CN115340982A - 一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学技术领域，具体为一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，包括以下步骤：S1、纯机械法获取新生小鼠脑皮质原代细胞：S2、小胶质及内皮细胞和神经元的滤过：S3、混合胶质细胞培养；S4、利用机械与化学结合的方法分离纯化少突胶质前体细胞：S5、少突胶质前体细胞的传代及诱导分化成熟。本发明操作简便，可重复性强；所需耗材较少；在获取过程中不需要使用抗体标记少突胶质前体细胞，以及避免了胰酶等传统消化液对少突胶质前体细胞的损伤，并降低了纯机械手段提纯细胞造成的机械损伤，增加了细胞成活率，本发明保证了小鼠少突胶质前体细胞活性，不改变其生物学特性，适用于后续一系列的科学研究。

Description

一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法

技术领域

本发明涉及医学技术领域，具体为一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法。

背景技术

目前分离纯化培养少突胶质前体细胞的方法，主要包括混合胶质细胞培养后摇床振摇分离法、免疫吸附分选法、神经干细胞定向诱导法以及使用神经母细胞瘤B104的条件培养基共培养法等。

混合胶质细胞培养后使用摇床对细胞进行振荡分离是目前为获得大鼠少突胶质前体细胞，使用胰酶将组织消化为单细胞悬液后接种于培养瓶中培养一周左右，后将培养瓶置于恒温摇床振荡分离16-18h后获得被摇晃剥脱下来的OPCs。

免疫吸附分选法又可分为免疫磁珠法和流式细胞术法。免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。流式细胞术是一种可对溶液中的单个细胞进行快速筛选和分析的技术。流式细胞仪利用激光作为光源产生散射光和荧光信号，这些信号被转换成电子信号，特定的细胞亚群可以基于它们的荧光或光散射特性进行分析并进行分离纯化。

神经干细胞定向诱导法，取大鼠胚胎脑的海马，采用机械分散结合反复离心的方法将收集的细胞进行悬浮培养，得到神经干细胞，将单克隆的神经干细胞球贴壁，并结合使用生长因子(PDGF和bFGF)，观察无血清培养的神经干细胞分化情况，并以GC免疫组化标记分化后的少突胶质细胞。

但对于小鼠来说，上述方法仍存在以下缺陷：1.小鼠少突胶质前体细胞胞体更小，生长增殖周期更长，胰酶等强力细胞消化液会破坏小鼠的少突胶质细胞膜结构，细胞更易受损死亡。并且小鼠的少突胶质前体细胞比大鼠更易贴壁并受力摇晃后亦更易脱失，振荡分离后杂细胞较多且少突胶质前体细胞机械损伤严重，降低了纯化的细胞密度与纯度。2.免疫吸附分选法，价格昂贵且分离过程复杂，耗时耗力，且无法保证抗体特异性的同时亦存在细胞表面抗原决定簇与抗体结合后对细胞活性和生物学特性产生的异常影响，从而影响后续细胞功能性实验结构及具体分子机制探究进程。3.神经干细胞定向诱导法其包括获取并培养神经干细胞和定向诱导分化两个步骤，需要处死怀孕母鼠取鼠胚脑进行细胞提取后再培养分化，需要长耗时，且技术要求高，成功率不稳定；且在定向诱导分化过程中可能出现细胞永生化等变异，操作难度较大。4.B104条件培养基来诱导少突胶质前体细胞增殖和形成克隆球，虽增加了少突胶质细胞的增殖能力，提高了细胞产量，但其促使细胞增殖的成分与作用机制尚未完全明确，且并不知道B104条件培养基共培养后少突胶质前体细胞的生物学特性是否发生改变。

综上所述，为避免以上方法的缺陷，我们提出一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，包括以下步骤：

S1、纯机械法获取新生小鼠脑皮质原代细胞：

取新生小鼠进行低温麻醉，在超净台中取出大脑皮质，留取大脑皮质部分，并将皮质剪成组织碎块后机械分离为单细胞悬液。

S2、小胶质及内皮细胞和神经元的滤过：

单细胞悬液种植于未经任何处理的无菌培养板内，于培养箱静置30min后，收集未贴壁的细胞悬液于40μm细胞筛过滤；

S3、混合胶质细胞培养：

收集过滤后的液体并进一步吹打混匀后将细胞种植在多聚赖氨酸涂布后的T25培养瓶中，置于5%C02恒温培养箱内培养，每2天换液1次；

S4、利用机械与化学结合的方法分离纯化少突胶质前体细胞：

细胞培养一周左右，培养瓶中加入2mL的消化液消化细胞后，于超静台内使用1mL移液枪轻轻反复吹打OPCs直至细胞脱壁，以及在镜下观察OPCs脱壁情况，收集细胞消化液再静置后接种；

S5、少突胶质前体细胞的传代及诱导分化成熟：

在培养基中添加有B27、N2和PDGF-AA生长因子促进OPCs的增殖，当细胞长满后以1：2的比例进行传代，4～5天传代一次，后添加碱性成纤维细胞生长因子进一步促进OPCs的增殖；诱导细胞分化时，撤除血小板源生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，添加三碘甲状腺原氨酸，每3天换液，培养一周使细胞分化。

优选的，所述步骤S1中的纯机械解离方法指使用1mL移液枪吹打方式解离组织，过程中液体使用DMEM/F-12高糖培养基。

优选的，所述步骤S3中的混合胶质细胞主要由少突胶质细胞和星形胶质细胞组成，培养基前4天为为10%FBS的DMEM/F-12基础培养基，后期使用添加有B27、N2和PDGF生长因子的DMEM/F-12基础培养基。

优选的，所述步骤S4中采用不含胰酶的ACCUTASE细胞消化液，每管2mL，于37℃恒温培养箱中静置2min后，使用1.5mL的巴氏吸管轻轻吹打贴壁细胞，促使少突胶质前体细胞脱壁，其后收集脱壁细胞悬液重新重悬后于新的培养皿中静置10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明操作简便，可重复性强；

本发明所需耗材较少；

本发明在获取过程中不需要使用抗体标记少突胶质前体细胞；

本发明避免了胰酶等传统消化液对少突胶质前体细胞的损伤；

本发明降低了纯机械手段提纯细胞造成的机械损伤，增加了细胞成活率；

本发明保证了小鼠少突胶质前体细胞活性，不改变其生物学特性，适用于后续一系列的科学研究。

附图说明

图1为本发明新生小鼠大脑皮质原代细胞悬液在多聚赖氨酸包被的培养底面上分别培养4、6、8天时的于倒置显微镜下呈现的细胞状态示意图；

图2为本发明经机械分离后的新生小鼠大脑皮质原代细胞悬液在无任何处理的培养皿中的静置30min后的贴壁示意图；

图3为本发明粘附在原培养底面的细胞进行GFAP/DAPI免疫细胞化学荧光检测结果示意图；

图4为本发明初次分离纯化后细胞的纯度和形态鉴定示意图；

图5为本发明在倒置显微镜下以及进行PDGFRα免疫细胞化学荧光检测结果示意图；

图6为本发明在倒置显微镜下以及进行MBP/O4/DAPI免疫细胞化学荧光检测结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施案例一

一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，包括以下步骤：

S1、纯机械法获取新生小鼠脑皮质原代细胞：

取新生小鼠进行低温麻醉，在超净台中，使用1mL移液枪吹打方式解离组织，过程中液体使用DMEM/F-12高糖培养基，且单细胞悬液制备过程无需任何酶类参与，取出大脑皮质，留取大脑皮质部分，并将皮质剪成组织碎块后机械分离为单细胞悬液，其中，新生小鼠是指出生1～3天的C57BL/6J小鼠。

S2、小胶质及内皮细胞和神经元的滤过：

如图2所示，其中图2显示了经机械分离后的新生小鼠大脑皮质原代细胞悬液在无任何处理的培养皿中的静置30min后的贴壁情况；进行Iba-1/DAP和CD31/DAPI免疫细胞化学荧光检发现，大量小胶质细胞以及内皮细胞经过30min的静置后沉淀贴壁，说明此方法可以一定程度上减少杂细胞对后续实验的干扰，单细胞悬液种植于未经任何处理的无菌培养板内，于培养箱静置30min后，收集未贴壁的细胞悬液于40μm细胞筛过滤；

S3、混合胶质细胞培养：

收集过滤后的液体并进一步吹打混匀后将细胞种植在多聚赖氨酸涂布后的T25培养瓶中，置于5%C02恒温培养箱内培养，每2天换液1次，其中，混合胶质细胞主要由少突胶质细胞和星形胶质细胞组成，培养基前4天为为10%FBS的DMEM/F-12基础培养基，后期使用添加有B27、N2和PDGF生长因子的DMEM/F-12基础培养基，多聚赖氨酸是指分子量大于70000的右旋多聚赖氨酸；

S4、利用机械与化学结合的方法分离纯化少突胶质前体细胞：

细胞培养一周左右，培养瓶中加入2mL的消化液消化细胞后，于超静台内使用1mL移液枪轻轻反复吹打OPCs直至细胞脱壁，以及在镜下观察OPCs脱壁情况，收集细胞消化液再静置后接种，其中，采用不含胰酶的ACCUTASE细胞消化液，每管2mL，于37℃恒温培养箱中静置2min后，使用1.5mL的巴氏吸管轻轻吹打贴壁细胞，促使少突胶质前体细胞脱壁，其后收集脱壁细胞悬液重新重悬后于新的培养皿中静置10min，快速贴壁是指细胞悬液在培养箱静置30min；

S5、少突胶质前体细胞的传代及诱导分化成熟：

在培养基中添加有B27、N2和PDGF-AA生长因子促进OPCs的增殖，当细胞长满后以1：2的比例进行传代，4～5天传代一次，后添加碱性成纤维细胞生长因子进一步促进OPCs的增殖；诱导细胞分化时，撤除血小板源生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，添加三碘甲状腺原氨酸，每3天换液，培养一周使细胞分化。

具体实施案例二

如图1、图2、图3、图4、图5和6所示，一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，具体包括以下步骤：

步骤1、新生小鼠大脑皮质细胞的获取和机械分离：

将提原代OPC的器械与尼龙细胞筛进行高压灭菌，取新生1～3天的新生C57BL/6J小鼠、Reln+/-或Reln-/-小鼠若干只，置于碎冰上低温麻醉，用75%酒精消毒全身，待酒精挥发后迅速断头取脑，将鼠脑置于预冷的高糖基础培养基中，并放置于冰板上；

在体式显微镜下用细胞镊摘除小脑和嗅球、清除大脑腹侧的核团和脑膜，仅保留大脑皮质，将取好的皮质转移至盛有高糖基础培养基中另一玻璃皿中；吸弃高糖基础培养基，用眼科剪剪碎组织。将剪碎的脑组织转移至15mL离心管中，每管加入约3只鼠脑的组织碎块，按每只鼠脑3-4mL的量加入高糖基础培养基；

使用1mL移液器将每个离心管的组织悬液吹打约15次，静置2min，取上清2mL转移至新的离心管中。重复以上的步骤约4-7次，直到底部的脑组织块几乎消失。

步骤2、皮质细胞悬液的短暂静置：

将上清液全部转移至新的离心管中，弃去无法吹散的脑组织块，以1200r/min的速度离心5min；加入少量高糖完全培养基重悬细胞，使用20µm细胞筛过滤细胞悬液，收取过滤后的液体移入未经多聚赖氨酸处理的无菌培养皿中，静置于恒温培养箱中30min。

步骤3、混合胶质细胞的培养：

如图1所示，图1显示了新生小鼠大脑皮质原代细胞悬液在多聚赖氨酸包被的培养底面上分别培养4、6、8天时的于倒置显微镜下呈现的细胞状态；可见培养4天后，初步出现成簇的少突胶质前体细胞(白色箭头所示)，而6天时由于更换增殖培养基，OPC的细胞数目明细快速增多；已接近铺满表层，同时可见大量星形胶质细胞铺于底层；

收集细胞悬液并进一步吹打混匀，使用孔径为40μm的尼龙细胞筛过滤细胞悬液，收集过滤后细胞悬液并种植在多聚赖氨酸涂布后的T25培养瓶中，加入含10%FBS的DMEM/F-12培养基，前4d使用完全培养基，之后每2天用高糖促增殖培养基换液一次，视细胞生长状况，在OPC密度达到一定程度之后进行分离并纯化；置于5%CO2恒温培养箱内培养，每2天换液1次，培养一周左右振荡分离并纯化培养OPCs。

步骤4、OPC的分离纯化培养：

如图3和图4所示，其中图3显示了通过不含胰酶的ACCUTASE细胞消化液消化并结合人工吹打后，对仍然粘附在原培养底面的细胞进行GFAP/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果，显示多量细胞为GFAP阳性的星形胶质细胞；图4显示了初次分离纯化后细胞的纯度和形态鉴定，可见细胞纯度密度较高，成PDGFRα、Olig2、A2B5阳性，细胞形态呈现光滑的圆形或椭圆形，胞体较小，具有典型的双极突起；

向每个T25中加入2mL不含胰酶的细胞消化液，放入37℃培养箱消化约3min，使用1mL移液器轻轻吹打贴壁细胞，吹打过程中尽量避免产生气泡；在显微镜下观察OPC脱壁情况；反复吹打过程2~3次，直至OPC基本完全消化下来，加入高糖完全培养基混匀终止消化；后将T25中的培养基转移至15mL离心管中，以1200r/min的速度离心5min后弃上清，用DMEM/F-12增殖培养基重悬细胞，调整纯化后的OPC悬液浓度约为3×104个/mL，向24孔培养板每孔加500µL悬液，置于5%CO2，37℃培养箱培养；

细胞约培养至5~6天后按1:2或1:3进行传代，在培养基中添加10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），维持少突胶质前体细胞的持续增殖，保持未分化状态。

步骤5、少突胶质前体细胞的传代及诱导分化成熟：

如图5和图6所示，其中，图5分别显示了传代1-3次的小鼠少突胶质前体细胞高密度培养状态下(2×105/cm2)，在倒置显微镜下以及进行PDGFRα免疫细胞化学荧光检测的结果；可见绝大部分细胞呈PDGFRα阳性(>98％)，且细胞密度较高；图6显示了小鼠少突胶质前体细胞在撤除PDGF-AA、N2和B27添加T3的培养基中分化7天后，在倒置显微镜下以及进行MBP/O4/DAPI免疫细胞化学荧光检测的结果。可见大部分细胞呈现突起密集分支如蜘蛛网样形态，并呈O4和MBP阳性，提示为分化成熟的少突胶质细胞；

在培养基中添加10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，进一步促进OPCs的增殖，当细胞长满后以1：2的比例进行传代；诱导细胞分化时，撤除血小板源生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，添加15nM的三碘甲状腺原氨酸(T3)于培养基中，每3天换液，继续培养5～10天。

步骤6、细胞的免疫荧光实验鉴定少突胶质前体细胞及少突胶质细胞：

在铺有爬片的24孔培养板中用4%多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗涤3次；每孔加入牛血清或山羊血清封闭液200µL，室温封闭30min；弃封闭液，加入0.25%Triton破膜剂，室温破膜15min。吸弃破膜剂，加入一抗，将24孔培养板置于4℃冰箱孵育过夜。次日取出24孔培养板，恢复至室温，用PBS洗涤3次；吸弃PBS，加入二抗，室温避光孵育2h；继续用PBS洗涤3次，滴加DAPI进行复染，室温孵育5min；用PBS洗涤3次，在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭剂，扣出爬片倒扣在抗荧光淬灭剂中封片，用超高分辨激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照。

一抗包括A2B5(MAB1416R&D)、Olig2(AB9610Sigma)、PDGFRα(ab230457abcam)、MBP（sc-13564santa）、GFAP(ab7260abcam)等，使用浓度按说明书及试剂盒提供的标准使用浓度进行。

Claims (4)

1.一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、纯机械法获取新生小鼠脑皮质原代细胞：

取新生小鼠进行低温麻醉，在超净台中取出大脑皮质，留取大脑皮质部分，并将皮质剪成组织碎块后机械分离为单细胞悬液。

S2、小胶质及内皮细胞和神经元的滤过：

单细胞悬液种植于未经任何处理的无菌培养板内，于培养箱静置30min后，收集未贴壁的细胞悬液于40μm细胞筛过滤；

S3、混合胶质细胞培养：

收集过滤后的液体并进一步吹打混匀后将细胞种植在多聚赖氨酸涂布后的T25培养瓶中，置于5％C02恒温培养箱内培养，每2天换液1次；

S4、利用机械与化学结合的方法分离纯化少突胶质前体细胞：

细胞培养一周左右，培养瓶中加入2mL的消化液消化细胞后，于超静台内使用1mL移液枪轻轻反复吹打OPCs直至细胞脱壁，以及在镜下观察OPCs脱壁情况，收集细胞消化液再静置后接种；

S5、少突胶质前体细胞的传代及诱导分化成熟：

在培养基中添加有B27、N2和PDGF-AA生长因子促进OPCs的增殖，当细胞长满后以1：2的比例进行传代，4～5天传代一次，后添加碱性成纤维细胞生长因子进一步促进OPCs的增殖；诱导细胞分化时，撤除血小板源生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，添加三碘甲状腺原氨酸，每3天换液，培养一周使细胞分化。

2.根据权利要求1所述的一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤S1中的纯机械解离方法指使用1mL移液枪吹打方式解离组织，过程中液体使用DMEM/F-12高糖培养基。

3.根据权利要求1所述的一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤S3中的混合胶质细胞主要由少突胶质细胞和星形胶质细胞组成，培养基前4天为为10％FBS的DMEM/F-12基础培养基，后期使用添加有B27、N2和PDGF生长因子的DMEM/F-12基础培养基。

4.根据权利要求1所述的一种分离并纯化新生小鼠皮质区少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤S4中采用不含胰酶的ACCUTASE细胞消化液，每管2mL，于37℃恒温培养箱中静置2min后，使用1.5mL的巴氏吸管轻轻吹打贴壁细胞，促使少突胶质前体细胞脱壁，其后收集脱壁细胞悬液重新重悬后于新的培养皿中静置10min。

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