WO2006028049A1

WO2006028049A1 - アストロサイト様細胞馴化培地の製造方法

Info

Publication number: WO2006028049A1
Application number: PCT/JP2005/016245
Authority: WO
Inventors: Yasushi Kondo; Yutaka Suzuki; Tsuyoshi Okuno; Takashi Nakayama; Nobuo Inoue
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co., Ltd.
Priority date: 2004-09-06
Filing date: 2005-09-05
Publication date: 2006-03-16
Also published as: TW200617165A; EP1801203A1; KR20070047836A; IL181702A0; US20080096273A1; CN101052711A; CA2578685A1; EP1801203A4; JPWO2006028049A1; AU2005281110A1

Abstract

　胚性幹細胞の分化によって得られたアストロサイト様細胞を培養することを特徴とする胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の製造方法及び該製造方法により得られた培地、並びに該培地の神経細胞の培養及び胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導等における使用。

Description

明細書

ァストロサイト様細胞馴化培地の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地に関する。さらに詳しくは

、本発明は、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地、その製造方法、該胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いる神経細胞の培養方法、該培養方法で培養された神経細胞、該胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用ヽる胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下に分化誘導して得られる神経系細胞に関する。

背景技術

[0002] 神経系細胞の培養には、通常、神経系細胞の維持に必要であると考えられる因子

(例えば、神経成長因子、サイト力イン等）や既知組成の（chemically-defined)成分が添加された基本培地カゝらなる合成培地、又はァストロサイト馴化培地を含有する培地が用いられている。合成培地に比べ、ァストロサイト馴化培地を含有する培地によれば、神経細胞をより長期かつ安定に培養しうることが知られている。

[0003] また、胚性幹細胞の分ィ匕誘導によって神経系細胞を得ようとする場合、ァストロサイト馴化培地を含有した培地によれば、胚性幹細胞から神経系細胞の分化誘導を効率よく行なうことができることも知られて、る (非特許文献 1及び 2参照)。

[0004] 前記ァストロサイト馴化培地として、動物（ラット、マウス、ゥシ、ゥマ、ブタ、サル、ゥサギ、 -ヮトリ等)の神経系組織よりァストロサイトを採取し、該初代培養ァストロサイトを栄養培地中で培養することにより得られる培養上清が用いられている（特許文献 1 及び 2参照)。

[0005] し力しながら、ァストロサイトの供給源となる生体 (神経系）組織の入手に制限があるうえ、生体からのァストロサイトの採取に、多大な時間と労力が必要である。また、初代培養細胞は、培養器中で安定的に培養維持することが難しぐ継代操作も数回以内に限られる。したがって、前記のようなァストロサイト馴化培地の製造法でァストロサイト馴化培地を大量に製造する場合、生体組織を十分量確保したうえで、さらに処理工程を繰り返し行なう必要があるため、多大な労力と時間とを要するという欠点があつた。

[0006] さらに、初代培養ァストロサイトは、それが由来する生体の成熟段階や、生体組織の部位により性質が異なっている。また、生体からの採取に際し、目的とするァストロサイト以外の細胞が混入が避けられない。したがって、実質的に均質なァストロサイト馴化培地を安定的に製造することは困難であった。

[0007] 神経細胞の培養維持のための培地として、種々のサイト力イン、成長因子等を添加した培地 (無血清培地)がこれまでに多く報告されて、る (非特許文献 3及び非特許文献 4参照)。し力しながら、これらの文献等に記載の培地等を用いた培養系では、一般に、神経細胞を長期間、安定的に培養できない。また、たとえ神経細胞の培養維持に効果があつたとしても、グリア細胞の増殖をも促進してしまい、その結果、神経細胞とグリア細胞との混合培養物をもたらすことが多い。したがって、これらの培養系は、例えば、神経細胞に対する被検物質の薬理作用を検討する場合のように、神経細胞のみを対象とする培養系としては必ずしも適切でない。

[0008] さらに、初代培養ァストロサイト馴化培地が神経細胞の培養能を有することが古くから知られている。し力しながら、神経細胞の長期安定培養に関しては、初代培養ァストロサイト馴化培地の単独使用では従来報告されていた程の効果がないことが明らかにされている。そして、初代ァストロサイト馴化培地に様々な添加剤（因子）を加えることにより、はじめて、神経細胞の長期安定培養の用途に適した培養液を得ることができる、と報告されている (特許文献 1及び 2参照)。

特許文献 1：特開平 9 - 289891号公報

特許文献 2：特開平 9 322765号公報

非特許文献 1：中山孝ら、 Neuroreport、「胚性幹細胞からの神経幹細胞及び神経細胞の効率のよい製造方法（Efficient production of neural stem cells and neurons fr om embryonic stem cells)」、第 15卷、第 3号、第 487— 491頁、 2004年 3月発行非特許文献 2 :中山孝ら、 Neuroscience Research、「ァスト口サイト由来因子は、胚性幹細胞の神経細胞への分化を指示する（Astrocyte-derived factors instruct diff erentiation of embryonic stem cell into neurons)」、 ¾¾46 、弟 2 、弟 241— 249 頁、 2003年 2月発行

非特許文献 3 :ボテンシユタイン (Bottenstein JE)ら、「無血清培地におけるラットネ申経牙删包 Ik糸田胞糸の生育 (Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free sup plemented medium)」、 Proc. Natl. Sci. Acad. USA.、第 76卷、第 514— 517頁、 1979年発行

非特許文献 4：ブリューヮー（Brewer GJ)ら、「低密度での規定培地における海馬- ユーロンの生存及び生育：長所、技術又は低酸素 (survival and growth of hippocamp al neurons in defined medium at low density： advantages, technique or low oxgen)」、 Brain Research,第 494卷、第 65〜74頁、 1989年発行

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明は、実質的に均質なァストロサイト様細胞馴化培地を安定的に供給すること、簡便な方法でァストロサイト様細胞馴化培地を大量に供給すること、所望の動物以外の動物由来の細胞成分を実質的に含まないァストロサイト様細胞馴化培地を供給すること、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まないヒトァスト口サイト様細胞馴化培地を供給すること、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができるァストロサイト様細胞馴化培地を供給すること、単離された神経細胞を長期間にわたつて安定に、良好な状態で培養維持することができるァストロサイト様細胞馴化培地を供給すること等の、少なくとも 1つを達成しうる、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の製造方法を提供することを目的とするものである。

[0010] 本発明はまた、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導すること、神経系細胞を長期間にわたつて安定に、良好な状態で培養すること等の少なくとも 1つを達成しうる、前記製造方法により得られるァストロサイト様細胞馴化培地を提供することを目的とするものである。

[0011] さらに、本発明は、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養すること、所望の動物以外の動物由来の成分を実質的に含まな!/、条件下に所望の動物の神経細胞を培養すること等の少なくとも 1つを達成しうる、神経細胞の維持方法を提供することを目的とするものである。 [0012] また、本発明は、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導すること、所望の動物以外の動物に由来する成分を実質的に含まない条件下で所望の動物の胚性幹細胞から神経系細胞に分化誘導すること等の少なくとも 1つを達成しうる、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法を提供することを目的とするものである。

[0013] さらに、本発明は、所望の動物 (例えば、ヒト）以外の成分の混入を実質的に伴わずに細胞移植治療を行なうこと、所望の動物 (例えば、ヒト）の生体への高い適合性を発揮すること等の少なくとも 1つを達成しうる、胚性幹細胞力も分ィ匕誘導した神経系細胞を提供することを目的として!ヽる。

本発明のさらなる目的は、本明細書の記載及び従来技術より明らかである。

課題を解決するための手段

[0014] 本発明は、上記の目的に鑑みてなされたものであり、

〔1〕胚性幹細胞の分ィ匕によって得られたァストロサイト様細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の製造方法、

〔2〕胚性幹細胞が、哺乳動物の胚性幹細胞である、前記〔1〕記載の製造方法、

〔3〕哺乳動物が、霊長類動物である、前記〔2〕記載の製造方法、

〔4〕霊長類動物が、ヒトである、前記〔3〕記載の製造方法、

〔5〕（A)胚性幹細胞力もァストロサイト様細胞を得る工程、及び

(B)前記工程 (A)で得られたァストロサイト様細胞を培養し、培養上清を得る工程、を含む、前記〔1〕〜〔4〕 V、ずれか 1項に記載の製造方法、

〔6〕工程 (A)にお、て、ァストロサイト馴化培地、予め調製されたァストロサイト様細胞馴化培地、又は該ァストロサイト馴化培地若しくはァストロサイト様細胞馴化培地と機能的に同等の予め調製された培地を用いて、胚性幹細胞を分化誘導させる、前記

〔5〕記載の製造方法、

〔7〕前記〔1〕〜〔6〕いずれ力 1項に記載の製造方法により得られる、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地、

〔8〕前記〔7〕記載の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下で神経細胞を培養することを特徴とする、神経細胞の培養方法、

〔9〕前記〔8〕記載の培養方法により培養された神経細胞、〔10〕前記〔7〕記載の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下で胚性幹細胞から神経系細胞へ分化誘導することを特徴とする、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法、並びに

〔11〕前記〔7〕記載の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて分ィ匕誘導されてなる、神経系細胞、

などに関する。

発明の効果

[0015] 本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の製造方法によれば、実質的に均質なァストロサイト様細胞馴化培地を、簡便に、大量にかつ安定的に供給することができる。また、本発明の製造方法によれば、所望の動物以外の動物由来の成分、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まないヒトァスト口サイト様細胞馴化培地を供給することができる。

[0016] さらに、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、実質的に均質であるという優れた性質を有する。また、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができ、神経細胞を長期間にわたって安定的に、良好な状態で維持することができる。また、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地によれば、所望の動物以外の動物に由来する成分が実質的に存在しない条件下で神経系細胞を製造又は維持することができる。本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地によれば、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まない工程でヒト神経系細胞 (神経幹細胞、神経細胞、ァストロサイト等)を製造することができる。

[0017] また、本発明の神経細胞の培養方法によれば、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養することができ、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しな、条件下で神経細胞を培養することができる。本発明の神経細胞の培養方法によれば、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まない条件下でヒト神経細胞を培養維持することができる。

[0018] さらに、本発明の胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく製造することができ、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しない条件下で神経系細胞を得ることができる。したがって、本発明の分化誘導方法により得られた神経系細胞は、再生医療分野における細胞移植材、創薬アツセィ系 (例えば、毒性評価、薬効評価等)への利用等の医薬品開発等に有用である。

[0019] また、本発明の神経系細胞によれば、所望の動物以外の動物に由来する成分を実質的に伴わずに細胞移植治療を行なうことができる。さらに、本発明の神経系細胞は、所望の動物 (例えば、ヒト）の生体への高い適合性を発揮しうる。本発明の神経系細胞は、所望の動物（例えば、ヒト）に適した医薬の開発のための創薬アツセィ系に利用することができる。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1]図 1は、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞をマウス胚性幹細胞由来ァスト口サイト様細胞馴化培地又は N2培地（DMEM :F—12 + N2添加物）で 2日間培養して得られた細胞の形態を示す図である。図中、パネル A及び Bは、 N2培地を用いた場合の結果を示し、パネル C及び Dは、マウス胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の結果を示す。図中、スケールバーは 50 mを示す。

[0021] [図 2]図 2は、免疫染色により GFAP (グリア繊維酸性タンパク質)及び MAP2 (微小管関連タンパク質 2)のそれぞれの発現を検出した結果を示す図である。図中、パネル Aは、 N2培地を用いた場合の結果を示し、パネル Bは、マウス胚性幹細胞由来ァスト口サイト様細胞馴化培地を用いた場合の結果を示す。 MAP2の発現は、緑色の蛍光により検出され、 GFAPの発現は、赤色の蛍光により検出される。また、図中、スケールバ一は 50 μ mを示す。

[0022] [図 3]図 3は、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地及び B— 27サプリメント含有 Neurobasal™培地を用いた場合に得られる細胞の培養 8日目の状態を示す図である。図中、パネル A及び Bは、 B— 27サプリメントを含有する Neurobasal™培地を用いた場合の細胞を示し、パネル C及び Dは、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の細胞を示す。また、図中、スケールバーは 50 mを示す。

[0023] [図 4]図 4は、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地及び B— 27サプリメント含有 Neurobasal™培地を用いた場合に得られる細胞の培養 10日目の状態を示す図である。図中、パネル A及び Bは、 B— 27サプリメントを含有する Neurobasal™培地を用いた場合の細胞を示し、パネル C及び Dは、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の細胞を示す。また、図中、スケールバーは 50 mを示す。

[0024] [図 5]図 5は、サル胚性幹細胞カゝら調製したァストロサイト様細胞を示す。抗 GFAP抗体及び抗 MAP2抗体による免疫染色の結果として、図中、パネル Aは GFAPの発現 (緑色蛍光）、パネル Bは MAP2の発現（赤色蛍光）、パネル Cは、パネル Aと Bの重ね合わせ画像を示す。スケールバーは 100 μ mを示す。

[0025] [図 6]図 6は、サル胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、サル胚性幹細胞を神経 (系）細胞に分化誘導した結果を示す図である。図中、パネル A及び Dは、免疫染色を行った細胞 (hrGFPの構成的発現により緑色蛍光を呈し、本検討に用いたサル胚性幹細胞 (CMK6-G4株)及びこれから派生した分化細胞の所在を示す。）を、パネル Bとパネル Eは、それぞれ jS IIIチューブリン発現 (赤色蛍光;パネル Aに対応するもの）と MAP2発現 (赤色蛍光;パネル Dに対応するもの）を、またパネル C及び Fは、それぞれパネル Aと B、パネル Dと Eの重ね合わせ画像を示す。また、図中、スケールバーは 100 /z mを示す。

[0026] [図 7]図 7は、ヒト胚性幹細胞カゝら調製したァストロサイト様細胞を示す。抗 GFAP抗体及び抗 MAP2抗体による免疫染色の結果として、図中、パネル Aは GFAPの発現（緑色蛍光）、パネル Bは MAP2の発現（赤色蛍光）、パネル Cは、パネル Aと Bの重ね合わせ画像を示す。スケールバーは 100 μ mを示す。

[0027] [図 8]図 8は、ヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、ヒト胚性幹細胞を神経 (系）細胞に分化誘導した結果を示す図である。図中、パネル A及び D は、免疫染色を行った細胞 (hrGFPの構成的発現により緑色蛍光を呈し、本検討に用いたヒト胚性幹細胞（SA181hrG2株)及びこれから派生した分化細胞の所在を示す。）を、パネル Bとパネル Eは、それぞれ j8 IIIチューブリン発現（赤色蛍光；パネル A に対応するもの）と MAP2発現 (赤色蛍光;パネル Dに対応するもの）を、またパネル C及び Fは、それぞれパネル Aと B、パネル Dと Eの重ね合わせ画像を示す。また、図中、スケールバーは 100 μ mを示す。

[0028] [図 9]図 9は、ヒト神経前駆細胞をヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地又は N2培地で 14日間培養して得られた細胞集団におけるクラス III βチューブリン陽性細胞を免疫染色により検出した結果を示す。図中、パネル Αは、 N2培地 (N2 )を用いた結果を示し、パネル Bは、ヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地 (hES-ACM)を用いた結果を示す。 N2培地を用いた場合、培養容器中にパネル Aのような部分がまばらに観察されるのに対し、 hES-ACMを用いた場合には、培養容器中の全面にパネル Bのような神経細胞が観察される。図中、スケールバーは 1 00 μ mを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0029] 本発明は、胚性幹細胞の分ィ匕によって得られるァストロサイト様細胞を培養することにより得られる馴化培地を、神経系細胞の培養又は胚性幹細胞力神経系細胞への分化誘導に用いると、初代培養ァストロサイトの馴化培地と同等又はそれ以上の優れた神経系細胞培養維持能及び神経分化誘導能を示すという驚くべき知見に基づ

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[0030] 本明細書中、「ァストロサイト様細胞」とは、胚性幹細胞の分ィ匕により得られるグリア線維酸性タンパク質（Glial fibrillary acidic protein： GFAP)を発現する細胞集団として定義される。一方、「初代培養ァストロサイト」とは、生体より組織を取出し、該組織をトリプシン等の細胞分散剤で処理して個々の細胞を解離させることにより得られる、 GFAPを発現する細胞集団をいう。したがって、力かる初代培養ァストロサイトには、組織を構成する種々の細胞が混在する。

[0031] また、本明細書中、「ァストロサイト馴化培地」とは、特に明記しない限り、前記初代培養ァストロサイトに由来する培養上清をいう。

[0032] さらに、本明細書中、本発明の、胚性幹細胞を分ィ匕誘導して得られたァストロサイト様細胞の馴化培地を、「ァストロサイト様細胞馴化培地」又は「胚性幹細胞由来ァスト口サイト様細胞馴化培地」とも、う。

[0033] なお、本明細書中、前記「ァストロサイト馴化培地」、本発明の「ァストロサイト様細胞馴化培地」及び本発明の「胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地」を総称して、「馴化培地」又は「本発明の馴化培地」と表記する場合もある。

[0034] また、本明細書中で用いられる「神経系細胞」という用語は、神経幹細胞、神経細胞 (ニューロン)、グリア細胞 (例えば、ァストロサイト、オリゴデンドロサイト）等を包含するものとする。なお、グリア細胞は、神経細胞 (ニューロン)を支持する細胞全般を指す。

[0035] 本発明の 1つの側面は、胚性幹細胞の分ィ匕によって得られたァストロサイト様細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞由来ァストロサイト馴化培地の製造方法である。本発明の製造方法によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができるという優れた性質を有する馴化培地を、簡便な操作により、安定かつ大量に供給することができる。また、本発明の製造方法によれば、神経細胞を長期間にわたつて良好な状態で培養維持することができるという優れた性質を有する馴化培地を簡便な操作により、安定かつ大量に供給することができる。

[0036] 本発明の製造方法の特徴の一つは、馴化培地の製造に際して、胚性幹細胞の分化によって得られるァストロサイト様細胞を用いる点にある。したがって、本発明の製造方法により得られる馴化培地は、神経系細胞への分ィヒ誘導等に関し、初代培養ァスト口サイトを用いて得られる馴化培地と同等又はそれ以上の性質を有する。しかも、本発明の製造方法によれば、初代培養ァストロサイトを使用する際に危惧される問題、すなわち、供給源である生体の部位、年齢等により、培地の性質や状態等にばらつきを生じる恐れがあり、かつ、ァストロサイト以外の他の細胞の混入が避けられない、という問題を回避することができるので、実質的に均質な胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を提供することができる。

[0037] また、本発明の製造方法に用いるァストロサイト様細胞は、無限増殖性を有する胚性幹細胞を一定の条件下で分化させることによって得られる細胞であり、量産性や品質の安定性が優れている。そのため、本発明の製造方法は、初代ァストロサイトを用いる馴化培地製造方法に比較して、馴化培地を安定的にかつ大量に供給することができ、工業的に優れた効果を発揮する。

[0038] さらに、本発明の製造方法は、生体由来の初代培養ァストロサイトを使用するものではな!/、ため、所望の動物以外の動物由来の細胞成分を実質的に含まな!/、条件下で、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を供給できるという優れた効果を発揮する。また、本発明の製造方法によれば、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まない工程で胚性幹細胞由来ァストロサイト馴化培地を供給することができる。このため、例えば、ヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト馴化培地を用いることにより、非ヒト細胞成分を実質的に含まない工程で、ヒト胚性幹細胞からヒト神経系細胞を製造することが可能になる。したがって、本発明によれば、細胞移植治療等の再生医療への応用、創薬研究における霊長類動物、特に、ヒト細胞を利用する医薬品開発、霊長類動物、特に、ヒトの神経系細胞の実質的に純粋な状態での培養や長期にわたる安定的な培養等が可能になる。

[0039] 本発明の製造方法に用いる胚性幹細胞は、使用目的等に応じて、適当な動物由来の胚性幹細胞であればよぐ具体的には、哺乳動物の胚性幹細胞等が挙げられる。前記哺乳動物としては、より具体的には、マウス、ラット、ミンク、ハムスター、ブタ、サル (例えば、マーモセット、ァカゲザル、力-クイザル等）、ヒト等が挙げられる。なお、本発明においては、例えば、動物への移植等の目的で用いられる神経系細胞の製造、維持等、具体的には、ヒトへの細胞移植治療等の臨床応用のための細胞の製造、維持等に用いるための馴化培地を製造する場合、組織適合性等の観点から、移植等の対象となるヒト由来の胚性幹細胞を用いることが有利である。

[0040] 本発明の製造方法としては、

(A)胚性幹細胞力ゝらァスト口サイト様細胞を得る工程、及び

(B)前記工程 (A)で得られたァストロサイト様細胞を培養し、培養上清を得る工程、を含む方法等が挙げられる。

[0041] 前記工程 (A)は、具体的には、特に限定されないが、例えば、

1)ァストロサイト馴化培地を用いて、胚性幹細胞から神経幹細胞へ分化誘導するェ程、

2)前記工程で生じた神経幹細胞を増幅する工程、及び

3)前記工程で増幅された神経幹細胞力ァストロサイト様細胞へ選択的に分ィ匕誘導する工程、

により行うことができる。

[0042] 前記工程 1)にお、て、胚性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導は、例えば、胚性幹細胞を、ァストロサイト馴化培地中で培養すること等により行なうことができる。なお、前記工程 1)においては、前記ァストロサイト馴化培地若しくは該ァストロサイト馴化培地に機能的に同等の培地等に、因子 (例えば、成長因子、サイト力イン等)ゃィ匕学的に決定された (chemically-defined)成分が添加された基本培地からなる合成培地を混合してもよい。

[0043] なお、本発明の製造方法においては、一旦、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞が得られた後は、前記ァストロサイト馴化培地の代わりに、前記胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞により得られるァストロサイト様細胞馴化培地を用いることができる。本発明のァストロサイト様細胞馴化培地を継続的に使用して本発明のァストロサイト様細胞馴化培地を製造することができる。本発明においては、好ましくは、前記工程 1)として、

1 ' )胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、胚性幹細胞から神経幹細胞へ分化誘導する工程を行なう態様が望ま Uヽ。

[0044] 前記工程 1)及び 1 ' )それぞれにおける分ィ匕誘導は、例えば、浮遊培養等により行なうことができる。

[0045] 前記工程 1)又は 1 ' )において、より具体的には、例えば、胚性幹細胞の未分化コロニーを丸ごとの状態で浮遊培養することにより、細胞塊（いわゆる Neural stem sphere;

NSS)が生じ、該 NSSの表層部に多数の神経幹細胞が局在する構造等の特徴を示す細胞が出現すればよい。ここで、「神経幹細胞」とは、ァストロサイト様細胞に分化する前駆細胞であり、ネスチン、ムサシ等の神経幹細胞マーカー、 A2B5等のダリァ前駆細胞マーカー等を発現する陽性細胞として同定できる細胞をいう。

[0046] 前記培養に用いる培養容器の形状及び大きさは、細胞塊 (NSS)力浮遊培養中に培養容器の底面等に接着せず、安定に浮遊培養を継続して行なうことができるものであればよい。カゝかる培養容器としては、例えば、浮遊培養用ディッシュ、細菌用ペトリディッシュ等が挙げられる。また、前記培養容器は、 0. 5重量％ァガロース (寒天）を入れ、底面に細胞塊が接着しないように加工されたものであってもよい。

[0047] 浮遊培養時間は、用いられる胚性幹細胞の種類に応じて適宜設定することができる。かかる培養時間は、例えば、 NSSの表層部に、ァストロサイト前駆細胞となる神経幹細胞が出現することを指標として設定してもよい。前記神経幹細胞は、例えば、神経幹細胞マーカー（例えば、ネスチン、ムサシ等）、グリア前駆細胞マーカー (A2B5 等)の発現を指標として検出することができる。さらに、浮遊培養による神経系細胞の分化誘導効率の評価は、幼若神経マーカー（ β IIIチューブリン等)の発現を、免疫組織ィ匕学的手法により検出することによつても行なうことができる。前記培養時間は、具体的には、例えば、マウス胚性幹細胞を用いる場合、通常、 1〜10日、好ましくは、 4 日前後（例えば 3〜5日）、霊長類動物（サル、ヒト)胚性幹細胞の場合、通常、 1〜15 日、好ましくは、 7日前後（例えば、 5〜8日）であればよい。

[0048] っ、で、神経幹細胞を増幅する〔工程 2〕。前記工程 2)にお、て、前記工程 1)で生じた神経幹細胞自体又は該神経幹細胞を含む NSSを、接着培養する。前記工程 2) を行なうことにより、神経幹細胞が増幅される。また、神経幹細胞を含む NSSを接着培養した場合、接着した NSSの周囲に、神経幹細胞が、遊走増殖される。したがつて、力かる工程 2)を行ない、神経幹細胞を増幅することにより、後述の工程 3)でァストロサイト様細胞を大量に調製できる。

[0049] 前記工程 2)にお、て、 NSSを、神経幹細胞等を接着させて増幅させるに適した培地としては、例えば、 DMEM :F— 12 (1 : 1)、商品名： Neurobasal™培地〔インビトロジェン（Invitrogen)社製〕等に、 B27添カ卩物〔ブリューヮー（Brewer, G. J. ) , Focus, 1 6, 6-9 (1994)；ブリューヮー（Brewer, G. J. ) , J. Neurosci. Res. , 35, 567-576 (199 3)〕〔インビトロジェン（Invitrogen)社製、カタログ番号： 17504— 044〕と、塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)、上皮細胞成長因子 (EGF)等の増殖 ·成長因子とを含む培地等が挙げられる。具体的には、 B27添加物と bFGFと任意に EGFとを含む Neur obasaは咅地、 N2添カ卩物と bFGFと任意に EGFとを含む DMEM :F— 12 (1： 1)を用い、接着培養を行なうこと等により、神経幹細胞を増幅させることができる。

[0050] 神経幹細胞を増幅するための接着培養に際しては、 NSS及び遊走増幅する神経幹細胞それぞれの培養容器への接着性と神経幹細胞の性状を安定に維持する観点から、培養容器を、例えば、マトリゲル™〔ビーディー'バイオサイエンス (BD Biosc ience)社製〕、ポリ一 L—リジン、ラミニン等でコートした培養容器を用いることが好ましい。

[0051] 前記培養容器のコーティングは、マトリゲルを用いる場合、製造者の説明書に記載の方法により行なえばよい。また、その他の細胞外基質を用いる場合も、慣用の方法、例えば、細胞外基質を含む溶液に、培養容器の底面が十分に浸るようにし、一定時間放置又は 37°Cでインキュベーションする方法等により行なうことができる。

[0052] 前記 bFGF、 EGF等の増殖.成長因子を用いる場合、培地中における bFGF、 EG F等の増殖'成長因子の濃度は、胚性幹細胞の種類等により適宜設定することができる。 bFGFを用いる場合、 l〜200ngZml、好ましくは、 20〜40ngZmlであることが望ましい。また、 EGFを用いる場合、 10〜50ngZml、好ましくは、 10〜20ngZm 1であることが望ましい。さらに、 bFGFと EGFとを併用する場合、例えば、 bFGFを 10 〜20ngZmlの濃度、 EGFを 10〜20ngZmlの濃度となるように混合して用いてもよい。

[0053] 前記接着培養における培養時間は、胚性幹細胞の由来元となる動物種、分ィ匕誘導の程度等に応じて適宜設定することができる。

[0054] 前記工程 2)にお、ては、遊走増幅した神経幹細胞を、トリプシン、デイスパーゼ、コラゲナーゼ、パパイン等の酵素、 EDTA、細胞解離バッファー〔ギブコインビトロジェン社製〕等の細胞分散剤を用ヽて培養器から解離 ·分散させ、別の新 Uヽ培養容器に継代することによって、さらに神経幹細胞を増幅することもできる。具体的には、例えば、 0. 05〜0. 35重量％トリブシンを用いて、遊走増殖した各神経幹細胞を解離' 分散し、さらに継代増幅すればよい。

[0055] また、 NSSから神経幹細胞を遊走増幅させる途上で、培養系から未分化胚性幹細胞等の神経幹細胞以外の細胞種の混在率を低減し、神経幹細胞の存在比を高める観点から、細胞集団の中心部分に存在する未分化胚性幹細胞等を除去してもよヽ。

[0056] その後、前記工程 2)で増幅された神経幹細胞力ァストロサイト様細胞へ選択的に分化誘導する〔工程 3]。

[0057] ァストロサイト様細胞への選択的な分ィ匕誘導は、用いる胚性幹細胞の種類に応じて適宜設定することができるが、例えば、前記工程 2)で用いた培地を、前記 bFGF、 E

GF等の増殖'成長因子を含まない培地に交換すること等により、行なうことができる。

[0058] 前記工程 (A)において、工程 1)〜3)を行なうことにより、 GFAPを発現する細胞を含む細胞集団として、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞を得ることができる。 [0059] っ、で、前記工程 (A)で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞を培養し、培養上清を得る〔工程 (B)〕。

[0060] 前記工程 (B)にお、て、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞の培養は、該ァスト口サイト様細胞の生存が可能で、かつ該ァストロサイト様細胞力各種因子が放出され得る条件であれば、培養条件は特に限定されないが、異種生物細胞成分の混入を回避した製造過程が必要である場合等においては、無血清培地を培地に用いることが好ましい。具体的には、例えば、 N2添加物を、 X 1濃度〔5 /z gZmlインスリン、 10 0 μ g/mlトランスフェリン、 63ng/mlプロゲステロン、 16. 11 μ g/mlプトレッシン、 2ngZml亜セレン酸塩〕で含有する DMEM :F— 12培地などを用い、 37°C、 C O濃度 5%前後で培養すればよい。

2

[0061] 前記工程 (B)における培養時間は、動物種、細胞数等に応じ、ァストロサイト様細胞が産生する各種因子を十分に培養液中に放出させるように適宜設定することができるが、通常は、例えば、 1日前後であればよい。

[0062] 培養後、得られた培養物力も上清を回収する。具体的には、培養物を全部又は上清の一部を回収し、例えば、遠心分離及び適切な孔径のフィルタ一等に供して、ァストロサイト様細胞を除去することにより、無細胞の培養上清として胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を得ることができる。

[0063] 培養物を全部回収して、ァストロサイト様細胞を除去した場合、当該ァストロサイト様細胞に、前記工程 (B)での培養に用いる培地及び添加剤を添加し、同様の培養条件で培養を行なうことからなる一連の操作を繰り返すことにより、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を繰り返し製造することが可能である。また、培養物から上清の一部を回収した場合、残部の培養物に、前記工程 (B)での培養に用いる培地及び添加剤を補追し、さら〖こ、同様の培養条件で培養を行なう一連の操作を繰り返すことにより、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を繰り返し製造することが可能である。本発明の製造方法には、力かる態様の製造方法も含まれる。

[0064] 本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができる。また、本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地によれば、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養維持することができる。

[0065] 本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、神経細胞培養維持能及び胚性幹細胞における神経分化誘導能を調べること〖こより評価することができる。

[0066] 前記神経細胞培養維持能は、例えば、生体から調製された初代培養神経細胞又は胚性幹細胞から分化誘導して得られた神経細胞を、本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト馴化培地の存在下に培養し、経時的又は定期的に、細胞の性状 (生存 ·形態等)を解析することにより評価することができる。なお、前記神経細胞の培養は、例えば、シュプリンガーフエアラーク東京発行、中川八郎監修、畠中寛編、ニューロサイエンスラボマニュアル「神経細胞培養法」第 347頁（35) ( 1997年 4月 24日）に記載の条件により行なうことができる。

[0067] 神経細胞の維持培養を行なう場合、該神経細胞を、評価対象の馴化培地の存在下、培養に適した条件で培養する。形態的特徴を、細胞体、榭状突起、軸索、軸索成長円錐等の有無に基づいて評価する。また、マーカーとして、神経伝達物質の受容体の発現、例えば、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、コリンァセチルトランスフェラーゼ等の発現を免疫組織ィ匕学的手法等により検出すること等により、評価する。これらマーカーの発現を示し、特有の形態がみられた場合、前記馴化培地を、神経細胞を良好に維持することができるものと評価することがでさる。

[0068] 本発明の他の側面は、本発明の製造方法により得られる、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地である。本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、胚性幹細胞カゝら分ィ匕誘導して得られたァストロサイト様細胞の培養上清に基づくものであるため、初代培養ァストロサイトの馴化培地に比べ、より安定した品質を示し得る。また、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト馴化培地と胚性幹細胞とを組み合わせて使用すれば、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しない工程により、神経系細胞を製造することができる。したがって、本発明の胚性幹細胞由来ァスト口サイト様細胞馴化培地によれば、実質的に所望の動物以外の動物由来の成分を含まない、より高い品質の神経系細胞を供給できるため、例えば、医薬品開発における創薬アツセィ系への利用や細胞毒性評価への利用が可能になり、また、細胞移植治療等の再生医療に適した適合性の高!、移植細胞材の供給が可能になる。

[0069] さらに、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト馴化培地によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができ、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養維持することができる。

[0070] 本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、 N2添加物〔インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸塩、プロゲステロン；例えば、ボテンシユタイン（Bottenst ein)ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USAゝ 76 : 514 (1979)等を参照のこと〕、アルブミン、前記アンチオキシダント等の添加剤をさらに含有してもよい。本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地中における前記添加剤の含有量は、使用目的、培養対象の細胞、例えば、胚性幹細胞、神経系細胞等の種類、該細胞の供給源となる動物種に応じて適宜設定することができる。前記 N2添加物の含有量は、特に限定されないが、例えば、インスリンについて、最終濃度 1〜： LOO /z gZml 好ましくは、 3〜2 O ^ g/ml,トランスフェリンについて、最終濃度 1〜： LOO /z gZml 好ましくは、 3〜2 0 μ g/m 亜セレン酸塩について、最終濃度 1〜： L00nM、好ましくは、 3〜50nM、プロゲステロンについて、最終濃度 1〜： L00nM、好ましくは、 20nMであればよい。

[0071] なお、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、使用目的、培養対象の細胞の種類、該細胞の供給源となる動物種等に応じて、細胞の培養に適し、所望の細胞への分ィ匕誘導を促進し得る因子等をさらに含有してもよい。

[0072] また、前記胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、細胞、例えば、神経系細胞のより長期かつ安定的な維持及びより効率のよい分ィ匕誘導を行なう観点から、細胞、例えば、胚性幹細胞、神経系細胞等に用いられる慣用の基本培地をさらに含有してもよい。前記胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地と、基本培地との混合比は、使用目的、培養対象の細胞の種類、該細胞の供給源となる動物種等に応じて、適宜設定されうる。

[0073] 本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、例えば、凍結又は冷蔵して保存することができる。本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を長期保存する場合、凍結して保存することが望ましぐ好ましくは、 10〜一 80 °Cで保存することが望ましい。本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を凍結して保存する場合、当該培地の性能の根源であると考えられる各種タンパク質性因子の活性低下を軽減し、安定した性質を発揮させる観点等から、凍結融解の操作を繰り返さないことが望ましい。また、冷蔵保存する場合、好ましくは、 4〜8°C で保存することが望ましい。

[0074] 本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、単独で、あるいは、例えば、各動物種の胚性幹細胞、神経系細胞、細胞の培養に適した因子又は試薬、分化誘導に適した因子又は試薬、細胞接着分子でコーティングされた培養容器、浮遊培養に適した培養容器等とともにキットとしても提供することができる。

[0075] なお、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地中から分離同定される各種の機能的に有効な成分 (以下、「機能成分」と呼称)をそれぞれ有効量用いることにより、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地と同等の効果を得ることが可能となる。したがって、本発明には、例えば、個々の機能成分を供給し、使用前に前記機能成分それぞれを混合して、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地と同等の神経系細胞の培養能、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導能を有する機能成分混合培地を調製する態様も含まれる。本発明には、前記機能成分を混合して得られた機能成分混合培地も含まれる。また、前記機能成分は、単独でも、神経系細胞の培養能、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導能を示しうる成分もある。力かる機能成分の単独での使用も本発明に含まれる。前記機能成分は、単独で、又は少なくとも 2種を組み合わせて、神経系細胞の培養用及び Z又は維持用試薬、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導用試薬として、提供することができる。

[0076] また、本発明の別の側面は、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を培地として使用すること、具体的には、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下で神経細胞を培養することを特徴とする、神経細胞の培養方法である。本発明の神経細胞の培養方法によれば、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地が用いられているため、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養することができ、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しない条件下で神経細胞を培養することができる。

[0077] また、本発明の培養方法においては、神経細胞の供給源となる動物種は、特に限定されるものではなぐ例えば、哺乳動物、具体的には、マウス、ラット、ミンク、ハムスター、ブタ、ィヌ、ヒッジ、ャギ、サル、ヒト等が挙げられる。

[0078] なお、本発明の培養方法にお!、ては、適用対象となる神経系細胞を、例えば、移植等に用いる場合、適合性等の観点から、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、移植対象となる動物と同種の胚性幹細胞より得られたァストロサイト様細胞の馴化培地であることが望ま、。

[0079] 本発明の培養方法は、神経細胞を培養するいかなる方法にも適用することができる

[0080] 神経細胞を培養する場合、例えば、該神経細胞を、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下、培養に適した条件で培養することにより行なわれうる。胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いること以外の培養条件は、特に限定されるものではないが、具体的には、胚性幹細胞由来ァストロサイト馴化培地の存在下、 N2添加物を、 X 1濃度〔5 μ g/mlインスリン、 100 μ g/mlトランスフェリン、 63ng/mlプロゲステロン、 16. 1 1 μ g/mlプトレツシン、 2ng/ml 亜セレン酸塩〕で含有する DMEM： F- 12培地で胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞を培養した後の培養上清、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地に前記 N2添加物を X I濃度で追補した培地等を用い、 37°C前後（例えば、 37 °C ± 0. 2°C)、 CO 濃度 5%前後（例えば、 4. 8〜5. 2%)で、ポリ L リジン、ラミ

2

ニン等でコーティングされた培養容器で培養すること等が挙げられる。

[0081] 本発明の別の側面は、本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を培地として用いること、例えば、本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下で胚性幹細胞から神経系細胞へ分化誘導することを特徴とする、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法である。本発明の分化誘導方法によれば、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地が用いられているため、所望の動物由来の神経系細胞を調製する場合、かかる動物種の胚性幹細胞を用いることにより、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しなヽ条件下で神経系細胞を得ることができる。したがつて、本発明の分化誘導方法により得られた神経系細胞によれば、移植等への使用に好適な細胞を調製することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の分化誘導方法によれば、ヒトへの臨床応用、例えば、神経系細胞を用いる細胞移植治療において、非ヒト成分を実質的に含まない工程により得られたヒト神経系細胞を製造できる点で有利である。

[0082] 本発明の分化誘導方法に用いられる胚性幹細胞は、得られた神経系細胞の使用目的等に応じて、適宜選択することができる。本発明の分化誘導方法に用いられる胚性幹細胞の供給源の動物種は、特に限定されるものではなぐ例えば、哺乳動物、具体的には、マウス、ラット、ミンク、ハムスター、ブタ、ィヌ、ヒッジ、ャギ、サル、ヒト等が挙げられる。

[0083] 本発明の分化誘導方法により、胚性幹細胞から、神経幹細胞への分化誘導は、前記製造方法における工程 (A)の工程 1 ' )により行なうことができる。

[0084] 得られた神経幹細胞は、神経系細胞 (神経細胞ゃグリア細胞)への分化能や前記神経幹細胞マーカーの発現等を調べることにより評価することができる。

[0085] また、本発明の分化誘導方法による、胚性幹細胞から、神経細胞への分化誘導は、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、胚性幹細胞のコロニーを、浮遊培養して、中心 (芯)部分の未分ィ匕胚性幹細胞の層と表層部に生じた多数の神経幹細胞とから構成される構造等の特徴を示す細胞塊 (NSS)を生じさせ、得られた NSSを、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下、接着培養すること;前記神経幹細胞を、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下、接着培養すること等により行なうことができる。さらに、得られた神経細胞の同定は、神経細胞マーカー、例えば、ニューロフィラメント、チロシン水酸ィ匕酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、コリンァセチルトランスフェラーゼ等のマ一力一の発現を指標として行うことができる。用いられる培地は、本発明の胚性幹細胞由来ァスト口サイト様細胞馴化培地が挙げられ、さらに、 DMEM :F— 12、 DME M、 F— 12、 MEM、 Neurobasal 等のいずれかの培地や新たな因子等を添加してもよい。培養気相の条件としては、 37°C前後、例えば、 37°C±0. 2°C、 CO濃度 5%

2 前後、例えば、 4. 8〜5. 2%、湿度 100%の条件等が挙げられる。培養時間は、胚性幹細胞の供給源となる動物種に応じて、適宜設定でき、マウスの場合、 1〜7日であることが望ましぐサルの場合、 1〜14日であることが望ましい。

[0086] 得られた細胞が神経細胞であることは、例えば、形態的特徴、例えば、細胞体、榭状突起、軸索、軸索成長円錐等を指標として確認することもできる。また、得られた神経細胞は、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、コリンァセチルトランスフェラーゼ等のマーカー又はそれをコードする遺伝子の発現等を調べること〖こより評価することができる。

[0087] 本発明の分化誘導方法による、胚性幹細胞から、グリア細胞への分化誘導は、前記 NSS又は神経幹細胞を、接着培養すること等により行なうことができる。用いられる培地としては、特に限定されないが、 DMEM :F—12 + N2添加物（N2培地）等が挙げられる。培養時間は、用いられる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができ、マウス由来胚性幹細胞の場合、 1〜7日であることが望ましぐサルの場合、 1〜1 4日であることが望ましい。さらに、得られたグリア細胞は、形態的特徴ゃグリア細胞マーカー、例えば、ァストロサイトはグリア繊維酸性タンパク質 (GFAP)等のマーカーの発現等を指標とし同定することができる。

[0088] 本発明の分化誘導方法により得られる神経系細胞は、所望の動物以外の動物由来の成分、例えば、非ヒト成分の非存在下に得られる。したがって、前記神経系細胞によれば、所望の動物以外の動物由来の成分を実質的に伴わずに細胞移植治療を行なうことができる。また、本発明の分化誘導方法により得られる神経系細胞は、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて得られる細胞であるため、所望の動物（例えば、ヒト）の胚性幹細胞由来のァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、分ィ匕誘導することにより、所望の動物以外の動物由来の成分を実質的に伴わずに、所望の動物の生体への高、適合性を有する神経系細胞を得ることができる。したがつて、本発明の神経系細胞は、所望の動物に適した医薬の開発のための創薬アツセィ系に利用することができる。また、本発明の神経系細胞によれば、個体の神経変性部位又は神経損傷部位に導入することにより、神経変性又は神経損傷に起因する疾患や状態、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患;脳虚血、脱髄疾患、頭部外傷、脊髄損傷、脳梗塞等における神経再生医療への応用が可能になる。力かる神経系細胞も本発明に含まれる。

実施例

[0089] 以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「％」は、特に明記がない場合は、重量％を示すものとする。また、 COにおける「％」表記は、体積％を示すも

2

のとする。

[0090] 実施例 1

マウス胚性幹細胞 129SV株を常法により培養し、播種後 3日目に、キヤピラリーを用いて、物理的に細胞をコロニーごとピックアップした。得られたコロニーを、神経細胞培養用培養液 (ここでは、初代培養ァストロサイト馴化培地の代替物として使用した、住友ベークライト製品：品番 MB— X9501)で 37°C、 5%COで 4日間浮遊培養

2

し、それにより、中心に未分化胚性幹細胞の層、神経幹細胞の表層、両者の中間層の 3層構造を形成している Neural stem sphere (NSS)を得た。

[0091] その後、前記 NSSを、ポリ一 L リジン Zラミニンコートディッシュ中、 1 X B— 27サプリメント〔カタログ番号： 17504— 044、インビトロジェンコーポレーション（Invitroge n Corporation)製； X 50濃度の市販品を、 X 1の濃度に調整して使用〕を含有した Ne urobasal™培地〔カタログ番号： 21103— 049、インビトロジェンコーポレーション製〕上に播種し、毎日、塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)を最終濃度 20ngZmlとなるよう添加しながら、 37°C、 5%COで培養し、神経幹細胞を増殖させた。なお、前記

2

ポリ L リジン Zラミニンコートディッシュは、ポリ L リジンコートディッシュ〔IWA KI、旭テクノグラス社製〕を、 lO ^ g/ml ラミニン〔カタログ番号: L0001、旭テクノグラス社製〕で 3時間処理することによりコーティングした。

[0092] 7日間培養した後、遊走増幅された神経幹細胞の存在比を高める目的でキヤビラリ一ピペットを用いて、増殖している細胞の中心部分の未分化細胞を物理的に除去し、 37°C、 5%COでさらに 7日間培養を継続し、神経幹細胞を増幅させた。 [0093] その後、増幅した神経幹細胞をァストロサイト様細胞に選択的に分化誘導するために、培地を除去して、 Ca²⁺及び Mg²⁺不含リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄後、 0. 05重量％トリプシン ZEDTAで該細胞を解離させた。解離後の細胞について、ポリ—L—リジン Zラミニンコートディッシュ〔住友ベークライト社製〕中、以下の濃度： 5 ^ g/ml インシュリン、 100 gZml トランスフェリンと、 6. 3ng/ml プロゲステロン、 16. 11 /z gZml プ卜レツシン、 5. 2ng/ml 亜セレン酸塩、カタログ番号： 175 02— 048、インビトロジェン（Invitrogen)社製で N2添力卩物を添カロした DMEM :F— 1 2培地 (以下、 N2培地と称す）により継代培養を行なった。

[0094] つ!、で、 3日間培養後、得られた培養物から上清を回収し、孔径 22nmのフィルタ一〔商品名： DISMIC— 25CS、アドバンテック社製〕で濾過し、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を得た。得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地に、栄養素を補う目的で N2添加物〔インビトロジェンコーポレーション製〕を、最終濃度 1%〔前記 N2添加物（X 100濃度）を X 1濃度となるように調整〕となるように添カロした。

[0095] 実施例 2

神経細胞の培養能の検討に用いる神経細胞を調製する目的で、凍結保存されたマウス胎仔大脳皮質〔神経細胞培養システム〔住友ベークライト社製〕の商品名：神経細胞 CX(M)〔カタログ番号: MB— X0305〕を室温で融解し、神経細胞分散液〔神経細胞培養システム〔住友ベークライト社製〕の細胞分散液キット〔カタログ番号： MB -X9901]に分散させ、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞分散液を得た。

[0096] ついで、前記マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞分散液を、日立製作所社製 h imac CF702を用い、 300rpmで 1分間遠心分離し、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞を洗浄した。ついで、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞を、前記実施例 1で得られたマウス胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地に、 1 X 10⁵細胞 Z mlとなるように懸濁させ、ポリ—L—リジンコート 24ゥエルプレート〔住友ベークライト社製〕上に、 0. 5mlZゥエルとなるように播種し、 37°Cで 5%COで培養した。なお、培

2

地を、 2日おきに全培地の半分の量ずつ交換した。また、対照として、 N2培地を用い、前記マウス胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合と同様に、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞を培養した。 2日間培養した時点の細胞の形態を観察した結果を図 1に示す。図 1中、パネル A及び Bは、 N2培地を用いた場合の結果を示し、パネル C及び Dは、マウス胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の結果を示す。

[0097] その結果、図 1のパネル C及び Dに示されるように、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、非常に良好な接着と突起の伸長が見られた。一方、図 1のパネル A及び Bに示されるように、 N2培地を用いた場合、細胞の接着自体が不十分であり、接着した細胞もほとんど突起を伸ばさないことがわかる。

[0098] さらに、培養 4日目、培養物から培地を除去した。得られた細胞に、 4重量％パラホルムアルデヒドを添カ卩し、室温で 5分間インキュベーションした。その後、得られた混合物に、 0. 1% Triton™ -X 1mlを添カ卩し、室温で 5分間インキュベーションした。得られた混合物に、 1重量％Normal Goat Serumをさらに添カ卩し、室温で 30分間インキュベーシヨンして、ブロッキングを行なった。

[0099] その後、前記ブロッキング後の細胞に、 1重量％Normal Goat Serumで適宜希釈した抗 GFAP抗体〔カタログ番号： AB5804、ケミコン（CHEMICON)社製〕及び抗 M AP2抗体〔カタログ番号： 442695、カルビオケム（CALBIOCHEM)社製〕を添加し、 4°Cでー晚インキュベーションして、反応させた。ついで、 Ca²⁺及び Mg²⁺フリーのリン酸緩衝化生理食塩水で、細胞を洗浄し、 2次抗体〔商品名： Alexa Fluor488 ;モレキユラ一プローブス（Molecular Probe)社製〕を添カ卩し、室温で 30分間インキュベーションし、反応させた。その後、前記 2次抗体の蛍光により、細胞におけるグリア線維性酸性タンパク質 (GFAP)及び MAP2のそれぞれの発現を検出した。かかる免疫染色の結果を図 2に示す。図中、パネル Aは、 N2培地を用いた場合の結果を示し、パネル Bは、マウス胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の結果を示す。

[0100] その結果、図 2のパネル Bに示されるように、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、細胞において、非常に良好に MAP2の発現が見られたが、 GFAPの発現はほとんど見られな力つた。これは、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いると、神経細胞のみが非常に良好に培養できることを示している。一方、図 2のパネル Aに示されるように、 N2培地を用いた場合、 GFAP及び MA P2のそれぞれに対して陽性の細胞が見られな力つた。

[0101] また、培養 2日目、前記実施例 1で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて得られた培養物のゥエルにおいて、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を、 I X B— 27サプリメント〔インビトロジェンコーポレーション製〕を含有した Neurobasal™培地〔インビトロジェンコーポレーション製〕に置換し、さらに、 3 7°C、 5%COで 10日間培養し、前記実施例 1で得られた胚性幹細胞由来ァストロサ

2

イト様細胞馴化培地による長期培養能について評価した。

[0102] その結果、培養開始時力も N2培地を用いて培養を行なった細胞は、培養 5日目には死滅した。

[0103] 胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地及び B— 27サプリメント含有 Neurob asal™培地を用いた場合の細胞について、培養 8日目の状態を図 3に、培養 10日目の状態を図 4に示す。各図中、パネル A及び Bは、 B— 27サプリメント含有 Neurobasal ™培地を用いた場合の細胞を示し、パネル C及び Dは、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の細胞を示す。

[0104] その結果、図 3及び図 4それぞれのパネル C及び Dに示されるように、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて培養した神経系細胞は、培養 10日目にぉヽても神経細胞間の緊密なネットワークを形成して、ることがわ力る。

[0105] 一方、 B— 27サプリメント含有 Neurobasal™培地で培養した神経系細胞は、培養 7 日目力死に始め、図 3のパネル A及び Bに示されるように、培養 8日目の時点で、ほとんどの細胞が死んでおり、図 4のパネル A及び Bに示されるように、培養 10日目には死滅して、ることがわ力る。

[0106] このように、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いると、従来、長期間にわたって良好な状態で維持することが困難であった神経細胞、例えば、初代培養系神経細胞を in vitroで長期間、安定的に培養維持することが可能であることが示された。

[0107] 実施例 3

前記実施例 1で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用、て、以下のように、マウス胚性幹細胞から神経細胞への分化誘導能を調べた。

[0108] マウス胚性幹細胞 129SV株を、常法により 3日間培養し、大きく成長したコロニーを形成させた。ついで、キヤビラリ一ピペットを用いて、コロニーごと回収し、得られたコロニーを、前記実施例 1で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地、対照として、 N2培地を用いて、 37°C、 5%COで 4日間浮遊培養した。

2

[0109] その後、得られたコロニーをポリ一 L—リジンコートディッシュ〔旭テクノグラス社製〕上、それぞれの培地で、 37°C、 5%COで 7日間接着培養し、神経系細胞に分化誘

2

導した。

[0110] マウス胚性幹細胞からの神経細胞分化の程度 (神経分ィ匕のみられたコロニー数)を評価する目的で、得られた細胞集団におけるクラス III βチューブリンの発現を、抗 β IIIチューブリン抗体 (T i)を用いた免疫染色により解析した。結果を表 1に示す。表中、 ESACMは得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を、 N2は N 2培地をそれぞれ示す。また、表中、括弧内の数値は陽性コロニー数の割合を示しており、（総陽性コロニー数 Zピックアップ数） X 100 (%)により算出された値である。

[0111] [表 1]

[0112] その結果、表 1に示されるように、胚性幹細胞から神経細胞への分化誘導系において、前記実施例 1で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、陽性コロニー数の割合は、 51%であり、胚性幹細胞を神経系細胞に分化誘導する能力を十分に有することが明らかとなった。

[0113] また、分ィ匕誘導によって得られる神経幹細胞の性状を確認するため、前記実施例 1 で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導された神経幹細胞の性状について、分化誘導された神経幹細胞の増殖能を、 Neurobasal™ 培地〔インビトロジェンコーポレーション製〕で 37°C、 5%COで 7日間培養し、得ら

2

れた細胞について、顕微鏡〔株式会社ニコン製、商品名： ECLIPSE TE2000-U 〕下で観察した。

その結果、前記実施例 1で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導された神経幹細胞は、良好な増殖が観察された。

[0114] さらに、増幅した神経幹細胞について、前記実施例 1で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地により 7日間培養後、得られた細胞を慣用の手法により、 MAP2により免疫染色し、顕微鏡下〔株式会社ニコン製、商品名： ECLIPSE TE20 00 -U]で観察することにより、神経細胞への分化を調べた。

その結果、前記増殖細胞は、神経細胞の形態に分化し、大半の細胞力 MAP2に対して陽性であった。したがって、前記実施例 1で得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導された神経幹細胞は、増殖能及び分化能を有して!/ヽることが示唆された。

[0115] また、サル胚性幹細胞 CMK6株について、得られた胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用い、サル由来細胞に適した条件下、実施例 2と同様の手順により、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導を行なった。その結果を表 2に示す。表中、 ESACMは胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を、 N2は N2培地を、それぞれ示す。

[0116] [表 2]

[0117] その結果、表 2に示されるように、サル胚性幹細胞においても胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、十分な神経系細胞への分化誘導能を有して!/ヽることが明らかとなった。またマウス胚性幹細胞の場合と同様に、誘導した神経幹細胞の増殖能を検討した結果、良好な増殖能が観察できた。

[0118] 実施例 4

力-クイザル ES細胞 CMK6株を常法により培養し、播種後 3日目に、キヤビラリ一を用いて、細胞をコロニーごと物理的にピックアップした。得られたコロニーを、 20ng /mlの bFGFを含む神経細胞培養用培養液 (住友ベークライト製品：品番 MB—X 9501、初代培養ァストロサイト馴化培地の代替物として使用）で 37°C、 5%COで 10

2 日間浮遊培養し、それにより Neural stem sphere (NSS)を得た。 10日間の浮遊培養期間中は、上記の浮遊培養液に毎日、塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)を最終濃度 20ngZmlとなるよう添カ卩した。

[0119] その後、前記 NSSを I X B- 27添カ卩物〔カタログ番号： 17504— 044、インビトロジェンコーポレーション製； X 50濃度の市販品を X 1の濃度で使用〕を含有した Neurob asal™培地〔カタログ番号： 21103— 049、インビトロジェンコーポレーション製〕培地を用いて、ポリ— L リジン Zラミニンコートディッシュ上に播種し、毎日、 bFGFと上皮細胞成長因子 (EGF)を、それぞれ最終濃度 20ngZmlとなるよう添加しながら、 3 7°C、 5%COで 7日間接着培養し、神経幹細胞を増殖させた。

2

[0120] なお、前記ポリ一 L—リジン/ラミニンコートディッシュは、ポリ一 L—リジンコートディッシュ〔IWAKI、旭テクノグラス社製〕を、 10 g/ml ラミニン〔カタログ番号： L000 1、旭テクノグラス社製〕で 3時間処理することによりコーティングして使用した。

[0121] 7日間培養した後、キヤビラリ一ピペットを用いて、増殖している細胞の中心部分を物理的にポリ— L—リジン/ラミニンコートディッシュ上に移しかえ、 G-5添加物〔カタログ番号： 17503— 012、インビトロジェン社製； X 100濃度〕を X 1濃度でカ卩えた Dul becco's Modified Eagle Medium (DMEM)〔カタログ番号： 11960— 069、インビトロジェン社製〕（以下、 G5培地と称す）により培養を継続した。 37°C、 5%COでさらに 7

2

日間培養を継続した。この培養期間中は、毎日 bFGF及び EGFを 20ngZmlが最終濃度になるよう添加し続けた。

[0122] 上記培養 7日めの時点で、増殖している細胞の中心部分をキヤビラリ一により物理的に除去し、その後さらに 7日間培養を継続した。

その後、 G-5培地を除去して、 Ca²⁺及び Mg²⁺不含リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄後、 0. 05重量％トリプシン ZEDTAで該細胞を解離させ、この解離後の細胞 (上記で増幅した神経幹細胞）を、再び G-5培地を培養液として、ポリ L リジン Z ラミニンコートディッシュ上で 10日間の培養を行い、ァストロサイト様細胞を誘導した。

[0123] 図 5は、こうして得られたサル胚性幹細胞由来の培養物を抗 GFAP抗体〔カタログ番号： AB5804、ケミコン（CHEMICON)社製〕及び抗 MAP2抗体〔カタログ番号： 442695,カルビオケム（CALBIOCHEM)社製〕を用、て常法に従つて免疫染色した結果を示す。図中、パネル Aは GFAPの発現、パネル Bは MAP2の発現、パネル Cは、パネル Aと Bの重ね合わせ画像を示す。

[0124] 培養器中のほとんどの細胞がァストロサイト様細胞（GFAP陽性）となっており、 MA P2陽性の神経細胞は殆ど存在せず、純度のかなり高い均一なサルァスト口サイト様細胞が得られることがわ力つた。

[0125] その後、培養液を N2培地（N2添加物を X 1濃度で添カ卩した DMEM/F— 12培地 )に置換して培養を継続し、その 2— 4日後に、得られた培養物力上清を回収し、孔径 22nmのフィルター〔商品名： DISMIC— 25CS、アドバンテック社製〕で濾過し、サル胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を得た。

得られたサル胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、その後、 N2添加物〔カタログ番号： 17502— 048、インビトロジェン社製； X 100濃度〕あるいは B— 27 添加物〔カタログ番号： 17504— 044、インビトロジヱン社製； X 50濃度〕を、それぞれ最終 X 1濃度となるように添加した後、胚性幹細胞の神経細胞誘導能や神経細胞の長期安定培養能を検討した。

[0126] 実施例 5

実施例 4により調製したサル胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、 CMK6-G4株 (hrGFP遺伝子安定発現株）の神経細胞への分化誘導能を検討した。

CMK6-G4株を常法により培養し、播種後 3日目に、キヤピラリーを用いて、細胞をコロニーごと物理的にピックアップした。得られたコロニーを、 20ngZmlの bFGFを含むサル胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地 (実施例 4で得られたもの）で 37。C、 5%COで 10日間浮遊培養し、それにより、 Neural stem sphere (NSS)を得

2

た。 10日間の浮遊培養期間中は、上記の浮遊培養液に毎日、 bFGFを 20ngZml が最終濃度になるよう添加した。

[0127] その後、前記 NSSを、同じサル胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、ポリ— L—リジン/ラミニンコートディッシュ上に播種し、 37°C、 5%COで 14日間接着培養し、神経系細胞に分化誘導したところ、おびただしい数の神経突起が顕微鏡下で観察された。

[0128] サル胚性幹細胞からの神経細胞分化を確認する目的で、得られた細胞集団におけるクラス III βチューブリン及び ΜΑΡ2の発現を、それぞれ抗 β IIIチューブリン (T uj)抗体〔カタログ番号： MAB1637、ケミコン（CHEMICON)社製〕及び抗 MAP2 抗体〔カタログ番号： 442695、カルビオケム（CALBIOCHEM)社製〕を用いた免疫染色を常法にて解析した。力かる結果を図 6に示す。

[0129] 図 6に示されるように、サル胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、極めて多数の β IIIチューブリンや ΜΑΡ2を発現する細胞 (神経細胞）が分ィ匕誘導されて、ることがわ力つた。

このことは、サル胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地が、サル胚性幹細胞から神経幹細胞を誘導し、神経細胞を効率よく分化誘導する能力を有することを示す結果といえる。

[0130] 一方、比較対照として、 N2培地 (馴化培地の調製に用いた基本培地)や B27培地

(B— 27サプリメント含有 Neurobasal™培地）を用いたものでは、自発的分化と思われる少量程度の神経細胞は観察されたものの、積極的な神経分化誘導効果は、認められな力つた。（データ省略）

[0131] 実施例 6

ヒト ES細胞 SA181株を常法により培養し、播種後 3日目に、キヤピラリーを用いて、細胞をコロニーごと物理的にピックアップした。得られたコロニーを、 20ngZmlの bF GFを含む神経細胞培養用培養液 (住友ベークライト製品：品番 MB— X9501、初代培養ァストロサイト馴化培地の代替物として使用）で 37°C、 5%COで 12日間浮遊培

2

養し、それにより、 Neural stem sphere (NSS)を得た。この浮遊培養期間中は、上記の浮遊培養液に bFGFを 20ngZmlが最終濃度になるよう毎日添加を続けた。

[0132] その後、前記 NSSを、 1 X B— 27添加物〔カタログ番号： 17504— 044、インビトロジェンコーポレーション製； X 50濃度の市販品を X 1の濃度で使用〕を含有した Neu robasal™培地〔カタログ番号： 21103— 049、インビトロジェンコーポレーション製〕培地を用いて、ポリ— L—リジン Zラミニンコートディッシュ上に播種し、毎日、 bFGF と EGFを、それぞれ最終濃度 20ngZmlとなるよう添カ卩しながら、 37°C、 5%COで 7

2 日間接着培養して神経幹細胞を増殖させた。

[0133] なお、前記ポリ一 L—リジン/ラミニンコートディッシュは、ポリ一 L—リジンコートディッシュ〔IWAKI、旭テクノグラス社製〕を、 10 g/ml ラミニン〔カタログ番号： LOOO 1、旭テクノグラス社製〕で 3時間処理することによりコーティングして使用した。

[0134] 7日間培養した後、キヤビラリ一ピペットを用いて、増殖している細胞の中心部分を物理的にポリ— L—リジン/ラミニンコートディッシュ上に移しかえ、 G-5添加物〔カタログ番号： 17503— 012、インビトロジェン社製； X 100濃度〕を X 1濃度でカ卩えた Dul becco's Modified Eagle Medium (DMEM)〔カタログ番号： 11960— 069、インビトロジェン社製〕（以下、 G5培地と称す）により培養を継続した。 37°C、 5%COでさらに 7

2

[0135] 上記培養 7日めの時点で、増殖している細胞の中心部分をキヤビラリ一により物理的に除去し、その後さらに 7日間培養を継続した。

その後、 G-5培地を除去して、 Ca²⁺及び Mg²⁺不含リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄後、 0. 05重量％トリプシン ZEDTAで該細胞を解離させ、この解離後の細胞を、再び G-5培地を培養液として、ポリ—L—リジン Zラミニンコートディッシュ上で

14日間の培養を行い、ァストロサイト様細胞を誘導した。

[0136] 図 7は、こうして得られたヒト胚性幹細胞由来の培養物を抗 GFAP抗体及び抗 MA

P2抗体を用いて免疫染色した結果を示す。

図に示されるように、培養器中のほとんどの細胞がァストロサイト様細胞 (GFAP陽性）となっており、 MAP2陽性の神経細胞は殆ど存在せず、純度のかなり高い均一なサルァスト口サイト様細胞が得られることがわ力つた。

[0137] その後、培養液を N2培地（N2添加物を X 1濃度で添カ卩した DMEM/F— 12培地

)に置換して培養を継続し、その 2— 4日後に、得られた培養物力上清を回収し、孔径 22nmのフィルター〔商品名： DISMIC— 25CS、アドバンテック社製〕で濾過し、ヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を得た。

得られたヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、その後、 N2添加物〔カタログ番号： 17502— 048、インビトロジェン社製； X 100濃度〕あるいは B- 27添加物〔カタログ番号： 17504— 044、インビトロジヱン社製； X 50濃度〕を、それぞれ最終 X 1濃度となるように添加した。

[0138] 実施例 7

実施例 6により調製したヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、 SA181hrG2株 (hrGFP遺伝子安定発現株；緑色蛍光を発することで細胞の同定が容易〖こなるように作製されたもの）の神経細胞への分化誘導能を検討した。

SA181hrG2株を常法により培養し、播種後 3日目に、キヤピラリーを用いて、細胞をコロニーごと物理的にピックアップした。得られたコロニーを、 20ngZmlの bFGF を含むヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地 (実施例 6で得られたもの）で 37。C、 5%COで 12日間浮遊培養し、それにより、 Neural stem sphere (NSS)を得

2

た。 12日間の浮遊培養期間中は、上記の浮遊培養液に毎日、 bFGFを 20ngZml が最終濃度になるよう添加した。

[0139] その後、前記 NSSを、同じヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、ポリ— L—リジン/ラミニンコートディッシュ上に播種し、 37°C、 5%COで 14日

2 間接着培養し、神経細胞を分化誘導したところ、おびただしい数の神経突起が顕微鏡下で観察された。

[0140] ヒト胚性幹細胞からの神経細胞分化を確認する目的で、得られた細胞集団におけるクラス III βチューブリン及び ΜΑΡ2の発現を、それぞれ抗 β IIIチューブリン (T i )抗体〔カタログ番号： MAB1637、ケミコン（CHEMICON)社製〕及び抗 MAP2抗体〔カタログ番号： 442695、カルビオケム（CALBIOCHEM)社製〕を用いた免疫染色を常法にて解析した。力かる免疫染色の結果を図 8に示す。

[0141] 図 8に示されるように、ヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、極めて多数の神経細胞 (クラス III βチューブリンや ΜΑΡ2を発現する細胞）が分化誘導されて、ることがわ力つた。

このことは、ヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地が、ヒト胚性幹細胞から神経幹細胞を誘導し、神経細胞を効率よく分化誘導する能力を有することを示す結果といえる。 [0142] 一方、比較対照として、 N2培地 (馴化培地の調製に用いた基本培地)や B27培地 (B— 27サプリメント含有 Neurobasal™培地）を用いたものでは、自発的分化と思われる少量程度の神経細胞は観察されたものの、積極的な神経分化誘導効果は、認められなかった。

[0143] また、実施例 6で調製したヒト胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて、神経細胞を培養した検討では、実施例 2に記載された内容と全く同様の結果として、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞〔カタログ番号： MB— X0305：神経細胞 CX(M)、住友ベークライト社製〕をはじめ、正常ヒト神経前駆細胞〔製品コード: PT— 2599： Cambrex社製〕、ヒト胚性幹細胞から分化した神経細胞の、ずれにお!ヽても、良好な培養性能 (神経細胞の生存と神経突起の伸展）が確認されて!ヽる。

[0144] 図 9は、ヒト神経前駆細胞を培養した結果を示す。 N2培地 (馴化培地を調製する際の基本培地）を用いた場合、培養容器中にパネル Aのような部分がまばらに観察されるのに対し、 hES-ACMを用いた場合には、パネル Bのような多数の神経細胞が培養容器中の全面にわたって観察され、良好な培養性能を示すことがわかる。

[0145] 実施例 8

マウス由来ァストロサイト細胞株である KT- 5細胞 (GFAP陽性；ヒューマンサイェンス研究資源バンク資産番号: IFO50161)力も同様の方法にて馴化培地を調製し、それを用いて ES細胞神経細胞分化誘導能及び神経細胞の長期安定培養性能について検討した。

[0146] マウス KT- 5細胞を 10%ゥシ胎児血清を含む Nutrient Mixture F- 12 HAM培養液 (カタログ No. N8641 ;シグマ社製）を用いた常法にて継代培養し、 70%コンフルェントの状態になった段階で、培養液を N2添加物を X 1濃度で含有する DMEM ZF— 12倍溶液に置換し、 2日培養した後、その培養物から上清を回収し、孔径 22 nmのフィルター〔商品名： DISMIC— 25CS、アドバンテック社製〕で濾過することで、マウス KT-5細胞馴化培地を得た。

[0147] 得られた当該馴化培地には、その後、 N2添加物〔カタログ番号： 17502— 048、ィンビトロジェンコーポレーション製； X 100濃度〕あるいは B-27添カ卩物〔カタログ番号： 17504— 044、インビトロジェンコーポレーション製； X 50濃度〕を、それぞれ最終 X 1濃度となるように添加した後、マウス胚性幹細胞に対する神経系細胞への分化誘導能及び神経細胞の in vitro培養における長期安定培養能を検討した。

しかし、この KT— 5細胞馴化培地を用いた場合には、神経細胞を長期安定培養したり、胚性幹細胞を神経系細胞に効率よく分ィ匕誘導したりすることができな力つた。

[0148] この結果は、同じ GFAP陽性細胞 (ァストロサイト様細胞)であっても、その馴化培地における機能面において、必ずしも、神経細胞の長期安定培養能や、胚性幹細胞の神経系細胞への分化誘導能を保証するものではな、こと (胚性幹細胞由来ァスト口サイト様細胞馴化培地と同等の性能を獲得できるものではないということ)を示す 1 例といえる。

[0149] 以上の実施例により、本発明の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地は、神経細胞の長時間にわたる安定的な維持、胚性幹細胞の神経系細胞への分化誘導等に有用であることが明らかとなった。産業上の利用可能性

[0150] 本発明によれば、ァストロサイト馴化培地を簡便に、大量かつ安定的に供給することができる。この馴化培地は、神経系細胞の安定的な製造や工業的製造において、神経細胞の長期かつ安定的な培養、胚性幹細胞から神経系細胞への効率的な分化誘導、胚性幹細胞から神経系細胞への工業的スケールでの分化誘導による神経系細胞の供給等を可能にするものである。したがって、本発明により、簡便に、大量かつ高品質の神経系細胞を供給することが可能になる。また、本発明によれば、所望の動物以外の動物由来の細胞成分が実質的に存在しない条件下に神経系細胞を維持又は生産することができるため、細胞移植療法等に適した生体への適合性が高い材料の提供が可能になる。

Claims

請求の範囲

[I] 胚性幹細胞の分ィ匕によって得られたァストロサイト様細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の製造方法。

[2] 胚性幹細胞が、哺乳動物の胚性幹細胞である、請求項 1記載の製造方法。

[3] 哺乳動物が、霊長類動物である、請求項 2記載の製造方法。

[4] 霊長類動物が、ヒトである、請求項 3記載の製造方法。

[5] (A)胚性幹細胞力もァストロサイト様細胞を得る工程、及び

(B)前記工程 (A)で得られたァストロサイト様細胞を培養し、培養上清を得る工程、を含む、請求項 1〜4いずれか 1項に記載の製造方法。

[6] 工程 (A)にお、て、ァストロサイト馴化培地、予め調製されたァストロサイト様細胞馴化培地、又は該ァストロサイト馴化培地若しくはァストロサイト様細胞馴化培地と機能的に同等の予め調製された培地を用いて、胚性幹細胞を分化誘導させる、請求項

5記載の製造方法。

[7] 請求項 1〜6いずれか 1項に記載の製造方法により得られる、胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地。

[8] 請求項 7記載の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下で神経細胞を培養することを特徴とする、神経細胞の培養方法。

[9] 請求項 8記載の培養方法により培養された神経細胞。

[10] 請求項 7記載の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地の存在下で胚性幹細胞から神経細胞を分化誘導することを特徴とする、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法。

[II] 請求項 7記載の胚性幹細胞由来ァストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導されてなる、神経系細胞。