローナル」という修飾詞は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を意味する。
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団内に含有される個々の抗体が、起こり得る自然発生突然変異(若干存在し得る)以外は同一である集団から得ることができる。したがって、「モノクローナル」という修飾詞は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を意味する。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler G & Milstein C. Nature. 1975 Aug 7; 256 (5517):495-7に初めて記載されたハイブリドーマ法を用いて作成され得るか、又は組み換えDNA法により作成され得る(米国特許第4,816,567号明細書)。
ハイブリドーマ法においては、マウス又は他の適当な宿主動物(ハムスター等)を以上に記載されるように免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、又は産生することが可能なリンパ球を誘導する。代替的には、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。リンパ球を次に、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
このように調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する1つ又は複数の物質を含有する、適切な培養培地に播種して成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は典型的には、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む(HAT培地)。
幾つかの実施形態において、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、また培地、例えばHAT培地に対して感受性がある。例示的な骨髄腫細胞株としては、マウス骨髄腫細胞株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なMOPC−21及びMPC−11マウス腫瘍及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas, Virginia, USA)から入手可能なSP−2又はX63−Ag8−653細胞由来のものが挙げられる。 ヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている(Kozbor D, et al., J Immunol. 1984 Dec;133(6):3001-5、Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が成長している細胞培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関して検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又はラジオイムノアッセイ(RIA)若しくは酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合アッセイによって求められる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson PJ & Rodbard D. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39のスキャッチャード解析によって決定することができる。所望の特異性、親和性、及び/又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))によって成長させてもよい。この目的に適した培養培地には、例えばD−MEM培地又はRPML−1640培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍として、インビボで成長させてもよい。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインAセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等によって培養培地、腹水、又は血清から適切に分離することができる。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて)容易に単離及び配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、かかるDNAの好ましい供給源となる。DNAを単離した後、発現ベクターに入れ、それを次に宿主細胞(免疫グロブリンタンパク質を本来産生しない、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞等)にトランスフェクトすることにより、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするDNAの細菌における組み換え発現に関する総説としては、Skerra A. Curr Opin Immunol. 1993 Apr; 5 (2):256-62 及びand Pluckthun A. Immunol Rev. 1992 Dec;130:151-88が挙げられる。
TBC1D7タンパク質に対して反応性を有する特異的抗体又は抗体断片を作り出す別の方法は、TBC1D7タンパク質又はペプチドによって細菌において発現される、免疫グロブリン遺伝子又はその一部分をコードする発現ライブラリをスクリーニングすることである。例えば、完全Fab断片、VH領域、及びFv領域を、細菌においてファージ発現ライブラリを用いて発現させることができる。例えば、Ward ES, et al., Nature. 1989 Oct 12; 341(6242): 544-6、Huse WD et al., Science 1989 Dec 8; 246(4935): 1275-81、及びMcCafferty J et al., Nature. 1990 Dec 6; 348(6301): 552-4を参照されたい。かかるライブラリをTBC1D7タンパク質、例えばTBC1D7ペプチドを用いてスクリーニングすることにより、TBC1D7タンパク質と反応する免疫グロブリン断片を同定することができる。代替的には、抗体又はその断片を生成するためにSCID−huマウス(Genpharmから入手可能)を使用することができる。
さらなる実施形態においては、抗体又は抗体断片を、McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4に記載されている技法を用いて作り出される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8;及びMarks JD, et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991) J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97はそれぞれ、ファージライブラリを用いたマウス抗体及びヒト抗体の単離について記載している。その後の刊行物には、鎖シャッフリング(chain shuffling)による高親和性(nM範囲)ヒト抗体の生成(Marks JD, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Jul;10(7):779-83)、並びに非常に大きいファージライブラリを構築する戦略として、組合せ感染(combinatorial infection)及びインビボ組換え(Waterhouse P, et al., Nucleic Acids Res. 1993 May 11;21(9):2265-6)が記載されている。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替手段である。
また、例えば、コード配列を相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインで置換すること(米国特許第4,816,567号明細書、Morrison SL, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Nov;81(21):6851-5))、又は非免疫グロブリンポリペプチドに関するコード配列の全部又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、DNAを修飾してもよい。
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインを置換するか、又は抗体の一抗原結合部位の可変ドメインを置換することによって、第1の抗原に対して特異性を有する1つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作成する。
(iii)ヒト化抗体:
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、ヒト以外の供給源に由来する1つ又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入(import)」残基と称されることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者らの方法((Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5; Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7; Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6))に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行なうことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインよりかなり小さな部分が、ヒト以外の種の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号明細書)である。実際には、ヒト化抗体は典型的に、幾つかの超可変領域残基、及び場合によっては幾つかのFR残基が、齧歯動物抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、ヒト以外の供給源に由来する1つ又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入(import)」残基と称されることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者らの方法((Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5; Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7; Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6))に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行なうことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインよりかなり小さな部分が、ヒト以外の種の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号明細書)である。実際には、ヒト化抗体は典型的に、幾つかの超可変領域残基、及び場合によっては幾つかのFR残基が、齧歯動物抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
抗原性を低下させるためには、ヒト化抗体の作成に使用するヒト可変ドメイン(軽鎖及び重鎖の両方)の選択が非常に重要である。いわゆる「最良適合(best-fit)」法によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次に、齧歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体に関するヒトフレームワーク領域(FR)とする(Sims MJ et al., J Immunol. 1993 Aug 15;151(4):2296-308、Chothia et al., J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。幾つかの異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用してもよい(Carter P, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9; Presta LG, et al., J Immunol. 1993 Sep 1;151(5):2623-32)。
ヒト化される抗体は、抗原に対する高い親和性、及び他の好適な生物学的特性を保持していることがさらに重要である。この目標を達成するには、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて分析するプロセスによって調製され得る。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の、考え得る三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する増大した親和性等の所望の抗体特徴が達成されるように、受容(recipient)配列及び移入配列からFR残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は抗原結合の影響に直接的且つ最も実質的に関与する。
(iv)ヒト抗体:
ヒト化の代替手段として、ヒト抗体を作り出すことができる。例えば、免疫化の際に内因性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を引き起こす。例えば、Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5、 Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8、 Bruggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40;並びに米国特許第5,591,669号明細書、同第5,589,369号明細書、及び同第5,545,807号明細書を参照されたい。
ヒト化の代替手段として、ヒト抗体を作り出すことができる。例えば、免疫化の際に内因性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を引き起こす。例えば、Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5、 Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8、 Bruggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40;並びに米国特許第5,591,669号明細書、同第5,589,369号明細書、及び同第5,545,807号明細書を参照されたい。
代替的には、ファージディスプレイ法(McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4)を使用して、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生成することができる。この技法によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、M13又はfd等の糸状バクテリオファージの主要又は微量コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択は、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。したがって、ファージはB細胞の特性の幾つかを模倣する。ファージディスプレイは多様な形式で行なうことができるが、それらの概説については、例えば、Johnson KS & Chiswell DJ. Curr Opin Struct Biol. 1993 ;3:564-71を参照されたい。V遺伝子セグメントの幾つかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。
Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8は、免疫化したマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小ランダム組み合わせライブラリから抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを単離した。Marks JD, et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97、又はGriffiths AD, et al., EMBO J. 1993 Feb;12(2):725-34.によって記載される技法に基本的に従って、非免疫化ヒトドナー由来のV遺伝子のレパートリーを構築し、抗原(自己抗原を含む)の種々のアレイに対する抗体を単離することができる。また、米国特許第5,565,332号明細書及び同第5,573,905号明細書を参照されたい。
ヒト抗体はまた、インビトロ活性化B細胞によって作り出してもよい(米国特許第5,567,610号明細書及び同第5,229,275号明細書を参照)。
(v)非抗体結合タンパク質
本発明は、CXタンパク質に対する、例えばEPHA7のN末端部分に対する非抗体結合タンパク質も考慮する。「非抗体結合タンパク質」又は「非抗体リガンド」又は「抗原結合タンパク質」という用語は下記でより詳細に論じられる、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子、及び抗体様結合ペプチド模倣薬を含む非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する抗体模倣体を互換可能に指す。
本発明は、CXタンパク質に対する、例えばEPHA7のN末端部分に対する非抗体結合タンパク質も考慮する。「非抗体結合タンパク質」又は「非抗体リガンド」又は「抗原結合タンパク質」という用語は下記でより詳細に論じられる、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子、及び抗体様結合ペプチド模倣薬を含む非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する抗体模倣体を互換可能に指す。
抗体と同様に標的化し、標的に結合する他の化合物も開発されている。これらの「抗体模倣体」の一部は、非免疫グロブリンタンパク質骨格をタンパク質フレームワークの代替として抗体の可変領域に使用する。
例えば、Ladner et al.(米国特許第5,260,203号明細書)には、凝集しているが分子的には分離した、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と同様の結合特異性を有する一本鎖ポリペプチド結合分子が記載されている。該一本鎖結合分子は、ペプチドリンカーにより連結した抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方の抗原結合部位を含有し、2つのペプチド抗体と同様の構造に折り畳まれる。一本鎖結合分子は、サイズがより小さい、安定性がより大きい、及びより容易に修飾される等、従来の抗体に優る幾つかの利点を示す。
Ku et al. (Proc Natl Acad Sci USA 92(14):6552-6556 (1995))は、シトクロムb562に基づく抗体の代替手段を記載している。Ku et al. (1995)は、シトクロムb562のループの2つを無作為化し、ウシ血清アルブミンに対する結合に関して選択したライブラリを作り出した。個々の突然変異体は、抗BSA抗体と同様に選択的にBSAに結合することが見出された。
Lipovsek et al.(米国特許第6,818,418号明細書及び同第7,115,396号明細書)は、フィブロネクチン又はフィブロネクチン様タンパク質骨格、及び少なくとも1つの可変ループを特徴とする抗体模倣体を記載している。アドネクチンとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的リガンドに関する高い親和性及び特異性を含む、自然抗体又は改変抗体と同じ特徴の多くを示す。新たな又は改善された結合タンパク質を発展させる任意の技法を、これらの抗体模倣体と共に使用することができる。
これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、IgG重鎖の可変領域の構造と同様である。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と本質的に同様の抗原結合特性及び親和性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体及び抗体断片に優る或る特定の利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は固有の折り畳み安定性に関してジスルフィド結合に依存せず、したがって、通常は抗体を分解する可能性のある条件下で安定である。また、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、IgG重鎖の構造と同様であるため、ループの無作為化及びシャフリングのプロセスは、抗体のインビボ親和性成熟のプロセスと同様、インビトロで採用することができる。Beste et al.(Proc Natl Acad Sci USA 96(5): 1898-1903 (1999))は、リポカリン骨格(Anticalin(登録商標))に基づく抗体模倣体を記載している。リポカリンは、タンパク質末端に4つの超可変ループを有するβバレルから成る。Beste(1999)は、該ループにランダム突然変異誘発を行ない、例えばフルオレセインとの結合に関して選択した。3つの変異体がフルオレセインと特異的な結合を示し、1つの変異体が抗フルオレセイン抗体と同様の結合を示した。さらなる分析によって、無作為化位置が全て可変であることが明らかとなったが、これはAnticalin(登録商標)が抗体の代替手段としての使用に適切であり得ることを意味する。
Anticalin(登録商標)は、典型的には160残基〜180残基の小さな一本鎖ペプチドであり、生産コストの減少、貯蔵安定性の増大、及び免疫反応の減少を含む、抗体に優る幾つかの利点を提供する。
Hamilton et al.(米国特許第5,770,380号明細書)は、結合部位として使用される複数の可変ペプチドループが付着した、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を使用した合成抗体模倣体を記載している。ペプチドループは全て、互いにカリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出する。この幾何学的構造のために、全てのループが結合に利用可能であり、リガンドに対する結合親和性が増大する。しかしながら、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体はペプチドのみから成るものではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。上記骨格も純粋にペプチド、DNA、又はRNAから成るものではなく、これはこの抗体模倣体が厳しい環境条件において比較的安定であり、寿命が長いことを意味する。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応をもたらす可能性は低い。
Murali et al.(Cell Mol Biol. 49(2): 209-216 (2003))は、抗体をより小さいペプチド模倣体にする方法論を記載している。該ペプチド模倣体は「抗体様結合ペプチド模倣体」(ABiP)と称され、これも抗体に対する代替手段として有用であり得る。
Silverman et al.(Nat Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561)は、「アビマー」と称される複数のドメインを含む一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質を記載している。アビマーは、ヒト細胞外受容体ドメインからインビトロエキソンシャフリング及びファージディスプレイにより開発されたため、様々な標的分子に対する親和性及び特異性において抗体と幾らか類似した結合タンパク質群である。得られたマルチドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して改善された親和性(場合によってはnM以下の)及び特異性を示し得る、複数の独立した結合ドメインを含み得る。アビマーを構築及び使用する方法に関するさらなる詳細は、例えば米国特許出願公開第20040175756号明細書、同第20050048512号明細書、同第20050053973号明細書、同第20050089932号明細書、及び同第20050221384号明細書に開示されている。
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、抗体特性はまた、RNA分子及び非天然オリゴマー(例えばプロテアーゼ阻害剤、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、及びβターン模倣体)(全て本発明による使用に適切である)を含むがこれらに限定されない化合物において模倣されてきた。
当該技術分野において知られるように、アプタマーは、特異的な分子標的に強く結合する核酸から成る巨大分子である。Tuerk and Gold(Science. 249: 505-510 (1990))は、アプタマーの選択に関するSELEX法(試験管内進化法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment))を開示している。SELEX法では、標的分子を用いて核酸分子の大きなライブラリ(例えば、1015個の異なる分子)を生成及び/又はスクリーニングする。単離したアプタマーを次にさらに精製して、標的の結合及び/又はアプタマー構造に寄与しないヌクレオチド(すなわち、コア結合ドメインを欠くアプタマー)を取り除いてもよい。アプタマー技術の概説に関しては、例えばJayasena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-1650を参照されたい。
試験薬剤/化合物ライブラリの構築は当該技術分野においてよく知られているが、以下に、本スクリーニング方法のための試験薬剤又は化合物の同定及びかかる薬剤又は化合物のライブラリの構築に関するさらなる指針を与える。
(vi)抗体断片:
抗体断片の生成について、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解によって誘導されていた(例えば、Morimoto K & Inouye K.J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar; 24(1-2): 107-17、Brennan M et al., Science. 1985 Jul 5; 229(4708) 81-3を参照されたい)。しかしながら、現在では、これらの断片は組換え宿主細胞によって直接生成することができる。例えば、上述の抗体ファージライブラリから抗体断片を単離することができる。代替的には、Fab’−SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的カップリングを行なってF(ab’)2断片を形成することもできる(CarterP et al., BioTechnology(NY). 1992 Feb; 10(2): 163-7)。別のアプローチによれば、F(ab’)2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を生成するための他の技法は、当業者には明らかである。他の実施形態において、好適な抗体は一本鎖Fv断片(scFv)である。国際公開第93/16185号パンフレット、米国特許第5,571,894号明細書、及び米国特許第5,587,458号明細書を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第5,641,870号明細書に記載されるような「直鎖状抗体」であってもよい。かかる直鎖状抗体断片は単一特異的であっても、又は二重特異的であってもよい。
抗体断片の生成について、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解によって誘導されていた(例えば、Morimoto K & Inouye K.J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar; 24(1-2): 107-17、Brennan M et al., Science. 1985 Jul 5; 229(4708) 81-3を参照されたい)。しかしながら、現在では、これらの断片は組換え宿主細胞によって直接生成することができる。例えば、上述の抗体ファージライブラリから抗体断片を単離することができる。代替的には、Fab’−SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的カップリングを行なってF(ab’)2断片を形成することもできる(CarterP et al., BioTechnology(NY). 1992 Feb; 10(2): 163-7)。別のアプローチによれば、F(ab’)2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を生成するための他の技法は、当業者には明らかである。他の実施形態において、好適な抗体は一本鎖Fv断片(scFv)である。国際公開第93/16185号パンフレット、米国特許第5,571,894号明細書、及び米国特許第5,587,458号明細書を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第5,641,870号明細書に記載されるような「直鎖状抗体」であってもよい。かかる直鎖状抗体断片は単一特異的であっても、又は二重特異的であってもよい。
(vii)抗体又は抗体断片の選択
上述の方法によって調製される抗体又は抗体断片は、癌細胞のようなCX遺伝子を発現する細胞に関しての親和性を検出することによって選択される。これらの細胞との非特異的な結合は、室温で30分間、3% BSAを含有するPBSで処理することによって阻止される。細胞を室温で60分間、候補抗体又は抗体断片とインキュベートする。PBSで洗浄した後、細胞を室温で60分間、FITC結合二次抗体によって染色し、蛍光光度計によって検出した。代替的に、表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサを、本発明における抗体又は抗体断片を検出又は定量する手段として使用することができる。細胞表面上でCXペプチドを検出することができる抗体又は抗体断片が本発明で選択される。
上述の方法によって調製される抗体又は抗体断片は、癌細胞のようなCX遺伝子を発現する細胞に関しての親和性を検出することによって選択される。これらの細胞との非特異的な結合は、室温で30分間、3% BSAを含有するPBSで処理することによって阻止される。細胞を室温で60分間、候補抗体又は抗体断片とインキュベートする。PBSで洗浄した後、細胞を室温で60分間、FITC結合二次抗体によって染色し、蛍光光度計によって検出した。代替的に、表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサを、本発明における抗体又は抗体断片を検出又は定量する手段として使用することができる。細胞表面上でCXペプチドを検出することができる抗体又は抗体断片が本発明で選択される。
(3)二本鎖分子
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に指定のない限り、本明細書中で互換可能に使用され、一般的に許容される1文字コードで表される。この用語は、1つ又は複数の核酸がエステル結合で連結する核酸(ヌクレオチド)ポリマーに適用する。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA又はそれらの組合せから成り得る。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に指定のない限り、本明細書中で互換可能に使用され、一般的に許容される1文字コードで表される。この用語は、1つ又は複数の核酸がエステル結合で連結する核酸(ヌクレオチド)ポリマーに適用する。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA又はそれらの組合せから成り得る。
本明細書で使用されるように、「単離二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子(例えば低分子干渉RNA(siRNA、例えば二本鎖リボ核酸(dsRNA)又は低分子ヘアピンRNA(shRNA))及び低分子干渉DNA/RNA(siD/R−NA、例えばDNAとRNAとの二本鎖キメラ(dsD/R−NA)又はDNAとRNAとの低分子ヘアピンキメラ(shD/R−NA))を含む)の発現を阻害する核酸分子を表す。
本明細書で使用されるように、「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を防ぐ二本鎖RNA分子を表す。siRNAを細胞に導入する標準的な技法(DNAが、RNAが転写される鋳型であるものを含む)を用いる。siRNAとしては、TBC1D7遺伝子のセンス核酸配列(「センス鎖」とも称される)に対応するリボヌクレオチド、TBC1D7遺伝子のアンチセンス核酸配列(「アンチセンス鎖」とも称される)に対応するリボヌクレオチド又はその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、siRNAを構築することができる。siRNAはdsRNA又はshRNAのいずれかであり得る。本明細書で使用されるように、「dsRNA」という用語は、互いに相補配列を含み、且つ二本鎖RNA分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、2つのRNA分子の構築物を表す。2つの鎖の配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」又は「アンチセンス」RNAだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するRNA分子も含み得る。
本明細書で使用されるように、「shRNA」という用語は、互いに相補的である、第1の領域及び第2の領域、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ステム−ループ構造を有するsiRNAを表す。領域の相補性及び配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第1の領域及び第2の領域がループ領域によって連結し、そのループは、ループ領域内のヌクレオチド(又はヌクレオチド類似体)間の塩基対合の欠失によって生じる。shRNAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間にある一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で使用されるように、「siD/R−NA」という用語は、RNAとDNAとの両方から成る二本鎖分子を表し、RNA及びDNAのハイブリッド及びキメラを含み、標的mRNAの翻訳を妨げる。本明細書中で、ハイブリッドは、DNAから成るオリゴヌクレオチドとRNAから成るオリゴヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を含む鎖の一方又は両方がRNA及びDNAを含有し得ることを示す。siD/R−NAを細胞に導入する標準的な技法が用いられる。siD/R−NAとしては、TBC1D7遺伝子のセンス核酸配列(「センス鎖」とも称される)、TBC1D7遺伝子のアンチセンス核酸配列(「アンチセンス鎖」とも称される)又はその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、siD/R−NAを構築することができる。siD/R−NAはdsD/R−NA又はshD/R−NAのいずれかであり得る。
本明細書で使用されるように、「dsD/R−NA」という用語は、互いに相補配列を含み、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、2つの分子の構築物を表す。2つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」又は「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。dsD/R−NAを構築する2つの分子の1つ又は両方が、RNAとDNAとの両方から成るか(キメラ分子)、又は代替的に分子の1つがRNAから成り、もう一方がDNAから成る(ハイブリッド二本鎖)。
本明細書で使用されるように、「shD/R−NA」という用語は、互いに相補的である、第1の領域及び第2の領域、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ステム−ループ構造を有するsiD/R−NAを表す。領域の相補性及び配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第1の領域及び第2の領域がループ領域によって連結し、そのループは、ループ領域内のヌクレオチド(又はヌクレオチド類似体)間の塩基対合の欠失によって生じる。shD/R−NAのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間にある一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
(i)標的配列
標的mRNAとハイブリダイズする、TBC1D7遺伝子に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常一本鎖のmRNA転写産物に関連付け、それにより翻訳に干渉することにより、標的遺伝子でコードされるタンパク質の発現を阻害することによって、TBC1D7遺伝子でコードされるTBC1D7タンパク質の生成を阻害又は低減する。癌細胞株におけるTBC1D7遺伝子の発現は、本発明の2つの二本鎖分子によって阻害された(図3A及び図3B)。
標的mRNAとハイブリダイズする、TBC1D7遺伝子に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常一本鎖のmRNA転写産物に関連付け、それにより翻訳に干渉することにより、標的遺伝子でコードされるタンパク質の発現を阻害することによって、TBC1D7遺伝子でコードされるTBC1D7タンパク質の生成を阻害又は低減する。癌細胞株におけるTBC1D7遺伝子の発現は、本発明の2つの二本鎖分子によって阻害された(図3A及び図3B)。
したがって本発明は、細胞に導入されると癌細胞においてTBC1D7遺伝子の発現を阻害又は低減する能力がある単離二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、以下で言及されるsiRNA設計アルゴリズムによって設計される。
TBC1D7標的配列としては例えば、ヌクレオチド
5'- GAACAGTGCAGAGAAGATA -3' (配列番号18)又は
5'- GATAAAGTTGTGAGTGGAT -3' (配列番号19)
が挙げられる。
5'- GAACAGTGCAGAGAAGATA -3' (配列番号18)又は
5'- GATAAAGTTGTGAGTGGAT -3' (配列番号19)
が挙げられる。
具体的に、本発明は、以下の二本鎖分子[1]〜[19]を提供する:
[1]単離二本鎖分子であって、
細胞に導入されると、TBC1D7遺伝子のインビボ発現と細胞増殖とを阻害し、上記二本鎖分子が、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される標的配列に一致するmRNAで作用する、単離二本鎖分子。
[2]センス鎖と、それに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成し、
上記センス鎖は、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、[1]に記載の二本鎖分子。
[3]上記標的配列が、配列番号1から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約10個の連続ヌクレオチドを含む、[1]に記載の二本鎖分子。
[4]上記標的配列が、配列番号1から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約19〜約25個の連続ヌクレオチドを含む、[3]に記載の二本鎖分子。
[5]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約100ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[2]に記載の二本鎖分子。
[6]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約75ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[5]に記載の二本鎖分子。
[7]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約50ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[6]に記載の二本鎖分子。
[8]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約25ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[7]に記載の二本鎖分子。
[9]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約19〜約25ヌクレオチドの間の長さを有する二本鎖分子を形成する、[8]に記載の二本鎖分子。
[10]介在一本鎖によって連結したセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を含む単一オリゴヌクレオチドから成る、[1]に記載の二本鎖分子。
[11]一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、
[A]は、TBC1D7では、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19からなる群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
[B]は介在一本鎖であり、
[A’]は[A]で選択された配列と相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である)を有する、[10]に記載の二本鎖分子。
[12]RNAを含む、[1]に記載の二本鎖分子。
[13]DNAとRNAとの両方を含む、[1]に記載の二本鎖分子。
[14]DNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[13]に記載の二本鎖分子。
[15]センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれDNA及びRNAから構成される、[14]に記載の二本鎖分子。
[16]DNAとRNAとのキメラである、[13]に記載の二本鎖分子。
[17]センス鎖における標的配列の5’末端領域、及び/又はアンチセンス鎖における標的配列の相補的な配列の3’末端領域がRNAから成る、[16]に記載の二本鎖分子。
[18]RNA領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[17]に記載の二本鎖分子。
[19]3’オーバーハングを含有する、[2]に記載の二本鎖分子。
[1]単離二本鎖分子であって、
細胞に導入されると、TBC1D7遺伝子のインビボ発現と細胞増殖とを阻害し、上記二本鎖分子が、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される標的配列に一致するmRNAで作用する、単離二本鎖分子。
[2]センス鎖と、それに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成し、
上記センス鎖は、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、[1]に記載の二本鎖分子。
[3]上記標的配列が、配列番号1から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約10個の連続ヌクレオチドを含む、[1]に記載の二本鎖分子。
[4]上記標的配列が、配列番号1から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約19〜約25個の連続ヌクレオチドを含む、[3]に記載の二本鎖分子。
[5]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約100ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[2]に記載の二本鎖分子。
[6]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約75ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[5]に記載の二本鎖分子。
[7]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約50ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[6]に記載の二本鎖分子。
[8]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約25ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、[7]に記載の二本鎖分子。
[9]上記センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約19〜約25ヌクレオチドの間の長さを有する二本鎖分子を形成する、[8]に記載の二本鎖分子。
[10]介在一本鎖によって連結したセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を含む単一オリゴヌクレオチドから成る、[1]に記載の二本鎖分子。
[11]一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、
[A]は、TBC1D7では、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19からなる群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
[B]は介在一本鎖であり、
[A’]は[A]で選択された配列と相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である)を有する、[10]に記載の二本鎖分子。
[12]RNAを含む、[1]に記載の二本鎖分子。
[13]DNAとRNAとの両方を含む、[1]に記載の二本鎖分子。
[14]DNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[13]に記載の二本鎖分子。
[15]センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれDNA及びRNAから構成される、[14]に記載の二本鎖分子。
[16]DNAとRNAとのキメラである、[13]に記載の二本鎖分子。
[17]センス鎖における標的配列の5’末端領域、及び/又はアンチセンス鎖における標的配列の相補的な配列の3’末端領域がRNAから成る、[16]に記載の二本鎖分子。
[18]RNA領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[17]に記載の二本鎖分子。
[19]3’オーバーハングを含有する、[2]に記載の二本鎖分子。
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
細胞において標的遺伝子発現を阻害する能力がある二本鎖分子を設計する方法が知られている(例えば米国特許第6,506,559号明細書(その全体が本明細書中で参照により援用される)を参照されたい)。例えば、siRNAを設計するコンピュータプログラムは、Ambionのウェブサイトから入手可能である(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
標的部位の設計
1.転写産物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なsiRNA標的部位として、それぞれのAAの発生とその3’側に隣接した19個のヌクレオチドとを記録する。Tuschl et al.は、5’非翻訳領域及び3’非翻訳領域(UTR)及び開始コドン近くの領域(75塩基以内)に対してsiRNAを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、UTR結合タンパク質及び/又は翻訳開始複合体が、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
1.転写産物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なsiRNA標的部位として、それぞれのAAの発生とその3’側に隣接した19個のヌクレオチドとを記録する。Tuschl et al.は、5’非翻訳領域及び3’非翻訳領域(UTR)及び開始コドン近くの領域(75塩基以内)に対してsiRNAを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、UTR結合タンパク質及び/又は翻訳開始複合体が、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
2.潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラット等)とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でのNCBIサーバーにあるBLASTを用いる(Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402)。
3.合成のために条件を満たす標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って評価する標的配列を幾つか選択するのが一般的である。該プロトコルにより、本発明の単離二本鎖分子の標的配列は、以下のように設計された。
TBC1D7標的配列は、例えば、ヌクレオチド
5'- GAACAGTGCAGAGAAGATA -3'(配列番号18)又は
5'- GATAAAGTTGTGAGTGGAT -3'(配列番号19)を含む。
TBC1D7標的配列は、例えば、ヌクレオチド
5'- GAACAGTGCAGAGAAGATA -3'(配列番号18)又は
5'- GATAAAGTTGTGAGTGGAT -3'(配列番号19)を含む。
具体的に、本発明は、上述の標的配列を標的とする以下の二本鎖分子を提供し、これらをそれぞれ標的遺伝子を発現する細胞の成長を阻害又は低減する能力に関して調べた。TBC1D7を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞株A549及び肺癌細胞株LC319の成長は、本発明の2つの二本鎖分子によって阻害された(図3A及び図B)。例えば、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する。
TBC1D7標的配列は、例えば、ヌクレオチド
5'- GAACAGTGCAGAGAAGATA-3'(配列番号18)又は
5'- GATAAAGTTGTGAGTGGAT -3'(配列番号19)を含む。
TBC1D7標的配列は、例えば、ヌクレオチド
5'- GAACAGTGCAGAGAAGATA-3'(配列番号18)又は
5'- GATAAAGTTGTGAGTGGAT -3'(配列番号19)を含む。
本発明の二本鎖分子は単一標的TBC1D7遺伝子配列に関し、又は複数の標的TBC1D7遺伝子配列に関し得る。
TBC1D7遺伝子の上述の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子としては、標的配列の核酸配列及び/又は標的配列に相補的な配列のいずれかを含む単離ポリヌクレオチド(複数可)が挙げられる。TBC1D7遺伝子を標的とする二本鎖分子の例としては、配列番号18又は配列番号19に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドと、それに対する相補配列とが挙げられる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、修飾分子がTBC1D7遺伝子の発現を抑制する能力を保持していれば、上述の核酸配列においてわずかな(minor)な修飾が許容可能である。本明細書で核酸配列における「わずかな修飾」は、配列への核酸の1つ、2つ又は幾つかの置換、欠失、付加又は挿入を示す。
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる(実施例1における(i)RNA干渉アッセイを参照されたい)。実施例では、TBC1D7遺伝子のmRNAの様々な部分のセンス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含む二本鎖分子は、インビトロで標準的な方法に従って癌細胞株におけるTBC1D7遺伝子産物の産出を低減させる能力に関して試験した(例えば、LC319及びA549を用いて)。さらに例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べて、候補二本鎖分子と接触させた細胞でのTBC1D7遺伝子産物の低減は、言及された例えばTBC1D7遺伝子のmRNAに対するプライマーを用いたRT−PCRで検出することができる(実施例1における(b)半定量RT−PCRを参照されたい)。インビトロ細胞ベースのアッセイにおけるTBC1D7遺伝子産物の産生を低減する配列は、細胞成長に及ぼすこれらの阻害効果に関して試験することができる。それから、インビトロ細胞ベースのアッセイにおける細胞成長を阻害する配列は、TBC1D7遺伝子産物の産生の低減及び癌細胞成長の低減を確認するために、癌を有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いてこれらのインビボ能力に関して試験することができる。
単離ポリヌクレオチドがRNA又はそれらの誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「t」は「u」に置き換えるものとする。本明細書で使用されるように、「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドユニット間のワトソンクリック型又はフーグスティーン型の塩基対合を表し、「結合」という用語は、2つのポリヌクレオチド間の物理的な又は化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチド及び/又は非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドは同じように互いに結合することもできる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件化でハイブリダイズして、ほとんど又は全くミスマッチを含有しない安定二本鎖を形成する。さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子又はヘアピンループ構造を形成することができる。一実施形態において、このような二本鎖は10個のマッチ毎にわずか1個のマッチしか含有していない。幾つかの実施形態では、二本鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖はミスマッチを含有しない。
ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子では500ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、又は25ヌクレオチド長未満である。本発明の単離ポリヌクレオチドは、TBC1D7遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、又は二本鎖分子をコードする鋳型DNAを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子を形成するのに使用される場合、ポリヌクレオチドのセンス鎖は19ヌクレオチドより長く、例えば21ヌクレオチドより長く、例えば約19ヌクレオチド〜25ヌクレオチドであり得る。したがって、本発明は、標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、アンチセンス鎖とを含む二本鎖分子を提供する。好ましい態様では、当該センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、19ヌクレオチド〜25ヌクレオチド長を有する二本鎖分子を形成する。
本発明の二本鎖分子は、1つ又は複数の修飾ヌクレオチド及び/又は非ホスホジエステル結合を含有し得る。当該技術分野に既知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性及び/又は細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる他の種類の化学修飾にも気づくであろう(国際公開第03/070744号パンフレット、国際公開第2005/045037号パンフレット)。一実施形態では、分解耐性の改善又は取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、2’−O−メチルリボヌクレオチド(特に二本鎖分子のセンス鎖上で)、2’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、2’−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基(universal base)」ヌクレオチド、5’−C−メチルヌクレオチド、及び逆デオキシ脱塩基残基の組み込み(米国特許出願第20060122137号明細書)が挙げられる。
別の実施形態では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、又は標的化の効率を増大させるために修飾を用いることができる。修飾としては、二本鎖分子の2つの相補鎖間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の3’末端又は5’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾及び/又は骨格修飾、2−フルオロ修飾リボヌクレオチド及び2’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる(国際公開第2004/029212号パンフレット)。
別の実施形態において、標的mRNAにおける、及び/又は相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性の増減に修飾を用いることができる(国際公開第2005/044976号パンフレット)。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを2−チオピリミジン、5−アルキニルピリミジン、5−メチルピリミジン、又は5−プロピルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを7−デザプリン、7−アルキルプリン、又は7−アルケニルプリンに置換することができる。別の実施形態では、二本鎖分子が3’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、3’末端のヌクレオチドが突き出た(overhanging)ヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる(Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200)。さらに詳細には、公開文献、例えば米国特許出願第20060234970号明細書が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られた分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持していれば、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に利用することができる。
さらに、本発明の二本鎖分子はDNAとRNAとの両方を含み得る(例えばdsD/R−NA又はshD/R−NA)。特に、DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドポリヌクレオチド又はDNA−RNAキメラポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。DNAとRNAとの混合物、即ちDNA鎖(ポリヌクレオチド)とRNA鎖(ポリヌクレオチド)とから成るハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖(ポリヌクレオチド)の一方又は両方上でDNAとRNAとの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。DNA鎖とRNA鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖がDNAであり、アンチセンス鎖がRNAであるか、又はその反対のいずれかであってもよい。
幾つかの実施形態において、センス鎖のポリヌクレオチドはDNAであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはRNAである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖とアンチセンス鎖との両方がDNAとRNAとから成るか、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれか一方がDNAとRNAとから成ってもよい。二本鎖分子の安定性を向上するために、幾つかの実施形態では、分子は可能な限り多くのDNAを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、分子には発現の十分な阻害を誘導する範囲内でRNAが必要である。キメラ型二本鎖分子の一例では、二本鎖分子の上流部分領域(即ちセンス鎖又はアンチセンス鎖内の標的配列又はその相補配列に隣接する領域)がRNAである。
幾つかの実施形態では、上流部分領域は、センス鎖の5’側(5’末端)及びアンチセンス鎖の3’側(3’末端)を示す。即ち、幾つかの実施形態では、アンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域、又はセンス鎖の5’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域との両方がRNAから成る。例えば、本発明のキメラ又はハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖:5’−[-----DNA-----]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’:アンチセンス鎖、
センス鎖:5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’:アンチセンス鎖、及び
センス鎖:5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(RNA)−5’:アンチセンス鎖。
センス鎖:5’−[-----DNA-----]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’:アンチセンス鎖、
センス鎖:5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’:アンチセンス鎖、及び
センス鎖:5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(RNA)−5’:アンチセンス鎖。
上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖内で、標的配列又はこれに対する相補配列の末端から数えて約9個〜13個のヌクレオチドから成るドメインであり得る。さらに、かかるキメラ型二本鎖分子の例としては、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域(センス鎖では5’側領域及びアンチセンス鎖では3’側領域)がRNAであり、もう半分がDNAである19個〜21個のヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。かかるキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がRNAである場合、標的遺伝子の発現阻害効果がかなり高くなる(米国特許出願第20050004064号明細書)。
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンRNA(shRNA)及びDNAとRNAとから成るショートヘアピン(shD/R−NA)を形成することができる。shRNA又はshD/R−NAは、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができるタイトヘアピンカーブ(tight hairpin turn)を作る、RNAの配列又はRNAとDNAとの混合物の配列である。shRNA又はshD/R−NAは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分けられる。一般的に、ヘアピン構造は、細胞機構によってdsRNA又はdsD/R−NAに切断され、続いてRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と結合する。この複合体は、dsRNA又はdsD/R−NAの標的配列に一致するmRNAと結合すると共に、これを切断する。
任意ヌクレオチド配列から成るループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列との間に位置し得る。したがって、本発明は、一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、[A]は標的配列を含むセンス鎖であり、[B]は介在一本鎖であり、[A’]は[A]に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である)を有する二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、配列番号18又は配列番号19のヌクレオチドから成る群から選択され得る。
本発明はこれらの例には限定されず、[A]における標的配列は、標的となるTBC1D7遺伝子の発現を抑制する能力を保持し、これによりこれらの遺伝子を発現する細胞の阻害又は低減がもたらされれば、これらの例から修飾された配列であってもよい。[A]領域は[A’]領域とハイブリダイズし、[B]領域を含むループを形成する。介在一本鎖部分[B]、即ちループ配列は3ヌクレオチド長〜23ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列から成る群から選択することができる(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。さらに、23個のヌクレオチドから成るループ配列は活性siRNAも提供する(Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26):
CCC、CCACC、又はCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG:Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10;及び
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
CCC、CCACC、又はCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG:Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10;及び
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
本発明のヘアピンループ構造を有する例示的な二本鎖分子は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC及びUUCAAGAGAから成る群から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない:
GAACAGUGCAGAGAAGAUAUU-[B]- UAUCUUCUCUGCACUGUUC(標的配列番号18);及び
GAUAAAGUUGUGAGUGGAUUU-[B]- AUCCACUCACAACUUUAUC(標的配列番号19)。
GAACAGUGCAGAGAAGAUAUU-[B]- UAUCUUCUCUGCACUGUUC(標的配列番号18);及び
GAUAAAGUUGUGAGUGGAUUU-[B]- AUCCACUCACAACUUUAUC(標的配列番号19)。
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「u」を3’オーバーハングとして標的配列のアンチセンス鎖の3’末端に付加することができる。付加される「u」の数は少なくとも2、概して2〜10、例えば2〜5である。付加される「u」は二本鎖分子のアンチセンス鎖の3’末端で一本鎖を形成する。
二本鎖分子を調製する方法は、当該技術分野で既知の化学合成方法のいずれかを利用することができる。化学合成方法に従って、センス鎖及びアンチセンス鎖の一本鎖ポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する一実施形態では、合成一本鎖ポリヌクレオチドは少なくとも約3:7、例えば約4:6、例えば実質的に等モル量(即ち約5:5のモル比)のモル比で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリング二本鎖ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用するか、又は残存一本鎖ポリヌクレオチドが、例えば適当な酵素による分解によって取り除かれる方法が挙げられる。
標的配列に隣接する調節配列は同一であっても又は異なっていてもよく、このためこれらの発現は別々に又は一時的に又は空間的に調整することができる。二本鎖分子は、TBC1D7遺伝子鋳型を、例えば低分子核RNA(snRNA)U6由来のRNAポリIII転写ユニット又はヒトH1 RNAプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって細胞内で転写することができる。
(ii)ベクター
本明細書に記載の二本鎖分子を1つ又は複数含有するベクター、及び該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書中で、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入される場合、ベクターが前記分子を発現するであろうことを示す。一実施形態では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な制御要素を含む。かかる本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに、又は癌を治療するための活性成分として直接使用することができる。
本明細書に記載の二本鎖分子を1つ又は複数含有するベクター、及び該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書中で、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入される場合、ベクターが前記分子を発現するであろうことを示す。一実施形態では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な制御要素を含む。かかる本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに、又は癌を治療するための活性成分として直接使用することができる。
本発明のベクターは、例えば、両方の鎖を(DNA分子の転写によって)発現されるような方法で制御配列が機能的に連結するように、標的配列を含む配列を発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる(Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5)。例えば、mRNAに対するアンチセンス鎖であるRNA分子が第1のプロモーター(例えばクローニングDNAの3’末端と隣接するプロモーター配列)によって転写され、mRNAに対するセンス鎖であるRNA分子が第2のプロモーター(例えばクローニングDNAの5’末端に隣接するプロモーター配列)によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズし、遺伝子をサイレンシングするために二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれコードする2つのベクター構築物は、センス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現した後、二本鎖分子構築物を形成するために利用する。さらに、クローニング配列は二次構造(例えばヘアピン)を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列と相補的なアンチセンス配列との両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる(例えば相同的な組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい)。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第5,580,859号明細書、同第5,589,466号明細書、同第5,804,566号明細書、同第5,739,118号明細書、同第5,736,524号明細書、同第5,679,647号明細書、及び国際公開第98/04720号パンフレットを参照されたい。DNAベースの送達技術の例としては、「ネイキッド(naked:裸)DNA」、促進性(ブピバカイン(bupivicaine)、ポリマー、ペプチド媒介性)送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子媒介性(「遺伝子銃」)又は圧力媒介性の送達が挙げられる(例えば米国特許第5,922,687号明細書を参照されたい)。
本発明のベクターは例えば、ウイルス又は細菌ベクターであり得る。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えば牛痘又は鶏痘が挙げられる(例えば米国特許第4,722,848号明細書を参照されたい)。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての牛痘ウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現する細胞に導入する際、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌(Bacille Calmette Guerin)(BCG)が挙げられる。BCGベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与及び生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌(Salmonella typhi)ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、及びHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
(iii)癌細胞の成長を阻害若しくは低減する、又は二本鎖分子を用いて癌を治療若しくは予防する方法
本発明において、上述の標的配列を標的とする二本鎖分子を、標的遺伝子を(過剰)発現する細胞の成長を阻害又は低減する能力に関して試験した。TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、TBC1D7(過剰)発現細胞、例えば肺癌細胞株A549及び肺癌細胞株LC319の成長は2つの二本鎖分子によって阻害された(図3A及び3B)。
本発明において、上述の標的配列を標的とする二本鎖分子を、標的遺伝子を(過剰)発現する細胞の成長を阻害又は低減する能力に関して試験した。TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、TBC1D7(過剰)発現細胞、例えば肺癌細胞株A549及び肺癌細胞株LC319の成長は2つの二本鎖分子によって阻害された(図3A及び3B)。
したがって本発明は、TBC1D7遺伝子の発現を阻害することによって、細胞成長、即ちTBC1D7遺伝子の過剰発現から生じる又はTBC1D7遺伝子によって媒介される、癌由来の細胞の癌性細胞成長を阻害する方法を提供する。TBC1D7遺伝子の発現は、特に相補的なTBC1D7遺伝子の発現を標的とする、上述の本発明の二本鎖分子、又は二本鎖分子のいずれかを発現することができる本発明のベクターのいずれかによって阻害することができる。本発明の二本鎖分子及びベクターの癌性細胞の細胞成長を阻害するような能力は、これらがTBC1D7遺伝子の過剰発現によって生じる、又はTBC1D7遺伝子によって媒介される癌を治療する方法に使用することができることを示している。したがって、本発明は、これらの遺伝子が正常器官ではほとんど検出されなかったので、有害な効果なくTBC1D7遺伝子に対する二本鎖分子、即ち阻害核酸又は分子を発現するベクターを投与することによって、TBC1D7遺伝子の過剰発現によって生じる、又はTBC1D7遺伝子によって媒介される癌を有する患者を治療する方法を提供する。
特に本発明は、以下の方法[1]〜[22]を提供する:
[1]TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する細胞の成長を阻害若しくは低減する方法、又はTBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌を治療若しくは予防する方法であって、該方法が少なくとも1つの二本鎖分子を与える段階を含み、該二本鎖分子が細胞に導入され、該TBC1D7遺伝子のインビボ発現を阻害又は低減する、方法。
[2]上記二本鎖分子が、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される標的配列と配列同一性を共有する、又はこれに対して相補的であるmRNAで作用する、[1]に記載の方法。
[3]上記二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖が、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、[2]に記載の方法。
[4]複数の二本鎖分子が投与される、[1]に記載の方法。幾つかの実施形態では、二本鎖分子は異なる核酸配列を含む。
[5]複数の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、[4]に記載の方法。
[6]二本鎖分子が約100ヌクレオチド長未満である、[1]に記載の方法。
[7]上記二重鎖分子のセンス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約75ヌクレオチド長未満の二重鎖分子を形成する、[6]に記載の方法。
[8]上記二重鎖分子のセンス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約50ヌクレオチド長未満の二重鎖分子を形成する、[7]に記載の方法。
[9]上記二重鎖分子のセンス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約25ヌクレオチド長未満の二重鎖分子を形成する、[8]に記載の方法。
[10]上記二重鎖分子のセンス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約19〜約25ヌクレオチド長の間の二重鎖分子を形成する、[9]に記載の方法。
[11]上記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一オリゴヌクレオチドから成る、[1]に記載の方法。
[12]上記二本鎖分子が一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、
[A]は、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
[B]は介在一本鎖であり、
[A’]は[A]で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む前記アンチセンス鎖である)を有する、[11]に記載の方法。
[13]二本鎖分子がRNAを含む、[1]に記載の方法。
[14]二本鎖分子がDNAとRNAとの両方を含む、[1]に記載の方法。
[15]DNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[14]に記載の方法。
[16]センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、DNAとRNAとから成る、[15]に記載の方法。
[17]二本鎖分子がDNAとRNAとのキメラである、[14]に記載の方法。
[18]センス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの1つ又は両方の5’末端に隣接する領域がRNAから成る、[17]に記載の方法。
[19]隣接領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[18]に記載の方法。
[20]二本鎖分子が3’オーバーハングを含有する、[1]に記載の方法。
[21]二本鎖分子がベクターによってコードされる、[1]に記載の方法。
[22]上記二本鎖分子が一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、
[A]は、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
[B]は介在一本鎖であり、
[A’]は[A]で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む前記アンチセンス鎖である)を有する、[21]に記載の方法。
[23]二本鎖分子が、分子の他にトランスフェクション増強剤と細胞浸透剤とを含む組成物中に含有される、[1]に記載の方法。
[1]TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する細胞の成長を阻害若しくは低減する方法、又はTBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌を治療若しくは予防する方法であって、該方法が少なくとも1つの二本鎖分子を与える段階を含み、該二本鎖分子が細胞に導入され、該TBC1D7遺伝子のインビボ発現を阻害又は低減する、方法。
[2]上記二本鎖分子が、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される標的配列と配列同一性を共有する、又はこれに対して相補的であるmRNAで作用する、[1]に記載の方法。
[3]上記二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖が、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、[2]に記載の方法。
[4]複数の二本鎖分子が投与される、[1]に記載の方法。幾つかの実施形態では、二本鎖分子は異なる核酸配列を含む。
[5]複数の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、[4]に記載の方法。
[6]二本鎖分子が約100ヌクレオチド長未満である、[1]に記載の方法。
[7]上記二重鎖分子のセンス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約75ヌクレオチド長未満の二重鎖分子を形成する、[6]に記載の方法。
[8]上記二重鎖分子のセンス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約50ヌクレオチド長未満の二重鎖分子を形成する、[7]に記載の方法。
[9]上記二重鎖分子のセンス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約25ヌクレオチド長未満の二重鎖分子を形成する、[8]に記載の方法。
[10]上記二重鎖分子のセンス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約19〜約25ヌクレオチド長の間の二重鎖分子を形成する、[9]に記載の方法。
[11]上記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一オリゴヌクレオチドから成る、[1]に記載の方法。
[12]上記二本鎖分子が一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、
[A]は、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
[B]は介在一本鎖であり、
[A’]は[A]で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む前記アンチセンス鎖である)を有する、[11]に記載の方法。
[13]二本鎖分子がRNAを含む、[1]に記載の方法。
[14]二本鎖分子がDNAとRNAとの両方を含む、[1]に記載の方法。
[15]DNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[14]に記載の方法。
[16]センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、DNAとRNAとから成る、[15]に記載の方法。
[17]二本鎖分子がDNAとRNAとのキメラである、[14]に記載の方法。
[18]センス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの1つ又は両方の5’末端に隣接する領域がRNAから成る、[17]に記載の方法。
[19]隣接領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[18]に記載の方法。
[20]二本鎖分子が3’オーバーハングを含有する、[1]に記載の方法。
[21]二本鎖分子がベクターによってコードされる、[1]に記載の方法。
[22]上記二本鎖分子が一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、
[A]は、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
[B]は介在一本鎖であり、
[A’]は[A]で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む前記アンチセンス鎖である)を有する、[21]に記載の方法。
[23]二本鎖分子が、分子の他にトランスフェクション増強剤と細胞浸透剤とを含む組成物中に含有される、[1]に記載の方法。
本方法は以下でより詳細に説明される。
TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する細胞の成長は、細胞を、TBC1D7遺伝子に対する二本鎖分子、分子を発現するベクター、又はこれを含む組成物に接触させることによって阻害される。さらに細胞を、トランスフェクション剤に接触させる。好適なトランスフェクション剤は当該技術分野で既知である。「細胞成長の阻害」という語句は、細胞が、分子に曝露されない細胞に比べて、より遅い速度で増殖するか、又は生存率が低減することを示す。細胞成長は、例えばMTT細胞増殖アッセイを用いた当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現又は過剰発現していれば、いずれかの種類の細胞の成長も本発明に従って抑制することができる。例示的な細胞としては癌細胞が挙げられる。したがって、TBC1D7遺伝子に関連する疾患を患う又は発症する危険性がある患者は、少なくとも1つの本発明の二本鎖分子、少なくとも1つの分子を発現する少なくとも1つのベクター、又は少なくとも1つの分子を含む少なくとも1つの組成物を投与することによって治療することができる。例えば、癌患者は本方法に従って治療することができる。癌の種類は、診断される特定種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定することができる。幾つかの実施形態では、本方法によって治療される患者は、RT−PCR、ハイブリダイゼーション又はイムノアッセイによって、患者由来の生検材料で、TBC1D7遺伝子の(過剰)発現を検出することによって選択される。幾つかの実施形態では、本発明の治療の前に、対象由来の生検標本が、当該技術分野で既知の方法、例えば免疫組織化学解析、ハイブリダイゼーション又はRT−PCRによって、TBC1D7遺伝子を過剰発現することが確認される(実施例1における(b)半定量RT−PCR、(c)ノーザンブロット分析、(e)ウェスタンブロット法、又は(f)免疫組織化学を参照されたい)。
細胞成長を阻害又は低減し、それにより癌を治療する本方法によれば、複数の二本鎖分子(又はこれを発現するベクター又はこれを含有する組成物)を投与する場合、それぞれの分子は、同じ遺伝子の異なる標的配列、又は異なる遺伝子の異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば、方法は、同じTBC1D7遺伝子転写産物に指向性を有する異なる二本鎖分子を利用することができる。代替的に例えば、方法は、同じTBC1D7遺伝子から選択される1つ、2つ又はそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を利用することができる。
細胞成長を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、分子と対応するmRNA転写産物との結合を達成する形態で、細胞に直接導入することができる。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするDNAは、ベクターとして細胞に導入することができる。二本鎖分子及びベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばFuGENE(Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)及びNucleofector(和光純薬工業株式会社)を利用することができる。
治療は、臨床的利点、例えばTBC1D7遺伝子の発現の低減、又は対象における癌のサイズ、有病率若しくは転移能の減少をもたらすかどうかで有効であるかを求められる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、治療が癌の形成を遅らせる若しくは防ぐか、又は癌の臨床症状を緩和するという意味である。有効性(Efficaciousness)は、特定の腫瘍型を診断又は治療する任意の既知の方法に関連して求められる。
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量で標的mRNA(TBC1D7遺伝子転写産物)を分解することが理解される。理論に束縛されないが、本発明の二本鎖分子によって、触媒的に標的mRNAの分解が起こると考えられている。したがって、標準的な癌治療に比べて、治療効果を発揮するために癌部位に又はその近くに送達される必要のある二本鎖分子は、有意に少ない。
当業者は、因子、例えば対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状及び他の状態;投与経路;並びに投与が局所的又は全身的のいずれであるかを考慮して、所定の対象に投与されるべき、本発明の二本鎖分子の有効量を容易に求めることができる。概して、有効量の本発明の二本鎖分子は、癌部位に又はその近くに、細胞内濃度が約1ナノモル(nM)〜約100nM、例えば約2nM〜約50nM、例えば約2.5nM〜約10nMの二本鎖分子を含む。より多くの又はより少ない量の二本鎖分子を投与できることが考慮される。
本方法は、癌、例えばTBC1D7遺伝子の過剰発現によって生じる、又はTBC1D7遺伝子によって媒介される癌、例えば肺癌又は食道癌の成長又は転移を阻害するのに使用することができる。特に、TBC1D7に関して配列番号18及び19から成る群から選択される標的配列に指向性を有する二本鎖分子は、癌の治療のための使用が見出される。
癌、例えばTBC1D7遺伝子によって促進される癌を治療するために、本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子とは異なる医薬品と併用して対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子は、癌を治療するために設計される別の治療法と併用して対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、癌を治療する又は癌転移を予防するのに現在利用されている治療法(例えば放射線療法、外科的手術及び化学療法剤(例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、5−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン又はタモキシフェン)を用いた治療)と併用して投与することができる。
本方法において、二本鎖分子は、送達試薬と共にネイキッド二本鎖分子、又は該二本鎖分子を発現する組換えプラスミド若しくはウイルスベクターとしてのいずれかで対象に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と共に投与するのに好適な送達試薬としては、Mirus Transit TKO脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、又はポリカチオン(例えばポリリシン)又はリポソームが挙げられる。一実施形態では、送達試薬はリポソームである。リポソームは、特定の組織、例えば網膜組織又は腫瘍組織への二本鎖分子の送達に役立ち、二本鎖分子の血液半減期も増大させ得る。本発明での使用に好適なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、概してこれには、中性又は負に帯電したリン脂質とステロール、例えばコレステロールとが含まれる。一般的には、所望のリポソームのサイズ及び血流中におけるリポソームの半減期などの因子を考慮して、脂質の選択が導かれる。リポソームを調製するのに、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、及び米国特許第4,235,871号明細書、同第4,501,728号明細書、同第4,837,028号明細書、及び同第5,019,369号明細書(その開示全体が参照により本明細書に引用される)で記載されるような様々な方法が知られている。
幾つかの実施形態において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームを癌部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍又は小胞内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原又は内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体のための使用が見出される。幾つかの実施形態では、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン阻害部分を有することによって、単核マクロファージ及び網内系によるクリアランスを避けるように修飾される。一実施形態では、本発明のリポソームは、オプソニン阻害部分とリガンドとの両方を含み得る。
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン阻害部分は、例えば脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、又は膜脂質の活性基への直接結合によって、膜と化学的に又は物理的に接着する場合に、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン阻害親水性ポリマーは、例えば米国特許第4,920,016号明細書(その開示全体が参照により本明細書に援用される)に記載されるように、マクロファージ−単球系(「MMS」)及び網内系(「RES」)によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもかなり長く循環血液中に留まる。このため、かかるリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
ステルスリポソームは、多孔性又は「漏出性(leaky)」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。したがって、かかる微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は効率的にこれらのリポソームを集積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、RESによる取り込みの低減が、肝臓及び脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
リポソームを修飾するのに好適なオプソニン阻害部分は、分子量が約500ダルトン〜約40000ダルトン、例えば約2000ダルトン〜約20000ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。かかるポリマーとしては、ポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレングリコール(PPG)誘導体;例えばメトキシPEG又はPPG、及びPEG又はPPGステアレート;合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド又はポリN−ビニルピロリドン;直鎖、分岐又は樹状のポリアミドアミン;ポリアクリル酸;多価アルコール、例えばカルボン酸基又はアミノ基が化学結合したポリビニルアルコール及びポリキシリトール、並びにガングリオシド、例えばガングリオシドGM1が挙げられる。PEG、メトキシPEG若しくはメトキシPPGのコポリマー、又はそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン阻害ポリマーは、PEGと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン阻害ポリマーは、アミノ酸又はカルボン酸を含有する天然多糖(例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン);アミノ化多糖又はオリゴ糖(直鎖又は分岐);又はカルボン酸基の連結を有するカルボン酸の誘導体と反応させたカルボキシル化多糖又はカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
幾つかの実施形態では、オプソニン阻害部分はPEG、PPG又はその誘導体である。PEG又はPEG誘導体によって変性したリポソームは「PEG化リポソーム」と呼ばれることもある。
オプソニン阻害部分は、多くの既知の技法のいずれか1つによってリポソーム膜と結合することができる。例えば、PEGのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、60℃でNa(CN)BH3及び溶媒混合物(例えばテトラヒドロフランと水とを30:12の比で)を用いて還元アミノ化によってステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で検討される。少なくとも1つの本発明の二本鎖分子を発現するかかるベクターもまた、直接又は好適な送達試薬(Mirus Transit LT1脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、又はポリカチオン(例えばポリリシン)又はリポソームを含む)と共に投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者の癌領域に送達する方法は当該技術分野内である。
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子を癌部位に送達するのに好適な任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば、二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、又は他の好適な非経口投与経路若しくは腸内投与経路によって投与することができる。
好適な腸内投与経路としては、経口、直腸又は鼻腔送達が挙げられる。
好適な非経口投与経路としては、静脈内投与(例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入及び血管系へのカテーテル点滴);傍組織及び組織内注射(例えば傍腫瘍及び腫瘍内注射);皮下注入を含む皮下注射又は皮下沈着(例えば浸透圧ポンプによって);例えばカテーテル若しくは他の留置装置(placement device)(例えば、多孔性、非孔性又はゼラチン様材料を含む、坐剤又はインプラント)による癌部位の領域又はその近くの領域への直接適用;並びに吸入が挙げられる。幾つかの実施形態では、二本鎖分子又はベクターの注射又は注入は、癌の部位で又はその近くで行われる。
本発明の二本鎖分子は、単回投与又は複数回の投与で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続投与で行うか、又は複数回の注入によって送達することができる。薬剤の注射は、癌部位の組織、又は癌部位の近くの組織に直接行うことができる。癌部位の組織に又は癌部位の近くの組織に薬剤を複数回注射することによって、投与することができる。
当業者は容易に、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するのに適当な投薬計画(dosage regimen)を決定することもできる。例えば、二本鎖分子は、例えば癌部位での又はその近くでの単回注射又は沈着として対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子は、約3日〜約28日、例えば約7日〜約10日の間、1日1回又は2回、対象に投与することができる。例示的な一投与計画では、二本鎖分子は7日間、1日1回、癌部位に又はその近くに注射される。投与計画に複数回の投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことが理解される。
(iv)組成物
さらに本発明は、分子をコードする、本発明の二本鎖分子又はベクターの少なくとも1つを含む医薬組成物を提供する。特に本発明は、以下の組成物[1]〜[24]を提供する:
[1]TBC1D7遺伝子を発現する細胞の成長を阻害若しくは低減する組成物、又はTBC1D7遺伝子を発現する癌を治療若しくは予防する組成物であって、該組成物が少なくとも1つの二本鎖分子を含み、該二本鎖分子が細胞に導入され、該遺伝子のインビボ発現を阻害又は低減する、組成物。
[2]上記二本鎖分子が、TBC1D7に関して配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される標的配列と適合するmRNAで作用する、[1]に記載の組成物。
[3]上記二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖が、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、[2]に記載の組成物。
治療される癌が、TBC1D7遺伝子の過剰発現によって生じる、又はTBC1D7遺伝子によって媒介される癌である、[1]に記載の組成物。
[4]治療される癌が肺癌又は食道癌である、[1]に記載の組成物。
[5]肺癌が小細胞肺癌又は非小細胞肺癌である、[4]に記載の組成物。
[6]組成物が複数種類の二本鎖分子を含有する、[1]に記載の組成物。
[7]複数種類の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、[6]に記載の組成物。
[8]二本鎖分子のセンス鎖が約100ヌクレオチド長未満である、[1]に記載の組成物。
[9]二本鎖分子のセンス鎖が約75ヌクレオチド長未満である、[8]に記載の組成物。
[10]二本鎖分子のセンス鎖が約50ヌクレオチド長未満である、[9]に記載の組成物。
[11]二本鎖分子のセンス鎖が約25ヌクレオチド長未満である、[10]に記載の組成物。
[12]二本鎖分子のセンス鎖が約19〜約25ヌクレオチド長の間である、[11]に記載の組成物。
[13]上記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一オリゴヌクレオチドから成る、[1]に記載の組成物。
[14]上記二本鎖分子が一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、
[A]は、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
[B]は介在一本鎖であり、
[A’]は[A]で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である)を有する、[13]に記載の組成物。
[15]二本鎖分子がRNAを含む、[1]に記載の組成物。
[16]二本鎖分子がDNAとRNAとを含む、[1]に記載の組成物。
[17]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[16]に記載の組成物。
[18]センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、DNAとRNAとから成る、[17]に記載の組成物。
[19]二本鎖分子がDNAとRNAとのキメラである、[18]に記載の組成物。
[20]センス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの1つ又は両方の5’末端に隣接する少なくとも1つの領域がRNAから成る、[19]に記載の組成物。
[21]隣接領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[20]に記載の組成物。
[22]二本鎖分子が3’オーバーハングを含有する、[1]に記載の組成物。
[23]二本鎖分子がベクターによってコードされ、組成物に含有される、[1]に記載の組成物。
[24]トランスフェクション増強剤と、細胞浸透剤と、薬学的に許容可能な担体とをさらに含む、[1]に記載の組成物。
さらに本発明は、分子をコードする、本発明の二本鎖分子又はベクターの少なくとも1つを含む医薬組成物を提供する。特に本発明は、以下の組成物[1]〜[24]を提供する:
[1]TBC1D7遺伝子を発現する細胞の成長を阻害若しくは低減する組成物、又はTBC1D7遺伝子を発現する癌を治療若しくは予防する組成物であって、該組成物が少なくとも1つの二本鎖分子を含み、該二本鎖分子が細胞に導入され、該遺伝子のインビボ発現を阻害又は低減する、組成物。
[2]上記二本鎖分子が、TBC1D7に関して配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される標的配列と適合するmRNAで作用する、[1]に記載の組成物。
[3]上記二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖が、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、[2]に記載の組成物。
治療される癌が、TBC1D7遺伝子の過剰発現によって生じる、又はTBC1D7遺伝子によって媒介される癌である、[1]に記載の組成物。
[4]治療される癌が肺癌又は食道癌である、[1]に記載の組成物。
[5]肺癌が小細胞肺癌又は非小細胞肺癌である、[4]に記載の組成物。
[6]組成物が複数種類の二本鎖分子を含有する、[1]に記載の組成物。
[7]複数種類の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、[6]に記載の組成物。
[8]二本鎖分子のセンス鎖が約100ヌクレオチド長未満である、[1]に記載の組成物。
[9]二本鎖分子のセンス鎖が約75ヌクレオチド長未満である、[8]に記載の組成物。
[10]二本鎖分子のセンス鎖が約50ヌクレオチド長未満である、[9]に記載の組成物。
[11]二本鎖分子のセンス鎖が約25ヌクレオチド長未満である、[10]に記載の組成物。
[12]二本鎖分子のセンス鎖が約19〜約25ヌクレオチド長の間である、[11]に記載の組成物。
[13]上記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一オリゴヌクレオチドから成る、[1]に記載の組成物。
[14]上記二本鎖分子が一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’(式中、
[A]は、配列番号3、配列番号4、配列番号18及び配列番号19から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
[B]は介在一本鎖であり、
[A’]は[A]で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である)を有する、[13]に記載の組成物。
[15]二本鎖分子がRNAを含む、[1]に記載の組成物。
[16]二本鎖分子がDNAとRNAとを含む、[1]に記載の組成物。
[17]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[16]に記載の組成物。
[18]センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、DNAとRNAとから成る、[17]に記載の組成物。
[19]二本鎖分子がDNAとRNAとのキメラである、[18]に記載の組成物。
[20]センス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの1つ又は両方の5’末端に隣接する少なくとも1つの領域がRNAから成る、[19]に記載の組成物。
[21]隣接領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[20]に記載の組成物。
[22]二本鎖分子が3’オーバーハングを含有する、[1]に記載の組成物。
[23]二本鎖分子がベクターによってコードされ、組成物に含有される、[1]に記載の組成物。
[24]トランスフェクション増強剤と、細胞浸透剤と、薬学的に許容可能な担体とをさらに含む、[1]に記載の組成物。
本方法は以下でより詳細に説明される。
本発明の二本鎖分子は、当該技術分野で既知の技法に従って、対象に投与する前に医薬組成物として配合することができる。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用されるように、「医薬製剤(pharmaceutical formulation)」は、ヒト及び獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.(1985)(その開示全体が参照により本明細書に援用される)に記載のように当該技術分野内である。
本発明の医薬製剤は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合して、本発明の二本鎖分子又はこれをコードするベクターの少なくとも1つ(例えば0.1重量%〜90重量%)、又は該分子の生理学的に許容可能な塩を含む。例示的な生理学的に許容可能な担体媒体としては例えば、水、緩衝水、生理食塩水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸等が挙げられる。
本発明によれば、組成物は、複数種類の二本鎖分子を含有することができ、その分子のそれぞれが、TBC1D7遺伝子の同じ標的配列又は異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば、組成物は、TBC1D7遺伝子に指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。代替的に、例えば組成物は、TBC1D7遺伝子から選択される、1つ、2つ又はそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。
さらに本発明の組成物は、1つ又は複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有することができる。例えばベクターは、1つ、2つ又は幾つかの種類の本発明の二本鎖分子をコードすることができる。代替的に本発明の組成物は、複数種類のベクターを含有することができ、そのベクターのそれぞれが異なる二本鎖分子をコードする。その上、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「癌を治療する方法」の項を参照されたい。
本発明の医薬組成物は、従来の薬学的賦形剤及び/又は添加剤も含み得る。好適な薬学的賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤及びpH調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性がある緩衝剤(例えば塩酸トロメタミン)、キレート剤(chelant)の添加物(例えばDTPA又はDTPA−ビスアミド)又はカルシウム錯体(例えばカルシウムDTPA、CaNaDTPA−ビスアミド)、又は任意でカルシウムキレート塩若しくはナトリウム塩の添加物(例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム)が挙げられる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、又は凍結乾燥されていてもよい。
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
例えば、経口投与するための固体医薬組成物は、上記で列挙された担体及び賦形剤のいずれかと、10%〜95%、例えば25%〜75%の1つ又は複数の本発明の二本鎖分子とを含み得る。エアロゾル(吸入)投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソームに封入される0.01重量%〜20重量%、例えば1重量%〜10重量%の1つ又は複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達ではレシチンが含まれ得る。
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しなければ、他の薬学的に活性のある成分を含有することができる。例えば組成物は、癌を治療するのに従来使用される化学療法剤を含有することができる。
本発明は、TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌を治療するための医薬組成物を製造する際の本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、肺癌及び食道癌を含む、TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌を治療するための医薬組成物を製造するための、TBC1D7遺伝子を過剰発現する細胞での該遺伝子の(過剰)発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用であって、この分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、配列番号3及び/又は配列番号4の配列を標的とする、二本鎖核酸分子の使用に関する。
本発明はまた、TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌を治療する際に用いられる本発明の二本鎖核酸分子を提供する。
本発明はさらに、TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスであって、この方法又はプロセスが、TBC1D7遺伝子を過剰発現する細胞で活性成分としての該遺伝子の(過剰)発現を阻害する二本鎖核酸分子に、薬学的に又は生理学的に許容可能な担体を配合する段階を含み、この分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、配列番号3及び/又は配列番号4の配列を標的とする、方法又はプロセスを提供する。
本発明は、TBC1D7遺伝子を(過剰)発現する癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスであって、この方法又はプロセスが、活性成分を薬学的に又は生理学的に許容可能な担体と混和させる段階を含み、活性成分は、TBC1D7遺伝子を過剰発現する細胞で該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、この分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、配列番号3及び/又は配列番号4の標的配列を標的とする、方法又はプロセスも提供する。
(5)TBC1D7遺伝子媒介性癌を診断する方法
TBC1D7遺伝子の発現は、対応する正常組織に比べて、肺癌及び食道癌の組織で特に上昇することが見出された(図1)。したがって、本明細書で同定された遺伝子、並びにその転写産物及び翻訳産物は、TBC1D7遺伝子によって媒介される癌に対するマーカーとして診断有用性を有し、及び癌を患っている疑いがある患者由来の試料においてTBC1D7遺伝子の発現を測定することにより診断有用性を有する。これらの癌は、被験体由来の試料と正常な試料の間のTBC1D7の発現レベルを比較することによって、診断する又は検出することができる。特に本発明は、対象においてTBC1D7遺伝子の発現レベルを測定することによって、TBC1D7遺伝子によって媒介される癌を診断又は検出する方法を提供する。本方法によって診断又は検出することができるTBC1D7遺伝子促進癌としては、肺癌及び食道癌が挙げられる。肺癌としては、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌が挙げられる。
TBC1D7遺伝子の発現は、対応する正常組織に比べて、肺癌及び食道癌の組織で特に上昇することが見出された(図1)。したがって、本明細書で同定された遺伝子、並びにその転写産物及び翻訳産物は、TBC1D7遺伝子によって媒介される癌に対するマーカーとして診断有用性を有し、及び癌を患っている疑いがある患者由来の試料においてTBC1D7遺伝子の発現を測定することにより診断有用性を有する。これらの癌は、被験体由来の試料と正常な試料の間のTBC1D7の発現レベルを比較することによって、診断する又は検出することができる。特に本発明は、対象においてTBC1D7遺伝子の発現レベルを測定することによって、TBC1D7遺伝子によって媒介される癌を診断又は検出する方法を提供する。本方法によって診断又は検出することができるTBC1D7遺伝子促進癌としては、肺癌及び食道癌が挙げられる。肺癌としては、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌が挙げられる。
代替的に、本発明は、対象由来の組織試料における癌細胞を検出又は同定するための方法であって、対象由来の組織試料におけるTBC1D7遺伝子の発現レベルを決定する段階を含み、ここで、前記遺伝子の正常対照レベルと比較した前記発現レベルの上昇によって組織中の癌細胞の存在又はその疑いが示される、方法も提供する。好ましくは、組織は肺組織又は食道組織である。
本発明に従って、対象の状態を試験する中間的な結果が与えられ得る。かかる中間的な結果は、医者、看護師又は他の療法士(practitioner)が、対象が疾患を患っていると診断するのを補助する付加的情報と組み合わせることができる。代替的に、本方法は、対象から得た組織において癌性細胞を検出するため、及び対象が疾患を患っていることを診断するのに有用な情報を医者に与えるために使用することができる。
例えば、本発明に従って、対象から得た組織中の癌細胞の存在に関して疑いがある場合には、TBC1D7遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理、血液中の公知の腫瘍マーカーのレベル、及び対象の臨床経過等を含む、前記疾患の種々の局面も合わせて考慮することにより、臨床的決断に至ることができる。例えば、いくつかの周知の血液中の肺癌及び食道癌の診断マーカーには、ACT、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CA602、CEA、DUPAN-2、IAP、KMO-1、NSE、SCC、SLX、Span-1、STN、TPA、サイトケラチン19断片及びCYFRA 21-1が含まれる。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の成果は、対象の病状のさらなる診断のための中間的な結果としての役を果たす。
別の態様において、本発明は、癌の診断マーカーを検出するための方法であって、対象由来の生物試料におけるTBC1D7遺伝子の発現を、癌(例えば、肺癌又は食道癌)の診断マーカーとして検出する段階を含む方法を提供する。
特に本発明は、以下の方法[1]〜[10]を提供する:
[1]癌、例えばTBC1D7遺伝子によって媒介又は促進される癌を診断する方法であって、
(a)生物試料において、TBC1D7遺伝子の発現レベルを検出する段階と、
(b)遺伝子の正常対照レベルに対する発現レベルの増大を疾患と関連付ける段階とを含む、方法。
[2]発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも10%大きい、[1]に記載の方法。
[3]発現レベルが、
(a)TBC1D7ポリペプチドをコードするmRNAを検出すること、
(b)TBC1D7ポリペプチドを検出すること、並びに
(c)TBC1D7ポリペプチドの生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか1つによって検出される、[2]に記載の方法。
癌がTBC1D7遺伝子の過剰発現によって生じるか、又はTBC1D7遺伝子によって媒介若しくは促進される、[1]に記載の方法。
[4]癌が肺癌又は食道癌である、[1]に記載の方法。
[5]肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、[4]に記載の方法。
[6]発現レベルが、プローブと、TBC1D7ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物とのハイブリダイゼーションを検出することによって求められる、[3]に記載の方法。
[7]発現レベルが、TBC1D7ポリペプチドに対する抗体の結合を検出することによって求められる、[3]に記載の方法。
[8]生物試料が生検材料、痰又は血液を含む、[1]に記載の方法。
[9]対象から得た生物試料が、上皮細胞、血清、胸水又は食道粘液を含む、[1]に記載の方法。
[10]対象から得た生物試料が癌細胞を含む、[1]に記載の方法。
[11]対象から得た生物試料が癌性上皮細胞を含む、[1]に記載の方法。
[1]癌、例えばTBC1D7遺伝子によって媒介又は促進される癌を診断する方法であって、
(a)生物試料において、TBC1D7遺伝子の発現レベルを検出する段階と、
(b)遺伝子の正常対照レベルに対する発現レベルの増大を疾患と関連付ける段階とを含む、方法。
[2]発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも10%大きい、[1]に記載の方法。
[3]発現レベルが、
(a)TBC1D7ポリペプチドをコードするmRNAを検出すること、
(b)TBC1D7ポリペプチドを検出すること、並びに
(c)TBC1D7ポリペプチドの生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか1つによって検出される、[2]に記載の方法。
癌がTBC1D7遺伝子の過剰発現によって生じるか、又はTBC1D7遺伝子によって媒介若しくは促進される、[1]に記載の方法。
[4]癌が肺癌又は食道癌である、[1]に記載の方法。
[5]肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、[4]に記載の方法。
[6]発現レベルが、プローブと、TBC1D7ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物とのハイブリダイゼーションを検出することによって求められる、[3]に記載の方法。
[7]発現レベルが、TBC1D7ポリペプチドに対する抗体の結合を検出することによって求められる、[3]に記載の方法。
[8]生物試料が生検材料、痰又は血液を含む、[1]に記載の方法。
[9]対象から得た生物試料が、上皮細胞、血清、胸水又は食道粘液を含む、[1]に記載の方法。
[10]対象から得た生物試料が癌細胞を含む、[1]に記載の方法。
[11]対象から得た生物試料が癌性上皮細胞を含む、[1]に記載の方法。
癌を診断する方法が以下でより詳細に説明される。
本方法によって診断される対象は哺乳動物であり得る。例示的な哺乳動物としては例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが挙げられるが、これらに限定されない。
本方法を実施する際に、生物試料を、診断する対象から採取し、診断を実施する。任意の生体材料は、TBC1D7遺伝子の目的となる転写産物又は翻訳産物を含んでいれば、測定のための生物試料として使用することができる。生物試料としては、身体組織及び体液、例えば血液(例えば血清、痰、尿及び胸水)が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、生物試料は、上皮細胞、例えば癌性上皮細胞又は癌性である疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含有する。さらに、必要であれば、細胞を得られた身体組織及び体液から精製した後、生物試料として使用することができる。
本発明に従って、対象から得た生物試料におけるTBC1D7遺伝子の発現レベルが求められる。発現レベルは、当該技術分野で既知の方法を用いて、転写(核酸)産物レベルで求めることができる。例えば、TBC1D7遺伝子のmRNAは、ハイブリダイゼーション法(例えばノーザンブロット分析)によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップ又はアレイで実施することができる。アレイの使用は、TBC1D7遺伝子を含む複数の遺伝子(例えば様々な癌特異的遺伝子)の発現レベルを検出するためのものであり得る。当業者は、TBC1D7(配列番号1、GenBankアクセッション番号NM_016495)の配列情報を利用して、かかるプローブを調製することができる。例えば、TBC1D7遺伝子のcDNAはプローブとして使用することができる。必要であれば、プローブは、好適な標識、例えば染料、蛍光色素及びアイソトープで標識することができ、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズされた標識の強度として検出することができる(実施例1における(c)ノーザンブロット分析を参照されたい)。
さらに、TBC1D7遺伝子の転写産物は、増幅ベースの検出法(例えばRT−PCR)でプライマーを用いて定量することができる。かかるプライマーは、利用可能な遺伝子の配列情報に基づき調製することもできる。例えば、実施例で使用されるプライマー(配列番号5及び配列番号6)は、RT−PCR又はノーザンブロット分析による検出に利用することができるが、本発明はそれらに限定されない(実施例1における(b)半定量RT−PCR及び(c)ノーザンブロット分析を参照されたい)。
特に、本方法で使用されるプローブ又はプライマーは、ストリンジェント、中程度ストリンジェント、又は低ストリンジェントの条件下でTBC1D7遺伝子のmRNAとハイブリダイズする。
代替的に翻訳産物は、本発明の診断のために検出することができる。例えば、TBC1D7タンパク質の量を求めることができる。翻訳産物としてタンパク質の量を求める方法としては、タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片(例えばキメラ抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)は、断片がTBC1D7タンパク質との結合能を保持していれば、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる(定義における(2)抗体を参照されたい)。
その翻訳産物に基づきTBC1D7遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、TBC1D7タンパク質に対する抗体を用いて、免疫組織化学解析によって染色の強度を観察することができる。即ち、強い染色の観察は、タンパク質の存在の増大と同時に、TBC1D7遺伝子の高い発現レベルとを示す(実施例1における(g)免疫組織化学及び組織マイクロアレイの解析を参照されたい)。
さらに、診断の正確性を改善するために、TBC1D7遺伝子の発現レベルに加えて、他の癌関連遺伝子、例えば癌によって異なる発現をすることが知られる遺伝子の発現レベルも求めることができる。
生物試料においてTBC1D7遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、(例えば正常細胞又は非癌性細胞における)対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルから、例えば10%、25%若しくは50%増大していれば、又は1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超若しくはそれ以上に増大していれば、増大していると考えることができる。
疾患状態(癌性又は非癌性)が既知の対象(複数可)からこれまでに採取し、保管した試料(複数可)を使用することによって、対照レベルを試験生物試料と同時に求めることができる。代替的に、疾患状態が既知の対象の試料において、これまでに測定されたTBC1D7遺伝子の発現レベル(複数可)を解析することによって得られたデータに基づき、統計的方法によって対照レベルを求めることができる。さらに、対照レベルは、これまでに試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであり得る。その上、本発明の一態様によれば、生物試料におけるTBC1D7遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から求められる複数の対照レベルと比較することができる。幾つかの実施形態では、患者から得た生物試料のものと同程度の組織型に由来する参照試料から求められる対照レベルが用いられる。幾つかの実施形態では、疾患状態が既知である集団におけるTBC1D7遺伝子の発現レベルの標準値が用いられる。標準値は、当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±2S.D.又は平均±3S.D.の範囲を標準値として使用することができる。
本発明に関して、癌性でないことが既知の生物試料から求められる対照レベルは「正常対照レベル」と呼ばれる。他方で、対照レベルが癌性生物試料から求められる場合、これは「癌性対照レベル」と呼ばれる。
TBC1D7遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、又は癌性対照レベルと同程度である場合、対象は、癌、例えばTBC1D7遺伝子の過剰発現によって媒介される若しくはこれから生じる癌を患っているか又は発症する危険性があると診断され得る。さらに、TBC1D7遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似は、対象が、癌、例えばTBC1D7遺伝子の過剰発現によって媒介される若しくはこれから生じる癌を患っているか又は発症する危険性があることを示す。
試験生物試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違は、発現レベルが細胞の癌性状態又は非癌性状態に応じて変わらない対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子としては、βアクチン、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ及びリボソームタンパク質P1が挙げられるが、これらに限定されない。
(6)TBC1D7遺伝子媒介性癌の予後を評価する方法
本発明は、TBC1D7の(過剰)発現は、TBC1D7遺伝子媒介性癌(例えば肺癌又は食道癌)の患者の予後が悪くなることに有意に関連があるという発見に一部基づいている。したがって本発明は、患者の生物試料においてTBC1D7遺伝子の発現レベルを検出すること、検出発現レベルを対照レベルと比較すること、及び予後不良(poor prognosis)(低い生存率)の指標として、対照レベルに対する発現レベルの増大を求めることによって、TBC1D7遺伝子の過剰発現によって媒介される若しくはこれから生じる癌(例えば肺癌及び/又は食道癌)の患者の予後を判定する又は評価する方法を提供する。
本発明は、TBC1D7の(過剰)発現は、TBC1D7遺伝子媒介性癌(例えば肺癌又は食道癌)の患者の予後が悪くなることに有意に関連があるという発見に一部基づいている。したがって本発明は、患者の生物試料においてTBC1D7遺伝子の発現レベルを検出すること、検出発現レベルを対照レベルと比較すること、及び予後不良(poor prognosis)(低い生存率)の指標として、対照レベルに対する発現レベルの増大を求めることによって、TBC1D7遺伝子の過剰発現によって媒介される若しくはこれから生じる癌(例えば肺癌及び/又は食道癌)の患者の予後を判定する又は評価する方法を提供する。
本明細書中で、「予後」という用語は、疾患の推定転帰、並びに症例の性質及び症状によって示されるような、疾患からの回復の可能性(prospect)に関する予測(forecast)を表す。したがって、良好ではない、陰性又は不良である予後は、治療後の生存期間又は生存率の低下によって規定される。反対に、陽性、良好な(favorable, or good)予後は、治療後の生存期間又は生存率の上昇によって規定される。「予後を評価する」という用語は、患者の癌の今後の転帰(例えば悪性度、癌の治癒見込み、推定の生存時間等)によって、所定の検出又は測定を予測する(predicting, forecasting)又は相互に関連付ける能力を表す。例えば、経時的にTBC1D7の発現レベルを求めることで、患者に対する転帰(例えば悪性度の増減、癌の進行度(grade)の増減、癌の治癒見込み、生存率等)の予測が可能となる。本発明に関して、「予後を評価する(判定する)」という語句は、癌の進行、特に癌の再発、転移拡散及び疾患再発の予測及び見込み解析を包含することが意図される。本発明の予後を判定する方法は、治療的介入、診断基準、例えば疾患の病期分類、並びに腫瘍性疾患の転移又は再発に関する疾患モニタリング及び監視を含む、治療法について結論を出す際に臨床的に使用されることが意図される。
本方法に使用される患者から得た生物試料は、TBC1D7遺伝子を試料で検出することができれば、判定される対象由来の任意の試料であってもよい。幾つかの実施形態では、生物試料は、肺細胞(肺又は食道から得られる細胞)を含む。さらに、生物試料としては、体液、例えば痰、血液、血清、血漿、胸水、食道粘液等が挙げられる。その上、試料は組織から精製される細胞であってもよい。生物試料は、治療前、治療中及び/又は治療後を含む様々な時点で、患者から得ることができる。
本発明に従って、患者から得た生物試料において測定されるTBC1D7遺伝子の発現レベルが高ければ、治療後の寛解、回復及び/又は生存に関する予後が不良になり且つ不良な臨床転帰の見込みが高くなることが示された。したがって、本方法によれば、比較に使用される「対照レベル」は例えば、治療後に癌の良好な又は陽性の予後を示した個体又は個体集団において、任意の種類の治療の前に検出されたTBC1D7遺伝子の発現レベルであり、本明細書で「良好な予後対照レベル」とも称される。代替的に、「対照レベル」は、治療後に癌の不良な又は陰性の予後を示した個体又は個体集団において、任意の種類の治療の前に検出されたTBC1D7遺伝子の発現レベルであり、本明細書で「不良な予後対照レベル」とも称される。「対照レベル」は、単一の参照集団に由来する単一発現パターン又は複数の発現パターンである。したがって、対照レベルは、癌の患者、又は疾患状態(良好又は不良な予後)が既知の患者の集団における任意の種類の治療の前に検出されたTBC1D7遺伝子の発現レベルに基づき求めることができる。幾つかの実施形態では、癌は肺癌である。幾つかの実施形態では、疾患状態が既知の患者群においてTBC1D7遺伝子の発現レベルの標準値が用いられる。標準値は、当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±2S.D.又は平均±3S.D.の範囲を標準値として使用することができる。
対照レベルは、任意の種類の治療の前に、疾患状態(良好な予後又は不良な予後)が既知の癌患者(複数可)(対照又は対照群)からこれまでに採取及び保存された試料(複数可)を使用することによって、試験生物試料と同時に求めることができる。
代替的に、対照レベルは、対照群からこれまでに採取及び保存された試料におけるTBC1D7遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて統計的方法によって求めることができる。さらに、対照レベルは、これまでに試験された細胞又は患者由来の発現パターンのデータベースであり得る。その上、本発明の一態様によれば、生物試料におけるTBC1D7遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から求められる複数の対照レベルと比較することができる。幾つかの実施形態では、患者から得た生物試料のものと同程度の組織型に由来する参照試料から求められる対照レベルが用いられる。
本発明によれば、TBC1D7遺伝子の発現レベルと良好な予後対照レベルとの類似が患者のより良好な予後を示し、良好な予後対照レベルに対する発現レベルの増大が、治療後の寛解、回復、生存及び/又は臨床転帰に対する、より良好ではない不良な予後を示す。他方で、不良な予後対照レベルに対するTBC1D7遺伝子の発現レベルの低減が、患者のより良好な予後を示し、発現レベルと不良な予後対照レベルとの類似が治療後の寛解、回復、生存及び/又は臨床転帰に対する、より良好ではない不良な予後を示す。
生物試料におけるTBC1D7遺伝子の発現レベルは、対照レベルの1.0倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、又はそれ以上異なる場合に変化(即ち増大又は低減)していると考えられ得る。
試験生物試料レベルと対照レベルとの間の発現レベルの相違は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に正規化することができる。例えば、発現レベルが癌性細胞と非癌性細胞との間で異ならないことが知られるポリヌクレオチド(βアクチン、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ及びリボソームタンパク質P1をコードするものを含む)を、TBC1D7遺伝子の発現レベルを正規化するのに使用することができる。
発現レベルは、当該技術分野で既知の技法を用いて患者から得た生物試料において遺伝子転写産物を検出することによって求めることができる。本発明の方法によって検出される遺伝子転写産物には、転写産物及び翻訳産物、例えばmRNA及びタンパク質の両方が含まれる。例えば、TBC1D7遺伝子の転写産物は、遺伝子転写産物に対するTBC1D7遺伝子プローブを使用するハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション分析によって検出することができる。検出はクリップ又はアレイ上で行うことができる。TBC1D7遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルを検出するために、アレイを使用することができる。別の例として、TBC1D7遺伝子に特異的なプライマーを使用する増幅ベースの検出法、例えば逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を検出に利用することができる(実施例1における(b)半定量RT−PCRを参照されたい)。TBC1D7遺伝子に特異的なプローブ又はプライマーは、TBC1D7(配列番号1)の配列全体を参照することにより従来の技法を用いて設計及び調製することができる。例えば、実施例で使用されるプライマー(配列番号5及び配列番号6)は、RT−PCRによる検出に利用することができるが、本発明はそれらに限定されない。
特に、本発明の方法で使用されるプローブ又はプライマーは、ストリンジェント、中程度ストリンジェント、又は低ストリンジェントの条件下でTBC1D7遺伝子のmRNAとハイブリダイズする。本明細書で使用されるように、「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブ又はプライマーがその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況下で異なる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェント条件の温度は、規定のイオン強度及びpHで特定の配列のために、熱融解点(Tm)より約5℃低く選択される。Tmは、(規定のイオン強度、pH及び核酸濃度で)標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。一般的にTmでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの50%が平衡状態で占められる。典型的に、ストリンジェント条件は、塩濃度がpH7.0〜8.3で約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的に約0.01M〜1.0Mのナトリウムイオン(又はその塩)であり、温度が、短いプローブ又はプライマー(例えば10個〜50個のヌクレオチド)では少なくとも約30℃であり、長いプローブ又はプライマーでは少なくとも約60℃である。ストリンジェント条件は、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。
代替的に翻訳産物は、本発明の判定のために検出することができる。例えば、TBC1D7タンパク質の量を求めることができる。翻訳産物としてタンパク質の量を求める方法としては、TBC1D7タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片(例えばキメラ抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)は、断片がTBC1D7タンパク質との結合能を保持していれば、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる。その翻訳産物に基づきTBC1D7遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、TBC1D7タンパク質に対する抗体を用いて、免疫組織化学解析によって染色の強度を観察することができる。即ち、強い染色の観察は、TBC1D7タンパク質の存在の増大と同時に、TBC1D7遺伝子の高い発現レベルを示す。
さらに、TBC1D7タンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、TBC1D7遺伝子の発現レベルは、指標としてかかる細胞増殖活性を用いて求めることができる。例えば、TBC1D7を発現する細胞は、生物試料の存在下で調製及び培養し、それから増殖速度を検出すること又は細胞周期若しくはコロニー形成能を測定することによって、生物試料の細胞増殖活性を求めることができる。
その上、判定の正確性を改善するために、TBC1D7遺伝子の発現レベルに加えて、他の肺細胞関連遺伝子、例えば肺癌又は食道癌で異なる発現をすることが知られる遺伝子の発現レベルも求めることができる。かかる他の肺癌関連遺伝子としては、国際公開第2004/031413号パンフレット及び国際公開第2005/090603号パンフレットに記載されるものが挙げられ、かかる他の食道癌関連遺伝子としては、国際公開第2007/013671号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
本方法に従って癌の予後を判定される患者は哺乳動物であってもよく、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが挙げられる。
代替的に、本発明に従って、対象の予後を判定する他の試験結果に加えて、中間結果も与えられ得る。かかる中間結果は、医者、看護師又は他の療法士が対象の予後を判定、判断又は推測するのを補助することができる。予後を判定するために、本発明によって得られる中間結果と組み合わせて考慮することができる付加的情報としては、対象の臨床症状及び身体状態が挙げられる。
(7)癌を診断する又は癌の予後を判定するキット
本発明は、癌を診断する又は癌の予後を判定するキットを提供する。幾つかの実施形態では、癌は、TBC1D7遺伝子によって媒介されるか、又はTBC1D7遺伝子、例えば肺癌及び/又は食道癌の過剰発現によって生じる。特にキットは、患者から得た生物試料においてTBC1D7遺伝子の発現を検出する試薬を少なくとも1つ含み、この試薬は、
(a)TBC1D7遺伝子のmRNAを検出する試薬、
(b)TBC1D7タンパク質を検出する試薬、及び
(c)TBC1D7タンパク質の生物活性を検出する試薬から成る群から選択され得る。
本発明は、癌を診断する又は癌の予後を判定するキットを提供する。幾つかの実施形態では、癌は、TBC1D7遺伝子によって媒介されるか、又はTBC1D7遺伝子、例えば肺癌及び/又は食道癌の過剰発現によって生じる。特にキットは、患者から得た生物試料においてTBC1D7遺伝子の発現を検出する試薬を少なくとも1つ含み、この試薬は、
(a)TBC1D7遺伝子のmRNAを検出する試薬、
(b)TBC1D7タンパク質を検出する試薬、及び
(c)TBC1D7タンパク質の生物活性を検出する試薬から成る群から選択され得る。
TBC1D7遺伝子のmRNAを検出するのに好適な試薬としては、TBC1D7のmRNAと特異的に結合する又は同定する核酸、例えばTBC1D7のmRNAの一部に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、TBC1D7のmRNAに特異的なプライマー及びプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の方法に基づき調製することができる。必要であれば、TBC1D7のmRNAを検出する試薬は固体マトリクス上に固定することができる。その上、TBC1D7のmRNAを検出する試薬を2つ以上キットに包含させることができる。
他方で、TBC1D7タンパク質を検出するのに好適な試薬としては、TBC1D7タンパク質に対する抗体が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片(例えばキメラ抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)は、断片がTBC1D7タンパク質との結合能を保持していれば、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる。さらに抗体は、直接連結又は間接的な標識法によってシグナル生成分子で標識することができる。抗体を標識し、抗体とそれらの標的との結合を検出するための標識及び方法が当該技術分野で既知であり、任意の標識及び方法を本発明に利用することができる。その上、TBC1D7タンパク質を検出する試薬を2つ以上キットに包含させることができる。
さらに生物活性は、例えば生物試料で発現したTBC1D7タンパク質によって細胞増殖活性を測定することによって求めることができる。例えば、細胞を患者から得た生物試料の存在下で培養し、それから増殖速度を検出すること又は細胞周期若しくはコロニー形成能を測定することによって、生物試料の細胞増殖活性を求めることができる。必要であれば、TBC1D7のmRNAを検出する試薬は固体マトリクス上に固定することができる。その上、TBC1D7タンパク質の生物活性を検出する試薬を2つ以上キットに包含させることができる。
キットは、上述の試薬を2つ以上含み得る。さらに、キットは、固体マトリクスと、TBC1D7遺伝子に対するプローブと結合する試薬又はTBC1D7タンパク質に対する抗体と、細胞を培養するための培地及び容器と、陽性及び陰性の対照試薬と、TBC1D7タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体とを含み得る。例えば、予後が良好な又は予後不良の患者から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットはさらに、商業的視点及び使用者視点から望まれる他の材料(緩衝剤、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、及び使用者用取扱説明書に同封された添付文書(例えば、書面、テープ、CD−ROM等)を含む)を含み得る。これらの試薬等が、標識を備える容器内に含まれ得る。好適な容器としては、ボトル、バイアル及び試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックで構成され得る。
本発明の一実施形態として、試薬がTBC1D7のmRNAに対するプローブである場合、試薬は、固体マトリクス、例えば多孔性ストリップ上で固定し、少なくとも1つの検出部位を形成することができる。多孔性ストリップの測定領域又は検出領域は、それぞれが核酸(プローブ)を含有する複数の部位を含み得る。試験ストリップは、陰性及び/又は陽性の対照に関する部位も含有し得る。代替的に、対照部位は、試験ストリップから分けられたストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定化核酸、即ち第1の検出部位ではより多量に及びその後の部位ではより少量に含有することができる。試験試料の添加の際、検出シグナルを提示する部位の数は、試料中に存在するTBC1D7のmRNA量の定量的指標を与える。検出部位は、任意の好適に検出可能な形状で構成されていてもよく、典型的に試験ストリップ幅に広がるバー又はドットの形状である。
本発明のキットはさらに、陽性対照試料又はTBC1D7標準試料を含み得る。本発明の陽性対照試料は、TBC1D7陽性血液試料を採取することによって調製することができ、それからそのTBC1D7レベルを分析する。代替的に、精製TBC1D7タンパク質又はポリヌクレオチドを、TBC1D7無含有血清に添加し、陽性試料又はTBC1D7標準を形成することができる。本発明では、精製TBC1D7は組換えタンパク質であり得る。陽性対照試料のTBC1D7レベルは例えば、カットオフ値を超える。
以下で、実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法及び実施例は本発明の態様を説明しているにすぎず、決して本発明の範囲の限定を意図するものではない。同様に、本明細書で記載のものと同様又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができる。
スクリーニング方法
(1)スクリーニングのための試験化合物
本発明に関して、本スクリーニング法により同定される薬剤は任意の化合物又は組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞又はタンパク質に曝露される試験薬剤又は化合物は、単一の化合物であっても、又は化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを方法に使用する場合、化合物は順次又は同時に接触させることができる。
(1)スクリーニングのための試験化合物
本発明に関して、本スクリーニング法により同定される薬剤は任意の化合物又は組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞又はタンパク質に曝露される試験薬剤又は化合物は、単一の化合物であっても、又は化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを方法に使用する場合、化合物は順次又は同時に接触させることができる。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験薬剤又は化合物、例えば細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物(アンチセンスDNA、siRNA、リボザイム等の核酸構築物等を含む)、及び天然化合物を使用することができる。本発明の試験薬剤又は化合物はまた、
(1)生物学的ライブラリ法、
(2)空間的にアドレス可能なパラレル固相又は溶液相ライブラリ法、
(3)デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、
(4)「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、及び
(5)アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当該技術分野で既知の組み合わせライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。
(1)生物学的ライブラリ法、
(2)空間的にアドレス可能なパラレル固相又は溶液相ライブラリ法、
(3)デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、
(4)「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、及び
(5)アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当該技術分野で既知の組み合わせライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。
アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の4つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、又は低分子ライブラリにも適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67)。分子ライブラリを合成する方法の例は、当該技術分野において見つけることができる(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51)。化合物のライブラリは、溶液中(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照)、又はビーズ(Lam, Nature 1991, 354: 82-4)、チップ(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6)、細菌(米国特許第5,223,409号明細書)、胞子(米国特許第5,571,698号明細書、同第5,403,484号明細書、及び同第5,223,409号明細書)、プラスミド(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9)、若しくはファージ(Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第2002-103360号明細書)上で提供され得る。
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングした化合物の構造の一部を付加、欠失、及び/又は置換により変換した化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる薬剤に含まれる。
さらに、スクリーニングした試験薬剤又は化合物がタンパク質である場合、タンパク質をコードするDNAを得るために、タンパク質の全アミノ酸配列を求めて、タンパク質をコードする核酸配列を推測するか、又は得られるタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、該配列に基づいてオリゴDNAをプローブとして調製し、該プローブを用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするDNAを得ることができる。得られるDNAは、癌を治療又は予防するための候補である試験薬剤又は化合物を調製する上での使用が見出される。
本明細書中に記載されるスクリーニングに有用な試験薬剤又は化合物はまた、TBC1D7ペプチド、又はパートナーと結合する活性を欠く部分TBC1D7タンパク質に特異的に結合する抗体又は非抗体結合タンパク質であり得る。かかる部分タンパク質又は抗体は、本明細書に記載の方法によって調製することができ(定義における(1)癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物又は抗体を参照されたい)、また、前記タンパク質とその結合パートナーとの結合阻害能について試験することができる。
(i)分子モデリング:
試験薬剤/化合物ライブラリの構築は、求められる特性を有することが知られる化合物の分子構造、及び/又は阻害される標的分子の分子構造の情報により容易になる。さらなる評価に適切な試験薬剤又は化合物を予備スクリーニングする一アプローチは、試験薬剤/化合物とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
試験薬剤/化合物ライブラリの構築は、求められる特性を有することが知られる化合物の分子構造、及び/又は阻害される標的分子の分子構造の情報により容易になる。さらなる評価に適切な試験薬剤又は化合物を予備スクリーニングする一アプローチは、試験薬剤/化合物とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、及び該分子と相互作用する新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元構成は典型的には選択した分子のx線結晶学的分析又はNMRイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全なものにする化合物及び標的分子の構造の実験的操作を可能にする。軽微な変化が一方又は両方に加えられる場合に、分子−化合物相互作用何であるか予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェア及び計算主体の(computationally intensive)コンピュータが必要とされる。
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、CHARMmプログラム及びQUANTAプログラム(Polygen Corporation,Waltham,Mass)が含まれる。CHARMmは、エネルギー最小化及び分子ダイナミクスの機能を実行する。QUANTAは分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び分析を実行する。QUANTAは、分子の互いの相互作用的構築、修飾、可視化、及び挙動分析を可能にする。
Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、及び核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90等の多数の論文が、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説している。
化学物質をスクリーニング及び図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.(Pasadena,Calif.)、Allelix, Inc.(Mississauga,Ontario,Canada)、及びHypercube, Inc.(Cambridge,Ontario)等の会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
TBC1D7活性の阻害剤を同定した後、下記に詳述するように、コンビナトリアル化学技法を採用し、同定した阻害剤の化学的構造に基づいて、任意の数の変異体を構成することができる。得られた候補阻害剤又は「試験薬剤又は化合物」のライブラリを本方法を用いてスクリーニングし、TBC1D7活性を障害するライブラリの試験薬剤又は化合物を同定してもよい。
(ii)コンビナトリアル化学合成
試験薬剤又は化合物のコンビナトリアルライブラリは、TBC1D7活性の既知の阻害剤中に存在するコア構造の情報を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを促す適度なサイズにライブラリを維持することが可能になる。代替的には、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより単純な、特に短い重合体分子ライブラリが構築され得る。この後者のアプローチの一例は、6アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。かかるペプチドライブラリは6アミノ酸おきの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
試験薬剤又は化合物のコンビナトリアルライブラリは、TBC1D7活性の既知の阻害剤中に存在するコア構造の情報を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを促す適度なサイズにライブラリを維持することが可能になる。代替的には、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより単純な、特に短い重合体分子ライブラリが構築され得る。この後者のアプローチの一例は、6アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。かかるペプチドライブラリは6アミノ酸おきの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に既知であり、化学合成又は生物学的合成のいずれかにより作り出すことができる。コンビナトリアル化学ライブラリとしては、ペプチドライブラリ(例えば米国特許第5,010,175号明細書、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作り出すための他の化学を使用することもできる。かかる化学としては、ペプチド(例えば国際公開第91/19735号パンフレット)、コード化ペプチド(例えば国際公開第93/20242号パンフレット)、ランダムバイオオリゴマー(random bio-oligomer)(例えば国際公開第92/00091号パンフレット)、ベンゾジアゼピン(例えば米国特許第5,288,514号明細書)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチド等のダイバーソマー(diversomer)(DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13)、ビニル性ポリペプチド(Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568)、グルコース骨格を有する非ペプチド性(nonpeptidal)ペプチド模倣体(Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8)、低分子化合物ライブラリの類似有機合成(Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661)、オリゴカルバメート(oligocarbamate)(Cho et al., Science 1993, 261: 1303)、及び/又はペプチジルホスホネート(peptidylphosphonate)(Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658)、核酸ライブラリ(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1990-2008, John Wiley Interscience、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdEd., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照)、ペプチド核酸ライブラリ(例えば米国特許第5,539,083号明細書を参照)、抗体ライブラリ(例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、及び国際出願PCT/US96/10287号明細書を参照)、炭水化物ライブラリ(例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第5,593,853号明細書を参照)、並びに有機低分子ライブラリ(例えば、ベンゾジアゼピン(Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.)、イソプレノイド(米国特許第5,569,588号明細書)、チアゾリジノン及びメタチアゾノン(metathiazanone)(米国特許第5,549,974号明細書)、ピロリジン(米国特許第5,525,735号明細書及び同第5,519,134号明細書)、モルホリノ化合物(米国特許第5,506,337号明細書)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号明細書)等を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。
(iii)その他の候補
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組み換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)を用いて、非常に大きいライブラリを構築することができる(例えば106個〜108個の化学物質)。第2のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74)、及びFodor et al.の方法(Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten(米国特許第4,631,211号明細書)、及びRutter et al.(米国特許第5,010,175号明細書)は、アゴニスト又はアンタゴニストとして試験することのできるペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組み換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)を用いて、非常に大きいライブラリを構築することができる(例えば106個〜108個の化学物質)。第2のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74)、及びFodor et al.の方法(Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten(米国特許第4,631,211号明細書)、及びRutter et al.(米国特許第5,010,175号明細書)は、アゴニスト又はアンタゴニストとして試験することのできるペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
アプタマーとは、特定の分子標的と強固に結合する、核酸で構成される巨大分子のことである。Tuerk及びGold(Science. 249:505-510 (1990))は、アプタマーの選択のためのSELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)法を開示している。SELEX法では、核酸分子の大規模ライブラリー(例えば、1015種の異なる分子)をスクリーニングのために用いることができる。
(2)スクリーニング方法
(i)一般的なスクリーニング方法
TBC1D7タンパク質と結合する化合物は、例えば免疫沈降によって、スクリーニングすることができる。免疫沈降において、抗体又は非抗体結合タンパク質を、適当な洗浄剤を用いて調製された細胞溶解物に添加することによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ポリペプチドと、ポリペプチドに対する結合親和性を有するポリペプチドと、抗体又は非抗体結合タンパク質とから成る。免疫沈降は、上記のエピトープに対する抗体を使用するのに加えて、ポリペプチドに対する抗体を使用しても実施することができ、これらの抗体は上記のように調製することができる(抗体を参照されたい)。
(i)一般的なスクリーニング方法
TBC1D7タンパク質と結合する化合物は、例えば免疫沈降によって、スクリーニングすることができる。免疫沈降において、抗体又は非抗体結合タンパク質を、適当な洗浄剤を用いて調製された細胞溶解物に添加することによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ポリペプチドと、ポリペプチドに対する結合親和性を有するポリペプチドと、抗体又は非抗体結合タンパク質とから成る。免疫沈降は、上記のエピトープに対する抗体を使用するのに加えて、ポリペプチドに対する抗体を使用しても実施することができ、これらの抗体は上記のように調製することができる(抗体を参照されたい)。
抗体がマウスIgG抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインAセファロース又はプロテインGセファロースによって沈降され得る。本発明のポリペプチドがエピトープを有する融合タンパク質、例えばGSTとして調製される場合、免疫複合体は、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース4Bを用いて、ポリペプチドに対する抗体を使用するのと同じように形成することができる。免疫沈降は以下のように、又は例えば文献(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988))における方法に従って行なうことができる。
SDS−PAGEは、免疫沈降タンパク質の分析に一般に使用され、結合したタンパク質は、適当な濃度のゲルを用いてタンパク質の分子量により分析される。ポリペプチドに結合したタンパク質は、例えばクマシー染色又は銀染色等の一般の染色法によって検出することが困難であるため、該タンパク質に対する検出感度は細胞を、細胞中のタンパク質を標識する放射性同位体35S−メチオニン又は35S−システインを含有する培養培地中で培養し、タンパク質を検出することにより改善され得る。標的タンパク質はSDS−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、タンパク質の分子量が明らかとなっている場合にその配列を求めることができる。
TBC1D7ポリペプチドに結合するタンパク質を、該ポリペプチドを用いてスクリーニングする方法として、例えばウエストウエスタンブロット分析(Skolnik et al., Cell 65: 83-90(1991))を使用することができる。具体的には、TBC1D7ポリペプチドに結合するタンパク質は、細胞、組織、器官(定義における(1)癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい)、又はTBC1D7ポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが期待される培養細胞からcDNAライブラリを、ファージベクター(例えばZAP)を用いて調製し、LB−アガロース上でタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質をフィルタ上に固定し、精製及び標識したTBC1D7ポリペプチドを該フィルタと反応させ、TBC1D7ポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを標識によって検出することにより得ることができる。TBC1D7ポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの間の結合を利用するか、又はTBC1D7ポリペプチドと特異的に結合する抗体、又はTBC1D7ポリペプチドに融合させたペプチド若しくはポリペプチド(例えばGST)を利用することにより標識してもよい。放射性同位体又は蛍光等を用いる方法も使用することができる。
「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、本明細書では、分光的手段、光化学的手段、生物学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物を表すのに用いられる。かかる標識としては、標識されたストレプトアビジン複合体による染色のためのビオチン、磁気ビーズ(例えばDYNABEADS(商標))、蛍光染料(例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、fluorescein isothiocyanate (FITC)等)、放射線標識(例えば3H、125I、131I、35S、14C、32P又は33P)、酵素(例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ及びELISAに共通して使用される他のもの)、及び熱量測定標識、例えばコロイド金又は着色ガラス若しくはプラスチック(例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等)ビーズが挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第3,817,837号明細書、同第3,850,752号明細書、同第3,939,350号明細書、同第3,996,345号明細書、同第4,275,149号明細書、及び同第4,366,241号明細書が挙げられる。かかる標識を検出する手段は当業者にとって既知である。このようにして例えば、放射線標識は写真フィルム又はシンチレーションカウンタを使用して検出することができ、蛍光マーカーは発光を検出するために光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は典型的に、酵素に基質を与え、基質に対する酵素作用によって生成された反応生成物を検出することによって検出され、熱量測定標識は着色標識を単純に視覚化することによって検出される。
代替的には、本発明のスクリーニング法の別の実施形態では、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい(「MATCHMAKER Two−Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two−Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one−Hybrid system」(Clontech);「HybriZAP Two−Hybrid Vector System」(Stratagene);参考文献は"Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)"、"Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)")。
ツーハイブリッドシステムにおいては、本発明のポリペプチドをSRF−結合領域又はGAL4−結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。cDNAライブラリを、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが期待される細胞から、ライブラリが発現される場合に、VP16転写活性化領域又はGAL4転写活性化領域に融合するように調製することができる。次に、cDNAライブラリを上記酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するcDNAを検出される陽性クローンから単離する(本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、その2つの結合がレポーター遺伝子を活性化するため、陽性クローンが検出可能となる)。cDNAによりコードされるタンパク質は、上記で単離されるcDNAを大腸菌に導入し、タンパク質を発現させることにより調製することができる。
レポーター遺伝子として、HIS3遺伝子に加えて、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等も使用することができる。
TBC1D7ポリペプチドに結合する化合物は、アフィニティークロマトグラフィーを用いてもスクリーニングすることができる。例えば、TBC1D7ポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化させ、TBC1D7ポリペプチドに結合することが可能なタンパク質を含有する試験化合物をカラムに適用してもよい。本明細書における試験化合物は、例えば細胞抽出物、細胞可溶化物等であり得る。試験化合物を投入した後、カラムを洗浄し、TBC1D7ポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。
試験化合物がタンパク質である場合、得られるタンパク質のアミノ酸配列を分析して、該配列に基づいてオリゴDNAを合成し、オリゴDNAをプローブとして用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするDNAを得る。
本発明においては、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサーを、結合した化合物を検出又は定量化する手段として使用してもよい。かかるバイオセンサーを使用する場合、TBC1D7ポリペプチドと試験化合物との間の相互作用は、わずかな量のポリペプチドを用いて、標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとして即時に観察することができる(例えばBIAcore(Pharmacia))。したがって、BIAcore等のバイオセンサーを用いて、本発明のTBC1D7ポリペプチドと試験化合物との間の結合を評価することが可能である。
TBC1D7タンパク質とその結合パートナー(例えば、RAB17、14-3-3ζ、TSC1)との間の結合を阻害する化合物に関するスクリーニングの方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。例えば、スクリーニングをインビトロアッセイ系、例えば細胞系などで行うことができる。より具体的には、まず、TBC1D7タンパク質又はその結合パートナーのいずれかを支持体と結合させ、それに対してもう一方のタンパク質を試験化合物とともに添加する。例えば、RAB17ポリペプチド、14-3-3ζポリペプチド又はTSC1ポリペプチドを支持体と結合させ、それに対して結合パートナーポリペプチドを試験化合物とともに添加する。次に、その混合物をインキュベートし、洗浄して、支持体と結合したもう一方のタンパク質を検出及び/又は測定する。有望な候補化合物は、TBC1D7ポリペプチドと上述した結合パートナーとの間の結合を阻害することができる。ここで、TBC1D7、RAB17、14-3-3ζ及びTSC1は、天然のタンパク質としてだけでなく、遺伝子組換え手法によって調製された組換えタンパク質として調製することもできる。天然のタンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって調製することができる。一方、組換えタンパク質は、TBC1D7、RAB17、14-3-3ζ又はTSC1をコードするDNAで形質転換した細胞を培養して、その中でタンパク質を発現させ、その後それを回収することによって調製することができる。
TBC1D7ポリペプチドと上述した結合パートナーとの間の結合は、TBC1D7又はその結合パートナーに対する抗体を用いて検出又は測定することができる。例えば、支持体上に固定化された結合パートナーを被験化合物と接触させ、TBC1D7を添加し、インキュベートして洗浄した上で、TBC1D7ポリペプチドに対する抗体を用いて検出又は測定を行うことができる。代替的には、TBC1D7ポリペプチドを支持体上に固定化し、結合パートナーに対する抗体を検出のために用いることもできる。抗体を本スクリーニングに用いる場合には、抗体を本明細書中に述べた標識物質の1つで標識して、その標識物質に基づいて検出又は測定を行うことが好ましい。代替的には、TBC1D7又は結合パートナーに対する抗体を、標識物質で標識された二次抗体によって検出するための一次抗体として用いることもできる。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質と結合した抗体を、プロテインG又はプロテインAカラムを用いて検出又は測定することもできる。
本発明に関して、2つのタンパク質間の「結合の阻害」は、タンパク質間の結合を少なくとも低減することを表す。したがって場合によって、試験薬剤又は化合物の存在下で試料において結合対の割合が適当な(例えば、試験化合物で処理しない、又は非癌試料由来の、又は癌試料由来の)対照に比べて低減する。結合タンパク質量の低減は例えば、対照試料で結合した対の90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、25%未満、10%未満、5%未満、1%未満又はそれより少なくなり得る(例えば0%)。
タンパク質の結合に使用することができる支持体の例としては例えば、不溶性多糖、例えばアガロース、セルロース及びデキストラン;及び合成樹脂、例えばポリアクリルアミド、ポリスチレン及びシリコンが挙げられる。例えば上記の材料から調製された市販のビーズ及びプレート(例えばマルチウェルプレート、バイオセンサチップ等)を使用することができる。ビーズを使用する場合、カラムに充填してもよい。代替的に、磁気ビーズの使用も当該技術分野で既知であり、磁性を介してビーズ上で結合したタンパク質を容易に単離することを可能にする。
タンパク質と支持体との結合は、常法、例えば化学結合及び物理的吸着に従って実施することができる。代替的に、タンパク質は、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体と結合することができる。その上、タンパク質と支持体との結合は、アビジン及びビオチンによっても実施することができる。タンパク質間の結合は、例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液中で実施されるが、緩衝液がタンパク質間の結合を阻害しない限り、これらに限定されない。
固定化ポリペプチドが合成化学物質、又は天然物質バンク又はランダムファージペプチド提示ライブラリに曝されたときに結合するところの分子をスクリーニングする方法と、タンパク質だけでなく、タンパク質と結合する化学物質(アゴニスト及びアンタゴニストを含む)も単離するための、コンビナトリアル化学的技法(combinatorial chemistry technique)に基づくハイスループットを用いてスクリーニングする方法(Wrighton et al., Science 273: 458-63(1996)、Verdine, Nature 384: 11-3(1996))とが当業者に既知である。
さらに、ポリペプチド又はその機能的等価物のリン酸化レベルは、当該技術分野で既知の任意の方法に従って検出することができる。例えば、試験化合物をポリペプチド発現細胞に接触させ、ポリペプチドをリン酸化させるのに十分な時間、細胞をインキュベートした後、リン酸化したポリペプチドの量を検出することができる。代替的に、インビトロで試験化合物をポリペプチドに接触させ、ポリペプチドをリン酸化させる条件下でポリペプチドをインキュベートした後、リン酸化したポリペプチドの量を検出することができる((14)インビトロ及びインビボのキナーゼアッセイを参照されたい)。
本発明において、リン酸化に好適な条件は、リン酸供与体、例えばATPの存在下での基質と酵素タンパク質とのインキュベーションによって与えられ得る。またリン酸化に好適な条件としては、ポリペプチドを発現する細胞を培養する際の条件が挙げられる。例えば細胞は、TBC1D7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを保有する形質転換細胞である(定義における(1)癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい)。インキュベーション後、例えばリン酸化基質を認識する抗体を用いて、又はATPリン酸供与体によって伝達された標識γホスフェートを検出することによって、基質のリン酸化レベルを検出することができる。リン酸化基質の検出の前に、基質を形質転換細胞の他の要素又は細胞溶解物から分離することができる。例えば、ゲル電気泳動を基質の分離に使用することができる。代替的に、基質に対する抗体を有する担体と接触させることによって、基質を捕捉することができる。
リン酸化タンパク質の検出のために、SDS−PAGE又は免疫沈降を使用することができる。さらに、リン酸化残基又は伝達された標識ホスフェートを認識する抗体を、リン酸化タンパク質レベルを検出するのに使用することができる。リン酸化ポリペプチドを認識する抗体を用いた任意の免疫学的技法を検出に使用することができる。リン酸化ポリペプチドを認識する抗体によるELISA又は免疫ブロット法を本発明に用いることができる。標識リン酸供与体を使用する場合、標識を追跡することによって、基質のリン酸化レベルを検出することができる。例えば、放射標識ATP(例えば32P−ATP)をリン酸化供与体として使用することができ、分離した基質の放射能は基質のリン酸化レベルと相関関係にある。代替的に、非リン酸化基質からリン酸化基質を特異的に認識する抗体を、リン酸化基質の検出に使用することができる。
試験化合物と接触したリン酸化TBC1D7ポリペプチドの検出量が、試験化合物と接触してない場合に検出された量まで減少する場合、試験化合物は、TBC1D7タンパク質のポリペプチドリン酸化を阻害し、これにより肺癌及び/又は食道癌抑制能があると見なされる。本明細書で、リン酸化レベルは、試験薬剤又は化合物と接触していない細胞で検出されたものに比べて、例えば10%、25%若しくは50%、又は少なくとも0.1倍、少なくとも0.2倍、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍若しくは少なくとも10倍又はそれ以上減少した場合に「減少」したと見なすことができる。例えば、スチューデントt検定、マンホイットニーU検定又はANOVAを統計的解析に使用することができる。
さらに、ポリペプチド又はその機能的等価物の発現レベルは、当該技術分野で既知の任意の方法に従って検出することができる。例えば、レポーターアッセイを用いることができる。好適なレポーター遺伝子及び宿主細胞が当該技術分野で既知である。スクリーニングに要求されるレポーター構築物は、TBC1D7遺伝子又はその下流の遺伝子の転写調節領域を用いることによって調製することができる。遺伝子の転写調節領域が当業者にとって既知である場合、レポーター構築物はこれまでの配列情報を用いることによって調製することができる。転写調節領域が同定されないままである場合、遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づき、ゲノムライブラリから転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントを単離することができる。特に、スクリーニングに要求されるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列を対象のTBC1D7遺伝子の転写調節領域と連結させることによって調製することができる。TBC1D7遺伝子の転写調節領域は、開始コドンから少なくとも500bp上流、例えば1000bp、例えば5000bp又は10000bp上流の領域にある。転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができるか、又はPCRによって伝播することができる。転写調節領域を同定する方法、及びアッセイプロトコルも既知である(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
様々なロースループット(low-throughput)及びハイスループットの酵素アッセイフォーマットが当該技術分野で既知であり、TBC1D7ポリペプチドのリン酸化レベルの検出又は測定に容易に適合させることができる。便宜上、ハイスループットアッセイのために、基質を固体支持体上に固定することができる。反応後に、上記の方法によって、リン酸化した基質を固体支持体上で検出することができる。代替的に、接触させる段階を溶液中で実施することができ、その後基質を固体支持体上に固定し、リン酸化した基質を検出することができる。かかるアッセイを容易にするために、固体支持体を、ストレプトアビジンとビオチンで標識した基質とでコーティングすることができるか、又は固体支持体を基質に対する抗体でコーティングすることができる。当業者は、スクリーニングの所望のスループット能に応じて好適なアッセイフォーマットを求めることができる。
本発明のアッセイは、ハイスループットスクリーニングを容易にする自動化手法にも好適である。多くの既知のロボットシステムが溶液相化学分野で開発されている。これらのシステムとしては、武田薬品工業株式会社(日本、大阪)で開発された自動化合成装置及びロボットアームを利用する多くのロボットシステム(Zymate II,Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.、Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.)のような自動化ワークステーションが挙げられ、これらは化学者によって行われる手動の合成操作の代わりをする。上記の装置のいずれかが、本発明での使用に好適である。これらの装置の性質、及び(必要であれば)これらの装置を本明細書で考慮されるように操作することができるような、これらの装置に対する改良の実施は、関連技術分野における当業者にとって明らかになる。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリ自体が市販されている(例えばComGenex, Princeton, N.J.、Asinex, Moscow, Ru、Tripos, Inc., St. Louis, MO、ChemStar, Ltd, Moscow, RU、3D Pharmaceuticals, Exton, PA、Martek Biosciences, Columbia, MD等を参照されたい)。
(ii)TBC1D7タンパク質と結合する化合物のスクリーニング
本発明において、精巣を除く正常な器官では発現しないにもかかわらず、肺癌及び食道癌においてTBC1D7の過剰発現が検出された(図1)。したがって、TBC1D7遺伝子、当該遺伝子によってコードされるタンパク質、又は当該遺伝子の転写調節領域を用いて、当該遺伝子の発現、又は当該遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を変える化合物をスクリーニングすることができる。かかる化合物は、肺癌及び食道癌を治療若しくは予防するための調合薬、又は肺癌及び食道癌を診断する薬剤を検出し、肺癌及び/又は食道癌の患者の予後を判定するための検出剤として使用される。
本発明において、精巣を除く正常な器官では発現しないにもかかわらず、肺癌及び食道癌においてTBC1D7の過剰発現が検出された(図1)。したがって、TBC1D7遺伝子、当該遺伝子によってコードされるタンパク質、又は当該遺伝子の転写調節領域を用いて、当該遺伝子の発現、又は当該遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を変える化合物をスクリーニングすることができる。かかる化合物は、肺癌及び食道癌を治療若しくは予防するための調合薬、又は肺癌及び食道癌を診断する薬剤を検出し、肺癌及び/又は食道癌の患者の予後を判定するための検出剤として使用される。
特に本発明は、TBC1D7ポリペプチドを用いて癌を診断、治療又は予防するのに有用な薬剤又は化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法の一実施形態は、
(a)試験薬剤又は化合物をTBC1D7タンパク質から成る群から選択されるポリペプチド又はその断片に接触させる段階と、
(b)ポリペプチドと上記試験薬剤又は化合物との結合を検出する段階と、
(c)段階(a)の上記ポリペプチドと結合する試験薬剤又は化合物を選択する段階とを含む。
(a)試験薬剤又は化合物をTBC1D7タンパク質から成る群から選択されるポリペプチド又はその断片に接触させる段階と、
(b)ポリペプチドと上記試験薬剤又は化合物との結合を検出する段階と、
(c)段階(a)の上記ポリペプチドと結合する試験薬剤又は化合物を選択する段階とを含む。
本発明によれば、候補薬剤もしくは化合物がTBC1D7タンパク質に対する結合を抑制する上での、又は候補薬剤もしくは化合物がTBC1D7に関係する癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療もしくは予防する上での治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、TBC1D7ポリペプチド又はその断片を用いて、候補薬剤もしくは化合物を、細胞増殖を抑制することに関して、又は候補薬剤もしくは化合物を、癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療もしくは予防することに関してスクリーニングする方法であって、以下の段階:
a)試験薬剤又は化合物をTBC1D7ポリペプチド又はその機能的断片と接触させる段階;及び
b)ポリペプチドと試験薬剤又は化合物との結合を検出する段階、及び
c)b)の結合を、試験薬剤又は化合物の治療効果と相関づける段階、を含む方法も提供する。
a)試験薬剤又は化合物をTBC1D7ポリペプチド又はその機能的断片と接触させる段階;及び
b)ポリペプチドと試験薬剤又は化合物との結合を検出する段階、及び
c)b)の結合を、試験薬剤又は化合物の治療効果と相関づける段階、を含む方法も提供する。
本発明において、治療効果は、試験薬剤又は化合物のTBC1D7ポリペプチド(又はその断片)に対する結合特性と相関づけることができる。例えば、試験薬剤又は化合物がTBC1D7ポリペプチド(又はその断片)と結合する場合には、その試験薬剤又は化合物を、治療効果を有する候補薬剤又は化合物として同定又は選択することができる。代替的に、試験薬剤又は化合物がTBC1D7ポリペプチド(又はその断片)と結合しない場合には、その試験薬剤又は化合物を、有意な治療効果を有しない薬剤又は化合物として同定することができる。
本方法を以下により詳細に説明する。
スクリーニングに使用されるTBC1D7ポリペプチドは、天然ポリペプチド又はその部分ペプチドに由来する組換えポリペプチド又はタンパク質であり得る。試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、又は他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
TBC1D7ポリペプチドを用いて、例えばTBC1D7ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に既知の多くの方法を用いることができる。かかるスクリーニングは、例えば免疫沈降法によって実施することができる。TBC1D7ポリペプチドをコードする遺伝子は、遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばpSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS及びpCD8に挿入することによって宿主(例えば、動物)細胞等で発現する。
発現に使用されるプロモーターは、一般的に使用することができる任意のプロモーターであってもよく、例えばSV40初期プロモーター(Rigby in Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141(1982))、EF−αプロモーター(Kim et al., Gene 91: 217-23(1990))、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 108: 193(1991))、RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987))、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988))、CMV前初期プロモーター(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987))、SV40後期プロモーター(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982))、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989))、HSV TKプロモーター等が挙げられる。
外来遺伝子を発現するために、任意の方法、例えば電気穿孔法(Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987))、リン酸カルシウム法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987))、DEAEデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984))、リポフェクチン法(Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993))等に従って、遺伝子の宿主細胞への導入を実施することができる。
TBC1D7遺伝子によってコードされるポリペプチドは、特異性が明らかになっているモノクローナル抗体のエピトープをポリペプチドのN末端又はC末端に導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を含む融合タンパク質として発現され得る。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。その複数のクローニング部位の使用によって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)等を有する融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。また、融合によってTBC1D7ポリペプチドの特性が変わらないように、数個から十数個のアミノ酸から成る小さいエピトープのみを導入することによって調製される融合タンパク質も報告されている。エピトープ、例えばポリヒスチジン(Hisタグ)、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc−myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV−GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSVタグ)、Eタグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)等、及びこれらを認識するモノクローナル抗体は、TBC1D7ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。
免疫沈降において、免疫複合体は、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって形成される。免疫複合体は、TBC1D7ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とから成る。また上記のように調製することができる、上記エピトープに対する抗体を使用することに加えて、TBC1D7ポリペプチドに対する抗体を使用して、免疫沈降を実施することができる。抗体がマウスIgG抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインAセファロース又はプロテインGセファロースによって沈降され得る。TBC1D7遺伝子によってコードされるポリペプチドがエピトープを有する融合タンパク質、例えばGSTとして調製される場合、免疫複合体は、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース4Bを用いて、TBC1D7ポリペプチドに対する抗体を使用するのと同じように形成することができる。
免疫沈降は、例えば文献(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))における方法に従って又は準じて実施することができる。
SDS−PAGEは、免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合タンパク質は、適当な濃度のゲルを用いて、タンパク質の分子量によって解析することができる。TBC1D7ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色又は銀染色等の一般的な染色法では検出することが困難であるため、タンパク質に対する検出感度は、細胞を、細胞中の該タンパク質を標識する放射性同位体、35S−メチオニン又は35S−システインを含有する培養培地中で培養し、該タンパク質を検出することにより改善され得る。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質はSDS−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
ポリペプチドを用いて、TBC1D7ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウェスト−ウェスタンブロット法解析(Skolnik et al., Cell 65: 83-90(1991))を使用することができる。特に、TBC1D7ポリペプチドと結合するタンパク質は、ファージベクター(例えばZAP)を用いて、TBC1D7ポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが期待される培養細胞(例えば肺癌細胞株又は食道癌細胞株)からcDNAライブラリを調製すること、LB−アガロース上でタンパク質を発現すること、フィルター上で発現したタンパク質を固定すること、精製及び標識したTBC1D7ポリペプチドを上記のフィルターと反応させること、並びに標識に従って、TBC1D7ポリペプチドと結合したタンパク質を発現するプラークを検出することによって得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用すること、又はTBC1D7ポリペプチドと特異的に結合する抗体、又はTBC1D7ポリペプチドに融合するペプチド若しくはポリペプチド(例えばGST)を利用することによって標識することができる。放射性同位体又は蛍光色素等を使用する方法も用いることができる。
代替的に、本発明のスクリーニング方法の別の実施形態において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用することができる(「MATCHMAKER Two−Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two−Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one−Hybrid system」(Clontech)、「HybriZAP Two−Hybrid Vector System」(Stratagene)、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612(1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92(1994)」を参照されたい)。
ツーハイブリッドシステムにおいて、本発明のポリペプチドは、SRF結合領域又はGAL4結合領域に融合し、酵母細胞で発現する。cDNAライブラリは、発現するとVP16又はGAL4の転写活性化領域と融合するように、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが期待される細胞から調製される。それから、cDNAライブラリを上記の酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するcDNAを検出される陽性クローンから単離する(本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現する場合、2つの結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にさせる)。cDNAによってコードされたタンパク質は、上記で単離されたcDNAを大腸菌に導入すること及びタンパク質を発現することによって調製することができる。HIS3遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
TBC1D7遺伝子によってコードされたポリペプチドと結合する化合物は、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定することができ、本発明のポリペプチドとの結合が可能なタンパク質を含有する試験化合物をカラムに適用する。本明細書での試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物を充填した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、配列に基づきオリゴDNAを合成し、タンパク質をコードするDNAを得るために、プローブとしてオリゴDNAを用いて、cDNAライブラリをスクリーニングする。
表面プラズモン共鳴現象を用いたバイオセンサが、本発明において結合化合物を検出又は定量する手段として使用され得る。かかるバイオセンサが使用される場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との相互作用は、微量のポリペプチドだけを用いて、標識を用いずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる(例えばBIAcore、Pharmacia)。したがって、バイオセンサ、例えばBIAcoreを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
固定化TBC1D7ポリペプチドが合成化学物質、又は天然物質バンク又はランダムファージペプチド提示ライブラリに曝されると、結合する分子をスクリーニングする方法と、タンパク質だけでなく、TBC1D7タンパク質と結合する化学物質(アゴニスト及びアンタゴニストを含む)も単離するために、コンビナトリアル化学的技法に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法(Wrighton et al., Science 273: 458-64(1996)、Verdine, Nature 384: 11-13(1996)、Hogan, Nature 384: 17-9(1996))とが当業者に既知である。
(iii)TBC1D7遺伝子の生物活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明において、TBC1D7タンパク質は癌細胞の細胞増殖を促進する活性(図3C)及び浸潤活性(図3D)を有する。この生物活性を用いて、このタンパク質のこの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。したがって本発明は、TBC1D7遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、TBC1D7遺伝子を発現する癌、例えば肺癌(非小細胞肺癌又は小細胞肺癌)又は食道癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
本発明において、TBC1D7タンパク質は癌細胞の細胞増殖を促進する活性(図3C)及び浸潤活性(図3D)を有する。この生物活性を用いて、このタンパク質のこの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。したがって本発明は、TBC1D7遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、TBC1D7遺伝子を発現する癌、例えば肺癌(非小細胞肺癌又は小細胞肺癌)又は食道癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
特に本発明は、以下の[1]〜[19]の方法を提供する:
[1]TBC1D7を発現する癌を治療又は予防するのに有用な薬剤又は化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)試験薬剤又は化合物を、癌で発現する遺伝子によってコードされるポリペプチド、又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞に接触させる段階と、
(b)段階(a)の上記ポリヌクレオチド又は上記ポリペプチドのレベルを検出する段階と、
(c)段階(b)で検出された上記レベルを、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する段階と、
(d)段階(c)の上記レベルを低減又は阻害する試験薬剤又は化合物を選択する段階とを含む、方法。
[2]上記レベルが、
(a)TBC1D7ポリペプチド、又はその機能的等価物をコードするmRNAの量を検出すること、
(b)TBC1D7ポリペプチド、又はその機能的等価物の量を検出すること、並びに
(c)TBC1D7ポリペプチド、又はその機能的等価物の生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか1つによって検出される、[1]に記載の方法。
[3]上記生物活性が、
(a)TBC1D7ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物を発現する細胞の増殖活性、及び
(b)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞の浸潤活性、から成る群から選択される活性のいずれか1つである、[2]に記載の方法。
[1]TBC1D7を発現する癌を治療又は予防するのに有用な薬剤又は化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)試験薬剤又は化合物を、癌で発現する遺伝子によってコードされるポリペプチド、又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞に接触させる段階と、
(b)段階(a)の上記ポリヌクレオチド又は上記ポリペプチドのレベルを検出する段階と、
(c)段階(b)で検出された上記レベルを、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されたレベルと比較する段階と、
(d)段階(c)の上記レベルを低減又は阻害する試験薬剤又は化合物を選択する段階とを含む、方法。
[2]上記レベルが、
(a)TBC1D7ポリペプチド、又はその機能的等価物をコードするmRNAの量を検出すること、
(b)TBC1D7ポリペプチド、又はその機能的等価物の量を検出すること、並びに
(c)TBC1D7ポリペプチド、又はその機能的等価物の生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか1つによって検出される、[1]に記載の方法。
[3]上記生物活性が、
(a)TBC1D7ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物を発現する細胞の増殖活性、及び
(b)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞の浸潤活性、から成る群から選択される活性のいずれか1つである、[2]に記載の方法。
本発明によれば、候補薬剤もしくは化合物がTBC1D7のレベルもしくは生物活性(例えば、細胞増殖促進活性)を抑制する上での、又は候補薬剤もしくは化合物がTBC1D7に関係する癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療もしくは予防する上での治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、TBC1D7を用いて、候補薬剤もしくは化合物を、細胞増殖を抑制することに関して、又は候補薬剤もしくは化合物を、癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療もしくは予防することに関してスクリーニングする方法であって、以下の段階:
(a)試験薬剤又は化合物を、癌において発現される遺伝子によってコードされるポリペプチド又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞と接触させる段階;
(b)段階(a)の前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドのレベル又は生物活性を検出する段階;及び
(c)b)のレベル又は生物活性を試験薬剤又は化合物の治療効果と相関づける段階、を含む方法も提供する。
(a)試験薬剤又は化合物を、癌において発現される遺伝子によってコードされるポリペプチド又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞と接触させる段階;
(b)段階(a)の前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドのレベル又は生物活性を検出する段階;及び
(c)b)のレベル又は生物活性を試験薬剤又は化合物の治療効果と相関づける段階、を含む方法も提供する。
本発明において、治療効果は、TBC1D7ポリペプチド又はポリヌクレオチド(又はその機能的断片)のレベル又は生物活性と相関づけることができる。例えば、試験薬剤又は化合物が、TBC1D7のレベル又は生物活性を、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されるレベル又は生物活性と比較して抑制又は阻害する場合には、その試験薬剤又は化合物を、治療効果を有する候補薬剤又は化合物として同定又は選択することができる。代替的に、試験薬剤又は化合物が、TBC1D7のレベル又は生物活性を、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されるレベル又は生物活性と比較して抑制も阻害もしない場合には、その試験薬剤又は化合物を、有意な治療効果を有しない薬剤又は化合物として同定することができる。
本方法を以下でより詳細に説明する。
任意のポリペプチドは、TBC1D7タンパク質の生物活性を含んでいればスクリーニングに使用することができる。かかる生物活性としては、細胞増殖活性、細胞浸潤を促進する活性、又は、RAB17結合活性、 14-3-3 ζ結合活性若しくは TSC1結合活性が挙げられる。例えば、TBC1D7タンパク質を使用してもよく、これらのタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを使用してもよい。かかるポリペプチドは、細胞によって内因的に又は外因的に発現され得る。
このスクリーニングによって単離される化合物は、TBC1D7遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補物質である。「アンタゴニスト」という用語は、その結合によってポリペプチドの機能を阻害する分子を表す。この用語は、TBC1D7をコードする遺伝子の発現を低減又は阻害する分子も表す。その上、このスクリーニングによって単離される化合物は、TBC1D7ポリペプチドと分子(DNA及びタンパク質を含む)とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補物質である。
本方法で検出される生物活性が細胞増殖である場合、これは、例えばTBC1D7から成る群から選択されるポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験化合物の存在下で前記細胞を培養して細胞周期等を測定して、細胞増殖の速度を決定することにより、並びに例えば実施例1−jで示されるコロニー形成能を測定すること、MTTアッセイ、コロニー形成アッセイ又はFACSによって検出することができる。
本明細書で規定されるような「生物活性を抑制する」という用語は、化合物の非存在下に比べてのTBC1D7の生物活性の少なくとも10%の抑制、例えば少なくとも25%、50%又は75%の抑制、例えば少なくとも90%の抑制を表す。
(iv)TBC1D7遺伝子の発現を変える化合物のスクリーニング
本発明において、TBC1D7遺伝子に特異的な二本鎖分子によるTBC1D7遺伝子の発現の低減が癌細胞の増殖の阻害を引き起こす(図3)。したがって、癌の治療又は予防に使用することができる化合物は、指標としてTBC1D7遺伝子の発現レベルを用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明に関して、かかるスクリーニングは例えば以下の段階を含み得る:
(a)候補化合物を、TBC1D7を発現する細胞と接触させる段階、
(b)TBC1D7の発現レベルを検出する段階、及び
(c)対照と比較して、TBC1D7の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する段階。
本発明において、TBC1D7遺伝子に特異的な二本鎖分子によるTBC1D7遺伝子の発現の低減が癌細胞の増殖の阻害を引き起こす(図3)。したがって、癌の治療又は予防に使用することができる化合物は、指標としてTBC1D7遺伝子の発現レベルを用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明に関して、かかるスクリーニングは例えば以下の段階を含み得る:
(a)候補化合物を、TBC1D7を発現する細胞と接触させる段階、
(b)TBC1D7の発現レベルを検出する段階、及び
(c)対照と比較して、TBC1D7の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する段階。
本発明によれば、候補化合物がTBC1D7の発現を変化させる上での、又は候補化合物がTBC1D7に関係する癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療もしくは予防する上での治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、候補化合物がTBC1D7の発現を変化させること、又は候補化合物が癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療もしくは予防することに関するスクリーニングの方法であって、以下の段階を含む方法も提供する:
a)候補化合物を、TBC1D7を発現する細胞と接触させる段階;
b)TBC1D7の発現レベルを検出する段階;及び
c)b)の発現レベルを試験化合物の治療効果と相関づける段階。
a)候補化合物を、TBC1D7を発現する細胞と接触させる段階;
b)TBC1D7の発現レベルを検出する段階;及び
c)b)の発現レベルを試験化合物の治療効果と相関づける段階。
本発明において、治療効果を、TBC1D7の発現レベルと相関づけることができる。例えば、試験化合物が、試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較してTBC1D7の発現レベルを抑制する場合には、その試験化合物を、治療効果を有する候補化合物として同定又は選択することができる。又は、試験化合物が、TBC1D7の発現レベルを、試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して抑制しない場合には、その試験化合物を、有意な治療効果を有しない薬剤又は化合物として同定することができる。
本方法を下記により詳細に記載する。
TBC1D7を発現する細胞には、例えば肺癌又は食道癌から樹立される細胞株が含まれ、かかる細胞は本発明の上記スクリーニングに使用することができる(例えばA549及びLC319)。発現レベルは当業者に既知の方法、例えばRT−PCR、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、ELISA又はフローサイトメトリー分析により予想することができる。本明細書中に規定する「発現レベルを低下させる」という用語は、TBC1D7の発現レベルを、化合物の非存在での発現レベルと比較して、少なくとも10%、例えば少なくとも25%、50%、又は75%、例えば少なくとも95%レベルを低下させることである。本明細書における化合物は化学物質、二本鎖ヌクレオチド等を含む。二本鎖ヌクレオチドの調整は上述の通りである。スクリーニング法においては、TBC1D7の発現レベルを低下させる化合物を、癌、例えば肺癌及び/又は食道癌の治療又は予防に使用される候補薬剤又は化合物として選択することができる。
代替的には、本発明のスクリーニング法には、
(a)候補化合物を、TBC1D7の転写調節領域及び転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を備えるベクターを導入した細胞と接触させる段階、
(b)上記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する段階、並びに
(c)上記レポーター遺伝子の発現又は活性を低下させる候補化合物を選択する段階が含まれ得る。
(a)候補化合物を、TBC1D7の転写調節領域及び転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を備えるベクターを導入した細胞と接触させる段階、
(b)上記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する段階、並びに
(c)上記レポーター遺伝子の発現又は活性を低下させる候補化合物を選択する段階が含まれ得る。
好適なレポーター遺伝子及び宿主細胞は当該技術分野で既知である。例えば、レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、イソギンチャクモドキ(Discosoma sp.)赤色蛍光タンパク質(DsRed)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、lacZ、及びβグルクロニダーゼ(GUS)が挙げられる。宿主細胞はCOS7、HEK293、HeLa等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列とCXの転写調節領域とを連結することにより調製することができる。本明細書におけるCXの転写調節領域は、開始コドンから少なくとも500bp上流、例えば1000bp、例えば5000bp又は10000bp上流までの領域であるが、それに制限されない。転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、又はPCRによって増幅させる(propagated)ことができる。転写調節領域を同定する方法、さらにアッセイプロトコルは既知である(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
上記レポーター構築物を含有するベクターを、宿主細胞に感染させ、レポーター遺伝子の発現又は活性を当該技術分野で既知の方法により(例えばルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を用いて)検出する。本明細書中に規定する「発現又は活性を低下させる」とは、レポーター遺伝子の発現又は活性を、化合物の非存在での発現又は活性と比較して、少なくとも10%、例えば少なくとも25%、50%、又は75%、例えば少なくとも95%低下させることに言及する。
本発明の局面を以下の実施例で説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定する意図はない。
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者(当業者)により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下で説明する。
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
(v)TBC1D7及びRAB17、14-3-3ζ又はTSC1の結合を指標として用いるスクリーニング
本発明において、TBC1D7タンパク質がRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質と相互作用することが確かめられた(図4)。すなわち、TBC1D7タンパク質とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質との結合を阻害する化合物を、TBC1D7タンパク質とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質とのそのような結合を指標として用いてスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、TBC1D7タンパク質とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質とのそのような結合を指標として用いて、化合物を、TBC1D7タンパク質とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質との結合を阻害することに関してスクリーニングするための方法を提供する。さらに、本発明はまた、化合物を、TBC1D7を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞及び/又は食道癌細胞の成長を阻害又は低下させることに関して、ならびに化合物を癌、例えば肺癌及び/又は食道癌を治療又は予防することに関してスクリーニングするための方法も提供する。
本発明において、TBC1D7タンパク質がRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質と相互作用することが確かめられた(図4)。すなわち、TBC1D7タンパク質とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質との結合を阻害する化合物を、TBC1D7タンパク質とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質とのそのような結合を指標として用いてスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、TBC1D7タンパク質とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質とのそのような結合を指標として用いて、化合物を、TBC1D7タンパク質とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1タンパク質との結合を阻害することに関してスクリーニングするための方法を提供する。さらに、本発明はまた、化合物を、TBC1D7を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞及び/又は食道癌細胞の成長を阻害又は低下させることに関して、ならびに化合物を癌、例えば肺癌及び/又は食道癌を治療又は予防することに関してスクリーニングするための方法も提供する。
具体的には、本発明は、以下の[1]から[5]までの方法を提供する:
[1]TBC1D7ポリペプチドとRAB17、14-3-3ζ又はTSC1ポリペプチドとの結合を遮断する薬剤又は化合物に関するスクリーニングの方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験薬剤又は化合物の存在下でRAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる段階;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する段階;
(c)段階(b)で検出された結合レベルを、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されたものと比較する段階;及び
(d)結合レベルを低下させるか又は阻害する試験薬剤又は化合物を選択する段階。
[2]癌の治療又は予防において有用な薬剤又は化合物に関するスクリーニングの方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験薬剤又は化合物の存在下で,RAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる段階;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する段階;
(c)段階(b)で検出された結合レベルを、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されたものと比較する段階;及び
(d)結合レベルを低下させるか又は阻害する試験薬剤又は化合物を選択する段階。
[3]TBC1D7の機能的等価物がRAB17、14-3-3ζ又はTSC1結合ドメインを含む、[1]又は[2]の方法。
[4]RAB17、14-3-3ζ又はTSC1の機能的等価物がTBC1D7結合ドメインを含む、[1]又は[2]の方法。
[5]癌が肺癌及び食道癌からなる群より選択される、[1]の方法。
[1]TBC1D7ポリペプチドとRAB17、14-3-3ζ又はTSC1ポリペプチドとの結合を遮断する薬剤又は化合物に関するスクリーニングの方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験薬剤又は化合物の存在下でRAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる段階;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する段階;
(c)段階(b)で検出された結合レベルを、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されたものと比較する段階;及び
(d)結合レベルを低下させるか又は阻害する試験薬剤又は化合物を選択する段階。
[2]癌の治療又は予防において有用な薬剤又は化合物に関するスクリーニングの方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験薬剤又は化合物の存在下で,RAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる段階;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する段階;
(c)段階(b)で検出された結合レベルを、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されたものと比較する段階;及び
(d)結合レベルを低下させるか又は阻害する試験薬剤又は化合物を選択する段階。
[3]TBC1D7の機能的等価物がRAB17、14-3-3ζ又はTSC1結合ドメインを含む、[1]又は[2]の方法。
[4]RAB17、14-3-3ζ又はTSC1の機能的等価物がTBC1D7結合ドメインを含む、[1]又は[2]の方法。
[5]癌が肺癌及び食道癌からなる群より選択される、[1]の方法。
本発明の文脈において、TBC1D7、RAB17、14-3-3ζ又はTSC1ポリペプチドの機能的等価物とは、それぞれTBC1D7ポリペプチド(配列番号2)、RAB17(配列番号12)、14-3-3ζ(配列番号14)又はTSC1(配列番号45)ポリペプチドと等価な生物活性を有するポリペプチドのことである(定義における(1)癌に関連した遺伝子及び癌に関連したタンパク質、ならびにそれらの機能的等価物、を参照)。特に、TBC1D7の機能的等価物は、配列番号28のアミノ酸配列のような、RAB17、14-3-3ζ又はTSC1に対する結合ドメインを含むポリペプチド断片である。より具体的には、RAB17の機能的等価物は配列番号12のポリペプチド断片であり、14-3-3ζのそれは配列番号14のポリペプチド断片であり、TSC1のそれは配列番号45の断片であり、いずれもTBC1D7結合ドメインを含む。
TBC1D7のRAB17、14-3-3ζ又はTSC1に対する結合をモジュレートする、例えば阻害する化合物に関するスクリーニングの方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。
スクリーニングのために用いようとするポリペプチドは、組換えポリペプチド、又は天然源に由来するタンパク質、又はそれらの部分的ペプチドのいずれであってもよい。上述した任意の試験化合物をスクリーニングのために用いることができる。
例えば、ポリペプチドと結合するタンパク質を、TBC1D7、RAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチド又はそれらの機能的な等価物を用いてスクリーニングする方法(定義における(1)癌に関連した遺伝子及び癌に関連したタンパク質、ならびにそれらの機能的等価物、を参照)としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降、ウエスタンブロット分析(Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991))、細胞を利用するツーハイブリッド系("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech);"HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene);参考文献 "Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)", "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)")、アフィニティークロマトグラフィー及び表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサー((i)一般的なスクリーニング方法、を参照)を用いて実施することができる。上述した任意の試験化合物を用いることができる((1)スクリーニング用の試験化合物、を参照)。
いくつかの態様において、本方法はさらに、候補化合物のTBC1D7タンパク質、RAB17タンパク質、14-3-3ζタンパク質もしくはTSC1タンパク質に対する結合を検出する段階、又はTBC1D7タンパク質のRAB17、14-3-3ζタンパク質もしくはTSC1タンパク質に対する結合のレベルを検出する段階を含む。TBC1D7タンパク質、RAB17及びTSC1タンパク質ならびに/又は14-3-3ζタンパク質を発現する細胞には、例えば、癌、例えば肺癌及び/又は食道癌から樹立された細胞株が含まれ、そのような細胞は、細胞がこれらの2種の遺伝子を発現する限り、本発明の上記のスクリーニングのために用いることができる。代替的には、細胞を、TBC1D7及びRAB17、14-3-3ζならびに/又はTSC1タンパク質の発現ベクターの両方又は一方で、これらの2種の遺伝子を発現するようにトランスフェクトすることもできる。TBC1D7タンパク質のRAB17、14-3-3ζタンパク質及び/又はTSC1タンパク質に対する結合は、抗TBC1D7抗体、抗RAB17抗体、抗14-3-3ζ抗体及びTSC1抗体を用いる免疫沈降アッセイによって検出することができる(図4)。
本発明によれば、候補薬剤もしくは化合物がTBC1D7ポリペプチドとRAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチドとの結合を遮断する上での、又は候補薬剤もしくは化合物がTBC1D7に関係する癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療もしくは予防する上での治療効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を用いて、候補薬剤又は化合物をTBC1D7ポリペプチドとRAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチドとの結合を遮断することに関して、又は候補薬剤もしくは化合物を癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療もしくは予防することに関してスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法も提供する:
(a)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験薬剤又は化合物の存在下で、RAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる段階;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する段階;
(c)段階(b)で検出された結合レベルを、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されたものと比較する段階;及び
(d)(c)の結合レベルを試験薬剤又は化合物の治療効果と相関づける段階。
(a)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験薬剤又は化合物の存在下で、RAB17、14-3-3ζもしくはTSC1ポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる段階;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する段階;
(c)段階(b)で検出された結合レベルを、試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されたものと比較する段階;及び
(d)(c)の結合レベルを試験薬剤又は化合物の治療効果と相関づける段階。
本発明において、治療効果は、TBC1D7ポリペプチドとRAB17、14-3-3ζ又はTSC1ポリペプチドとの結合と相関づけることができる。例えば、試験薬剤又は化合物がポリペプチド間の結合のレベルを試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して抑制又は阻害する場合には、その試験薬剤又は化合物を、治療効果を有する候補薬剤又は化合物として同定又は選択することができる。代替的には、試験薬剤又は化合物がポリペプチド間の結合のレベルを試験薬剤又は化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して抑制も阻害もしない場合には、その試験薬剤又は化合物は、有意な治療効果を有しない薬剤又は化合物として同定することができる。
TBC1D7の相互作用を阻害するドミナントネガティブタンパク質
本発明は、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含む阻害性ポリペプチドに関する。いくつかの好ましい態様において、阻害性ポリペプチドには、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28);そのポリペプチドと機能的に等価なポリペプチド;又はそれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれ、ここでそのポリペプチドはEGFRに対するTTKのキナーゼ活性を欠いている。そのEGFR断片が肺癌細胞の増殖を阻害することは、本発明によって証明された新規な知見である。
本発明は、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含む阻害性ポリペプチドに関する。いくつかの好ましい態様において、阻害性ポリペプチドには、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28);そのポリペプチドと機能的に等価なポリペプチド;又はそれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれ、ここでそのポリペプチドはEGFRに対するTTKのキナーゼ活性を欠いている。そのEGFR断片が肺癌細胞の増殖を阻害することは、本発明によって証明された新規な知見である。
本発明の選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、そのポリペプチドがアミノ酸配列YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含み、かつ癌細胞増殖を阻害する限り、任意の長さであってよい。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号2由来の約250個未満のアミノ酸からなるTBC1D7の短縮型である。いくつかの態様において、ポリペプチドは、約100個未満のアミノ酸からなってもよい。いくつかの態様において、アミノ酸配列の長さは20〜60残基の範囲であってよい。
本発明のポリペプチドは、2つ又はそれ以上の「選択されたアミノ酸配列」を含みうる。この2つ又はそれ以上の「選択されたアミノ酸配列」は、同じアミノ酸配列であっても異なるアミノ酸配列であってもよい。さらに、「選択されたアミノ酸配列」が直接的に連結されてもよい。代替的には、それらの間に何らかの介在配列が配置されていてもよい。
さらに、本発明は、本明細書で具体的に開示したYWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)ポリペプチドに対して相同なポリペプチド(すなわち、配列同一性を有するもの)にも関する。本発明において、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)ポリペプチドに対して相同なポリペプチドとは、1つ又はいくつかのアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び挿入から選択される何らかの変異を含み、かつ機能的に等価なものである。「機能的に等価な」という語句は、TBC1D7とTSC1などの他のタンパク質との間の相互作用を阻害して細胞増殖を阻害する機能を有することを指す。したがって、本発明におけるYWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)ペプチドと機能的な等価なポリペプチドは、好ましくは、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)配列以外の部位にアミノ酸変異を有する。本発明におけるYWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)ペプチドと機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列は、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)配列を保存しており、かつ、「選択されたアミノ酸配列」に対して60%もしくはそれ以上、通常は70%もしくはそれ以上、好ましくは80%もしくはそれ以上、より好ましくは90%もしくはそれ以上、又は95%もしくはそれ以上、さらにより好ましくは98%もしくはそれ以上の相同性を有する。アミノ酸配列の相同性は、当技術分野において周知のアルゴリズム、例えば、デフォルト設定に設定されたBLAST又はALIGNを用いて決定することができる。
本発明のポリペプチドは、選択されたアミノ酸配列に基づいて任意の位置から化学合成することができる。通常のペプチド化学に用いられる諸方法を、ポリペプチドを合成する方法のために用いることができる。具体的には、これらの方法には、以下の文書及び日本語特許公報に記載されたものが含まれる:
Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976;
Peputido gousei (Peptide Synthesis), Maruzen (Inc.), 1975;
Peputido gousei no kiso to jikken (Fundamental and Experimental Peptide Synthesis), Maruzen (Inc.), 1985;
Iyakuhin no kaihatsu (Development of Pharmaceuticals), Sequel, Vol. 14: Peputido gousei (Peptide Synthesis), Hirokawa Shoten, 1991;
国際特許公報WO 99/67288号。
Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976;
Peputido gousei (Peptide Synthesis), Maruzen (Inc.), 1975;
Peputido gousei no kiso to jikken (Fundamental and Experimental Peptide Synthesis), Maruzen (Inc.), 1985;
Iyakuhin no kaihatsu (Development of Pharmaceuticals), Sequel, Vol. 14: Peputido gousei (Peptide Synthesis), Hirokawa Shoten, 1991;
国際特許公報WO 99/67288号。
また、本発明のポリペプチドを公知の遺伝子工学手法によって合成することもできる。遺伝子工学手法の一例は以下の通りである。具体的には、所望のペプチドをコードするDNAを適切な宿主細胞に導入して形質転換細胞を調製する。本発明のポリペプチドは、この形質転換細胞によって産生されたポリペプチドを回収することによって得ることができる。代替的には、所望のポリペプチドを、タンパク質合成のために必要な要素がインビトロで再構成されるインビトロ翻訳系を用いて合成することもできる。
遺伝子工学手法を用いる場合には、本発明のポリペプチドを、異なるアミノ酸配列を有するペプチドと融合させたタンパク質として発現させることができる。所望の融合タンパク質を発現するベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、異なるペプチドをコードするポリヌクレオチドと、それらが同一のリーディングフレーム内にあるように連結させ、続いて、結果として得られたヌクレオチドを発現ベクター中に導入することによって得ることができる。融合タンパク質は、結果として得られたベクターで適切な宿主を形質転換することによって発現させる。融合タンパク質の形成に用いることのできる種々のペプチドには、以下のペプチドが含まれる:
FLAG(Hopp et al., (1988) BioTechnology 6, 1204-10)、
6個のHis(ヒスチジン)残基からなる6xHis、10xHis、
インフルエンザ血球凝集素(HA)、
ヒトc-myc断片、
VSV-GP断片、
p18 HIV断片、
T7-タグ、
HSV-タグ、
E-タグ、
SV40T抗原断片、
lckタグ、
α-チューブリン断片、
B-タグ、
プロテインC断片、
GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、
HA(インフルエンザ血球凝集素)、
免疫グロブリン定常領域、
β-ガラクトシダーゼ、及び
MBP(マルトース結合タンパク質)。
FLAG(Hopp et al., (1988) BioTechnology 6, 1204-10)、
6個のHis(ヒスチジン)残基からなる6xHis、10xHis、
インフルエンザ血球凝集素(HA)、
ヒトc-myc断片、
VSV-GP断片、
p18 HIV断片、
T7-タグ、
HSV-タグ、
E-タグ、
SV40T抗原断片、
lckタグ、
α-チューブリン断片、
B-タグ、
プロテインC断片、
GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、
HA(インフルエンザ血球凝集素)、
免疫グロブリン定常領域、
β-ガラクトシダーゼ、及び
MBP(マルトース結合タンパク質)。
本発明のポリペプチドは、そのようにして産生された融合タンパク質を適切なプロテアーゼで処理し、続いて所望のポリペプチドを回収することによって得ることができる。ポリペプチドを精製するためには、融合タンパク質を、その融合タンパク質と結合するアフィニティークロマトグラフィーによって前もって捕捉し、続いて捕捉した融合タンパク質をプロテアーゼで処理することができる。プロテアーゼ処理により、所望のポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーから分離され、高純度の所望のポリペプチドが回収される。
本発明のポリペプチドには修飾ポリペプチドが含まれる。本発明において、「修飾」という用語は、例えば、他の物質との結合のことを指す。したがって、本発明において、本発明のポリペプチドは、細胞膜透過性物質などの他の物質をさらに含みうる。これらの他の物質には、ペプチド、脂質、糖及びさまざまな天然性又は合成性のポリマーといった有機化合物が含まれる。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドがTBC1D7の相互作用を阻害するという所望の活性を保っている限り、任意の修飾を有してよい。いくつかの態様において、阻害性ポリペプチドは、TBC1D7に対するTSC1の結合と直接競合することができる。また、修飾が本発明のポリペプチドに対して追加的な機能を付与することもできる。追加的な機能の例には、標的化能力(targetability)、送達能力(deliverability)及び安定化が含まれる。
本発明における修飾の好ましい例には、例えば、細胞膜透過性物質の導入が含まれる。通常は、細胞内構造は細胞膜によって外側から遮断される。このため、細胞外物質を細胞内に効率的に導入することは困難である。細胞膜透過性は、本発明のポリペプチドに対して、ポリペプチドを細胞膜透過性物質で修飾することによって付与することができる。その結果として、本発明のポリペプチドを細胞と接触させることにより、ポリペプチドを細胞内に送達し、そこで作用させることができる。
「細胞膜透過性物質」とは、哺乳動物細胞膜を透過して細胞質に入ることのできる物質を指す。例えば、ある種のリポソームは細胞膜と融合して、その内容物を細胞内に放出する。一方、あるタイプのポリペプチドは哺乳動物細胞の細胞質膜を透過して、細胞の内側に入る。そのような細胞内進入活性を有するポリペプチドに関しては、細胞質膜及び本発明におけるそのようなものが、前記物質としては好ましい。具体的には、本発明は、以下の一般式を有するポリペプチドを含む:
[R]-[D];
式中、[R]は細胞膜透過性物質を表し;[D]はYWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含む断片配列を表す。上記の一般式において、[R]及び[D]は直接的に連結されてもよく、又はリンカーを介して間接的に連結されてもよい。ペプチド、複数の官能基を有する化合物等を、リンカーとして用いることができる。具体的には、-GGG-を含むアミノ酸配列をリンカーとして用いることができる。代替的には、細胞膜透過性物質及び選択された配列を含むポリペプチドを、微粒子の表面に結合させることもできる。[R]は、[D]の任意の位置に連結させることができる。具体的には、[R]は、[D]のN末端もしくはC末端に、又は[D]を構成するアミノ酸の側鎖に連結させることができる。さらに、複数の[R]分子を[D]の1つの分子に連結させることもできる。これらの[R]分子は[D]分子の様々な位置に導入することができる。代替的には、[D]を、ともに連結された多数の[R]で修飾することもできる。
[R]-[D];
式中、[R]は細胞膜透過性物質を表し;[D]はYWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含む断片配列を表す。上記の一般式において、[R]及び[D]は直接的に連結されてもよく、又はリンカーを介して間接的に連結されてもよい。ペプチド、複数の官能基を有する化合物等を、リンカーとして用いることができる。具体的には、-GGG-を含むアミノ酸配列をリンカーとして用いることができる。代替的には、細胞膜透過性物質及び選択された配列を含むポリペプチドを、微粒子の表面に結合させることもできる。[R]は、[D]の任意の位置に連結させることができる。具体的には、[R]は、[D]のN末端もしくはC末端に、又は[D]を構成するアミノ酸の側鎖に連結させることができる。さらに、複数の[R]分子を[D]の1つの分子に連結させることもできる。これらの[R]分子は[D]分子の様々な位置に導入することができる。代替的には、[D]を、ともに連結された多数の[R]で修飾することもできる。
例えば、細胞膜透過性を有する種々の天然の、又は人工的に合成されたポリペプチドが報告されている(Joliot A. & Prochiantz A., Nat Cell Biol. 2004;6: 189-96)。これらの公知の細胞膜透過性物質のすべてを、本発明におけるポリペプチドを修飾するために用いることができる。本発明においては、例えば、以下の群から選択される任意の物質を、上記の細胞透過性物質として用いることができる:
ポリアルギニン;Matsushita et al., (2003) J. Neurosci.; 21, 6000-7.
[Tat / RKKRRQRRR] (配列番号 29) Frankel et al., (1988) Cell 55,1189-93.
Green & Loewenstein (1988) Cell 55, 1179-88.
[ペネトラチン / RQIKIWFQNRRMKWKK] (配列番号30)
Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-50.
[ブフォリンII / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK] (配列番号 31)
Park et al., (2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50.
[トランスポータン / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL] (配列番号32)
Pooga et al., (1998) FASEB J. 12, 67-77.
[MAP (両親媒性ペプチドモデル) / KLALKLALKALKAALKLA] (配列番号33)
Oehlke et al., (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39.
[K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP] (配列番号34)
Lin et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14255-8.
[Ku70 / VPMLK] (配列番号35)
Sawada et al., (2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.
[Ku70 / PMLKE] (配列番号36)
Sawada et al., (2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.
[プリオン / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP] (配列番号37)
Lundberg et al., (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90.
[pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK] (配列番号38)
Elmquist et al., (2001) Exp. Cell Res. 269, 237-44.
[Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV] (配列番号39)
Morris et al., (2001) Nature Biotechnol. 19, 1173-6.
[SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR] (配列番号40)
Rousselle et al., (2000) Mol. Pharmacol. 57, 679-86.
[Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY] (配列番号41)
Gao et al., (2002) Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65.
[HN-1 / TSPLNIHNGQKL] (配列番号42)
Hong & Clayman (2000) Cancer Res. 60, 6551-6.
ポリアルギニン;Matsushita et al., (2003) J. Neurosci.; 21, 6000-7.
[Tat / RKKRRQRRR] (配列番号 29) Frankel et al., (1988) Cell 55,1189-93.
Green & Loewenstein (1988) Cell 55, 1179-88.
[ペネトラチン / RQIKIWFQNRRMKWKK] (配列番号30)
Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-50.
[ブフォリンII / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK] (配列番号 31)
Park et al., (2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50.
[トランスポータン / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL] (配列番号32)
Pooga et al., (1998) FASEB J. 12, 67-77.
[MAP (両親媒性ペプチドモデル) / KLALKLALKALKAALKLA] (配列番号33)
Oehlke et al., (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39.
[K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP] (配列番号34)
Lin et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14255-8.
[Ku70 / VPMLK] (配列番号35)
Sawada et al., (2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.
[Ku70 / PMLKE] (配列番号36)
Sawada et al., (2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.
[プリオン / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP] (配列番号37)
Lundberg et al., (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90.
[pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK] (配列番号38)
Elmquist et al., (2001) Exp. Cell Res. 269, 237-44.
[Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV] (配列番号39)
Morris et al., (2001) Nature Biotechnol. 19, 1173-6.
[SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR] (配列番号40)
Rousselle et al., (2000) Mol. Pharmacol. 57, 679-86.
[Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY] (配列番号41)
Gao et al., (2002) Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65.
[HN-1 / TSPLNIHNGQKL] (配列番号42)
Hong & Clayman (2000) Cancer Res. 60, 6551-6.
本発明において、細胞膜透過性物質の一例として上に挙げたポリアルギニンは、任意の数のアルギニン残基で構成されうる。具体的には、例えば、それは連続する5〜20個のアルギニン残基によって構成される。アルギニン残基の好ましい数は11である(配列番号43)。
YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含む医薬組成物
本発明のポリペプチドは、肺癌細胞の増殖を阻害する。したがって、本発明は、有効成分として、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含むポリペプチド;又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む、癌に対する治療剤及び/又は予防剤を提供する。代替的には、本発明は、本発明のポリペプチドを投与する段階を含む、癌を治療及び/又は予防するための方法に関する。さらに、本発明は、肺癌を治療及び/又は予防するための医薬組成物の製造における、本発明のポリペプチドの使用にも関する。さらに、本発明はまた、肺癌を治療及び/又は予防するための、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含むペプチドから選択されるポリペプチドにも関する。
本発明のポリペプチドは、肺癌細胞の増殖を阻害する。したがって、本発明は、有効成分として、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含むポリペプチド;又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む、癌に対する治療剤及び/又は予防剤を提供する。代替的には、本発明は、本発明のポリペプチドを投与する段階を含む、癌を治療及び/又は予防するための方法に関する。さらに、本発明は、肺癌を治療及び/又は予防するための医薬組成物の製造における、本発明のポリペプチドの使用にも関する。さらに、本発明はまた、肺癌を治療及び/又は予防するための、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含むペプチドから選択されるポリペプチドにも関する。
代替的には、本発明の阻害性ポリペプチドを、癌細胞のアポトーシスを誘導するために用いることもできる。したがって、本発明は、有効成分として、YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含むポリペプチド;又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞に対するアポトーシス誘導剤を提供する。本発明のアポトーシス誘導剤は、癌などの細胞増殖性疾患を治療するために用いることができる。代替的には、本発明は、本発明のポリペプチドを投与する段階を含む、細胞のアポトーシスを誘導するための方法にも関する。さらに、本発明は、細胞におけるアポトーシスを誘導するための医薬組成物の製造における、本発明のポリペプチドの使用にも関する。本発明の阻害性ポリペプチドは、肺癌などのTTK発現細胞においてアポトーシスを誘導する。一方、TTK発現は、ほとんどの正常臓器では観察されていない。いくつかの正常臓器においては、TTKの発現レベルは肺癌組織と比較して相対的に低い。したがって、本発明のポリペプチドは、肺癌細胞において特異的にアポトーシスを誘導する可能性がある。
本発明のポリペプチドを、調製された医薬品として、肺癌を治療するため、又は細胞におけるアポトーシスを誘導するために、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ及びチンパンジーなどの他の哺乳動物に投与する場合には、単離された化合物を直接投与することもでき、又は、医薬品を調製するための公知の方法を用いて適切な剤形に製剤化することもできる。例えば、必要に応じて、医薬品を、糖衣錠、カプセル、エリキシル剤及びマイクロカプセルとして経口投与することもでき、又は代替的には、滅菌溶液、又は水もしくは任意の他の薬学的に許容される液体による懸濁液である注射用剤形として非経口的に投与することもできる。例えば、化合物を、一般に許容される医薬品を生成するために必要な単位投薬量で、薬学的に許容される担体又は媒質、具体的には滅菌水、生理的食塩水、植物油、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、安定化剤、矯正剤、添加剤、媒体、保存料及び結合剤と混合することができる。これらの製剤中の有効成分の量に応じて、特定された範囲内にある適した用量を決定することができる。
錠剤中及びカプセル内に混合することのできる添加物の例には、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム及びアラビアゴムなどの結合剤;結晶セルロースなどの媒質;コーンスターチ、ゼラチン及びアルギン酸などの膨張剤;ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤;スクロース、ラクトース又はサッカリンなどの甘味剤;ならびに、ペパーミント、冬緑油及びチェリーなどの矯正剤がある。単位投薬量がカプセルである場合には、油などの液体担体を上記の成分中にさらに含めることができる。注射用の滅菌された混合物は、注射用蒸留水などの媒質を用いて、通常の医薬品製造に則して製剤化することができる。
生理的食塩水、グルコース溶液、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール及び塩化ナトリウムなどの補助剤を含む他の等張液を、注射用の水性溶液として用いることができる。それらは適した溶解補助剤、例えば、アルコール、具体的にはエタノール、ならびにプロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどの多価アルコール、ポリソルベート80(商標)及びHCO-50などの非イオン性界面活性剤と組み合わせて用いることができる。
ゴマ油又はダイズ油は油脂性液体として用いることができ、また、それらを溶解補助剤としての安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと組み合わせて用いることもできる。さらに、それらを、リン酸緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液;塩酸プロカインなどの鎮痛剤;ベンジルアルコール及びフェノールなどの安定化剤;ならびに抗酸化剤とともにさらに製剤化することもできる。そのようにして調製された注射剤は、適切なアンプル中に充填することができる。
例えば動脈内注射、静脈内注射、又は皮下注射による、同様に、鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、又は経口投与によるといった、当業者に周知の方法を本発明の薬学的化合物を患者に投与するために用いることができる。用量及び投与方法は、患者の体重及び年齢、ならびに投与方法によって異なる。しかし、当業者は、それらを慣例的に選択することができる。本発明のポリペプチドをコードするDNAを遺伝子治療のためにベクター中に挿入し、そのベクターを治療のために投与することができる。用量及び投与方法は患者の体重、年齢及び症状に応じて異なるものの、当業者はそれらを適切に選択することができる。例えば、本発明のポリペプチドと結合し、それらの活性を調節させるための化合物の用量は、症状に応じて幾分異なるものの、標準的な成人(体重60kg)に経口投与する場合、約0.1mg〜約100mg/日、好ましくは約1.0mg〜約50mg/日、より好ましくは約1.0mg〜約20mg/日である。
化合物を標準的な成人(体重60kg)に注射用剤形で非経口的に投与する場合には、患者、標的臓器、症状及び投与方法に応じて幾分異なるものの、約0.01mg〜約30mg/日、好ましくは約0.1mg〜約20mg/日、より好ましくは約0.1mg〜約10mg/日の用量を静脈内注射することが好都合である。同様に、化合物を体重60kgに対する用量から換算した量で他の動物に投与することもできる。
(i)TBC1D7と結合する;(ii)TBC1D7の生物活性を抑制する;(iii)TBC1D7の発現レベルを変化させる;(iv)TBC1D7とRAB17、14-3-3ζ又はTSC1との結合を阻害する、候補化合物に関するスクリーニングによって、癌(例えば、肺癌及び食道癌)を治療又は予防する潜在能力のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物の癌を治療又は予防する潜在能力は、癌に対する治療用物質を同定するための第2のスクリーニング及び/又はさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、上記の(i)から(iv)までのいずれか1つの活性を有する化合物、例えばTBC1D7と結合する化合物が、上記の癌の活性を阻害する場合には、そのような化合物はTBC1D7特異的な治療効果を有すると結論づけることができる。
別に規定しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施において用いることができるが、適した方法及び材料を以下に記載する。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それらは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
材料及び方法
細胞株及び臨床的組織試料
本研究に用いたヒト肺癌細胞株は以下の通りであった:肺腺癌(ADC)NCI-H1781、NCI-H1373、LC319、A549及びPC14;肺扁平上皮癌(SCC)SK-MES-1、NCI-H2170、NCI-H520、NCI-H1703及びLU61;肺大細胞癌(LCC)LX1;ならびに小細胞肺癌(SCLC)SBC-3、SBC-5、DMS273及びDMS114。本研究に用いたヒト食道癌細胞株は以下の通りであった:9種のSCC細胞株(TE1、TE2、TE3、TE4、TE5、TE6、TE8、TE9及びTE10)ならびに1種のADC細胞株(TE7)(Nishihira T. et al. J Cancer Res Clin Oncol 1993;119:441-449)。細胞はすべて、10%ウシ胎仔血清(FCS)を加えた適切な培地中で単層として成長させ、5% CO2を含む加湿空気雰囲気中にて37℃で維持した。ヒト小気道上皮細胞(SAEC)は、Cambrex Bio Science Inc.から購入した最適化培地(SAGM)中で成長させた。原発性の肺癌及び食道癌は、以前に記載した通りに、患者からインフォームドコンセントを得た上で隣接する正常肺組織試料とともに入手した。北海道大学(Hokkaido University)及びその関連病院(Sapporo, Japan)で手術を受けた患者から、組織マイクロアレイ上での免疫染色のために、合計270例のNSCLC又は261例のNSCLC(153例のADC、89例のSCC、3例の腺扁平上皮癌、16例のLCC;88例の女性患者及び173例の男性患者;年齢の中央値65.0歳、範囲26〜84歳;腫瘍サイズはpT1が112件、pT2が121件、pT3が28件;リンパ節状態はpN0が203件、pN1が23件、pN2が35件)試料、さらには隣接する正常肺組織試料も入手した。本研究及びすべての臨床材料の使用は、個々の施設の倫理委員会によって承認された。
細胞株及び臨床的組織試料
本研究に用いたヒト肺癌細胞株は以下の通りであった:肺腺癌(ADC)NCI-H1781、NCI-H1373、LC319、A549及びPC14;肺扁平上皮癌(SCC)SK-MES-1、NCI-H2170、NCI-H520、NCI-H1703及びLU61;肺大細胞癌(LCC)LX1;ならびに小細胞肺癌(SCLC)SBC-3、SBC-5、DMS273及びDMS114。本研究に用いたヒト食道癌細胞株は以下の通りであった:9種のSCC細胞株(TE1、TE2、TE3、TE4、TE5、TE6、TE8、TE9及びTE10)ならびに1種のADC細胞株(TE7)(Nishihira T. et al. J Cancer Res Clin Oncol 1993;119:441-449)。細胞はすべて、10%ウシ胎仔血清(FCS)を加えた適切な培地中で単層として成長させ、5% CO2を含む加湿空気雰囲気中にて37℃で維持した。ヒト小気道上皮細胞(SAEC)は、Cambrex Bio Science Inc.から購入した最適化培地(SAGM)中で成長させた。原発性の肺癌及び食道癌は、以前に記載した通りに、患者からインフォームドコンセントを得た上で隣接する正常肺組織試料とともに入手した。北海道大学(Hokkaido University)及びその関連病院(Sapporo, Japan)で手術を受けた患者から、組織マイクロアレイ上での免疫染色のために、合計270例のNSCLC又は261例のNSCLC(153例のADC、89例のSCC、3例の腺扁平上皮癌、16例のLCC;88例の女性患者及び173例の男性患者;年齢の中央値65.0歳、範囲26〜84歳;腫瘍サイズはpT1が112件、pT2が121件、pT3が28件;リンパ節状態はpN0が203件、pN1が23件、pN2が35件)試料、さらには隣接する正常肺組織試料も入手した。本研究及びすべての臨床材料の使用は、個々の施設の倫理委員会によって承認された。
半定量的RT-PCR分析
培養細胞及び臨床組織から、Trizol試薬(Life Technologies, Inc.)を製造元のプロトコルに従って用いて全RNAを抽出した。抽出したRNAをDNアーゼI(Nippon Gene)で処理し、オリゴ(dT)プライマー及びSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写させた。半定量的RT-PCR実験は、以下の合成したTBC1D7特異的プライマー又は内部対照としてのβ-アクチン(ACTB)特異的プライマーを用いて実施した:
TBC1D7、
5'-CCCTAGTTTTTGTAGCTGTCGAA-3'(配列番号5)又は
5'-CCTAGTTTTTGTAGCTGTCGAA-3'(配列番号15)及び
5'-GATCACATGCCAAGAACACAAT-3'(配列番号6);
TSC1、
5'-CTCCACAGCCAGATCAGACA-3'(配列番号16)及び
5'-GCTGCCTGTTCAAGAACTCC-3'(配列番号17);
ACTB、
5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3'(配列番号7)及び
5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'(配列番号8)。
PCR反応は、サイクル数について、増幅の対数期の中にある産物強度が確実に得られるように最適化した。
培養細胞及び臨床組織から、Trizol試薬(Life Technologies, Inc.)を製造元のプロトコルに従って用いて全RNAを抽出した。抽出したRNAをDNアーゼI(Nippon Gene)で処理し、オリゴ(dT)プライマー及びSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写させた。半定量的RT-PCR実験は、以下の合成したTBC1D7特異的プライマー又は内部対照としてのβ-アクチン(ACTB)特異的プライマーを用いて実施した:
TBC1D7、
5'-CCCTAGTTTTTGTAGCTGTCGAA-3'(配列番号5)又は
5'-CCTAGTTTTTGTAGCTGTCGAA-3'(配列番号15)及び
5'-GATCACATGCCAAGAACACAAT-3'(配列番号6);
TSC1、
5'-CTCCACAGCCAGATCAGACA-3'(配列番号16)及び
5'-GCTGCCTGTTCAAGAACTCC-3'(配列番号17);
ACTB、
5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3'(配列番号7)及び
5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'(配列番号8)。
PCR反応は、サイクル数について、増幅の対数期の中にある産物強度が確実に得られるように最適化した。
ノーザンブロット分析
ヒト多組織ブロット(human multiple tissue blot)(BD Biosciences Clontech)を、TBC1D7の32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。TBC1D7のcDNAプローブは、上記のプライマーを用いるRT-PCRによって調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄は、供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーを、増感スクリーンを用いて-80℃で1週間かけて行った。
ヒト多組織ブロット(human multiple tissue blot)(BD Biosciences Clontech)を、TBC1D7の32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。TBC1D7のcDNAプローブは、上記のプライマーを用いるRT-PCRによって調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄は、供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーを、増感スクリーンを用いて-80℃で1週間かけて行った。
抗TBC1D7抗体
Hisタグ付加エピトープをNH2末端に含むTBC1D7の完全長断片を発現するプラスミドを、pET28ベクター(Novagen, Madison, WI)を用いて調製した。組換えペプチドを大腸菌(Escherichia coli)BL21コドンプラス株(Stratagene, LaJolla, CA)で発現させ、TALON樹脂(BD Bioscience)を供給元のプロトコルに従って用いて精製した。このタンパクをウサギに接種し;標準的な方法に従って、免疫血清をアフィニティーカラム上で精製した。アフィニティー精製した抗TBC1D7抗体を、ウエスタンブロット法、さらには免疫細胞化学的及び免疫組織化学的検討のために用いた。抗体がTBC1D7に対して特異的であることは、TBC1D7を内因性に発現する細胞株または内因性には発現しない細胞株のいずれについても、TBC1D7発現ベクターでトランスフェクトした細胞株からの溶解物及び肺癌細胞株からの溶解物を用いたウエスタンブロット並びにそれら細胞株の免疫細胞化学染色によって確認した。
Hisタグ付加エピトープをNH2末端に含むTBC1D7の完全長断片を発現するプラスミドを、pET28ベクター(Novagen, Madison, WI)を用いて調製した。組換えペプチドを大腸菌(Escherichia coli)BL21コドンプラス株(Stratagene, LaJolla, CA)で発現させ、TALON樹脂(BD Bioscience)を供給元のプロトコルに従って用いて精製した。このタンパクをウサギに接種し;標準的な方法に従って、免疫血清をアフィニティーカラム上で精製した。アフィニティー精製した抗TBC1D7抗体を、ウエスタンブロット法、さらには免疫細胞化学的及び免疫組織化学的検討のために用いた。抗体がTBC1D7に対して特異的であることは、TBC1D7を内因性に発現する細胞株または内因性には発現しない細胞株のいずれについても、TBC1D7発現ベクターでトランスフェクトした細胞株からの溶解物及び肺癌細胞株からの溶解物を用いたウエスタンブロット並びにそれら細胞株の免疫細胞化学染色によって確認した。
ウエスタンブロット法
細胞を、溶解緩衝液;50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、0.5% NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDSに加えてプロテアーゼ阻害因子(プロテアーゼインヒビターCocktail Set III;Calbiochem)中で溶解させた。それは、以前に記載したように(Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19.)、ECLウエスタンブロット分析システム(GE Healthcare Bio-sciences)に用いた。
細胞を、溶解緩衝液;50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、0.5% NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDSに加えてプロテアーゼ阻害因子(プロテアーゼインヒビターCocktail Set III;Calbiochem)中で溶解させた。それは、以前に記載したように(Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19.)、ECLウエスタンブロット分析システム(GE Healthcare Bio-sciences)に用いた。
免疫細胞化学分析
培養細胞をPBS(-)で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド溶液中で37℃で30分間固定して、続いて、0.1% Triton X-100を含むPBS(-)により3分間にわたって透過性を付与した。一次抗体反応の前に、非特異的な抗体結合をブロックするために、細胞をブロッキング溶液[3%ウシ血清アルブミン、PBS(-)中]で7分間又は10分間覆った。細胞をヒトTBC1D7に対する抗体(組換えTBC1D7に対して産生;上記を参照されたい)、Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ二次抗体(Molecular Probes)を、内因性TBC1D7を示すために添加した。核は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールで染色した。抗体で染色した細胞をレーザー共焦点顕微鏡(TSC SP2 AOBS:Leica Microsystems)で観察した。
培養細胞をPBS(-)で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド溶液中で37℃で30分間固定して、続いて、0.1% Triton X-100を含むPBS(-)により3分間にわたって透過性を付与した。一次抗体反応の前に、非特異的な抗体結合をブロックするために、細胞をブロッキング溶液[3%ウシ血清アルブミン、PBS(-)中]で7分間又は10分間覆った。細胞をヒトTBC1D7に対する抗体(組換えTBC1D7に対して産生;上記を参照されたい)、Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ二次抗体(Molecular Probes)を、内因性TBC1D7を示すために添加した。核は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールで染色した。抗体で染色した細胞をレーザー共焦点顕微鏡(TSC SP2 AOBS:Leica Microsystems)で観察した。
免疫組織化学分析及び組織マイクロアレイ分析
臨床材料におけるTBC1D7タンパク質の存在について調べるために、本発明者らは、ENVISION+ Kit/HRP(DakoCytomation, Glostrup, Denmark)を用いて組織切片を染色した。抗原回復のために、スライドをTarget Retrieval Solution High pH(DakoCytomation)中に浸漬させ、オートクレーブ内にて108℃で15分間煮沸した。7μg又は12μg/mlのアフィニティー精製したウサギポリクローナル抗TBC1D7抗体(組換えTBC1D7に対して産生;上記を参照されたい)を、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質のブロッキング後に添加し、各切片を二次抗体としてのHRP標識抗ウサギIgGとともにインキュベートした。基質-色素原を添加し、標本をヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍-組織マイクロアレイは、他に開示されているように(Chin SF. et al. Molecular Pathology : MP 2003;56:275-279., Callagy G. et al. Diagnostic Molecular Pathology 2003;12:27-34., Callagy G. et al. J Pathol 2005;205:388-396.)、切除後の組織を収集及び固定するための同一プロトコルを用いて、単一の施設グループより入手したホルマリン固定アーカイブ化NSCLCを使用して構築した(Suzuki C. et al. Cancer Res 2003;63:7038-41., Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19., Mizukami Y. et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54. Suzuki C. et al. Cancer Res 2003;63:7038-41., Ishikawa N. et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70., Kato T. et al. Cancer Res 2005;65:5638-46., Furukawa C. et al. Cancer Res 2005;65:7102-10., Ishikawa N. et al. Cancer Res 2005;65:9176-84., Suzuki C. et al. Cancer Res 2005;65:11314-25., Ishikawa N. et al. Cancer Sci 2006;97:737-45., Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19., Hayama S. et al. Cancer Res 2006;66:10339-48., Kato T. et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42., Suzuki C. et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51., Yamabuki T. et al. Cancer Res 2007;67:2517-25., Hayama S. et al. Cancer Res 2007;67:4113-22., Kato T. et al. Cancer Res 2007;67:8544-53., Taniwaki M. et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31., Ishikawa N. et al. Cancer Res 2007;67:11601-11., Mano Y. et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13., Suda T. et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8., Kato T. et al. Clin Cancer Res Res 2008;14:2363-70., Mizukami Y. et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54.)。個々の肺腫瘍の組織学的な不均一性を考慮して、試料採取のための組織面積は、スライド上の対応するHE染色切片の肉眼でのアラインメントに基づいて選択した。ドナー側の腫瘍ブロックから採取した3つ、4つ又は5つの組織コア(直径0.6mm;高さ3〜4mm)を、組織マイクロアレイ作製装置(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)を用いて、レシピエント側のパラフィンブロックの中に置いた。正常組織のコアは各症例からパンチ生検した。結果として得られたマイクロアレイブロックの5μm切片を免疫組織化学分析のために用いた。3人の独立の研究者が、臨床病理学的データを事前に知らされずに、TBC1D7陽性度(positivity)に関して半定量的に判定した。TBC1D7染色の強度は以下の基準を用いて評価した:強陽性(2+)、腫瘍細胞の50%超で核及び細胞質を完全に不明瞭にする暗褐色染色;弱陽性(1+)、核及び細胞質で認められる幾分低い度合いの褐色染色;存在せず(0としてスコア化)、腫瘍細胞において認めうる染色なし。症例は、3人の審査者が独立にそれらを強陽性と定めた場合にのみ強陽性として認めた。
臨床材料におけるTBC1D7タンパク質の存在について調べるために、本発明者らは、ENVISION+ Kit/HRP(DakoCytomation, Glostrup, Denmark)を用いて組織切片を染色した。抗原回復のために、スライドをTarget Retrieval Solution High pH(DakoCytomation)中に浸漬させ、オートクレーブ内にて108℃で15分間煮沸した。7μg又は12μg/mlのアフィニティー精製したウサギポリクローナル抗TBC1D7抗体(組換えTBC1D7に対して産生;上記を参照されたい)を、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質のブロッキング後に添加し、各切片を二次抗体としてのHRP標識抗ウサギIgGとともにインキュベートした。基質-色素原を添加し、標本をヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍-組織マイクロアレイは、他に開示されているように(Chin SF. et al. Molecular Pathology : MP 2003;56:275-279., Callagy G. et al. Diagnostic Molecular Pathology 2003;12:27-34., Callagy G. et al. J Pathol 2005;205:388-396.)、切除後の組織を収集及び固定するための同一プロトコルを用いて、単一の施設グループより入手したホルマリン固定アーカイブ化NSCLCを使用して構築した(Suzuki C. et al. Cancer Res 2003;63:7038-41., Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19., Mizukami Y. et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54. Suzuki C. et al. Cancer Res 2003;63:7038-41., Ishikawa N. et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70., Kato T. et al. Cancer Res 2005;65:5638-46., Furukawa C. et al. Cancer Res 2005;65:7102-10., Ishikawa N. et al. Cancer Res 2005;65:9176-84., Suzuki C. et al. Cancer Res 2005;65:11314-25., Ishikawa N. et al. Cancer Sci 2006;97:737-45., Takahashi K. et al. Cancer Res 2006;66:9408-19., Hayama S. et al. Cancer Res 2006;66:10339-48., Kato T. et al. Clin Cancer Res 2007;13:434-42., Suzuki C. et al. Mol Cancer Ther 2007;6:542-51., Yamabuki T. et al. Cancer Res 2007;67:2517-25., Hayama S. et al. Cancer Res 2007;67:4113-22., Kato T. et al. Cancer Res 2007;67:8544-53., Taniwaki M. et al. Clin Cancer Res 2007;13:6624-31., Ishikawa N. et al. Cancer Res 2007;67:11601-11., Mano Y. et al. Cancer Sci 2007;98:1902-13., Suda T. et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8., Kato T. et al. Clin Cancer Res Res 2008;14:2363-70., Mizukami Y. et al. Cancer Sci 2008;99:1448-54.)。個々の肺腫瘍の組織学的な不均一性を考慮して、試料採取のための組織面積は、スライド上の対応するHE染色切片の肉眼でのアラインメントに基づいて選択した。ドナー側の腫瘍ブロックから採取した3つ、4つ又は5つの組織コア(直径0.6mm;高さ3〜4mm)を、組織マイクロアレイ作製装置(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)を用いて、レシピエント側のパラフィンブロックの中に置いた。正常組織のコアは各症例からパンチ生検した。結果として得られたマイクロアレイブロックの5μm切片を免疫組織化学分析のために用いた。3人の独立の研究者が、臨床病理学的データを事前に知らされずに、TBC1D7陽性度(positivity)に関して半定量的に判定した。TBC1D7染色の強度は以下の基準を用いて評価した:強陽性(2+)、腫瘍細胞の50%超で核及び細胞質を完全に不明瞭にする暗褐色染色;弱陽性(1+)、核及び細胞質で認められる幾分低い度合いの褐色染色;存在せず(0としてスコア化)、腫瘍細胞において認めうる染色なし。症例は、3人の審査者が独立にそれらを強陽性と定めた場合にのみ強陽性として認めた。
統計学的分析
統計学的分析は、StatView統計プログラム(SaS)を用いて行った。分割表を用いて、臨床病理学的変数(年齢、性別、組織型及び病理学的TNMステージ)を、組織マイクロアレイ分析によって決定されたTBC1D7の発現レベルと相関づけた。手術日からNSCLCに関連した死亡時まで、又は最後の経過観察時までの生存曲線を算出した。カプラン・マイヤー曲線を、各関連変数及びTBC1D7発現に関して算出した;患者サブグループ間の生存期間の差をログランク検定を用いて分析した。Cox比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析及び多変量解析を行い、臨床病理学的変数と癌に関係する死亡率との間の関連を判定した。第1に、本発明者らは、死亡と、年齢、性別、組織型、pT分類及びpN分類を含む潜在的な予後因子との間の関連について、1回につき1つの因子を考慮に入れて分析した。第2に、常にモデルにTBC1D7発現を強制するバックワード(ステップワイズ)手順に対して、エントリーレベル(entry level)のP値が0.05未満を満たしたあらゆる変数で、多変量Cox解析を適用した。本モデルが因子を加え続ける間、独立因子がエグジットレベル(exit level)P<0.05というを上回ることはなかった。
統計学的分析は、StatView統計プログラム(SaS)を用いて行った。分割表を用いて、臨床病理学的変数(年齢、性別、組織型及び病理学的TNMステージ)を、組織マイクロアレイ分析によって決定されたTBC1D7の発現レベルと相関づけた。手術日からNSCLCに関連した死亡時まで、又は最後の経過観察時までの生存曲線を算出した。カプラン・マイヤー曲線を、各関連変数及びTBC1D7発現に関して算出した;患者サブグループ間の生存期間の差をログランク検定を用いて分析した。Cox比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析及び多変量解析を行い、臨床病理学的変数と癌に関係する死亡率との間の関連を判定した。第1に、本発明者らは、死亡と、年齢、性別、組織型、pT分類及びpN分類を含む潜在的な予後因子との間の関連について、1回につき1つの因子を考慮に入れて分析した。第2に、常にモデルにTBC1D7発現を強制するバックワード(ステップワイズ)手順に対して、エントリーレベル(entry level)のP値が0.05未満を満たしたあらゆる変数で、多変量Cox解析を適用した。本モデルが因子を加え続ける間、独立因子がエグジットレベル(exit level)P<0.05というを上回ることはなかった。
RNA干渉アッセイ
(実験1)
低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖(Dharmacon, Inc.)(100nM)をNSCLC細胞株A549及び食道癌細胞株TE9に、24μLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を製造元のプロトコルに従って用いて、トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を7日間培養し、トランスフェクションから7日後の時点で、コロニーの数をギムザ染色によって算定し、細胞の生存度を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイ(cell counting kit-8溶液;Dojindo Laboratories)によって評価した。TBC1D7発現の抑制を確かめるために、上記のTBC1D7に対して特異的な合成プライマーを用いて、半定量的RT-PCRを実施した。ヒトTBC1D7に対するsiRNA二重鎖である、si-TBC1D7-#1:siGenome二重鎖1[D-021140-01:GAACAGUGCAGAGAAGAUAUU](標的配列である配列番号18に対して、配列番号3)、及びsi-TBC1D7-#2:siGenome二重鎖4[D-021140-4:GAUAAAGUUGUGAGUGGAUUU](標的配列である配列番号19に対して、配列番号4)を、Dharmaconから購入した。また、対照1(EGFP:高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子、オワンクラゲ(Aequorea victoria )GFPの突然変異体)、5'-NNGAAGCAGCACGACUUCUUC-3'(標的配列である配列番号9に対して)、並びに、対照2(スクランブル(SCR):5S及び16S rRNAをコードする葉緑体ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)遺伝子)5'-NNGCGCGCUUUGUAGGAUUCG(標的配列配列番号10に対して)に対して、siRNAオリゴヌクレオチドが設計された。
(実験1)
低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖(Dharmacon, Inc.)(100nM)をNSCLC細胞株A549及び食道癌細胞株TE9に、24μLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を製造元のプロトコルに従って用いて、トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を7日間培養し、トランスフェクションから7日後の時点で、コロニーの数をギムザ染色によって算定し、細胞の生存度を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイ(cell counting kit-8溶液;Dojindo Laboratories)によって評価した。TBC1D7発現の抑制を確かめるために、上記のTBC1D7に対して特異的な合成プライマーを用いて、半定量的RT-PCRを実施した。ヒトTBC1D7に対するsiRNA二重鎖である、si-TBC1D7-#1:siGenome二重鎖1[D-021140-01:GAACAGUGCAGAGAAGAUAUU](標的配列である配列番号18に対して、配列番号3)、及びsi-TBC1D7-#2:siGenome二重鎖4[D-021140-4:GAUAAAGUUGUGAGUGGAUUU](標的配列である配列番号19に対して、配列番号4)を、Dharmaconから購入した。また、対照1(EGFP:高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子、オワンクラゲ(Aequorea victoria )GFPの突然変異体)、5'-NNGAAGCAGCACGACUUCUUC-3'(標的配列である配列番号9に対して)、並びに、対照2(スクランブル(SCR):5S及び16S rRNAをコードする葉緑体ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)遺伝子)5'-NNGCGCGCUUUGUAGGAUUCG(標的配列配列番号10に対して)に対して、siRNAオリゴヌクレオチドが設計された。
(実験2)
低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖(100nM)を、24μLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を製造元のプロトコルに従って用いて、NSCLC細胞株A549及びLC319にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を7日間培養し、トランスフェクションから7日後の時点で、コロニーの数をギムザ染色によって算定し、細胞の生存度を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイ(cell counting kit-8溶液;Dojindo Laboratories)によって評価した。TBC1D7及びTSC1の発現の抑制を確かめるために、TBC1D7及びTSC1に対する抗体を用いたウエスタンブロット法、ならびに上記のTBC1D7及びTSC1に対して特異的な合成プライマーを用いた半定量的RT-PCRを実施した。ヒトTBC1D7及びTSC1に対するsiRNA配列は以下の通りであった:si-TBC1D7#3:GAACAGUGCAGAGAAGAUA(配列番号18)、si-TBC1D7#4:GAUAAAGUUGUGAGUGGAU(配列番号19)及びsi-TSC1:CGACACGGCUGAUAACUGA(配列番号20)。本発明者らはまた、対照-1(LUC:フォチナス-フィラリス(Photinus pyralis)のルシフェラーゼ遺伝子)、5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'(配列番号21)及び対照-2(EGFP:高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子、オワンクラゲGFPの突然変異体)、5'-GAAGCAGCACGACUUCUUC-3'(配列番号22)に対するsiRNAオリゴヌクレオチドも設計した。
低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖(100nM)を、24μLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を製造元のプロトコルに従って用いて、NSCLC細胞株A549及びLC319にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を7日間培養し、トランスフェクションから7日後の時点で、コロニーの数をギムザ染色によって算定し、細胞の生存度を3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイ(cell counting kit-8溶液;Dojindo Laboratories)によって評価した。TBC1D7及びTSC1の発現の抑制を確かめるために、TBC1D7及びTSC1に対する抗体を用いたウエスタンブロット法、ならびに上記のTBC1D7及びTSC1に対して特異的な合成プライマーを用いた半定量的RT-PCRを実施した。ヒトTBC1D7及びTSC1に対するsiRNA配列は以下の通りであった:si-TBC1D7#3:GAACAGUGCAGAGAAGAUA(配列番号18)、si-TBC1D7#4:GAUAAAGUUGUGAGUGGAU(配列番号19)及びsi-TSC1:CGACACGGCUGAUAACUGA(配列番号20)。本発明者らはまた、対照-1(LUC:フォチナス-フィラリス(Photinus pyralis)のルシフェラーゼ遺伝子)、5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'(配列番号21)及び対照-2(EGFP:高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子、オワンクラゲGFPの突然変異体)、5'-GAAGCAGCACGACUUCUUC-3'(配列番号22)に対するsiRNAオリゴヌクレオチドも設計した。
フローサイトメトリー
細胞をPBS中に収集し、70%冷エタノール中で30分間かけて固定した。100μg/mL RNアーゼ(Sigma/Aldrich, St. Louis, MO)による処理後に、細胞をPBS中の50μg/mLヨウ化プロピジウム(Sigma/Aldrich, St. Louis, MO)で染色した。フローサイトメトリーをBecton Dickinson FACScanで行い、ModFitソフトウエア(Verity Software House, Inc., Topsham, ME)によって分析した。ゲーティングされていない(ungated)少なくとも10,000個の細胞から選択した細胞を、DNA含有量に関して分析した。
細胞をPBS中に収集し、70%冷エタノール中で30分間かけて固定した。100μg/mL RNアーゼ(Sigma/Aldrich, St. Louis, MO)による処理後に、細胞をPBS中の50μg/mLヨウ化プロピジウム(Sigma/Aldrich, St. Louis, MO)で染色した。フローサイトメトリーをBecton Dickinson FACScanで行い、ModFitソフトウエア(Verity Software House, Inc., Topsham, ME)によって分析した。ゲーティングされていない(ungated)少なくとも10,000個の細胞から選択した細胞を、DNA含有量に関して分析した。
TBC1D7を発現するCOS-7トランスフェクタントの樹立及びそれらのインビトロでの成長
(実験1)
TBC1D7を発現する安定なトランスフェクタントを標準的なプロトコルに従って樹立した。TBC1D7のコード領域全体をRT-PCRによって増幅した。その産物をEcoRI及びXhoIで消化して、TBC1D7タンパク質のC末端に3×flagエピトープ配列を含むpCAGGSn3FCベクターの適切な部位にクローニングした。FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics)を製造元の指示に従って用いて、TBC1D7を発現するプラスミド(pCAGGS-TBC1D7-flag)又はモックプラスミド(pCAGGSn3FC)のいずれかで、COS-7細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10% FCS及びジェネティシン(0.8mg/ml)を含む培地中で14日間培養した;続いて50個の個々のコロニーをトリプシン処理し、限界希釈アッセイによって安定なトランスフェクタントに関してスクリーニングした。各クローンにおいて、TBC1D7の発現をウエスタンブロット法及び免疫細胞化学検査によって判定した。2種の安定なクローン(COS-7-TBC1D7-#1及び-#2)ならびに2種の対照クローン(COS-7-モック-#1及び-#2)の細胞生存度を、24、72、120及び168時間においてMTTアッセイを用いて定量した。
(実験1)
TBC1D7を発現する安定なトランスフェクタントを標準的なプロトコルに従って樹立した。TBC1D7のコード領域全体をRT-PCRによって増幅した。その産物をEcoRI及びXhoIで消化して、TBC1D7タンパク質のC末端に3×flagエピトープ配列を含むpCAGGSn3FCベクターの適切な部位にクローニングした。FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics)を製造元の指示に従って用いて、TBC1D7を発現するプラスミド(pCAGGS-TBC1D7-flag)又はモックプラスミド(pCAGGSn3FC)のいずれかで、COS-7細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10% FCS及びジェネティシン(0.8mg/ml)を含む培地中で14日間培養した;続いて50個の個々のコロニーをトリプシン処理し、限界希釈アッセイによって安定なトランスフェクタントに関してスクリーニングした。各クローンにおいて、TBC1D7の発現をウエスタンブロット法及び免疫細胞化学検査によって判定した。2種の安定なクローン(COS-7-TBC1D7-#1及び-#2)ならびに2種の対照クローン(COS-7-モック-#1及び-#2)の細胞生存度を、24、72、120及び168時間においてMTTアッセイを用いて定量した。
(実験2)
TBC1D7を発現する安定なトランスフェクタントを標準的なプロトコルに従って樹立した。TBC1D7のコード領域全体をRT-PCRによって増幅した。その産物をEcoRI及びXhoIで消化して、TBC1D7タンパク質のC末端に3×flagエピトープ配列を含むpCAGGSn3FCベクターの適切な部位にクローニングした。FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics)を製造元の指示に従って用いて、TBC1D7を発現するプラスミド(pCAGGS-TBC1D7-flag)又はモックプラスミド(pCAGGSn3FC)のいずれかで、COS-7細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10% FCS及びジェネティシン(0.6mg/ml)を含む培地中で14日間培養した;続いて50個の個々のコロニーをトリプシン処理し、限界希釈アッセイによって安定なトランスフェクタントに関してスクリーニングした。各クローンにおいて、TBC1D7の発現をウエスタンブロット法及び免疫細胞化学検査によって判定した。2種の安定なクローン(COS-7-TBC1D7-#A及び-#B)ならびに2種の対照クローン(COS-7-モック-#A及び-#B)の細胞生存度を、24、72、120及び168時間においてMTTアッセイを用いて定量した。
TBC1D7を発現する安定なトランスフェクタントを標準的なプロトコルに従って樹立した。TBC1D7のコード領域全体をRT-PCRによって増幅した。その産物をEcoRI及びXhoIで消化して、TBC1D7タンパク質のC末端に3×flagエピトープ配列を含むpCAGGSn3FCベクターの適切な部位にクローニングした。FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics)を製造元の指示に従って用いて、TBC1D7を発現するプラスミド(pCAGGS-TBC1D7-flag)又はモックプラスミド(pCAGGSn3FC)のいずれかで、COS-7細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10% FCS及びジェネティシン(0.6mg/ml)を含む培地中で14日間培養した;続いて50個の個々のコロニーをトリプシン処理し、限界希釈アッセイによって安定なトランスフェクタントに関してスクリーニングした。各クローンにおいて、TBC1D7の発現をウエスタンブロット法及び免疫細胞化学検査によって判定した。2種の安定なクローン(COS-7-TBC1D7-#A及び-#B)ならびに2種の対照クローン(COS-7-モック-#A及び-#B)の細胞生存度を、24、72、120及び168時間においてMTTアッセイを用いて定量した。
マトリゲル浸潤アッセイ
COS-7-TBC1D7-#1又はCOS-7-モック-#1を、10% FCSを含むDMEM中で、コンフルエント付近まで増殖させた。細胞をトリプシン処理によって回収し、血清もプロテアーゼ阻害因子も添加していないDMEM中で洗浄して、DMEM中に2×105細胞/mLの濃度で懸濁させた。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲルマトリックス(Becton Dickinson Labware)の乾燥層を、DMEMにより室温で2時間かけて再水和させた。10% FCSを含むDMEM(0.75mL)を24ウェルのマトリゲル浸潤チャンバーの下方チャンバーの各々に添加し、0.5mL(細胞1×105個)の細胞懸濁液を上方チャンバーの各インサートに添加した。インサートのプレートを37℃で22時間インキュベートし、チャンバーを処理した;供給元(Becton Dickinson Labware)による指定の通りに、マトリゲルを通って浸潤している細胞を固定し、ギムザによって染色した。
COS-7-TBC1D7-#1又はCOS-7-モック-#1を、10% FCSを含むDMEM中で、コンフルエント付近まで増殖させた。細胞をトリプシン処理によって回収し、血清もプロテアーゼ阻害因子も添加していないDMEM中で洗浄して、DMEM中に2×105細胞/mLの濃度で懸濁させた。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲルマトリックス(Becton Dickinson Labware)の乾燥層を、DMEMにより室温で2時間かけて再水和させた。10% FCSを含むDMEM(0.75mL)を24ウェルのマトリゲル浸潤チャンバーの下方チャンバーの各々に添加し、0.5mL(細胞1×105個)の細胞懸濁液を上方チャンバーの各インサートに添加した。インサートのプレートを37℃で22時間インキュベートし、チャンバーを処理した;供給元(Becton Dickinson Labware)による指定の通りに、マトリゲルを通って浸潤している細胞を固定し、ギムザによって染色した。
マウスモデル
施設内動物使用委員会による承認を得た上で、実験動物の飼育及び使用に関する施設内及び国内の指針に従い、動物実験を実施した。TBC1D7過剰発現によるインビボ腫瘍形成を評価するために、上記のように樹立したTBC1D7を安定的に発現するCOS-7細胞又はモックプラスミドをトランスフェクトした細胞(1×107個)を、8匹のBALB/cAJcl-nu/nuマウス(雄性、7週齡)の背中中央後側に皮下注射した。引き続いて、細胞移植から60日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を切離した。
施設内動物使用委員会による承認を得た上で、実験動物の飼育及び使用に関する施設内及び国内の指針に従い、動物実験を実施した。TBC1D7過剰発現によるインビボ腫瘍形成を評価するために、上記のように樹立したTBC1D7を安定的に発現するCOS-7細胞又はモックプラスミドをトランスフェクトした細胞(1×107個)を、8匹のBALB/cAJcl-nu/nuマウス(雄性、7週齡)の背中中央後側に皮下注射した。引き続いて、細胞移植から60日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を切離した。
TBC1D7関連タンパク質の同定
COS-7-TBC1D7-#A又はCOS-7-モック-#Aからの細胞抽出物を、最終容積1mLの免疫沈降用緩衝液(0.5% NP-40、50mM Tris-HCl、150mM NaCl)中で、プロテアーゼ阻害因子の存在下において、100μLのプロテインG-アガロースビーズと4℃、1時間インキュベーションすることによって、あらかじめ浄化した。1000rpm、4℃で1分間の遠心の後に、上清を抗Flag M2アガロースビーズと4℃で2時間インキュベートした。続いてビーズを5000rpm、1分間の遠心によって回収し、各1mLの免疫沈降緩衝液により6回洗浄した。洗浄したビーズを20μLのLaemmliサンプル緩衝液中に再懸濁させて、5分間煮沸し、タンパク質を5〜10% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲル(BIO RAD)にて分離させた。電気泳動の後に、ゲルを銀染色した。抗Flag M2アガロースビーズとともに免疫沈降したCOS-7-TBC1D7-#A抽出物中に特異的に認められたタンパク質バンドを切り出し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF-MS)(AXIMA-CFR plus、SHIMADZU BIOTECH)に供した。
COS-7-TBC1D7-#A又はCOS-7-モック-#Aからの細胞抽出物を、最終容積1mLの免疫沈降用緩衝液(0.5% NP-40、50mM Tris-HCl、150mM NaCl)中で、プロテアーゼ阻害因子の存在下において、100μLのプロテインG-アガロースビーズと4℃、1時間インキュベーションすることによって、あらかじめ浄化した。1000rpm、4℃で1分間の遠心の後に、上清を抗Flag M2アガロースビーズと4℃で2時間インキュベートした。続いてビーズを5000rpm、1分間の遠心によって回収し、各1mLの免疫沈降緩衝液により6回洗浄した。洗浄したビーズを20μLのLaemmliサンプル緩衝液中に再懸濁させて、5分間煮沸し、タンパク質を5〜10% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲル(BIO RAD)にて分離させた。電気泳動の後に、ゲルを銀染色した。抗Flag M2アガロースビーズとともに免疫沈降したCOS-7-TBC1D7-#A抽出物中に特異的に認められたタンパク質バンドを切り出し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF-MS)(AXIMA-CFR plus、SHIMADZU BIOTECH)に供した。
ドミナントネガティブペプチドアッセイ
TBC1D7中の最小化されたTSC1結合ドメインに由来する20アミノ酸の配列(コドン112〜171;図5B参照)を、そのN末端で、他の場所において記載されている膜貫通性の11個のポリアルギニン配列(11R)と共有結合させた(Hayama S, Daigo Y, Kato T, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48, Hayama S, Daigo Y, Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007;67:4113-22)。コドン112〜171領域を範囲に含む3種のドミナントネガティブペプチドを合成した:11R-TBC112-131、RRRRRRRRRRR-GGG-YQLESGKLPRSPSFPLEPDD(配列番号23);11R-TBC132-151、RRRRRRRRRRR-GGG-EVFLAIAKAMEEMVEDSVDC(配列番号24);11R-TBC152-171 RRRRRRRRRRR-GGG-YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号25)。これらのペプチドを調製用逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製して95%超の純度とした。TBC1D7及びTSC1の両方を発現する肺癌LC319細胞、ならびにTBC1D7を発現しない正常ヒト肺線維芽細胞由来のCCD19Luを、10、15又は20μMの濃度の11Rペプチドとともに3日間インキュベートした。細胞の生存度を、処理から3日後にMTTアッセイによって評価した。
TBC1D7中の最小化されたTSC1結合ドメインに由来する20アミノ酸の配列(コドン112〜171;図5B参照)を、そのN末端で、他の場所において記載されている膜貫通性の11個のポリアルギニン配列(11R)と共有結合させた(Hayama S, Daigo Y, Kato T, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48, Hayama S, Daigo Y, Yamabuki T, et al. Cancer Res 2007;67:4113-22)。コドン112〜171領域を範囲に含む3種のドミナントネガティブペプチドを合成した:11R-TBC112-131、RRRRRRRRRRR-GGG-YQLESGKLPRSPSFPLEPDD(配列番号23);11R-TBC132-151、RRRRRRRRRRR-GGG-EVFLAIAKAMEEMVEDSVDC(配列番号24);11R-TBC152-171 RRRRRRRRRRR-GGG-YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号25)。これらのペプチドを調製用逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製して95%超の純度とした。TBC1D7及びTSC1の両方を発現する肺癌LC319細胞、ならびにTBC1D7を発現しない正常ヒト肺線維芽細胞由来のCCD19Luを、10、15又は20μMの濃度の11Rペプチドとともに3日間インキュベートした。細胞の生存度を、処理から3日後にMTTアッセイによって評価した。
結果
肺癌及び正常組織におけるTBC1D7発現
27,648種の遺伝子を提示しているDNAマイクロアレイを用いたところ、TBC1D7は肺癌の大半で高度にトランス活性化されていることが同定されたが、一方、それは精巣及び胎児肝臓のみで検出された。本発明者らは引き続いて、半定量的RT-PCR実験により、そのトランス活性化を15件の肺癌組織のうち14件で確認した(5件のADCのうち5件;5件のSCCのうち5件;5件のSCLSのうち4件(図1A)。高レベルのTBC1D7発現は、検討した15種の肺癌細胞株のうち13種でも観察されたが、正常気道上皮に由来するSAEC細胞では転写物はほとんど検出されなかった(図1B)。引き続いて、抗TBC1D7抗体を用いたウエスタンブロット分析により、肺癌細胞株における30kDaのTBC1D7タンパク質の過剰発現が確認された(図1C)。肺癌LC319細胞における内因性TBC1D7の細胞内局在を検討するために、抗TBC1D7抗体及びLC319細胞を用いた免疫蛍光分析を行った。TBC1D7は核及び細胞質に局在していた(図1D)。TBC1D7 cDNAをプローブとして用いたノーザンブロット分析により、1.35kbの転写物が、16種の正常な成人組織のうち精巣において排他的かつ豊富に同定された(図1E)。さらに、抗TBC1D7ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学により、5種の正常組織(心臓、肺、肝臓、腎臓及び精巣)におけるTBC1D7タンパク質の発現を肺癌における発現と比較した。TBC1D7は精巣(精母細胞の核及び細胞質において)及び肺癌において豊富に発現されたが、残りの4種の正常組織ではその発現はほとんど検出不能であった(図1F)。
肺癌及び正常組織におけるTBC1D7発現
27,648種の遺伝子を提示しているDNAマイクロアレイを用いたところ、TBC1D7は肺癌の大半で高度にトランス活性化されていることが同定されたが、一方、それは精巣及び胎児肝臓のみで検出された。本発明者らは引き続いて、半定量的RT-PCR実験により、そのトランス活性化を15件の肺癌組織のうち14件で確認した(5件のADCのうち5件;5件のSCCのうち5件;5件のSCLSのうち4件(図1A)。高レベルのTBC1D7発現は、検討した15種の肺癌細胞株のうち13種でも観察されたが、正常気道上皮に由来するSAEC細胞では転写物はほとんど検出されなかった(図1B)。引き続いて、抗TBC1D7抗体を用いたウエスタンブロット分析により、肺癌細胞株における30kDaのTBC1D7タンパク質の過剰発現が確認された(図1C)。肺癌LC319細胞における内因性TBC1D7の細胞内局在を検討するために、抗TBC1D7抗体及びLC319細胞を用いた免疫蛍光分析を行った。TBC1D7は核及び細胞質に局在していた(図1D)。TBC1D7 cDNAをプローブとして用いたノーザンブロット分析により、1.35kbの転写物が、16種の正常な成人組織のうち精巣において排他的かつ豊富に同定された(図1E)。さらに、抗TBC1D7ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学により、5種の正常組織(心臓、肺、肝臓、腎臓及び精巣)におけるTBC1D7タンパク質の発現を肺癌における発現と比較した。TBC1D7は精巣(精母細胞の核及び細胞質において)及び肺癌において豊富に発現されたが、残りの4種の正常組織ではその発現はほとんど検出不能であった(図1F)。
TBC1D7発現とNSCLC患者の予後不良との関連
(実験1)
パラフィン包埋したNSCLCから調製した組織マイクロアレイを用いて、アフィニティー精製した抗TBC1D7ポリクローナル抗体による免疫組織化学分析が行われた。本発明者らは、TBC1D7発現のパターンを陰性又は陽性に分類した。NSCLC細胞における核及び細胞質におけるTBC1D7染色に関して、検討した270例のNSCLC症例のうち142例(52.6%)は陽性と判明し、128例(47.4%)は陰性と判明したが、それらに隣接する正常肺細胞及びストロマ細胞のいずれにおいても染色は全く観察されなかった(図2、上のパネル)。続いて、TBC1D7の発現と、根治的手術を受けたNSCLC患者のさまざまな臨床病理学的パラメーターとの関連について検討したところ、性別(男性でより高度、P=0.0051)、組織病理学的型(非ADCでより高度、P<0.0001)、腫瘍サイズ(T2+T3+T4でより高度、P<0.0001)及びリンパ節の状態(N1+N2でより高度;表1A)との有意な相関が見いだされた。カプラン・マイヤー解析により、NSCLCにおけるTBC1D7の陽性度と、比較的不良な腫瘍特異的生存度との間の有意な関連が指し示された(ログランク検定によりP=0.0124;図2、下のパネル)。本発明者らはまた、患者予後と、年齢、性別、組織型(ADCと非ADCとの比較)、pTステージ(腫瘍サイズ;T1とT2+T3+T4との比較)、pNステージ(リンパ節の状態;N0とN1+N2との比較)及びTBC1D7の状態(欠除又は弱発現と強発現との比較)を含むいくつかの因子との間の関連を評価するために単変量解析も適用した。それらのパラメーターはすべて予後不良と有意に関連していた(表1B)。多変量解析では、TBC1D7の状態は、本試験に組み入れられた外科治療を受けた肺癌患者に対しての独立した予後因子として統計学的に有意な水準には到達せず(P=0.7586)、このことは肺癌におけるTBC1D7発現とこれらの臨床病理学的な因子との関連性を示唆している(表1B)。
(実験1)
パラフィン包埋したNSCLCから調製した組織マイクロアレイを用いて、アフィニティー精製した抗TBC1D7ポリクローナル抗体による免疫組織化学分析が行われた。本発明者らは、TBC1D7発現のパターンを陰性又は陽性に分類した。NSCLC細胞における核及び細胞質におけるTBC1D7染色に関して、検討した270例のNSCLC症例のうち142例(52.6%)は陽性と判明し、128例(47.4%)は陰性と判明したが、それらに隣接する正常肺細胞及びストロマ細胞のいずれにおいても染色は全く観察されなかった(図2、上のパネル)。続いて、TBC1D7の発現と、根治的手術を受けたNSCLC患者のさまざまな臨床病理学的パラメーターとの関連について検討したところ、性別(男性でより高度、P=0.0051)、組織病理学的型(非ADCでより高度、P<0.0001)、腫瘍サイズ(T2+T3+T4でより高度、P<0.0001)及びリンパ節の状態(N1+N2でより高度;表1A)との有意な相関が見いだされた。カプラン・マイヤー解析により、NSCLCにおけるTBC1D7の陽性度と、比較的不良な腫瘍特異的生存度との間の有意な関連が指し示された(ログランク検定によりP=0.0124;図2、下のパネル)。本発明者らはまた、患者予後と、年齢、性別、組織型(ADCと非ADCとの比較)、pTステージ(腫瘍サイズ;T1とT2+T3+T4との比較)、pNステージ(リンパ節の状態;N0とN1+N2との比較)及びTBC1D7の状態(欠除又は弱発現と強発現との比較)を含むいくつかの因子との間の関連を評価するために単変量解析も適用した。それらのパラメーターはすべて予後不良と有意に関連していた(表1B)。多変量解析では、TBC1D7の状態は、本試験に組み入れられた外科治療を受けた肺癌患者に対しての独立した予後因子として統計学的に有意な水準には到達せず(P=0.7586)、このことは肺癌におけるTBC1D7発現とこれらの臨床病理学的な因子との関連性を示唆している(表1B)。
TBC1D7に対するsiRNAによる腫瘍細胞成長抑制
TBC1D7配列に対して特異的ないくつかのsiRNA発現オリゴヌクレオチドが用いられ、高レベルのTBC1D7を内因性に発現するLC319細胞及びA549細胞株にそれらをトランスフェクトした。本発明者らがsi-TBC1D7-#1構築物及びsi-TBC1D7-#2構築物(図3A、上のパネル)を用いた場合、ノックダウンの影響がRT-PCRによって確かめられた。MTTアッセイ及びコロニー形成アッセイにより、si-TBC1D7-#1、#2をトランスフェクトした細胞の数の劇的な減少が判明した(図3A、中央及び下のパネル)。フローサイトメトリー分析により、肺癌LC319細胞に対するsi-TBC1D7のトランスフェクションから48〜96時間後に、S期にある細胞の数が連続的に減少し、一方、トランスフェクションから48〜96時間後までの間にG2/M期にある細胞の割合は増加したことが判明した(図3B)。
TBC1D7配列に対して特異的ないくつかのsiRNA発現オリゴヌクレオチドが用いられ、高レベルのTBC1D7を内因性に発現するLC319細胞及びA549細胞株にそれらをトランスフェクトした。本発明者らがsi-TBC1D7-#1構築物及びsi-TBC1D7-#2構築物(図3A、上のパネル)を用いた場合、ノックダウンの影響がRT-PCRによって確かめられた。MTTアッセイ及びコロニー形成アッセイにより、si-TBC1D7-#1、#2をトランスフェクトした細胞の数の劇的な減少が判明した(図3A、中央及び下のパネル)。フローサイトメトリー分析により、肺癌LC319細胞に対するsi-TBC1D7のトランスフェクションから48〜96時間後に、S期にある細胞の数が連続的に減少し、一方、トランスフェクションから48〜96時間後までの間にG2/M期にある細胞の割合は増加したことが判明した(図3B)。
TBC1D7による細胞成長及び浸潤活性の活性化
組織マイクロアレイ上での免疫組織化学分析により、TBC1D7強陽性腫瘍を有する肺癌患者はTBC1D7弱陽性及び/又は陰性腫瘍を有する者よりも短い癌特異的生存期間を示すことが指し示されたことから、細胞成長及び浸潤におけるTBC1D7の潜在的な役割について検討した。本発明者らは、TBC1D7を発現するように設計されたプラスミド(pCAGGS-TBC1D7-flag)をCOS-7細胞にトランスフェクトして、外因性TBC1D7を過剰発現する2種の独立したCOS-7細胞株(COS-7-TBC1D7-#1及び-#2)を樹立した。それらの成長を、モックベクターでトランスフェクトした対照細胞(COS-7-モック-#1及び-#2)と比較した。この2種のCOS-7-TBC1D7細胞の成長は、ウエスタンブロット分析によって検出されたTBC1D7の発現レベルに応じて有意な度合いで促進された(図3C)。TBC1D7の活性化が細胞浸潤に及ぼす可能性のある発癌作用についてさらに探るため、それらの浸潤活性をマトリゲル浸潤アッセイを用いて比較した。図3Dに示されているように、マトリゲルを通過するCOS-7-TBC1D7-#1の浸潤活性はCOS-7-モック-#1と比べて有意に亢進した。
組織マイクロアレイ上での免疫組織化学分析により、TBC1D7強陽性腫瘍を有する肺癌患者はTBC1D7弱陽性及び/又は陰性腫瘍を有する者よりも短い癌特異的生存期間を示すことが指し示されたことから、細胞成長及び浸潤におけるTBC1D7の潜在的な役割について検討した。本発明者らは、TBC1D7を発現するように設計されたプラスミド(pCAGGS-TBC1D7-flag)をCOS-7細胞にトランスフェクトして、外因性TBC1D7を過剰発現する2種の独立したCOS-7細胞株(COS-7-TBC1D7-#1及び-#2)を樹立した。それらの成長を、モックベクターでトランスフェクトした対照細胞(COS-7-モック-#1及び-#2)と比較した。この2種のCOS-7-TBC1D7細胞の成長は、ウエスタンブロット分析によって検出されたTBC1D7の発現レベルに応じて有意な度合いで促進された(図3C)。TBC1D7の活性化が細胞浸潤に及ぼす可能性のある発癌作用についてさらに探るため、それらの浸潤活性をマトリゲル浸潤アッセイを用いて比較した。図3Dに示されているように、マトリゲルを通過するCOS-7-TBC1D7-#1の浸潤活性はCOS-7-モック-#1と比べて有意に亢進した。
インビボ腫瘍発生におけるTBC1D7の潜在的な役割について調べるために、COS-7-TBC1D7-#1細胞又はCOS-7-モック-#1細胞をBALB/cAJcl-nu/nuマウスに皮下移植した。60日間の観察中に、COS-7-TBC1D7-#1細胞を個々に移植した4匹のマウスはすべて、生細胞を含む腫瘍を有したが、COS-7-モック-#1細胞を移植した4匹の独立したマウスでは視認しうる腫瘍は全く形成されなかった(図3E及び3F)。これらの所見は、TBC1D7のインビボ及びインビトロでの発癌作用を意味する。
TBC1D7と相互作用する分子の同定
(実験1)
肺癌発生及び食道癌発生におけるTBC1D7の生物学的機序を解明するために、本発明者らはTBC1D7と相互作用すると考えられるタンパク質を同定することを試みた。TBC1D7はコンセンサス mode-1 14-3-3結合モチーフを有することから、flag-TBC1D7-発現ベクター又はモックベクター(陰性対照)を一過性にトランスフェクトしたCOS-7細胞からの細胞抽出物をflag M2アガロースとともに免疫沈降させ、その後に抗14-3-3ζ抗体(Cell Signaling technology, USA)を用いる免疫ブロット法を行った。その結果、外因性TBC1D7と内因性14-3-3ζとのコグネイト相互作用が確認された(図4A)。一方、TBC1D7は一次線毛形成においてコグネイトGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)としてRAB17に対して作用することが最近報告されており、このためRAB17発現ベクター(pcDNA3.1 Myc-His RAB17)を構築したところ、TBC1D7とRAB17との間の相互作用が確認された(図4B)。
(実験1)
肺癌発生及び食道癌発生におけるTBC1D7の生物学的機序を解明するために、本発明者らはTBC1D7と相互作用すると考えられるタンパク質を同定することを試みた。TBC1D7はコンセンサス mode-1 14-3-3結合モチーフを有することから、flag-TBC1D7-発現ベクター又はモックベクター(陰性対照)を一過性にトランスフェクトしたCOS-7細胞からの細胞抽出物をflag M2アガロースとともに免疫沈降させ、その後に抗14-3-3ζ抗体(Cell Signaling technology, USA)を用いる免疫ブロット法を行った。その結果、外因性TBC1D7と内因性14-3-3ζとのコグネイト相互作用が確認された(図4A)。一方、TBC1D7は一次線毛形成においてコグネイトGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)としてRAB17に対して作用することが最近報告されており、このためRAB17発現ベクター(pcDNA3.1 Myc-His RAB17)を構築したところ、TBC1D7とRAB17との間の相互作用が確認された(図4B)。
(実験2)
TBC1D7のTSC1との相互作用
肺癌発生におけるTBC1D7の生物学的機序を解明するために、TBC1D7と相互作用すると考えられるタンパク質を同定することを試みた。TBC1D7のインビトロ成長作用及びインビボ腫瘍形成作用を検討するために用いたCOS-7-TBC1D7-#Aからの細胞抽出物、又はCOS-7-モック-#A(陰性対照)を、抗Flag M2アガロースビーズとともに免疫沈降させた。SDS-PAGEによる分離後に、タンパク質複合体を銀染色した。COS-7-TBC1D7-#Aでは抗Flag M2アガロースによる免疫沈降物中に認められたが、陰性対照細胞では認められなかった1つのタンパク質バンドを切り出し、トリプシン処理して、質量分析に供した。抽出した130kDaのバンドからのペプチドは、ヒトとサルとの間で保存されているTSC1の部分に一致した。次に、ヒト肺癌細胞株におけるTSC1発現を半定量的RT-PCR実験及びウエスタンブロット法によって検討したところ、検討した肺癌細胞のほとんどでTBC1D7及びTSC1の共発現が見いだされ(図4C)、このことは肺癌細胞におけるこれらの2種のタンパク質の複合体形成の可能性を示唆する。本発明者らはひき続いて、肺癌LC319細胞における内因性TBC1D7と内因性TSC1との間の相互作用を、TBC1D7及びTSC1に対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫沈降によって確認した(図4D)。
TBC1D7のTSC1との相互作用
肺癌発生におけるTBC1D7の生物学的機序を解明するために、TBC1D7と相互作用すると考えられるタンパク質を同定することを試みた。TBC1D7のインビトロ成長作用及びインビボ腫瘍形成作用を検討するために用いたCOS-7-TBC1D7-#Aからの細胞抽出物、又はCOS-7-モック-#A(陰性対照)を、抗Flag M2アガロースビーズとともに免疫沈降させた。SDS-PAGEによる分離後に、タンパク質複合体を銀染色した。COS-7-TBC1D7-#Aでは抗Flag M2アガロースによる免疫沈降物中に認められたが、陰性対照細胞では認められなかった1つのタンパク質バンドを切り出し、トリプシン処理して、質量分析に供した。抽出した130kDaのバンドからのペプチドは、ヒトとサルとの間で保存されているTSC1の部分に一致した。次に、ヒト肺癌細胞株におけるTSC1発現を半定量的RT-PCR実験及びウエスタンブロット法によって検討したところ、検討した肺癌細胞のほとんどでTBC1D7及びTSC1の共発現が見いだされ(図4C)、このことは肺癌細胞におけるこれらの2種のタンパク質の複合体形成の可能性を示唆する。本発明者らはひき続いて、肺癌LC319細胞における内因性TBC1D7と内因性TSC1との間の相互作用を、TBC1D7及びTSC1に対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫沈降によって確認した(図4D)。
TSC1の発現が肺癌細胞におけるTBC1D7の機能に影響を及ぼすか否かをさらに評価するために、LC319細胞におけるTSC1の抑制又は過剰発現後のTBC1D7のレベルを検討した。TSC1に対するsiRNAオリゴヌクレオチド(si-TSC1)によるLC319細胞の処理は、対照siRNA(si-EGFP)と比較して内因性TSC1の発現を抑制した。興味深いことに、si-TSC1で処理した細胞において、TBC1D7のタンパク質レベルは低下したが、TBC1D7の転写レベルは変化しなかった(図4E、左のパネル)。一方、TSC1の過剰発現はTBC1D7タンパク質の増加をもたらしたが、TBC1D7転写物の発現レベルは変化しなかった(図4E、右のパネル)。si-TSC1で処理した細胞におけるTBC1D7タンパク質の減少は、TSC1を発現するプラスミドの誘導によって補償され(図4F)、このことはTSC1と相互作用を通してTBC1D7タンパク質が安定化される可能性および、TSC1の細胞成長促進への寄与の可能性を示唆している。
TBC1D7のドミナントネガティブペプチドによる肺癌細胞の成長阻害
これらの2種のタンパク質の相互作用の生物学的意義をさらに調べるために、そのN末端にFlag配列のあるTBC1D7の3種の部分的構築物のいずれか(TBC1-231、TBC51-293及びTBC51-231;図5A、左のパネル)で、COS-7細胞をトランスフェクトした。モノクローナル抗Flag抗体との免疫沈降により、どの構築物も内因性TSC1と相互作用しうることが示された(図5A、右上のパネル)。TBC51-231中の最小限かつ高親和性のTSC1結合ドメインの範囲をさらに明確にするために、TBC1D7のさらに3種の構築物(TBC51-111、TBC112-171及びTBC172-231;図5A、左のパネル)でCOS-7細胞をトランスフェクトしたところ、TBC112-171はTSC1と相互作用することができるが、TBC51-111及びTBC172-231はできないことが見いだされた(図5A、右下のパネル)。これらの実験により、TBC1D7中の60アミノ酸ポリペプチド(コドン112〜171)はTSC1との相互作用において重要な役割を果たすであろうことが示唆された。
これらの2種のタンパク質の相互作用の生物学的意義をさらに調べるために、そのN末端にFlag配列のあるTBC1D7の3種の部分的構築物のいずれか(TBC1-231、TBC51-293及びTBC51-231;図5A、左のパネル)で、COS-7細胞をトランスフェクトした。モノクローナル抗Flag抗体との免疫沈降により、どの構築物も内因性TSC1と相互作用しうることが示された(図5A、右上のパネル)。TBC51-231中の最小限かつ高親和性のTSC1結合ドメインの範囲をさらに明確にするために、TBC1D7のさらに3種の構築物(TBC51-111、TBC112-171及びTBC172-231;図5A、左のパネル)でCOS-7細胞をトランスフェクトしたところ、TBC112-171はTSC1と相互作用することができるが、TBC51-111及びTBC172-231はできないことが見いだされた(図5A、右下のパネル)。これらの実験により、TBC1D7中の60アミノ酸ポリペプチド(コドン112〜171)はTSC1との相互作用において重要な役割を果たすであろうことが示唆された。
TBC1D7のTSC1との機能的関連を阻害することのできる生理活性のある細胞透過性ペプチドを開発するために、TBC112-171中のTSC1結合ドメインを範囲に含み、膜透過性の11個のアルギニン残基(11R)をそのN末端に有する3種類の20アミノ酸ポリペプチド(11R-TBC1D7112-131、11R-TBC1D7132-151及び11R-TBC1D7152-171)を合成した。これらの多価アルギニン連結ペプチドの肺癌細胞成長/生存に対する影響を検証するために、LC319をこの3種のペプチドのそれぞれで処理した。培地への11R-TBC1D7152-171の添加により、TBC1D7とTSC1との間の複合体形成が阻害され(図5B)、MTTアッセイによる測定で細胞生存度の有意な低下がもたらされた(図5C;15μMのペプチド処理ではP<0.0001、20μMではP<0.0001、独立t検定による)。一方、細胞を残りの2種のペプチド(11R-TBC1D7112-131及び11R-TBC1D7132-151)で処理した場合には、細胞成長に対する影響は観察されなかった。11R-TBC1D7152-171は、TBC1D7発現がほとんど検出不能な正常ヒト肺線維芽細胞由来のCCD19Lu細胞の細胞生存度には影響を及ぼさないことが判明した(図5D)。これらのデータにより、11R-TBC1D7152-171ペプチドはTBC1D7及びTSC1の機能的な複合体形成を阻害することができ、かつTBC1D7タンパク質を発現しない正常ヒト細胞に対するオフターゲット毒性作用を有しないことが示唆された。
考察
新たな分子標的抗癌薬の開発にもかかわらず、生存利得を有する患者の割合は依然として極めて限られており、彼らの中には重篤な有害作用を被る者もある。そこで、本発明は、現行の治療法よりも効率的な抗癌作用を有し、かつ有害反応はわずかである低分子化合物を開発するための治療標的を同定するのに有効なシステムを確立した(Kikuchi T. et al. 癌遺伝子 2003;22:2192-205., Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99., Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43., Kikuchi T. et al. Int J Oncol 2006;28:799-805., Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75., Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84.)。この戦略は以下の通りである;1)肺癌及び食道癌においてアップレギュレートされる遺伝子をcDNAマイクロアレイシステムを用いるゲノムワイドスクリーニングによって同定すること、2)cDNAマイクロアレイ及びノーザンブロット分析により、候補遺伝子を正常組織における発現が存在しないか又は低レベルであることに関して検証すること、3)アーカイブ化された数百の肺癌試料におけるそれらの過剰発現を組織マイクロアレイによって確認し、臨床病理学的因子との相関と検討すること、4)標的遺伝子が癌細胞の細胞成長又は生存に必須であるか否かをRNAiアッセイによって検証すること、及び5)癌特異的オンコプロテインから、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を強化するエピトープをスクリーニングすること。この系統的アプローチにより、TBC1D7が、臨床的な肺癌及び食道癌の試料の大多数において過剰発現されるオンコプロテインであり、発癌のために必須であることが見いだされた。
新たな分子標的抗癌薬の開発にもかかわらず、生存利得を有する患者の割合は依然として極めて限られており、彼らの中には重篤な有害作用を被る者もある。そこで、本発明は、現行の治療法よりも効率的な抗癌作用を有し、かつ有害反応はわずかである低分子化合物を開発するための治療標的を同定するのに有効なシステムを確立した(Kikuchi T. et al. 癌遺伝子 2003;22:2192-205., Kakiuchi S. et al. Mol Cancer Res 2003;1:485-99., Kakiuchi S. et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43., Kikuchi T. et al. Int J Oncol 2006;28:799-805., Taniwaki M. et al. Int J Oncol 2006;29:567-75., Yamabuki T. et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84.)。この戦略は以下の通りである;1)肺癌及び食道癌においてアップレギュレートされる遺伝子をcDNAマイクロアレイシステムを用いるゲノムワイドスクリーニングによって同定すること、2)cDNAマイクロアレイ及びノーザンブロット分析により、候補遺伝子を正常組織における発現が存在しないか又は低レベルであることに関して検証すること、3)アーカイブ化された数百の肺癌試料におけるそれらの過剰発現を組織マイクロアレイによって確認し、臨床病理学的因子との相関と検討すること、4)標的遺伝子が癌細胞の細胞成長又は生存に必須であるか否かをRNAiアッセイによって検証すること、及び5)癌特異的オンコプロテインから、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を強化するエピトープをスクリーニングすること。この系統的アプローチにより、TBC1D7が、臨床的な肺癌及び食道癌の試料の大多数において過剰発現されるオンコプロテインであり、発癌のために必須であることが見いだされた。
TBC1D7に対する特異的siRNAのNSCLC細胞へのトランスフェクションは、その発現を低下させ、成長抑制をもたらした。それに一致して、哺乳動物COS-7細胞におけるTBC1D7の誘導は、インビトロでの細胞成長及びマウスにおけるインビボ腫瘍形成を促進した。さらに、本発明者らの組織マイクロアレイ実験を通じての臨床病理学的な証拠により、TBC1D7を強発現する腫瘍を有するNSCLC患者は、TBC1D7発現が陰性であるか又は弱い患者よりも、短い癌特異的生存期間を示すことが実証された。インビトロ及びインビボでのアッセイによって得られた結果は、過剰発現されたTBC1D7が肺腫瘍形成における重要な分子であることを実証している。これは、本発明者らの知る限り、TBC1D7の発癌機能及び予後判定的な価値を示した初めての研究である。
TBCドメインを含むタンパク質は、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)として作用し、Rab様低分子Gタンパク質との相互作用を通じて機能することが示されている。Rabタンパク質の多くは、小胞融合、受容体リサイクリング、膜輸送及び細胞分裂などの基本的な生物的なプロセスと関連している(Zerial M and McBride H. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:107-17.)。各RabメンバーはGDPが結合した不活性状態とGTPが結合した活性状態を周期的に繰り返し、GTPが結合した活性化形態はエフェクター分子との特異的相互作用を通じて膜輸送を媒介し、それらの機能を制御する(Zerial M and McBride H. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:107-17., Pfeffer SR. Trends Cell Biol. 2001;11:487-91., Stenmark H and Olkkonen VM. Genome Biol. 2001;2 REVIEWS3007)。鍵となる2種の酵素ファミリーであるグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)及びGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)は一般に、RabのGDP/GTPサイクリングを制御すると考えられている(Zerial M and McBride H. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:107-17., Segev N. Sci STKE. 2001;100:RE11.)。最近、一次線毛形成における生化学的GAPアッセイによって、TBC1D7はRab17に対して作用すると報告されている(Yoshimura S. et al. J Cell Biol. 2007;178:363-9)。Rab17は以前、細胞極性化の際に誘導されること、及び極性化上皮細胞におけるアピカルソーティング(apical sorting)エンドソームの機能に関与することが報告されているが(Lutcke A. et al. J Cell Biol. 1993;121:553-64., Zacchi P. et al. J Cell Biol. 1998;140:1039-53.)、癌細胞におけるRAB17の機能は記載されていない。免疫沈降アッセイを用いて、TBC1D7とRAB17との間の相互作用を確認した。GAPは、Gタンパク質についての本来は緩徐なGTPアーゼ活性を強化して、それらの不活性化を引き起こし、そうすることで各々のGタンパク質によって制御される細胞経路をモジュレートする(Bernards A. Biochim Biophys Acta 2003;1603:47-82, Chavrier P, Goud B. Curr Opin Cell Biol 1999;11:466-75)。TBCドメインを含むいくつかのタンパク質は、発癌における関与が報告されている(Pei L, Peng Y, Yang Y, et al. Cancer Res 2002;62:5420-24)。例えば、TRE17癌遺伝子はユーイング肉腫で発現し、Rho GTPアーゼであるCdc42及びRac1のエフェクター経路の構成要素としてアクチンリモデリングに関与する(Masuda-Robens JM, Kutney SN, Qi H, et al. Mol Cell Biol 2003;23:2151-61)。
一方、TBC1D7はコンセンサスmode-1 14-3-3結合モチーフ(RSxpSxP)を有しており、TBC1D7と14-3-3ζとの間の相互作用が免疫沈降アッセイを用いて実証された。14-3-3タンパク質は高度に保存された細胞タンパク質のファミリーであり、中心的な生理的経路の調節において鍵となる役割を果たす。200種を上回る14-3-3標的タンパク質が同定されており、これには有糸分裂及び細胞生存のシグナル伝達、細胞周期制御、並びにアポトーシス性細胞死に関与するタンパク質が含まれる。重要なことには、さまざまな癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の調節における14-3-3タンパク質の関与が、ヒト癌において潜在的な役割を果たしていると指摘されている(Tzivion G. et al. Semin Cancer Biol. 2006;16:203-13.)。最適な結合モチーフは、すべての14-3-3アイソフォームによって認識されるmode-1(RSXpSXP)及びmode-2(RXF/YXpSXP、ここでpSはホスホセリン又はホスホトレオニンを表す)配列に対応する(Gardino AK et al. Semin Cancer Biol. 2006;16:173-82.)。TBC1D7のリン酸化は、本発明者らのホスファターゼアッセイでは全く検出されず(データ示さず)、このことはこの相互作用が間接的である可能性を示唆している。TBC1D7中の14-3-3結合モチーフの今後の研究は、これらのタンパク質とTBC1D7の発癌機能との関連を理解する一助になると考えられる。
本明細書中のデータは、TSC1がTBC1D7と相互作用してそれを安定化しうることを明らかにした。TBC1D7のドミナントネガティブ細胞透過性ペプチドを用いてのこれらの分子の相互作用の阻害は、癌細胞成長の抑制をもたらし、このことはこの相互作用が癌細胞の成長において決定的な役割を果たすことを示している。重要なことは、この透過性ペプチドはTBC1D7を発現しない正常ヒト細胞に対しては毒性作用を及ぼさないことである。癌細胞におけるTBC1D7-TSC1複合体の詳細な機能はまだ明らかになっていないが、TBC1D7-TSC1複合体ならびにTBC1D7機能の特異的阻害は、肺癌を治療するための有効なアプローチである可能性が高い。
TSC1は130kDaタンパク質をコードし、結節性硬化症複合体(TSC)におけるTSC1の喪失は、悪性リスクの低い過誤腫などの良性腫瘍症候群の原因である(Consortium TEC1T. Cell 1993;75:1305-15, Crino PB, Nathanson KL, Henske EP. N Engl J Med 2006;355:1345-56, Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Mol Cell Biol 2008;28:4104-15)。TSC1-TSC2複合体は細胞内のシグナル統合ノード(signal-integrating node)において中心的な役割を果たす(Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Mol Cell Biol 2008;28:4104-15)。興味深いことに、最近の研究により、高レベルのTSC2発現は乳癌患者における腫瘍浸潤性の増大及び予後不良と相関することが示唆されている(Liu H, Radisky DC, Nelson CM, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:4134-9)。TSC1-TSC2複合体はmTORC1の決定的な上流阻害因子であることが今や明らかであるが、この複合体の他の下流標的の調節における役割は依然として不明である(Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Mol Cell Biol 2008;28:4104-15)。事実、TSC1-TSC2複合体の喪失は、AKTリン酸化の全般的な低下を招き(Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Mol Cell Biol 2008;28:4104-15)、このことはTSC1発現が細胞生存において重要な役割を果たすことを示し得る。TSC1の発現が肺癌細胞におけるmTORC1経路に影響しうるか否かをさらに評価するために、LC319細胞におけるTSC1の抑制又は過剰発現後に、mTORC1の下流標的であるp-rpS6(Ser235/236)のレベルを調べた。TSC1に対するsiRNAを用いたLC319細胞の処理によって、内因性TSC1の発現は抑制され、TBC1D7タンパク質のレベルは低下したが、p-rpS6(Ser235/236)タンパク質のレベルは変化しなかった(図6、左のパネル)。一方、TSC1の過剰発現はTBC1D7タンパク質の増加をもたらしたが、p-rpS6(Ser235/236)タンパク質のレベルは影響されなかった(図6、右のパネル)。これらの結果は、TSC1-TSC2複合体の機能は、肺癌細胞におけるmTORC1経路とは独立していることを示唆し得る。
まとめると、ヒトTBC1D7は肺癌及び食道癌の成長/生存及び悪性度の性質において重要な機能的役割を有する。本発明者らのデータは、TBC1D7の酵素活性を特異的に標的とする新たな低分子化合物を設計するための手段を提供する。摘出した腫瘍標本におけるTBC1D7の過剰発現は、予後不良である可能性が高い患者へのアジュバント療法の適用のための予後判定用バイオマーカーとして有用な指標となる。
産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクション及びゲノムワイドcDNAマイクロアレイの組み合わせを用いた、本明細書に記載した癌の遺伝子発現解析により、複数の特定遺伝子が癌の予防及び治療法のための標的として同定された。差異を伴って発現されるこれらの遺伝子のサブセットの発現に基づき、本発明は、癌を同定及び検出するため、ならびに予後を判定するための分子診断用マーカーを提供する。
レーザーキャプチャーダイセクション及びゲノムワイドcDNAマイクロアレイの組み合わせを用いた、本明細書に記載した癌の遺伝子発現解析により、複数の特定遺伝子が癌の予防及び治療法のための標的として同定された。差異を伴って発現されるこれらの遺伝子のサブセットの発現に基づき、本発明は、癌を同定及び検出するため、ならびに予後を判定するための分子診断用マーカーを提供する。
また、本明細書に記載した方法は、癌の予防、診断及び治療のためのさらなる分子標的の同定のためにも有用である。本明細書に提示したデータは、癌の包括的理解を高め、新規な診断戦略の開発を助長し、治療薬及び予防薬の分子標的の同定の手がかりを与える。そのような情報は、腫瘍形成のより深い理解に寄与し、癌の診断、治療、そして究極的には予防のための新規戦略の開発のための指標を与える。
本明細書中に引用したすべての特許、特許出願及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
さらに、本発明を詳細に、その具体的な態様を参照しながら説明してきたが、前記の説明は例示的及び説明的な性質のものであり、本発明及びその好ましい態様を例証することを意図したものであることが理解されるべきである。定型的な実験を通じて、当業者は本発明の精神及び範囲から逸脱することなしにさまざまな変更及び改変をそれに加えうることを容易に認識するであろう。したがって、本発明は、上記の説明によってではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されるものとする。
Claims (39)
- 対象における癌の検出又は診断の方法であって、患者由来の生物試料におけるTBC1D7の発現レベルを決定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの上昇が、該対象が癌に罹患しているか又は癌を発症するリスクを有することを示し、その発現レベルが以下からなる群より選択されるいずれか1つの方法によって決定される方法:
(a)TBC1D7のmRNAを検出する段階、
(b)TBC1D7によってコードされるタンパク質を検出する段階、及び
(c)TBC1D7によってコードされるタンパク質の生物活性を検出する段階。 - 前記上昇が、正常対照レベルを少なくとも10%上回る、請求項1記載の方法。
- 患者由来の生物試料が生検試料である、請求項1記載の方法。
- 癌が肺癌及び食道癌からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- TBC1D7の転写産物又は翻訳産物と結合する検出用試薬を含む、癌の検出又は診断のためのキット。
- 肺癌及び/又は食道癌の患者の予後を評価するための方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)生物試料におけるTBC1D7の発現レベルを検出する段階;及び
(b)検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階;及び
(c)(b)の比較に基づいて患者の予後を判定する段階。 - 対照レベルが予後良好な対照レベルであり、該対照レベルと比較した発現レベルの上昇が予後不良と判定される、請求項6記載の方法。
- 前記上昇が対照レベルを少なくとも10%上回る、請求項7記載の方法。
- 前記発現レベルが、以下からなる群より選択されるいずれか1つの手段によって決定される、請求項6記載の方法:
(a)TBC1D7のmRNAを検出すること;
(b)TBC1D7によってコードされるタンパク質を検出すること;及び
(c)TBC1D7によってコードされるタンパク質の生物活性を検出すること。 - 癌の治療もしくは予防又は癌細胞成長の阻害のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
a)試験化合物を、TBC1D7によってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
b)該ポリペプチドと試験化合物との間の結合活性を検出する段階;及び
c)該ポリペプチドと結合する化合物を選択する段階。 - 癌の治療もしくは予防又は癌細胞成長の阻害のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
a)試験化合物を、TBC1D7を発現する細胞と接触させる段階;及び
b)TBC1D7の発現レベルを低下させる化合物を選択する段階。 - 癌の治療もしくは予防又は癌細胞成長の阻害のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
a)試験化合物を、TBC1D7によってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
b)段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;及び
c)該ポリペプチドの生物活性を、試験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して抑制する化合物を選択する段階。 - 生物活性が細胞増殖活性又は浸潤活性である、請求項12記載の方法。
- 癌の治療もしくは予防又は癌細胞成長の阻害のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
a)試験化合物を、TBC1D7遺伝子の転写調節領域及び該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、
b)該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する段階;及び
c)該レポーター遺伝子の発現又は活性のレベルを、試験化合物の非存在下におけるレベルと比較して低下させる化合物を選択する段階。 - TBC1D7ポリペプチドと14-3-3ζポリペプチド、RAB17ポリペプチド又はTSC1ポリペプチドとの間の結合の阻害のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)TBC1D7ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験薬剤の存在下で、14-3-3ζ、RAB17又はTSC1ポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる段階;
(b)該ポリペプチド間の結合を検出する段階;
(c)段階(b)で検出された結合レベルを、試験薬剤の非存在下で検出されるレベルと比較する段階;及び
(d)段階(c)において試験薬剤の非存在下で検出されたレベルと比較して、結合レベルを低下させるか阻害する試験薬剤を選択する段階。 - TBC1D7の機能的等価物が、14-3-3ζ結合ドメイン、RAB17結合ドメイン又はTSC1結合ドメインを含む、請求項15記載の方法。
- 癌が肺癌又は食道癌である、請求項10、11、12及び14記載の方法。
- センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、センス鎖が配列番号18又は19からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖が該センス鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖及び該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子がTBC1D7遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。 - 約19〜約25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項18記載の二本鎖分子。
- 一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写物である、請求項18記載の二本鎖分子。
- 前記ポリヌクレオチドが、一般式:
5'-[A]-[B]-[A’]-3'
を有し、式中、[A]が、配列番号18又は19を含むヌクレオチド配列であり;[B]が、約3〜約23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A’]が、[A]に対して相補的なヌクレオチド配列である、請求項20記載の二本鎖分子。 - TBC1D7遺伝子を発現する細胞が、膀胱癌細胞、胃癌細胞、結腸及び直腸癌細胞、乳癌細胞、食道癌細胞、肺癌細胞、リンパ腫細胞、膵癌細胞並びに精巣癌細胞の群から選択される、請求項18記載の二本鎖分子。
- センス鎖核酸及びアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドのそれぞれ又は両方を含むベクターであって、該センス鎖核酸が配列番号18又は19のヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖及び該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該ベクターがTBC1D7遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、ベクター。
- ポリヌクレオチドが約19〜約25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項23記載のベクター。
- 二本鎖分子が、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写物である、請求項23記載のベクター。
- ポリヌクレオチドが一般式:
5'-[A]-[B]-[A’]-3'
を有し、式中、[A]が、配列番号18又は19を含むヌクレオチド配列であり;[B]が、約3〜約23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A’]が、[A]に対して相補的なヌクレオチド配列である、請求項25記載のベクター。 - 対象における癌の治療もしくは予防の方法であって、TBC1D7に対する二本鎖分子の薬学的有効量、又はTBC1D7遺伝子を発現する細胞と接触して細胞増殖を阻害する該二本鎖分子を含むベクターの薬学的有効量と、薬学的に許容される担体とを該対象に投与する段階を含む、方法。
- 二本鎖分子が請求項18記載のものであり、ベクターが請求項23記載のものである、請求項27記載の方法。
- 癌が肺癌及び食道癌から選択される、請求項27記載の方法。
- TBC1D7に対する二本鎖分子の薬学的有効量、又はTBC1D7遺伝子を発現する細胞と接触して細胞増殖を阻害する該二本鎖分子を含むベクターの薬学的有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、癌の治療又は予防のための組成物。
- 二本鎖分子が請求項18記載のものであり、ベクターが請求項23記載のものである、請求項30記載の組成物。
- 癌が肺癌及び食道癌の群から選択される、請求項30記載の組成物。
- 以下からなる群より選択されるポリペプチド;
(a)YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含むポリペプチド、及び
(b)YWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)からなるポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、
配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドの生物学的機能を欠くポリペプチド。 - 請求項33記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 生物学的機能が細胞増殖活性又は浸潤活性である、請求項33記載のポリペプチド。
- 20〜60残基からなる、請求項33記載のポリペプチド。
- 細胞膜透過性物質によって修飾されている、請求項33記載のポリペプチド。
- 以下の一般式:
[R]-[D];
を有し、式中、[R]が細胞膜透過性物質を表し;[D]がYWITRRFVNQLNTKYRDSLP(配列番号28)を含む断片配列のアミノ酸配列;又は該断片配列を含むポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列を表し、該ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドの生物学的機能を欠き、[R]及び[D]が直接的に連結されてもよく、又はリンカーを介して間接的に連結されてもよい、請求項37記載のポリペプチド。 - 細胞膜透過性物質が以下のものからなる群より選択されるいずれか1つである、請求項38記載のポリペプチド:
ポリアルギニン/RRRRRRRRRRR/配列番号43;
Tat/RKKRRQRRR/配列番号29;
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/配列番号30;
ブフォリンII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/配列番号31;
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/配列番号32;
MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA/配列番号33;
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/配列番号34;
Ku70/VPMLK/配列番号35;
Ku70/PMLKE/配列番号36;
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/配列番号37;
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/配列番号38;
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/配列番号39;
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/配列番号40;
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/配列番号41;及び
HN-1/TSPLNIHNGQKL/配列番号42。
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