CN109722416A - 一种纯化培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞的培养，具体涉及一种可长期培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基配方及其使用方法。首先通过机械离解制作大脑及脊髓细胞悬液，利用原代大鼠少突胶质前体细胞可在多聚赖氨酸包被的培养底物上快速贴壁的特点，获取富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞。在含有PDGF、Purmorphamine、N2添加剂及微量血清的培养基中培养，使少突胶质前体细胞大量增殖。5～6天后，撤除培养基中微量血清2～3天，使少突胶质前体细胞粘附力暂时降低，同时结合短暂机械震荡方式选择性分离、纯化少突胶质前体细胞。获得的细胞能够长期维持增殖能力，保持较高纯度，具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞的培养，具体涉及一种能够长期体外培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基配方组成以及利用这种培养基进行少突胶质前体细胞的分离、扩增和进一步纯化的方法。
背景技术
少突胶质前体细胞在中枢神经系统内发挥着多种重要功能，它们不仅能够分化为成熟的少突胶质细胞，维持神经纤维电冲动的正常传导，而且能够与神经元形成突触联系，并且可以产生多种营养因子以支持和保护神经元(Lin SC,Bergles DE.Synapticsignaling between GABAergic interneurons and oligodendrocyte precursor cellsin the hippocampus.Nat Neurosci 2004；7:24-32.)(Lee Y,Morrison BM,Li Y,Lengacher S,Farah MH,Hoffman PN,et al.Oligodendroglia metabolically supportaxons and contribute to neurodegeneration.Nature 2012；487:443-8.)。在体外获取并纯化少突胶质前体细胞进行研究，不仅有助于进一步明确它们在发育和成熟阶段的生物学功能与特性，而且也为相关神经疾病如脊髓损伤、多发性硬化等的细胞移植治疗研究，提供重要的前提条件和基础。
目前分离及纯化培养少突胶质前体细胞的方法，主要包括混合胶质细胞培养后振摇分离法(McCarthyKD,de Vellis J.Preparation ofseparate astroglial andoligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.J Cell Biol 1980；85:890-902)，免疫吸附纯化法(Shi J,MarinovichA,Barres BA.Purification andcharacterization of adult oligodendrocyte precursor cells from the rat opticnerve.J Neurosci1998；18:4627-36.)，神经干细胞定向诱导法(ChenY,BalasubramaniyanV,Peng J,Hurlock EC,Tallquist M,Li J,et al.Isolation and culture ofratandmouse oligodendrocyte precursor cells.Nat Protoc 2007；2:1044-51.)。此外，还有少量文献报道采用神经母细胞瘤B104的条件培养基来促使原代少突胶质前体细胞增殖并形成克隆球。
混合胶质细胞培养后振摇分离法是获取大鼠少突胶质前体细胞的最常用方法之一，是通过将新生鼠大脑皮质等处的原代混合胶质细胞在含10～20％胎牛血清的培养基中培养大约7～12天，待胶质细胞分层后，通过恒温摇床过夜振摇，来促使上层的少突胶质前体细胞脱落；免疫吸附纯化法，主要是通过针对少突胶质前体细胞胞膜上的抗原，利用特异性抗体包被的培养皿等来特异性吸附细胞悬液中的少突胶质前体细胞，或通过免疫磁珠、流式细胞仪等仪器方法筛选分离特异性标记的细胞；神经干细胞定向诱导法，是首先将胚胎或新生期的神经组织解离后进行悬浮培养产生神经干细胞克隆，再通过定向诱导的方法如添加血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor PDGF)等，使一部分神经干细胞球转变为少突胶质前体细胞球。
但是迄今为止，上述培养基以及技术方法尚存以下缺陷：1)混合胶质细胞培养方法中，少突胶质前体细胞需要在含有高浓度血清(10～20％)的培养基中长期培养增殖，这与少突胶质前体细胞自身体内的生长环境之间存在明显差异，已知较高浓度血清对于少突胶质前体细胞的生物学特性存在明显而复杂的影响，能够促使少突胶质前体细胞在体外分化为2型星形胶质细胞，甚至可在bFGF(basic fibroblast growth factor bFGF)的协同作用下，诱使少突胶质前体细胞去分化成为神经干细胞(Kondo T,Raff M.Oligodendrocyteprecursor cells reprogrammed to become multipotential CNS stem cells.Science2000；289:1754-7.)。2)免疫吸附纯化法，获取细胞过程需要的抗体数量及种类较多，价格昂贵；同时分离操作步骤复杂，对操作人员实践经验或仪器设备要求条件较高，并且较长的操作时间、吸附于细胞表面的抗体，都有可能对细胞的活性以及细胞生物学性状产生不利影响。3)神经干细胞定向诱导，实际上包括获取并培养神经干细胞和定向诱导两个步骤。实验不仅有时要处死怀孕母鼠、准备和培养过程费时而昂贵，而且在定向诱导过程中可能会因为诱导的特异选择作用而出现细胞永生化等变异，从而使获取细胞与正常发育的少突胶质前体细胞存在差异。同时，这种永生化等变异也同样存在于使用B104条件培养基来诱导少突胶质前体细胞增殖和形成克隆球的过程中，此外B104条件培养基需要单独制备、保存，其中促使少突胶质前体细胞增殖的成分较复杂，目前作用机理尚未完全明确。
嘌呤衍生物Purmorphamine是一种小分子化合物(分子量520)。此前发现，Purmorphamine能够作为Sonic Hedgehog(SHH)蛋白的替代物，激活Shh信号通路，特异性诱导前体细胞向少突胶质细胞方向分化(Hu BY,Du ZW,Li XJ,Ayala M,Zhang SC.Humanoligodendrocytes from embryonic stem cells:conserved SHH signaling networksand divergent FGF effects.Development 2009；136:1443-52.)。同时，近年来利用细胞黏附强度的差异来分离纯化特定类型的细胞，已有较多实验报道(Liang X,Osman TA,Sapkota D,Neppelberg E,Lybak S,Liavaag PG,et al.Rapid adherence to collagenIV enriches for tumour initiating cells in oral cancer.Eur J Cancer 2014；50:3262-70.)(SinghA,Suri S,Lee T,Chilton JM,Cooke MT,Chen W,et al.Adhesionstrength-based,label-free isolation ofhuman pluripotent stem cells.NatMethods 2013；10:438-44.)。这为我们发现一种能够长期体外培养大鼠少突胶质前体细胞的新培养基配方以及利用这种培养基进行少突胶质前体细胞的分离、扩增和进一步纯化，提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种从新生大鼠大脑皮质及脊髓组织快速获取少突胶质前体细胞的培养基配方及其使用方法；进一步提供一种不需要高浓度血清刺激和抗体吸附标记的大鼠少突胶质前体细胞。
本发明方法通过机械离解方法制作大鼠大脑皮质及脊髓组织细胞悬液，利用大鼠少突胶质前体细胞可在多聚赖氨酸包被的培养底物上快速贴壁的特点，获取富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞。将获取的贴壁细胞在含有PDGF、Purmorphamine、N2神经细胞生长添加剂及0.5％胎牛血清的特定培养基中培养，促使贴壁少突胶质前体细胞快速大量增殖。培养5～6天，将培养基中微量血清短暂撤除2～3天，促使少突胶质前体细胞出现可逆性突起回缩、胞体变圆，与底物的粘附性明显降低，而其它非少突胶质前体细胞仍牢固贴壁。同时，结合短暂机械震荡方法，使上述少突胶质前体细胞脱壁，获取较高纯度的少突胶质前体细胞。获取的细胞可在上述培养基中连续传代培养，并具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。获取的细胞也可在含B27添加剂的无血清培养基中长期增殖。
上述制备方法中，所述的新生大鼠指出生1～3天的SD大鼠。
所述的机械解离是指通过吸管吹打方式解离组织，不应用任何消化酶。
所述的快速贴壁是指细胞悬液在室温静置10～15分钟。
所述的多聚赖氨酸是指右旋多聚赖氨酸或左旋多聚赖氨酸，分子量大于70000。
具体而言，本发明利用一种新培养基从新生大鼠神经组织进行少突胶质前体细胞的粘附分离、扩增和进一步纯化，其特征在于，包括以下步骤：
(1)新生大鼠大脑皮质及脊髓组织的获取和机械解离：
无菌状态下分离新生大鼠大脑皮质或脊髓，通过单纯机械解离方法制备细胞悬液并过滤。
(2)细胞悬液中细胞的短暂粘附：
将细胞悬液混匀后，置于涂布多聚赖氨酸的细胞培养瓶及培养板内。静置贴壁10～15分钟(室温25℃左右)，静置过程避免震动。静置结束后，轻轻倾斜培养瓶及培养板，吸除全部液体。
(3)富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞的培养：
将培养基沿着培养瓶壁及板壁轻轻加入，避免对贴壁细胞的冲击。将细胞置于37℃、5％CO2条件下静置培养。培养基每2天完全换液一次，换液前，适度手工摇晃震荡培养细胞，促使一些细胞碎片团块及死亡细胞脱壁。
(4)利用特定成分短暂撤除方法降低少突胶质前体细胞粘附性
细胞培养5～6天后，大量少突胶质前体细胞增殖。将培养基中0.5％胎牛血清成分撤除后，继续培养2～3天后，少突胶质前体细胞出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积明显变少，易于脱壁。其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞形态无明显改变。
(5)利用短暂机械震荡分离方法纯化少突胶质前体细胞：
将上述培养细胞在无菌操作台内轻轻震荡敲击，使大部分少突胶质前体细胞脱壁，而绝大部分非少突胶质前体细胞仍然贴壁。收集脱壁少突胶质前体细胞进行培养，换为含有0.5％胎牛血清的培养基。
(5)少突胶质前体细胞的长期培养及诱导
细胞6～8天传代一次，利用上述短暂血清撤除结合机械震荡方法分离细胞，按1:2或1:3进行传代培养，或更换为含2％B27添加剂的无血清培养基；诱导分化时，将细胞培养基中的PDGF以及Purmorphamine撤除，添加三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次，促使细胞分化成熟。
本发明提供了一种能够长期体外培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基，并利用细胞粘附强度差异从新生大鼠神经组织中获取并纯化培养少突胶质前体细胞。
本发明对获取的的大鼠少突胶质前体细胞及其分化而来的少突胶质细胞进行体外特征鉴定，鉴定步骤为：
(1)大鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞的体外特征鉴定：
在体外对大鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞进行细胞形态观测和细胞免疫荧光染色等指标检测，鉴定大鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞的体外特征；
本发明对获取的的大鼠少突胶质前体细胞及其分化而来的少突胶质细胞进行体外特征鉴定，鉴定结果为：
(1)大鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞在体外：
大鼠少突胶质前体细胞呈现双极及三级突起，符合少突胶质前体细胞的典型形态特征；表达少突胶质前体细胞特异性标志物，包括：细胞表面神经节苷脂A2B5、硫酸软骨素蛋白多糖NG2。
分化产生的少突胶质细胞呈现密集分支突起，部分呈蜘蛛网状，符合少突胶质细胞的典型形态特征；表达少突胶质细胞特异性标志蛋白，包括：半乳糖脑苷脂酶(galactocerebroside GC)和髓鞘碱性蛋白(myelinbasic protein MBP)。
本发明提供了一种能够长期体外培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基，并利用细胞粘附强度差异从新生大鼠神经组织中获取并纯化培养少突胶质前体细胞，有如下优点：
1、本培养基配方简单，配制方便，价格相对低廉；本培养基可以连续传代培养大鼠少突胶质前体细胞60天以上，细胞存活状态稳定，死亡率低，增殖迅速；同时，本培养基更换为添加B27的无血清培养液后，少突胶质前体细胞生长正常，提示本培养基不存在对少突胶质前体细胞进行定向选择与淘汰的缺点。
2、可通过培养基中特定成分(微量血清)的增减，暂时改变少突胶质前体细胞粘附性，并结合简单机械分离，达到分离纯化少突胶质前体细胞的目的。操作过程步骤简单，获取细胞方便迅速，可重复性强。
3、在细胞分离、纯化、传代过程不需要任何酶消化，避免了酶消化对少突胶质前体细胞可能带来的损伤。
4、从原代细胞培养开始即避免了高浓度血清对少突胶质前体细胞的影响；同时培养过程中不需添加bFGF，避免了bFGF对细胞的刺激。
附图说明
图1显示了新生SD大鼠大脑皮质原代细胞悬液在多聚赖氨酸包被的培养底面上短暂黏附15分钟后在添加PDGF、Purmorphamine和0.5％胎牛血清的培养基中培养3、5、8天(已撤除血清2天)时，在倒置显微镜下的检测结果。培养3天后，可见大量少突胶质前体细胞出现，细胞呈典型的双极或三极形态。伴随培养时间延长，细胞数目快速增多。在撤除血清2天后，可见大部分少突胶质前体细胞突起回缩、胞体变圆，与培养底面的接触面积变少。白色箭头所示为粘附的其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞等，扁平多突起，在撤除血清时形态无明显变化。
图2显示了新生SD大鼠脊髓原代细胞悬液在多聚赖氨酸包被的培养底面上短暂黏附10分钟后在添加PDGF、Purmorphamine和0.5％胎牛血清的培养基中培养5天时，在倒置显微镜下以及进行免疫细胞化学检测的结果。中图和右图显示原代培养细胞呈A2B5及NG2免疫细胞化学荧光检测阳性。
图3显示了突起回缩的少突胶质前体细胞经震荡脱壁后传代接种，并重新加入0.5％胎牛血清进行培养时，在倒置显微镜下的检测结果。可见多数细胞呈典型的双极或三极形态。右图显示为连续传代5次的少突胶质前体细胞，细胞形态无明显改变。
图4显示了连续传代后的少突胶质前体细胞在更换为无血清培养基(添加B27添加剂)后在倒置显微镜下以及进行免疫细胞化学检测的结果。可见大部分细胞仍呈典型的双极或三极形态，大部分细胞呈NG2免疫细胞化学荧光检测阳性(>95％)。
图5显示了少突胶质前体细胞在撤除PDGF与Purmorphamine并添加T3的培养基中分化5天后，在倒置显微镜下以及进行NG2/GC/MBP免疫细胞化学荧光检测的结果。可见大多数细胞突起密集分支蜘蛛网状，呈GC/MBP阳性，提示为分化成熟的少突胶质细胞。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中，未具体注明实施条件和方法处，均为按照常规实验方案，如《分子克隆实验指南(第三版)》([美]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，2003)中所述方法或试剂生产商建议方案来开展。
实施例1：多聚赖氨酸预涂培养瓶培养板
将溶于无菌蒸馏水(10mg/ml)的右旋多聚赖氨酸(PDL,Sigma公司P6407)或左旋多聚赖氨酸(PLL,Sigma公司P6282)溶液，用滤膜过滤除菌(0.22μm)后，吸入25ml培养瓶(Nunc公司)及6孔培养板(Corning公司)以及12孔培养板(内置经过泡酸及高温消毒处理后的盖玻片)。置于4℃过夜后，吸除多聚赖氨酸溶液，将培养瓶及培养板置于无菌37℃细胞箱或无菌超净台内，彻底晾干。收藏于4℃或室温保存(保存至少3周)。使用之前，用消毒蒸馏水至少清洗2遍。
实施例2：新生大鼠大脑皮质及脊髓组织的获取和机械分离
取新生1～3天的SD大鼠，经低温麻醉后，在无菌条件下取出大脑，浸泡在盛有4℃预冷D-PBS的玻璃培养皿中，去除嗅球及海马等结构，仔细剥除脑膜，只保留大脑皮质；或在无菌状态下，小心剪开椎管，取出整条脊髓，仔细剥除脊膜。用消毒手术刀或眼科剪将皮质或脊髓剪为1mm3左右的小块，转移到15ml离心管内，加入适量D-PBS，约5ml/脑或4ml/脊髓。
用火焰抛光管口的1ml巴斯德玻璃吸管，轻轻吹打D-PBS中剪碎的组织块，每次约10～15次，吹打过程尽量避免产生气泡，然后室温静置离心管约2分钟，使组织团块逐步沉淀。轻轻吸取离心管内上层液体1～2ml，置于一只新离心管内。吸取新的D-PBS 1～2ml，加入沉淀组织团块液中，继续上述吹打步骤和沉淀步骤大约3～10轮，直到大部团块被吹散分离成细胞悬液。弃掉最后难以吹散的组织团块成分。
实施例3：细胞悬液的短暂粘附
收集细胞悬液(大约5ml/脑或4ml/脊髓)，轻柔吹打混匀后，经40μm尼龙细胞筛(Corning公司)进行过滤并收集，轻柔吹打混匀后，将细胞悬液种植在前述多聚赖氨酸涂布的25ml细胞培养瓶(4～5ml)，及6孔培养板(1.5ml/孔)或12孔培养板内(1ml/孔)内。静置于超净台内(室温25℃左右)，静置贴壁时间10～15分钟，静置过程避免震动。静置结束后，轻轻倾斜培养瓶及培养板，吸除全部液体，吸除过程避免明显震荡，以防止贴壁细胞大量脱壁。
实施例4：新生大鼠少突胶质前体细胞的培养与克隆形成
将培养基沿着培养瓶壁及板壁轻轻加入，尽量避免对贴壁细胞的冲击。将细胞置于37℃、5％CO2条件下静置培养。培养基每2天完全换液一次，换液前，轻柔手工摇晃震荡培养细胞，促使一些细胞碎片团块及死亡细胞脱壁。
少突胶质前体细胞培养基的成分包括DMEM/F12基础培养液(Gibco公司)，Purmorphamine(1μM Sigma公司)、血小板源生长因子(10ng/ml Platelet-derived growthfactor-AA，PDGF-AA,PeproTech公司)，0.5％胎牛血清(Gibco公司)，1％N2神经细胞生长添加剂(17502048Invitrogen公司)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma公司)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco公司)。
细胞培养2天后，可见少突胶质前体细胞大量增殖。增殖细胞呈簇状或散在迁移，呈双极突起或三级突起，胞体圆形或椭圆形，与周围粘附的星形胶质细胞等区别明显。伴随细胞培养时间延长，细胞数量快速增长。与此同时，粘附的其它非少突胶质前体细胞，增殖速度缓慢，少突胶质前体细胞的总体比例明显提高。
实施例5：利特定成分短暂撤除方法降低少突胶质前体细胞粘附性
细胞培养5～6天后，大量细胞增殖接近铺满视野。换液时，更换为不含血清的培养基，但仍然含有Purmorphamine、N2以及PDGF，每2天换液一次。细胞培养2～3后，出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积明显变少，易于脱壁。由于培养液中仍然有N2添加剂及PDGF，可以维持少突胶质前体细胞的存活以及未分化状态。与此同时，其它非少突胶质前体细胞形态变化不大。
实施例6：利用机械震荡分离方法纯化少突胶质前体细胞
将培养细胞更换正常体积的新鲜培养液后，仍暂时不添加血清，在超净台操作台面上，轻轻震荡敲击培养瓶及培养板，持续1～2分钟，大部分少突胶质前体细胞在此过程中脱离底面。其它非少突胶质前体细胞绝大多数仍牢固贴壁。将培养液连同脱落细胞收集入一只新离心管，轻柔吹打混匀后，进行细胞计数并调整密度，添加0.5％血清，按照2×104cells/ml传代接种在新的培养瓶及板内。
实施例7：少突胶质前体细胞的连续传代培养，以及诱导分化成熟为少突胶质细胞
上述机械分离纯化的少突胶质前体细胞在添加微量血清后，快速贴壁并重新伸出突起呈典型形态。细胞在培养约一周后，增殖接近铺满视野，纯度95％以上。利用上述撤除血清结合机械震荡分离方法分离细胞，进行传代。
细胞分化：将细胞培养基中的血小板源生长因子撤除，添加15nM的三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3，Sigma公司)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次。
实施例8：免疫细胞化学反应鉴定少突胶质前体细胞及少突胶质细胞
细胞用2％～4％多聚甲醛室温固定20分钟。随后在室温用PBS清洗3次(15分钟)，并用含0.1％BSA的PBS继续清洗两次。随后在封闭液中(含10％正常驴血清及0.2％TritonX-100的PBS)室温封闭45分钟。加入一抗后4℃过夜，用PBS清洗3次后，加入对应二抗在室温避光反应孵育45分钟，PBS清洗3次后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)染核，继续PBS清洗3次后，封闭观察。在荧光显微镜及共聚焦显微镜下观察拍照，并用相关软件进行分析。
一抗包括A2B5(MAB1416R&D)、NG2(D262413BBILife)、GC(G9152 Sigma)、MBP(M3821Sigma)等，使用浓度按说明书及试剂盒提供的使用浓度进行。
Claims (5)
1.一种能够长期体外培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基配方组成及其应用使用方法，其特征在于，通过机械离解方法制作大鼠大脑皮质及脊髓组织细胞悬液，利用少突胶质前体细胞可在多聚赖氨酸包被的培养底物上快速贴壁的特点，获取富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞；将获取的贴壁细胞在含有PDGF、一种嘌呤化合物Purmorphamine、N2添加剂及0.5％胎牛血清的特定培养基中培养，促使贴壁少突胶质前体细胞快速大量增殖；培养5～6天后，将培养基中微量血清短暂撤除2～3天，但仍然保留N2添加剂，PDGF以及Purmorphamine，使少突胶质前体细胞出现可逆性突起回缩、胞体变圆，与底物的粘附性明显降低，而其它非少突胶质前体细胞仍牢固贴壁；结合轻柔机械震荡方法，使上述少突胶质前体细胞脱壁，从而获取较高纯度的细胞；获取的细胞可在上述培养基中连续传代培养数月，具有连续增殖能力，以及分化为成熟少突胶质细胞的能力；
包括步骤：
(1)新生大鼠大脑皮质及脊髓组织的获取和机械解离：
无菌状态下分离新生小鼠大脑皮质或脊髓，通过纯机械解离方法制备细胞悬液并过滤；
(2)细胞悬液中细胞的快速短暂粘附：
将细胞悬液混匀后，置于涂布多聚赖氨酸的细胞培养瓶及培养板内；静置贴壁10～15分钟(室温25℃左右)，静置过程避免震动；静置结束后，轻轻倾斜培养瓶及培养板，吸除全部液体；
(3)富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞的培养：
将培养基沿着培养瓶壁及板壁轻轻加入，避免对贴壁细胞的冲击；将细胞置于37℃、5％CO2条件下静置培养；培养基每2天完全换液一次，换液前，适度手工摇晃震荡培养细胞，促使一些细胞碎片团块及死亡细胞脱壁；
(4)利用特定成分短暂撤除方法降低少突胶质前体细胞粘附性
细胞培养5～6天后，大量少突胶质前体细胞增殖；将培养基中0.5％胎牛血清成分撤除后，继续培养2～3天后，少突胶质前体细胞出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积明显变少，易于脱壁；与此同时，其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞形态无明显改变；
(5)利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞：
将上述培养细胞在无菌操作台内轻轻震荡敲击，使大部分少突胶质前体细胞脱壁，绝大部分非少突胶质前体细胞仍牢固贴壁；收集脱壁少突胶质前体细胞进行培养，换为含有0.5％胎牛血清的培养基；
(5)少突胶质前体细胞的长期培养及诱导
细胞6～8天传代一次，利用上述短暂血清撤除结合机械震荡方法分离细胞，按1:2或1:3进行传代；诱导分化时，将细胞培养基中的PDGF以及嘌呤化合物purmorphamine撤除，添加三碘甲状腺原氨酸(T3)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次，促使细胞分化成熟。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的纯机械解离方法指通过吸管吹打方式解离组织，不应用任何消化酶。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的快速贴壁是指细胞悬液在室温(25℃左右)静置10～15分钟。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的大鼠少突胶质前体细胞培养液为DMEM/F12基础培养液，其中添加Purmorphamine、0.5％胎牛血清、N2神经细胞生长添加剂和PDGF。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)特定成分短暂撤除是指将培养基中0.5％胎牛血清成分撤除2～3天。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115044557A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-13 | 南京鼓楼医院 | 一种诱导少突胶质前体细胞向少突胶质细胞分化的方法和试剂盒 |
| CN115044557B (zh) * | 2022-06-27 | 2023-09-01 | 南京鼓楼医院 | 一种诱导少突胶质前体细胞向少突胶质细胞分化的方法和试剂盒 |
| CN115340982A (zh) * | 2022-08-23 | 2022-11-15 | 徐州医科大学 | 一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法 |
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| Publication number | Publication date |
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| CN109722416B (zh) | 2023-12-01 |
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