CN109722418A - 一种获取和纯化新生小鼠少突胶质前体细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞培养的方法，具体涉及一种从新生小鼠大脑获取和纯化少突胶质前体细胞的方法。本方法利用原代小鼠少突胶质前体细胞能够快速粘附于多聚赖氨酸包被底物的特性，通过将纯机械解离的细胞悬液短暂置于多聚赖氨酸包被的培养底面上，使少突胶质前体细胞快速贴壁、富集，并在添加无血清培养基中培养，形成大量克隆；培养6～8天后，利用小鼠少突胶质前体细胞与多聚赖氨酸包被底物粘附强度较低的特性，通过机械吹打方式进行选择性分离，获得进一步纯化的小鼠少突胶质前体细胞。获得的细胞能够维持连续增殖能力，持续保持前体状态和较高纯度，并具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。

Description

一种获取和纯化新生小鼠少突胶质前体细胞的方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞培养的方法，具体涉及一种从新生小鼠大脑皮质获取并纯化培养少突胶质前体细胞的方法。

背景技术

少突胶质前体细胞在中枢神经系统内发挥着多种重要功能，它们不仅能够分化为成熟的少突胶质细胞，维持神经纤维电冲动的正常传导，而且能够与神经元形成突触联系，并且可以产生多种营养因子以支持和保护神经元(Lin SC,Bergles DE.Synapticsignaling between GABAergic interneurons and oligodendrocyte precursor cellsin the hippocampus.Nat Neurosci 2004；7:24-32.)(Lee Y,Morrison BM,Li Y,Lengacher S,Farah MH,Hoffman PN,et al.Oligodendroglia metabolically supportaxons and contribute to neurodegeneration.Nature 2012；487:443-8.)。在体外获取并纯化少突胶质前体细胞进行研究，不仅有助于进一步明确它们在发育和成熟阶段的生物学功能与特性，而且也为相关神经疾病如脊髓损伤、多发性硬化等的细胞移植治疗研究，提供重要的前提条件和基础。

目前分离纯化培养少突胶质前体细胞的方法，主要包括混合胶质细胞培养后振摇分离法(McCarthy KD,de Vellis J.Preparation of separate astroglial andoligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.J Cell Biol 1980；85:890-902)，免疫吸附纯化法(Shi J,Marinovich A,Barres BA.Purification andcharacterization of adult oligodendrocyte precursor cells from the rat opticnerve.J Neurosci 1998；18:4627-36.)，神经干细胞定向诱导法(ChenY,Balasubramaniyan V,Peng J,Hurlock EC,Tallquist M,Li J,et al.Isolation andculture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.Nat Protoc 2007；2:1044-51.)。此外，还有少量文献报道采用神经母细胞瘤B104的条件培养基来促使原代少突胶质前体细胞增殖并形成克隆球。

混合胶质细胞培养后振摇分离法是获取大鼠少突胶质前体细胞的常用方法，是通过在含血清的培养基中将大脑皮质来源的胶质细胞混合培养大约7～12天后，通过恒温摇床过夜振摇，来促使上层的少突胶质前体细胞脱落；免疫吸附纯化法，主要是通过针对少突胶质前体细胞胞膜上的抗原，利用特异性抗体包被的培养皿等来特异性吸附细胞，或通过免疫磁珠、流式细胞仪等对标记细胞进行特异性分离筛选；神经干细胞定向诱导法，是首先将胚胎组织进行培养产生神经干细胞，再通过定向诱导的方法如添加血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)等，使一部分神经干细胞转变为少突胶质前体细胞。

但是对于小鼠来说，上述的技术方法尚存以下缺陷：1)小鼠少突胶质前体细胞在含有血清的培养基中存活数量少，易于分化，且生长速度和粘附特性与大鼠少突胶质前体不同，因此获取困难(ChenY,Balasubramaniyan V,Peng J,Hurlock EC,Tallquist M,LiJ,et al.Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursorcells.Nat Protoc 2007；2:1044-51.)；同时，血清对于少突胶质前体细胞的生物学特性存在明显而复杂的影响，不仅能够促使少突胶质前体细胞在体外分化为2型星形胶质细胞，而且能在bFGF(basic fibroblast growth factor，bFGF)的共同作用下，去分化成为神经干细胞(Kondo T,Raff M.Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to becomemultipotential CNS stem cells.Science 2000；289:1754-7.)。2)免疫吸附纯化法，价格昂贵，分离过程复杂费时，而且吸附的抗体有可能对细胞活性和生物学特性产生异常影响；此外由于小鼠细胞的抗原表达与大鼠细胞存在差异，因此对于获取小鼠少突胶质前体细胞的方法特异性或细胞纯度存在一定争议。3)神经干细胞定向诱导，实际上包括获取并培养神经干细胞和定向诱导两个步骤。实验不仅要处死怀孕母鼠、准备和培养过程费时而昂贵，而且在定向诱导过程中可能会因为特异选择作用而出现细胞永生化等变异，从而使获取细胞与正常发育的少突胶质前体细胞存在差异。同时，这种永生化等变异也同样存在于利用B104条件培养基来诱导少突胶质前体细胞增殖和形成克隆球的过程中，此外B104条件培养基中促使少突胶质前体细胞增殖的成分目前还没有完全清楚，其中机理尚未完全明确。

近年来，利用细胞黏附强度的差异来分离纯化特定类型的细胞，已有较多实验报道(Liang X,Osman TA,Sapkota D,Neppelberg E,Lybak S,Liavaag PG,et al.Rapidadherence to collagen IV enriches for tumour initiating cells in oralcancer.Eur J Cancer 2014；50:3262-70.)(SinghA,Suri S,Lee T,Chilton JM,CookeMT,ChenW,et al.Adhesion strength-based,label-free isolation of humanpluripotent stem cells.Nat Methods 2013；10:438-44.)。这为我们发展一种更加简单、稳定、经济的少突胶质前体细胞获取和纯化方法提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的是克服现有方法、技术的缺陷和不足，提供一种获取原代小鼠少突胶质前体细胞的方法；进一步提供一种不需要血清刺激和抗体吸附标记的小鼠少突胶质前体细胞。

本发明方法通过将机械分离的新生小鼠大脑皮质细胞悬液种植在多聚赖氨酸包被的培养底面上，利用小鼠少突胶质前体细胞能够快速贴壁的特性，富集小鼠少突胶质前体细胞，在无血清培养基中培养并形成大量克隆；6～9天后，利用小鼠少突胶质前体细胞与培养底物粘附强度较低的特性，通过机械吹打方式，选择性地分离并进一步纯化细胞。获得的小鼠少突胶质前体细胞具有连续增殖能力，可以连续传代，并具有有分化为成熟少突胶质细胞的能力。

上述制备方法中，所述的机械分离是指通过吸管吹打方式解离原代大脑组织成为细胞悬液，不应用任何消化酶。

所述的新生小鼠是指出生1～3天的C57BL/6J小鼠。

所述的快速贴壁是指细胞悬液在室温静置5～30分钟。

所述的多聚赖氨酸是指右旋多聚赖氨酸或左旋多聚赖氨酸，分子量大于70000。

具体而言，本发明从新生小鼠大脑皮质获取并纯化培养少突胶质前体细胞，其特征在于，包括以下步骤：

(1)新生小鼠大脑皮质原代细胞的获取和机械分离：

无菌状态下分离新生小鼠大脑皮质，通过纯机械分离方法制备细胞悬液并过滤。

(2)细胞悬液中细胞的快速短暂粘附：

将细胞悬液混匀后，置于涂布多聚赖氨酸的细胞培养瓶及培养板内。静置贴壁5～30分钟(室温25℃左右)，静置过程避免震动。静置结束后，轻轻倾斜培养瓶及培养板，吸除全部液体。

(3)富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞的培养：

将培养基沿着培养瓶壁及板壁轻轻加入，避免对贴壁细胞的冲击。将细胞置于37℃、5％CO₂条件下静置培养。培养基每2天完全换液一次，换液前，适度手工摇晃震荡培养细胞，促使一些细胞碎片团块及死亡细胞脱壁。

(4)利用机械分离方法进一步纯化少突胶质前体细胞：

细胞培养6～8天后，将培养细胞更换新鲜培养液，用火焰抛光管口的玻璃吸管，吸取培养液，轻柔吹打贴壁细胞，反复2～3次，逐步遍及整个培养瓶及培养板底面，促使少突胶质前体细胞脱壁。混杂的星形胶质细胞及成纤维细胞仍然贴壁。

(5)少突胶质前体细胞的长期培养及诱导分化成熟：

将获取的细胞继续培养，细胞5～6天传代一次，利用上述机械吹打分离方法分离细胞，按1:2或1:3进行传代。连续传代3～5次后，在培养基中添加10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，维持少突胶质前体细胞的持续增殖，保持未分化状态；诱导分化时，将细胞培养基中的血小板源生长因子及碱性成纤维细胞生长因子撤除，添加三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次，促使细胞分化成熟。

本发明提供了一种利用细胞粘附强度差异获取的小鼠少突胶质前体细胞。

本发明对获取的的小鼠少突胶质前体细胞及其分化而来的少突胶质细胞进行体外特征鉴定，鉴定步骤为：

(1)小鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞的体外特征鉴定：

在体外对小鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞进行细胞形态观测和细胞免疫荧光染色等指标检测，鉴定小鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞的体外特征；

本发明对获取的的小鼠少突胶质前体细胞及其分化而来的少突胶质细胞进行体外特征鉴定，鉴定结果为：

(1)小鼠少突胶质前体细胞及其分化产生的少突胶质细胞在体外：

小鼠少突胶质前体细胞呈现双极及三级突起，符合少突胶质前体细胞的典型形态特征；表达少突胶质前体细胞特异性标志物，包括：细胞表面神经节苷脂A2B5、硫酸软骨素蛋白多糖NG2和巢蛋白(Nestin)。

分化产生的少突胶质细胞呈现密集分支突起，部分呈蜘蛛网状，符合少突胶质细胞的典型形态特征；表达少突胶质细胞特异性标志蛋白，包括：半乳糖脑苷脂酶(galactocerebroside GC)和髓鞘碱性蛋白(myelinbasic protein MBP)。

本发明利用细胞粘附强度差异方式获取小鼠少突胶质前体细胞，方法具有如下优点：

该方法操作简便，可重复性强。前述的振摇分离法、免疫吸附纯化法、神经干细胞定向诱导法等，对于实验人员的操作技术及实践经验要求较高，需要专门的相关仪器设备如恒温摇床、流式细胞仪以及多种纯化标记细胞所需的昂贵抗体。

该方法需要材料量少。前述其它方法一次实验使用材料往往需要数只至数十只新生小鼠。本方法可一次只利用一只新生小鼠大脑皮质，可在一周后获取超过2×10⁵个少突胶质前体细胞，这对于某些来源有限或难于存活的的转基因小鼠而言，尤其重要。

该方法在获取过程中不需要使用抗体标记少突胶质前体细胞。

该方法避免了血清甚至外源bFGF对少突胶质前体细胞的刺激与影响。

该方法避免了消化酶对少突胶质前体细胞的损伤。

该方法获取的小鼠少突胶质前体细胞活性较好，纯度较高，有助于在相关生物学和医学研究中的广泛应用。

附图说明

图1显示了新生小鼠大脑皮质原代细胞悬液在多聚赖氨酸包被的培养底面上分别短暂黏附5分钟和30分钟后在添加PDGF的无血清培养基中培养1、4、7天时，在倒置显微镜下的检测结果。可见培养4天后，初步出现成簇的少突胶质前体细胞(白色箭头所示)，伴随培养时间延长，克隆内细胞数目快速增多。30分钟组(下)的克隆数目高于5分钟(上)组。细胞在培养7天时已接近铺满；少数细胞在高密度下出现分化，突起出现大量分支(黑色箭头所示)。

图2显示了新生小鼠大脑皮质原代细胞悬液在多聚赖氨酸包被的培养底面上短暂黏附15分钟后在添加PDGF的无血清培养基中培养7天时，在倒置显微镜下以及进行A2B5/GFAP/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果。可见多个克隆呈A2B5阳性，间有少量GFAP阳性的星形胶质细胞。右侧放大图片可见克隆内小鼠少突胶质前体细胞呈典型的双极或三极形态。白色箭头所示为少量A2B5/GFAP双阴性的成纤维样细胞。

图3显示了短暂粘附细胞在多聚赖氨酸包被的培养底面上培养7天，通过人工吹打机械分离少突胶质前体细胞后，对仍然粘附在原培养底面的细胞进行GFAP/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果，显示多量细胞为GFAP阳性的星形胶质细胞(白色箭头所示)。

图4显示了传代2次的小鼠少突胶质前体细胞高密度培养状态下(2×10⁵/cm²)，在倒置显微镜下以及进行A2B5/GFAP/Nestin/DAPI和TUJ1/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果。可见绝大部分细胞呈A2B5/Nestin阳性(>98％)，而呈GFAP阳性的星形胶质细胞和呈TUJ1阳性的神经元数目极少(白色箭头所示)。

图5显示了传代2次的小鼠少突胶质前体细胞进行NG2/Nestin/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果。可见绝大部分细胞呈NG2/Nestin阳性(>98％)。

图6显示了小鼠少突胶质前体细胞在撤除PDGF并添加T3的培养基中分化7天后，在倒置显微镜下以及进行GC/DAPI和MBP/A2B5/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果。可见大部分细胞呈现突起密集分支如蜘蛛网样形态，并呈GC和MBP阳性，提示为分化成熟的少突胶质细胞。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中，未具体注明实施条件和方法处，均为按照常规实验方案，如《分子克隆实验指南(第三版)》([美]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，2003)中所述方法或试剂生产商建议方案来开展。

实施例1：多聚赖氨酸预涂培养瓶培养板

将溶于无菌蒸馏水(10mg/ml)的右旋多聚赖氨酸(PDL,Sigma公司P6407)或左旋多聚赖氨酸(PLL,Sigma公司P6282)溶液，用滤膜过滤除菌(0.22μm)后，吸入25ml培养瓶(Nunc公司)及6孔培养板(Corning公司)以及12孔培养板(内置经过泡酸及高温消毒处理后的盖玻片)。置于4℃过夜后，吸除多聚赖氨酸溶液，将培养瓶及培养板置于无菌37℃细胞箱或无菌超净台内，彻底晾干。收藏于4℃或室温保存(保存至少3周)。使用之前，用消毒蒸馏水至少清洗2遍。

实施例2：新生小鼠大脑皮质细胞的获取和机械分离

取新生1～3天的新生C57BL/6J小鼠，经低温麻醉后，在无菌条件下取出大脑，浸泡在盛有4℃预冷D-PBS的玻璃培养皿中，去除嗅球及海马等结构，仔细剥除脑膜，只保留大脑皮质。用消毒手术刀或眼科剪将皮质剪为1mm³左右的小块，转移到15ml离心管内，加入适量D-PBS，约3ml/脑。

用火焰抛光管口的1ml巴斯德玻璃吸管，轻轻吹打D-PBS中剪碎的脑组织块，每次约10～15次，吹打过程尽量避免产生气泡，然后室温静置离心管约2分钟，使组织团块逐步沉淀。轻轻吸取离心管内上层液体1～2ml，置于一只新离心管内。吸取新的D-PBS 1～2ml，加入沉淀组织团块液中，继续上述吹打步骤和沉淀步骤大约3～10轮，直到大部团块被吹散分离成细胞悬液。弃掉最后难以吹散的组织团块成分。

实施例3：皮质细胞悬液的短暂粘附

收集细胞悬液(大约3～4ml/脑)，轻柔吹打混匀后，经40μm尼龙细胞筛(Corning公司)进行过滤并收集，轻柔吹打混匀后，将细胞悬液种植在前述多聚赖氨酸涂布的25ml细胞培养瓶(4～5ml)，及6孔培养板(1.5ml/孔)或12孔培养板内(1ml/孔)内。静置于超净台内(室温25℃左右)，静置贴壁时间5～30分钟，静置过程避免震动。静置结束后，轻轻倾斜培养瓶及培养板，吸除全部液体，吸除过程避免明显震荡，以防止贴壁细胞大量脱壁。

实施例4：新生小鼠少突胶质前体细胞的培养与克隆形成

将培养基沿着培养瓶壁及板壁轻轻加入，尽量避免对贴壁细胞的冲击。将细胞置于37℃、5％CO₂条件下静置培养。培养基每2天完全换液一次，换液前，轻柔手工摇晃震荡培养细胞，促使一些细胞碎片团块及死亡细胞脱壁。

少突胶质前体细胞培养基的成分包括DMEM/F12基础培养液(Gibco公司)，2％B27无血清培养基添加剂(17504044Invitrogen公司)、1％N2神经细胞生长添加剂(17502048Invitrogen公司)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma公司)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco公司)，并添加10ng/ml血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor-AA，PDGF-AA,PeproTech公司)。细胞传代5次后，进一步后续添加10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF,PeproTech公司)。

实施例5：利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞

细胞培养6～8天后，大量克隆形成。将培养细胞更换正常体积的新鲜培养液后，用一支经火焰抛光管口的1ml巴斯德玻璃吸管，吸取培养液，轻轻吹打贴壁细胞，反复2～3次，逐步遍及整个培养瓶及培养板底面，吹打过程中尽量避免产生气泡。将培养液连同吹打脱落细胞收集入一只新离心管。在原培养瓶及板内加入正常体积新培养液，在倒置显微镜下观察细胞脱壁情况，重复一次吹打并继续收集细胞悬液。将获取的细胞连同培养液轻柔吹打混匀后，进行细胞计数并进行密度调整，按照2×10⁴cells/ml传代接种在新的培养瓶及板内。

实施例6：少突胶质前体细胞的诱导分化成熟为少突胶质细胞

细胞在培养约5天后，接近融合，利用上述机械吹打分离方法分离细胞，按1：2或1：3进行传代。在细胞连续传代3～5次后，部分细胞出现自发分化现象，此时可在培养基中添加10ng/ml bFGF，以维持少突胶质前体细胞的持续增殖，保持未分化状态。

细胞分化：将细胞培养基中的血小板源生长因子及碱性成纤维细胞生长因子撤除，添加15nM的三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3，Sigma公司)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次。

实施例7：免疫细胞化学反应鉴定少突胶质前体细胞及少突胶质细胞

细胞用2％～4％多聚甲醛室温固定20分钟。随后在室温用PBS清洗3次(15分钟)，并用含0.1％BSA的PBS继续清洗两次。随后在封闭液中(含10％正常驴血清及0.2％TritonX-100的PBS)室温封闭45分钟。加入一抗后4℃过夜，用PBS清洗3次后，加入对应二抗在室温避光反应孵育45分钟，PBS清洗3次后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)染核，继续PBS清洗3次后，封闭观察。在荧光显微镜及共聚焦显微镜下观察拍照，并用相关软件进行分析，包括cellSens Entry 1.5(Olympus)及ImageJ(NIH)。

一抗包括A2B5(MAB1416R&D)、NG2(D262413BBILife)、Nestin(NES Aves Labs)、GC(G9152Sigma)、MBP(M3821Sigma)、GFAP(Z0334Dako)等，使用浓度按说明书及试剂盒提供的使用浓度进行。

Claims (5)

1.一种从新生小鼠大脑皮质获取和纯化培养少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，利用原代小鼠少突胶质前体细胞能够快速粘附于多聚赖氨酸包被底物的特性，通过将纯机械解离的新生小鼠皮质细胞悬液短暂置于多聚赖氨酸包被的培养底面上，使小鼠少突胶质前体细胞快速贴壁、富集，并在添加PDGF的无血清培养基中培养，形成大量增殖克隆；培养6～8天后，利用小鼠少突胶质前体细胞与多聚赖氨酸包被底物粘附强度较低的特性，通过机械吹打方式，选择性分离小鼠少突胶质前体细胞，获得进一步纯化的小鼠少突胶质前体细胞；获得的细胞能够维持连续增殖能力，保持前体状态和较高纯度，具有分化为成熟少突胶质细胞的能力；

包括步骤：

(1)新生小鼠大脑皮质原代细胞的获取和机械解离：

无菌状态分离新生小鼠大脑皮质，通过纯机械解离方法制备细胞悬液并过滤；

(2)细胞悬液中细胞的快速粘附：

将细胞悬液混匀后，种植在涂布多聚赖氨酸的细胞培养瓶及培养板内；静置贴壁5～30分钟(室温25℃左右)，静置过程避免震动；静置结束后，轻轻倾斜培养瓶及培养板，吸除全部液体；

(3)富含小鼠少突胶质前体细胞的贴壁细胞的培养：

将添加PDGF的无血清培养基沿着培养瓶壁及板壁轻轻加入；将细胞置于37℃、5％CO₂条件下静置培养；培养基每2天完全换液一次，换液前，适度手工摇晃震荡培养细胞，促使一些细胞碎片团块及死亡细胞脱壁；

(4)利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞：

细胞培养6～8天后，将细胞更换新鲜培养基，用火焰抛光管口的玻璃吸管，吸取培养液，轻柔吹打贴壁细胞，反复2～3次，逐步遍及整个培养瓶及培养板底面，促使少突胶质前体细胞脱壁；

(5)少突胶质前体细胞的长期培养及诱导分化成熟：

将获取的细胞继续培养，5～6天传代一次，利用上述机械吹打分离方法分离细胞，按1：2或1：3进行传代。连续传代3～5次后，在培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子，维持少突胶质前体细胞的持续增殖，保持未分化状态；将细胞培养基中的血小板源生长因子及碱性成纤维细胞生长因子撤除，添加三碘甲状腺原氨酸(T3)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次，促使细胞分化成熟。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的纯机械解离方法指通过吸管吹打方式解离组织，不应用任何消化酶。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的快速粘附是指细胞悬液在室温(25℃左右)静置5～30分钟。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的小鼠少突胶质前体细胞培养液为DMEM/F12基础培养液，其中添加有B27、N2和PDGF生长因子。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞过程，采用机械分离方法是指通过吸管吸取培养液，人工吹打贴壁细胞的方式促使少突胶质前体细胞脱壁。